TW202344262A

TW202344262A - 含中草藥萃取物的組合用於治療及/或預防與程序性細胞死亡-配體1有關的疾病的用途

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Publication number: TW202344262A
Application number: TW111117056A
Authority: TW
Inventors: 林宏惲; 莫汝谷; 李姿霖; 楊宇辰; 汪嘉康; 劉昉
Original assignee: 林宏惲
Priority date: 2022-05-05
Filing date: 2022-05-05
Publication date: 2023-11-16

Abstract

本發明提供一種含中草藥萃取物的組合用於治療及/或預防與程序性細胞死亡-配體1有關的疾病的用途。本發明含中草藥萃取物的組合藉由抑制PD-L1的表現及蛋白質積累、降血糖、清除活性氧化物及抗發炎，達到治療及/或預防與PD-L1有關的疾病之功效。

Description

含中草藥萃取物的組合用於治療及/或預防與程序性細胞死亡-配體1有關的疾病的用途

本發明是有關於一種含中草藥萃取物的組合用於治療及/或預防與程序性細胞死亡-配體1 (programmed cell death-ligand 1, PD-L1)有關的疾病的用途。

肥胖是一種輕度慢性炎症，可能會損害細胞介導免疫，增加感染的風險。其也是大腸癌和其他惡性腫瘤的危險因素。實際上，肥胖症會干擾T細胞的產生和功能，損害細胞介導免疫活化T細胞保護性免疫反應的能力。高血糖會刺激活性氧化物(reactive oxygen species, ROS)的產生並促進氧化應激。ROS和氧化應激會增加癌化和轉移的風險。另外，脂肪細胞會產生發炎介質來刺激炎症。過重可能會有致瘤性免疫功能障礙，可通過免疫檢查點抑制劑有效調控。因此在免疫檢查點抑制劑的前瞻性臨床試驗中會使用BMI檢測臨床患者是否超重。肥胖即是一種“代謝性發炎”，會導致免疫反應失調和發炎，但其在癌化和免疫治療過程中對免疫反應的影響尚未完全闡明。在臨床前研究裡，年輕和瘦的小鼠用於研究癌症的進展和發展，以代表癌症患者。但大多研究未能呈現癌症患者的臨床情況。儘管尚未闡明其機制，但臨床分析表明，在使用標靶治療和抑制檢查點免疫療法治療的癌症中，肥胖與患者的存活率相關。

負檢查點調節劑可降低免疫反應、抑制免疫激活、減少附帶損害並維持周邊天然免疫耐受性。研究最深入的兩個負檢查點調節劑：細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4 (CTLA-4，也稱為分化群152 (cluster of differentiation 152, CD152))和程序性細胞死亡蛋白質-1 (programmed cell death protein-1, PD-1)(也稱為CD279)。它們用不同的方式調節不同階段的免疫反應。首先，CTLA-4的調節T細胞活化早期階段。而PD-1主要調節組織和腫瘤中正在進行免疫反應的子T細胞活性。程序性細胞死亡-配體1 (programmed cell death-ligand 1, PD-L1)參與迴避免疫監控。B和T淋巴細胞減毒劑(BTLA)是歸類為CD28超家族(免疫球蛋白(Ig)超家族)的檢查點共抑制受體。它存在於多種免疫細胞中，包括T細胞、B細胞和自然殺傷(NK)細胞。BTLA在結構上和功能上與CTLA-4和PD-1有關。升高的BTLA水平與胃癌的進展和不良的預後有關。另外，顯示PD-L1過度表現會干擾細胞週期、細胞生長、凋亡和致癌作用。因此，檢查點基因的過度表現可能會調節癌症的生長和進程。

PD-L1也被稱為CD274或B7同源物1 (B7 homolog 1, B7-H1)，是I型跨膜蛋白，在細胞水平影響免疫反應的生理調節。藉由PD-1與活化的T淋巴細胞表面的受體結合，PD-L1對免疫細胞產生抑制作用，可防止影響健康細胞的有害免疫反應。然而，癌細胞表現PD-L1並避免活化的T細胞介導的免疫破壞的能力已被充分描述。因此，PD-L1被認為是罹癌的生物標誌，並且有許多用於抗癌免疫治療的抗PD-L1及抗PD-1藥物已被使用或正在開發中，腫瘤表現PD-L1來自多種細胞內信號傳導途徑，包含核因子(NF)-κB、有絲分裂活化蛋白質激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、JAK激酶/信號傳感器以及轉錄激活因子 (JAK/STAT)。PD-L1的發生是受到受體介導的信號通路調節，這些信號通路會影響細胞週期、細胞增殖、細胞凋亡及細胞存活率，讓細胞癌變。此外，PD-L1的蛋白質穩定性和免疫抑制功能受EGFR信號傳導調控的翻譯後修飾(包括磷酸化，糖基化和泛素化)的調控。

有鑑於目前治療與PD-L1有關的疾病之藥物仍存在副作用、具細胞毒性及效果不彰的缺點。為了解決上述問題，本領域的技術人員急需研發出新穎且有效治療與PD-L1有關的疾病的醫藥品以造福有此需求的廣大族群。

有鑑於此，本發明之目的為提供一種含中草藥萃取物的組合用於製備治療及/或預防一與程序性細胞死亡-配體1 (programmed cell death-ligand 1, PD-L1)有關的疾病之醫藥品的用途，其中該含中草藥萃取物的組合包含一金線連( Anoectochilus formosanus Hayata)萃取物、白藜蘆醇(resveratrol)及2,3,5,4'-四羥基sti-2-O-β-葡萄糖苷(2,3,5,4'-tetrahydroxy sti-2-O-β-glucopyranoside, THSG)。

