TW202337475A - 治療癲癇之方法及組成物 - Google Patents

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克里斯多夫 穆勒
席琳 布瓦洛
賽維林 德佛吉斯
奧利斐爾 達諾斯
安德魯 摩瑟
理查德 波特
艾普羅 Ｒ 特珀
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艾克斯 馬賽大學
法國波爾多大學
美商銳進科斯生物股份有限公司
法國國家科學研究中心
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Abstract

本揭露提供與藉由靶向 Grik2 mRNA 來治療有需要之個體的諸如顳葉癲癇之癲癇的基因療法相關之方法及組成物。特定而言，本揭露提供能夠抑制 GluK2 蛋白表現及抑制過度興奮神經元迴路中癲癇樣放電之抑制性 RNA 構建體。

Description

治療癲癇之方法及組成物
本揭露屬於癲癇領域。特定而言，本揭露涉及用於治療癲癇諸如顳葉癲癇之方法及組成物。
顳葉癲癇 (TLE) 為成人中最常見的部分性癲癇形式 (佔所有癲癇形式的 30% 至 40%)。已知海馬迴在 TLE 之病理生理學中發揮關鍵作用。在 TLE 的人類患者及動物模型中，發生神經元迴路的異常重新佈線。網絡重組 (「反應性可塑性」) 的最好實例中之一者為復發性苔狀纖維 (rMF) 之出芽，其在海馬迴中的齒狀顆粒細胞 (DGC) 上建立新穎病理生理學麩胺酸突觸 (Tauck 及 Nadler，1985；Represa 等人，1989a，1989b；Sutula 等人，1989；Gabriel 等人，2004)，導致復發性興奮環。rMF 突觸經由異位紅藻氨酸受體 (KAR) 起作用 (Epsztein 等人，2005；Artinian 等人，2011，2015)。KAR 係由 GluK1-GluK5 次單元組裝而成的四聚體麩胺酸受體。在異源表現系統中，GluK1、GluK2 及 GluK3 可以形成同聚體受體，而 GluK4 及 GluK5 與 GluK1-3 次單元一起形成異聚體受體。天然 KAR 廣泛分佈於大腦中，在海馬迴中發現高密度受體 (Carta 等人，2016，EJN)，海馬迴為 TLE 中涉及的一個關鍵結構。本發明人在先研究已經確定，在缺乏 GluK2 KAR 次單元的小鼠中，包含發作間尖峰及發作放電在內的癲癇活動顯著減少。此外，在使用含有 GluK2/GluK5 的 KARs 之藥理學小分子拮抗劑後，癲癇狀活動大大減少，這些小分子拮抗劑阻斷異位突觸 KARs (Peret 等人，2014)。這些資料表明，在 DGC 中的 rMF 處異位表現的 KAR 在 TLE 的慢性癲癇發作中發揮主要作用。因此，在 DGC 中表現並由 GluK2/GluK5 構成的異常 KAR 被認為代表治療耐藥性 TLE 的有希望的標靶。
已經針對許多疾病標靶提出了 RNA 干擾 (RNAi) 策略。基於 RNAi 的療法的成功應用受到限制。RNAi 療法面臨多重挑戰，諸如預測易受影響之脫靶域以指導 RNA 設計、可變的活體內基因沉默功效以及減少脫靶效應，尤其是在存在復雜基因表現模式的情況下，如在中樞神經系統 (CNS) 中的情況那樣。然而，可用於治療難治性 TLE 的基於 RNAi 的基因療法有限。因此，對於用於治療癲癇病症諸如 TLE (例如，難治性 TLE) 之新型治療方式存在迫切需求。
本揭露提供用於治療或預防有需要的個體 (例如，人) 的癲癇諸如顳葉癲癇 (TLE) 之組成物及方法。所揭示之方法包括向診斷為患有癲癇或有發生癲癇風險的個體投予治療有效量之抑制性 RNA (例如，反義寡核苷酸 (ASO)、shRNA、siRNA、微小 RNA 或 shmiRNA)，該抑制性 RNA 靶向由麩胺酸離子型受體紅藻氨酸型次單元 2 ( Grik2) 基因或編碼其的核酸載體 (例如，慢病毒載體或腺相關病毒 (AAV) 載體，諸如 AAV9 載體) 所編碼之 mRNA。本揭露之特徵亦在於包含所揭示之 ASO 劑或編碼其的核酸載體中之一者或多者的醫藥組成物。
在第一態樣中，本揭露提供一種經分離之多核苷酸，其具有不多於 800 個 (例如，不多於 800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、100、90、80、70、60、50、40、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20 或 19 個) 核苷酸之長度，特異性雜交於 Grik2mRNA 之單股區域內，其中所雜交之多核苷酸具有小於 18 kcal/mol (例如，小於 17 kcal/mol、16 kcal/mol、15 kcal/mol、14 kcal/mol、13 kcal/mol、12 kcal/mol、11 kcal/mol、10 kcal/mol、9 kcal/mol、8 kcal/mol、7 kcal/mol、6 kcal/mol、5 kcal/mol、4 kcal/mol、3 kcal/mol、2 kcal/mol 或 1 kcal/mol 或更小) 的目標打開能 (Target Opening Energy)，且其中：(a) 多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 (亦即，歐洲專利申請第 EP19185533.7 號之 SEQ ID NO: 1 至 3) 中任一者之核酸序列；(b) 多核苷酸包含 SEQ ID NO: 68 或 SEQ ID NO: 68 及 SEQ ID NO: 649 之核酸序列；或 (c) 多核苷酸不具有介於 5.53 kcal/mol 與 5.55 kcal/mol 之間 (例如，5.4 kcal/mol) 的總打開能 (Total Opening energy)。
在前述態樣的一些實施例中，多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列。在一些實施例中，多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 1 至 771 之序列中任一者的組合。在一些實施例中，SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之核酸序列具有介於 5.53 kcal/mol 與 5.55 kcal/mol 之間 (例如，5.4 kcal/mol) 的總打開能。
在另一態樣中，本揭露提供一種經分離之 RNA 多核苷酸，其具有不多於 23 個核苷酸之長度，特異性雜交於 Grik2mRNA 之單股區域內，其中所雜交之多核苷酸具有小於 18 kcal/mol (例如，小於 17 kcal/mol、16 kcal/mol、15 kcal/mol、14 kcal/mol、13 kcal/mol、12 kcal/mol、11 kcal/mol、10 kcal/mol、9 kcal/mol、8 kcal/mol、7 kcal/mol、6 kcal/mol、5 kcal/mol、4 kcal/mol、3 kcal/mol、2 kcal/mol 或 1 kcal/mol 或更小) 的總打開能，其中多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之核酸序列。
在前述態樣的一些實施例中，所雜交之多核苷酸不具有介於 5.53 kcal/mol 與 5.55 kcal/mol 之間的總打開能。在一些實施例中，所雜交之多核苷酸具有小於 5.54 kcal/mol 的總打開能。在一些實施例中，所雜交之多核苷酸具有大於 5.54 kcal/mol 的總打開能。在一些實施例中，所雜交之多核苷酸具有小於 5.54 kcal/mol 或大於 5.54 kcal/mol 的總打開能。
在前述態樣的一些實施例中，所雜交之多核苷酸具有大於 -35 kcal/mol (例如，大於 -30 kcal/mol、-25 kcal/mol、-20 kcal/mol、-15 kcal/mol、-10 kcal/mol、-5 kcal/mol、-4 kcal/mol、-3 kcal/mol、-2 kcal/mol、-1 kcal/mol 或更大) 的雙股形成能/來自雙股形成的能量 (Energy of/from Duplex Formation)。在一些實施例中，所雜交之多核苷酸不具有介於 -36.7 kcal/mol 與 -36.5 kcal/mol 之間的雙股形成能 (Energy of Duplex Formation)。在一些實施例中，所雜交之多核苷酸具有大於 -36.61 kcal/mol 的雙股形成能。在一些實施例中，所雜交之多核苷酸具有小於 -36.61 kcal/mol 的雙股形成能。
在一些實施例中，所雜交之多核苷酸具有大於 -24 kcal/mol (例如，大於 -20 kcal/mol、-15 kcal/mol、-10 kcal/mol、-5 kcal/mol、-4 kcal/mol、‑3 kcal/mol、-2 kcal/mol、-1 kcal/mol 或更大) 的總結合能 (Total Energy of Binding)。在一些實施例中，所雜交之多核苷酸不具有介於 -29.5 kcal/mol 與 -29.3 kcal/mol 之間的總結合能。在一些實施例中，所雜交之多核苷酸具有大於 -29.4 kcal/mol 的總結合能。在一些實施例中，所雜交之多核苷酸具有小於 -29.4 kcal/mol 的總結合能。
在一些實施例中，所雜交之多核苷酸具有小於 50% (例如，小於 45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1% 或更小) 的 GC 含量。在一些實施例中，所雜交之多核苷酸不具有介於 42.7% 與 47.6% 之間的 GC 含量。在一些實施例中，所雜交之多核苷酸具有小於 42.9% 的 GC 含量。在一些實施例中，所雜交之多核苷酸具有大於 42.9% 的 GC 含量。在一些實施例中，GC 含量係針對多核苷酸來判定。在一些實施例中，GC 含量係針對與多核苷酸實質上互補 (例如，具有不多於 10、9、8、7、6、5、4、3、2 或 1 個錯配) 之序列來判定。在一些實施例中，GC 含量係針對由多核苷酸及與該多核苷酸實質上互補之序列之間之雜交所形成之雙股來判定。
在一些實施例中，多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 1 至 771 之序列中任何一者或多者的組合。在一些實施例中，多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 之序列的組合。在一些實施例中，多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 及 649 之序列的組合。
在另一態樣中，本揭露提供一種經分離之多核苷酸，其具有不多於 800 個核苷酸之長度，特異性雜交於 Grik2mRNA 之單股區域內，其中所雜交之多核苷酸不具有介於 5.53 與 5.55 kcal/mol 之間的總打開能，且其中多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之核酸序列。在一些實施例中，多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 1 至 771 之序列中任何一者或多者的組合。在一些實施例中，多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 之序列的組合。在一些實施例中，多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 及 649 之序列的組合。
在另一態樣中，本揭露提供一種經分離之多核苷酸，其具有不多於 800 個核苷酸之長度，特異性雜交於 Grik2mRNA 之單股區域內，其中所雜交之多核苷酸不具有介於 -36.7 與 -36.5 kcal/mol 之間的雙股形成能，且其中多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之核酸序列。在一些實施例中，多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 1 至 771 之序列中任何一者或多者的組合。在一些實施例中，多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 之序列的組合。在一些實施例中，多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 及 649 之序列的組合。
在另一態樣中，本揭露提供一種經分離之多核苷酸，其具有不多於 800 個核苷酸之長度，特異性雜交於 Grik2mRNA 之單股區域內，其中所雜交之多核苷酸不具有介於 -29.5 與 -29.3 kcal/mol 之間的總結合能，且其中多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之核酸序列。在一些實施例中，多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 1 至 771 之序列中任何一者或多者的組合。在一些實施例中，多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 之序列的組合。在一些實施例中，多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 及 649 之序列的組合。
在另一態樣中，本揭露提供一種經分離之 RNA 多核苷酸，其具有不多於 23 個核苷酸之長度，特異性雜交於 Grik2mRNA 之單股區域內，其中所雜交之多核苷酸不具有介於 5.53 與 5.55 kcal/mol 之間的總打開能，且其中多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之核酸序列。在一些實施例中，多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 1 至 771 之序列中任何一者或多者的組合。在一些實施例中，多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 之序列的組合。在一些實施例中，多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 及 649 之序列的組合。
在另一態樣中，本揭露提供一種經分離之多核苷酸，其具有不多於 23 個核苷酸之長度，特異性雜交於 Grik2mRNA 之單股區域內，其中所雜交之多核苷酸不具有介於 -36.7 與 -36.5 kcal/mol 之間的雙股形成能，且其中多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之核酸序列。在一些實施例中，多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 1 至 771 之序列中任何一者或多者的組合。在一些實施例中，多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 之序列的組合。在一些實施例中，多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 及 649 之序列的組合。
在另一態樣中，本揭露提供一種經分離之 RNA 多核苷酸，其具有不多於 23 個核苷酸之長度，特異性雜交於 Grik2mRNA 之單股區域內，其中所雜交之多核苷酸不具有介於 -29.5 與 -29.3 kcal/mol 之間的總結合能，且其中多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之核酸序列。在一些實施例中，多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 1 至 771 之序列中任何一者或多者的組合。在一些實施例中，多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 之序列的組合。在一些實施例中，多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 及 649 之序列的組合。
在前述態樣的一些實施例中， Grik2mRNA 之單股區域係選自由環區域 1 至 14 所組成之群組。在一些實施例中，多核苷酸特異性雜交於：(a) Grik2mRNA 之環 1 區域內；(b) Grik2mRNA 之環 2 區域內；(c) Grik2mRNA 之環 3 區域內；(d) Grik2mRNA 之環 4 區域內；(e) Grik2mRNA 之環 5 區域內；(f) Grik2mRNA 之環 6 區域內；(g) Grik2mRNA 之環 7 區域內；(h) Grik2mRNA 之環 8 區域內；(i) Grik2mRNA 之環 9 區域內；(j) Grik2mRNA 之環 10 區域內；(k) Grik2mRNA 之環 11 區域內；(l) Grik2mRNA 之環 12 區域內；(m) Grik2mRNA 之環 13 區域內；或 (n) Grik2mRNA 之環 14 區域內。
在一些實施例中，環 1 區域係由相對於 SEQ ID NO: 145 之至少 10 個 (例如，至少 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 或 80 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼。
在一些實施例中，環 2 區域係由相對於 SEQ ID NO: 146 之至少 10 個 (例如，至少 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 或 80 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼。
在一些實施例中，環 3 區域係由相對於 SEQ ID NO: 147 之至少 10 個 (例如，至少 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 或 80 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼。
在一些實施例中，環 4 區域係由相對於 SEQ ID NO: 148 之至少 10 個 (例如，至少 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 或 80 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼。
在一些實施例中，環 5 區域係由相對於 SEQ ID NO: 149 之至少 10 個 (例如，至少 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 或 80 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼。
在一些實施例中，環 6 區域係由相對於 SEQ ID NO: 150 之至少 10 個 (例如，至少 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 或 80 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼。
在一些實施例中，環 7 區域係由相對於 SEQ ID NO: 151 之至少 10 個 (例如，至少 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 或 80 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼。
在一些實施例中，環 8 區域係由相對於 SEQ ID NO: 152 之至少 10 個 (例如，至少 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 或 80 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼。
在一些實施例中，環 9 區域係由相對於 SEQ ID NO: 153 之至少 10 個 (例如，至少 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 或 80 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼。
在一些實施例中，環 10 區域係由相對於 SEQ ID NO: 154 之至少 10 個 (例如，至少 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 或 80 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼。
在一些實施例中，環 11 區域係由相對於 SEQ ID NO: 155 之至少 10 個 (例如，至少 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 或 80 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼。
在一些實施例中，環 12 區域係由相對於 SEQ ID NO: 156 之至少 10 個 (例如，至少 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 或 80 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼。
在一些實施例中，環 13 區域係由相對於 SEQ ID NO: 157 之至少 10 個 (例如，至少 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 或 80 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼。
在一些實施例中，環 14 區域係由相對於 SEQ ID NO: 158 之至少 10 個 (例如，至少 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 或 80 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼。
在一些實施例中，序列同一性係相對於 SEQ ID NO: 145 至 158 中任一者之至少 15 個 (例如，至少 16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 或 80 個) 連續核苷酸來判定。在一些實施例中，序列同一性係相對於 SEQ ID NO: 145 至 158 中任一者之至少 30 個 (例如，至少 35、40、45、50、55、60、65、70、75 或 80 個) 連續核苷酸來判定。在一些實施例中，序列同一性係相對於 SEQ ID NO: 145 至 158 中任一者之至少 60 個 (例如，至少 65、70、75 或 80 個) 連續核苷酸判定。在一些實施例中，序列同一性係相對於 SEQ ID NO: 145 至 158 中任一者之全長來判定。
在一些實施例中，多核苷酸包含： (a) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 1 之至少 5 個 (例如，至少 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (b) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 4 之至少 5 個 (例如，至少 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (c) (i) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 5 之至少 5 個 (例如，至少 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性；或 (ii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 6 之至少 5 個 (例如，至少 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (d) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 7 之至少 5 個 (例如，至少 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (e) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 96 之至少 5 個 (例如，至少 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (f)  (i) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 8 之至少 5 個 (例如，至少 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (ii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 98 之至少 5 個 (例如，至少 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性；或 (iii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 99 之至少 5 個 (例如，至少 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (g) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 9 之至少 5 個 (例如，至少 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (h) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 63 之至少 5 個 (例如，至少 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (i) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 10 之至少 5 個 (例如，至少 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性；或 (j)  核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 11 之至少 5 個 (例如，至少 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性。
在一些實施例中，序列同一性係相對於 SEQ ID NO: 1、4 至 11、63、96、98 或 99 中任一者之至少 10 個 (例如，至少 11、12、13、14、15、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸來判定。在一些實施例中，序列同一性係相對於 SEQ ID NO: 1、4 至 11、63、96、98 或 99 中任一者之至少 15 個 (例如，至少 16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸來判定。在一些實施例中，序列同一性係相對於 SEQ ID NO: 1、4 至 11、63、96、98 或 99 中任一者之至少 20 個 (例如，至少 20、21 或 22 個) 連續核苷酸來判定。在一些實施例中，序列同一性係相對於 SEQ ID NO: 1、4 至 11、63、96、98 或 99 中任一者之全長來判定。
在一些實施例中，多核苷酸包含由多核苷酸及 Grik2mRNA 之單股區域所形成之雙股結構，其中該雙股結構包含至少一個 (例如，至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 個或更多) 介於多核苷酸之核苷酸與 Grik2mRNA 之單股區域之核苷酸之間的錯配。
在一些實施例中， Grik2mRNA 之單股區域係選自由環區域 1 至 14 所組成之群組。
在一些實施例中，平均位置熵 23 至 79 個核苷酸進行計算。
在一些實施例中， Grik2mRNA 之單股區域係選自由未配對區域 1 至 5 所組成之群組。
在一些實施例中，多核苷酸特異性雜交於 (a) Grik2mRNA 之未配對區域 1 內；(b) Grik2mRNA 之未配對區域 2 內；(c) Grik2mRNA 之未配對區域 3 內；(d) Grik2mRNA 之未配對區域 4 內；或 (e) Grik2mRNA 之未配對區域 5 內。
在一些實施例中，(a) 未配對區域 1 係由相對於 SEQ ID NO: 159 之至少 10 個 (例如，至少 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 或 80 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼；(b) 未配對區域 2 係由相對於 SEQ ID NO: 160 之至少 10 個 (例如，至少 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 或 80 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼；(c) 未配對區域 3 係由相對於 SEQ ID NO: 161 之至少 10 個 (例如，至少 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 或 80 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼；(d) 未配對區域 4 係由相對於 SEQ ID NO: 162 之至少 10 個 (例如，至少 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 或 80 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼；及/或 (e) 未配對區域 5 係由相對於 SEQ ID NO: 163 之至少 10 個 (例如，至少 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 或 80 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼。
在一些實施例中，序列同一性係相對於 SEQ ID NO: 159 至 163 中任一者之至少 15 個 (例如，至少 16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 或 80 個) 連續核苷酸來判定。在一些實施例中，序列同一性係相對於 SEQ ID NO: 159 至 163 中任一者之至少 30 個 (例如，至少 35、40、45、50、55、60、65、70、75 或 80 個) 連續核苷酸來判定。在一些實施例中，序列同一性係相對於 SEQ ID NO: 159 至 163 中任一者之至少 60 個 (例如，至少 65、70、75 或 80 個) 連續核苷酸判定。在一些實施例中，序列同一性係相對於 SEQ ID NO: 159 至 163 中任一者之全長來判定。
在一些實施例中，多核苷酸包含： (a) (i) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 13 之至少 5 個 (例如，至少 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (ii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 14 之至少 5 個 (例如，至少 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (iii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 72 之至少 5 個 (例如，至少 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性；或 (iv) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 73 之至少 5 個 (例如，至少 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (b) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 15 之至少 5 個 (例如，至少 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性15；或 (c) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 16 之至少 5 個 (例如，至少 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性。
在一些實施例中，序列同一性係相對於 SEQ ID NO: 13 至 16、72 或 73 中任一者之至少 10 個 (例如，至少 11、12、13、14、15、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸來判定。在一些實施例中，序列同一性係相對於 SEQ ID NO: 13 至 16、72 或 73 中任一者之至少 15 個 (例如，至少 15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸來判定。在一些實施例中，序列同一性係相對於 SEQ ID NO: 13 至 16、72 或 73 中任一者之至少 20 個 (例如，至少 20、21 或 22 個) 連續核苷酸來判定。在一些實施例中，序列同一性係相對於 SEQ ID NO: 13 至 16、72 或 73 中任一者之全長來判定。在一些實施例中，序列同一性係相對於 SEQ ID NO: 13 至 16、72 或 73 中任一者之不多於 30 個 (例如，不多於 30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3 或 2 個) 連續核苷酸來判定。在一些實施例中，序列同一性係相對於 SEQ ID NO: 13 至 16、72 或 73 中任一者之不多於 25 個 (例如，不多於 25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3 或 2 個) 連續核苷酸來判定。
在一些實施例中，多核苷酸包含由多核苷酸及 Grik2mRNA 之單股區域所形成之雙股結構，其中該雙股結構包含至少一個 (例如，至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 個或更多) 介於多核苷酸之核苷酸與 Grik2mRNA 之單股區域之核苷酸之間的錯配。
在一些實施例中，平均位置熵 23 至 79 個核苷酸進行計算。
在一些實施例中，多核苷酸與 Grik2mRNA 之編碼序列雜交。在一些實施例中，多核苷酸雜交至 (a) Grik2mRNA 之外顯子 1 內的區域；(b) Grik2mRNA 之外顯子 2 內的區域；(c) Grik2mRNA 之外顯子 3 內的區域；(d) Grik2mRNA 之外顯子 4 內的區域；(e) Grik2mRNA 之外顯子 5 內的區域；(f) Grik2mRNA 之外顯子 6 內的區域；(g) Grik2mRNA 之外顯子 7 內的區域；(h) Grik2mRNA 之外顯子 8 內的區域；(i) Grik2mRNA 之外顯子 9 內的區域；(j) Grik2mRNA 之外顯子 10 內的區域；(k) Grik2mRNA 之外顯子 11 內的區域；(l) Grik2mRNA 之外顯子 12 內的區域；(m) Grik2mRNA 之外顯子 13 內的區域；(n) Grik2mRNA 之外顯子 14 內的區域；(o) Grik2mRNA 之外顯子 15 內的區域；及/或 (p) Grik2mRNA 之外顯子 16 內的區域。
在一些實施例中，(a) Grik2mRNA 之外顯子 1 係由相對於 SEQ ID NO: 129 之至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼；(b) Grik2mRNA 之外顯子 2 係由相對於 SEQ ID NO: 130 之至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼；(c) Grik2mRNA 之外顯子 3 係由相對於 SEQ ID NO: 131 之至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼；(d) Grik2mRNA 之外顯子 4 係由相對於 SEQ ID NO: 132 之至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼；(e) Grik2mRNA 之外顯子 5 係由相對於 SEQ ID NO: 133 之至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼；(f) Grik2mRNA 之外顯子 6 係由相對於 SEQ ID NO: 134 之至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼；(g) Grik2mRNA 之外顯子 7 係由相對於 SEQ ID NO: 135 之至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼；(h) Grik2mRNA 之外顯子 8 係由相對於 SEQ ID NO: 136 之至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼；(i) Grik2mRNA 之外顯子 9 係由相對於 SEQ ID NO: 137 之至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼；(j) Grik2mRNA 之外顯子 10 係由相對於 SEQ ID NO: 138 之至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼；(k) Grik2mRNA 之外顯子 11 係由相對於 SEQ ID NO: 139 之至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼；(l) Grik2mRNA 之外顯子 12 係由相對於 SEQ ID NO: 140 之至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼；(m) Grik2mRNA 之外顯子 13 係由相對於 SEQ ID NO: 141 之至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼；(n) Grik2mRNA 之外顯子 14 係由相對於 SEQ ID NO: 142 之至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼；(o) Grik2mRNA 之外顯子 15 係由相對於 SEQ ID NO: 143 之至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼；及/或 (p) Grik2mRNA 之外顯子 16 係由相對於 SEQ ID NO: 144 之至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列進行編碼。
在一些實施例中，多核苷酸包含： (a) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 1 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (b) (i) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 2 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (ii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 3 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (iii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 30 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (iv) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 31 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (v) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 36 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (vi) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 40 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (vii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 59 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (viii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 76 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (ix) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 80 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (x) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 81 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (xi) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 92 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性；及/或 (xii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 93 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (c) (i) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 40 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (ii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 60 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (iii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 68 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (iv) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 70 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性70；及/或 (v) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 86 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (d) (i) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 68 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (ii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 69 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性；及/或 (iii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 70 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (e) (i) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 4 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (ii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 5 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (iii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 6 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (iv) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 56 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (v) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 57 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (vi) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 58 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (vii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 91 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (viii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 94 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性；及/或 (ix) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 95 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (f)  (i) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 20 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (ii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 37 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (iii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 38 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (iv) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 44 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (v) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 46 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (g) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 12 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (h) (i) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 7 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (ii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 8 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (iii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 96 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (iv) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 98 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性；及/或 (v) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 99 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (i)  (i) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 22 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (ii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 39 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (iii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 62 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (iv) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 74 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (v) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 75 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (vi) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 87 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (vii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 88 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (viii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 89 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性；及/或 (ix) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 90 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (j)  (i) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 82 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (ii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 83 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (iii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 84 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性；及/或 (iv) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 85 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (k) (i) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 13 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (ii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 14 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (iii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 72 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性；及/或 (iv) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 73 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (l)  (i) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 34 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (ii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 35 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (iii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 77 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (iv) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 78 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性；及/或 (v) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 79 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (m) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 51 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； 及/或 (n) (i) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 9 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (ii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 10 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (iii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 11 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (iv) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 15 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (v) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 16 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (vi) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 17 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (vii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 18 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (viii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 27 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (ix) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 32 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (x) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 33 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (xi) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 41 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (xii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 49 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (xiii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 50 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (xiv) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 52 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (xv) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 53 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性； (xvi) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 61 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性；及/或 (xvii) 核酸序列，其相對於 SEQ ID NO: 63 之至少 5 個 (例如，至少 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性。
