TW202340247A - 結合ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６、及５ｔ４之蛋白質 - Google Patents

結合ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６、及５ｔ４之蛋白質 Download PDF

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Abstract

描述結合NKG2D受體、CD16、及5T4之多特異性結合蛋白、以及可用於治療癌症的多特異性結合蛋白之醫藥組成物、配方、及治療方法。

Description

結合NKG2D、CD16、及5T4之蛋白質
本申請案係關於結合至細胞上之NKG2D、CD16、及5T4之多特異性結合蛋白、包含此類蛋白質之醫藥組成物、及使用此類蛋白質及醫藥組成物之治療方法（包括用於治療癌症）。
儘管有大量的研究努力，癌症仍舊為全球各國的重大臨床及財務負擔。根據世界衛生組織(World Health Organization, WHO)，其係第二大死因。在現有治療模式中，有手術、放射療法、化學療法、生物療法、免疫療法、荷爾蒙療法、幹細胞移植、及精準醫療。儘管在此等領域中進行廣泛研究，但尚未識別出高度有效的治癒性解決方案，特別是針對最具侵襲性的癌症。此外，許多現有抗癌治療模式具有重大不良副作用。
癌症免疫療法係所欲的，因為其具有高度特異性，並可使用患者自身免疫系統促進癌細胞的破壞。融合蛋白（諸如雙特異性T細胞銜接器）係文獻中描述的癌症免疫療法，其結合至腫瘤細胞及T細胞以促進腫瘤細胞的破壞。腫瘤之複製較慢的類幹細胞（亦即癌症幹細胞）可能係在經過靶向快速增殖細胞（構成腫瘤主體(bulk)）的傳統療法之後臨床復發(relapse)或再發(recurrence)的原因。此外，腫瘤微環境（包括癌相關纖維母細胞(cancer-associated fibroblast, CAF)）常促進惡性疾病並抑制癌症療法。
自然殺手(NK)細胞係先天免疫系統之組分，且大約佔循環淋巴球之15%。NK細胞幾乎浸潤所有組織，且原本的特徵在於在不需要先前致敏化下即有效殺滅腫瘤細胞的能力。活化NK細胞藉由類似於細胞毒性T細胞的手段殺滅目標細胞，亦即經由含有穿孔素及顆粒酶之細胞裂解性顆粒、以及經由死亡受體路徑。活化NK細胞亦分泌發炎性細胞介素，諸如IFN-γ及趨化因子（促進募集其他白血球至目標組織）。
NK細胞透過其表面上之各種活化及抑制受體對信號作出反應。例如，當NK細胞遇到健康自體細胞時，其活性透過殺手細胞免疫球蛋白樣受體(killer-cell immunoglobulin-like receptor, KIR)之活化而受到抑制。替代地，當NK細胞遇到外來細胞或癌細胞時，其經由其活化受體（例如NKG2D、NCR、DNAM1）活化。NK細胞亦可藉由一些免疫球蛋白之恆定區，透過其表面上之CD16受體活化。NK細胞對活化的整體敏感性取決於刺激性及抑制性信號之總和。NKG2D係II型跨膜蛋白，其係由基本上所有自然殺手細胞表現，NKG2D在自然殺手細胞中作為活化受體。亦在T細胞上發現NKG2D，其在T細胞中作用為共刺激受體。經由NKG2D調節NK細胞功能的能力可用於各種治療背景中，包括惡性疾病。
人類滋養層醣蛋白5T4係一種N-醣基化跨膜蛋白。其表現與透過下列之細胞方向性移動呈機械性相關：上皮間質轉化、促進CXCL12/CXCR4趨化性、及阻斷典型(canonical) Wnt/β-連環蛋白（同時有利於非典型路徑信號傳導）。此等程序在發育中及成人組織中受到高度調控，但其等有助於驅動癌細胞擴散。已顯示5T4在正常成人組織中表現非常有限，但其廣泛分布於許多癌症中，包括結腸直腸癌、卵巢癌、非小細胞肺癌、腎癌、乳癌、子宮內膜癌、鱗狀細胞癌、頭頸鱗狀細胞癌、子宮癌、胰臟癌、間皮瘤、及胃癌。此外，5T4與癌症幹細胞有關(Harper J et al.Mol Cancer Ther. 2017)。5T4亦可能與腫瘤微環境相關。
因此，本領域仍需要結合5T4之新穎且有用的蛋白質，其用於治療癌症。
因此，在一個態樣中，本揭露提供一種蛋白質，其包含：(a)第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)；(b)第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含分別包含SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列的互補決定區1 (CDR1)序列、互補決定區2 (CDR2)序列、及互補決定區3 (CDR3)序列，且該VL包含分別包含SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；及(c)足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。在另一態樣中，提供一種蛋白質，其包含：(a)第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)；(b)第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含分別包含SEQ ID NO: 472、474、及140之胺基酸序列的互補決定區1 (CDR1)序列、互補決定區2 (CDR2)序列、及互補決定區3 (CDR3)序列，且該VL包含分別包含SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，其中該等CDR係根據Kabat編號方案；及(c)足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。在另一態樣中，提供一種蛋白質，其包含：(a)第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)；(b)第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含分別包含SEQ ID NO: 138、482、及483之胺基酸序列的互補決定區1 (CDR1)序列、互補決定區2 (CDR2)序列、及互補決定區3 (CDR3)序列，且該VL包含分別包含SEQ ID NO: 484、485、及486之胺基酸序列的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，其中該等CDR係根據Chothia；及(c)足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。在另一態樣中，提供一種蛋白質，其包含：(a)第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)；(b)第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含分別包含SEQ ID NO: 499、500、及501之胺基酸序列的互補決定區1 (CDR1)序列、互補決定區2 (CDR2)序列、及互補決定區3 (CDR3)序列，且該VL包含分別包含SEQ ID NO: 502、485、及143之胺基酸序列的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，其中該等CDR係根據IMGT；及(c)足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。在另一態樣中，提供一種蛋白質，其包含：(a)第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)；(b)第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含分別包含SEQ ID NO: 516、521、及518之胺基酸序列的互補決定區1 (CDR1)序列、互補決定區2 (CDR2)序列、及互補決定區3 (CDR3)序列，且該VL包含分別包含SEQ ID NO: 519、522、及486之胺基酸序列的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，其中該等CDR係根據Honegger；及(c)足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。在一些實施例中，CD16係人類CD16。在一些實施例中，人類CD16係人類CD16a (FcγRIIIa)。
在一些實施例中，包含抗NKG2D抗體之VH及VL的第一抗原結合位點係Fab片段，且包含抗5T4抗體之VH及VL的第二抗原結合位點係scFv。在一些實施例中，包含抗NKG2D抗體之VH及VL的第一抗原結合位點係scFv，且包含抗5T4抗體之VH及VL的第二抗原結合位點係Fab片段。
在一些實施例中，蛋白質進一步包含額外抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL。在一些實施例中，包含抗NKG2D抗體之VH及VL的第一抗原結合位點係scFv，且包含抗5T4抗體之VH及VL的第二抗原結合位點及額外抗原結合位點各自係Fab片段。在一些實施例中，包含抗NKG2D抗體之VH及VL的第一抗原結合位點係scFv，且包含抗5T4抗體之VH及VL的第二抗原結合位點及額外抗原結合位點各自係scFv。在一些實施例中，第二抗原結合位點及額外抗原結合位點之胺基酸序列係同一的。
在一些實施例中，包含抗NKG2D抗體之VH及VL的scFv係經由鉸鏈連接至足以結合CD16之抗體恆定域或其部分，鉸鏈包含Ala-Ser或Gly-Ser。在一些實施例中，包含抗NKG2D抗體之VH及VL的scFv係經由鉸鏈連接至足以結合CD16之抗體恆定域或其部分，鉸鏈包含Ala-Ser。在一些實施例中，包含抗5T4抗體之VH及VL的各scFv係經由鉸鏈連接至足以結合CD16之抗體恆定域或其部分，鉸鏈包含Ala-Ser或Gly-Ser。在一些實施例中，鉸鏈進一步包含胺基酸序列Thr-Lys-Gly。
在一些實施例中，在包含抗NKG2D抗體之VH及VL的scFv內，scFv之VH與scFv之VL形成雙硫鍵。在一些實施例中，在包含抗5T4抗體之VH及VL的各scFv內，scFv之VH與scFv之VL形成雙硫鍵。在一些實施例中，雙硫鍵係在VH之C44與VL之C100之間形成，其係依Kabat編號方案編號。
在一些實施例中，在包含抗NKG2D抗體之VH及VL的scFv內，VH係經由可撓性連接子連接至VL。在一些實施例中，在包含抗5T4抗體之VH及VL的各scFv內，VH係經由可撓性連接子連接至VL。在一些實施例中，其中可撓性連接子包含(G 4S) 4(SEQ ID NO:119)。
在一些實施例中，在包含抗NKG2D抗體之VH及VL的scFv內，VH係位於VL之C端。在一些實施例中，在包含抗5T4抗體之VH及VL的各scFv內，VH係位於VL之C端。在一些實施例中，在包含抗NKG2D抗體之VH及VL的scFv內，VH係位於VL之N端。在一些實施例中，在包含抗5T4抗體之VH及VL的各scFv內，VH係位於VL之N端。在一些實施例中，包含抗NKG2D抗體之VH及VL的Fab片段不位於抗原結合位點與Fc或其部分之間。在一些實施例中，無包含抗5T4抗體之VH及VL的Fab片段位於抗原結合位點與Fc或其部分之間。在一些實施例中，包含下列的Fab片段不位於抗原結合位點與Fc或其部分之間：第二抗原結合位點（包含抗5T4抗體之VH及VL）或額外抗原結合位點（包含抗5T4抗體之VH及VL）之VH及VL。
在一些實施例中，第一抗原結合位點結合人類NKG2D。在一些實施例中，第二抗原結合位點結合人類5T4。在一些實施例中，第二抗原結合位點在LRR1域內結合人類5T4。
在一些實施例中，包含抗NKG2D抗體之VH及VL的第一抗原結合位點包含：VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 81、82、及112之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。
在另一態樣中，本揭露提供一種蛋白質，其包含：(a)第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 81、82、及112之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含由SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；(b)第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含由SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；及(c)足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。在一些實施例中，包含抗NKG2D抗體之VH及VL的第一抗原結合位點包含：VH，其包含分別由SEQ ID NO: 81、82、及97之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；及VL，其包含分別由SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列。
在另一態樣中，本揭露提供一種蛋白質，其包含：(a)第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 81、82、及112之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含分別由SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；(b)第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 472、474、140之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含分別由SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，其中該編號係根據Kabat編號方案；及(c)足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。在一些實施例中，包含抗NKG2D抗體之VH及VL的第一抗原結合位點包含：VH，其包含分別由SEQ ID NO: 81、82、及97之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；及VL，其包含分別由SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列。
在另一態樣中，本揭露提供一種蛋白質，其包含：(a)第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 381、390、及391之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含分別由SEQ ID NO: 392、385、及393之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；(b)第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 138、482、及483之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含分別由SEQ ID NO: 484、485、及486之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，其中該編號係根據Chothia；及(c)足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。在一些實施例中，包含抗NKG2D抗體之VH及VL的第一抗原結合位點包含：VH，其包含分別由SEQ ID NO: 381、390、及395之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；及VL，其包含分別由SEQ ID NO: 392、385、及393之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列。
在另一態樣中，本揭露提供一種蛋白質，其包含：(a)第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 422、423、及111之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含分別由SEQ ID NO: 424、385、及87之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；(b)第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 499、500、及501之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含分別由SEQ ID NO: 502、485、及143之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，其中該編號係根據IMGT；及(c)足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。在一些實施例中，包含抗NKG2D抗體之VH及VL的第一抗原結合位點包含：VH，其包含分別由SEQ ID NO: 422、423、及96之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；及VL，其包含分別由SEQ ID NO: 424、385、及87之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列。
在另一態樣中，本揭露提供一種蛋白質，其包含：(a)第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 462、463、及464之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含由SEQ ID NO: 465、459、及393之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；(b)第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 516、521、及518之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含由SEQ ID NO: 519、522、及486之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，其中該編號係根據Honegger；及(c)足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。在一些實施例中，包含抗NKG2D抗體之VH及VL的第一抗原結合位點包含：VH，其包含分別由SEQ ID NO: 462、463、及467之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；及VL，其包含分別由SEQ ID NO: 465、459、及393之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列。
在另一態樣中，本揭露提供一種蛋白質，其包含：(a)第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 81、82、及97之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含由SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；(b)第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含由SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；及(c)抗體Fc域，其包含足以結合CD16之第一抗體Fc域多肽或其部分、及足以結合CD16之第二抗體Fc域多肽或其部分；且其中該抗NKG2D抗體之該VH或該VL係融合至足以結合CD16之該第一抗體Fc域多肽或其部分之N端，且該抗5T4抗體之該VH或該VL係融合至足以結合CD16之該第二抗體Fc域多肽或其部分之N端。
在一些實施例中，第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:95至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:85至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第一抗原結合位點包含：VH，其包含SEQ ID NO:95之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO:85之胺基酸序列。在一些實施例中，第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:95至少95%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:85至少95%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:95至少96%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:85至少96%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:95至少97%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:85至少97%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:95至少98%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:85至少98%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:95至少99%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:85至少99%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第一抗原結合位點包含：VH，其係由SEQ ID NO:95之胺基酸序列所組成；及VL，其係由SEQ ID NO:85之胺基酸序列所組成。
在一些實施例中，第二抗原結合位點包含：VH，其與SEQ ID NO:144至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一；及VL，其與SEQ ID NO:145至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:263至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:145至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含：VH，其相對於SEQ ID NO:144具有G44C取代；及VL，其相對於SEQ ID NO:145具有G100C取代。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列的VH、及包含SEQ ID NO:145之胺基酸序列的VL；或包含與SEQ ID NO:146至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列的VH、及包含與SEQ ID NO:147至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列的VL。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含：VH，其包含SEQ ID NO:146之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO:147之胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含：VH，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO:145之胺基酸序列。
在一些實施例中，第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:146至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:147至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:146至少95%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:147至少95%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:146至少96%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:147至少96%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:146至少97%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:147至少97%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:146至少98%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:147至少98%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:146至少99%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:147至少99%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含：VH，其包含SEQ ID NO:146之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO:147之胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含：VH，其係由SEQ ID NO:146之胺基酸序列所組成；及VL，其係由SEQ ID NO:147之胺基酸序列所組成。
在一些實施例中，第二抗原結合位點包含單鏈可變片段(scFv)，且其中scFv包含：VH，其包含SEQ ID NO:146之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO:147之胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含單鏈可變片段(scFv)，且其中scFv包含與選自由SEQ ID NO: 148及149所組成之群組的序列至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含scFv，且scFv包含與SEQ ID NO:148至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含scFv，且scFv包含與SEQ ID NO:148至少95%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含scFv，且scFv包含與SEQ ID NO:148至少96%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含scFv，且scFv包含與SEQ ID NO:148至少97%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含scFv，且scFv包含與SEQ ID NO:148至少98%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含scFv，且scFv包含與SEQ ID NO:148至少99%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含scFv，且scFv包含SEQ ID NO:148之胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含scFv，且scFv包含SEQ ID NO:148之胺基酸序列。
在一些實施例中，蛋白質包含與SEQ ID NO:198至少90%同一、例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質包含與SEQ ID NO: 198至少95%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質包含與SEQ ID NO:198至少96%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質包含與SEQ ID NO:198至少97%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質包含與SEQ ID NO:198至少98%同一的胺基酸序列。蛋白質包含與SEQ ID NO:198至少99%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質包含SEQ ID NO:198之胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質包含SEQ ID NO:198之胺基酸序列。
在一些實施例中，本揭露提供一種蛋白質，其包含：第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，其中該VH包含SEQ ID NO:95之胺基酸序列，且VL包含SEQ ID NO:85之胺基酸序列；第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含SEQ ID NO:146之胺基酸序列，且VL包含SEQ ID NO:147之胺基酸序列；及抗體Fc域，其包含足以結合CD16之第一抗體Fc域多肽或其部分、及足以結合CD16之第二抗體Fc域多肽或其部分。
在一些實施例中，本揭露提供一種蛋白質，其包含：第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，其中該VH包含SEQ ID NO:95之胺基酸序列，且VL包含SEQ ID NO:85之胺基酸序列；第二抗原結合位點，其包含SEQ ID NO:148之胺基酸序列；及抗體Fc域，其包含足以結合CD16之第一抗體Fc域多肽或其部分、及足以結合CD16之第二抗體Fc域多肽或其部分。
在另一態樣中，本文提供一種蛋白質，其包含：(a)第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)；(b)第二抗原結合位點，其包含：包含選自表2之CDR1、CDR2、及CDR3序列的VH、及包含選自表2之CDR1、CDR2、及CDR3序列的VL；或包含選自表12之CDR1、CDR2、及CDR3序列的VH、及包含選自表12之CDR1、CDR2、及CDR3序列的VL；及(c)足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。在一些實施例中，蛋白質包含(a)第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)；(b)第二抗原結合位點，其包含：包含選自表2之CDR1、CDR2、及CDR3序列的VH、及包含選自表2之CDR1、CDR2、及CDR3序列的VL；或包含選自表12之CDR1、CDR2、及CDR3序列的VH、及包含分別包含SEQ ID NO: 189、190、及143之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3序列的VL；及(c)足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。
在一些實施例中，抗體Fc域係人類IgG1抗體Fc域。在一些實施例中，抗體Fc域或其部分包含與SEQ ID NO:118至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體Fc域或其部分包含與SEQ ID NO:118至少95%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體Fc域或其部分包含與SEQ ID NO:118至少96%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體Fc域或其部分包含與SEQ ID NO:118至少97%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體Fc域或其部分包含與SEQ ID NO:118至少98%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體Fc域之至少一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:118在選自下列之一或多個位置處包含一或多個突變：Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411、及K439，其係根據EU編號系統編號。在一些實施例中，抗體Fc域之至少一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:118包含選自下列之一或多個突變：Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、F405L、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、K409R、T411D、T411E、K439D、及K439E，其係根據EU編號系統編號。在一些實施例中，抗體重鏈恆定區之一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:118在選自下列之一或多個位置處包含一或多個突變：Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411、及K439；且該抗體重鏈恆定區之另一多肽鏈相對於SEQ ID NO:118在選自下列之一或多個位置處包含一或多個突變：Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、D401、F405、Y407、K409、T411、及K439，其係根據EU編號系統編號。
在一些實施例中，抗體重鏈恆定區之一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:118包含K360E及K409W取代；且該抗體重鏈恆定區之另一多肽鏈相對於SEQ ID NO:118包含Q347R、D399V、及F405T取代，其係根據EU編號系統編號。在一些實施例中，抗NKG2D抗體之VH係融合至相對於SEQ ID NO:118包含K360E及K409W取代的第一抗體Fc域多肽之N端，且抗5T4抗體之VH係融合至相對於SEQ ID NO:118包含Q347R、D399V、及F405T取代的第二抗體Fc域多肽之N端，其係根據EU編號系統編號。在一些實施例中，第一抗體Fc域多肽及第二抗體Fc域多肽形成異二聚體。在一些實施例中，異二聚體形成係由下列促進：第一抗體Fc域多肽中之K360E及K409W取代；及第二抗體Fc域多肽中之Q347R、D399V、及F405T取代。在一些實施例中，抗體重鏈恆定區之一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:118包含F405L取代；且該抗體重鏈恆定區之另一多肽鏈相對於SEQ ID NO:118包含K409R取代，其係根據EU編號系統編號。在一些實施例中，抗體重鏈恆定區之一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:118包含Y349C取代；且該抗體重鏈恆定區之另一多肽鏈相對於SEQ ID NO:118包含S354C取代，其係根據EU編號系統編號。在一些實施例中，抗NKG2D抗體之VH係融合至相對於SEQ ID NO:118包含Y349C取代的第一抗體Fc域多肽之N端，且抗5T4抗體之VH係融合至相對於SEQ ID NO:118包含S354C取代的第二抗體Fc域多肽之N端，其係根據EU編號系統編號。在一些實施例中，第一抗體Fc域多肽與第二抗體Fc域多肽形成雙硫鍵。在一些實施例中，雙硫鍵係在第一抗體Fc域多肽中之Y349C取代與第二抗體Fc域多肽中之S354C取代之間形成，其係根據EU編號系統編號。
在一個態樣中，提供一種三特異性抗體，其包含：(a)人類NKG2D結合位點，其係包含VH及VL之Fab片段，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 81、82、及97之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含分別由SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；(b)人類5T4結合位點，其係包含VH及VL之scFv，其中該VH包含分別包含SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含分別包含SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，其中該VH係位於該VL之C端，其中該VH係經由可撓性連接子連接至該VL，該可撓性連接子包含(G4S)4 (SEQ ID NO:119)，且其中雙硫鍵係在該VH之C44與該VL之C100之間形成，其係依Kabat編號方案編號；及(c)人類CD16a結合位點，其係包含下列之人類IgG1抗體Fc域：(i)第一Fc域多肽，其包含與SEQ ID NO:118至少95%同一的胺基酸序列，且相對於SEQ ID NO:118包含Y349C、K360E、及K409W取代，其係根據EU編號系統編號，及(ii)第二Fc域多肽，其包含與SEQ ID NO:118至少95%同一的胺基酸序列，且相對於SEQ ID NO:118包含Q347R、S354C、D399V、及F405T取代，其係根據EU編號系統編號，其中雙硫鍵係在(i)之C349與(ii)之C354之間形成，且其中(i)及(iii)形成異二聚體，其中(a)之該VH係融合至該第一Fc域多肽之N端，且(b)之該VH係經由鉸鏈融合至該第二Fc域多肽之N端，該鉸鏈包含Ala-Ser。在三特異性抗體之一些實施例中，(a)之VH包含SEQ ID NO:95之胺基酸序列，(a)之VL包含SEQ ID NO:85之胺基酸序列，(b)之VH包含SEQ ID NO:146之胺基酸序列，(b)之VL包含SEQ ID NO:147之胺基酸序列，第一Fc域多肽包含與SEQ ID NO:118至少98%同一的胺基酸序列，且第二Fc域多肽包含與SEQ ID NO:118至少98%同一的胺基酸序列。在三特異性抗體之一些實施例中，(b)包含SEQ ID NO:148之胺基酸序列。在一些實施例中，三特異性抗體包含：(a)第一多肽，其包含SEQ ID NO:198之胺基酸序列；(b)第二多肽，其包含SEQ ID NO:199之胺基酸序列；及(c)第三多肽，其包含SEQ ID NO:200之胺基酸序列。
在另一態樣中，本揭露提供一種醫藥配方，其包含：(a)蛋白質，其包含：(i)第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)；(ii)第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL；及(iii)足以結合CD16之抗體Fc域或其部分；(b)緩衝劑，其包含檸檬酸鹽；(c)蔗糖；及(d)聚山梨醇酯，其中該醫藥配方之pH係6.0至7.0。
在一些實施例中，醫藥配方中蛋白質之濃度係1 mg/mL至125 mg/mL。在一些實施例中，醫藥配方中蛋白質之濃度係2 mg/mL至100 mg/mL。在一些實施例中，醫藥配方中蛋白質之濃度係5 mg/mL至50 mg/mL。在一些實施例中，醫藥配方中蛋白質之濃度係7.5 mg/mL至25 mg/mL。在一些實施例中，醫藥配方中蛋白質之濃度係10 mg/mL至20 mg/mL。在一些實施例中，醫藥配方中蛋白質之濃度係約15 mg/mL。
在一些實施例中，醫藥配方中檸檬酸鹽之濃度係15 mM至25 mM。在一些實施例中，醫藥配方中檸檬酸鹽之濃度係17.5 mM至22.5 mM。在一些實施例中，醫藥配方中檸檬酸鹽之濃度係約20 mM。在一些實施例中，醫藥配方中之檸檬酸鹽包含檸檬酸鈉、檸檬酸、或其組合。在一些實施例中，醫藥配方中之緩衝劑包含檸檬酸鈉及檸檬酸之組合。在一些實施例中，醫藥配方中檸檬酸鈉之濃度係17 mM至21 mM。在一些實施例中，醫藥配方中檸檬酸鈉之濃度係約18.9 mM。在一些實施例中，醫藥配方中檸檬酸之濃度係0.5 mM至1.5 mM。在一些實施例中，醫藥配方中檸檬酸之濃度係約1.1 mM。在一些實施例中，醫藥配方中緩衝劑之pH係6.0至7.0。在一些實施例中，醫藥配方中緩衝劑之pH係6.5。
在一些實施例中，醫藥配方中蔗糖之濃度係170 mM至180 mM。在一些實施例中，醫藥配方中蔗糖之濃度係172.5 mM至177.5 mM。在一些實施例中，醫藥配方中蔗糖之濃度係約175.2 mM。
在一些實施例中，醫藥配方中之聚山梨醇酯係聚山梨醇酯80。在一些實施例中，醫藥配方中聚山梨醇酯之濃度係0.05 mg/mL至0.15 mg/mL。在一些實施例中，醫藥配方中聚山梨醇酯之濃度係約0.1 mg/mL。在一些實施例中，醫藥配方之pH係6.5。
本揭露亦提供一種小瓶，其包含醫藥配方，該醫藥配方包含：(a)蛋白質，其包含：(i)第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)；(ii)第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL；及(iii)足以結合CD16之抗體Fc域或其部分；(b)緩衝劑，其包含檸檬酸鹽；(c)蔗糖；及(d)聚山梨醇酯，其中該醫藥配方之pH係6.0至7.0。在一些實施例中，小瓶包含100 mg至200 mg的蛋白質。在一些實施例中，小瓶包含約150 mg的蛋白質。
在一些實施例中，小瓶包含50 mg至60 mg的檸檬酸鈉。在一些實施例中，小瓶包含約55.5 mg的檸檬酸鈉。在一些實施例中，小瓶包含1.5 mg至3 mg的檸檬酸。在一些實施例中，小瓶包含約2.3 mg的檸檬酸。在一些實施例中，小瓶包含500 mg至700 mg的蔗糖。在一些實施例中，小瓶包含約600 mg的蔗糖。在一些實施例中，醫藥配方中之聚山梨醇酯係聚山梨醇酯80。在一些實施例中，小瓶包含0.5 mg至1.5 mg的聚山梨醇酯80。在一些實施例中，小瓶包含約1 mg的聚山梨醇酯80。在一些實施例中，醫藥配方之pH係6.5。在一些實施例中，小瓶包含約10 mL的醫藥配方。
在一些實施例中，在50℃下培養28天之後，醫藥配方中多於93%的蛋白質具有如粒徑篩析層析法所判定之天然構形(native conformation)。
在一些實施例中，醫藥配方中之蛋白質包含：(a)第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)；(b)第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含分別包含SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列的互補決定區1 (CDR1)序列、互補決定區2 (CDR2)序列、及互補決定區3 (CDR3)序列，且該VL包含分別包含SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；及(c)足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。
在一些實施例中，醫藥配方中之蛋白質包含第一抗原結合位點，其中抗NKG2D抗體之VH及VL係Fab片段，且包含抗5T4抗體之VH及VL的第二抗原結合位點係scFv。在一些實施例中，包含抗NKG2D抗體之VH及VL的第一抗原結合位點係scFv，且包含抗5T4抗體之VH及VL的第二抗原結合位點係Fab片段。
在一些實施例中，醫藥配方中之蛋白質進一步包含額外抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL。在一些實施例中，包含抗NKG2D抗體之VH及VL的第一抗原結合位點係scFv，且包含抗5T4抗體之VH及VL的第二抗原結合位點及額外抗原結合位點各自係Fab片段。在一些實施例中，包含抗NKG2D抗體之VH及VL的第一抗原結合位點係scFv，且包含抗5T4抗體之VH及VL的第二抗原結合位點及額外抗原結合位點各自係scFv。在一些實施例中，第二抗原結合位點及額外抗原結合位點之胺基酸序列係同一的。
在一些實施例中，醫藥配方中之蛋白質包含：包含抗NKG2D抗體之VH及VL的scFv，其係經由鉸鏈連接至足以結合CD16之抗體恆定域或其部分，鉸鏈包含Ala-Ser或Gly-Ser。在一些實施例中，醫藥配方中之蛋白質包含：包含抗NKG2D抗體之VH及VL的scFv，其係經由鉸鏈連接至足以結合CD16之抗體恆定域或其部分，鉸鏈包含Ala-Ser。在一些實施例中，包含抗5T4抗體之VH及VL的各scFv係經由鉸鏈連接至足以結合CD16之抗體恆定域或其部分，鉸鏈包含Ala-Ser或Gly-Ser。在一些實施例中，鉸鏈進一步包含胺基酸序列Thr-Lys-Gly。
在一些實施例中，醫藥配方中之蛋白質包含：包含抗NKG2D抗體之VH及VL的scFv，其中scFv之VH與scFv之VL形成雙硫鍵。在一些實施例中，在包含抗5T4抗體之VH及VL的各scFv內，scFv之VH與scFv之VL形成雙硫鍵。在一些實施例中，雙硫鍵係在VH之C44與VL之C100之間形成，其係依Kabat編號方案編號。
在一些實施例中，醫藥配方中之蛋白質包含：包含抗NKG2D抗體之VH及VL的scFv，其中VH係經由可撓性連接子連接至VL。在一些實施例中，在包含抗5T4抗體之VH及VL的各scFv內，VH係經由可撓性連接子連接至VL。在一些實施例中，可撓性連接子包含(G 4S) 4(SEQ ID NO:119)。
在一些實施例中，醫藥配方中之蛋白質包含：包含抗NKG2D抗體之VH及VL的scFv，其中VH係位於VL之C端。在一些實施例中，在包含抗5T4抗體之VH及VL的各scFv內，VH係位於VL之C端。在一些實施例中，在包含抗NKG2D抗體之VH及VL的scFv內，VH係位於VL之N端。在一些實施例中，在包含抗5T4抗體之VH及VL的各scFv內，VH係位於VL之N端。
在一些實施例中，醫藥配方中之蛋白質包含：包含抗NKG2D抗體之VH及VL的Fab片段，其中Fab片段不位於抗原結合位點與Fc或其部分之間。在一些實施例中，無包含抗5T4抗體之VH及VL的Fab片段位於抗原結合位點與Fc或其部分之間。在一些實施例中，包含下列的Fab片段不位於抗原結合位點與Fc或其部分之間：第二抗原結合位點（包含抗5T4抗體之VH及VL）或額外抗原結合位點（包含抗5T4抗體之VH及VL）之VH及VL。
在一些實施例中，醫藥配方中之蛋白質包含結合人類NKG2D之第一抗原結合位點；在一些實施例中，第二抗原結合位點結合人類5T4。在一些實施例中，第二抗原結合位點在LRR1域內結合人類5T4。
在一些實施例中，醫藥配方中之蛋白質包含：包含抗NKG2D抗體之VH及VL的第一抗原結合位點，其包含：VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 81、82、及112之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。
在一些實施例中，醫藥配方中之蛋白質包含：(a)第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，該VH包含分別由SEQ ID NO: 81、82、及112之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含分別由SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；(b)第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，該VH包含分別由SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含分別由SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；及(c)足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。在一些實施例中，包含抗NKG2D抗體之VH及VL的第一抗原結合位點包含：VH，其包含分別由SEQ ID NO: 81、82、及97之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；及VL，其包含分別由SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列。
在一些實施例中，醫藥配方中之蛋白質包含：(a)第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，該VH包含分別由SEQ ID NO: 81、82、及97之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含分別由SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；(b)第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，該VH包含分別由SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含分別由SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；及(c)抗體Fc域，其包含足以結合CD16之第一抗體Fc域多肽或其部分、及足以結合CD16之第二抗體Fc域多肽或其部分；且抗NKG2D抗體之VH或VL係融合至足以結合CD16之第一抗體Fc域多肽或其部分之N端，且抗5T4抗體之VH或VL係融合至足以結合CD16之第二抗體Fc域多肽或其部分之N端。
在一些實施例中，第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:95至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:85至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第一抗原結合位點包含：VH，其包含SEQ ID NO:95之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO:85之胺基酸序列。在一些實施例中，第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:95至少95%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:85至少95%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:95至少96%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:85至少96%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:95至少97%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:85至少97%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:95至少98%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:85至少98%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:95至少99%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:85至少99%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第一抗原結合位點包含：VH，其係由SEQ ID NO:95之胺基酸序列所組成；及VL，其係由SEQ ID NO:85之胺基酸序列所組成。
在一些實施例中，第二抗原結合位點包含：VH，其與SEQ ID NO:144至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一；及VL，其與SEQ ID NO:145至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含：VH，其包含SEQ ID NO:263之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO:145之胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含：VH，其相對於SEQ ID NO:144或SEQ ID NO:263具有G44C取代；及VL，其相對於SEQ ID NO:145具有G100C取代。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含：包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列的VH、及包含SEQ ID NO:145之胺基酸序列的VL；或包含與SEQ ID NO:146至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列的VH、及包含與SEQ ID NO:147至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列的VL。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:146至少95%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:147至少95%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:146至少96%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:147至少96%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:146至少97%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:147至少97%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:146至少98%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:147至少98%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:146至少99%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:147至少99%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含：VH，其包含SEQ ID NO:146之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO:147之胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含：VH，其係由SEQ ID NO:146之胺基酸序列所組成；及VL，其係由SEQ ID NO:147之胺基酸序列所組成。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含：VH，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO:145之胺基酸序列。
在一些實施例中，醫藥配方中之蛋白質之第二抗原結合位點包含單鏈可變片段(scFv)，且scFv包含：VH，其包含SEQ ID NO:146之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO:147之胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含單鏈可變片段(scFv)，且scFv包含與選自SEQ ID NO: 148及149的序列至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含scFv，且scFv包含與SEQ ID NO:148至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點包含scFv，且scFv包含SEQ ID NO:148之胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質包含SEQ ID NO:198之胺基酸序列。
在一些實施例中，本揭露提供一種醫藥組成物，其包含：(a)蛋白質，其包含：(i)第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，其中該VH包含SEQ ID NO:95之胺基酸序列，且VL包含SEQ ID NO:85之胺基酸序列；(ii)第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含SEQ ID NO:146之胺基酸序列，且VL包含SEQ ID NO:147之胺基酸序列；及(iii)抗體Fc域，其包含足以結合CD16之第一抗體Fc域多肽或其部分、及足以結合CD16之第二抗體Fc域多肽或其部分；(b)緩衝劑，其包含檸檬酸鹽；(c)蔗糖；及(d)聚山梨醇酯，其中該醫藥配方之pH係6.0至7.0。
在一些實施例中，本揭露提供一種醫藥組成物，其包含：(a)蛋白質，其包含：(i)第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，其中該VH包含SEQ ID NO:95之胺基酸序列，且VL包含SEQ ID NO:85之胺基酸序列；(ii)第二抗原結合位點，其包含SEQ ID NO:148之胺基酸序列；及(iii)抗體Fc域，其包含足以結合CD16之第一抗體Fc域多肽或其部分、及足以結合CD16之第二抗體Fc域多肽或其部分；(b)緩衝劑，其包含檸檬酸鹽；(c)蔗糖；及(d)聚山梨醇酯，其中該醫藥配方之pH係6.0至7.0。
在一些實施例中，本揭露提供一種小瓶，其包含醫藥組成物，該醫藥組成物包含：(a)蛋白質，其包含：(i)第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，其中該VH包含SEQ ID NO:95之胺基酸序列，且VL包含SEQ ID NO:85之胺基酸序列；(ii)第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含SEQ ID NO:146之胺基酸序列，且VL包含SEQ ID NO:147之胺基酸序列；及(iii)抗體Fc域，其包含足以結合CD16之第一抗體Fc域多肽或其部分、及足以結合CD16之第二抗體Fc域多肽或其部分；(b)緩衝劑，其包含檸檬酸鹽；(c)蔗糖；及(d)聚山梨醇酯，其中該醫藥配方之pH係6.0至7.0。
在一些實施例中，本揭露提供一種小瓶，其包含醫藥組成物，該醫藥組成物包含：(a)蛋白質，其包含：(i)第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，其中該VH包含SEQ ID NO:95之胺基酸序列，且VL包含SEQ ID NO:85之胺基酸序列；(ii)第二抗原結合位點，其包含SEQ ID NO:148之胺基酸序列；及(iii)抗體Fc域，其包含足以結合CD16之第一抗體Fc域多肽或其部分、及足以結合CD16之第二抗體Fc域多肽或其部分；(b)緩衝劑，其包含檸檬酸鹽；(c)蔗糖；及(d)聚山梨醇酯，其中該醫藥配方之pH係6.0至7.0。
在一些實施例中，醫藥配方中之蛋白質包含：(a)第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)；(b)第二抗原結合位點，其包含：包含選自表2之CDR1、CDR2、及CDR3序列的VH、及包含選自表2之CDR1、CDR2、及CDR3序列的VL；或包含選自表12之CDR1、CDR2、及CDR3序列的VH、及包含選自表12之CDR1、CDR2、及CDR3序列的VL；及(c)足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。在一些實施例中，醫藥配方中之蛋白質包含：(a)第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)；(b)第二抗原結合位點，其包含：包含選自表2之CDR1、CDR2、及CDR3序列的VH、及包含選自表2之CDR1、CDR2、及CDR3序列的VL；或包含選自表12之CDR1、CDR2、及CDR3序列的VH、及包含分別包含SEQ ID NO: 189、190、及143之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3序列的VL；及(c)足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。
在一些實施例中，抗體Fc域係人類IgG1抗體Fc域。在一些實施例中，抗體Fc域或其部分包含與SEQ ID NO:118至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體Fc域之至少一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:118在選自下列之一或多個位置處包含一或多個突變：Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411、及K439，其係根據EU編號系統編號。在一些實施例中，抗體Fc域之至少一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:118包含選自下列之一或多個突變：Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、F405L、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、K409R、T411D、T411E、K439D、及K439E，其係根據EU編號系統編號。在一些實施例中，抗體重鏈恆定區之一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:118在選自下列之一或多個位置處包含一或多個突變：Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411、及K439；且該抗體重鏈恆定區之另一多肽鏈相對於SEQ ID NO:118在選自下列之一或多個位置處包含一或多個突變：Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、D401、F405、Y407、K409、T411、及K439，其係根據EU編號系統編號。在一些實施例中，抗體重鏈恆定區之一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:118包含K360E及K409W取代；且該抗體重鏈恆定區之另一多肽鏈相對於SEQ ID NO:118包含Q347R、D399V、及F405T取代，其係根據EU編號系統編號。在一些實施例中，抗體重鏈恆定區之一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:118包含F405L取代；且該抗體重鏈恆定區之另一多肽鏈相對於SEQ ID NO:118包含K409R取代，其係根據EU編號系統編號。在一些實施例中，抗體重鏈恆定區之一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:118包含Y349C取代；且該抗體重鏈恆定區之另一多肽鏈相對於SEQ ID NO:118包含S354C取代，其係根據EU編號系統編號。
在另一態樣中，本揭露提供一種蛋白質，其包含：(a)第一多肽，其包含與SEQ ID NO:198至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列；(b)第二多肽，其包含與SEQ ID NO:199至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列；及(c)第三多肽，其包含與SEQ ID NO:200至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質包含(a)第一多肽，其包含與SEQ ID NO:198至少95%同一的胺基酸序列；(b)第二多肽，其包含與SEQ ID NO:199至少95%同一的胺基酸序列；及(c)第三多肽，其包含與SEQ ID NO:200至少95%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質包含(a)第一多肽，其包含與SEQ ID NO:198至少96%同一的胺基酸序列；(b)第二多肽，其包含與SEQ ID NO:199至少96%同一的胺基酸序列；及(c)第三多肽，其包含與SEQ ID NO:200至少96%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質包含(a)第一多肽，其包含與SEQ ID NO:198至少96%同一的胺基酸序列；(b)第二多肽，其包含與SEQ ID NO:199至少96%同一的胺基酸序列；及(c)第三多肽，其包含與SEQ ID NO:200至少96%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質包含(a)第一多肽，其包含與SEQ ID NO:198至少97%同一的胺基酸序列；(b)第二多肽，其包含與SEQ ID NO:199至少97%同一的胺基酸序列；及(c)第三多肽，其包含與SEQ ID NO:200至少97%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質包含(a)第一多肽，其包含與SEQ ID NO:198至少98%同一的胺基酸序列；(b)第二多肽，其包含與SEQ ID NO:199至少98%同一的胺基酸序列；及(c)第三多肽，其包含與SEQ ID NO:200至少98%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質包含(a)第一多肽，其包含與SEQ ID NO:198至少99%同一的胺基酸序列；(b)第二多肽，其包含與SEQ ID NO:199至少99%同一的胺基酸序列；及(c)第三多肽，其包含與SEQ ID NO:200至少99%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質包含(a)第一多肽，其包含SEQ ID NO:198之胺基酸序列；(b)第二多肽，其包含SEQ ID NO:199之胺基酸序列；及(c)第三多肽，其包含SEQ ID NO:200之胺基酸序列。在蛋白質之某些實施例中，i)人類NKG2D結合位點係由SEQ ID NO:199中之VH (SEQ ID NO:95)及SEQ ID NO:200中之VL (SEQ ID NO:85)形成，ii)人類5T4結合位點係由SEQ ID NO:198中之VH (SEQ ID NO:146)及SEQ ID NO:198中之VL (SEQ ID NO:147)形成，且iii)人類CD16a結合位點係由SEQ ID NO:198中之Fc結合域多肽及SEQ ID NO:199中之Fc結合域多肽形成。在蛋白質之某些實施例中，i)雙硫鍵係在SEQ ID NO:146中之C44與SEQ ID NO:147中之C100之間形成，其係依Kabat編號方案編號，ii)雙硫鍵係在SEQ ID NO:199中之C349與SEQ ID NO:198中之C354之間形成，其係根據EU編號系統編號，且iii)異二聚體係在SEQ ID NO:198中之Fc域與SEQ ID NO:199中之Fc域之間形成。在一些實施例中，蛋白質係三特異性抗體。在一些實施例中，三特異性抗體能夠結合至NK細胞表面上之人類NKG2D及人類CD16a及結合至腫瘤細胞表面上之人類5T4。
在另一態樣中，醫藥配方或小瓶中之蛋白質包含：(i)第一多肽，其包含與SEQ ID NO:198至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列；(ii)第二多肽，其包含與SEQ ID NO:199至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列；及(ii)第三多肽，其包含與SEQ ID NO:200至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質包含(a)第一多肽，其包含與SEQ ID NO:198至少95%同一的胺基酸序列；(b)第二多肽，其包含與SEQ ID NO:199至少95%同一的胺基酸序列；及(c)第三多肽，其包含與SEQ ID NO:200至少95%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質包含(a)第一多肽，其包含與SEQ ID NO:198至少96%同一的胺基酸序列；(b)第二多肽，其包含與SEQ ID NO:199至少96%同一的胺基酸序列；及(c)第三多肽，其包含與SEQ ID NO:200至少96%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質包含(a)第一多肽，其包含與SEQ ID NO:198至少96%同一的胺基酸序列；(b)第二多肽，其包含與SEQ ID NO:199至少96%同一的胺基酸序列；及(c)第三多肽，其包含與SEQ ID NO:200至少96%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質包含(a)第一多肽，其包含與SEQ ID NO:198至少97%同一的胺基酸序列；(b)第二多肽，其包含與SEQ ID NO:199至少97%同一的胺基酸序列；及(c)第三多肽，其包含與SEQ ID NO:200至少97%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質包含(a)第一多肽，其包含與SEQ ID NO:198至少98%同一的胺基酸序列；(b)第二多肽，其包含與SEQ ID NO:199至少98%同一的胺基酸序列；及(c)第三多肽，其包含與SEQ ID NO:200至少98%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質包含(a)第一多肽，其包含與SEQ ID NO:198至少99%同一的胺基酸序列；(b)第二多肽，其包含與SEQ ID NO:199至少99%同一的胺基酸序列；及(c)第三多肽，其包含與SEQ ID NO:200至少99%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質包含(a)第一多肽，其包含SEQ ID NO:198之胺基酸序列；(b)第二多肽，其包含SEQ ID NO:199之胺基酸序列；及(c)第三多肽，其包含SEQ ID NO:200之胺基酸序列。在蛋白質之某些實施例中，i)人類NKG2D結合位點係由SEQ ID NO:199中之VH (SEQ ID NO:95)及SEQ ID NO:200中之VL (SEQ ID NO:85)形成，ii)人類5T4結合位點係由SEQ ID NO:198中之VH (SEQ ID NO:146)及SEQ ID NO:198中之VL (SEQ ID NO:147)形成，且iii)人類CD16a結合位點係由SEQ ID NO:198中之Fc結合域多肽及SEQ ID NO:199中之Fc結合域多肽形成。在蛋白質之某些實施例中，i)雙硫鍵係在SEQ ID NO:146中之C44與SEQ ID NO:147中之C100之間形成，其係依Kabat編號方案編號，ii)雙硫鍵係在SEQ ID NO:199中之C349與SEQ ID NO:198中之C354之間形成，其係根據EU編號系統編號，且iii)異二聚體係在SEQ ID NO:198中之Fc域與SEQ ID NO:199中之Fc域之間形成。在一些實施例中，蛋白質係三特異性抗體。在一些實施例中，三特異性抗體能夠結合至NK細胞表面上之人類NKG2D及人類CD16a及結合至腫瘤細胞表面上之人類5T4。
在另一態樣中，本揭露提供一種醫藥組成物，其包含本文所提供之蛋白質及醫藥上可接受之載劑。
在另一態樣中，本揭露提供一種細胞，其包含編碼本文所提供之蛋白質之一或多種核酸。
在另一態樣中，本揭露提供一種增強腫瘤細胞死亡之方法，該方法包含使該腫瘤細胞及自然殺手細胞暴露於有效量的本文所提供之蛋白質或本文所提供之醫藥組成物。在另一態樣中，提供一種本文所提供之蛋白質或本文所提供之醫藥組成物用於增強腫瘤細胞死亡之用途，其藉由使該腫瘤細胞及自然殺手細胞暴露於有效量的該蛋白質或醫藥組成物（包含此類蛋白質）。在另一態樣中，提供本文所提供之蛋白質或本文所提供之醫藥組成物，其用於增強腫瘤細胞死亡，其藉由使該腫瘤細胞及自然殺手細胞暴露於有效量的該蛋白質或醫藥組成物（包含此類蛋白質）。
在另一態樣中，本揭露提供一種增強癌相關纖維母細胞(cancer-associated fibroblast, CAF)細胞死亡之方法，該方法包含使該CAF及自然殺手細胞暴露於有效量的本文所提供之蛋白質或本文所提供之醫藥組成物。在另一態樣中，提供一種本文所提供之蛋白質或本文所提供之醫藥組成物用於增強癌相關纖維母細胞(CAF)細胞死亡之用途，其藉由使該CAF及自然殺手細胞暴露於有效量的該蛋白質或醫藥組成物（包含此類蛋白質）。在另一態樣中，提供本文所提供之蛋白質或本文所提供之醫藥組成物，其用於增強癌相關纖維母細胞(CAF)細胞死亡，其藉由使該CAF及自然殺手細胞暴露於有效量的該蛋白質或醫藥組成物（包含此類蛋白質）。
在另一態樣中，本揭露提供一種治療癌症之方法，該方法包含向有需要之對象投予有效量的本文所提供之蛋白質或本文所提供之醫藥組成物。在另一態樣中，提供一種本文所提供之蛋白質或本文所提供之醫藥組成物用於治療癌症之用途。在另一態樣中，提供本文所提供之蛋白質或本文所提供之醫藥組成物，其用於治療癌症。在一些實施例中，癌症係選自由下列所組成之群組：結腸直腸癌、卵巢癌、非小細胞肺癌、腎癌、乳癌（例如激素受體陽性(HR+)乳癌）、子宮內膜癌、鱗狀細胞癌、頭頸鱗狀細胞癌、子宮癌、胰臟癌、間皮瘤、及胃癌。在一些實施例中，癌症係轉移性癌症。在一些實施例中，對象對化學療法呈難治性。在一些實施例中，其中該方法增加對象之整體存活期及/或無進展存活期。
在一些實施例中，5T4係由癌細胞表現。在一些實施例中，5T4係由癌相關纖維母細胞表現。在一些實施例中，相對於正常細胞，5T4係以高水平表現。在一些實施例中，相對於正常細胞，5T4係以低水平表現。
在一些實施例中，本文所提供之蛋白質係純化蛋白質。在一些實施例中，本文所提供之三特異性抗體係純化三特異性抗體。在一些實施例中，蛋白質或三特異性抗體係使用選自由下列所組成之群組的方法純化：離心、深層過濾、細胞裂解、均質化、冷凍解凍、親和純化、凝膠過濾、離子交換層析法、疏水性交互作用交換層析法、及混合模式層析法。
相關申請案之交互參照
本申請案依據35 U.S.C. § 119(e)主張2021年12月8日申請之美國臨時專利申請案第63/287,524號及2022年9月15日申請之美國臨時專利申請案第63/375,826號之權益，其等全文出於所有目的特此以引用方式併入本文中。 序列表
本申請案含有以.XML檔案格式電子提交之序列表，且其全文特此以引用方式併入本文中。該.XML副本（建立於2022年11月22日）係命名為DFY-124-TW-NP_SL.xml，且檔案大小為572,081位元組。
本申請案提供多特異性結合蛋白，其結合自然殺手細胞上之NKG2D受體及CD16受體、及癌細胞上之5T4。在一些實施例中，多特異性結合蛋白進一步包括結合5T4之額外抗原結合位點。本申請案亦提供：醫藥組成物，其包含此類多特異性結合蛋白；及治療方法，其使用此類多特異性結合蛋白及醫藥組成物，用於諸如治療癌症之目的。本申請案所述之多特異性結合蛋白之各種態樣係於以下章節中闡述；然而，一個特定章節所述之多特異性結合蛋白之態樣不限於任何特定章節。
為了促進對本申請案之理解，以下定義許多用語及片語。
除非上下文不適當，否則如本文中所使用，用語「一(a/an)」意指「一或多(one or more)」且包括複數。
如本文中所使用，用語「抗原結合位點(antigen-binding site)」係指參與抗原結合之免疫球蛋白分子之部分。在人類抗體中，抗原結合位點係由重（「H」）鏈及輕（「L」）鏈之N端可變（「V」）區之胺基酸殘基形成。重鏈及輕鏈之V區內的三個高度相異延伸(highly divergent stretch)係稱為「高度變異區(hypervariable region)」，其插入更為保守的側翼(flanking)延伸（稱為「構架區(framework region)」或「FR」）之間。因此，用語「FR」係指天然存在於免疫球蛋白中之高度變異區之間且相鄰於該等高度變異區的胺基酸序列。在人類抗體分子中，輕鏈之三個高度變異區及重鏈之三個高度變異區係在三維空間中彼此相對設置，以形成抗原結合表面。抗原結合表面係與所結合抗原之三維表面互補，且重鏈及輕鏈之各者之三個高度變異區係稱為「互補決定區(complementarity-determining region)」或「CDR」。在某些動物（諸如駱駝及軟骨魚）中，抗原結合位點係由提供「單域抗體(single domain antibody)」之單一抗體鏈形成。抗原結合位點可存在於完整抗體、保留抗原結合表面的抗體之抗原結合片段、或重組多肽（諸如scFv）中，其使用肽連接子連接重鏈可變域與輕鏈可變域於單一多肽中。
CDR之胺基酸序列邊界可由所屬技術領域中具有通常知識者使用許多已知編號方案中之任一者判定，包括下列所描述者：Kabat et al., J. Biol. Chem.252, 6609-6616 (1977)及Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991)（「Kabat」編號方案）；Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)、Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948（「Chothia」編號方案）；MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol. 262:732-745（「Contact」編號方案）；Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol., 2003, 27:55-77（「IMGT」編號方案）；及Honegger and Plückthun, J. Mol. Biol., 2001, 309:657-70（「AHo」或「Honegger」編號方案）；其等各者之全文以引用方式併入本文中。可例如使用抗體編號軟體指派CDR，諸如Abnum，其可在www.bioinf.org.uk/abs/abnum/取得，並描述於Abhinandan and Martin, Immunology, 2008, 45:3832-3839（其全文以引用方式併入）中。
如本文中所使用，用語「蛋白質(protein)」意指包含一或多個胺基酸鏈之巨分子。此類胺基酸鏈可稱為多肽，其係由肽鍵連接之連續無支鏈胺基酸鏈。因此，蛋白質可包括單個多肽或多個多肽。
如本文中所使用，用語「腫瘤相關抗原(tumor-associated antigen)」意指任何抗原，包括但不限於與癌症相關之蛋白質、醣蛋白、神經節苷脂、碳水化合物、或脂質。此類抗原可表現於惡性細胞上或腫瘤微環境（諸如腫瘤相關血管、胞外基質、間質基質(mesenchymal stroma)、或免疫浸潤物）中。在本揭露之某些實施例中，用語「腫瘤相關抗原」係指5T4，其係由存在於本揭露之多特異性結合蛋白中的第二及/或額外抗原結合位點靶向。然而，應理解的是，5T4亦可與非腫瘤或癌症之疾病及病症相關。
如本文中所使用，用語「對象(subject)」及「患者(patient)」係指待藉由本文所述之方法及組成物治療的生物體。此類生物體較佳地包括但不限於哺乳動物（例如鼠類、類人猿(simian)、馬、牛、豬、犬科、貓科、及類似者），且更佳地包括人類。
如本文中所使用，用語「有效量(effective amount)」係指足以實現有益或所欲結果的化合物（例如本申請案之化合物）之量。有效量可以一或多次投予、施加、或劑量投予，且其不意欲限於特定配方或投予途徑。如本文中所使用，用語「治療(treating)」包括導致改善病況、疾病、病症、及類似者、或改善其症狀的任何效果，例如減輕(lessening)、減少、調節、改善、或消除。
關於癌症治療，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）可選地與一或多種如本文所述之額外治療劑可(i)減少病變細胞之數目；(ii)減少腫瘤大小；(iii)在一定程度上抑制、阻滯、減緩、且較佳地阻止病變細胞浸潤至周邊器官中；(iv)抑制（例如在一定程度上減緩且較佳地阻止）腫瘤轉移；(v)抑制腫瘤生長；(vi)預防或延緩腫瘤之發生及/或再發；且/或(vii)在一定程度上和緩與癌症或骨髓增生性疾病相關之一或多種症狀。在一些實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）可選地與一或多種如本文所述之額外治療劑可(i)減少癌細胞之數目；(ii)減少腫瘤大小；(iii)在一定程度上抑制、阻滯、減緩、且較佳地阻止癌細胞浸潤至周邊器官中；(iv)抑制（例如在一定程度上減緩且較佳地阻止）腫瘤轉移；(v)抑制腫瘤生長；(vi)預防或延緩腫瘤之發生及/或再發；且/或(vii)在一定程度上和緩與癌症相關之一或多種症狀。在各種實施例中，量足以改善、緩和、減輕、及/或延緩癌症之一或多種症狀。
「增加的(increased)」或「增強的(enhanced)」量（例如關於癌細胞增殖或擴增、抗腫瘤反應、癌細胞轉移）係指本文所述之量或水平的1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、或50或更多倍（例如100、500、1000倍）（包括介於之間及大於1之所有整數及小數點，例如2.1、2.2、2.3、2.4等）增加。亦可包括增加本文所述之量或水平的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少150%、至少200%、至少500%、或至少1000%。
「降低的(decreased)」或「減少的(reduced)」或「較少的(lesser)」量（例如關於腫瘤大小、癌細胞增殖或生長）係指本文所述之量或水平的約1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、或50或更多倍（例如100、500、1000倍）（包括介於之間及大於1之所有整數及小數點，例如1.5、1.6、1.7、1.8等）降低。亦可包括降低本文所述之量或水平的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、或至少90%、至少100%、至少150%、至少200%、至少500%、或至少1000%。在各種實施例中，腫瘤負荷係使用線性尺寸(linear dimensional)方法判定（例如Response Evaluation Criteria in Solid Tumors (RECIST) v1.1 (Eisenhauer, et al., Eur J Cancer. (2009) 45(2):228–47）。在各種實施例中，腫瘤負荷係使用體積分析（例如正子發射斷層造影(PET) /電腦斷層(CT)掃描）判定。參見例如Paydary, et al., Mol Imaging Biol. (2019) 21(1):1-10；Li, et al., AJR Am J Roentgenol. (2021) 217(6):1433-1443；及Kerner, et al., EJNMMI Res. (2016) Dec; 6(1):33。
如本文中所使用，「抗腫瘤效應(anti-tumor effect)」係指可呈現為腫瘤體積降低、腫瘤細胞數目降低、腫瘤細胞增殖降低、轉移數目降低、整體或無進展存活期增加、預期壽命增加、或改善與腫瘤相關之各種生理症狀的生物效應。抗腫瘤效應亦可指預防腫瘤發生或再發，例如緩解後復發。
如本文中所使用，用語「醫藥組成物(pharmaceutical composition)」係指活性劑與惰性或活性載劑之組合，使得組成物尤其適用於體內或離體的診斷或治療用途。
如本文中所使用，用語「醫藥上可接受之載劑(pharmaceutically acceptable carrier)」係指任何標準醫藥載劑，諸如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液（例如諸如油/水或水/油乳液）、及各種類型的潤濕劑。組成物亦可包括穩定劑及防腐劑。關於載劑、穩定劑、及佐劑之實例，參見例如Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA [1975]。
如本文中所使用，用語「醫藥上可接受之鹽(pharmaceutically acceptable salt)」係指本申請案所述之化合物之任何醫藥上可接受之鹽（例如酸或鹼），其在投予至對象後，能夠提供本申請案所述之化合物或其活性代謝物或殘基。如所屬技術領域中具有通常知識者已知的，本申請案所述之化合物之「鹽」可衍生自無機或有機酸及鹼。例示性酸包括但不限於鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、過氯酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、琥珀酸、對甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、及類似者。雖然其他酸（諸如草酸）本身非醫藥上可接受，但其可用於製備可在獲得下列中作為中間物之鹽：本申請案所述之化合物及其醫藥上可接受之酸加成鹽。
例示性鹼包括但不限於鹼金屬（例如鈉）氫氧化物、鹼土金屬（例如鎂）氫氧化物、氨、及式NW 4 +之化合物（其中W係C 1-4烷基）、及類似者。
例示性鹽包括但不限於：乙酸鹽、己二酸鹽、藻酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、氟庚酸鹽(flucoheptanoate)、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、順丁烯二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、草酸鹽、雙羥萘酸鹽(palmoate)、果膠酸鹽(pectinate)、過硫酸鹽、苯丙酸鹽、苦味酸鹽、三甲基乙酸鹽(pivalate)、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一酸鹽、及類似者。鹽之其他實例包括與合適陽離子化合的本申請案所述之化合物之陰離子，陽離子諸如Na +、NH 4 +、及NW 4 +（其中W係C 1-4烷基）、及類似者。
為供治療用途，設想本申請案所述之化合物之鹽係醫藥上可接受的。然而，亦發現非醫藥上可接受之酸及鹼的鹽可用於例如製備或純化醫藥上可接受之化合物。
如本文中所使用，5T4（亦稱為滋養層醣蛋白、TPBG、Wnt活化抑制因子1、WAIF1、M6P1、及5T4AG）係指Uniprot登錄號Q13641之蛋白質及相關異構體及異種同源物。5T4之NCBI基因ID係7162。
在某些實施例中，5T4之低表現係指約5,000至約20,000個複本/細胞，例如約5,000至約10,000、約5,000至約15,000、或約5,000至約20,000個。在某些實施例中，5T4之高表現係指約40,000至約60,000個複本/細胞，例如約40,000至約60,000、約45,000至約60,000、約50,000至約55,000、或約55,000至約60,000個複本/細胞。
如本文中所使用，NKG2D（亦稱為殺手細胞凝集素樣受體K1、D12S2489E、CD314、KLR、殺手細胞凝集素樣受體亞家族K成員1、NKG2-D II型整合膜蛋白、NKG2-D活化NK受體、及NK細胞受體D）係指Uniprot登錄號P26718之蛋白質及相關異構體及異種同源物。NKG2D之NCBI基因ID係22914。
如本文中所使用，關於如本文所述之多特異性結合蛋白或抗原結合片段與目標分子、特定抗原（例如多肽目標）、或特定抗原上之表位之結合，用語「特異性結合(specific binding)」、「特異性結合至(specifically binds to)」、「對……具特異性(specific for)」、「選擇性結合(selectively binds)」、及「對……具選擇性(selective for)」意指在測量上不同於非特異性或非選擇性交互作用（例如與非目標分子）的結合。特異性結合可例如藉由測量與目標分子之結合，並將其及與非目標分子之結合進行比較來測量。特異性結合亦可藉由與對照分子競爭來判定，對照分子模擬目標分子上識別之表位。在此情況下，若多特異性結合蛋白或抗原結合片段與目標分子之結合被對照分子競爭性抑制，則指示特異性結合。「特異性結合至」特定多肽或特定多肽上之表位、或「對」其「具特異性」之如本文所述之多特異性結合蛋白或抗原結合片段係結合至該特定多肽或特定多肽上之表位而未實質結合至任何其他多肽或多肽表位者。在一些情況下，例如以scFv、Fab、或多特異性結合蛋白之其他形式，在約4℃、25℃、37℃、或42℃之溫度下測量，如本文所述之多特異性結合蛋白或抗原結合片段以如本文所述之解離常數(K D)特異性結合至抗原（例如多肽目標）。如本文所述之多特異性結合蛋白或抗原結合片段的親和力可容易地使用習知技術判定，例如下列所描述者：Scatchard et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. USA, 51:660 (1949)、ELISA檢定、生物膜干涉技術(biolayer interferometry, BLI)檢定、及表面電漿共振(SPR)檢定。如本文所述之多特異性結合蛋白或抗原結合片段與其抗原、細胞、或組織之結合性質通常可使用免疫偵測方法判定及評估，免疫偵測方法包括例如基於免疫螢光之檢定，諸如免疫組織化學法(IHC)及/或螢光活化細胞分選(FACS)。通常而言（但不一定），提及「結合」意指「特異性結合」。
在整個描述（其中組成物係描述為具有、包括、或包含特定組分，或其中程序及方法係描述為具有、包括、或包含特定步驟）中，額外地設想到基本上由所述組分所組成或由所述組分所組成的本申請案所述之組成物，並設想到基本上由所述處理步驟所組成或由所述處理步驟所組成的根據本申請案之程序及方法。
就一般情況而言，除非另有說明，否則指定百分比之組成物係以重量計。此外，若變數未伴隨定義，則以變數之先前定義為準。 I. 蛋白質
本申請案提供多特異性結合蛋白，其結合至自然殺手細胞上之NKG2D受體及CD16受體、及表現於癌細胞及/或癌相關纖維母細胞上之5T4。多特異性結合蛋白可用於本文所述之醫藥組成物及治療方法中。多特異性結合蛋白與自然殺手細胞上之NKG2D受體及CD16受體之結合增強自然殺手細胞破壞表現5T4抗原之腫瘤細胞的活性。多特異性結合蛋白與5T4表現性細胞之結合使癌細胞接近自然殺手細胞，其促進自然殺手細胞對腫瘤細胞的直接及間接破壞。結合NKG2D、CD16、及另一目標之多特異性結合蛋白係揭示於國際申請公開案第WO2018148445號及第WO2019157366號，其等全文出於所有目的以引用方式併入本文中。以下提供一些例示性多特異性結合蛋白之進一步描述。
多特異性結合蛋白之第一組分係抗NKG2D抗體之抗原結合位點，其結合至NKG2D。NKG2D係可發現於NKG2D表現性細胞上之受體，該等細胞可包括但不限於NK細胞、γδ T細胞、及CD8 +αβ T細胞。在NKG2D結合後，多特異性結合蛋白可阻斷天然配體（諸如ULBP6及MICA）結合至NKG2D及活化NK細胞。
多特異性結合蛋白之第二組分係抗5T4抗體之抗原結合位點，其結合至5T4。5T4表現性細胞可發現於例如結腸直腸癌、卵巢癌、非小細胞肺癌、腎癌、乳癌（例如激素受體陽性(HR+)乳癌）、子宮內膜癌、鱗狀細胞癌、頭頸鱗狀細胞癌、子宮癌、胰臟癌、間皮瘤、及胃癌。
多特異性結合蛋白之第三組分係足以結合CD16之抗體Fc域或其部分、或結合至表現CD16之細胞之抗原結合位點。CD16係發現於白血球表面上之Fc受體，該等白血球包括自然殺手細胞、巨噬細胞、嗜中性球、嗜酸性球、肥大細胞、及濾泡樹突細胞。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白之第一及第二組分採用本文所述之抗體片段之形式。因此，具有抗NKD2D抗體之VH及VL的抗原結合位點及具有抗5T4抗體之VH及VL的抗原結合位點可獨立地係本文所述之抗體片段中之任一者，在一些實施例中，具有抗NKD2D抗體之VH及VL的抗原結合位點係Fab片段，且具有抗5T4抗體之VH及VL的抗原結合位點係scFv。在一些實施例中，具有抗NKG2D抗體之VH及VL的抗原結合位點係scFv，且包含抗5T4抗體之VH及VL的第二抗原結合位點係Fab片段。
多特異性結合蛋白之額外抗原結合位點亦可結合5T4。在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點係scFv，且結合5T4之第二抗原結合位點及額外抗原結合位點各自係Fab片段。在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點係scFv，且結合5T4之第二抗原結合位點及額外抗原結合位點各自係scFv。在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點係Fab片段，且結合5T4之第二抗原結合位點及額外抗原結合位點各自係scFv。在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點係Fab，且結合5T4之第二抗原結合位點及額外抗原結合位點各自係Fab片段。在一些實施例中，結合NKG2D之Fab片段不位於抗原結合位點與Fc或其部分之間。在一些實施例中，無結合5T4之Fab片段位於抗原結合位點與Fc或其部分之間。
本文所述之多特異性結合蛋白可採用各種形式。例如，一種形式係異二聚體多特異性抗體，其包括第一免疫球蛋白重鏈、第一免疫球蛋白輕鏈、第二免疫球蛋白重鏈、及第二免疫球蛋白輕鏈（ 圖 1）。第一免疫球蛋白重鏈包括第一Fc（鉸鏈-CH2-CH3）域、第一重鏈可變域、及可選地第一CH1重鏈域。第一免疫球蛋白輕鏈包括第一輕鏈可變域及可選地第一輕鏈恆定域。第一免疫球蛋白輕鏈與第一免疫球蛋白重鏈一起形成結合NKG2D之抗原結合位點。第二免疫球蛋白重鏈包含第二Fc（鉸鏈-CH2-CH3）域、第二重鏈可變域、及可選地第二CH1重鏈域。第二免疫球蛋白輕鏈包括第二輕鏈可變域及可選地第二輕鏈恆定域。第二免疫球蛋白輕鏈與第二免疫球蛋白重鏈一起形成結合5T4之抗原結合位點。在一些實施例中，第一Fc域及第二Fc域一起能夠結合至CD16（ 圖 1）。在一些實施例中，第一免疫球蛋白輕鏈係與第二免疫球蛋白輕鏈同一。
抗原結合位點可各自併入抗體重鏈可變域及抗體輕鏈可變域（例如，配置成抗體，或融合在一起形成scFv），或抗原結合位點中之一或多者可係單域抗體，諸如V HH抗體（如駱駝科動物(camelid)抗體）或V NAR抗體（如軟骨魚中所發現者）。
在一些實施例中，第二抗原結合位點併入輕鏈可變域，該輕鏈可變域具有與第一抗原結合位點中存在之輕鏈可變域之胺基酸序列同一的胺基酸序列。
另一例示性形式涉及異二聚體多特異性抗體，其包括第一免疫球蛋白重鏈、第二免疫球蛋白重鏈、及免疫球蛋白輕鏈（例如 圖 2A）。在一些實施例中，第一免疫球蛋白重鏈包括第一Fc（鉸鏈-CH2-CH3）域，其經由連接子或抗體鉸鏈融合至單鏈可變片段(scFv)，該scFv係由重鏈可變域及輕鏈可變域所構成，該重鏈可變域及該輕鏈可變域配對並結合NKG2D或結合5T4。在一些實施例中，第二免疫球蛋白重鏈包括第二Fc（鉸鏈-CH2-CH3）域、第二重鏈可變域、及CH1重鏈域。免疫球蛋白輕鏈包括輕鏈可變域及輕鏈恆定域。在一些實施例中，第二免疫球蛋白重鏈與免疫球蛋白輕鏈配對並結合至NKG2D或結合5T4，前提是當第一Fc域係融合至結合NKG2D之scFv時，與免疫球蛋白輕鏈配對之第二免疫球蛋白重鏈結合5T4但不結合NKG2D，且反之亦然。在一些實施例中，第一免疫球蛋白重鏈中之scFv結合5T4；且第二免疫球蛋白重鏈中之重鏈可變域及免疫球蛋白輕鏈中之輕鏈可變域（當配對時）結合NKG2D（例如 圖 2E）。在一些實施例中，第一免疫球蛋白重鏈中之scFv結合NKG2D；且第二免疫球蛋白重鏈中之重鏈可變域及免疫球蛋白輕鏈中之輕鏈可變域（當配對時）結合5T4。在一些實施例中，第一Fc域及第二Fc域一起能夠結合至CD16（例如 圖 2A）。在一些實施例中，第一Fc域及第二Fc域一起能夠結合至CD16（例如 圖 2A）。
另一例示性形式涉及異二聚體多特異性抗體，其包括第一免疫球蛋白重鏈及第二免疫球蛋白重鏈（例如 圖 2B）。在一些實施例中，第一免疫球蛋白重鏈包括第一Fc（鉸鏈-CH2-CH3）域，其經由連接子或抗體鉸鏈融合至單鏈可變片段(scFv)，該scFv係由重鏈可變域及輕鏈可變域所構成，該重鏈可變域及該輕鏈可變域配對並結合NKG2D或結合5T4。在一些實施例中，第二免疫球蛋白重鏈包括第二Fc（鉸鏈-CH2-CH3）域，其經由連接子或抗體鉸鏈融合至單鏈可變片段(scFv)，該scFv係由重鏈可變域及輕鏈可變域所構成，該重鏈可變域及該輕鏈可變域配對並結合NKG2D或結合5T4，前提是當第一Fc域係融合至結合NKG2D之scFv時，融合至scFv之第二Fc域結合5T4但不結合NKG2D，且反之亦然。在一些實施例中，第一Fc域及第二Fc域一起能夠結合至CD16（例如 圖 2B）。
在一些實施例中，上述單鏈可變片段(scFv)係經由鉸鏈序列連接至抗體恆定域。在一些實施例中，鉸鏈包含胺基酸Ala-Ser或Gly-Ser。在一些實施例中，鉸鏈包含胺基酸Ala-Ser。在一些實施例中，鉸鏈包含胺基酸Ala-Ser。在一些實施例中，連接scFv（例如結合NKG2D之scFv或結合5T4之scFv）及抗體重鏈恆定域之鉸鏈包含胺基酸Ala-Ser。在一些實施例中，連接scFv（例如結合NKG2D之scFv或結合5T4之scFv）及抗體重鏈恆定域之鉸鏈包含胺基酸Gly-Ser。在一些其他實施例中，鉸鏈包含胺基酸Ala-Ser及Thr-Lys-Gly。鉸鏈序列可提供結合至目標抗原的可撓性(flexibility)，並在可撓性與最佳幾何形狀之間取得平衡。
在一些實施例中，上述單鏈可變片段(scFv)包括重鏈可變域及輕鏈可變域。在一些實施例中，重鏈可變域與輕鏈可變域形成雙硫鍵(disulfide bridge)（又名雙硫鍵(disulfide bond)），以增強scFv之穩定性。例如，雙硫鍵可在重鏈可變域之C44殘基與輕鏈可變域之C100殘基之間形成，胺基酸位置係依Kabat編號方案編號。在一些實施例中，重鏈可變域係經由可撓性連接子連接至輕鏈可變域。可使用任何合適的連接子，例如(G 4S) 4連接子((GlyGlyGlyGlySer) 4(SEQ ID NO:119))。在scFv之一些實施例中，重鏈可變域係位於輕鏈可變域之N端。在scFv之一些實施例中，重鏈可變域係位於輕鏈可變域之C端。在一些實施例中，在包含抗NKG2D抗體之VH及VL的scFv內，VH係位於VL之N端。在一些實施例中，在包含抗5T4抗體之VH及VL的各scFv內，VH係位於VL之N端。
本文所述之多特異性結合蛋白可進一步包括一或多個額外抗原結合位點。（多個）額外抗原結合位點可以可選地經由連接子序列融合至恆定區CH2域之N端或恆定區CH3域之C端。在某些實施例中，（多個）額外抗原結合位點採用可選地經雙硫鍵穩定之單鏈可變區(scFv)之形式，因而產生四價或三價多特異性結合蛋白。例如，多特異性結合蛋白包括結合NKG2D之第一抗原結合位點、結合5T4之第二抗原結合位點、結合5T4之額外抗原結合位點、及足以結合CD16之抗體恆定區或其部分或結合CD16之第四抗原結合位點。此等抗原結合位點中之任一者可採用Fab片段或scFv（諸如上述scFv）之形式。
在一些實施例中，額外抗原結合位點結合與第二抗原結合位點不同的5T4之表位。在一些實施例中，額外抗原結合位點結合與第二抗原結合位點相同的表位。在一些實施例中，額外抗原結合位點包含與第二抗原結合位點相同的重鏈及輕鏈CDR序列。在一些實施例中，額外抗原結合位點包含與第二抗原結合位點相同的重鏈及輕鏈可變域序列。在一些實施例中，額外抗原結合位點具有與第二抗原結合位點相同的（多個）胺基酸序列。在一些實施例中，額外抗原結合位點包含與第二抗原結合位點之重鏈及輕鏈可變域序列不同的重鏈及輕鏈可變域序列。在一些實施例中，額外抗原結合位點具有與第二抗原結合位點之序列不同的胺基酸序列。在一些實施例中，第二抗原結合位點及額外抗原結合位點結合不同腫瘤相關抗原。在一些實施例中，第二抗原結合位點及額外抗原結合位點結合不同抗原。例示性形式係顯示 圖 2C及 圖 2D中。因此，多特異性結合蛋白可提供5T4之雙價銜接。多特異性結合蛋白與5T4之雙價銜接可穩定腫瘤細胞表面上之5T4，並增強NK細胞對腫瘤細胞的細胞毒性。多特異性結合蛋白與5T4之雙價銜接可賦予多特異性結合蛋白與腫瘤細胞之較強結合，藉以促進NK細胞對腫瘤細胞（尤其是對表現低水平5T4之腫瘤細胞）的較強細胞毒性反應。
多特異性結合蛋白可採用額外形式。在一些實施例中，多特異性結合蛋白係呈三功能抗體形式（ 圖 3），其係維持類IgG形狀之三功能性雙特異性抗體。此嵌合體係由兩個半抗體所組成，其等各具有一個輕鏈及一個重鏈（源自兩種親本抗體）。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白係呈KiH共同輕鏈(LC)形式，其併入鈕扣(KiH)技術（例如 圖 4所表示之多特異性結合蛋白）。KiH共同LC形式係異二聚體，其包含結合至第一目標之Fab、結合至第二目標之Fab、及藉由異二聚化突變穩定之Fc域。兩個Fab各自包含重鏈及輕鏈，其中各Fab之重鏈與另一者不同，且與各個各別重鏈配對之輕鏈係兩個Fab共有的。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白係KiH形式，其涉及鈕扣(KiH)技術。KiH涉及將C H3域工程改造以在各重鏈中建立「鈕(knob)」或「孔(hole)」，以促進異二聚化。「鈕扣(KiH)」Fc技術背後的概念係將「鈕」引入一個CH3域(CH3A)中，其係藉由將小型殘基用大型者（例如EU編號的T366W CH3A）取代。為了容納「鈕」，藉由將最接近鈕的殘基用較小者（例如T366S/L368A/Y407V CH3B）置換，在另一CH3域(CH3B)上建立互補「孔」表面。將「孔」突變藉由結構化引導之噬菌體庫篩選(structured-guided phage library screening)最佳化(Atwell S, Ridgway JB, Wells JA, Carter P., Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library, J. Mol. Biol.(1997) 270(1):26–35)。KiH Fc變體之X射線晶體結構(Elliott JM, Ultsch M, Lee J, Tong R, Takeda K, Spiess C, et al., Antiparallel conformation of knob and hole aglycosylated half-antibody homodimers is mediated by a CH2-CH3 hydrophobic interaction. J. Mol. Biol.(2014) 426(9):1947–57; Mimoto F, Kadono S, Katada H, Igawa T, Kamikawa T, Hattori K. Crystal structure of a novel asymmetrically engineered Fc variant with improved affinity for FcγRs. Mol. Immunol.(2014) 58(1):132–8)證實，在CH3域間核心界面的立體互補性所驅動之疏水性交互作用在熱力學上有利於異二聚化，而鈕-鈕及孔-孔界面分別因有利交互作用的立體障礙及破壞而不利於同二聚化。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白係呈雙可變域免疫球蛋白(DVD-Ig ™)形式（ 圖 5），其經由可撓性天然存在的連接子組合兩種單株抗體之目標結合域，並產出四價類IgG分子。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白係呈正交Fab界面(Ortho-Fab)形式（ 圖 6）。在正交Fab IgG方法(Lewis SM, Wu X, Pustilnik A, Sereno A, Huang F, Rick HL, et al., Generation of bispecific IgG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface. Nat. Biotechnol.(2014) 32(2):191–8)中，基於結構之區域性設計僅在一個Fab片段中之LC及HC VH-CH1界面引入互補突變，而未對另一Fab片段做出任何改變。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白係呈2合1 Ig形式（ 圖 7）。在一些實施例中，多特異性結合蛋白係呈ES形式（ 圖 8），其係異二聚體構築體，其含有結合至目標1及目標2之兩個不同Fab片段，該等Fab片段係融合至Fc。藉由Fc中之靜電轉向(electrostatic steering)突變確保異二聚化。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白係呈ĸλ-Body形式，其係具有兩個不同Fab片段之異二聚體構築體，該等Fab片段係融合至Fc（藉由異二聚化突變穩定）：靶向抗原1之Fab片段1含有κLC，且靶向抗原2之Fab片段2含有λLC。 圖 13A係一種ĸλ-Body形式的例示性圖示； 圖 13B係另一種ĸλ-Body的例示性圖示。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白係呈Fab臂交換形式（ 圖 9 ），其藉由下列交換Fab片段臂：將重鏈及附接之輕鏈（半分子）換成來自另一分子之重-輕鏈對，因而產生雙特異性抗體。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白係呈SEED Body形式（ 圖 10）。將股交換工程改造域(strand-exchange engineered domain, SEED)平台設計為產生不對稱且類似雙特異性抗體的分子，即擴增天然抗體之治療性應用的能力。此蛋白質工程改造平台係基於在保守CH3域內交換免疫球蛋白之結構相關序列。SEED設計允許有效產生AG/GA異二聚體，而不利於AG及GA SEED CH3域的同二聚化。(Muda M. et al., Protein Eng. Des. Sel. (2011, 24(5):447-54))。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白係呈LuZ-Y形式（ 圖 11），其中白胺酸拉鏈係用以誘導兩個不同HC的異二聚化。(Wranik, BJ. et al., J. Biol. Chem.(2012), 287:43331-9)。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白係呈Cov-X-Body形式（ 圖 12）。在雙特異性CovX-Body中，兩個不同肽係使用支鏈氮呾酮(azetidinone)連接子連接在一起，並在輕度條件下以位點特異性方式融合至支架抗體。藥效團負責功能活性，而抗體支架賦予長半衰期及Ig樣分布。藥效團可經化學最佳化，或用其他藥效團置換，以產生最佳化或獨特雙特異性抗體。(Doppalapudi VR et al., PNAS(2010), 107(52); 22611-22616)。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白係呈OAsc-Fab異二聚體形式（ 圖 14），其包括結合至目標1之Fab片段及結合至目標2之scFab（融合至Fc）。藉由Fc中之突變確保異二聚化。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白係呈DuetMab形式（ 圖 15），其係異二聚體構築體，其含有：兩個不同Fab片段，其結合至抗原1及2；及Fc，其係藉由異二聚化突變穩定。Fab片段1及2含有差別性S-S鍵，其確保正確的LC及HC配對。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白係呈CrossmAb形式（ 圖 16），其係異二聚體構築體，其具有結合至目標1及目標2之兩個不同Fab片段，該等Fab片段係融合至Fc（藉由異二聚化穩定）。將CL及CH1域與VH及VL域切換，例如，CH1係與VL框內融合，且CL係與VH框內融合。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白係呈Fit-Ig形式（ 圖 17），其係同二聚體構築體，其中結合至抗原2之Fab片段係融合至結合至抗原1之Fab片段之HC之N端。構築體含有野生型Fc。