在本發明的一實施例中，該與PD-L1有關的疾病是選自於下列所組成的群組：肥胖、老化、癌症、糖尿病、子宮肌瘤、心血管疾病、不孕症、發炎，及其組合。

在本發明的一實施例中，該糖尿病是第二型糖尿病。

在本發明的一實施例中，該2,3,5,4'-四羥基sti-2-O-β-葡萄糖苷是得自於何首烏( Polygonum multiflorumThunb.)。

在本發明的一實施例中，該金線連萃取物係以一溶劑萃取一金線連所獲得，該溶劑為水、醇、或醇水混合物。

在本發明的一實施例中，該金線連萃取物的有效濃度為至少100 g/mL。

在本發明的一實施例中，該白藜蘆醇的有效濃度為至少10 M。

在本發明的一實施例中，該2,3,5,4'-四羥基sti-2-O-β-葡萄糖苷的有效濃度為至少25 M。

在本發明的一實施例中，該與PD-L1有關的疾病是藉由抑制PD-L1的表現及蛋白質積累而被治療及/或預防。

在本發明的一實施例中，該醫藥品是一供非經腸道投藥的劑型。

綜上所述，本發明含中草藥萃取物的組合的功效在於：藉由抑制PD-L1的表現及蛋白質積累、降血糖、清除活性氧化物(reactive oxygen species, ROS)及抗發炎，達到治療及/或預防與PD-L1有關的疾病(例如肥胖、老化、癌症、糖尿病、子宮肌瘤、心血管疾病、不孕症、發炎，及其組合)之功效。

以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

定義

本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。

依據本發明，用語“金線連( Anoectochilus formosanus Hayata)”為蘭科(Orchidaceae)金線連屬( Anoectochilus)之小型地生蘭，屬多年生藥用植物，全草皆可入藥，是民間珍貴藥材。

如本文中所使用的，“治療(treating)”或“治療(treatment)”意指緩解(alleviating)、減少(reducing)、改善(ameliorating)、減輕(relieving)或控制(controlling)一疾病(disease)或障礙(disorder)的一或多個臨床徵兆(clinical sign)，以及降低(lowering)、停止(stopping)或逆轉(reversing)一正在被治療中的病況(condition)或症狀(symptom)之嚴重性(severity)的進展(progression)。

如本文中所使用的，用語“預防(preventing)”或“預防(prevention)”意指當一藥物被使用於一不具有疾病發病(disease onset)的症狀但具有疾病發病的高風險的個體時，阻止或延緩(delaying)疾病發病的症狀。

依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)或口服地(orally)投藥的劑型(dosage form)，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。

依據本發明的醫藥品可以一選自於由下列所構成的群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)、靜脈內注射(intravenous injection)、病灶內注射(intralesional injection)、舌下投藥(sublingual administration)以及穿皮投藥(transdermal administration)。

依據本發明的醫藥品可包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥學上可接受的載劑。例如，該醫藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於由下列所構成之群組中的試劑：溶劑(solvent)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該醫藥學上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)、含糖溶液、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)，以及它們的組合。 實施例 1. 金線連 ( Anoectochilus formosanus Hayata) 萃取物、白藜蘆醇( resveratrol) 及 2,3,5,4'- 四羥基 sti-2-O-β- 葡萄糖苷 (2,3,5,4'-tetrahydroxy sti-2-O-β-glucopyranoside, THSG) 的組合 的製備

本發明金線連( Anoectochilus formosanus Hayata)萃取物、白藜蘆醇(resveratrol)(購自於Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, Mo, USA)及2,3,5,4'-四羥基sti-2-O-β-葡萄糖苷(2,3,5,4'-tetrahydroxy sti-2-O-β-glucopyranoside, THSG)的組合的製備流程如下。金線連整株植物採自台灣南投縣埔里鄉山區，經臺北醫學大學生物化學暨細胞分子生物學科鄭可大教授鑑定。將新鮮的金線連整株植物冷凍過夜，然後在60°C下烘乾。乾燥的整株植物在室溫下用甲醇萃取並過濾，然後減壓蒸發濾液，得到金線連萃取物。將金線連萃取物回溶水中，加入等體積的正己烷進行劃分萃取，收集正己烷層後；將其水層再與乙酸乙酯進行劃分萃取，得到乙酸乙酯層，將此層萃取液進行減壓濃縮乾燥，得到金線連萃取物的乙酸乙酯分劃物(EA)。

THSG的製備流程如下。何首烏( Polygoni multiflora Thunb)購自中國中藥市場，經台灣工業技術研究院鑑定。將何首烏的根莖切成小塊，浸入50%乙醇中，65°C回流2小時。濾液在真空蒸發器下濃縮以除去乙醇。然後將萃取物冷凍乾燥成凍乾粉末(PM-E)。高效能液相層析法(high performance liquid chromatography, HPLC)測定PM-E中THSG的含量。將THSG溶於50%乙醇供動物餵食，溶於二甲基亞碸(DMSO)供細胞處理。 實施例 2. 金線連萃取物、白藜蘆醇及 2,3,5,4'- 四羥基 sti-2-O-β- 葡萄糖苷 (THSG) 的組合與該組合任一者相比減少更多的 PD-L1 表現

在本實施例中，金線連萃取物、白藜蘆醇與THSG的最佳濃度用於兩種藥物組合和三種藥物組合。用不同的藥物組合(單一藥物、兩種藥物組合或三種藥物組合)處理細胞24小時。收穫細胞，並收穫總蛋白質，並對PD-L1蛋白質進行蛋白質印跡分析。結果顯示於圖1。

