TW202342509A - 以IGF1R為標的之pre-pro前驅體型嵌合抗原受體表現細胞 - Google Patents

以IGF1R為標的之pre-pro前驅體型嵌合抗原受體表現細胞 Download PDF

Info

Publication number
TW202342509A
TW202342509A TW112103302A TW112103302A TW202342509A TW 202342509 A TW202342509 A TW 202342509A TW 112103302 A TW112103302 A TW 112103302A TW 112103302 A TW112103302 A TW 112103302A TW 202342509 A TW202342509 A TW 202342509A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
igf
cells
car
cancer
igf1r
Prior art date
Application number
TW112103302A
Other languages
English (en)
Inventor
中沢洋三
平林耕一
丸山悠太
柳生茂希
三島修治
清水公裕
Original Assignee
國立大學法人信州大學
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 國立大學法人信州大學 filed Critical 國立大學法人信州大學
Publication of TW202342509A publication Critical patent/TW202342509A/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明提供一種可期待對表現IGF1R之腫瘤有效之IGF1R CAR-T細胞。 本發明提供一種聚核苷酸及包含其之載體、以及導入有上述多肽或載體之基因修飾細胞，該聚核苷酸係編碼具有與類胰島素生長因子-1受體(IGF1R)結合之標的結合域、跨膜結構域及細胞內訊號傳遞域之嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor：CAR)蛋白者，且標的結合域為類胰島素生長因子(IGF)之pre-pro前驅體或其E域缺失之片段。

Description

以IGF1R為標的之pre-pro前驅體型嵌合抗原受體表現細胞
本發明係關於一種可用於過繼免疫療法之領域中的編碼嵌合抗原受體之聚核苷酸及包含其之載體、以及表現嵌合抗原受體之基因修飾細胞及其製作方法。
類胰島素生長因子-1受體(IGF1R)係屬於胰島素受體(INSR)家族之受體型酪胺酸激酶，構成異型四聚物，該異型四聚物包含構成配體結合域之2個細胞外α次單元、及具有激酶域之2個跨膜β次單元。IGF1R係根據表現其之細胞之種類或狀況，以各種親和性與其配體(主要為IGF-1及IGF-2)結合，經由Ras/Raf/MEK/ERK或PI3K/Akt/mTor訊號傳遞路徑，控制各種細胞之增殖、分化、生存、代謝。IGF1R亦可與INSR(insulin receptor，胰島素受體)-A或INSR-B構成混合受體(分別為IGF1R/INSR-A、IGF1R/INSR-B)，該等混合受體可與IGF-1、IGF-2、胰島素結合。於該等混合受體與其配體結合之情形時，亦產生與其配體結合於IGF1R之情形相同之訊號傳遞級聯反應。由IGF1R、INSR、其等之混合受體(IGF1R/INSR-A、IGF1R/INSR-B)、及其等之配體(IGF-1、IGF-2、胰島素)等所形成之蛋白質群被稱為IGF軸。
於包含肉瘤、乳癌、前列腺癌、胰臟癌、黑色素瘤之廣泛之癌種中確認到IGF1R之高表現或血中IGF配體之高值，有報告稱，於一些癌種中與進展速度或預後不良相關。進而，顯示來自IGF1R之訊號係惡性轉化所必須者。有報告稱，除IGF-1及IGF1R以外，於廣泛之癌種中亦可見IGF-2或INSR-A之高表現，認為IGF軸為理想之癌症治療標的(非專利文獻1及2)。
迄今為止，嘗試開發以IGF軸為標的之各種藥劑，抗IGF1R抗體、IGF1R酪胺酸激酶抑制劑、抗IGF-1/IGF-2抑制抗體雖藉由尤因氏肉瘤、骨肉瘤、神經內分泌腫瘤、小細胞肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、肝細胞癌、大腸癌、乳癌、卵巢癌等各種癌種之臨床試驗進行了評價，但治療效果或安全性不充分，尚未投入實際使用(非專利文獻1及2)。於癌細胞中以高水準表現IGF1R、INSR及IGF配體，其等對藉由抗IGF1R抗體等抑制IGF1R發揮補充作用，因此認為對抗IGF1R抗體等產生抗性。又，關於抗IGF1R抗體、IGF1R酪胺酸激酶抑制劑等，有報告稱，高程度且高頻度地發生高血糖，提示了其係因與葡萄糖代謝相關之INSR-B及其與IGF1R之混合受體(IGF1R/INSR-B)之障礙而產生的可能性。因此，期待效果及安全性優異之以IGF軸為標的之新方式登場。
近年來，表現嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor：CAR)之T細胞(CAR-T細胞)因其顯著之細胞毒殺活性，而期待作為針對難治性癌症之有希望之下一代方式。其中，Huang等人報告了以IGF1R為標的之CAR-T細胞之研究(非專利文獻3)。Huang等人報告了使用來自針對IGF1R之抗體之單鏈抗體(scFv)作為標的結合域之scFv型CAR-T細胞對IGF1R高表現肉瘤顯現出特異性免疫應答及活體外(in vitro)抗腫瘤效果，於腹腔內注入有肉瘤細胞之異種移植片小鼠模型中顯現出腫瘤縮小效果及壽命延長效果，於靜脈內注入有肉瘤細胞之異種移植片小鼠模型中亦顯現出腫瘤縮小效果(非專利文獻3)。然而，迄今為止不存在達到臨床試驗之IGF1R CAR-T細胞。
另一方面，作為以生長因子受體為標的之CAR-T細胞之製作方法，本發明人等報告了一種CAR(配體型CAR)之設計技術，其使用受體配體而非先前之scFV型作為CAR之標的結合域(非專利文獻4及5、專利文獻1)。 先前技術文獻 專利文獻
專利文獻1：國際公開第2020/085480號 非專利文獻
非專利文獻1：Simpson A et al., Target Oncol., 2017, 12(5):571-597, doi: 10.1007/s11523-017-0514-5 非專利文獻2：Anastassios Philippou et al., Mutation Research. Reviews in Mutation Research, 2017, 772：105-122, doi: 10.1016/j.mrrev.2016.09.005 非專利文獻3：Huang X et al., PLoS One, 2015, 10(7), doi: 10.1371/journal.pone.0133152 非專利文獻4：Nakazawa Y et al., J Hematol Oncol., 2016, 9:27 非專利文獻5：Hasegawa A et al., Clin Transl Immunology., 2021, 10(5):e1282
[發明所欲解決之問題]
如上所述，迄今為止不存在達到臨床試驗之IGF1R CAR-T細胞。因此，期望進一步開發可期待對表現IGF1R之腫瘤有效之IGF1R CAR-T細胞。 [解決問題之技術手段]
本發明人等考慮利用IGF1R之配體代替scFv作為標的結合域之CAR-T細胞可用作針對IGF1R表現腫瘤之過繼免疫治療劑的可能性，進行了銳意研究。結果，可知於製作使用作為天然配體之成熟IGF-1作為標的結合域之CAR-T細胞之情形時，於導入有CAR基因之T細胞中CAR表現率隨時間經過而消失，而且CAR-T細胞幾乎無法殺傷IGF1R表現腫瘤細胞。因此，本發明人等製作使用成熟IGF-1之前驅體pre-pro-IGF-1代替成熟IGF-1作為標的結合域之CAR-T細胞，結果驚奇地發現CAR表現率得以維持，抗腫瘤效果提昇。本發明人等進而發現於使用pre-pro-IGF-1之E域缺失之片段作為標的結合域之情形時，顯現出較使用野生型pre-pro-IGF-1之情形更高之CAR表現率及抗腫瘤效果，進而發現於使用pre-pro-IGF-2作為標的結合域之情形時，亦維持CAR表現率，顯現出抗腫瘤效果，從而完成了本發明。
即，本發明包括以下內容。 [1]一種聚核苷酸，其係編碼具有與類胰島素生長因子-1受體(IGF1R)結合之標的結合域、跨膜結構域及細胞內訊號傳遞域之嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor：CAR)蛋白者，且標的結合域為類胰島素生長因子(IGF)之pre-pro前驅體或其E域缺失之片段。 [2]如[1]所記載之聚核苷酸，其中上述IGF為IGF-1。 [3]如[1]或[2]所記載之聚核苷酸，其中標的結合域包含相對於序列編號4、6、8或10所表示之胺基酸序列具有至少90%之序列同一性之胺基酸序列。 [4]如[1]所記載之聚核苷酸，其中上述IGF為IGF-2。 [5]如[1]或[4]所記載之聚核苷酸，其中標的結合域包含相對於序列編號14所表示之胺基酸序列具有至少90%之序列同一性之胺基酸序列。 [6]一種載體，其包含如[1]至[5]中任一項所記載之聚核苷酸。 [7]一種基因修飾細胞，其導入有如[1]至[5]中任一項所記載之聚核苷酸、或如[6]所記載之載體。 [8]一種CAR蛋白表現細胞之製作方法，其包括將如[1]至[5]中任一項所記載之聚核苷酸、或如[6]所記載之載體導入至細胞中。 [9]一種針對與IGF1R表現細胞有關之疾病之治療劑，其包含如[7]所記載之細胞。 [10]一種醫藥組合物，其包含如[9]所記載之治療劑、及醫藥上所容許之載體。 [11]如[9]所記載之治療劑或如[10]所記載之組合物，其中與IGF1R表現細胞有關之疾病選自由白血病、多發性骨髓瘤、淋巴瘤、肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、肝癌、肝細胞癌、胰臟癌、結腸直腸癌、大腸癌、結腸癌、乳癌、子宮體癌、子宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、甲狀腺癌、腎癌、腎上腺癌、黑色素瘤、神經內分泌腫瘤、視網膜母細胞瘤、及肉瘤所組成之群。 [12]一種用以製作以IGF1R表現細胞為標的之CAR蛋白表現細胞之套組，其包含如[6]所記載之載體。 本說明書包括作為本案之優先權之基礎之日本專利申請號2022-012674號的揭示內容。 [發明之效果]
根據本發明，提供一種與表現IGF1R之標的細胞結合，發揮抗腫瘤效果之基因修飾細胞。