在一些實施例中，序列同一性係相對於 SEQ ID NO: 1 至 12、13 至 18、20、22、27、30 至 41、44、46、49 至 53、56 至 63、68 至 70、72 至 92 或 94 至 99 中任一者之至少 10 個 (例如，至少 10、11、12、13、14、15、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸來判定。在一些實施例中，序列同一性係相對於 SEQ ID NO: 1 至 12、13 至 18、20、22、27、30 至 41、44、46、49 至 53、56 至 63、68 至 70、72 至 92 或 94 至 99 中任一者之至少 15 個 (例如，至少 15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 連續核苷酸來判定。在一些實施例中，序列同一性係相對於 SEQ ID NO: 1 至 12、13 至 18、20、22、27、30 至 41、44、46、49 至 53、56 至 63、68 至 70、72 至 92 或 94 至 99 中任一者之至少 20 個 (例如，至少 20、21 或 22 個) 連續核苷酸來判定。在一些實施例中，序列同一性係相對於 SEQ ID NO: 1 至 12、13 至 18、20、22、27、30 至 41、44、46、49 至 53、56 至 63、68 至 70、72 至 92 或 94 至 99 中任一者之全長來判定。
在一些實施例中，多核苷酸包含 SEQ ID NO: 68 之核酸序列。在一些實施例中，多核苷酸包含 SEQ ID NO: 68 及 649 之核酸序列。在一些實施例中，多核苷酸從 5 至 3' 包含：SEQ ID NO: 68、758 及 649 之核酸序列。在一些實施例中，多核苷酸從 5 至 3' 包含：SEQ ID NO: 649、758 及 68 之核酸序列。在一些實施例中，多核苷酸從 5 至 3' 包含：SEQ ID NO: 649、758 及 68 之核酸序列。在一些實施例中，多核苷酸從 5 至 3' 包含：SEQ ID NO: 752、68、758、649 及 753 之核酸序列。在一些實施例中，多核苷酸從 5 至 3' 包含：SEQ ID NO: 752、649、758、68 及 753 之核酸序列。
在一些實施例中，多核苷酸與 Grik2mRNA 之非編碼序列雜交。在一些實施例中，非編碼序列包含 Grik2mRNA 之 5' 非轉譯區域 (UTR)。在一些實施例中，5' UTR 係由與 SEQ ID NO: 126 之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的多核苷酸進行編碼。在一些實施例中，非編碼序列包含 Grik2mRNA 之 3' UTR。在一些實施例中，3' UTR 係由與 SEQ ID NO: 127 之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的多核苷酸進行編碼。
在一些實施例中，多核苷酸與 SEQ ID NO: 115 至 681 之核酸序列中之任一者雜交。
在一些實施例中，多核苷酸與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。
在一些實施例中，多核苷酸為反義寡核苷酸 (ASO)。在一些實施例中，ASO 為短干擾 RNA (siRNA)、短髮夾 RNA (shRNA)、微小 RNA (miRNA) 或 shRNA 改編的微小 RNA (shmiRNA)。
在一些實施例中，多核苷酸在 19 至 21 個核苷酸之間。在一些實施例中，多核苷酸為 19 個核苷酸。在一些實施例中，多核苷酸為 20 個核苷酸。在一些實施例中，多核苷酸為 21 個核苷酸。
在一些實施例中， Grik2mRNA 係由 SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 123 或 SEQ ID NO: 124 之核酸序列進行編碼。
在一些實施例中，多核苷酸能夠降低細胞中之 Gluk2 蛋白之水平。在一些實施例中，多核苷酸將細胞中之 GluK2 蛋白之水平降低至少 10%、至少 至少 15%、至少 20%、至少 25%、至少 30%、至少 35%、至少 40%、至少 45%、至少 50%、至少 55%、至少 60%、至少 65%、至少 70% 或至少 75%。在一些實施例中，細胞為神經元。在一些實施例中，神經元為海馬迴神經元。在一些實施例中，海馬迴神經元為齒狀顆粒細胞 (DGC)。
在前述態樣的一些實施例中，多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列。在一些實施例中，多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 1 至 771 中任一者之序列中之任一者的組合。在一些實施例中，多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 之序列的組合。在一些實施例中，多核苷酸不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 及 649 之序列的組合。
在另一態樣中，本揭露提供一種載體，其包含前述態樣及實施例之多核苷酸。在一些實施例中，載體為複製缺陷型載體。在一些實施例中，複製缺陷型載體為缺少一個或多個病毒顆粒合成、複製及包裝所必需之基因編碼區的載體。在一些實施例中，載體為哺乳動物、細菌或病毒載體。在一些實施例中，載體為表現載體。
在一些實施例中，病毒載體係選自由以下所組成之群組：腺相關病毒 (AAV)、反轉錄病毒、腺病毒、小病毒、冠狀病毒、負股 RNA 病毒、正黏液病毒、棒狀病毒、副黏液病毒、正股 RNA 病毒、小核糖核酸病毒、α 病毒、雙股 DNA 病毒、疱疹病毒、艾司坦氏-巴爾氏病毒、巨細胞病毒、雞痘病毒及金絲雀痘病毒。在某些實施例中，載體為 AAV 載體。在一些實施例中，AAV 載體為 AAV9 或 AAVrh10 載體。
在一些實施例中，載體包含表現匣，該表現匣含有美國臨時專利申請第 63/050,742 號的表 9 或表 10 中所定義之序列中之任一者，其藉由引用併入本文。
在一些實施例中，前述態樣之載體不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列。在一些實施例中，載體不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 1 至 771 之序列中任一者的組合。在一些實施例中，載體不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 之序列的組合。在一些實施例中，載體不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 及 649 之序列的組合。
在另一態樣中，本揭露提供一種表現匣，其包含 hSyn 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 或其變體，該變體與之具有高達 85% 或更高序列同一性)，該啟動子可操縱地連接至包含抗 Grik2引導序列的多核苷酸，該引導序列與選自由以下所組成之群組的 Grik2mRNA 標靶序列完全或實質上互補：表 4 中所述之標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中之任一者或其變體，該變體與表 4 中所述之標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中之任一者具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，以及與引導序列完全或實質上互補之隨從序列。
在另一態樣中，本揭露提供一種表現匣，其包含 CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 或其變體，該變體與之具有高達 85% 或更高序列同一性)，該啟動子可操縱地連接至包含抗 Grik2引導序列的多核苷酸，該引導序列與選自由以下所組成之群組的 Grik2mRNA 標靶序列完全或實質上互補：表 4 中所述之標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中之任一者或其變體，該變體與表 4 中所述之標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中之任一者具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，以及與引導序列完全或實質上互補之隨從序列。
在另一態樣中，本揭露提供一種表現匣，其包含 CAG 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 737 或其變體，該變體與之具有高達 85% 或更高序列同一性)，該啟動子可操縱地連接至包含抗 Grik2引導序列的多核苷酸，該引導序列與選自由以下所組成之群組的 Grik2mRNA 標靶序列完全或實質上互補：表 4 中所述之標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中之任一者或其變體，該變體與表 4 中所述之標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中之任一者具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，以及與引導序列完全或實質上互補之隨從序列。
在另一態樣中，本揭露提供一種表現匣，其包含 CBA 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 738 或其變體，該變體與之具有高達 85% 或更高序列同一性)，該啟動子可操縱地連接至包含抗 Grik2引導序列的多核苷酸，該引導序列與選自由以下所組成之群組的 Grik2mRNA 標靶序列完全或實質上互補：表 4 中所述之標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中之任一者或其變體，該變體與表 4 中所述之標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中之任一者具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，以及與引導序列完全或實質上互補之隨從序列。
在另一態樣中，本揭露提供一種表現匣，其包含 U6 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 728 至 733 中任一者或其變體，該變體與之具有高達 85% 或更高序列同一性)，該啟動子可操縱地連接至包含抗 Grik2引導序列的多核苷酸，該引導序列與選自由以下所組成之群組的 Grik2mRNA 標靶序列完全或實質上互補：表 4 中所述之標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中之任一者或其變體，該變體與表 4 中所述之標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中之任一者具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，以及與引導序列完全或實質上互補之隨從序列。
在另一態樣中，本揭露提供一種表現匣，其包含 H1 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 734 或其變體，該變體與之具有高達 85% 或更高序列同一性)，該啟動子可操縱地連接至包含抗 Grik2引導序列的多核苷酸，該引導序列與選自由以下所組成之群組的 Grik2mRNA 標靶序列完全或實質上互補：表 4 中所述之標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中之任一者或其變體，該變體與表 4 中所述之標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中之任一者具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，以及與引導序列完全或實質上互補之隨從序列。
在另一態樣中，本揭露提供一種表現匣，其包含 7SK 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 746 或其變體，該變體與之具有高達 85% 或更高序列同一性)，該啟動子可操縱地連接至包含抗 Grik2引導序列的多核苷酸，該引導序列與選自由以下所組成之群組的 Grik2mRNA 標靶序列完全或實質上互補：表 4 中所述之標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中之任一者或其變體，該變體與表 4 中所述之標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中之任一者具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，以及與引導序列完全或實質上互補之隨從序列。
在另一態樣中，本揭露提供一種表現匣，其包含 hSyn 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中任一者或其變體，該變體與之具有高達 85% 或更高序列同一性)，該啟動子可操縱地連接至包含抗 Grik2引導序列的多核苷酸，該引導序列係選自由以下所組成之群組：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，以及與引導序列完全或實質上互補之隨從序列。
在另一態樣中，本揭露提供一種表現匣，其包含 CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中任一者或其變體，該變體與之具有高達 85% 或更高序列同一性)，該啟動子可操縱地連接至包含抗 Grik2引導序列的多核苷酸，該引導序列係選自由以下所組成之群組：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，以及與引導序列完全或實質上互補之隨從序列。
在另一態樣中，本揭露提供一種表現匣，其包含 CAG 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 790 或其變體，該變體與之具有高達 85% 或更高序列同一性)，該啟動子可操縱地連接至包含抗 Grik2引導序列的多核苷酸，該引導序列係選自由以下所組成之群組：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，以及與引導序列完全或實質上互補之隨從序列。
在另一態樣中，本揭露提供一種表現匣，其包含 CBA 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 738 或其變體，該變體與之具有高達 85% 或更高序列同一性)，該啟動子可操縱地連接至包含抗 Grik2引導序列的多核苷酸，該引導序列係選自由以下所組成之群組：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，以及與引導序列完全或實質上互補之隨從序列。
在另一態樣中，本揭露提供一種表現匣，其包含 U6 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 728 至 733 中任一者或其變體，該變體與之具有高達 85% 或更高序列同一性)，該啟動子可操縱地連接至包含抗 Grik2引導序列的多核苷酸，該引導序列係選自由以下所組成之群組：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，以及與引導序列完全或實質上互補之隨從序列。
在另一態樣中，本揭露提供一種表現匣，其包含 H1 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 734 或其變體，該變體與之具有高達 85% 或更高序列同一性)，該啟動子可操縱地連接至包含抗 Grik2引導序列的多核苷酸，該引導序列係選自由以下所組成之群組：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，以及與引導序列完全或實質上互補之隨從序列。
在另一態樣中，本揭露提供一種表現匣，其包含 7SK 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 746 或其變體，該變體與之具有高達 85% 或更高序列同一性)，該啟動子可操縱地連接至包含抗 Grik2引導序列的多核苷酸，該引導序列係選自由以下所組成之群組：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，以及與引導序列完全或實質上互補之隨從序列。      在另一態樣中，本揭露提供一種表現匣，該表現匣選自表 9 (參見具體實施方式) 中所述之表現匣中之任一者。
在另一態樣中，本揭露提供一種表現匣，該表現匣包含含有莖環序列的核苷酸序列，該莖環序列從 5' 至 3' 包含：(i) 5' 莖環臂，其包含與以下具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列之引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 中任一者或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)；(ii) 環區域，其中該環區域包含微小 RNA 環序列；(iii) 3' 莖環臂，其包含與引導序列互補或實質上互補的隨從核苷酸序列。
在另一態樣中，本揭露提供一種表現匣，其包含含有以下之核苷酸序列：(a) 莖環序列，其從 5' 至 3' 包含：(i) 5' 莖環臂，其包含與以下具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列之引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 中任一者或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)；(ii) 環區域，其中該環區域包含微小 RNA 環序列；(iii) 3' 莖環臂，其包含與引導序列互補或實質上互補的隨從核苷酸序列，(b) 第一側翼區域，其位於該引導序列之 5' 處；以及 (c) 第二側翼區域，其位於該隨從序列之 3' 處。
在一些實施例中，前述態樣之表現匣不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列。在一些實施例中，表現匣不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 1 至 771 之序列中之任何一者或多者的組合。在一些實施例中，表現匣不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 之序列的組合。在一些實施例中，表現匣不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 及 649 之序列的組合。在一些實施例中，表現匣不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 及 649 之序列的組合。
在另一態樣中，本揭露提供一種表現匣，該表現匣包含核苷酸序列，該核苷酸序列包含莖環序列，該莖環序列從 5' 至 3' 包含：(i) 5' 莖環臂，其包含與引導序列互補或實質上互補的隨從核苷酸序列；(ii) 環區域，其中該環區域包含微小 RNA 環序列；(iii) 3' 莖環臂，其包含與以下具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列之引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 中之任一者或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)。在一些實施例中，表現匣進一步包含第二莖環序列，該第二莖環序列從 5' 至 3' 包含：(i) 第二 5' 莖環臂，其包含與第二引導序列互補或實質上互補的第二隨從核苷酸序列；(ii) 第二環區域，其中該第二環區域包含第二微小 RNA 環序列；(iii) 第二 3' 莖環臂，其包含與以下具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的第二引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列之引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 中之任一者或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)。在一些實施例中，第一莖環序列與第二莖環序列為相同的。在一些實施例中，第一莖環序列與第二莖環序列為不同的。
在另一態樣中，本揭露提供一種表現匣，其包含核苷酸序列，該核苷酸序列包含：(a) 莖環序列，其從 5' 至 3' 包含：(i) 5' 莖環臂，其包含與引導序列互補或實質上互補的隨從核苷酸序列；(ii) 環區域，其中該環區域包含微小 RNA 環序列；(iii) 3' 莖環臂，其包含與以下具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列之引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 中任一者或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)；(b) 第一側翼區域，其位於該引導序列之 5' 處；以及 (c) 第二側翼區域，其位於該隨從序列之 3' 處。在一些實施例中，表現匣進一步包含：(a) 第二莖環序列，其從 5' 至 3' 包含：(i) 第二 5' 莖環臂，其包含與第二引導序列互補或實質上互補的第二隨從核苷酸序列；(ii) 第二環區域，其中該第二環區域包含第二微小 RNA 環序列；(iii) 第二 3' 莖環臂，其包含與以下具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的第二引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列之引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 中任一者或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)；(b) 第三側翼區域，其位於該第二引導序列之 5' 處；以及 (c) 第四側翼區域，其位於該第二隨從序列之 3' 處。在一些實施例中，第一莖環序列與第二莖環序列為相同的。在一些實施例中，第一莖環序列與第二莖環序列為不同的。
在前述態樣及實施例的一些實施例中，第一側翼區域包含與 SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768 中任一者之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的多核苷酸。在一些實施例中，第二側翼區域包含與 SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769 中任一者之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的多核苷酸。
在一些實施例中，第一側翼區域包含 5' 間隔子序列及 5' 側翼序列。在一些實施例中，第二側翼區域包含 3' 間隔子序列及 3' 側翼序列。
在一些實施例中，微小 RNA 環序列為 miR-30、miR-155、miR-218-1 或 miR-124-3 序列。在一些實施例中，微小 RNA 環序列包含與 SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770 中任一者之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的多核苷酸。
在一些實施例中，表現匣包含選自由以下所組成之群組的啟動子：U6 啟動子、H1 啟動子、7SK 啟動子、載脂蛋白 E-人類 α 1-抗胰蛋白酶 (ApoE-hAAT) 啟動子、CAG 啟動子、CBA 啟動子、CK8 啟動子、mU1a 啟動子、延長因子 1α (EF1α) 啟動子、單純疱疹病毒 (HSV) 啟動子、甲狀腺素結合球蛋白 (TBG) 啟動子、突觸蛋白啟動子 (SYN)、RNA 結合 Fox-1 同系物 3 (RBFOX3) 啟動子、鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶 II (CaMKII) 啟動子、神經元特異性烯醇酶 (NSE) 啟動子、血小板衍生生長因子次單元 β (PDGFβ) 啟動子、囊泡麩胺酸轉運蛋白 (VGAT) 啟動子、體抑素 (SST) 啟動子、神經肽 Y (NPY) 啟動子、血管活性腸肽 (VIP) 啟動子、小白蛋白 (PV) 啟動子、麩胺酸脫羧酶 65 (GAD65) 啟動子、麩胺酸脫羧酶 67 (GAD67) 啟動子、多巴胺受體 D1 (DRD1) 啟動子、多巴胺受體 D2 (DRD2) 啟動子、補體 C1q 樣 2 (C1QL2) 啟動子、前腦啡黑細胞促素皮促素 (POMC) 啟動子、Prospero 同源匣 1 (PROX1) 啟動子、微管相關蛋白 1B (MAP1B) 啟動子及微管蛋白 α 1 (T-α1/TUBA3) 啟動子。在一些實施例中，表現匣包含 SYN 啟動子 (例如，諸如人類 SYN 啟動子，例如，SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 682 至 682 及 790 中任一者之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)。在一些實施例中，表現匣包含 CAMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中任一者之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)。在一些實施例中，表現匣包含 C1QL2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791 或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791 之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)。在一些實施例中，啟動子可操縱地連接至兩個或更多個莖環序列。在一些實施例中，啟動子可操縱地連接至兩個莖環序列 (例如，兩個串聯存在於載體中的莖環序列)。
在一些實施例中，表現匣包含與 SEQ ID NO: 775、777、779、781、783 至 788、796、798 至 801、803、805、807、809、811、813、817、819 及 821 中任一者之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的多核苷酸。在一些實施例中，表現匣併入至載體中，該載體與 SEQ ID NO: 804、806、808、810、812、814、818、820 及 822 中任一者之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。
在另一態樣中，本揭露提供一種表現匣，其從 5' 至 3' 包含：(a) 第一啟動子序列 (例如，本文所揭示之啟動子序列中之任一者，諸如表 5 中所揭示的那些，例如，hSyn 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者)、CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者) 或 C1ql2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)；(b) 第一引導核苷酸序列，其與以下具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性：表 2 及/或表 3 中所列之引導序列中之任一者 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 中之任一者或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)，其中第一引導核苷酸序列可操縱地連接至第一啟動子；(c) 視情況，第二啟動子序列 (例如，本文所揭示之啟動子序列中之任一者，諸如表 5 中所揭示的那些，例如，hSyn 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者)、CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO:687 至 691 及 802 中之任一者) 或 C1ql2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)；(b) 第二引導核苷酸序列，其與以下具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性：表 2 及/或表 3 中所列之引導序列中之任一者 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 中之任一者或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)，其中視情況，第二引導核苷酸序列可操縱地連接至第二啟動子。在一些實施例中，第一引導序列及/或第二引導序列為 G9 序列 (SEQ ID NO: 68) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。在一些實施例中，第一引導序列及/或第二引導序列為 GI 序列 (SEQ ID NO: 77) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。在一些實施例中，第一引導序列及/或第二引導序列為 MW 序列 (SEQ ID NO: 80) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。在一些實施例中，第一引導序列及/或第二引導序列為 MU 序列 (SEQ ID NO: 96) 中之任一者或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。在一些實施例中，第一引導序列為 G9 序列 (SEQ ID NO: 68) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，且第二引導序列為 GI 序列 (SEQ ID NO: 77) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。在一些實施例中，第一引導序列為 G9 序列 (SEQ ID NO: 68) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，且第二引導序列為 MW 序列 (SEQ ID NO: 80) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。在一些實施例中，第一引導序列為 GI 序列 (SEQ ID NO: 77) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，且第二引導序列為 G9 序列 (SEQ ID NO: 68) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。在一些實施例中，第一引導序列為 GI 序列 (SEQ ID NO: 77) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，且第二引導序列為 MW 序列 (SEQ ID NO: 80) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。
在一些實施例中，表現匣包含與 SEQ ID NO: 785 至 788 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的多核苷酸。
在一些實施例中，第一啟動子為 SYN 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，且視情況，第二啟動子為 CAMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。
在前述態樣的一些實施例中，表現匣進一步包含與第一引導核苷酸序列互補或實質上互補的第一隨從核苷酸序列，其中該第一隨從核苷酸序列相對於第一引導核苷酸序列位於 5' 或 3' 處。
在前述態樣的一些實施例中，表現匣進一步包含與第二引導核苷酸序列互補或實質上互補的第二隨從核苷酸序列，其中該第二隨從核苷酸序列相對於第二引導核苷酸序列位於 5' 或 3' 處。
在前述態樣的一些實施例中，表現匣進一步包含第一 5' 側翼區域 (例如，SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 及 768 中之任一者或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)，該第一 5' 側翼區域相對於第一引導序列位於 5' 處。
在前述態樣的一些實施例中，表現匣進一步包含第一 3' 側翼區域，該第一 3' 側翼區域相對於第一引導序列位於 3' 處。
在前述態樣的一些實施例中，表現匣進一步包含第二 5' 側翼區域，該第二 5' 側翼區域相對於第二引導序列位於 5' 處。
在前述態樣的一些實施例中，表現匣進一步包含第二 3' 側翼區域，該第二 3' 側翼區域相對於第二引導序列位於 5' 處。
在前述態樣的一些實施例中，表現匣進一步包含位於第一引導序列與第一隨從序列之間的第一環區域，其中該第一環區域包含第一微小 RNA 環序列 (例如，SEQ ID NO: 758、761、764、767 及 770 中之任一者或其變體，該變體具有一個、兩個或三個核苷酸改變)。
在前述態樣的一些實施例中，表現匣進一步包含位於第二引導序列與第二隨從序列之間的第二環區域，其中該第二環區域包含第二微小 RNA 環序列 (例如，SEQ ID NO: 758、761、764、767 及 770 中之任一者或其變體，該變體具有一個、兩個或三個核苷酸改變)。
在另一態樣中，本揭露提供一種表現匣，其包含核苷酸序列，該核苷酸序列從 5' 至 3' 包含： (a) 第一啟動子序列 (例如，本文所揭示之啟動子序列中之任一者，諸如表 5 中所揭示的那些，例如，hSyn 啟動子 (例如，SEQ ID NO:682 至 685 及 790 中之任一者)、CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者) 或 C1ql2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)； (b) 第一 5' 側翼區域，其位於第一隨從核苷酸序列 (例如，SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 及 768 中之任一者或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性) 之 5' 處； (c) 第一莖環序列，其從 5' 至 3' 包含： (i) 第一 5' 莖環臂，其包含與第一引導序列互補或實質上互補的第一隨從核苷酸序列； (ii) 第一環區域，其中第一環區域包含第一微小 RNA 環序列 (例如，SEQ ID NO: 758、761、764、767 及 770 中之任一者或其變體，該變體具有一個、兩個或三個核苷酸改變)； (iii) 第一 3' 莖環臂，其包含與以下具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的第一引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列之引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)； (d) 第一 3' 側翼區域，其位於該第一引導核苷酸序列 (例如，SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 及 769 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性) 之 3' 處； (e) 視情況，第二啟動子序列 (例如，本文所揭示之啟動子序列中之任一者，諸如表 5 中所揭示的那些，例如，hSyn 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者)、CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者) 或 C1ql2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)； (f) 第二 5' 側翼區域，其位於第二隨從核苷酸序列 (例如，SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 及 768 中之任一者或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性) 之 5' 處； (g) 第二莖環序列，其從 5' 至 3' 包含： (i) 第二 5' 莖環臂，其包含與第二引導序列互補或實質上互補的第二隨從核苷酸序列；(ii) 第二環區域，其中第二環區域包含第二微小 RNA 環序列 (例如，SEQ ID NO: 758、761、764、767 及 770 中之任一者或其變體，該變體具有一個、兩個或三個核苷酸改變)； (iii) 第二 3' 莖環臂，其包含與以下具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的第二引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列之引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)； 及 (h) 第二 3' 側翼區域，其位於該第二引導核苷酸序列 (例如，SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 及 769 中之任一者) 之 3' 處。
在一些實施例中，表現匣包含與 SEQ ID NO: 785、787 及 788 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的多核苷酸。
在另一態樣中，本揭露提供一種表現匣，其包含核苷酸序列，該核苷酸序列從 5' 至 3' 包含： (a) 第一啟動子序列 (例如，本文所揭示之啟動子序列中之任一者，諸如表 5 中所揭示的那些，例如，hSyn 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者)、CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者) 或 C1ql2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)； (b) 第一 5' 側翼區域，其位於第一隨從核苷酸序列 (例如，SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 及 768 中之任一者) 之 5' 處； (c) 第一莖環序列，其從 5' 至 3' 包含： (i) 第一 5' 莖環臂，其包含與第一引導序列互補或實質上互補的第一隨從核苷酸序列； (ii) 第一環區域，其中第一環區域包含第一微小 RNA 環序列 (例如，SEQ ID NO: 758、761、764、767 及 770 中之任一者)； (iii) 第一 3' 莖環臂，其包含與以下具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的第一引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列之引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)； (d) 第一 3' 側翼區域，其位於該第一引導核苷酸序列 (例如，SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 及 769 中之任一者) 之 3' 處； (e) 視情況，第二啟動子序列 (例如，本文所揭示之啟動子序列中之任一者，諸如表 5 中所揭示的那些，例如，hSyn 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者)、CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者) 或 C1ql2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)； (f) 第二 5' 側翼區域，其位於第二引導核苷酸序列 (例如，SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 及 768 中之任一者) 之 5' 處； (g) 第二莖環序列，其從 5' 至 3' 包含： (i) 第二 5' 莖環臂，其包含與以下具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列之引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)； (ii) 第二環區域，其中第二環區域包含第二微小 RNA 環序列 (例如，SEQ ID NO: 758、761、764、767 及 770 中之任一者)； (iii) 第二 3' 莖環臂，其包含與第二引導序列互補或實質上互補的第二隨從核苷酸序列； 及 (h) 第二 3' 側翼區域，其位於該隨從核苷酸序列 (例如，SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 及 769 中之任一者) 之 3' 處。
在另一態樣中，本揭露提供一種表現匣，其包含核苷酸序列，該核苷酸序列從 5' 至 3' 包含： (a) 第一啟動子序列 (例如，本文所揭示之啟動子序列中之任一者，諸如表 5 中所揭示的那些，例如，hSyn 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者)、CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者) 或 C1ql2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)； (b) 第一 5' 側翼區域，其位於第一引導核苷酸序列 (例如，SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 及 768 中之任一者) 之 5' 處； (c) 第一莖環序列，其從 5' 至 3' 包含： (i) 第一 5' 莖環臂，其包含與以下具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的第一引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列之引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)； (ii) 第一環區域，其中第一環區域包含第一微小 RNA 環序列 (例如，SEQ ID NO: 758、761、764、767 及 770 中之任一者)； (iii) 第一 3' 莖環臂，其包含與第一引導序列互補或實質上互補的第一隨從核苷酸序列； (d) 第一 3' 側翼區域，其位於該第一隨從核苷酸序列 (例如，SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 及 769 中之任一者) 之 3' 處； (e) 視情況，第二啟動子序列 (例如，本文例如表 5 所揭示之啟動子序列中之任一者，例如，hSyn 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者)、CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者) 或 C1ql2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)； (f) 第二 5' 側翼區域，其位於第二隨從核苷酸序列 (例如，SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 及 768 中之任一者) 之 5' 處； (g) 第二莖環序列，其從 5' 至 3' 包含： (i) 第二 5' 莖環臂，其包含與第二引導序列互補或實質上互補的第二隨從核苷酸序列； (ii) 第二環區域，其中第二環區域包含第二微小 RNA 環序列 (例如，SEQ ID NO: 758、761、764、767 及 770 中之任一者)； (iii) 第二 3' 莖環臂，其包含與以下具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的第二引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列之引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)； 及 (h) 第二 3' 側翼區域，其位於該第二引導核苷酸序列 (例如，SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 及 769 中之任一者) 之 3' 處。
在一些實施例中，表現匣包含與 SEQ ID NO: 786 之核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的多核苷酸。
在另一態樣中，本揭露提供一種表現匣，其包含核苷酸序列，該核苷酸序列從 5' 至 3' 包含： (a) 第一啟動子序列 (例如，本文所揭示之啟動子序列中之任一者，諸如表 5 中所揭示的那些，例如，hSyn 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者)、CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者) 或 C1ql2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)； (b) 第一 5' 側翼區域，其位於第一引導核苷酸序列 (例如，SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 及 768 中之任一者) 之 5' 處； (c) 第一莖環序列，其從 5' 至 3' 包含： (i) 第一 5' 莖環臂，其包含與以下具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的第一引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列之引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)； (ii) 第一環區域，其中第一環區域包含第一微小 RNA 環序列 (例如，SEQ ID NO: 758、761、764、767 及 770 中之任一者)； (iii) 第一 3' 莖環臂，其包含與第一引導序列互補或實質上互補的第一隨從核苷酸序列； (d) 第一 3' 側翼區域，其位於該第一隨從核苷酸序列 (例如，SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 及 769 中之任一者) 之 3' 處； (e) 視情況，第二啟動子序列 (例如，本文所揭示之啟動子序列中之任一者，諸如表 5 中所揭示的那些，例如，hSyn 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者)、CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者) 或 C1ql2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)； (f) 第二 5' 側翼區域，其位於第二引導核苷酸序列 (例如，SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 及 768 中之任一者) 之 5' 處； (g) 第二莖環序列，其從 5' 至 3' 包含： (i) 第二 5' 莖環臂，其包含與以下具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列之引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)； (ii) 第二環區域，其中第二環區域包含第二微小 RNA 環序列 (例如，SEQ ID NO: 758、761、764、767 及 770 中之任一者)； (iii) 第二 3' 莖環臂，其包含與第二引導序列互補或實質上互補的第二隨從核苷酸序列； 及 (h) 第二 3' 側翼區域，其位於該隨從核苷酸序列 (例如，SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 及 769 中之任一者) 之 3' 處。
在一些實施例中，第一啟動子及/或視情況選用的第二啟動子係選自由以下所組成之群組：U6 啟動子、H1 啟動子、7SK 啟動子、載脂蛋白 E-人類 α 1-抗胰蛋白酶啟動子、CAG 啟動子、CBA 啟動子、CK8 啟動子、mU1a 啟動子、延長因子 1α 啟動子、HSV 啟動子、甲狀腺素結合球蛋白啟動子、突觸蛋白啟動子、RNA 結合 Fox-1 同系物 3 啟動子、鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶 II 啟動子、神經元特異性烯醇酶啟動子、血小板衍生生長因子次單元 β 啟動子、囊泡麩胺酸轉運蛋白啟動子、體抑素啟動子、神經肽 Y 啟動子、血管活性腸肽啟動子、小白蛋白啟動子、麩胺酸脫羧酶 65 啟動子、麩胺酸脫羧酶 67 啟動子、多巴胺受體 D1 啟動子、多巴胺受體 D2 啟動子、補體 C1q 樣 2 啟動子、前腦啡黑細胞促素皮促素啟動子、Prospero 同源匣 1 啟動子、微管相關蛋白 1B 啟動子及微管蛋白 α 1 啟動子。
在一些實施例中，第一啟動子為 SYN 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，且視情況，第二啟動子為 CAMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。
在一些實施例中，第一 5' 側翼區域及/或第二 5' 側翼區域包含與 SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 及 768 中任一者之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的多核苷酸。在一些實施例中，第一 5' 側翼區域及/或第二 5' 側翼區域包含具有 752、754、756、759、762、765 及 768 之核酸序列的多核苷酸。
在一些實施例中，第一 3' 側翼區域及/或第二 3' 側翼區域包含與 SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 及 768 中任一者之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的多核苷酸753、755、757、760、763、766 及 769 中任一者之核酸序列的多核苷酸。在一些實施例中，第一 3' 側翼區域及/或第二3' 側翼區域包含具有 SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 及 769 中任一者之核酸序列的多核苷酸。
在一些實施例中，第一微小 RNA 環序列及/或第二微小 RNA 環序列為 miR-30、miR-155、miR-218-1 或 miR-124-3序列。在一些實施例中，第一微小 RNA 環序列及/或第二微小 RNA 環序列包含與 SEQ ID NO: 758、761、764、767 及 770 中任一者之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的多核苷酸。在一些實施例中，第一微小 RNA 環序列及/或第二微小 RNA 環序列包含具有 SEQ ID NO: 758、761、764、767 及 770 之核酸序列的多核苷酸。
在一些實施例中，表現匣包含在該表現匣之 5' 末端上的 5'-反向末端重複 (ITR) 序列及在該表現匣之 3' 末端上的 3'-ITR 序列。在一些實施例中，5'-ITR 及 3' ITR 序列為 AAV2 5'-ITR 及 3' ITR 序列。在一些實施例中，5'-ITR 序列包含與 SEQ ID NO: 746 或 SEQ ID NO: 747 之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的多核苷酸。在一些實施例中，5'-ITR 序列包含具有 SEQ ID NO: 746 或 SEQ ID NO: 747 之核酸序列的多核苷酸。在一些實施例中，3'-ITR 序列包含與 SEQ ID NO: 748、SEQ ID NO: 749 或 SEQ ID NO: 789 之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的多核苷酸。在一些實施例中，3'-ITR 序列包含具有 SEQ ID NO: 748、SEQ ID NO: 749 或 SEQ ID NO: 789 之核酸序列的多核苷酸。