圖1顯示金線連萃取物(100 g/ml)、白藜蘆醇(10 M)及THSG (100 M)的組合與該組合任一者相比減少更多的PD-L1表現，其中GAPDH表示甘油醛-3-磷酸去氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)。由圖1可見，與該組合的每種藥物相比，本發明金線連萃取物、白藜蘆醇與THSG的組合降低PD-L1表現量更為顯著。特別地，抑制PD-L1表現對於慢性發炎疾病(諸如子宮肌瘤及心血管疾病)扮演重要角色。因此，金線連萃取物、白藜蘆醇及THSG的組合被認為具有治療及/或預防子宮肌瘤及心血管疾病的高潛力。 實施例 3. 金線連萃取物、白藜蘆醇及 2,3,5,4'- 四羥基 sti-2-O-β- 葡萄糖苷 (THSG) 的組合在調節膽管癌 HuCC-T1 細胞中 PD-L1 與增殖细胞核抗原 (proliferating cell nuclear antigen, PCNA) 的基因表現與抑制膽管癌 SSP25 與 HuCC-T1 細胞增殖

在本實施例中，探討金線連萃取物、白藜蘆醇及2,3,5,4'-四羥基sti-2-O-β-葡萄糖苷(THSG)的組合能否調節膽管癌HuCC-T1細胞中 PD-L1與增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的基因表現。實驗方法如下：在單一處理中以最佳濃度使用白藜蘆醇、金線連萃取物及THSG。細胞用最佳濃度的單一試劑處理，兩種試劑聯合處理或三種試劑聯合處理24小時。結果顯示於圖2。

圖2顯示金線連萃取物、白藜蘆醇及2,3,5,4'-四羥基sti-2-O-β-葡萄糖苷(THSG)三者的組合調節膽管癌HuCC-T1細胞中 PD-L1與 PCNA的基因表現。從圖2可見，金線連萃取物、白藜蘆醇及2,3,5,4'-四羥基sti-2-O-β-葡萄糖苷(THSG)的組合處理膽管細胞1天並萃取其總RNA進行qPCR分析，金線連萃取物、白藜蘆醇及2,3,5,4'-四羥基sti-2-O-β-葡萄糖苷(THSG)的組合除了可以調節PD-L1的基因表現，還抑制增殖基因 PCNA的表現。因此，本發明金線連萃取物、白藜蘆醇及2,3,5,4'-四羥基sti-2-O-β-葡萄糖苷(THSG)的組合具有治療及/或預防與PD-L1有關的疾病之潛力。

進一步地，探討金線連萃取物、白藜蘆醇及2,3,5,4'-四羥基sti-2-O-β-葡萄糖苷(THSG)的組合能否抑制膽管癌SSP25與HuCC-T1細胞增殖。結果顯示於圖3。從圖3可見，金線連萃取物、白藜蘆醇及2,3,5,4'-四羥基sti-2-O-β-葡萄糖苷(THSG)的組合處理膽管細胞3天，發現金線連萃取物、白藜蘆醇及2,3,5,4'-四羥基sti-2-O-β-葡萄糖苷(THSG)的組合比該組合中任一者有更好抑制癌細胞增殖的能力。 實施例 4. 金線連萃取物在抑制口腔癌 SCC25 細胞中程序性細胞死亡 - 配體 1 (programmed cell death-ligand 1, PD-L1) 的表現上的效用評估

在本實施例中，每天用不同濃度的金線連萃取物或二甲雙胍(metformin)(為治療第二型糖尿病的一線藥物)對口腔癌SCC25細胞(原本是人舌鱗狀細胞癌，是一種上皮細胞)進行處理，並在每天更新的培養基中處理3天。萃取細胞的總RNA及蛋白質並對PD-L1 (左圖)及PD-L1蛋白質(右圖)進行定量聚合酶鏈反應(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)和西方墨點分析(Western blotting analysis)。結果顯示於圖4。

圖4顯示金線連萃取物抑制口腔癌SCC25細胞中PD-L1的表現，其中GAPDH表示甘油醛-3-磷酸去氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)，獨立研究的次數(n = 3)，***表示與對照組相比，p＜0.001，##表示與金線連萃取物組相比，p＜0.01。由圖4可見，金線連萃取物會抑制癌細胞PD-L1的mRNA表現與蛋白質積累，而二甲雙胍只會抑制PD-L1的mRNA表現，不會抑制PD-L1蛋白質積累。本實施例的結果證明，金線連萃取物可抑制口腔癌SCC25細胞中PD-L1的表現。 實施例 5. 金線連萃取物在調節口腔癌 SCC25 細胞中發炎、增殖及抗增殖基因的表現上的效用評估

在本實施例中，口腔癌細胞SCC25細胞置於培養皿中，以金線連萃取物或二甲雙胍處理SCC25細胞3天，每天更新培養基及試劑。萃取細胞的總RNA並進行qPCR分析以表現發炎及增殖基因，包括環氧化酶-2 ( cyclooxygenase-2, COX-2)基因、腫瘤壞死因子- ( tumor necrosis factor- , TNF- )基因、週期蛋白D1 ( cyclin D1, CCND1)基因、 c-Myc基因及基質金屬蛋白酶-2 ( matrix metalloproteinase-2, MMP-2)基因。結果顯示於圖5。

圖5顯示金線連萃取物抑制口腔癌SCC25細胞中發炎及增殖基因的表現，獨立研究的次數(n = 3)，**表示與對照組相比，p＜0.01，***表示與對照組相比，p＜0.001，由圖5可見，金線連萃取物(1 mg/ml)減少發炎基因 COX-2與 TNF-α，及增殖基因 CCND1、 c-Myc與 MMP-2。1 mg/ml二甲雙胍不能抑制 TNF-α的表現，而在相同處理濃度下只能抑制33%的 COX-2表現。