本發明提供一種聚核苷酸，其係編碼具有與類胰島素生長因子-1受體(IGF1R)結合之標的結合域、跨膜結構域及細胞內訊號傳遞域之嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor：CAR)蛋白者，且標的結合域為類胰島素生長因子(IGF)之pre-pro前驅體或其E域缺失之片段。
於本說明書中，「嵌合抗原受體(CAR)」係指可將標的特異性移植至T細胞(例如，初始T細胞、幹細胞記憶T細胞、中央記憶T細胞、效應記憶T細胞、或其等之組合等T細胞)等細胞之修飾受體。又，CAR亦作為人工T細胞受體、嵌合T細胞受體、或嵌合免疫受體而為人所知。於本說明書中，「CAR-T細胞」意指於細胞表面表現嵌合抗原受體(CAR)之T細胞。
於本說明書中，「域」係多肽內之區域，表示與其他區域獨立地摺疊成特定之結構之區域。
於本說明書中使用之情形時，「聚核苷酸」包含天然或合成DNA(Deoxyribonucleic Acid，去氧核糖核酸)及RNA(Ribonucleic acid，核糖核酸)、例如基因組DNA、cDNA(complementary DNA，互補DNA)、mRNA(messenger RNA，信使RNA)、rRNA(ribosomal RNA，核糖體RNA)、shRNA(small hairpin RNA，小髮夾RNA)、snRNA(small nuclear RNA，小核RNA)、snoRNA(small nucleolar RNA，小核仁RNA)、miRNA(micro RNA，微RNA)、及/或tRNA(Transfer RNA，轉運RNA)，但並不限定於該等。
於本說明書中，「編碼」係指如該領域中通常使用，規定之核苷酸序列對規定之蛋白質或(多)肽之胺基酸序列資訊進行加密，於本說明書中，於「編碼」之上下文中使用正義股及反義股兩者。
於本說明書中，「類胰島素生長因子-1受體(IGF1R)」係屬於胰島素受體家族之受體型酪胺酸激酶，包含構成配體結合域之2個細胞外α次單元、及具有激酶域之2個跨膜β次單元。IGF1R係與其配體(主要為IGF-1及IGF-2)結合，經由Ras/Raf/MEK/ERK或PI3K/Akt/mTor訊號傳遞路徑，控制各種細胞之增殖、分化、生存、代謝。
已知IGF1R於廣泛之腫瘤中表現。作為IGF1R表現腫瘤，例如可例舉：白血病、多發性骨髓瘤、及淋巴瘤等血液腫瘤；肺癌(例如小細胞肺癌、非小細胞肺癌、例如肺腺癌等)、頭頸部鱗狀細胞癌、肝癌、肝細胞癌、胰臟癌、結腸直腸癌、大腸癌、結腸癌、乳癌、子宮體癌、子宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、甲狀腺癌、腎癌、腎上腺癌、黑色素瘤、神經內分泌腫瘤、及視網膜母細胞瘤等實體腫瘤；以及肉瘤(例如尤因氏肉瘤、骨肉瘤等)。
IGF1R蛋白之胺基酸序列例如登錄為Uniprot登錄號P08069。
於本說明書中，「類胰島素生長因子結合蛋白(IGFBP)」係與IGF-1及IGF-2結合，延長其等之血液半衰期之蛋白質。IGFBP包含6種蛋白質(IGFBP1～6)，其中IGFBP3係血液中最富集存在之IGFBP(L A Bach et al., Journal of Molecular Endocrinology, 2018, 61, T11-T28)。人類IGFBP3蛋白之胺基酸序列例如登錄為Uniprot登錄號P17936-1。已知IGFBP係由各種腫瘤分泌。作為分泌IGFBP3之腫瘤，可例舉：腎癌、黑色素瘤、胰臟癌、乳癌、肺腺癌及頭頸部鱗狀細胞癌等。
於本說明書中，「類胰島素生長因子(IGF)」係與IGF1R結合，使其活化而顯現出生長促進作用之蛋白質。IGF包括IGF-1及IGF-2這2個分子種類。有報告稱，IGF-1及IGF-2均於廣泛之癌症中過度表現，與預後不良有關。作為天然存在之成熟IGF-1之胺基酸序列，例如可例舉序列編號2所表示者，作為編碼其之為了於人類細胞中表現而經密碼子最佳化之鹼基序列，例如可例舉序列編號1。又，作為天然存在之成熟IGF-2之胺基酸序列，例如可例舉序列編號12所表示者，作為編碼其之為了於人類細胞中表現而經密碼子最佳化之鹼基序列，例如可例舉序列編號11。
已知於生物體內，IGF-1及IGF-2合成為前驅體蛋白後，去除N末端及C末端部分，從而成為成熟蛋白。具體而言，已知IGF-1首先轉譯成作為自N末端側起包含訊息肽、成熟IGF-1、及E域之前驅體蛋白的pre-pro-IGF-1，其後，去除訊息肽而成為pro-IGF-1，進而藉由蛋白酶切割使E域分離，從而成為成熟IGF-1。已知IGF-2亦同樣地，轉譯成作為自N末端側起包含訊息肽、成熟IGF-2肽、及E域之前驅體蛋白的pre-pro-IGF-2，其後，去除訊息肽而成為pro-IGF-2，進而藉由蛋白酶切割使E域分離，從而成為成熟IGF-2(Brisson BK and Barton E, frontiers in ENDOCRINOLOGY, 2013, 4(42): 1-6)。
於本發明中，CAR蛋白包含與IGF1R結合之標的結合域。標的結合域對IGF1R(較佳為其細胞外配體結合域)顯現出結合性，可實現對在細胞表面上表現IGF1R之標的細胞之免疫應答。
於本發明中，可使用作為IGF1R之配體的IGF之pre-pro前驅體或其E域缺失之片段作為標的結合域。
於本說明書中，「IGF之pre-pro前驅體(配體前驅體)」意指去除N末端及C末端部分之前之包含訊息肽、成熟IGF、及E域之IGF之前驅體。IGF之pre-pro前驅體可為來自包括人類、家畜(馬、牛、綿羊、山羊、豬等)、寵物(狗、貓、兔等)、實驗動物(小鼠、大鼠、猴等)等之任意哺乳動物者，較佳為來自人類者。IGF之pre-pro前驅體包括IGF-1之pre-pro前驅體(pre-pro-IGF-1)及IGF-2之pre-pro前驅體(pre-pro-IGF-2)。
於本說明書中，IGF之pre-pro前驅體之「E域缺失之片段」(於本說明書中，亦稱為「pre前驅體」)意指藉由自IGF之pre-pro前驅體缺失(去除)E域而獲得之片段。於本說明書中，「E域」意指存在於pre-pro前驅體中之C末端之由前驅蛋白轉化酶去除之域。於本說明書中，pre-pro-IGF-1之E域例如可為自與序列編號4、6、或8之第119位之胺基酸對應之胺基酸之位置開始者。於本說明書中，pre-pro-IGF-2之E域例如可為自與序列編號14之第92位之胺基酸對應之胺基酸之位置開始者。
已知IGF-1基因含有6個外顯子，於人類中，藉由選擇性剪接而產生被稱為IGF-1 Ea、IGF-1 Eb、IGF-1 Ec之3種不同類型之mRNA變異體(Candice G. T. Tahimic, et al., frontiers in ENDOCRINOLOGY, 2013, 4(6), p. 1-14)。IGF-1 Ea、IGF-1 Eb、IGF-1 Ec mRNA係在包含外顯子1或2(編碼訊息肽)以及外顯子3及4(編碼成熟IGF)之方面共通，但C末端外顯子(編碼E域)不同，IGF-1 Ea mRNA不包含外顯子5而包含外顯子6，IGF-1 Eb mRNA不包含外顯子6而包含外顯子5，IGF-1Ec mRNA包含外顯子5及6兩者。
於本說明書中，pre-pro-IGF-1含有：包含由外顯子1編碼之訊息肽之IGF-1 Ea、IGF-1 Eb、及IGF-1 Ec(有時亦稱為1類IGF-1 Ea、IGF-1 Eb、及IGF-1 Ec)蛋白；以及包含由外顯子2編碼之訊息肽之IGF-1 Ea、IGF-1 Eb、及IGF-1 Ec(有時亦稱為2類IGF-1 Ea、IGF-1 Eb、及IGF-1 Ec)蛋白，較佳為選自1類IGF-1 Ea、IGF-1 Eb、及IGF-1 Ec蛋白中者。
於本發明中，pre-pro-IGF-1可為天然存在之全長型pre-pro-IGF-1(IGF-1 Ea、IGF-1 Eb、及IGF-1 Ec)。作為天然存在之全長型1類IGF-1 Ea，例如可例舉包含序列編號4所表示之胺基酸序列者，作為編碼其之為了於人類細胞中表現而經密碼子最佳化之鹼基序列，例如可例舉序列編號3所表示者。作為天然存在之全長型1類IGF-1 Eb，例如可例舉包含序列編號6所表示之胺基酸序列者，作為編碼其之為了於人類細胞中表現而經密碼子最佳化之鹼基序列，例如可例舉序列編號5所表示者。作為天然存在之全長型1類IGF-1 Ec，例如可例舉包含序列編號8所表示之胺基酸序列者，作為編碼其之為了於人類細胞中表現而經密碼子最佳化之鹼基序列，例如可例舉序列編號7所表示者。
於本發明中，pre-pro-IGF-1之E域缺失之片段(於本說明書中，亦稱為「IGF-1 w/oE」或「pre-IGF-1」)可為自天然存在之全長型pre-pro-IGF-1缺失E域而成者。作為此種片段，例如可例舉包含序列編號10所表示之胺基酸序列者，作為編碼其之為了於人類細胞中表現而經密碼子最佳化之鹼基序列，例如可例舉序列編號9所表示者。
於本發明中，作為標的結合域，除上述天然存在之全長型pre-pro-IGF-1或其E域缺失之片段以外，亦可使用其等之變異體，例如包含相對於序列編號4、6、8或10所表示之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%之序列同一性之胺基酸序列者。
上述天然存在之全長型pre-pro-IGF-1或其E域缺失之片段之變異體可於成熟IGF-1部分之任意位置具有胺基酸突變，例如，可於成熟IGF-1部分之任意位置具有1～10個或1～5個胺基酸突變。於本說明書中，「胺基酸突變」意指相對於天然胺基酸序列之變化，包括胺基酸序列之插入、缺失、置換、附加等。作為上述變異體可具有之成熟IGF-1部分之胺基酸突變，例如可例舉與序列編號2之第1～5位對應之區域內之1個、2個、3個、4個或5個胺基酸之缺失、插入、及/或置換，例如與序列編號2之第1～3位對應之區域內之1個、2個或3個胺基酸之缺失，較佳為與序列編號2之第1～3位對應之區域內之3個胺基酸之缺失(尤其是與序列編號2之第1～3位之胺基酸對應之3個胺基酸之缺失)。具有與序列編號2之第1～3位對應之區域內之3個胺基酸之缺失之pre-pro-IGF-1之E域缺失的片段例如可為具有序列編號27所表示之胺基酸序列者。再者，於本說明書中，「與序列編號2之第1～「x」位對應之區域」係指於與序列編號2之胺基酸序列比對之胺基酸序列中，相對於序列編號2之胺基酸序列之第1～x位之區域進行比對之區域。
如下述實施例10所示，本發明人等製作使用pre-pro-IGF-1之E域缺失之片段(IGF-1 w/oE)作為標的結合域之CAR-T細胞(IGF-1 w/oE型CAR-T細胞)、及使用去除了IGF-1 w/oE之成熟IGF-1部分(序列編號2)之第1～3位之3個胺基酸(GPE)者(IGF-1 w/oE des1-3)作為標的結合域之CAR-T細胞(IGF-1 w/oE des1-3型CAR-T細胞)，發現對於IGFBP3表現腫瘤，後者具有高於前者之抗腫瘤活性。