在一些實施例中，表現匣進一步包含增強子序列。在一些實施例中，增強子序列包含與 SEQ ID NO: 745 之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的多核苷酸。在一些實施例中，增強子序列包含具有 SEQ ID NO: 745 之核酸序列的多核苷酸。
在一些實施例中，表現匣進一步包含內含子序列。在一些實施例中，內含子序列包含與 SEQ ID NO: 743 或 SEQ ID NO: 744 之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的多核苷酸。在一些實施例中，內含子序列包含具有 SEQ ID NO: 743 或 SEQ ID NO: 744 之核酸序列的多核苷酸。
在一些實施例中，表現匣進一步包含一個或多個多腺苷酸化訊號。在一些實施例中，該等一個或多個多腺苷酸化訊號為兔 β-珠蛋白 (RBG) 多腺苷酸化訊號。在一些實施例中，RBG 多腺苷酸化訊號包含與 SEQ ID NO: 750、SEQ ID NO: 751 或 SEQ ID NO: 792 之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的多核苷酸。在一些實施例中，RBG 多腺苷酸化訊號包含具有 SEQ ID NO: 750、SEQ ID NO: 751 或 SEQ ID NO: 792 之核酸序列的多核苷酸。在一些實施例中，多腺苷酸化訊號為牛生長激素 (BGH) 多腺苷酸化訊號。在一些實施例中，BGH 多腺苷酸化訊號包含與 SEQ ID NO: 793 之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的多核苷酸。在一些實施例中，BGH 多腺苷酸化訊號包含具有 SEQ ID NO: 793 之核酸序列的多核苷酸。
在一些實施例中，前述態樣及實施例之表現匣係併入前述態樣及實施例之載體中。
在一些實施例中，前述態樣之表現匣不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列。在一些實施例中，表現匣不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 1 至 771 之序列中任何一者或多者的組合。在一些實施例中，表現匣不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 之序列的組合。在一些實施例中，表現匣不包含 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 及 649 之序列的組合。
在一些實施例中，表現匣進一步包含一個或多個 (例如，1、2 個或更多) 填充序列。在一些實施例中，該等一個或多個填充序列位於表現匣之 3' 末端處。在一些實施例中，該等一個或多個填充序列與 SEQ ID NO: 815 之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。在一些實施例中，該等一個或多個填充序列與 SEQ ID NO: 815 之核酸序列具有至少 90% (例如，至少 91%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。在一些實施例中，該等一個或多個填充序列與 SEQ ID NO: 815 之核酸序列具有至少 95% (例如，至少 96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。在一些實施例中，該等一個或多個填充序列與 SEQ ID NO: 815 之核酸序列具有至少 99% 序列同一性。在一些實施例中，該等一個或多個填充序列具有 SEQ ID NO: 815 之核酸序列。在一些實施例中，該等一個或多個填充序列與 SEQ ID NO: 816 之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。在一些實施例中，該等一個或多個填充序列與 SEQ ID NO: 816 之核酸序列具有至少 90% (例如，至少 91%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。在一些實施例中，該等一個或多個填充序列與 SEQ ID NO: 816 之核酸序列具有至少 95% (例如，至少 96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。在一些實施例中，該等一個或多個填充序列與 SEQ ID NO: 816 之核酸序列具有至少 99% 序列同一性。在一些實施例中，該等一個或多個填充序列具有 SEQ ID NO: 816 之核酸序列。
在另一態樣中，本揭露提供一種抑制細胞中之 Grik2表現之方法，該方法包括使細胞與前述態樣及實施例之至少一種多核苷酸、前述態樣及實施例之載體或前述態樣及實施例之表現匣接觸。
在一些實施例中，多核苷酸與 Grik2mRNA 特異性雜交，並抑制或降低細胞中之 Grik2之表現 。在一些實施例中，該方法降低細胞中之 Grik2mRNA 之水平。在一些實施例中，相對於用不能與 Grik2mRNA 雜交的對照多核苷酸處理的細胞或相對於不用多核苷酸處理的細胞中之 GluK2 之水平，該方法將細胞中之 Grik2mRNA 之水平降低至少 10%、至少 至少 15%、至少 20%、至少 25%、至少 30%、至少 35%、至少 40%、至少 45%、至少 50%、至少 55%、至少 60%、至少 65%、至少 70% 或至少 75%。 在一些實施例中，該方法降低細胞中之 Gluk2 蛋白之水平。在一些實施例中，相對於用不能與 Grik2mRNA 雜交的對照多核苷酸處理的細胞或相對於不用多核苷酸處理的細胞中之 GluK2 蛋白之水平，該方法將細胞中之 GluK2 蛋白之水平降低至少 10%、至少 至少 15%、至少 20%、至少 25%、至少 30%、至少 35%、至少 40%、至少 45%、至少 50%、至少 55%、至少 60%、至少 65%、至少 70% 或至少 75%。
在一些實施例中，細胞為神經元。在一些實施例中，神經元為海馬迴神經元。在一些實施例中，海馬迴神經元為 DGC。在一些實施例中，DGC 包含異常復發性苔狀纖維軸突。細胞亦可為衍生自誘導多能幹細胞 (iPSC) 的神經元細胞，諸如表現 Grik2的 iPSC 衍生麩胺酸神經元。
在一些實施例中，前述態樣之方法不包含使用 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列。在一些實施例中，該方法不包含使用 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 1 至 771 之序列中任何一者或多者的組合。在一些實施例中，該方法不包含使用 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 之序列的組合。在一些實施例中，該方法不包含使用 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 及 SEQ ID NO: 649 之序列的組合。
在另一態樣中，本揭露提供一種治療或改善有需要之個體的病症之方法，該方法包括向該個體投予前述態樣及實施例之至少一種多核苷酸、前述態樣及實施例之載體或前述態樣及實施例之表現匣 (例如，包含與 SEQ ID NO: 775、777、779、781、783 至 788、796、798 至 801、803、805、807、809、811、813、817、819 及 821 中任一者之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的多核苷酸的表現匣)。
在一些實施例中，病症為癲癇。在一些實施例中，癲癇為顳葉癲癇 (TLE)、慢性癲癇及/或難治性癲癇。在一些實施例中，癲癇為 TLE。在一些實施例中，TLE 為外側 TLE (lTLE)。在一些實施例中，TLE 為內側 TLE (mTLE)。
在上述實施例中之一者或多者或每一者中，個體為人。
在一些實施例中，前述態樣之方法不包含投予 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列。在一些實施例中，該方法不包含投予 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 1 至 771 之序列中任何一者或多者的組合。在一些實施例中，多核苷酸不包含投予 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 之序列的組合。在一些實施例中，多核苷酸不包含投予 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 及 SEQ ID NO: 649 之序列的組合。
在另一態樣中，本揭露提供一種醫藥組成物，該醫藥組成物前述態樣及實施例之多核苷酸、前述態樣及實施例之載體或前述態樣及實施例之表現匣以及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
在一些實施例中，前述態樣之醫藥組成物不包含具有 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列的多核苷酸。在一些實施例中，醫藥組成物不包含具有 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 1 至 771 之序列中任何一者或多者的組合的多核苷酸。在一些實施例中，醫藥組成物不包含具有 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 之序列的組合的多核苷酸。在一些實施例中，醫藥組成物不包含具有 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 及 SEQ ID NO: 649 之序列的組合的多核苷酸。
在另一態樣中，本揭露提供一種套組，該套組包含前述態樣之醫藥組成物及藥品仿單。在一些實施例中，藥品仿單包含在前述態樣及實施例之方法中使用醫藥組成物的說明。
在一些實施例中，前述態樣之套組不包含具有 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列的多核苷酸。在一些實施例中，套組不包含具有 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 1 至 771 之序列中任何一者或多者的組合的多核苷酸。在一些實施例中，套組不包含具有 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 之序列的組合的多核苷酸。在一些實施例中，套組不包含具有 SEQ ID NO: 772 至 774 中任一者之序列與 SEQ ID NO: 68 及 SEQ ID NO: 649 之序列的組合的多核苷酸。 定義
為合宜起見，下文提供在說明書、實例及隨附申請專利範圍中使用的一些術語及短語的含義。除非另有說明或上下文中暗示，否則以下術語及短語包含下文提供的含義。提供該等定義用於幫助描述特定實施例，並非意欲用於限制所要求保護的技術。除非另有定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本技術所屬技術者通常所理解相同的含義。若本領域中術語之使用與其在本文提供的定義之間存在明顯差異，則以說明書內提供的定義為準。
在本申請案中，除非上下文另有明確規定，否則 (i) 術語「一個」可以理解為表示「至少一個」；(ii) 術語「或」可以理解為「及/或」；且 (iii) 術語「包含」及「包含」可以理解為包含逐項列出的組件或步驟，無論是單獨呈現還是與一個或多個額外組件或步驟一起呈現。
術語「約」係指列舉的值 ± 10% 並且可以為列舉的值 ± 5% 或列舉的值 ± 2% 的量。
術語「3' 非轉譯區域」及「3' UTR」係指相對於 mRNA 分子 (例如， Grik2mRNA) 的終止密碼子的區域 3'。3' UTR 不轉譯成蛋白質，但包含對 mRNA 轉錄物的多腺苷酸化、定位、穩定及/或轉譯效率重要的調節性序列。3' UTR 中之調節性序列可包含增強子、沉默子、富含 AU 的元件、多 A 尾、終止子及微小 RNA 識別序列。術語「3' 非轉譯區域」及「3' UTR」也可以指編碼 mRNA 分子的基因的相應區域。
術語「5' 非轉譯區域」及「5' UTR」係指相對於起始密碼子為 5' 的 mRNA 分子 (例如， Grik2mRNA) 之區域。該區域對於轉譯起始的調節是重要的。5' UTR 可完全未轉譯，亦可在一些生物體中具有經轉譯之某些區域。轉錄起始位點標記 5' UTR 之開始，並在起始密碼子之前結束一個核苷酸。在真核生物中，5' UTR 包含攜帶起始密碼子的科札克 (Kozak) 共同序列。5' UTR 可能包含順式作用調節性元件，亦稱為上游開放讀框，對轉譯之調節是重要的。該區亦可攜帶上游 AUG 密碼子及終止密碼子。鑑於其高 GC 含量，5' UTR 可形成二級結構，諸如在轉譯之調節中發揮作用的髮夾環。術語「投予」係指藉由任何有效途徑向個體提供或給予治療劑 (例如，與 Grik2mRNA 結合並抑制其表現的反義寡核苷酸 (ASO)，或編碼其的載體，如本文所揭示)。示例性投予途徑描述於本文及下文中 (例如，腦室內注射、鞘內注射、實質內注射、靜脈內注射及立體定位注射)。
術語「腺相關病毒載體」或「AAV 載體」係指衍生自腺相關病毒血清型的載體，包含但不限於 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.EB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV-TT、AAV-DJ8 或 AAV.HSC16。AAV 載體可具有一個或多個全部或部分缺失的 AAV 野生型基因，例如 rep 及/或 cap 基因，但保留功能性側翼 ITR 序列。功能性 ITR 序列促進 AAV 病毒顆粒之拯救、複製及包裝。因此，AAV 載體在本文中定義為至少包含病毒複製及包裝所需的那些順式序列 (例如，功能性 ITR)。ITR 無需為野生型多核苷酸序列並且可以被改變，例如，藉由核苷酸之插入、缺失或取代，只要序列提供功能性拯救、複製及包裝即可。AAV 表現載體使用已知技術構建，以至少提供為在轉錄方向上的可操作連接之組分，包含轉錄起始區、目標 DNA (例如，編碼本揭露的 ASO 劑的多核苷酸) 及轉錄終止區的控制元件。
術語「腺相關病毒反向末端重複」及「AAV ITR」係指本領域公認的位於 AAV 基因體每一末端側翼的區域，其以順式方式一起用作 DNA 複製之起點及病毒包裝訊號。AAV ITR 連同 AAV rep編碼區一起提供有效切除並將插入兩個側翼 ITR 之間的多核苷酸序列整合到哺乳動物基因體中。AAV ITR 區之多核苷酸序列為已知的。如本文所用，「AAV ITR」不一定包含野生型多核苷酸序列，其可以被改變，例如，藉由核苷酸之插入、缺失或取代來實現。此外，AAV ITR 可衍生自若干 AAV 血清型中之任一者，包含但不限於 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.EB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV-TT、AAV-DJ8 或 AAV.HSC16 等。此外，位於 AAV 載體中選定多核苷酸序列側翼的 5' 及 3' ITR 不需要相同或衍生自相同的 AAV 血清型或分離物，只要它們按預期發揮作用即可，例如，允許切除及拯救從宿主細胞基因體或載體中之目標序列，及在 AAV Rep 基因產物存在於細胞中時允許將異源序列整合到受體細胞基因體中。此外，AAV ITR 可衍生自若干 AAV 血清型中之任一者，包含但不限於 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.EB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV-TT、AAV-DJ8 或 AAV.HSC16 等。
術語「反義寡核苷酸」及「ASO」係指能夠經由互補鹼基配對與標靶 mRNA 分子 (例如， Grik2mRNA) 雜交並經由 mRNA 去穩定化及降解或轉譯抑制來抑制其表現的寡核苷酸。ASO 的非限制性實例包含短干擾 RNA (siRNA)、短髮夾 RNA (shRNA) 及微小 RNA (miRNA)。
術語「cDNA」係指為與 mRNA 序列等同之 DNA 之核酸序列 (即，尿苷被胸苷取代)。通常，術語 cDNA 與 mRNA 在提及特定基因 (例如， Grik2基因) 時可互換使用，因為本領域技術人員將理解，除尿苷被讀為胸苷外，cDNA 序列與 mRNA 序列相同。
術語「編碼序列」對應於編碼蛋白質或其部分的 mRNA 分子的核酸序列。相關地，「非編碼序列」對應於不編碼蛋白質或其部分的 mRNA 分子的核酸序列。非編碼序列的非限制性實例包含 5' 及 3' 非轉譯區域 (UTR)、內含子、polyA 尾、啟動子、增強子、終止子及其他順式調節性序列。
術語「互補」當用於描述與第二核苷酸或核苷序列相關的第一核苷酸或核苷序列時，係指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些條件下與包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸雜交並形成雙股結構的能力。例如，此類條件可為嚴格條件，其中嚴格條件可包含：400 mM NaCl、40 mM PIPES pH 6.4、1 mM EDTA、50℃ 或 70℃，持續 12 至 16 小時，然後洗滌 (參見例如，「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」，Sambrook 等人(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press)。可應用其他條件，諸如在生物體內可能遇到的生理相關條件。根據經雜交之核苷酸或核苷之最終應用判定最適合測試兩個序列互補性的條件組的方法為本領域所熟知。
如本文所用，「互補」序列亦可包含或完全由非瓦特生克立克鹼基對及/或由非天然及替代核苷酸形成的鹼基對形成，只要滿足關於其雜交能力的上述要求即可。此類非瓦特生克立克鹼基對包含但不限於 G:U 搖擺或 Hoogstein 鹼基配對。如本文所述之寡核苷酸及標靶序列之間的互補序列包含包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一個或兩個核苷酸序列的全長上的鹼基配對。此類序列在本文中可稱為彼此「完全互補」。當第一序列在本文中被稱為相對於第二序列「實質上互補」時，這兩個序列可完全互補或它們在雜交為多達 30 個鹼基對的雙股後可形成一個或多個 (但通常不多於 10、9、8、7、6、5、4、3、2 或 1 個) 錯配鹼基對，同時保留在與其最終應用最相關的條件下雜交的能力，例如與 mRNA (諸如 Grik2mRNA) 結合並抑制其表現。例如，若多核苷酸與目標 mRNA 之未中斷部分實質上互補，則該序列與目標 mRNA 的至少一部分互補。
術語「互補區域」係指寡核苷酸上與基因、初級轉錄物、序列 (例如，標靶序列) 或經加工之 mRNA 的全部或一部分實質上互補以便乾擾內源性基因 (例如， Grik2) 之表現的區域。在互補區域與標靶序列不完全互補的情況下，錯配可在分子的內部或末端區域中。通常，最可耐受的錯配發生於末端區域，例如在寡核苷酸之 5' 端及/或 3' 端的 5、4、3 或 2 個核苷酸內。
術語「保守性胺基酸取代」、「保守性取代」及「保守性突變」係指一種或多種胺基酸取代一種或多種不同的胺基酸，這些胺基酸顯示出相似的物化性質，諸如極性、靜電荷及立體體積。下表 1 中總結了二十種天然發生之胺基酸中之各者的這些特性。 表 1. 天然發生之胺基酸的代表性物化性質
胺基酸 3 字母代碼 1 字母代碼 側鏈極性 生理 pH (7.4) 下的靜電特徵 立體體積 †
丙胺酸 Ala A 非極性 中性 小
精胺酸 Arg R 極性 陽離子 大
天冬醯胺酸 Asn N 極性 中性 中等
天門冬胺酸 Asp D 極性 陰離子 中等
半胱胺酸 Cys C 非極性 中性 中等
麩胺酸 Glu E 極性 陰離子 中等
麩醯胺酸 Gln Q 極性 中性 中等
甘胺酸 Gly G 非極性 中性 小
組胺酸 His H 極性 在 pH 7.4 下處於平衡態的中性及陽離子形式 大
異白胺酸 Ile I 非極性 中性 大
白胺酸 Leu L 非極性 中性 大
離胺酸 Lys K 極性 陽離子 大
甲硫胺酸 Met M 非極性 中性 大
苯丙胺酸 Phe F 非極性 中性 大
脯胺酸 Pro P 非極性 中性 中等
絲胺酸 Ser S 極性 中性 小
蘇胺酸 Thr T 極性 中性 中等
色胺酸 Trp W 非極性 中性 巨大
酪胺酸 Tyr Y 極性 中性 大
纈胺酸 Val V 非極性 中性 中等
†基於 A 3中的體積：50 至 100 為小，100 至 150 為中等，150 至 200 為大，且 ＞ 200 為巨大
從該表中應當理解，保守性胺基酸家族包含 (i) G、A、V、L 及 I；(ii) D 及 E；(iii) C、S 及 T；(iv) H、K 及 R；(v) N 及 Q；以及 (vi) F、Y 及 W。因此，保守性突變或取代係用一個胺基酸取代相同胺基酸家族的成員 (例如，Ser 取代 Thr 或 Lys 取代 Arg)。
短語「使細胞與寡核苷酸 (諸如本文所揭示之寡核苷酸) 接觸」包含藉由任何可能的方式接觸細胞。使細胞與寡核苷酸接觸包含使細胞在活體外與寡核苷酸接觸或使細胞在活體內與寡核苷酸接觸。使細胞與多核苷酸接觸還亦可以指使細胞與編碼該多核苷酸的核酸載體或含有該多核苷酸的醫藥組成物接觸。接觸可以直接或間接來完成。因此，例如，可藉由執行該方法的受試者將寡核苷酸置於與細胞物理接觸，或替代性地，可以將寡核苷酸藥劑置於將允許或導致其隨後與細胞接觸的情況下。在活體外接觸細胞可藉由例如將細胞與寡核苷酸一起孵育來完成。在活體外接觸細胞可藉由例如將寡核苷酸注入細胞所在的組織中或附近，或藉由將寡核苷酸藥劑注入另一個區域，例如血流或皮下空間，使得該藥劑隨後將到達待接觸之細胞所在的組織。活體外及活體內接觸方法之組合亦為可能的。例如，細胞亦可在活體外與寡核苷酸接觸並隨後移植到個體中。
使細胞與寡核苷酸接觸包含藉由促進或影響攝取或吸收到細胞中來「引入」或「將寡核苷酸遞送至細胞中」。寡核苷酸之吸收或攝取可經由無輔助之擴散或活性細胞過程或藉由輔助劑或裝置來發生。將寡核苷酸引入細胞中可以在 活體外及/或 活體內。例如，對於 活體內引入，可將一種或多種寡核苷酸注入組織部位或全身性投予。活體外引入細胞中包含本領域已知的方法，諸如電穿孔及脂質轉染。在另一實例中，可藉由轉導 (諸如藉由編碼多核苷酸的病毒載體) 將寡核苷酸引入細胞中。病毒載體可經歷細胞加工 (例如，細胞內化、殼體脫落、多核苷酸之轉錄以及藉由 Drosha 及 Dicer 之加工) 以便表現所編碼之多核苷酸。另一種方法描述於下文中及/或在本領域中為已知的。
相對於基因 (例如， Grik2) 的術語「破壞表現」、「抑制表現」或「降低表現」係指防止或減少功能性基因產物 (例如，GluK2 蛋白) 之形成。若基因產物實現其正常 (野生型) 功能，則其為功能性的。基因表現之破壞阻止或降低由該基因編碼的功能性蛋白質之表現。基因表現可藉由使用例如乾擾 RNA 分子(例如，ASO) 諸如本文所述的那些來破壞。
本文所述之組成物、載體構建體或病毒載體的術語「有效量」、「治療有效量」及「足量」係指當投予個體 (包含哺乳動物，例如人) 時足以實現有益或預期的結果 (包含臨床結果) 的量。因此，「有效量」或其同義詞取決於其應用的情境。例如，在治療顳葉癲癇 (TLE) 的情境下，與不投予組成物、載體構建體或病毒載體時獲得的反應相比，該有效量為足以達到治療反應的組成物、載體構建體或病毒載體的量。對應於此類量的本文所述之給定組成物的量將根據多種因素而變化，諸如給定藥劑、醫藥調配物、投予途徑、疾病或病症的類型及其嚴重程度、個體身份 (例如，年齡、性別、體重)、正在治療的宿主、及/或在癲癇的情況下癲癇病灶之大小 (例如，腦容量) 等，但仍然可根據本領域所熟知之方法來判定。再者，如本文所用，本揭露之組成物、載體構建體或病毒載體的「治療有效量」是與對照相比在個體中產生有益或預期結果的量。如本文所定義，本揭露之組成物、載體構建體、病毒載體或細胞的治療有效量可容易藉由本領域已知的方法 (諸如本文所述之那些方法) 來判定。可以調整給藥方案以提供合適的終點治療反應 (例如，在接受治療的個體中癲癇發作的發生在統計學上顯著減少)。
術語「癲癇」係指一種或多種臨床表現為復發性癲癇發作的神經性疾病。癲癇可根據國際抗癲癇聯盟的分類與術語 (ILAE；Berg 等人，2010) 的電臨床症候群進行分類。這些症候群可根據發病年齡、獨特症狀 (手術症候群) 及結構代謝原因進行分類，諸如：(A) 發病年齡：(i) 新生兒期包含良性家族性新生兒癲癇 (BFNE)、早期肌陣攣性腦病 (EME)、大田原症候群；(ii) 嬰兒期包含嬰兒癲癇伴遊走性局灶性癲癇發作、West 症候群、嬰兒期肌陣攣性癲癇 (MEI)、良性嬰兒癲癇、良性家族性嬰兒癲癇、Dravet 症候群、非進行性病症中之肌陣攣性腦病；(iii) 兒童期包含熱性驚厥加症 (FS+)、Panayiotopoulos 症候群、癲癇伴肌陣攣性失張性 (先前不安定) 癲癇發作、伴有中央顳區棘波的良性癲癇 (BECTS)、常染色體顯性遺傳性夜間額葉癲癇 (ADNFLE)、遲發性兒童枕葉癲癇癲癇 (Gastaut 型)、伴有肌陣攣缺失的癲癇、Lennox-Gastaut 症候群、伴有睡眠期間連續棘波的癲癇性腦病 (CSWS)、Landau-Kleffner 症候群 (LKS)、兒童失神性癲癇 (CAE)；(iv) 青春期-成年期包含青少年失神性癲癇 (JAE)、青少年肌陣攣性癲癇 (JME)、僅伴全面性強直陣攣發作的癲癇、進行性肌陣攣性癲癇 (PME)、伴有聽覺特徵的常染色體顯性遺傳性癲癇 (ADEAF)、其他家族性顳葉癲癇；(v) 不同年齡的發病包含具有可變病灶的家族性局灶性癲癇 (兒童到成人)、反射性癲癇；(B) 獨特症狀 (手術症候群) 包含內側顳葉癲癇 (MTLE)、Rasmussen 症候群、下丘腦錯構瘤的痴笑樣發作、側身驚厥-偏癱-癲癇；(C) 由結構代謝原因引起及組織的癲癇包含皮質發育畸形 (半腦畸形、異位等)、神經皮膚症候群 (結節性硬化症及 Sturge-Weber 二氏症候群)、腫瘤、感染、外傷、血管瘤、圍產期損傷及中風。術語「難治性癲癇」係指藥物治療難治性癲癇；也就是說，當前藥物治療無法有效治療患者的疾病 (參見例如 Englot 等人J Neurosurg Pediatr 12:134-41 (2013))。
術語「外顯子」係指基因 (例如， Grik2基因) 編碼區域內的區域，其核苷酸序列決定對應蛋白質的胺基酸序列。術語「外顯子」亦係指從基因轉錄的 RNA 的對應區域。外顯子經轉錄成前驅 mRNA，並可以包含於成熟 mRNA 中，取決於基因的選擇性剪接。在加工後包含於成熟 mRNA 中的外顯子經轉譯成蛋白質。外顯子之序列決定蛋白質之胺基酸組成。替代性地，成熟 mRNA 中包含的外顯子可能為非編碼的 (例如，不轉譯成蛋白質的外顯子)。
當在基因或核酸表現的上下文中使用時，術語「表現」係指將基因中包含的資訊轉化為基因產物。基因產物可為基因的直接轉錄產物 (例如 mRNA、tRNA、rRNA、反義 RNA、核酶、結構 RNA 或任何其他類型的 RNA) 或藉由 mRNA 之轉譯所產生的蛋白質。基因產物亦包含藉由加帽、多腺苷酸化、甲基化及編輯等過程修飾的 mRNA，以及藉由例如甲基化、乙醯化、磷酸化、泛素化、SUMO 化、ADP-核糖基化、肉豆蔻醯化及醣基化修飾的蛋白質 (例如，GluK2)。
術語「表現」係指以下事件中之一者或多者：(1) 從 DNA 序列產生 RNA 模板 (例如，藉由轉錄)；(2) 加工 RNA 轉錄物 (例如，藉由剪接、編輯、5' 帽形成及/或 3' 末端加工)；(3) RNA 轉譯成多肽或蛋白質；及 (4) 多肽或蛋白質的轉譯後修飾。目標基因在個體中之表現可藉由例如偵測從個體獲得的樣品中的以下指標來證明：編碼對應蛋白質的 mRNA 的數量或濃度之降低或增加 (例如，使用本文所述或本領域已知的 RNA 偵測程序，諸如定量聚合酶鏈反應 (qPCR) 及 RNA seq 技術)、對應蛋白質的數量或濃度之降低或增加 (如使用本文所述或本領域已知的蛋白質偵測方法諸如酶聯結免疫吸附檢定法 (ELISA) 等所評定) 及/或對應蛋白質活性之降低或增加 (例如，在離子通道的情況下，如使用本文所述或本領域已知的電生理方法所評定)。
術語「GluK2」，亦稱為「GluR6」、「GRIK2」、「MRT6」、「EAA4」或「GluK6」，係指麩胺酸離子型受體紅藻氨酸型次單元 2 蛋白，如目前使用的 IUPHAR 命名法中所命名 (Collingridge, G.L., Olsen, R.W., Peters, J., Spedding, M., 2009. A nomenclature for ligand-gated ion channels. Neuropharmacology 56, 2–5)。術語「含有 GluK2 的 KAR」、「GluK2 受體」、「GluK2 蛋白」與「GluK2 次單元」在全文中可互換使用，並且通常係指由 Grik2基因編碼或表現的蛋白質。
術語「引導股」或「引導序列」係指位於莖環結構的 5' 或 3' 莖環臂上的莖環 RNA 結構 (例如，shRNA 或微小 RNA) 的組分，其中引導股/序列包含 Grik2mRNA 反義序列 (例如，SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)，該反義序列能夠與 Grik2mRNA 結合並抑制其表現。引導股/序列亦可包含額外序列，諸如間隔子序列或連接子序列。引導序列可以與莖環 RNA 結構之隨從股/序列互補或實質上互補 (例如，具有不多於 5、4、3、2 或 1 個錯配)。
術語「離子型麩胺酸受體」包含 NMDA (N-甲基-D-天門冬胺酸)、AMPA (α-胺基-3-羥基-5-甲基-4-異㗁唑丙酸) 及紅藻氨酸受體 (KAR) 類的成員。功能性 KAR 可由命名為 GluK1、GluK2、GluK3、GluK4 及 GluK5 次單元的五個次單元的同聚體或異聚體組合組裝成四聚體組件 (Reiner 等人，2012)。在一些情況下，本揭露之目標為由 GluK2 及 GluK5 構成的 KAR 複合體。鑑於觀察到 GluK5 次單元本身不形成功能性同聚體通道，抑制 Grik2基因的表現足以消除 GluK2/GluK5 紅藻氨酸受體功能。
「表現抑制劑」係指具有抑制或降低基因 (例如， Grik2基因) 表現的生物效應的藥劑 (例如，本揭露之 ASO 劑)。抑制基因 (例如， Grik2基因) 之表現通常將導致標靶細胞或組織中基因產物 (蛋白質，例如 GluK2 蛋白) 之減少或甚至消除，儘管可以達到不同位準之抑制。抑制或減少表現通常稱為敲落。
術語「經分離之多核苷酸」係指包含兩個或更多個共價連接之核苷酸的經分離之分子。此類經共價連接之核苷酸亦可稱為核酸分子。通常，「經分離之」多核苷酸係指人造、化學合成、經純化及/或相對於從其獲得的核酸序列異源的多核苷酸。
術語「微小 RNA」係指一種短的 (例如，通常約 22 個核苷酸) 非編碼 RNA 序列，其調節 mRNA 轉譯並從而影響目標蛋白質豐度。一些微小 RNA 由單個單順反子基因轉錄，而另一些則作為多基因基因簇的一部分來轉錄。微小 RNA 之結構可包含 5' 及 3' 側翼序列、包含莖及莖環序列的髮夾序列。在細胞內加工期間，未成熟之微小 RNA 被 Drosha 截短，其切除 5' 及 3' 側翼序列。接著，微小 RNA 分子從細胞核轉位至細胞質，在其中經歷 Dicer 切割環區域。微小 RNA 的生物作用經由與 mRNA 分子的區域 (通常為 3' 非轉譯區域) 結合並導致 mRNA 之切割、降解、不穩定及/或低效轉譯，在轉譯調節位準上發揮作用。微小 RNA 與其標靶之結合通常由微小 RNA 的髮夾序列內的短 (例如，6 至 8 個核苷酸) 「種子區域」媒介。在本揭露全文中，術語 siRNA 可以包含其等同的 miRNA，使得 miRNA 涵蓋與其等同 siRNA 具有與標靶 (例如，在種子區域中) 之同源性的相同鹼基。如本文所述，微小 RNA 可以為非天然發生之微小 RNA，諸如具有一個或多個異源核酸序列的微小 RNA。
術語「核苷酸」定義為經修飾或天然發生之脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。核苷酸通常包含嘌呤及嘧啶，其包含胸苷、胞苷、鳥苷、腺苷及尿苷。如本文所用之術語「寡核苷酸」定義為上述所定義的核苷酸或本文所揭示之經修飾之核苷酸的寡聚物。術語「寡核苷酸」指 3' 至 5' 或 5' 至 3' 取向的核酸序列，其可以為單股或雙股。在本揭露之上下文中所用的寡核苷酸可以特定而言為 DNA 或 RNA。該術語亦包含「寡核苷酸類似物」，其係指具有以下之寡核苷酸：(i) 經修飾之骨架結構，例如，不同於在天然寡核苷酸及多核苷酸中發現的標準磷酸二酯鍵的骨架，及 (ii) 視情況選用的經修飾之糖部分，例如，N-嗎啉基部分而不是核糖或脫氧核糖部分。寡核苷酸類似物支持能夠藉由瓦特生克立克鹼基配對與標準多核苷酸鹼基形成氫鍵結的鹼基，其中類似物骨架以允許寡核苷酸類似物分子與標準多核苷酸 (例如，單股 RNA 或單股 DNA) 中之鹼基之間以序列特異性方式形成氫鍵結的方式呈現鹼基。特定而言，類似物為具有基本上不帶電荷的含磷骨架的那些。寡核苷酸類似物中基本上不帶電荷的含磷骨架為其中大多數次單元鍵聯 (例如，在 50% 至 100% 之間的鍵聯，通常為至少 60% 至 100% 或 75% 或 80% 的鍵結) 不帶電荷且含有單個磷原子的骨架。進一步地，術語「寡核苷酸」係指相對於其正常轉錄方向反轉的寡核苷酸序列，因此對應於與宿主細胞內表現的標靶基因 mRNA 分子互補的 RNA 或 DNA 序列。反義引導股可以以多種不同的方式構建，條件是其能夠干擾標靶基因之表現。例如，反義引導股可藉由相對於其正常轉錄方向反向互補標靶基因的編碼區域 (或其一部分) 來構建，以允許其補體之轉錄 (例如，由反義及有義基因編碼的 RNA 可能互補)。寡核苷酸不需要與標靶基因具有相同的內含子或外顯子模式，並且標靶基因之非編碼片段在達到標靶基因表現的反義抑制方面可以與編碼區段諸如 ASO 同樣有效。在一些情況下，ASO 具有與標靶基因相同的外顯子模式。
寡核苷酸可具有允許靶向並雜交至 Grik2mRNA 的任何長度 (例如，寡核苷酸與 Grik2mRNA 的至少一個區域完美或實質上互補)，並且長度可以在約 10 至 50 個鹼基對的範圍內，例如，長度為約 15 至 50 個鹼基對或長度為 18 至 50 個鹼基對，例如長度為約 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 或 50 個鹼基對，諸如長度為約 15 至 30、15 至 29、15 至 28、15 至 27、15 至 26、15 至 25、15 至 24、15 至 23、15 至 22、15 至 21、15 至 20、15 至 19、15 至 18、15 至 17、18 至 30、18 至 29、18 至 28、18 至 27、18 至 26、18 至 25、18 至 24、18 至 23、18 至 22、18 至 21、18 至 20、19 至 30、19 至 29、19 至 28、19 至 27、19 至 26、19 至 25、19 至 24、19 至 23、19 至 22、19 至 21、19 至 20、20 至 30、20 至 29、20 至 28、20 至 27、20 至 26、20 至 25、20 至 24、20 至 23、20 至 22、20 至 21、21 至 30、21 至 29、21 至 28、21 至 27、21 至 26、21 至 25、21 至 24、21 至 23 或 21 至 22 個鹼基對。上文所引述之範圍及長度中間的範圍及長度亦被設想為本揭露之一部分。
術語「隨從股」及「隨從序列」係指位於莖環結構的 5' 或 3' 莖環臂上的莖環 RNA 結構 (例如，shRNA 或微小 RNA) 的組分，該莖環結構包含互補或實質上互補的序列 (例如，與 Grik2mRNA 反義序列 (例如，SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 108 中任一者之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性) 具有不多於 5、4、3、2 或 1 個錯配)。隨從股/序列亦可包含額外序列，諸如間隔子序列或連接子序列。隨從序列可以與莖環 RNA 結構之引導股/序列互補或實質上互補。
術語「質粒」係指染色體外環狀雙股 DNA 分子，額外的 DNA 片段可連接至該分子中。質粒為一種類型之載體 (一種能夠傳送已與其連接之另一種核酸的核酸分子)。某些質粒能夠在引入它們的宿主細胞 (例如，具有細菌複製起始點的細菌質粒，及附加型哺乳動物質粒) 中自主複製。其他載體 (例如，非附加型哺乳動物載體) 可在引入宿主細胞中後整合在宿主細胞之基因體中，從而與宿主基因體一起複製。某些質粒能夠指導與其可操縱地連接之基因的表現。
術語「定位熵」當應用於多核苷酸 (例如， Grik2mRNA) 內的單個核苷酸時，係指代表給定 mRNA 二級結構所施加之約束及局部拓撲結構，核苷酸可採取的分子位置、組態或排列之數量的熱力學量。特定核苷酸位置之低定位熵指示核苷酸可佔據少量位置組態。特定核苷高位置之高定位熵指示核苷酸可佔據大量位置組態。多核苷酸鏈內的核苷酸可由於參與與另一個核苷酸之鹼基配對而顯示出低定位熵，從而限制鹼基配對核苷酸可採取的位置組態的總數。相反，多核苷酸內的核苷酸可能由於未雜交而顯示出高定位熵，從而相對於鹼基配對核苷酸在其位置組態方面具有更多自由度。術語「平均定位熵」係指給定序列的所有核苷酸位置中的定位熵值的平均值。例如，平均定位熵可對至少 2 個 (例如，至少 2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 個或更多) 核苷酸進行計算。在一個特定實例中，平均位置熵 2 個或更多核苷酸進行計算。在另一實例中，平均位置熵 5 個或更多核苷酸進行計算。在另一實例中，平均位置熵 10 個或更多核苷酸進行計算。在另一實例中，平均位置熵 15 個或更多核苷酸進行計算。在另一實例中，平均位置熵 20 個或更多核苷酸進行計算。在另一實例中，平均位置熵 25 個或更多核苷酸進行計算。在另一實例中，平均位置熵 30 個或更多核苷酸進行計算。在另一實例中，平均位置熵 35 個或更多核苷酸進行計算。在另一實例中，平均位置熵 40 個或更多核苷酸進行計算。在另一實例中，平均位置熵 45 個或更多核苷酸進行計算。在另一實例中，平均位置熵 50 個或更多核苷酸進行計算。在另一實例中，平均位置熵 55 個或更多核苷酸進行計算。在另一實例中，平均位置熵 60 個或更多核苷酸進行計算。在另一實例中，平均位置熵 65 個或更多核苷酸進行計算。在另一實例中，平均位置熵 70 個或更多核苷酸進行計算。在另一實例中，平均位置熵 75 個或更多核苷酸進行計算。在另一實例中，平均位置熵 80 個或更多核苷酸進行計算。在另一實例中，平均位置熵 85 個或更多核苷酸進行計算。在另一實例中，平均位置熵 90 個或更多核苷酸進行計算。在另一實例中，平均位置熵 95 個或更多核苷酸進行計算。在另一實例中，平均位置熵 100 個或更多核苷酸進行計算。
定量多核苷酸序列內的核苷酸之定位熵之方法為本領域所熟知。單股多核苷酸之二級結構，諸如在折疊算法 (諸如 RNAfold) 中預測的具有高定位熵 (較接近於零；以 kcal/mol 為單位) 的 mRNA 或 RNA 抑制劑，在其自身結構諸如莖環內形成強的穩定雙股的可能性低。該預測的高定位熵、單股 RNA 通常對其結合標靶顯示出高親和力 (參見 例如，公開於 2015 年 5 月 21 日的 PCT 國際公開號 WO2015/073360)。預測 Grik2 mRNA 之未配對區域 (未配對之環及未配對之莖) 具有高定位熵 (值較接近於零；以 kcal/mol 為單位) 且有利於與引導序列之交互作用。
術語「啟動子」係指 DNA 上由 RNA 聚合酶結合的識別位點。聚合酶驅動多核苷酸之轉錄。適用於本文所述之組成物及方法的示例性啟動子描述於例如 Sandelin 等人，Nature Reviews Genetics 8:424 (2007) 中，其揭露內容藉由引用併入本文，因為其涉及核酸調節性元件。此外，術語「啟動子」可以指合成啟動子，其為生物系統中非天然發生之調節性 DNA 序列。合成啟動子含有與自然界中不存在的多核苷酸序列結合的天然發生之啟動子部分，並可以使用多種多核苷酸、載體及標靶細胞類型進行優化以表現重組 DNA。
相對於參考多核苷酸或多肽序列的「序列同一性百分比 (%)」定義為在比對序列並必要時引入間隙以達成最大序列同一性百分比之後，候選序列中與參考多核苷酸或多肽序列中之核酸或胺基酸相同的核酸或胺基酸的百分比。為判定核酸或胺基酸百分比序列同一性之目的而進行的比對可透過本領域中所熟知之各種方式來達到，例如，使用公眾可取得的電腦軟體諸如 BLAST、BLAST-2 或 Megalign 軟體。使用公認且習用的方法，可判定用於比對序列的適當參數，包含在被比較序列的全長上達到最大比對所需之任何演算法。例如，可使用序列比較電腦程式 BLAST 生成序列同一性百分比值。作為説明，給定核酸或胺基酸序列 A 與/對/針對給定核酸或胺基酸序列 B 的序列同一性百分比 (其可替代性地表述為給定核酸或胺基酸序列 A 與與/對/針對給定核酸或胺基酸序列 B 具有特定序列同一性百分比)，具有或反對給定的核酸或胺基酸序列，B) 計算如下： 100 乘以 (分數 X/Y)
其中 X 為藉由序列比對程式 (例如 BLAST) 在 A 與 B 之程式比對中評分為相同匹配的核苷酸或胺基酸的數量，且其中 Y 為 B 中核酸之總數。當核酸或胺基酸序列 A 的長度不等於核酸或胺基酸序列 B 的長度時，A 與 B 之序列同一性百分比將不等於 B 與 A 之序列同一性百分比。
術語「醫藥上可接受」係指那些適於與個體諸如哺乳動物 (例如，人) 的組織接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應及其他問題並發症並與合理的收益/風險比相稱的化合物、材料、組成物及/或劑型。
如本文所用，術語「醫藥組成物」代表含有本文所述之化合物 (例如，ASO 或含有其的載體) 與醫藥上可接受之賦形劑一起配製並且在一些情況下可以在獲得政府監管機構批准的情況下作為用於治療哺乳動物疾病的治療方案的一部分進行製造或銷售的組成物。醫藥組成物可配製用於例如單位劑型的口服投予 (例如，片劑、膠囊、囊片、膠囊錠或糖漿)、局部投予 (例如，作為乳膏、凝膠、洗劑或軟膏)、靜脈內投予 (例如，作為不含顆粒栓子的無菌溶液及在適於靜脈內使用的溶劑系統中)、鞘內注射、腦室內注射、實質內注射或任何其他醫藥上可接受之調配物。
「醫藥上可接受之賦形劑」係指除本文所述之化合物 (例如，能夠懸浮或溶解活性化合物的媒劑) 以外並且具有對患者基本上無毒且無炎性的特性的任何成分。賦形劑可以包含例如：抗粘劑、抗氧化劑、粘合劑、包衣劑、壓縮助劑、崩解劑、染料 (色素)、潤膚劑、乳化劑、填充劑 (稀釋劑)、成膜劑或包衣劑、風味劑、芳香劑、助流劑 (流動增強劑)、潤滑劑、防腐劑、印刷油墨、吸附劑、懸浮劑或分散劑、甜味劑及水合水。示例性賦形劑包含但不限於丁基化羥基甲苯 (BHT)、碳酸鈣、磷酸鈣 (二元)、硬脂酸鈣、交聯羧甲基纖維素、交聯聚乙烯吡咯烷酮、檸檬酸、交聯聚維酮、半胱胺酸、乙基纖維素、明膠、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乳糖、硬脂酸鎂、麥芽糖醇、甘露醇、甲硫胺酸、甲基纖維素、對羥基苯甲酸甲酯、微晶纖維素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、普維酮、預膠化澱粉、對羥基苯甲酸丙酯、棕櫚酸視黃酯、蟲膠、二氧化矽、羧甲基纖維素鈉、檸檬酸鈉、羥乙酸澱粉鈉、山梨糖醇、澱粉 (玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石粉、二氧化鈦、維生素 A、維生素 E、維生素 C 及木糖醇。
本文所述之化合物 (例如，ASO 及含有其的載體) 可具有可電離基團，以便能夠製備為醫藥上可接受之鹽。這些鹽可以為涉及無機酸或有機酸的酸加成鹽，或在本文所述之化合物之酸性形式的情況下，該等鹽可以由無機鹼或有機鹼製備。通常，化合物作為醫藥上可接受之鹽製備或使用，製備為醫藥上可接受之酸或鹼之加成產物。適當的醫藥上可接受之酸及鹼以及製備適當的鹽之方法為本領域所熟知。鹽可以由醫藥上可接受之無毒酸及鹼 (包含無機及有機酸及鹼) 進行製備。代表性酸加成鹽包含乙酸鹽、己二酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天門冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、延胡索酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果凍酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一酸鹽及戊酸鹽。代表性鹼金屬或鹼土金屬鹽包含鈉、鋰、鉀、鈣及鎂鹽，以及無毒的銨、四級銨及胺陽離子，包含但不限於銨、四甲基銨、四乙基銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺及乙胺。
術語「調節性序列」包含啟動子、增強子及其他控制基因之轉錄或轉譯的表現控制元件 (例如，多腺苷酸化訊號)。此類調節性序列描述於例如 Perdew 等人 Regulation of Gene Expression (Humana Press, New York, NY (2014)) 中；其藉由引用併入本文。
術語「標靶」或「靶向」係指 ASO 劑 (例如，本文所述之 ASO 劑) 經由互補鹼基配對與 Grik2基因或編碼 GluK2 蛋白的 mRNA 特異性結合的能力。
術語「單股區域」對應於 Grik2mRNA 之預測二級結構的區域 (例如以下 Grik2mRNA，其具有 SEQ ID NO: 115 之核酸序列或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 115 之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，並且為單股的 (例如，未與 mRNA 內的其他核苷酸雜交) 或實質上單股的 (例如，在與相同 Grik2mRNA 分子之其他核苷酸雜交的區域內具有不多於 5% 的核苷酸)。 Grik2mRNA 之單股區域的非限制性實例包含 Grik2mRNA (SEQ ID NO: 115) 之預測的環區域 1 至 14 (SEQ ID NO: 145 至 158) 及預測的未配對區域 1 至 5 (SEQ ID NO: 159 至 163)。
術語「短干擾 RNA」及「siRNA」係指雙股核酸，其中每股包含 RNA、RNA 類似物或 RNA 及 DNA。siRNA 分子可包含在 19 與 23 個之間的核苷酸 (例如，21 個核苷酸)。siRNA 通常在每股的 3' 末端具有 2 bp 突出，使得 siRNA 中之雙股區包含 17 至 21 個核苷酸 (例如，19 個核苷酸)。通常，siRNA 之反義股與標靶基因/RNA 之標靶序列充分互補。siRNA 分子在 RNA 干擾途徑內運作，導致藉由與標靶 mRNA (例如， Grik2mRNA) 結合並經由 Dicer 所媒介的 mRNA 切割以降解 mRNA 來抑制 mRNA 表現。在本揭露全文中，術語 siRNA 意在包含其等同的 miRNA，使得 miRNA 涵蓋與其等同 siRNA 具有與標靶之同源性的相同鹼基。
術語「短髮夾 RNA」及「shRNA」係指在細胞中形成莖環結構之 50 至 100 個核苷酸的單股 RNA，其含有具有 5 至 30 個核苷酸的環區域，以及在環區域兩側具有 15 至 50 個核苷酸的長互補 RNA，其藉由互補 RNA 序列之間的鹼基配對形成雙股莖；並且，在一些情況下，在形成莖的每個互補股之前及之後包含額外的 1 至 500 個核苷酸。例如，shRNA 通常需要髮夾 3' 的特定序列來終止藉由 RNA 聚合酶之轉錄。由於其包含短的 5' 及 3' 側翼序列，此類 shRNA 通常可避免藉由 Drosha 之加工。其他 shRNA，諸如由 RNA 聚合酶 II 轉錄的「shRNA 樣微小 RNA」，包含較長的 5' 及 3' 側翼序列，並且需要在細胞核中由 Drosha 進行加工，之後經切割之 shRNA 從細胞核輸出至胞質液，並在胞質液中由 Dicer 進一步切割。與 siRNA 一樣，shRNA 以序列特異性方式與標靶 mRNA 結合，從而切割並破壞標靶 mRNA，從而抑制標靶 mRNA 之表現。
術語「個體」及「患者」係指動物 (例如，哺乳動物，諸如人)。將根據本文所述之方法治療的個體可以爲已被診斷患有癲癇 (例如，TLE) 的個體或具有形成該病況的風險的個體。可藉由本領域已知的任何方法或技術進行診斷。根據本揭露待治療之個體可能已經經歷標準測試，或可能已經在未經檢查的情況下被鑑別為由於存在一種或多種與疾病或病況相關聯之風險因素而處於風險中的個體。
術語「顳葉癲癇」或「TLE」係指一種慢性神經性病状，其特徵在於源自大腦顳葉的慢性及復發性癲癇發作 (癲癇)。該疾病不同於天然腦組織中之急性癲癇發作，因為 TLE 的特徵在於神經元網絡的形態-功能重組及來自海馬迴齒狀腦回的顆粒細胞的復發苔狀纖維之出芽，而天然組織中之急性癲癇發作不促發此類迴路特定之重組。TLE 可能由大腦之一個或兩個半球中出現癲癇病灶而引起。
術語「轉導 (transduction/transduce)」係指將核酸材料 (例如，載體，諸如病毒載體構建體或其一部分) 引入細胞並接著在細胞中表現由該核酸材料 (例如，載體構建體或其一部分) 編碼的多核苷酸之方法。
術語「治療 (treatment/treat)」係指治療性及預防性治療以及治愈性或疾病改善治療，包含治療具有感染疾病風險或疑似感染疾病的患者，以及治療生病或被診斷為罹患疾病或醫學病症的患者。治療亦包含抑制臨床復發。可以向患有醫學病症或最終可能患有病症的個體投予治療，以預防、治愈、延遲病症之或復發病症之發作、降低該病症之或復發病症之嚴重程度或改善其一種或多種症狀，或以便將個體之存活期延長至超過在不存在此類治療的情況下的預期值。術語「治療方案」係指疾病之治療模式，例如治療期間所用的給藥模式。治療方案可包含誘導方案及維持方案。短語「誘導方案」或「誘導期」係指用於疾病初始治療的治療方案 (或治療方案的一部分)。誘導方案的總體目標為在治療方案的初始階段為患者提供高水平之藥物。誘導方案可 (部分或全部) 採用「負荷方案」，其可以包含投予比醫師在維持方案期間所用的藥物更大劑量的藥物、比醫師在維持方案期間更頻繁地投予藥物，或兩者兼而有之。短語「維持方案」或「維持期」係指用於在疾病治療期間維持患者的治療方案 (或治療方案的一部分)，例如，以使患者長期 (月或年) 處於緩解狀態。維持方案可採用連續療法 (例如，定期例如每週、每月、每年等投予藥物) 或間歇療法 (例如，中斷治療、間歇治療、復發時治療或在達到特定預先判定之標準 (例如，疾病表現) 後治療)。
術語「載體」包含核酸載體，例如，DNA 載體，諸如質粒、RNA 載體或另外的適當的複制子 (例如，病毒載體)。已經開發出多種載體用於將編碼外源多核苷酸或蛋白質的多核苷酸遞送至原核或真核細胞中。此類表現載體的實例揭示於例如 WO 1994/011026 中；其藉由引用併入本文，因為其涉及適合表現目標核酸材料的載體。適用於本文所述之組成物及方法的表現載體含有多核苷酸序列以及例如用於在哺乳動物細胞中表現異源核酸材料 (例如，ASO) 的額外序列元件。可用於表現本文所述之 ASO 劑的某些載體包含含有調節性序列的質粒，諸如指導基因轉錄的啟動子及增強子區域。用於表現本文所揭示之 ASO 劑的其他有用的載體含有增強這些多核苷酸之轉譯速率或改善由基因轉錄所產生的 RNA 之穩定性或核輸出的多核苷酸序列。這些序列元件包含例如 5' 及 3' 非轉譯區域、IRES 及多腺苷酸化訊號位點，以便指導表現載體上所攜帶之基因之有效轉錄。適用於本文所述之組成物及方法的表現載體亦可含有編碼用於選擇含有此類載體的細胞的標記物的多核苷酸。適當的標記物的實例為編碼對抗生素諸如胺苄青黴素、氯黴素、康黴素、諾爾絲黴素或吉歐黴素具有抗性的基因。
術語「總結合自由能」係指核苷酸或多核苷酸的熱力學性質 (以 kcal/mol 測量)，其對應於核苷酸或多核苷酸 (例如，本揭露之 ASO 劑) 與其在 Grik2mRNA 上的對應標靶序列 (例如，SEQ ID NO: 115) 雜交過程的自由能，該過程包含打開 mRNA 上的標靶區域、生成單股引導序列以及單股 siRNA 引導序列與其單股 mRNA 標靶序列雜交。在本揭露之上下文中，對於特定 ASO 序列，總結合自由能的更負的值通常與該 ASO 對 Grik2mRNA 表現之敲落效率降低相關聯，而較接近於零的值通常反映敲落效率增加。
術語「來自雙股形成的能量」係指核苷酸或多核苷酸的熱力學性質 (以 kcal/mol 測量)，其對應於單股 siRNA 引導序列與單股 mRNA 序列 (例如， Grik2mRNA) 雜交的自由能。在本揭露之上下文中，對於給定的核苷酸或多核苷酸，更負的雙股形成能值反映雙股之形成比雙股形成能較接近於零的雙股的形成更有利，並且亦反映 Grik2mRNA 表現之降低的敲落效率。因此，該值指示雙股形成的有利程度與敲落效率之間的反比關係，表明雙鏈形成能為判定雙股分離 (其倒數) 的有利程度而不是雙股形成提供了更強的度量。因此，雙股形成能的值越負，則雙股越穩定。於是，不太穩定的 Grik2標靶:ASO 雙股可能指示 ASO 可能更有效地敲落 Grik2mRNA 表現，其可能是由於其持續力的增加。換言之，與標靶序列複合的 ASO 更有可能脫離不太穩定的雙股，以便靶向不同 mRNA 分子上的相同區域，這將反映其敲落效率。
術語「打開能」及「總打開能」係指核苷酸或多核苷酸的熱力學性質 (以 kcal/mol 為單位)，對應於在標的位置分解 (亦即，打開/呈現可觸及的) RNA 二級結構所需的能量，並可能包含分解附近的二級結構或涉及與標的序列形成二級結構的遠側序列。在本揭露之上下文中，更負的打開能指示分解 RNA 二級結構的能量要求越高，並反映出對應 ASO 序列的降低的敲落效率。該值指示需要較少能量展開的標的序列更易於展開，並因此可被認為更容易進行 ASO 結合。
術語「GC 含量」及「GC 百分比 (%)」係指多核苷酸 (例如，本揭露之 ASO 或其完全或實質上互補的序列) 中鳥嘌呤 (G) 或胞嘧啶 (C) 的鹼基百分比。與由兩個氫鍵所媒介的 A-T/U 鍵合不同，G-C 鍵合由三個氫鍵媒介。具有更高 GC 含量的多核苷酸雙股更穩定並需要更多能量來分解該雙股。該穩定性不一定是由增加的氫鍵數量賦予的，而是由更穩定的鹼基堆疊所賦予的。對於給定的多核苷酸，GC 含量可以計算如下：
序列表
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本文所述為用於治療個體 (諸如哺乳動物個體，例如人) 之癲癇諸如顳葉癲癇 (TLE；例如，難治性 TLE) 之組成物及方法。例如，可投予 (例如，根據本文所述之方法) 治療有效量的靶向由麩胺酸離子型受體紅藻氨酸類型次單元 2 ( Grik2) 基因的抑制性 RNA 分子 (例如，反義寡核苷酸 (ASO) 或編碼其的核酸載體，以治療有需要之個體之癲癇。本文所述為含有編碼靶向 Grik2mRNA 的 ASO 劑的核酸載體 (例如，病毒載體，諸如慢病毒或腺相關病毒 (AAV) 載體) 的組成物，其用於治療 TLE。 Grik2
Grik2為編碼離子型麩胺酸受體次單元 GluK2 的基因，其可被促效劑紅藻氨酸選擇性活化。含有 GluK2 的紅藻氨酸受體 (KAR) 與其他離子型麩胺酸受體一樣，藉由麩胺酸表現出快速配體門控，其藉由打開可滲透鈉及鉀的陽離子通道孔發揮作用。KAR 複合體可由若干次單元組裝成 KAR 次單元之異聚體或同聚體組裝體。此類受體的特徵在於細胞外 N 端及大肽環，其一起形成配體結合域及細胞內 C 端。離子型麩胺酸受體複合物本身用作配體門控離子通道，並在結合麩胺酸後，媒介荷電離子穿過神經元膜。通常，KAR 為 GluK1、2 及/或 3 (先前分別命名為 GluR5、GluR6 及 GluR7)、GluK4 (KA1) 及 GluK5 (KA2) 次單元的多聚體構建體 (Collingridge, Neuropharmacology.2009 Jan;56(1):2-5)。KAR 複合體中涉及的各種次單元組合通常由編碼特定 KAR 次單元的 mRNA 之 RNA 剪接及/或 RNA 編輯 (例如，藉由腺苷脫氨酶將腺苷轉化為肌苷) 判定。此外，此類 RNA 修飾可影響受體之特性，諸如改變通道的鈣滲透性。含有 GluK2 的 KAR 為調節離子型麩胺酸受體活性並接著改善與癲癇發生相關的症狀的合適標靶。 顳葉癲癇
癲癇發生為導致癲癇形成的過程，並且其可能在導致發生病理性神經元網絡重組的細胞、分子及形態學改變時潛伏。基於致癲癇病灶之解剖學起源，TLE 的特徵在於兩種主要類型。源自內側顳葉 (例如，海馬迴、海馬旁迴、海馬下腳及杏仁核等) 的 TLE 被命名為內側 TLE (mTLE)，而源自外側顳葉 (例如，顳葉新皮質) 的 TLE 被稱為外側 TLE (lTLE)。TLE 之額外特徵可能包含海馬迴 CA1、CA3、齒狀門及齒狀腦回 (DG) 區域之神經元細胞死亡、GABA 逆轉電位的逆轉、DG 中的顆粒細胞 (GC) 分散及復發苔狀纖維之出芽 (導致在齒狀 GC 上形成病理生理學復發性興奮性突觸 (rMF-DGC 突觸))。