接著，以金線連萃取物處理口腔癌SCC25細胞並分析兩個促凋亡(即抗增殖)基因的表現，包括BCL2關聯性細胞死亡促效劑( BCL2 associated agonist of cell death, BAD)基因及半胱-天冬胺酸蛋白酶2 ( caspase 2, CASP2)基因。結果顯示於圖6。

圖6顯示金線連萃取物調節口腔癌SCC25細胞中抗增殖基因的表現。由圖6可見，金線連萃取物誘導的 BAD表現(0.2及1 mg/ml)顯著，但二甲雙胍1 mg/ml抑制 BAD表現。另一方面，0.2 mg/ml金線連萃取物的 CASP2表現很明顯，但是1 mg/ml金線連萃取物抑制 CASP2表現。二甲雙胍對 CASP2表現沒有影響。本實施例的結果證明，金線連萃取物可調節口腔癌SCC25細胞中發炎、增殖及抗增殖基因的表現。 實施例 6. 白藜蘆醇( resveratrol) 在口腔癌 SCC25 細胞中抑制甲狀腺素誘導的基因表現上的效用評估

本實施例探討白藜蘆醇抑制口腔癌SCC25細胞中甲狀腺素(T ₄)誘導的基因表現。白藜蘆醇抑制PD-L1表現和其他促炎基因的表現以及癌細胞的增殖。甲狀腺素可以誘導PD-L1和其他促炎基因的表達。它也誘導癌細胞的生長。本實施例分析白藜蘆醇調節與炎症、增殖、抗增殖和免疫調節相關基因的表現。結果顯示於圖7。

圖7顯示白藜蘆醇在口腔癌SCC25細胞中抑制甲狀腺素誘導的基因表現。由圖7可見，促發炎因子介白素-1 ( interleukin-1, IL-1)基因僅受甲狀腺素刺激。甲狀腺素誘導SCC25細胞中 CCND1和 PD-L1(CD274)基因的表現。相反地，白藜蘆醇抑制增殖基因 CCND1和 PD-L1。在將SCC25細胞與甲狀腺素和白藜蘆醇共同處理時，白藜蘆醇抑制甲狀腺素對 CCND1和 PD-L1基因的表現。本實施例的結果證明，白藜蘆醇抑制口腔癌SCC25細胞中甲狀腺素(T ₄)誘導的基因表現，包括 IL-1基因、 CCND1基因及 PD-L1基因。 實施例 7. 白藜蘆醇調節乳癌細胞 MDA-MB-231 中 p53 磷酸化信號傳遞並抑制二氫睪固酮 (dihydorotestosterone, DHT) 誘導的磷酸肌醇 3- 激酶 (phosphoinositide 3-kinase, PI3K)

在本實施例中，以白藜蘆醇處理乳癌細胞MDA-MB-231 (MDA-MB-231細胞是一種人乳腺上皮癌細胞株，它是從一名患有轉移性乳腺的51歲白人女性的胸腔積液中建立的乳腺癌，是醫學研究實驗室中最常用的乳腺癌細胞株之一)歷時24小時後萃取細胞總蛋白質並進行西方墨點分析。用二氫睪固酮(dihydorotestosterone, DHT)(10 ^-10~10 ^-8M)處理人乳腺癌MDA-MB-231細胞，加或不加10 μM白藜蘆醇4小時。結果顯示於圖8。

圖8顯示白藜蘆醇調節乳癌細胞MDA-MB-231中p53磷酸化信號傳遞並抑制DHT誘導的磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)，其中DHT表示二氫睪固酮，它會誘導乳癌細胞增生，N = 4，*表示與對照組相比，p＜0.05，**表示與對照組相比，p＜0.005，***表示與對照組相比，p＜0.001。由圖8可見，白藜蘆醇激活胞外訊號調節激酶1/2 (extracellular signal-regulated kinase 1/2, ERK1/2)但抑制DHT誘導的磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)激活，及白藜蘆醇誘導的p53的Ser-15磷酸化。 實施例 8. 單獨白藜蘆醇或其與 NDAT 組合抑制口腔癌細胞中甲狀腺素 - 誘導的 PD-L1 表現

在本實施例中，探討單獨白藜蘆醇或其與NDAT組合抑制口腔癌細胞中甲狀腺素-誘導的 PD-L1表現。結果顯示於圖9A及圖9B。圖9A的操作流程如下：將口腔癌SCC-25細胞接種在6壁托盤中，並用10 ^-7M T ₄、10 μM白藜蘆醇或它們的聯合處理24小時。萃取總RNA並進行PD-L1的qPCR。獨立研究的次數(n = 3)，數據以平均值標準差(SD)表示，a~d表示顯著差異的事後分析後的子集(subsets)藉由單因子變異數分析(one-way ANOVA)獲得。圖9B的操作流程如下：口腔癌OEC-M1細胞用10 μM白藜蘆醇、10 ^-7M NDAT或它們的組合處理24小時，然後萃取總RNA並進行PD-L1的qPCR。N = 5，**表示與對照組比較，p＜0.01，***表示與對照組比較，p＜0.001，#表示與T ₄組比較，p＜0.05，$$$表示與處理T ₄及白藜蘆醇的組合比較，p＜0.001。

由圖9A可見，T ₄會增加 PD-L1的mRNA表現，而白藜蘆醇會抑制T ₄-誘導的 PD-L1的mRNA表現。由圖9B可見，T ₄會增加 PD-L1的mRNA表現，而白藜蘆醇及其與NDAT的組合會抑制T ₄-誘導的 PD-L1的mRNA表現。 實施例 9. 白藜蘆醇在抑制甲狀腺素誘導的 PD-L1 表現上的效用評估