因此，關於使用具有與序列編號2之第1～3位之胺基酸對應之3個胺基酸之缺失之pre-pro-IGF-1或其E域缺失之片段作為標的結合域的CAR-T細胞，與使用不具有該缺失之pre-pro-IGF-1或其E域缺失之片段作為標的結合域之CAR-T細胞相比，於IGFBP3之存在下可具有較高之抗腫瘤活性。此種於IGFBP3之存在下具有較高之抗腫瘤活性之CAR-T細胞係於治療分泌IGFBP3之癌症(腎癌、黑色素瘤、胰臟癌、乳癌、肺腺癌及頭頸部鱗狀細胞癌等)之情形時尤其有用。又，由於IGFBP3存在於血液中，故於IGFBP3之存在下具有較高之抗腫瘤活性之CAR-T細胞亦於治療血癌之情形時或進行靜脈內投予之情形時尤其有用。
又，如下述實施例11所示，本發明人等發現具有上述3個胺基酸之缺失之IGF-1 w/oE des1-3具有不具有該缺失之IGF-1 w/oE之3倍以上之IGFBP3結合能力。於先前研究中，有報告稱，IGF-1對IGFBP3之結合能力因上述3個胺基酸之缺失而明顯下降(Sara VR et al., Annals New York Academy of Sciences, 1993, 692：183-91, Ballard F et al., Int. J. Biochem. Cell Biol., 1996, 28(10)：1085-1087)，因此該結果出乎意料。
進而，如下述實施例12所示，本發明人等發現IGF-1 w/oE des1-3型CAR-T細胞不僅與IGF1R結合而活化，亦藉由與IGFBP3結合而活化。
因此，認為使用具有與序列編號2之第1～3位之胺基酸對應之3個胺基酸之缺失之pre-pro-IGF-1或其E域缺失之片段作為標的結合域的CAR-T細胞不僅與IGF1R結合而活化，亦藉由與IGFBP3結合而活化，藉此於IGFBP3之存在下顯現出較高之抗腫瘤活性，但不受理論限制。
於本發明中，pre-pro-IGF-2可為天然存在之全長型pre-pro-IGF-2。作為天然存在之全長型pre-pro-IGF-2，例如可例舉包含序列編號14所表示之胺基酸序列者，作為編碼其之為了於人類細胞中表現而經密碼子最佳化之鹼基序列，例如可例舉序列編號13所表示者。
於本發明中，pre-pro-IGF-2之E域缺失之片段(於本說明書中，亦稱為「IGF-2 w/oE」或「pre-IGF-2」)可為自天然存在之全長型pre-pro-IGF-2缺失E域而成者。作為此種片段，例如可例舉包含序列編號14之第1～91位之胺基酸序列者。
於本發明中，作為標的結合域，除上述天然存在之全長型pre-pro-IGF-2或其E域缺失之片段以外，亦可使用其等之變異體，例如包含相對於序列編號14所表示之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%之序列同一性之胺基酸序列者；包含相對於序列編號14之第1～91位之胺基酸序列所表示之胺基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%之序列同一性之胺基酸序列者。
上述天然存在之全長型pre-pro-IGF-2或其E域缺失之片段之變異體可於成熟IGF-2部分之任意位置具有胺基酸突變，例如，可於成熟IGF-2部分之任意位置具有1～10個或1～5個胺基酸突變。作為上述變異體可具有之成熟IGF-2部分之胺基酸突變，例如可例舉與序列編號12之第1～6位對應之區域內之1個、2個、3個、4個、5個、或6個胺基酸之缺失、插入、及/或置換。再者，於本說明書中，「與序列編號12之第1～6位對應之區域」係指於與序列編號12之胺基酸序列比對之胺基酸序列中，相對於序列編號12之胺基酸序列之第1～6位之區域進行比對之區域。
於在標的細胞中表現包含上述IGF之pre-pro前驅體或其片段作為標的結合域之CAR之情形時，於細胞內去除IGF之pre-pro前驅體或其片段中之訊息肽後，CAR可能呈現於細胞表面，於本說明書中，方便起見，將包含訊息肽之上述IGF之pre-pro前驅體或其片段稱為「標的結合域」。
於本發明中，標的結合域可為其本身與IGF1R結合者。又，標的結合域亦可為自其去除訊息肽後與IGF1R結合者。
標的結合域或去除了訊息肽之標的結合域對IGF1R之結合能力意味著KD值例如為100 nM以下，較佳為10 nM以下，更佳為5 nM以下。該結合能力可為與抗原和抗體之結合能力相比相對較弱之結合。
於本發明中，標的結合域可為與使用成熟IGF作為標的結合域之情形相比，使導入有編碼包含其之CAR之聚核苷酸之細胞集群中之CAR表現率增加者。於本說明書中，細胞集群中之「CAR表現率」意指於細胞表面表現CAR之特定之細胞(例如T細胞)於細胞集群中之比率。CAR表現率例如可為基因(編碼CAR之聚核苷酸)導入1～10天後(例如，1、3、6、或10天後)之CAR表現率。CAR表現率例如可藉由如下方式確定：使用檢測T細胞標記之螢光標記抗體及檢測CAR之螢光標記抗體對細胞集群進行染色，進行流式細胞分析，測定T細胞標記及CAR兩者為陽性之細胞率作為CAR表現率。於導入有編碼包含某一標的結合域之CAR之聚核苷酸之細胞集群中的CAR表現率與導入有編碼除使用成熟IGF代替上述標的結合域以外其餘相同之CAR之聚核苷酸之細胞集群中的CAR表現率相比增加(例如增加10%以上，統計學上顯著增加)之情形時，可判斷與使用成熟IGF作為標的結合域之情形相比，上述標的結合域使導入有編碼包含其之CAR之聚核苷酸之細胞集群中的CAR表現率增加。
於本發明中，CAR蛋白可視情形於細胞外存在之標的結合域與跨膜結構域之間包含「細胞外間隔域」。細胞外間隔域較理想為促進CAR與抗原之結合，提高向細胞內之訊號傳遞之序列。例如，可使用抗體之Fc片段、或者其片段或衍生物、抗體之鉸鏈區、或者其片段或衍生物、抗體之CH2區、抗體之CH3區、人工間隔序列、或者其等之組合。
於本發明之一態樣中，作為細胞外間隔域，可使用(i)Ig(immunoglobulin，免疫球蛋白)G4之鉸鏈、CH2、及CH3區；(ii)IgG4之鉸鏈區；(iii)IgG4之鉸鏈及CH2；(iv)CD8a之鉸鏈區；(v)IgG1之鉸鏈、CH2、及CH3區；(vi)IgG1之鉸鏈區；或(vii)IgG1之鉸鏈及CH2；或其等之組合。例如，可適宜地使用具有以下之胺基酸序列(序列編號15)者作為IgG1之鉸鏈區，但並不限定於此。
又，可適宜地使用具有序列編號16所表示之胺基酸序列者作為IgG1之CH2區，可適宜地使用具有序列編號17所表示之胺基酸序列者作為CH3區。
作為較佳之態樣，細胞外間隔域可使用人類IgG1之鉸鏈、CH2、及CH3區或其一部分。
又，作為較佳之態樣，細胞外間隔域可使用(i)單獨之人類IgG1之鉸鏈區(序列編號15)，(ii)人類IgG1之鉸鏈區(序列編號15)及CH2區(序列編號16)及CH3區(序列編號17)之組合，(iii)人類IgG1之鉸鏈區(序列編號15)及CH3區(序列編號17) 之組合，(iv)單獨之CH3區(序列編號17)。
作為本發明之一態樣，可使用式(G4S)n所表示之間隔序列作為細胞外間隔域所使用之人工間隔序列。式中，n為1～10，較佳為n＝3。具有此種間隔序列之間隔子有時亦被稱為肽連接子。可將該領域中適宜地使用之肽連接子適當用於本發明中。於該情形時，肽連接子之構成及鏈長可於不會損害所獲得之CAR蛋白之功能之範圍內選擇適當者。
細胞外間隔域並無特別限定，可自以上所例示者中適當選擇，或基於該領域中之技術常識進而進行修飾而用於本發明。
細胞外間隔域可以可存在於標的結合域與跨膜結構域之間之方式，將編碼各域之胺基酸序列之鹼基序列連結並插入至載體，於宿主細胞中表現。或者，細胞外間隔域亦可將預先製作之編碼質體CAR蛋白之聚核苷酸作為模板進行修飾。
細胞外間隔域之修飾例如於考慮導入有編碼CAR之聚核苷酸之CAR-T細胞於宿主細胞中之CAR基因表現率之提昇、訊號傳遞、細胞之老化、在腫瘤中之分佈、抗原識別或對活體內活性之影響之情形時有用。
於本發明中，CAR蛋白包含：細胞外域，其包含標的結合域及任意細胞外間隔域；跨膜結構域；及細胞內域，其包含細胞內訊號傳遞域及任意共刺激域。如該領域中周知，細胞外域及細胞內域均為親水性域，相對於此，「跨膜結構域」係對構成細胞膜之脂質雙層具有親和性之域。
關於跨膜結構域，CAR蛋白可存在於細胞膜上，並無特別限定，只要不會損害標的結合域及細胞內訊號傳遞域之功能即可，亦可能有來自與下述共刺激域相同之蛋白質之多肽發揮作為跨膜結構域之功能的情形。跨膜結構域例如可使用CD28、CD3ε、CD8α、CD3、CD4或4-1BB等跨膜結構域。例如，跨膜結構域可使用人類CD28(Uniprot No.：P10747(153-179))。具體而言，可適宜地使用具有由NCBI(National Center for Biotechnology Information，美國生物技術資訊中心)登錄號：NM_006139.3 (679-759)之核苷酸序列所編碼之胺基酸序列者作為跨膜結構域。
CAR蛋白可視情形包含「共刺激域」。共刺激域係與共刺激配體特異性地結合，藉此，介導CAR-T細胞之增殖、細胞激素產生、功能分化、標的細胞之細胞死亡之類的細胞之共刺激應答，但並不限定於該等。作為共刺激域，例如可使用CD27、CD28、4-1BB (CD137)、CD134 (OX40)、Dap10、CD27、CD2、CD5、CD30、CD40、PD-1、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、TNFR-1、TNFR-II、Fas、Lck。例如，共刺激域可使用人類CD28(Uniprot No. ：P10747(180-220))或4-1BB(GenBank：U03397.1)等。具體而言，可適宜地使用具有由NCBI登錄號：NM_006139.3 (760-882)之核苷酸序列所編碼之胺基酸序列者作為共刺激域。
於跨膜結構域及共刺激域均使用來自人類CD28者之情形時，例如可使用具有序列編號18所表示之胺基酸序列者。
CAR蛋白包含「細胞內訊號傳遞域」。細胞內訊號傳遞域傳遞發揮免疫細胞之效應功能所需之訊號。作為細胞內訊號傳遞域，例如可使用人類CD3ζ鏈、FcγRIII、FcεRI、Fc受體之細胞質末端、具有免疫受體酪胺酸活化基序(ITAM)之細胞質受體或其等之組合。例如，細胞內訊號傳遞域可使用人類CD3ζ鏈(例如NCBI登錄號NM_000734.3之核苷酸299-637)。具體而言，可適宜地使用具有序列編號19所表示之胺基酸序列者作為細胞內訊號傳遞域。
基於促進CAR蛋白分泌之目的，於蛋白質之N末端適當包含轉譯時或轉譯後引導蛋白質之轉移之前導序列。本發明中可適宜地使用之有用之前導序列之例可例舉：人類免疫球蛋白(Ig)重鏈訊息肽、CD8α訊息肽、或人類GM-CSF受體α訊息肽，但並不限定於該等。Ig重鏈訊息肽例如可適宜地使用來自IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgM者等。
於本發明中，CAR蛋白可為對表現該CAR蛋白之細胞賦予對IGF1R表現細胞之細胞溶解活性者。