在一些實施例中，本文所提供之多特異性結合蛋白可呈所屬技術領域中熟知的形式，包括但不限於Fab片段、Fab'片段、F(ab') 2片段、Fv、雙特異性抗體、雙特異性Fab2、雙特異性(mab) 2、人源化抗體、雙特異性T細胞銜接器、雙特異性NK細胞銜接器、單鏈抗體（例如單鏈可變片段或scFv）、三功能抗體、鈕扣(kih) IgG（具有共同輕鏈）、crossmab、ortho-Fab IgG、DVD-Ig、2合1-IgG、IgG-scFv、sdFv2-Fc、雙奈米抗體(bi-nanobody)、tandAb、雙親和力重靶向抗體(dual-affinity retargeting antibody, DART)、DART-Fc、scFv-HSA-scFv（其中HSA =人類血清白蛋白）、或對接及鎖定(dock-and-lock, DNL)-Fab3。
以下更詳細描述多特異性結合蛋白之個別組分。 NKG2D結合位點或NKG2D結合域
在結合至自然殺手細胞上之NKG2D受體及CD16受體、及5T4後，多特異性結合蛋白可銜接多於一種NK活化受體，且可阻斷天然配體與NKG2D之結合。在某些實施例中，蛋白質可促效人類之NK細胞。在一些實施例中，蛋白質可促效人類及其他物種（諸如囓齒動物及食蟹獼猴）之NK細胞。在一些實施例中，蛋白質可促效人類及其他物種（諸如食蟹獼猴）之NK細胞。
表1列出重鏈可變域及輕鏈可變域之多肽序列，其等組合可結合至NKG2D。在一些實施例中，重鏈可變域及輕鏈可變域係以Fab形式配置。在一些實施例中，重鏈可變域及輕鏈可變域係融合在一起以形成scFv。
表1所列之NKG2D結合位點或NKG2D結合域可改變其對NKG2D之結合親和力，然而其等皆活化人類NK細胞。
除非另有指示，否則 表 1所提供之CDR序列係依Kabat編號方案判定。表1A提供根據Kabat編號方案之CDR序列。表1B提供根據Chothia編號方案之CDR序列。表1C提供根據IMGT編號方案之CDR序列。表1D提供根據Honegger編號方案之CDR序列。 表1.結合NKG2D之例示性抗原結合位點或抗原結合域之序列
殖株 重鏈可變區胺基酸序列 輕鏈可變區胺基酸序列
ADI-27705 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1) CDR1 (SEQ ID NO:2) – GSFSGYYWS（非Kabat） CDR2 (SEQ ID NO:3) – EIDHSGSTNYNPSLKS CDR3 (SEQ ID NO:4) – ARARGPWSFDP (IMGT) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYPITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:5)
ADI-27724 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:6)
ADI-27740 (A40) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYHSFYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:7)
ADI-27741 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQSNSYYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:8)
ADI-27743 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:9)
ADI-28153 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWGFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:10) ELQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSISSYLNWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYCQQSYDIPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:11)
ADI-28226 (C26) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYGSFPITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:12)
ADI-28154 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQQSKEVPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:13)
ADI-29399 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSFPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:14)
ADI-29401 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYDIYPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:15)
ADI-29403 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYDSYPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:16)
ADI-29405 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYGSFPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:17)
ADI-29407 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYQSFPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:18)
ADI-29419 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYSSFSTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:19)
ADI-29421 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYESYSTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:20)
ADI-29424 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYDSFITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:21)
ADI-29425 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYQSYPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:22)
ADI-29426 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYHSFPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:23)
ADI-29429 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYELYSYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:24)
ADI-29447 (F47) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYDTFITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:25)
ADI-27727 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGDSSIRHAYYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:26) CDR1– GTFSSYAIS（非Kabat）(SEQ ID NO:27)或SYAIS (SEQ ID NO:28) CDR2 (SEQ ID NO:29) – GIIPIFGTANYAQKFQG CDR3 – ARGDSSIRHAYYYYGMDV （非Kabat）(SEQ ID NO:30)或GDSSIRHAYYYYGMDV (SEQ ID NO:31) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPITFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:32) CDR1 (SEQ ID NO:33) – KSSQSVLYSSNNKNYLA CDR2 (SEQ ID NO:34) – WASTRES CDR3 (SEQ ID NO:35) – QQYYSTPIT
ADI-29443 (F43) QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGSDRFHPYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:36) CDR1– GSISSSSYYWG（非Kabat）(SEQ ID NO:37)或SSSYYWG (SEQ ID NO:38) CDR2 (SEQ ID NO:39) – SIYYSGSTYYNPSLKS CDR3 – ARGSDRFHPYFDY（非Kabat）(SEQ ID NO:40)或GSDRFHPYFDY (SEQ ID NO:41) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSRYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQFDTWPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:42) CDR1 (SEQ ID NO:43) – RASQSVSRYLA CDR2 (SEQ ID NO:44) – DASNRAT CDR3 (SEQ ID NO:45) – QQFDTWPPT
ADI-29404 (F04) QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKGLEWIGEIDHSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARGPWSFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:1) DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCEQYDSYPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:46)
ADI-28200 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGRKASGSFYYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:47) CDR1 (SEQ ID NO:27) – GTFSSYAIS（非Kabat） CDR2 (SEQ ID NO:29) – GIIPIFGTANYAQKFQG CDR3 (SEQ ID NO:48) – ARRGRKASGSFYYYYGMDV (IMGT) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCESSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKPLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYSYPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:49) CDR1 (SEQ ID NO:50) – ESSQSLLNSGNQKNYLT CDR2 (SEQ ID NO:34) – WASTRES CDR3 (SEQ ID NO:51) – QNDYSYPYT
ADI-29379 (E79) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGAPNYGDTTHDYYYMDVWGKGTTVTVSS (SEQ ID NO:52) CDR1 (SEQ ID NO:53) – YTFTSYYMH（非Kabat）或SYYMH (SEQ ID NO:54) CDR2 (SEQ ID NO:55) - IINPSGGSTSYAQKFQG CDR3 – ARGAPNYGDTTHDYYYMDV（非Kabat）(SEQ ID NO:56)或GAPNYGDTTHDYYYMDV (SEQ ID NO:57) EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYDDWPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:58) CDR1 (SEQ ID NO:59) - RASQSVSSNLA CDR2 (SEQ ID NO:60) - GASTRAT CDR3 (SEQ ID NO:61) – QQYDDWPFT
ADI-29463 (F63) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDTGEYYDTDDHGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:62) CDR1 - YTFTGYYMH（非Kabat）(SEQ ID NO:63)或GYYMH (SEQ ID NO:64) CDR2 (SEQ ID NO:65) - WINPNSGGTNYAQKFQG CDR3 – ARDTGEYYDTDDHGMDV（非Kabat）(SEQ ID NO:66)或DTGEYYDTDDHGMDV (SEQ ID NO:67) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQDDYWPPTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:68) CDR1 (SEQ ID NO:59) - RASQSVSSNLA CDR2 (SEQ ID NO:60) - GASTRAT CDR3 (SEQ ID NO:69) - QQDDYWPPT
ADI-27744 (A44) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGGYYDSGAGDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:70) CDR1– FTFSSYAMS（非Kabat）(SEQ ID NO:71)或SYAMS (SEQ ID NO:115) CDR2 (SEQ ID NO:72) - AISGSGGSTYYADSVKG CDR3 - AKDGGYYDSGAGDY（非Kabat）(SEQ ID NO:73)或DGGYYDSGAGDY (SEQ ID NO:74) DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIDSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSYPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:75) CDR1 (SEQ ID NO:76) - RASQGIDSWLA CDR2 (SEQ ID NO:77) - AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:78) - QQGVSYPRT
ADI-27749 (A49) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPMGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:79) CDR1 - FTFSSYSMN (SEQ ID NO:80)（非Kabat）或SYSMN (SEQ ID NO:81) CDR2 (SEQ ID NO:82) - SISSSSSYIYYADSVKG CDR3– ARGAPMGAAAGWFDP (SEQ ID NO:83)（非Kabat）或GAPMGAAAGWFDP (SEQ ID NO:84) DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:85) CDR1 (SEQ ID NO:86) - RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:77) - AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:87) - QQGVSFPRT
scFv (VL-VH)，VH中具有Q44C且VL中具有G100C，連接子以斜體表示：DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFG CGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGK CLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPMGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:88)
ADI-29378 (E78) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGAGFAYGMDYYYMDVWGKGTTVTVSS (SEQ ID NO:89) CDR1 – YTFTSYYMH (SEQ ID NO:53)（非Kabat）或SYYMH (SEQ ID NO:54) CDR2 (SEQ ID NO:55) - IINPSGGSTSYAQKFQG CDR3 – AREGAGFAYGMDYYYMDV (SEQ ID NO:90)（非Kabat）或EGAGFAYGMDYYYMDV (SEQ ID NO:91) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSDNWPFTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:92) CDR1 (SEQ ID NO:93) - RASQSVSSYLA CDR2 (SEQ ID NO:44) - DASNRAT CDR3 (SEQ ID NO:94) - QQSDNWPFT
A49MI EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPIGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:95) CDR1：FTFSSYSMN (SEQ ID NO:80)（非Kabat）或SYSMN (SEQ ID NO:81) CDR2：SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:82) CDR3：ARGAPIGAAAGWFDP (SEQ ID NO:96)（非Kabat）或GAPIGAAAGWFDP (SEQ ID NO:97) DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:85) CDR1 (SEQ ID NO:86) - RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:77) - AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:87) - QQGVSFPRT
scFv (VL-VH)，VH中具有Q44C且VL中具有G100C，連接子以斜體表示： DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFG CGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGK CLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPIGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:288)
A49MQ EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPQGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:98) CDR1：FTFSSYSMN (SEQ ID NO:80)（非Kabat）或SYSMN (SEQ ID NO:81) CDR2：SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:82) CDR3 - ARGAPQGAAAGWFDP (SEQ ID NO:99)（非Kabat）或GAPQGAAAGWFDP (SEQ ID NO:100) DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:85) CDR1 (SEQ ID NO:86) - RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:77) - AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:87) - QQGVSFPRT   
A49ML EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPLGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:101) CDR1：FTFSSYSMN (SEQ ID NO:80)（非Kabat）或SYSMN (SEQ ID NO:81) CDR2：SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:82) CDR3 – ARGAPLGAAAGWFDP (SEQ ID NO:102)（非Kabat）或GAPLGAAAGWFDP (SEQ ID NO:103) DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:85) CDR1 (SEQ ID NO:86) - RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:77) - AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:87) - QQGVSFPRT
A49MF EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPFGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:104) CDR1：FTFSSYSMN (SEQ ID NO:80)（非Kabat）或SYSMN (SEQ ID NO:81) CDR2：SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:82) CDR3 - ARGAPFGAAAGWFDP (SEQ ID NO:105)（非Kabat）或GAPFGAAAGWFDP (SEQ ID NO:106) DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:85) CDR1 (SEQ ID NO:86) - RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:77) - AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:87) - QQGVSFPRT
A49MV EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPVGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:107) CDR1：FTFSSYSMN (SEQ ID NO:80)（非Kabat）或SYSMN (SEQ ID NO:81) CDR2：SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:82) CDR3– ARGAPVGAAAGWFDP (SEQ ID NO:108)（非Kabat）或GAPVGAAAGWFDP (SEQ ID NO:109) DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:85) CDR1 (SEQ ID NO:86) - RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:77) - AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:87) - QQGVSFPRT
A49-共有 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAP XGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS，其中X係M、L、I、V、Q、或F (SEQ ID NO:110) CDR1：FTFSSYSMN (SEQ ID NO:80)（非Kabat）或SYSMN (SEQ ID NO:81) CDR2：SISSSSSYIYYADSVKG (SEQ ID NO:82) CDR3– ARGAP XGAAAGWFDP (SEQ ID NO:111)（非Kabat）或GAP XGAAAGWFDP (SEQ ID NO:112)，其中X係M、L、I、V、Q、或F DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:85) CDR1 (SEQ ID NO:86) - RASQGISSWLA CDR2 (SEQ ID NO:77) - AASSLQS CDR3 (SEQ ID NO:87) - QQGVSFPRT
US 9,273,136中之NKG2D結合體 QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:113) QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:114)
US 7,879,985中之NKG2D結合體 QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSDDSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGHISYSGSANYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCANWDDAFNIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:116) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:117)
表 1A – 說明性抗 NKG2D 結合抗原結合域之 CDR (Kabat)
Ab 名稱 VH – CDR1 VH – CDR2 VH – CDR3 VL – CDR1 VL – CDR2 VL – CDR3
1 GYYWS SEQ ID NO:298 EIDHSGSTNYNPSLKS SEQ ID NO:3 ARGPWSFDP SEQ ID NO:299 RASQSISSWLA SEQ ID NO:300 KASSLES SEQ ID NO:301 QQYNSYPIT SEQ ID NO:302
2 GYYWS SEQ ID NO:298 EIDHSGSTNYNPSLKS SEQ ID NO:3 ARGPWSFDP SEQ ID NO:299 RASQSVSSSYLA SEQ ID NO:303 GASSRAT SEQ ID NO:304 QQYGSSPIT SEQ ID NO:305
3 GYYWS SEQ ID NO:298 EIDHSGSTNYNPSLKS SEQ ID NO:3 ARGPWSFDP SEQ ID NO:299 RASQSIGSWLA SEQ ID NO:306 KASSLES SEQ ID NO:301 QQYHSFYT SEQ ID NO:307
4 GYYWS SEQ ID NO:298 EIDHSGSTNYNPSLKS SEQ ID NO:3 ARGPWSFDP SEQ ID NO:299 RASQSIGSWLA SEQ ID NO:306 KASSLES SEQ ID NO:301 QQSNSYYT SEQ ID NO:308
5 GYYWS SEQ ID NO:298 EIDHSGSTNYNPSLKS SEQ ID NO:3 ARGPWSFDP SEQ ID NO:299 RASQSISSWLA SEQ ID NO:300 KASSLES SEQ ID NO:301 QQYNSYPT SEQ ID NO:309
6 GYYWS SEQ ID NO:298 EIDHSGSTNYNPSLKS SEQ ID NO:3 ARGPWGFDP SEQ ID NO:310 RTSQSISSYLN SEQ ID NO:311 WASTRES SEQ ID NO:34 QQSYDIPYT SEQ ID NO:312
7 GYYWS SEQ ID NO:298 EIDHSGSTNYNPSLKS SEQ ID NO:3 ARGPWSFDP SEQ ID NO:299 RASQSISSWLA SEQ ID NO:300 KASSLES SEQ ID NO:301 QQYGSFPIT SEQ ID NO:313
8 GYYWS SEQ ID NO:298 EIDHSGSTNYNPSLKS SEQ ID NO:3 ARGPWSFDP SEQ ID NO:299 RASQSISSWLA SEQ ID NO:300 KASSLES SEQ ID NO:301 QQSKEVPWT SEQ ID NO:314
9 GYYWS SEQ ID NO:298 EIDHSGSTNYNPSLKS SEQ ID NO:3 ARGPWSFDP SEQ ID NO:299 RASQSISSWLA SEQ ID NO:300 KASSLES SEQ ID NO:301 QQYNSFPT SEQ ID NO:315
10 GYYWS SEQ ID NO:298 EIDHSGSTNYNPSLKS SEQ ID NO:3 ARGPWSFDP SEQ ID NO:299 RASQSIGSWLA SEQ ID NO:306 KASSLES SEQ ID NO:301 QQYDIYPT SEQ ID NO:316
11 GYYWS SEQ ID NO:298 EIDHSGSTNYNPSLKS SEQ ID NO:3 ARGPWSFDP SEQ ID NO:299 RASQSISSWLA SEQ ID NO:300 KASSLES SEQ ID NO:301 QQYDSYPT SEQ ID NO:317
12 GYYWS SEQ ID NO:298 EIDHSGSTNYNPSLKS SEQ ID NO:3 ARGPWSFDP SEQ ID NO:299 RASQSISSWLA SEQ ID NO:300 KASSLES SEQ ID NO:301 QQYGSFPT SEQ ID NO:318
13 GYYWS SEQ ID NO:298 EIDHSGSTNYNPSLKS SEQ ID NO:3 ARGPWSFDP SEQ ID NO:299 RASQSISSWLA SEQ ID NO:300 KASSLES SEQ ID NO:301 QQYQSFPT SEQ ID NO:319
14 GYYWS SEQ ID NO:298 EIDHSGSTNYNPSLKS SEQ ID NO:3 ARGPWSFDP SEQ ID NO:299 RASQSISSWLA SEQ ID NO:300 KASSLES SEQ ID NO:301 QQYSSFST SEQ ID NO:320
15 GYYWS SEQ ID NO:298 EIDHSGSTNYNPSLKS SEQ ID NO:3 ARGPWSFDP SEQ ID NO:299 RASQSISSWLA SEQ ID NO:300 KASSLES SEQ ID NO:301 QQYESYST SEQ ID NO:321
16 GYYWS SEQ ID NO:298 EIDHSGSTNYNPSLKS SEQ ID NO:3 ARGPWSFDP SEQ ID NO:299 RASQSISSWLA SEQ ID NO:300 KASSLES SEQ ID NO:301 QQYDSFIT SEQ ID NO:322
17 GYYWS SEQ ID NO:298 EIDHSGSTNYNPSLKS SEQ ID NO:3 ARGPWSFDP SEQ ID NO:299 RASQSISSWLA SEQ ID NO:300 KASSLES SEQ ID NO:301 QQYQSYPT SEQ ID NO:323
18 GYYWS SEQ ID NO:298 EIDHSGSTNYNPSLKS SEQ ID NO:3 ARGPWSFDP SEQ ID NO:299 RASQSIGSWLA SEQ ID NO:306 KASSLES SEQ ID NO:301 QQYHSFPT SEQ ID NO:324
19 GYYWS SEQ ID NO:298 EIDHSGSTNYNPSLKS SEQ ID NO:3 ARGPWSFDP SEQ ID NO:299 RASQSIGSWLA SEQ ID NO:306 KASSLES SEQ ID NO:301 QQYELYSYT SEQ ID NO:325
20 GYYWS SEQ ID NO:298 EIDHSGSTNYNPSLKS SEQ ID NO:3 ARGPWSFDP SEQ ID NO:299 RASQSISSWLA SEQ ID NO:300 KASSLES SEQ ID NO:301 QQYDTFIT SEQ ID NO:326
21 SYAIS SEQ ID NO:28 GIIPIFGTANYAQKFQG SEQ ID NO:29 GDSSIRHAYYYYGMDV SEQ ID NO:31 KSSQSVLYSSNNKNYLA SEQ ID NO:33 WASTRES SEQ ID NO:34 QQYYSTPIT SEQ ID NO:35
22 SSSYYWG SEQ ID NO:38 SIYYSGSTYYNPSLKS SEQ ID NO:39 GSDRFHPYFDY SEQ ID NO:41 RASQSVSRYLA SEQ ID NO:43 DASNRAT SEQ ID NO:44 QQFDTWPPT SEQ ID NO:45
23 GYYWS SEQ ID NO:298 EIDHSGSTNYNPSLKS SEQ ID NO:3 ARGPWSFDP SEQ ID NO:299 RASQSIGSWLA SEQ ID NO:306 KASSLES SEQ ID NO:301 EQYDSYPT SEQ ID NO:327
24 SYAIS SEQ ID NO:28 GIIPIFGTANYAQKFQG SEQ ID NO:29 RGRKASGSFYYYYGMDV SEQ ID NO:328 ESSQSLLNSGNQKNYLT SEQ ID NO:50 WASTRES SEQ ID NO:34 QNDYSYPYT SEQ ID NO:51
25 SYYMH SEQ ID NO:54 IINPSGGSTSYAQKFQG SEQ ID NO:55 GAPNYGDTTHDYYYMDV SEQ ID NO:57 RASQSVSSNLA SEQ ID NO:59 GASTRAT SEQ ID NO:60 QQYDDWPFT SEQ ID NO:61
26 GYYMH SEQ ID NO:64 WINPNSGGTNYAQKFQG SEQ ID NO:65 DTGEYYDTDDHGMDV SEQ ID NO:67 RASQSVSSNLA SEQ ID NO:59 GASTRAT SEQ ID NO:60 QQDDYWPPT SEQ ID NO:69
27 SYAMS SEQ ID NO:115 AISGSGGSTYYADSVKG SEQ ID NO:72 DGGYYDSGAGDY SEQ ID NO:74 RASQGIDSWLA SEQ ID NO:76 AASSLQS SEQ ID NO:77 QQGVSYPRT SEQ ID NO:78
28 SYYMH SEQ ID NO:54 IINPSGGSTSYAQKFQG SEQ ID NO:55 EGAGFAYGMDYYYMDV SEQ ID NO:91 RASQSVSSYLA SEQ ID NO:93 DASNRAT SEQ ID NO:44 QQSDNWPFT SEQ ID NO:94
29 SYSMN SEQ ID NO:81 SISSSSSYIYYADSVKG SEQ ID NO:82 GAPXGAAAGWFDP X=M、I、Q、L、F、V SEQ ID NO:112 RASQGISSWLA SEQ ID NO:86 AASSLQS SEQ ID NO:77 QQGVSFPRT SEQ ID NO:87
30 SYSMN SEQ ID NO:81 SISSSSSYIYYADSVKG SEQ ID NO:82 GAPMGAAAGWFDP SEQ ID NO:84 RASQGISSWLA SEQ ID NO:86 AASSLQS SEQ ID NO:77 QQGVSFPRT SEQ ID NO:87
31 SYSMN SEQ ID NO:81 SISSSSSYIYYADSVKG SEQ ID NO:82 GAPIGAAAGWFDP SEQ ID NO:97 RASQGISSWLA SEQ ID NO:86 AASSLQS SEQ ID NO:77 QQGVSFPRT SEQ ID NO:87
32 SYSMN SEQ ID NO:81 SISSSSSYIYYADSVKG SEQ ID NO:82 GAPQGAAAGWFDP SEQ ID NO:100 RASQGISSWLA SEQ ID NO:86 AASSLQS SEQ ID NO:77 QQGVSFPRT SEQ ID NO:87
33 SYSMN SEQ ID NO:81 SISSSSSYIYYADSVKG SEQ ID NO:82 GAPLGAAAGWFDP SEQ ID NO:103 RASQGISSWLA SEQ ID NO:86 AASSLQS SEQ ID NO:77 QQGVSFPRT SEQ ID NO:87
34 SYSMN SEQ ID NO:81 SISSSSSYIYYADSVKG SEQ ID NO:82 GAPFGAAAGWFDP SEQ ID NO:106 RASQGISSWLA SEQ ID NO:86 AASSLQS SEQ ID NO:77 QQGVSFPRT SEQ ID NO:87
35 SYSMN SEQ ID NO:81 SISSSSSYIYYADSVKG SEQ ID NO:82 GAPVGAAAGWFDP SEQ ID NO:109 RASQGISSWLA SEQ ID NO:86 AASSLQS SEQ ID NO:77 QQGVSFPRT SEQ ID NO:87
表 1B – 說明性抗 NKG2D 結合抗原結合域之 CDR (Chothia)
Ab 名稱 VH – CDR1 VH – CDR2 VH – CDR3 VL – CDR1 VL – CDR2 VL – CDR3
36 GGSFSGY SEQ ID NO:329 HSG SEQ ID NO:330 RGPWSFD SEQ ID NO:331 SQSISSW SEQ ID NO:332 KAS SEQ ID NO:333 YNSYPI SEQ ID NO:334
37 GGSFSGY SEQ ID NO:329 HSG SEQ ID NO:330 RGPWSFD SEQ ID NO:331 SQSVSSSY SEQ ID NO:335 GAS SEQ ID NO:336 YGSSPI SEQ ID NO:337
38 GGSFSGY SEQ ID NO:329 HSG SEQ ID NO:330 RGPWSFD SEQ ID NO:331 SQSIGSW SEQ ID NO:338 KAS SEQ ID NO:333 YHSFY SEQ ID NO:339
39 GGSFSGY SEQ ID NO:329 HSG SEQ ID NO:330 RGPWSFD SEQ ID NO:331 SQSIGSW SEQ ID NO:338 KAS SEQ ID NO:333 SNSYY SEQ ID NO:340
40 GGSFSGY SEQ ID NO:329 HSG SEQ ID NO:330 RGPWSFD SEQ ID NO:331 SQSISSW SEQ ID NO:332 KAS SEQ ID NO:333 YNSYP SEQ ID NO:341
41 GGSFSGY SEQ ID NO:329 HSG SEQ ID NO:330 RGPWGFD SEQ ID NO:551 SQSISSY SEQ ID NO:342 WAS SEQ ID NO:343 SYDIPY SEQ ID NO:344
42 GGSFSGY SEQ ID NO:329 HSG SEQ ID NO:330 RGPWSFD SEQ ID NO:331 SQSISSW SEQ ID NO:332 KAS SEQ ID NO:333 YGSFPI SEQ ID NO:345
43 GGSFSGY SEQ ID NO:329 HSG SEQ ID NO:330 RGPWSFD SEQ ID NO:331 SQSISSW SEQ ID NO:332 KAS SEQ ID NO:333 SKEVPW SEQ ID NO:346
44 GGSFSGY SEQ ID NO:329 HSG SEQ ID NO:330 RGPWSFD SEQ ID NO:331 SQSISSW SEQ ID NO:332 KAS SEQ ID NO:333 YNSFP SEQ ID NO:347
45 GGSFSGY SEQ ID NO:329 HSG SEQ ID NO:330 RGPWSFD SEQ ID NO:331 SQSIGSW SEQ ID NO:338 KAS SEQ ID NO:333 YDIYP SEQ ID NO:348
46 GGSFSGY SEQ ID NO:329 HSG SEQ ID NO:330 RGPWSFD SEQ ID NO:331 SQSISSW SEQ ID NO:332 KAS SEQ ID NO:333 YDSYP SEQ ID NO:349
47 GGSFSGY SEQ ID NO:329 HSG SEQ ID NO:330 RGPWSFD SEQ ID NO:331 SQSISSW SEQ ID NO:332 KAS SEQ ID NO:333 YGSFP SEQ ID NO:350
47 GGSFSGY SEQ ID NO:329 HSG SEQ ID NO:330 RGPWSFD SEQ ID NO:331 SQSISSW SEQ ID NO:332 KAS SEQ ID NO:333 YQSFP SEQ ID NO:351
48 GGSFSGY SEQ ID NO:329 HSG SEQ ID NO:330 RGPWSFD SEQ ID NO:331 SQSISSW SEQ ID NO:332 KAS SEQ ID NO:333 YSSFS SEQ ID NO:352
49 GGSFSGY SEQ ID NO:329 HSG SEQ ID NO:330 RGPWSFD SEQ ID NO:331 SQSISSW SEQ ID NO:332 KAS SEQ ID NO:333 YESYS SEQ ID NO:353
50 GGSFSGY SEQ ID NO:329 HSG SEQ ID NO:330 RGPWSFD SEQ ID NO:331 SQSISSW SEQ ID NO:332 KAS SEQ ID NO:333 YDSFI SEQ ID NO:354
51 GGSFSGY SEQ ID NO:329 HSG SEQ ID NO:330 RGPWSFD SEQ ID NO:331 SQSISSW SEQ ID NO:332 KAS SEQ ID NO:333 YQSYP SEQ ID NO:355
52 GGSFSGY SEQ ID NO:329 HSG SEQ ID NO:330 RGPWSFD SEQ ID NO:331 SQSIGSW SEQ ID NO:338 KAS SEQ ID NO:333 YHSFP SEQ ID NO:356
53 GGSFSGY SEQ ID NO:329 HSG SEQ ID NO:330 RGPWSFD SEQ ID NO:331 SQSIGSW SEQ ID NO:338 KAS SEQ ID NO:333 YELYSY SEQ ID NO:357
54 GGSFSGY SEQ ID NO:329 HSG SEQ ID NO:330 RGPWSFD SEQ ID NO:331 SQSISSW SEQ ID NO:332 KAS SEQ ID NO:333 YDTFI SEQ ID NO:358
55 GGTFSSY SEQ ID NO:359 PIFG SEQ ID NO:360 DSSIRHAYYYYGMD SEQ ID NO:361 SQSVLYSSNNKNY SEQ ID NO:362 WAS SEQ ID NO:343 YYSTPI SEQ ID NO:363
56 GGSISSSSY SEQ ID NO:364 YSG SEQ ID NO:365 SDRFHPYFD SEQ ID NO:366 SQSVSRY SEQ ID NO:367 DAS SEQ ID NO:368 FDTWPP SEQ ID NO:369
57 GGSFSGY SEQ ID NO:329 HSG SEQ ID NO:330 RGPWSFD SEQ ID NO:331 SQSISSW SEQ ID NO:332 KAS SEQ ID NO:333 YDSYP SEQ ID NO:349
58 GGTFSSY SEQ ID NO:359 PIFG SEQ ID NO:360 GRKASGSFYYYYGMD SEQ ID NO:370 SQSLLNSGNQKNY SEQ ID NO:371 WAS SEQ ID NO:343 DYSYPY SEQ ID NO:372
59 GYTFTSY SEQ ID NO:186 PSGG SEQ ID NO:373 APNYGDTTHDYYYMD SEQ ID NO:374 SQSVSSN SEQ ID NO:375 GAS SEQ ID NO:336 YDDWPF SEQ ID NO:376
60 GYTFTGY SEQ ID NO:377 PNSG SEQ ID NO:378 TGEYYDTDDHGMD SEQ ID NO:379 SQSVSSN SEQ ID NO:375 GAS SEQ ID NO:336 DDYWPP SEQ ID NO:380
61 GFTFSSY SEQ ID NO:381 GSGG SEQ ID NO:382 GGYYDSGAGD SEQ ID NO:383 SQGIDSW SEQ ID NO:384 AAS SEQ ID NO:385 GVSYPR SEQ ID NO:386
62 GYTFTSY SEQ ID NO:186 PSGG SEQ ID NO:373 GAGFAYGMDYYYMD SEQ ID NO:387 SQSVSSY SEQ ID NO:388 DAS SEQ ID NO:368 SDNWPF SEQ ID NO:389
63 GFTFSSY SEQ ID NO:381 SSSS SEQ ID NO:390 APXGAAAGWFD X=M、I、Q、L、F、V SEQ ID NO:391 SQGISSW SEQ ID NO:392 AAS SEQ ID NO:385 GVSFPR SEQ ID NO:393
64 GFTFSSY SEQ ID NO:381 SSSS SEQ ID NO:390 APMGAAAGWFD SEQ ID NO:394 SQGISSW SEQ ID NO:392 AAS SEQ ID NO:385 GVSFPR SEQ ID NO:393
65 GFTFSSY SEQ ID NO:381 SSSS SEQ ID NO:390 APIGAAAGWFD SEQ ID NO:395 SQGISSW SEQ ID NO:392 AAS SEQ ID NO:385 GVSFPR SEQ ID NO:393
66 GFTFSSY SEQ ID NO:381 SSSS SEQ ID NO:390 APQGAAAGWFD SEQ ID NO:396 SQGISSW SEQ ID NO:392 AAS SEQ ID NO:385 GVSFPR SEQ ID NO:393
67 GFTFSSY SEQ ID NO:381 SSSS SEQ ID NO:390 APLGAAAGWFD SEQ ID NO:397 SQGISSW SEQ ID NO:392 AAS SEQ ID NO:385 GVSFPR SEQ ID NO:393
68 GFTFSSY SEQ ID NO:381 SSSS SEQ ID NO:390 APFGAAAGWFD SEQ ID NO:398 SQGISSW SEQ ID NO:392 AAS SEQ ID NO:385 GVSFPR SEQ ID NO:393
69 GFTFSSY SEQ ID NO:381 SSSS SEQ ID NO:390 APVGAAAGWFD SEQ ID NO:399 SQGISSW SEQ ID NO:392 AAS SEQ ID NO:385 GVSFPR SEQ ID NO:393
表 1C – 說明性抗 NKG2D 結合抗原結合域之 CDR (IMGT)
Ab 名稱 VH – CDR1 VH – CDR2 VH – CDR3 VL – CDR1 VL – CDR2 VL – CDR3  
70 GGSFSGYY SEQ ID NO:400 IDHSGST SEQ ID NO:401 ARARGPWSFDP SEQ ID NO:4 QSISSW SEQ ID NO:402 KAS SEQ ID NO:333 QQYNSYPIT SEQ ID NO:302  
71 GGSFSGYY SEQ ID NO:400 IDHSGST SEQ ID NO:401 ARARGPWSFDP SEQ ID NO:4 QSVSSSY SEQ ID NO:552 GAS SEQ ID NO:336 QQYGSSPIT SEQ ID NO:305  
72 GGSFSGYY SEQ ID NO:400 IDHSGST SEQ ID NO:401 ARARGPWSFDP SEQ ID NO:4 QSIGSW SEQ ID NO:403 KAS SEQ ID NO:333 QQYHSFYT SEQ ID NO:307  
73 GGSFSGYY SEQ ID NO:400 IDHSGST SEQ ID NO:401 ARARGPWSFDP SEQ ID NO:4 QSIGSW SEQ ID NO:403 KAS SEQ ID NO:333 QQSNSYYT SEQ ID NO:308  
74 GGSFSGYY SEQ ID NO:400 IDHSGST SEQ ID NO:401 ARARGPWSFDP SEQ ID NO:4 QSISSW SEQ ID NO:402 KAS SEQ ID NO:333 QQYNSYPT SEQ ID NO:309  
75 GGSFSGYY SEQ ID NO:400 IDHSGST SEQ ID NO:401 ARARGPWGFDP SEQ ID NO:404 QSISSY SEQ ID NO:405 WAS SEQ ID NO:343 QQSYDIPYT SEQ ID NO:312  
76 GGSFSGYY SEQ ID NO:400 IDHSGST SEQ ID NO:401 ARARGPWSFDP SEQ ID NO:4 QSISSW SEQ ID NO:402 KAS SEQ ID NO:333 QQYGSFPIT SEQ ID NO:313  
77 GGSFSGYY SEQ ID NO:400 IDHSGST SEQ ID NO:401 ARARGPWSFDP SEQ ID NO:4 QSISSW SEQ ID NO:402 KAS SEQ ID NO:333 QQSKEVPWT SEQ ID NO:314  
78 GGSFSGYY SEQ ID NO:400 IDHSGST SEQ ID NO:401 ARARGPWSFDP SEQ ID NO:4 QSISSW SEQ ID NO:402 KAS SEQ ID NO:333 QQYNSFPT SEQ ID NO:315  
79 GGSFSGYY SEQ ID NO:400 IDHSGST SEQ ID NO:401 ARARGPWSFDP SEQ ID NO:4 QSIGSW SEQ ID NO:403 KAS SEQ ID NO:333 QQYDIYPT SEQ ID NO:316  
80 GGSFSGYY SEQ ID NO:400 IDHSGST SEQ ID NO:401 ARARGPWSFDP SEQ ID NO:4 QSISSW SEQ ID NO:402 KAS SEQ ID NO:333 QQYDSYPT SEQ ID NO:317  
81 GGSFSGYY SEQ ID NO:400 IDHSGST SEQ ID NO:401 ARARGPWSFDP SEQ ID NO:4 QSISSW SEQ ID NO:402 KAS SEQ ID NO:333 QQYGSFPT SEQ ID NO:318  
82 GGSFSGYY SEQ ID NO:400 IDHSGST SEQ ID NO:401 ARARGPWSFDP SEQ ID NO:4 QSISSW SEQ ID NO:402 KAS SEQ ID NO:333 QQYQSFPT SEQ ID NO:319  
83 GGSFSGYY SEQ ID NO:400 IDHSGST SEQ ID NO:401 ARARGPWSFDP SEQ ID NO:4 QSISSW SEQ ID NO:402 KAS SEQ ID NO:333 QQYSSFST SEQ ID NO:320  
84 GGSFSGYY SEQ ID NO:400 IDHSGST SEQ ID NO:401 ARARGPWSFDP SEQ ID NO:4 QSISSW SEQ ID NO:402 KAS SEQ ID NO:333 QQYESYST SEQ ID NO:321  
85 GGSFSGYY SEQ ID NO:400 IDHSGST SEQ ID NO:401 ARARGPWSFDP SEQ ID NO:4 QSISSW SEQ ID NO:402 KAS SEQ ID NO:333 QQYDSFIT SEQ ID NO:322  
86 GGSFSGYY SEQ ID NO:400 IDHSGST SEQ ID NO:401 ARARGPWSFDP SEQ ID NO:4 QSISSW SEQ ID NO:402 KAS SEQ ID NO:333 QQYQSYPT SEQ ID NO:323  
87 GGSFSGYY SEQ ID NO:400 IDHSGST SEQ ID NO:401 ARARGPWSFDP SEQ ID NO:4 QSIGSW SEQ ID NO:403 KAS SEQ ID NO:333 QQYHSFPT SEQ ID NO:324  
88 GGSFSGYY SEQ ID NO:400 IDHSGST SEQ ID NO:401 ARARGPWSFDP SEQ ID NO:4 QSIGSW SEQ ID NO:403 KAS SEQ ID NO:333 QQYELYSYT SEQ ID NO:325  
89 GGSFSGYY SEQ ID NO:400 IDHSGST SEQ ID NO:401 ARARGPWSFDP SEQ ID NO:4 QSISSW SEQ ID NO:402 KAS SEQ ID NO:333 QQYDTFIT SEQ ID NO:326  
90 GGTFSSYA SEQ ID NO:406 IIPIFGTA SEQ ID NO:407 ARGDSSIRHAYYYYGMDV SEQ ID NO:30 QSVLYSSNNKNY SEQ ID NO:408 WAS SEQ ID NO:343 QQYYSTPIT SEQ ID NO:35  
91 GGSISSSSYY SEQ ID NO:409 IYYSGST SEQ ID NO:410 ARGSDRFHPYFDY SEQ ID NO:40 QSVSRY SEQ ID NO:411 DAS SEQ ID NO:368 QQFDTWPPT SEQ ID NO:45  
92 GGSFSGYY SEQ ID NO:400 IDHSGST SEQ ID NO:401 ARARGPWSFDP SEQ ID NO:4 QSISSW SEQ ID NO:402 KAS SEQ ID NO:333 EQYDSYPT SEQ ID NO:327  
93 GGTFSSYA SEQ ID NO:406 IIPIFGTA SEQ ID NO:407 ARRGRKASGSFYYYYGMDV SEQ ID NO:48 QSLLNSGNQKNY SEQ ID NO:412 WAS SEQ ID NO:343 QNDYSYPYT SEQ ID NO:51  
94 GYTFTSYY SEQ ID NO:413 INPSGGST SEQ ID NO:414 ARGAPNYGDTTHDYYYMDV SEQ ID NO:56 QSVSSN SEQ ID NO:415 GAS SEQ ID NO:336 QQYDDWPFT SEQ ID NO:61  
95 GYTFTGYY SEQ ID NO:416 INPNSGGT SEQ ID NO:417 ARDTGEYYDTDDHGMDV SEQ ID NO:66 QSVSSN SEQ ID NO:415 GAS SEQ ID NO:336 QQDDYWPPT SEQ ID NO:69  
96 GFTFSSYA SEQ ID NO:418 ISGSGGST SEQ ID NO:419 AKDGGYYDSGAGDY SEQ ID NO:73 QGIDSW SEQ ID NO:420 AAS SEQ ID NO:385 QQGVSYPRT SEQ ID NO:78  
97 GYTFTSYY SEQ ID NO:413 INPSGGST SEQ ID NO:414 AREGAGFAYGMDYYYMDV SEQ ID NO:90 QSVSSY SEQ ID NO:421 DAS SEQ ID NO:368 QQSDNWPFT SEQ ID NO:94  
98 GFTFSSYS SEQ ID NO:422 ISSSSSYI SEQ ID NO:423 ARGAPXGAAAGWFDP X=M、I、Q、L、F、V SEQ ID NO:111 QGISSW SEQ ID NO:424 AAS SEQ ID NO:385 QQGVSFPRT SEQ ID NO:87  
99 GFTFSSYS SEQ ID NO:422 ISSSSSYI SEQ ID NO:423 ARGAPMGAAAGWFDP SEQ ID NO:83 QGISSW SEQ ID NO:424 AAS SEQ ID NO:385 QQGVSFPRT SEQ ID NO:87  
100 GFTFSSYS SEQ ID NO:422 ISSSSSYI SEQ ID NO:423 ARGAPIGAAAGWFDP SEQ ID NO:96 QGISSW SEQ ID NO:424 AAS SEQ ID NO:385 QQGVSFPRT SEQ ID NO:87  
101 GFTFSSYS SEQ ID NO:422 ISSSSSYI SEQ ID NO:423 ARGAPQGAAAGWFDP SEQ ID NO:99 QGISSW SEQ ID NO:424 AAS SEQ ID NO:385 QQGVSFPRT SEQ ID NO:87  
102 GFTFSSYS SEQ ID NO:422 ISSSSSYI SEQ ID NO:423 ARGAPLGAAAGWFDP SEQ ID NO:102 QGISSW SEQ ID NO:424 AAS SEQ ID NO:385 QQGVSFPRT SEQ ID NO:87  
103 GFTFSSYS SEQ ID NO:422 ISSSSSYI SEQ ID NO:423 ARGAPFGAAAGWFDP SEQ ID NO:105 QGISSW SEQ ID NO:424 AAS SEQ ID NO:385 QQGVSFPRT SEQ ID NO:87  
104 GFTFSSYS SEQ ID NO:422 ISSSSSYI SEQ ID NO:423 ARGAPVGAAAGWFDP SEQ ID NO:108 QGISSW SEQ ID NO:424 AAS SEQ ID NO:385 QQGVSFPRT SEQ ID NO:87  
表 1D – 說明性抗 NKG2D 結合抗原結合域之 CDR (Honegger)
Ab 名稱 VH – CDR1 VH – CDR2 VH – CDR3 VL – CDR1 VL – CDR2 VL – CDR3
105 VYGGSFSGYY SEQ ID NO:425 IDHSGSTNYNPSLKSR SEQ ID NO:426 ARGPWSFD SEQ ID NO:427 ASQSISSW SEQ ID NO:428 KASSLESGVPSR SEQ ID NO:429 YNSYPI SEQ ID NO:334
106 VYGGSFSGYY SEQ ID NO:425 IDHSGSTNYNPSLKSR SEQ ID NO:426 ARGPWSFD SEQ ID NO:427 ASQSVSSSY SEQ ID NO:430 GASSRATGIPDR SEQ ID NO:431 YGSSPI SEQ ID NO:337
107 VYGGSFSGYY SEQ ID NO:425 IDHSGSTNYNPSLKSR SEQ ID NO:426 ARGPWSFD SEQ ID NO:427 ASQSIGSW SEQ ID NO:432 KASSLESGVPSR SEQ ID NO:429 YHSFY SEQ ID NO:339
108 VYGGSFSGYY SEQ ID NO:425 IDHSGSTNYNPSLKSR SEQ ID NO:426 ARGPWSFD SEQ ID NO:427 ASQSIGSW SEQ ID NO:432 KASSLESGVPSR SEQ ID NO:429 SNSYY SEQ ID NO:340
109 VYGGSFSGYY SEQ ID NO:425 IDHSGSTNYNPSLKSR SEQ ID NO:426 ARGPWSFD SEQ ID NO:427 ASQSISSW SEQ ID NO:428 KASSLESGVPSR SEQ ID NO:429 YNSYP SEQ ID NO:341
110 VYGGSFSGYY SEQ ID NO:425 IDHSGSTNYNPSLKSR SEQ ID NO:426 ARGPWGFD SEQ ID NO:433 TSQSISSY SEQ ID NO:434 WASTRESGVPDR SEQ ID NO:435 SYDIPY SEQ ID NO:344
111 VYGGSFSGYY SEQ ID NO:425 IDHSGSTNYNPSLKSR SEQ ID NO:426 ARGPWSFD SEQ ID NO:427 ASQSISSW SEQ ID NO:428 KASSLESGVPSR SEQ ID NO:429 YGSFPI SEQ ID NO:345
112 VYGGSFSGYY SEQ ID NO:425 IDHSGSTNYNPSLKSR SEQ ID NO:426 ARGPWSFD SEQ ID NO:427 ASQSISSW SEQ ID NO:428 KASSLESGVPSR SEQ ID NO:429 SKEVPW SEQ ID NO:346
113 VYGGSFSGYY SEQ ID NO:425 IDHSGSTNYNPSLKSR SEQ ID NO:426 ARGPWSFD SEQ ID NO:427 ASQSISSW SEQ ID NO:428 KASSLESGVPSR SEQ ID NO:429 YNSFP SEQ ID NO:347
114 VYGGSFSGYY SEQ ID NO:425 IDHSGSTNYNPSLKSR SEQ ID NO:426 ARGPWSFD SEQ ID NO:427 ASQSIGSW SEQ ID NO:432 KASSLESGVPSR SEQ ID NO:429 YDIYP SEQ ID NO:348
115 VYGGSFSGYY SEQ ID NO:425 IDHSGSTNYNPSLKSR SEQ ID NO:426 ARGPWSFD SEQ ID NO:427 ASQSISSW SEQ ID NO:428 KASSLESGVPSR SEQ ID NO:429 YDSYP SEQ ID NO:349
116 VYGGSFSGYY SEQ ID NO:425 IDHSGSTNYNPSLKSR SEQ ID NO:426 ARGPWSFD SEQ ID NO:427 ASQSISSW SEQ ID NO:428 KASSLESGVPSR SEQ ID NO:429 YGSFP SEQ ID NO:350
117 VYGGSFSGYY SEQ ID NO:425 IDHSGSTNYNPSLKSR SEQ ID NO:426 ARGPWSFD SEQ ID NO:427 ASQSISSW SEQ ID NO:428 KASSLESGVPSR SEQ ID NO:429 YQSFP SEQ ID NO:351
118 VYGGSFSGYY SEQ ID NO:425 IDHSGSTNYNPSLKSR SEQ ID NO:426 ARGPWSFD SEQ ID NO:427 ASQSISSW SEQ ID NO:428 KASSLESGVPSR SEQ ID NO:429 YSSFS SEQ ID NO:352
119 VYGGSFSGYY SEQ ID NO:425 IDHSGSTNYNPSLKSR SEQ ID NO:426 ARGPWSFD SEQ ID NO:427 ASQSISSW SEQ ID NO:428 KASSLESGVPSR SEQ ID NO:429 YESYS SEQ ID NO:353
120 VYGGSFSGYY SEQ ID NO:425 IDHSGSTNYNPSLKSR SEQ ID NO:426 ARGPWSFD SEQ ID NO:427 ASQSISSW SEQ ID NO:428 KASSLESGVPSR SEQ ID NO:429 YDSFI SEQ ID NO:354
121 VYGGSFSGYY SEQ ID NO:425 IDHSGSTNYNPSLKSR SEQ ID NO:426 ARGPWSFD SEQ ID NO:427 ASQSISSW SEQ ID NO:428 KASSLESGVPSR SEQ ID NO:429 YQSYP SEQ ID NO:355
122 VYGGSFSGYY SEQ ID NO:425 IDHSGSTNYNPSLKSR SEQ ID NO:426 ARGPWSFD SEQ ID NO:427 ASQSIGSW SEQ ID NO:432 KASSLESGVPSR SEQ ID NO:429 YHSFP SEQ ID NO:356
123 VYGGSFSGYY SEQ ID NO:425 IDHSGSTNYNPSLKSR SEQ ID NO:426 ARGPWSFD SEQ ID NO:427 ASQSIGSW SEQ ID NO:432 KASSLESGVPSR SEQ ID NO:429 YELYSY SEQ ID NO:357
124 VYGGSFSGYY SEQ ID NO:425 IDHSGSTNYNPSLKSR SEQ ID NO:426 ARGPWSFD SEQ ID NO:427 ASQSISSW SEQ ID NO:428 KASSLESGVPSR SEQ ID NO:429 YDTFI SEQ ID NO:358
125 ASGGTFSSYA SEQ ID NO:436 IIPIFGTANYAQKFQGR SEQ ID NO:437 GDSSIRHAYYYYGMD SEQ ID NO:438 SSQSVLYSSNNKNY SEQ ID NO:439 WASTRESGVPDR SEQ ID NO:435 YYSTPI SEQ ID NO:363
126 VSGGSISSSSYY SEQ ID NO:440 IYYSGSTYYNPSLKSR SEQ ID NO:441 GSDRFHPYFD SEQ ID NO:442 ASQSVSRY SEQ ID NO:443 DASNRATGIPAR SEQ ID NO:444 FDTWPP SEQ ID NO:369
127 VYGGSFSGYY SEQ ID NO:425 IDHSGSTNYNPSLKSR SEQ ID NO:426 ARGPWSFD SEQ ID NO:427 ASQSISSW SEQ ID NO:428 KASSLESGVPSR SEQ ID NO:429 YDSYP SEQ ID NO:349
128 ASGGTFSSYA SEQ ID NO:436 IIPIFGTANYAQKFQGR SEQ ID NO:437 RGRKASGSFYYYYGMD SEQ ID NO:445 SSQSLLNSGNQKNY SEQ ID NO:446 WASTRESGVPDR SEQ ID NO:435 DYSYPY SEQ ID NO:372
129 ASGYTFTSYY SEQ ID NO:447 INPSGGSTSYAQKFQGR SEQ ID NO:448 GAPNYGDTTHDYYYMD SEQ ID NO:449 ASQSVSSN SEQ ID NO:450 GASTRATGIPAR SEQ ID NO:451 YDDWPF SEQ ID NO:376
130 ASGYTFTGYY SEQ ID NO:452 INPNSGGTNYAQKFQGR SEQ ID NO:453 DTGEYYDTDDHGMD SEQ ID NO:454 ASQSVSSN SEQ ID NO:450 GASTRATGIPAR SEQ ID NO:451 DDYWPP SEQ ID NO:380
131 ASGFTFSSYA SEQ ID NO:455 ISGSGGSTYYADSVKGR SEQ ID NO:456 DGGYYDSGAGD SEQ ID NO:457 ASQGIDSW SEQ ID NO:458 AASSLQSGVPSR SEQ ID NO:459 GVSYPR SEQ ID NO:386
132 ASGYTFTSYY SEQ ID NO:447 INPSGGSTSYAQKFQGR SEQ ID NO:448 EGAGFAYGMDYYYMD SEQ ID NO:460 ASQSVSSY SEQ ID NO:461 DASNRATGIPAR SEQ ID NO:444 SDNWPF SEQ ID NO:389
133 ASGFTFSSYS SEQ ID NO:462 ISSSSSYIYYADSVKGR SEQ ID NO:463 GAPXGAAAGWFD X=M、I、Q、L、F、V SEQ ID NO:464 ASQGISSW SEQ ID NO:465 AASSLQSGVPSR SEQ ID NO:459 GVSFPR SEQ ID NO:393
134 ASGFTFSSYS SEQ ID NO:462 ISSSSSYIYYADSVKGR SEQ ID NO:463 GAPMGAAAGWFD SEQ ID NO:466 ASQGISSW SEQ ID NO:465 AASSLQSGVPSR SEQ ID NO:459 GVSFPR SEQ ID NO:393
135 ASGFTFSSYS SEQ ID NO:462 ISSSSSYIYYADSVKGR SEQ ID NO:463 GAPIGAAAGWFD SEQ ID NO:467 ASQGISSW SEQ ID NO:465 AASSLQSGVPSR SEQ ID NO:459 GVSFPR SEQ ID NO:393
136 ASGFTFSSYS SEQ ID NO:462 ISSSSSYIYYADSVKGR SEQ ID NO:463 GAPQGAAAGWFD SEQ ID NO:468 ASQGISSW SEQ ID NO:465 AASSLQSGVPSR SEQ ID NO:459 GVSFPR SEQ ID NO:393
137 ASGFTFSSYS SEQ ID NO:462 ISSSSSYIYYADSVKGR SEQ ID NO:463 GAPLGAAAGWFD SEQ ID NO:469 ASQGISSW SEQ ID NO:465 AASSLQSGVPSR SEQ ID NO:459 GVSFPR SEQ ID NO:393
138 ASGFTFSSYS SEQ ID NO:462 ISSSSSYIYYADSVKGR SEQ ID NO:463 GAPFGAAAGWFD SEQ ID NO:470 ASQGISSW SEQ ID NO:465 AASSLQSGVPSR SEQ ID NO:459 GVSFPR SEQ ID NO:393
139 ASGFTFSSYS SEQ ID NO:462 ISSSSSYIYYADSVKGR SEQ ID NO:463 GAPVGAAAGWFD SEQ ID NO:471 ASQGISSW SEQ ID NO:465 AASSLQSGVPSR SEQ ID NO:459 GVSFPR SEQ ID NO:393
在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合位點或第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Kabat編號方案）： •     SEQ ID NO: 298、3、299、300、301、及302； •     SEQ ID NO: 298、3、299、303、304、及305； •     SEQ ID NO: 298、3、299、306、301、及307； •     SEQ ID NO: 298、3、299、306、301、及308； •     SEQ ID NO: 298、3、299、300、301、及309； •     SEQ ID NO: 298、3、310、311、34、及312； •     SEQ ID NO: 298、3、299、300、301、及313； •     SEQ ID NO: 298、3、299、300、301、及314； •     SEQ ID NO: 298、3、299、300、301、及315； •     SEQ ID NO: 298、3、299、306、301、及316； •     SEQ ID NO: 298、3、299、300、301、及317； •     SEQ ID NO: 298、3、299、300、301、及318； •     SEQ ID NO: 298、3、299、300、301、及319； •     SEQ ID NO: 298、3、299、300、301、及320； •     SEQ ID NO: 298、3、299、300、301、及321； •     SEQ ID NO: 298、3、299、300、301、及322； •     SEQ ID NO: 298、3、299、300、301、及323； •     SEQ ID NO: 298、3、299、306、301、及324； •     SEQ ID NO: 298、3、299、306、301、及325； •     SEQ ID NO: 298、3、299、306、301、及326； •     SEQ ID NO: 28、29、31、33、34、及35； •     SEQ ID NO: 38、39、41、43、44、及45； •     SEQ ID NO: 298、3、299、306、301、及327； •     SEQ ID NO: 28、29、328、50、34、及51； •     SEQ ID NO: 54、55、57、59、60、及61； •     SEQ ID NO: 64、65、67、59、60、及69； •     SEQ ID NO: 115、72、74、76、77、及78； •     SEQ ID NO: 54、55、91、93、44、及94； •     SEQ ID NO: 81、82、112、86、77、及87； •     SEQ ID NO: 81、82、84、86、77、及87； •     SEQ ID NO: 81、82、97、86、77、及87； •     SEQ ID NO: 81、82、100、86、77、及87； •     SEQ ID NO: 81、82、103、86、77、及87； •     SEQ ID NO: 81、82、106、86、77、及87；或 •     SEQ ID NO: 81、82、109、86、77、及87。
在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合位點或第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Kabat編號方案）： •     SEQ ID NO: 81、82、112、86、77、及87； •     SEQ ID NO: 81、82、84、86、77、及87； •     SEQ ID NO: 81、82、97、86、77、及87； •     SEQ ID NO: 81、82、100、86、77、及87； •     SEQ ID NO: 81、82、103、86、77、及87； •     SEQ ID NO: 81、82、106、86、77、及87；或 •     SEQ ID NO: 81、82、109、86、77、及87。
在一些實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合位點或第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Kabat編號方案）：SEQ ID NO: 81、82、112、86、77、及87。在一些實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Kabat編號方案）：SEQ ID NO: 81、82、84、86、77、及87。在一些實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Kabat編號方案）：SEQ ID NO: 81、82、97、86、77、及87。在一些實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Kabat編號方案）：SEQ ID NO: 81、82、100、86、77、及87。在一些實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Kabat編號方案）：SEQ ID NO: 81、82、103、86、77、及87。在一些實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Kabat編號方案）：SEQ ID NO: 81、82、106、86、77、及87。在一些實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Kabat編號方案）：SEQ ID NO: 81、82、109、86、77、及87。
在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合位點或第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Chothia編號方案）： •     SEQ ID NO: 329、330、331、332、333、及334； •     SEQ ID NO: 329、330、331、335、336、及337； •     SEQ ID NO: 329、330、331、338、333、及339； •     SEQ ID NO: 329、330、331、338、333、及340； •     SEQ ID NO: 329、330、331、332、333、及341； •     SEQ ID NO: 329、330、331、551、343、及344； •     SEQ ID NO: 329、330、331、332、333、及345； •     SEQ ID NO: 329、330、331、332、333、及346； •     SEQ ID NO: 329、330、331、332、333、及347； •     SEQ ID NO: 329、330、331、332、333、及348； •     SEQ ID NO: 329、330、331、332、333、及349； •     SEQ ID NO: 329、330、331、332、333、及350； •     SEQ ID NO: 329、330、331、332、333、及351； •     SEQ ID NO: 329、330、331、332、333、及352； •     SEQ ID NO: 329、330、331、332、333、及353； •     SEQ ID NO: 329、330、331、332、333、及354； •     SEQ ID NO: 329、330、331、332、333、及355； •     SEQ ID NO: 329、330、331、338、333、及356； •     SEQ ID NO: 329、330、331、338、333、及357； •     SEQ ID NO: 329、330、331、332、333、及358； •     SEQ ID NO: 359、360、361、362、343、及363； •     SEQ ID NO: 364、365、366、367、368、及369； •     SEQ ID NO: 359、360、370、371、343、及372； •     SEQ ID NO: 186、373、374、375、336、及376； •     SEQ ID NO: 377、378、379、375、336、及380； •     SEQ ID NO: 186、373、387、388、368、及389； •     SEQ ID NO: 381、390、391、392、385、及393； •     SEQ ID NO: 381、390、394、392、385、及393； •     SEQ ID NO: 381、390、395、392、385、及393； •     SEQ ID NO: 381、390、396、392、385、及393； •     SEQ ID NO: 381、390、397、392、385、及393； •     SEQ ID NO: 381、390、398、392、385、及393；或 •     SEQ ID NO: 381、390、399、392、385、及393。
在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合位點或第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Chothia編號方案）： • SEQ ID NO: 381、390、391、392、385、及393； • SEQ ID NO: 381、390、394、392、385、及393； • SEQ ID NO: 381、390、395、392、385、及393； • SEQ ID NO: 381、390、396、392、385、及393； • SEQ ID NO: 381、390、397、392、385、及393； • SEQ ID NO: 381、390、398、392、385、及393；或 • SEQ ID NO: 381、390、399、392、385、及393。
在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Chothia編號方案）：SEQ ID NO: 381、390、391、392、385、及393。在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Chothia編號方案）：SEQ ID NO: 381、390、394、392、385、及393。在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Chothia編號方案）：SEQ ID NO: 381、390、395、392、385、及393。在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Chothia編號方案）：SEQ ID NO: 381、390、396、392、385、及393。在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Chothia編號方案）：SEQ ID NO: 381、390、397、392、385、及393。在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Chothia編號方案）：SEQ ID NO: 381、390、398、392、385、及393。在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Chothia編號方案）：SEQ ID NO: 381、390、399、392、385、及393。
在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合位點或第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據IMGT編號方案）： • SEQ ID NO: 400、401、4、402、333、及302； • SEQ ID NO: 400、401、4、552、336、及305； • SEQ ID NO: 400、401、4、403、333、及307； • SEQ ID NO: 400、401、4、403、333、及308； • SEQ ID NO: 400、401、4、402、333、及309； • SEQ ID NO: 400、401、4、405、343、及312； • SEQ ID NO: 400、401、4、402、333、及313； • SEQ ID NO: 400、401、4、402、333、及314； • SEQ ID NO: 400、401、4、402、333、及315； • SEQ ID NO: 400、401、4、403、333、及316； • SEQ ID NO: 400、401、4、402、333、及317； • SEQ ID NO: 400、401、4、402、333、及318； • SEQ ID NO: 400、401、4、402、333、及319； • SEQ ID NO: 400、401、4、402、333、及320； • SEQ ID NO: 400、401、4、402、333、及321； • SEQ ID NO: 400、401、4、402、333、及322； • SEQ ID NO: 400、401、4、402、333、及323； • SEQ ID NO: 400、401、4、403、333、及324； • SEQ ID NO: 400、401、4、403、333、及325； • SEQ ID NO: 400、401、4、402、333、及326； • SEQ ID NO: 406、407、30、408、343、及35； • SEQ ID NO: 409、410、40、411、368、及45； • SEQ ID NO: 400、401、4、402、333、及327； • SEQ ID NO: 406、407、48、412、343、及51； • SEQ ID NO: 413、414、56、415、336、及61； • SEQ ID NO: 416、417、66、415、336、及69； • SEQ ID NO: 418、419、73、420、385、及78； • SEQ ID NO: 413、414、90、421、368、及94； • SEQ ID NO: 422、423、111、424、385、及87； • SEQ ID NO: 422、423、83、424、385、及87； • SEQ ID NO: 422、423、96、424、385、及87； • SEQ ID NO: 422、423、99、424、385、及87； • SEQ ID NO: 422、423、102、424、385、及87； • SEQ ID NO: 422、423、105、424、385、及87；或 • SEQ ID NO: 422、423、108、424、385、及87。
在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合位點或第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據IMGT編號方案）： • SEQ ID NO: 422、423、111、424、385、及87； • SEQ ID NO: 422、423、83、424、385、及87； • SEQ ID NO: 422、423、96、424、385、及87； • SEQ ID NO: 422、423、99、424、385、及87； • SEQ ID NO: 422、423、102、424、385、及87； • SEQ ID NO: 422、423、105、424、385、及87；或 • SEQ ID NO: 422、423、108、424、385、及87。
在一些實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合位點或第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據IMGT編號方案）：SEQ ID NO: 422、423、111、424、385、及87。在一些實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據IMGT編號方案）：SEQ ID NO: 422、423、83、424、385、及87。在一些實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據IMGT編號方案）：SEQ ID NO: 422、423、96、424、385、及87。在一些實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據IMGT編號方案）：SEQ ID NO: 422、423、99、424、385、及87。在一些實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據IMGT編號方案）：SEQ ID NO: 422、423、102、424、385、及87。在一些實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據IMGT編號方案）：SEQ ID NO: 422、423、105、424、385、及87。在一些實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據IMGT編號方案）：SEQ ID NO: 422、423、108、424、385、及87。
在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合位點或第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Honegger編號方案）： • SEQ ID NO: 425、426、427、428、429、及334； • SEQ ID NO: 425、426、427、430、431、及337； • SEQ ID NO: 425、426、427、432、429、及339； • SEQ ID NO: 425、426、427、432、429、及340； • SEQ ID NO: 425、426、427、428、429、及341； • SEQ ID NO: 425、426、433、434、435、及344； • SEQ ID NO: 425、426、427、428、429、及345； • SEQ ID NO: 425、426、427、428、429、及346； • SEQ ID NO: 425、426、427、428、429、及347； • SEQ ID NO: 425、426、427、432、429、及348； • SEQ ID NO: 425、426、427、428、429、及349； • SEQ ID NO: 425、426、427、428、429、及350； • SEQ ID NO: 425、426、427、428、429、及351； • SEQ ID NO: 425、426、427、428、429、及352； • SEQ ID NO: 425、426、427、428、429、及353； • SEQ ID NO: 425、426、427、428、429、及354； • SEQ ID NO: 425、426、427、428、429、及355； • SEQ ID NO: 425、426、427、432、429、及356； • SEQ ID NO: 425、426、427、432、429、及357； • SEQ ID NO: 425、426、427、428、429、及358； • SEQ ID NO: 436、437、438、439、435、及372； • SEQ ID NO: 447、448、449、450、451、及376； • SEQ ID NO: 452、453、454、450、451、及380； • SEQ ID NO: 455、456、457、458、459、及386； • SEQ ID NO: 447、448、460、461、444、及389； • SEQ ID NO: 462、463、464、465、459、及393； • SEQ ID NO: 462、463、466、465、459、及393； • SEQ ID NO: 462、463、467、465、459、及393； • SEQ ID NO: 462、463、468、465、459、及393； • SEQ ID NO: 462、463、469、465、459、及393； • SEQ ID NO: 462、463、470、465、459、及393；或 • SEQ ID NO: 462、463、471、465、459、及393。
在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合位點或第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Honegger編號方案）： • SEQ ID NO: 462、463、464、465、459、及393； • SEQ ID NO: 462、463、466、465、459、及393； • SEQ ID NO: 462、463、467、465、459、及393； • SEQ ID NO: 462、463、468、465、459、及393； • SEQ ID NO: 462、463、469、465、459、及393； • SEQ ID NO: 462、463、470、465、459、及393；或 • SEQ ID NO: 462、463、471、465、459、及393。
在一些實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合位點或第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Honegger編號方案）：SEQ ID NO: 462、463、464、465、459、及393。在一些實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Honegger編號方案）：SEQ ID NO: 462、463、466、465、459、及393。在一些實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Honegger編號方案）：SEQ ID NO: 462、463、467、465、459、及393。在一些實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Honegger編號方案）：SEQ ID NO: 462、463、468、465、459、及393。在一些實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Honegger編號方案）：SEQ ID NO: 462、463、469、465、459、及393。在一些實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Honegger編號方案）：SEQ ID NO: 462、463、470、465、459、及393。在一些實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Honegger編號方案）：SEQ ID NO: 462、463、471、465、459、及393。
在某些實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合位點包含：抗體重鏈可變域(VH)，其包含與表1所揭示之抗體之VH至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及抗體輕鏈可變域(VL)，其包含與表1所揭示之相同抗體之VL至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含表1所揭示之抗體之VH及VL序列之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3、及輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，其依下列判定：Kabat（參見Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication No. 91-3242, Bethesda）、Chothia（參見例如Chothia C & Lesk A M, (1987), J. Mol. Biol. 196: 901-917）、MacCallum（參見MacCallum R M et al., (1996) J. Mol. Biol. 262: 732-745）、或所屬技術領域中已知的任何其他CDR判定方法。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含表1、表1A、表1B、表1C、或表1D所揭示之抗體之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3、及輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。序列同一性可根據BLAST演算法(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)、使用預設設定判定。