在本實施例中，進一步探討白藜蘆醇在抑制甲狀腺素誘導的PD-L1表現上的效用。結果顯示於圖10。

圖10是一共聚焦顯微鏡圖像，顯示白藜蘆醇可抑制甲狀腺素誘導的PD-L1，所使用的細胞株為卵巢癌細胞株A2780，RV表示白藜蘆醇(resveratrol)，T ₄表示甲狀腺素，COX-2表示環氧化酶-2 (cyclooxygenase-2)，最右欄表示左邊白色方框的放大。因此，白藜蘆醇與甲狀腺素共處理可抑制甲狀腺素誘導的PD-L1表現。 實施例 10. 金線連萃取物在 抑制口腔癌 SCC25 細胞增殖上的效用評估

在本實施例中，探討金線連萃取物能否抑制口腔癌SCC25細胞增殖，結果顯示於圖11。圖11顯示金線連萃取物抑制口腔癌SCC25細胞增殖，獨立研究的次數(n = 3)，*表示與對照組相比，p＜0.05，**表示與對照組相比，p＜0.01。由圖11可見，細胞活性測定顯示1 mg/ml金線連萃取物抑制口腔癌SCC25細胞增殖超過82%。用二甲雙胍(1 mg/ml)處理只能抑制26%的SCC25細胞生長，與0.2 mg/ml金線連萃取物相似。因此，金線連萃取物可抑制口腔癌SCC25細胞增殖。 實施例 11. 金線連萃取物在抑制膽管癌 SSP25 與 HuCC-T1 細胞增殖上的效用評估

在本實施例中，探討金線連萃取物在抑制膽管癌SSP25與HuCC-T1細胞增殖上的效用。不同類型的膽管癌細胞用金線連萃取物處理3天，每天更新培養基和試劑。圖12顯示金線連萃取物在抑制膽管癌SSP25與HuCC-T1細胞增殖上的效用，獨立研究的次數(n = 3)，*表示與對照組1相比，p＜0.05，**表示與對照組1相比，p＜0.01，***表示與對照組1相比，p＜0.001，#表示與對照組2相比，p＜0.05，##表示與對照組2相比，p＜0.01，###表示與對照組2相比，p＜0.001。結果顯示，金線連萃取物可抑制膽管癌細胞的細胞可活性(cell viability)(參見圖12)。 實施例 12. 金線連萃取物抑制癌細胞中胰島素誘導的腫瘤壞死因子 - (tumor necrosis factor- , TNF- ) 表現

在本實施例中，當用金線連萃取物處理人類結腸癌細胞株HCT116時，在存在或不存在胰島素的情況下，金線連萃取物(甲醇萃取物)、金線連萃取物的乙酸乙酯分劃物(EA)或槲皮素(quercetin)持續24小時，金線連萃取物(甲醇萃取物)，金線連萃取物的乙酸乙酯分劃物(EA)和槲皮素抑制TNF- 表現，參見圖13，其顯示金線連萃取物抑制癌細胞中胰島素誘導的TNF- 表現，其中所用細胞為人類結腸癌細胞株HCT116；EA表示金線連萃取物的乙酸乙酯分劃物；*表示與對照組比較， p＜0.05；**表示與對照組比較， p＜0.01；#表示與胰島素組比較， p＜0.05；##表示與胰島素組比較， p＜0.01；###表示與胰島素組比較， p＜0.001。 實施例 13. 金線連萃取物 降低胰島素治療的癌細胞中糖酵解基因第四型葡萄糖轉運蛋白 ( glucose transporter type 4, Glut4) 基因和己糖激酶 1 ( hexokinase1, HK1) 基因的表現

在本實施例中，探討金線連萃取物降低胰島素治療的人類結腸癌細胞株HCT116中糖酵解基因第四型葡萄糖轉運蛋白( glucose transporter type 4, Glut4)基因和己糖激酶1 ( hexokinase1, HK1)基因的表現，結果顯示於圖14。圖14顯示金線連萃取物降低胰島素治療的人類結腸癌細胞株HCT116中糖酵解基因 Glut4基因和 HK1基因的表現，由圖14可見，當使用金線連萃取物(甲醇萃取物)，存在或不存在胰島素的金線連萃取物的乙酸乙酯分劃物(EA)或槲皮素處理癌細胞24小時，金線連萃取物(甲醇萃取物)、金線連萃取物的乙酸乙酯分劃物和槲皮素顯著抑制糖酵解基因 Glut4和 HK1。胰島素顯著刺激了 Glut4和 HK1。另一方面，金線連萃取物、金線連萃取物的乙酸乙酯分劃物(EA)和槲皮素均顯著抑制胰島素誘導的 Glut4和 HK1表現。 實施例 14. 金線連萃取物 抑制正常細胞中胰島素誘導的 TNF- 表現

在本實施例中，探討金線連萃取物能否抑制小鼠前脂肪細胞(preadipocyte) 3T3-L1中胰島素誘導的TNF- 表現，結果顯示於圖15。圖15顯示金線連萃取物抑制小鼠前脂肪細胞(preadipocyte) 3T3-L1中胰島素誘導的TNF- 表現，其中EA表示金線連萃取物的乙酸乙酯分劃物；*表示與對照組比較， p＜0.05；**表示與對照組比較， p＜0.01；***表示與對照組比較， p＜0.001；###表示與胰島素組比較， p＜0.001。由圖15可見，用金線連萃取物處理小鼠前脂肪細胞(preadipocyte) 3T3-L1時，在有或沒有胰島素的情況下，金線連萃取物、EA或槲皮素持續24小時，金線連萃取物(甲醇萃取物)、金線連萃取物的乙酸乙酯分劃物和槲皮素抑制TNF- 表現。胰島素抑制TNF- 表現。然而，除了金線連萃取物，EA或槲皮素合併胰島素處理均能顯著誘導TNF- 表現。 實施例 15. 金線連萃取物抑制正常細胞中胰島素誘導的 第一型葡萄糖轉運蛋白 ( glucose transporter type 1, Glut1) 基因表現