目標聚核苷酸可按照常規方法容易地製作。可自表示各域之胺基酸序列之NCBI RefSeq ID或GenBank之登錄號獲取編碼胺基酸序列之鹼基序列，可使用標準分子生物學及/或化學程序製作本發明之聚核苷酸。例如，可基於該等鹼基序列合成核酸，又，可自cDNA庫，將使用聚合酶鏈反應(PCR)所獲得之DNA片段組合而製作本發明之聚核苷酸。
因此，編碼CAR蛋白之聚核苷酸可將編碼上述各域之聚核苷酸連結而製作，可藉由將該聚核苷酸導入至適當之細胞中，而製作基因修飾細胞。又，CAR蛋白亦可藉由如下方式製作：以編碼除標的結合域以外之構成成分相同之既有之CAR蛋白之聚核苷酸作為模板，按照常規方法，重組標的結合域。
進而，可根據目的，以既有之編碼CAR蛋白之聚核苷酸作為模板，使用反向PCR(iPCR)法等，對1個以上之域、例如細胞外間隔域進行修飾。細胞外間隔域之修飾技術例如記載於Oncoimmunology, 2016, Vol.5, No.12, e1253656等中。
用以製作基因修飾細胞之聚核苷酸之導入方法並無特別限定，只要為通常使用者即可。於使用載體導入之情形時，作為可使用之載體，並無特別限定，例如可例舉：慢病毒載體、反轉錄病毒載體、泡沫病毒載體、腺相關病毒載體等。又，聚核苷酸之導入可藉由基於轉位子法之非病毒性方法實施。於轉位子法中，可使用質體轉位子，可適宜地使用睡美人轉位子系統(例如記載於Huang X, Guo H, et al. Mol Ther. 2008; 16: 580-9；Singh H, Manuri PR, et al. Cancer Res. 2008; 68: 2961-71；Deniger DC, Yu J, et al. PLoS One. 2015; 10: e0128151；Singh H, Moyes JS, et al. Cancer Gene Ther. 2015; 22: 95-100；Hou X, Du Y, et al. Cancer Biol Ther. 2015; 16: 8-16；Singh H, Huls H, et al. Immunol Rev. 2014; 257: 181-90；及Maiti SN, Huls H, et al. J Immunother. 2013; 36: 112-23中)或piggyBac轉位子系統(記載於Nakazawa Y, Huye LE, et al. J Immunother. 2009; 32: 826-36；Galvan DL, Nakazawa Y, et al. J Immunother. 2009; 32: 837-44；Nakazawa Y, Huye LE, et al. Mol Ther. 2011; 19: 2133-43；Huye LE, Nakazawa Y, et al. Mol Ther. 2011; 19: 2239-48；Saha S, Nakazawa Y, et al. J Vis Exp. 2012; (69): e4235；Nakazawa Y, Saha S, et al. J Immunother. 2013; 36: 3-10； Saito S, Nakazawa Y, et al. Cytotherapy. 2014; 16: 1257-69；及Nakazawa et al. Journal of Hematology & Oncology (2016) 9:27中)。
於使用piggyBac轉位子系統之情形時，典型地，導入(轉染)攜帶編碼piggyBac轉位酶之基因之質體(於本說明書中記載為piggyBac質體)、及具備編碼CAR蛋白之聚核苷酸被piggyBac反向重複序列夾著之結構之質體。轉染時，可利用電穿孔法(electroporation)、核轉染法、脂轉染法、磷酸鈣法等各種方法。兩種質體中可包含多聚腺苷酸附加前導序列、報導基因、選擇標記基因、增強子序列等。
用於電穿孔法之裝置並無限定，例如可使用4D-Nucleofector(Lonza Japan股份有限公司)、NEPA21(Nepa Gene股份有限公司)、Maxcyte GT(Maxcyte, Inc)等，可按照各者之使用說明書進行操作。
可藉由上述方法，將基因導入至1×10 6～2×10 7個之範圍之細胞中。
作為供導入上述聚核苷酸之細胞，可使用來自哺乳動物、例如人類之細胞或來自猴、小鼠、大鼠、豬、牛、狗等非人類哺乳動物之T細胞或包含T細胞之細胞集群，較佳為使用釋放細胞毒殺性蛋白(穿孔素、顆粒酶等)之細胞。具體而言，例如可使用含有T細胞、T細胞之前驅細胞(造血幹細胞、淋巴細胞前驅細胞等)、NK-T細胞之細胞集群。進而，作為可分化成該等細胞的細胞，包含ES(Embryonic stem，胚胎幹)細胞、iPS(induced Pluripotent Stem，誘導性多能幹)細胞等各種幹細胞。T細胞包括CD8陽性T細胞、CD4陽性T細胞、控制性T細胞、細胞毒殺性T細胞、或腫瘤浸潤淋巴細胞。含有T細胞及T細胞之前驅細胞之細胞集群中包含PBMC(Peripheral blood mononuclear cell，周邊血液單核細胞)。上述細胞可為采自生物體者、將其進行擴大培養所得者或建立成細胞株者之任一者。於將所製造之表現CAR之細胞或自該細胞分化之細胞移植至生物體中之情形時，較理想為將核酸導入至該生物體本身或自同種生物體採取之細胞中。
為了獲得本發明之基因修飾細胞而導入聚核苷酸，作為過繼免疫療法所使用之T細胞，可使用可期待持續性抗腫瘤效果之T細胞、例如幹細胞記憶T細胞。幹細胞記憶T細胞之解析可按照常規方法，例如按照(Yang Xu, et al. Blood. 2014; 123:3750-3759)等之記載而容易地確認。
作為實施態樣之一，幹細胞記憶T細胞例如可使用作為CD45R0-、CD62L+、CD45RA+及CCR7+之T細胞。
又，本發明提供一種包含上述本發明之聚核苷酸之載體。
又，本發明提供一種導入有上述本發明之聚核苷酸、或上述本發明之載體之基因修飾細胞。本發明之基因修飾細胞係於細胞膜上表現使用IGF之pre-pro前驅體或其E域缺失之片段作為標的結合域之CAR蛋白。該標的結合域包含訊息肽及成熟IGF，於去除訊息肽之前或之後，不僅可與IGF1R結合，亦可與IGF1R/INSR-A混合受體及IGF1R/INSR-B混合受體結合。因此，本發明之基因修飾細胞與僅以IGF1R表現腫瘤細胞為標的之藥劑相比，具有強力之抗腫瘤效果。
進而，本發明提供一種CAR蛋白表現細胞之製作方法，其包括將上述本發明之聚核苷酸、或上述本發明之載體導入至細胞中。
CAR蛋白表現細胞之培養、擴增並無特別限定，例如可如上所述，將編碼CAR蛋白之聚核苷酸導入至細胞中之後，基於CAR蛋白表現細胞之活化等目的，對細胞施加非特異性或CAR特異性刺激。細胞刺激之方法並無限定，例如，作為非特異性細胞刺激，可使用基於抗CD3抗體及/或抗CD28抗體之刺激，作為CAR特異性刺激，可使用基於在K562等腫瘤細胞株中表現與CAR結合之抗原分子或共刺激因子之人工抗原呈現細胞(aAPCs)的CAR特異性刺激等。此處之培養條件並無特別限定，例如較佳為於37℃、5%CO 2下培養1～10天。
於上述本發明之方法中，向細胞中之導入並無限定，較佳為藉由轉位子法進行。又，作為轉位子法，可使用上述轉位子系統、及適合本發明之其他系統之任一者，並無特別限定，藉由使用piggyBac法可適宜地實施本發明之方法。
於非特異性刺激之另一態樣中，可藉由一種或複數種病毒肽抗原對包含T細胞之細胞集群施加刺激後，藉由常規方法對病毒增殖能力進行不活化處理，將所獲得之細胞作為餵養細胞，促進導入有CAR之細胞之活化。所使用之病毒肽抗原例如可使用AdV抗原肽混合物、CMV抗原肽混合物或EBV抗原肽混合物、或者其等之組合。
作為特異性刺激之另一態樣，可例舉如WO 2020/085480所記載，將未成熟樹狀細胞與CAR表現細胞共培養，該未成熟樹狀細胞係藉由將來自與CAR表現細胞所來自之個體相同之個體的PBMC，於含有人類IL(Interleukin，介白素)-4及GM-CSF(granulocyte macrophage colony stimulating factor，顆粒球巨噬細胞群落刺激因子)之培養基中進行培養而製作。
又，基於提高細胞之存活率/增殖率之目的，可於一種或複數種細胞激素之存在下進行，例如較佳為於IL-7及IL-15等細胞激素之存在下進行培養。
進而，本發明提供一種用以製作以IGF1R表現細胞為標的之CAR蛋白表現細胞之套組，其包含上述本發明之載體。本發明之套組中可適當包含製作CAR蛋白表現細胞所需之試劑、緩衝液、反應容器、使用說明書等。本發明之套組可適宜地用於製作上述本發明之基因修飾細胞。
本發明之細胞係藉由對在表面表現IGF1R之標的細胞引起受體特異性免疫應答，而將訊號傳遞至細胞內，使其活化。表現CAR之細胞之活化根據宿主細胞之種類或CAR之細胞內域而不同，但例如可以細胞激素(例如IFN(Interferon，干擾素)-γ、IL-2等)之釋放、細胞增殖率之提昇、細胞表面分子之變化等為指標來確認。細胞毒殺性蛋白之釋放(穿孔素、顆粒酶等)會導致表現受體之細胞受到破壞。
本發明之基因修飾細胞可用作針對與IGF1R表現細胞有關之疾病之治療劑。因此，本發明提供一種針對與IGF1R表現細胞有關之疾病之治療劑，其包含本發明之基因修飾細胞。作為可期待藉由本發明之治療劑治療之疾病，並無限定，只要為對該細胞顯現出敏感性之疾病即可，例如可例舉：與於細胞膜上表現IGF1R之細胞相關之疾病、例如癌症，例如白血病、多發性骨髓瘤、淋巴瘤等血液腫瘤；肺癌(例如小細胞肺癌、非小細胞肺癌、例如肺腺癌等)、頭頸部鱗狀細胞癌、肝癌、肝細胞癌、胰臟癌、結腸直腸癌、大腸癌、結腸癌、乳癌、子宮體癌、子宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、甲狀腺癌、腎癌、腎上腺癌、黑色素瘤、神經內分泌腫瘤、及視網膜母細胞瘤等實體腫瘤；以及肉瘤(例如尤因氏肉瘤、骨肉瘤等)。
本發明之治療劑之一態樣係針對上述腫瘤之類的IGF1R表現腫瘤細胞之抗癌劑。本發明之治療劑或抗癌劑可單獨使用，亦可與不同機制之藥劑及/或治療組合使用。
因此，本發明之治療劑可單獨或與其他有效成分組合而製成醫藥組合物之形態。本發明之治療劑或醫藥組合物可局部投予或全身投予。作為具體之投予形態，並無限定，例如可例舉：靜脈內投予、腫瘤內投予、及脊椎內投予等。例如於治療白血病之情形時，投予形態較佳為靜脈內投予。於醫藥組合物中，除本發明之治療劑及其他有效成分以外，根據投予形態，可包含該領域中通常使用之載體、賦形劑、緩衝劑、穩定劑等。於本發明之一態樣中，醫藥組合物例如可包含本發明之治療劑及醫藥上所容許之載體。
本發明之治療劑之投予量根據患者之體重、年齡、疾病之嚴重程度等而變動，並無特別限定，例如可於10 4～10 10CAR陽性細胞數/kg體重之範圍內1天1次～數次、每2天、每3天、每1週、每2週、每個月、每2個月、每3個月進行投予。
作為投予本發明之治療劑或醫藥組合物之對象，可例舉包括人類、家畜(馬、牛、綿羊、山羊、豬等)、寵物(狗、貓、兔等)、實驗動物(小鼠、大鼠、猴等)等之任意哺乳動物，較佳為人類。