在某些實施例中，結合至NKG2D之第一抗原結合位點包含衍生自SEQ ID NO:1之重鏈可變域，諸如藉由具有與SEQ ID NO:1至少90%（例如至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列，且/或併入與SEQ ID NO:1之CDR1 (SEQ ID NO:2)、CDR2 (SEQ ID NO:3)、及CDR3 (SEQ ID NO:4)序列同一的胺基酸序列。與SEQ ID NO:1相關之重鏈可變域可與各種輕鏈可變域偶合，以形成NKG2D結合位點。例如，併入與SEQ ID NO:1相關之重鏈可變域的第一抗原結合位點可進一步併入輕鏈可變域，該輕鏈可變域係選自衍生自SEQ ID NO: 5、6、7、8、9、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、及46之序列。例如，第一抗原結合位點併入：重鏈可變域，其具有與SEQ ID NO:1至少90%（例如至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及輕鏈可變域，其具有與選自SEQ ID NO: 5、6、7、8、9、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、及46之序列中之任一者至少90%（例如至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:10之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:11至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:26之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:32至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 27或28、29、及30或31（例如，分別包含SEQ ID NO: 27、29、及30，或分別包含SEQ ID NO: 28、29、及31）之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 33、34、及35之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含(a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 27或28、29、及30或31（例如，分別包含SEQ ID NO: 27、29、及30，或分別包含SEQ ID NO: 28、29、及31）之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及(b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 33、34、及35之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:36之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:42至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 37或38、39、及40或41（例如，分別包含SEQ ID NO: 37、39、及40，或分別包含SEQ ID NO: 38、39、及41）之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 43、44、及45之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含(a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 37或38、39、及40或41（例如，分別包含SEQ ID NO: 37、39、及40，或分別包含SEQ ID NO: 38、39、及41）之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及(b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 43、44、及45之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:47之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:49至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 27、29、及48之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 50、34、及51之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含(a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 27、29、及48之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及(b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 50、34、及51之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:52之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:58至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 53或54、55、及56或57（例如，分別包含SEQ ID NO: 53、55、及56，或分別包含SEQ ID NO: 54、55、及57）之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 59、60、及61之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含(a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 53或54、55、及56或57（例如，分別包含SEQ ID NO: 53、55、及56，或分別包含SEQ ID NO: 54、55、及57）之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及(b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 59、60、及61之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:62之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:68至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 63或64、65、及66或67（例如，分別包含SEQ ID NO: 63、65、及66，或分別包含SEQ ID NO: 64、65、及67）之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 59、60、及69之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含(a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 63或64、65、及66或67（例如，分別包含SEQ ID NO: 63、65、及66，或分別包含SEQ ID NO: 64、65、及67）之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及(b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 59、60、及69之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:89之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:92至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 53或54、55、及90或91（例如，分別包含SEQ ID NO: 53、55、及90，或分別包含SEQ ID NO: 54、55、及91）之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 93、44、及94之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含(a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 53或54、55、及90或91（例如，分別包含SEQ ID NO: 53、55、及90，或分別包含SEQ ID NO: 54、55、及91）之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及(b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 93、44、及94之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:70之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:75至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 71或115、72、及73或74（例如，分別包含SEQ ID NO: 71、72、及73，或分別包含SEQ ID NO: 115、72、及74）之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 76、77、及78之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含(a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 71或115、72、及73或74（例如，分別包含SEQ ID NO: 71、72、及73，或分別包含SEQ ID NO: 115、72、及74）之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及(b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 76、77、及78之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:79之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:85至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 80或81、82、及83或84（例如，分別包含SEQ ID NO: 80、82、及83，或分別包含SEQ ID NO: 81、82、及84）之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含(a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 80或81、82、及83或84（例如，分別包含SEQ ID NO: 80、82、及83，或分別包含SEQ ID NO: 81、82、及84）之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及(b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含scFv，該scFv在VH中具有Q44C取代且在VL中具有G100C取代。因此，在一些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含與SEQ ID NO: 88之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:95之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:85至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 80或81、82、及96或97（例如，分別包含SEQ ID NO: 80、82、及96，或分別包含SEQ ID NO: 81、82、及97）之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含(a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 80或81、82、及96或97（例如，分別包含SEQ ID NO: 80、82、及96，或分別包含SEQ ID NO: 81、82、及97）之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及(b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含scFv，該scFv在VH中具有Q44C取代且在VL中具有G100C取代。因此，在一些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含與SEQ ID NO: 288之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:98之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:85至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 80或81、82、及99或100（例如，分別包含SEQ ID NO: 80、82、及99，或分別包含SEQ ID NO: 81、82、及100）之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含(a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 80或81、82、及99或100（例如，分別包含SEQ ID NO: 80、82、及99，或分別包含SEQ ID NO: 81、82、及100）之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及(b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:101之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:85至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 80或81、82、及102或103（例如，分別包含SEQ ID NO: 80、82、及102，或分別包含SEQ ID NO: 81、82、及103）之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含(a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 80或81、82、及102或103（例如，分別包含SEQ ID NO: 80、82、及102，或分別包含SEQ ID NO: 81、82、及103）之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及(b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:104之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:85至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 80或81、82、及105或106（例如，分別包含SEQ ID NO: 80、82、及105，或分別包含SEQ ID NO: 81、82、及106）之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含(a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 80或81、82、及105或106（例如，分別包含SEQ ID NO: 80、82、及105，或分別包含SEQ ID NO: 81、82、及106）之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及(b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:107之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:85至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 80或81、82、及108或109（例如，分別包含SEQ ID NO: 80、82、及108，或分別包含SEQ ID NO: 81、82、及109）之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含(a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 80或81、82、及108或109（例如，分別包含SEQ ID NO: 80、82、及108，或分別包含SEQ ID NO: 81、82、及109）之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及(b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:110之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:85至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含分別包含SEQ ID NO: 80或81、82、及111或112（例如，分別包含SEQ ID NO: 80、82、及111，或分別包含SEQ ID NO: 81、82、及112）之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列。在某些實施例中，第一抗原結合位點包含(a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 80或81、82、及111或112（例如，分別包含SEQ ID NO: 80、82、及111，或分別包含SEQ ID NO: 81、82、及112）之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及(b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:113之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:114至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，結合NKG2D之第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:116之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:117至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
多特異性結合蛋白可結合至NKG2D表現性細胞，該等細胞包括但不限於NK細胞、γδ T細胞、及CD8 +αβ T細胞。在NKG2D結合後，多特異性結合蛋白可阻斷天然配體（諸如ULBP6及MICA）結合至NKG2D及活化NK細胞。
多特異性結合蛋白結合至表現CD16（白血球表面上之Fc受體）之細胞，該等白血球包括自然殺手細胞、巨噬細胞、嗜中性球、嗜酸性球、肥大細胞、及濾泡樹突細胞。
在某些實施例中，本揭露之多特異性結合蛋白以2 nM至400 nM之K D（亦即解離常數）的親和力結合至NKG2D（例如人類NKG2D），例如2 nM至390 nM、2 nM至390 nM、2 nM至380 nM、2 nM至370 nM、2 nM至360 nM、2 nM至350 nM、2 nM至340 nM、2 nM至330 nM、2 nM至320 nM、2 nM至310 nM、2 nM至300 nM、2 nM至290 nM、2 nM至280 nM、2 nM至270 nM、2 nM至260 nM、2 nM至250 nM、2 nM至240 nM、2 nM至230 nM、2 nM至220 nM、2 nM至210 nM、2 nM至200 nM、2 nM至190 nM、2 nM至180 nM、2 nM至170 nM、2 nM至160 nM、2 nM至150 nM、2 nM至140 nM、2 nM至130 nM、2 nM至120 nM、2 nM至110 nM、2 nM至100 nM、2 nM至90 nM、2 nM至80 nM、2 nM至70 nM、2 nM至60 nM、2 nM至50 nM、2 nM至40 nM、2 nM至30 nM、2 nM至20 nM、2 nM至10 nM、5 nM至400 nM、10 nM至400 nM、20 nM至400 nM、30 nM至400 nM、40 nM至400 nM、50 nM至400 nM、60 nM至400 nM、70 nM至400 nM、80 nM至400 nM、90 nM至400 nM、100 nM至400 nM、110 nM至400 nM、120 nM至400 nM、130 nM至400 nM、140 nM至400 nM、150 nM至400 nM、160 nM至400 nM、170 nM至400 nM、180 nM至400 nM、190 nM至400 nM、200 nM至400 nM、210 nM至400 nM、220 nM至400 nM、230 nM至400 nM、240 nM至400 nM、250 nM至400 nM、260 nM至400 nM、270 nM至400 nM、280 nM至400 nM、290 nM至400 nM、300 nM至400 nM、310 nM至400 nM、320 nM至400 nM、330 nM至400 nM、340 nM至400 nM、350 nM至400 nM、360 nM至400 nM、370 nM至400 nM、380 nM至400 nM、390 nM至400 nM、100 nM至380 nM、200 nM至380 nM、300 nM至380 nM、350 nM至380 nM、360 nM至380 nM、100 nM至200 nM、200 nM至300 nM、約400 nM、約390 nM、約380 nM、約370 nM、約360 nM、約350 nM、約340 nM、約330 nM、約310 nM、約300 nM、約290 nM、約280 nM、約270 nM、約260 nM、約250 nM、約240 nM、約230 nM、約220 nM、約210 nM、約200 nM、約190 nM、約180 nM、約170 nM、約160 nM、約150 nM、約140 nM、約130 nM、約120 nM、約110 nM、約100 nM、約90 nM、約80 nM、約70 nM、約60 nM、約50 nM、約40 nM、約30 nM、約20 nM、約15 nM、約14 nM、約13 nM、約12 nM、約11 nM、約10 nM、約9 nM、約8 nM、約7 nM、約6 nM、約5 nM、約4.5 nM、約4 nM、約3.5 nM、約3 nM、約2.5 nM、約2 nM、約1.5 nM、約1 nM、在約0.5 nM至約1 nM、約1 nM至約2 nM、約2 nM至3 nM、約3 nM至4 nM、約4 nM至約5 nM、約5 nM至約6 nM、約6 nM至約7 nM、約7 nM至約8 nM、約8 nM至約9 nM、約9 nM至約10 nM、約1 nM至約10 nM、約2 nM至約10 nM、約3 nM至約10 nM、約4 nM至約10 nM、約5 nM至約10 nM、約6 nM至約10 nM、約7 nM至約10 nM、約8 nM至約10 nM、約100 nM至約400 nM、約200 nM至約400 nM、或約300 nM至約400 nM之間，如使用標準結合檢定（例如表面電漿共振(SPR)）（例如，使用以下實例1中所述之方法）或生物膜干涉技術(BLI)所測量。在一些實施例中，NKG2D結合位點以10至62 nM之K D特異性結合至NKG2D。在一些實施例中，NKG2D結合位點以300至400 nM之K D特異性結合至NKG2D。在一些實施例中，NKG2D結合位點以360至380 nM之K D特異性結合至NKG2D。在某些實施例中，本揭露之多特異性結合蛋白以等於或低於下列之K d（亦即解離速率，亦稱為K off）特異性結合NKG2D（例如人類NKG2D）：1 × 10 -5、1 × 10 -4、1 × 10 -3、5 × 10 -3、0.01、0.02、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.2、0.3、0.4、或0.5 1/s，如藉由SPR（例如，使用以下實例1中所述之方法）或藉由BLI所測量。 5T4結合位點或5T4結合域
本文所揭示之多特異性結合蛋白之5T4位點包含重鏈可變域及輕鏈可變域。
在一個態樣中，本揭露提供多特異性結合蛋白，其結合至自然殺手細胞上之NKG2D受體及CD16受體、及5T4。 表 2列出重鏈可變域及輕鏈可變域之一些例示性序列，其等組合可結合至5T4。
除非另有指示，否則 表 2中之CDR序列係依Chothia編號識別。表2A提供根據Kabat編號方案之CDR序列。表2B提供根據Chothia編號方案之CDR序列。表2C提供根據IMGT編號方案之CDR序列。表2D提供根據Honegger編號方案之CDR序列。 表2 ：結合5T4之例示性抗原結合位點或抗原結合域之序列
殖株 VH VL
10F10鼠類 EVQLQESGGGLVKPGGSRRLSCAAS RFTFSDFGMHWVRQAPEKGLEWIAYI SSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCAS SQSYYRGTLDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:136) CDR1- RFTFSDF (SEQ ID NO:138) CDR2- SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3- SQSYYRGTLDY (SEQ ID NO:140) DIVLTQSPASLAVTLGQRATISC RASQSVTTSNYNYMHWFHQKPGQPPKLLIK FASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDIATYYC QHSWEIPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:137) CDR1- RASQSVTTSNYNYMH (SEQ ID NO:141) CDR2- FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3- QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
AB1002（人源化10F10，T62S） EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS RFTFSDFGMHWVRQAPGKGLEWVSYI SSGSSTIYYAD SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS SQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:144) CDR1- RFTFSDF (SEQ ID NO:138) CDR2- SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3- SQSYYRGTLDY (SEQ ID NO:140) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:145) CDR1- RASQSVTTSNYNYMH (SEQ ID NO:141) CDR2- FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3- QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
AB1002（具有半胱胺酸異二聚化突變，用於雙硫鍵形成） EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS RFTFSDFGMHWVRQAPGK CLEWVSYI SSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS SQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:146) CDR1- RFTFSDF (SEQ ID NO:138) CDR2- SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3- SQSYYRGTLDY (SEQ ID NO:140) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIK (SEQ ID NO:147) CDR1- RASQSVTTSNYNYMH (SEQ ID NO:141) CDR2- FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3- QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
AB1002 scFv (VL-VH) (AB1310 TriNKET ®) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS RFTFSDFGMHWVRQAPGK CLEWVSYI SSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS SQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:148)
AB1002 scFv (VH-VL) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS RFTFSDFGMHWVRQAPGK CLEWVSYI SSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS SQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIK (SEQ ID NO:149)
AB1002（人源化10F10）M33L EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS RFTFSDFGMHWVRQAPGKGLEWVSYI SSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS SQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:144) CDR1- RFTFSDF (SEQ ID NO:138) CDR2- SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3- SQSYYRGTLDY (SEQ ID NO:140) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSVTTSNYNYLHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:289) CDR1- RASQSVTTSNYNYLH (SEQ ID NO:290) CDR2- FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3- QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
AB1002（人源化10F10）M33V EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS RFTFSDFGMHWVRQAPGKGLEWVSYI SSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS SQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:144) CDR1- RFTFSDF (SEQ ID NO:138) CDR2- SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3- SQSYYRGTLDY (SEQ ID NO:140) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSVTTSNYNYVHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:291) CDR1- RASQSVTTSNYNYVH (SEQ ID NO:292) CDR2- FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3- QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
05H04 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYKFTDYYMDWVRQAPGQGLEWIGYI FPNDASTTYNEKFKGKATLTADKSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR SRDADYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:150) CDR1- GYKFTDY (SEQ ID NO:152) CDR2- FPNDAS (SEQ ID NO:158) CDR3- SRDADY (SEQ ID NO:153) ENVLTQSPATLSLSPGERATLSC SAKSSVSYIHWYQQKPGQAPRLLIY DTSYLGSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC QQWSSYPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:151) CDR1- SAKSSVSYIH (SEQ ID NO:154) CDR2- DTSYLGS (SEQ ID NO:155) CDR3- QQWSSYPYT (SEQ ID NO:156)
05H04 Q1E EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYKFTDYYMDWVRQAPGQGLEWIGYI FPNDASTTYNEKFKGKATLTADKSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR SRDADYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:157) CDR1- GYKFTDY (SEQ ID NO:152) CDR2- FPNDAS (SEQ ID NO:158) CDR3- SRDADY (SEQ ID NO:153) ENVLTQSPATLSLSPGERATLSC SAKSSVSYIHWYQQKPGQAPRLLIY DTSYLGSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC QQWSSYPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:151) CDR1- SAKSSVSYIH (SEQ ID NO:154) CDR2- DTSYLGS (SEQ ID NO:155) CDR3- QQWSSYPYT (SEQ ID NO:156)
05H04 scFv (VH-VL) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYKFTDYYMDWVRQAPGQ CLEWIGYI FPNDASTTYNEKFKGKATLTADKSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR SRDADYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSENVLTQSPATLSLSPGERATLSC SAKSSVSYIHWYQQKPGQAPRLLIY DTSYLGSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC QQWSSYPYTFG CGTKVEIK (SEQ ID NO:159)
05H04 scFv (VL-VH) ENVLTQSPATLSLSPGERATLSC SAKSSVSYIHWYQQKPGQAPRLLIY DTSYLGSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC QQWSSYPYTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYKFTDYYMDWVRQAPGQ CLEWIGYI FPNDASTTYNEKFKGKATLTADKSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR SRDADYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:221)
05H04 Q1E (VH-VL) EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYKFTDYYMDWVRQAPGQ CLEWIGYI FPNDASTTYNEKFKGKATLTADKSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR SRDADYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSENVLTQSPATLSLSPGERATLSC SAKSSVSYIHWYQQKPGQAPRLLIY DTSYLGSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYC QQWSSYPYTFG CGTKVEIK (SEQ ID NO:160)
11F09 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCEAS GFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWLAYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:161) CDR1- GFTFSDY (SEQ ID NO:163) CDR2- SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3- SQSYYRGTMDY (SEQ ID NO:164) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYLHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:162) CDR1- RASQGVSTSTYTYLH (SEQ ID NO:165) CDR2- FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3- QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
10F10 21*05 AB1002親本人源化(T62) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS RFTFSDFGMHWVRQAPGKGLEWVSYI SSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS SQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:166) CDR1- RFTFSDF (SEQ ID NO:138) CDR2- SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3- SQSYYRGTLDY (SEQ ID NO:140) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:145) CDR1- RASQSVTTSNYNYMH (SEQ ID NO:141) CDR2- FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3- QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
10F10 21*05 scFv (VL-VH) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS RFTFSDFGMHWVRQAPGK CLEWVSYI SSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS SQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:167)
10F10 23*03人源化變體2 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS RFTFSDFGMHWVRQAPGKGLEWIAYI SSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS SQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:168) CDR1- RFTFSDF (SEQ ID NO:138) CDR2- SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3- SQSYYRGTLDY (SEQ ID NO:140) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:145) CDR1- RASQSVTTSNYNYMH (SEQ ID NO:141) CDR2- FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3- QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
10F10 23*03 scFv (VL-VH) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS RFTFSDFGMHWVRQAPGK CLEWIAYI SSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS SQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:169)
10F10 23*03 BM1 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS RFTFSDFGMHWVRQAPGKGLEWVSYI SSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS SQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:236) CDR1- RFTFSDF (SEQ ID NO:138) CDR2- SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3- SQSYYRGTLDY (SEQ ID NO:140) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 145) CDR1- RASQSVTTSNYNYMH (SEQ ID NO:141) CDR2- FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3- QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
10F10 23*03 BM1 scFv (VL-VH) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS RFTFSDFGMHWVRQAPGK CLEWVSYI SSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA SSQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:293)
10F10 48*01人源化變體3 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS RFTFSDFGMHWVRQAPGKGLEWVSYI SSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS SQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:170) CDR1- RFTFSDF (SEQ ID NO:138) CDR2- SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3- SQSYYRGTLDY (SEQ ID NO:140) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:145) CDR1- RASQSVTTSNYNYMH (SEQ ID NO:141) CDR2- FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3- QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
10F10 48*01 scFv (VL-VH) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS RFTFSDFGMHWVRQAPGK CLEWVSYI SSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS SQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:171)
10F10 48*01 BM2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS RFTFSDFGMHWVRQAPGKGLEWIAYI SSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS SQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:228) CDR1- RFTFSDF (SEQ ID NO:138) CDR2- SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3- SQSYYRGTLDY (SEQ ID NO:140) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:145) CDR1- RASQSVTTSNYNYMH (SEQ ID NO:141) CDR2- FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3- QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
10F10 48*01 BM2 scFv (VL-VH) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS RFTFSDFGMHWVRQAPGK CLEWIAYI SSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS SQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:229)
10F10 11*01人源化變體4 QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS RFTFSDFGMHWVRQAPGKGLEWIAYI SSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS SQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:172) CDR1- RFTFSDF (SEQ ID NO:138) CDR2- SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3- SQSYYRGTLDY (SEQ ID NO:140) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:145) CDR1- RASQSVTTSNYNYMH (SEQ ID NO:141) CDR2- FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3- QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
10F10 11*01 scFv (VL-VH) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS RFTFSDFGMHWVRQAPGK CLEWIAYI SSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS SQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:173)
10F10 21*05人源化變體5 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS RFTFSDFGMHWVRQAPGKGLEWIAYI SSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS SQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:174) CDR1- RFTFSDF (SEQ ID NO:138) CDR2- SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3- SQSYYRGTLDY (SEQ ID NO:140) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:145) CDR1- RASQSVTTSNYNYMH (SEQ ID NO:141) CDR2- FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3- QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
10F10 21*05 scFv (VL-VH) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS RFTFSDFGMHWVRQAPGK CLEWIAYI SSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS SQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:175)
10F10 11*01 BM1 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS RFTFSDFGMHWIRQAPGKGLEWVSYI SSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAS SQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSSG (SEQ ID NO:232) CDR1- RFTFSDF (SEQ ID NO:138) CDR2- SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3- SQSYYRGTLDY (SEQ ID NO:140) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:145) CDR1- RASQSVTTSNYNYMH (SEQ ID NO:141) CDR2- FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3- QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
10F10 11*01 scFv (VL-VH) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS RFTFSDFGMHWIRQAPGK CLEWVSYI SSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASS QSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:233)
10F10人源化共有序列 X 1VQLX 2ESGGGLVX 3PGGSLRLSCAAS RFTFSDFGMHWVRQAPGKGLEWX 4X 5YI SSGSSTIYYADX 6VKGRFTISRDNAKNX 7LYLQMNSLRAEDTAVYYCAS SQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:263) CDR1- RFTFSDF (SEQ ID NO:138) CDR2- SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3- SQSYYRGTLDY (SEQ ID NO:140) 其中X 1係E或Q；X 2係V或L；X 3係K或Q；X 4係V或I；X 5係S或A；X 6係S或T；且X 7係S或T DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:145) CDR1- RASQSVTTSNYNYMH (SEQ ID NO:141) CDR2- FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3- QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
10F10人源化共有scFv (VH-VL) X 1VQLX 2ESGGGLVX 3PGGSLRLSCAAS RFTFSDFGMHWVRQAPGKGLEWX 4X 5YI SSGSSTIYYADX 6VKGRFTISRDNAKNX 7LYLQMNSLRAEDTAVYYCAS SQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:264) 其中X 1係E或Q；X 2係V或L；X 3係K或Q；X 4係V或I；X 5係S或A；X 6係S或T；且X 7係S或T
10F10人源化共有scFv (VL-VH) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSX 1VQLX 2ESGGGLVX 3PGGSLRLSCAAS RFTFSDFGMHWVRQAPGKGLEWX 4X 5YI SSGSSTIYYADX 6VKGRFTISRDNAKNX 7LYLQMNSLRAEDTAVYYCAS SQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:265) 其中X 1係E或Q；X 2係V或L；X 3係K或Q；X 4係V或I；X 5係S或A；X 6係S或T；且X 7係S或T
10F10人源化共有scFv (VH-VL)（具有半胱胺酸突變，用於雙硫鍵形成） X 1VQLX 2ESGGGLVX 3PGGSLRLSCAAS RFTFSDFGMHWVRQAPGK CLEWX 4X 5YI SSGSSTIYYADX 6VKGRFTISRDNAKNX 7LYLQMNSLRAEDTAVYYCAS SQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIK (SEQ ID NO:296) 其中X 1係E或Q；X 2係V或L；X 3係K或Q；X 4係V或I；X 5係S或A；X 6係S或T；且X 7係S或T
10F10人源化共有scFv (VL-VH)（具有半胱胺酸突變，用於雙硫鍵形成） DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSX 1VQLX 2ESGGGLVX 3PGGSLRLSCAAS RFTFSDFGMHWVRQAPGK CLEWX 4X 5YI SSGSSTIYYADX 6VKGRFTISRDNAKNX 7LYLQMNSLRAEDTAVYYCAS SQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:297) 其中X 1係E或Q；X 2係V或L；X 3係K或Q；X 4係V或I；X 5係S或A；X 6係S或T；且X 7係S或T
11F09 48*01 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVSYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:176) CDR1- GFTFSDY (SEQ ID NO:163) CDR2- SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3- SQSYYRGTMDY (SEQ ID NO:164) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:177) CDR1- RASQGVSTSTYTYMH (SEQ ID NO:178) CDR2- FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3- QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
11F09 48*01 scFv (VL-VH) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIKFASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSWEIPWTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGK CLEWVSYISSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGSSQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:179)
11F09 48*01 BM2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWLAYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:245) CDR1- GFTFSDY (SEQ ID NO:163) CDR2- SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3- SQSYYRGTMDY (SEQ ID NO:164) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:177) CDR1- RASQGVSTSTYTYMH (SEQ ID NO:178) CDR2- FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3- QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
11F09 48*01 BM2 scFv (VL-VH) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIKFASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSWEIPWTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGK CLEWLAYISSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGSSQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:246)
11F09 21*05 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCEAS GFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWLAYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:161) CDR1- GFTFSDY (SEQ ID NO:163) CDR2- SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3- SQSYYRGTMDY (SEQ ID NO:164) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:177) CDR1- RASQGVSTSTYTYMH (SEQ ID NO:178) CDR2- FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3- QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
11F09 21*05 scFv (VL-VH) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCEAS GFTFSDYGMHWVRQAPGK CLEWLAYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:202)
11F09 21*05 BM1 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCEAS GFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVSYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:242) CDR1- GFTFSDY (SEQ ID NO:163) CDR2- SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3- SQSYYRGTMDY (SEQ ID NO:164) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:177) CDR1- RASQGVSTSTYTYMH (SEQ ID NO:178) CDR2- FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3- QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
11F09 21*05 scFv (VL-VH) BM1 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCEAS GFTFSDYGMHWVRQAPGK CLEWVSYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:243)
11F09 11*01 QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWLAYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:180) CDR1- GFTFSDY (SEQ ID NO:163) CDR2- SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3- SQSYYRGTMDY (SEQ ID NO:164) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:177) CDR1- RASQGVSTSTYTYMH (SEQ ID NO:178) CDR2- FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3- QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
11F09 11*01 scFv (VL-VH) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSDYGMHWVRQAPGK CLEWLAYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:181)
11F09 11*01 BM1 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSDYGMHWIRQAPGKGLEWVSYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:247) CDR1- GFTFSDY (SEQ ID NO:163) CDR2- SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3- SQSYYRGTMDY (SEQ ID NO:164) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:177) CDR1- RASQGVSTSTYTYMH (SEQ ID NO:178) CDR2- FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3- QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
11F09 11*01 BM1 scFv (VL-VH) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSDYGMHWIRQAPGK CLEWVSYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:248)
11F09 23*03 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVSYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCG SSQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:182) CDR1- GFTFSDY (SEQ ID NO:163) CDR2- SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3- SQSYYRGTMDY (SEQ ID NO:164) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:177) CDR1- RASQGVSTSTYTYMH (SEQ ID NO:178) CDR2- FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3- QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
11F09 23*03 scFv (VL-VH) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSDYGMHWVRQAPGK CLEWVSYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:183)
11F09 23*03-BM2 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWLAYIS SGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:250) CDR1- GFTFSDY (SEQ ID NO:163) CDR2- SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3- SQSYYRGTMDY (SEQ ID NO:164) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:177) CDR1- RASQGVSTSTYTYMH (SEQ ID NO:178) CDR2- FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3- QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
11F09 23*03-BM2 scFv (VL-VH) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSDYGMHWVRQAPGK CLEWLAYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:251)
08E06 EVQLQESGAEMVRPGASVKLSCKAS GYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGKI DSSDSKTQYNQKFKDKATLTVDKSSITVYMELNSLTSEDSAVYYCAR GGYLWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO:184) CDR1- GYTFTSY (SEQ ID NO:186) CDR2- DSSDSK (SEQ ID NO:187) CDR3- GGYLWFAY (SEQ ID NO:188) DIVMTQSPASLAVSLGQRATISC RASQSVSTSTYSYMHWYQQKPGQSPKLLIT YASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDIATYYC QHSWEIPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:185) CDR1- RASQSVSTSTYSYMH (SEQ ID NO:189) CDR2- YASNLES (SEQ ID NO:190) CDR3- QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
08E06-人源化變體1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGKI DSSDSKTQYNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR GGYLWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:191) CDR1- GYTFTSY (SEQ ID NO:186) CDR2- DSSDSK (SEQ ID NO:187) CDR3- GGYLWFAY (SEQ ID NO:188) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC RASQSVSTSTYSYMHWYQQKPGQPPKLLIY YASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:192) CDR1- RASQSVSTSTYSYMH (SEQ ID NO:189) CDR2- YASNLES (SEQ ID NO:190) CDR3- QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
scFv 08E06 (VH-VL)人源化變體1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGKI DSSDSKTQYNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR GGYLWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINC RASQSVSTSTYSYMHWYQQKPGQPPKLLIY YASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:193)
scFv08E06 (VL-VH)人源化變體1 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC RASQSVSTSTYSYMHWYQQKPGQPPKLLIY YASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGKI DSSDSKTQYNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR GGYLWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:194)
scFv 08E06 (VH-VL)人源化變體1（具有半胱胺酸突變，用於雙硫鍵形成） QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYWMHWVRQAPGQ CLEWMGKI DSSDSKTQYNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR GGYLWFAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINC RASQSVSTSTYSYMHWYQQKPGQPPKLLIY YASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIK (SEQ ID NO:294)
scFv08E06 (VL-VH)人源化變體1（具有半胱胺酸突變，用於雙硫鍵形成） DIVMTQSPDSLAVSLGERATINC RASQSVSTSTYSYMHWYQQKPGQPPKLLIY YASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYWMHWVRQAPGQ CLEWMGKI DSSDSKTQYNQKFKDRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR GGYLWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:295)
08E06-人源化變體2 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGKI DSSDSKTQYNQKFKDRVTMTVDTSSSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR GGYLWFAYWGQGTLVTVS (SEQ ID NO:195) CDR1- GYTFTSY (SEQ ID NO:186) CDR2- DSSDSK (SEQ ID NO:187) CDR3- GGYLWFAY (SEQ ID NO:188) DIVMTQSPASLAVSLGERATINC RASQSVSTSTYSYMHWYQQKPGQPPKLLIT YASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:196) CDR1- RASQSVSTSTYSYMH (SEQ ID NO:189) CDR2- YASNLES (SEQ ID NO:190) CDR3- QHSWEIPWT (SEQ ID NO: 143)
AB1011 (11F09-VH_BM1-VK_BM1) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVSYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:266) CDR1 – GFTFSDY (SEQ ID NO:163) CDR2 – SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3 - SQSYYRGTMDY (SEQ ID NO:164) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:177) CDR1 - RASQGVSTSTYTYMH (SEQ ID NO:178) CDR2 - FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3 - QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
AB1011 scFv (VL-VH) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSDYGMHWVRQAPGK CLEWVSYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:271)
AB1012 (11F09-VH_BM1-VK_BM1_M33L) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVSYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:266) CDR1 – GFTFSDY (SEQ ID NO:163) CDR2 – SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3 - SQSYYRGTMDY (SEQ ID NO:164) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYLHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:162) CDR1 - RASQGVSTSTYTYLH (SEQ ID NO:165) CDR2 - FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3 - QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
AB1012 scFv (VL-VH) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYLHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSDYGMHWVRQAPGK CLEWVSYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:272)
AB1013 (11F09-VH_BM1-VK_BM1_M33V) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVSYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:266) CDR1 – GFTFSDY (SEQ ID NO:163) CDR2 – SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3 - SQSYYRGTMDY (SEQ ID NO:164) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYVHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:267) CDR1 - RASQGVSTSTYTYVH (SEQ ID NO:268) CDR2 - FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3 - QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
AB1013 scFv (VL-VH) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYVHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSDYGMHWVRQAPGK CLEWVSYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:273)
AB1014 (11F09-VH_BM1_M100cI-VK_BM1) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVSYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTIDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:269) CDR1 – GFTFSDY (SEQ ID NO:163) CDR2 – SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3 - SQSYYRGTIDY (SEQ ID NO:270) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:177) CDR1 - RASQGVSTSTYTYMH (SEQ ID NO:178) CDR2 - FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3 - QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
AB1014 scFv (VL-VH) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSDYGMHWVRQAPGK CLEWVSYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTIDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:274)
AB1015 (11F09-VH_BM1_M100cI-VK_BM1_M33L) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVSYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTIDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:269) CDR1 – GFTFSDY (SEQ ID NO:163 CDR2 – SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3 - SQSYYRGTIDY (SEQ ID NO:270) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYLHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:162) CDR1 - RASQGVSTSTYTYLH (SEQ ID NO:165) CDR2 - FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3 - QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
AB1015 scFv (VL-VH) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYLHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSDYGMHWVRQAPGK CLEWVSYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTIDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:275)
AB1016 (11F09-VH_BM1_M100cI-VK_BM1_M33V) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVSYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTIDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:269) CDR1 – GFTFSDY (SEQ ID NO:163) CDR2 – SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3 - SQSYYRGTIDY (SEQ ID NO:270) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYVHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:267) CDR1 - RASQGVSTSTYTYVH (SEQ ID NO:268) CDR2 - FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3 - QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
AB1016 scFv (VL-VH) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYVHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAAS GFTFSDYGMHWVRQAPGK CLEWVSYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTIDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:276)
AB1017 (11F09-VH_BM2-VK_BM1) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCEAS GFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWLAYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:161) CDR1 – GFTFSDY (SEQ ID NO:163) CDR2 – SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3 - SQSYYRGTMDY (SEQ ID NO:164) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:177) CDR1 - RASQGVSTSTYTYMH (SEQ ID NO:178) CDR2 - FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3 - QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
AB1017 scFv (VL-VH) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCEAS GFTFSDYGMHWVRQAPGK CLEWLAYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:277)
AB1018 (11F09-VH_BM2-VK_BM1_M33L) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCEAS GFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWLAYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:161) CDR1 – GFTFSDY (SEQ ID NO:163) CDR2 – SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3 - SQSYYRGTMDY (SEQ ID NO:164) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYLHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:162) CDR1 - RASQGVSTSTYTYLH (SEQ ID NO:165) CDR2 - FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3 - QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
AB1018 scFv (VL-VH) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYLHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCEAS GFTFSDYGMHWVRQAPGK CLEWLAYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:278)
AB1019 (11F09-VH_BM2-VK_BM1_M33V) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCEAS GFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWLAYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:161) CDR1 – GFTFSDY (SEQ ID NO:163) CDR2 – SSGSST (SEQ ID NO:139) CDR3 - SQSYYRGTMDY (SEQ ID NO:164) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYVHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:267) CDR1 - RASQGVSTSTYTYVH (SEQ ID NO:268) CDR2 - FASNLES (SEQ ID NO:142) CDR3 - QHSWEIPWT (SEQ ID NO:143)
AB1019 scFv (VL-VH) DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQGVSTSTYTYVHWFQQKPGKAPKLLIK FASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSWEIPWTFG CGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCEAS GFTFSDYGMHWVRQAPGK CLEWLAYI SSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGS SQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:279)
表 2A – 說明性抗 5T4 結合抗原結合域之 CDR (Kabat)
Ab 名稱 VH – CDR1 VH – CDR2 VH – CDR3 VL – CDR1 VL – CDR2 VL – CDR3
140 DFGMH SEQ ID NO:472 YISSGSSTIYYADTVKG SEQ ID NO:473 SQSYYRGTLDY SEQ ID NO:140 RASQSVTTSNYNYMH SEQ ID NO:141 FASNLES SEQ ID NO:142 QHSWEIPWT SEQ ID NO:143
141 DFGMH SEQ ID NO:472 YISSGSSTIYYADSVKG SEQ ID NO:474 SQSYYRGTLDY SEQ ID NO:140 RASQSVTTSNYNYMH SEQ ID NO:141 FASNLES SEQ ID NO:142 QHSWEIPWT SEQ ID NO:143
142 DFGMH SEQ ID NO:472 YISSGSSTIYYADSVKG SEQ ID NO:474 SQSYYRGTLDY SEQ ID NO:140 RASQSVTTSNYNYLH SEQ ID NO:290 FASNLES SEQ ID NO:142 QHSWEIPWT SEQ ID NO:143
143 DFGMH SEQ ID NO:472 YISSGSSTIYYADSVKG SEQ ID NO:474 SQSYYRGTLDY SEQ ID NO:140 RASQSVTTSNYNYVH SEQ ID NO:292 FASNLES SEQ ID NO:142 QHSWEIPWT SEQ ID NO:143
144 DFGMH SEQ ID NO:472 YISSGSSTIYYADX 6VKG X 6=S或T SEQ ID NO:475 SQSYYRGTLDY SEQ ID NO:140 RASQSVTTSNYNYX 8H X 8=L、M、或V SEQ ID NO:541 FASNLES SEQ ID NO:142 QHSWEIPWT SEQ ID NO:143
145 DYYMD SEQ ID NO:476 YIFPNDASTTYNEKFKG SEQ ID NO:477 SRDADY SEQ ID NO:153 SAKSSVSYIH SEQ ID NO:154 DTSYLGS SEQ ID NO:155 QQWSSYPYT SEQ ID NO:156
146 DYGMH SEQ ID NO:478 YISSGSSTFYYADTVKG SEQ ID NO:479 SQSYYRGTMDY SEQ ID NO:164 RASQGVSTSTYTYLH SEQ ID NO:165 FASNLES SEQ ID NO:142 QHSWEIPWT SEQ ID NO:143
147 DYGMH SEQ ID NO:478 YISSGSSTFYYADTVKG SEQ ID NO:479 SQSYYRGTMDY SEQ ID NO:164 RASQGVSTSTYTYMH SEQ ID NO:178 FASNLES SEQ ID NO:142 QHSWEIPWT SEQ ID NO:143
148 DYGMH SEQ ID NO:478 YISSGSSTFYYADTVKG SEQ ID NO:479 SQSYYRGTMDY SEQ ID NO:164 RASQGVSTSTYTYVH SEQ ID NO:268 FASNLES SEQ ID NO:142 QHSWEIPWT SEQ ID NO:143
149 DYGMH SEQ ID NO:478 YISSGSSTFYYADTVKG SEQ ID NO:479 SQSYYRGTIDY SEQ ID NO:270 RASQGVSTSTYTYMH SEQ ID NO:178 FASNLES SEQ ID NO:142 QHSWEIPWT SEQ ID NO:143
150 DYGMH SEQ ID NO:478 YISSGSSTFYYADTVKG SEQ ID NO:479 SQSYYRGTIDY SEQ ID NO:270 RASQGVSTSTYTYLH SEQ ID NO:165 FASNLES SEQ ID NO:142 QHSWEIPWT SEQ ID NO:143
151 DYGMH SEQ ID NO:478 YISSGSSTFYYADTVKG SEQ ID NO:479 SQSYYRGTIDY SEQ ID NO:270 RASQGVSTSTYTYVH SEQ ID NO:268 FASNLES SEQ ID NO:142 QHSWEIPWT SEQ ID NO:143
152 SYWMH SEQ ID NO:480 KIDSSDSKTQYNQKFKD SEQ ID NO:481 GGYLWFAY SEQ ID NO:188 RASQSVSTSTYSYMH SEQ ID NO:189 YASNLES SEQ ID NO:190 QHSWEIPWT SEQ ID NO:143
表 2B – 說明性抗 5T4 結合抗原結合域之 CDR (Chothia)
Ab 名稱 VH – CDR1 VH – CDR2 VH – CDR3 VL – CDR1 VL – CDR2 VL – CDR3
153 RFTFSDF SEQ ID NO:138 SGSS SEQ ID NO:482 QSYYRGTLD SEQ ID NO:483 SQSVTTSNYNY SEQ ID NO:484 FAS SEQ ID NO:485 SWEIPW SEQ ID NO:486
154 GYKFTDY SEQ ID NO:152 PNDA SEQ ID NO:487 RDAD SEQ ID NO:488 KSSVSY SEQ ID NO:489 DTS SEQ ID NO:490 WSSYPY SEQ ID NO:491
155 GFTFSDY SEQ ID NO:163 SGSS SEQ ID NO:482 QSYYRGTMD SEQ ID NO:492 SQGVSTSTYTY SEQ ID NO:493 FAS SEQ ID NO:485 SWEIPW SEQ ID NO:486
156 GFTFSDY SEQ ID NO:163 SGSS SEQ ID NO:482 QSYYRGTID SEQ ID NO:494 SQGVSTSTYTY SEQ ID NO:493 FAS SEQ ID NO:485 SWEIPW SEQ ID NO:486
157 GYTFTSY SEQ ID NO:186 SSDS SEQ ID NO:495 GYLWFA SEQ ID NO:496 SQSVSTSTYSY SEQ ID NO:497 YAS SEQ ID NO:498 SWEIPW SEQ ID NO:486
表 2C – 說明性抗 5T4 結合抗原結合域之 CDR (IMGT)
Ab 名稱 VH – CDR1 VH – CDR2 VH – CDR3 VL – CDR1 VL – CDR2 VL – CDR3
158 RFTFSDFG SEQ ID NO:499 ISSGSSTI SEQ ID NO:500 ASSQSYYRGTLDY SEQ ID NO:501 QSVTTSNYNY SEQ ID NO:502 FAS SEQ ID NO:485 QHSWEIPWT SEQ ID NO:143
159 GYKFTDYY SEQ ID NO:503 IFPNDAST SEQ ID NO:504 ARSRDADY SEQ ID NO:505 SSVSY SEQ ID NO:506 DTS SEQ ID NO:490 QQWSSYPYT SEQ ID NO:156
160 GFTFSDYG SEQ ID NO:507 ISSGSSTF SEQ ID NO:508 GSSQSYYRGTMDY SEQ ID NO:509 QGVSTSTYTY SEQ ID NO:510 FAS SEQ ID NO:485 QHSWEIPWT SEQ ID NO:143
161 GFTFSDYG SEQ ID NO:507 ISSGSSTF SEQ ID NO:508 GSSQSYYRGTIDY SEQ ID NO:511 QGVSTSTYTY SEQ ID NO:510 FAS SEQ ID NO:485 QHSWEIPWT SEQ ID NO:143
162 GYTFTSYW SEQ ID NO:512 IDSSDSKT SEQ ID NO:513 ARGGYLWFAY SEQ ID NO:514 QSVSTSTYSY SEQ ID NO:515 YAS SEQ ID NO:498 QHSWEIPWT SEQ ID NO:143
表 2D – 說明性抗 5T4 結合抗原結合域之 CDR (Honegger)
Ab 名稱 VH – CDR1 VH – CDR2 VH – CDR3 VL – CDR1 VL – CDR2 VL – CDR3  
163 ASRFTFSDFG SEQ ID NO:516 ISSGSSTIYYADTVKGR SEQ ID NO:517 SQSYYRGTLD SEQ ID NO:518 ASQSVTTSNYNY SEQ ID NO:519 FASNLESGVPAR SEQ ID NO:520 SWEIPW SEQ ID NO:486  
164 ASRFTFSDFG SEQ ID NO:516 ISSGSSTIYYADSVKGR SEQ ID NO:521 SQSYYRGTLD SEQ ID NO:518 ASQSVTTSNYNY SEQ ID NO:519 FASNLESGVPSR SEQ ID NO:522 SWEIPW SEQ ID NO:486  
165 ASRFTFSDFG SEQ ID NO:516 ISSGSSTIYYADX 6VKGR X 6= S或T SEQ ID NO:523 SQSYYRGTLD SEQ ID NO:518 ASQSVTTSNYNY SEQ ID NO:519 FASNLESGVPSR SEQ ID NO:522 SWEIPW SEQ ID NO:486  
166 ASRFTFSDFG SEQ ID NO:516 ISSGSSTIYYADX 6VKGR X 6= S或T SEQ ID NO:523 SQSYYRGTLD SEQ ID NO:518 ASQSVTTSNYNY SEQ ID NO:519 FASNLESGVPX 9R X 9= A或S SEQ ID NO:542 SWEIPW SEQ ID NO:486  
167 ASGYKFTDYY SEQ ID NO:524 IFPNDASTTYNEKFKGK SEQ ID NO:525 SRDAD SEQ ID NO:526 AKSSVSY SEQ ID NO:527 DTSYLGSGIPAR SEQ ID NO:528 WSSYPY SEQ ID NO:491  
168 ASGFTFSDYG SEQ ID NO:529 ISSGSSTFYYADTVKGR SEQ ID NO:530 SQSYYRGTMD SEQ ID NO:531 ASQGVSTSTYTY SEQ ID NO:532 FASNLESGVPSR SEQ ID NO:522 SWEIPW SEQ ID NO:486  
169 ASGFTFSDYG SEQ ID NO:529 ISSGSSTFYYADTVKGR SEQ ID NO:530 SQSYYRGTID SEQ ID NO:533 ASQGVSTSTYTY SEQ ID NO:532 FASNLESGVPSR SEQ ID NO:522 SWEIPW SEQ ID NO:486  
170 ASGYTFTSYW SEQ ID NO:534 IDSSDSKTQYNQKFKDK SEQ ID NO:535 GGYLWFA SEQ ID NO:536 ASQSVSTSTYSY SEQ ID NO:537 YASNLESGVPAR SEQ ID NO:538 SWEIPW SEQ ID NO:486  
171 ASGYTFTSYW SEQ ID NO:534 IDSSDSKTQYNQKFKDR SEQ ID NO:539 GGYLWFA SEQ ID NO:536 ASQSVSTSTYSY SEQ ID NO:537 YASNLESGVPDR SEQ ID NO:540 SWEIPW SEQ ID NO:486  
在各種實施例中，結合5T4（例如人類5T4）之第二抗原結合位點或第二抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Kabat編號方案）： • SEQ ID NO: 472、473、140、141、142、及143； • SEQ ID NO: 472、474、140、141、142、及143； • SEQ ID NO: 472、474、140、290、142、及143； • SEQ ID NO: 472、474、140、292、142、及143； • SEQ ID NO: 472、475、140、141、142、及143； • SEQ ID NO: 472、475、140、541、142、及143； • SEQ ID NO: 476、477、153、154、155、及156； • SEQ ID NO: 478、479、164、165、142、及143； • SEQ ID NO: 478、479、164、178、142、及143； • SEQ ID NO: 478、479、164、268、142、及143； • SEQ ID NO: 478、479、270、165、142、及143； • SEQ ID NO: 478、479、270、178、142、及143； • SEQ ID NO: 478、479、270、268、142、及143；或 • SEQ ID NO: 480、481、188、189、190、及143。
在各種實施例中，結合5T4（例如人類5T4）之第二抗原結合位點或第二抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Kabat編號方案）： • SEQ ID NO: 472、473、140、141、142、及143； • SEQ ID NO: 472、474、140、141、142、及143； • SEQ ID NO: 472、474、140、290、142、及143； • SEQ ID NO: 472、474、140、292、142、及143； • SEQ ID NO: 472、475、140、141、142、及143；或 • SEQ ID NO: 472、475、140、541、142、及143。
在一些實施例中，結合5T4（例如人類5T4）之第二抗原結合位點或第二抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Kabat編號方案）：SEQ ID NO: 472、473、140、141、142、及143。在一些實施例中，結合5T4（例如人類5T4）之本案抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Kabat編號方案）：SEQ ID NO: 472、474、140、141、142、及143。在一些實施例中，結合5T4（例如人類5T4）之本案抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Kabat編號方案）：SEQ ID NO: 472、474、140、290、142、及143。在一些實施例中，結合5T4（例如人類5T4）之本案抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Kabat編號方案）：SEQ ID NO: 472、474、140、292、142、及143。在一些實施例中，結合5T4（例如人類5T4）之本案抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Kabat編號方案）：SEQ ID NO: 472、475、140、141、142、及143。在一些實施例中，結合5T4（例如人類5T4）之本案抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Kabat編號方案）：SEQ ID NO: 472、475、140、541、142、及143。
在各種實施例中，結合5T4（例如人類5T4）之第二抗原結合位點或第二抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Chothia編號方案）： • SEQ ID NO: 138、482、483、484、485、及486； • SEQ ID NO: 152、487、488、489、490、及491； • SEQ ID NO: 163、482、492、493、485、及486； • SEQ ID NO: 163、482、492、494、485、及486；或 • SEQ ID NO: 186、495、496、497、498、及486。
在各種實施例中，結合5T4（例如人類5T4）之第二抗原結合位點或第二抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Chothia編號方案）：SEQ ID NO: 138、482、483、484、485、及486。
在各種實施例中，結合5T4（例如人類5T4）之第二抗原結合位點或第二抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據IMGT編號方案）： • SEQ ID NO: 499、500、501、502、485、及143； • SEQ ID NO: 503、504、505、506、490、及156； • SEQ ID NO: 507、508、509、510、485、及143； • SEQ ID NO: 507、508、511、510、485、及143；或 • SEQ ID NO: 512、513、514、515、498、及143。
在各種實施例中，結合5T4（例如人類5T4）之第二抗原結合位點或第二抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據IMGT編號方案）：SEQ ID NO: 499、500、501、502、485、及143。
在各種實施例中，結合5T4（例如人類5T4）之第二抗原結合位點或第二抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Honegger編號方案）： • SEQ ID NO: 516、517、518、519、520、及486； • SEQ ID NO: 516、521、518、519、522、及486； • SEQ ID NO: 516、523、518、519、522、及486； • SEQ ID NO: 516、523、518、519、542、及486； • SEQ ID NO: 524、525、526、527、528、及491； • SEQ ID NO: 529、530、531、532、522、及486； • SEQ ID NO: 529、530、533、532、522、及486； • SEQ ID NO: 534、535、536、537、538、及486；或 • SEQ ID NO: 534、539、536、537、540、及486。