在本實施例中，探討金線連萃取物能否抑制小鼠前脂肪細胞3T3-L1中胰島素誘導的第一型葡萄糖轉運蛋白( glucose transporter type 1, Glut1)基因表現，結果顯示於圖16。圖16顯示金線連萃取物抑制小鼠前脂肪細胞3T3-L1中胰島素誘導的 Glut1基因表現，其中***表示與對照組比較， p＜0.001，###表示與胰島素組比較， p＜0.001。由圖16可見，當用金線連萃取物處理小鼠前脂肪細胞3T3-L1時，在存在或不存在胰島素的情況下，金線連萃取物、EA或槲皮素持續24小時，金線連萃取物(甲醇萃取物)、金線連萃取物的乙酸乙酯分劃物(EA)和槲皮素會抑制 Glut1表現。胰島素抑制 Glut1表現。但是，除金線連萃取物外，EA和槲皮素合併胰島素處理均可顯著誘導 Glut1表現。 實施例 16. 白藜蘆醇在抑制甲狀腺素誘導的癌細胞增殖作用上的效用評估

在本實施例中，探討白藜蘆醇能否抑制甲狀腺素誘導的口腔癌細胞株SCC-25增殖作用，結果顯示於圖17。圖17顯示白藜蘆醇抑制甲狀腺素誘導的癌細胞增殖作用，其中T ₄表示甲狀腺素，RV表示白藜蘆醇。由圖17可見，甲狀腺素誘導癌細胞的增殖，而白藜蘆醇可以抑制甲狀腺素誘導的癌細胞增殖。 實施例 17. 金線連萃取物在降血糖上的效用評估

在本實施例中，探討金線連萃取物在降血糖上的效用。在高血糖小鼠中，金線連萃取物降低的血糖的作用與二甲雙胍相同。金線連萃取物具有與二甲雙胍相同的性能，可降低高血糖小鼠的血糖。本實施例比較了金線連萃取物和二甲雙胍引起的降血糖作用對血糖的影響。禁食12小時後，在0分鐘時從小鼠收集尾靜脈血液。腹膜內注射50 mg/kg金線連萃取物或二甲雙胍。給予葡萄糖溶液(1 g/kg)，並在給予葡萄糖後30、60和120分鐘測試小鼠的血糖，結果顯示於圖18。

圖18顯示金線連萃取物在降血糖上的效用，其中NS表示用生理鹽水處理；***表示與對照組相比，p＜0.001。由圖18可見，與對照組相比，金線連萃取物和二甲雙胍給藥後的血糖濃度顯著降低並且相似。與對照組相比，由50 mg/kg的二甲雙胍和金線連萃取物誘導的ΔAUC也很顯著。此外，金線連萃取物50 mg/kg對葡萄糖的還原作用與二甲雙胍50 mg/kg對葡萄糖的還原作用相當。儘管金線連萃取物50 mg/kg的ΔAUC高於二甲雙胍給藥組，但兩個藥物治療組之間無顯著差異，顯示金線連萃取物50 mg/kg的降血糖功能與二甲雙胍50 mg/kg相似。 實施例 18. 奈米二胺基甲狀腺激素 (nano-diamino-tetrac, NDAT) 和白藜蘆醇對體內腫瘤生長的影響

在本實施例中，探討白藜蘆醇能否抑制人類結腸癌細胞株HCT116異種移植小鼠模型中腫瘤生長的活性。結果顯示於圖19。

圖19顯示白藜蘆醇抑制人類結腸癌細胞株HCT116異種移植小鼠模型中腫瘤生長的活性，其中A顯示將腫瘤體積的生長曲線歸一化為治療開始時的體積；B顯示各組之間最終腫瘤體積的比較；C顯示治療開始和結束時的動物體重，數據顯示為平均值±標準差(SD)，**表示與對照組比較， p＜0.01，$表示與NDAT (0.1 mg/kg)組比較， p＜0.05，##表示與白藜蘆醇(2.5 mg/kg)組比較， p＜0.01。從圖19可見，用NDAT (具有抗癌性質)或白藜蘆醇治療異種移植動物明顯抑制腫瘤的生長(圖19A、B)。0.1 mg/kg的NDAT產生76.98%的抑制率，相當於2.5 mg/kg的白藜蘆醇(80.99%)。更重要的是，NDAT對白藜蘆醇誘導的抗增殖的增強作用在體內是可重現的，因為NDAT (0.1mg/kg)與白藜蘆醇(2.5 mg/kg)的組合顯示出92.54%的腫瘤抑制率，對腫瘤無細胞毒性小鼠(圖19C)。 實施例 19. 白藜蘆醇在抑制人類類纖維瘤 ( fibroid) 細胞的訊號傳遞及增殖上的效用評估

在本實施例中，探討白藜蘆醇在抑制人類類纖維瘤細胞的訊號傳遞及增殖上的效用。結果顯示於圖20。

圖20顯示白藜蘆醇可抑制人類類纖維瘤(fibroid)細胞的訊號傳遞及增殖，其中正常子宮肌細胞(003)及類纖維瘤細胞(006、010、016及018)的初代細胞培養物被培養並用不同濃度的白藜蘆醇(RSV)處理24小時(西方墨點分析)或96小時(細胞可活性分析)。獲取細胞並萃取總蛋白質用於凋亡蛋白酶原(pro-caspase) 3與9及BCL-2的西方墨點分析。GAPDH用作內部對照組。對於細胞可活性分析，獲取細胞用於流動式細胞測量分析。由圖20可知，白藜蘆醇可抑制人類類纖維瘤細胞的增殖並抑制凋亡蛋白酶原3與9及BCL-2的表現。