本發明之治療劑或醫藥組合物中所包含之CD4+ CAR-T細胞及/或CD8+ CAR-T細胞中之CD45RA+CD62L+細胞(幹細胞記憶T細胞)例如可為70%以上或80%以上。
本發明進而提供一種與IGF1R表現細胞有關之疾病之治療方法，其包括將上述本發明之基因修飾細胞、治療劑或醫藥組合物以治療有效量投予至患者，上述與IGF1R表現細胞有關之疾病例如為與於細胞膜上表現IGF1R之細胞有關之疾病，例如白血病、多發性骨髓瘤、淋巴瘤等血液腫瘤、肺癌(例如小細胞肺癌、非小細胞肺癌、例如肺腺癌等)、頭頸部鱗狀細胞癌、肝癌、肝細胞癌、胰臟癌、結腸直腸癌、大腸癌、結腸癌、乳癌、子宮體癌、子宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、甲狀腺癌、腎癌、腎上腺癌、黑色素瘤、神經內分泌腫瘤、及視網膜母細胞瘤等實體腫瘤、以及肉瘤(例如尤因氏肉瘤、骨肉瘤等)等癌症。治療有效量及投予方案可考慮如上所述之各種因素而適當確定。 [實施例]
以下，使用實施例對本發明更具體地進行說明。但是，本發明之技術範圍並不限定於該等實施例。
[實施例1 成熟IGF-1、IGF-1 Ea、IGF-1 Eb、IGF-1 Ec、或IGF-1 w/oE型CAR表現質體之製作] 設計使用成熟IGF-1、pre-pro-IGF-1(IGF-1 Ea、IGF-1 Eb、IGF-1 Ec)、或pre-pro-IGF-1之E域缺失之片段(IGF-1 w/oE)作為標的結合域之CAR(分別為成熟IGF-1、IGF-1 Ea、IGF-1 Eb、IGF-1 Ec、IGF-1 w/oE型CAR)(圖1)。
藉由國際公開第2020/085480號中所記載之方法製作用以表現其等之質體(分別為成熟IGF-1、IGF-1 Ea、IGF-1 Eb、IGF-1 Ec、IGF-1 w/oE型CAR表現質體)。
將所製作之各質體之載體圖示於圖2～6。
成熟IGF-1型CAR表現質體(序列編號20)包含CAR構築體，該CAR構築體包含編碼前導序列(序列編號20之第30～86位)、人類成熟IGF-1(序列編號20之第87～296位)、間隔子(序列編號20之第297～1004位)、CD28(序列編號20之第1005位～第1208位)、及CD3ζ(序列編號20之第1209位～第1547位)之鹼基序列(圖2)。
IGF-1 Ea、Eb、Ec、w/oE型CAR表現質體(分別為序列編號21、22、23、24)除分別包含編碼人類IGF-1 Ea、Eb、Ec、w/oE代替人類成熟IGF-1之鹼基序列以外，與上述成熟IGF-1型CAR表現質體相同(圖3～6)。
將上述CAR表現質體中所使用之人類成熟IGF-1、IGF-1 Ea、Eb、Ec、w/oE之鹼基序列分別示於序列編號1、3、5、7、9。又，將由其等所編碼之胺基酸序列分別示於序列編號2、4、6、8、10。
[實施例2 成熟IGF-1型CAR-T細胞及IGF-1 Ea型CAR-T細胞之培養、擴增] 使用實施例1中所製作之CAR表現質體，製作使用成熟IGF-1或IGF-1 Ea作為標的結合域之CAR-T細胞(分別為成熟IGF-1型CAR-T細胞及IGF-1 Ea型CAR-T細胞)，進行培養、擴增。
＜2-1 PBMC之單離(Day 0)＞ 自健康志願者供體之末梢血液，使用Ficoll-PaquePlus(GE Healthcare，Chicago，IL)單離周邊血液單核細胞(PBMC)。
＜2-2 基因導入及培養(Day 0～3)＞ 對上述2-1中所單離之PBMC 2×10 7個加入添加有實施例1中所製作之CAR表現質體(成熟IGF-1型CAR表現質體或IGF-1 Ea型CAR表現質體)7.5 μg、Super PiggyBac轉位酶表現載體(Super PiggyBac Transposase Expression Vector，System Biosciences)7.5 μg、Supplement 1之P3原代細胞Nucleofector TM溶液(Lonza，Basel，Switzerland)100 μl，使用4D-Nucleofector裝置(program FL-115)進行電穿孔(Day 0)。
使經電穿孔之PBMC懸浮於含有10 ng/mL人類IL-7(Miltenyi Biotec，BergischGladbach，Germany)、5 ng/mL人類IL-15(Miltenyi Biotec，BergischGladbach，Germany)及5%人工血清(不含動物成分之人工血清，Cell Science & Technology Institute Inc., Japan)之ALyS TM705培養液(Cell Science and Technology Institute Inc., Japan)中，接種於24孔板，於37℃、5%CO 2下培養3天(Day 0～3)。
＜2-3 未成熟樹狀細胞之製作(Day 0～3)＞ 使上述2-1中所單離之PBMC 3×10 6個懸浮於含有10 ng/mL人類IL-4及10 ng/mL人類GM-CSF之ALyS TM705培養液中，接種於G-REX R6孔細胞培養板(Wilson Wolf, Saint Paul，MN)，於37℃、5%CO 2下培養3天(Day 0～3)。
＜2-4 藉由未成熟樹狀細胞來刺激及培養基因導入細胞(Day 3～10)＞ 自含有上述2-3中培養3天之未成熟樹狀細胞之G-REX R細胞培養板去除上清液，添加含有10 ng/mL人類IL-7、5 ng/mL人類IL-15及5%人工血清(不含動物成分之人工血清)之ALyS TM705培養液。於該G-REX R細胞培養板加入上述2-2中培養3天之基因導入細胞(Day 3)，進而繼續培養7天。培養期間，培養基每3～4天更換一半，以最終濃度分別成為10 ng/mL、5 ng/mL之方式添加IL-7及IL-15。
＜2-5 對照T細胞之製作(Day 0～10)＞ 使上述2-1中所單離之PBMC 1.5×10 6個懸浮於含有5 ng/mL之IL-15及5%人工血清之ALyS TM705培養液中，接種於經抗CD3抗體及抗CD28抗體(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)塗佈之24孔未處理培養板，於37℃、5%CO 2下開始培養(Day 0)。
於培養開始後第2天(Day 2)，轉移至24孔處理培養板，進而繼續培養8天。培養期間，培養基每3～4天進行更換。
[實施例3 成熟IGF-1型CAR-T細胞及IGF-1 Ea型CAR-T細胞中之CAR表現率之評價(Day 1、3、6及10)] 藉由流式細胞分析對實施例2中所獲得之成熟IGF-1型CAR-T細胞及IGF-1 Ea型CAR-T細胞中之CAR表現率進行評價。
將實施例2中培養至基因導入後第1、3、6及10天(Day 1、3、6及10)之成熟IGF-1型CAR-T細胞及IGF-1 Ea型CAR-T細胞藉由FITC(fluorescein isothiocyanate，螢光異硫氰酸鹽)標記抗人類IgG抗體、及APC標記抗CD3抗體進行染色。作為FITC標記抗人類IgG抗體，使用螢光素(FITC) AffiniPure F(ab') 2片段山羊抗人類IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch Inc. West Grove，PA，USA)。作為APC標記抗CD3抗體，使用APC標記抗人CD3抗體(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)。FITC標記抗人類IgG抗體可與CAR之間隔子部分結合，檢測CAR表現細胞。APC標記抗CD3抗體可檢測T細胞。
將經染色之細胞置於流式細胞儀BD Accuri TMC6 Plus(BD Biosciences San Jose，CA)，使用Flowjo(BD Biosciences San Jose，CA)進行解析，測定CAR陽性CD3陽性細胞率作為CAR表現率。
將結果示於圖7。 於成熟IGF-1型CAR-T細胞中，於基因導入第二天(Day 1)可見較高之CAR表現率，但於培養中CAR表現率階段性地下降，於基因導入10天後(Day 10)CAR之表現消失。
另一方面，於IGF-1 Ea型CAR-T細胞中，於基因導入第二天(Day 1)可見高於成熟IGF-1型CAR-T細胞之CAR表現率，於基因導入6天後(Day 6)為止可見表現率階段性地下降，但於基因導入10天後(Day 10)之時點CAR表現率維持在20%以上。
該等結果顯示，藉由使用pre-pro-IGF-1而非成熟IGF-1作為標的結合域來製作CAR-T細胞，可獲得CAR表現率得到改善之CAR-T細胞。
[實施例4 成熟IGF-1型CAR-T細胞及IGF-1 Ea型CAR-T細胞之抗腫瘤細胞活性之比較] 為了對實施例2中所製作之成熟IGF-1型CAR-T細胞及IGF-1 Ea型CAR-T細胞之抗腫瘤細胞活性進行評價，進行CAR-T細胞與腫瘤細胞之共培養試驗。
回收實施例2中培養至Day 10天之CAR-T細胞及對照T細胞，於不包含細胞激素之含有5%人工血清之ALyS TM705培養基中進行培養。
於培養開始2天後，將作為腫瘤細胞(目標(T))之人類急性單核球性白血病細胞株THP-1(美國典型培養物保藏中心)0.5×10 6個添加至24孔板之各孔中。繼而，將所培養之上述CAR-T細胞或對照T細胞(效應細胞(E))以E：T比成為4：1、2：1、1：1或1：2之方式添加至上述24孔板之孔中，於37℃、5%CO 2下進行共培養。作為培養液，使用添加有10%FBS(Fetal Bovine Serum，胎牛血清)之RPMI(Roswell Park Memorial Institute，羅斯韋爾帕克紀念研究所)1640培養基。
於共培養開始4天後回收細胞，使用APC標記抗CD3抗體(檢測T細胞)、FITC標記抗CD33抗體(檢測腫瘤細胞)、及7-胺基放射菌素D(7-Amino-Actinomycin D，7-AAD)(檢測死細胞)進行染色。作為FITC標記抗CD33抗體，使用FITC標記抗人CD33抗體(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)，作為APC標記抗CD3抗體，使用APC標記抗人CD3抗體(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)。
將經染色之細胞置於流式細胞儀BD Accuri TMC6 Plus(BD Biosciences San Jose，CA)，使用Flowjo(BD Biosciences San Jose，CA)進行解析。
將結果示於圖8～10。 IGF-1 Ea型CAR-T細胞(圖9)係於所試驗之所有E：T比下，與對照T細胞(圖8)相比腫瘤細胞率(由CD3陰性CD33陽性之細胞率表示)下降，顯現出腫瘤細胞之殺傷能力。另一方面，成熟IGF-1型CAR-T細胞(圖10)係於1：1及1：2之E：T比下，與對照T細胞(圖8)相比腫瘤細胞率未下降，未顯現出腫瘤細胞之殺傷能力。