在各種實施例中，結合5T4（例如人類5T4）之第二抗原結合位點或第二抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Honegger編號方案）： • SEQ ID NO: 516、517、518、519、520、及486； • SEQ ID NO: 516、521、518、519、522、及486； • SEQ ID NO: 516、523、518、519、522、及486；或 • SEQ ID NO: 516、523、518、519、542、及486。
在各種實施例中，結合5T4（例如人類5T4）之第二抗原結合位點或第二抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Honegger編號方案）：SEQ ID NO: 516、517、518、519、520、及486。在各種實施例中，結合5T4（例如人類5T4）之本案抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Honegger編號方案）：SEQ ID NO: 516、517、518、519、522、及486。在各種實施例中，結合5T4（例如人類5T4）之本案抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Honegger編號方案）：SEQ ID NO: 516、523、518、519、522、及486。在各種實施例中，結合5T4（例如人類5T4）之本案抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Honegger編號方案）：SEQ ID NO: 516、523、518、519、542、及486。
在某些實施例中，結合5T4（例如人類5T4）之第二抗原結合位點包含：抗體重鏈可變域(VH)，其包含與表2所揭示之抗體之VH至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及抗體輕鏈可變域(VL)，其包含與表2所揭示之相同抗體之VL至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含表2所揭示之抗原結合位點之VH及VL序列之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3、及輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3，其依下列判定：Kabat（參見Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH Publication No. 91-3242, Bethesda）、Chothia（參見例如Chothia C & Lesk A M, (1987), J Mol Biol196: 901-917）、MacCallum（參見MacCallum R M et al., (1996) J Mol Biol262: 732-745）、或所屬技術領域中已知的任何其他CDR判定方法。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含表2、表2A、表2B、表2C、或表2D所揭示之抗體之重鏈CDR1、CDR2、及CDR3、及輕鏈CDR1、CDR2、及CDR3。
在某些實施例中，本揭露之抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:263之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:145之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，抗原結合位點包含VL，該VL相對於SEQ ID NO:145具有G100C取代。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列。
在某些實施例中，抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:264或SEQ ID NO:265之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:296或SEQ ID NO:297之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點包含(a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及(b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:144之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:145之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO:145之胺基酸序列。在某些實施例中，抗原結合位點包含VH，該VH相對於SEQ ID NO:144具有G44C取代。在某些實施例中，抗原結合位點包含VL，該VL相對於SEQ ID NO:145具有G100C取代。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含在位置33處之白胺酸(L)取代，其係根據Kabat編號方案。因此，在一些實施例中，VL包含SEQ ID NO:289之胺基酸序列，或VL包含：包含SEQ ID NO: 290、142、及143之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。在某些實施例中，VL包含在位置33處之纈胺酸(V)取代，其係根據Kabat編號方案。因此，在一些實施例中，VL包含SEQ ID NO:291之胺基酸序列，或VL包含：包含SEQ ID NO: 292、142、及143之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:166之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:145之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:168之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:145之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含在位置62處之絲胺酸(S)取代，其係根據Kabat編號方案）。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:236之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:145之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含在位置62處之絲胺酸(S)取代，其係根據Kabat編號方案）。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:170之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:145之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含在位置62處之絲胺酸(S)取代，其係根據Kabat編號方案）。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:228之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:145之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含在位置62處之絲胺酸(S)取代，其係根據Kabat編號方案）。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:172之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:145之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含在位置62處之絲胺酸(S)取代，其係根據Kabat編號方案）。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:174之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:145之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含在位置62處之絲胺酸(S)取代，其係根據Kabat編號方案）。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:232之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:145之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含在位置62處之絲胺酸(S)取代，其係根據Kabat編號方案）。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:146之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:147之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:146之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:147之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:146之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:147之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:146之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:147之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:146之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:147之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:146之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:147之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:146之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:147之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含SEQ ID NO:146之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO:147之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含：VH，其包含與SEQ ID NO:146之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:147之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:148或SEQ ID NO:149之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:148之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:148之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:148之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:148之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:148之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:148之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含SEQ ID NO:148之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:167之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:169之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:293之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:171之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:229之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:173之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:175之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:233之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點包含(a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 152、158、及153之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及(b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 154、155、及156之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:150之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:151之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 152、158、及153之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 154、155、及156之胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含在位置1處之麩胺酸(E)取代，其係根據Kabat編號方案。因此，在一些實施例中，VH包含SEQ ID NO:157之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:221、或SEQ ID NO:160之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:221之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:159之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:160之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點包含(a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 163、139、及164之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及(b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 165、142、及143之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:161之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:162之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 163、139、及164之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 165、142、及143之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:176之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:177之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 163、139、及164之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 178、142、及143之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:179之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:242之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:177之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 163、139、及164之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 178、142、及143之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:243之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:245之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:177之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 163、139、及164之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 178、142、及143之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:246之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:161之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:177之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 163、139、及164之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 178、142、及143之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:202之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:180之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:177之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 163、139、及164之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 178、142、及143之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:181之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:247之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:177之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 163、139、及164之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 178、142、及143之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:248之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:182之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:177之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 163、139、及164之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 178、142、及143之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:183之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:250之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:177之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 163、139、及164之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 178、142、及143之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:251之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點包含(a) VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 186、187、及188之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及(b) VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 189、190、及143之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:184之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:185之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 186、187、188之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 189、190、及143之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:191之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:192之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 186、187、及188之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 189、190、及143之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:193或SEQ ID NO:194之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:294或SEQ ID NO:295之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:195之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:196之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 186、187、及188之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 189、190、及143之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:266之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:177之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 163、139、及164之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 178、142、及143之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:271之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:266之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:162之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 163、139、及164之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 165、142、及143之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:272之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:266之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:267之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 163、139、及164之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 268、142、及143之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:273之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:269之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:177之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 163、139、及270之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 178、142、及143之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:274之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:269之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:162之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 163、139、及270之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 165、142、及143之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:275之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:269之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:267之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 163、139、及270之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 268、142、及143之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:276之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:161之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:177之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 163、139、及164之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 178、142、及143之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:277之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:161之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:162之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 163、139、及164之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 165、142、及143之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:278之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:161之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:267之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，VH包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 163、139、及164之胺基酸序列。在某些實施例中，VL包含CDR1、CDR2、及CDR3，其等分別包含SEQ ID NO: 268、142、及143之胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點係以scFv存在，其中scFv包含與SEQ ID NO:279之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。
在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：VH，其包含分別包含SEQ ID NO:138、139、及140之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及VL，其包含分別包含SEQ ID NO:141、142、及143之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3，其中抗原結合位點在LRR1域內結合5T4。因此，CDR序列係識別為驅動抗原結合性質之特徵，所屬技術領域中具有通常知識者理解到，包含相同CDR之抗原結合位點預期會展現類似抗原結合性質。在一些態樣中，包含下列之抗原結合位點係人類抗原結合位點：VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。在一些態樣中，包含下列之抗原結合位點係鼠類抗原結合位點：VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。
在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 163、139、及164之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 165、142、及143之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3，其中抗原結合位點在LRR1域內結合5T4。因此，CDR序列係識別為驅動抗原結合性質之特徵，所屬技術領域中具有通常知識者理解到，包含相同CDR之抗原結合位點預期會展現類似抗原結合性質。在一些態樣中，包含下列之抗原結合位點係人類抗原結合位點：VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 163、139、及164之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 165、142、及143之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。在一些態樣中，包含下列之抗原結合位點係鼠類抗原結合位點：VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 163、139、及164之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 165、142、及143之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。
在某些實施例中，第二抗原結合位點包含：VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 186、187、及188之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 189、190、及143之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3，其中抗原結合位點在LRR2域內結合5T4。因此，CDR序列係識別為驅動抗原結合性質之特徵，所屬技術領域中具有通常知識者理解到，包含相同CDR之抗原結合位點預期會展現類似抗原結合性質。在一些態樣中，包含下列之抗原結合位點係人類抗原結合位點：VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 186、187、及188之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 189、190、及143之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。在一些態樣中，包含下列之抗原結合位點係鼠類抗原結合位點：VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 186、187、及188之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 189、190、及143之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。
在某些實施例中，結合5T4之第二抗原結合位點係scFv。例如，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含SEQ ID NO: 148、149、159、160、167、169、171、173、175、179、181、183、193、194、202、221、229、233、243、246、248、251、264、265、271、272、273、274、275、276、277、278、279、293、294、295、296、或297之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含SEQ ID NO: 148或149之胺基酸序列。在某些實施例中，第二抗原結合位點包含SEQ ID NO:148之胺基酸序列。
在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列： •     SEQ ID NO: 81、82、112、86、77、及87；或 •     SEQ ID NO: 81、82、97、86、77、及87；且 結合5T4（例如人類5T4）之第二抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列： • SEQ ID NO: 138、139、140、141、142、及143。
在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Kabat編號方案）： •     SEQ ID NO: 81、82、112、86、77、及87； •     SEQ ID NO: 81、82、84、86、77、及87； •     SEQ ID NO: 81、82、97、86、77、及87； •     SEQ ID NO: 81、82、100、86、77、及87； •     SEQ ID NO: 81、82、103、86、77、及87； •     SEQ ID NO: 81、82、106、86、77、及87；或 •     SEQ ID NO: 81、82、109、86、77、及87；且 結合5T4（例如人類5T4）之第二抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Kabat編號方案）： • SEQ ID NO: 472、473、140、141、142、及143； • SEQ ID NO: 472、474、140、141、142、及143； • SEQ ID NO: 472、474、140、290、142、及143； • SEQ ID NO: 472、474、140、292、142、及143； • SEQ ID NO: 472、475、140、141、142、及143；或 •     SEQ ID NO: 472、475、140、541、142、及143。
在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Kabat編號方案）： • SEQ ID NO: 81、82、112、86、77、及87；或 • SEQ ID NO: 81、82、97、86、77、及87；且 結合5T4（例如人類5T4）之第二抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Kabat編號方案）： • SEQ ID NO: 472、474、140、141、142、及143。
在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Kabat編號方案）：SEQ ID NO: 81、82、112、86、77、及87；且 結合5T4（例如人類5T4）之第二抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Kabat編號方案）： • SEQ ID NO: 472、475、140、141、142、及143；或 •     SEQ ID NO: 472、475、140、541、142、及143。
在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Kabat編號方案）：SEQ ID NO: 81、82、97、86、77、及87；且 結合5T4（例如人類5T4）之第二抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Kabat編號方案）：SEQ ID NO: 472、474、140、141、142、及143。
在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Chothia編號方案）： • SEQ ID NO: 381、390、391、392、385、及393； • SEQ ID NO: 381、390、394、392、385、及393； • SEQ ID NO: 381、390、395、392、385、及393； • SEQ ID NO: 381、390、396、392、385、及393； • SEQ ID NO: 381、390、397、392、385、及393； • SEQ ID NO: 381、390、398、392、385、及393；或 • SEQ ID NO: 381、390、399、392、385、及393；且 結合5T4（例如人類5T4）之第二第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Chothia編號方案）： • SEQ ID NO: 138、482、483、484、485、及486； • SEQ ID NO: 152、487、488、489、490、及491； • SEQ ID NO: 163、482、492、493、485、及486； • SEQ ID NO: 163、482、492、494、485、及486；或 • SEQ ID NO: 186、495、496、497、498、及486。
在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Chothia編號方案）： • SEQ ID NO: 381、390、391、392、385、及393；或 • SEQ ID NO: 381、390、395、392、385、及393；且 結合5T4（例如人類5T4）之第二第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Chothia編號方案）： • SEQ ID NO: 138、482、483、484、485、及486。
在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Chothia編號方案）：SEQ ID NO: 381、390、395、392、385、及393；且 結合5T4（例如人類5T4）之第二第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Chothia編號方案）：SEQ ID NO: 138、482、483、484、485、及486。
在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據IMGT編號方案）： • SEQ ID NO: 422、423、111、424、385、及87； • SEQ ID NO: 422、423、83、424、385、及87； • SEQ ID NO: 422、423、96、424、385、及87； • SEQ ID NO: 422、423、99、424、385、及87； • SEQ ID NO: 422、423、102、424、385、及87； • SEQ ID NO: 422、423、105、424、385、及87；或 • SEQ ID NO: 422、423、108、424、385、及87；且 結合5T4（例如人類5T4）之第二抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據IMGT編號方案）： • SEQ ID NO: 499、500、501、502、485、及143； • SEQ ID NO: 503、504、505、506、490、及156； • SEQ ID NO: 507、508、509、510、485、及143； • SEQ ID NO: 507、508、511、510、485、及143；或 • SEQ ID NO: 512、513、514、515、498、及143。
在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據IMGT編號方案）： • SEQ ID NO: 422、423、111、424、385、及87；或 • SEQ ID NO: 422、423、96、424、385、及87；且 結合5T4（例如人類5T4）之第二抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據IMGT編號方案）： • SEQ ID NO: 499、500、501、502、485、及143。
在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據IMGT編號方案）：SEQ ID NO: 422、423、96、424、385、及87；且 結合5T4（例如人類5T4）之第二抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據IMGT編號方案）：SEQ ID NO: 499、500、501、502、485、及143。
在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Honegger編號方案）： •     SEQ ID NO: 462、463、464、465、459、及393； •     SEQ ID NO: 462、463、466、465、459、及393； •     SEQ ID NO: 462、463、467、465、459、及393； •     SEQ ID NO: 462、463、468、465、459、及393； •     SEQ ID NO: 462、463、469、465、459、及393； •     SEQ ID NO: 462、463、470、465、459、及393；或 •     SEQ ID NO: 462、463、471、465、459、及393；且 結合5T4（例如人類5T4）之第二抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Honegger編號方案）： •     SEQ ID NO: 516、517、518、519、520、及486； •     SEQ ID NO: 516、521、518、519、522、及486； •     SEQ ID NO: 516、523、518、519、522、及486；或 •     SEQ ID NO: 516、523、518、519、542、及486。
在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Honegger編號方案）： •     SEQ ID NO: 462、463、464、465、459、及393；或 •     SEQ ID NO: 462、463、467、465、459、及393；且 結合5T4（例如人類5T4）之第二抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Honegger編號方案）： •     SEQ ID NO: 516、521、518、519、522、及486。
在各種實施例中，結合NKG2D（例如人類NKG2D）之第一抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Honegger編號方案）：SEQ ID NO: 462、463、467、465、459、及393；且 結合5T4（例如人類5T4）之第二抗原結合域包含VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL-CDR1、VL-CDR2、及VL-CDR3，其等分別包含下列胺基酸序列（根據Honegger編號方案）： •     SEQ ID NO: 516、521、518、519、522、及486； •     SEQ ID NO: 516、523、518、519、522、及486；或 •     SEQ ID NO: 516、523、518、519、542、及486。
在某些實施例中，結合至5T4之第二抗原結合位點包含：VH，其包含選自表12之CDR1、CDR2、及CDR3序列；及VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 189、190、及143之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3序列。例如，在某些實施例中，第二抗原結合位點包含VH，該VH包含選自由下列所組成之群組的CDR1、CDR2、及CDR3序列：(a) GYTFTSY (SEQ ID NO:186)、DSSDSK (SEQ ID NO:187)、及GGYLWFAY (SEQ ID NO:188)；(b) GYTFGSY (SEQ ID NO:203)、DASTEK (SEQ ID NO:204)、及GGYLWFQY (SEQ ID NO:205)；(c) GYLFTSY (SEQ ID NO:206)、SVSDAK (SEQ ID NO:207)、及GGYLWFKY (SEQ ID NO:208)；(d) GYTFGSY (SEQ ID NO: 203)、DARSAK (SEQ ID NO:209)、及GGYLWFKY(SEQ ID NO: 208)；(e) GYRFTSY (SEQ ID NO:210)、DASSAK (SEQ ID NO:211)、及GGYLWFKY (SEQ ID NO: 208)；(f) GYGFTSY (SEQ ID NO:212)、DARTAK (SEQ ID NO:213)、及GGYLWYAY (SEQ ID NO:214)；(g) GYTFTSY (SEQ ID NO: 186)、DASDAK (SEQ ID NO:215)、及GGYLWYHY (SEQ ID NO:216)；(h) GYTFTSY (SEQ ID NO: 186)、DASDAK (SEQ ID NO:215)、及GGYLWYSY (SEQ ID NO:217)；(i) GYTFTSY (SEQ ID NO: 186)、DASDAK (SEQ ID NO:215)、及GGYLWYAY (SEQ ID NO:214)；(j) GYSFTSY (SEQ ID NO:218)、DASDAK (SEQ ID NO:215)、及GGYLWFKY (SEQ ID NO: 208)；(k) GYTFTSY (SEQ ID NO: 186)、DASDAK (SEQ ID NO:215)、及GGYLWFKY (SEQ ID NO: 208)；及(l) GYGFTSY (SEQ ID NO:212)、DARTAK (SEQ ID NO:213)、及GGHLWYAY (SEQ ID NO:219)。結合至5T4之此類第二抗原結合位點可藉由以下形成：將此等VH中之任一者與VL組合，該VL包含分別包含SEQ ID NO: 189、190、及143之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3序列。
替代地，可結合至5T4之新穎抗原結合位點可藉由針對與胺基酸序列之結合篩選來識別，該胺基酸序列係由與胺基酸序列之結合定義，其係由SEQ ID NO:197、其變體、其成熟胞外片段、或含有5T4之結構域之片段定義。 MPGGCSRGPAAGDGRLRLARLALVLLGWVSSSSPTSSASSFSSSAPFLASAVSAQPPLPDQCPALCECSEAARTVKCVNRNLTEVPTDLPAYVRNLFLTGNQLAVLPAGAFARRPPLAELAALNLSGSRLDEVRAGAFEHLPSLRQLDLSHNPLADLSPFAFSGSNASVSAPSPLVELILNHIVPPEDERQNRSFEGMVVAALLAGRALQGLRRLELASNHFLYLPRDVLAQLPSLRHLDLSNNSLVSLTYVSFRNLTHLESLHLEDNALKVLHNGTLAELQGLPHIRVFLDNNPWVCDCHMADMVTWLKETEVVQGKDRLTCAYPEKMRNRVLLELNSADLDCDPILPPSLQTSYVFLGIVLALIGAIFLLVLYLNRKGIKKWMHNIRDACRDHMEGYHYRYEINADPRLTNLSSNSDV (SEQ ID NO:197)
設想的是，在scFv中，VH及VL可藉由連接子連接，例如(GlyGlyGlyGlySer) 4，亦即(G 4S) 4連接子(SEQ ID NO:119)。所屬技術領域中具有通常知識者經理解，任何其他所揭示之連接子（參見例如表10）可用於具有本文（例如表2）所揭示之VH及VL序列的scFv中。
在前述實施例之各者中，本文設想結合5T4之scFv、VH、及/或VL序列可在VH及/或VL之構架區中含有胺基酸改變（例如至少1、2、3、4、5、或10個胺基酸取代、缺失、或添加），而不影響其對5T4的能力。例如，本文設想結合5T4之scFv、VH、及/或VL序列可含有半胱胺酸異二聚化突變，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。
在某些實施例中，第二抗原結合位點與上述對應抗原結合位點競爭結合至5T4。
在某些實施例中，本揭露之多特異性結合蛋白以下列之K D（亦即解離常數）特異性結合5T4（例如人類5T4或食蟹獼猴5T4）：25 nM、20 nM、15 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM、0.1 nM、或更低，如使用標準結合檢定（例如表面電漿共振(SPR)）（例如，使用以下實例1中所述之方法）或生物膜干涉技術(BLI)所測量。在某些實施例中，如本文所揭示之多特異性結合蛋白以小於9 nM之K D特異性結合5T4。在某些實施例中，如本文所揭示之多特異性結合蛋白以小於8 nM之K D特異性結合5T4。在某些實施例中，如本文所揭示之多特異性結合蛋白以小於7 nM之K D特異性結合5T4。在某些實施例中，如本文所揭示之多特異性結合蛋白以小於6 nM之K D特異性結合5T4。在某些實施例中，如本文所揭示之多特異性結合蛋白以小於5 nM之K D特異性結合5T4。在某些實施例中，本揭露之多特異性結合蛋白以下列之K d（亦即解離速率，亦稱為K off）特異性結合5T4（例如人類5T4或食蟹獼猴5T4）：等於或低於1 × 10 -5、9 × 10 -4、8 × 10 -4、7 × 10 -4、6 × 10 -4、5 × 10 -4、4 × 10 -4、3 × 10 -4、2 × 10 -4、1 × 10 -4、1 × 10 -3、5 × 10 -3、0.01、0.02、或0.05 1/s，如藉由SPR（例如，使用以下實例1中所述之方法）或藉由BLI所測量。 Fc域
在Fc域內，CD16結合係由鉸鏈區及CH2域介導。例如，在人類IgG1內，與CD16之交互作用主要集中於CH2域中之胺基酸殘基Asp 265 – Glu 269、Asn 297 – Thr 299、Ala 327 – Ile 332、Leu 234 – Ser 239、及碳水化合物殘基N-乙醯基-D-葡萄醣胺（參見Sondermann et al., Nature, 406 (6793):267-273）。基於已知結構域，可選擇突變以增強或降低與CD16之結合親和力（諸如藉由使用噬菌體展示庫或酵母菌表面展示cDNA庫），或可基於交互作用之已知三維結構設計突變。因此，在某些實施例中，抗體Fc域或其部分包含鉸鏈及CH2域。
在一些實施例中，本文所述之多特異性結合蛋白包括一或多種抗原結合位點之VH或VL，其係融合至抗體Fc域多肽或其部分之N端。此類抗原結合位點可包括如本文所述之抗NKG2D抗體或抗5T4抗體之VH或VL。因此，在一些實施例中，抗NKG2D抗體之VH或VL係融合至足以結合CD16之抗體Fc域多肽或其部分之N端。在一些實施例中，抗5T4抗體之VH或VL係融合至足以結合CD16之抗體Fc域多肽或其部分之N端。在一些實施例中，抗NKG2D抗體之VH或VL係融合至足以結合CD16之第一抗體Fc域多肽或其部分之N端，且抗5T4抗體之VH或VL係融合至足以結合CD16之第二抗體Fc域多肽或其部分之N端。在一些實施例中，抗NKG2D抗體之VH係融合至足以結合CD16之第一抗體Fc域多肽或其部分之N端，且抗5T4抗體之VH係融合至足以結合CD16之第二抗體Fc域多肽或其部分之N端。
異二聚體抗體重鏈的組裝可藉由在相同細胞中表現兩種不同抗體重鏈序列達成，其可導致各抗體重鏈之同二聚體的組裝以及同二聚體的組裝。促進異二聚體的優先組裝可藉由在各抗體重鏈恆定區之CH3域中併入不同突變達成，如US13/494870、US16/028850、US11/533709、US12/875015、US13/289934、US14/773418、US12/811207、US13/866756、US14/647480、US13/642253、及US14/830336中所示。例如，突變在CH3域中進行，其係基於人類IgG1，並在第一多肽及第二多肽內併入不同的胺基酸取代對，允許此條兩鏈選擇性地與彼此異二聚化。以下說明之胺基酸取代位置皆根據EU索引編號，如同在Kabat（Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，其全文以引用方式併入本文中）。抗體技術領域中具有通常知識者將理解，此等常規係由免疫球蛋白序列之特定區中之非依序編號所組成，使得能夠進行對免疫球蛋白家族中之保守位置的標準化參考。因此，如藉由EU索引或藉由Kabat編號方案定義之任何給定免疫球蛋白之位置將不一定對應於其依序序列。
具備根據Kabat或EU索引編號之殘基編號的知識，具有通常知識者可應用所屬技術領域之教示識別本揭露內之胺基酸序列修飾（根據常用的編號常規）。應理解的是，SEQ ID NO提供給定多肽內之胺基酸之依序編號，因此可能不符合如由Kabat或EU索引提供之對應胺基酸編號。
在一個情境下，第一多肽中之胺基酸取代將原始胺基酸用大型胺基酸置換，大型胺基酸係選自精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、或色胺酸(W)，且第二多肽中之至少一個胺基酸取代將（多個）原始胺基酸用（多個）小型胺基酸置換，小型胺基酸係選自丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、或纈胺酸(V)，使得大型胺基酸取代（突起）符合小型胺基酸取代之表面（腔）。例如，一個多肽可併入T366W取代，且另一者可併入三個取代，包括T366S、L368A、及Y407V。
本申請案所述之抗體重鏈可變域可以可選地偶合至與抗體恆定區至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列，抗體恆定區諸如IgG恆定區（包括鉸鏈、CH2域、及CH3域，具有或不具有CH1域）。在一些實施例中，恆定區之胺基酸序列係與人類抗體恆定區至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一，人類抗體恆定區諸如人類IgG1恆定區、IgG2恆定區、IgG3恆定區、或IgG4恆定區。在一個實施例中，足以結合CD16之抗體Fc域或其部分包含與以下闡述之野生型人類IgG1 Fc序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列； DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:118)。
在一些實施例中，抗體Fc域或其部分包含與SEQ ID NO:118之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體Fc域或其部分包含與SEQ ID NO:118之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體Fc域或其部分包含與SEQ ID NO:118之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體Fc域或其部分包含與SEQ ID NO:118之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體Fc域或其部分包含與SEQ ID NO:118之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，抗體Fc域或其部分包含SEQ ID NO:118之胺基酸序列。
在一些其他實施例中，恆定區之胺基酸序列係與來自另一種哺乳動物（諸如兔、犬、貓、小鼠、或馬）之抗體恆定區至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一。
在一些實施例中，本文所述之多特異性結合蛋白包含足以結合至CD16（例如人類CD16）之Fc域或其部分。在一些實施例中，連接至scFv或Fab片段之抗體恆定域能夠結合至CD16（例如人類CD16）。在一些實施例中，蛋白質併入抗體Fc域之部分（例如足以結合CD16（例如人類CD16）之抗體Fc域之部分），其中抗體Fc域包含鉸鏈及CH2域（例如人類IgG1抗體之鉸鏈及CH2域）、及/或與人類IgG抗體之胺基酸序列234至332至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在一些實施例中，CD16係人類CD16。在一些實施例中，人類CD16係人類CD16a (FcγRIIIa)。
相較於人類IgG1恆定區，一或多個突變可併入恆定區中，例如在Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411、及/或K439處。例示性取代包括例如Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、T350V、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、T394W、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、F405L、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、K409R、T411D、T411E、K439D、及K439E。
在某些實施例中，可併入人類IgG1恆定區之CH1中的突變可在胺基酸V125、F126、P127、T135、T139、A140、F170、P171、及/或V173處。在某些實施例中，可併入人類IgG1恆定區之Cκ中的突變可在胺基酸E123、F116、S176、V163、S174、及/或T164處。
替代地，胺基酸取代可選自以下 表 3所示之取代組。
表3      
   第一多肽 第二多肽
第1組 S364E/F405A Y349K/T394F
第2組 S364H/D401K Y349T/T411E
第3組 S364H/T394F Y349T/F405A
第4組 S364E/T394F Y349K/F405A
第5組 S364E/T411E Y349K/D401K
第6組 S364D/T394F Y349K/F405A
第7組 S364H/F405A Y349T/T394F
第8組 S364K/E357Q L368D/K370S
第9組 L368D/K370S S364K
第10組 L368E/K370S S364K
第11組 K360E/Q362E D401K
第12組 L368D/K370S S364K/E357L
第13組 K370S S364K/E357Q
第14組 F405L K409R
第15組 K409R F405L
替代地，胺基酸取代可選自以下 表 4所示之取代組。
表4      
   第一多肽 第二多肽
第1組 K409W D399V/F405T
第2組 Y349S E357W
第3組 K360E Q347R
第4組 K360E/K409W Q347R/D399V/F405T
第5組 Q347E/K360E/K409W Q347R/D399V/F405T
第6組 Y349S/K409W E357W/D399V/F405T
替代地，胺基酸取代可選自以下 表 5所示之取代組。
表5      
   第一多肽 第二多肽
第1組 T366K/L351K L351D/L368E
第2組 T366K/L351K L351D/Y349E
第3組 T366K/L351K L351D/Y349D
第4組 T366K/L351K L351D/Y349E/L368E
第5組 T366K/L351K L351D/Y349D/L368E
第6組 E356K/D399K K392D/K409D
替代地，各多肽鏈中之至少一個胺基酸取代可選自 表 6。
表6   
第一多肽 第二多肽
L351Y、D399R、D399K、S400K、S400R、Y407A、Y407I、Y407V T366V、T366I、T366L、T366M、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、K409F、K409W、T411D、及T411E
替代地，至少一個胺基酸取代可選自以下 表 7中之取代組，其中第一多肽欄中所指示之（多個）位置被任何已知的帶負電胺基酸置換，且第二多肽欄中所指示之（多個）位置被任何已知的帶正電胺基酸置換。
表7   
第一多肽 第二多肽
K392、K370、K409、或K439 D399、E356、或E357
替代地，至少一個胺基酸取代可選自以下 表 8中之組，其中第一多肽欄中所指示之（多個）位置被任何已知的帶正電胺基酸置換，且第二多肽欄中所指示之（多個）位置被任何已知的帶負電胺基酸置換。
表8   
第一多肽 第二多肽
D399、E356、或E357 K409、K439、K370、或K392
替代地，胺基酸取代可選自以下 表 9中之組。
表9   
第一多肽 第二多肽
T350V、L351Y、F405A、及Y407V T350V、T366L、K392L、及T394W
替代地或此外，可藉由在第一或第二多肽鏈上引入S354C，並在相對多肽鏈上引入Y349C（其在兩個多肽之界面內形成人工雙硫鍵），增加異多聚蛋白之結構穩定性。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列在位置T366處有所不同，且其中抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列在選自由T366、L368、及Y407所組成之群組的一或多個位置處有所不同。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列在選自由T366、L368、及Y407所組成之群組的一或多個位置處有所不同，且其中抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列在位置T366處有所不同。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列在選自由E357、K360、Q362、S364、L368、K370、T394、D401、F405、及T411所組成之群組的一或多個位置處有所不同，且其中抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列在選自由Y349、E357、S364、L368、K370、T394、D401、F405、及T411所組成之群組的一或多個位置處有所不同。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列在選自由Y349、E357、S364、L368、K370、T394、D401、F405、及T411所組成之群組的一或多個位置處有所不同，且其中抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列在選自由E357、K360、Q362、S364、L368、K370、T394、D401、F405、及T411所組成之群組的一或多個位置處有所不同。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列在選自由L351、D399、S400、及Y407所組成之群組的一或多個位置處有所不同，且其中抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列在選自由T366、N390、K392、K409、及T411所組成之群組的一或多個位置處有所不同。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列在選自由T366、N390、K392、K409、及T411所組成之群組的一或多個位置處有所不同，且其中抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列在選自由L351、D399、S400、及Y407所組成之群組的一或多個位置處有所不同。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列在選自由Q347、Y349、K360、及K409所組成之群組的一或多個位置處有所不同，且其中抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列在選自由Q347、E357、D399、及F405所組成之群組的一或多個位置處有所不同。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列在選自由Q347、E357、D399、及F405所組成之群組的一或多個位置處有所不同，且其中抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列在選自由Y349、K360、Q347、及K409所組成之群組的一或多個位置處有所不同。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列在選自由K370、K392、K409、及K439所組成之群組的一或多個位置處有所不同，且其中抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列在選自由D356、E357、及D399所組成之群組的一或多個位置處有所不同。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列在選自由D356、E357、及D399所組成之群組的一或多個位置處有所不同，且其中抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列在選自由K370、K392、K409、及K439所組成的群組之一或多個位置處有所不同。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列在選自由L351、E356、T366、及D399所組成之群組的一或多個位置處有所不同，且其中抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列在選自由Y349、L351、L368、K392、及K409所組成之群組的一或多個位置處有所不同。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列在選自由Y349、L351、L368、K392、及K409所組成之群組的一或多個位置處有所不同，且其中抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列在選自由L351、E356、T366、及D399所組成之群組的一或多個位置處有所不同。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列因S354C取代而有所不同，且其中抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列因Y349C取代而有所不同。在一些實施例中，包含S354C取代之一個多肽鏈係融合至本文所述之抗NKG2D抗體之VH。在一些實施例中，包含Y349C取代之一個多肽鏈係融合至本文所述之抗5T4抗體之VH。因此，在一些實施例中，抗NKG2D抗體之VH係融合至包含S354C取代之Fc域多肽之N端，且抗5T4抗體之VH係融合至包含Y349C取代之Fc域多肽之N端。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列因Y349C取代而有所不同，且其中抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列因S354C取代而有所不同。在一些實施例中，包含Y349C取代之一個多肽鏈係融合至本文所述之抗NKG2D抗體之VH。在一些實施例中，包含S354C取代之一個多肽鏈係融合至本文所述之抗5T4抗體之VH。因此，在一些實施例中，抗NKG2D抗體之VH係融合至包含Y349C取代之Fc域多肽之N端，且抗5T4抗體之VH係融合至包含S354C取代之Fc域多肽之N端。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列因K360E及K409W取代而有所不同，且其中抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列因Q347R、D399V、及F405T取代而有所不同。在一些實施例中，包含K360E及K409W取代之一個多肽鏈係融合至本文所述之抗NKG2D抗體之VH。在一些實施例中，包含Q347R、D399V、及F405T取代之一個多肽鏈係融合至本文所述之抗5T4抗體之VH。因此，在一些實施例中，抗NKG2D抗體之VH係融合至包含K360E及K409W取代之Fc域多肽之N端，且抗5T4抗體之VH係融合至包含Q347R、D399V、及F405T取代之Fc域多肽之N端。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列因Q347R、D399V、及F405T取代而有所不同，且其中抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列因K360E及K409W取代而有所不同。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列因T366W取代而有所不同，且其中抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列因T366S、T368A、及Y407V取代而有所不同。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列因T366S、T368A、及Y407V取代而有所不同，且其中抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列因T366W取代而有所不同。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列因T350V、L351Y、F405A、及Y407V取代而有所不同，且其中抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列因T350V、T366L、K392L、及T394W取代而有所不同。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列因T350V、T366L、K392L、及T394W取代而有所不同，且其中抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列因T350V、L351Y、F405A、及Y407V取代而有所不同。
在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列因F405L取代而有所不同，且其中抗體恆定區之另一多肽鏈之胺基酸序列與IgG1（例如人類IgG1）恆定區之胺基酸序列因K409R取代而有所不同。 例示性多特異性結合蛋白
以下列出TriNKET ®（三特異性NK細胞銜接器療法）之實例，其包含結合5T4之抗原結合位點及結合NKG2D之抗原結合位點，該等抗原結合位點各自連接至抗體恆定區，其中抗體恆定區包括使兩個Fc鏈異二聚化的突變。
設想例示性5T4靶向TriNKET ®呈F3'、F4、及2-Fab形式。如上所述，在F3'形式中，結合5T4之抗原結合位點係scFv，且結合NKG2D之抗原結合位點係Fab。在F4形式中，結合5T4之抗原結合位點係Fab片段，且結合NKG2D之抗原結合位點係scFv。在各TriNKET ®中，scFv可在VH及VL區中包含Cys取代，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。在2-Fab形式中，結合5T4之抗原結合位點及結合NKG2D之抗原結合位點兩者皆係Fab。
scFv之VH及VL可經由連接子（例如肽連接子）連接。在某些實施例中，肽連接子係可撓性連接子。關於連接子之胺基酸組成，肽係以賦予可撓性之性質進行選擇，不干擾本申請案所述之蛋白質之其他結構域的結構及功能，並抵抗蛋白酶的切割。例如，甘胺酸及絲胺酸殘基通常提供蛋白酶抗性。在某些實施例中，VL係經由(GlyGlyGlyGlySer) 4((G 4S) 4)連接子(SEQ ID NO:119)連接至VH之N端或C端。
連接子（例如可撓性連接子）之長度可係「短」的（例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12個胺基酸殘基）或「長」的（例如至少13個胺基酸殘基）。在某些實施例中，連接子係10至50、10至40、10至30、10至25、10至20、15至50、15至40、15至30、15至25、15至20、20至50、20至40、20至30、或20至25個胺基酸殘基長。
在某些實施例中，連接子包含下列或由下列所組成：(GS) n(SEQ ID NO:120)、(GGS) n(SEQ ID NO:121)、(GGGS) n(SEQ ID NO:122)、(GGSG) n(SEQ ID NO:123)、(GGSGG) n(SEQ ID NO:124)、及(GGGGS) n(SEQ ID NO:125)序列，其中n係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20。在某些實施例中，連接子包含下列或由下列所組成：選自如表10中所列之SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:119、126至135、及SEQ ID NO: 126至134之胺基酸序列。
表10   
SEQ ID 胺基酸序列
SEQ ID NO:126 GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS
SEQ ID NO:127 GGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGS
SEQ ID NO:128 GGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGS
SEQ ID NO:129 GGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSG
SEQ ID NO:130 GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG
SEQ ID NO:131 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:119 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:132 GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:133 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:134 GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG
SEQ ID NO:135 SGSGGGGS
在F3'-TriNKET ®中，結合5T4之scFv係經由Ala-Ser或Gly-Ser連接子連接至Fc之N端。肘部(elbow)鉸鏈區序列處包括Ala-Ser或Gly-Ser連接子，以在可撓性與最佳幾何形狀之間取得平衡。在某些實施例中，可將額外胺基酸序列Thr-Lys-Gly添加至鉸鏈處之Ala-Ser或Gly-Ser序列之N端或C端。在F4 TriNKET ®中，NKG2D結合scFv係經由短連接子連接至Fc之C端，短連接子包含胺基酸序列SGSGGGGS (SEQ ID NO:135)。
如本文中用以描述此等例示性TriNKET ®，Fc包括抗體鉸鏈、CH2、及CH3。在各例示性TriNKET ®中，連接至scFv之Fc域包含Q347R、D399V、及F405T之突變，且連接至Fab之Fc域包含匹配突變K360E及K409W以用於形成異二聚體。連接至scFv之Fc域在CH3域中進一步包括S354C取代，其與在連接至Fab之Fc上之Y349C取代形成雙硫鍵。此等取代在此小節所述之序列中係以粗體表示。在某些實施例中，針對下述例示性TriNKET ®之各者，連接至scFv之Fc域包含K360E及K409W之突變，且連接至Fab之Fc域包含匹配突變Q347R、D399V、及F405T以用於形成異二聚體。在此等實施例中，連接至scFv之Fc域在CH3域中進一步包括Y349C取代，其與在連接至Fab之Fc上之S354C取代形成雙硫鍵。
例如，本揭露所述之TriNKET ®係AB1310/AB1783-TriNKET ®。AB1310/AB1783-TriNKET ®包括(a) 5T4結合scFv序列，其包含表2中所述之AB1002之VH及VL序列，其在VH位於VL之C端的定向上連接至Fc域；及(b)衍生自A49MI之NKG2D結合Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分、及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域係連接至Fc域。AB1310/AB1783-TriNKET ®包括三個多肽：scFv-AB1002-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:198)、A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)、及A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)。 scFv-AB1002-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:198)（「鏈S」） DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIKFASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSWEIPWTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASRFTFSDFGMHWVRQAPGKCLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASSQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSSASDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)（「鏈H」） EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPIGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)（「鏈L」） DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
scFv-AB1002-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:198)表示下列之完整序列：5T4結合scFv，其經由包含Ala-Ser之鉸鏈連接至Fc域。連接至scFv之Fc域包括：Q347R、D399V、及F405T取代，其用於異二聚化；及S354C取代，其用於與A49MI-VH-CH1-Fc（如下所述）中之Y349C取代形成雙硫鍵。scFv具有SEQ ID NO:148之胺基酸序列，其包括AB1002之重鏈可變域，其經由(G 4S) 4連接子(SEQ ID NO:119)連接至AB1002之輕鏈可變域之C端。scFv在VH及VL區中於G44及G100處包含Cys取代，因而產生G44C及G100C取代，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:198之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:198之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:198之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:198之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:198之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:198之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:198之胺基酸序列。
A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)表示Fab片段之重鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之重鏈可變域(SEQ ID NO:95)及CH1域（連接至Fc域）。A49MI-VH-CH1-Fc中之Fc域在CH3域中包括Y349C取代，其與scFv-AB1002-VL-VH-Fc中之Fc上之S354C取代形成雙硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代，其用於與scFv-AB1002-VL-VH-Fc中之Fc異二聚化。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:199之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:199之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:199之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:199之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:199之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:199之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:199之胺基酸序列。
A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)表示Fab片段之輕鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之輕鏈可變域(SEQ ID NO:85)及輕鏈恆定域。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:200之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:200之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:200之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:200之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:200之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:200之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:200之胺基酸序列。
在某些實施例中，連接至scFv之Fc域包括：K360E及K409W取代，其用於異二聚化；及Y349C取代，其用於與A49MI-VH-CH1-Fc（其包括Q347R、D399V、及F405T）中之S354C取代形成雙硫鍵。
在上述TriNKET ®之某些實施例中，TriNKET ®內之鏈之部分形成結合特定目標蛋白質之結合位點。因此，在一些實施例中，結合至NKG2D之抗原結合位點（例如人類NKG2D結合位點）係由SEQ ID NO:199中之VH (SEQ ID NO:95)及SEQ ID NO:200中之VL (SEQ ID NO:85)形成。在一些實施例中，結合至5T4之抗原結合位點（例如人類5T4結合位點）係由SEQ ID NO:198中之VH (SEQ ID NO:146)及SEQ ID NO:198中之VL (SEQ ID NO:147)形成。在一些實施例中，結合CD16之結合位點（例如人類CD16a結合位點）係由SEQ ID NO:198中之Fc結合域多肽及SEQ ID NO:199中之Fc結合域多肽形成。
在上述TriNKET ®之某些實施例中，可發現額外能力。例如，在一些實施例中，雙硫鍵係在SEQ ID NO:146中之C44與SEQ ID NO:147中之C100之間形成，其係依Kabat編號方案編號。在一些實施例中，雙硫鍵係在SEQ ID NO:199中之C349與SEQ ID NO:198中之C354之間形成，其係根據EU編號系統編號。在一些實施例中，異二聚體係在SEQ ID NO:198中之Fc域與SEQ ID NO:199中之Fc域之間形成。在一些實施例中，TriNKET ®能夠結合至NK細胞表面上之NKG2D（例如人類NKG2D）及CD16（例如人類CD16a）及結合至腫瘤細胞表面上之5T4（例如人類5T4）。
本揭露所述之另一TriNKET ®係AB1310/AB1783-VH-VL-TriNKET ®。AB1310/AB1783 VH-VL-TriNKET ®包括(a) 5T4結合scFv序列，其包含表2中所述之AB1002之VH及VL序列，其在VH位於VL之N端的定向上連接至Fc域；及(b)衍生自A49MI之NKG2D結合Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分、及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域係連接至Fc域。AB1310/AB1783- VH-VL - TriNKET ®'包括三個多肽：scFv-AB1002-VH-VL-Fc (SEQ ID NO:201)、A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)、及A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)。 scFv-AB1002-VH-VL-Fc (SEQ ID NO:201)（「鏈S」） EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASRFTFSDFGMHWVRQAPGKCLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASSQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIKFASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSWEIPWTFGCGTKVEIK AS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
scFv- AB1002-VH-VL-Fc (SEQ ID NO:201)表示下列之完整序列：5T4結合scFv，其經由包含Ala-Ser之鉸鏈連接至Fc域。連接至scFv之Fc域包括：Q347R、D399V、及F405T取代，其用於異二聚化；及S354C取代，其用於與A49MI-VH-CH1-Fc（如下所述）中之Y349C取代形成雙硫鍵。scFv具有SEQ ID NO:149之胺基酸序列，其包括AB1002之重鏈可變域，其經由(G 4S) 4連接子(SEQ ID NO:119)連接至AB1002之輕鏈可變域之N端。scFv在VH及VL區中於G44及G100處包含Cys取代，因而產生G44C及G100C取代，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:201之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:201之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:201之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:201之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:201之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:201之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:201之胺基酸序列。
A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)表示Fab片段之重鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之重鏈可變域(SEQ ID NO:95)及CH1域（連接至Fc域）。A49MI-VH-CH1-Fc中之Fc域在CH3域中包括Y349C取代，其與scFv- AB1002-VH-VL-Fc中之Fc上之S354C取代形成雙硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代，其用於與scFv- AB1002-VL-VH-Fc中之Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)表示Fab片段之輕鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之輕鏈可變域(SEQ ID NO:85)及輕鏈恆定域。
本揭露所述之另一TriNKET ®係AB2092-VL-VH-TriNKET ®。AB2092-TriNKET ®包括(a) 5T4結合scFv序列，其包含表2中所述之05H04之VH及VL序列，其在VH位於VL之C端的定向上連接至Fc域；及(b)衍生自A49MI之NKG2D結合Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分、及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域係連接至Fc域。AB2092- VL-VH -TriNKET ®包括三個多肽：scFv-05H04-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:220)、A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)、及A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)。 scFv-05H04-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:220)（「鏈S」） ENVLTQSPATLSLSPGERATLSCSAKSSVSYIHWYQQKPGQAPRLLIYDTSYLGSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSYPYTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTDYYMDWVRQAPGQCLEWIGYIFPNDASTTYNEKFKGKATLTADKSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRDADYWGQGTTVTVSS GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
scFv-05H04-VL-VH -Fc (SEQ ID NO:220)表示下列之完整序列：5T4結合scFv，其經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接至Fc域。連接至scFv之Fc域包括：Q347R、D399V、及F405T取代，其用於異二聚化；及S354C取代，其用於與A49MI-VH-CH1-Fc（如下所述）中之Y349C取代形成雙硫鍵。scFv具有SEQ ID NO:221之胺基酸序列，其包括05H04之重鏈可變域，其經由(G 4S) 4連接子(SEQ ID NO:119)連接至05H04之輕鏈可變域之C端。scFv在VH及VL區中於G44及G100處包含Cys取代，因而產生G44C及G100C取代，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:220之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:220之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:220之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:220之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:200之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:220之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:220之胺基酸序列。
A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)表示Fab片段之重鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之重鏈可變域(SEQ ID NO:95)及CH1域（連接至Fc域）。A49MI-VH-CH1-Fc中之Fc域在CH3域中包括Y349C取代，其與scFv-05H04-VL-VH -Fc中之Fc上之S354C取代形成雙硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代，其用於與scFv-05H04-VL-VH -Fc中之Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)表示Fab片段之輕鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之輕鏈可變域(SEQ ID NO:85)及輕鏈恆定域。
本揭露所述之另一TriNKET ®係AB2093-VH-VL-TriNKET ®。AB2093-TriNKET ®包括(a) 5T4結合scFv序列，其包含表2中所述之05H04之VH及VL序列，其在VH位於VL之N端的定向上連接至Fc域；及(b)衍生自A49MI之NKG2D結合Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分、及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域係連接至Fc域。AB2093-VH-VL-TriNKET ®包括三個多肽：scFv-05H04-VH-VL-Fc (SEQ ID NO:222)、A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)、及A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)。 scFv-05H04-VH-VL-Fc (SEQ ID NO:222)（「鏈S」） QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTDYYMDWVRQAPGQCLEWIGYIFPNDASTTYNEKFKGKATLTADKSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRDADYWGQGTTVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSENVLTQSPATLSLSPGERATLSCSAKSSVSYIHWYQQKPGQAPRLLIYDTSYLGSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSYPYTFGCGTKVEIK GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
scFv-05H04-VH-VL -Fc (SEQ ID NO:222)表示下列之完整序列：5T4結合scFv，其經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接至Fc域。連接至scFv之Fc域包括：Q347R、D399V、及F405T取代，其用於異二聚化；及S354C取代，其用於與A49MI-VH-CH1-Fc（如下所述）中之Y349C取代形成雙硫鍵。scFv具有SEQ ID NO:159之胺基酸序列，其包括05H04之重鏈可變域，其經由(G 4S) 4連接子(SEQ ID NO:119)連接至05H04之輕鏈可變域之N端。scFv在VH及VL區中於G44及G100處包含Cys取代，因而產生G44C及G100C取代，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:222之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:222之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:222之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:222之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:222之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:222之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:222之胺基酸序列。
A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)表示Fab片段之重鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之重鏈可變域(SEQ ID NO:95)及CH1域（連接至Fc域）。A49MI-VH-CH1-Fc中之Fc域在CH3域中包括Y349C取代，其與scFv-05H04-VH-VL -Fc中之Fc上之S354C取代形成雙硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代，其用於與scFv-05H04-VH-VL -Fc中之Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)表示Fab片段之輕鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之輕鏈可變域(SEQ ID NO:85)及輕鏈恆定域。
本揭露所述之另一TriNKET ®係AB2143-VH-VL-Q1E-TriNKET ®。AB2143-Q1E-TriNKET ®包括(a) 5T4結合scFv序列，其包含表2中所述之05H04-Q1E之VH及VL序列，其在VH位於VL之N端的定向上連接至Fc域；及(b)衍生自A49MI之NKG2D結合Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分、及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域係連接至Fc域。AB2143-VH-VL-TriNKET ®包括三個多肽：scFv-05H04- VH-VL-Q1E-Fc (SEQ ID NO:223)、A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)、及A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)。 scFv-05H04-VH-VL-Q1E-Fc (SEQ ID NO:223)（「鏈S」） EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTDYYMDWVRQAPGQCLEWIGYIFPNDASTTYNEKFKGKATLTADKSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRDADYWGQGTTVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSENVLTQSPATLSLSPGERATLSCSAKSSVSYIHWYQQKPGQAPRLLIYDTSYLGSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSYPYTFGCGTKVEIK GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
scFv-05H04-VH-VL-Q1E -Fc (SEQ ID NO:223)表示下列之完整序列：5T4結合scFv，其經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接至Fc域。連接至scFv之Fc域包括：Q347R、D399V、及F405T取代，其用於異二聚化；及S354C取代，其用於與A49MI-VH-CH1-Fc（如下所述）中之Y349C取代形成雙硫鍵。scFv具有SEQ ID NO:160之胺基酸序列，其包括05H04-Q1E之重鏈可變域，其經由(G 4S) 4連接子(SEQ ID NO:119)連接至05H04之輕鏈可變域之N端。scFv在VH及VL區中於G44及G100處包含Cys取代，因而產生G44C及G100C取代，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:223之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:223之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:223之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:223之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:223之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:223之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:223之胺基酸序列。