綜上所述，本發明含中草藥萃取物的組合可藉由抑制PD-L1的表現及蛋白質積累、降血糖、清除活性氧化物(reactive oxygen species, ROS)及抗發炎，達到治療及/或預防與PD-L1有關的疾病(例如肥胖、老化、癌症、糖尿病、子宮肌瘤、心血管疾病、不孕症、發炎，及其組合)之功效。

以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。

無

圖1顯示金線連萃取物、白藜蘆醇及2,3,5,4'-四羥基sti-2-O-β-葡萄糖苷(2,3,5,4'-tetrahydroxy sti-2-O-β-glucopyranoside, THSG)三者的組合，與該組合任一者相比減少更多的PD-L1表現，其中GAPDH表示甘油醛-3-磷酸去氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)。圖2顯示金線連萃取物、白藜蘆醇及2,3,5,4'-四羥基sti-2-O-β-葡萄糖苷(THSG)三者的組合調節膽管癌HuCC-T1細胞中 PD-L1與 PCNA的基因表現，其中*表示與對照組相比，p＜0.05；**表示與對照組相比，p＜0.01；***表示與對照組相比，p＜0.001；#表示與單獨使用白藜蘆醇相比，p＜0.05；##表示與單獨使用白藜蘆醇相比，p＜0.01；###表示與單獨使用白藜蘆醇相比，p＜0.001；$表示與單獨使用金線連萃取物相比，p＜0.05；$$$表示與單獨使用金線連萃取物相比，p＜0.001；&表示與單獨使用THSG相比，p＜0.05；&&表示與單獨使用THSG相比，p＜0.01；&&&表示與單獨使用THSG相比，p＜0.001；%表示與金線連萃取物及THSG的組合相比，p＜0.05。圖3顯示金線連萃取物、白藜蘆醇及2,3,5,4'-四羥基sti-2-O-β-葡萄糖苷(THSG)三者的組合抑制膽管癌SSP25與HuCC-T1細胞增殖，其中*表示與對照組相比，p＜0.05；**表示與對照組相比，p＜0.01；***表示與對照組相比，p＜0.001；#表示與單獨使用白藜蘆醇相比，p＜0.05；##表示與單獨使用白藜蘆醇相比，p＜0.01；###表示與單獨使用白藜蘆醇相比，p＜0.001；$表示與單獨使用金線連萃取物相比，p＜0.05；$$表示與單獨使用金線連萃取物相比，p＜0.01；$$$表示與單獨使用金線連萃取物相比，p＜0.001；&表示與單獨使用THSG相比，p＜0.05；&&表示與單獨使用THSG相比，p＜0.01；&&&表示與單獨使用THSG相比，p＜0.001；%表示與金線連萃取物及THSG的組合相比，p＜0.05。圖4顯示金線連( Anoectochilus formosanus Hayata)萃取物抑制口腔癌SCC25細胞中程序性細胞死亡-配體1 (programmed cell death-ligand 1, PD-L1)的表現，其中GAPDH表示甘油醛-3-磷酸去氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)，獨立研究的次數(n = 3)，***表示與對照組相比，p＜0.001，##表示與金線連萃取物組相比，p＜0.01。圖5顯示金線連萃取物抑制口腔癌SCC25細胞中發炎及增殖基因的表現，包括環氧化酶-2 ( cyclooxygenase-2, COX-2)基因、腫瘤壞死因子- ( tumor necrosis factor- , TNF- )基因、週期蛋白D1 ( cyclin D1, CCND1)基因、 c-Myc基因及基質金屬蛋白酶-2 ( matrix metalloproteinase-2, MMP-2)基因，獨立研究的次數(n = 3)，**表示與對照組相比，p＜0.01，***表示與對照組相比，p＜0.001。圖6顯示金線連萃取物調節口腔癌SCC25細胞中抗增殖基因的表現，包括BCL2關聯性細胞死亡促效劑( BCL2 associated agonist of cell death, BAD)基因及半胱-天冬胺酸蛋白酶2 ( caspase 2, CASP2)基因。圖7顯示白藜蘆醇(resveratrol)在口腔癌SCC25細胞中抑制甲狀腺素(T ₄)誘導的基因表現，包括促發炎因子介白素-1 ( interleukin-1, IL-1)基因、 CCND1基因及 PD-L1基因。圖8顯示白藜蘆醇調節乳癌細胞MDA-MB-231中p53磷酸化信號傳遞並抑制二氫睪固酮(dihydorotestosterone, DHT)誘導的磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)，其中DHT表示二氫睪固酮(dihydorotestosterone)，它會誘導乳癌細胞增生，N = 4，*表示與對照組相比，p＜0.05，**表示與對照組相比，p＜0.005，***表示與對照組相比，p＜0.001。圖9A及圖9B顯示單獨白藜蘆醇或其與NDAT組合抑制口腔癌細胞中甲狀腺素-誘導的 PD-L1表現，其中RV表示白藜蘆醇，a~d表示顯著差異的事後分析後的子集(subsets)藉由單因子變異數分析(one-way ANOVA)獲得，**表示與對照組比較，p＜0.01，***表示與對照組比較，p＜0.001，#表示與T ₄組比較，p＜0.05，$$$表示與處理T ₄及白藜蘆醇的組合比較，p＜0.001。圖10是一共聚焦顯微鏡圖像，顯示白藜蘆醇可抑制甲狀腺素誘導的PD-L1，所使用的細胞株為卵巢癌細胞株A2780，RV表示白藜蘆醇(resveratrol)，T ₄表示甲狀腺素，COX-2表示環氧化酶-2 (cyclooxygenase-2)，最右欄表示左邊白色方框的放大。圖11顯示金線連萃取物抑制口腔癌SCC25細胞增殖，獨立研究的次數(n = 3)，*表示與對照組相比，p＜0.05，**表示與對照組相比，p＜0.01。圖12顯示金線連萃取物在抑制膽管癌SSP25與HuCC-T1細胞增殖上的效用，獨立研究的次數(n = 3)，*表示與對照組1相比，p＜0.05，**表示與對照組1相比，p＜0.01，***表示與對照組1相比，p＜0.001，#表示與對照組2相比，p＜0.05，##表示與對照組2相比，p＜0.01，###表示與對照組2相比，p＜0.001。圖13顯示金線連萃取物抑制癌細胞中胰島素誘導的腫瘤壞死因子- (tumor necrosis factor- , TNF- )表現，其中所用細胞為人類結腸癌細胞株HCT116；EA表示金線連萃取物的乙酸乙酯分劃物；*表示與對照組比較， p＜0.05；**表示與對照組比較， p＜0.01；#表示與胰島素組比較， p＜0.05；##表示與胰島素組比較， p＜0.01；###表示與胰島素組比較， p＜0.001。圖14顯示金線連萃取物降低胰島素治療的人類結腸癌細胞株HCT116中糖酵解基因第四型葡萄糖轉運蛋白( glucose transporter type 4, Glut4)基因和己糖激酶1 ( hexokinase1, HK1)基因的表現，**表示與對照組比較，p＜0.01，***表示與對照組比較，p＜0.001，###表示與胰島素組比較，p＜0.001。圖15顯示金線連萃取物抑制小鼠前脂肪細胞(preadipocyte) 3T3-L1中胰島素誘導的TNF- 表現，其中EA表示金線連萃取物的乙酸乙酯分劃物；*表示與對照組比較， p＜0.05；**表示與對照組比較， p＜0.01；***表示與對照組比較， p＜0.001；###表示與胰島素組比較， p＜0.001。圖16顯示金線連萃取物抑制小鼠前脂肪細胞3T3-L1中胰島素誘導的第一型葡萄糖轉運蛋白( glucose transporter type 1, Glut1)基因表現，其中***表示與對照組比較， p＜0.001，###表示與胰島素組比較， p＜0.001。圖17顯示白藜蘆醇抑制甲狀腺素誘導的癌細胞增殖作用，其中T ₄表示甲狀腺素，RV表示白藜蘆醇(resveratrol)。圖18顯示金線連萃取物在降血糖上的效用，其中NS表示生理鹽水處理；***表示與對照組相比，p＜0.001。圖19顯示白藜蘆醇抑制人類結腸癌細胞株HCT116異種移植小鼠模型中腫瘤生長的活性，其中A顯示將腫瘤體積的生長曲線歸一化為治療開始時的體積；B顯示各組之間最終腫瘤體積的比較；C顯示治療開始和結束時的動物體重，數據顯示為平均值±標準差(SD)，NDAT表示奈米二胺基甲狀腺激素(nano-diamino-tetrac)，具有抗癌增殖，**表示與對照組比較， p＜0.01，$表示與NDAT (0.1 mg/kg)組比較， p＜0.05，##表示與白藜蘆醇(2.5 mg/kg)組比較， p＜0.01。圖20顯示白藜蘆醇可抑制人類類纖維瘤(fibroid)細胞的訊號傳遞及增殖，其中正常子宮肌細胞(003)及類纖維瘤細胞(006、010、016及018)的初代細胞培養物被培養並用不同濃度的白藜蘆醇(RVS)處理24小時(西方墨點分析)或96小時(細胞可活性分析)。獲取細胞並萃取總蛋白質用於凋亡蛋白酶原(pro-caspase) 3與9及BCL-2的西方墨點分析。GAPDH用作內部對照組。