該等結果顯示，藉由使用pre-pro-IGF-1而非成熟IGF-1作為標的結合域來製作CAR-T細胞，可獲得具有更高之抗腫瘤細胞活性之CAR-T細胞。
[實施例5 IGF-1 Ea、IGF-1 Eb、IGF-1 Ec、IGF-1 w/oE型CAR-T細胞之培養、擴增及CAR表現率、抗腫瘤細胞活性之評價] ＜5-1 CAR-T細胞之培養、擴增＞ 使用實施例1中所製作之CAR表現質體，藉由與實施例2相同之方法，製作使用IGF-1 Ea、IGF-1 Eb、IGF-1 Ec、IGF-1 w/oE作為標的結合域之CAR-T細胞(分別為IGF-1 Ea、IGF-1 Eb、IGF-1 Ec、IGF-1 w/oE型CAR-T細胞)，進行培養、擴增。同時，藉由與實施例2相同之方法培養對照T細胞(經抗CD3抗體及抗CD28抗體活化之T細胞)。
＜5-2 CAR表現率之評價＞ 按照實施例3中所記載之方法，藉由流式細胞分析對5-1中培養至基因導入後第10天(Day 10)之IGF-1 Ea、IGF-1 Eb、IGF-1 Ec、IGF-1 w/oE型CAR-T細胞中之CAR表現率進行評價。
將結果示於圖11。 IGF-1 Ea、IGF-1 Eb、IGF-1 Ec、IGF-1 w/oE型CAR-T細胞均於第10天維持超過15%之高CAR表現率。尤其是，IGF-1 w/oE型CAR-T細胞係於4種CAR-T細胞中顯現出最高之CAR表現率。
IGF-1 w/oE型CAR-T細胞係使用自pre-pro-IGF1缺失E域而成之肽(即，僅包含訊息肽域及成熟IGF-1域之肽)作為CAR-T之標的結合域。因此，本實施例之實驗結果顯示，藉由使用pre-pro-IGF-1之訊息肽及成熟IGF-1部分作為標的結合域來製作CAR-T細胞，可獲得CAR表現率得到改善之CAR-T細胞；E域對於改善CAR表現率而言並非必須者。
＜5-3 抗腫瘤細胞活性之評價＞ 為了對5-1中所製作之IGF-1 Ea、IGF-1 Eb、IGF-1 Ec、IGF-1 w/oE型CAR-T細胞之抗腫瘤細胞活性進行評價，藉由與實施例4相同之方法，進行CAR-T細胞與腫瘤細胞之共培養試驗。
回收5-1中培養至Day 10之CAR-T細胞及對照T細胞，於不包含細胞激素之含有5%人工血清之ALyS TM705培養基中進行培養。
於培養開始2天後，將CAR-T細胞或對照T細胞以E：T比成為2：1、1：1或1：2之方式添加至腫瘤細胞中，除此以外，以與實施例4相同之方式進行共培養及免疫染色。
為了將T細胞數及腫瘤細胞數定量化，於經染色之細胞中添加CountBright絕對計數珠(Invitrogen，Carlsbad，CA)後，置於流式細胞儀BD Accuri TMC6 Plus(BD Biosciences San Jose，CA)，使用Flowjo(BD Biosciences San Jose，CA)進行解析。
將結果示於圖12及13。 IGF-1 Ea、IGF-1 Eb、IGF-1 Ec、IGF-1 w/oE型CAR-T細胞均於所試驗之所有共培養比下顯現出顯著之腫瘤細胞數減少效果。尤其是IGF-1 w/oE型CAR-T細胞於4種CAR-T細胞中顯現出最強之腫瘤抑制效果(圖12)。
IGF-1 Ea、IGF-1 Eb、IGF-1 Ec、IGF-1 w/oE型CAR-T細胞均於共培養後增加。尤其是IGF-1 w/oE型CAR-T細胞顯著增加(圖13)。
該等結果顯示，藉由使用pre-pro-IGF-1之訊息肽及成熟IGF-1部分作為標的結合域來製作CAR-T細胞，顯示可獲得具有更高之抗腫瘤細胞活性之CAR-T細胞；E域對於CAR-T細胞之抗腫瘤細胞活性而言並非必須者。
[實施例6 pre-pro-IGF-2型CAR表現質體之製作] 藉由國際公開第2020/085480號中所記載之方法製作用以表現使用pre-pro-IGF-2作為標的結合域之CAR之質體(pre-pro-IGF-2型CAR表現質體)。
將所製作之質體之載體圖示於圖14。 pre-pro-IGF-2型CAR表現質體(序列編號25)包含CAR構築體，該CAR構築體包含編碼前導序列(序列編號25之30～86)、人類pre-pro-IGF-2(序列編號25之第87～626位)、間隔子(序列編號25之第627～1334位)、CD28(序列編號25之第1335～1538位)、及CD3ζ(序列編號25之第1539～1877位)之鹼基序列(圖14)。
將上述CAR表現質體中所使用之pre-pro-IGF-2之鹼基序列示於序列編號13。又，將由其編碼之胺基酸序列示於序列編號14。
[實施例7 pre-pro-IGF-2型CAR-T細胞之培養、擴增及CAR表現率、抗腫瘤細胞活性之評價] ＜7-1 CAR-T細胞之培養、擴增＞ 使用實施例6中所製作之CAR表現質體，藉由與實施例2相同之方法，製作使用pre-pro-IGF-2作為標的結合域之CAR-T細胞(pre-pro-IGF-2型CAR-T細胞)，進行培養、擴增。同時，藉由與實施例2相同之方法培養對照T細胞(經抗CD3抗體及抗CD28抗體活化之T細胞)。
＜7-2 CAR表現率之評價＞ 按照實施例3中所記載之方法，藉由流式細胞分析對7-1中培養至基因導入後第10天(Day 10)之pre-pro-IGF-2型CAR-T細胞中之CAR表現率進行評價。
將結果示於圖15。 pre-pro-IGF-2型CAR-T細胞於Day 10顯現出較高之CAR表現率(14.5%)。該結果顯示，藉由使用pre-pro-IGF-2作為標的結合域來製作CAR-T細胞，可獲得CAR表現率得到維持之CAR-T細胞。
＜7-3 抗腫瘤活性之評價＞ 為了對7-1中所製作之pre-pro-IGF-2型CAR-T細胞之抗腫瘤細胞活性進行評價，藉由與實施例4相同之方法，進行CAR-T細胞與腫瘤細胞之共培養試驗。
回收7-1中培養至Day 10之CAR-T細胞及對照T細胞，於不包含細胞激素之含有5%人工血清之ALyS TM705培養基中進行培養。
於培養開始2天後，將CAR-T細胞或對照T細胞以E：T比成為2：1、1：1或1：2之方式添加至腫瘤細胞中，除此以外，以與實施例4相同之方式進行共培養及免疫染色。同時，不將CAR-T細胞或對照T細胞添加至腫瘤細胞中，進行相同之操作。
為了將T細胞數及腫瘤細胞數定量化，於經染色之細胞中添加CountBright絕對計數珠(Invitrogen，Carlsbad，CA)後，置於流式細胞儀BD Accuri TMC6 Plus(BD Biosciences San Jose，CA)，使用Flowjo(BD Biosciences San Jose，CA)進行解析。
將結果示於圖16及17。 pre-pro-IGF-2型CAR-T細胞(圖17)係於所試驗之所有E：T比下，與對照T細胞(圖16)相比腫瘤細胞率下降，顯現出腫瘤細胞之殺傷能力。該結果顯示，藉由使用pre-pro-IGF-2作為標的結合域來製作CAR-T細胞，可獲得具有較高之抗腫瘤細胞活性之CAR-T細胞。
[實施例8 IGF-1 w/oE型CAR-T細胞之抗腫瘤細胞活性之評價] 藉由流式細胞分析對乳癌細胞株MX-1(Cell Lines Service)、肺腺癌細胞株H1568(美國典型培養物保藏中心)、子宮體癌細胞株ARK-1(京都大學醫學部婦產科教室)、子宮頸癌細胞株HeLa(JCRB細胞庫)、及卵巢癌細胞株RMG-1(JCRB細胞庫)之IGF1R表現進行調查，結果該等癌細胞株均表現IGF1R。因此，使用該等細胞株，評價IGF-1 w/oE型CAR-T細胞對乳癌、肺腺癌、子宮體癌、子宮頸癌、及卵巢癌之抗腫瘤細胞活性。
具體而言，藉由與實施例2相同之方法製作IGF-1 w/oE型CAR-T細胞，進行培養、擴增，又，培養對照T細胞(經抗CD3抗體及抗CD28抗體活化之T細胞)。藉由與實施例4及5相同之方法，將上述IGF-1 w/oE型CAR-T細胞或對照T細胞與腫瘤細胞(乳癌細胞株MX-1、肺腺癌細胞株H1568、或子宮體癌細胞株ARK-1)(2×10 5個)以4：1、2：1、1：1、1：2或1：4之E：T比共培養5天，對共培養後之腫瘤細胞數進行測定。同樣地，將上述IGF-1 w/oE型CAR-T細胞或對照T細胞與腫瘤細胞(子宮頸癌細胞株HeLa、或卵巢癌細胞株RMG-1)(2×10 5個)以4：1、2：1、或1：1之E：T比共培養4天，對共培養後之腫瘤細胞數進行測定。但是，使用B7-H3而非CD33作為腫瘤細胞之標記。又，於共培養開始24小時後回收一部分培養上清液，使用ELISA套組(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)測定培養上清液中之IFN-γ及IL-2之濃度。
將共培養後之腫瘤細胞數之測定結果示於圖18及19。對於所試驗之所有種類之癌細胞株，IGF-1 w/oE型CAR-T細胞均顯現出腫瘤細胞數之顯著減少效果。
又，關於所試驗之所有種類之癌細胞株，與將對照T細胞與腫瘤細胞共培養後之培養上清液中之IFN-γ及IL-2之濃度相比，將IGF-1 w/oE型CAR-T細胞與腫瘤細胞共培養24小時後之培養上清液中之IFN-γ及IL-2之濃度顯著較高，最低亦為高達24倍以上之值。
該等結果顯示，本發明之CAR-T細胞對作為IGF1R表現腫瘤之乳癌、肺腺癌、子宮體癌、子宮頸癌、及卵巢癌等具有抗腫瘤效果。
再者，藉由流式細胞分析對為了研究對MX-1、H1568、ARK-1之抗腫瘤細胞活性而進行培養、擴增之IGF-1 w/oE型CAR-T細胞之表型進行調查，結果CD4+ CAR-T細胞、CD8+ CAR-T細胞中CD45RA+CD62L+細胞(幹細胞記憶T細胞)之比率均為約80%。
[實施例9 IGF-1 w/oE des1-3型CAR表現質體之製作] 設計使用IGF-1 w/oE之成熟IGF-1部分之N末端之3個胺基酸(GPE)經去除者(IGF-1 w/oE des1-3)作為標的結合域之CAR，藉由國際公開第2020/085480號中所記載之方法製作用以表現其之質體(IGF-1 w/oE des1-3型CAR表現質體)。
IGF-1 w/oE des1-3型CAR表現質體除與成熟IGF-1部分之N末端之3個胺基酸對應之鹼基序列缺失以外，與IGF-1 w/oE型CAR表現質體相同。
將IGF-1 w/oE des1-3型CAR表現質體之鹼基序列示於序列編號26，將IGF-1 w/oE des1-3之胺基酸序列示於序列編號27。
[實施例10 IGF-1 w/oE型CAR-T細胞及IGF-1 w/oE des1-3型CAR-T細胞之培養、擴增及CAR表現率、抗腫瘤細胞活性之比較] ＜10-1. CAR-T細胞之培養、擴增＞ 使用實施例1及9中所製作之IGF-1 w/oE型CAR表現質體及IGF-1 w/oE des1-3型CAR表現質體，藉由與實施例2相同之方法，製作使用IGF-1 w/oE或IGF-1 w/oE des1-3作為標的結合域之CAR-T細胞(分別為IGF-1 w/oE型CAR-T細胞、IGF-1 w/oE des1-3型CAR-T細胞)，進行培養、擴增。同時，藉由與實施例2相同之方法培養對照T細胞(經抗CD3抗體及抗CD28抗體活化之T細胞)。