A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)表示Fab片段之重鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之重鏈可變域(SEQ ID NO:95)及CH1域（連接至Fc域）。A49MI-VH-CH1-Fc中之Fc域在CH3域中包括Y349C取代，其與scFv-05H04-Q1E-VH-VL -Fc中之Fc上之S354C取代形成雙硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代，其用於與scFv-05H04-VL-VH -Fc中之Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)表示Fab片段之輕鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之輕鏈可變域(SEQ ID NO:85)及輕鏈恆定域。
本揭露所述之另一TriNKET ®係AB1878-VL-VH TriNKET ®。AB1878-TriNKET ®包括(a) 5T4結合scFv序列，其包含表2中所述之10F10 21*05之VH及VL序列，其在VH位於VL之C端的定向上連接至Fc域；及(b)衍生自A49MI之NKG2D結合Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分、及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域係連接至Fc域。AB1878-TriNKET ®包括三個多肽：scFv-10F10 21*05 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:224)、A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)、及A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)。 scFv-10F10 21*05 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:224)（「鏈S」） DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIKFASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSWEIPWTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASRFTFSDFGMHWVRQAPGKCLEWVSYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASSQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
scFv-10F10 21*05 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:224)表示下列之完整序列：5T4結合scFv，其經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接至Fc域。連接至scFv之Fc域包括：Q347R、D399V、及F405T取代，其用於異二聚化；及S354C取代，其用於與A49MI-VH-CH1-Fc（如下所述）中之Y349C取代形成雙硫鍵。scFv具有SEQ ID NO:167之胺基酸序列，其包括10F10 21*05之重鏈可變域，其經由(G 4S) 4連接子(SEQ ID NO:119)連接至10F10 21*05之輕鏈可變域之C端。scFv在VH及VL區中於G44及G100處包含Cys取代，因而產生G44C及G100C取代，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:224之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:224之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:224之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:224之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:224之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:224之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:224之胺基酸序列。
A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)表示Fab片段之重鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之重鏈可變域(SEQ ID NO:95)及CH1域（連接至Fc域）。A49MI-VH-CH1-Fc中之Fc域在CH3域中包括Y349C取代，其與scFv-10F10 21*05 -VL-VH-Fc中之Fc上之S354C取代形成雙硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代，其用於與scFv-10F10 21*05 -VL-VH-Fc中之Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)表示Fab片段之輕鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之輕鏈可變域(SEQ ID NO:85)及輕鏈恆定域。
本揭露所述之另一TriNKET ®係AB1881-VL-VH TriNKET ®。AB1881-TriNKET ®包括(a) 5T4結合scFv序列，其包含表2中所述之10F10 23*03之VH及VL序列，其在VH位於VL之C端的定向上連接至Fc域；及(b)衍生自A49MI之NKG2D結合Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分、及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域係連接至Fc域。AB1881-TriNKET ®包括三個多肽：scFv-10F10 23*03 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:225)、A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)、及A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)。 scFv-10F10 21*03 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:225)（「鏈S」） DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIKFASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSWEIPWTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASRFTFSDFGMHWVRQAPGKCLEWIAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASSQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
scFv-10F10 23*03 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:225)表示下列之完整序列：5T4結合scFv，其經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接至Fc域。連接至scFv之Fc域包括：Q347R、D399V、及F405T取代，其用於異二聚化；及S354C取代，其用於與A49MI-VH-CH1-Fc（如下所述）中之Y349C取代形成雙硫鍵。scFv具有SEQ ID NO:169之胺基酸序列，其包括10F10 23*03之重鏈可變域，其經由(G 4S) 4連接子(SEQ ID NO:119)連接至10F10 23*03之輕鏈可變域之C端。scFv在VH及VL區中於G44及G100處包含Cys取代，因而產生G44C及G100C取代，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:225之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:225之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:225之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:225之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:225之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:225之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:225之胺基酸序列。
A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)表示Fab片段之重鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之重鏈可變域(SEQ ID NO:95)及CH1域（連接至Fc域）。A49MI-VH-CH1-Fc中之Fc域在CH3域中包括Y349C取代，其與scFv-10F10 23*03 -VL-VH-Fc中之Fc上之S354C取代形成雙硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代，其用於與scFv-10F10 23*03 -VL-VH-Fc中之Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)表示Fab片段之輕鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之輕鏈可變域(SEQ ID NO:85)及輕鏈恆定域。
本揭露所述之另一TriNKET ®係AB1882-VL-VH TriNKET ®。AB1882-TriNKET ®包括(a) 5T4結合scFv序列，其包含表2中所述之10F10 48*01之VH及VL序列，其在VH位於VL之C端的定向上連接至Fc域；及(b)衍生自A49MI之NKG2D結合Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分、及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域係連接至Fc域。AB1882-TriNKET ®包括三個多肽：scFv-10F10 48*01-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:226)、A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)、及A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)。 scFv-10F10 48*01 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:226)（「鏈S」） DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIKFASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSWEIPWTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRFTFSDFGMHWVRQAPGKCLEWVSYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASSQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
scFv-10F10 48*01 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:226)表示下列之完整序列：5T4結合scFv，其經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接至Fc域。連接至scFv之Fc域包括：Q347R、D399V、及F405T取代，其用於異二聚化；及S354C取代，其用於與A49MI-VH-CH1-Fc（如下所述）中之Y349C取代形成雙硫鍵。scFv具有SEQ ID NO:171之胺基酸序列，其包括10F10 48*01之重鏈可變域，其經由(G 4S) 4連接子(SEQ ID NO:119)連接至10F10 48*01之輕鏈可變域之C端。scFv在VH及VL區中於G44及G100處包含Cys取代，因而產生G44C及G100C取代，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:226之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:226之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:226之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:226之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:226之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:226之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:226之胺基酸序列。
A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)表示Fab片段之重鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之重鏈可變域(SEQ ID NO:95)及CH1域（連接至Fc域）。A49MI-VH-CH1-Fc中之Fc域在CH3域中包括Y349C取代，其與scFv-10F10 48*01-VL-VH-Fc中之Fc上之S354C取代形成雙硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代，其用於與scFv-10F10 48*01 -VL-VH-Fc中之Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)表示Fab片段之輕鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之輕鏈可變域(SEQ ID NO:85)及輕鏈恆定域。
本揭露所述之另一TriNKET ®係AB1884-VL-VH TriNKET ®。AB1884-TriNKET ®包括(a) 5T4結合scFv序列，其包含表2中所述之10F10 48*01 BM2 scFv之VH及VL序列，其在VH位於VL之C端的定向上連接至Fc域；及(b)衍生自A49MI之NKG2D結合Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分、及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域係連接至Fc域。AB1884-TriNKET ®包括三個多肽：scFv-10F10 48*01 BM2 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:227)、A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)、及A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)。 scFv-10F10 48*01 BM2 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:227)（「鏈S」） DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIKFASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSWEIPWTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRFTFSDFGMHWVRQAPGKCLEWIAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASSQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
scFv-10F10 48*01 BM2 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:227)表示下列之完整序列：5T4結合scFv，其經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接至Fc域。連接至scFv之Fc域包括：Q347R、D399V、及F405T取代，其用於異二聚化；及S354C取代，其用於與A49MI-VH-CH1-Fc（如下所述）中之Y349C取代形成雙硫鍵。scFv具有SEQ ID NO:229之胺基酸序列，其包括10F10 48*01 BM2之重鏈可變域，其經由(G 4S) 4連接子(SEQ ID NO:119)連接至10F10 48*01 BM2之輕鏈可變域之C端。scFv在VH及VL區中於G44及G100處包含Cys取代，因而產生G44C及G100C取代，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:227之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:227之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:227之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:227之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:227之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:227之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:227之胺基酸序列。
A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)表示Fab片段之重鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之重鏈可變域(SEQ ID NO:95)及CH1域（連接至Fc域）。A49MI-VH-CH1-Fc中之Fc域在CH3域中包括Y349C取代，其與scFv-10F10 48*01 BM2-VL-VH-Fc中之Fc上之S354C取代形成雙硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代，其用於與scFv-10F10 48*01 BM3 -VL-VH-Fc中之Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)表示Fab片段之輕鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之輕鏈可變域(SEQ ID NO:85)及輕鏈恆定域。
本揭露所述之另一TriNKET ®係AB1885-VL-VH TriNKET ®。AB1885-TriNKET ®包括(a) 5T4結合scFv序列，其包含表2中所述之10F10 11*01 scFv之VH及VL序列，其在VH位於VL之C端的定向上連接至Fc域；及(b)衍生自A49MI之NKG2D結合Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分、及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域係連接至Fc域。AB1885-TriNKET ®包括三個多肽：scFv-10F10 11*01 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:230)、A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)、及A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)。 scFv-10F10 11*01 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:230)（「鏈S」） DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIKFASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSWEIPWTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASRFTFSDFGMHWVRQAPGKCLEWIAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASSQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
scFv-10F10 11*01 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:230)表示下列之完整序列：5T4結合scFv，其經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接至Fc域。連接至scFv之Fc域包括：Q347R、D399V、及F405T取代，其用於異二聚化；及S354C取代，其用於與A49MI-VH-CH1-Fc（如下所述）中之Y349C取代形成雙硫鍵。scFv具有SEQ ID NO:173之胺基酸序列，其包括10F10 11*01之重鏈可變域，其經由(G 4S) 4連接子(SEQ ID NO:119)連接至10F10 11*01之輕鏈可變域之C端。scFv在VH及VL區中於G44及G100處包含Cys取代，因而產生G44C及G100C取代，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:230之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:230之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:230之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:230之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:230之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:230之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:230之胺基酸序列。
A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)表示Fab片段之重鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之重鏈可變域(SEQ ID NO:95)及CH1域（連接至Fc域）。A49MI-VH-CH1-Fc中之Fc域在CH3域中包括Y349C取代，其與scFv-10F10 11*01 -VL-VH-Fc中之Fc上之S354C取代形成雙硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代，其用於與scFv-10F10 11*01-VL-VH-Fc中之Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)表示Fab片段之輕鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之輕鏈可變域(SEQ ID NO:85)及輕鏈恆定域。
本揭露所述之另一TriNKET ®係AB1886-VL-VH TriNKET ®。AB1886-TriNKET ®包括(a) 5T4結合scFv序列，其包含表2中所述之10F10-11*01 BM1 scFv之VH及VL序列，其在VH位於VL之C端的定向上連接至Fc域；及(b)衍生自A49MI之NKG2D結合Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分、及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域係連接至Fc域。AB1886-TriNKET ®包括三個多肽：scFv-10F10-11*01 BM1-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:231)、A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)、及A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)。 scFv-10F10 11*01 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:231)（「鏈S」） DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIKFASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSWEIPWTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASRFTFSDFGMHWIRQAPGKCLEWVSYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASSQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
scFv-10F10 11*01 BM1-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:231)表示下列之完整序列：5T4結合scFv，其經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接至Fc域。連接至scFv之Fc域包括：Q347R、D399V、及F405T取代，其用於異二聚化；及S354C取代，其用於與A49MI-VH-CH1-Fc（如下所述）中之Y349C取代形成雙硫鍵。scFv具有SEQ ID NO:233之胺基酸序列，其包括10F10 11*01 BM1之重鏈可變域，其經由(G 4S) 4連接子(SEQ ID NO:119)連接至10F10 11*01 BM1之輕鏈可變域之C端。scFv在VH及VL區中於G44及G100處包含Cys取代，因而產生G44C及G100C取代，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:231之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:231之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:231之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:231之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:231之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:231之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:231之胺基酸序列。
A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)表示Fab片段之重鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之重鏈可變域(SEQ ID NO:95)及CH1域（連接至Fc域）。A49MI-VH-CH1-Fc中之Fc域在CH3域中包括Y349C取代，其與scFv-10F10 11*01 BM1-VL-VH-Fc中之Fc上之S354C取代形成雙硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代，其用於與scFv-10F10 11*01 BM1-VL-VH-Fc中之Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)表示Fab片段之輕鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之輕鏈可變域(SEQ ID NO:85)及輕鏈恆定域。
本揭露所述之另一TriNKET ®係AB1887-VL-VH TriNKET ®。AB1887-TriNKET ®包括(a) 5T4結合scFv序列，其包含表2中所述之10F10-21*05- scFv之VH及VL序列，其在VH位於VL之C端的定向上連接至Fc域；及(b)衍生自A49MI之NKG2D結合Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分、及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域係連接至Fc域。AB1887-TriNKET ®包括三個多肽：scFv-10F10 21*05 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:234)、A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)、及A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)。 scFv-10F10 21*05 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:234)（「鏈S」） DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIKFASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSWEIPWTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASRFTFSDFGMHWVRQAPGKCLEWIAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASSQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
scFv-10F10-21*05 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:234)表示下列之完整序列：5T4結合scFv，其經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接至Fc域。連接至scFv之Fc域包括：Q347R、D399V、及F405T取代，其用於異二聚化；及S354C取代，其用於與A49MI-VH-CH1-Fc（如下所述）中之Y349C取代形成雙硫鍵。scFv具有SEQ ID NO:175之胺基酸序列，其包括10F10-21*05之重鏈可變域，其經由(G 4S) 4連接子(SEQ ID NO:119)連接至10F10-21*05之輕鏈可變域之C端。scFv在VH及VL區中於G44及G100處包含Cys取代，因而產生G44C及G100C取代，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:234之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:234之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:234之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:234之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:234之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:234之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:234之胺基酸序列。
A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)表示Fab片段之重鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之重鏈可變域(SEQ ID NO:95)及CH1域（連接至Fc域）。A49MI-VH-CH1-Fc中之Fc域在CH3域中包括Y349C取代，其與scFv-10F10-21*05 -VL-VH-Fc中之Fc上之S354C取代形成雙硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代，其用於與scFv-10F10-21*05 -VL-VH-Fc中之Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)表示Fab片段之輕鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之輕鏈可變域(SEQ ID NO:85)及輕鏈恆定域。
本揭露所述之另一TriNKET ®係AB1892-VL-VH TriNKET ®。AB1892-TriNKET ®包括(a) 5T4結合scFv序列，其包含表2中所述之10F10-23*03 BM1 scFv之VH及VL序列，其在VH位於VL之C端的定向上連接至Fc域；及(b)衍生自A49MI之NKG2D結合Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分、及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域係連接至Fc域。AB1892-TriNKET ®包括三個多肽：scFv-10F10-23*03 BM1 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:235)、A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)、及A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)。 scFv-10F10-23*03 BM1 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:235)（「鏈S」） DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIKFASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSWEIPWTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASRFTFSDFGMHWVRQAPGKCLEWVSYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASSQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
scFv-10F10-23*03 BM1 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:235)表示下列之完整序列：5T4結合scFv，其經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接至Fc域。連接至scFv之Fc域包括：Q347R、D399V、及F405T取代，其用於異二聚化；及S354C取代，其用於與A49MI-VH-CH1-Fc（如下所述）中之Y349C取代形成雙硫鍵。scFv具有SEQ ID NO:293之胺基酸序列，其包括10F10-23*03 BM1之重鏈可變域，其經由(G 4S) 4連接子(SEQ ID NO:119)連接至10F10-23*03 BM1之輕鏈可變域之C端。scFv在VH及VL區中於G44及G100處包含Cys取代，因而產生G44C及G100C取代，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:235之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:235之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:235之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:235之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:235之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:235之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:235之胺基酸序列。
A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)表示Fab片段之重鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之重鏈可變域(SEQ ID NO:95)及CH1域（連接至Fc域）。A49MI-VH-CH1-Fc中之Fc域在CH3域中包括Y349C取代，其與scFv-10F10-23*03 BM1 -VL-VH-Fc中之Fc上之S354C取代形成雙硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代，其用於與scFv-10F10-23*03 BM1 -VL-VH-Fc中之Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)表示Fab片段之輕鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之輕鏈可變域(SEQ ID NO:85)及輕鏈恆定域。
本揭露所述之另一TriNKET ®係AB1319-VL-VH TriNKET ®。AB1319-TriNKET ®包括(a) 5T4結合scFv序列，其包含表2中所述之11F09 21*05 scFv之VH及VL序列，其在VH位於VL之C端的定向上連接至Fc域；及(b)衍生自A49MI之NKG2D結合Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分、及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域係連接至Fc域。AB1319-TriNKET ®包括三個多肽：scFv-11F09 21*05-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:237)、A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)、及A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)。 scFv-11F09 21*05-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:237)（「鏈S」） DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIKFASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSWEIPWTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCEASGFTFSDYGMHWVRQAPGKCLEWLAYISSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGSSQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS AS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
scFv-11F09 21*05-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:237)表示下列之完整序列：5T4結合scFv，其經由包含Ala-Ser之鉸鏈連接至Fc域。連接至scFv之Fc域包括：Q347R、D399V、及F405T取代，其用於異二聚化；及S354C取代，其用於與A49MI-VH-CH1-Fc（如下所述）中之Y349C取代形成雙硫鍵。scFv具有SEQ ID NO:202之胺基酸序列，其包括11F09 21*05之重鏈可變域，其經由(G 4S) 4連接子(SEQ ID NO:119)連接至11F09 21*05之輕鏈可變域之C端。scFv在VH及VL區中於G44及G100處包含Cys取代，因而產生G44C及G100C取代，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:237之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:237之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:237之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:237之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:237之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:237之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:237之胺基酸序列。
A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)表示Fab片段之重鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之重鏈可變域(SEQ ID NO:95)及CH1域（連接至Fc域）。A49MI-VH-CH1-Fc中之Fc域在CH3域中包括Y349C取代，其與scFv-11F09 21*05-VL-VH-Fc中之Fc上之S354C取代形成雙硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代，其用於與scFv-11F09 21*05-VL-VH-Fc中之Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)表示Fab片段之輕鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之輕鏈可變域(SEQ ID NO:85)及輕鏈恆定域。
本揭露所述之另一TriNKET ®係AB1879-VL-VH TriNKET ®。AB1879-TriNKET ®包括(a) 5T4結合scFv序列，其包含表2中所述之11F09 48*01 scFv之VH及VL序列，其在VH位於VL之C端的定向上連接至Fc域；及(b)衍生自A49MI之NKG2D結合Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分、及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域係連接至Fc域。AB1879-TriNKET ®包括三個多肽：scFv-11F09 48*01 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:238)、A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)、及A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)。 scFv-11F09 48*01-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:238)（「鏈S」） DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIKFASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSWEIPWTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKCLEWVSYISSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGSSQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
scFv-11F09 48*01 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:238)表示下列之完整序列：5T4結合scFv，其經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接至Fc域。連接至scFv之Fc域包括：Q347R、D399V、及F405T取代，其用於異二聚化；及S354C取代，其用於與A49MI-VH-CH1-Fc（如下所述）中之Y349C取代形成雙硫鍵。scFv具有SEQ ID NO:179之胺基酸序列，其包括11F09 48*01之重鏈可變域，其經由(G 4S) 4連接子(SEQ ID NO:119)連接至11F09 48*01之輕鏈可變域之C端。scFv在VH及VL區中於G44及G100處包含Cys取代，因而產生G44C及G100C取代，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:238之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:238之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:238之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:238之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:238之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:238之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:238之胺基酸序列。
A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)表示Fab片段之重鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之重鏈可變域(SEQ ID NO:95)及CH1域（連接至Fc域）。A49MI-VH-CH1-Fc中之Fc域在CH3域中包括Y349C取代，其與scFv-11F09 48*01-VL-VH-Fc中之Fc上之S354C取代形成雙硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代，其用於與scFv-11F09 48*01-VL-VH-Fc中之Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)表示Fab片段之輕鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之輕鏈可變域(SEQ ID NO:85)及輕鏈恆定域。
本揭露所述之另一TriNKET ®係AB1880-VL-VH TriNKET ®。AB1880-TriNKET ®包括(a) 5T4結合scFv序列，其包含表2中所述之11F09 21*05 scFv之VH及VL序列，其在VH位於VL之C端的定向上連接至Fc域；及(b)衍生自A49MI之NKG2D結合Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分、及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域係連接至Fc域。AB1880-TriNKET ®包括三個多肽：scFv-11F09 21*05 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:239)、A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)、及A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)。 scFv-11F09 21*05 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:239)（「鏈S」） DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIKFASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSWEIPWTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCEASGFTFSDYGMHWVRQAPGKCLEWLAYISSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGSSQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
scFv-11F09 21*05 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:239)表示下列之完整序列：5T4結合scFv，其經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接至Fc域。連接至scFv之Fc域包括：Q347R、D399V、及F405T取代，其用於異二聚化；及S354C取代，其用於與A49MI-VH-CH1-Fc（如下所述）中之Y349C取代形成雙硫鍵。scFv具有SEQ ID NO:202之胺基酸序列，其包括21*05之重鏈可變域，其經由(G 4S) 4連接子(SEQ ID NO:119)連接至21*05之輕鏈可變域之C端。scFv在VH及VL區中於G44及G100處包含Cys取代，因而產生G44C及G100C取代，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:239之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:239之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:239之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:239之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:239之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:239之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:239之胺基酸序列。
A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)表示Fab片段之重鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之重鏈可變域(SEQ ID NO:95)及CH1域（連接至Fc域）。A49MI-VH-CH1-Fc中之Fc域在CH3域中包括Y349C取代，其與scFv-11F09 21*05 -VL-VH-Fc中之Fc上之S354C取代形成雙硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代，其用於與scFv-11F09 21*05-VL-VH-Fc中之Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)表示Fab片段之輕鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之輕鏈可變域(SEQ ID NO:85)及輕鏈恆定域。
本揭露所述之另一TriNKET ®係AB1883-VL-VH TriNKET ®。AB1883-TriNKET ®包括(a) 5T4結合scFv序列，其包含表2中所述之11F09 11*01 scFv之VH及VL序列，其在VH位於VL之C端的定向上連接至Fc域；及(b)衍生自A49MI之NKG2D結合Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分、及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域係連接至Fc域。AB1883-TriNKET ®包括三個多肽：scFv-11F09 11*01-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:240)、A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)、及A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)。 scFv-11F09 11*01-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:240)（「鏈S」） DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIKFASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSWEIPWTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKCLEWLAYISSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGSSQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
scFv-11F09 11*01-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:240)表示下列之完整序列：5T4結合scFv，其經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接至Fc域。連接至scFv之Fc域包括：Q347R、D399V、及F405T取代，其用於異二聚化；及S354C取代，其用於與A49MI-VH-CH1-Fc（如下所述）中之Y349C取代形成雙硫鍵。scFv具有SEQ ID NO:181之胺基酸序列，其包括11*01之重鏈可變域，其經由(G 4S) 4連接子(SEQ ID NO:119)連接至11*01之輕鏈可變域之C端。scFv在VH及VL區中於G44及G100處包含Cys取代，因而產生G44C及G100C取代，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:240之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:240之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:240之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:240之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:240之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:240之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:240之胺基酸序列。
A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)表示Fab片段之重鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之重鏈可變域(SEQ ID NO:95)及CH1域（連接至Fc域）。A49MI-VH-CH1-Fc中之Fc域在CH3域中包括Y349C取代，其與scFv-11F09 11*01-VL-VH-Fc中之Fc上之S354C取代形成雙硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代，其用於與scFv-11F09 11*01-VL-VH-Fc中之Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)表示Fab片段之輕鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之輕鏈可變域(SEQ ID NO:85)及輕鏈恆定域。
本揭露所述之另一TriNKET ®係AB1888-VL-VH TriNKET ®。AB1888-TriNKET ®包括(a) 5T4結合scFv序列，其包含表2中所述之11F09 21*05 BM1 scFv/AB1011之VH及VL序列，其在VH位於VL之C端的定向上連接至Fc域；及(b)衍生自A49MI之NKG2D結合Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分、及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域係連接至Fc域。AB1888-TriNKET ®包括三個多肽：scFv-11F09 21*05 BM1-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:241)、A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)、及A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)。 scFv-11F09 21*05 BM1-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:241)（「鏈S」） DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIKFASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSWEIPWTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKCLEWVSYISSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGSSQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
scFv-11F09 21*05 BM1-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:241)表示下列之完整序列：5T4結合scFv，其經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接至Fc域。連接至scFv之Fc域包括：Q347R、D399V、及F405T取代，其用於異二聚化；及S354C取代，其用於與A49MI-VH-CH1-Fc（如下所述）中之Y349C取代形成雙硫鍵。scFv具有SEQ ID NO:271之胺基酸序列，其包括11F09 21*05 BM1（表2中之AB1011）之重鏈可變域，其經由(G 4S) 4連接子(SEQ ID NO:119)連接至11F09 21*05 BM1（表2中之AB1011）之輕鏈可變域之C端。scFv在VH及VL區中於G44及G100處包含Cys取代，因而產生G44C及G100C取代，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:241之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:241之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:241之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:241之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:241之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:241之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:241之胺基酸序列。
A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)表示Fab片段之重鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之重鏈可變域(SEQ ID NO:95)及CH1域（連接至Fc域）。A49MI-VH-CH1-Fc中之Fc域在CH3域中包括Y349C取代，其與scFv-11F09 21*05 BM1-VL-VH-Fc中之Fc上之S354C取代形成雙硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代，其用於與scFv-11F09 21*05 BM1-VL-VH-Fc中之Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)表示Fab片段之輕鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之輕鏈可變域(SEQ ID NO:85)及輕鏈恆定域。
本揭露所述之另一TriNKET ®係AB1889-VL-VH TriNKET ®。AB1889-TriNKET ®包括(a) 5T4結合scFv序列，其包含表2中所述之11F09 48*01 BM2 scFv之VH及VL序列，其在VH位於VL之C端的定向上連接至Fc域；及(b)衍生自A49MI之NKG2D結合Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分、及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域係連接至Fc域。AB1889-TriNKET ®包括三個多肽：scFv-11F09 48*01 BM2-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:244)、A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)、及A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)。 scFv-11F09 48*01 BM2-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:244)（「鏈S」） DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIKFASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSWEIPWTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKCLEWLAYISSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGSSQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
scFv-11F09 48*01 BM2-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:244)表示下列之完整序列：5T4結合scFv，其經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接至Fc域。連接至scFv之Fc域包括：Q347R、D399V、及F405T取代，其用於異二聚化；及S354C取代，其用於與A49MI-VH-CH1-Fc（如下所述）中之Y349C取代形成雙硫鍵。scFv具有SEQ ID NO:246之胺基酸序列，其包括11F09 48*01 BM2之重鏈可變域，其經由(G 4S) 4連接子(SEQ ID NO:119)連接至11F09 48*01 BM2之輕鏈可變域之C端。scFv在VH及VL區中於G44及G100處包含Cys取代，因而產生G44C及G100C取代，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:244之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:244之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:244之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:244之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:244之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:244之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:244之胺基酸序列。
A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)表示Fab片段之重鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之重鏈可變域(SEQ ID NO:95)及CH1域（連接至Fc域）。A49MI-VH-CH1-Fc中之Fc域在CH3域中包括Y349C取代，其與scFv-11F09 48*01 BM2-VL-VH-Fc中之Fc上之S354C取代形成雙硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代，其用於與scFv-11F09 48*01 BM2-VL-VH-Fc中之Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)表示Fab片段之輕鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之輕鏈可變域(SEQ ID NO:85)及輕鏈恆定域。
本揭露所述之另一TriNKET ®係AB1890-VL-VH TriNKET ®。AB1890-TriNKET ®包括(a) 5T4結合scFv序列，其包含表2中所述之11F09 23*03 scFv之VH及VL序列，其在VH位於VL之C端的定向上連接至Fc域；及(b)衍生自A49MI之NKG2D結合Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分、及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域係連接至Fc域。AB1890-TriNKET ®包括三個多肽：scFv-11F09 23*03-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:286)、A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)、及A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)。 scFv-11F09 23*03 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:286)（「鏈S」） DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIKFASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSWEIPWTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKCLEWVSYISSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGSSQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
scFv-11F09 23*03-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:286)表示下列之完整序列：5T4結合scFv，其經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接至Fc域。連接至scFv之Fc域包括：Q347R、D399V、及F405T取代，其用於異二聚化；及S354C取代，其用於與A49MI-VH-CH1-Fc（如下所述）中之Y349C取代形成雙硫鍵。scFv具有SEQ ID NO:183之胺基酸序列，其包括11F09 23*03之重鏈可變域，其經由(G 4S) 4連接子(SEQ ID NO:119)連接至11F09 23*03之輕鏈可變域之C端。scFv在VH及VL區中於G44及G100處包含Cys取代，因而產生G44C及G100C取代，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:286之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:286之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:286之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:286之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:286之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:286之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:286之胺基酸序列。
A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)表示Fab片段之重鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之重鏈可變域(SEQ ID NO:95)及CH1域（連接至Fc域）。A49MI-VH-CH1-Fc中之Fc域在CH3域中包括Y349C取代，其與scFv-11F09 23*03-VL-VH-Fc中之Fc上之S354C取代形成雙硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代，其用於與scFv-11F09 11F09 23*03-VL-VH-Fc中之Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)表示Fab片段之輕鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之輕鏈可變域(SEQ ID NO:85)及輕鏈恆定域。
本揭露所述之另一TriNKET ®係AB1891-VL-VH TriNKET ®。AB1891-TriNKET ®包括(a) 5T4結合scFv序列，其包含表2中所述之11F09 11*01-BM1 scFv之VH及VL序列，其在VH位於VL之C端的定向上連接至Fc域；及(b)衍生自A49MI之NKG2D結合Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分、及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域係連接至Fc域。AB1891-TriNKET ®包括三個多肽：scFv-11F09 11*01-BM1-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:287)、A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)、及A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)。 scFv-11F09 23*03 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:287)（「鏈S」） DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIKFASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSWEIPWTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWIRQAPGKCLEWVSYISSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGSSQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
scFv-11F09 11*01-BM1-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:287)表示下列之完整序列：5T4結合scFv，其經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接至Fc域。連接至scFv之Fc域包括：Q347R、D399V、及F405T取代，其用於異二聚化；及S354C取代，其用於與A49MI-VH-CH1-Fc（如下所述）中之Y349C取代形成雙硫鍵。scFv具有SEQ ID NO:248之胺基酸序列，其包括11F09 11*01-BM1之重鏈可變域，其經由(G 4S) 4連接子(SEQ ID NO:119)連接至11F09 11*01-BM1之輕鏈可變域之C端。scFv在VH及VL區中於G44及G100處包含Cys取代，因而產生G44C及G100C取代，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:287之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:287之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:287之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:287之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:287之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:287之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:287之胺基酸序列。
A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)表示Fab片段之重鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之重鏈可變域(SEQ ID NO:95)及CH1域（連接至Fc域）。A49MI-VH-CH1-Fc中之Fc域在CH3域中包括Y349C取代，其與scFv-11F09 11*01-BM1-VL-VH-Fc中之Fc上之S354C取代形成雙硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代，其用於與scFv-11F09 11F09 11*01-BM1-VL-VH-Fc中之Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)表示Fab片段之輕鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之輕鏈可變域(SEQ ID NO:85)及輕鏈恆定域。
本揭露所述之另一TriNKET ®係AB1893-VL-VH TriNKET ®。AB1893-TriNKET ®包括(a) 5T4結合scFv序列，其包含表2中所述之11F09 23*03-BM2 scFv之VH及VL序列，其在VH位於VL之C端的定向上連接至Fc域；及(b)衍生自A49MI之NKG2D結合Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分、及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域係連接至Fc域。AB1893-TriNKET ®包括三個多肽：scFv-11F09 23*03-BM2 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:249)、A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)、及A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)。 scFv-11F09 23*03-BM2 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:249)（「鏈S」） DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIKFASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSWEIPWTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKCLEWLAYISSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCGSSQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
scFv-11F09 23*03-BM2 -VL-VH-Fc (SEQ ID NO:249)表示下列之完整序列：5T4結合scFv，其經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接至Fc域。連接至scFv之Fc域包括：Q347R、D399V、及F405T取代，其用於異二聚化；及S354C取代，其用於與A49MI-VH-CH1-Fc（如下所述）中之Y349C取代形成雙硫鍵。scFv具有SEQ ID NO:251之胺基酸序列，其包括11F09 23*03-BM2之重鏈可變域，其經由(G 4S) 4連接子(SEQ ID NO:119)連接至11F09 23*03-BM2之輕鏈可變域之C端。scFv在VH及VL區中於G44及G100處包含Cys取代，因而產生G44C及G100C取代，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:249之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:249之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:249之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:249之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:249之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:249之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:249之胺基酸序列。
A49MI-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:199)表示Fab片段之重鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之重鏈可變域(SEQ ID NO:95)及CH1域（連接至Fc域）。A49MI-VH-CH1-Fc中之Fc域在CH3域中包括Y349C取代，其與scFv-11F09 23*03-BM2 -VL-VH-Fc中之Fc上之S354C取代形成雙硫鍵。在A49MI-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代，其用於與scFv-11F09 11F09 23*03-BM2 -VL-VH-Fc中之Fc異二聚化。
A49MI-VL-CL (SEQ ID NO:200)表示Fab片段之輕鏈部分，其包含NKG2D結合A49MI之輕鏈可變域(SEQ ID NO:85)及輕鏈恆定域。
本揭露所述之另一TriNKET ®係AB2509-F3-TriNKET ®。AB2509-F3-TriNKET ®包括(a) NKG2D結合scFv序列，其包含表2中所述之A49MI scFv之VH及VL序列，其在VH位於VL之C端的定向上連接至Fc域；及(b)衍生自05H04之5T4結合Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分、及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域係連接至Fc域。AB2509-F3-TriNKET ®包括三個多肽：scFv-A49MI- VL- VH-Fc (SEQ ID NO:252)、05H04-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:253)、及05H04-VL-CL (SEQ ID NO:254)。 scFv- A49MI-VL- VH-Fc (SEQ ID NO:252)（「鏈S」） DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGCGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKCLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPIGAAAGWFDPWGQGTLVTVSS GS DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPRVYTLPPCRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLVSDGSFTLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 05H04-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:253)（「鏈H」） QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTDYYMDWVRQAPGQGLEWIGYIFPNDASTTYNEKFKGKATLTADKSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRDADYWGQGTTVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 05H04-VL-CL (SEQ ID NO:254)（「鏈L」） ENVLTQSPATLSLSPGERATLSCSAKSSVSYIHWYQQKPGQAPRLLIYDTSYLGSGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
scFv- A49MI-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:252)表示下列之完整序列：NKG2D結合scFv，其經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接至Fc域。連接至scFv之Fc域包括：Q347R、D399V、及F405T取代，其用於異二聚化；及S354C取代，其用於與05H04-VH-CH1-Fc（如下所述）中之Y349C取代形成雙硫鍵。scFv具有SEQ ID NO:288之胺基酸序列，其包括A49MI之重鏈可變域，其經由(G 4S) 4連接子(SEQ ID NO:119)連接至A49MI之輕鏈可變域之C端。scFv在VH及VL區中於G44及G100處包含Cys取代，因而產生G44C及G100C取代，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:252之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:252之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:252之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:252之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:252之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:252之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:252之胺基酸序列。
05H04-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:253)表示Fab片段之重鏈部分，其包含5T4結合05H04之重鏈可變域(SEQ ID NO:150)及CH1域（連接至Fc域）。05H04-VH-CH1-Fc中之Fc域在CH3域中包括Y349C取代，其與scFv- A49MI- VL - VH-Fc中之Fc上之S354C取代形成雙硫鍵。在05H04-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代，其用於與scFv- A49MI- VL - VH-Fc中之Fc異二聚化。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:253之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:253之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:253之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:253之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:253之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:253之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:253之胺基酸序列。
05H04-VL-CL (SEQ ID NO:254)表示Fab片段之輕鏈部分，其包含5T4結合05H04之輕鏈可變域(SEQ ID NO:151)及輕鏈恆定域。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:254之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:254之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:254之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:254之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:254之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:254之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:254之胺基酸序列。
本揭露所述之另一TriNKET ®係AB2511-F3-TriNKET ®。AB2511-F3-TriNKET ®包括(a) NKG2D結合scFv序列，其包含表1中所述之A49MI scFv之VH及VL序列，其在VH位於VL之C端的定向上連接至Fc域；及(b)衍生自11F09 21*05之5T4結合Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分、及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域係連接至Fc域。AB2511-F3-TriNKET ®包括三個多肽：scFv-A49MI- VL- VH-Fc (SEQ ID NO:252)、11F09 21*05-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:255)、及11F09 21*05-VL-CL (SEQ ID NO:256)。 11F09 21*05-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:255)（「鏈H」） EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCEASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWLAYISSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGSSQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 11F09 21*05-VL-CL (SEQ ID NO:256)（「鏈L」） DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGVSTSTYTYMHWFQQKPGKAPKLLIKFASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSWEIPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
scFv- A49MI- VL - VH-Fc (SEQ ID NO:252)表示下列之完整序列：NKG2D結合scFv，其經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接至Fc域。連接至scFv之Fc域包括：Q347R、D399V、及F405T取代，其用於異二聚化；及S354C取代，其用於與11F09 21*05-VH-CH1-Fc（如下所述）中之Y349C取代形成雙硫鍵。scFv具有SEQ ID NO:288之胺基酸序列，其包括A49MI之重鏈可變域，其經由(G 4S) 4連接子(SEQ ID NO:119)連接至A49MI之輕鏈可變域之C端。scFv在VH及VL區中於G44及G100處包含Cys取代，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。
11F09 21*05-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:255)表示Fab片段之重鏈部分，其包含5T4結合11F09 21*05之重鏈可變域(SEQ ID NO:161)及CH1域（連接至Fc域）。11F09 21*05-VH-CH1-Fc中之Fc域在CH3域中包括Y349C取代，其與scFv- A49MI- VL - VH-Fc中之Fc上之S354C取代形成雙硫鍵。在11F09 21*05-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代，其用於與scFv-A49MI- VL - VH-Fc中之Fc異二聚化。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:255之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:255之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:255之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:255之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:255之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:255之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:255之胺基酸序列。
11F09 21*05-VL-CL (SEQ ID NO:256)表示Fab片段之輕鏈部分，其包含5T4結合11F09 21*05之輕鏈可變域(SEQ ID NO:177)及輕鏈恆定域。
本揭露所述之另一TriNKET ®係AB2512-F3-TriNKET ®。AB2512-F3-TriNKET ®包括(a) NKG2D結合scFv序列，其包含表2中所述之A49MI scFv之VH及VL序列，其在VH位於VL之C端的定向上連接至Fc域；及(b)衍生自11F09之5T4結合Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分、及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域係連接至Fc域。AB2512-F3-TriNKET ®包括三個多肽：scFv-A49MI- VL-VH- Fc (SEQ ID NO:252)、11F09-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:257)、及11F09-VL-CL (SEQ ID NO:258)。 11F09-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:257)（「鏈H」） EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCEASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWLAYISSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCGSSQSYYRGTMDYWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 11F09-VL-CL (SEQ ID NO:258)（「鏈L」） DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGVSTSTYTYLHWFQQKPGKAPKLLIKFASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSWEIPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
scFv- A49MI- VL - VH-Fc (SEQ ID NO:252)表示下列之完整序列：NKG2D結合scFv，其經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接至Fc域。連接至scFv之Fc域包括：Q347R、D399V、及F405T取代，其用於異二聚化；及S354C取代，其用於與11F09-VH-CH1-Fc（如下所述）中之Y349C取代形成雙硫鍵。scFv具有SEQ ID NO:288之胺基酸序列，其包括A49MI之重鏈可變域，其經由(G 4S) 4連接子(SEQ ID NO:119)連接至A49MI之輕鏈可變域之C端。scFv在VH及VL區中於G44及G100處包含Cys取代，因而產生G44C及G100C取代，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。
11F09-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:257)表示Fab片段之重鏈部分，其包含5T4結合11F09之重鏈可變域(SEQ ID NO:161)及CH1域（連接至Fc域）。11F09-VH-CH1-Fc中之Fc域在CH3域中包括Y349C取代，其與scFv- A49MI- VL - VH-Fc中之Fc上之S354C取代形成雙硫鍵。在11F09-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代，其用於與scFv-A49MI- VL -VH-Fc中之Fc異二聚化。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:257之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:257之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:257之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:257之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:257之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:257之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:257之胺基酸序列。
11F09-VL-CL (SEQ ID NO:258)表示Fab片段之輕鏈部分，其包含5T4結合11F09之輕鏈可變域(SEQ ID NO:162)及輕鏈恆定域。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:258之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:258之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:258之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:258之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:258之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:258之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:258之胺基酸序列。
本揭露所述之另一TriNKET ®係AB2513-F3-TriNKET ®。AB2513-F3-TriNKET ®包括(a) NKG2D結合scFv序列，其包含表1中所述之A49MI scFv之VH及VL序列，其在VH位於VL之C端的定向上連接至Fc域；及(b)衍生自10F10 21*05之5T4結合Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分、及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域係連接至Fc域。AB2513-F3-TriNKET ®包括三個多肽：scFv-A49MI- VL-VH-Fc (SEQ ID NO:252)、10F10 21*05-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:259)、及10F10 21*05-VL-CL (SEQ ID NO:260)。 10F10 21*05-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:259)（「鏈H」） EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASRFTFSDFGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASSQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 10F10 21*05-VL-CL (SEQ ID NO:260)（「鏈L」） DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIKFASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSWEIPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
scFv- A49MI- VL - VH-Fc (SEQ ID NO:252)表示下列之完整序列：NKG2D結合scFv，其經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接至Fc域。連接至scFv之Fc域包括：Q347R、D399V、及F405T取代，其用於異二聚化；及S354C取代，其用於與10F10-VH-CH1-Fc（如下所述）中之Y349C取代形成雙硫鍵。scFv具有SEQ ID NO:288之胺基酸序列，其包括A49MI之重鏈可變域，其經由(G 4S) 4連接子(SEQ ID NO:119)連接至A49MI之輕鏈可變域之C端。scFv在VH及VL區中於G44及G100處包含Cys取代，因而產生G44C及G100C取代，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。
10F10 21*05-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:259)表示Fab片段之重鏈部分，其包含5T4結合10F10 21*05之重鏈可變域(SEQ ID NO:166)及CH1域（連接至Fc域）。10F10-VH-CH1-Fc中之Fc域在CH3域中包括Y349C取代，其與scFv- A49MI- VL - VH-Fc中之Fc上之S354C取代形成雙硫鍵。在10F10-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代，其用於與scFv-A49MI- VL - VH-Fc中之Fc異二聚化。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:259之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:259之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:259之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:259之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:259之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:259之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:259之胺基酸序列。
10F10 21*05-VL-CL (SEQ ID NO:260)表示Fab片段之輕鏈部分，其包含5T4結合10F10 21*05之輕鏈可變域(SEQ ID NO:145)及輕鏈恆定域。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:260之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:260之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:260之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:260之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:260之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:260之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:260之胺基酸序列。