多種致病因子已被歸因於 TLE 之病因學，包含內側顳葉硬化、創傷性腦損傷、腦感染 (例如，腦炎及腦膜炎)、缺氧性腦損傷、中風、腦腫瘤、遺傳症候群及熱性驚厥。由於 CNS 之可塑性取決於發育狀態及大腦特定區域的易感性，因此並非所有具有腦損傷的個體皆發展為癲癇。海馬迴 (包含 DG) 已被鑑定為特別容易受到導致 TLE 的損傷的大腦區域，並且在一些情況下，已經與治療抗性 (亦即，難治性) 癲癇相關聯 (Jarero-Basulto, J.J. 等人Pharmaceuticals, 2018, 11, 17; doi:10.3390/ph11010017)。興奮性麩胺酸傳訊之放大可能促進自發性癲癇發作 (Kuruba 等人 Epilepsy Behav. 2009, 14 (Suppl. 1), 65–73)。化學麩胺酸抑制劑，例如 NMDA 受體拮抗劑，已顯示出阻斷或減少由麩胺酸媒介的興奮性毒性及急性癲癇發作引起的神經元死亡。然而，此類藥劑在 TLE 中表現出較差之功效 (Foster, AC 及 Kemp, JA. Curr. Opin. Pharmacol. 2006, 6, 7–17)。
不希望受理論束縛，經由含有異位 GluK2 的 KARs 起作用的異常 rMF-DGC 突觸 (Epsztein 等人，2005；Artinian 等人，2011，2015) 可能在 TLE 的慢性癲癇發作中發揮關鍵作用 (Peret 等人，2014)。例如，在缺乏 GluK2 受體次單元或存在抑制 GluK2/GluK5 受體的藥物的轉基因小鼠中，發作間尖峰及發作事件 (亦即，癲癇狀大腦活動的電生理學特徵) 減少 (Peret 等人，2014；Crépel 及 Mulle，2015)。雖然在旨在檢驗這些理論的轉基因動物模型中敲落或沉默 GluK2 為可行的，但設計對 GluK2 次單元具有選擇性且安全用於人類的抑制劑具有挑戰性。GluK 次單元在結構上是保守的，並且其 DNA 編碼序列共有大量同系物。大腦中相對於同聚體及異聚體離子型及代謝型麩胺酸受體的複雜基因表現模式使任何治療策略進一步複雜化。本文所揭示之方法及組成物適用於藉由靶向 Grik2mRNA 並降低 (例如，敲落) 神經元或星形膠質細胞中含有 GluK2 的 KAR 的表現來治療 TLE (例如，mTLE 或 LTE)，其促進 (例如) 神經元迴路 (例如，海馬迴路) 中自發性癲癇狀放電的減少。因此，本文所述之組成物及方法靶向疾病之生理原因並可用於根治治療。 靶向 Grik2mRNA 的寡核苷酸劑
眾所周知，TLE 之臨床管理非常困難，多達三分之一的 TLE 患者無法使用現有藥物充分控制使人衰弱的癲癇發作。這些患者通常經歷難以治療的復發性癲癇發作。在此類情形下，TLE 患者可能採取侵入性及不可逆的手術切除顳葉致癲癇病灶，其可能導致非所欲的認知缺陷。因此，很大一部分 TLE 患者需要新穎的治療途徑來治療耐藥性 TLE。本文所述之組成物及方法提供治療導致 TLE 形成及進展的潛在分子病理生理學的益處。
本文所述之組成物為編碼抑制性 RNA 構建體 (例如，ASO 劑或編碼其的核酸載體) 的多核苷酸，其靶向 Grik2mRNA (例如，SEQ ID NO: 115 至 125 中之任一者)，可根據本文所述之方法投予以治療 TLE。本文所述之方法及組成物可用於治療患有任何類型的 TLE 的 TLE 患者，諸如伴有局灶性癲癇發作的 TLE、伴有全身性癲癇發作的 TLE、mTLE 或 lTLE。此外，本文所揭示之方法及組成物可用於治療由任何病因 (諸如內側顳葉硬化、外傷性腦損傷、腦感染 (例如腦炎及腦膜炎)、缺氧性腦損傷、中風、腦腫瘤、遺傳症候群或熱性驚厥) 引起的 TLE。本文所述之組成物及方法亦可作為預防性治療向具有形成 TLE 的風險的個體 (例如，處於 TLE 進展潛伏期的個體) 投予。
根據本文所揭示之方法及組成物，ASO 可藉由引起細胞 (例如，神經元，諸如海馬迴神經元，諸如齒狀腦回的海馬迴神經元，諸如齒狀顆粒細胞 (DGC)) 中 Grik2mRNA 降解來抑制 Grik2mRNA 之表現，從而阻止該 mRNA 轉譯成功能性 GluK2 蛋白。
本文所揭示之靶向 Grik2mRNA 的 ASO 劑可用於降低一個或多個大腦區域中癲癇性大腦活動 (例如，癲癇狀放電) 的發生頻率或完全抑制其發生。此類大腦區域可包含但不限於內側顳葉、外側顳葉、額葉，或更具體地，海馬迴 (例如，DG、CA1、CA2、CA3、海馬下腳) 或新皮質。由於 DG 的 rMF-DGC 中含有 GluK2 的 KAR 的異常表現，DG 中癲癇腦活動的發生可能受到抑制。
因此，本揭露提供用於減少 CNS 細胞 (例如，DGC) 中癲癇狀放電的方法及組成物，其藉由使細胞與有效量的與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性的 ASO或編碼其的核酸載體接觸來實現。
本揭露之 ASO 劑可以為 GluK2 抑制劑。特定而言，GluK2 抑制劑可以為 Grik2mRNA 表現抑制劑。抑制 GluK2 的表現亦可抑制 GluK5 的水平 (Ruiz 等人，J Neuroscience 2005)。儘管不希望受任何特定理論之束縛，但本揭露係基於單獨充分去除 GluK2 應當能夠去除所有 GluK2/GluK5 異聚體的原則，因為單獨 GluK5 次單元不能形成同聚體組裝體。
根據所揭示之方法及組成物，本文所揭示之 ASO 劑可具有 15 至 50 個核苷酸 (例如，15、16、17、18、19、20、21、22、23、24 或 25、30、35、40、45 或最多 50 個核苷酸) 之長度。例如，本文所揭示之 ASO 劑可具有 15 個核苷酸之長度。在另一實例中，ASO 劑具有 16 個核苷酸之長度。在另一實例中，ASO 劑具有 17 個核苷酸之長度。在另一實例中，ASO 劑具有 18 個核苷酸之長度。在另一實例中，ASO 劑具有 19 個核苷酸之長度。在另一實例中，ASO 劑具有 20 個核苷酸之長度。在另一實例中，ASO 劑具有 21 個核苷酸之長度。在另一實例中，ASO 劑具有 22 個核苷酸之長度。在另一實例中，ASO 劑具有 23 個核苷酸之長度。在另一實例中，ASO 劑具有 24 個核苷酸之長度。在另一實例中，ASO 劑具有 25 個核苷酸之長度。在另一實例中，ASO 劑具有 25 至 30 個核苷酸之長度。在另一實例中，ASO 劑具有 30 至 35 個核苷酸之長度。在另一實例中，ASO 劑具有 35 至 40 個核苷酸之長度。在另一實例中，ASO 劑具有 40 至 45 個核苷酸之長度。在另一實例中，ASO 劑具有 45 至 50 個核苷酸之長度。
本揭露之 ASO 劑包含與 Grik2mRNA 之序列 (例如，SEQ ID NO: 115 至 689 中之任一者) 或其變體至少實質上互補或完全互補的序列，該互補性足以在細胞內條件下產生特異性結合。例如，本揭露設想到具有與 Grik2mRNA 的一個或多個區域的至少 7 個 (例如，至少 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22 個或更多) 連續核苷酸互補的反義序列的 ASO 劑。在一個特定實例中，ASO 劑具有與 Grik2mRNA 之一個或多個區域的 7 個連續核苷酸互補的反義序列。在另一實例中，ASO 劑具有與 Grik2mRNA 之一個或多個區域的 8 個連續核苷酸互補的反義序列。在另一實例中，ASO 劑具有與 Grik2mRNA 之一個或多個區域的 9 個連續核苷酸互補的反義序列。在另一實例中，ASO 劑具有與 Grik2mRNA 之一個或多個區域的 10 個連續核苷酸互補的反義序列。在另一實例中，ASO 劑具有與 Grik2mRNA 之一個或多個區域的 11 個連續核苷酸互補的反義序列。在另一實例中，ASO 劑具有與 Grik2mRNA 之一個或多個區域的 12 個連續核苷酸互補的反義序列。在另一實例中，ASO 劑具有與 Grik2mRNA 之一個或多個區域的 13 個連續核苷酸互補的反義序列。在另一實例中，ASO 劑具有與 Grik2mRNA 之一個或多個區域的 14 個連續核苷酸互補的反義序列。在另一實例中，ASO 劑具有與 Grik2mRNA 之一個或多個區域的 15 個連續核苷酸互補的反義序列。在另一實例中，ASO 劑具有與 Grik2mRNA 之一個或多個區域的 16 個連續核苷酸互補的反義序列。在另一實例中，ASO 劑具有與 Grik2mRNA 之一個或多個區域的 17 個連續核苷酸互補的反義序列。在另一實例中，ASO 劑具有與 Grik2mRNA 之一個或多個區域的 18 個連續核苷酸互補的反義序列。在另一實例中，ASO 劑具有與 Grik2mRNA 之一個或多個區域的 19 個連續核苷酸互補的反義序列。在另一實例中，ASO 劑具有與 Grik2mRNA 之一個或多個區域的 20 個連續核苷酸互補的反義序列。在另一實例中，ASO 劑具有與 Grik2mRNA 之一個或多個區域的 21 個連續核苷酸互補的反義序列。在另一實例中，ASO 劑具有與 Grik2mRNA 之一個或多個區域的 22 個連續核苷酸互補的反義序列。在又一實例中，ASO 劑具有與 Grik2的一個或多個區域的核苷酸 100% 互補的反義序列。
本揭露設想到以下 ASO 劑，其與 Grik2mRNA 的一個或多個區域 (例如，SEQ ID NO: 115 至 681 中所述之 Grik2mRNA 的區域中之任一者) 結合時，與長度為 7 至 22 個 (例如，7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 或 22 個) 核苷酸的 Grik2mRNA 形成雙股結構。例如，ASO 劑與 Grik2mRNA 之間的雙股結構的長度可以為 7 個核苷酸。在另一實例中，ASO 劑與 Grik2mRNA 之間的雙股結構的長度可以為 8 個核苷酸。在另一實例中，ASO 劑與 Grik2mRNA 之間的雙股結構的長度可以為 9 個核苷酸。在另一實例中，ASO 劑與 Grik2mRNA 之間的雙股結構的長度可以為 10 個核苷酸。在另一實例中，ASO 劑與 Grik2mRNA 之間的雙股結構的長度可以為 11 個核苷酸。在另一實例中，ASO 劑與 Grik2mRNA 之間的雙股結構的長度可以為 12 個核苷酸。在另一實例中，ASO 劑與 Grik2mRNA 之間的雙股結構的長度可以為 13 個核苷酸。在另一實例中，ASO 劑與 Grik2mRNA 之間的雙股結構的長度可以為 14 個核苷酸。在另一實例中，ASO 劑與 Grik2mRNA 之間的雙股結構的長度可以為 15 個核苷酸。在另一實例中，ASO 劑與 Grik2mRNA 之間的雙股結構的長度可以為 16 個核苷酸。在另一實例中，ASO 劑與 Grik2mRNA 之間的雙股結構的長度可以為 17 個核苷酸。在另一實例中，ASO 劑與 Grik2mRNA 之間的雙股結構的長度可以為 18 個核苷酸。在另一實例中，ASO 劑與 Grik2mRNA 之間的雙股結構的長度可以為 19 個核苷酸。在另一實例中，ASO 劑與 Grik2mRNA 之間的雙股結構的長度可以為 20 個核苷酸。在另一實例中，ASO 劑與 Grik2mRNA 之間的雙股結構的長度可以為 21 個核苷酸。在又一實例中，ASO 劑與 Grik2mRNA 之間的雙股結構的長度可以為 10 個核苷酸。
根據所揭示之方法及組成物，由 ASO 劑 (例如，本文所揭示之 ASO 劑中之任一者，諸如 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)與 Grik2mRNA 的一個或多個區域形成的雙股結構可包含至少一個 (例如，至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 或 15 個) 錯配：例如，雙股結構可含有 1 個錯配。在另一實例中，雙股結構含有 2 個錯配。在另一實例中，雙股結構含有 3 個錯配。在另一實例中，雙股結構含有 4 個錯配。在另一實例中，雙股結構含有 5 個錯配。在另一實例中，雙股結構含有 6 個錯配。在另一實例中，雙股結構含有 7 個錯配。在另一實例中，雙股結構含有 8 個錯配。在另一實例中，雙股結構含有 9 個錯配。在另一實例中，雙股結構含有 10 個錯配。在另一實例中，雙股結構含有 11 個錯配。在另一實例中，雙股結構含有 12 個錯配。在另一實例中，雙股結構含有 13 個錯配。在另一實例中，雙股結構含有 14 個錯配。在又一實例中，雙股結構含有 15 個錯配。
因此，本揭露的一個目的涉及經分離、合成的或重組的靶向 Grik2mRNA 的 ASO 劑。本揭露之 ASO 劑可以為任何合適的類型，包含 RNA 或 DNA 寡核苷酸。因此，所揭示之方法及組成物的特徵在於作為 ASO 劑 (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA 或 shmiRNA) 的 Grik2表現抑制劑。ASO 劑，包含反義 RNA 分子及反義 DNA 分子，可藉由與其結合並阻止蛋白質轉譯或增加 mRNA 降解來直接阻斷 Grik2mRNA 之轉譯，從而降低 GluK2 蛋白之水平及活性。例如，具有至少約 19 個鹼基並與編碼 GluK2 的 mRNA 轉錄物序列的獨特區域互補的 ASO 劑可例如藉由習用技術 (例如，本文所揭示之技術) 合成，並藉由例如靜脈內注射或輸注及本文所述之其他途徑 (諸如直接注射到大腦區域) 來投予。使用反義技術特異性減輕序列已知的基因之基因表現之方法為本領域所熟知 (例如，參見美國專利第 6,566,135；6,566,131；6,365,354；6,410,323；6,107,091；6,046,321；及 5,981,732 號，其各者皆藉由引用整體併入本文)。
在一個特定實例中，本揭露之 Grik2ASO 劑可以為短干擾 RNA (siRNA)。可藉由使個體或細胞與小雙股 RNA (dsRNA) 或編碼其的載體接觸來降低 Grik2基因表現，從而導致產生能夠藉由以序列特異性方式 (例如，藉由 RNA 干擾途徑) 降解 mRNA 來特異性抑制 Grik2表現的小雙股 RNA。對於序列已知的基因，用於選擇適當的 dsRNA 或 dsRNA 編碼載體之方法為本領域已知的 (例如，參見 Tuschl, T. 等人(1999)；Elbashir, S. M. 等人(2001)；Hannon, GJ.(2002)；McManus, MT. 等人(2002)；Brummelkamp, TR. 等人(2002)；美國專利第 6,573,099 及 6,506,559 號；及國際專利公開第 WO 01/36646、WO 99/32619 及 WO 01/68836 號，其各者皆藉由引用整體併入本文)。
本揭露之 Grik2ASO 劑亦可以為短髮夾 RNA (shRNA)。shRNA 為一種形成緊密髮夾彎的 RNA 序列，可用於經由 RNA 干擾使基因表現沉默。shRNA 通常使用引入標靶細胞中的載體來表現，其中載體通常利用普存 U6 啟動子來確保 shRNA 組成性地表現。該載體通常被傳遞給子細胞，使基因沉默在細胞分裂後得以維持。shRNA 髮夾結構藉由細胞機制切割成 siRNA，其然後與 RNA 誘導的沉默複合體 (RISC) 結合。該複合體結合至並切割與其結合的 siRNA 序列相匹配的 mRNA。
此外，本揭露之 Grik2表現抑制劑可以為微小 RNA (miRNA)。miRNA 具有本領域中之一般含義並且係指例如通常長度為 21 至 22 個核苷酸 (儘管長度為 19 個且最多 23 個核苷酸已見諸報導) 的微小 RNA 分子，並且可用於抑制靶向 mRNA 的轉譯。miRNA 各自由較長之前體 RNA 分子 (「前體 miRNA」) 加工得到。前體 miRNA 由非蛋白質編碼基因轉錄得到。前體 miRNA 具有兩個互補區域，使它們能夠形成類似莖環或折回的結構，該結構在動物體內被稱為 Dicer 的核糖核酸酶 III 狀核酸酶切割。經加工之 miRNA 通常為含有「種子序列」(通常為 6 至 8 個核苷酸) 的莖的一部分，該種子序列與標靶 mRNA 的一個區域完全或實質上互補。經加工之 miRNA (亦稱為「成熟 miRNA」) 成為大復合體的一部分以下調 (例如，減少轉譯或降解 mRNA) 特定標靶基因。
此外，本揭露之 GluK2 抑制劑為 miRNA 改編的 shRNA (shmiRNA)。shmiRNA 劑係指在含有微小 RNA 側翼及環序列的微小 RNA 支架 (例如，miR-30 支架) 的 -5p 或 -3p 臂內摻入反義序列的嵌合分子。與 shRNA 相比，shmiRNA 通常具有基於微小 RNA 衍生序列的更長的莖環結構，其中 -5p 及 -3p 臂顯示出完全或實質性互補性 (例如，錯配、G:U 搖擺)。由於其較長的序列及加工要求，shmiRNA 通常由 Pol II 啟動子表現。與基於 shRNA 的藥劑相比，這些構建體亦已經表現出降低之毒性。
可採用多種 miRNA 於敲落 Grik2mRNA 表現 (並接著敲落基因產物 GluK2)。miRNA 可以與不同標靶轉錄物或單個標靶轉錄物的不同結合位點互補。亦可利用多基因或多基因轉錄物以增強標靶基因敲落的效率。編碼相同 miRNA 或不同 miRNA 的多個基因可以在單個轉錄物中一起調節，或作為單個載體匣中的單獨轉錄物進行調節。本揭露之 miRNA 可以包裝到載體諸如病毒載體中，該載體包含但不限於重組腺相關病毒 (rAAV) 載體、慢病毒載體、反轉錄病毒載體及基於反轉錄轉位子的載體系統。
與 Grik2mRNA 之有義標靶序列互補 (舉例而言，基本上或完全互補) 的 ASO 通常由用於產生任何前述抑製劑 (舉例而言，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 之 DNA 序列編碼。編碼目標雙股 RNA 之 DNA 可以併入基因盒 (舉例而言，其中 DNA 之轉錄受啟動子控制的表現匣)。 反義寡核苷酸序列
根據本揭露之方法及組成物，本文揭示之抑制性 RNA 藥劑可以包括表 2 中揭示之 ASO 藥劑中的任何一個或多個 (舉例而言，SEQ ID NO: 1 至 100) 或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任何一個的相應核酸序列具有至少85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如下文所示。ASO 藥劑可以結合至下表 4 中描述之 Grik2mRNA之相應標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中的任何一個或其變體，該變體與下表 4 中描述之相應標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中的任何一個具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。 表 2 ：靶向 Grik2mRNA 之反義寡核苷酸序列
ID 導引序列 (ASO) SEQ ID NO 人類 Grik2 mRNA 中編碼標靶序列之 cDNA 序列 SEQ ID NO 標靶序列核苷酸位置 ( Grik2mRNA) Grik2 區 % KD
G0 AAGGGUAGUAUUGGGUAGCAA 1 TTGCTACCCAATACTACCCTT 582 208-228 (SEQ ID NO: 116) 501-521 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 2 質心環 1 83%
TV AGGCCCGAAGAUGGCAGCCAC 2 GTGGCTGCCATCTTCGGGCCT 583 307-327 (SEQ ID NO: 116) 600-620 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 3 0%
TU AGCAUUGCAGAUGGACUGCAC 3 GTGCAGTCCATCTGCAATGCT 584 352-372 (SEQ ID NO: 116) 645-665 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 3 72%
TT UGUUAACACCACUGUAUCGGU 4 ACCGATACAGTGGTGTTAACA 585 806-826 (SEQ ID NO: 116) 1099-1119 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 6 質心環 2 83%
G1 AAUCGGGUUUCGGAGGUGCCU 5 AGGCACCTCCGAAACCCGATT 586 905-925 (SEQ ID NO: 116) 1198-1218 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 6 質心環 3 64%
G2 AUCGGGUUUCGGAGGUGCCUG 6 CAGGCACCTCCGAAACCCGAT 587 904-924 (SEQ ID NO: 116 1197-1217 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 6 質心環 3 52%
GD UGUAGAUAACUCUCUGAGGAG 7 CTCCTCAGAGAGTTATCTACA 588 1396-1416 (SEQ ID NO: 116) 1689-1709 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 10 質心環 5 72%
G3 UUAGUUCACGAACCAUUCCAU 8 ATGGAATGGTTCGTGAACTAA 589 1496-1516 (SEQ ID NO: 116) 1789-1809 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 10 質心環 6 59%
G4 AAUAACUGGGGCCUGUGGCUU 9 AAGCCACAGGCCCCAGTTATT 590 2632-2652 (SEQ ID NO: 116) 2925-2945 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 16 質心環 8 52%
TS UUAGUGACACUUUUAUUGGUU 10 AACCAATAAAAGTGTCACTAA 591 3382-3402 (SEQ ID NO: 115) 3' UTR 質心環 11 外顯子 16 26%
TR UUAUUAUUUGGGAUAUGGGGG 11 CCCCCATATCCCAAATAATAA 592 3792-3812 (SEQ ID NO: 115) 3' UTR 質心環 12 外顯子 16 71%
TQ GAUGUUCGCUGGCUUUCCCUU 12 AAGGGAAAGCCAGCGAACATC 593 1252-1272 (SEQ ID NO: 116) 1545-1565 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 9 61%
TP uGUUCCACUGUCAGAAAGGCG 13 CGCCTTTCTGACAGTGGAAC 594 1968-1987 (SEQ ID NO: 116) 2213-2233 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 13 質心未配對區域 1 82%
TO CGUUCCACUGUCAGAAAGGCG 14 CGCCTTTCTGACAGTGGAACG 595 1968-1988 (SEQ ID NO: 116) 2213-2233 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 13 質心未配對區域 1 86%
G5 UGAUAUUCCAUCUCCUGGCAA 15 TTGCCAGGAGATGGAATATCA 596 3347-3367 (SEQ ID NO: 115) 3' UTR 質心未配對區域 3 外顯子 16 89%
TN AUAAGUGAUGAACAUCUGCUU 16 AAGCAGATGTTCATCACTTAT 597 3605-3625 (SEQ ID NO: 115) 3' UTR 質心未配對區域 4 外顯子 16 73%
TM UAUUUCCUUGAUAAUUGGCAU 17 ATGCCAATTATCAAGGAAATA 598 3686-3706 (SEQ ID NO: 115) 3' UTR 78%
G6 uAUCCUCAAUUCUUCUACCAU 18 ATGGTAGAAGAATTGAGGAT 599 2581-2601 (SEQ ID NO: 116) 2874-2893 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 16 76%
G7 CAUCCUCAAUUCUUCUACCAU 19 ATGGTAGAAGAATTGAGGATG 600 2581-2601 (SEQ ID NO: 116) 2874-2893 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 16 31%
TL UGUCGAUUACACUGCAAGGAA 20 TTCCTTGCAGTGTAATCGACA 601 1029-1049 (SEQ ID NO: 116) 1322-1342 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 7 85%
TJ GAUGCGUCGAGUGGUGACCGC 21 GCGGTCACCACTCGACGCATC 602 197-217 (SEQ ID NO: 115) 5' UTR 外顯子 1 63%
TH CUCGAACAUAGGUAAUAGCCA 22 TGGCTATTACCTATGTTCGAG 603 1550-1570 (SEQ ID NO: 116) 1843-1863 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 11 70%
TG GGUUCGGGUAGAAAUGAGGAU 23 ATCCTCATTTCTACCCGAACC 604 215-235 (SEQ ID NO: 115) 5' UTR 外顯子 1 14%
TF uUAGCGUUCGGCUCCUGGGUU 24 AACCCAGGAGCCGAACGCTA 605 232-251 (SEQ ID NO: 115) 5' UTR 外顯子 1 49%
TE CUAGCGUUCGGCUCCUGGGUU 25 AACCCAGGAGCCGAACGCTAG 606 232-252 (SEQ ID NO: 115) 5' UTR 外顯子 1 52%
TD GUUCGGCUCCUGGGUUCGGGU 26 ACCCGAACCCAGGAGCCGAAC 607 227-247 (SEQ ID NO: 115) 5' UTR 外顯子 1 0%
GJ AACGUUGGUGGUGCACACGCA 27 TGCGTGTGCACCACCAACGTT 608 4289-4309 (SEQ ID NO: 115) 3' UTR 外顯子 16 45%
TC uGGUGCGCCUGAAGACUGGAU 28 ATCCAGTCTTCAGGCGCACCA 609 29-48 (SEQ ID NO: 116) 322-341 (SEQ ID NO: 115)   外顯子 1 訊息肽 3%
CK  CGGUGCGCCUGAAGACUGGAU 29 ATCCAGTCTTCAGGCGCACCG 610 29-49 (SEQ ID NO: 116) 322-342 (SEQ ID NO: 115)    外顯子 1 訊息肽 6%
CL uAGCGGGUCUGUAUGUGGGGA 30 TCCCCACATACAGACCCGCT 611 381-400 (SEQ ID NO: 116) 674-693 (SEQ ID NO: 115)    外顯子 3 69%
CM CAGCGGGUCUGUAUGUGGGGA 31 TCCCCACATACAGACCCGCTG 612 381-401 (SEQ ID NO: 116) 674-694 (SEQ ID NO: 115)    外顯子 3 54%
CN uACGCACUACCAUUCAUGCUU 32 AAGCATGAATGGTAGTGCGT 613 4274-4293 (SEQ ID NO: 115) 3' UTR 外顯子 16 34%
CO CACGCACUACCAUUCAUGCUU 33 AAGCATGAATGGTAGTGCGTG 614 4274-4294 (SEQ ID NO: 115) 3' UTR 外顯子 16 0%
CP uUCGAUGGUUGUUGACUCCAU 34 ATGGAGTCAACAACCATCGA 615 2209-2228 (SEQ ID NO: 116) 2502-2521 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 14 66%
CQ CUCGAUGGUUGUUGACUCCAU 35 ATGGAGTCAACAACCATCGAG 616 2209-2229 (SEQ ID NO: 116) 2502-2522 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 14 61%
CR AGCGGGUCUGUAUGUGGGGAA 36 TTCCCCACATACAGACCCGCT 617 380-400 (SEQ ID NO: 116) 673-693 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 3 33%
CS UUGAACGGCCACAGACACCAC 37 GTGGTGTCTGTGGCCGTTCAA 618 985-1005 (SEQ ID NO: 116) 1278-1298 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 7 0%
CT AAAGCGGGUCCCGAAGCGCCA 38 TGGCGCTTCGGGACCCGCTTT 619 1057-1077 (SEQ ID NO: 116) 1350-1370 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 7 2%
CU AGACGCCUGGGUUUGUACCAU 39 ATGGTACAAACCCAGGCGTCT 620 1637-1657 (SEQ ID NO: 116) 1930-1950 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 11 42%
CV AAACGAAUGAGACCAGUGCUG 40 CAGCACTGGTCTCATTCGTTT 621 534-554 (SEQ ID NO: 116) 827-847 (SEQ ID NO: 115)  與外顯子 3 及外顯子 4 重疊 43%
CW AUAAACGCAGUCCACUUCCAA 41 TTGGAAGTGGACTGCGTTTAT 622 4078-4098 (SEQ ID NO: 115) 3' UTR 外顯子 16 80%
CX GACCGCAGACACGAUCACGGC 42 GCCGTGATCGTGTCTGCGGTC 623 182-202 (SEQ ID NO: 115) 5' UTR 外顯子 1 65%
CY UUCGGCUCCUGGGUUCGGGUA 43 TACCCGAACCCAGGAGCCGAA 624 226-246 (SEQ ID NO: 115) 5' UTR 外顯子 1 59%
CZ UAAAGCGGGUCCCGAAGCGCC 44 GGCGCTTCGGGACCCGCTTTA 625 1058-1078 (SEQ ID NO: 116) 1351-1371 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 7 47%
D0 uACGGCACCCACUUCCCCGAU 45 ATCGGGGAAGTGGGTGCCGT 626 253-272 (SEQ ID NO: 115) 5' UTR 外顯子 1 28%
D1 CACGGCACCCACUUCCCCGAU 46 ATCGGGGAAGTGGGTGCCGTG 627 253-273 (SEQ ID NO: 115) 5' UTR 外顯子 1 29%
D2 AGCGCCAGGGUUUAUGUCGAU 47 ATCGACATAAACCCTGGCGCT 628 1043-1063 (SEQ ID NO: 116) 1336-1356 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 7 50%
D3 GUCUCCGCUUCCCAAACCCAU 48 ATGGGTTTGGGAAGCGGAGAC 629 139-159 (SEQ ID NO: 115) 5' UTR 外顯子 1 28%
XS GACGACAGUUUGUGCUUGGGU 49 ACCCAAGCACAAACTGTCGTC 630 3037-3057 (SEQ ID NO: 115) 3' UTR 外顯子 16 51%
XT AGCCUCGUGGAAACCAGGGGU 50 ACCCCTGGTTTCCACGAGGCT 631 4417-4437 (SEQ ID NO: 115) 3' UTR 外顯子 16 57%
XU UGUCUCGAUAUGGAGAACCCA 51 TGGGTTCTCCATATCGAGACA 632 2309-2329 (SEQ ID NO: 116) 2602-2622 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 15 68%
XV uGACGCUGGCACUUCAGGGAC 52 GTCCCTGAAGTGCCAGCGTCA 633 2601-2620 (SEQ ID NO: 116) 2894-2913 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 16 CDS 之 3' 末端 0%
XW CGACGCUGGCACUUCAGGGAC 53 GTCCCTGAAGTGCCAGCGTCG 634 2601-2621 (SEQ ID NO: 116) 2894-2914 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 16 CDS 之 3' 末端 9%
XZ AGACACGAUCACGGCAUGGUC 54 GACCATGCCGTGATCGTGTCT 635 176-196 (SEQ ID NO: 115) 5' UTR 外顯子 1 12%
Y0 UUCCCCGAUCUAGCGUUCGGC 55 GCCGAACGCTAGATCGGGGAA 636 241-261 (SEQ ID NO: 115) 5' UTR 外顯子 1 6.84%
Y1 UGCAAUCGUUCCAUCGACCAC 56 GTGGTCGATGGAACGATTGCA 637 885-905 (SEQ ID NO: 116) 1178-1198 (SEQ ID NO: 115)  外顯子 6 40%
Y2 uUGAAUCGGGUUUCGGAGGUG 57 CACCTCCGAAACCCGATTCA 638 908-927 (SEQ ID NO: 116) 1201-1220 (SEQ ID NO: 115)  外顯子 6 39%
Y3 CUGAAUCGGGUUUCGGAGGUG 58 CACCTCCGAAACCCGATTCAG 639 908-928 (SEQ ID NO: 116) 1201-1221 (SEQ ID NO: 115)  外顯子 6 22%
Y4 AAGGCCCGAAGAUGGCAGCCA 59 TGGCTGCCATCTTCGGGCCTT 640 308-328 (SEQ ID NO: 116) 601-621 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 3 0%
Y5 UUGAGUCGAAGAUUAUACCUU 60 AAGGTATAATCTTCGACTCAA 641 579-599 (SEQ ID NO: 116) 872-892 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 4 81%
Y6 GGCUAGUAACAUCAUCACCUC 61 GAGGTGATGATGTTACTAGCC 642 3479-3499 (SEQ ID NO: 115) 3' UTR 外顯子 16 41%
Y7 AGAUAUCAGGGGAGAGAGGAU 62 ATCCTCTCTCCCCTGATATCT 643 1670-1690 (SEQ ID NO: 116) 1963-1983 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 11 50%
YA GGUUGCAUAUUUCCACAGGAA 63 TTCCTGTGGAAATATGCAACC 644 3085-3105 (SEQ ID NO: 115) 3' UTR 外顯子 16 質心環 9 67%
GF UGCGUCGAGUGGUGACCGCAG 64 CTGCGGTCACCACTCGACGCA 645 195-215 (SEQ ID NO: 115) 5' UTR 外顯子 1 63%
GE UUAGUCGGAGAGCAUCCGGGA 65 TCCCGGATGCTCTCCGACTAA 646 42-62 (SEQ ID NO: 115) 5' UTR 外顯子 1 76%
GH AUGCGUCGAGUGGUGACCGCA 66 TGCGGTCACCACTCGACGCAT 647 196-216 (SEQ ID NO: 115) 5' UTR 外顯子 1 21%
YB uAUCCGGGAGAAAUCCAGCAC 67 GTGCTGGATTTCTCCCGGAT 648 30-49 (SEQ ID NO: 115) 5' UTR 外顯子 1 56%
G9 CCCAUAGCUAAUGCCUGUUUU 68 AAAACAGGCATTAGCTATGGG 649 717-737 (SEQ ID NO: 116) 1010-1030 (SEQ ID NO: 115) 與外顯子 4 及外顯子 5 重疊 77%
ME uUGUCAUCAUUCCCAUAGCUA 69 TAGCTATGGGAATGATGACAA 650 728-747 (SEQ ID NO: 116) 1021-1040 (SEQ ID NO: 115)  外顯子 5 77%
MD CAUUCCCAUAGCUAAUGCCUG 70 CAGGCATTAGCTATGGGAATG 651 721-741 (SEQ ID NO: 116) 1014-1034 (SEQ ID NO: 115) 與外顯子 4 及外顯子 5 重疊 0%
GB CCCAUAGCUAAUGCCUGCUUU 71 AAAGCAGGCATTAGCTATGG 652 (小鼠)   0%
MR AAACCACCAAAUGCCUCCCAC 72 GTGGGAGGCATTTGGTGGTTT 653 1906-1926 (SEQ ID NO: 116) 2199-2219 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 13 質心未配對區域 1 39%
MQ AUGAUAAGUGUGAAAAACCAC 73 GTGGTTTTTCACACTTATCAT 654 1920-1940 (SEQ ID NO: 116) 2213-2233 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 13 質心未配對區域 1 59%
TK AGUCGAUGACCUUCUCUCGAA 74 TTCGAGAGAAGGTCATCGACT 655 1565-1585 (SEQ ID NO: 116) 1858-1878 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 11 85%
TI uUCGAACAUAGGUAAUAGCCA 75 TGGCTATTACCTATGTTCGA 656 1550-1569 (SEQ ID NO: 116) 1843-1862 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 11 80%
MP GACACCUGGUGCUUCCAGCGG 76 CCGCTGGAAGCACCAGGTGTC 657 396-416 (SEQ ID NO: 116) 689-709 (SEQ ID NO: 115)    外顯子 3 14%
GI GUCUCGAUAUGGAGAACCCAU 77 ATGGGTTCTCCATATCGAGAC 658 2308-2328 (SEQ ID NO: 116) 2601-2621 (SEQ ID NO: 115) 與外顯子 14 及 15 重疊 83%
MO uGAUAUGGAGAACCCAUGGGA 78 TCCCATGGGTTCTCCATATCA 659 2304-2323 (SEQ ID NO: 116) 2597-2616 (SEQ ID NO: 115) 與外顯子 14 及 15 重疊 43%
MN GAUAUGGAGAACCCAUGGGAG 79 CTCCCATGGGTTCTCCATATC 660 2303-2323 (SEQ ID NO: 116) 2596-2616 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 14 51%
MW CAGAGCAUUGCAGAUGGACUG 80 CAGTCCATCTGCAATGCTCTG 661 355-375 (SEQ ID NO: 116) 648-668 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 3 79%
MV CCCAGAGCAUUGCAGAUGGAC 81 GTCCATCTGCAATGCTCTGGG 662 357-377 (SEQ ID NO: 116) 650-670 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 3 31%
XX uACCACGUCUGAGUCAGGGUU 82 AACCCTGACTCAGACGTGGT 663 1786-1805 (SEQ ID NO: 116) 2079-2098 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 12 67%
XY CACCACGUCUGAGUCAGGGUU 83 AACCCTGACTCAGACGTGGTG 664 1786-1806 (SEQ ID NO: 116) 2079-2099 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 12 67%
MM uUGAGUCAGGGUUGCAAGGGU 84 ACCCTTGCAACCCTGACTCAG 665 1778-1797 (SEQ ID NO: 116) 2071-2090 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 12 62%
ML AGAGCUCCAACUCCAAACCAG 85 CTGGTTTGGAGTTGGAGCTCT 666 1836-1856 (SEQ ID NO: 116) 2129-2149 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 12 80%
MK UGAUGGAGCUUUGAUGAGCUC 86 GAGCTCATCAAAGCTCCATCA 667 559-579 (SEQ ID NO: 116) 852-872 (SEQ ID NO: 115)  外顯子 4 26%
Y8 uAUAGGUAAUAGCCAGUGGAG 87 CTCCACTGGCTATTACCTAT 668 1544-1563 (SEQ ID NO: 116) 1837-1856 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 11 80%
Y9 CAUAGGUAAUAGCCAGUGGAG 88 CTCCACTGGCTATTACCTATG 669 1544-1564 (SEQ ID NO: 116) 1837-1857 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 11 87%
MJ GAGCAACUGCAAGGUCAGCUU 89 AAGCTGACCTTGCAGTTGCTC 670 1526-1546 (SEQ ID NO: 116) 外顯子 11 26%
MI AGGUAAUAGCCAGUGGAGCAA 90 TTGCTCCACTGGCTATTACCT 671 1541-1561 (SEQ ID NO: 116) 1834-1854 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 11 55%
GG AGUCGUCAUAAAUCCAUCCAG 91 CTGGATGGATTTATGACGACT 672 934-954 (SEQ ID NO: 116) 1227-1247 (SEQ ID NO: 115)  外顯子 6 67%
G8 ACUGACAUAGAAGGAAUCUUU 92 AAAGATTCCTTCTATGTCAGT 673 424-444 (SEQ ID NO: 116) 717-737 (SEQ ID NO: 115)    外顯子 3 66%
MF UAGAGACUGACAUAGAAGGAA 93 TTCCTTCTATGTCAGTCTCTA 674 429-449 (SEQ ID NO: 116) 722-742 (SEQ ID NO: 115)  外顯子 3 69%
MH uGUCAUAAAUCCAUCCAGCAA 94 TTGCTGGATGGATTTATGACA 675 931-950 (SEQ ID NO: 116) 1224-1243 (SEQ ID NO: 115)  外顯子 6 74%
MG uAUCAGUCGUCAUAAAUCCAU 95 ATGGATTTATGACGACTGATA 676 938-957 (SEQ ID NO: 116) 1231-1250 (SEQ ID NO: 115)  外顯子 6 71%
MU UUCAUAUGUAAAGCCAAGGAU 96 ATCCTTGGCTTTACATATGAA 677 1417-1437 (SEQ ID NO: 116) 1710-1730 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 10 質心環 5 82%
GA ACUGACAUAGAAGGAAUCCUU 97 AAGGATTCCTTCTATGTCAGT 678 (小鼠) 3' UTR 28%
MT AAUGGACAAUGGAAUGGAAUG 98 CATTCCATTCCATTGTCCATT 679 1483-1503 (SEQ ID NO: 116) 1776-1796 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 10 質心環 6 4%
MS AUGGAAUGGAAUGGUUCGUGA 99 TCACGAACCATTCCATTCCAT 680 1491-1511 (SEQ ID NO: 116) 1784-1804 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 10 質心環 6 0%
ZZ UAGUCGGAGAGCAUCCGGGAG 100 CTCCCGGATGCTCTCCGACTA 681 41-61 (SEQ ID NO: 115) 5' UTR 外顯子 1 N/A
註： % KD 值對應於在雙熒光素酶報導子測定中藉由鑒別的 ASO 藥劑實現的 GluK2 蛋白質敲落百分比，如實例 1A 中詳細描述。
前述序列表示為可以併入本揭露之載體中的 DNA (即，cDNA) 序列；然而，這些序列亦可以表示為從細胞內的載體合成的相應 RNA 序列。熟習此項技術者將理解，cDNA 序列等同於 mRNA 序列，除了尿苷被胸苷取代，並可以在本文中用於相同目的，即，產生用於抑製 Grik2mRNA 之表現的反義寡核苷酸。在 DNA 載體 (舉例而言 AAV) 之情況下，含有反義核酸之多核苷酸為 DNA 序列。在 RNA 載體之情況下，轉基因盒併入了本文所描述之反義 DNA 序列的 RNA 等效物。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 1 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 1 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 1 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 1 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 2 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 2 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 2 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 2 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 2 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性3.舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 3 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 3 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 3 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 4 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 4 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 4 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 4 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 5 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 5 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 5 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 5 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 6 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 6 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 6 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 6 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 7 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 7 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 7 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 7 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 8 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 8 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 8 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 8 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 9 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 9 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 9 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 9 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 10 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 10 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 10 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 10 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 11 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 11 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 11 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 11 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 12 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 12 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 12 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 12 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 13 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 13 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 13 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 13 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 14 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 14 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 14 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 14 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 15 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 15 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 15 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 15 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 16 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 16 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 16 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 16 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 17 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 17 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 17 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 17 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 18 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 18 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 18 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 18 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 19 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 19 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 19 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 19 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 20 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 20 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 20 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 20 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 21 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 7 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 21 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 21 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 22 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 22 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 22 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 22 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 23 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 23 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 23 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 23 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 24 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 24 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 24 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 24 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 25 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 25 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 25 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 25 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 26 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 26 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 26 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 26 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 27 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 27 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 27 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 27 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 28 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 28 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 28 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 28 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 29 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 29 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 29 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 29 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 30 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性.舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 7 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 7 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 30 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 31 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 31 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 31 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 31 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 32 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 32 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 32 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 32 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 33 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 33 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 33 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 33 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 34 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 34 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 34 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 34 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 35 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 35 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 35 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 35 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 36 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 36 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 36 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 36 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 37 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 37 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 37 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 37 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 38 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 38 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 38 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 38 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 39 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 39 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 39 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 39 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 40 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 40 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 40 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 40 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 41 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 41 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 41 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 41 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 42 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 42 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 42 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 42 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 43 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 43 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 43 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 43 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 44 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 7 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 44 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 44 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 45 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 45 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 45 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 45 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 46 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 46 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 46 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 46 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 47 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 47 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 47 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 47 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 48 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 48 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 48 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 48 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 49 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 49 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 49 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 49 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 50 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 50 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 50 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 50 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 51 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 51 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 51 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 51 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 52 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 52 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 52 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 52 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 53 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 53 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 53 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 53 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 54 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 54 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 54 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 54 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 55 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 55 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 55 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 55 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 56 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 56 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 56 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 56 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 57 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 57 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 57 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 57 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 58 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 58 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 58 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 58 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 59 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 59 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 59 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 59 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 60 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 60 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 60 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 60 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 61 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 61 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 61 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 61 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 62 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 62 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 62 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 62 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 63 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 63 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 63 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 63 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 64 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 64 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 64 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 64 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 65 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 65 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 65 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 65 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 66 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 66 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 66 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 66 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 67 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 67 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 67 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 67 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 68 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 68 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 68 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 68 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 69 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 69 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 69 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 69 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 70 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 70 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 70 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 70 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 71 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 71 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 71 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 71 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 72 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 72 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 72 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 72 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 73 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 73 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 73 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 73 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 74 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 74 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 74 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 74 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 75 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 75 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 75 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 75 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 76 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 76 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 76 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 76 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 77 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 77 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 77 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 77 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 78 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 78 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 78 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 78 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 79 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 79 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 79 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 79 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 80 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 80 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 80 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 80 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 81 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 81 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 81 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 81 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 82 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 82 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 82 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 82 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 83 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 83 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 83 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 83 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 84 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 84 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 84 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 84 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 85 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 85 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 85 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 85 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 86 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 86 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 86 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 86 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 87 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 87 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 87 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 87 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 88 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 88 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 88 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 88 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 89 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 89 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 89 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 89 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 90 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 90 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 90 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 90 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 91 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 91 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 91 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 91 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 92 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 92 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 92 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 92 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 93 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 93 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 93 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 93 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 94 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 94 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 94 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 94 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 95 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 95 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 95 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 95 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 96 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 96 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 96 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 96 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 97 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 97 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 97 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 97 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 98 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 98 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 98 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 98 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 99 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 99 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 99 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 99 之核酸序列。
本揭露之 ASO 序列可以與 SEQ ID NO: 100 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。舉例而言，ASO 可以與 SEQ ID NO: 100 之核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可以與 SEQ ID NO: 100 之核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，ASO 可具有 SEQ ID NO: 100 之核酸序列。 具有搖擺鹼基對之反義寡核苷酸
本揭露的進一步特徵在於具有一個或多個搖擺鹼基對之 ASO 藥劑。四個主要的搖擺鹼基對為鳥嘌呤-尿嘧啶 (G-U)、次黃嘌呤-尿嘧啶 (I-U)、次黃嘌呤-腺嘌呤 (I-A) 及次黃嘌呤-胞嘧啶 (I-C)，其中次黃嘌呤代表核苷肌苷。G-U 搖擺鹼基對已證明展現對 G-C、A-T 及 A-U 之相似的熱力學穩定性 (Saxena 等人, 2003, J Biol Chem, 278(45):44312-9)。
因此，本揭露提供了一種 ASO 藥劑，其核苷酸序列與 SEQ ID NO: 115 或 SEQ ID NO: 116 之標靶區之互補序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性115 或 SEQ ID NO: (舉例而言，ASO 可能與 Grik2基因序列之反義股具有至少 85% 序列同一性)。特定而言，本揭露之 ASO 藥劑可以具有 1、2 或 3 個核苷酸，其不與相應比對的人類 Grik2mRNA 轉錄物 (舉例而言，SEQ ID NO: 115 或 SEQ ID NO: 116) 互補。因此，本揭露之 ASO 藥劑可以具有與 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之標靶區之互補序列至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多)、至少 86% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多)、至少 87% (舉例而言，至少 87%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多)、至少 88% (舉例而言，至少 88%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多)、至少 89% (舉例而言，至少 89%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 或至少 90% (舉例而言，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 相同的核苷酸序列。與比對的 Grik2mRNA 序列之互補序列並非 100% 相同的核苷酸可為搖擺核苷酸。
如本文中之表 2 所示，相對於表 2 中列出之其他人類 ASO 藥劑，在 5'-末端具有小寫字母 「u」 之 ASO 藥劑具有少一個的與人類 Grik2mRNA 之互補序列相同的核苷酸。在 5'-末端包括 『u』 (產生 G:U 搖擺鹼基對) 以改進 RISC 加載 (siSPOTR 軟體，Boudreau, R.L. 等人, Nucleic Acid Res2013, 41(1):e9)。
由針對 Grik2轉錄物上特定區設計的反義 RNA 介導的脫靶效應的概率可以使用任何數量的公開可用算法來測量。舉例而言，可以使用線上工具 siSPOTR (「siRNA Sequence Probability-of-Off-Targeting Reduction」，其可在 world-wide-web.sispotr.icts.uiowa.edu/sispotr/index.html_ 獲得)。
某些 Grik2反義序列被判定為 「特異性」 siSPOTR 導引序列 (基於脫靶預測程式 siSPOTR)，並為反義 RNA，其已被預測可以避免或減少人類基因體中之脫靶序列特異性基因抑制，同時保持轉錄物 (包括 SEQ ID NO: 115 或 SEQ ID NO: 116) 之序列特異性抑制(參見表 3)。
某些 Grik2反義 RNA 被判定為 「共有」 siSPOTR 序列 (基於脫靶預測程式 siSPOTR)，並為反義 RNA，其已被預測可以避免或減少人類基因體中之脫靶序列特異性基因抑制並在人類、猴子及小鼠 Grik2mRNA 序列之間具有顯著的共有同源性，並預期維持對轉錄物 (包括 SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116 (還有 SEQ ID NO: 117 至 125)) 之序列特異性。
表 3 ：siSPOTR 預測之 Grik2mRNA 反義序列
ID 預測之導引 RNA (5'-3') SEQ ID NO 編碼標靶人類 Grik2mRNA 序列 (5'-3') 之 cDNA SEQ ID NO 標靶序列核苷酸位置 Grik2mRNA 標靶區
TC (siSPOTR1)(特異性) uGGUGCGCCUGAAGACUGGAU 28 ATCCAGTCTTCAGGCGCACCA 609 29-48 (SEQ ID NO: 116) 322-341 (SEQ ID NO: 115)    外顯子 1， 訊息肽
CR (siSPOTR2)(特異性) AGCGGGUCUGUAUGUGGGGAA 36 TTCCCCACATACAGACCCGCT 617 380-400 (SEQ ID NO: 116) 673-693 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 3
G1 (siSPOTR3)(特異性) AAUCGGGUUUCGGAGGUGCCU 5 AGGCACCTCCGAAACCCGATT 586 905-925 (SEQ ID NO: 116) 1198-1218 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 6，質心環 3
GG (siSPOTR4)(共有及特異性) AGUCGUCAUAAAUCCAUCCAG 91 CTGGATGGATTTATGACGACT 673 934-954 (SEQ ID NO: 116) 1227-1247 (SEQ ID NO: 115) 與外顯子 6 及外顯子 7 重疊
TL (siSPOTR5)(特異性) UGUCGAUUACACUGCAAGGAA 20 TTCCTTGCAGTGTAATCGACA 601 1029-1049 (SEQ ID NO: 116) 1322-1342 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 7
Y8 (siSPOTR6)(共有) uAUAGGUAAUAGCCAGUGGAG 87 CTCCACTGGCTATTACCTAT 669 1544-1563 (SEQ ID NO: 116) 1837-1856 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 11
TI (siSPOTR7)(特異性) uUCGAACAUAGGUAAUAGCCA 75 TGGCTATTACCTATGTTCGA 657 1550-1569 (SEQ ID NO: 116) 1843-1862 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 11
TK (siSPOTR8)(特異性) AGUCGAUGACCUUCUCUCGAA 74 TTCGAGAGAAGGTCATCGACT 656 1565-1585 (SEQ ID NO: 116) 1878-1898 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 11
CU (siSPOTR9)(共有及特異性) AGACGCCUGGGUUUGUACCAU 39 ATGGTACAAACCCAGGCGTCT 620 1637-1657 (SEQ ID NO: 116) 1930-1950 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 11
Y7 (siSPOTR10)(共有) AGAUAUCAGGGGAGAGAGGAU 62 ATCCTCTCTCCCCTGATATCT 643 1670-1690 (SEQ ID NO: 116) 1963-1983 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 11   
XX (siSPOTR11)(共有) uACCACGUCUGAGUCAGGGUU 82 AACCCTGACTCAGACGTGGT 664 1786-1805 (SEQ ID NO: 116) 2079-2098 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 12
CP (siSPOTR12)(特異性) uUCGAUGGUUGUUGACUCCAU 34 ATGGAGTCAACAACCATCGA 615 2209-2228 (SEQ ID NO: 116) 2502-2521 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 14
GI (siSPOTR13)(共有) GUCUCGAUAUGGAGAACCCAU 77 ATGGGTTCTCCATATCGAGAC 659 2308-2328 (SEQ ID NO: 116) 2601-2621 (SEQ ID NO: 115) 與外顯子 13 及外顯子 14 重疊
XU (siSPOTR14)(共有) UGUCUCGAUAUGGAGAACCCA 51 TGGGTTCTCCATATCGAGACA 632 2309-2329 (SEQ ID NO: 116) 2602-2622 (SEQ ID NO: 115) 外顯子 15
YB (siSPOTR15)(特異性) uAUCCGGGAGAAAUCCAGCAC 67 GTGCTGGATTTCTCCCGGAT 648 30-49 (SEQ ID NO: 115) 5' UTR 外顯子 1
ZZ (siSPOTR16)(特異性) UAGUCGGAGAGCAUCCGGGAG 100 CTCCCGGATGCTCTCCGACTA 682 41-61 (SEQ ID NO: 115) 5' UTR 外顯子 1
GE (siSPOTR17)(特異性) UUAGUCGGAGAGCAUCCGGGA 65 TCCCGGATGCTCTCCGACTAA 646 42-62 (SEQ ID NO: 115) 5' UTR 外顯子 1
D3 (siSPOTR18)(共有) GUCUCCGCUUCCCAAACCCAU 48 ATGGGTTTGGGAAGCGGAGAC 636 139-159 (SEQ ID NO: 115) 5' UTR 外顯子 1
CX (siSPOTR19)(特異性) GACCGCAGACACGAUCACGGC 42 GCCGTGATCGTGTCTGCGGTC 630 182-202 (SEQ ID NO: 115) 5' UTR 外顯子 1
GF (siSPOTR20)(特異性) UGCGUCGAGUGGUGACCGCAG 64 CTGCGGTCACCACTCGACGCA 652 195-215 (SEQ ID NO: 115) 5' UTR 外顯子 1
GH (siSPOTR21)(特異性) AUGCGUCGAGUGGUGACCGCA 66 TGCGGTCACCACTCGACGCAT 654 196-216 (SEQ ID NO: 115) 5' UTR 外顯子 1
TJ (siSPOTR22)(特異性) GAUGCGUCGAGUGGUGACCGC 21 GCGGTCACCACTCGACGCATC 609 197-217 (SEQ ID NO: 115) 5' UTR 外顯子 1
TG (siSPOTR23)(特異性) GGUUCGGGUAGAAAUGAGGAU 23 ATCCTCATTTCTACCCGAACC 611 215-235 (SEQ ID NO: 115) 5' UTR 外顯子 1
TD (siSPOTR24)(特異性) ACCCGAACCCAGGAGCCGAAC 26 ACCCGAACCCAGGAGCCGAAC 614 227-247 (SEQ ID NO: 115) 5' UTR 外顯子 1
TF (siSPOTR25)(特異性) uUAGCGUUCGGCUCCUGGGUU 24 AACCCAGGAGCCGAACGCTA 612 232-251 (SEQ ID NO: 115) 5' UTR 外顯子 1
本文揭露之 ASO 藥劑靶向編碼 GluK2 蛋白 (舉例而言，包括 SEQ ID NO: 102 至 114 中之任何一個的 GluK2 蛋白，或至少包括 SEQ ID NO: 102 之胺基酸 1 至 509 的 GluK2 蛋白) 之 mRNA。編碼 GluK2 蛋白之 mRNA 可包括編碼多肽之多核苷酸，該多肽相對於具有 SEQ ID NO: 102-114 中之任一個之序列的多肽，含有一個或多個胺基酸取代，諸如一個或多個保守胺基酸取代 (舉例而言，1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個或更多個胺基酸取代，諸如 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個或更多個保守胺基酸取代)102-114。
本文揭露之 Grik2ASO 藥劑可藉由使用舉例而言生物資訊學工具使用 Grik2mRNA 之序列作為起點來設計。 Grik2mRNA 序列可見于 NCBI 基因 ID NO: 2898.在另一個實例中，編碼 SEQ ID NO: 102 之多核苷酸序列；編碼 SEQ ID NO: 102 之連續胺基酸 1 至 509 之多核苷酸序列；或編碼以下中之任一個之胺基酸序列的多核苷酸序列：SEQ ID NO: 102 (UniProtKB Q13002-1)、SEQ ID NO: 103 (UniProtKB Q13002-2)、SEQ ID NO: 104 (UniProtKB Q13002-3)、SEQ ID NO: 105 (UniProtKB Q13002-4)、SEQ ID NO: 106 (UniProtKB Q13002-5)、SEQ ID NO: 107 (UniProtKB Q13002-6)、SEQ ID NO: 108 (UniProtKB Q13002-7)、SEQ ID NO: 109 (NCBI 登錄號：NP_001104738.2)、SEQ ID NO: 110 (NCBI 登錄號：NP_034479.3)、SEQ ID NO: 111 (NCBI 登錄號：NP_034479.3)、SEQ ID NO: 112 (NCBI 登錄號：XP_014992481.1)、SEQ ID NO: 113 (NCBI 登錄號：XP_014992483.1) 及 SEQ ID NO: 114 (NCBI 登錄號：NP_062182.1) 可用作設計靶向編碼 GluK2 蛋白之 mRNA 的核酸的基礎。編碼 GluK2 受體之多核苷酸序列可選自 SEQ ID NO: 115-125 中之任何一個115-125。