＜10-2. CAR表現率之比較＞ 按照實施例3中所記載之方法，調查10-1中所製作之IGF-1 w/oE型CAR-T細胞及IGF-1 w/oE des1-3型CAR-T細胞中之CAR表現率(基因導入後第14天)。結果，IGF-1 w/oE型CAR-T細胞及IGF-1 w/oE des1-3型CAR-T細胞顯現出同等之CAR表現率。
＜10-3. 抗腫瘤活性之比較＞ 調查10-1中所製作之IGF-1 w/oE型CAR-T細胞及IGF-1 w/oE des1-3型CAR-T細胞對肺腺癌細胞株A549(JCRB細胞庫)之抗腫瘤細胞活性。
具體而言，藉由與實施例4及5相同之方法，將上述IGF-1 w/oE型CAR-T細胞、IGF-1 w/oE des1-3型CAR-T細胞、或對照T細胞與腫瘤細胞(A549)(2×10 5個)以1：1、1：2或1：4之E：T比共培養4天，對共培養後之腫瘤細胞數進行測定。但是，於本實驗中，除不添加T細胞以外，藉由相同之方法，亦進行僅腫瘤細胞之培養。然後，藉由以下之式算出腫瘤細胞之溶解率。 溶解率(%)＝{1－(將腫瘤細胞與T細胞共培養之情形時之腫瘤細胞數)/(僅培養腫瘤細胞之情形時之腫瘤細胞數)}×100
又，於共培養開始24小時後回收一部分培養上清液，使用ELISA套組(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)對培養上清液中之IFN-γ及IL-2之濃度進行測定。
將溶解率之測定結果示於圖20。IGF-1 w/oE型CAR-T細胞與對照T細胞相比顯現出較高之溶解率，IGF-1 w/oE des1-3型CAR-T細胞較IGF-1 w/oE型CAR-T細胞顯現出更高之溶解率。因此，顯示IGF-1 w/oE des1-3型CAR-T細胞對肺腺癌細胞株A549具有高於IGF-1 w/oE型CAR-T細胞之抗腫瘤活性。
再者，藉由ELISA法對本實施例中所使用之肺腺癌細胞株A549培養24小時後之培養上清液中之IGFBP3濃度進行測定，結果為約2800 pg/ml。因此，A549分泌IGFBP3。
[實施例11 IGF-1 w/oE型CAR-T細胞及IGF-1 w/oE des1-3型CAR-T細胞之標的結合域對IGFBP3之結合能力]
藉由流式細胞分析對IGF-1 w/oE型CAR-T細胞及IGF-1 w/oE des1-3型CAR-T細胞之標的結合域對IGFBP3之結合能力進行調查。
具體之實驗程序如下所述。 步驟1. 於附加有His標籤之人類IGFBP3蛋白(ACROBiosystems，目錄號：IG3-H52H9，1 μg/μl)中添加PBS，稀釋至0.25 μg/μl。 步驟2. 將藉由與實施例10相同之方法進行培養、擴增之對照T細胞(經抗CD3抗體及抗CD28抗體活化之T細胞)、IGF-1 w/oE型CAR-T細胞、或IGF-1 w/oE des1-3型CAR-T細胞(1M)回收至試管中。 步驟3. 於步驟2之試管中添加PBS，以1500 rpm(或400 g)離心分離10分鐘。將該步驟反覆進行2次。 步驟4. 自步驟3之試管去除上清液，於含有IGF-1 w/oE型CAR-T細胞或IGF-1 w/oE des1-3型CAR-T細胞之試管中加入步驟1中所製備之附加有His標籤之人類IGFBP3蛋白溶液2 μl。將所有試管於室溫下培養1小時。 步驟5. 如下所示地調整染色用試劑(試劑A～C)。
[表1]
   試劑A 試劑B 試劑C
PBS 50 μl 50 μl 50 μl
APC標記抗CD3抗體 (T細胞檢測用抗體) 2 μl 2 μl 2 μl
FITC標記抗人類IgG抗體 (CAR檢測用抗體) 2 μl 2 μl 2 μl
PE標記小鼠IgG2a (Miltenyi Biotec，純系名稱：S43.10) - 2 μl -
PE標記抗His標籤抗體 (BioLegend，純系名稱：J095G46) - - 5 μl
步驟6. 將步驟4中所培養之試管以1500 rpm(或400 g)離心分離10分鐘，去除上清液。將該操作反覆進行2次。 步驟7. 於含有對照T細胞之試管中添加試劑A，於含有IGF-1 w/oE型CAR-T細胞之試管中添加試劑B或C，於含有IGF-1 w/oE des1-3型CAR-T細胞之試管中添加試劑C。將所有試管用鋁箔包裹，於4℃下培養15分鐘。 步驟8. 將步驟7之試管洗淨1次後，於各試管中添加300 μL之PBS。 步驟9. 對步驟8之試管中之細胞進行流式細胞分析。 步驟10. 藉由以下之式算出IGFBP3結合率。 IGFBP3結合率(%)=(CD3陽性CAR陽性His標籤陽性細胞數)/(CD3陽性CAR陽性細胞數)×100
將結果示於圖21。IGF-1 w/oE型CAR-T細胞及IGF-1 w/oE des1-3型CAR-T細胞分別顯現出約20%、約60%之IGFBP3結合率。因此，IGF-1 w/oE des1-3顯現出高於IGF-1 w/oE之IGFBP3結合能力。
根據先前研究，已知N末端具有3個胺基酸之缺失之IGF-1之變異體(Des1-3 IGF-1)對IGFBP之結合能力明顯下降(Sara VR et al., Annals New York Academy of Sciences, 1993, 692：183-91、Ballard F et al., Int. J. Biochem. Cell Biol., 1996, 28(10)：1085-1087)。因此，具有該3個胺基酸之缺失之IGF-1 w/oE des1-3顯現出高於不具有該3個胺基酸之缺失之IGF-1 w/oE之IGFBP3結合能力係出乎意料之結果。
[實施例12 由IGFBP3或IGFBP3＋IGF1R所引起之IGF-1 w/oE des1-3型CAR-T細胞之活化] 調查經IGFBP3或IGFBP3＋IGF1R刺激後之IGF-1 w/oE des1-3型CAR-T細胞之IFNγ之釋放量，由此調查由IGFBP3或IGFBP3＋IGF1R所引起之IGF-1 w/oE des1-3型CAR-T細胞之活化。
具體之實驗程序如下所述。 步驟1. 將含有或不含1 μg之附加有His標籤之人類IGF1R蛋白(ACROBiosystems，目錄號：IGR-H5229)的500 μl之PBS添加至24孔未處理培養板之孔中。將該培養板於冰箱中培養一晚使其固相化。 步驟2. 將步驟1之培養板洗淨2次後，將藉由與實施例10相同之方法進行培養、擴增之對照T細胞(經抗CD3抗體及抗CD28抗體活化之T細胞)或IGF-1 w/oE des1-3型CAR-T細胞(10 6個)、及1 μg之附加有His標籤之人類IGFBP3蛋白(ACROBiosystems，目錄號：IG3-H52H9)添加至培養板之各孔中。 步驟3. 於步驟2之培養板之各孔中添加RPMI而使總量為2 ml。將該培養板於37℃下培養24小時。 步驟4. 自步驟3之培養後之培養板之各孔回收1 mL上清液。 步驟5. 使用ELISA套組對步驟4中所回收之上清液中之IFN-γ之濃度進行測定。
將結果示於圖22。 於藉由IGFBP3刺激IGF-1 w/oE des1-3型CAR-T細胞之情形時，與藉由IGFBP3刺激對照T細胞之情形相比IFN-γ濃度較高。該結果顯示，IGF-1 w/oE des1-3型CAR-T細胞不僅與IGF1R結合而活化，亦藉由與IGFBP3結合而活化。
又，作為藉由IGFBP3＋IGF1R刺激IGF-1 w/oE des1-3型CAR-T細胞之情形時之IFN-γ濃度，與藉由IGFBP3＋IGF1R刺激對照T細胞之情形時之IFN-γ濃度相比顯著較高，與藉由IGFBP3刺激IGF-1 w/oE des1-3型CAR-T細胞之情形時之IFN-γ濃度相比亦顯著較高。該等結果顯示，IGF-1 w/oE des1-3型CAR-T細胞於IGFBP3及IGF1R之存在下與IGFBP3及IGF1R兩者結合而活化。
序列 序列編號1 編碼成熟IGF-1之鹼基序列
序列編號2 成熟IGF-1之胺基酸序列
序列編號3 編碼IGF-1 Ea之鹼基序列
序列編號4 IGF-1 Ea之胺基酸序列
序列編號5 編碼IGF-1 Eb之鹼基序列
序列編號6 IGF-1 Eb之胺基酸序列
序列編號7 編碼IGF-1 Ec之鹼基序列
序列編號8 IGF-1 Ec之胺基酸序列
序列編號9 編碼IGF-1 w/oE之鹼基序列
序列編號10 IGF-1 w/oE之胺基酸序列
序列編號11 編碼成熟IGF-2之鹼基序列
序列編號12 成熟IGF-2之胺基酸序列
序列編號13 編碼pre-pro-IGF-2之鹼基序列
序列編號14 pre-pro-IGF-2之胺基酸序列
序列編號15 IgG1之鉸鏈區之胺基酸序列 序列編號16 IgG1之CH2區之胺基酸序列 序列編號17 IgG1之CH3區之胺基酸序列 序列編號18 來自人類CD28之跨膜結構域及共刺激域之胺基酸序列 序列編號19 來自人類CD3ζ鏈之細胞內訊號傳遞域之胺基酸序列 序列編號20 成熟IGF-1型CAR表現質體之鹼基序列 序列編號21 IGF-1 Ea型CAR表現質體之鹼基序列 序列編號22 IGF-1 Eb型CAR表現質體之鹼基序列 序列編號23 IGF-1 Ec型CAR表現質體之鹼基序列 序列編號24 IGF-1 w/oE型CAR表現質體之鹼基序列 序列編號25 pre-pro-IGF-2型CAR表現質體之鹼基序列 序列編號26 IGF-1 w/oE des1-3型CAR表現質體之鹼基序列 序列編號27 IGF-1 w/oE des1-3之胺基酸序列 本說明書中所引用之所有刊物、專利及專利申請案係直接藉由引用而併入本說明書中。