本揭露所述之另一TriNKET ®係AB1002-F3-TriNKET ®。AB1002-F3-TriNKET ®包括(a) NKG2D結合scFv序列，其包含表1中所述之A49MI scFv之VH及VL序列，其在VH位於VL之C端的定向上連接至Fc域；及(b)衍生自AB1002之5T4結合Fab片段，其包括包含重鏈可變域及CH1域之重鏈部分、及包含輕鏈可變域及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中CH1域係連接至Fc域。AB1002-F3-TriNKET ®包括三個多肽：scFv-A49MI- VL- VH-Fc (SEQ ID NO:252)、AB1002-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:261)、及10F10-VL-CL (SEQ ID NO:262)。 AB1002-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:261)（「鏈H」） EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASRFTFSDFGMHWVRQAPGKGLEWVSYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCASSQSYYRGTLDYWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG AB1002-VL-CL (SEQ ID NO:262)（「鏈L」） DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVTTSNYNYMHWFQQKPGKAPKLLIKFASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSWEIPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
scFv- A49MI-VL-VH-Fc (SEQ ID NO:252)表示下列之完整序列：NKG2D結合scFv，其經由包含Gly-Ser之鉸鏈連接至Fc域。連接至scFv之Fc域包括：Q347R、D399V、及F405T取代，其用於異二聚化；及S354C取代，其用於與AB1002-VH-CH1-Fc（如下所述）中之Y349C取代形成雙硫鍵。scFv具有SEQ ID NO:288之胺基酸序列，其包括A49MI之重鏈可變域，其經由(G 4S) 4連接子(SEQ ID NO:119)連接至A49MI之輕鏈可變域之C端。scFv在VH及VL區中於G44及G100處包含Cys取代，因而產生G44C及G100C取代，其促進雙硫鍵在scFv之VH與VL之間形成。
AB1002-VH-CH1-Fc (SEQ ID NO:261)表示Fab片段之重鏈部分，其包含5T4結合AB1002之重鏈可變域(SEQ ID NO:144)及CH1域（連接至Fc域）。AB1002-VH-CH1-Fc中之Fc域在CH3域中包括Y349C取代，其與scFv- A49MI-VL -VH-Fc中之Fc上之S354C取代形成雙硫鍵。在AB1002-VH-CH1-Fc中，Fc域亦包括K360E及K409W取代，其用於與scFv-A49MI-VL -VH-Fc中之Fc異二聚化。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:261之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:261之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:261之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:261之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:261之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:261之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:261之胺基酸序列。
AB1002-VL-CL (SEQ ID NO:262)表示Fab片段之輕鏈部分，其包含5T4結合AB1002之輕鏈可變域(SEQ ID NO:145)及輕鏈恆定域。
在某些實施例中，本文所提供之TriNKET ®包含與SEQ ID NO:266之胺基酸序列至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:266之胺基酸序列至少95%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:266之胺基酸序列至少96%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:266之胺基酸序列至少97%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:266之胺基酸序列至少98%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含與SEQ ID NO:266之胺基酸序列至少99%同一的胺基酸序列。在某些實施例中，TriNKET ®包含SEQ ID NO:266之胺基酸序列。
在某些實施例中，本揭露所述之F3' TriNKET ®係與上述例示性TriNKET ®中之一者同一，惟(a)連接至NKG2D結合Fab片段之Fc域在CH3域中包括Q347R、D399V、及F405T取代以用於異二聚化，且連接至5T4結合scFv之Fc域在CH3域中包括匹配的K360E及K409W取代；且/或(b)連接至NKG2D結合Fab片段之Fc域在CH3域中包括S354C取代，且連接至5T4結合scFv之Fc域在CH3域中包括匹配的Y349C取代以用於形成雙硫鍵。
在某些實施例中，本揭露所述之2-Fab TriNKET ®係與上述例示性TriNKET ®中一者同一，惟連接至NKG2D結合Fab片段之Fc域在CH3域中包括F405L取代以用於異二聚化，且連接至5T4結合Fab片段之Fc域在CH3域中包括匹配的K409R取代。
在某些實施例中，本文所述之TriNKET ®包含人類NKG2D結合位點，其係包含VH及VL之Fab片段，其中VH包含分別由SEQ ID NO: 81、82、及97之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3，且VL包含分別由SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列。在某些實施例中，本文所述之TriNKET ®包含人類5T4結合位點，其係包含VH及VL之scFv，其中VH包含分別包含SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且VL包含分別包含SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，其中VH係位於VL之C端，其中VH係經由可撓性連接子連接至VL，可撓性連接子包含(G 4S) 4(SEQ ID NO:119)，且其中雙硫鍵係在VH之C44與VL之C100之間形成，其係依Kabat編號方案編號。在某些實施例中，本文所述之TriNKET ®包含人類CD16a結合位點，其係包含下列之人類IgG1抗體Fc域：(i)第一Fc域多肽，其包含與SEQ ID NO:118至少95%同一的胺基酸序列，且相對於SEQ ID NO:118包含Y349C、K360E、及K409W取代，其係根據EU編號系統編號，及(ii)第二Fc域多肽，其包含與SEQ ID NO:118至少95%同一的胺基酸序列，且相對於SEQ ID NO:118包含Q347R、S354C、D399V、及F405T取代，其係根據EU編號系統編號，其中雙硫鍵係在(i)之C349與(ii)之C354之間形成，且其中(i)及(iii)形成異二聚體，其中(a)之該VH係融合至該第一Fc域多肽之N端，且(b)之該VH係經由鉸鏈融合至該第二Fc域多肽之N端，該鉸鏈包含Ala-Ser。在一些實施例中，對於具有本文所述之特徵之TriNKET ®，人類NKD2D結合位點之VH包含SEQ ID NO:95之胺基酸序列，且人類NKD2D結合位點之VL包含SEQ ID NO:85之胺基酸序列。在一些實施例中，對於具有本文所述之特徵之TriNKET ®，人類5T4結合位點之VH包含SEQ ID NO:146之胺基酸序列，且人類5T4結合位點之VL包含SEQ ID NO:147之胺基酸序列。在一些實施例中，對於具有本文所述之特徵之TriNKET ®，第一Fc域多肽包含與SEQ ID NO:118至少98%同一的胺基酸序列，且第二Fc域多肽包含與SEQ ID NO:118至少98%同一的胺基酸序列。在一些實施例中，對於具有本文所述之特徵之TriNKET ®，包含VH及VL之scFV包含SEQ ID NO:148之胺基酸序列。在一些實施例中，具有本文所述之特徵之TriNKET ®包含第一多肽、第二多肽、及第三多肽，其中第一多肽包含SEQ ID NO:198之胺基酸序列；第二多肽包含SEQ ID NO:199之胺基酸序列；且第三多肽包含SEQ ID NO:200之胺基酸序列。
所屬技術領域中具有通常知識者將理解，在蛋白質產生及/或儲存期間，N端麩胺酸(E)或麩醯胺酸(Q)可環化以形成內醯胺（例如，自發地或藉由產生及/或儲存期間存在的酶催化）。因此，在其中多肽之胺基酸序列之N端殘基係E或Q之一些實施例中，本文亦設想其中E或Q經焦麩胺酸置換的對應胺基酸序列。
所屬技術領域中具有通常知識者亦經理解，在蛋白質產生及/或儲存期間，可移除蛋白質之C端離胺酸(K)（例如，自發地或藉由產生及/或儲存期間存在的酶催化）。在其C端包含Fc域之蛋白質中常觀察到K的此類移除。因此，在其中多肽之胺基酸序列（例如Fc域序列）之C端殘基係K之一些實施例中，本文亦設想其中K被移除的對應胺基酸序列。
可使用所屬技術領域中具有通常知識者熟知的重組DNA技術製造上述多特異性結合蛋白。例如，可將編碼第一免疫球蛋白重鏈之第一核酸序列選殖至第一表現載體中；可將編碼第二免疫球蛋白重鏈之第二核酸序列選殖至第二表現載體中；可將編碼免疫球蛋白輕鏈之第三核酸序列選殖至第三表現載體中；且可將第一、第二、及第三表現載體一起穩定地轉染至宿主細胞中或染色體整合至宿主細胞之基因體中，以產生多聚體蛋白質。
為了達成多特異性結合蛋白之最高產率，可探究第一、第二、及第三表現載體之不同比率，以判定用於轉染至宿主細胞中之最佳比率。在轉染之後，可使用所屬技術領域中已知的方法（諸如有限稀釋(limited dilution)、ELISA、FACS、顯微鏡術、或Clonepix），單離單一殖株以用於細胞庫產生。
可將殖株在適用於生物反應器擴展(scale-up)及維持多特異性結合蛋白表現之條件下培養。可將多特異性結合蛋白單離並純化。在一些實施例中，已單離並純化之此類多特異性結合蛋白實質上不含至少一種組分（相較於培養物中產生之多特異性結合蛋白）。因此，當純化多特異性結合蛋白係在非自然發生環境中產生、儲存、或存在時，可將其部分或完全自一或多種其他物質分離。可使用所屬技術領域中已知的方法，自細胞培養物單離並純化多特異性結合蛋白，該等方法包括離心、深層過濾、細胞裂解、均質化、冷凍解凍、親和純化、凝膠過濾、硫酸銨或乙醇沉澱、離子交換層析法（陰離子或陽離子）、疏水性交互作用交換層析法、及混合模式層析法。其他熟知方法係描述於 Process Scale Purification of Antibodies, Second Edition, U. Gottschalk (Ed.), John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ (2017)。替代地，本文所提供之多特異性結合蛋白可使用熟知的重組方法獲得（參見例如Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001)；及Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Baltimore, MD (1999)）。用於純化本文所提供之多特異性結合蛋白的方法及條件可由所屬技術領域中具有通常知識者選擇，且例如藉由如本文所述之結合及/或功能性檢定監測純化。
本揭露亦提供核酸，其編碼包含如本文所述之多特異性結合蛋白之鏈中之一或多者。在一些實施例中，核酸編碼VH，該VH包含與表1所揭示之抗體之VH至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在一些實施例中，核酸編碼VL，該VL包含與表1所揭示之相同抗體之VL至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在一些實施例中，核酸編碼VH，該VH包含與表2所揭示之抗體之VH至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在一些實施例中，核酸編碼VL，該VL包含與表2所揭示之相同抗體之VL至少90%（例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%）同一的胺基酸序列。在一些實施例中，核酸編碼本文所述之例示性多特異性結合蛋白之鏈中之一或多者。因此，在一些實施例中，核酸編碼本文所述之鏈S、鏈H、及鏈L中之一或多者。在一些實施例中，核酸編碼鏈S。在一些實施例中，核酸編碼鏈H。在一些實施例中，核酸編碼鏈S。在一些實施例中，核酸編碼鏈S及鏈H。在一些實施例中，核酸編碼鏈S及鏈L。在一些實施例中，核酸編碼鏈H及鏈L。在一些實施例中，核酸編碼鏈S、鏈H、及鏈L。本揭露又進一步提供核酸，其編碼如本文所述之Fc域或其部分，其包括形成本文所述之TriNKET形式中之任一者之鏈。
本揭露之例示性核酸序列係提供於 表 11中。如本文中所使用之AB1310係指包含AB1002 scFv (VL-VH)之多特異性結合蛋白。如本文中所使用之AB1783係指包含AB1002 scFv (VL-VH)之多特異性結合蛋白。AB1310及AB1783之胺基酸序列係同一的。如 表 11中所示之核酸序列在不同宿主細胞中的表現有所不同。AB1783針對在CHO細胞中之表現經最佳化。 表11.例示性核酸序列（編碼結合5T4之抗原結合位點）之序列
殖株 序列
AB1310 5T4-scFv (scFv-AB1002-VL-VH-Fc) GTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGGACTCTAGAGGATCGAACCCTTAAGCTTGCCACCATGGACATGAGAGTGCCCGCTCAACTGCTGGGACTGCTGCTGCTTTGGCTTCCTGGCGCTAGATGCGACATCCAGCTGACACAGAGCCCTAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGAGCGTGACCACCAGCAACTACAACTACATGCACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCAAGTTCGCCAGCAACCTGGAAAGCGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATATCTAGCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCCACCTACTACTGTCAGCACAGCTGGGAGATCCCTTGGACCTTTGGCTGTGGCACCAAGGTGGAAATCAAAGGCGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGAAGCGGAGGCGGAGGAAGCGGTGGCGGCGGATCTGAAGTTCAGCTGGTTGAAAGTGGCGGAGGCCTGGTTAAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCTCCAGATTCACCTTCAGCGACTTCGGAATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAATGTCTGGAATGGGTGTCCTACATCAGCAGCGGCAGCAGCACCATCTACTACGCCGATAGCGTGAAGGGCAGATTCACAATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCAGCAGCCAGTCCTACTACCGGGGCACACTGGATTATTGGGGCCAGGGCACAACCGTGACAGTGTCCAGCGCCAGCGATAAGACCCACACCTGTCCTCCATGTCCTGCTCCAGAACTGCTCGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCAGAACACCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCTCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAACAGCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTAGAGTGTATACCTTGCCTCCATGCCGGGACGAGCTGACCAAGAATCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCTGTGCTGGTGTCCGACGGCAGCTTTACCCTGTACAGCAAGCTGACAGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCTCCTGGATGATAATCTAGAAAGGGTTCGATCCCTACCGGTTAGTAATGAGTTTGATATCTCGACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGAACGGGGGAGGCTAACTGAAACACGGAAGGAGACAATACCGGAAGGAACCCGCGCTATGACGGCAATAAAAAGACAGAATAAAACGCACGGGTGTTGGGTCGTTTGTTCATAAACGCGGGGTTCGGTCCCAGGGCTGGCACTCTGTCGATACCCCACCGAGACCCCATTGGGGCCAATACGCCCGCGTTTCTTCCTTTTCCCCACCCCACCCCCCAAGTTCGGGTGAAGGCCCAGGGCTCGCAGCCAACGTCGGGGCGGCAGGCCCTGCCATAGCAGATCTGCGCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTC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AB1783 A49MI-VH-CH1-Fc GAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGCGGCGGACTTGTGAAGCCTGGCGGATCTCTGAGACTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACTCTATGAACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAATGGGTGTCCTCTATCTCCTCCAGCTCCTCCTACATCTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCAGCCGGGACAACGCCAAGAACTCCCTGTACCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCTAGAGGCGCTCCTATCGGCGCTGCCGCTGGATGGTTCGATCCTTGGGGACAGGGAACCCTGGTCACCGTGTCCTCTGCTTCTACCAAGGGACCCAGCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTCCAGCAAGTCTACCTCTGGCGGAACAGCTGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTTCCTGAGCCTGTGACCGTGTCTTGGAACTCTGGCGCTCTGACATCCGGCGTGCACACATTTCCAGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCTCTGTCCTCTGTCGTGACCGTGCCTTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACCTACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCTTCCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCTCCATGTCCTGCTCCAGAACTGCTCGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCTCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCTCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCTAGAGAGGAACAGTACAACTCCACCTACAGAGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCAATCGAAAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAACCTCAAGTCTGTACCTTGCCTCCTAGCCGGGATGAGCTGACCGAGAATCAGGTGTCCCTGACCTGCCTCGTGAAGGGATTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGTCTAATGGCCAGCCAGAGAACAACTACAAGACAACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTTCTGTACTCCTGGCTGACAGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCTCTGTCCCCTGGC (SEQ ID NO:549)
AB1783 A49MI-VL-CL 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(SEQ ID NO:285)
AB1783 A49MI-VL-CL GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCGTGTCTGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGCATCTCTTCTTGGCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCAAGGCTCCCAAGCTGCTGATCTACGCTGCTTCCAGTCTGCAGTCTGGCGTGCCCTCCAGATTTTCCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTTACCCTGACAATCTCCAGCCTGCAGCCTGAGGACTTCGCCACCTACTATTGTCAGCAGGGCGTGTCCTTTCCTCGGACCTTTGGCGGAGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGGACAGTGGCCGCTCCTTCCGTGTTCATCTTCCCACCTTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACAGCTTCTGTCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCTCGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCTCTGCAGTCCGGCAACTCCCAAGAGTCCGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACTCTACCTACAGCCTGTCCTCCACACTGACCCTGTCCAAGGCCGACTACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACCCATCAGGGCCTGTCTAGCCCTGTGACCAAGTCTTTCAACCGGGGCGAGTGC (SEQ ID NO:550)
在某些實施例中，本揭露之核酸分子包含SEQ ID NO:280。在某些實施例中，本揭露之核酸分子包含SEQ ID NO:281。在某些實施例中，本揭露之核酸分子包含SEQ ID NO:282。在某些實施例中，本揭露之核酸分子包含SEQ ID NO:283。在某些實施例中，本揭露之核酸分子包含SEQ ID NO:284。在某些實施例中，本揭露之核酸分子包含SEQ ID NO:285。在某些實施例中，本揭露之核酸分子包含SEQ ID NO:545。在某些實施例中，本揭露之核酸分子包含SEQ ID NO:546。在某些實施例中，本揭露之核酸分子包含SEQ ID NO:547。在某些實施例中，本揭露之核酸分子包含SEQ ID NO:548。在某些實施例中，本揭露之核酸分子包含SEQ ID NO:549。在某些實施例中，本揭露之核酸分子包含SEQ ID NO:550。 II. 多特異性結合蛋白之特徵
本文所述之多特異性結合蛋白包括NKG2D結合位點、5T4結合位點、及足以結合CD16之抗體Fc域或其部分或結合CD16之抗原結合位點。在一些實施例中，多特異性結合蛋白含有結合5T4之額外抗原結合位點，如F4-TriNKET ®形式所例示（例如圖2C及圖2D）。
在一些實施例中，本文所述之多特異性結合蛋白（其包括5T4之結合位點）以下列之EC 50值結合至表現5T4之細胞（例如腫瘤/癌細胞、癌相關纖維母細胞、或癌症幹細胞）：約3 nM至約52 nM（例如3至52 nM、3至51 nM、3至50 nM、3至49 nM、3至48 nM、3至47 nM、3至46 nM、3至45 nM、3至44 nM、3至43 nM、3至42 nM、3至41 nM、3至40 nM、3至39 nM、3至38 nM、3至37 nM、3至36 nM、3至35 nM、3至34 nM、3至33 nM、3至32 nM、3至31 nM、3至30 nM、3至29 nM、3至28 nM、3至27 nM、3至26 nM、3至25 nM、3至24 nM、3至23 nM、3至22 nM、3至21 nM、3至20 nM、3至19 nM、3至18 nM、3至17 nM、3至16 nM、3至15 nM、3至14 nM、3至13 nM、3至12 nM、3至11 nM、3至10 nM、3至9 nM、3至8 nM、3至7 nM、3至6 nM、3至5 nM、3至4 nM、4至52 nM、5至52 nM、6至52 nM、7至52 nM、8至52 nM、9至52 nM、10至52 nM、11至52 nM、12至52 nM、13至52 nM、14至52 nM、15至52 nM、16至52 nM、17至52 nM、18至52 nM、19至52 nM、20至52 nM、21至52 nM、22至52 nM、23至52 nM、24至52 nM、25至52 nM、26至52 nM、27至52 nM、28至52 nM、29至52 nM、30至52 nM、31至52 nM、32至52 nM、33至52 nM、34至52 nM、35至52 nM、36至52 nM、37至52 nM、38至52 nM、39至52 nM、40至52 nM、41至52 nM、42至52 nM、43至52 nM、44至52 nM、45至52 nM、46至52 nM、47至52 nM、48至52 nM、49至52 nM、50至52 nM、或51至52 nM）。在一些實施例中，本文所述之多特異性結合蛋白（例如包含抗5T4抗體之VH及VL的蛋白質，其中VH包含分別包含SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列的互補決定區1 (CDR1)序列、互補決定區2 (CDR2)序列、及互補決定區3 (CDR3)序列，且VL包含分別包含SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列）以下列之EC 50值結合至表現5T4之細胞（例如腫瘤/癌細胞、癌相關纖維母細胞、或癌症幹細胞）：約3 nM至6 nM（例如3 nM至5.5 nM、3 nM至5.4 nM、3 nM至5.3 nM、3 nM至5.2 nM、3 nM至4 nM、3.1 nM至6 nM、3.2 nM至6 nM、3.3 nM至6 nM、3.4 nM至6 nM、3.5 nM至6 nM、3.6 nM至6 nM、3.7 nM至6 nM、3.8 nM至6 nM、3.9 nM至6 nM、4 nM至6 nM、4.1 nM至6 nM、4.2 nM至6 nM、4.3 nM至6 nM、4.4 nM至6 nM、4.5 nM至6 nM、4.6 nM至6 nM、4.7 nM至6 nM、4.8 nM至6 nM、4.9 nM至6 nM、5 nM至6 nM、5.1 nM至6 nM、5.2 nM至6 nM、5.3 nM至6 nM、5.4 nM至6 nM、5.5 nM至6 nM、5.6 nM至6 nM、5.7 nM至6 nM、5.8 nM至6 nM、或5.9 nM至6 nM）。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白展示與對應單株抗體（亦即含有與併入多特異性結合蛋白中者相同的5T4結合位點之單株抗體）類似的熱穩定性。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白同時結合至表現NKG2D及/或CD16之細胞（諸如NK細胞）、及表現5T4之細胞（諸如某些腫瘤細胞）。多特異性結合蛋白與NK細胞之結合可增強NK細胞破壞5T4表現性細胞（例如5T4表現性腫瘤細胞）的活性。已報導NK細胞對受壓力的目標細胞展現出更強效的細胞毒性（參見Chan et al., (2014) Cell Death Differ. 21(1):5-14)。不希望受理論束縛，假設當NK細胞係藉由TriNKET ®銜接至細胞群時，NK細胞可選擇性地殺滅受壓力的目標細胞（例如惡性細胞及腫瘤微環境中之細胞）。此機制可有助於TriNKET ®之特異性增加及毒性降低，使其可選擇性地清除受壓力的細胞，即使5T4表現不限於所欲目標細胞。
在一些實施例中，多特異性結合蛋白以與對應抗5T4單株抗體（亦即含有與併入多特異性結合蛋白中者相同的5T4結合位點之單株抗體）類似的親和力結合至5T4。在一些實施例中，多特異性結合蛋白較對應單株抗體更有效地殺滅表現5T4之腫瘤細胞。
在某些實施例中，本文所述之多特異性結合蛋白（其包括5T4之結合位點）當與表現5T4之細胞共培養時，活化初代人類NK細胞。NK細胞活化係以CD107a去顆粒(degranulation)增加及IFN-γ細胞介素產生來標記。此外，相較於對應抗5T4單株抗體，多特異性結合蛋白可在表現5T4之細胞存在下顯示人類NK細胞的優越活化。
在一些實施例中，本文所述之多特異性結合蛋白（其包括5T4之結合位點）當與表現5T4之細胞共培養時，增強靜置及IL-2活化之人類NK細胞的活性。
在一些實施例中，相較於結合至5T4之對應單株抗體，多特異性結合蛋白在靶向表現中低5T4水平的腫瘤細胞方面提供優點。
在一些實施例中，TriNKET ®之雙價F4形式（亦即，TriNKET ®包括結合至5T4之額外抗原結合位點）改善TriNKET ®結合至5T4之親合力(avidity)。在一些實施例中，F4-TriNKET ®較對應F3-TriNKET ®或F3'-TriNKET ®介導更強效的腫瘤細胞殺滅。 III. 治療性應用
本申請案亦描述用於治療癌症之方法，其使用本文所述之多特異性結合蛋白及/或本文所述之醫藥組成物。此類方法包括向有需要之對象投予有效量的本文所述之多特異性結合蛋白中之任一者，其包括向有需要之對象投予呈下列形式之多特異性結合蛋白：有效量的本文所述之蛋白質、或其醫藥組成物、配方、或劑量。可使用所屬技術領域中熟知的用於投予抗體或抗體片段之任何途徑（包括但不限於靜脈內或皮下投予），向對象投予多特異性結合蛋白。本申請案之方法可改善各種臨床終點。例如，在一些實施例中，該方法增加對象之整體存活期（相對於未接受治療之個體）。在一些實施例中，該方法增加對象之無進展存活期（相對於未接受治療之個體）。在一些實施例中，該方法增加對象之整體存活期及無進展存活期（相對於未接受治療之個體）。
本申請案之方法可用以治療表現5T4之各種癌症。因此，在一些實施例中，5T4係由癌細胞表現。在一些實施例中，5T4係由癌相關纖維母細胞表現。在一些實施例中，相對於正常細胞，5T4係以高水平表現。在一些實施例中，相對於正常細胞，5T4係以低水平表現。
治療方法可根據待治療之癌症表徵。待治療之癌症可根據癌細胞表面上所表現之特定抗原（例如5T4）的存在表徵。
由5T4表現表徵之癌症包括但不限於結腸直腸癌、卵巢癌、子宮頸癌、肺（例如非小細胞肺癌）、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、乳癌（例如激素受體陽性(HR+)乳癌）、子宮癌、子宮內膜癌、鱗狀細胞癌、頭頸鱗狀細胞癌、子宮癌、胰臟癌、間皮瘤、食道癌、及胃癌。參見例如Stern, et al., Cancer Immunol Immunother(2017) 66:415–426。
設想的是，本揭露所述之蛋白質、接合物、細胞、及/或醫藥組成物可用以治療各種癌症，不限於其中癌細胞或癌症微環境中之細胞表現5T4之癌症。亦設想的是，用本揭露所述之蛋白質、接合物、細胞、及/或醫藥組成物治療之對象先前已經接受治療，包括用於癌症之化學療法。因此，在一些實施例中，藉由本揭露所述之蛋白質、接合物、細胞、及/或醫藥組成物治療之對象對化學療法呈難治性。
在某些實施例中，癌症係實體腫瘤。在一些實施例中，癌症係轉移性癌症。在某些其他實施例中，癌症係腦癌、膀胱癌、乳癌（例如激素受體陽性(HR+)乳癌）、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、白血病、肺癌、肝癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌、胃癌、睪丸癌、或子宮癌。在又其他實施例中，癌症係血管化腫瘤(vascularized tumor)、鱗狀細胞癌、腺癌、小細胞癌、黑色素瘤、神經膠質瘤、神經母細胞瘤、肉瘤（例如血管肉瘤或軟骨肉瘤）、喉癌、腮腺癌、膽道癌(biliary tract cancer)、甲狀腺癌、肢端小痣性黑色素瘤、光化性角化症(actinic keratoses)、急性淋巴球白血病、急性骨髓性白血病、腺樣囊狀癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鱗狀癌、肛管癌、肛門癌、肛門直腸癌、星形細胞瘤、巴氏腺癌(Bartholin gland carcinoma)、基底細胞癌、膽癌(biliary cancer)、骨癌、骨髓癌、支氣管癌、支氣管腺癌、類癌、膽管癌(cholangiocarcinoma)、軟骨肉瘤、脈絡叢乳頭狀瘤/癌、慢性淋巴球白血病、慢性骨髓性白血病、透明細胞癌、結締組織癌、囊腺瘤、消化系統癌、十二指腸癌、內分泌系統癌、內胚竇瘤、子宮內膜增生、子宮內膜基質肉瘤、類子宮內膜腺癌、內皮細胞癌、室管膜癌、上皮細胞癌、Ewing氏肉瘤、眼與眼窩癌(eye and orbit cancer)、女性生殖器官癌、局部結節性增生、膽囊癌、胃竇癌、胃底癌、胃泌素瘤(gastrinoma)、神經膠母細胞瘤、升糖素瘤、心臟癌、血管母細胞瘤、血管內皮瘤、血管瘤、肝腺瘤(hepatic adenoma)、肝腺瘤病(hepatic adenomatosis)、肝膽癌、肝細胞癌、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、迴腸癌、胰島素瘤、上皮內贅瘤形成(intraepithelial neoplasia)、上皮內鱗狀細胞贅瘤形成(intraepithelial squamous cell neoplasia)、肝內膽管癌、侵襲性鱗狀細胞癌、空腸癌、關節癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、骨盆癌(pelvic cancer)、大細胞癌、大腸癌、平滑肌肉瘤、惡性雀斑樣黑色素瘤(lentigo maligna melanoma)、淋巴瘤、男性生殖器官癌、惡性黑色素瘤、惡性間皮腫瘤、髓母細胞瘤、髓上皮瘤(medulloepithelioma)、腦膜癌、間皮癌、轉移癌、口腔癌(mouth cancer)、黏液表皮樣癌(mucoepidermoid carcinoma)、多發性骨髓瘤、肌肉癌、鼻道癌(nasal tract cancer)、神經系統癌、神經上皮腺癌、結節性黑色素瘤(nodular melanoma)、非上皮性皮膚癌、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、燕麥細胞癌(oat cell carcinoma)、寡樹突神經膠質細胞癌(oligodendroglial cancer)、口腔癌(oral cavity cancer)、骨肉瘤、乳突狀漿液性腺癌(papillary serous adenocarcinoma)、陰莖癌、咽癌、腦下垂體瘤、漿細胞瘤、假性肉瘤(pseudosarcoma)、肺母細胞瘤、直腸癌、腎細胞癌、呼吸系統癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、肉瘤、漿液性癌(serous carcinoma)、鼻竇癌(sinus cancer)、皮膚癌、小細胞癌、小腸癌、平滑肌癌、軟組織癌、體抑素分泌腫瘤(somatostatin-secreting tumor)、脊椎癌(spine cancer)、鱗狀細胞癌、橫紋肌癌、間皮下癌(submesothelial cancer)、表淺擴散性黑色素瘤、T細胞白血病、舌癌、未分化癌、輸尿管癌、尿道癌、膀胱癌、泌尿系統癌、子宮頸癌、子宮體癌(uterine corpus cancer)、葡萄膜黑色素瘤、陰道癌、疣狀癌、血管活性腸肽瘤(VIPoma)、外陰癌、高分化癌、或威爾姆氏瘤(Wilms tumor)。
在一些實施例中，癌症係選自由下列所組成之群組：結腸直腸癌、卵巢癌、子宮頸癌、肺（例如非小細胞肺癌）、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、乳癌（例如激素受體陽性(HR+)乳癌）、子宮癌、子宮內膜癌、鱗狀細胞癌、頭頸鱗狀細胞癌、子宮癌、胰臟癌、間皮瘤、食道癌、及胃癌。在某些實施例中，癌症係選自由下列所組成之群組：乳癌、子宮頸癌、肺（例如非小細胞肺癌）、腎癌、膀胱癌、頭頸鱗狀細胞癌、胰臟癌、及胃癌。 IV. 組合療法
本申請案之另一態樣提供組合療法。本文所述之多特異性結合蛋白可與額外治療劑組合使用以治療癌症。
可用作治療癌症之組合療法之部分的例示性治療劑例如包括放射、絲裂黴素、維A酸(tretinoin)、利博莫司汀(ribomustin)、吉西他濱(gemcitabine)、長春新鹼(vincristine)、依託泊苷(etoposide)、克拉屈濱(cladribine)、二溴甘露醇(mitobronitol)、胺甲喋呤(methotrexate)、阿黴素(doxorubicin)、卡波醌(carboquone)、噴司他丁(pentostatin)、二胺硝吖啶(nitracrine)、淨司他汀(zinostatin)、西曲瑞克(cetrorelix)、來曲唑(letrozole)、雷替曲塞(raltitrexed)、道諾黴素(daunorubicin)、法屈唑(fadrozole)、福莫司汀(fotemustine)、胸腺法新(thymalfasin)、索布佐生(sobuzoxane)、奈達鉑(nedaplatin)、阿糖胞苷(cytarabine)、比卡魯胺(bicalutamide)、長春瑞濱(vinorelbine)、維司力農(vesnarinone)、胺魯米特(aminoglutethimide)、安吖啶(amsacrine)、丙谷胺(proglumide)、依利醋銨(elliptinium acetate)、酮色林(ketanserin)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、艾視網酸酯(etretinate)、異維A酸(isotretinoin)、鏈脲佐菌素(streptozocin)、尼莫司汀(nimustine)、長春地辛(vindesine)、氟他胺(flutamide)、佐吉能(drogenil)、甘胺硫嘌呤(butocin)、卡莫氟(carmofur)、雷佐生(razoxane)、西佐喃(sizofilan)、卡鉑(carboplatin)、二溴衛矛醇(mitolactol)、替加氟(tegafur)、異環磷醯胺(ifosfamide)、潑尼莫司汀(prednimustine)、畢西巴尼(picibanil)、左旋咪唑(levamisole)、替尼泊苷(teniposide)、英丙舒凡(improsulfan)、依諾他濱(enocitabine)、利速萊得(lisuride)、氫氧美蘇腦(oxymetholone)、他莫昔芬(tamoxifen)、助孕酮(progesterone)、美雄烷(mepitiostane)、環硫雄醇(epitiostanol)、福美司坦(formestane)、干擾素α、干擾素2α、干擾素β、干擾素γ (IFN-γ)、群落刺激因子-1、群落刺激因子-2、地尼白介素(denileukin diftitox)、介白素2、黃體成長激素釋放因子、及前述藥劑之變體（可展現與其同源受體的差別性結合、或血清半衰期增加或減少）。
可用作治療癌症之組合療法之部分的額外藥劑類別係免疫檢查點抑制劑。例示性免疫檢查點抑制劑包括抑制下列中之一或多者之藥劑：(i)細胞毒性T淋巴球相關抗原4 (CTLA4)、(ii)程式性細胞死亡蛋白1 (PD1)、(iii) PDL1、(iv) LAG3、(v) B7-H3、(vi) B7-H4、及(vii) TIM3。CTLA4抑制劑伊匹單抗(ipilimumab)已獲得美國食品藥物管理局核准(United States Food and Drug Administration)用於治療黑色素瘤。
可用作治療癌症之組合療法之部分的又其他藥劑係靶向非檢查點目標之單株抗體劑（例如賀癌平(herceptin)）及非細胞毒性劑（例如酪胺酸激酶抑制劑）。
又其他抗癌劑類別包括例如：(i)抑制劑，其係選自ALK抑制劑、ATR抑制劑、A2A拮抗劑、鹼基切除修復抑制劑、Bcr-Abl酪胺酸激酶抑制劑、布魯頓氏(Bruton)酪胺酸激酶抑制劑、CDC7抑制劑、CHK1抑制劑、週期蛋白依賴性激酶抑制劑、DNA-PK抑制劑、DNA-PK及mTOR兩者之抑制劑、DNMT1抑制劑、DNMT1抑制劑加上2-氯-去氧腺苷、HDAC抑制劑、刺蝟信號傳導路徑抑制劑、IDO抑制劑、JAK抑制劑、mTOR抑制劑、MEK抑制劑、MELK抑制劑、MTH1抑制劑、PARP抑制劑、磷酸肌醇3-激酶抑制劑、PARP1及DHODH兩者之抑制劑、蛋白酶體抑制劑、拓樸異構酶II抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑、VEGFR抑制劑、及WEE1抑制劑；(ii) OX40、CD137、CD40、GITR、CD27、HVEM、TNFRSF25、或ICOS之促效劑；及(iii)細胞介素，例如其係選自IL-2、IL-12、IL-15、GM-CSF、G-CSF、及其變體。
在一些實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係與選自下列之一或多種治療劑共投予：PI3K抑制劑、FLT3R促效劑、PD-1拮抗劑、PD-L1拮抗劑、CD47抑制劑、Trop-2抑制劑、MCL1抑制劑、CCR8結合劑、HPK1拮抗劑、DGKα抑制劑、CISH抑制劑、PARP-7抑制劑、Cbl-b抑制劑、KRAS抑制劑（例如KRAS G12C或G12D抑制劑）、KRAS降解劑、β-連環蛋白降解劑、helios降解劑、CD73抑制劑、腺苷受體拮抗劑、TIGIT拮抗劑、TREM1結合劑、TREM2結合劑、CD137促效劑、GITR結合劑、OX40結合劑、及CAR-T細胞療法。
在一些實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係與選自下列之一或多種治療劑共投予：PI3Kδ抑制劑（例如依地利司(idealisib)）、FLT3L-Fc融合蛋白（例如GS-3583）、抗PD-1抗體（派姆單抗(pembrolizumab)、納武單抗(nivolumab)、賽帕利單抗(zimberelimab)）、小分子PD-L1抑制劑（例如GS-4224）、抗PD-L1抗體（例如阿特珠單抗(atezolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)）、CD47抑制劑（例如馬格羅單抗(magrolimab)）、Trop-2抑制劑（例如薩西土珠單抗戈維特坎(sacituzumab govitecan) (TRODELVY ™)）、小分子MCL1抑制劑（例如GS-9716）、小分子HPK1抑制劑（例如GS-6451）、HPK1降解劑（PROTAC；例如ARV-766）、小分子DGKα抑制劑、小分子CD73抑制劑（例如奎立克魯司他(quemliclustat) (AB680)）、抗CD73抗體（例如奧勒魯單抗(oleclumab)）、雙重A2a/A2b腺苷受體拮抗劑（例如艾魯美冷(etrumadenant) (AB928)）、抗TIGIT抗體（例如替瑞利尤單抗(tiragolumab)、維博利單抗(vibostolimab)、多伐那利單抗(domvanalimab)、AB308）、抗TREM1抗體（例如PY159）、抗TREM2抗體（例如PY314）、CD137促效劑（例如AGEN-2373）、GITR/OX40結合劑（例如AGEN-1223）、IL-2受體促效劑（例如GS-4528）、及CAR-T細胞療法（例如西卡思羅(axicabtagene ciloleucel)、布萊奧妥(brexucabtagene autoleucel)、替沙津魯(tisagenlecleucel)）。
在一些實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係與選自下列之一或多種治療劑共投予：馬格羅單抗、薩西土珠單抗戈維特坎(TRODELVY ™)、GS-4528、依地利司、GS-3583、賽帕利單抗、GS-4224、GS-9716、GS-6451、奎立克魯司他(AB680)、艾魯美冷(AB928)、多伐那利單抗、AB308、PY159、PY314、AGEN-1223、AGEN-2373、西卡思羅、及布萊奧妥。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抑制CD47與SIRPα之間的結合之藥劑組合。在各種實施例中，抑制CD47與SIRPα之間的結合之藥劑係結合至下列之抗體或其抗原結合片段：CD47（又名IAP、MER6、OA3；NCBI基因ID：961；UniProt Q08722）。在各種實施例中，結合至CD47之抗體具有具效應功能之Fc。在各種實施例中，結合至CD47之抗體係IgG4或IgG1。使用的抗CD47抗體之實例包括但不限於：馬格羅單抗、利佐帕單抗(lemzoparlimab)、來那普利單抗(letaplimab)、利古法利單抗(ligufalimab) (AK117)、AO-176、IBI-322、ZL-1201、IMC-002、SRF-231、CC-90002（又名INBRX-103）、NI-1701（又名TG-1801）、STI-6643 (Vx-1004)、CNTO-7108、RCT-1938、RRx-001、DSP-107、VT-1021、及SGN-CD47M。
在各種實施例中，抑制CD47與SIRPα CD47之間的結合之藥劑係結合至下列之抗體或其抗原結合片段：信號調節蛋白α (SIRPα)（NCBI基因ID：140885；UniProt P78324）。結合至SIRPα之說明性抗體包括但不限於：安祖斯托巴特(anzurstobart)（又名CC-95251）、GS-0189 (FSI-189)、ES-004、BI765063、及ADU1805。
在各種實施例中，抑制CD47與SIRPα CD47之間的結合之藥劑係SIRPα-Fc融合蛋白或「高親和力SIRPα試劑」，其包括SIRPα衍生之多肽及其類似物。使用的說明性SIRPα-Fc融合蛋白包括ALX-148（又名依沃帕西普(evorpacept)，描述於WO2013109752中）、TTI-621或TTI-622（描述於WO2014094122中）、SIRPa-F8、JY002-M2G1 (N297A)、JMT601 (CPO107)、SS002M91、SIRPα-lgG4-Fc-Fc、及hCD172a(SIRPa)-Fc-LIGHT。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與下列之促效劑組合：fms相關受體酪胺酸激酶3 (FLT3)；FLK2；STK1；CD135；FLK-2；NCBI基因ID：2322）。FLT3促效劑之實例包括但不限於CDX-301及GS-3583。GS-3583係描述於例如WO 2020/263830中，其全文出於所有目的特此以引用方式併入本文中。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗CD19劑或抗體組合。可共投予的抗CD19劑或抗體之實例包括但不限於：蘭妥莫單抗(blinatumomab)、他法替他單抗(tafasitamab)、XmAb5574 (Xencor)、AFM-11、因厄比利珠單抗(inebilizumab)、隆卡妥昔單抗(loncastuximab)、MEDI 551 (Cellective Therapeutics)；及MDX-1342 (Medarex)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗CD20劑或抗體組合。可共投予的抗CD20劑或抗體之實例包括但不限於：IGN-002、PF-05280586；利妥昔單抗(Rituxan/Biogen Idec)、奧法木單抗(Arzerra/Genmab)、阿托珠單抗(Gazyva/Roche Glycart Biotech)、阿侖單抗、維托珠單抗、維托珠單抗、奧克珠單抗(Ocrevus/Biogen Idec; Genentech)、奧卡拉珠單抗及烏妥昔單抗、及LFB-R603 (LFB Biotech.; rEVO Biologics)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗CD22劑或抗體組合。可共投予的抗CD22劑或抗體之實例包括但不限於：依帕珠單抗(Epratuzumab)、AMG-412、及IMMU-103 (Immunomedics)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗CD30劑或抗體組合。可共投予的抗CD30劑或抗體之實例包括但不限於：本妥昔單抗維多汀(Brentuximab vedotin) (Seattle Genetics)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗CD33劑或抗體組合。可共投予的抗CD33劑或抗體之實例包括但不限於：吉妥珠單抗(gemtuzumab)、林妥珠單抗(lintuzumab)、伐達妥昔單抗(vadastuximab)、CIK-CAR.CD33；CD33CART、AMG-330 (CD33/CD3)、AMG-673 (CD33/CD3)、GEM-333 (CD3/CD33)、及IMGN-779。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗CD37劑或抗體組合。可共投予的抗CD37劑或抗體之實例包括但不限於：BI836826 (Boehringer Ingelheim)、奧特勒土珠單抗(Otlertuzumab)、及TRU-016 (Trubion Pharmaceuticals)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗CD38劑或抗體組合。可共投予的抗CD38劑或抗體之實例包括但不限於：CD38，諸如T-007、UCART-38；Darzalex (Genmab)、達雷木單抗、JNJ-54767414 (Darzalex/Genmab)、艾薩妥昔單抗(isatuximab)、SAR650984 (ImmunoGen)、MOR202、MOR03087 (MorphoSys)、TAK-079；及抗CD38阿騰金(attenukine)，諸如TAK573。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗CD52劑或抗體組合。可共投予的抗CD52劑或抗體之實例包括但不限於：抗CD52抗體，諸如阿侖單抗(Campath/University of Cambridge)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗CD98 (4F2, FRP-1)劑或抗體組合。可共投予的抗CD98劑或抗體之實例包括但不限於：IGN523 (Igenica)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗CD157 (BST-1)劑或抗體組合。可共投予的抗CD157劑或抗體之實例包括但不限於：OBT357及MEN1112 (Menarini; Oxford BioTherapeutics)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗DKK-1劑或抗體組合。可共投予的抗DKK-1劑或抗體之實例包括但不限於：BHQ880 (MorphoSys; Novartis)及DKN-01、LY-2812176 (Eli Lilly)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗GRP78 (BiP)劑或抗體組合。可共投予的抗GRP78劑或抗體之實例包括但不限於：PAT-SM6 (OncoMab GmbH)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗NOTCH1劑或抗體組合。可共投予的抗NOTCH1劑或抗體之實例包括但不限於：布隆妥珠單抗(Brontictuzumab)及OMP-52M51 (OncoMed Pharmaceuticals)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗ROR1劑或抗體組合。可共投予的抗ROR1劑或抗體之實例包括但不限於：馬帕木單抗(Mapatumumab)、TRM1、及HGS-1012 (Cambridge Antibody Technology)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗SLAMF7 (CS1, CD319)劑或抗體組合。可共投予的抗SLAMF7劑或抗體之實例包括但不限於：埃羅妥珠單抗(Elotuzumab)、HuLuc63、BMS-901608 (Empliciti/PDL BioPharma)、及莫格利珠單抗(Mogamulizumab) (KW-0761)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與下列組合：抗TNFRSF10A (DR4; APO2; CD261; TRAILR1; TRAILR-1)劑或抗體。可共投予的抗TNFRSF10A劑或抗體之實例包括但不限於：馬帕木單抗(Mapatumumab)、TRM1、及HGS-1012 (Cambridge Antibody Technology)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與下列組合：抗運鐵蛋白受體(TFRC; CD71)劑或抗體。可共投予的抗運鐵蛋白受體劑或抗體之實例包括但不限於：E2.3/A27.15 (University of Arizona)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗EPHA3劑或抗體組合。可共投予的抗EPHA3劑或抗體之實例包括但不限於：依法妥珠單抗(Ifabotuzumab)、及KB004 (Ludwig Institute for Cancer Research)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗CCR4劑或抗體組合。可共投予的抗CCR4劑或抗體之實例包括但不限於：莫格利珠單抗(Mogamulizumab)、及KW-0761 (Poteligeo/Kyowa Hakko Kirin Co.)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗CXCR4劑或抗體組合。可共投予的抗CXCR4劑或抗體之實例包括但不限於：尤洛庫單抗(Ulocuplumab)、BMS-936564、MDX-1338 (Medarex)、及PF-06747143 (Pfizer)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗BAFF劑或抗體組合。可共投予的抗BAFF劑或抗體之實例包括但不限於：塔巴魯單抗(Tabalumab)、及LY2127399 (Eli Lilly)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗BAFF受體(BAFF-R)劑或抗體組合。可共投予的抗BAFF-R劑或抗體之實例包括但不限於：VAY736 (MorphoSys; Novartis)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗RANKL劑或抗體組合。可共投予的抗RANKL劑或抗體之實例包括但不限於：地諾單抗(Denosumab)、及AMG-162 (Prolia; Ranmark; Xgeva/Amgen)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗IL-6劑或抗體組合。可共投予的抗IL-6劑或抗體之實例包括但不限於：司妥昔單抗(Siltuximab)、及CNTO-328 (Sylvant/Centocor)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗IL-6受體(IL-6R)劑或抗體組合。可共投予的抗IL-6R劑或抗體之實例包括但不限於：托珠單抗(Tocilizumab)、R-1569 (Actemra/Chugai Pharmaceutical; Osaka University)、及AS-101 (CB-06-02, IVX-Q-101)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗IL3RA (CD123)劑或抗體組合。可共投予的抗IL3RA (CD123)劑或抗體之實例包括但不限於：塔格索夫(tagraxofusp)、塔拉考單抗(talacotuzumab) (JNJ-56022473; CSL362 (CSL))、pivekimab sunirine (IMGN632)、MB-102 (Mustang Bio)、CSL360 (CSL)；維克妥單抗(XmAb14045; Xencor)；KHK2823 (Kyowa Hakko Kirin Co.)；MGD-024 (CD123/CD3; Macrogenics)、APVO436 (CD123/CD3)；弗圖珠單抗(CD123/CD3)；JNJ-63709178 (CD123/CD3)；及XmAb-14045 (CD123/CD3) (Xencor)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗IL2RA (CD25)劑或抗體組合。可共投予的抗IL2RA劑或抗體之實例包括但不限於：巴利昔單抗(Basiliximab)、SDZ-CHI-621 (Simulect/Novartis)、及達利珠單抗(Daclizumab)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗IGF-1R (CD221)劑或抗體組合。可共投予的抗IGF-1R劑或抗體之實例包括但不限於：加尼圖單抗(Ganitumab)、AMG-479 (Amgen)；Ganitumab、AMG-479 (Amgen)、達洛圖單抗(Dalotuzumab)、MK-0646 (Pierre Fabre)、及AVE1642 (ImmunoGen)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗GM-CSF (CSF2)劑或抗體組合。可共投予的抗GM-CSF劑或抗體之實例包括但不限於：朗齊魯單抗(Lenzilumab)（又名KB003；KaloBios Pharmaceuticals）。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗HGF劑或抗體組合。可共投予的抗HGF劑或抗體之實例包括但不限於：費拉妥珠單抗(Ficlatuzumab)、AV-299 (AVEO Pharmaceuticals)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗CD44劑或抗體組合。可共投予的抗CD44劑或抗體之實例包括但不限於：RG7356、RO5429083 (Chugai Biopharmaceuticals; Roche)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗VLA-4 (CD49d)劑或抗體組合。可共投予的抗VLA-4劑或抗體之實例包括但不限於：那他珠單抗(Natalizumab)、及BG-0002-E (Tysabri/Elan Corporation)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗ICAM-1 (CD54)劑或抗體組合。可共投予的抗ICAM-1劑或抗體之實例包括但不限於：BI-505 (BioInvent International)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗VEGF-A劑或抗體組合。可共投予的抗VEGF-A劑或抗體之實例包括但不限於：貝伐單抗(Bevacizumab) (Avastin/Genentech; Hackensack University Medical Center)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗內皮唾液酸蛋白(Endosialin) (CD248, TEM1)劑或抗體組合。可共投予的抗內皮唾液酸蛋白劑或抗體之實例包括但不限於：翁特珠單抗(Ontecizumab)、及MORAB-004 (Ludwig Institute for Cancer Research; Morphotek)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗CD79劑或抗體組合。可共投予的抗CD79劑或抗體之實例包括但不限於：保納珠單抗(polatuzumab)、DCDS4501A、及RG7596 (Genentech)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與抗異檸檬酸去氫酶(IDH)劑或抗體組合。可共投予的抗IDH劑或抗體之實例包括但不限於：IDH1抑制劑艾伏尼布(ivosidenib) (Tibsovo; Agios)及IDH2抑制劑艾那尼布(Idhifa; Celgene/Agios)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與靶向下列之抗體組合：腫瘤相關鈣信號轉導子2 (TACSTD2)（NCBI基因ID：4070；EGP-1、EGP1、GA733-1、GA7331、GP50、M1S1、TROP2），抗體諸如薩西土珠單抗(sacituzumab)，例如薩西土珠單抗戈維特坎(sacituzumab govitecan) (TRODELVY ™)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與下列組合：抗主要組織相容性複合體I類G（HLA-G；NCBI基因ID：3135）抗體，諸如TTX-080。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與下列組合：抗白血球免疫球蛋白樣受體B2（LILRB2，又名CD85D、ILT4；NCBI基因ID：10288）抗體，諸如JTX-8064或MK-4830。 TNF受體超家族(TNFRSF)成員促效劑或活化劑
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與一或多個TNF受體超家族(TNFRSF)成員之促效劑組合，例如下列中之一或多者之促效劑：TNFRSF1A（NCBI基因ID：7132）、TNFRSF1B（NCBI基因ID：7133）、TNFRSF4（OX40、CD134；NCBI基因ID：7293）、TNFRSF5（CD40；NCBI基因ID：958）、TNFRSF6（FAS、NCBI基因ID：355）、TNFRSF7（CD27、NCBI基因ID：939）、TNFRSF8（CD30、NCBI基因ID：943）、TNFRSF9（4-1BB、CD137、NCBI基因ID：3604）、TNFRSF10A（CD261、DR4、TRAILR1、NCBI基因ID：8797）、TNFRSF10B（CD262、DR5、TRAILR2、NCBI基因ID：8795）、TNFRSF10C（CD263、TRAILR3、NCBI基因ID：8794）、TNFRSF10D（CD264、TRAILR4、NCBI基因ID：8793）、TNFRSF11A（CD265、RANK、NCBI基因ID：8792）、TNFRSF11B（NCBI基因ID：4982）、TNFRSF12A（CD266、NCBI基因ID：51330）、TNFRSF13B（CD267、NCBI基因ID：23495）、TNFRSF13C（CD268、NCBI基因ID：115650）、TNFRSF16（NGFR、CD271、NCBI基因ID：4804）、TNFRSF17（BCMA、CD269、NCBI基因ID：608）、TNFRSF18（GITR、CD357、NCBI基因ID：8784）、TNFRSF19（NCBI基因ID：55504）、TNFRSF21（CD358、DR6、NCBI基因ID：27242）、及TNFRSF25（DR3、NCBI基因ID：8718）。
可共投予的抗TNFRSF4 (OX40)抗體之實例包括但不限於MEDI6469、MEDI6383、MEDI0562（塔伏利西單抗）、MOXR0916、PF-04518600、RG-7888、GSK-3174998、INCAGN1949、BMS-986178、GBR-8383、ABBV-368，以及WO2016179517、WO2017096179、WO2017096182、WO2017096281、及WO2018089628中所述者，上述各文獻之全文特此以引用方式併入。
可共投予的例示性抗TNF受體超家族成員10b (TNFRSF10B, DR5, TRAILR2)抗體包括但不限於：DS-8273、CTB-006、INBRX-109、及GEN-1029。
可共投予的抗TNFRSF5 (CD40)抗體之實例包括但不限於：塞魯單抗(selicrelumab) (RO7009789)、米佐利單抗(mitazalimab)（又名瓦那利單抗(vanalimab)、ADC-1013、JNJ-64457107）、RG7876、SEA-CD40、APX-005M及ABBV-428、ABBV-927、及JNJ-64457107。
可共投予的抗TNFRSF7 (CD27)之實例包括但不限於：瓦里木單抗(varlilumab) (CDX-1127)。
可共投予的抗TNFRSF9 (4-1BB, CD137)抗體之實例包括但不限於：烏瑞魯單抗(urelumab)、烏圖木單抗(utomilumab) (PF-05082566)、AGEN2373、及ADG-106、BT-7480、及QL1806。
可共投予的抗TNFRSF17 (BCMA)之實例包括但不限於：GSK-2857916。
可共投予的抗TNFRSF18 (GITR)抗體之實例包括但不限於：MEDI1873、FPA-154、INCAGN-1876、TRX-518、BMS-986156、MK-1248、GWN-323、及WO2017096179、WO2017096276、WO2017096189、及WO2018089628中所述者。在一些實施例中，共靶向TNFRSF4 (OX40)及TNFRSF18 (GITR)之抗體或其片段經共投予。此類抗體係描述例如於WO2017096179及WO2018089628中，其等各者之全文特此以引用方式併入。
可共投予的抗TRAILR1、抗TRAILR2、抗TRAILR3、抗TRAILR4抗體之實例包括但不限於：ABBV-621。
可共投予的靶向TNFRSF家族成員之雙特異性抗體之實例包括但不限於：PRS-343 (CD-137/HER2)、AFM26 (BCMA/CD16A)、AFM-13 (CD16/CD30)、REGN-1979 (CD20/CD3)、AMG-420 (BCMA/CD3)、INHIBRX-105 (4-1BB/PDL1)、FAP-4-IBBL (4-1BB/FAP)、XmAb-13676 (CD3/CD20)、RG-7828 (CD20/CD3)、CC-93269 (CD3/BCMA)、REGN-5458 (CD3/BCMA)、及IMM-0306 (CD47/CD20)、及AMG-424 (CD38.CD3)。
可共投予的含PVR相關免疫球蛋白域(PVRIG, CD112R)之抑制劑之實例包括但不限於：COM-701。
可共投予的具有Ig及ITIM域之T細胞免疫受體（TIGIT；NCBI基因ID：201633）之抑制劑之實例包括但不限於：BMS-986207、RG-6058、AGEN-1307、及COM-902、厄提吉利單抗(etigilimab)、替瑞利尤單抗(tiragolumab)（又名MTIG-7192A；RG-6058；RO 7092284）、AGEN1777、IBI-939、AB154、MG1131、及EOS884448 (EOS-448)。
可共投予的A型肝炎病毒細胞受體2 (HAVCR2, TIMD3, TIM-3)之抑制劑之實例包括但不限於：考伯利單抗(cobolimab) (TSR-022)、LY-3321367、薩巴托利單抗(sabatolimab) (MBG-453)、INCAGN-2390、RO-7121661 (PD-1/TIM-3)、LY-3415244 (TIM-3/PDL1)、及RG7769 (PD-1/TIM-3)。
可共投予的淋巴球活化3 (LAG-3, CD223)之抑制劑之實例包括但不限於：瑞拉單抗(relatlimab) (ONO-4482)、LAG-525、MK-4280、REGN-3767、INCAGN2385、TSR-033、MGD-013 (PD-1/LAG-3)、及FS-118 (LAG-3/PD-L1)。
可共投予的抗V-set免疫調節受體(VSIR, B7H5, VISTA)抗體之實例包括但不限於：HMBD-002、及CA-170 (PD-L1/VISTA)。
可共投予的抗CD70抗體之實例包括但不限於：AMG-172。
可共投予的抗ICOS抗體之實例包括但不限於：JTX-2011、及GSK3359609。
可共投予的ICOS促效劑之實例包括但不限於：ICOS-L.COMP (Gariepy, et al.106th Annu Meet Am Assoc Immunologists (AAI) (May 9-13, San Diego) 2019, Abst 71.5)。 免疫檢查點抑制劑
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與一或多種免疫檢查點抑制劑組合。在一些實施例中，一或多種免疫檢查點抑制劑係PD-L1 (CD274)、PD-1 (PDCD1)、或CTLA4之蛋白質（例如抗體或其片段、或抗體擬似物）抑制劑。在一些實施例中，一或多種免疫檢查點抑制劑包含PD-L1 (CD274)、PD-1 (PDCD1)、或CTLA4之小型有機分子抑制劑。
可共投予的CTLA4之抑制劑之實例包括但不限於：伊匹單抗(ipilimumab)、曲美木單抗(tremelimumab)、BMS-986218、AGEN1181、AGEN1884、BMS-986249、MK-1308、REGN-4659、ADU-1604、CS-1002、BCD-145、APL-509、JS-007、BA-3071、ONC-392、AGEN-2041、JHL-1155、KN-044、CG-0161、ATOR-1144、PBI-5D3H5、BPI-002、HBM-4003、以及多特異性抑制劑FPT-155 (CTLA4/PD-L1/CD28)、PF-06936308 (PD 1/CTLA4)、MGD-019 (PD-1/CTLA4)、KN-046 (PD-1/CTLA4)、MEDI-5752 (CTLA4/PD-1)、XmAb-20717 (PD-1/CTLA4)、及AK-104 (CTLA4/PD-1)。
可共投予的PD-L1 (CD274)或PD-1 (PDCD1)之抑制劑/抗體之實例包括但不限於：賽帕利單抗(zimberelimab)、派姆單抗(pembrolizumab) (KEYTRUDA ®, MK-3477)、納武單抗(nivolumab) (OPDIVO ®, BMS-936558, MDX-1106)、西米普利單抗(cemiplimab)、皮地利珠單抗(pidilizumab)、斯巴達珠單抗(spartalizumab) (PDR-001)、阿特珠單抗(atezolizumab) (RG 7446; TECENTRIQ, MPDL3280A)、德瓦魯單抗(durvalumab) (MEDI-4736)、阿維魯單抗(avelumab) (MSB0010718C)、替雷利珠單抗(tislelizumab) (BGB-A317)、特瑞普利珠單抗(toripalimab) (JS-001)、傑諾珠單抗(genolimzumab) (CBT-501)、卡瑞利珠單抗(camrelizumab) (SHR-1210)、多斯利單抗(dostarlimab) (TSR-042)、信迪利單抗(sintilimab) (IBI-308)、替雷利珠單抗(BGB-A317)、西米普利單抗(REGN-2810)、拉立珠單抗(lambrolizumab)（CAS登記號1374853-91-4）、AMG-404、AMP-224、MEDI0680 (AMP-514)、BMS-936559、CK-301、PF-06801591、GEN-1046 (PD-L1/4-1BB)、GLS-010 (WBP-3055)、AK-103 (HX-008)、AK-105、CS-1003、HLX-10、MGA-012、BI-754091、AGEN-2034、JNJ-63723283、LZM-009、BCD-100、LY-3300054、SHR-1201、Sym-021、ABBV-181、PD1-PIK、BAT-1306、CX-072、CBT-502、MSB-2311、JTX-4014、BGB-A333、SHR-1316、CS-1001 (WBP-3155)、KN-035、HLX-20、KL-A167、STI-A1014、STI-A1015 (IMC-001)、BCD-135、FAZ-053、TQB-2450、MDX1105-01、GS-4224、GS-4416、INCB086550、MAX10181、以及多特異性抑制劑FPT-155 (CTLA4/PD-L1/CD28)、PF-06936308 (PD-1/CTLA4)、MGD-013 (PD-1/LAG-3)、RO-7247669 (PD-1/LAG-3)、FS-118 (LAG-3/PD-L1) MGD-019 (PD-1/CTLA4)、KN-046 (PD-1/CTLA4)、MEDI-5752 (CTLA4/PD-1)、RO-7121661 (PD-1/TIM-3)、XmAb-20717 (PD-1/CTLA4)、AK-104 (CTLA4/PD-1)、M7824（PD-L1/TGFβ-EC域）、CA-170 (PD-L1/VISTA)、CDX-527 (CD27/PD-L1)、LY-3415244 (TIM-3/PDL1)、RG7769 (PD-1/TIM-3)及INBRX-105 (4-1BB/PDL1)、GNS-1480 (PD-L1/EGFR)、SCH-900475、PF-06801591、AGEN-2034、AK-105、PD1-PIK、BAT-1306、BMS-936559、CK-301、MEDI-0680、PDR001 + Tafinlar ®+ Mekinist ®、及描述於下列中者：國際專利公開案第WO2018195321號、第WO2020014643號、第WO2019160882號、及第WO2018195321號。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與下列之抑制劑組合：MCL1細胞凋亡調節劑（BCL2家族成員）（MCL1、TM；EAT；MCL1L；MCL1S；Mcl-1；BCL2L3；MCL1-ES；bcl2-L-3；mcl1/EAT；NCBI基因ID：4170）。MCL1抑制劑之實例包括AMG-176、AMG-397、S-64315、及AZD-5991、483-LM、A-1210477、UMI-77、JKY-5-037、及WO2018183418、WO2016033486、及WO2017147410中所述者。 類鐸受體(TLR)促效劑
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係與類鐸受體(TLR)之促效劑組合，例如TLR1（NCBI基因ID：7096）、TLR2（NCBI基因ID：7097）、TLR3（NCBI基因ID：7098）、TLR4（NCBI基因ID：7099）、TLR5（NCBI基因ID：7100）、TLR6（NCBI基因ID：10333）、TLR7（NCBI基因ID：51284）、TLR8（NCBI基因ID：51311）、TLR9（NCBI基因ID：54106）、及/或TLR10（NCBI基因ID：81793）之促效劑。可共投予的TLR7促效劑之實例包括但不限於：DS-0509、GS-9620、LHC-165、TMX-101（咪喹莫特）、GSK-2245035、雷西莫特(resiquimod)、DSR-6434、DSP-3025、IMO-4200、MCT-465、MEDI-9197、3M-051、SB-9922、3M-052、林托普(Limtop)、TMX-30X、TMX-202、RG-7863、RG-7795、及下列中所揭示之化合物：US20100143301 (Gilead Sciences)、US20110098248 (Gilead Sciences)、及US20090047249 (Gilead Sciences)、US20140045849 (Janssen)、US20140073642 (Janssen)、WO2014/056953 (Janssen)、WO2014/076221 (Janssen)、WO2014/128189 (Janssen)、US20140350031 (Janssen)、WO2014/023813 (Janssen)、US20080234251 (Array Biopharma)、US20080306050 (Array Biopharma)、US20100029585 (Ventirx Pharma)、US20110092485 (Ventirx Pharma)、US20110118235 (Ventirx Pharma)、US20120082658 (Ventirx Pharma)、US20120219615 (Ventirx Pharma)、US20140066432 (Ventirx Pharma)、US20140088085 (Ventirx Pharma)、US20140275167 (Novira Therapeutics)、及US20130251673 (Novira Therapeutics)。可共投予的TLR7/TLR8促效劑係NKTR-262。可共投予的TLR8促效劑之實例包括但不限於：E-6887、IMO-4200、IMO-8400、IMO-9200、MCT-465、MEDI-9197、莫托莫德(motolimod)、雷西莫特、GS-9688、VTX-1463、VTX-763、3M-051、3M-052、及下列中所揭示之化合物：US20140045849 (Janssen)、US20140073642 (Janssen)、WO2014/056953 (Janssen)、WO2014/076221 (Janssen)、WO2014/128189 (Janssen)、US20140350031 (Janssen)、WO2014/023813 (Janssen)、US20080234251 (Array Biopharma)、US20080306050 (Array Biopharma)、US20100029585 (Ventirx Pharma)、US20110092485 (Ventirx Pharma)、US20110118235 (Ventirx Pharma)、US20120082658 (Ventirx Pharma)、US20120219615 (Ventirx Pharma)、US20140066432 (Ventirx Pharma)、US20140088085 (Ventirx Pharma)、US20140275167 (Novira Therapeutics)、及US20130251673 (Novira Therapeutics)。可共投予的TLR9促效劑之實例包括但不限於：AST-008、CMP-001、IMO-2055、IMO-2125、利騰莫特(litenimod)、MGN-1601、BB-001、BB-006、IMO-3100、IMO-8400、IR-103、IMO-9200、阿托莫特(agatolimod)、DIMS-9054、DV-1079、DV-1179、AZD-1419、勒托莫德(leftolimod) (MGN-1703)、CYT-003、CYT-003-QbG10、及PUL-042。TLR3促效劑之實例包括瑞他立德(rintatolimod)、poly-ICLC、RIBOXXON ®、Apoxxim、RIBOXXIM ®、IPH-33、MCT-465、MCT-475、及ND-1.1。
TLR8抑制劑之實例包括但不限於E-6887、IMO-8400、IMO-9200、及VTX-763。
TLR8促效劑之實例包括但不限於MCT-465、莫托莫德、GS-9688、及VTX-1463。
TLR9促效劑之實例包括但不限於AST-008、IMO 2055、IMO-2125、勒托莫德(lefitolimod)、利騰莫特、MGN-1601、及PUL-042。
TLR7/TLR8促效劑之實例包括但不限於：NKTR-262、IMO-4200、MEDI-9197（特拉莫德(telratolimod)）、及雷西莫特(resiquimod)。
TLR促效劑之實例包括但不限於：勒托莫德、替索莫德(tilsotolimod)、瑞他立德(rintatolimod)、DSP-0509、AL-034、G-100、庫比莫德(cobitolimod)、AST-008、莫托莫德(motolimod)、GSK-1795091、GSK-2245035、VTX-1463、GS-9688、LHC-165、BDB-001、RG-7854、及特拉莫德。
在一些實施例中，治療劑係干擾素基因(STING)之刺激劑。在一些實施例中，STING受體促效劑或活化劑係選自：ADU-S100 (MIW-815)、SB-11285、MK-1454、SR-8291、AdVCA0848、GSK-532、SYN-STING、MSA-1、SR-8291、5,6-二甲基 酮-4-乙酸(DMXAA)、環狀-GAMP (cGAMP)、及環狀-二-AMP。 造血祖細胞激酶1 (HPK1)抑制劑
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與下列之抑制劑組合：促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶1（MAP4K1、HPK1；NCBI基因ID：11184）。造血祖細胞激酶1 (HPK1)抑制劑之實例包括但不限於WO-2018183956、WO-2018183964、WO-2018167147、WO-2018183964、WO-2016205942、WO-2018049214、WO-2018049200、WO-2018049191、WO-2018102366、WO-2018049152、WO2020092528、WO2020092621、及WO-2016090300中所述者。 細胞凋亡信號調節激酶(ASK)抑制劑
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與下列之抑制劑組合：ASK抑制劑，例如促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶5（MAP3K5；ASK1、MAPKKK5、MEKK5；NCBI基因ID：4217）。ASK1抑制劑之實例包括但不限於描述於WO 2011/008709 (Gilead Sciences)及WO 2013/112741 (Gilead Sciences)中者。 布魯頓氏酪胺酸激酶(BTK)抑制劑
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與下列之抑制劑組合：布魯頓氏酪胺酸激酶（BTK、AGMX1、AT、ATK、BPK、IGHD3、IMD1、PSCTK1、XLA；NCBI基因ID：695）。BTK抑制劑之實例包括但不限於(S)-6-胺基-9-(1-(丁-2-炔醯基)吡咯啶-3-基)-7-(4-苯氧基苯基)-7H-嘌呤-8(9H)-酮、阿卡替尼(acalabrutinib) (ACP-196)、BGB-3111、CB988、HM71224、依魯替尼(ibrutinib)（依布魯維卡(Imbruvica)）、M-2951（依伏替尼(evobrutinib)）、M7583、替拉替尼(tirabrutinib) (ONO-4059)、PRN-1008、司培替尼(spebrutinib) (CC-292)、TAK-020、維卡替尼(vecabrutinib)、ARQ-531、SHR-1459、DTRMWXHS-12、TAS-5315、卡昆司(Calquence) + AZD6738、及卡昆司+丹伐特生(danvatirsen)。 週期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與下列之抑制劑組合：週期蛋白依賴性激酶1（CDK1、CDC2；CDC28A；P34CDC2；NCBI基因ID：983）；週期蛋白依賴性激酶2（CDK2、CDKN2；p33(CDK2)；NCBI基因ID：1017）；週期蛋白依賴性激酶3（CDK3；NCBI基因ID：1018）；週期蛋白依賴性激酶4（CDK4、CMM3；PSK-J3；NCBI基因ID：1019）；週期蛋白依賴性激酶6（CDK6、MCPH12；PLSTIRE；NCBI基因ID：1021）；週期蛋白依賴性激酶7（CDK7、CAK；CAK1；HCAK；MO15；STK1；CDKN7；p39MO15；NCBI基因ID：1022）；週期蛋白依賴性激酶9（CDK9、TAK；C-2k；CTK1；CDC2L4；PITALRE；NCBI基因ID：1025）。CDK 1、2、3、4、6、7、及/或9之抑制劑包括但不限於：阿貝馬昔布(abemaciclib)、阿伏西地(alvocidib)（HMR-1275、夫拉平度(flavopiridol)）、AT-7519、地那昔利(dinaciclib)、艾博蘭斯(ibrance)、FLX-925、LEE001、帕博西尼(palbociclib)、瑞博西尼(ribociclib)、瑞戈替布(rigosertib)、塞利尼索(selinexor)、UCN-01、SY1365、CT-7001、SY-1365、G1T38、米西西尼(milciclib)、曲拉西利(trilaciclib)、PF-06873600、AZD4573、及TG-02。 盤基蛋白域受體(DDR)抑制劑
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與下列之抑制劑組合：盤基蛋白域受體酪胺酸激酶1（DDR1、CAK、CD167、DDR、EDDR1、HGK2、MCK10、NEP、NTRK4、PTK3、PTK3A、RTK6、TRKE；NCBI基因ID：780）；及/或盤基蛋白域受體酪胺酸激酶2（DDR2、MIG20a、NTRKR3、TKT、TYRO10、WRCN；NCBI基因ID：4921）。DDR抑制劑之實例包括但不限於達沙替尼(dasatinib)及揭示於WO2014/047624 (Gilead Sciences)、US 2009-0142345 (Takeda Pharmaceutical)、US 2011-0287011 (Oncomed Pharmaceuticals)、WO 2013/027802 (Chugai Pharmaceutical)、及WO2013/034933 (Imperial Innovations)中者。 組蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與組蛋白去乙醯酶之抑制劑組合，例如組蛋白去乙醯酶9（HDAC9、HD7、HD7b、HD9、HDAC、HDAC7、HDAC7B、HDAC9B、HDAC9FL、HDRP、MITR；基因ID：9734）。HDAC抑制劑之實例包括但不限於阿貝司他(abexinostat)、ACY-241、AR-42、BEBT-908、貝林司他(belinostat)、CKD-581、CS-055 (HBI-8000)、CUDC-907（非米司他(fimepinostat)）、恩替司他(entinostat)、吉韋司他(givinostat)、莫塞司他(mocetinostat)、帕比司他(panobinostat)、普拉司他(pracinostat)、奎西司他(quisinostat) (JNJ-26481585)、雷米諾他(resminostat)、瑞科司他(ricolinostat)、SHP-141、丙戊酸(VAL-001)、伏立諾他(vorinostat)、替諾斯汀(tinostamustine)、雷米諾他、恩替司他、羅米地辛(romidepsin)、及土西司他(tucidinostat)。 吲哚胺-吡咯-2,3-二加氧酶(IDO1)抑制劑
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與下列之抑制劑組合：吲哚胺2,3-二加氧酶1（IDO1；NCBI基因ID：3620）。IDO1抑制劑之實例包括但不限於BLV-0801、依波斯他(epacadostat)、F-001287、GBV-1012、GBV-1028、GDC-0919、吲哚莫德(indoximod)、NKTR-218、基於NLG-919之疫苗、PF-06840003、哌喃萘醌(pyranonaphthoquinone)衍生物(SN-35837)、雷米諾他、SBLK-200802、BMS-986205、shIDO-ST、EOS-200271、KHK-2455、及LY-3381916。 Janus激酶(JAK)抑制劑
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與下列之抑制劑組合：Janus激酶1（JAK1、JAK1A、JAK1B、JTK3；NCBI基因ID：3716）；Janus激酶2（JAK2、JTK10、THCYT3；NCBI基因ID：3717）；及/或Janus激酶3（JAK3、JAK-3、JAK3_HUMAN、JAKL、L-JAK、LJAK；NCBI基因ID：3718）。JAK抑制劑之實例包括但不限於AT9283、AZD1480、巴瑞替尼、BMS-911543、非達替尼(fedratinib)、費戈替尼(GLPG0634)、甘多替尼(gandotinib) (LY2784544)、INCB039110（伊他替尼(itacitinib)）、來他替尼(lestaurtinib)、莫羅替尼(momelotinib) (CYT0387)、NS-018、帕瑞替尼(pacritinib) (SB1518)、皮非替尼(peficitinib) (ASP015K)、魯索替尼(ruxolitinib)、托法替尼（舊名塔索替尼(tasocitinib)）、INCB052793、及XL019。 基質金屬蛋白酶(MMP)抑制劑
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與基質金屬蛋白酶(MMP)之抑制劑組合，例如下列之抑制劑：MMP1（NCBI基因ID：4312）、MMP2（NCBI基因ID：4313）、MMP3（NCBI基因ID：4314）、MMP7（NCBI基因ID：4316）、MMP8（NCBI基因ID：4317）、MMP9（NCBI基因ID：4318）；MMP10（NCBI基因ID：4319）；MMP11（NCBI基因ID：4320）；MMP12（NCBI基因ID：4321）、MMP13（NCBI基因ID：4322）、MMP14（NCBI基因ID：4323）、MMP15（NCBI基因ID：4324）、MMP16（NCBI基因ID：4325）、MMP17（NCBI基因ID：4326）、MMP19（NCBI基因ID：4327）、MMP20（NCBI基因ID：9313）、MMP21（NCBI基因ID：118856）、MMP24（NCBI基因ID：10893）、MMP25（NCBI基因ID：64386）、MMP26（NCBI基因ID：56547）、MMP27（NCBI基因ID：64066）、及/或MMP28（NCBI基因ID：79148）。MMP9抑制劑之實例包括但不限於馬立馬司他(marimastat) (BB-2516)、西馬司他(cipemastat) (Ro 32-3555)、GS-5745（安德西單抗(andecaliximab)）、及WO 2012/027721 (Gilead Biologics)中所述者。 RAS及RAS路徑抑制劑
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與下列之抑制劑組合：KRAS原致癌基因（GTP酶）（KRAS；又名NS；NS3；CFC2；RALD；K-Ras；KRAS1；KRAS2；RASK2；KI-RAS；C-K-RAS；K-RAS2A；K-RAS2B；K-RAS4A；K-RAS4B；c-Ki-ras2；NCBI基因ID：3845）；NRAS原致癌基因（GTP酶）（NRAS；又名NS6；CMNS；NCMS；ALPS4；N-ras；NRAS1；NCBI基因ID：4893）；HRas原致癌基因（GTP酶）（HRAS；又名CTLO；KRAS；HAMSV；HRAS1；KRAS2；RASH1；RASK2；Ki-Ras；p21ras；C-H-RAS；c-K-ras；H-RASIDX；c-Ki-ras；C-BAS/HAS；aC-HA-RAS1；及NCBI基因ID：3265）。Ras抑制劑可在多核苷酸（例如轉錄抑制劑）或多肽（例如GTP酶抑制劑）層級上抑制Ras。在一些實施例中，抑制劑靶向Ras路徑中之一或多種蛋白質，例如抑制EGFR、Ras、Raf (A-Raf, B-Raf, C-Raf)、MEK (MEK1, MEK2)、ERK、PI3K、AKT、及mTOR中之一或多者。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與KRAS之抑制劑組合。KRAS抑制劑之實例包括AMG-510、COTI-219、MRTX-1257、ARS-3248、ARS-853、WDB-178、BI-3406、BI-1701963、ARS-1620 (G12C)、SML-8-73-1 (G12C)、化合物3144 (G12D)、Kobe0065/2602 (Ras GTP)、RT11、MRTX-849 (G12C)、及K-Ras(G12D)-選擇性抑制肽，包括KRpep-2 (Ac-RRCPLYISYDPVCRR-NH2) (SEQ ID NO: 543)及KRpep-2d (Ac-RRRRCPLYISYDPVCRRRR-NH2) (SEQ ID NO: 544)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與KRAS mRNA之抑制劑組合。例示性KRAS mRNA抑制劑包括抗KRAS U1轉接蛋白、AZD-4785、siG12D-LODER ™、及siG12D胞外體。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與MEK之抑制劑組合。可共投予的說明性MEK抑制劑包括畢尼替尼(binimetinib)、考比替尼(cobimetinib)、PD-0325901、匹瑪替布(pimasertib)、RG-7304、司美替尼(selumetinib)、曲美替尼(trametinib)、及司美替尼。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與AKT之抑制劑組合。可共投予的說明性AKT抑制劑包括RG7440、MK-2206、伊巴替布(ipatasertib)、阿弗替布(afuresertib)、AZD5363、及ARQ-092、卡瓦替布(capivasertib)、曲西立濱(triciribine)、及ABTL-0812 (PI3K/Akt/mTOR)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與Raf之抑制劑組合。可共投予的說明性Raf抑制劑包括BGB-283 (Raf/EGFR)、HM-95573、LXH-254、LY-3009120、RG7304、TAK-580、達拉非尼(dabrafenib)、維羅非尼(vemurafenib)、恩拉非尼(encorafenib) (LGX818)、PLX8394。RAF-265 (Raf/VEGFR)、及ASN-003 (Raf/PI3K)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與ERK之抑制劑組合。可共投予的說明性ERK抑制劑包括LTT-462、LY-3214996、MK-8353、雷沃替尼(ravoxertinib)、GDC-0994、及優立替尼(ulixertinib)。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與PI3K之抑制劑組合。可共投予的說明性PI3K抑制劑包括艾德昔布(idelalisib) (Zydelig ®)、艾培昔布(alpelisib)、布帕昔布(buparlisib)、皮克昔布(pictilisib)、伊格納昔布(eganelisib) (IPI-549)。可共投予的說明性PI3K/mTOR抑制劑包括達妥昔布(dactolisib)、奧米昔布(omipalisib)、沃塔昔布(voxtalisib)、吉達昔布(gedatolisib)、GSK2141795、及RG6114。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與mTOR之抑制劑組合。可共投予的說明性mTOR抑制劑包括賽泮替布(sapanisertib)、維塞替布(vistusertib) (AZD2014)、ME-344、西羅莫司(sirolimus)（口服奈米非晶配方，癌症）、及TYME-88（mTOR/細胞色素P450 3A4）。
在某些實施例中，具有CDKN2A突變之Ras驅使癌症（例如NSCLC）可藉由共投MEK抑制劑司美替尼及CDK4/6抑制劑帕博西尼來抑制。參見例如Zhou, et al., Cancer Lett. 2017 Nov 1;408:130-137。此外，K-RAS及突變體N-RAS可藉由不可逆ERBB1/2/4抑制劑來那替尼來減少。參見例如Booth, et al., Cancer Biol Ther. 2018 Feb 1;19(2):132-137。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與RAS之抑制劑組合。RAS抑制劑之實例包括NEO-100及瑞戈替布。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與EGFR之拮抗劑組合，諸如AMG-595、奈昔木單抗(necitumumab)、ABBV-221、瑪汀-迪妥昔珠單抗(depatuxizumab mafodotin) (ABT-414)、托木妥昔單抗(tomuzotuximab)、ABT-806、維必施(vectibix)、莫多妥昔單抗(modotuximab)、及RM-1929。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與下列之抑制劑組合：蛋白酪胺酸磷酸酶非受體11型（PTPN11；BPTP3、CFC、JMML、METCDS、NS1、PTP-1D、PTP2C、SH-PTP2、SH-PTP3、SHP2；NCBI基因ID：5781）。SHP2抑制劑之實例包括TNO155 (SHP-099)、RMC-4550、JAB-3068、RMC-4630、SAR442720、及WO2018172984及WO2017211303中所述者。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與下列之抑制劑組合：促分裂原活化蛋白激酶7（MAP2K7、JNKK2、MAPKK7、MEK、MEK 7、MKK7、PRKMK7、SAPKK-4、SAPKK4；NCBI基因ID：5609）。MEK抑制劑之實例包括安卓奎諾爾(antroquinonol)、畢尼替尼、CK-127、考比替尼(GDC-0973, XL-518)、MT-144、司美替尼(AZD6244)、索拉非尼、曲美替尼(GSK1120212)、阿瑟替布(uprosertib) +曲美替尼、PD-0325901、皮馬瑟替、LTT462、AS703988、CC-90003、瑞法替尼(refametinib)、TAK-733、CI-1040、及RG7421。
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與磷脂醯肌醇-4,5-雙磷酸3-激酶催化次單元之抑制劑組合，例如磷脂醯肌醇-4,5-雙磷酸3-激酶催化次單元α（PIK3CA、CLAPO、CLOVE、CWS5、MCAP、MCM、MCMTC、PI3K、PI3K-α、p110-α；NCBI基因ID：5290）；磷脂醯肌醇-4,5-雙磷酸3-激酶催化次單元β（PIK3CB、P110BETA、PI3K、PI3KBETA、PIK3C1；NCBI基因ID：5291）；磷脂醯肌醇-4,5-雙磷酸3-激酶催化次單元γ（PIK3CG、PI3CG、PI3K、PI3Kγ、PIK3、p110γ、p120-PI3K；基因ID：5494）；及/或磷脂醯肌醇-4,5-雙磷酸3-激酶催化次單元δ（PIK3CD、APDS、IMD14、P110δ、PI3K、p110D，NCBI基因ID：5293）。在一些實施例中，PI3K抑制劑係泛PI3K抑制劑。PI3K抑制劑之實例包括但不限於ACP-319、AEZA-129、AMG-319、AS252424、AZD8186、BAY 1082439、BEZ235、必米昔布(PQR309)、布帕昔布(BKM120)、BYL719（艾培昔布）、羧基醯胺基三唑乳清酸鹽(CTO)、CH5132799、CLR-457、CLR-1401、考班昔布(BAY 80-6946)、DS-7423、達妥昔布、杜維昔布(duvelisib) (IPI-145)、非米司他(fimepinostat) (CUDC-907)、吉達昔布(PF-05212384)、GDC-0032、GDC-0084 (RG7666)、GDC-0077、皮克昔布(GDC-0941)、GDC-0980、GSK2636771、GSK2269577、GSK2141795、艾德昔布(Zydelig ®)、INCB040093、INCB50465、IPI-443、IPI-549、KAR4141、LY294002、LY3023414、NERLYNX ®（來那替尼）、奈米利塞(nemiralisib) (GSK2269557)、奧米昔布(GSK2126458, GSK458)、OXY111A、帕努昔布(panulisib) (P7170, AK151761)、PA799、哌立福新(KRX-0401)、皮拉昔布(Pilaralisib) (SAR245408; XL147)、普喹替尼(puquitinib)甲磺酸酯(XC-302)、SAR260301、塞萊斯布(seletalisib) (UCB-5857)、賽拉昔布(serabelisib) (INK-1117,MLN-1117,TAK-117)、SF1126、索諾昔布(sonolisib) (PX-866)、RG6114、RG7604、瑞戈替布鈉（ON-01910鈉）、RP5090、特納昔布(tenalisib) (RP6530)、RV-1729、SRX3177、泰斯昔布(taselisib)、TG100115、溫布昔布(umbralisib) (TGR-1202)、TGX221、沃塔昔布(SAR245409)、VS-5584、WX-037、X-339、X-414、XL499、XL756、渥曼青黴素(wortmannin)、ZSTK474、及描述於WO 2005/113556 (ICOS)、WO 2013/052699 (Gilead Calistoga)、WO 2013/116562 (Gilead Calistoga)、WO 2014/100765 (Gilead Calistoga)、WO 2014/100767 (Gilead Calistoga)、及WO 2014/201409 (Gilead Sciences)中之化合物。 脾臟酪胺酸激酶(SYK)抑制劑
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與脾臟相關酪胺酸激酶（SYK、p72-Syk，基因ID：6850）之抑制劑組合。SYK抑制劑之實例包括但不限於6-(1H-吲唑-6-基)-N-(4-N- 啉基苯基)咪唑并[1,2-a]吡𠯤-8-胺、BAY-61-3606、賽度替尼(cerdulatinib) (PRT-062607)、恩妥替尼(entospletinib)、福他替尼(fostamatinib) (R788)、HMPL-523、NVP-QAB 205 AA、R112、R343、塔馬替尼(tamatinib) (R406)、及US 8450321 (Gilead Connecticut)中所述者與U.S. 2015/0175616中所述者。 酪胺酸激酶抑制劑(TKI)
在各種實施例中，如本文所述之5T4靶向TriNKET ®（抗5T4 × NKG2D × CD16多特異性分子）係進一步與酪胺酸激酶抑制劑(TKI)組合。TKI可靶向表皮生長因子受體(EGFR)及纖維母細胞生長因子(FGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、及血管內皮生長因子(VEGF)之受體。TKI之實例包括但不限於阿西替尼(axitinib)、阿法替尼(afatinib)、ARQ-087（德贊替尼(derazantinib)）、asp5878、AZD3759、AZD4547、伯舒替尼(bosutinib)、布格替尼(brigatinib)、卡博替尼(cabozantinib)、西地尼布(cediranib)、克諾拉尼(crenolanib)、克唑替尼(crizotinib)、達可替尼(dacomitinib)、達沙替尼、多韋替尼(dovitinib)、E-6201、厄達替尼(erdafitinib)、埃羅替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉列替尼(gilteritinib) (ASP-2215)、FP-1039、HM61713、埃克替尼(icotinib)、伊馬替尼(imatinib)、KX2-391 (Src)、拉帕替尼(lapatinib)、來他替尼、樂伐替尼(lenvatinib)、米哚妥林(midostaurin)、尼達尼布(nintedanib)、ODM-203、奧莫替尼(olmutinib)、奧希替尼(osimertinib) (AZD-9291)、帕唑帕尼(pazopanib)、普納替尼(ponatinib)、波齊替尼(poziotinib)、喹雜替尼(quizartinib)、拉多替尼(radotinib)、羅西替尼(rociletinib)、索凡替尼(sulfatinib) (HMPL-012)、舒尼替尼(sunitinib)、法米替尼(famitinib) L-蘋果酸鹽、(MAC-4)、替沃尼布(tivoanib)、TH-4000、MEDI-575（抗PDGFR抗體）、及TAK-659。