GluK2 多肽可具有 SEQ ID NO: 102 之胺基酸序列，或可為其與 SEQ ID NO: 102 之胺基酸序列具有至少85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之變體，如下所示 (UniProt Q13002-1；GRIK2_人類麩胺酸受體離子移變型紅藻氨酸 2)： MKIIFPILSNPVFRRTVKLLLCLLWIGYSQGTTHVLRFGGIFEYVESGPMGAEELAFRFA VNTINRNRTLLPNTTLTYDTQKINLYDSFEASKKACDQLSLGVAAIFGPSHSSSANAVQS ICNALGVPHIQTRWKHQVSDNKDSFYVSLYPDFSSLSRAILDLVQFFKWKTVTVVYDDST GLIRLQELIKAPSRYNLRLKIRQLPADTKDAKPLLKEMKRGKEFHVIFDCSHEMAAGILK QALAMGMMTEYYHYIFTTLDLFALDVEPYRYSGVNMTGFRILNTENTQVSSIIEKWSMER LQAPPKPDSGLLDGFMTTDAALMYDAVHVVSVAVQQFPQMTVSSLQCNRHKPWRFGTRFM SLIKEAHWEGLTGRITFNKTNGLRTDFDLDVISLKEEGLEKIGTWDPASGLNMTESQKGK PANITDSLSNRSLIVTTILEEPYVLFKKSDKPLYGNDRFEGYCIDLLRELSTILGFTYEI RLVEDGKYGAQDDANGQWNGMVRELIDHKADLAVAPLAITYVREKVIDFSKPFMTLGISI LYRKPNGTNPGVFSFLNPLSPDIWMYILLAYLGVSCVLFVIARFSPYEWYNPHPCNPDSD VVENNFTLLNSFWFGVGALMQQGSELMPKALSTRIVGGIWWFFTLIIISSYTANLAAFLT VERMESPIDSADDLAKQTKIEYGAVEDGATMTFFKKSKISTYDKMWAFMSSRRQSVLVKS NEEGIQRVLTSDYAFLMESTTIEFVTQRNCNLTQIGGLIDSKGYGVGTPMGSPYRDKITI AILQLQEEGKLHMMKEKWWRGNGCPEEESKEASALGVQNIGGIFIVLAAGLVLSVFVAVG EFLYKSKKNAQLEKRSFCSAMVEELRMSLKCQRRLKHKPQAPVIVKTEEVINMHTFNDRR LPGKETMA (SEQ ID NO: 102)
GluK2 多肽 可具有 SEQ ID NO: 103 之胺基酸序列或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 103 之胺基酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如下所示 (UniProt Q13002-2；麩胺酸受體離子紅藻氨酸 2 之 GRIK2_HUMAN 異構體 2) ： MKIIFPILSNPVFRRTVKLLLCLLWIGYSQGTTHVLRFGGIFEYVESGPMGAEELAFRFA VNTINRNRTLLPNTTLTYDTQKINLYDSFEASKKACDQLSLGVAAIFGPSHSSSANAVQS ICNALGVPHIQTRWKHQVSDNKDSFYVSLYPDFSSLSRAILDLVQFFKWKTVTVVYDDST GLIRLQELIKAPSRYNLRLKIRQLPADTKDAKPLLKEMKRGKEFHVIFDCSHEMAAGILK QALAMGMMTEYYHYIFTTLDLFALDVEPYRYSGVNMTGFRILNTENTQVSSIIEKWSMER LQAPPKPDSGLLDGFMTTDAALMYDAVHVVSVAVQQFPQMTVSSLQCNRHKPWRFGTRFM SLIKEAHWEGLTGRITFNKTNGLRTDFDLDVISLKEEGLEKIGTWDPASGLNMTESQKGK PANITDSLSNRSLIVTTILEEPYVLFKKSDKPLYGNDRFEGYCIDLLRELSTILGFTYEI RLVEDGKYGAQDDANGQWNGMVRELIDHKADLAVAPLAITYVREKVIDFSKPFMTLGISI LYRKPNGTNPGVFSFLNPLSPDIWMYILLAYLGVSCVLFVIARFSPYEWYNPHPCNPDSD VVENNFTLLNSFWFGVGALMQQGSELMPKALSTRIVGGIWWFFTLIIISSYTANLAAFLT VERMESPIDSADDLAKQTKIEYGAVEDGATMTFFKKSKISTYDKMWAFMSSRRQSVLVKS NEEGIQRVLTSDYAFLMESTTIEFVTQRNCNLTQIGGLIDSKGYGVGTPMGSPYRDKITI AILQLQEEGKLHMMKEKWWRGNGCPEEESKEASALGVQNIGGIFIVLAAGLVLSVFVAVG EFLYKSKKNAQLEKESSIWLVPPYHPDTV (SEQ ID NO: 103)
GluK2 多肽 可具有 SEQ ID NO: 105 之胺基酸序列或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 105 之胺基酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如下所示 (UniProt Q13002-4；麩胺酸受體離子紅藻氨酸 4 之 GRIK2_HUMAN 異構體 2)： MKIIFPILSNPVFRRTVKLLLCLLWIGYSQGTTHVLRFGGIFEYVESGPMGAEELAFRFA VNTINRNRTLLPNTTLTYDTQKINLYDSFEASKKACDQLSLGVAAIFGPSHSSSANAVQS ICNALGVPHIQTRWKHQVSDNKDSFYVSLYPDFSSLSRAILDLVQFFKWKTVTVVYDDST GLIRLQELIKAPSRYNLRLKIRQLPADTKDAKPLLKEMKRGKEFHVIFDCSHEMAAGILK QALAMGMMTEYYHYIFTTLDLFALDVEPYRYSGVNMTGFRILNTENTQVSSIIEKWSMER LQAPPKPDSGLLDGFMTTDAALMYDAVHVVSVAVQQFPQMTVSSLQCNRHKPWRFGTRFM SLIKEAHWEGLTGRITFNKTNGLRTDFDLDVISLKEEGLEKIGTWDPASGLNMTESQKGK PANITDSLSNRSLIVTTILEEPYVLFKKSDKPLYGNDRFEGYCIDLLRELSTILGFTYEI RLVEDGKYGAQDDANGQWNGMVRELIDHKADLAVAPLAITYVREKVIDFSKPFMTLGISI LYRKPNGSELMPKALSTRIVGGIWWFFTLIIISSYTANLAAFLTVERMESPIDSADDLAK QTKIEYGAVEDGATMTFFKKSKISTYDKMWAFMSSRRQSVLVKSNEEGIQRVLTSDYAFL MESTTIEFVTQRNCNLTQIGGLIDSKGYGVGTPMGSPYRDKITIAILQLQEEGKLHMMKE KWWRGNGCPEEESKEASALGVQNIGGIFIVLAAGLVLSVFVAVGEFLYKSKKNAQLEKRS FCSAMVEELRMSLKCQRRLKHKPQAPVIVKTEEVINMHTFNDRRLPGKETMA (SEQ ID NO: 105)
GluK2 多肽 可具有 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 106 之胺基酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如下所示 (UniProt Q13002-5；麩胺酸受體離子紅藻氨酸 5 之 GRIK2_HUMAN 異構體 2)： MKIIFPILSNPVFRRTVKLLLCLLWIGYSQGTTHVLRFGGIFEYVESGPMGAEELAFRFA VNTINRNRTLLPNTTLTYDTQKINLYDSFEASKKACDQLSLGVAAIFGPSHSSSANAVQS ICNALGVPHIQTRWKHQVSDNKDSFYVSLYPDFSSLSRAILDLVQFFKWKTVTVVYDDST GLIRLQELIKAPSRYNLRLKIRQLPADTKDAKPLLKEMKRGKEFHVIFDCSHEMAAGILK QALAMGMMTEYYHYIFTTLDLFALDVEPYRYSGVNMTGFRILNTENTQVSSIIEKWSMER LQAPPKPDSGLLDGFMTTDAALMYDAVHVVSVAVQQFPQMTVSSLQCNRHKPWRFGTRFM SLIKEAHWEGLTGRITFNKTNGLRTDFDLDVISLKEEGLEKIGTWDPASGLNMTESQKGK PANITDSLSNRSLIVTTILEEPYVLFKKSDKPLYGNDRFEGYCIDLLRELSTILGFTYEI RLVEDGKYGAQDDANGQWNGMVRELIDHKADLAVAPLAITYVREKVIDFSKPFMTLGISI LYRKPNGTNPGVFSFLNPLSPDIWMYILLAYLGVSCVLFVIARFSPYEWYNPHPCNPDSD VVENNFTLLNSFWFGVGALMQQGSELMPKALSTRIVGGIWWFFTLIIISSYTANLAAFLT VERMESPIDSADDLAKQTKIEYGAVEDGATMTFFKKSKISTYDKMWAFMSSRRQSVLVKS NEEGIQRVLTSDYAFLMESTTIEFVTQRNCNLTQIGGLIDSKGYGVGTPMGSPYRDKITI AILQLQEEGKLHMMKEKWWRGNGCPEEESKEASALGVQNIGGIFIVLAAGLVLSVFVAVG EFLYKSKKNAQLEKRAKTKLPQDYVFLPILESVSISTVLSSSPSSSSLSSCS (SEQ ID NO: 106)
GluK2 多肽 可具有 SEQ ID NO: 107 之胺基酸序列或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 107 之胺基酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如下所示 (UniProt Q13002-6；麩胺酸受體離子紅藻氨酸 6 之 GRIK2_HUMAN 異構體 2)： MKIIFPILSNPVFRRTVKLLLCLLWIGYSQGTTHVLRFGGIFEYVESGPMGAEELAFRFA VNTINRNRTLLPNTTLTYDTQKINLYDSFEASKKACDQLSLGVAAIFGPSHSSSANAVQS ICNALGVPHIQTRWKHQVSDNKDSFYVSLYPDFSSLSRAILDLVQFFKWKTVTVVYDDST GLIRLQELIKAPSRYNLRLKIRQLPADTKDAKPLLKEMKRGKEFHVIFDCSHEMAAGILK QALAMGMMTEYYHYIFTTLDLFALDVEPYRYSGVNMTGFRILNTENTQVSSIIEKWSMER LQAPPKPDSGLLDGFMTTDAALMYDAVHVVSVAVQQFPQMTVSSLQCNRHKPWRFGTRFM SLIKEAHWEGLTGRITFNKTNGLRTDFDLDVISLKEEGLEKIGTWDPASGLNMTESQKGK PANITDSLSNRSLIVTTILEEPYVLFKKSDKPLYGNDRFEGYCIDLLRELSTILGFTYEI RLVEDGKYGAQDDANGQWNGMVRELIDHKSKISTYDKMWAFMSSRRQSVLVKSNEEGIQR VLTSDYAFLMESTTIEFVTQRNCNLTQIGGLIDSKGYGVGTPMGSPYRDKITIAILQLQE EGKLHMMKEKWWRGNGCPEEESKEASALGVQNIGGIFIVLAAGLVLSVFVAVGEFLYKSK KNAQLEKESSIWLVPPYHPDTV (SEQ ID NO: 107)
GluK2 多肽 可具有 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 108 之胺基酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如下所示 (UniProt Q13002-7；麩胺酸受體離子紅藻氨酸 7 之 GRIK2_HUMAN 異構體 2)： MKIIFPILSNPVFRRTVKLLLCLLWIGYSQGTTHVLRFGGIFEYVESGPMGAEELAFRFA VNTINRNRTLLPNTTLTYDTQKINLYDSFEASKKACDQLSLGVAAIFGPSHSSSANAVQS ICNALGVPHIQTRWKHQVSDNKDSFYVSLYPDFSSLSRAILDLVQFFKWKTVTVVYDDST GLIRLQELIKAPSRYNLRLKIRQLPADTKDAKPLLKEMKRGKEFHVIFDCSHEMAAGILK QALAMGMMTEYYHYIFTTLDLFALDVEPYRYSGVNMTGFRILNTENTQVSSIIEKWSMER LQAPPKPDSGLLDGFMTTDAALMYDAVHVVSVAVQQFPQMTVSSLQCNRHKPWRFGTRFM SLIKEAHWEGLTGRITFNKTNGLRTDFDLDVISLKEEGLEKIGTWDPASGLNMTESQKGK PANITDSLSNRSLIVTTILEEPYVLFKKSDKPLYGNDRFEGYCIDLLRELSTILGFTYEI RLVEDGKYGAQDDANGQWNGMVRELIDHKSVLVKSNEEGIQRVLTSDYAFLMESTTIEFV TQRNCNLTQIGGLIDSKGYGVGTPMGSPYRDKITIAILQLQEEGKLHMMKEKWWRGNGCP EEESKEASALGVQNIGGIFIVLAAGLVLSVFVAVGEFLYKSKKNAQLEKRAKTKLPQDYV FLPILESVSISTVLSSSPSSSSLSSCS (SEQ ID NO: 108)
GluK2 多肽 可具有 SEQ ID NO: 109 之胺基酸序列或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 109 之胺基酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，109，如下所示 (NP_001104738.2；GRIK2_麩胺酸受體離子移變型紅藻氨酸 2 之小鼠異構體 1 前驅物)： MKIISPVLSNLVFSRSIKVLLCLLWIGYSQGTTHVLRFGGIFEYVESGPMGAEELAFRFAVNTINRNRTLLPNTTLTYDTQKINLYDSFEASKKACDQLSLGVAAIFGPSHSSSANAVQSICNALGVPHIQTRWKHQVSDNKDSFYVSLYPDFSSLSRAILDLVQFFKWKTVTVVYDDSTGLIRLQELIKAPSRYNLRLKIRQLPADTKDAKPLLKEMKRGKEFHVIFDCSHEMAAGILKQALAMGMMTEYYHYIFTTLDLFALDVEPYRYSGVNMTGFRILNTENTQVSSIIEKWSMERLQAPPKPDSGLLDGFMTTDAALMYDAVHVVSVAVQQFPQMTVSSLQCNRHKPWRFGTRFMSLIKEAHWEGLTGRITFNKTNGLRTDFDLDVISLKEEGLEKIGTWDPSSGLNMTESQKGKPANITDSLSNRSLIVTTILEEPYVLFKKSDKPLYGNDRFEGYCIDLLRELSTILGFTYEIRLVEDGKYGAQDDVNGQWNGMVRELIDHKADLAVAPLAITYVREKVIDFSKPFMTLGISILYRKPNGTNPGVFSFLNPLSPDIWMYILLAYLGVSCVLFVIARFSPYEWYNPHPCNPDSDVVENNFTLLNSFWFGVGALMQQGSELMPKALSTRIVGGIWWFFTLIIISSYTANLAAFLTVERMESPIDSADDLAKQTKIEYGAVEDGATMTFFKKSKISTYDKMWAFMSSRRQSVLVKSNEEGIQRVLTSDYAFLMESTTIEFVTQRNCNLTQIGGLIDSKGYGVGTPMGSPYRDKITIAILQLQEEGKLHMMKEKWWRGNGCPEEESKEASALGVQNIGGIFIVLAAGLVLSVFVAVGEFLYKSKKNAQLEKRSFCSAMVEELRMSLKCQRRLKHKPQAPVIVKTEEVINMHTFNDRRLPGKETMA (SEQ ID NO: 109)
GluK2 多肽 可具有 SEQ ID NO: 110 之胺基酸序列或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 110 之胺基酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如下所示 (UniProt NP_034479.3；麩胺酸受體離子紅藻氨酸 2 之 GRIK2_MOUSE 異構體 2 前驅物)： MKIISPVLSNLVFSRSIKVLLCLLWIGYSQGTTHVLRFGGIFEYVESGPMGAEELAFRFAVNTINRNRTL LPNTTLTYDTQKINLYDSFEASKKACDQLSLGVAAIFGPSHSSSANAVQSICNALGVPHIQTRWKHQVSDNKDSFYVSLYPDFSSLSRAILDLVQFFKWKTVTVVYDDSTGLIRLQELIKAPSRYNLRLKIRQLPADTKDAKPLLKEMKRGKEFHVIFDCSHEMAAGILKQALAMGMMTEYYHYIFTTLDLFALDVEPYRYSGVNMTGFRILNTENTQVSSIIEKWSMERLQAPPKPDSGLLDGFMTTDAALMYDAVHVVSVAVQQFPQMTVSSLQCNRHKPWRFGTRFMSLIKEAHWEGLTGRITFNKTNGLRTDFDLDVISLKEEGLEKIGTWDPSSGLNMTESQKGKPANITDSLSNRSLIVTTILEEPYVLFKKSDKPLYGNDRFEGYCIDLLRELSTILGFTYEIRLVEDGKYGAQDDVNGQWNGMVRELIDHKADLAVAPLAITYVREKVIDFSKPFMTLGISILYRKPNGTNPGVFSFLNPLSPDIWMYILLAYLGVSCVLFVIARFSPYEWYNPHPCNPDSDVVENNFTLLNSFWFGVGALMQQGSELMPKALSTRIVGGIWWFFTLIIISSYTANLAAFLTVERMESPIDSADDLAKQTKIEYGAVEDGATMTFFKKSKISTYDKMWAFMSSRRQSVLVKSNEEGIQRVLTSDYAFLMESTTIEFVTQRNCNLTQIGGLIDSKGYGVGTPMGSPYRDKITIAILQLQEEGKLHMMKEKWWRGNGCPEEESKEASALGVQNIGGIFIVLAAGLVLSVFVAVGEFLYKSKKNAQLEKESSIWLVPPYHPDTV (SEQ ID NO: 110)
GluK2 多肽 可具有 SEQ ID NO: 111 之胺基酸序列或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 111 之胺基酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如下所示 (UniProt NP_001345795.2；麩胺酸受體離子紅藻氨酸 1 之 GRIK2_MOUSE 異構體 2 前驅物)： MKIISPVLSNLVFSRSIKVLLCLLWIGYSQGTTHVLRFGGIFEYVESGPMGAEELAFRFAVNTINRNRTL LPNTTLTYDTQKINLYDSFEASKKACDQLSLGVAAIFGPSHSSSANAVQSICNALGVPHIQTRWKHQVSDNKDSFYVSLYPDFSSLSRAILDLVQFFKWKTVTVVYDDSTGLIRLQELIKAPSRYNLRLKIRQLPADTKDAKPLLKEMKRGKEFHVIFDCSHEMAAGILKQALAMGMMTEYYHYIFTTLDLFALDVEPYRYSGVNMTGFRILNTENTQVSSIIEKWSMERLQAPPKPDSGLLDGFMTTDAALMYDAVHVVSVAVQQFPQMTVSSLQCNRHKPWRFGTRFMSLIKEAHWEGLTGRITFNKTNGLRTDFDLDVISLKEEGLEKIGTWDPSSGLNMTESQKGKPANITDSLSNRSLIVTTILEEPYVLFKKSDKPLYGNDRFEGYCIDLLRELSTILGFTYEIRLVEDGKYGAQDDVNGQWNGMVRELIDHKADLAVAPLAITYVREKVIDFSKPFMTLGISILYRKPNGTNPGVFSFLNPLSPDIWMYILLAYLGVSCVLFVIARFSPYEWYNPHPCNPDSDVVENNFTLLNSFWFGVGALMQQGSELMPKALSTRIVGGIWWFFTLIIISSYTANLAAFLTVERMESPIDSADDLAKQTKIEYGAVEDGATMTFFKKSKISTYDKMWAFMSSRRQSVLVKSNEEGIQRVLTSDYAFLMESTTIEFVTQRNCNLTQIGGLIDSKGYGVGTPMGSPYRDKITIAILQLQEEGKLHMMKEKWWRGNGCPEEESKEASALGVQNIGGIFIVLAAGLVLSVFVAVGEFLYKSKKNAQLEKRSFCSAMVEELRMSLKCQRRLKHKPQAPVIVKTEEVINMHTFNDRRLPGKETMA (SEQ ID NO: 111)
GluK2 多肽 可具有 SEQ ID NO: 112 之胺基酸序列或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 112 之胺基酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，112，如下所示 (XP_014992481.1；GRIK2_恆河獼猴異構體 X1，麩胺酸受體離子移變型紅藻氨酸 2)： MKIIFPILSNPVFRRTVKLLLCLLWIGYSQGTTHVLRFGGIFEYVESGPMGAEELAFRFAVNTINRNRTL LPNTTLTYDTQKINLYDSFEASKKACDQLSLGVAAIFGPSHSSSANAVQSICNALGVPHIQTRWKHQVSDNKDSFYVSLYPDFSSLSRAILDLVQFFKWKTVTVVYDDSTGLIRLQELIKAPSRYNLRLKIRQLPADTKDAKPLLKEMKRGKEFHVIFDCSHEMAAGILKQALAMGMMTEYYHYIFTTLDLFALDVEPYRYSGVNMTGFRILNTENTQVSSIIEKWSMERLQAPPKPDSGLLDGFMTTDAALMYDAVHVVSVAVQQFPQMTVSSLQCNRHKPWRFGTRFMSLIKEAHWEGLTGRITFNKTNGLRTDFDLDVISLKEEGLEKIGTWDPASGLNMTESQKGKPANITDSLSNRSLIVTTILEEPYVLFKKSDKPLYGNDRFEGYCIDLLRELSTILGFTYEIRLVEDGKYGAQDDANGQWNGMVRELIDHKADLAVAPLAITYVREKVIDFSKPFMTLGISILYRKPNGTNPGVFSFLNPLSPDIWMYILLAYLGVSCVLFVIARFSPYEWYNPHPCNPDSDVVENNFTLLNSFWFGVGALMQQGSELMPKALSTRIVGGIWWFFTLIIISSYTANLAAFLTVERMESPIDSADDLAKQTKIEYGAVEDGATMTFFKKSKISTYDKMWAFMSSRRQSVLVKSNEEGIQRVLTSDYAFLMESTTIEFVTQRNCNLTQIGGLIDSKGYGVGTPMGSPYRDKITIAILQLQEEGKLHMMKEKWWRGNGCPEEESKEASALGVQNIGGIFIVLAAGLVLSVFVAVGEFLYKSKKNAQLEKRSFCSAMVEELRMSLKCQRRLKHKPQAPVIVKTEEVINMHTFNDRRLPGKETMA (SEQ ID NO: 112)
GluK2 多肽 可具有 SEQ ID NO: 113 之胺基酸序列或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 113 之胺基酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如下所示 (XP_014992483.1；GRIK2_RHESUS MACAQUE 異構體 X1，麩胺酸受體離子紅藻氨酸 2)： MKIIFPILSNPVFRRTVKLLLCLLWIGYSQGTTHVLRFGGIFEYVESGPMGAEELAFRFAVNTINRNRTL LPNTTLTYDTQKINLYDSFEASKKACDQLSLGVAAIFGPSHSSSANAVQSICNALGVPHIQTRWKHQVSDNKDSFYVSLYPDFSSLSRAILDLVQFFKWKTVTVVYDDSTGLIRLQELIKAPSRYNLRLKIRQLPADTKDAKPLLKEMKRGKEFHVIFDCSHEMAAGILKQALAMGMMTEYYHYIFTTLDLFALDVEPYRYSGVNMTGFRILNTENTQVSSIIEKWSMERLQAPPKPDSGLLDGFMTTDAALMYDAVHVVSVAVQQFPQMTVSSLQCNRHKPWRFGTRFMSLIKEAHWEGLTGRITFNKTNGLRTDFDLDVISLKEEGLEKIGTWDPASGLNMTESQKGKPANITDSLSNRSLIVTTILEEPYVLFKKSDKPLYGNDRFEGYCIDLLRELSTILGFTYEIRLVEDGKYGAQDDANGQWNGMVRELIDHKADLAVAPLAITYVREKVIDFSKPFMTLGISILYRKPNGTNPGVFSFLNPLSPDIWMYILLAYLGVSCVLFVIARFSPYEWYNPHPCNPDSDVVENNFTLLNSFWFGVGALMQQGSELMPKALSTRIVGGIWWFFTLIIISSYTANLAAFLTVERMESPIDSADDLAKQTKIEYGAVEDGATMTFFKKSKISTYDKMWAFMSSRRQSVLVKSNEEGIQRVLTSDYAFLMESTTIEFVTQRNCNLTQIGGLIDSKGYGVGTPMGSPYRDKITIAILQLQEEGKLHMMKEKWWRGNGCPEEESKEASALGVQNIGGIFIVLAAGLVLSVFVAVGEFLYKSKKNAQLEKRSFCSAMVEELRMSLKCQRRLKHKPQAPVIVKTEEVINMHTFNDRRLPGKETMA (SEQ ID NO: 113)
GluK2 多肽 可具有 SEQ ID NO: 114 之胺基酸序列或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 114 之胺基酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，114，如下所示 (NP_062182.1；麩胺酸受體離子紅藻氨酸 2 之 GRIK2_RAT 前驅物)： MKIISPVLSNLVFSRSIKVLLCLLWIGYSQGTTHVLRFGGIFEYVESGPMGAEELAFRFAVNTINRNRTL LPNTTLTYDTQKINLYDSFEASKKACDQLSLGVAAIFGPSHSSSANAVQSICNALGVPHIQTRWKHQVSDNKDSFYVSLYPDFSSLSRAILDLVQFFKWKTVTVVYDDSTGLIRLQELIKAPSRYNLRLKIRQLPADTKDAKPLLKEMKRGKEFHVIFDCSHEMAAGILKQALAMGMMTEYYHYIFTTLDLFALDVEPYRYSGVNMTGFRILNTENTQVSSIIEKWSMERLQAPPKPDSGLLDGFMTTDAALMYDAVHVVSVAVQQFPQMTVSSLQCNRHKPWRFGTRFMSLIKEAHWEGLTGRITFNKTNGLRTDFDLDVISLKEEGLEKIGTWDPASGLNMTESQKGKPANITDSLSNRSLIVTTILEEPYVLFKKSDKPLYGNDRFEGYCIDLLRELSTILGFTYEIRLVEDGKYGAQDDVNGQWNGMVRELIDHKADLAVAPLAITYVREKVIDFSKPFMTLGISILYRKPNGTNPGVFSFLNPLSPDIWMYVLLACLGVSCVLFVIARFSPYEWYNPHPCNPDSDVVENNFTLLNSFWFGVGALMRQGSELMPKALSTRIVGGIWWFFTLIIISSYTANLAAFLTVERMESPIDSADDLAKQTKIEYGAVEDGATMTFFKKSKISTYDKMWAFMSSRRQSVLVKSNEEGIQRVLTSDYAFLMESTTIEFVTQRNCNLTQIGGLIDSKGYGVGTPMGSPYRDKITIAILQLQEEGKLHMMKEKWWRGNGCPEEESKEASALGVQNIGGIFIVLAAGLVLSVFVAVGEFLYKSKKNAQLEKRSFCSAMVEELRMSLKCQRRLKHKPQAPVIVKTEEVINMHTFNDRRLPGKETMA (SEQ ID NO: 114)
Grik2mRNA 可為含有 5' 及 3' 非轉譯區 (UTR) 並具有 SEQ ID NO: 115 之核酸序列的多核苷酸，或可為其與 SEQ ID NO: 115 之核酸序列具有至少85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之變體(RefSeq NM_021956.1:4592 智人麩胺酸離子受體紅藻氨酸型次單元 2 (GRIK2)，轉錄物變體 1，mRNA)，如表 4 中所示。
Grik2mRNA 可為具有 SEQ ID NO: 116 之核酸序列的多核苷酸，或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 116 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性(RefSeq NM_021956.4:294-3020 智人麩胺酸離子移變型受體紅藻氨酸型次單元 2 (GRIK2)，轉錄物變體 1，mRNA)，如表 4 中所示。
另外地或可替代地， Grik2mRNA 可為具有 SEQ ID NO: 117 之核酸序列的多核苷酸，或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 117 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性117 (RefSeq NM_175768.3:294-2903 智人麩胺酸離子移變型受體紅藻氨酸型次單元 2 (GRIK2)，轉錄物變體 2，mRNA)，如表 4 中所示。
另外地或可替代地， Grik2mRNA 可為具有 SEQ ID NO: 118 之核酸序列的多核苷酸，或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 118 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性(RefSeq NM_001166247.1:294-2972 智人麩胺酸離子移變型受體紅藻氨酸型次單元 2 (GRIK2)，轉錄物變體 3，mRNA)，如表 4 中所示。
另外地或可替代地， Grik2mRNA 可為具有 SEQ ID NO: 118 之核酸序列的多核苷酸，或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 119 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性(RefSeq NM_001111268.2 家鼷鼠麩胺酸離子移變型受體紅藻氨酸型次單元 2 (GRIK2)，轉錄物變體 4，mRNA)，如下所示。
另外地或可替代地， Grik2mRNA 可為具有 SEQ ID NO: 118 之核酸序列的多核苷酸，或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 120 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性(RefSeq NM_010349.4 家鼷鼠麩胺酸離子移變型受體紅藻氨酸型次單元 2 (GRIK2)，轉錄物變體 5，mRNA)，如表 4 中所示。
另外地或可替代地， Grik2mRNA 可為具有 SEQ ID NO: 118 之核酸序列的多核苷酸，或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 121 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性(RefSeq NM_ 001358866 家鼷鼠麩胺酸離子移變型受體紅藻氨酸型次單元 2 (GRIK2)，轉錄物變體 6，mRNA)，如表 4 中所示。
另外地或可替代地， Grik2mRNA 可為具有 SEQ ID NO: 118 之核酸序列的多核苷酸，或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 122 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性(RefSeq XM_015136995.2 恆河獼猴麩胺酸離子移變型受體紅藻氨酸型次單元 2 (GRIK2)，轉錄物變體 7，mRNA)，如表 4 中所示。
另外地或可替代地， Grik2mRNA 可為具有 SEQ ID NO: 118 之核酸序列的多核苷酸，或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 123 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性(RefSeq XM_015136997.2 恆河獼猴麩胺酸離子移變型受體紅藻氨酸型次單元 2 (GRIK2)，轉錄物變體 X1，mRNA)，如表 4 中所示。
另外地或可替代地， Grik2mRNA 可為具有 SEQ ID NO: 118 之核酸序列的多核苷酸，或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 124 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性(RefSeq NM_019309.2 溝鼠麩胺酸離子移變型受體紅藻氨酸型次單元 2 (GRIK2)，mRNA)，如表 4 中所示。
另外地或可替代地， Grik2mRNA 包括對應於成熟 GluK2 肽編碼序列並具有 SEQ ID NO: 125 之核酸序列的多核苷酸，或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 125 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。
根據所揭露之方法及組成物， Grik2mRNA 可包括 5' UTR，諸如舉例而言由具有 SEQ ID NO: 126 之核酸序列的多核苷酸編碼的 5' UTR，或其與 SEQ ID NO: 126 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之變體如表 4 中所示。
Grik2mRNA 亦可包括 3' UTR，諸如由具有 SEQ ID NO: 127 之核酸序列的多核苷酸編碼的 3' UTR，或其與 SEQ ID NO: 127 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之變體如表 4 中所示。
另外， Grik2mRNA 可包括編碼 Grik2訊息肽序列之多核苷酸，諸如舉例而言由 SEQ ID NO: 128 之核酸序列編碼的訊息肽序列，或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 128 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。 Grik2 mRNA 標靶序列
本揭露之 ASO 藥劑可靶向 (舉例而言，特異性雜交) 至 Grik2mRNA 之一個或多個區域 (舉例而言，本文所鑒別出之一個或多個區域)，諸如舉例而言轉譯起始位點 (AUG 密碼子)、編碼區中之序列 (舉例而言本文所描述之外顯子 1 至 16 中的一個或多個) 或具有 Grik2mRNA 之 5' UTR 或 3' UTR 的區域。藉由靶向這些區域，本揭露之 ASO 藥劑可能乾擾 mRNA 之正常生物加工，包括但不限於 mRNA 易位至蛋白質轉譯位點 (舉例而言，自細胞核易位至細胞質)、將 mRNA 轉譯至 GluK2 蛋白中，mRNA 之剪接或成熟及/或 RNA 可能參與的獨立催化活性。這種干擾 RNA 功能之總體影響為引起對 Gluk2 蛋白表現之乾擾，從而減少或消除細胞 (舉例而言神經元或星形膠質細胞) 中之 GluK2 表現。
Grik2標靶序列為 Grik2mRNA 序列 (舉例而言有義標靶序列) 之部分或區域，適於藉由反義 RNA 抑製或敲落。核酸之幾個標靶位點經鑒別為靶向的 Grik2轉錄物之識別位點。如下表 4 中所示，本發明人已經鑒別了與 Grik2標靶位點雜交 (或結合) 之多種反義 RNA。 Grik2mRNA 標靶核酸包括具有初級轉錄物 (RNA) 或編碼其之 cDNA 的區域內之核苷酸序列。熟習此項技術者將理解，cDNA 序列等同於 mRNA 序列，除了用胸苷取代尿苷，並且可以用於本文中之相同目的，即產生用於抑製 Grik2mRNA 之表現的反義寡核苷酸。
可與本文所揭露之方法及組成物結合使用的抑制性 RNA 構建體 (舉例而言，本文所揭露之 ASO 藥劑) 包括能夠結合至 (舉例而言，藉由互補鹼基配對) Grik2mRNA 之一個或多個 (舉例而言，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19 或更多個) 標靶區域，諸如舉例而言在以下中之任一個的至少一部分內的 ASO 藥劑：SEQ ID NO: 115-125 之 Grik2mRNA 轉錄物、5' UTR (SEQ ID NO: 126)、3' UTR (SEQ ID NO: 127)、編碼 Grik2訊息肽之核酸序列 (SEQ ID NO: 128)、 Grik2mRNA 之外顯子 1 (SEQ ID NO: 129)、 Grik2mRNA 之外顯子 2 (SEQ ID NO: 130)、 Grik2mRNA 之外顯子 3 (SEQ ID NO: 131)、 Grik2mRNA 之外顯子 4 (SEQ ID NO: 132)、 Grik2mRNA 之外顯子 5 (SEQ ID NO: 133)、 Grik2mRNA 之外顯子 6 (SEQ ID NO: 134)、 Grik2mRNA 之外顯子 7 (SEQ ID NO: 135)、 Grik2mRNA 之外顯子 8 (SEQ ID NO: 136)、 Grik2mRNA 之外顯子 9 (SEQ ID NO: 137)、 Grik2mRNA 之外顯子 10 (SEQ ID NO: 138)、 Grik2mRNA 之外顯子 11 (SEQ ID NO: 139)、 Grik2mRNA 之外顯子 12 (SEQ ID NO: 140)、 Grik2mRNA 之外顯子 13 (SEQ ID NO: 141)、 Grik2mRNA 之外顯子 14 (SEQ ID NO: 142)、 Grik2mRNA 之外顯子 15 (SEQ ID NO: 143) 及 Grik2mRNA 之外顯子 16 (SEQ ID NO: 144) 中重建。靶向 SEQ ID NO: 115 或 SEQ ID NO: 116 之至少一部分或區域內的核酸的 Grik2ASO可選自表 2 或表 3 中所列之 ASO 藥劑。
舉例而言，本揭露之重組 ASO 藥劑包括與 SEQ ID NO: 115 之至少一部分或區域內的核苷酸序列互補的核苷酸序列115.在另一個實例中，ASO 藥劑包括與 SEQ ID NO: 116 之至少一部分或區域內的核苷酸序列互補的核苷酸序列116.
在另一實例中，靶向 Grik2mRNA 之本揭露的 ASO 藥劑包括與 5' UTR (SEQ ID NO: 126) 之至少一部分或區域內的核苷酸序列互補之核苷酸序列。在另一個實例中，靶向 Grik2mRNA 之本揭露的 ASO 藥劑包括與 3' UTR (SEQ ID NO: 127) 之至少一部分或區域內的核苷酸序列互補之核苷酸序列127) 中重建。
所揭露之 ASO 藥劑可以雜交至 Grik2mRNA 之一個或多個外顯子，諸如舉例而言具有 SEQ ID NO: 115 之核酸序列或其與 SEQ ID NO: 115 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之變體的 Grik2mRNA 之一個或多個外顯子或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 115 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，。因此，ASO 藥劑可在 Grik2mRNA 之外顯子 1 的至少一部分或區域內雜交，諸如舉例而言，位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 1 至 408 處的 Grik2mRNA 之外顯子 1。 Grik2mRNA 之外顯子 1 的序列可為 SEQ ID NO: 129 之核酸序列，或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 129 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。
舉例而言，考慮使用本文所揭露之 ASO 藥劑進行靶向的 Grik2標靶核酸包括核苷酸 197-217 (SEQ ID NO: 115)、215-235 (SEQ ID NO: 115)、232-251 (SEQ ID NO: 115)、232-252 (SEQ ID NO: 115)、227-247 (SEQ ID NO: 115)、29-48 (SEQ ID NO: 116)、322-341 (SEQ ID NO: 115)、29-49 (SEQ ID NO: 116)、322-342 (SEQ ID NO: 115)、182-202 (SEQ ID NO: 115)、226-246 (SEQ ID NO: 115)、253-272 (SEQ ID NO: 115)、253-273 (SEQ ID NO: 115)、139-159 (SEQ ID NO: 115)、176-196 (SEQ ID NO: 115)、241-261 (SEQ ID NO: 115)、195-215 (SEQ ID NO: 115)、42-62 (SEQ ID NO: 115)、196-216 (SEQ ID NO: 115) 或 30-49 (SEQ ID NO: 115) 中重建。此外， Grik2ASO 藥劑可雜交至以下核苷酸內之 Grik2mRNA：97-217 (SEQ ID NO: 115)、215-235 (SEQ ID NO: 115)、232-251 (SEQ ID NO: 115)、232-252 (SEQ ID NO: 115)、227-247 (SEQ ID NO: 115)、29-48 (SEQ ID NO: 116)、322-341 (SEQ ID NO: 115)、29-49 (SEQ ID NO: 116)、322-342 (SEQ ID NO: 115)、182-202 (SEQ ID NO: 115)、226-246 (SEQ ID NO: 115)、253-272 (SEQ ID NO: 115)、253-273 (SEQ ID NO: 115)、139-159 (SEQ ID NO: 115)、176-196 (SEQ ID NO: 115)、241-261 (SEQ ID NO: 115)、195-215 (SEQ ID NO: 115)、42-62 (SEQ ID NO: 115)、196-216 (SEQ ID NO: 115)、30-49 (SEQ ID NO: 115)，或其片段或部分。
靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 1 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO 藥劑可選自 siRNA TJ (SEQ ID NO: 21)、siRNA TG (SEQ ID NO: 23)、siRNA TF (SEQ ID NO: 24)、siRNA TE (SEQ ID NO: 25)、siRNA TD (SEQ ID NO: 26)、siRNA TC (SEQ ID NO: 28)、siRNA CK (SEQ ID NO: 29)、siRNA CX (SEQ ID NO: 42)、siRNA CY (SEQ ID NO: 43)、siRNA D0 (SEQ ID NO: 45)、siRNA D1 (SEQ ID NO: 46)、siRNA D3 (SEQ ID NO: 48)、siRNA XZ (SEQ ID NO: 54)、siRNA Y0 (SEQ ID NO: 55)、siRNA GF (SEQ ID NO: 64)、siRNA ZZ (SEQ ID NO: 100)、siRNA GE (SEQ ID NO: 65)、siRNA GH (SEQ ID NO: 66) 或 siRNA YB (SEQ ID NO: 67) 或與以下中之任一個具有至少超過 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之反義寡核苷酸：siRNA TJ (SEQ ID NO: 21)、siRNA TG (SEQ ID NO: 23)、siRNA TF (SEQ ID NO: 24)、siRNA TE (SEQ ID NO: 25)、siRNA TD (SEQ ID NO: 26)、siRNA TC (SEQ ID NO: 28)、siRNA CK (SEQ ID NO: 29)、siRNA CX (SEQ ID NO: 42)、siRNA CY (SEQ ID NO: 43)、siRNA D0 (SEQ ID NO: 45)、siRNA D1 (SEQ ID NO: 46)、siRNA D3 (SEQ ID NO: 48)、siRNA XZ (SEQ ID NO: 54)、siRNA Y0 (SEQ ID NO: 55)、siRNA GF (SEQ ID NO: 64)、siRNA ZZ (SEQ ID NO: 100)、siRNA GE (SEQ ID NO: 65)、siRNA GH (SEQ ID NO: 66) 或 siRNA YB (SEQ ID NO: 67)。靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 1 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO 藥劑115 可表現出至少 10% (舉例而言至少 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 蛋白敲落。此外，Grik2 反義寡核苷酸可選自 siRNA TJ (SEQ ID NO: 21)、siRNA TG (SEQ ID NO: 23)、siRNA TF (SEQ ID NO: 24)、siRNA TE (SEQ ID NO: 25)、siRNA TD (SEQ ID NO: 26)、siRNA TC (SEQ ID NO: 28)、siRNA CK (SEQ ID NO: 29)、siRNA CX (SEQ ID NO: 42)、siRNA CY (SEQ ID NO: 43)、siRNA D0 (SEQ ID NO: 45)、siRNA D1 (SEQ ID NO: 46)、siRNA D3 (SEQ ID NO: 48)、siRNA XZ (SEQ ID NO: 54)、siRNA Y0 (SEQ ID NO: 55)、siRNA GF (SEQ ID NO: 64)、siRNA ZZ (SEQ ID NO: 100)、siRNA GE (SEQ ID NO: 65)、siRNA GH (SEQ ID NO: 66) 或 siRNA YB (SEQ ID NO: 67)，或其具有至少 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之反義寡核苷酸，且表現出至少 10% (舉例而言至少 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。
此外，ASO 藥劑可在 Grik2mRNA 之外顯子 2 的至少一部分或區域內雜交，諸如舉例而言，位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 409-576 處的 Grik2mRNA 之外顯子 2115. Grik2mRNA 之外顯子 2 的序列可為 SEQ ID NO: 130 之核酸序列，或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 130 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。
舉例而言，考慮使用本文所揭露之 ASO 藥劑進行靶向的 Grik2標靶核酸包括 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 501 至 521或 SEQ ID NO: 116 之核苷酸 208-228，或其片段或部分。
靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 2 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO 藥劑為 siRNA G0 (SEQ ID NO: 1)，或與 siRNA G0 (SEQ ID NO: 1) 具有大於 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之反義寡核苷酸。在其他實施例中，靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 2 的一部分或區域內之核酸的 Grik2反義寡核苷酸表現出大於 75% 的 GluK2 敲落。在其他實施例中，Grik2 反義寡核苷酸為 siRNA G0 (SEQ ID NO: 1)，或其具有大於 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之反義寡核苷酸，且表現出大於 75% (舉例而言，至少 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。
ASO 藥劑亦可在 Grik2mRNA 之外顯子 3 的至少一部分或區域內雜交，諸如舉例而言，位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 577-834 處的 Grik2mRNA 之外顯子 3。 Grik2mRNA 之外顯子 3 的序列可為 SEQ ID NO: 131 之核酸序列，或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 131 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。
舉例而言，考慮使用本文所揭露之 ASO 藥劑進行靶向的 Grik2標靶核酸包括 SEQ ID NO: 116 之核苷酸 307 至 327或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 600 至 620、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 352 至 372、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 645 至 665、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 381 至 400、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 674 至 693、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 381 至 401、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 674 至 694、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 380 至 400、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 673 至 693、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 534 至 554、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 827 至 847、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 308 至 328、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 601 至 621、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 396 至 416、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 689 至 709、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 355 至 375、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 648 至 668、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 357 至 377、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 650 至 670、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 424 至 444、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 717 至 737、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 429 至 449、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 722 至 742、或其片段或部分。
靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 3 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO 藥劑係選自 siRNA TV (SEQ ID NO: 2)、siRNA TU (SEQ ID NO: 3)、siRNA CL (SEQ ID NO: 30)、siRNA CM (SEQ ID NO: 31)、siRNA CR (SEQ ID NO: 36)、siRNA CV (SEQ ID NO: 40)、siRNA Y4 (SEQ ID NO: 59)、siRNA MP (SEQ ID NO: 76)、siRNA MW (SEQ ID NO: 80)、siRNA MV (SEQ ID NO: 81)、siRNA G8 (SEQ ID NO: 92) 或 siRNA MF (SEQ ID NO: 93)，或與以下具有大於 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之 ASO：siRNA TV (SEQ ID NO: 2)、siRNA TU (SEQ ID NO: 3)、siRNA CL (SEQ ID NO: 30)、siRNA CM (SEQ ID NO: 31)、siRNA CR (SEQ ID NO: 36)、siRNA CV (SEQ ID NO: 40)、siRNA Y4 (SEQ ID NO: 59)、siRNA MP (SEQ ID NO: 76)、siRNA MW (SEQ ID NO: 80)、siRNA MV (SEQ ID NO: 81)、siRNA G8 (SEQ ID NO: 92) 或 siRNA MF (SEQ ID NO: 93)。此外，靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 3 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO 藥劑可表現出至少 15% (舉例而言至少 15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。在其他實施例中， Grik2ASO 係選自 siRNA TV (SEQ ID NO: 2)、siRNA TU (SEQ ID NO: 3)、siRNA CL (SEQ ID NO: 30)、siRNA CM (SEQ ID NO: 31)、siRNA CR (SEQ ID NO: 36)、siRNA CV (SEQ ID NO: 40)、siRNA Y4 (SEQ ID NO: 59)、siRNA MP (SEQ ID NO: 76)、siRNA MW (SEQ ID NO: 80)、siRNA MV (SEQ ID NO: 81)、siRNA G8 (SEQ ID NO: 92) 或 siRNA MF (SEQ ID NO: 93)，或其具有大於 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之 ASO，且表現出大於 15% (舉例而言至少 15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。