圖1示出本案實施例中用作CAR之標的結合域之成熟IGF-1、pre-pro-IGF-1(IGF-1 Ea、IGF-1 Eb、IGF-1 Ec)、及pre-pro-IGF-1之E域缺失之片段(IGF-1 w/oE)的結構。 圖2示出成熟IGF-1型CAR表現質體之載體圖。 圖3示出IGF-1 Ea型CAR表現質體之載體圖。 圖4示出IGF-1 Eb型CAR表現質體之載體圖。 圖5示出IGF-1 Ec型CAR表現質體之載體圖。 圖6示出IGF-1 w/oE型CAR表現質體之載體圖。 圖7示出成熟IGF-1型CAR-T細胞及IGF-1 Ea型CAR-T細胞中之基因導入後第1、3、6、10天(Day 1、3、6及10)之CAR表現率。 圖8示出表示將對照T細胞及腫瘤細胞以4：1、2：1、1：1或1：2之E：T比共培養4天時之對照T細胞之抗腫瘤細胞活性的流式細胞分析之結果。 圖9示出表示將IGF-1 Ea型CAR-T細胞及腫瘤細胞以4：1、2：1、1：1或1：2之E：T比共培養4天時之IGF-1 Ea型CAR-T細胞之抗腫瘤細胞活性的流式細胞分析之結果。 圖10示出表示將成熟IGF-1型CAR-T細胞及腫瘤細胞以4：1、2：1、1：1或1：2之E：T比共培養4天時之成熟IGF-1型CAR-T細胞之抗腫瘤細胞活性的流式細胞分析之結果。 圖11示出IGF-1 Ea、IGF-1 Eb、IGF-1 Ec、IGF-1 w/oE型CAR-T細胞中之基因導入後第10天(Day 10)之CAR表現率。 圖12示出將IGF-1 Ea、IGF-1 Eb、IGF-1 Ec、IGF-1 w/oE型CAR-T細胞或對照T細胞以2：1、1：1或1：2之E：T比與腫瘤細胞共培養4天後之腫瘤細胞數。 圖13示出將IGF-1 Ea、IGF-1 Eb、IGF-1 Ec、IGF-1 w/oE型CAR-T細胞或對照T細胞以2：1、1：1或1：2之E：T比與腫瘤細胞共培養4天後之T細胞數。 圖14示出pre-pro-IGF-2型CAR表現質體之載體圖。 圖15示出表示pre-pro-IGF-2型CAR-T細胞及對照T細胞之基因導入後第10天(Day 10)之CAR表現解析結果的流式細胞分析之結果。 圖16示出表示將對照T細胞及腫瘤細胞以2：1、1：1或1：2之E：T比共培養4天時之對照T細胞之抗腫瘤細胞活性的流式細胞分析之結果。 圖17示出表示將pre-pro-IGF-2型CAR-T細胞及腫瘤細胞以2：1、1：1或1：2之E：T比共培養4天時之pre-pro-IGF-2型CAR-T細胞之抗腫瘤細胞活性的流式細胞分析之結果。 圖18示出將IGF-1 w/oE型CAR-T細胞或對照T細胞以4：1、2：1、1：1、1：2、或1：4之E：T比與(A)乳癌細胞株MX-1、(B)肺腺癌細胞株H1568、(C)子宮體癌細胞株ARK-1共培養4天後之腫瘤細胞數。 圖19示出將IGF-1 w/oE型CAR-T細胞或對照T細胞以4：1、2：1、或1：1之E：T比與(A)子宮頸癌細胞株HeLa、(B)卵巢癌細胞株RMG-1共培養4天後之腫瘤細胞數。 圖20示出將IGF-1 w/oE型CAR-T細胞、IGF-1 w/oE des1-3型CAR-T細胞、或對照T細胞以1：1、1：2、或1：4之E：T比與肺腺癌細胞株A549共培養4天後之腫瘤細胞之溶解率。 圖21示出IGF-1 w/oE型CAR-T細胞及IGF-1 w/oE des1-3型CAR-T細胞之IGFBP3結合率。 圖22示出藉由IGFBP3或IGFBP3＋IGF1R刺激IGF-1 w/oE型CAR-T細胞及IGF-1 w/oE des1-3型CAR-T細胞後之培養上清液中之IFNγ濃度。
TW202342509A_112103302_SEQL.xml

Claims (12)

  1. 一種聚核苷酸，其係編碼具有與類胰島素生長因子-1受體(IGF1R)結合之標的結合域、跨膜結構域及細胞內訊號傳遞域之嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor：CAR)蛋白者，且標的結合域為類胰島素生長因子(IGF)之pre-pro前驅體或其E域缺失之片段。
  2. 如請求項1之聚核苷酸，其中上述IGF為IGF-1。
  3. 如請求項1或2之聚核苷酸，其中標的結合域包含相對於序列編號4、6、8或10所表示之胺基酸序列具有至少90%之序列同一性之胺基酸序列。
  4. 如請求項1之聚核苷酸，其中上述IGF為IGF-2。
  5. 如請求項1或4之聚核苷酸，其中標的結合域包含相對於序列編號14所表示之胺基酸序列具有至少90%之序列同一性之胺基酸序列。
  6. 一種載體，其包含如請求項1至5中任一項之聚核苷酸。
  7. 一種基因修飾細胞，其係導入如請求項1至5中任一項之聚核苷酸、或如請求項6之載體而成。
  8. 一種CAR蛋白表現細胞之製作方法，其包括將如請求項1至5中任一項之聚核苷酸、或如請求項6之載體導入至細胞中。
  9. 一種針對與IGF1R表現細胞有關之疾病之治療劑，其包含如請求項7之細胞。
  10. 一種醫藥組合物，其包含如請求項9之治療劑、及醫藥上所容許之載體。
  11. 如請求項9之治療劑或如請求項10之組合物，其中與IGF1R表現細胞有關之疾病選自由白血病、多發性骨髓瘤、淋巴瘤、肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌、肝癌、肝細胞癌、胰臟癌、結腸直腸癌、大腸癌、結腸癌、乳癌、子宮體癌、子宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、甲狀腺癌、腎癌、腎上腺癌、黑色素瘤、神經內分泌腫瘤、視網膜母細胞瘤、及肉瘤所組成之群。
  12. 一種用以製作以IGF1R表現細胞為標的之CAR蛋白表現細胞之套組，其包含如請求項6之載體。
TW112103302A 2022-01-31 2023-01-31 以IGF1R為標的之pre-pro前驅體型嵌合抗原受體表現細胞 TW202342509A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022-012674 2022-01-31
JP2022012674 2022-01-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202342509A true TW202342509A (zh) 2023-11-01

Family

ID=87471783

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW112103302A TW202342509A (zh) 2022-01-31 2023-01-31 以IGF1R為標的之pre-pro前驅體型嵌合抗原受體表現細胞

Country Status (2)

Country Link
TW (1) TW202342509A (zh)
WO (1) WO2023145961A1 (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0712052A2 (pt) * 2006-06-09 2012-01-10 Novartis Ag polipeptìdeos de fator de crescimento tipo insulina estabilizados
JP2009542719A (ja) * 2006-07-06 2009-12-03 モレキュラー ロジックス，インコーポレイテッド インスリン様成長因子−ｉレセプターアンタゴニスト
EP3707166A4 (en) * 2017-11-06 2021-11-24 Daniel J. Monticello CHIMERA ANTIGEN RECEPTOR SYSTEMS WITH DOMINANT NEGATIVE LIGAND
CA3090787A1 (en) * 2018-02-09 2019-08-15 The Trustees Of Dartmouth College Chimeric antigen receptors for treatment of neurodegenerative diseases and disorders

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023145961A1 (ja) 2023-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI790213B (zh) 用於使用融合蛋白之tcr重編程的組合物及方法
TWI787599B (zh) 嵌合抗原和ｔ細胞受體及使用方法
US20240075070A1 (en) Chimeric antigen receptor t cells targeting the tumor microenvironment
US11905528B2 (en) Compound chimeric antigen receptor (cCAR) targeting multiple antigens, compositions and methods of use thereof
JP2022091750A (ja) 細胞に基づくネオ抗原ワクチンおよびその使用
JP2019088330A (ja) 二重特異性キメラ抗原受容体およびその治療的使用
JP2018518972A (ja) 腫瘍特異的活性化のためのマスキングキメラ抗原受容体ｔ細胞
JP2018522567A (ja) 固形腫瘍を標的とする二重特異性ｃａｒ ｔ細胞
JP2021500894A (ja) キメラ抗原受容体発現細胞を作製する方法
CN110582488A (zh) 具有增强功效的免疫效应细胞疗法
US20190135894A1 (en) COMPOUND CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR (cCAR) TARGETING MULTIPLE ANTIGENS, COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
CA3013773A1 (en) Administration of engineered t cells for treatment of cancers in the central nervous system
WO2020191316A1 (en) Car-t cell therapies with enhanced efficacy
TW202023580A (zh) 使用靶特異性融合蛋白進行ｔｃｒ再程式化之組合物及方法
JP2022514023A (ja) 操作されたサイトカイン受容体対を使用して腫瘍浸潤リンパ球を拡大培養する方法及びその使用
KR20190130024A (ko) 최적화된 다기능 t 세포를 포함하는 키메라 수용체 t 세포를 사용하는 치료
WO2018052142A1 (ja) 遺伝子改変細胞及びその作製方法
JP2021536245A (ja) 血液中または濃縮ｐｂｍｃ中のリンパ球を遺伝子改変するための方法および組成物
TW202146644A (zh) 一種新穎的ｃｄ１６陽性自然殺手細胞及一種培養ｃｄ１６陽性自然殺手細胞的方法
JP7296133B2 (ja) 遺伝子改変細胞及びその作製方法
CN111378046B (zh) 一种免疫效应细胞转换受体
US20230110313A1 (en) Switch receptors using il-9 signaling domains
WO2022037562A1 (en) Engineered immunoresponsive cells and uses thereof
WO2023145961A1 (ja) ＩＧＦ１Ｒを標的とするｐｒｅ－ｐｒｏ前駆体型キメラ抗原受容体発現細胞
WO2023234330A1 (ja) Ｅｇｆｒを標的とするキメラ抗原受容体発現細胞