Claims

一種含中草藥萃取物的組合用於製備治療及/或預防一與程序性細胞死亡-配體1 (programmed cell death-ligand 1, PD-L1)有關的疾病之醫藥品的用途，其中該含中草藥萃取物的組合包含一金線連( Anoectochilus formosanus Hayata)萃取物、白藜蘆醇(resveratrol)及2,3,5,4'-四羥基sti-2-O-β-葡萄糖苷(2,3,5,4'-tetrahydroxy sti-2-O-β-glucopyranoside, THSG)。
如請求項1的用途，其中該與PD-L1有關的疾病是選自於下列所組成的群組：肥胖、老化、癌症、糖尿病、子宮肌瘤、心血管疾病、不孕症、發炎，及其組合。
如請求項2的用途，其中該糖尿病是第二型糖尿病。
如請求項1的用途，其中該2,3,5,4'-四羥基sti-2-O-β-葡萄糖苷是得自於何首烏( Polygonum multiflorumThunb.)。
如請求項1的用途，其中該金線連萃取物係以一溶劑萃取一金線連所獲得，該溶劑為水、醇、或醇水混合物。
如請求項1的用途，其中該金線連萃取物的有效濃度為至少100 g/mL。
如請求項1的用途，其中該白藜蘆醇的有效濃度為至少10 M。
如請求項1的用途，其中該2,3,5,4'-四羥基sti-2-O-β-葡萄糖苷的有效濃度為至少25 M。
如請求項1的用途，其中該與PD-L1有關的疾病是藉由抑制PD-L1的表現及蛋白質積累而被治療及/或預防。
如請求項1的用途，其中該醫藥品是一供非經腸道投藥的劑型。