另外，所揭露之 ASO 藥劑可在 Grik2mRNA 之外顯子 4 的至少一部分或區域內雜交，諸如舉例而言，位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 835 至 1016 處的 Grik2mRNA 之外顯子 4。 Grik2mRNA 之外顯子 4 的序列可為 SEQ ID NO: 132 之核酸序列，或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 132 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。
舉例而言，考慮使用本文所揭露之 ASO 藥劑進行靶向的 Grik2標靶核酸包括 SEQ ID NO: 116 之核苷酸 534 至 554或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 827 至 847、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 579 至 599、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 872 至 892、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 717 至 737、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1010 至 1030、115、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 721-741、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1014 至 1034及 SEQ ID NO: 116 之核苷酸 559 至 579或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 852 至 872、115，或其片段或一部分。
靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 4 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 4 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO 藥劑係選自 siRNA CV (SEQ ID NO: 40)、siRNA Y5 (SEQ ID NO: 60)、siRNA G9 (SEQ ID NO: 68)、siRNA MD (SEQ ID NO: 70) 或 siRNA MK (SEQ ID NO: 86)，或與以下具有大於 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之 ASO：siRNA CV (SEQ ID NO: 40)、siRNA Y5 (SEQ ID NO: 60)、siRNA G9 (SEQ ID NO: 68)、siRNA MD (SEQ ID NO: 70) 或 siRNA MK (SEQ ID NO: 86) 中重建。此外，靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 4 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO 藥劑表現出大於 25% (舉例而言至少 25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。此外， Grik2ASO 係選自 siRNA CV (SEQ ID NO: 40)、siRNA Y5 (SEQ ID NO: 60)、siRNA G9 (SEQ ID NO: 68)、siRNA MD (SEQ ID NO: 70) 或 siRNA MK (SEQ ID NO: 86)，或其具有大於 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之 ASO，且表現出大於 25% (舉例而言至少 25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。
此外，ASO 藥劑可在 Grik2mRNA 之外顯子 5 的至少一部分或區域內雜交，諸如舉例而言，位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 1017 至 1070 處的 Grik2mRNA 之外顯子 5。 Grik2mRNA 之外顯子 5 的序列可為 SEQ ID NO: 133 之核酸序列，或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 133 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。
舉例而言，考慮使用本文所揭露之 ASO 藥劑進行靶向的 Grik2標靶核酸包括 SEQ ID NO: 116 之核苷酸 717 至 737或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1010 至 1030、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 728 至 747、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1021 至 1040及 SEQ ID NO: 116 之核苷酸 721 至 741、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1014 至 1034或其片段或部分。
靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 5 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO係選自 siRNA G9 (SEQ ID NO: 68)、siRNA ME (SEQ ID NO: 69) 或 siRNA MD (SEQ ID NO: 70)，或與以下具有大於 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之 ASO：siRNA G9 (SEQ ID NO: 68)、siRNA ME (SEQ ID NO: 69)SEQ ID NO: 69) 或 siRNA MD (SEQ ID NO: 70)。此外，靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 5 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO表現出大於 75% (舉例而言，至少 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。此外， Grik2ASO 係選自 siRNA G9 (SEQ ID NO: 68)、siRNA ME (SEQ ID NO: 69) 或 siRNA MD (SEQ ID NO: 70)，或其具有大於 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之 ASO，且表現出大於 75% (舉例而言，至少 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。
ASO 藥劑亦可在 Grik2mRNA 之外顯子 6 的至少一部分或區域內雜交，諸如舉例而言，位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 1071 至 1244 處的 Grik2mRNA 之外顯子 6。 Grik2mRNA 之外顯子 6 的序列可為 SEQ ID NO: 134 之核酸序列，或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 134 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。
舉例而言，考慮使用本文所揭露之 ASO 藥劑進行靶向的 Grik2標靶核酸包括 SEQ ID NO: 116 之核苷酸 806 至 826或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1099 至 1119、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 905 至 925、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1198 至 1218、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 904 至 924、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1197 至 1217、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 885 至 905、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1178 至 1198、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 908 至 927、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1201 至 1220、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 908 至 928、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1201 至 1221、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 934 至 954或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1227 至 1247、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 931 至 950或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1224 至 1243及 SEQ ID NO: 116 之核苷酸 938 至 957或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1231 至 1250或其片段或部分。
靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 6 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO係選自 siRNA TT (SEQ ID NO: 4)、siRNA G1 (SEQ ID NO: 5)、siRNA G2 (SEQ ID NO: 6)、siRNA Y1 (SEQ ID NO: 56)、siRNA Y2 (SEQ ID NO: 57)、siRNA Y3 (SEQ ID NO: 58)、siRNA GG (SEQ ID NO: 91)、siRNA MH (SEQ ID NO: 94) 或 siRNA MG (SEQ ID NO: 95)，或與以下具有大於 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之 ASO：siRNA TT (SEQ ID NO: 4)、siRNA G1 (SEQ ID NO: 5)、siRNA G2 (SEQ ID NO: 6)、siRNA Y1 (SEQ ID NO: 56)、siRNA Y2 (SEQ ID NO: 57)、siRNA Y3 (SEQ ID NO: 58)、siRNA GG (SEQ ID NO: 91)、siRNA MH (SEQ ID NO: 94) 或 siRNA MG (SEQ ID NO: 95)。此外，靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 6 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO表現出大於 20% (舉例而言至少 20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。在其他實施例中， Grik2ASO 係選自 siRNA TT (SEQ ID NO: 4)、siRNA G1 (SEQ ID NO: 5)、siRNA G2 (SEQ ID NO: 6)、siRNA Y1 (SEQ ID NO: 56)、siRNA Y2 (SEQ ID NO: 57)、siRNA Y3 (SEQ ID NO: 58)、siRNA GG (SEQ ID NO: 91)、siRNA MH (SEQ ID NO: 94) 或 siRNA MG (SEQ ID NO: 95)，或其具有大於 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之 ASO，且表現出大於 20% (舉例而言至少 20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。
另外，ASO 藥劑可在 Grik2mRNA 之外顯子 7 的至少一部分或區域內雜交，諸如舉例而言，位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 1245 至 1388 處的 Grik2mRNA 之外顯子 7。 Grik2mRNA 之外顯子 7 的序列可為 SEQ ID NO: 135 之核酸序列，或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 135 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。
舉例而言，考慮使用本文所揭露之 ASO 藥劑進行靶向的 Grik2標靶核酸包括 SEQ ID NO: 116 之核苷酸 1029 至 1049或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1322 至 1342、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 985 至 1005、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1278 至 1298、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 1057 至 1077、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1350 至 1370、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 1058 至 1078、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1351 至 1371及 SEQ ID NO: 116 之核苷酸 1043 至 1063、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1336 至 1356、或其片段或部分。
靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 7 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO係選自 siRNA TL (SEQ ID NO: 20)、siRNA CS (SEQ ID NO: 37)、siRNA CT (SEQ ID NO: 38)、siRNA CZ (SEQ ID NO: 44) 或 siRNA D2 (SEQ ID NO: 47)，或與以下具有大於 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之 ASO：siRNA TL (SEQ ID NO: 20)、siRNA CS (SEQ ID NO: 37)、siRNA CT (SEQ ID NO: 38)、siRNA CZ (SEQ ID NO: 44) 或 siRNA D2 (SEQ ID NO: 47)。此外，靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 7 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO表現出大於 45% (舉例而言至少 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。此外， Grik2ASO 係選自 siRNA TL (SEQ ID NO: 20)、siRNA CS (SEQ ID NO: 37)、siRNA CT (SEQ ID NO: 38)、siRNA CZ (SEQ ID NO: 44) 或 siRNA D2 (SEQ ID NO: 47)，或其具有大於 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之 ASO，且表現出大於 45% (舉例而言至少 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。
ASO 藥劑可进一步在 Grik2mRNA 之外顯子 8 的至少一部分或區域內雜交，諸如舉例而言，位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 1389 至 1496 處的 Grik2mRNA 之外顯子 8。 Grik2mRNA 之序列外顯子 8 可為 SEQ ID NO: 136 之核酸序列或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 136 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。靶向外顯子 8 之一部分或區域的 ASO 藥劑可表現出至少 10% (舉例而言至少 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。
另外，ASO 藥劑可在 Grik2mRNA 之外顯子 9 的至少一部分或區域內雜交，諸如舉例而言，位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 1497 至 1610 處的 Grik2mRNA 之外顯子 9。 Grik2mRNA 之外顯子 9 的序列可為 SEQ ID NO: 137 之核酸序列，或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 137 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。
舉例而言，考慮使用本文所揭露之 ASO 藥劑進行靶向的 Grik2標靶核酸包括 SEQ ID NO: 116 之核苷酸 1252 至 1272或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1545 至 1565或其片段或部分。
靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 9 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO為 siRNA TQ (SEQ ID NO: 12)，或與 siRNA TQ (SEQ ID NO: 12) 具有大於 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之 ASO。此外，靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 9 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO表現出大於 50% (舉例而言至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。此外， Grik2ASO 為 siRNA TQ (SEQ ID NO: 12)，或其具有大於 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之 ASO，且表現出大於 50% (舉例而言至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。
ASO 藥劑可另外雜交至 Grik2mRNA 之外顯子 10，諸如舉例而言，位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 1611 至 1817 處的 Grik2mRNA 之外顯子 10。 Grik2mRNA 之外顯子 10 的序列可為 SEQ ID NO: 138 之核酸序列，或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 138 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。
舉例而言，考慮使用本文所揭露之 ASO 藥劑進行靶向的 Grik2標靶核酸包括 SEQ ID NO: 116 之核苷酸 1396 至 1416或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1689 至 1709、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 1496 至 1516或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1789 至 1809、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 1417 至 1437、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1710 至 1730、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 1483 至 1503或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1776 至 1796及 SEQ ID NO: 116 之核苷酸 1491 至 1511、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1784 至 1804或其片段或部分。
靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 10 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO係選自 siRNA GD (SEQ ID NO: 7)、G3 (SEQ ID NO: 8)、siRNA MU (SEQ ID NO: 96)、siRNA MT (SEQ ID NO: 98) 或 siRNA MS (SEQ ID NO: 99)，或與以下具有大於 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之 ASO：siRNA GD (SEQ ID NO: 7)、G3 (SEQ ID NO: 8)、siRNA MU (SEQ ID NO: 96)、siRNA MT (SEQ ID NO: 98) 或 siRNA MS (SEQ ID NO: 99)。此外，靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 10 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO表現出大於 50% (舉例而言至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。此外， Grik2ASO 係選自 GD (SEQ ID NO: 7)、G3 (SEQ ID NO: 8)、siRNA MU (SEQ ID NO: 96)、siRNA MT (SEQ ID NO: 98) 或 siRNA MS (SEQ ID NO: 99)，或其具有大於 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之 ASO，且表現出大於 50% (舉例而言至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。
另外，ASO 藥劑可在 Grik2mRNA 之外顯子 11 的至少一部分或區域內雜交，諸如舉例而言，位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 1818 至 2041 處的 Grik2mRNA 之外顯子 11。 Grik2mRNA 之外顯子 11 的序列可為 SEQ ID NO: 139 之核酸序列，或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 139 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。
舉例而言，考慮使用本文所揭露之 ASO 藥劑進行靶向的 Grik2標靶核酸包括 SEQ ID NO: 116 之核苷酸 1550 至 1570或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1843 至 1863、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 1637 至 1657或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1930 至 1950、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 1670 至 1690或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1963 至 1983、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 1565 至 1585或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1858 至 1878、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 1550 至 1569或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1843 至 1862、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 1544 至 1563、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1837 至 1856、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 1544 至 1564或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1837 至 1857、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 1526 至 1546及 SEQ ID NO: 116 之核苷酸 1541 至 1561或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 1834 至 1854、或其片段或部分。
靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 11 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO係選自 siRNA TH (SEQ ID NO: 22)、siRNA CU (SEQ ID NO: 39)、siRNA Y7 (SEQ ID NO: 62)、siRNA TK (SEQ ID NO: 74)、siRNA TI (SEQ ID NO: 75)、siRNA Y8 (SEQ ID NO: 87)、siRNA Y9 (SEQ ID NO: 88)、siRNA MJ (SEQ ID NO: 89) 或 siRNA MI (SEQ ID NO: 90)，或與以下具有大於 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之 ASO：siRNA TH (SEQ ID NO: 22)、siRNA CU (SEQ ID NO: 39)、siRNA Y7 (SEQ ID NO: 62)、siRNA TK (SEQ ID NO: 74)、siRNA TI (SEQ ID NO: 75)、siRNA Y8 (SEQ ID NO: 87)、siRNA Y9 (SEQ ID NO: 88)、siRNA MJ (SEQ ID NO: 89) 或 siRNA MI (SEQ ID NO: 90)。此外，靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 11 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO表現出大於 25% (舉例而言至少 25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。此外， Grik2ASO 係選自 siRNA TH (SEQ ID NO: 22)、siRNA CU (SEQ ID NO: 39)、siRNA Y7 (SEQ ID NO: 62)、siRNA TK (SEQ ID NO: 74)、siRNA TI (SEQ ID NO: 75)、siRNA Y8 (SEQ ID NO: 87)、siRNA Y9 (SEQ ID NO: 88)、siRNA MJ (SEQ ID NO: 89) 或 siRNA MI (SEQ ID NO: 90)，或其具有大於 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之 ASO，且表現出大於 25% (舉例而言至少 25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。
作為另一實例，ASO 藥劑可在 Grik2mRNA 之外顯子 12 的至少一部分或區域內雜交，諸如舉例而言，位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 2042 至 2160 處的 Grik2mRNA 之外顯子 12。 Grik2mRNA 之外顯子 12 的序列可為 SEQ ID NO: 140 之核酸序列，或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 140 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。
舉例而言，考慮使用本文所揭露之 ASO 藥劑進行靶向的 Grik2標靶核酸包括 SEQ ID NO: 116 之核苷酸 1786 至 1805或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 2079 至 2098、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 1786 至 1806或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 2079 至 2099、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 1778 至 1797或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 2071 至 2090及 SEQ ID NO: 116 之核苷酸 1836 至 1856或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 2129 至 2149或其片段或部分。
靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 12 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO係選自 siRNA XX (SEQ ID NO: 82)、siRNA XY (SEQ ID NO: 83)、siRNA MM (SEQ ID NO: 84) 或 siRNA ML (SEQ ID NO: 85)，或與以下具有大於 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之 ASO：siRNA XX (SEQ ID NO: 82)、siRNA XY (SEQ ID NO: 83)、siRNA MM (SEQ ID NO: 84) 或 siRNA ML (SEQ ID NO: 85)。此外，靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 12 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO表現出大於 50% (舉例而言至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。此外， Grik2ASO 係選自 siRNA XX (SEQ ID NO: 82)、siRNA XY (SEQ ID NO: 83)、siRNA MM (SEQ ID NO: 84) 或 siRNA ML (SEQ ID NO: 85)，或其具有大於 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之 ASO，且表現出大於 50% (舉例而言至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。
ASO 藥劑亦可在 Grik2mRNA 之外顯子 13 的至少一部分或區域內雜交，諸如舉例而言，位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 2161 至 2378 處的 Grik2mRNA 之外顯子 13。 Grik2mRNA 之外顯子 13 的序列可為 SEQ ID NO: 141 之核酸序列，或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 141 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。
舉例而言，考慮使用本文所揭露之 ASO 藥劑進行靶向的 Grik2標靶核酸包括 SEQ ID NO: 116 之核苷酸 1968 至 1987或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 2213 至 2233、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 1968 至 1988、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 2213 至 2233、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 1906 至 1926或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 2199 至 2219及 SEQ ID NO: 116 之核苷酸 1920 至 1940或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 2213 至 2233或其片段或部分。
靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 13 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO係選自 siRNA TP (SEQ ID NO: 13)、siRNA TO (SEQ ID NO: 14)、siRNA MR (SEQ ID NO: 72) 或 siRNA MQ (SEQ ID NO: 73)，或與以下具有大於 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之 ASO：siRNA TP (SEQ ID NO: 13)、siRNA TO (SEQ ID NO: 14)、siRNA MR (SEQ ID NO: 72) 或 siRNA MQ (SEQ ID NO: 73)。此外，靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 13 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO表現出大於 35% (舉例而言至少 35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。此外， Grik2ASO 係選自 siRNA TP (SEQ ID NO: 13)、siRNA TO (SEQ ID NO: 14)、siRNA MR (SEQ ID NO: 72) 或 siRNA MQ (SEQ ID NO: 73)，或其具有大於 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之 ASO，且表現出大於 35% (舉例而言至少 35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。
此外，ASO 藥劑可在 Grik2mRNA 之外顯子 14 的至少一部分或區域內雜交，諸如舉例而言，位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 2379 至 2604 處的 Grik2mRNA 之外顯子 14。 Grik2mRNA 之外顯子 14 的序列可為 SEQ ID NO: 142 之核酸序列，或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 142 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。
舉例而言，考慮使用本文所揭露之 ASO 藥劑進行靶向的 Grik2標靶核酸包括 SEQ ID NO: 116 之核苷酸 2209 至 2228或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 2502 至 2521、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 2209 至 2229、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 2502 至 2522、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 2308 至 2328或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 2601 至 2621、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 2304 至 2323、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 2597 至 2616及 SEQ ID NO: 116 之核苷酸 2303 至 2323、或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 2596 至 2616、或其片段或部分。
靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 14 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO係選自 siRNA CP (SEQ ID NO: 34)、siRNA CQ (SEQ ID NO: 35)、siRNA GI (SEQ ID NO: 77)、siRNA MO (SEQ ID NO: 78) 或 siRNA MN (SEQ ID NO: 79)，或與以下具有大於 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之 ASO：siRNA CP (SEQ ID NO: 34)、siRNA CQ (SEQ ID NO: 35)、siRNA GI (SEQ ID NO: 77)、siRNA MO (SEQ ID NO: 78) 或 siRNA MN (SEQ ID NO: 79)。此外，靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 14 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO表現出大於 35% (舉例而言至少 35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。此外， Grik2ASO 係選自 siRNA CP (SEQ ID NO: 34)、siRNA CQ (SEQ ID NO: 35)、siRNA GI (SEQ ID NO: 77)、siRNA MO (SEQ ID NO: 78) 或 siRNA MN (SEQ ID NO: 79)，或其具有大於 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之 ASO，且表現出大於 35% (舉例而言至少 35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。
ASO 藥劑亦可在 Grik2mRNA 之外顯子 15 的至少一部分或區域內雜交，諸如舉例而言，位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 2605 至 2855 處的 Grik2mRNA 之外顯子 15。 Grik2mRNA 之外顯子 15 之核苷酸序列可為 SEQ ID NO: 143 之核酸序列或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 143 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。
舉例而言，考慮使用本文所揭露之 ASO 藥劑進行靶向的 Grik2標靶核酸包括 SEQ ID NO: 116 之核苷酸 2309 至 2329或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 2602 至 2622或其片段或部分。
靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 15 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO為 siRNA XU (SEQ ID NO: 51)，或與 siRNA XU (SEQ ID NO:X) 具有大於 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之 ASO。此外，靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 15 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO表現出大於 50% (舉例而言至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。此外， Grik2ASO 為 siRNA XU (SEQ ID NO: 51)，或其具有大於 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之 ASO，且表現出大於 50% (舉例而言至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。
另外，ASO 藥劑可在 Grik2mRNA 之外顯子 16 的至少一部分或區域內雜交，諸如舉例而言，位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 2856 至 4592 處的 Grik2mRNA 之外顯子 16。 Grik2mRNA 之外顯子 16 的序列可為 SEQ ID NO: 144 之核酸序列，或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 144 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。
舉例而言，考慮使用本文所揭露之 ASO 藥劑進行靶向的 Grik2標靶核酸包括 SEQ ID NO: 116 之核苷酸 2632 至 2652或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 2925 至 2945、SEQ ID NO: 115 之核苷酸 3382 至 3402、SEQ ID NO: 115 之核苷酸 3792 至 3812、SEQ ID NO: 115 之核苷酸 3347 至 3367、SEQ ID NO: 115 之核苷酸 3605 至 3625、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 2581 至 2601或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 2874 至 2893、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 2581 至 2601或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 2874 至 2893、SEQ ID NO: 115 之核苷酸 4289 至 4309、SEQ ID NO: 115 之核苷酸 4274 至 4293、SEQ ID NO: 115 之核苷酸 4274 至 4294、SEQ ID NO: 115 之核苷酸 4078 至 4098、SEQ ID NO: 115 之核苷酸 3037 至 3057、SEQ ID NO: 115 之核苷酸 4417 至 4437、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 2601 至 2620或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 2894 至 2913、SEQ ID NO: 116 之核苷酸 2601 至 2621或 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 2894 至 2914、SEQ ID NO: 115 之核苷酸 3479 至 3499及 SEQ ID NO: 115 之核苷酸 3085 至 3105或其片段或部分。
靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 16 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO係選自 siRNA G4 (SEQ ID NO: 9)、siRNA TS (SEQ ID NO: 10)、siRNA TR (SEQ ID NO: 11)、siRNA G5 (SEQ ID NO: 15)、siRNA TN (SEQ ID NO: 16)、siRNA G6 (SEQ ID NO: 18)、siRNA G7 (SEQ ID NO: 19)、siRNA GJ (SEQ ID NO: 27)、siRNA CN (SEQ ID NO: 32)、siRNA CO (SEQ ID NO: 33)、siRNA CW (SEQ ID NO: 41)、siRNA XS (SEQ ID NO: 49)、siRNA XT (SEQ ID NO: 50)、siRNA XV (SEQ ID NO: 52)、siRNA XW (SEQ ID NO: 53)、siRNA Y6 (SEQ ID NO: 61) 或 siRNA YA (SEQ ID NO: 63)，或與以下具有大於 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之 ASO：siRNA G4 (SEQ ID NO: 9)、siRNA TS (SEQ ID NO: 10)、siRNA TR (SEQ ID NO: 11)、siRNA G5 (SEQ ID NO: 15)、siRNA TN (SEQ ID NO: 16)、siRNA G6 (SEQ ID NO: 18)、siRNA G7 (SEQ ID NO: 19)、siRNA GJ (SEQ ID NO: 27)、siRNA CN (SEQ ID NO: 32)、siRNA CO (SEQ ID NO: 33)、siRNA CW (SEQ ID NO: 41)、siRNA XS (SEQ ID NO: 49)、siRNA XT (SEQ ID NO: 50)、siRNA XV (SEQ ID NO: 52)、siRNA XW (SEQ ID NO: 53)、siRNA Y6 (SEQ ID NO: 61) 或 siRNA YA (SEQ ID NO: 63)。此外，靶向 SEQ ID NO: 116 或 SEQ ID NO: 115 之外顯子 16 的一部分或區域內之核酸的 Grik2ASO表現出大於 5% (舉例而言至少 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。此外， Grik2ASO 係選自 siRNA G4 (SEQ ID NO: 9)、siRNA TS (SEQ ID NO: 10)、siRNA TR (SEQ ID NO: 11)、siRNA G5 (SEQ ID NO: 15)、siRNA TN (SEQ ID NO: 16)、siRNA G6 (SEQ ID NO: 18)、siRNA G7 (SEQ ID NO: 19)、siRNA GJ (SEQ ID NO: 27)、siRNA CN (SEQ ID NO: 32)、siRNA CO (SEQ ID NO: 33)、siRNA CW (SEQ ID NO: 41)、siRNA XS (SEQ ID NO: 49)、siRNA XT (SEQ ID NO: 50)、siRNA XV (SEQ ID NO: 52)、siRNA XW (SEQ ID NO: 53)、siRNA Y6 (SEQ ID NO: 61) 或 siRNA YA (SEQ ID NO: 63)，或其具有大於 85% (舉例而言至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性之 ASO，且表現出大於 5% (舉例而言至少 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) GluK2 敲落。 反義寡核苷酸及 Grik2 標靶區域之熱力學性質
RNA 二級結構，諸如舉例而言由本揭露之反義劑或其雜交之標靶序列 (舉例而言， Grik2標靶序列) 之相應區域形成之彼等，可以使用從熱力學借用的概念 (諸如熵及熱力學自由能) 來描述。熱力學自由能通常被描述為系統在恆定溫度下的過程中可以執行的最大工作量，並表示該過程在熱力學上是有利的還是禁止的。簡而言之，熱力學自由能係指系統經歷物理狀態變化的能力。在多核苷酸 (舉例而言，本揭露之 ASO 藥劑或其實質上互補的序列) 之上下文中，基於熱力學自由能之度量可以描述可以解析特定二級結構之難易程度 (亦即，打開反義寡核苷酸或其部分或全部補體之二級 RNA 結構所需的能量)，RNA 分子之間或內部之雙股形成產生的能量及 RNA 分子與其自身或另一個 RNA 分子結合之總能量，其中考慮了解析各 RNA 所需的總能量及雜交 本身之能量。
本揭露部分基於本發明人所做的發現，亦即可使用 RNA 分子 (舉例而言本揭露之 ASO 構建體或其實質上互補的序列，諸如舉例而言 Grik2標靶區域) 之熱力學特徵來預測反義分子可以敲落標靶 mRNA 表現之功效。因此，本文揭示之組成物及方法可使用熱力學參數來表徵 ASO 序列或其標靶 mRNA 序列以預測 mRNA 表現敲落的可能性。
具體而言，本揭露提供了三種不同的熱力學參數，此等參數可用於預測特定 ASO 序列相對於其標靶 mRNA 區域之敲落功效，亦即總結合自由能、來自雙股形成的能量及標靶打開能 (或打開能)。可用於表徵 RNA 分子之熱力學穩定性及預測特定 ASO 藥劑之敲落功效的另一個概念為 RNA 分子之 GC (鳥嘌呤-胞嘧啶；%) 含量。在本揭露之上下文中，ASO 之總結合自由能 (kcal/mol) 係指 ASO 與其相應的標靶 mRNA 序列雜交之過程的自由能。此包括打開 mRNA (舉例而言 Grik2mRNA) 之標靶區域所需的能量、生成單股反義導引序列所需的能量及多核苷酸與其補體 (全部或大部分) 之間的雜交能量。相關地，來自雙股形成的能量係指一種熱力學性質，其表明兩個 RNA 分子之間形成雙股結構的有利性，以及由此導致的 RNA 雙股的穩定性。總打開能為一種熱力學度量，其反映了在標靶位置解析 (亦即打開/呈現可觸及的) RNA 二級結構所需的能量，包括解析附近的二級結構或涉及與標靶序列形成二級結構的遠側序列。
因此，本揭露涵蓋具有小於 10 kcal/mol (舉例而言，小於 10 kcal/mol、9 kcal/mol、8 kcal/mol、7 kcal/mol、6 kcal/mol、5 kcal/mol、4 kcal/mol、3 kcal/mol、2 kcal/mol 或 1 kcal/mol) 之總打開能的 ASO 序列 (諸如舉例而言，本文所揭示之 ASO 序列)。在特定實例中，本揭露之 ASO 序列具有小於 9 kcal/mol (舉例而言，小於 8 kcal/mol、7 kcal/mol、6 kcal/mol、5 kcal/mol、4 kcal/mol、3 kcal/mol、2 kcal/mol 或 1 kcal/mol 或更小) 之總打開能。在另一實例中，本揭露之 ASO 序列具有小於 8 kcal/mol (舉例而言，小於 7 kcal/mol、6 kcal/mol、5 kcal/mol、4 kcal/mol、3 kcal/mol、2 kcal/mol 或 1 kcal/mol 或更小) 之總打開能。在另一實例中，本揭露之 ASO 序列具有小於 7 kcal/mol (舉例而言，小於 6 kcal/mol、5 kcal/mol、4 kcal/mol、3 kcal/mol、2 kcal/mol 或 1 kcal/mol 或更小) 之總打開能。在另一實例中，本揭露之 ASO 序列具有小於 6 kcal/mol (舉例而言，小於 5 kcal/mol、4 kcal/mol、3 kcal/mol、2 kcal/mol 或 1 kcal/mol 或更小) 之總打開能。在另一實例中，本揭露之 ASO 序列具有小於 5 kcal/mol (舉例而言，小於 4 kcal/mol、3 kcal/mol、2 kcal/mol 或 1 kcal/mol 或更小) 之總打開能。在另一實例中，本揭露之 ASO 序列具有小於 4 kcal/mol (舉例而言，小於 3 kcal/mol、2 kcal/mol 或 1 kcal/mol 或更小) 之總打開能。在另一實例中，本揭露之 ASO 序列具有小於 3 kcal/mol (舉例而言，小於 2 kcal/mol 或 1 kcal/mol 或更小) 之總打開能。在另一實例中，本揭露之 ASO 序列具有小於 2 kcal/mol (舉例而言，1 kcal/mol 或更小) 之總打開能。在另一實例中，本揭露之 ASO 序列具有小於 1 kcal/mol 之總打開能。