本申請案之蛋白質亦可用作手術移除原發病灶之輔助手段(adjunct)。
可選擇多特異性結合蛋白及額外治療劑之量、及相關投予時機，以達成所欲組合治療效果。例如，當向需要此類投予之患者投予組合療法時，組合中之治療劑、或包含治療劑之醫藥組成物或組成物可以任何順序投予，諸如例如依序(sequentially)、並行(concurrently)、一起、同時(simultaneously)、及類似者。此外，例如，可在（多種）額外治療劑發揮其疾病預防或治療效果的時間期間投予多特異性結合蛋白，或反之亦然。 V. 醫藥組成物及配方
本揭露亦描述醫藥組成物及配方，其含有治療有效量的本文所述之蛋白質。可調配組成物或配方以用於各種藥物遞送系統。亦可在用於適當配方之組成物中包括一或多種生理上可接受之賦形劑或載劑。適用於本揭露之配方係見於例如Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985及Steven Shire, “Monoclonal Antibodies: Meeting the Challenges in Manufacturing, Formulation, Delivery and Stability of Final Drug Product,” Woodhead Publishing; 1st edition (April 24, 2015)。關於藥物遞送方法的簡要綜述，參見例如Langer (Science 249:1527-1533, 1990)。
本申請案中所述之靜脈內藥物遞送配方可包含在注射袋、注射筆、或注射器中。在某些實施例中，注射袋可連接至通道，通道包含管及/或針。在某些實施例中，配方可係凍乾配方或液體配方。在某些實施例中，配方可經冷凍乾燥（凍乾），並包含在約12至60個小瓶中。在某些實施例中，配方可經冷凍乾燥，且45 mg的冷凍乾燥配方可包含在一個小瓶中。在某些實施例中，約40 mg至約100 mg的冷凍乾燥配方可包含在一個小瓶中。在某些實施例中，將來自12、27、或45個小瓶之冷凍乾燥配方組合，以獲得靜脈內藥物配方中治療劑量的蛋白質。在某些實施例中，配方可係液體配方，並以約250 mg/小瓶至約1000 mg/小瓶儲存。在某些實施例中，配方可係液體配方，並以約600 mg/小瓶儲存。在某些實施例中，配方可係液體配方，並以約250 mg/小瓶儲存。
蛋白質可存在於液體水性醫藥配方中，其包括治療有效量的蛋白質於緩衝溶液中（形成配方）。
此等組成物可藉由習知滅菌技術滅菌，或可經無菌過濾。可將所得水溶液原樣(as-is)包裝以供使用或凍乾，凍乾製劑係在投予前與無菌水性載劑組合。製劑之pH一般將在3與11之間，例如在5與9之間或在6與8之間，且在某些實施例中，在7與8之間，諸如7至7.5。呈固體形式之所得組成物可以多個單次劑量單位包裝，其各自含有固定量的（多種）上述藥劑。亦可將呈固體形式之組成物包裝於容器中，以供彈性的數量。醫藥配方包括一或多種賦形劑，且係維持在一定pH下。如本文中所使用，用語「賦形劑(excipient)」意指任何非治療劑，其係添加至配方中以提供所欲物理或化學性質，例如pH、滲透壓、黏度、澄清度、顏色、等張性、氣味、無菌性、穩定性、溶解或釋放速率、吸附、或滲透。
可將本揭露之多特異性結合蛋白以各種濃度調配於醫藥配方中。在一些實施例中，醫藥配方包括大於或等於1 mg/mL、大於或等於10 mg/mL、大於或等於20 mg/mL、大於或等於30 mg/mL、大於或等於40 mg/mL、大於或等於50 mg/mL、大於或等於60 mg/mL、大於或等於70 mg/mL、大於或等於80 mg/mL、大於或等於90 mg/mL、大於或等於100 mg/mL、大於或等於125 mg/mL、大於或等於150 mg/mL、大於或等於175 mg/mL、或大於或等於200 mg/mL的多特異性結合蛋白。在某些實施例中，醫藥配方包括1 mg/ml至200 mg/ml、2 mg/ml至200 mg/ml、5 mg/ml至200 mg/ml、7.5 mg/ml至200 mg/ml、10 mg/ml至200 mg/ml、12.5 mg/ml至200 mg/ml、15 mg/ml至200 mg/ml、20 mg/ml至200 mg/ml、25 mg/ml至200 mg/ml、50 mg/ml至200 mg/ml、75 mg/ml至200 mg/ml、100 mg/ml至200 mg/ml、125 mg/ml至200 mg/ml、150 mg/ml至200 mg/ml、175 mg/ml至200 mg/ml、1 mg/ml至150 mg/ml、2 mg/ml至150 mg/ml、5 mg/ml至150 mg/ml、7.5 mg/ml至150 mg/ml、10 mg/ml至150 mg/ml、12.5 mg/ml至150 mg/ml、15 mg/ml至150 mg/ml、20 mg/ml至150 mg/ml、25 mg/ml至150 mg/ml、50 mg/ml至150 mg/ml、75 mg/ml至150 mg/ml、100 mg/ml至150 mg/ml、125 mg/ml至150 mg/ml、1 mg/ml至100 mg/ml、2 mg/ml至100 mg/ml、5 mg/ml至100 mg/ml、7.5 mg/ml至100 mg/ml、10 mg/ml至100 mg/ml、12.5 mg/ml至100 mg/ml、15 mg/ml至100 mg/ml、20 mg/ml至100 mg/ml、25 mg/ml至100 mg/ml、50 mg/ml至100 mg/ml、75 mg/ml至100 mg/ml、1 mg/ml至50 mg/ml、2 mg/ml至50 mg/ml、5 mg/ml至50 mg/ml、7.5 mg/ml至50 mg/ml、10 mg/ml至50 mg/ml、12.5 mg/ml至50 mg/ml、15 mg/ml至50 mg/ml、20 mg/ml至50 mg/ml、25 mg/ml至50 mg/ml、1 mg/ml至25 mg/ml、2 mg/ml至25 mg/ml、5 mg/ml至25 mg/ml、7.5 mg/ml至25 mg/ml、10 mg/ml至25 mg/ml、12.5 mg/ml至25 mg/ml、15 mg/ml至25 mg/ml、20 mg/ml至25 mg/ml、1 mg/ml至20 mg/ml、2 mg/ml至20 mg/ml、5 mg/ml至20 mg/ml、7.5 mg/ml至20 mg/ml、10 mg/ml至20 mg/ml、12.5 mg/ml至20 mg/ml、或15 mg/ml至20 mg/ml的多特異性結合蛋白。在一些實施例中，醫藥配方包括約5 mg/ml、約7.5 mg/ml、約10 mg/ml、約12.5 mg/ml、約15 mg/ml、約20 mg/ml、約25 mg/ml、或約50 mg/ml的多特異性結合蛋白。在某些實施例中，醫藥配方包括約15 mg/ml的多特異性結合蛋白。
在某些實施例中，本申請案描述一種儲放壽命延長的配方，其包括如本文所述之多特異性結合蛋白與甘露醇、檸檬酸單水合物、檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉二水合物、磷酸二氫鈉二水合物、氯化鈉、聚山梨醇酯80、水、及氫氧化鈉之組合。 賦形劑及pH
本揭露之醫藥配方中之一或多種賦形劑可包括緩衝劑。如本文中所使用，用語「緩衝劑(buffering agent)」係指具下列條件之一或多種組分：當添加至水溶液中時，能夠在添加酸或鹼時，或在用溶劑稀釋後，保護溶液免受pH變化的影響。在一些實施例中，可使用檸檬酸鹽、磷酸鹽緩衝劑、甘胺酸鹽、碳酸鹽、組胺酸緩衝劑、及類似者，在此情況下，鈉離子、鉀離子、或銨離子可作為相對離子。
在某些實施例中，緩衝劑或緩衝系統包括至少一種緩衝劑，其具有與pH 6.0至7.0之範圍完全或部分重疊的緩衝範圍。在某些實施例中，緩衝劑具有約6.0至7.0之pKa。在某些實施例中，緩衝劑包括檸檬酸鹽。在某些實施例中，檸檬酸係以下列之濃度存在：5至100 mM、7.5至100 mM、10至100 mM、12.5至100 mM、15至100 mM、17.5至100 mM、20至100 mM、22.5至100 mM、25至100 mM、50 mM至100 mM、75 mM至100 mM、5至75 mM、7.5至75 mM、10至75 mM、12.5至75 mM、15至75 mM、17.5至75 mM、20至75 mM、22.5至75 mM、25至75 mM、50 mM至75 mM、5至50 mM、7.5至50 mM、10至50 mM、12.5至50 mM、15至50 mM、17.5至50 mM、20至50 mM、22.5至50 mM、25至50 mM、5至25 mM、7.5至25 mM、10至25 mM、12.5至25 mM、15至25 mM、17.5至25 mM、20至25 mM、5 mM至20 mM、7.5至20 mM、10 mM至20 mM、12.5至20 mM、15 mM至20 mM、17.5至20 mM、5 mM至15 mM、7.5至15 mM、或10 mM至15 mM。在某些實施例中，檸檬酸係以下列之濃度存在：約5 mM、約7.5 mM、約10 mM、約12.5 mM、約15 mM、約17.5 mM、約20 mM、約22.5 mM、約25 mM、或約50 mM。在某些實施例中，檸檬酸係以20 mM之濃度存在。
在一些實施例中，檸檬酸鹽包含檸檬酸鈉、檸檬酸、或其組合。在某些實施例中，檸檬酸鈉係以下列之濃度存在：15 mM至25 mM、17 mM至21 mM、或17.5 mM至20.5 mM。在某些實施例中，檸檬酸鈉係以下列之濃度存在：約15 mM、約16 mM、約17 mM、約18 mM、約19 mM、約20 mM、約21 mM、約22 mM、約23 mM、約24 mM、或約25 mM。在某些實施例中，檸檬酸鈉係以約18.9 mM之濃度存在。在某些實施例中，檸檬酸係以下列之濃度存在：0.5 mM至1.5 mM、0.7 mM至1.3 mM、或1.0 mM至1.2。在某些實施例中，檸檬酸係以下列之濃度存在：約0.5 mM、約0.6 mM、約0.7 mM、約0.8 mM、約0.9 mM、約1.0 mM、約1.1 mM、約1.2 mM、約1.3 mM、約1.4 mM、或約1.5 mM。在某些實施例中，檸檬酸係以約2.3 mg之量存在。在某些實施例中，檸檬酸鹽係在pH 6.5下。
本文所揭示之醫藥配方可具有6.0至7.0之pH。例如，在某些實施例中，醫藥配方具有下列之pH：6.1至7.0、6.2至7.0、6.3至7.0、6.4至7.0、6.5至7.0、6.6至7.0、6.7至7.0、6.8至7.0、6.9至7.0、6.1至6.9、6.2至6.9、6.3至6.9、6.4至6.9、6.5至6.9、6.6至6.9、6.7至6.9、6.8至6.9、6.1至6.8、6.2至6.8、6.3至6.8、6.4至6.8、6.5至6.8、6.6至6.8、6.7至6.8、6.1至6.7、6.2至6.7、6.3至6.7、6.4至6.7、6.5至6.7、6.6至6.7、6.1至6.6、6.2至6.6、6.3至6.6、6.4至6.6、6.5至6.6、6.1至6.5、6.2至6.5、6.3至6.5、6.4至6.5、6.1至6.4、6.2至6.4、6.3至6.4、6.1至6.3、6.2至6.3、或6.1至6.2。在某些實施例中，醫藥組成物或醫藥配方具有下列之pH：約6.2、約6.3、約6.4、約6.5、約6.6、約6.7、或約6.8。在某些實施例中，醫藥配方具有約6.5之pH。在科學捨入之規則下，將大於或等於5.95及小於或等於6.05之pH捨入為6.0。
在某些實施例中，製備水性配方，其包括本揭露之蛋白質於pH緩衝溶液中。配方之緩衝劑可具有範圍在約4至約8（例如約4.5至約6.0、或約4.8至約5.5）之pH，或可具有約5.0至約5.2之pH。上述pH之居中範圍亦意欲為本揭露之部分。例如，意欲包括使用任何上述值之組合作為上限及/或下限的值範圍。將pH控制在此範圍內的緩衝劑之實例包括乙酸鹽（例如乙酸鈉）、琥珀酸鹽（諸如琥珀酸鈉）、葡萄糖酸鹽、組胺酸、檸檬酸鹽、及其他有機酸緩衝劑。
在某些實施例中，配方包括緩衝系統，其含有檸檬酸鹽及磷酸鹽以將pH維持在約4至約8之範圍內。在某些實施例中，pH範圍可係約4.5至約6.0、或約pH 4.8至約5.5，或在約5.0至約5.2之pH範圍內。在某些實施例中，緩衝系統包括檸檬酸單水合物、檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉二水合物、及/或磷酸二氫鈉二水合物。在某些實施例中，緩衝系統包括約1.3 mg/mL的檸檬酸（例如1.305 mg/mL）、約0.3 mg/mL的檸檬酸鈉（例如0.305 mg/mL）、約1.5 mg/mL的磷酸氫二鈉二水合物（例如1.53 mg/mL）、約0.9 mg/mL的磷酸二氫鈉二水合物（例如0.86 mg/mL）、及約6.2 mg/mL的氯化鈉（例如6.165 mg/mL）。在某些實施例中，緩衝系統包括約1至約1.5 mg/mL的檸檬酸、約0.25至約0.5 mg/mL的檸檬酸鈉、約1.25至約1.75 mg/mL的磷酸氫二鈉二水合物、約0.7至約1.1 mg/mL的磷酸二氫鈉二水合物、及約6.0至約6.4 mg/mL的氯化鈉。在某些實施例中，用氫氧化鈉調整配方之pH。
配方中亦可包括多元醇，其作用為張力調節劑(tonicifier)且可穩定抗體。多元醇係以可就配方之所欲等張性而變化的量添加至配方中。在某些實施例中，水性配方可係等張的。多元醇之添加量亦可就多元醇之分子量而改變。例如，相較於雙醣（例如海藻糖），可添加較低量的單醣（例如甘露醇）。在某些實施例中，可用於配方中作為張力劑之多元醇係甘露醇。在某些實施例中，甘露醇濃度可係約5至約20 mg/mL。在某些實施例中，甘露醇之濃度可係約7.5至約15 mg/mL。在某些實施例中，甘露醇之濃度可係約10至約14 mg/mL。在某些實施例中，甘露醇之濃度可係約12 mg/mL。在某些實施例中，配方中可包括多元醇山梨醇。
配方中亦可包括糖，其作用為張力調節劑且可穩定抗體。糖係以可就配方之所欲等張性而變化的量添加至配方中。在某些實施例中，水性配方可係等張的。在某些實施例中，可用於配方中作為張力劑之糖係蔗糖。在某些實施例中，蔗糖濃度可係150 mM至200 mM。在某些實施例中，蔗糖之濃度可係160 mM至190 mM。在某些實施例中，蔗糖之濃度可係170 mM至180 mM。在某些實施例中，蔗糖之濃度可係172.5 mM至177.5 mM。在某些實施例中，蔗糖之濃度可係約175.3 mM。
本文所揭示之醫藥配方中之一或多種賦形劑進一步包括清潔劑或界面活性劑。如本文中所使用，用語「界面活性劑(surfactant)」係指含有疏水性部分（例如烷基鏈）及親水性部分（例如羧基及羧酸鹽基團）兩者之表面活性分子。界面活性劑在醫藥配方中可用於減少治療性蛋白質的聚集。亦可將清潔劑或界面活性劑添加至配方中。例示性清潔劑包括非離子清潔劑，諸如聚山梨醇酯（例如聚山梨醇酯20、80等）或泊洛沙姆(poloxamer)（例如泊洛沙姆188）。清潔劑之添加量係使得其減少調配抗體之聚集，且/或最小化配方中顆粒之形成，且/或減少吸附。在某些實施例中，配方可包括為聚山梨醇酯之界面活性劑。適用於醫藥配方中之界面活性劑通常係非離子界面活性劑，且包括但不限於聚山梨醇酯（例如聚山梨醇酯20或80）；泊洛沙姆（例如泊洛沙姆188）；山梨醇酐酯及衍生物；Triton；月桂基硫酸鈉；辛基醣苷鈉(sodium octyl glycoside)；月桂基、肉豆蔻基、亞油基(linoleyl)、或硬酯基磺基甜菜鹼(sulfobetadine)；月桂基、肉豆蔻基、亞油基、或硬酯基肌胺酸；亞油基、肉豆蔻基、或鯨蠟基甜菜鹼；月桂醯胺丙基(lauramidopropyl)、椰油醯胺丙基、亞油醯胺丙基(linoleamidopropyl)、肉豆蔻醯胺丙基、棕櫚醯胺丙基(palmidopropyl)、或異硬脂醯胺丙基甜菜鹼（例如月桂醯胺丙基(lauroamidopropyl)）；肉豆蔻醯胺丙基、棕櫚醯胺丙基、或異硬脂醯胺丙基二甲胺；甲基椰油醯基牛磺酸鈉或甲基油基牛磺酸二鈉(disodium methyl oleyl taurate)；及MONAQUAT TM系列(Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.)、聚乙二醇、聚丙二醇、及乙二醇及丙二醇之共聚物（例如Pluronic、PF68等）。在某些實施例中，界面活性劑係聚山梨醇酯。在某些實施例中，配方可含有界面活性劑聚山梨醇酯80或Tween 80。Tween 80係用以描述聚氧乙烯(20)山梨醇酐單油酸酯之用語（參見Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf, 4th ed., 1996）。在某些實施例中，配方可含有在約0.1 mg/mL與約10 mg/mL之間的聚山梨醇酯80、或在約0.5 mg/mL與約5 mg/mL之間。在某些實施例中，配方中可添加約0.1%聚山梨醇酯80。
適用於醫藥配方中之界面活性劑通常係非離子界面活性劑，且包括但不限於聚山梨醇酯（例如聚山梨醇酯20或80）；泊洛沙姆（例如泊洛沙姆188）；山梨醇酐酯及衍生物；Triton；月桂基硫酸鈉；辛基醣苷鈉(sodium octyl glycoside)；月桂基、肉豆蔻基、亞油基(linoleyl)、或硬酯基磺基甜菜鹼(sulfobetadine)；月桂基、肉豆蔻基、亞油基、或硬酯基肌胺酸；亞油基、肉豆蔻基、或鯨蠟基甜菜鹼；月桂醯胺丙基(lauramidopropyl)、椰油醯胺丙基、亞油醯胺丙基(linoleamidopropyl)、肉豆蔻醯胺丙基、棕櫚醯胺丙基(palmidopropyl)、或異硬脂醯胺丙基甜菜鹼（例如月桂醯胺丙基(lauroamidopropyl)）；肉豆蔻醯胺丙基、棕櫚醯胺丙基、或異硬脂醯胺丙基二甲胺；甲基椰油醯基牛磺酸鈉或甲基油基牛磺酸二鈉(disodium methyl oleyl taurate)；及MONAQUAT TM系列(Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.)、聚乙二醇、聚丙二醇、及乙二醇及丙二醇之共聚物（例如Pluronic、PF68等）。在某些實施例中，界面活性劑係聚山梨醇酯。在某些實施例中，界面活性劑係聚山梨醇酯80。
本揭露之醫藥組成物或醫藥配方內含有的非離子界面活性劑之量可取決於下列而有所變化：配方之所欲特定性質、以及意欲使用配方之特定情況及目的。在某些實施例中，醫藥配方包括0.005%至0.5% (w/v)、0.005%至0.25% (w/v)、0.005%至0.2% (w/v)、0.005%至0.1% (w/v)、0.005%至0.05% (w/v)、0.005%至0.025% (w/v)、0.005%至0.02% (w/v)、0.005%至0.01% (w/v)、0.0075%至0.5% (w/v)、0.0075%至0.2% (w/v)、.0075%至0.25% (w/v)、0.0075%至0.1% (w/v)、0.0075%至0.05% (w/v)、0.0075%至0.025% (w/v)、0.0075%至0.02% (w/v)、0.0075%至0.01% (w/v)、0.01%至0.5% (w/v)、0.01%至0.25% (w/v)、0.01%至0.2% (w/v)、0.01%至0.1% (w/v)、0.01%至0.05% (w/v)、0.01%至0.025% (w/v)、或0.01%至0.02% (w/v)的非離子界面活性劑（例如聚山梨醇酯80）。在某些實施例中，醫藥配方包括0.005% (w/v)、0.01% (w/v)、0.02% (w/v)、0.03% (w/v)、0.04% (w/v)、0.05% (w/v)、0.06% (w/v)、0.07% (w/v)、0.08% (w/v)、0.09% (w/v)、0.1% (w/v)、0.15% (w/v)、0.2% (w/v)、0.25% (w/v)、0.3% (w/v)、0.35% (w/v)、0.4% (w/v)、0.45% (w/v)、或0.5% (w/v)的聚山梨醇酯80。在某些實施例中，醫藥配方包括約0.01% (w/v)聚山梨醇酯80。
本揭露之醫藥組成物或醫藥配方內含有的非離子界面活性劑之量可取決於下列而有所變化：配方之所欲特定性質、以及意欲使用配方之特定情況及目的。在某些實施例中，醫藥配方包括0.005 mg/mL至0.5 mg/mL、0.005 mg/mL至0.25 mg/mL、0.005 mg/mL至0.2 mg/mL、0.005 mg/mL至0.1 mg/mL、0.005 mg/mL至0.05 mg/mL、0.005 mg/mL至0.025 mg/mL、0.005 mg/mL至0.02 mg/mL、0.005 mg/mL至0.01 mg/mL、0.0075 mg/mL至0.5 mg/mL、0.0075 mg/mL至0.2 mg/mL、.0075 mg/mL至0.25 mg/mL、0.0075 mg/mL至0.1 mg/mL、0.0075 mg/mL至0.05 mg/mL、0.0075 mg/mL至0.025 mg/mL、0.0075 mg/mL至0.02 mg/mL、0.0075 mg/mL至0.01 mg/mL、0.01 mg/mL至0.5 mg/mL、0.01 mg/mL至0.25 mg/mL、0.01 mg/mL至0.2 mg/mL、0.01 mg/mL至0.1 mg/mL、0.01 mg/mL至0.05 mg/mL、0.01 mg/mL至0.025 mg/mL、或0.01 mg/mL至0.02 mg/mL的非離子界面活性劑（例如聚山梨醇酯80）。在某些實施例中，醫藥配方包括0.005 mg/mL、0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL、0.06 mg/mL、0.07 mg/mL、0.08 mg/mL、0.09 mg/mL、0.1 mg/mL、0.15 mg/mL、0.2 mg/mL、0.25 mg/mL、0.3 mg/mL、0.35 mg/mL、0.4 mg/mL、0.45 mg/mL、或0.5 mg/mL的聚山梨醇酯80。在某些實施例中，醫藥配方包括約0.1 mg/mL聚山梨醇酯80。
本文所揭示之醫藥配方中之一或多種賦形劑可進一步包括糖或糖醇。糖及糖醇可用於醫藥配方中作為熱穩定劑。在某些實施例中，醫藥配方包括糖醇，例如衍生自單醣之糖醇（例如甘露醇、山梨醇、或木糖醇）、衍生自雙醣之糖醇（例如乳糖醇(lactitol)或麥芽糖醇）、或衍生自寡醣之糖醇。在某些實施例中，醫藥配方包括糖，例如單醣（葡萄糖、木糖、或赤藻糖醇(erythritol)）、雙醣（例如蔗糖、海藻糖、麥芽糖、或半乳糖）、或寡醣（例如水蘇糖）。在具體實施例中，醫藥配方包括蔗糖。
配方內含有的糖或糖醇之量可取決於使用配方之特定情況及意欲目的而有所變化。在某些實施例中，醫藥配方包括2%至10% (w/v)、3%至10% (w/v)、4%至10% (w/v)、5%至10% (w/v)、6%至10% (w/v)、7%至10% (w/v)、8%至10% (w/v)、9%至10% (w/v)、2%至9% (w/v)、3%至9% (w/v)、4%至9% (w/v)、5%至9% (w/v)、6%至9% (w/v)、7%至9% (w/v)、8%至9% (w/v)、2%至8% (w/v)、3%至8% (w/v)、4%至8% (w/v)、5%至8% (w/v)、6%至8% (w/v)、7%至8% (w/v)、2%至7% (w/v)、3%至7% (w/v)、4%至7% (w/v)、5%至7% (w/v)、6%至7% (w/v)、2%至6% (w/v)、3%至6% (w/v)、4%至6% (w/v)、5%至6% (w/v)、2%至5% (w/v)、3%至5% (w/v)、4%至5% (w/v)、2%至4% (w/v)、3%至4% (w/v)、或2%至3% (w/v)的糖或糖醇。
配方內含有的糖或糖醇之量可取決於使用配方之特定情況及意欲目的而有所變化。在某些實施例中，醫藥配方包括170 mM至180 mM、170.5至179.5、171 mM至179 mM、171.5至178.5、172 mM至178 mM、172.5至177.5、173 mM至177 mM、173.5至176.5、174 mM至176 mM之濃度的蔗糖。在某些實施例中，醫藥配方包括約170 mM、約172.5 mM、約175 mM、約177. mM 5、或約180 mM蔗糖。在某些實施例中，醫藥配方包括約175.2 mM蔗糖。
在某些實施例中，醫藥配方係等張的。「等張(isotonic)」配方係具有與人體血液基本上相同的滲透壓之配方。等張配方通常具有約250至350 mOsmol/kgH 2O之滲透壓。可使用蒸氣壓或冰凍(ice-freezing)型滲透壓計測量等張性。在某些實施例中，醫藥組成物或醫藥配方之滲透壓係250至350 mOsmol/kgH 2O。在某些實施例中，醫藥組成物或醫藥配方之滲透壓係300至350 mOsmol/kgH 2O。醫藥配方中可包括諸如糖、糖醇、及NaCl之物質，以達所欲滲透壓。
在某些實施例中，可添加「增積劑(bulking agent)」。「增積劑」係一種化合物，其將質量添加至凍乾混合物並促成凍乾餅(lyophilized cake)之物理結構（例如，促進產生基本上均勻的凍乾餅，其維持開孔結構）。說明性增積劑包括甘露醇、甘胺酸、聚乙二醇、及山梨醇。本申請案所述之多特異性結合蛋白之凍乾配方可含有此類增積劑。防腐劑減少細菌作用，且可例如促進多次使用（多劑量）配方之產生。
可以可選地將防腐劑添加至本文之配方中以減少細菌作用。例如，防腐劑之添加可促進多次使用（多劑量）配方之產生。
在某些實施例中，凍乾藥品可用水性載劑回溶。本文所關注之水性載劑係醫藥上可接受的（例如，對於投予至人類而言安全且無毒性）且可用於製備液體配方（在凍乾之後）。說明性稀釋劑包括無菌注射用水(SWFI)、抑菌注射用水(BWFI)、pH緩衝溶液（例如磷酸鹽緩衝鹽水）、無菌鹽水溶液、林格氏液、或右旋糖溶液。
在某些實施例中，將凍乾藥品用無菌注射用水(USP) (SWFI)或0.9%氯化鈉注射液(USP)回溶。在回溶期間，凍乾粉末溶解成溶液。
在某些實施例中，將凍乾蛋白質產物回溶至約4.5 mL注射用水，並用0.9%鹽水溶液（氯化鈉溶液）稀釋。 例示性配方
在一些實施例中，本揭露之醫藥配方包括多特異性結合蛋白、及下列中之一或多者：檸檬酸鹽；糖或糖醇；及聚山梨醇酯（pH 6.0至7.0）。在一些實施例中，本揭露之醫藥配方包括多特異性結合蛋白、檸檬酸鹽、糖或糖醇、及聚山梨醇酯（pH 6.0至7.0）。本揭露亦提供以上配方中之任一者，其進一步包括下列中之一或多者：(a)檸檬酸鹽、(b)糖或糖醇、及(c)聚山梨醇酯。
在一些實施例中，本揭露提供基本上由下列所組成之配方：(a)如本文所述之多特異性蛋白、(b)檸檬酸鹽、(c)糖或糖醇、及(d)聚山梨醇酯。該配方中之各組分之濃度可係如本揭露所述之濃度或範圍中之任一者。
在一些實施例中，醫藥配方中多特異性結合蛋白之濃度係1 mg/mL至125 mg/mL、2 mg/mL至100 mg/mL、5 mg/mL至50 mg/mL、5 mg/mL至20 mg/mL、或10 mg/mL至20 mg/mL。在一些實施例中，醫藥配方中多特異性結合蛋白之濃度係約15 mg/mL。在一些實施例中，在向對象投予前，將配方用合適的稀釋劑以1:0至1:10之範圍稀釋。在一些實施例中，醫藥配方中檸檬酸鹽之濃度係15 mM至25 mM或17.5 mM至22.5 mM。在一些實施例中，本揭露之醫藥配方含有約20 mM檸檬酸鹽。在一些實施例中，配方亦含有糖。在一些實施例中，糖係蔗糖。在一些實施例中，蔗糖之濃度係170 mM至180 mM或172.5 mM至177.5 mM。在一些實施例中，蔗糖之濃度係約175.2 mM。在一些實施例中，配方包括聚山梨醇酯，且聚山梨醇酯係80。在一些實施例中，聚山梨醇酯80之濃度係0.05 mg/m:至0.15 mg/mL。在一些實施例中，聚山梨醇酯80之濃度係約0.1 mg/mL。在一些實施例中，配方之pH係6.2至6.8或6.4至6.6。在一些實施例中，配方之pH係約6.5。在一些實施例中，配方含有：(a) 5 mg/mL至50 mg/mL的多特異性結合蛋白、(b) 15 mM至25 mM檸檬酸鹽、(c) 170 mM至180 mM蔗糖、及(d) 0.05 mg/mL至0.15 mg/mL聚山梨醇酯80。在一些實施例中，配方係在pH 6.2至6.8下。在一些實施例中，配方含有：(a) 10 mg/mL至20 mg/mL的多特異性結合蛋白、(b) 17.5 mM至22.5 mM檸檬酸鹽、(c) 172.5至177.5 mM蔗糖、及0.05 mg/mL至0.15 mg/mL聚山梨醇酯80。在一些實施例中，配方係在pH 6.4至6.6下。在一些實施例中，配方含有：(a) 15 mg/mL的多特異性結合蛋白、(b) 20 mM檸檬酸鹽、(c) 175.2 mM檸檬酸鹽、及(d) 0.1 mg/mL聚山梨醇酯80。在一些實施例中，配方係在約pH 6.5下。
在一些實施例中，醫藥配方中多特異性結合蛋白之濃度係1 mg/mL至125 mg/mL、2 mg/mL至100 mg/mL、5 mg/mL至50 mg/mL、5 mg/mL至20 mg/mL、或10 mg/mL至20 mg/mL。在一些實施例中，醫藥配方中多特異性結合蛋白之濃度係約15 mg/mL。在一些實施例中，在向對象投予前，將配方用合適的稀釋劑以1:0至1:10之範圍稀釋。在一些實施例中，醫藥配方中檸檬酸鹽之濃度係15 mM至25 mM或17.5 mM至22.5 mM。在一些實施例中，本揭露之醫藥配方含有約20 mM檸檬酸鹽。在一些實施例中，配方亦含有糖。在一些實施例中，糖係蔗糖。在一些實施例中，蔗糖之濃度係170 mM至180 mM或172.5 mM至177.5 mM。在一些實施例中，蔗糖之濃度係約175.2 mM。在一些實施例中，配方包括聚山梨醇酯，且聚山梨醇酯係聚山梨醇酯80。在一些實施例中，聚山梨醇酯80之濃度係0.005%至0.05% (w/v)或0.0075%至0.025% (w/v)。在一些實施例中，聚山梨醇酯80之濃度係約0.01% (w/v)。在一些實施例中，配方之pH係6.2至6.8或6.4至6.6。在一些實施例中，配方之pH係約6.5。在一些實施例中，配方含有：(a) 5 mg/mL至50 mg/mL的多特異性結合蛋白、(b) 15 mM至25 mM檸檬酸鹽、(c) 170 mM至180 mM蔗糖、及0.005%至0.05% (w/v)聚山梨醇酯80。在一些實施例中，配方係在pH 6.2至6.8下。在一些實施例中，配方含有：(a) 10 mg/mL至20 mg/mL的多特異性結合蛋白、(b) 17.5 mM至22.5 mM檸檬酸鹽、(c) 172.5 mM至177.5 mM蔗糖、及0.0075%至0.025% (w/v)聚山梨醇酯80。在一些實施例中，配方係在pH 6.4至6.6下。在一些實施例中，配方含有：(a) 15 mg/mL的多特異性結合蛋白、(b) 20 mM檸檬酸鹽、(c) 175.2 mM蔗糖、及(d) 0.01% (w/v)聚山梨醇酯80。在一些實施例中，配方係在約pH 6.5下。
在一些實施例中，本揭露之醫藥配方係包含在小瓶中。因此，在一些實施例中，本文提供小瓶，其包含：a)如本文所述之多特異性結合蛋白；b)緩衝劑，其包含檸檬酸鹽；c)蔗糖；及d)聚山梨醇酯。此類小瓶可包含醫藥配方，該醫藥配方具有如本文所述之某些組分及性質，包括例如其中醫藥配方之pH係在6.0至7.0之間、或約6.5。在一些實施例中，小瓶包含一定量的多特異性結合蛋白，諸如100 mg至200 mg的多特異性結合蛋白或約150 mg的多特異性結合蛋白。在一些實施例中，小瓶包含一定量的檸檬酸鈉，諸如50 mg至60 mg的檸檬酸鈉或約55.5 mg的檸檬酸鈉。在一些實施例中，小瓶包含一定量的檸檬酸，諸如1.5 mg至3 mg的檸檬酸或約2.3 mg的檸檬酸。在一些實施例中，小瓶包含一定量的蔗糖，諸如500 mg至700 mg的蔗糖或約600 mg的蔗糖。在一些實施例中，小瓶包含一定量的聚山梨醇酯80，諸如0.5 mg至1.5 mg的聚山梨醇酯80或約1 mg的聚山梨醇酯80。在一些實施例中，小瓶包含一定體積的醫藥組成物，諸如約10 mL的醫藥配方。 多特異性結合蛋白之穩定性
本文所揭示之醫藥配方展現出高水平的穩定性。在定義條件下儲存之後，當配方內之多特異性結合蛋白保留可接受的物理性質、化學結構、及/或生物功能時，醫藥配方係穩定的。
可藉由判定配方中多特異性結合蛋白在定義溫度下儲存定義時間之後仍保持天然構形的百分比，測量穩定性。呈天然構形之蛋白質的百分比可例如藉由粒徑篩析層析法（例如粒徑篩析高效液相層析法）判定，其中呈天然構形之蛋白質並未聚集（洗提於高分子量流份中）或降解（洗提於低分子量流份中）。在某些實施例中，在30℃下培養28天之後，多於90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的多特異性結合蛋白具有天然構形，如藉由粒徑篩析層析法所判定。在某些實施例中，在40℃下培養28天之後，多於90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的多特異性結合蛋白具有天然構形，如藉由粒徑篩析層析法所判定。在某些實施例中，在50℃下培養28天之後，多於90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%的多特異性結合蛋白具有天然構形，如藉由粒徑篩析層析法所判定。
亦可藉由判定存在於較酸性流份中之多特異性結合蛋白（「酸性形式」）相對於蛋白質之主要流份（「主要電荷形式」）的百分比，測量穩定性。儘管不希望受理論束縛，蛋白質的脫醯胺化可造成其變得更帶負電，因而相對於非脫醯胺化蛋白質更具酸性（參見例如Robinson, Protein Deamidation, (2002) PNAS 99(8):5283-88）。蛋白質之酸性形式的百分比可藉由離子交換層析法（例如陽離子交換高效液相層析法）或成像毛細管等電聚焦(imaged capillary isoelectric focusing, icIEF)判定。在某些實施例中，在30℃下培養28天之後，醫藥配方中之至少50%、60%、70%、80%、或90%的多特異性結合蛋白係呈主要電荷（中性）形式。在某些實施例中，在40℃下培養28天之後，醫藥配方中之至少50%、60%、70%、80%、或90%的多特異性結合蛋白係呈主要電荷（中性）形式。在某些實施例中，在50℃下培養28天之後，醫藥配方中之至少15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、或90%的多特異性結合蛋白係呈主要電荷（中性）形式。
在一些實施例中，醫藥配方在室溫下穩定至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少1年、至少1.5年、或至少2年。在一些實施例中，醫藥配方在-80℃下穩定至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少1年、至少1.5年、或至少2年。在一些實施例中，醫藥配方在-20℃下穩定至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少1年、至少1.5年、或至少2年。在一些實施例中，醫藥配方在-5℃下穩定至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少1年、至少1.5年、或至少2年。在一些實施例中，醫藥配方在冷藏溫度下穩定至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月、至少7個月、至少8個月、至少9個月、至少10個月、至少11個月、至少1年、至少1.5年、或至少2年。
如本文中所使用，「室溫(room temperature)」係溫度，其係指如所屬技術領域中具有通常知識者所理解之環境溫度。例如，室溫可包括10至30℃或20至25℃。例如，室溫包括但不限於10至30℃、15至30℃、20至30℃、25至30℃、10至25℃、15至25℃、20至25℃、10至20℃、15至20℃、或10至15℃。
如本文中所使用，「冷藏溫度(refrigerated temperature)」係等於或低於4℃的溫度。例如，冷藏溫度包括但不限於2至4℃、1至4℃、0至4℃、-2至4℃、-3至4℃、-4至4℃、或-5至4℃。 劑型
醫藥配方可作為液體配方或凍乾形式製備並儲存。在某些實施例中，醫藥配方係在2至8℃（例如4℃）下儲存的液體配方、或在-20℃或更低溫度下儲存的冷凍配方。配方中之糖或糖醇係用作凍乾保護劑。
在醫藥使用前，可將醫藥配方稀釋於適當緩衝劑或稀釋劑中。在一些實施例中，可將醫藥配方稀釋於下列中：15 mM至25 mM檸檬酸鹽（例如15 mM至25 mM、16 mM至25 mM、17 mM至25 mM、18 mM至25 mM、19 mM至25 mM、20 mM至25 mM、21 mM至25 mM、22 mM至25 mM、23 mM至25 mM、24 mM至25 mM、15 mM至24 mM、15 mM至23 mM、15 mM至22 mM、15 mM至23 mM、15 mM至22 mM、15 mM至21 mM、15 mM至20 mM、15 mM至19 mM、15 mM至18 mM、15 mM至17 mM、15 mM至16 mM、或約20 mM）；170 mM至180 mM蔗糖（例如170.5至179.5、171 mM至179 mM、171.5至178.5、172 mM至178 mM、172.5至177.5、173 mM至177 mM、173.5至176.5、174 mM至176 mM）（pH 6.2至6.8）。在一些實施例中，可將醫藥配方稀釋於下列中：20 mM檸檬酸鹽；約175.2 mM蔗糖；及0.01% (w/v)聚山梨醇酯80 (pH 6.5)。在一些實施例中，在向對象投予前，可將醫藥配方用合適的稀釋劑以1:0、1:1、1:1.5、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:8、1:10、1:15、1:20、1:25、1:50、或1:100之範圍稀釋。
在替代實施例中，可將醫藥配方稀釋且/或回溶於適用於投予途徑之水性載劑中。其他例示性載劑包括無菌注射用水(SWFI)、抑菌注射用水(BWFI)、pH緩衝溶液（例如磷酸鹽緩衝鹽水）、無菌鹽水溶液、林格氏液、或右旋糖溶液。例如，當製備用於靜脈內投予時，可將醫藥配方稀釋於0.9%氯化鈉(NaCl)溶液中。在某些實施例中，稀釋醫藥配方係等張的，且適用於藉由靜脈內輸注投予。
醫藥配方包括濃度適用於儲存的多特異性結合蛋白。在某些實施例中，醫藥配方包括下列濃度的多特異性結合蛋白：1 mg/ml至200 mg/ml、2 mg/ml至200 mg/ml、5 mg/ml至200 mg/ml、7.5 mg/ml至200 mg/ml、10 mg/ml至200 mg/ml、12.5 mg/ml至200 mg/ml、15 mg/ml至200 mg/ml、20 mg/ml至200 mg/ml、25 mg/ml至200 mg/ml、50 mg/ml至200 mg/ml、75 mg/ml至200 mg/ml、100 mg/ml至200 mg/ml、125 mg/ml至200 mg/ml、150 mg/ml至200 mg/ml、175 mg/ml至200 mg/ml、1 mg/ml至150 mg/ml、2 mg/ml至150 mg/ml、5 mg/ml至150 mg/ml、7.5 mg/ml至150 mg/ml、10 mg/ml至150 mg/ml、12.5 mg/ml至150 mg/ml、15 mg/ml至150 mg/ml、20 mg/ml至150 mg/ml、25 mg/ml至150 mg/ml、50 mg/ml至150 mg/ml、75 mg/ml至150 mg/ml、100 mg/ml至150 mg/ml、125 mg/ml至150 mg/ml、1 mg/ml至100 mg/ml、2 mg/ml至100 mg/ml、5 mg/ml至100 mg/ml、7.5 mg/ml至100 mg/ml、10 mg/ml至100 mg/ml、12.5 mg/ml至100 mg/ml、15 mg/ml至100 mg/ml、20 mg/ml至100 mg/ml、25 mg/ml至100 mg/ml、50 mg/ml至100 mg/ml、75 mg/ml至100 mg/ml、1 mg/ml至50 mg/ml、2 mg/ml至50 mg/ml、5 mg/ml至50 mg/ml、7.5 mg/ml至50 mg/ml、10 mg/ml至50 mg/ml、12.5 mg/ml至50 mg/ml、15 mg/ml至50 mg/ml、20 mg/ml至50 mg/ml、25 mg/ml至50 mg/ml、1 mg/ml至25 mg/ml、2 mg/ml至25 mg/ml、5 mg/ml至25 mg/ml、7.5 mg/ml至25 mg/ml、10 mg/ml至25 mg/ml、12.5 mg/ml至25 mg/ml、15 mg/ml至25 mg/ml、20 mg/ml至25 mg/ml、1 mg/ml至20 mg/ml、2 mg/ml至20 mg/ml、5 mg/ml至20 mg/ml、7.5 mg/ml至20 mg/ml、10 mg/ml至20 mg/ml、12.5 mg/ml至20 mg/ml、或15 mg/ml至20 mg/ml。
在某些實施例中，將醫藥配方包裝於容器（例如小瓶、注射袋、注射筆、或注射器）中。在某些實施例中，配方可係凍乾配方或液體配方。在某些實施例中，容器中之多特異性結合蛋白之量係適用於以單次劑量投予。在某些實施例中，容器中之多特異性結合蛋白之量係適用於多次劑量投予。在某些實施例中，醫藥配方包括量為0.1至2000 mg的多特異性結合蛋白。在某些實施例中，醫藥配方包括量為1至2000 mg、10至2000 mg、20至2000 mg、50至2000 mg、100至2000 mg、200至2000 mg、500至2000 mg、1000至2000 mg、0.1至1000 mg、1至1000 mg、10至1000 mg、20至1000 mg、50至1000 mg、100至1000 mg、200至1000 mg、500至1000 mg、0.1至500 mg、1至500 mg、10至500 mg、20至500 mg、50至500 mg、100至500 mg、200至500 mg、0.1至200 mg、1至200 mg、10至200 mg、20至200 mg、50至200 mg、100至200 mg、0.1至100 mg、1至100 mg、10至100 mg、20至100 mg、50至100 mg、0.1至50 mg、1至50 mg、10至50 mg、20至50 mg、0.1至20 mg、1至20 mg、10至20 mg、0.1至10 mg、1至10 mg、或0.1至1 mg的多特異性結合蛋白。在某些實施例中，醫藥配方包括量為0.1 mg、1 mg、2 mg、5 mg、10 mg、15 mg、20 mg、25 mg、30 mg、35 mg、40 mg、45 mg、50 mg、60 mg、70 mg、80 mg、90 mg、100 mg、150 mg、200 mg、250 mg、300 mg、400 mg、500 mg、600 mg、700 mg、800 mg、900 mg、1000 mg、1500 mg、或2000 mg的多特異性結合蛋白。在某些實施例中，約10 mL的醫藥配方包含約150 mg的多特異性結合蛋白。
本申請案所述之多特異性結合蛋白之醫藥組成物中活性成分之實際劑量水平可有所變化，以獲得活性成分之量，其有效達成針對特定患者、組成物、及投予模式之所欲治療反應，而對患者不具毒性。
具體劑量可係用於各患者之統一劑量，例如50至5000 mg的蛋白質。替代地，可根據患者之大概體重或表面積訂製患者之劑量。判定適當劑量之其他因子可包括待治療或預防之疾病或病況、疾病之嚴重性、投予途徑、及患者之年齡、性別、及醫療狀況。判定適當治療劑量所需之計算的進一步精細化係由所屬技術領域中具有通常知識者常規進行，尤其是鑑於本文所揭示之劑量資訊及檢定。劑量亦可透過使用已知檢定判定，該等已知檢定係用於判定與適當劑量反應數據結合使用的劑量。可隨著監測疾病進展調整個別患者之劑量。可測量患者中可靶向構築體或複合物之血液水平，以了解劑量是否需要調整以達到或維持有效濃度。可使用藥物基因體學，以判定哪種可靶向構築體及/或複合物、及其劑量最有可能對給定個體有效(Schmitz et al., Clinica Chimica Acta308: 43-53, 2001; Steimer et al., Clinica Chimica Acta308: 33-41, 2001)。
大致上，基於體重之劑量係每kg體重約0.01 µg至約100 mg，諸如約0.01 µg至約100 mg/kg體重、約0.01 µg至約50 mg/kg體重、約0.01 µg至約10 mg/kg體重、約0.01 µg至約1 mg/kg體重、約0.01 µg至約100 µg/kg體重、約0.01 µg至約50 µg/kg體重、約0.01 µg至約10 µg/kg體重、約0.01 µg至約1 µg/kg體重、約0.01 µg至約0.1 µg/kg體重、約0.1 µg至約100 mg/kg體重、約0.1 µg至約50 mg/kg體重、約0.1 µg至約10 mg/kg體重、約0.1 µg至約1 mg/kg體重、約0.1 µg至約100 µg/kg體重、約0.1 µg至約10 µg/kg體重、約0.1 µg至約1 µg/kg體重、約1 µg至約100 mg/kg體重、約1 µg至約50 mg/kg體重、約1 µg至約10 mg/kg體重、約1 µg至約1 mg/kg體重、約1 µg至約100 µg/kg體重、約1 µg至約50 µg/kg體重、約1 µg至約10 µg/kg體重、約10 µg至約100 mg/kg體重、約10 µg至約50 mg/kg體重、約10 µg至約10 mg/kg體重、約10 µg至約1 mg/kg體重、約10 µg至約100 µg/kg體重、約10 µg至約50 µg/kg體重、約50 µg至約100 mg/kg體重、約50 µg至約50 mg/kg體重、約50 µg至約10 mg/kg體重、約50 µg至約1 mg/kg體重、約50 µg至約100 µg/kg體重、約100 µg至約100 mg/kg體重、約100 µg至約50 mg/kg體重、約100 µg至約10 mg/kg體重、約100 µg至約1 mg/kg體重、約1 mg至約100 mg/kg體重、約1 mg至約50 mg/kg體重、約1 mg至約10 mg/kg體重、約10 mg至約100 mg/kg體重、約10 mg至約50 mg/kg體重、約50 mg至約100 mg/kg體重。
劑量可每天、每週、每月、或每年給予一次或多次，或甚至每2至20年給予一次。在一些實施例中，一或多次投予劑量係在約50 µg/kg/週至約20 mg/kg/週之範圍內，例如約100 µg/kg/週至約12 mg/kg/週，例如約100 µg/kg/週至約6 mg/kg/週，例如約100 µg/kg/週至約3 mg/kg/週。在一些實施例中，投予約50 µg/kg/週之一或多次劑量。在一些實施例中，投予約100 µg/kg/週之一或多次劑量。在一些實施例中，投予約300 µg/kg/週之一或多次劑量。在一些實施例中，投予約1 mg/kg/週之一或多次劑量。在一些實施例中，投予約3 mg/kg/週之一或多次劑量。在一些實施例中，投予約6 mg/kg/週之一或多次劑量。在一些實施例中，投予約12 mg/kg/週之一或多次劑量。在一些實施例中，投予約20 mg/kg/週之一或多次劑量。
所屬技術領域中具有通常知識者可基於體液或組織中可靶向構築體或複合物之測量滯留時間及濃度，容易地評估給藥之重複率。本申請案所述之多特異性結合蛋白的投予可係靜脈內、動脈內、腹膜內、肌內、皮下、胸膜內、鞘内(intrathecal)、腔內、藉由透過導管之灌注、或藉由直接病灶內注射。此可每天投予一次或多次、每週投予一次或多次、每月投予一次或多次、及每年投予一次或多次。
本文所述之醫藥配方的投予可係靜脈內、動脈內、腹膜內、肌內、皮下、胸膜內、鞘内(intrathecal)、腔內、藉由透過導管之灌注、或藉由直接病灶內注射。
在實施例中，將如本申請案所述之多特異性結合蛋白調配成液體配方。液體配方可以10 mg/mL濃度存在於USP / Ph Eur I型50R小瓶中，小瓶用橡膠塞閉合並用鋁製捲曲密封蓋(aluminum crimp seal closure)密封。塞可由彈性體（符合USP及Ph Eur）製成。在某些實施例中，小瓶可填充有61.2 mL的蛋白質產物溶液，以提供60 mL之可抽出量。在某些實施例中，液體配方可用0.9%鹽水溶液稀釋。
在某些實施例中，可將如本申請案所述之液體配方製備為10 mg/mL濃度溶液，其與糖以穩定水平組合。在某些實施例中，可將液體配方製備於水性載劑中。在某些實施例中，可添加穩定劑，其量不大於可導致對靜脈內投予而言非所欲或不適合的黏度的量。在某些實施例中，糖可係雙醣，例如蔗糖。在某些實施例中，液體配方亦可包括緩衝劑、界面活性劑、及防腐劑中之一或多者。
在某些實施例中，液體配方之pH可藉由添加醫藥上可接受之酸及/或鹼設定。在某些實施例中，醫藥上可接受之酸可係鹽酸。在某些實施例中，鹼可係氫氧化鈉。
除了聚集之外，脫醯胺化係肽及蛋白質之常見產物變體，其可能在發酵、採集/細胞澄清(cell clarification)、純化、原料藥/藥品儲存期間、及樣本分析期間發生。脫醯胺化係自蛋白質損失NH 3，形成琥珀醯亞胺中間物，其可經歷水解。琥珀醯亞胺中間物導致親本肽質量的17道耳頓質量減少。後續水解導致18道耳頓質量增加。由於在水性條件下的不穩定性，琥珀醯亞胺中間物難以單離。因此，脫醯胺化一般可在1道耳頓質量增加時偵測到。天冬醯胺酸之脫醯胺化產生天冬胺酸或異天冬胺酸。影響脫醯胺化速率的參數包括pH、溫度、溶劑介電常數、離子強度、一級序列、局部多肽構形、及三級結構。肽鏈中相鄰於Asn之胺基酸殘基影響脫醯胺化速率。蛋白質序列中Asn後之Gly及Ser導致更易於發生脫醯胺化。
在某些實施例中，如本申請案所述之液體配方可在pH及濕度之條件下保存，以預防蛋白質產物之脫胺。
本文所關注之水性載劑係醫藥上可接受（對於投予至人類而言安全且無毒性）且可用於製備液體配方者。說明性載劑包括無菌注射用水(SWFI)、抑菌注射用水(BWFI)、pH緩衝溶液（例如磷酸鹽緩衝鹽水）、無菌鹽水溶液、林格氏液、或右旋糖溶液。
可以可選地將防腐劑添加至本文所述之配方中以減少細菌作用。例如，防腐劑之添加可促進多次使用（多劑量）配方之產生。
靜脈內(IV)配方可係在特定情況下之投予途徑，諸如當患者在移植之後住院時經由IV途徑接受所有藥物。在某些實施例中，在投予之前，將液體配方用0.9%氯化鈉溶液稀釋。在某些實施例中，用於注射之稀釋藥品係等張的，且適用於藉由靜脈內輸注投予。
在某些實施例中，可以10 mM至200 mM之量添加鹽或緩衝組分。鹽及/或緩衝劑係醫藥上可接受的，且係衍生自各種已知酸（無機及有機）與「鹼形成」金屬或胺。在某些實施例中，緩衝劑可係磷酸鹽緩衝劑。在某些實施例中，緩衝劑可係甘胺酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽緩衝劑，在此情況下，鈉離子、鉀離子、或銨離子可作為相對離子。
如本申請案所述之多特異性結合蛋白可存在於凍乾配方中，凍乾配方包括蛋白質及凍乾保護劑。凍乾保護劑可係糖，例如雙醣。在某些實施例中，凍乾保護劑可係蔗糖或麥芽糖。凍乾配方亦可包括下列中之一或多者：緩衝劑、界面活性劑、增積劑、及/或防腐劑。
可用於穩定凍乾藥品的蔗糖或麥芽糖之量可呈至少1:2蛋白質與蔗糖或麥芽糖之重量比。在某些實施例中，蛋白質與蔗糖或麥芽糖重量比可係1:2至1:5。
在某些實施例中，在凍乾前，配方之pH可藉由添加醫藥上可接受之酸及/或鹼設定。在某些實施例中，醫藥上可接受之酸可係鹽酸。在某些實施例中，醫藥上可接受之鹼可係氫氧化鈉。
在凍乾之前，可將含有本揭露之蛋白質之溶液之pH調整在6至8之間。在某些實施例中，凍乾藥品之pH範圍可係7至8。
在某些實施例中，可以10 mM至200 mM之量添加鹽或緩衝組分。鹽及/或緩衝劑係醫藥上可接受的，且係衍生自各種已知酸（無機及有機）與「鹼形成」金屬或胺。在某些實施例中，緩衝劑可係磷酸鹽緩衝劑。在某些實施例中，緩衝劑可係甘胺酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽緩衝劑，在此情況下，鈉離子、鉀離子、或銨離子可作為相對離子。 套組
將本文所述之多特異性結合蛋白之配方製備為凍乾配方或液體配方。為了製備凍乾配方，將冷凍乾燥之多特異性結合蛋白滅菌並儲存於單次使用玻璃小瓶中。接著，將數個此類玻璃小瓶包裝於套組中，以用於將劑量遞送至經診斷患有癌症或腫瘤之對象。
在一個態樣中，本申請案提供一種套組，其包括一或多個容器，容器共同包括下列之配方：約10 mg、約20 mg、約30 mg、約40 mg、約50 mg、約60 mg、約70 mg、約80 mg、約90 mg、約100 mg、約120 mg、約130 mg、約140 mg、約150 mg、約200 mg、約300 mg、約400 mg、約500 mg、約600 mg、約700 mg、約800 mg、約900 mg、或約1 g的多特異性結合蛋白。在某些實施例中，本揭露提供一種套組，其包括一或多個容器，容器共同包括約150 mg的多特異性結合蛋白之配方。
在某些實施例中，製備配方，且將其包裝為液體配方，並以約為約100 mg/小瓶至200 mg/小瓶（例如110 mg/小瓶至190 mg/小瓶、120 mg/小瓶至180 mg/小瓶、130 mg/小瓶至170 mg/小瓶、或140 mg/小瓶至160 mg/小瓶）儲存。在某些實施例中，配方係以約為約100 mg/小瓶、約110 mg/小瓶、約120 mg/小瓶、約130 mg/小瓶、約140 mg/小瓶、約150 mg/小瓶、約160 mg/小瓶、約170 mg/小瓶、約180 mg/小瓶、約190 mg/小瓶、或約200 mg/小瓶儲存。在某些實施例中，配方係液體配方，並以約150 mg/小瓶儲存。
在某些實施例中，製備配方，且將其包裝為凍乾配方，並以約為約100 mg/小瓶至200 mg/小瓶（例如110 mg/小瓶至190 mg/小瓶、120 mg/小瓶至180 mg/小瓶、130 mg/小瓶至170 mg/小瓶、或140 mg/小瓶至160 mg/小瓶）儲存。在某些實施例中，配方係以約為約100 mg/小瓶、約110 mg/小瓶、約120 mg/小瓶、約130 mg/小瓶、約140 mg/小瓶、約150 mg/小瓶、約160 mg/小瓶、約170 mg/小瓶、約180 mg/小瓶、約190 mg/小瓶、或約200 mg/小瓶儲存。在某些實施例中，配方係液體配方，並以約150 mg/小瓶儲存。
在某些實施例中，容器中之配方可係凍乾配方。在某些實施例中，容器中之配方可係液體配方。
在某些實施例中，配方可包裝於套組中，套組含有合適數目的小瓶。可包括關於藥物的資訊，其係根據核准之提交文件。套組可在運輸冷卻容器（2℃至8℃）中運送，運輸冷卻容器係用溫度控制裝置監測。
配方可儲存在2℃至8℃下直到使用。配方之小瓶可係無菌且無熱原(nonpyrogenic)，且可不含有抑菌防腐劑。
以上描述提供本申請案所述之多特異性結合蛋白之多個態樣及實施例。
本專利申請案特別設想到態樣及實施例之所有組合及排列。本文中任何及所有實例、或例示性語言（例如「諸如(such as)」或「包括(including)」）之使用僅意欲更好地說明本申請案所述之多特異性結合蛋白，且不對本揭露之範疇作出限制，除非如此明確陳述。不應將本說明書中之語言解讀為指示任何未請求保護之元件實行本申請案所述之多特異性結合蛋白所必需的。 實例
以下實例僅係說明性，且不意欲以任何方式限制本申請案所述之多特異性結合蛋白之範疇或內容。 實例1 – 評估TriNKET ® 與細胞所表現之人類5T4 之結合 5T4 結合mAb 之產生及表徵
此實例描述來自抗體發現活動(antibody discovery campaign)之5T4之新識別的結合體。選擇一種結合體(AB1002-scFv)進行進一步開發，且表徵於下。 5T4抗體產生
從131種結合至重組人類5T4-His之融合瘤抗體開始，選擇5T4特異性抗體。其中，發現113種結合至細胞表面上之人類5T4 (h5T4)。自此，藉由表面電漿共振(SPR)，78個殖株顯示與人類5T4之結合。藉由SPR，62個殖株顯示與恆河猴(rhesus) 5T4 (r5T4)之結合。15個殖株結合至h5T4及r5T4的程度同樣好並滿足親和力標準。此等研究識別鼠類10F10為展示適用於生物製劑藥物候選者之性質的結合體。亦將額外鼠類結合體11F09及08E06識別為具有所欲特徵，且將鼠類05H04識別為具有所欲特徵之子集（儘管缺乏與食蟹獼猴5T4之結合）。 殖株08E06之親和力成熟
為了搜尋結合親和力改善的殖株08E06之變體，藉由使CDRH3殘基(GGYLWFAY (SEQ ID NO:188)突變，建立酵母菌展示親和力成熟庫。為富集對人類5T4 (h5T4)具有較高親和力之scFv，用1 nM的生物素化h5T4-R-hFc-His進行兩輪選擇。比較在親本殖株08E06與代表性個別庫殖株之間的親和力，並執行多輪FACS。
CDRH3為主之親和力成熟研究的結果展示親和力改善，且進一步改善係高度所欲的。因此，選擇CDRH1及CDRH2序列用於親和力成熟（CDRH1：GYTFTSY (SEQ ID NO:186)及CDRH2：DSSDSK (SEQ ID NO:187)），其使用成熟CDRH3骨架。目標係工程改造並選擇結合體，該等結合體之親和力較上述親本殖株(08E06 scFv)或CDRH3最佳化變體改善。此建立具有隨機CDRH1及CDRH2之庫，同時保留最佳化CDRH3。執行多輪FACS，以富集h5T4之高親和力結合體。自此等程序總共獲得53個親和力成熟殖株。殖株08E06之所選所得親和力成熟變體之CDR序列係顯示於 表 12中。 表12.殖株08E06之親和力成熟變體
殖株 CDRH1 CDRH2 CDRH3
08E06 GYTFTSY (SEQ ID NO:186) DSSDSK (SEQ ID NO:187) GGYLWFAY (SEQ ID NO:188)
AB1558 GYTFGSY (SEQ ID NO:203) DASTEK (SEQ ID NO:204) GGYLWFQY (SEQ ID NO:205)
AB1566 GYLFTSY (SEQ ID NO:206) SVSDAK (SEQ ID NO:207) GGYLWFKY (SEQ ID NO:208)
AB1554 GYTFGSY (SEQ ID NO: 203) DARSAK (SEQ ID NO:209) GGYLWFKY(SEQ ID NO: 208)
AB1574 GYRFTSY (SEQ ID NO:210) DASSAK (SEQ ID NO:211) GGYLWFKY (SEQ ID NO: 208)
AB1579 GYGFTSY (SEQ ID NO:212) DARTAK (SEQ ID NO:213) GGYLWYAY (SEQ ID NO:214)
AB1540 GYTFTSY (SEQ ID NO: 186) DASDAK (SEQ ID NO:215) GGYLWYHY (SEQ ID NO:216)
AB1541 GYTFTSY (SEQ ID NO: 186) DASDAK (SEQ ID NO:215) GGYLWYSY (SEQ ID NO:217)
AB1552 GYTFTSY (SEQ ID NO: 186) DASDAK (SEQ ID NO:215) GGYLWYAY (SEQ ID NO:214)
AB1565 GYSFTSY (SEQ ID NO:218) DASDAK (SEQ ID NO:215) GGYLWFKY (SEQ ID NO: 208)
AB1534 GYTFTSY (SEQ ID NO: 186) DASDAK (SEQ ID NO:215) GGYLWFKY (SEQ ID NO: 208)
AB1573 GYGFTSY (SEQ ID NO:212) DARTAK (SEQ ID NO:213) GGHLWYAY (SEQ ID NO:219)
人源化及序列不利條件評估
將殖株10F10及11F09人源化為多個構架序列；此等人源化殖株之序列係提供於上表2中。將可能負面影響蛋白質表現、穩定性、或免疫原性的胺基酸用可解決此等問題的替代品置換。此等經推定不利條件校正之殖株之序列亦提供於上表2中。
最終選擇AB1002（鼠類10F10之人源化變體，具有VH T62S修正以置換稀有殘基T62）用於進一步發展。 表位定位(Epitope Mapping)
執行5T4結合體相對於參考5T4抗體的結合，以判定結合表位。將鼠類10F10及鼠類11F09之表位定位至富含白胺酸重複序列1 (LRR1)域中之5T4上。此外，將鼠類08E06之表位定位至富含白胺酸重複序列2 (LRR2)域中之5T4上。參見例如Zhao, et al., Structure(2014) 22(4):612-20。 表面電漿共振(SPR)
將10F10 (AB1002 scFv)轉換為包含5T4-scFv及兩個非5T4結合體之多特異性結合蛋白，以產出AB1310/AB1783-TriNKET ®。此外，將08E06以類似方式轉換為兩種多特異性結合蛋白（AB0063-TriNKET ®(VH-VL)及AB0064-TriNKET ®(VL-VH)）。以類似方式使用殖株05H04及11F09以產生多特異性結合蛋白。此等多特異性結合蛋白結合至5T4表現性細胞的能力係顯示於 圖 18A中。此外，此等多特異性結合蛋白誘導對5T4表現性細胞的NK細胞介導之細胞毒性的能力係顯示於 圖 18B及 圖 18C中。多特異性結合蛋白之細胞結合及細胞毒性分析的結果係彙總於 表 13中。 表13.候選多特異性結合蛋白之細胞結合及細胞毒性分析
殖株(F0) 細胞結合 細胞毒性
EC50 (nM) 最大值(FOB) EC50 (nM) 最大裂解(%)
5H04* 2.7 22.6 0.054 46
10F10 3.4 17.9 0.059 40
11F09 6.8 21.6 0.21 47
8E06 ＞12 - 0.51 35
藉由表面電漿共振(SPR)測量AB1310/AB1783-TriNKET ®與5T4之結合親和力。簡言之，在37℃之生理溫度下使用Biacore 8K儀器執行SPR。簡言之，將人類Fc特異性抗體以約8000至10000個共振單位(resonance unit, RU)之密度共價固定於CM5生物感測器晶片之羧基甲基右旋糖酐基質上，以建立抗hFc IgG晶片。將樣本以10 µL/min之流速注射於抗hFc IgG晶片上60秒。將蛋白質用運行緩衝劑以三倍稀釋進行連續稀釋（300 nM至0.14 nM），並以30 µl/min之流速注射於經捕捉之測試物品上。監測締合240至300秒，並監測解離300至900秒。將表面在週期之間再生，其以三次脈衝的10 mM甘胺酸-HCl (pH 1.7)以100 µL/min注射20秒。
SPR分析顯示AB1310/AB1783-TriNKET ®、AB0063-TriNKET ®、及AB0064-TriNKET ®對5T4具有高親和力（ 圖 19A 至圖19E）。此結合親和力係維持在較低pH (6.0)下，其代表腫瘤微環境（ 圖 19F）。亦檢定AB1310/AB1783-TriNKET ®與NKG2D及CD16A之結合（ 圖 19G及 圖 19H）。5T4-TriNKET ®與5T4之結合之SPR分析細節係顯示於 表 14及 表 15中，且AB1310/AB1783-TriNKET ®之與人類及食蟹獼猴5T4之比較性結合係顯示於 表 16中。 表14. AB1310/AB1783、AB0063、及AB0064 TriNKET ®對人類5T4之結合親和力
分子 pH k a(M -1s -1) k d(s -1) 動力學擬合K D(nM)
AB1310/AB1783-TriNKET ® 7.4 (1.3 ± 0.0) × 10 5 (7.7 ± 0.3) × 10 -4 6.1 ± 0.2
6.0 (1.2 ± 0.1) × 10 5 (1.2 ± 0.0) × 10 -3 9.4 ± 0.6
AB0064-TriNKET ® 7.4 1.56 × 10 5 2.49 × 10 -4 1.6
AB0063-TriNKET ® 7.4 1.28 × 10 5 2.42 × 10 -4 1.9
表15.AB1310/AB1783-TriNKET ®對人類5T4、NKG2D、及CD16a之結合親和力
目標 k a(M -1s -1) k d(s -1) 動力學擬合K D(nM)
人類5T4 (1.3 ± 0.0) × 10 5 (7.7 ± 0.3) × 10 -4 6.1 ± 0.2
人類NKG2D (2.4 ± 0.1) × 10 5 (8.8 ± 0.0) × 10 -2 369.5 ± 9.2
人類CD16aV (1.5 ± 0.0) × 10 5 (1.7 ± 0.1) × 10 -2 111.8 ± 4.0
表16.AB1310/AB1783-TriNKET ®在SPR檢定中之結合親和力
物種 K D5T4 (nM)
人類 6.2 ± 0.4
食蟹獼猴 8.3 ± 2.2
評估特異性及細胞誘導之細胞毒性
進行研究，以評估5T4靶向TriNKET ®與細胞表面上表現之5T4之結合親和力。使用KYSE-30及H292人類癌細胞系，其分別衍生自食道鱗狀細胞癌及非小細胞肺癌。相較於H292細胞上所發現的，KYSE-30細胞表現較高水平的表面5T4。簡言之，將腫瘤細胞與5T4-TriNKET ®或5T4-mAb在4℃下培養1小時。在培養之後，使用螢光團接合抗人類IgG二級抗體，偵測TriNKET ®及mAb與5T4+細胞之結合模式。藉由流式細胞術分析細胞，且記述相對於僅二級對照組之MFI倍數。此外，使用相同規程，以評估5T4-TriNKET ®與5T4表現性初代肺癌相關纖維母細胞之結合。
圖20A、 圖 20B、 圖 22A、及 圖 22B顯示在與5T4-TriNKET ®或5T4-mAb培養之後與5T4陽性目標細胞之結合。TriNKET ®以較高量值結合於KYSE-30細胞（其較H292細胞表現較大水平的表面5T4）上。5T4靶向TriNKET ®以個位數nM濃度結合細胞，且具有較5T4-mAb高的最大結合。此外，觀察到5T4-TriNKET ®與初代癌相關纖維母細胞之穩健結合。相比之下，AB1310/AB1783-TriNKET ®及親本單株抗體(10F10)皆未顯示與5T4 -細胞系H2712之結合（ 圖 20C）。
進行研究，以評估5T4靶向TriNKET ®介導免疫效應細胞對5T4表現性癌細胞之細胞毒性的能力。簡言之，使用密度梯度離心，自人類周邊血液血沉棕黃層(buffy coat)單離周邊血液單核細胞(PBMC)。洗滌並準備經單離PBMC，以用於NK或CD8+細胞單離。使用負向選擇技術用磁珠單離NK細胞，且經單離NK細胞之純度一般係＞90% CD3-CD56+。將經單離NK細胞在培養基（沒有補充細胞介素）中靜置過夜，隔天將其用於細胞毒性檢定中。使用負向選擇技術用磁珠單離CD8+，且CD8+細胞之純度一般係＞90% CD3+CD56-CD8+。將經單離CD8+ T細胞在培養基（具有IL-15）中培養10天，以進行擴增。
針對細胞毒性檢定，自培養物採集表現5T4之人類癌細胞系或初代癌相關纖維母細胞，將細胞用HBS洗滌，並以10 6/mL再懸浮於生長培養基中，以用BATDA試劑(Perkin Elmer AD0116)標示。依循製造商說明標示目標細胞。在標示之後，將細胞用HBS洗滌3x，並以0.5至1.0×10 5/mL再懸浮於培養基中。為了製備背景孔，將經標示細胞之等分試樣放置一邊，且將細胞自培養基中離心出來。將100 µL的培養基以三重複小心地添加至孔中，以避免干擾沉澱細胞(pelleted cell)。將100 µL的經BATDA標示細胞添加至96孔盤之各孔中。保留孔用於自目標細胞的自發釋放，且準備孔用於目標細胞的最大裂解（藉由添加1% Triton-X）。將抗5T4之單株抗體（亦即5T4-mAb）或TriNKET ®（亦即5T4-TriNKET ®）稀釋於培養基中，且將50 µL的稀釋mAb或TriNKET ®添加至各孔中。自培養物採集靜置NK細胞，將細胞洗滌，並取決於所欲效應目標(E:T)比，以10 5至2.0×10 6個細胞/mL再懸浮於培養基中。將50 µL的NK細胞懸浮液添加至盤之各孔中，以使總培養物體積為200 µL。將盤在37℃及5% CO 2下培養2至3小時，之後開發檢定。
在培養2至3小時之後，將盤自培養箱移除，且藉由以200 g離心5分鐘使細胞沉澱。將20 µL的培養物上清液轉移至製造商所提供之乾淨微量盤，且將200 µL的室溫銪溶液添加至各孔中。將盤避光，並以250 rpm在盤振盪器上培養15分鐘，接著使用Victor 3或SpectraMax i3X儀器讀取。特異性裂解%係計算如下： 特異性裂解% = ((實驗釋放–自發釋放) / (最大釋放–自發釋放)) * 100%
圖21A及 圖 21B顯示在5T4-TriNKET ®或5T4-mAb存在下，人類NK細胞介導之H292細胞裂解，其使用來自2名不同健康人類供體之NK細胞（V/F及F/F CD16表現性NK細胞兩者）。5T4-mAb以NK細胞供體依賴性方式展示有意義或可忽略的活性，而在兩種背景下，5T4-TriNKET ®相較於mAb以次nM (sub-nM) EC50值觸發優越的最大裂解。以類似方式， 圖 22C及 圖 22D顯示相較於5T4-mAb，5T4-TriNKET ®所致的NK細胞介導之初代5T4表現性人類纖維母細胞裂解的優越增強（V/F及F/F CD16表現性NK細胞兩者）。 圖 21C顯示在5T4-TriNKET ®或5T4 mAb存在下CD8+ T細胞介導之786-O細胞裂解。儘管包括5T4-TriNKET ®觸發增強的IL-15預刺激CD8+ T細胞所致之腫瘤細胞裂解，缺乏高於基線之5T4-mAb活性。 圖 21D顯示在5T4-TriNKET ®或5T4-mAb存在下初代NK細胞所誘導的5T4 +H1975腫瘤細胞之干擾素γ (IFNγ)釋放。在所有測試濃度下5T4-mAb所誘導的IFNγ釋放皆最少，而5T4-TriNKET ®誘導優越的IFNγ釋放（尤其是在較高濃度下）。 圖 21E顯示在5T4-TriNKET ®或5T4-mAb存在下初代M0巨噬細胞所致的5T4表現性H292細胞之吞噬作用。 圖 21F顯示在5T4-TriNKET ®或5T4-mAb存在下初代M0巨噬細胞所致的5T4表現性KYSE-30食道鱗狀細胞癌(EsoSCC)細胞之吞噬作用。針對兩者腫瘤細胞類型，5T4-mAb顯示吞噬作用之誘導僅略高於基線，而5T4-TriNKET ®誘導吞噬作用大幅增加。數據係彙總於 表 17中。 表17 - AB1310/AB1783-TriNKET ® 之ADCP 活性的彙總
NucLight ™Green 細胞系 每個細胞之平均 5T4 AB1310/AB1783-TriNKET ® 親本 mAb
EC 50(nM) EC 90(nM) 最大吞噬作用 (%) EC 50(nM) 最大吞噬作用 (%)
KYSE-30 47,000 0.089±0.040 0.80±0.36 57±4 0.020±0.008 48±13
NCI-H292 7,900 0.15±0.02 1.3±0.2 23±6 NR 12±1
ADCP：抗體依賴性細胞吞噬作用；EC50：產生半最大反應的濃度（基於3參數非線性迴歸曲線擬合）；EC90：產生最大反應之90%的濃度（基於3參數非線性迴歸曲線擬合）；最大：由測試物品介導之最大增加（基於3參數非線性迴歸曲線擬合）；NR：未記錄。使用n = 3名健康人類巨噬細胞供體，計算平均±標準偏差(SD)值。各樣本係以二重複運行。
基於流式細胞術之PSR檢定允許濾出具有較高機率非特異性結合至不相關蛋白質的抗體。PSR檢定與下列具良好相關性：交叉交互作用層析法（替代抗體溶解度）以及桿狀病毒顆粒酶聯免疫吸附檢定（替代體內清除率）(Xu et. al(2013). Addressing polyspecificity of antibodies selected from an in vitro yeast presentation system: a FACS-based, high-throughput selection and analytical tool. Protein engineering design and selection, 26, 663-670)。
將50 µL的100 nM TriNKET ®或對照mAb（於PBSF中）與經預洗滌之5 µL蛋白質A dyna珠漿液（Invitrogen，目錄號10001D）在室溫下培養30分鐘。使TriNKET ®或mAb結合磁珠靜置於磁架60秒，且丟棄上清液。將結合珠用100 µL PBSF洗滌。將珠與50 µL的生物素化PSR試劑在冰上培養20分鐘，生物素化PSR試劑係自儲備液稀釋25倍(Xu et. al., (2013) Protein engineering design and selection, 26, 663-670)。將樣本置於磁架上，丟棄上清液，並用100 µL的PBSF洗滌。如下製造二級FACS試劑，以偵測生物素化PSR試劑與TriNKET ®或對照mAb之結合：將1:250 µL的鏈親和素-PE（Biologend，目錄號405204）及1:100驢抗人類Fc組合於PBSF中。向各樣本中，添加100 µL的二級試劑，並使其在冰上培養20分鐘。將珠用100 µL PBSF洗滌兩次，且在FACS Celesta (BD)上分析樣本。多特異性試劑(polyspecificity reagent, PSR)檢定進一步顯示AB1310/AB1783-TriNKET ®缺乏非特異性交互作用（ 圖 23）。 實例2– 評估AB1310/AB1783-TriNKET ® 功能及物理性質可製造性
可製造性分析顯示AB1310/AB1783-TriNKET ®具有有利性質。藉由粒徑篩析層析法(SEC)判定AB1310/AB1783-TriNKET ®之純度（ 圖 24A），以監測依據儲存條件而變動的高分子量物種(HMWS)及低分子量物種(LMWS)之形成。簡言之，將5 µg的測試材料注射至Agilent 1260 Infinity II高壓液相層析(HPLC)儀器（具有1260四元泵(Quat Pump)、1260 Vialsampler、1260 VWD）上。將樣本在Waters Acquity BEH 200 Å SEC（4.6 mm I.D. × 15 cm，1.7 µm管柱）上分離。SEC運行緩衝劑係PBS (pH 7.0)，以0.40 ml/min流動。在214 nm下監測吸光度，將峰面積手動積分，且記述高分子量物種(HMWS)、低分子量物種(LMWS)、及單體之百分比。
藉由非還原毛細管電泳(NR-CE)（ 圖 24B）及還原毛細管電泳(R-CE)（ 圖 24C）確認結果。如藉由質譜所測量，發現純化AB1310/AB1783-TriNKET ®之觀測質量與預期質量密切匹配（ 圖 24D）。AB1310/AB1783-TriNKET ®之質譜分析結果係彙總於 表 18中。 表18. AB1310/AB1783之質譜分析
完整質量結果
觀測質量(Da) 127,171.0
理論質量(Da) 127,170.1
質量準確度(ppm) 7.1
修飾 2 G0F
將AB1310/AB1783-TriNKET ®藉由下列進一步表徵：毛細管等電聚焦(cIEF)，以評估其電荷概況（ 圖 24E）；微差掃描熱量法(DSC)，以評估其熔融溫度（ 圖 24F）；疏水性交互作用層析法(HIC)，以評估其疏水性（ 圖 24G）。如藉由HIC所測量之AB1310/AB1783-TriNKET ®之疏水性在適當情況下與基準單株抗體阿達木單抗(adalimumab)及派姆單抗(pembrolizumab)進行比較（ 圖 24H）。比較性HIC結果係顯示於 表 19中。
針對cIEF，簡言之，將樣本用MilliQ水稀釋至1 mg/mL，將15 µL的樣本添加至60 µL的主混合物（水、甲基纖維素、Pharmalyte 3-10、精胺酸、pI標記4.05及9.99）中，渦旋，並短暫離心。自溶液頂部抽吸60 µL的樣本，將其添加至96孔盤中並離心，之後進行測試。在Maurice儀器(ProteinSimple, San Jose, CA)上，將樣本以1500伏特分離一分鐘，接著以3000伏特分離8分鐘。
針對DSC，簡言之，將樣本以0.5 mg/mL製備於1X PBS (Gibco, #10010-031)或替代配方中。將325 µL連同匹配的緩衝劑空白添加至96孔深孔盤。使用MicroCal PEAQ DSC (Malvern, PA)產生熱分析圖。將溫度以60℃/小時自20℃上升至100℃。將原始熱分析圖減去背景，基線模型係樣條(spline)，將數據使用非兩態(non-two state)模型擬合。
為了執行HIC，簡言之，將TriNKET ®（5 µg的蛋白質）之注射液以1 mL/min之流速在25℃之溫度下注射至Agilent 1260 Infinity II高壓液相層析(HPLC)儀器（配備有Sepax Proteomix HIC Butyl-NP5 5 um管柱）上。在六分鐘過程中，將樣本以高鹽緩衝劑（100 mM磷酸鈉、1.8 M硫酸銨，pH 6.5）至低鹽緩衝劑（100 mM磷酸鈉，pH 6.5）之線性梯度洗提。在214及280 nm兩者下監測吸光度，將峰手動積分，且記述滯留時間。 表19.AB1310/AB1783-TriNKET ®及其他生物製劑之物理性質
分析物 RT (min)
AB1310-TriNKET ® 5.1 ± 0.00
阿達木單抗 4.6
派姆單抗 6.3
AB1310/AB1783-TriNKET ®之穩定性分析
治療性蛋白質在各種壓力（例如高溫、低pH、高pH、及氧化條件）下的穩定性對其開發具重要性。經由SEC檢定AB1310-TriNKET ®在各種溫度條件下在78小時內的穩定性。在-80℃、5℃、環境溫度、或41℃下培養之後，AB1310/AB1783-TriNKET ®之單體純度沒有劇烈改變，其指示AB1310/AB1783-TriNKET ®保留適當摺疊（ 圖 25A）。DSC分析進一步顯示，AB1310/AB1783-TriNKET ®在預調配緩衝劑PBS (pH 7.4)（ 圖 25B）及HST (pH 6.0)（ 圖 25C）中具有高熱穩定性。AB1310/AB1783-TriNKET ®之DSC分析係彙總於 表 20中。 表20.預調配緩衝劑中AB1310/AB1783-TriNKET ®熱穩定性之DSC分析
緩衝劑 T 開始( ℃) Tm 1( ℃) Tm 2( ℃) Tm 3( ℃) Tm 4( ℃)
PBS, pH 7.4 57.5 ± 0.5 63.7 ± 0.1 66.2 ± 0.1 76.8 ± 0.1 82.3 ± 0.0
HST, pH 6.0 59.6 ± 0.2 66.2 ± 0.1 67.8 ± 0.1 78.9 ± 0.0 84.2 ± 0.0
SEC分析亦顯示，在酸性條件(pH 4)、鹼性條件(pH 9)、及氧化條件下，在50℃下培養之後，AB1310/AB1783-TriNKET ®仍保留適當摺疊（ 圖 25D）。NR-CE及R-CE分析進一步顯示，AB1310/AB1783-TriNKET ®在此等條件下未經歷降解（ 圖 25E及 圖 25F）。最後，AB1310/AB1783-TriNKET ®維持其結合5T4且誘導NK細胞介導之5T4表現性細胞裂解的能力（ 圖 25G）。在壓力條件下之AB1310/AB1783-TriNKET ®性質之分析結果係彙總於 表 21中。 表21.在壓力條件下之AB1310/AB1783-TriNKET ®物理性質之分析
SEC NR CE-SDS R CE-SDS h5T4 結合 細胞裂解
分析物 壓力 緩衝劑 時間 溫度( ℃) HMWS (%) 主要(%) LMWS (%) LMWS (%) 主要(%) HMWS (%) 純度(%) k a(1/Ms) k d(1/s) k D(nM) Rel. 效力 Rel. 最大值
AB1310/AB1783 -TriNKET ® 對照 HST, pH 6 7天 4℃ 3.3 96.1 0.6 2.2 97.8 N/A 99.4 1.2E+05 9.1E-04 7.8 1.00 1.0
pH Tris, pH 9 7天 40℃ 13.0 86.6 0.4 4.6 95.4 N/A 95.6 1.1E+05 1.6E-03 15.1* 0.18** 1.0
乙酸鹽pH 4 7天 40℃ 5.1 94.4 0.5 1.9 98.1 N/A 99.0 1.2E+05 9.1E-04 7.6 0.81 0.9
溫度 HST, pH 6 7天 50℃ 2.2 97.1 0.7 3.1 96.9 N/A 98.2 1.1E+05 8.8E-04 7.6 0.87 0.9
氧化 PBS, 0.02% H 2O 2 24 hr RT 2.7 96.9 0.3 2.3 97.7 N/A 100.0 1.2E+05 8.6E-04 7.0 0.41** 1.0
*異質結合，近似值 **2次獨立檢定運行之平均值 在體外評估與h5T4之表面結合
使用上述結合親和力檢定，所識別之5T4結合殖株10F10及11F09兩者在人源化及序列不利條件改變後，皆顯示維持與5T4 +腫瘤細胞H1975之結合（ 圖 26A 至圖26D ）。 圖 26E及 圖 26F係顯示各種濃度的人源化5T4結合體之結合（相對於背景的倍數(FOB)）的圖。
AB1310/AB1783-TriNKET ®以個位數奈莫耳相對親和力（1.5至7.6 nM EC50值）結合於一小組腫瘤細胞系（代表一系列5T4表現）上，且未結合5T4剔除系，其展示高親和力及特異性，顯示於 表 22中。 表22.AB1310/AB1783-TriNKET ®與5T4表現性腫瘤細胞系之結合
目標細胞系 來源 每個細胞之5T4 細胞結合EC50 (nM)
KYSE-30 HNSCC 61,000 2.5
HCC4006 NSCLC-腺 53,000 7.6
FaDu HNSCC 22,000 7.1
H1975 NSCLC -腺 22,000 1.9
Detroit 562 HNSCC 21,000 2.7
BT474 BRC 20,000 3.7
786-O RCC 18,000 2.7
H1703 NSCLC – SCC 15,000 2.6
HCT116 CRC 14,000 2.1
H292 NSCLC 12,000 1.5
HT29 CRC 5,000 4.1
H2172 NSCLC 0 N/A
H292-5T4KO NSCLC 0 N/A
AB1310/AB1783-TriNKET ®介導之細胞裂解
執行DELFIA細胞毒性檢定，以評估AB1310/AB1783介導之腫瘤細胞系之細胞裂解。簡言之，使5T4+目標細胞沉澱，並用1x HBS洗滌。將目標細胞以106個細胞/mL再懸浮於預溫熱RPMI初代細胞培養基中。將BATDA試劑（雙(乙醯氧基甲基) 2,2':6',2''-三聯吡啶-6,6''-二羧酸酯）以1:400稀釋至細胞懸浮液中。將細胞混合並在37℃及5% CO2下培養15分鐘。將經標示目標細胞用1x HBS洗滌3x，並以5x104個細胞/mL再懸浮於RPMI初代細胞培養基中。
自培養物中移除靜置人類NK細胞，並使其沉澱，將細胞以0.5×10 6個細胞/mL再懸浮於RPMI初代細胞培養基中。在RPMI初代細胞培養基中製備4x測試物品。在圓底TC 96孔盤中，添加100 µl的經標示目標細胞、50 µl的4x TriNKET ®/mAb、及50 µl的效應細胞。用於背景之對照孔的製備係藉由使經標示目標細胞沉澱，且將100 µl的上清液添加至背景孔（含有100 µl的RPMI初代細胞培養基）中。自發釋放孔的製備係藉由將100 µl的經標示目標細胞添加至孔（含有100 µl的RPMI初代細胞培養基）中。最大釋放孔的製備係藉由將100 µl的經標示目標細胞添加至孔（含有80 µl的RPMI初代細胞培養基及20 µl的10% TritonX-100溶液）中。將檢定盤在37℃及5% CO2下培養2至3小時。
將檢定盤自培養箱移除，且將盤離心以使細胞沉澱。自各孔移除20 µl的上清液，並將其轉移至乾淨的96孔黃色DELFIA檢定盤。將200 µl的室溫銪溶液添加至各孔中，且將盤放置於250 RPM的盤振盪器上15分鐘。
AB1310/AB1783-TriNKET ®增強NK細胞介導之腫瘤細胞系裂解，該等腫瘤細胞系代表一系列適應症及5T4表現水平，如 表 23中所示。在代表一系列5T4表現之細胞系中，AB1310/AB1783-TriNKET ®以次奈莫耳(subnanomolar) EC50值（範圍在0.072至0.42 nM）增強NK細胞介導之裂解。類似地，AB1310/AB1783增強NK細胞介導之初代CAF裂解，如 表 24中所示。 表23.AB1310/AB1783-TriNKET ®所致的NK細胞介導之裂解
目標細胞 來源 5T4/ 細胞 AB1310/AB1783 -TriNKET ® 10F10 mAb
EC50 (nM) 最大增強裂解(%) EC50 (nM) 最大增強裂解(%)
KYSE-30 HNSCC 61,000 0.072 15 0.085 12
HCC4006 NSCLC-腺 53,000 0.24 13 0.25 12
FaDu HNSCC 22,000 0.19 31 0.17 12
H1975 NSCLC -腺 22,000 0.29 11 0.18 3.5
Detroit 562 HNSCC 21,000 0.23 19 0.14 11
BT474 BRC 20,000 0.14 19 0.20 12
786-O RCC 18,000 0.19 40 0.16 13
H1703 NSCLC –鱗狀 15,000 0.14 29 0.047 7.6
HCT116 CRC 14,000 0.097 23 0.039 7.2
H292 NSCLC 12,000 0.10 44 0.17 24
HT29 CRC 5,000 0.42 17 ND 0.2
表24. AB1310/AB1783-TriNKET ®所致的NK細胞介導之CAF裂解
樣本 EC50 (nM) 最大(%) EC50 (nM) 最大(%)
AB1310-TriNKET ® 0.081 36 0.19 10
親本mAb 0.12 30 - 3.6
AB1310/AB1783-TriNKET ®所增強的NK細胞介導之裂解持續一段長時間。將表現NucLight ™Green之兩種5T4 +腫瘤細胞系（KYSE-30及H292）與下列培養於50%人類血清中：靜置初代NK細胞，以5:1 NK細胞與腫瘤細胞之比；或PBMC，以20:1 PBMC與腫瘤細胞之比。將細胞在IncuCyte ®S3中培養72小時。抑制百分比係計算如下：抑制% = (1- ((綠色物體計數時間X) / (綠色物體計數時間零)))* 100%。AB1310/17830-TriNKET ®增強在72小時培養期內由初代NK細胞（ 圖 31A及 圖 31B）或PBMC（ 圖 31C及 圖 31D）介導之5T4 +細胞殺滅。 AB1310/AB1783-TriNKET ®與NKG2D及CD16的交互作用
藉由蛋白質陣列評估AB1310/AB1783-TriNKET ®針對HEK293細胞上質膜蛋白質之結合。如 圖 27A中所示，AB1310/AB1783-TriNKET ®特異性地與主要目標5T4 (TPBG)交互作用。亦觀察到AB1310/AB1783-TriNKET ®與NKG2D-DAP10之弱結合(KLRK1 + HCST)。親本mAb中維持對5T4之特異性（ 圖 27B），且未觀察到與NKG2D之結合。在Fc靜默變體（其中引入靜默突變以抑制AB1310/AB1783-TriNKET ®之效應功能）中，維持與5T4及NKG2D兩者之結合（ 圖 27C ）。
進一步證實，AB1310/AB1783-TriNKET ®達到5T4及NKG2D靶向臂的同時共銜接，如 圖 28A（首先為5T4結合，接著為NKG2D）及 圖 28B（首先為NKG2D結合，接著為5T4）中所示。
簡言之，將AB1310/AB1783-TriNKET ®稀釋於1x HBS-EP+緩衝劑（含有0.1 mg/mL BSA）中，並以5 µL/min之流速在CM5晶片之抗人類Fc表面捕捉60 sec，以達到150至250 RU之捕捉水平。記錄在基線信號與AB1310-TriNKET ®注射完成後信號（代表經捕捉之AB1310/AB1783-TriNKET ®之量）之間的淨差異。在經捕捉AB1310/AB1783上，以20 µL/min注射h5T4-His (800 nM)或mFc-hNKG2D (7 µM)達90 sec，以達到飽和。此注射後立即以20 µL/min之流速注射h5T4-His (800 nM)及mFc-hNKG2D (7 µM)之預培養混合物達90 sec，其中在Biacore 8K控制軟體中使用A-B-A注射指令（將第二目標與第一目標預混合，以確保針對第一目標之所有結合位點被佔據）。將晶片藉由兩次20 sec脈衝的10 mM甘胺酸(pH 1.7)以100 µL/min再生。實驗係在37℃下進行，且使用1x HBS-EP+緩衝劑（含有0.1 mg/mL BSA）作為運行緩衝劑。以在個別抗原注射前之基線信號與之後12秒之間的淨差異，記錄各抗原之結合（以RU表示）。將各目標與AB1310/AB1783-TriNKET ®（未被另一目標（先注射）佔據）結合的平均相對結合比指派為1.0之值。將各目標與經捕捉AB1310/AB1783-TriNKET ®（已被另一目標（其次注射）飽和）結合的平均相對結合化學計量以與未佔據AB1310/AB1783-TriNKET ®的滿載(full capacity)結合之分率表示。化學計量係提供於 表 25中。
重要地，此等結果證實，5T4與AB1310 AB1783-TriNKET ®之結合不影響NKG2D之結合，NKG2D與AB1310 AB1783-TriNKET ®之結合不影響5T4之結合，且兩個結合臂可同時銜接。 表25.AB1310/AB1783-TriNKET ®之5T4-NKG2D結合化學計量
實驗設置 h5T4 ，相對結合化學計量 NKG2D ，相對結合化學計量
目標與AB1310/AB1783-TriNKET ®（未被另一目標（先注射）佔據）結合 1.00 1.00
目標與AB1310/AB1783-TriNKET ®（已被另一目標（其次注射）飽和）結合 1.04 ± 0.01 1.12 ± 0.03
評估NKG2D及CD16a之協同結合。簡言之，藉由如上所述之SPR並進行修改，評估協同NKG2D及CD16a結合。將單獨hNKG2D、單獨CD16a F158等位基因、及hNKG2D及CD16a F158之混合物胺基偶合至CM5系列S Biacore晶片之表面。將1.5 µM AB1310/AB1783-TriNKET ®以20 µL/min注射120秒。當不需要再生時，觀察解離相180秒，且當在相同流速下週期之間需要表面自然再生（分析物幾乎完全解離）時，觀察1200秒。使用1x HBS-EP+緩衝劑作為運行及樣本稀釋緩衝劑。將所得感測圖標準化至「分析物結合後期(analyte binding late)」記述點並定性評估。此外，AB1310/AB1783-TriNKET ®之結合展示藉由結合NKG2D及CD16a兩者增強的銜接，如藉由 圖 29之感測圖所證實。此同時銜接導致親合力改善的解離速率。 AB1310/AB1783-TriNKET ®所致之NK細胞活化
評估AB1310/AB1783-TriNKET ®活化人類及食蟹獼猴NK細胞的能力。簡言之，使用密度梯度離心，自人類或食蟹獼猴周邊血液血沉棕黃層單離周邊血液單核細胞(PBMC)。使用負向選擇用磁珠將NK細胞(CD3 -CD56 +)自PBMC單離，且經單離NK細胞之純度一般係＞95%。接著，將經單離NK細胞培養於含有100 ng/mL IL-2之培養基中24至48小時，之後將其轉移至吸附NKG2D結合域的微量盤之孔，並培養於含有螢光團接合抗CD107a抗體、布雷非德菌素A (brefeldin-A)、及孟寧素(monensin)之培養基中。將NK細胞與5T4+-KYSE-30細胞共培養。在共培養後，使用抗CD3、CD56、及IFNγ之螢光團接合抗體，藉由流式細胞術檢定NK細胞。在CD3 -CD56 +細胞中分析CD107a及IFNγ染色，以評估NK細胞活化。人類（ 圖 30A）及食蟹獼猴（ 圖 30B）細胞兩者皆觀察到類似的NK細胞活化水平。結果係彙總於 表 26中。 表26.AB1310/AB1783-TriNKET ®所致之NK細胞活化
目標細胞 來源 5T4/ 細胞 人類 食蟹獼猴
EC50 (nM) 最大IFNγ+ /CD107a+(%) EC50 (nM) 最大IFNγ+ /CD107a+(%)
KYSE-30 HNSCC 61,000 0.13 ± 0.03 34 ± 11 0.06 ± 0.02 39 ± 9
H292 NSCLC 12,000 0.35 ± 0.13 26 ± 12 0.06 ± 0.02 42 ± 12
各種5T4 TriNKET ®之結合親和力
比較不同5T4 TriNKET ®之結合親和力的結合檢定之結果係提供於下 表 27及 表 28中。 表27
TriNKET ® EC50 (nM) 最大相對於背景的倍數 (FOB)
AB178310F10 F3' LH H(T62S) CHO opt. 3.424 82.8
AB187911F09-IGHV3-48*01 BM1-YB 9.183 62.9
AB188011F09-IGHV3-21*05 BM2-YB 21.74 48.5
AB188311F09-IGHV3-11*01 BM2-YB 6.019 69.4
AB188811F09-IGHV3-21*05 BM1-YB 18.51 22.1
AB188911F09-IGHV3-48*01 BM2-YB 20.68 11.7
AB189011F09-IGHV3-23*03 BM1-YB 5.616 65.9
AB189111F09-IGHV3-11*01 BM1-YB 50.54 40.1
AB189311F09-IGHV3-23*03 BM2-YB 15.86 70.8
表28
TriNKET ® EC50 (nM) 最大相對於背景的倍數 (FOB)
AB178310F10 F3' LH H(T62S) CHO opt. 5.33 85.0
AB187810F10-IGHV3-21*05 BM1 10.09 71.6
AB188110F10-IGHV3-23*03 BM2 7.278 72.5
AB188210F10-IGHV3-48*01 BM1 8.551 71.8
AB188410F10-IGHV3-48*01 BM2 6.075 70.5
AB188510F10-IGHV3-11*01 BM2 5.365 68.0
AB188610F10-IGHV3-11*01 BM1 5.652 73.5
AB188710F10-IGHV3-21*05 BM2 10.21 75.0
AB189210F10-IGHV3-23*03 BM1 4.207 60.0
實例3– 評估AB1310/AB1783-TriNKET ® 之配方pH篩選
藉由粒徑篩析層析法(SEC)判定各種pH水平的配方中AB1310/AB1783-TriNKET ®之純度，以監測依據儲存條件而變動的高分子量物種(HMWS)及低分子量物種(LMWS)隨時間之形成。簡言之，將5 µg的測試材料注射至Agilent 1260 Infinity II高壓液相層析(HPLC)儀器（具有1260四元泵(Quat Pump)、1260 Vialsampler、1260 VWD）上。將樣本在Waters Acquity BEH 200 Å SEC（4.6 mm I.D. × 15 cm，1.7 µm管柱）上分離。SEC運行緩衝劑係PBS (pH 7.0)，以0.40 ml/min流動。在214 nm下監測吸光度，將峰面積手動積分，且記述高分子量物種(HMWS)、低分子量物種(LMWS)、及單體之百分比。顯示在50 ℃下儲存6天（ 圖 32A）及在40 ℃下儲存21天（圖32B）後的SEC分析結果。單體百分比的線性迴歸之斜率係顯示為特定緩衝劑之pH的函數（ 圖 32C）。此等結果展示配方（包括AB1310/AB1783-TriNKET ®）之最佳pH範圍為6.5至7.0。
AB1310/AB1783-TriNKET ®配方接下來係以毛細管等電聚焦(cIEF)表徵，以評估電荷概況。顯示電泳圖之酸性（ 圖 33A）、中性（ 圖 33B）、及鹼性（ 圖 33C）區中的變化。藉由非還原毛細管電泳(NR-CE)進一步檢驗AB1310/AB1783-TriNKET ®配方，以顯示AB1310/AB1783-TriNKET ®之純度（ 圖 34A）、片段之百分比（ 圖 34B）、及高分子量物種之形成（ 圖 34C）。組合結果指示最佳pH範圍為6.0至7.0。 賦形劑篩選
測試包含不同賦形劑及緩衝劑之配方，其包括組胺酸或檸檬酸鹽緩衝劑；蔗糖、甘露醇、或海藻糖；及聚山梨醇酯80之影響。所測試之緩衝劑之組成係顯示於 表 29中。 表29 —在賦形劑篩選中所測試之配方
配方 AB1310/AB1783-TriNKET ® 緩衝劑 糖 PS80
B1 2 mg/mL 20 mM組胺酸 6%蔗糖 0.01%
B2 2 mg/mL 20 mM組胺酸 6%蔗糖 0%
B3 2 mg/mL 20 mM檸檬酸鹽 6%蔗糖 0.01%
B4 2 mg/mL 20 mM檸檬酸鹽 6%蔗糖 0%
B5 2 mg/mL 20 mM檸檬酸鹽 4%甘露醇 0.01%
B6 2 mg/mL 20 mM檸檬酸鹽 6%海藻糖 0.01%
B7 2 mg/mL 20 mM檸檬酸鹽 5%/1%蔗糖/甘露醇 0.01%
藉由SEC（ 圖 35）、cIEF（ 圖 36）、R-CE（ 圖 37A）、及NR-CE（ 圖 37B）分析各種配方。結果指示，相較於含有甘露醇或海藻糖（而非蔗糖）或組胺酸緩衝劑（而非檸檬酸鹽緩衝劑）之配方，含有檸檬酸鹽及蔗糖之配方賦予多特異性結合蛋白優越的穩定性。
藉由動態光散射(DLS)，探究在基線或溫度壓力(50℃)條件下各種配方內AB1310/AB1783-TriNKET ®自行交互作用的傾向。針對DLS，簡言之，使用Nanotemper Prometheus Panta（以高靈敏度DLS模式運行）判定k D。簡言之，將樣本製備於緩衝劑中，且將10 µL裝載至三個單獨毛細管中，以用於每種濃度分析。將結果在Panta Analysis軟體中擬合，且個別計算各配方之k D值。所測試之配方包括：組胺酸緩衝劑加上0.01%聚山梨醇酯80 (B1)、不具有聚山梨醇酯8之組胺酸緩衝劑(B2)、具有0.01%聚山梨醇酯80之檸檬酸鹽緩衝劑(B3)、及不具有聚山梨醇酯80之組胺酸緩衝劑(B4)。所測試之緩衝劑之結果係顯示於 圖 38A 至圖38D中。在50℃下培養之後，相較於包括組胺酸緩衝劑之配方，檸檬酸鹽緩衝配方顯示整體較低的分子量及較少的總物種。 範圍探索研究
測試AB1310/AB1783-TriNKET ®之配方，以最佳化蔗糖及聚山梨醇酯80之濃度。所測試之配方係顯示於 表 30中。總體而言，沒有觀察到聚山梨醇酯80對TriNKET ®穩定性的影響。 表30 —在範圍探索研究中測試之配方
AB1310/AB1783-TriNKET ® 緩衝劑 糖 PS80
15 mg/mL 20 mM檸檬酸鹽，pH 6.5 6%蔗糖 0.01%
15 mg/mL 20 mM檸檬酸鹽，pH 6.5 6%蔗糖 無
15 mg/mL 20 mM檸檬酸鹽，pH 6.5 6%蔗糖 0.03%
15 mg/mL 20 mM檸檬酸鹽，pH 6.5 3%蔗糖 0.01%
15 mg/mL 20 mM檸檬酸鹽，pH 6.5 9%蔗糖 0.01%
在30℃（ 圖 39A）、40℃（ 圖 39B）、及50℃（ 圖 39C）下儲存28天後，藉由SEC測試各種配方，以觀察蔗糖濃度的影響。在40℃下培養之後，所有配方中皆觀察到約2.5%至3.3%之單體減少。在30℃（ 圖 40A）、40℃（ 圖 40B）、及50℃（ 圖 40C）下儲存28天後，藉由cIEF進一步分析配方，以觀察蔗糖濃度的影響。類似於SEC結果，在40℃下培養之後，所有配方中皆觀察到約9%至24%之中性物種減少。兩個實驗之結果係彙總於 圖 41中。
總體而言，結果建議包括下列之配方：20 mM檸檬酸鹽緩衝劑(pH 6.5)，用於緩衝；6%蔗糖，作為張力調節劑；及0.01%聚山梨醇酯80，作為AB1310/AB1783-TriNKET ®之界面活性劑。 實例4 - CD8+ T 細胞介導之對5T4+ 腫瘤細胞的細胞毒性
此實例顯示AB1310/AB1783-TriNKET ®觸發由CD8+ T細胞所致的腫瘤細胞之細胞裂解。針對兩種5T4+腫瘤細胞系之各者使用來自3名健康供體之IL-15初免CD8+ T細胞，研究AB1310/AB1783-TriNKET ®在多天培養中增強CD8+ T細胞介導之活性的能力，並使用INCUCYTE ®活細胞成像器評估。AB1310/AB1783-TriNKET ®刺激CD8+ T細胞對5T4表現性腫瘤細胞之裂解的劑量依賴性增加，而親本mAb並未顯示相對於基礎水平的CD8+ T細胞之細胞裂解增強（圖41；表30）。高濃度(50 nM)的TriNKET ®對照分子（無法銜接NKG2D）(AB1310/AB1783-TriNKET ®-NKG2Dsi)亦無法增強由CD8+ T細胞所致的裂解。 方法 試劑之製備
藉由下列製備完全羅斯威爾帕克紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute, RPMI)初代細胞培養基：將10%熱去活化胎牛血清(heat-inactivated fetal bovine serum, HI-FBS)、1X GlutaMAX ™、1X青黴素/鏈黴素(Pen/Strep)、及50 µM的2-巰基乙醇(BME)添加至RPMI 1640培養基中。 自PBMC活化、單離、及擴增CD8+ T細胞
將冷凍PBMC解凍，並在37℃及5% CO 2下，將其以2.5 × 10 6個細胞/mL與1-µg/mL刀豆球蛋白A於RPMI初代細胞培養基中培養18小時。置換培養基，且將細胞與5-ng/mL IL-2培養2天，之後用25-ng/mL IL-15進行後續置換並培養1天。根據製造商之說明，使用負向選擇技術用磁珠純化CD8+ T細胞。最後，將CD8+ T細胞以1 × 10 6個細胞/mL於培養基中培養9天，培養基含有25-ng/mL IL-15，其中培養基及細胞介素每2天置換一次，之後用於細胞裂解檢定中。 長期CD8+ T細胞細胞毒性Incucyte ®檢定
使IL-15活化CD8+ T細胞沉澱，並以2 × 10 6個細胞/mL再懸浮於RPMI初代細胞培養基中（準備用於20:1效應目標細胞比(E:T)），並保持在37℃及5% CO 2下直到準備使用。將穩定表現NucLight ™Green之人類腫瘤細胞用1X磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)溫和潤洗，用TrypLE酶剝離，使其沉澱，以3 × 10 4個細胞/mL再懸浮於完全RPMI初代細胞培養基中。將腫瘤細胞懸浮液(100 µL)分配至無菌平底96孔微量盤之各孔中。將盤在室溫下培養30分鐘，之後將邊緣貯庫(edge reservoir)用1.5至2.0 mL的1X PBS填充。將盤轉移至培養箱，以在37℃及5% CO 2下進一步培養3.5小時。在完全RPMI初代細胞培養基中製備4X測試物品之劑量滴定液，以用於經1:5或1:4連續稀釋，範圍分別在100 nM至0.258 pM或50 nM至48.8 pM之最終檢定濃度的AB1310/AB1783-TriNKET ®及親本mAb。對於AB1310/AB1783-TriNKET ®-NKG2Dsi，進行1:5連續稀釋（範圍在100 nM至0.8 nM），或使用50 nM之單一濃度。將含有腫瘤細胞之檢定盤自培養箱移除，且將50 µL的4X測試物品稀釋液及50 µL的CD8+ T細胞懸浮液添加至樣本孔中。將RPMI初代細胞培養基及CD8+ T細胞懸浮液（各50 µL）添加至僅E:T的無處理對照孔中，而僅腫瘤細胞的對照孔僅僅接收100 µL的RPMI初代細胞培養基。接著，將盤轉移至Incucyte ®活細胞成像器，以在37℃及5% CO 2下培養至少72小時。藉由Incucyte ®成像器以每24小時之排程拍攝綠色螢光影像，以評估綠色腫瘤細胞隨時間的生長及存活。將藉由Incucyte ®軟體計數的各孔中之綠色腫瘤細胞標準化至自初始時間點(t0)的相同孔之計數，以控制孔成像區域中細胞接種之變化性的方式，評估生長抑制。各樣本係以二重複或三重複運行，且每孔拍攝2個影像，在各時間點每個樣本條件總計有4個影像。將腫瘤細胞生長抑制解釋為由AB1310/AB1783-TriNKET ®刺激的CD8+ T細胞介導之活性的指標。
使用下式計算抑制百分比(%)： 抑制% = (T 72– S 72) / T 72* 100 T 72：在72小時的僅腫瘤細胞孔之平均綠色計數（標準化至0小時時間點） S 72：在72小時的樣本孔之平均綠色計數（標準化至0小時時間點）
將各濃度之抑制%對測試物品濃度（採對數軸）作圖，且使用GraphPad Prism v9，基於4參數非線性迴歸分析計算抑制之最大增強及EC50。結果係彙總於 表 31及 圖 42中。 表31 – AB1310/AB1783-TriNKET ® 所致的CD8+ T 細胞之5T4+ 目標細胞裂解的彙總
細胞系 來源；細節 每個細胞之平均 5T4 AB1310/AB1783 TriNKET ® 親本 mAb
EC 50(nM) 最大增強抑制 (%) EC 50(nM) 最大增強抑制 (%)
BT-474 BRCA 10,000 0.66±0.43 24±6 NR NR
FaDu HNSCC 13,000 0.59±0.37 26±12 NR NR
BRCC：乳癌；HNSCC：頭頸鱗狀細胞癌；E:T：效應目標比； EC50：產生半最大反應的濃度（基於4參數非線性迴歸曲線擬合）； Max：最大；備註：使用n數目的健康PBMC供體，計算平均±標準偏差(SD)值。 NR：未記錄。各樣本係以二重複或三重複運行。
除NK細胞外，NKG2D係表現於細胞毒性CD8+ T細胞上，且CD8+ T細胞可直接由NKG2D刺激觸發（當經由其TCR及/或細胞介素活化時）。使用與5T4表現性腫瘤細胞共培養的體外擴增IL-15初免CD8+ T細胞，評估AB1310/AB1783-TriNKET ®經由細胞介素刺激CD8+ T細胞誘導5T4表現性腫瘤細胞殺滅的能力。AB1310/AB1783-TriNKET ®以劑量反應性方式增強由CD8+ T細胞（已經擴增並用IL-15初免）所致的5T4+腫瘤細胞裂解。親本mAb在此背景下沒有活性，其與缺乏NKG2D銜接的情形一致。此外，AB1310/AB1783-TriNKET ®-NKG2Dsi無法增加CD8+ T細胞之裂解，其證實AB1310/AB1783-TriNKET ®直接藉由NKG2D刺激觸發CD8+ T細胞。 實例5 - AB1310/AB1783-TriNKET ® 刺激5T4 依賴性NK 細胞介導之細胞毒性
此實例顯示在使用初代人類NK細胞與5T4+人類癌細胞系或5T4+癌相關纖維母細胞(CAF)的長期（~72小時）共培養檢定中，AB1310/AB1783-TriNKET ®之裂解活性。
對一小組的4種5T4+腫瘤細胞系使用來自6名健康供體之過夜靜置初代人類NK細胞，研究AB1310/AB1783-TriNKET ®在多天培養中增強NK細胞活性的能力，並使用IncuCyte ®活細胞成像器評估。表現高親和力CD16a變體V158（雜合(V/F)）之供體、以及僅具有低親和力CD16a變體(F/F)之供體代表用以表徵AB1310/AB1783-TriNKET ®之活性的供體。
短期（2.5小時）檢定中由AB1310/AB1783-TriNKET ®觸發的穩健NK細胞介導之腫瘤細胞裂解轉變為對5T4+腫瘤細胞存活及生長（在3天培養期間內藉由IncuCyte ®成像偵測）的顯著抑制（ 圖 43）。測試代表臨床可能關注的適應症之腫瘤細胞系。AB1310/AB1783-TriNKET ®展示次奈莫耳效力並增強最大抑制（較基礎抑制高26%至51%），基礎抑制係由NK細胞單獨針對腫瘤細胞介導（ 表 32）。對於CD16a V/F及F/F供體兩者針對各細胞系的情形，AB1310/AB1783-TriNKET ®所達成之最大抑制超過親本mAb（較E:T背景高2%至15%）。 方法 長期細胞毒性Incucyte ®檢定
將來自6名健康人類供體之解凍冷凍人類NK細胞以10 6個細胞/mL在RPMI初代細胞培養基中培養過夜。將穩定表現NucLight ™Green之人類腫瘤細胞用1X磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)溫和潤洗，用TrypLE酶剝離，使其沉澱，以3 × 10 4個細胞/mL再懸浮於完全RPMI初代細胞培養基中。將腫瘤細胞懸浮液(100 µL)分配至無菌平底96孔微量盤之各孔中。將盤在室溫下培養30分鐘，之後將邊緣貯庫(edge reservoir)用1.5至2.0 mL的1X PBS填充。將盤轉移至培養箱，以在37℃及5% CO 2下進一步培養3.5小時。在完全RPMI初代細胞培養基中使用1:5連續稀釋製備4X測試物品之劑量滴定液，以用於範圍在100 nM至0.25 pM或100 nM至0.05 pM或100 nM至1.2 pM之最終檢定濃度的AB1310/AB1783-TriNKET ®及親本mAb。自培養物中回收靜置NK細胞，使其沉澱，以3 × 10 5個細胞/mL再懸浮於完全RPMI初代細胞培養基中（準備用於5:1效應目標比(E:T)）。
將含有腫瘤細胞之檢定盤自培養箱移除，且將50 µL的4X測試物品稀釋液及50 µL的NK細胞懸浮液添加至樣本孔中。將RPMI初代細胞培養基及NK細胞懸浮液（各50 µL）添加至僅E:T的無處理對照孔中，而僅腫瘤細胞的對照孔僅僅接收100 µL的RPMI初代細胞培養基。接著，將盤轉移至Incucyte ®活細胞成像器，以在37℃及5% CO 2下培養至少72小時。藉由Incucyte ®成像器以每24小時之排程拍攝綠色螢光影像，以評估綠色腫瘤細胞隨時間的生長及存活。將藉由Incucyte ®軟體計數的各孔中之綠色腫瘤細胞標準化至自初始時間點(t 0)的相同孔之計數，以控制孔成像區域中細胞接種之變化性的方式，評估生長抑制。各樣本係以二重複運行，且每孔拍攝2個影像，在各時間點每個樣本條件總計有4個影像。將腫瘤細胞生長抑制解釋為由AB1310/AB1783-TriNKET ®及親本mAb刺激的NK細胞介導之活性的指標。
使用下式計算抑制百分比(%)： 抑制% = (T72 – S72) / T72 * 100 T72：在72小時的僅腫瘤細胞孔之平均綠色計數（標準化至0小時時間點） S72：在72小時的樣本孔之平均綠色計數（標準化至0小時時間點）
將各濃度之抑制%對測試物品濃度（採對數軸）作圖，且使用GraphPad Prism v9，基於4參數非線性迴歸分析計算抑制之最大增強及EC 50。結果係彙總於 表 32及 圖 43中。 表32 - 在5T4 腫瘤細胞系上AB1310/AB1783-TriNKET ® 之長期NK 細胞介導之細胞毒性的彙總
NucLight ™Green 細胞系 每個細胞之平均 5T4 AB1310/AB1783-TriNKET ® 親本 mAb
EC50 (nM) EC50 (nM) 最大增強抑制 (%) EC50 (nM) 最大增強抑制 (%)
KYSE-30 51,000 0.087±0.016 0.87±0.86 51±9 0.13±0.01 a 15±5
HCT 116 10,000 0.16±0.07 0.37±0.43 26±8 0.0025 a 11±11
NCI-H292 8,000 0.37±0.43 2.9±3.6 32±5 NR 6.6±5.6
HT-29 4,000 1.3±0.4 19±25 32±16 NR 2.3±1.5
EC50：產生半最大反應的濃度（基於4參數非線性迴歸曲線擬合）；EC90：產生最大反應之90%的濃度（基於4參數非線性迴歸曲線擬合）；Max：最大；NR：未記錄。 使用n（以數目指明）名獨立健康NK細胞供體（具有V/F或F/F CD16a基因型，對各細胞系進行評估），計算平均±標準偏差(SD)值。各樣本係以二重複運行。 a3名供體中1或2名之平均EC50值，其係因為第二名或第三名供體之反應低，可能無法確切擬合至曲線。
短期檢定中由AB1310/AB1783-TriNKET ®觸發的穩健NK細胞介導之腫瘤細胞裂解轉變為對5T4+表現性腫瘤細胞過度生長的顯著抑制。AB1310/AB1783-TriNKET ®刺激對腫瘤細胞的穩健最大抑制，其效力範圍在0.087至1.322 nM。此外，在6名具有V/F或F/F CD16a基因型之健康人類NK細胞供體之中，當相較於親本mAb時，AB1310/AB1783-TriNKET ®展示優越的最大腫瘤抑制。 附錄 例示性多特異性結合蛋白序列 AB2092 – (hF3'.A49-M-I-YA.5T4-05H04-VH02_BM1-VL_BM1-VH-LH-SS-scFv-YB)鏈L： DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:200) 鏈H： EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPIGAAAGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID 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hF3'.A49-M-I-YA.5T4-10F10-IGHV3-21*05-BM1-YB（殖株10F10之替代人源化） 鏈L： DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:200) 鏈H： EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPIGAAAGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:199) 鏈S： 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hF3'.A49-M-I-YA.5T4-10F10-IGHV3-48*01-BM1-YB（殖株10F10之替代人源化） 鏈L： DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:200) 鏈H： EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPIGAAAGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:199) 鏈S： 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hF3'.A49-M-I-YA.5T4-10F10-IGHV3-11*01-BM2-YB（殖株10F10之替代人源化） 鏈L： DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:200) 鏈H： EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPIGAAAGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:199) 鏈S： 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hF3'.A49-M-I-YA.5T4-10F10-IGHV3-21*05-BM2-YB（殖株10F10之替代人源化） 鏈L： DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:200) 鏈H： EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPIGAAAGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:199) 鏈S： 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hF3'.A49-M-I-YA.5T4-11F09-5T4.C01-VH_BM2-VK_BM1-LH-scFv-SS-Fc-LH-YB鏈L： DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:200) 鏈H： EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPIGAAAGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:199) 鏈S： 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hF3'.A49-M-I-YA.5T4-11F09-IGHV3-21*05-BM2-YB（殖株11F09之替代人源化） 鏈L： DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:200) 鏈H： EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPIGAAAGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:199) 鏈S： 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hF3'.A49-M-I-YA.5T4-11F09-IGHV3-21*05-BM1-YB（殖株11F09之替代人源化） 鏈L： DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:200) 鏈H： EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPIGAAAGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:199) 鏈S： 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hF3'.A49-M-I-YA.5T4-11F09-IGHV3-23*03-BM2-YB（殖株11F09之替代人源化） 鏈L： DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGVSFPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:200) 鏈H： EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGAPIGAAAGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTENQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSWLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:199) 鏈S： 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除非有相反說明，否則本文參照之專利文件及科學文章之各者之完整揭露出於所有目的係以引用方式併入。與本申請案並行申請之隨附附錄中列出之序列出於所有目的係以引用方式併入，作為本文所述之揭露之部分。 等效物
本申請案可在不脫離其精神或基本特徵的情況下以其他特定形式實施。因此，在所有方面皆應將前述實施例視為說明性，而非視為限制本文所述之申請案。不同實施例之各種結構元件及各種所揭示之方法步驟可以各種組合及排列利用，且所有此類變體皆應被視為本揭露之形式。因此，本申請案之範疇係由隨附申請專利範圍而非前述實施方式指示，且在申請專利範圍等效性之意義及範圍內的所有變化皆意欲涵蓋於其中。
無
［ 圖 1］係異二聚體多特異性抗體（例如三特異性結合蛋白(TriNKET ®)）的圖示。各臂可代表NKG2D結合域或5T4結合域。在一些實施例中，NKG2D結合域及5T4結合域可共有共同輕鏈。 ［ 圖 2A］ 至［ 圖 2E］繪示多特異性結合蛋白（例如三特異性結合蛋白(TriNKET ®)）之五種例示性形式。如 圖 2A中所示，NKG2D結合域或5T4結合域可採用scFv形式（左臂）。含有NKG2D靶向scFv、5T4靶向Fab片段、及異二聚化抗體恆定區之抗體在本文中稱為F3-TriNKET ®。含有5T4靶向scFv、NKG2D靶向Fab片段、及異二聚化抗體恆定區/域（結合CD16）之抗體在本文中稱為F3'-TriNKET ®（ 圖 2E）。如 圖 2B中所示，NKG2D結合域及5T4結合域兩者皆可採用scFv形式。 圖 2C 至圖2D係具有三個抗原結合位點之抗體的圖示，其包括兩個結合5T4之抗原結合位點、及融合至異二聚化抗體恆定區之NKG2D結合位點。此等抗體形式在本文中稱為F4-TriNKET ®。 圖 2C繪示兩個5T4結合位點係呈Fab片段形式，且NKG2D結合位點係呈scFv形式。 圖 2D繪示5T4結合位點係呈scFv形式，且NKG2D結合位點係呈scFv形式。 圖 2E代表三特異性抗體(TriNKET ®)，其含有5T4靶向scFv、NKG2D靶向Fab片段、及異二聚化抗體恆定區/域（「CD域」）（結合CD16）。該抗體形式在本文中稱為F3'-TriNKET ®。在某些例示性多特異性結合蛋白中，抗體恆定區上之異二聚化突變包括一個恆定域上之K360E及K409W；及相對恆定域上之Q347R、D399V、及F405T（在CD域中以三角形鎖鑰形狀顯示）。在Fab片段之重鏈與輕鏈可變域之間的粗條代表雙硫鍵。 ［ 圖 3］係呈三功能抗體(Triomab)形式之TriNKET ®的圖示，其係維持類IgG形狀之三功能性雙特異性抗體。此嵌合體係由兩個半抗體所組成，其等各具有一個輕鏈及一個重鏈（源自兩種親本抗體）。三功能抗體形式可係異二聚體構築體，其含有1/2的大鼠抗體及1/2的小鼠抗體。 ［ 圖 4］係呈KiH共同輕鏈形式之TriNKET ®的圖示，其涉及鈕扣(knobs-into-holes, KIH)技術。KiH係異二聚體，其含有：2個Fab片段，其結合至目標1及2；及Fc，其係藉由異二聚化突變穩定。呈KiH形式之TriNKET ®可係異二聚體構築體，其具有結合至目標1及2之2個Fab片段，含有兩個不同重鏈及與兩個重鏈配對的共同輕鏈。 ［ 圖 5］係呈雙可變域免疫球蛋白(dual-variable domain immunoglobulin, DVD-Ig ™)形式之TriNKET ®的圖示，其經由可撓性天然存在的連接子組合兩種單株抗體之目標結合域，並產出四價類IgG分子。DVD-Ig ™係同二聚體構築體，其中靶向抗原2之可變域係融合至靶向抗原1之Fab片段之可變域之N端。DVD-Ig ™形式含有正常Fc。 ［ 圖 6］係呈正交Fab片段界面(Ortho-Fab)形式之TriNKET ®的圖示，其係異二聚體構築體，其含有結合至目標1及目標2之2個Fab片段，該等Fab片段係融合至Fc。藉由正交界面確保輕鏈(LC)-重鏈(HC)配對。藉由Fc中之突變確保異二聚化。 ［ 圖 7］係呈2合1 Ig形式之TriNKET ®的圖示。 ［ 圖 8］係呈ES形式之TriNKET ®的圖示，其係異二聚體構築體，其含有結合至目標1及目標2之兩個不同Fab片段，該等Fab片段係融合至Fc。藉由Fc中之靜電轉向(electrostatic steering)突變確保異二聚化。 ［ 圖 9］係呈Fab臂交換形式之TriNKET ®的圖示：交換Fab片段臂的抗體，其藉由將重鏈及附接之輕鏈（半分子）換成來自另一分子之重-輕鏈對，因而產生雙特異性抗體。Fab臂交換形式(cFae)係異二聚體，其含有：2個Fab片段，其結合至目標1及2；及Fc，其係藉由異二聚化突變穩定。 ［ 圖 10］係呈SEED Body形式之TriNKET ®的圖示，其係異二聚體，其含有：2個Fab片段，其結合至目標1及2；及Fc，其係藉由異二聚化突變穩定。 ［ 圖 11］係呈LuZ-Y形式之TriNKET ®的圖示，其中白胺酸拉鏈係用以誘導兩個不同HC的異二聚化。LuZ-Y形式係異二聚體，其含有結合至目標1及2之兩個不同scFab，該等scFab係融合至Fc。透過白胺酸拉鏈模體（融合至Fc之C端）確保異二聚化。 ［ 圖 12］係呈Cov-X-Body形式之TriNKET ®的圖示。 ［ 圖 13A］ 至［ 圖 13B］係呈ĸλ-Body形式之TriNKET ®的圖示，其係具有兩個不同Fab片段之異二聚體構築體，該等Fab片段係融合至Fc（藉由異二聚化突變穩定）：靶向抗原1之一個Fab片段含有κLC，且靶向抗原2之第二個Fab片段含有λLC。 圖 13A係一種ĸλ-Body形式的例示性圖示； 圖 13B係另一種ĸλ-Body的例示性圖示。 ［ 圖 14］係OAsc-Fab異二聚體構築體的圖示，其包括結合至目標1之Fab片段及結合至目標2之scFab，兩者皆係融合至Fc域。藉由Fc域中之突變確保異二聚化。 ［ 圖 15］係DuetMab的圖示，其係異二聚體構築體，其含有：兩個不同Fab片段，其結合至抗原1及2；及Fc，其係藉由異二聚化突變穩定。Fab片段1及2含有差別性S-S鍵，其確保正確的輕鏈及重鏈配對。 ［ 圖 16］係CrossmAb的圖示，其係異二聚體構築體，其具有：兩個不同Fab片段，其結合至目標1及2；及Fc，其係藉由異二聚化突變穩定。將CL及CH1域與VH及VL域切換，例如，CH1係與VL線上(in-line)融合，且CL係與VH線上融合。 ［ 圖 17］係Fit-Ig的圖示，其係同二聚體構築體，其中結合至抗原2之Fab片段係融合至結合至抗原1之Fab片段之HC之N端。構築體含有野生型Fc。 ［ 圖 18A］ 至［ 圖 18C］係顯示由5T4結合TriNKET ®所致之5T4 +H1975細胞之結合及裂解的圖，5T4結合TriNKET ®具有指示鼠類抗體殖株之5T4結合位點。 圖 18A顯示5T4-TriNKET ®與H1975細胞之結合的濃度曲線。 圖 18B顯示在不同濃度的5T4-TriNKET ®存在下培養之KHYG-CD16V細胞所誘導的H1975細胞裂解。 圖 18C顯示在不同濃度的指示08E06衍生之5T4-TriNKET ®存在下培養之KHYG-CD16V細胞所誘導的H1975細胞裂解。 ［ 圖 19A］至［ 圖 19H］係顯示多特異性結合蛋白之表面電漿共振(surface plasmon resonance, SPR)的圖。 圖 19A顯示在pH 7.4下AB1310/AB1783-TriNKET ®與人類5T4之結合。 圖 19B顯示在pH 7.4下AB0064-TriNKET ®與人類5T4之結合。 圖 19C顯示在pH 7.4下AB0064-TriNKET ®與食蟹獼猴5T4之結合。 圖 19D顯示在pH 7.4下AB0063-TriNKET ®與人類5T4之結合。 圖 19E顯示在pH 7.4下AB0063與食蟹獼猴5T4之結合。 圖 19F顯示在pH 7.4下AB1310/AB1783-TriNKET ®與人類NKG2D之結合。 圖 19G顯示在pH 7.4下AB1310/AB1783-TriNKET ®與人類NKG2D之結合。 圖 19H顯示在pH 7.4下AB1310/AB1783-TriNKET ®與人類CD16α之結合。 ［ 圖 20A］ 至［ 圖 20C］係顯示濃度曲線的圖，濃度曲線顯示AB1310/AB1783-TriNKET ®及親本抗體10F10與5T4表現性細胞之結合飽和。 圖 20A顯示與KYSE-30細胞之結合。 圖 20B顯示與H292細胞之結合。 圖 20C顯示與H2172細胞之結合。 ［ 圖 21A］ 至［ 圖 21F］係顯示免疫細胞之活化的圖，活化係藉由下列測量：在不同濃度的指示5T4-TriNKET ®存在下培養之NK細胞、T細胞、或巨噬細胞所誘導的腫瘤細胞裂解或細胞介素釋放。 圖 21A顯示在AB1310/AB1783-TriNKET ®存在下生長之V/F NK細胞所誘導的H292細胞裂解。 圖 21B顯示在AB1310/AB1783-TriNKET ®存在下生長之F/F NK細胞所誘導的H292細胞裂解。 圖 21C顯示在AB1310/AB1783- TriNKET ®存在下生長之經刺激CD8+ T細胞所誘導的786-O細胞裂解。 圖21D顯示在AB1310/AB1783-TriNKET ®存在下生長之初代NK細胞所誘導的H1975細胞之干擾素γ (IFNγ)釋放。 圖 21E顯示在AB1310/AB1783-TriNKET ®存在下生長之初代M0巨噬細胞所致的H292細胞之吞噬作用。 圖 21F顯示在AB1310/AB1783-TriNKET ®存在下生長之初代M0巨噬細胞所致的KYSE-30食道鱗狀細胞癌(EsoSCC)細胞之吞噬作用。 ［ 圖 22A］ 至［ 圖 22D］係顯示癌相關纖維母細胞(CAF)之結合或裂解的圖。 圖 22A係顯示AB1310/AB1783-TriNKET ®與CAF之結合飽和的濃度曲線。 圖 22B係顯示AB1310/AB1783-TriNKET ®與腫瘤細胞系及初代CAF之觀察到的結合EC 50值的圖。 圖 22C顯示在AB1310/AB1783-TriNKET ®存在下V/F NK細胞所誘導的CAF裂解。 圖 22D顯示在AB1310/AB1783-TriNKET ®存在下F/F NK細胞所誘導的CAF裂解。 ［ 圖 23］顯示多特異性檢定的圖，其顯示AB1310/AB1783-TriNKET ®（左圖）或對照組（中圖及右圖）在多特異性試劑(poly-specificity reagent, PSR)不存在（上圖）或存在（下圖）下的情況。 ［ 圖 24A］ 至［ 圖 24H］係彙總AB1310/AB1783-TriNKET ®之可製造性的圖。 圖 24A係顯示AB1310/AB1783-TriNKET ®之粒徑篩析層析法(size-exclusion chromatography, SEC)分析的層析圖。 圖 24B係顯示AB1310/AB1783-TriNKET ®之非還原毛細管電泳(non-reduced capillary electrophoresis, NR-CE)的圖。 圖 24C係顯示AB1310/AB1783-TriNKET ®之還原毛細管電泳(R-CE)的圖。 圖 24D係顯示AB1310/AB1783-TriNKET ®之質譜分析的圖。 圖 24E係顯示AB1310/AB1783- TriNKET ®之毛細管等電聚焦(capillary isoelectric focusing, cIEF)分析的圖。 圖 24F係顯示AB1310/AB1783-TriNKET ®之微差掃描熱量法(differential scanning calorimetry, DSC)分析的圖。 圖 24G係顯示AB1310/AB1783-TriNKET ®之疏水性交互作用層析法(hydrophobic interaction chromatography, HIC)分析的圖。 圖 24H係比較AB1310/AB1783-TriNKET ®相對於基準單株抗體之HIC分析的圖。 ［ 圖 25A］ 至［ 圖 25G］係彙總AB1310/AB1783-TriNKET ®穩定性的圖。 圖 25A係彙總在各種溫度下培養78 hr之後AB1310/AB1783-TriNKET ®之SEC分析的圖。 圖 25B係顯示AB1310/AB1783-TriNKET ®於PBS緩衝劑(pH 7.4)中之DSC分析的圖。 圖 25C係顯示AB1310/AB1783-TriNKET ®於HST緩衝劑(pH 6.0)中之DSC分析的圖。 圖 25D係彙總在指示條件下培養之後AB1310/AB1783-TriNKET ®之SEC分析的圖。 圖 25E係顯示在指示條件下培養之後AB1310/AB1783-TriNKET ®之NR-CE分析的圖。 圖 25F係顯示在指示條件下培養之後AB1310/AB1783-TriNKET ®之R-CE的圖。 圖 25G係顯示在不同濃度的AB1310/AB1783-TriNKET ®存在下培養且在指示條件下培養之後之KHYG-CD16V NK細胞所誘導的H292細胞裂解的圖。 ［ 圖 26A］ 至［ 圖 26D］係顯示各種濃度的10F10（ 圖 26A及 圖 26C）、11F09（ 圖 26B及 圖 26D）、及其突變體（經由人源化及序列不利條件(sequence liability)修正產生）與5T4 +H1975細胞之結合（相對於背景的倍數(fold over background, FOB)）的圖。 圖 26E 及圖26F係顯示各種濃度的人源化5T4結合體與5T4表現性腫瘤細胞之結合（相對於背景的倍數(FOB)）的圖。 ［ 圖 27A］ 至［ 圖 27C］係針對TriNKET ®（ 圖 27A）、親本mAb（ 圖 27B ）、及Fc靜默TriNKET ®（ 圖 27C），顯示AB1310/AB1783-TriNKET ®與5T4 (TPBG)及NKG2D-DAP10 (KLRK1 + HCST)之結合的蛋白質檢定。 ［ 圖 28A］ 至［ 圖 28B］係展示AB1310/AB1783-TriNKET ®5T4及NKG2D靶向臂之共銜接的圖，無論是先與5T4（ 圖 28A）或先與NKG2D（ 圖 28B）結合。 ［ 圖 29］係描繪AB1310/AB1783-TriNKET ®結合NKG2D及CD16兩者的感測圖。 ［ 圖 30A］至［ 圖 30B］係針對人類（ 圖 30A）及食蟹獼猴（ 圖 30B）NK細胞，顯示在與KYSE-30細胞共培養後AB1310/AB1783-TriNKET ®所致之NK細胞活化的圖。 ［ 圖 31A］ 至［ 圖 31D］係顯示AB1310-TriNKET ®（相較於對照組）所致之效應細胞介導之5T4 +細胞系殺滅的圖。 圖 31A顯示NK細胞介導之KYSE-30細胞殺滅。 圖 31B顯示NK細胞介導之H292細胞殺滅。 圖 31C顯示周邊血液單核細胞(PBMC)介導之KYSE-30細胞殺滅。 圖 31D顯示PBMC介導之H292細胞殺滅。 ［ 圖 32A］ 至［ 圖 32C］顯示包括AB1310/AB1783-TriNKET ®之例示性配方的SEC結果。 圖 32A係在50℃下培養6天之配方中之AB1310/AB1783-TriNKET ®的層析圖。 圖 32B係在40℃下培養21天之配方中之AB1310/AB1783-TriNKET ®的層析圖。 圖 32C係顯示在指示儲存溫度下具有指示pH之配方中AB1310/AB1783-TriNKET ®的單體百分比變化的圖。 ［ 圖 33A］ 至［ 圖 33C］係顯示帶電物種變化的圖，其係在指示pH水平下配方（包括AB1310/AB1783-TriNKET ®）之電泳圖之酸性（ 圖 33A）、中性（ 圖 33B）、及鹼性（ 圖 33C）區中藉由cIEF測量。 ［ 圖 34A］ 至［ 圖 34C］顯示藉由NR-CE測量之在指示pH水平下配方（包括AB1310/AB1783-TriNKET ®）之純度（ 圖 34A）、片段數目（ 圖 34B）、及高分子量物種（ 圖 34C）的變化。 ［ 圖 35］顯示指示配方中AB1310/AB1783-TriNKET ®藉由SEC觀察之單體百分比變化。 ［ 圖 36］顯示指示配方中AB1310/AB1783-TriNKET ®藉由cIEF觀察之電泳圖中性區中的鋒百分比變化。 ［ 圖 37A］及［ 圖 37B］顯示藉由R-CE（ 圖 37A）及NR-CE（ 圖 37B）測量之指示配方中AB1310/AB1783-TriNKET ®之純度。 ［ 圖 38A］ 至［ 圖 38D］係指示配方中AB1310/AB1783-TriNKET ®之動態光散射(dynamic light scattering, DLS)結果圖。 圖 38A顯示配方之DLS結果，該配方含有組胺酸緩衝劑及聚山梨醇酯80。 圖 38B顯示配方之DLS結果，該配方含有組胺酸緩衝劑，但不具有聚山梨醇酯80。 圖 38C顯示配方之DLS結果，該配方含有檸檬酸鹽緩衝劑及聚山梨醇酯80。 圖 38D顯示配方之DLS結果，該配方含有檸檬酸鹽緩衝劑，但不具有聚山梨醇酯80。 ［ 圖 39A］ 至［ 圖 39C］係顯示藉由SEC測量之配方中AB1310/AB1783-TriNKET ®隨時間之單體%的圖，該等配方含有指示濃度的蔗糖（以% w/v表示）。 圖 39A係顯示在30℃下培養之配方中AB1310/AB1783-TriNKET ®隨時間之單體%的圖，該配方含有6% (w/v)蔗糖。 圖 39B係顯示在40℃下培養之配方中AB1310/AB1783-TriNKET ®隨時間之單體%的圖，該等配方含有3%、6%、或9% (w/v)蔗糖。 圖 39C係顯示在50℃下培養之配方中AB1310/AB1783-TriNKET ®隨時間之單體%的圖，該等配方含有3%、6%、或9% (w/v)蔗糖。 ［ 圖 40A］ 至［ 圖 40C］係顯示藉由cIEF測量之配方中AB1310/AB1783-TriNKET ®隨時間之電泳圖中性區中之主峰%的圖，該等配方含有指示濃度的蔗糖（以% w/v表示）。 圖 40A係顯示在30℃下培養之配方中AB1310/AB1783-TriNKET ®隨時間之電泳圖中性區中之主峰%的圖，該配方含有6% (w/v)蔗糖。 圖 40B係顯示在40℃下培養之配方中AB1310/AB1783-TriNKET ®隨時間之電泳圖中性區中之主峰%的圖，該等配方含有3%、6%、或9% (w/v)蔗糖。 圖 40C係顯示在50℃下培養之配方中AB1310/AB1783-TriNKET ®隨時間之電泳圖中性區中之主峰%的圖，該等配方含有3%、6%、或9% (w/v)蔗糖。 ［ 圖 41］顯示在指示蔗糖濃度（以% w/v表示）下 圖 39B及 圖 40B的組合結果。 ［ 圖 42A］ 至［ 圖 42B］繪示下列之裂解：BT-474（乳癌(BRCC)；左圖）或FaDu（頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)；右圖）腫瘤細胞，其係在與初免(primed)初代人類CD8+ T細胞之共培養中測量。自刀豆球蛋白A (Concanavalin A, Con A)及介白素(IL)-2活化周邊血液單核細胞(PBMC)單離CD8+ T細胞，接著用IL-15擴增並初免9天。各點及誤差槓分別表示來自總計4個影像（來自具有不同測試物品之二重複共培養孔）之抑制%的平均值及標準偏差(SD)。E:T無處理背景裂解係以虛線標記。將劑量反應曲線在GraphPad Prism中與非線性4參數迴歸模型擬合。所描繪之圖係來自單一供體的數據，其代表來自3名健康T細胞供體的數據。 ［ 圖 43A］ 至［ 圖 43D］繪示下列之長期裂解：5T4表現性腫瘤細胞系KYSE-30（食道鱗狀細胞(EsoSCC)癌； 圖 43A 至圖43B）及NCI-H292（非小細胞肺癌(NSCLC)；（ 圖 43C 至圖43D）），其係在與過夜靜置NK細胞之共培養中測量，該等過夜靜置NK細胞僅具有低親和力CD16a變體（158FF或F/F；左欄）或存在一些高親和力CD16a多型性F158V（158VF或V/F；右欄），其係在72小時內進行。向已以3000個腫瘤細胞/孔（經轉染以穩定表現NucLight ™Green）預先接種4小時的孔中，添加靜置初代人類NK細胞，以達5:1效應目標細胞比(E:T)。對AB1310/AB1783-TriNKET ®（圓圈）及親本mAb（方形）自100 nM至0.25 pM或自100 nM至0.05 pM進行劑量滴定，以1:5稀釋。使用Incucyte ®活細胞成像器，拍攝綠色螢光影像，以評估腫瘤細胞隨時間之生長及存活。在標準化至初始掃描以控制孔成像區域中細胞接種之變化性之後，藉由將處理孔與無處理孔進行比較，計算在72小時的抑制%。各點及誤差槓分別表示來自總計4個影像（來自具有不同測試物品之二重複共培養孔）之抑制%的平均值及標準偏差(SD)。將劑量反應曲線在GraphPad Prism中與非線性4參數迴歸模型擬合。所顯示之圖係來自具有給定CD16a基因型之單一供體的數據，其代表來自具有相同CD16a基因型之1至2名健康人類NK細胞供體的數據。
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Claims (230)

  1. 一種蛋白質，其包含： (a)    第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)； (b)   第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含分別包含SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列的互補決定區1 (CDR1)序列、互補決定區2 (CDR2)序列、及互補決定區3 (CDR3)序列，且該VL包含分別包含SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；及 (c)    足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。
  2. 一種蛋白質，其包含： (a)    第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)； (b)   第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含分別包含SEQ ID NO: 472、474、及140之胺基酸序列的互補決定區1 (CDR1)序列、互補決定區2 (CDR2)序列、及互補決定區3 (CDR3)序列，且該VL包含分別包含SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，其中該等CDR係根據Kabat編號方案；及 (c)    足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。
  3. 一種蛋白質，其包含： (a)    第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)； (b)   第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含分別包含SEQ ID NO: 138、482、及483之胺基酸序列的互補決定區1 (CDR1)序列、互補決定區2 (CDR2)序列、及互補決定區3 (CDR3)序列，且該VL包含分別包含SEQ ID NO: 484、485、及486之胺基酸序列的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，其中該等CDR係根據Chothia編號方案；及 (c)    足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。
  4. 一種蛋白質，其包含： (a)    第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)； (b)   第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含分別包含SEQ ID NO: 499、500、及501之胺基酸序列的互補決定區1 (CDR1)序列、互補決定區2 (CDR2)序列、及互補決定區3 (CDR3)序列，且該VL包含分別包含SEQ ID NO: 502、485、及143之胺基酸序列的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，其中該等CDR係根據IMGT編號方案；及 (c)    足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。
  5. 一種蛋白質，其包含： (a)    第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)； (b)   第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含分別包含SEQ ID NO: 516、521、及518之胺基酸序列的互補決定區1 (CDR1)序列、互補決定區2 (CDR2)序列、及互補決定區3 (CDR3)序列，且該VL包含分別包含SEQ ID NO: 519、522、及486之胺基酸序列的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，其中該等CDR係根據Honegger編號方案；及 (c)    足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。
  6. 如請求項1至5中任一項之蛋白質，其中包含該抗NKG2D抗體之該VH及該VL的該第一抗原結合位點係Fab片段，且包含該抗5T4抗體之該VH及該VL的該第二抗原結合位點係scFv。
  7. 如請求項1至5中任一項之蛋白質，其中包含該抗NKG2D抗體之該VH及該VL的該第一抗原結合位點係scFv，且包含該抗5T4抗體之該VH及該VL的該第二抗原結合位點係Fab片段。
  8. 如請求項1至7中任一項之蛋白質，其進一步包含額外抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL。
  9. 如請求項8之蛋白質，其中包含該抗NKG2D抗體之該VH及該VL的該第一抗原結合位點係scFv，且包含該抗5T4抗體之該VH及該VL的該第二抗原結合位點及該額外抗原結合位點各自係Fab片段。
  10. 如請求項8之蛋白質，其中包含該抗NKG2D抗體之該VH及該VL的該第一抗原結合位點係scFv，且包含該抗5T4抗體之該VH及該VL的該第二抗原結合位點及該額外抗原結合位點各自係scFv。
  11. 如請求項8至10中任一項之蛋白質，其中該第二抗原結合位點及該額外抗原結合位點之胺基酸序列係同一的。
  12. 如請求項7及10至11中任一項之蛋白質，其中包含該抗NKG2D抗體之該VH及該VL的該scFv係經由鉸鏈連接至足以結合CD16之抗體恆定域或其部分，該鉸鏈包含Ala-Ser或Gly-Ser
  13. 如請求項6及10至12中任一項之蛋白質，其中包含該抗5T4抗體之該VH及該VL的各scFv係經由鉸鏈連接至足以結合CD16之抗體恆定域或其部分，該鉸鏈包含Ala-Ser或Gly-Ser。
  14. 如請求項6及10至13中任一項之蛋白質，其中包含該抗5T4抗體之該VH及該VL的各scFv係經由鉸鏈連接至足以結合CD16之抗體恆定域或其部分，該鉸鏈包含Ala-Ser。
  15. 如請求項12或請求項13之蛋白質，其中該鉸鏈進一步包含胺基酸序列Thr-Lys-Gly。
  16. 如請求項7及9至15中任一項之蛋白質，其中在包含該抗NKG2D抗體之該VH及該VL的該scFv內，該scFv之該VH與該scFv之該VL形成雙硫鍵。
  17. 如請求項6及10至16中任一項之蛋白質，其中在包含該抗5T4抗體之該VH及該VL的各scFv內，該scFv之該VH與該scFv之該VL形成雙硫鍵。
  18. 如請求項16或請求項17之蛋白質，其中該雙硫鍵係在該VH之C44與該VL之C100之間形成，其係依Kabat編號方案編號。
  19. 如請求項7及9至17中任一項之蛋白質，其中在包含該抗NKG2D抗體之該VH及該VL的該scFv內，該VH係經由可撓性連接子連接至該VL。
  20. 如請求項6及10至19中任一項之蛋白質，其中在包含該抗5T4抗體之該VH及該VL的各scFv內，該VH係經由可撓性連接子連接至該VL。
  21. 如請求項19或請求項20之蛋白質，其中該可撓性連接子包含(G 4S) 4(SEQ ID NO:119)。
  22. 如請求項7及9至21中任一項之蛋白質，其中在包含該抗NKG2D抗體之該VH及該VL的該scFv內，該VH係位於該VL之C端。
  23. 如請求項6及10至22中任一項之蛋白質，其中在包含該抗5T4抗體之該VH及該VL的各scFv內，該VH係位於該VL之C端。
  24. 如請求項7及9至21中任一項之蛋白質，其中在包含該抗NKG2D抗體之該VH及該VL的該scFv內，該VH係位於該VL之N端。
  25. 如請求項6、10至22、及24中任一項之蛋白質，其中在包含該抗5T4抗體之該VH及該VL的各scFv內，該VH係位於該VL之N端。
  26. 如請求項6、13至15、17至18、20至21、23、及25中任一項之蛋白質，其中包含該抗NKG2D抗體之該VH及該VL的該Fab片段不位於抗原結合位點與該Fc或其部分之間。
  27. 如請求項7、9、11至12、15至16、18至19、21至22、及24中任一項之蛋白質，其中無包含該抗5T4抗體之該VH及該VL的Fab片段位於抗原結合位點與該Fc或其部分之間。
  28. 如請求項1至27中任一項之蛋白質，其中該第一抗原結合位點結合人類NKG2D。
  29. 如請求項1至28中任一項之蛋白質，其中該第二抗原結合位點結合人類5T4。
  30. 如請求項1至29中任一項之蛋白質，其中該第二抗原結合位點在LRR1域內結合人類5T4。
  31. 如請求項1至30中任一項之蛋白質，其中該CD16係人類CD16。
  32. 如請求項31之蛋白質，其中該人類CD16係人類CD16a (FcγRIIIa)。
  33. 如請求項1至32中任一項之蛋白質，其中包含該抗NKG2D抗體之該VH及該VL的該第一抗原結合位點包含：VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 81、82、及112之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。
  34. 一種蛋白質，其包含： (a)    第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 81、82、及112之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含分別由SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列； (b)   第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含分別由SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；及 (c)    足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。
  35. 如請求項1至34中任一項之蛋白質，其中包含該抗NKG2D抗體之該VH及該VL的該第一抗原結合位點包含：VH，其包含分別由SEQ ID NO: 81、82、及97之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；及VL，其包含分別由SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列。
  36. 一種蛋白質，其包含： (a)    第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 81、82、及112之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含分別由SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列； (b)   第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 472、474、及140之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含分別由SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，其中該編號係根據Kabat編號方案；及 (c)    足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。
  37. 如請求項1至33及36中任一項之蛋白質，其中包含該抗NKG2D抗體之該VH及該VL的該第一抗原結合位點包含：VH，其包含分別由SEQ ID NO: 81、82、及97之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；及VL，其包含分別由SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列。
  38. 一種蛋白質，其包含： (a)    第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 381、390、及391之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含分別由SEQ ID NO: 392、385、及393之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列； (b)   第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 138、482、及483之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含分別由SEQ ID NO: 484、485、及486之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，其中該編號係根據Chothia編號方案；及 (c)    足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。
  39. 如請求項1至33及38中任一項之蛋白質，其中包含該抗NKG2D抗體之該VH及該VL的該第一抗原結合位點包含：VH，其包含分別由SEQ ID NO: 381、390、及395之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；及VL，其包含分別由SEQ ID NO: 392、385、及393之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列。
  40. 一種蛋白質，其包含： (a)    第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 422、423、及111之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含分別由SEQ ID NO: 424、385、及87之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列； (b)   第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 499、500、及501之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含分別由SEQ ID NO: 502、485、及143之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，其中該編號係根據IMGT編號方案；及 (c)    足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。
  41. 如請求項1至33及40中任一項之蛋白質，其中包含該抗NKG2D抗體之該VH及該VL的該第一抗原結合位點包含：VH，其包含分別由SEQ ID NO: 422、423、及96之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；及VL，其包含分別由SEQ ID NO: 424、385、及87之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列。
  42. 一種蛋白質，其包含： (a)    第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 462、463、及464之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含由SEQ ID NO: 465、459、及393之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列； (b)   第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 516、521、及518之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含由SEQ ID NO: 519、522、及486之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，其中該編號係根據Honegger編號方案；及 (c)    足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。
  43. 如請求項1至33及42中任一項之蛋白質，其中包含該抗NKG2D抗體之該VH及該VL的該第一抗原結合位點包含：VH，其包含分別由SEQ ID NO: 462、463、及467之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；及VL，其包含分別由SEQ ID NO: 465、459、及393之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列。
  44. 如請求項1至43中任一項之蛋白質，其中該抗體Fc域包含足以結合CD16之第一抗體Fc域多肽或其部分、及足以結合CD16之第二抗體Fc域多肽或其部分。
  45. 如請求項1至44中任一項之蛋白質，其中該抗NKG2D抗體之該VH或該VL係融合至足以結合CD16之該第一抗體Fc域多肽或其部分之N端，且該抗5T4抗體之該VH或該VL係融合至足以結合CD16之該第二抗體Fc域多肽或其部分之N端。
  46. 如請求項1至45中任一項之蛋白質，其中該抗NKG2D抗體之該VH係融合至足以結合CD16之該第一抗體Fc域多肽或其部分之N端，且該抗5T4抗體之該VH係融合至足以結合CD16之該第二抗體Fc域多肽或其部分之N端。
  47. 一種蛋白質，其包含： (a)    第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 81、82、及97之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含由SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列； (b)   第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含由SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；及 (c)    抗體Fc域，其包含足以結合CD16之第一抗體Fc域多肽或其部分、及足以結合CD16之第二抗體Fc域多肽或其部分；且 其中該抗NKG2D抗體之該VH或該VL係融合至足以結合CD16之該第一抗體Fc域多肽或其部分之N端，且該抗5T4抗體之該VH或該VL係融合至足以結合CD16之該第二抗體Fc域多肽或其部分之N端。
  48. 一種蛋白質，其包含： (a)    第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 81、82、及97之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含由SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列； (b)   第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含由SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；及 (c)    抗體Fc域，其包含第一抗體Fc域多肽或其部分、及第二抗體Fc域多肽或其部分，其中該第一抗體Fc域多肽或其部分、及該第二抗體Fc域多肽或其部分一起能夠結合CD16；且 其中該抗NKG2D抗體之該VH或該VL係融合至足以結合CD16之該第一抗體Fc域多肽或其部分之N端，且該抗5T4抗體之該VH或該VL係融合至足以結合CD16之該第二抗體Fc域多肽或其部分之N端。
  49. 如請求項1至48中任一項之蛋白質，其中該第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:95至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:85至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列。
  50. 如請求項1至49中任一項之蛋白質，其中該第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:95至少95%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:85至少95%同一的胺基酸序列。
  51. 如請求項1至50中任一項之蛋白質，其中該第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:95至少96%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:85至少96%同一的胺基酸序列。
  52. 如請求項1至51中任一項之蛋白質，其中該第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:95至少97%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:85至少97%同一的胺基酸序列。
  53. 如請求項1至52中任一項之蛋白質，其中該第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:95至少98%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:85至少98%同一的胺基酸序列。
  54. 如請求項1至53中任一項之蛋白質，其中該第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:95至少99%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:85至少99%同一的胺基酸序列。
  55. 如請求項1至54中任一項之蛋白質，其中該第一抗原結合位點包含：VH，其包含SEQ ID NO:95之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO:85之胺基酸序列。
  56. 如請求項1至55中任一項之蛋白質，其中該第二抗原結合位點包含：VH，其與SEQ ID NO:144至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一；及VL，其與SEQ ID NO:145至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一。
  57. 如請求項1至55中任一項之蛋白質，其中該第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:263至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:145至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列。
  58. 如請求項56或請求項57之蛋白質，其中該第二抗原結合位點包含：VH，其相對於SEQ ID NO:144具有G44C取代；及VL，其相對於SEQ ID NO:145具有G100C取代，其係依Kabat編號方案編號。
  59. 如請求項1至57中任一項之蛋白質，其中該第二抗原結合位點包含：包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列的VH、及包含SEQ ID NO:145之胺基酸序列的VL；或包含與SEQ ID NO:146至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列的VH、及包含與SEQ ID NO:147至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列的VL。
  60. 如請求項1至55及59中任一項之蛋白質，其中該第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:146至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:147至少90%、例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列。
  61. 如請求項1至55及59至60中任一項之蛋白質，其中該第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:146至少95%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:147至少95%同一的胺基酸序列。
  62. 如請求項1至55及59至61中任一項之蛋白質，其中該第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:146至少96%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:147至少96%同一的胺基酸序列。
  63. 如請求項1至55及59至62中任一項之蛋白質，其中該第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:146至少97%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:147至少97%同一的胺基酸序列。
  64. 如請求項1至55及59至63中任一項之蛋白質，其中該第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:146至少98%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:147至少98%同一的胺基酸序列。
  65. 如請求項1至55及59至64中任一項之蛋白質，其中該第二抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:146至少99%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:147至少99%同一的胺基酸序列。
  66. 如請求項1至55及59至65中任一項之蛋白質，其中該第二抗原結合位點包含：VH，其包含SEQ ID NO:146之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO:147之胺基酸序列。
  67. 如請求項1至59中任一項之蛋白質，其中該第二抗原結合位點包含：VH，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO:145之胺基酸序列。
  68. 如請求項1、6、13至15、17至18、20至21、23、25至26、28至55、及59至66中任一項之蛋白質，其中該第二抗原結合位點包含單鏈可變片段(scFv)，且其中該scFv包含：VH，其包含SEQ ID NO:146之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO:147之胺基酸序列。
  69. 如請求項1、6、13至15、17至18、20至21、23、25至26、28至55、及59至66中任一項之蛋白質，其中該第二抗原結合位點包含單鏈可變片段(scFv)，且其中該scFv包含與選自由SEQ ID NO: 148及149所組成之群組的序列至少90%同一、例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的胺基酸序列。
  70. 如請求項1、6、13至15、17至18、20至21、23、25至26、28至55、及59至66中任一項之蛋白質，其中該第二抗原結合位點包含scFv，且該scFv包含與SEQ ID NO:148至少90%同一、例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的胺基酸序列。
  71. 如請求項1、6、13至15、17至18、20至21、23、25至26、28至55、59至66、及70中任一項之蛋白質，其中該第二抗原結合位點包含scFv，且該scFv包含與SEQ ID NO:148至少95%同一的胺基酸序列。
  72. 如請求項1、6、13至15、17至18、20至21、23、25至26、28至55、59至66、及70至71中任一項之蛋白質，其中該第二抗原結合位點包含scFv，且該scFv包含與SEQ ID NO:148至少96%同一的胺基酸序列。
  73. 如請求項1、6、13至15、17至18、20至21、23、25至26、28至55、59至66、及70至72中任一項之蛋白質，其中該第二抗原結合位點包含scFv，且該scFv包含與SEQ ID NO:148至少97%同一的胺基酸序列。
  74. 如請求項1、6、13至15、17至18、20至21、23、25至26、28至55、59至66、及70至73中任一項之蛋白質，其中該第二抗原結合位點包含scFv，且該scFv包含與SEQ ID NO:148至少98%同一的胺基酸序列。
  75. 如請求項1、6、13至15、17至18、20至21、23、25至26、28至55、59至66、及70至74中任一項之蛋白質，其中該第二抗原結合位點包含scFv，且該scFv包含與SEQ ID NO:148至少99%同一的胺基酸序列。
  76. 如請求項1、6、13至15、17至18、20至21、23、25至26、28至55、59至66、及70至75中任一項之蛋白質，其中該第二抗原結合位點包含scFv，且該scFv包含SEQ ID NO:148之胺基酸序列。
  77. 如請求項1、6、13至15、17至18、20至21、23、25至26、28至55、59至66、及70至76中任一項之蛋白質，其中該蛋白質包含與SEQ ID NO:198至少90%同一、例如至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一的胺基酸序列。
  78. 如請求項1、6、13至15、17至18、20至21、23、25至26、28至55、59至66、及70至77中任一項之蛋白質，其中該蛋白質包含與SEQ ID NO:198至少95%同一的胺基酸序列。
  79. 如請求項1、6、13至15、17至18、20至21、23、25至26、28至55、59至66、及70至78中任一項之蛋白質，其中該蛋白質包含與SEQ ID NO:198至少96%同一的胺基酸序列。
  80. 如請求項1、6、13至15、17至18、20至21、23、25至26、28至55、59至66、及70至79中任一項之蛋白質，其中該蛋白質包含與SEQ ID NO:198至少97%同一的胺基酸序列。
  81. 如請求項1、6、13至15、17至18、20至21、23、25至26、28至55、59至66、及70至80中任一項之蛋白質，其中該蛋白質包含與SEQ ID NO:198至少98%同一的胺基酸序列。
  82. 如請求項1、6、13至15、17至18、20至21、23、25至26、28至55、59至66、及70至81中任一項之蛋白質，其中該蛋白質包含與SEQ ID NO:198至少99%同一的胺基酸序列。
  83. 如請求項1、6、13至15、17至18、20至21、23、25至26、28至55、59至66、及70至82中任一項之蛋白質，其中該蛋白質包含SEQ ID NO:198之胺基酸序列。
  84. 一種蛋白質，其包含： (a)    第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，其中該VH包含SEQ ID NO:95之胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO:85之胺基酸序列； (b)   第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含SEQ ID NO:146之胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO:147之胺基酸序列；及 (c)    抗體Fc域，其包含足以結合CD16之第一抗體Fc域多肽或其部分、及足以結合CD16之第二抗體Fc域多肽或其部分。
  85. 一種蛋白質，其包含： (a)    第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，其中該VH包含SEQ ID NO:95之胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO:85之胺基酸序列； (b)   第二抗原結合位點，其包含SEQ ID NO:148之胺基酸序列；及 (c)    抗體Fc域，其包含足以結合CD16之第一抗體Fc域多肽或其部分、及足以結合CD16之第二抗體Fc域多肽或其部分。
  86. 一種蛋白質，其包含： (a)    第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)； (b)   第二抗原結合位點，其包含：包含選自表2之CDR1、CDR2、及CDR3序列的VH、及包含選自表2之CDR1、CDR2、及CDR3序列的VL；或包含選自表12之CDR1、CDR2、及CDR3序列的VH、及包含分別包含SEQ ID NO: 189、190、及143之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3的VL；及 (c)    足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。
  87. 如請求項1至86中任一項之蛋白質，其中該抗體Fc域係人類IgG1抗體Fc域。
  88. 如請求項87之蛋白質，其中該抗體Fc域或其部分包含與SEQ ID NO:118至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列。
  89. 如請求項87至88中任一項之蛋白質，其中該抗體Fc域或其部分包含與SEQ ID NO:118至少95%同一的胺基酸序列。
  90. 如請求項87至89中任一項之蛋白質，其中該抗體Fc域或其部分包含與SEQ ID NO:118至少96%同一的胺基酸序列。
  91. 如請求項87至90中任一項之蛋白質，其中該抗體Fc域或其部分包含與SEQ ID NO:118至少97%同一的胺基酸序列。
  92. 如請求項87至91中任一項之蛋白質，其中該抗體Fc域或其部分包含與SEQ ID NO:118至少98%同一的胺基酸序列。
  93. 如請求項87至92中任一項之蛋白質，其中該抗體Fc域之至少一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:118在選自下列之一或多個位置處包含一或多個突變：Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411、及K439，其係根據EU編號系統編號。
  94. 如請求項87至93中任一項之蛋白質，其中該抗體Fc域之至少一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:118包含選自下列之一或多個突變：Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、F405L、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、K409R、T411D、T411E、K439D、及K439E，其係根據EU編號系統編號。
  95. 如請求項87至94中任一項之蛋白質，其中該抗體重鏈恆定區之一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:118在選自下列之一或多個位置處包含一或多個突變：Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411、及K439；且該抗體重鏈恆定區之另一多肽鏈相對於SEQ ID NO:118在選自下列之一或多個位置處包含一或多個突變：Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、D401、F405、Y407、K409、T411、及K439，其係根據EU編號系統編號。
  96. 如請求項95之蛋白質，其中該抗體重鏈恆定區之一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:118包含K360E及K409W取代；且該抗體重鏈恆定區之另一多肽鏈相對於SEQ ID NO:118包含Q347R、D399V、及F405T取代，其係根據EU編號系統編號。
  97. 如請求項96之蛋白質，其中該抗NKG2D抗體之該VH係融合至相對於SEQ ID NO:118包含K360E及K409W取代的第一抗體Fc域多肽之N端，且該抗5T4抗體之該VH係融合至相對於SEQ ID NO:118包含Q347R、D399V、及F405T取代的第二抗體Fc域多肽之N端，其係根據EU編號系統編號。
  98. 如請求項96至97中任一項之蛋白質，其中該第一抗體Fc域多肽及該第二抗體Fc域多肽形成異二聚體。
  99. 如請求項96至98中任一項之蛋白質，其中異二聚體形成係由下列促進：該第一抗體Fc域多肽中之該K360E及K409W取代；及該第二抗體Fc域多肽中之該Q347R、D399V、及F405T取代。
  100. 如請求項95之蛋白質，其中該抗體重鏈恆定區之一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:118包含F405L取代；且該抗體重鏈恆定區之另一多肽鏈相對於SEQ ID NO:118包含K409R取代，其係根據EU編號系統編號。
  101. 如請求項95至100中任一項之蛋白質，其中該抗體重鏈恆定區之一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:118包含Y349C取代；且該抗體重鏈恆定區之另一多肽鏈相對於SEQ ID NO:118包含S354C取代，其係根據EU編號系統編號。
  102. 如請求項101之蛋白質，其中該抗NKG2D抗體之該VH係融合至相對於SEQ ID NO:118包含Y349C取代的第一抗體Fc域多肽之N端，且該抗5T4抗體之該VH係融合至相對於SEQ ID NO:118包含S354C取代的第二抗體Fc域多肽之N端，其係根據EU編號系統編號。
  103. 如請求項101至102中任一項之蛋白質，其中該第一抗體Fc域多肽與該第二抗體Fc域多肽形成雙硫鍵。
  104. 如請求項101至103中任一項之蛋白質，其中該雙硫鍵係在該第一抗體Fc域多肽中之該Y349C取代與該第二抗體Fc域多肽中之該S354C取代之間形成，其係根據EU編號系統編號。
  105. 如請求項1、6、13至15、17至18、20至21、23、25至26、28至55、59至66、及70至104中任一項之蛋白質，其中該蛋白質包含： (a)    第一多肽，其包含與SEQ ID NO:198至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列； (b)   第二多肽，其包含與SEQ ID NO:199至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列；及 (c)    第三多肽，其包含與SEQ ID NO:200至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列。
  106. 如請求項1、6、13至15、17至18、20至21、23、25至26、28至55、59至66、及70至105中任一項之蛋白質，其中該蛋白質包含： (a)    第一多肽，其包含與SEQ ID NO:198至少95%同一的胺基酸序列； (b)   第二多肽，其包含與SEQ ID NO:199至少95%同一的胺基酸序列；及 (c)    第三多肽，其包含與SEQ ID NO:200至少95%同一的胺基酸序列。
  107. 如請求項1、6、13至15、17至18、20至21、23、25至26、28至55、59至66、及70至106中任一項之蛋白質，其中該蛋白質包含： (a)    第一多肽，其包含SEQ ID NO:198之胺基酸序列； (b)   第二多肽，其包含SEQ ID NO:199之胺基酸序列；及 (c)    第三多肽，其包含SEQ ID NO:200之胺基酸序列。
  108. 一種蛋白質，其包含： (a)    第一多肽，其包含與SEQ ID NO:198至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列； (b)   第二多肽，其包含與SEQ ID NO:199至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列；及 (c)    第三多肽，其包含與SEQ ID NO:200至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列。
  109. 如請求項105至108中任一項之蛋白質，其中： i)      人類NKG2D結合位點係由SEQ ID NO:199中之VH (SEQ ID NO:95)及SEQ ID NO:200中之VL (SEQ ID NO:85)形成， ii)     人類5T4結合位點係由SEQ ID NO:198中之VH (SEQ ID NO:146)及SEQ ID NO:198中之VL (SEQ ID NO:147)形成，且 iii)    人類CD16a結合位點係由SEQ ID NO:198中之Fc結合域多肽及SEQ ID NO:199中之Fc結合域多肽形成。
  110. 如請求項105至109中任一項之蛋白質，其中： i)      雙硫鍵係在SEQ ID NO:146中之C44與SEQ ID NO:147中之C100之間形成，其係依Kabat編號方案編號， ii)     雙硫鍵係在SEQ ID NO:199中之C349與SEQ ID NO:198中之C354之間形成，其係根據EU編號系統編號，且 iii)    異二聚體係在SEQ ID NO:198中之Fc域與SEQ ID NO:199中之Fc域之間形成。
  111. 如請求項105至110中任一項之蛋白質，其中該蛋白質係三特異性抗體。
  112. 如請求項105至111中任一項之蛋白質，其中該三特異性抗體能夠結合至NK細胞表面上之人類NKG2D及人類CD16a及結合至腫瘤細胞表面上之人類5T4。
  113. 一種三特異性抗體，其包含： (a)    人類NKG2D結合位點，其係包含VH及VL之Fab片段，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 81、82、及97之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含分別由SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列； (b)   人類5T4結合位點，其係包含VH及VL之scFv，其中該VH包含分別包含SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含分別包含SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列， 其中該VH係位於該VL之C端， 其中該VH係經由可撓性連接子連接至該VL，該可撓性連接子包含(G 4S) 4(SEQ ID NO:119)，且 其中雙硫鍵係在該VH之C44與該VL之C100之間形成，其係依Kabat編號方案編號；及 (c)    人類CD16a結合位點，其係包含下列之人類IgG1抗體Fc域： (i)    第一Fc域多肽，其包含與SEQ ID NO:118至少95%同一的胺基酸序列，且相對於SEQ ID NO:118包含Y349C、K360E、及K409W取代，其係根據EU編號系統編號，及 (ii)   第二Fc域多肽，其包含與SEQ ID NO:118至少95%同一的胺基酸序列，且相對於SEQ ID NO:118包含Q347R、S354C、D399V、及F405T取代，其係根據EU編號系統編號， 其中雙硫鍵係在(i)之C349與(ii)之C354之間形成，且 其中(i)及(iii)形成異二聚體， 其中(a)之該VH係融合至該第一Fc域多肽之N端，且(b)之該VH係經由鉸鏈融合至該第二Fc域多肽之N端，該鉸鏈包含Ala-Ser。
  114. 如請求項113之三特異性抗體，其中： ●      (a)之該VH包含SEQ ID NO:95之胺基酸序列， ●      (a)之該VL包含SEQ ID NO:85之胺基酸序列， ●      (b)之該VH包含SEQ ID NO:146之胺基酸序列， ●      (b)之該VL包含SEQ ID NO:147之胺基酸序列， ●      該第一Fc域多肽包含與SEQ ID NO:118至少98%同一的胺基酸序列，且 ●      該第二Fc域多肽包含與SEQ ID NO:118至少98%同一的胺基酸序列。
  115. 如請求項114之三特異性抗體，其中(b)包含SEQ ID NO:148之胺基酸序列。
  116. 如請求項113至115中任一項之三特異性抗體，其中該三特異性抗體包含： (a)    第一多肽，其包含SEQ ID NO:198之胺基酸序列； (b)   第二多肽，其包含SEQ ID NO:199之胺基酸序列；及 (c)    第三多肽，其包含SEQ ID NO:200之胺基酸序列。
  117. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至116中任一項之蛋白質或抗體、及醫藥上可接受之載劑。
  118. 一種細胞，其包含編碼如請求項1至116中任一項之蛋白質或抗體之一或多種核酸。
  119. 一種醫藥配方，其包含： a)     蛋白質，其包含： i)      第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)； ii)     第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL；及 iii)    足以結合CD16之抗體Fc域或其部分； b)     緩衝劑，其包含檸檬酸鹽； c)     蔗糖；及 d)     聚山梨醇酯， 其中該醫藥配方之pH係6.0至7.0。
  120. 如請求項119之醫藥配方，其中該醫藥配方中該蛋白質之濃度係1 mg/mL至125 mg/mL。
  121. 如請求項119或請求項120之醫藥配方，其中該醫藥配方中該蛋白質之濃度係2 mg/mL至100 mg/mL。
  122. 如請求項119至121中任一項之醫藥配方，其中該醫藥配方中該蛋白質之濃度係5 mg/mL至50 mg/mL。
  123. 如請求項119至122中任一項之醫藥配方，其中該醫藥配方中該蛋白質之濃度係7.5 mg/mL至25 mg/mL。
  124. 如請求項119至123中任一項之醫藥配方，其中該醫藥配方中該蛋白質之濃度係10 mg/mL至20 mg/mL。
  125. 如請求項119至124中任一項之醫藥配方，其中該醫藥配方中該蛋白質之濃度係約15 mg/mL。
  126. 如請求項119至125中任一項之醫藥配方，其中該醫藥配方中檸檬酸鹽之濃度係15 mM至25 mM。
  127. 如請求項119至126中任一項之醫藥配方，其中該醫藥配方中檸檬酸鹽之濃度係17.5 mM至22.5 mM。
  128. 如請求項119至127中任一項之醫藥配方，其中該醫藥配方中檸檬酸鹽之濃度係約20 mM。
  129. 如請求項119至128中任一項之醫藥配方，其中該醫藥配方中之包含檸檬酸鹽之該緩衝劑包含檸檬酸鈉、檸檬酸、或其組合。
  130. 如請求項119至129中任一項之醫藥配方，其中該醫藥配方中之該緩衝劑包含檸檬酸鈉及檸檬酸之組合。
  131. 如請求項129至130之醫藥配方，其中該醫藥配方中檸檬酸鈉之濃度係17 mM至21 mM。
  132. 如請求項129至131中任一項之醫藥配方，其中該醫藥配方中檸檬酸鈉之濃度係約18.9 mM。
  133. 如請求項129至132中任一項之醫藥配方，其中該醫藥配方中檸檬酸之濃度係0.5 mM至1.5 mM。
  134. 如請求項129至133中任一項之醫藥配方，其中該醫藥配方中檸檬酸之濃度係約1.1 mM。
  135. 如請求項119至134中任一項之醫藥配方，其中該醫藥配方中該緩衝劑之pH係6.0至7.0。
  136. 如請求項119至135中任一項之醫藥配方，其中該醫藥配方中該緩衝劑之pH係6.5。
  137. 如請求項119至136中任一項之醫藥配方，其中該醫藥配方中蔗糖之濃度係170 mM至180 mM。
  138. 如請求項119至137中任一項之醫藥配方，其中該醫藥配方中蔗糖之濃度係172.5 mM至177.5 mM。
  139. 如請求項119至138中任一項之醫藥配方，其中該醫藥配方中蔗糖之濃度係約175.2 mM。
  140. 如請求項119至139中任一項之醫藥配方，其中該醫藥配方中之該聚山梨醇酯係聚山梨醇酯80。
  141. 如請求項119至140中任一項之醫藥配方，其中該醫藥配方中該聚山梨醇酯之濃度係0.05 mg/mL至0.15 mg/mL。
  142. 如請求項119至141中任一項之醫藥配方，其中該醫藥配方中該聚山梨醇酯之濃度係約0.1 mg/mL。
  143. 如請求項119至142中任一項之醫藥配方，其中該醫藥配方之pH係6.5。
  144. 一種小瓶，其包含醫藥配方，該醫藥配方包含： a)     蛋白質，其包含： i)      第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)； ii)     第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL；及 iii)    足以結合CD16之抗體Fc域或其部分； b)     緩衝劑，其包含檸檬酸鹽； c)     蔗糖；及 d)     聚山梨醇酯， 其中該醫藥配方之pH係6.0至7.0。
  145. 如請求項144之小瓶，其中該小瓶包含100 mg至200 mg的該蛋白質。
  146. 如請求項144或請求項145之小瓶，其中該小瓶包含約150 mg的該蛋白質。
  147. 如請求項144至146中任一項之小瓶，其中該小瓶包含50 mg至60 mg的檸檬酸鈉。
  148. 如請求項144至147中任一項之小瓶，其中該小瓶包含約55.5 mg的檸檬酸鈉。
  149. 如請求項144至148中任一項之小瓶，其中該小瓶包含1.5 mg至3 mg的檸檬酸。
  150. 如請求項144至149中任一項之小瓶，其中該小瓶包含約2.3 mg的檸檬酸。
  151. 如請求項144至150中任一項之小瓶，其中該小瓶包含500 mg至700 mg的蔗糖。
  152. 如請求項144至151中任一項之小瓶，其中該小瓶包含約600 mg的蔗糖。
  153. 如請求項144至152中任一項之小瓶，其中該醫藥配方中之該聚山梨醇酯係聚山梨醇酯80。
  154. 如請求項153之小瓶，其中該小瓶包含0.5 mg至1.5 mg的聚山梨醇酯80。
  155. 如請求項153或請求項154之小瓶，其中該小瓶包含約1 mg的聚山梨醇酯80。
  156. 如請求項144至155中任一項之小瓶，其中該醫藥配方之pH係6.5。
  157. 如請求項144至156中任一項之小瓶，其中該小瓶包含約10 mL的該醫藥配方。
  158. 如請求項119至143中任一項之醫藥配方、或如請求項144至157中任一項之小瓶，其中在50℃下培養28天之後，多於93%的該蛋白質具有如粒徑篩析層析法所判定之天然構形(native conformation)。
  159. 如請求項119至143及158中任一項之醫藥配方、或如請求項144至158中任一項之小瓶，其中該蛋白質包含： (a)    第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)； (b)   第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含分別包含SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列的互補決定區1 (CDR1)序列、互補決定區2 (CDR2)序列、及互補決定區3 (CDR3)序列，且該VL包含分別包含SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；及 (c)    足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。
  160. 如請求項119至143及158至159中任一項之醫藥配方、或如請求項144至159中任一項之小瓶，其中包含該抗NKG2D抗體之該VH及該VL的該第一抗原結合位點係Fab片段，且包含該抗5T4抗體之該VH及該VL的該第二抗原結合位點係scFv。
  161. 如請求項119至143及158至159中任一項之醫藥配方、或如請求項144至159中任一項之小瓶，其中包含該抗NKG2D抗體之該VH及該VL的該第一抗原結合位點係scFv，且包含該抗5T4抗體之該VH及該VL的該第二抗原結合位點係Fab片段。
  162. 如請求項119至143及158至159中任一項之醫藥配方、或如請求項144至159中任一項之小瓶，其中該蛋白質進一步包含額外抗原結合位點，該額外抗原結合位點包含抗5T4抗體之VH及VL。
  163. 如請求項162之醫藥配方或小瓶，其中包含該抗NKG2D抗體之該VH及該VL的該第一抗原結合位點係scFv，且包含該抗5T4抗體之該VH及該VL的該第二抗原結合位點及該額外抗原結合位點各自係Fab片段。
  164. 如請求項162之醫藥配方或小瓶，其中包含該抗NKG2D抗體之該VH及該VL的該第一抗原結合位點係scFv，且包含該抗5T4抗體之該VH及該VL的該第二抗原結合位點及該額外抗原結合位點各自係scFv。
  165. 如請求項162至164中任一項之醫藥配方或小瓶，其中該第二抗原結合位點及該額外抗原結合位點之胺基酸序列係同一的。
  166. 如請求項161及164至165中任一項之醫藥配方或小瓶，其中包含該抗NKG2D抗體之該VH及該VL的該scFv係經由鉸鏈連接至足以結合CD16之抗體恆定域或其部分，該鉸鏈包含Ala-Ser或Gly-Ser。
  167. 如請求項160及164至166中任一項之醫藥配方或小瓶，其中包含該抗5T4抗體之該VH及該VL的各scFv係經由鉸鏈連接至足以結合CD16之抗體恆定域或其部分，該鉸鏈包含Ala-Ser或Gly-Ser。
  168. 如請求項160及164至167中任一項之醫藥配方或小瓶，其中包含該抗5T4抗體之該VH及該VL的各scFv係經由鉸鏈連接至足以結合CD16之抗體恆定域或其部分，該鉸鏈包含Ala-Ser。
  169. 如請求項166至168中任一項之醫藥配方或小瓶，其中該鉸鏈進一步包含胺基酸序列Thr-Lys-Gly。
  170. 如請求項161及163至169中任一項之醫藥配方或小瓶，其中在包含該抗NKG2D抗體之該VH及該VL的該scFv內，該scFv之該VH與該scFv之該VL形成雙硫鍵。
  171. 如請求項160及164至170中任一項之醫藥配方或小瓶，其中在包含該抗5T4抗體之該VH及該VL的各scFv內，該scFv之該VH與該scFv之該VL形成雙硫鍵。
  172. 如請求項170或請求項171之醫藥配方或小瓶，其中該雙硫鍵係在該VH之C44與該VL之C100之間形成，其係依Kabat編號方案編號。
  173. 如請求項161及163至172中任一項之醫藥配方或小瓶，其中在包含該抗NKG2D抗體之該VH及該VL的該scFv內，該VH係經由可撓性連接子連接至該VL。
  174. 如請求項160及164至173中任一項之醫藥配方或小瓶，其中在包含該抗5T4抗體之該VH及該VL的各scFv內，該VH係經由可撓性連接子連接至該VL。
  175. 如請求項173至174之醫藥配方或小瓶，其中該可撓性連接子包含(G 4S) 4(SEQ ID NO:119)。
  176. 如請求項161及163至175中任一項之醫藥配方或小瓶，其中在包含該抗NKG2D抗體之該VH及該VL的該scFv內，該VH係位於該VL之C端。
  177. 如請求項159及164至176中任一項之醫藥配方或小瓶，其中在包含該抗5T4抗體之該VH及該VL的各scFv內，該VH係位於該VL之C端。
  178. 如請求項161及163至175及177中任一項之醫藥配方或小瓶，其中在包含該抗NKG2D抗體之該VH及該VL的該scFv內，該VH係位於該VL之N端。
  179. 如請求項160、164至176、及178中任一項之醫藥配方或小瓶，其中在包含該抗5T4抗體之該VH及該VL的各scFv內，該VH係位於該VL之N端。
  180. 如請求項160、167至168、171、172、174、175、177、及179中任一項之醫藥配方或小瓶，其中包含該抗NKG2D抗體之該VH及該VL的該Fab片段不位於抗原結合位點與該Fc或其部分之間。
  181. 如請求項161、163、165至167、170、172、173、175、176、及178中任一項之醫藥配方或小瓶，其中無包含該抗5T4抗體之該VH及該VL的Fab片段位於抗原結合位點與該Fc或其部分之間。
  182. 如請求項159至181中任一項之醫藥配方或小瓶，其中該第一抗原結合位點結合人類NKG2D。
  183. 如請求項159至182中任一項之醫藥配方或小瓶，其中該第二抗原結合位點結合人類5T4。
  184. 如請求項159至183中任一項之醫藥配方或小瓶，其中該第二抗原結合位點在LRR1域內結合人類5T4。
  185. 如請求項159至184中任一項之醫藥配方或小瓶，其中包含該抗NKG2D抗體之該VH及該VL的該第一抗原結合位點包含：VH，其包含分別包含SEQ ID NO: 81、82、及112之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3；及VL，其包含分別包含SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3。
  186. 如請求項119至143及158中任一項之醫藥配方、或如請求項144至158中任一項之小瓶，其中該蛋白質包含： (a)    第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 81、82、及112之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含分別由SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列； (b)   第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含分別由SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；及 (c)    足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。
  187. 如請求項159至185中任一項之醫藥配方或小瓶，其中包含該抗NKG2D抗體之該VH及該VL的該第一抗原結合位點包含：VH，其包含分別由SEQ ID NO: 81、82、及97之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；及VL，其包含分別由SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列。
  188. 如請求項119至143及158中任一項之醫藥配方、或如請求項144至158中任一項之小瓶，其中該蛋白質包含： (a)    第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 81、82、及97之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含分別由SEQ ID NO: 86、77、及87之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列； (b)   第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含分別由SEQ ID NO: 138、139、及140之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列，且該VL包含分別由SEQ ID NO: 141、142、及143之胺基酸序列表示的CDR1序列、CDR2序列、及CDR3序列；及 (c)    抗體Fc域，其包含足以結合CD16之第一抗體Fc域多肽或其部分、及足以結合CD16之第二抗體Fc域多肽或其部分；且 其中該抗NKG2D抗體之該VH或該VL係融合至足以結合CD16之該第一抗體Fc域多肽或其部分之N端，且該抗5T4抗體之該VH或該VL係融合至足以結合CD16之該第二抗體Fc域多肽或其部分之N端。
  189. 如請求項159至188中任一項之醫藥配方或小瓶，其中該第一抗原結合位點包含：VH，其包含與SEQ ID NO:95至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列；及VL，其包含與SEQ ID NO:85至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列。
  190. 如請求項159至189中任一項之醫藥配方或小瓶，其中該第一抗原結合位點包含：VH，其包含SEQ ID NO:95之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO:85之胺基酸序列。
  191. 如請求項159至190中任一項之醫藥配方或小瓶，其中該第二抗原結合位點包含：VH，其與SEQ ID NO:144至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一；及VL，其與SEQ ID NO:145至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一。
  192. 如請求項159至190中任一項之醫藥配方或小瓶，其中該第二抗原結合位點包含：VH，其與SEQ ID NO:263至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一；及VL，其與SEQ ID NO:145至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一。
  193. 如請求項191或192之醫藥配方或小瓶，其中該第二抗原結合位點包含：VH，其相對於SEQ ID NO:144或SEQ ID NO:263具有G44C取代；及VL，其相對於SEQ ID NO:145具有G100C取代，其係依Kabat編號方案編號。
  194. 如請求項159至192中任一項之醫藥配方或小瓶，其中該第二抗原結合位點包含：包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列的VH、及包含SEQ ID NO:145之胺基酸序列的VL；或包含與SEQ ID NO:146至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列的VH、及包含與SEQ ID NO:147至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列的VL。
  195. 如請求項159至194中任一項之醫藥配方或小瓶，其中該第二抗原結合位點包含：VH，其包含SEQ ID NO:146之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO:147之胺基酸序列。
  196. 如請求項159至192及194中任一項之醫藥配方或小瓶，其中該第二抗原結合位點包含：VH，其包含SEQ ID NO:144之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO:145之胺基酸序列。
  197. 如請求項159、160、167至169、171至172、174至175、177、179至180、及182至195中任一項之醫藥配方或小瓶，其中該第二抗原結合位點包含單鏈可變片段(scFv)，且其中該scFv包含：VH，其包含SEQ ID NO:146之胺基酸序列；及VL，其包含SEQ ID NO:147之胺基酸序列。
  198. 如請求項159、160、167至169、171至172、174至175、177、179至180、及182至195中任一項之醫藥配方或小瓶，其中該第二抗原結合位點包含單鏈可變片段(scFv)，且其中該scFv包含與選自由SEQ ID NO: 148及149所組成之群組的序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列。
  199. 如請求項159、160、167至169、171至172、174至175、177、179至180、182至195、及197至198中任一項之醫藥配方或小瓶，其中該第二抗原結合位點包含scFv，且該scFv包含與SEQ ID NO:148至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列。
  200. 如請求項159、160、167至169、171至172、174至175、177、179至180、182至195、及197至199中任一項之醫藥配方或小瓶，其中該第二抗原結合位點包含scFv，且該scFv包含SEQ ID NO:148之胺基酸序列。
  201. 如請求項159、160、167至169、171至172、174至175、177、179至180、182至195、及197至200中任一項之醫藥配方或小瓶，其中該蛋白質包含SEQ ID NO:198之胺基酸序列。
  202. 一種醫藥配方，其包含： a.     蛋白質，其包含： i.     第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，其中該VH包含SEQ ID NO:95之胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO:85之胺基酸序列； ii.    第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含SEQ ID NO:146之胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO:147之胺基酸序列；及 iii.   抗體Fc域，其包含足以結合CD16之第一抗體Fc域多肽或其部分、及足以結合CD16之第二抗體Fc域多肽或其部分； b.     緩衝劑，其包含檸檬酸鹽； c.     蔗糖；及 d.     聚山梨醇酯， 其中該醫藥配方之pH係6.0至7.0。
  203. 一種醫藥配方，其包含： a.     蛋白質，其包含： i.      第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，其中該VH包含SEQ ID NO:95之胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO:85之胺基酸序列； ii.     第二抗原結合位點，其包含SEQ ID NO:148之胺基酸序列；及 iii.    抗體Fc域，其包含足以結合CD16之第一抗體Fc域多肽或其部分、及足以結合CD16之第二抗體Fc域多肽或其部分； b.     緩衝劑，其包含檸檬酸鹽； c.     蔗糖；及 d.     聚山梨醇酯， 其中該醫藥配方之pH係6.0至7.0。
  204. 一種小瓶，其包含醫藥配方，該醫藥配方包含： a.     蛋白質，其包含： i.      第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，其中該VH包含SEQ ID NO:95之胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO:85之胺基酸序列； ii.     第二抗原結合位點，其包含抗5T4抗體之VH及VL，其中該VH包含SEQ ID NO:146之胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO:147之胺基酸序列；及 iii.    抗體Fc域，其包含足以結合CD16之第一抗體Fc域多肽或其部分、及足以結合CD16之第二抗體Fc域多肽或其部分； b.     緩衝劑，其包含檸檬酸鹽； c.     蔗糖；及 d.     聚山梨醇酯， 其中該醫藥配方之pH係6.0至7.0。
  205. 一種小瓶，其包含醫藥配方，該醫藥配方包含： a.     蛋白質，其包含： i.      第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之VH及VL，其中該VH包含SEQ ID NO:95之胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO:85之胺基酸序列； ii.     第二抗原結合位點，其包含SEQ ID NO:148之胺基酸序列；及 iii.    抗體Fc域，其包含足以結合CD16之第一抗體Fc域多肽或其部分、及足以結合CD16之第二抗體Fc域多肽或其部分； b.     緩衝劑，其包含檸檬酸鹽； c.     蔗糖；及 d.     聚山梨醇酯， 其中該醫藥配方之pH係6.0至7.0。
  206. 如請求項119至143及158中任一項之醫藥配方、或如請求項144至158中任一項之小瓶，其中該蛋白質包含： (a)    第一抗原結合位點，其包含抗NKG2D抗體之重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)； (b)   第二抗原結合位點，其包含：包含選自表2之CDR1、CDR2、及CDR3序列的VH、及包含選自表2之CDR1、CDR2、及CDR3序列的VL；或包含選自表12之CDR1、CDR2、及CDR3序列的VH、及包含分別包含SEQ ID NO: 189、190、及143之胺基酸序列的CDR1、CDR2、及CDR3的VL；及 (c)    足以結合CD16之抗體Fc域或其部分。
  207. 如請求項159至206中任一項之醫藥配方或小瓶，其中該抗體Fc域係人類IgG1抗體Fc域。
  208. 如請求項207之醫藥配方或小瓶，其中該抗體Fc域或其部分包含與SEQ ID NO:118至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列。
  209. 如請求項207或請求項208之醫藥配方或小瓶，其中該抗體Fc域之至少一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:118在選自下列之一或多個位置處包含一或多個突變：Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411、及K439，其係根據EU編號系統編號。
  210. 如請求項207至209中任一項之醫藥配方或小瓶，其中該抗體Fc域之至少一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:118包含選自下列之一或多個突變：Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、F405L、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、K409R、T411D、T411E、K439D、及K439E，其係根據EU編號系統編號。
  211. 如請求項207至210中任一項之醫藥配方或小瓶，其中該抗體重鏈恆定區之一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:118在選自下列之一或多個位置處包含一或多個突變：Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411、及K439；且該抗體重鏈恆定區之另一多肽鏈相對於SEQ ID NO:118在選自下列之一或多個位置處包含一或多個突變：Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、D401、F405、Y407、K409、T411、及K439，其係根據EU編號系統編號。
  212. 如請求項211之醫藥配方或小瓶，其中該抗體重鏈恆定區之一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:118包含K360E及K409W取代；且該抗體重鏈恆定區之另一多肽鏈相對於SEQ ID NO:118包含Q347R、D399V、及F405T取代，其係根據EU編號系統編號。
  213. 如請求項211之醫藥配方或小瓶，其中該抗體重鏈恆定區之一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:118包含F405L取代；且該抗體重鏈恆定區之另一多肽鏈相對於SEQ ID NO:118包含K409R取代，其係根據EU編號系統編號。
  214. 如請求項211至213中任一項之醫藥配方或小瓶，其中該抗體重鏈恆定區之一個多肽鏈相對於SEQ ID NO:118包含Y349C取代；且該抗體重鏈恆定區之另一多肽鏈相對於SEQ ID NO:118包含S354C取代，其係根據EU編號系統編號。
  215. 如請求項119至143及158中任一項之醫藥配方、或如請求項144至158中任一項之小瓶，其中該蛋白質包含： (i)    第一多肽，其包含與SEQ ID NO:198至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列； (ii)   第二多肽，其包含與SEQ ID NO:199至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列；及 (ii)   第三多肽，其包含與SEQ ID NO:200至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一的胺基酸序列。
  216. 一種增強腫瘤細胞死亡之方法，該方法包含使該腫瘤細胞及自然殺手細胞暴露於有效量的如請求項1至112中任一項之蛋白質、如請求項113至116中任一項之三特異性抗體、如請求項117之醫藥組成物、或如請求項119至143、158至203、及206至215中任一項之醫藥配方。
  217. 一種增強癌相關纖維母細胞(cancer-associated fibroblast, CAF)細胞死亡之方法，該方法包含使該CAF及自然殺手細胞暴露於有效量的如請求項1至112中任一項之蛋白質、如請求項113至116中任一項之三特異性抗體、如請求項117之醫藥組成物、或如請求項119至143、158至203、及206至215中任一項之醫藥配方。
  218. 一種治療癌症之方法，該方法包含向有需要之對象投予有效量的如請求項1至112中任一項之蛋白質、如請求項113至116中任一項之三特異性抗體、如請求項117之醫藥組成物、或如請求項119至143、158至203、及206至215中任一項之醫藥配方。
  219. 如請求項218之方法，其中該癌症係選自由下列所組成之群組：結腸直腸癌、卵巢癌、非小細胞肺癌、腎癌、乳癌、子宮內膜癌、鱗狀細胞癌、頭頸鱗狀細胞癌、子宮癌、胰臟癌、間皮瘤、及胃癌。
  220. 如請求項219之方法，其中該癌症係激素受體陽性(HR+)乳癌。
  221. 如請求項218至220中任一項之方法，其中該癌症係轉移性癌症。
  222. 如請求項218至221中任一項之方法，其中該對象對化學療法呈難治性。
  223. 如請求項218至222中任一項之方法，其中該方法增加該對象之整體存活期及/或無進展存活期。
  224. 如請求項218至223中任一項之方法，其中5T4係由癌細胞表現。
  225. 如請求項218至224中任一項之方法，其中5T4係由癌相關纖維母細胞表現。
  226. 如請求項224至225中任一項之方法，其中相對於正常細胞，5T4係以高水平表現。
  227. 如請求項224至225中任一項之方法，其中相對於正常細胞，5T4係以低水平表現。
  228. 如請求項1至112中任一項之蛋白質，其中該蛋白質係純化蛋白質。
  229. 如請求項113至116中任一項之三特異性抗體，其中該三特異性抗體係純化三特異性抗體。
  230. 如請求項228之蛋白質或如請求項229之三特異性抗體，其中該蛋白質或該三特異性抗體係使用選自由下列所組成之群組的方法純化：離心、深層過濾、細胞裂解、均質化、冷凍解凍、親和純化、凝膠過濾、離子交換層析法、疏水性交互作用交換層析法、及混合模式層析法。
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