此外，本文揭示具有大於 -41 kcal/mol (舉例而言大於 -40 kcal/mol、-38 kcal/mol、-35 kcal/mol、-30 kcal/mol、-25 kcal/mol、-20 kcal/mol、-15 kcal/mol、-10 kcal/mol、-5 kcal/mol、-4 kcal/mol、-3 kcal/mol、-2 kcal/mol、-1 kcal/mol 或更大) 之雙股形成之能量/來自雙股形成的能量的 ASO 序列。在其他實例中，本揭露之 ASO 序列具有大於 -38 kcal/mol (舉例而言 -35 kcal/mol、-30 kcal/mol、-25 kcal/mol、-20 kcal/mol、-15 kcal/mol、-10 kcal/mol、-5 kcal/mol、-4 kcal/mol、-3 kcal/mol、-2 kcal/mol、-1 kcal/mol 或更大) 之來自雙股形成的能量。在一些實例中，本揭露之 ASO 序列具有大於 -35 kcal/mol (舉例而言大於 -30 kcal/mol、-25 kcal/mol、-20 kcal/mol、-15 kcal/mol、-10 kcal/mol、-5 kcal/mol、-4 kcal/mol、-3 kcal/mol、-2 kcal/mol、-1 kcal/mol 或更大) 之來自雙股形成的能量。在特定實例中，本揭露之 ASO 序列具有大於 -30 kcal/mol (舉例而言大於 -25 kcal/mol、-20 kcal/mol、-15 kcal/mol、-10 kcal/mol、-5 kcal/mol、-4 kcal/mol、-3 kcal/mol、-2 kcal/mol、-1 kcal/mol 或更大) 之來自雙股形成的能量。在另一實例中，本揭露之 ASO 序列具有大於 -25 kcal/mol (舉例而言大於 -20 kcal/mol、-15 kcal/mol、-10 kcal/mol、-5 kcal/mol、-4 kcal/mol、-3 kcal/mol、-2 kcal/mol、-1 kcal/mol 或更大) 之來自雙股形成的能量。在另一實例中，本揭露之 ASO 序列具有大於 -20 kcal/mol (舉例而言大於 -15 kcal/mol、-10 kcal/mol、-5 kcal/mol、-4 kcal/mol、-3 kcal/mol、-2 kcal/mol、-1 kcal/mol 或更大) 之來自雙股形成的能量。在另一實例中，本揭露之 ASO 序列具有大於 -15 kcal/mol (舉例而言大於 -10 kcal/mol、-5 kcal/mol、-4 kcal/mol、-3 kcal/mol、-2 kcal/mol、-1 kcal/mol 或更大) 之來自雙股形成的能量。在另一實例中，本揭露之 ASO 序列具有大於 -10 kcal/mol (舉例而言大於 -5 kcal/mol、-4 kcal/mol、-3 kcal/mol、-2 kcal/mol、-1 kcal/mol 或更大) 之來自雙股形成的能量。在另一實例中，本揭露之 ASO 序列具有大於 -5 kcal/mol (舉例而言大於 -4 kcal/mol、-3 kcal/mol、-2 kcal/mol、-1 kcal/mol 或更大) 之來自雙股形成的能量。在另一實例中，本揭露之 ASO 序列具有大於 -4 kcal/mol (舉例而言大於 -3 kcal/mol、-2 kcal/mol、-1 kcal/mol 或更大) 之來自雙股形成的能量。在另一實例中，本揭露之 ASO 序列具有大於 -3 kcal/mol (舉例而言大於 -3 kcal/mol、-2 kcal/mol、-1 kcal/mol 或更大) 之來自雙股形成的能量。在另一實例中，本揭露之 ASO 序列具有大於 -2 kcal/mol (舉例而言大於 -2 kcal/mol、-1 kcal/mol 或更大) 之來自雙股形成的能量。在另一實例中，本揭露之 ASO 序列具有大於 -1 kcal/mol 之來自雙股形成的能量。
此外，本揭露亦涉及具有大於-30.5 kcal/mol (舉例而言，大於-27 kcal/mol、-24 kcal/mol、-20 kcal/mol、-15 kcal/mol、-10 kcal/mol、-5 kcal/mol、-4 kcal/mol、-3 kcal/mol、-2 kcal/mol、-1 kcal/mol 或更大) 之總結合自由能的 ASO 序列。在一些實例中，本揭露之 ASO 序列具有大於 -27 kcal/mol (舉例而言，大於 -24 kcal/mol、-20 kcal/mol、-15 kcal/mol、-10 kcal/mol、-5 kcal/mol、-4 kcal/mol、-3 kcal/mol、-2 kcal/mol、-1 kcal/mol 或更大) 之總結合自由能。在又另一實例中，本揭露之 ASO 序列具有大於 -24 kcal/mol (舉例而言，大於 -20 kcal/mol、-15 kcal/mol、-10 kcal/mol、-5 kcal/mol、-4 kcal/mol、 -3 kcal/mol、-2 kcal/mol、-1 kcal/mol 或更大) 之總結合自由能。在另一實例中，本揭露之 ASO 序列具有大於 -20 kcal/mol (舉例而言，大於 -15 kcal/mol、-10 kcal/mol、-5 kcal/mol、-4 kcal/mol、-3 kcal/mol、-2 kcal/mol、-1 kcal/mol 或更大) 之總結合自由能。在另一實例中，本揭露之 ASO 序列具有大於 -15 kcal/mol (舉例而言，大於 -10 kcal/mol、-5 kcal/mol、-4 kcal/mol、-3 kcal/mol、-2 kcal/mol、-1 kcal/mol 或更大) 之總結合自由能。在另一實例中，本揭露之 ASO 序列具有大於 -10 kcal/mol (舉例而言，大於 -5 kcal/mol、-4 kcal/mol、-3 kcal/mol、-2 kcal/mol、-1 kcal/mol 或更大) 之總結合自由能。在另一實例中，本揭露之 ASO 序列具有大於 -5 kcal/mol (舉例而言，大於 -4 kcal/mol、-3 kcal/mol、-2 kcal/mol、-1 kcal/mol 或更大) 之總結合自由能。在另一實例中，本揭露之 ASO 序列具有大於 -4 kcal/mol (舉例而言，大於 -3 kcal/mol、-2 kcal/mol、-1 kcal/mol 或更大) 之總結合自由能。在另一實例中，本揭露之 ASO 序列具有大於 -3 kcal/mol (舉例而言，大於 -3 kcal/mol、-2 kcal/mol、-1 kcal/mol 或更大) 之總結合自由能。在另一實例中，本揭露之 ASO 序列具有大於 -2 kcal/mol (舉例而言，大於 -2 kcal/mol、-1 kcal/mol 或更大) 之總結合自由能。在另一實例中，本揭露之 ASO 序列具有大於 -1 kcal/mol 之總結合自由能。
此外，本揭露亦考慮了具有小於 60% (舉例而言，小於 55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1% 或更小) 之 GC 含量的 ASO 序列。在其他實例中，ASO 序列具有小於 55% (舉例而言，小於 50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1% 或更小) 之 GC 含量。在再其他實例中，ASO 序列具有小於 50% (舉例而言，小於 45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1% 或更小) 之 GC 含量。在特定實例中，ASO 序列具有小於 45% (舉例而言，小於 40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1% 或更小) 之 GC 含量。在另一實例中，ASO 序列具有小於 40% (舉例而言，小於 35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1% 或更小) 之 GC 含量。在另一實例中，ASO 序列具有小於 35% (舉例而言，小於 30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1% 或更小) 之 GC 含量。在另一實例中，ASO 序列具有小於 30% (舉例而言，小於 25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1% 或更小) 之 GC 含量。在另一實例中，ASO 序列具有小於 35% (舉例而言，小於 30%、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1% 或更小) 之 GC 含量。在另一實例中，ASO 序列具有小於 25% (舉例而言，小於 20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%、1% 或更小) 之 GC 含量。在另一實例中，ASO 序列具有小於 20% (舉例而言，小於 15%、10%、5%、4%、3%、2%、1% 或更小) 之 GC 含量。在另一實例中，ASO 序列具有小於 15% (舉例而言，小於 10%、5%、4%、3%、2%、1% 或更小) 之 GC 含量。在另一實例中，ASO 序列具有小於 10% (舉例而言，小於 5%、4%、3%、2%、1% 或更小) 之 GC 含量。在另一實例中，ASO 序列具有小於 5% (舉例而言，小於 4%、3%、2%、1% 或更小) 之 GC 含量。在另一實例中，ASO 序列具有小於 4% (舉例而言，小於 3%、2%、1% 或更小) 之 GC 含量。在另一實例中，ASO 序列具有小於 3% (舉例而言，小於 2%、1% 或更小) 之 GC 含量。在另一實例中，ASO 序列具有小於 2% (舉例而言，小於 1% 或更小) 之 GC 含量。在另一實例中，ASO 序列具有小於 1% 之 GC 含量。
判定生物分子諸如 RNA分子 (舉例而言本揭露之 ASO RNA 分子或其實質上互補的序列) 之熱力學特徵的方法為本領域中眾所周知的。舉例而言， Gruber 等人( Nucleic Acids Research36:W70-4, 2008) 概述了一系列工具，其可用於設計 RNA 序列以及分析 RNA 分子之折疊及熱力學特徵。Gruber 等人之披露內容由於其涉及判定 RNA 分子之熱力學性質的方法藉由引用併入本文。 Grik2 mRNA 二級結構
RNA 誘導的緘默複合體 (RISC) 為一種核糖核蛋白顆粒，其由以下構成：單股小 RNA (smRNA)，包括短干擾 RNA (siRNA)；及具有內切核苷酸活性的 argonaut 蛋白，其能夠切割與 smRNA 互補的 mRNA (舉例而言 ASO，諸如舉例而言，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA 或 shmiRNA) (Pratt AJ, MacRae IJ.The RNA-induced silencing complex: a versatile gene-silencing machine. J Biol Chem.; 284(27):17897‐17901, 2009；其整體併入本文)。已表明，RISC 裝載受控制 mRNA 敲落程度的多種因素的影響。標靶 mRNA 之核苷酸序列及反義序列可能促使 RISC 裝載不良、雙股解旋及特異性降低。標靶位點二級結構可能影響 RISC 標靶退火，而與 smRNA 互補性無關。不希望受理論束縛，經判定具有低鹼基配對概率及/或高位置熵之 Grik2轉錄物的某些標靶位點二級結構 (在圖 1A 及圖 1B 的比例尺中陰影強度增加；亦參見實例 1) 被鑑別出並優先用於導引序列 (舉例而言，反義序列) 設計。此等區域包括清晰描繪的環區域 (「質心環」或簡稱「環」) 以及描繪為莖樣 (「未配對」) 區域的區域，且各區域在二級 Grik2mRNA 結構內鹼基配對的可能性都很低。優先考慮經預測在一個或多個物種 (至少為人類，且在一些情況下在至少一個以上的物種 Grik2轉錄物，諸如小鼠或猴子中) 中具有低鹼基配對概率及/或高位置熵的區域。事實上，經預測之二級 Grik2mRNA 結構 (表 4 及圖 1B) 之許多環區域及莖樣未配對區域含有有利的區域，此等區域表現出低能量需求，舉例而言小於 10，且甚至小於 7.5 kcal/mol 標靶打開能，如藉由 RNAup 或等效計算所判定的，其在與各種 siRNA 及 miRNA 導引序列的配對安排中為有利的 (參見實例 1B、表 12 及表 13)。
因此， Grik2mRNA 之二級結構部分或區域 (舉例而言環區域及未配對區域) 內的 Grik2標靶核酸已被鑑別為當與本揭露之 ASO 藥劑 (舉例而言，SEQ ID NO: 1-108 中之任一個) 雜交時能夠降低 Grik2之表現，並為本發明之實施例。關於 Grik2mRNA 內之示例性二級結構區域，請參見表 4 及圖 1B。
因此，所揭示之 ASO 藥劑可結合於 Grik2mRNA 內之二級結構 (舉例而言，環結構或未配對的二級結構)。舉例而言，ASO 藥劑可結合於 Grik2mRNA 之二級結構內的環區域，諸如舉例而言位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 494 至 524或 SEQ ID NO: 116 之位置 201 至 231 處的環 1 區域。環 1 區域可具有 SEQ ID NO: 145 之核酸序列，或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 145 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。因此，所揭示之 ASO 藥劑可以在 Grik2mRNA 之環 1 區域的至少一部分內結合。舉例而言，靶向 SEQ ID NO: 115 或 116 之環 1 區域 (SEQ ID NO: 145) 之一部分或區域內的核酸序列的 Grik2ASO 藥劑可以為 siRNA G0 (SEQ ID NO: 1) 或其變體，該變體與 siRNA G0 (SEQ ID NO: 1) 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。
在其他情況下，ASO 藥劑可以結合於位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 1098 至 1124或 SEQ ID NO: 116 之位置 805 至 831 處的環 2 區域。環 2 區域可具有 SEQ ID NO: 146 之核酸序列，或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 146 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。因此，所揭示之 ASO 藥劑可以在 Grik2mRNA 之環 2 區域的至少一部分內結合。舉例而言，靶向 SEQ ID NO: 115 或 116 之環 2 區域 (SEQ ID NO: 146) 之一部分或區域內的核酸序列的 Grik2ASO 藥劑可以為 siRNA TT (SEQ ID NO: 4) 或其變體，該變體與 siRNA TT (SEQ ID NO: 4) 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。
ASO 藥劑亦可為結合於位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 1197 至 1237或 SEQ ID NO: 116之位置 904 至 944 處的環 3 區域的 ASO 藥劑。環 3 區域可具有 SEQ ID NO: 147 之核酸序列，或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 147 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。因此，所揭示之 ASO 藥劑可以在 Grik2mRNA 之環 3 區域的至少一部分內結合。舉例而言，靶向 SEQ ID NO: 115 或 116 之環 3 區域 (SEQ ID NO: 147) 之一部分或區域內的核酸序列的 Grik2ASO 藥劑為 siRNA G1 (SEQ ID NO: 5) 或 siRNA G2 (SEQ ID NO: 6) 或其變體，該變體與 siRNA G1 (SEQ ID NO: 5)或 siRNA G2 (SEQ ID NO: 6) 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。
在另外的實例中，ASO 藥劑可以結合於位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 1543 至 1569或 SEQ ID NO: 116 之位置 1250 至 1276 處的環 4 區域。環 4 區域可具有 SEQ ID NO: 148 之核酸序列，或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 148 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。因此，所揭示之 ASO 藥劑可以在 Grik2mRNA 之環 4 區域的至少一部分內結合。
ASO 藥劑亦可為結合於位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 1667 至 1731或 SEQ ID NO: 116 之位置 1374 至 1438 處的環 5 區域的 ASO 藥劑。環 5 區域可具有 SEQ ID NO: 149 之核酸序列，或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 149 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。因此，所揭示之 ASO 藥劑可以在 Grik2mRNA 之環 5 區域的至少一部分內結合。舉例而言，靶向 SEQ ID NO: 115 或 116 之環 5 區域 (SEQ ID NO: 149) 之一部分或區域內的核酸序列的 Grik2ASO 藥劑為 siRNA GD (SEQ ID NO: 7) 或 siRNA MU (SEQ ID NO: 96) 或其變體，該變體與 siRNA GD (SEQ ID NO: 7)7) 或 siRNA MU (SEQ ID NO: 96) 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。
在另外的實例中，ASO 藥劑可為結合於位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 1767 至 1830或 SEQ ID NO: 116 之位置 1474 至 1537 處的環 6 區域的 ASO 藥劑。環 6 區域可具有 SEQ ID NO: 150 之核酸序列，或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 150 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。因此，所揭示之 ASO 藥劑可以在 Grik2mRNA 之環 6 區域的至少一部分內結合。舉例而言，靶向 SEQ ID NO: 115 或 116 之環 6 區域 (SEQ ID NO: 150) 之一部分或區域內的核酸序列的 Grik2ASO 藥劑為 siRNA G3 (SEQ ID NO: 8)、siRNA MS (SEQ ID NO: 99) 或 siRNA MT (SEQ ID NO: 98) 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：siRNA G3 (SEQ ID NO: 8)、siRNA MS (SEQ ID NO: 99) 或 siRNA MT (SEQ ID NO: 98)。
ASO 藥劑亦可為結合於位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 2693 至 2716或 SEQ ID NO: 116 之位置 2400 至 2423 處的環 7 區域的 ASO 藥劑。環 7 區域可具有 SEQ ID NO: 151 之核酸序列，或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 151 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。因此，所揭示之 ASO 藥劑可以在 Grik2mRNA 之環 7 區域的至少一部分內結合。
ASO 藥劑亦可為結合於位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 2916 至 2955或 SEQ ID NO: 116 之位置 2623 至 2662 處的環 8 區域的 ASO 藥劑。環 8 區域可具有 SEQ ID NO: 152 之核酸序列，或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 152 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。因此，所揭示之 ASO 藥劑可以在 Grik2mRNA 之環 8 區域的至少一部分內結合。舉例而言，靶向 SEQ ID NO: 115 或 116 之環 8 區域 (SEQ ID NO: 152) 之一部分或區域內的核酸序列的 Grik2ASO 藥劑為 siRNA G4 (SEQ ID NO: 9) 或其變體，該變體與 siRNA G4 (SEQ ID NO: 9) 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。
此外，ASO 藥劑可為結合於位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 3065 至 3091 的環 9 區域的 ASO 藥劑。環 9 區域可具有 SEQ ID NO: 153 之核酸序列，或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 153 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。因此，所揭示之 ASO 藥劑可以在 Grik2mRNA 之環 9 區域的至少一部分內結合。舉例而言，靶向 SEQ ID NO: 115 或 116 之環 9 區域 (SEQ ID NO: 153) 之一部分或區域內的核酸序列的 Grik2 ASO 藥劑為 siRNA YA (SEQ ID NO: 63) 或其變體，該變體與 siRNA YA (SEQ ID NO: 63) 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。
另外，ASO 藥劑可為結合於位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 3141 至 3163 的環 10 區域的 ASO 藥劑。環 10 區域可具有 SEQ ID NO: 154 之核酸序列，或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 154 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。因此，所揭示之 ASO 藥劑可以在 Grik2mRNA 之環 10 區域的至少一部分內結合。
在進一步的實例中，ASO 藥劑可為結合於位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 3382 至 3413 的環 11 區域的 ASO 藥劑。環 11 區域可具有 SEQ ID NO: 155 之核酸序列，或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 155 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。因此，所揭示之 ASO 藥劑可以在 Grik2mRNA 之環 11 區域的至少一部分內結合。舉例而言，靶向 SEQ ID NO: 115 或 116 之環 11 區域 (SEQ ID NO: 155) 之一部分或區域內的核酸序列的 Grik2ASO 藥劑為 siRNA TS (SEQ ID NO: 10) 或其變體，該變體與 siRNA TS (SEQ ID NO: 10) 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。
ASO 藥劑亦可為結合於位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 3788 至 3856 處之環 12 區域。環 12 區域可具有 SEQ ID NO: 156 之核酸序列，或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 156 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。因此，所揭示之 ASO 藥劑可以在 Grik2mRNA 之環 12 區域的至少一部分內結合。舉例而言，靶向 SEQ ID NO: 115 或 116 之環 2 區域 (SEQ ID NO: 156) 之一部分或區域內的核酸序列的 Grik2ASO 藥劑為 siRNA TR (SEQ ID NO: 11) 或其變體，該變體與 siRNA TR (SEQ ID NO: 11) 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。
ASO 藥劑可為結合於位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 4550 至 4592 的環 13 區域的 ASO 藥劑。環 13 區域可具有 SEQ ID NO: 157 之核酸序列，或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 157 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。因此，所揭示之 ASO 藥劑可以在 Grik2mRNA 之環 13 區域的至少一部分內結合。
在進一步的實例中，ASO 藥劑可為結合於位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 4363 至 4386 的環 14 區域的 ASO 藥劑。環 14 區域可具有 SEQ ID NO: 158 之核酸序列，或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 158 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。因此，所揭示之 ASO 藥劑可以在 Grik2mRNA 之環 14 區域的至少一部分內結合。
可替代地，所揭示之 ASO 藥劑可為結合於 Grik2mRNA 之二級結構內的未配對區域，諸如舉例而言，位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 2209 至 2287 或 SEQ ID NO: 116 之位置 1916 至 1994。未配對區域 1 可具有 SEQ ID NO: 159 之核酸序列，或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 159 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。因此，本揭露內容之 ASO 藥劑可在 Grik2mRNA 之未配對區域 1 的至少一部分內結合。舉例而言，靶向 SEQ ID NO: 115 或 116 之未配對區域 1 (SEQ ID NO: 159) 之一部分或區域內的核酸序列的 Grik2ASO 藥劑為 siRNA TP (SEQ ID NO: 13)、siRNA TO (SEQ ID NO: 14)、siRNA MR (SEQ ID NO: 72) 或 siRNA MQ (SEQ ID NO: 73) 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：siRNA TP (SEQ ID NO: 13)、siRNA TO (SEQ ID NO: 14)、siRNA MR (SEQ ID NO: 72) 或 siRNA MQ (SEQ ID NO: 73)。
在進一步的實例中，ASO 藥劑可為結合於位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 2355 至 2391或 SEQ ID NO: 116 之位置 2062 至 2098 處的未配對區域 2 的 ASO 藥劑。未配對區域 2 可具有 SEQ ID NO 160 之核酸序列，或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 160 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。因此，所揭示之 ASO 藥劑可在 Grik2mRNA 之未配對區域 2 的至少一部分內結合。
在進一步的實例中，ASO 藥劑可為結合於位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 3324 至 3368 處的未配對區域 3 的 ASO 藥劑。未配對區域 3 可具有 SEQ ID NO: 161 之核酸序列，或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 161 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。因此，本揭露內容之 ASO 藥劑可在 Grik2mRNA 之未配對區域 3 的至少一部分內結合。舉例而言，靶向 SEQ ID NO: 115 或 116 之未配對區域 3 (SEQ ID NO: 161) 之一部分或區域內的核酸序列的 Grik2ASO 藥劑為 siRNA G5 (SEQ ID NO: 15) 或其變體，該變體與 siRNA G5 (SEQ ID NO: 15) 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。
本揭露之 ASO 藥劑亦可為結合於位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 3587 至 3639 處的未配對區域 4 的 ASO 藥劑。未配對區域 4 可具有 SEQ ID NO: 162 之核酸序列，或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 162 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。ASO 藥劑可在 Grik2mRNA 之未配對區域 4 的至少一部分內結合。舉例而言，靶向 SEQ ID NO: 115 或 116 之未配對區域 4 (SEQ ID NO: 162) 之一部分或區域內的核酸序列的 Grik2ASO 藥劑為 siRNA TN (SEQ ID NO: 16) 或其變體，該變體與 siRNA TN (SEQ ID NO: 16) 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。
另外，ASO 藥劑可為結合於位於 SEQ ID NO: 115 之核苷酸位置 3686 至 3713 處的未配對區域 5 的 ASO 藥劑。未配對區域 5 可具有 SEQ ID NO: 163 之核酸序列，或可為其變體，該變體與 SEQ ID NO: 163 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，如表 4 中所示。ASO 藥劑可在 Grik2mRNA 之未配對區域 5 的至少一部分內結合。舉例而言，靶向 SEQ ID NO: 115 或 116 之未配對區域 5 (SEQ ID NO: 163) 之一部分或區域內的核酸序列的 Grik2ASO 藥劑為 siRNA TM (SEQ ID NO: 17) 或其變體，該變體與 siRNA TM (SEQ ID NO: 17) 之核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。 表 4 ：編碼標靶 Grik2mRNA 序列之 cDNA 序列
說明 生物來源 RefSeq SEQ ID NO
Grik2mRNA，變體 1； 包括 5' UTR 及 3' UTR 智人 NM_021956.1:4592 115
Grik2mRNA，變體 1；(僅 CDS) 對應於 SEQ ID NO: 116 之 nt 位置 294 至 3020 智人   NM_021956.294-3020 116
Grik2mRNA，變體 2 智人   NM_175768.3:294-2903 117
Grik2mRNA，變體 3 智人   NM_001166247.1:294-2972 118
Grik2mRNA，變體 4 家鼷鼠 NM_001111268 119
Grik2mRNA，變體 5 家鼷鼠 NM_010349 120
Grik2mRNA，變體 6 家鼷鼠 NM_001358866 121
Grik2mRNA，變體 7 恆河獼猴 XM_015136995.2 122
Grik2mRNA，變體 8 恆河獼猴 XM_015136997.2 123
Grik2mRNA，變體 9 溝鼠 NM_019309.2 124
編碼成熟 GluK2 肽 CDS 之 Grik2mRNA 智人 NM_021956.1:4592 125
Grik2mRNA，5' UTR 智人 NM_021956.1:4592 126
Grik2mRNA，3' UTR 智人 NM_021956.1:4592 127
Grik2mRNA，訊息肽序列 智人 NM_021956.1:4592 128
Grik2mRNA，外顯子 1； SEQ ID NO: 115 智人 NM_021956.1:4592 129
Grik2mRNA，外顯子 2； SEQ ID NO: 115 處之 nt 409 至 576 智人 NM_021956.1:4592 130
Grik2mRNA，外顯子 3； SEQ ID NO: 115 處之 nt 409 至 576 智人 NM_021956.1:4592 131
Grik2mRNA，外顯子 4； SEQ ID NO: 115 處之 nt 835 至 1016 智人 NM_021956.1:4592 132
Grik2mRNA，外顯子 5； SEQ ID NO: 115 處之 nt 1017 至 1070 智人 NM_021956.1:4592 133
Grik2mRNA，外顯子 6； SEQ ID NO: 115 處之 nt 1071 至 1244 智人 NM_021956.1:4592 134
Grik2mRNA，外顯子 7； SEQ ID NO: 115 處之 nt 1245 至 1388 智人 NM_021956.1:4592 135
Grik2mRNA，外顯子 8； SEQ ID NO: 115 處之 nt 1389 至 1496 智人 NM_021956.1:4592 136
Grik2mRNA，外顯子 9； SEQ ID NO: 115 處之 nt 1497 至 1610 智人 NM_021956.1:4592 137
Grik2mRNA，外顯子 10； SEQ ID NO: 115 處之 nt 1611 至 1817 智人 NM_021956.1:4592 138
Grik2mRNA，外顯子 11； SEQ ID NO: 115 處之 nt 1818 至 2041 智人 NM_021956.1:4592 139
Grik2mRNA，外顯子 12； SEQ ID NO: 115 處之 nt 2042 至 2160 智人 NM_021956.1:4592 140
Grik2mRNA，外顯子 13； SEQ ID NO: 115 處之 nt 2161 至 2378 智人 NM_021956.1:4592 141
Grik2mRNA，外顯子 14； SEQ ID NO: 115 處之 nt 2379 至 2604 智人 NM_021956.1:4592 142
Grik2mRNA，外顯子 15； SEQ ID NO: 115 處之 nt 2605 至 2855 智人 NM_021956.1:4592 143
Grik2mRNA，外顯子 16； SEQ ID NO: 115 處之 nt 2856 至 4592 智人 NM_021956.1:4592 144
Grik2mRNA，環 1 區域；SEQ ID NO: 116 之 nt 494 至 524；SEQ ID NO: 116 之 nt 201 至 231   智人 NM_021956.1:4592 145
Grik2mRNA，環 2 區域；SEQ ID NO: 116 之 nt 1098 至 1124；SEQ ID NO: 116 之 nt 805 至 831   智人 NM_021956.1:4592 146
Grik2mRNA，環 3 區域；SEQ ID NO: 116 之 nt 1197 至 1237；SEQ ID NO: 116 之 nt 904 至 944   智人 NM_021956.1:4592 147
Grik2mRNA，環 4 區域；SEQ ID NO: 116 之 nt 1543 至 1569；SEQ ID NO: 116 之 nt 1250 至 1276   智人 NM_021956.1:4592 148
Grik2mRNA，環 5 區域；SEQ ID NO: 116 之 nt 1667 至 1731；SEQ ID NO: 116 之 nt 1374 至 1438   智人 NM_021956.1:4592 149
Grik2mRNA，環 6 區域；SEQ ID NO: 116 之 nt 1767 至 1830；SEQ ID NO: 116 之 nt 1474 至 1537   智人 NM_021956.1:4592 150
Grik2mRNA，環 7 區域；SEQ ID NO: 116 之 nt 2693 至 2716；SEQ ID NO: 116 之 nt 2400 至 2423   智人 NM_021956.1:4592 151
Grik2mRNA，環 8 區域；SEQ ID NO: 116 之 nt 2916 至 2955；SEQ ID NO: 116 之 nt 2623 至 2662   智人 NM_021956.1:4592 152
Grik2mRNA，環 9 區域；SEQ ID NO: 116 之 nt 3065 至 3091；在 3' UTR 區域內    智人 NM_021956.1:4592 153
Grik2mRNA，環 10 區域；SEQ ID NO: 116 之 nt 3141 至 3163；在 3' UTR 區域內    智人 NM_021956.1:4592 154
Grik2mRNA，環 11 區域；SEQ ID NO: 116 之 nt 3382 至 3413；在 3' UTR 區域內    智人 NM_021956.1:4592 155
Grik2mRNA，環 12 區域；SEQ ID NO: 116 之 nt 3788 至 3856；在 3' UTR 區域內    智人 NM_021956.1:4592 156
Grik2mRNA，環 13 區域；SEQ ID NO: 116 之 nt 4550 至 4592；在 3' UTR 區域內    智人 NM_021956.1:4592 157
Grik2mRNA，環 14 區域；SEQ ID NO: 116 之 nt 4363 至 4386；在 3' UTR 區域內    智人 NM_021956.1:4592 158
Grik2mRNA，未配對區域 1；SEQ ID NO: 116 之 nt 2209 至 2287；SEQ ID NO: 116 智人 NM_021956.1:4592 159
Grik2mRNA，未配對區域 2；SEQ ID NO: 116 之 nt 2355 至 2391；SEQ ID NO: 116 之 nt 2062 至 2098 智人 NM_021956.1:4592 160
Grik2mRNA，未配對區域 3；SEQ ID NO: 116 之 nt 3324 至 3368；在 3' UTR 區域內 智人 NM_021956.1:4592 161
Grik2mRNA，未配對區域 4；SEQ ID NO: 116 之 nt 3587 至 3639；在 3' UTR 區域內 智人 NM_021956.1:4592 162
Grik2mRNA，未配對區域 5；SEQ ID NO: 116 之 nt 3686 至 3713；在 3' UTR 區域內 智人 NM_021956.1:4592 163
本揭露之 ASO 藥劑亦可完全或實質上互補地結合於由選自 SEQ ID NO: 582 至 681 (參見表 2) 之核苷酸序列編碼的 Grik2mRNA (舉例而言，SEQ ID NO: 115) 之任一區域或由 SEQ ID NO: 164 至 581 中描述的核苷酸序列編碼的 Grik2mRNA 的任一區域。舉例而言，本揭露之 ASO 藥劑可為結合於 Grik2mRNA (舉例而言 SEQ ID NO: 115) 之任一區域的 ASO 藥劑，該任一區域選自 SEQ ID NO: 582 至 681 或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 582 至 681 中之任一個的核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，本揭露之 ASO 藥劑可為結合於 Grik2mRNA (舉例而言 SEQ ID NO: 115) 之任一區域的 ASO 藥劑，該任一區域選自 SEQ ID NO: 582 至 681 或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 582 至 681 中之任一個的核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，本揭露之 ASO 藥劑可為結合於 Grik2mRNA (舉例而言 SEQ ID NO: 115) 之任一區域的 ASO 藥劑，該任一區域選自 SEQ ID NO: 582 至 681 或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 582 至 681 中之任一個的核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，本揭露之 ASO 藥劑可為結合於 Grik2mRNA (舉例而言 SEQ ID NO: 115) 之任一區域的 ASO 藥劑，該任一區域選自 SEQ ID NO: 582 至 681。在另一實例中，本揭露之 ASO 藥劑可為結合於 Grik2mRNA (舉例而言 SEQ ID NO: 115) 之任一區域的 ASO 藥劑，該任一區域選自 SEQ ID NO: 164 至 581 或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 164 至 581 中之任一個的核酸序列具有至少 85% (舉例而言，至少 86%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，本揭露之 ASO 藥劑可為結合於 Grik2mRNA (舉例而言 SEQ ID NO: 115) 之任一區域的 ASO 藥劑，該任一區域選自 SEQ ID NO: 164 至 581 或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 164 至 581 中之任一個的核酸序列具有至少 90% (舉例而言，至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，本揭露之 ASO 藥劑可為結合於 Grik2mRNA (舉例而言 SEQ ID NO: 115) 之任一區域的 ASO 藥劑，該任一區域選自 SEQ ID NO: 164 至 581 或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 164 至 581 中之任一個的核酸序列具有至少 95% (舉例而言，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性。在另一實例中，本揭露之 ASO 藥劑可為結合於 Grik2mRNA (舉例而言 SEQ ID NO: 115) 之任一區域的 ASO 藥劑，該任一區域選自 SEQ ID NO: 164 至 581。 經修飾之寡核苷酸
本文揭示之 ASO 藥劑可含有天然存在的及/或經修飾的核苷酸。寡核苷酸可經修飾，特定而言經化學修飾，以便增加活體內穩定性及/或治療效率。將提高本揭露之 ASO 藥劑的功效的修飾，諸如穩定化修飾及/或減少 RNase H 活化以便避免經靶向轉錄物之降解的修飾為本領域中已知的 (參見舉例而言 Bennett 及 Swayze, Annu.Rev. Pharmacol.Toxicol.50:259-293, 2010；及 Juliano, Nucleic Acids Res.19;44(14):6518-48, 2016)。特定而言，在本揭露之上下文中使用的寡核苷酸可包括經修飾之核苷酸。化學修飾可能發生在三個不同的位點：(i) 在磷酸基處，(ii) 在糖部分上，及/或 (iii) 在寡核苷酸之整個骨架結構上。通常，化學修飾包括骨架修飾、雜環修飾、糖修飾及結合策略。
舉例而言，寡核苷酸可選自由以下所組成之群組：寡脫氧核糖核苷酸、寡核糖核苷酸、小調節 RNA (sRNA)、U7 或 U1 介導之 ASO 或其結合產物，諸如肽結合或奈米顆粒複合的 ASO，藉由骨架修飾進行化學修飾的寡核苷酸，諸如嗎啉代、磷酸二酰胺嗎啉代寡聚物 (Phosphorodiamidate morpholinos，PMO)、肽核酸 (PNA)、硫代磷酸酯 (PS) 寡核苷酸、立體化學純的硫代磷酸酯 (PS) 寡核苷酸、胺基磷酸酯修飾之寡核苷酸、硫代胺基磷酸酯修飾之寡核苷酸及膦酸甲酯修飾之寡核苷酸；藉由雜環修飾進行化學修飾的寡核苷酸，諸如雙環修飾之寡核苷酸、雙環核酸 (BNA)、三環修飾之寡核苷酸、三環 DNA 反義寡核苷酸 (ASO)，藉由核鹼基修飾，諸如嘧啶核鹼基上的 5-甲基取代、5-取代之嘧啶類似物、2-硫代胸腺嘧啶修飾之寡核苷酸及嘌呤修飾之寡核苷酸；藉由糖修飾進行化學修飾的寡核苷酸，諸如鎖核酸 (LNA) 寡核苷酸、2',4'-亞甲氧基橋接之核酸 (BNA)、亞乙基橋接之核酸 (ENA)、限制性乙基 (cEt) 寡核苷酸、2'-修飾之 RNA、2'- 及 4'- 修飾之寡核苷酸，諸如 2'-O-Me RNA (2'-OMe)、2'-O-甲氧基乙基 RNA (MOE)、2'-氟 RNA (FRNA) 及 4' -硫代修飾之 DNA 及 RNA；藉由結合策略進行化學修飾的寡核苷酸，諸如 N-乙酰半乳糖胺 (GalNAc) 寡核苷酸結合體，諸如 5'-GalNAc 及 3'-GalNAc ASO 結合體、脂質寡核苷酸結合體、細胞穿透肽 (CPP) 寡核苷酸結合體、經靶向寡核苷酸結合體、抗體-寡核苷酸結合體、聚合物-寡核苷酸結合體，諸如具有聚乙二醇化及靶向配體之聚合物-寡核苷酸結合體；以及藉由化學修飾及結合策略，舉例而言以下中所描述：Bennett 及 Swayze, 2010 ( 同上)；Wan 及 Seth, J Med Chem.59(21):9645-9667, 20116)；Juliano, 2016 ( 同上)；Lundin 等人, Hum Gene Ther.26(8):475-485, 2015)；及 Prakash, Chem Biodivers.8(9):1616-1641, 2011)。實際上，為了活體內使用，可以穩定寡核苷酸。「穩定的」寡核苷酸係指 (舉例而言，經由核酸外切酶或核酸內切酶) 對活體內降解具相對抗性之寡核苷酸。穩定化可隨長度或二級結構而變。特定而言，寡核苷酸穩定化可經由磷酸酯骨架修飾、磷酸二酯修飾、硫代磷酸酯 (PS) 骨架修飾、磷酸二酯及硫代磷酸酯修飾之組合、硫代胺基磷酸酯修飾、2' 修飾 (2'-O-Me、2'-O-(2-甲氧基乙基) (MOE) 修飾及 2'-氟修飾)、膦酸甲酯、硫代磷酸甲酯、二硫代磷酸酯、對乙氧基及其組合實現。
舉例而言，寡核苷酸可用為硫代磷酸酯衍生物 (用硫原子代替非橋接磷酰氧原子)，其對核酸酶消化具有增加的抗性。2'-甲氧基乙基 (MOE) 修飾 (諸如 IONIS Pharmaceuticals 商業化的經修飾骨架) 亦有效。另外地或可替代地，本揭露之寡核苷酸可包括完全、部分或組合的經修飾核苷酸，其為在糖之 2' 位置處具有取代之衍生物，特定而言具有以下化學修飾之衍生物：O-甲基 (2'-O-Me) 取代、2-甲氧基乙基 (2'-O-MOE) 取代、氟基 (2'-氟) 取代、氯基 (2'-Cl) 取代、溴基 (2'-Br) 取代、氰基 (2'-CN) 取代、三氟甲基 (2'-CF3) 取代、OCF3 基團 (2'-OCF3) 取代、OCN 基團 (2'-OCN) 取代、O-烷基 (2'-O-烷基) 取代、S-烷基 (2'-S-烷基) 取代、N-烷基 (2'-N-烷基) 取代、O-烯基 (2'-O-烯基) 取代、S-烯基 (2'-S-烯基) 取代、N-烯基 (2'-N-烯基) 取代、SOCH3 基團 (2'-SOCH3) 取代、SO2CH3 基團 (2'-SO2CH3) 取代、ONO2 基團 (2'-ONO2) 取代、NO2 基團 (2'-NO2) 取代、N3 基團 (2'-N3) 取代及/或 NH2 基團 (2'-NH2) 取代。另外地或可替代地，本揭露之寡核苷酸可包括完全或部分修飾的核苷酸，其中核糖部分用於產生鎖核酸 (LNA)，其中共價橋在核糖之 2' 氧及 4' 碳之間形成，從而將其固定在 3'-內切酶組態中。此等分子在生物介質中極其穩定，能夠諸如在 LNA 位於末端時活化 RNase H (Gapmer) 並與互補的 RNA 及 DNA 形成緊密雜交體。
在本揭露之上下文中使用的寡核苷酸可包括選自由以下所組成之群組的經修飾之核苷酸：LNA、2'-OMe 類似物、2'-O-Met、2'-O-(2-甲氧基乙基) (MOE) 寡聚物、2'-硫代磷酸酯類似物、2'-氟類似物、2'-Cl 類似物、2'-Br 類似物、2'-CN 類似物、2'-CF3 類似物、2'-OCF3 類似物、2'-OCN 類似物、2'-O-烷基類似物、2'-S-烷基類似物、2'-N-烷基類似物、2'-O-烯基類似物、2'-S-烯基類似物、2'-N-烯基類似物、2'-SOCH3 類似物、2'-SO2CH3 類似物、2'-ONO2 類似物、2'-NO2 類似物、2'-N3 類似物、2'-NH2 類似物、三環 (tc)-DNA、U7 短核 (sn) RNA、三環-DNA-寡反義分子及其組合 (美國臨時專利申請序號 61/212,384，關於：Tricyclo-DNA Antisense Oligonucleotides, Compositions and Methods for the Treatment of Disease, 提交於 2009 年 4 月 10 日，其全部內容藉由引用併入本文)。
特定而言，根據本揭露之寡核苷酸可為 LNA 寡核苷酸。術語「LNA」(鎖核酸)(或「LNA 寡核苷酸」) 係指含有一個或多個雙環、三環或多環核苷類似物的寡核苷酸，亦稱為 LNA 核苷酸及 LNA 類似物核苷酸。LNA 寡核苷酸、LNA 核苷酸及 LNA 類似物核苷酸一般描述於國際公開號 WO 99/14226 及後續申請案；國際公開號 WO 00/56746、WO 00/56748、WO 00/66604、WO 01/25248、WO 02/28875、WO 02/094250、WO 03/006475；美國專利號 6,043,060、6268490、6770748、6639051 及美國公開號 2002/0125241、2003/0105309、2003/0125241、2002/0147332、2004/0244840 及 2005/0203042，其全部藉由引用併入本文。LNA 寡核苷酸及 LNA 類似物寡核苷酸可商購自舉例而言位於 CO 80301 USA, Boulder, 6200 Lookout Road 之 Proligo LLC。
本揭露之其他形式的寡核苷酸為結合基於但不限於慢病毒或腺相關病毒的病毒轉移方法與諸如 U1 或 U7 之小核 RNA 分子偶合的寡核苷酸序列 (Denti, MA, 等人, 2008；Goyenvalle, A, 等人, 2004)。
本揭露之其他形式的寡核苷酸為肽核酸 (PNA)。在肽核酸中，寡核苷酸之脫氧核糖骨架經更類似於肽而非糖的骨架替換。各次單元或單體皆具有附接到此骨架之天然存在或非天然存在的鹼基。一種此類骨架係由經由酰胺鍵連接的 N-(2-胺基乙基)甘胺酸之重複單元構建。由於與脫氧核糖骨架之自由基偏離，此等化合物被命名為肽核酸 (PNA) (Dueholm 等人, New J. Chem., 1997, 21, 19-31)。PNA 結合 DNA 及 RNA 二者以形成 PNA/DNA 或 PNA/RNA 雙股。所得 PNA/DNA 或 PNA/RNA 雙股的結合親和力大於相應的 DNA/DNA、DNA/RNA 或 RNA/RNA 雙股，如由 Tm 所判定的。這種高熱穩定性可能歸因於 PNA 中之中性骨架導致電荷排斥的缺乏。PNA 之中性骨架亦導致 PNA/DNA(RNA) 雙股之 Tm 實際上與鹽濃度無關。因此，相比於高度依賴於離子強度的 DNA/DNA、DNA/RNA 或 RNA/RNA 雙股相互作用，PNA/DNA(RNA) 雙股相互作用提供了進一步的優勢。同型嘧啶 PNA 已顯示以反平行方向結合互補 DNA 或 RNA，從而形成具有高熱穩定性的 (PNA)2/DNA(RNA) 三鏈體 (參見舉例而言，Egholm, 等人, Science, 1991, 254, 1497；Egholm, 等人, J. Am. Chem.Soc., 1992, 114, 1895；Egholm, 等人, J. Am. Chem.Soc., 1992, 114, 9677)。除了增加的親和力外，PNA 亦被證明能以增加的特異性結合於 DNA 或 RNA。當 PNA/DNA 雙股錯配相對於 DNA/DNA 雙股解鏈時，可見 Tm 下降 8℃ 至 20℃。對於存在錯配的相應 DNA/DNA 雙股，看不到這種 Tm 下降幅度。PNA 股與 DNA 或 RNA 股之結合可在兩個方向之一上發生。當 5' 到 3' 方向上的 DNA 或 RNA 股與互補的 PNA 股結合使得 PNA 之羧基末端指向 DNA 或 RNA 之 5' 末端並且 PNA 之胺基末端指向 DNA 或 RNA 之 3' 末端時，該方向被稱為反平行。在平行方向上，PNA 之羧基末端及胺基末端恰好與 DNA 或 RNA 之 5'-3' 方向相反。與寡核苷酸相比，PNA 之另一優點為其聚酰胺骨架 (具有適當的核鹼基或與其附接的其他側鏈基團) 不被核酸酶或蛋白酶識別並且不被切割。因此，不同於核酸及肽，PNA 對酶的降解具有抗性。WO 92/20702 描述了一種肽核酸 (PNA) 化合物，其相比於相應的 DNA 更緊密地結合互補的 DNA 及 RNA 。PNA 已顯示出對互補 DNA 的強結合親和力及特異性 (Egholm, M., 等人, Chem.Soc., Chem.Commun., 1993, 800；Egholm, M., 等人, Nature, 1993, 365, 566；及 Nielsen, P., 等人Nucl.Acids Res., 1993, 21, 197)。此外，PNA 在細胞提取物中表現出核酸酶抗性及穩定性 (Demidov, V. V., 等人, Biochem.Pharmacol., 1994, 48, 1309-1313)。PNA 之修飾包括擴展的骨架 (Hyrup, B., 等人Chem.Soc., Chem.Commun., 1993, 518)、主幹及核鹼基之間的擴展接頭、酰胺鍵之逆轉 (Lagriffoul, P. H., 等人, Biomed.Chem.Lett., 1994, 4, 1081) 以及使用基於丙胺酸的對掌性骨架 (Dueholm, K. L, 等人, BioMed.Chem.Lett., 1994, 4, 1077)。肽核酸描述於美國專利號 5,539,082 及美國專利第 5,539,083 號。肽核酸進一步描述於美國專利號 5,766,855。
本揭露之寡核苷酸 (舉例而言，ASO 藥劑) 可藉由本領域中熟知的習用方法獲得。舉例而言，本揭露之寡核苷酸可使用本領域中熟知的多種程序中的任何一種從頭合成。舉例而言，b-氰乙基亞磷酰胺法 (Beaucage 等人, 1981)；核苷 H-膦酸鹽法 (Garegg 等人, 1986；Froehler 等人, 1986, Garegg 等人, 1986, Gaffney 等人, 1988)。此等化學反應可藉由可在市場上獲得的多種自動核酸合成儀進行。此等核酸可稱為合成核酸。可替代地，可在質粒中大規模生產寡核苷酸 (參見 Sambrook, 等人, 1989)。可使用已知技術從現有的核酸序列製備寡核苷酸，諸如那些採用限制酶、核酸外切酶或核酸內切酶的技術。以這種方式製備的寡核苷酸可稱為分離的核酸。
用於增強寡核苷酸之遞送及功效的方法及修飾，諸如寡核苷酸之化學修飾、基於脂質及聚合物的奈米顆粒或奈米載體、藉由將寡核苷酸連接至靶向劑 (諸如碳水化合物、肽、抗體、適體、脂質或小分子) 的配體-寡核苷酸結合體及改善寡核苷酸遞送之小分子在本領域中為眾所周知的，諸如舉例而言 Juliano (2016； 同上) 中所描述。親脂性結合體及脂質結合體包括脂肪酸-寡核苷酸結合體；固醇-寡核苷酸結合體及維生素-寡核苷酸結合體。
本揭露之寡核苷酸亦可藉由在 3' 或 5' 末端被部分取代來修飾，該部分包括至少三個飽和或不飽和的，特定而言飽和的，直鏈的或支鏈的，特定而言直鏈的，包括 2 至 30 個碳原子，特定而言 5 至 20 個碳原子，更特定而言 10 至 18 個碳原子之烴鏈，如 WO 2014/195432 中所描述。
本揭露之寡核苷酸可藉由在 3' 或 5' 末端被包括至少一個縮酮官能基的部分取代來修飾，其中所述縮酮官能基之縮酮碳帶有兩個飽和或不飽和的，特定而言飽和的，直鏈的或支鏈的，特定而言直鏈的，包括 1 至 22 個碳原子，特定而言 6 至 20 個碳原子，特定而言 10 至 19 個碳原子，且甚至更特定而言 12 至 18 個碳原子之烴鏈，如 WO 2014/195430 中所描述。
此外，本揭露之寡核苷酸可結合至第二分子。通常，第二分子可選自由適體、抗體或多肽所組成的群組。舉例而言，本揭露之寡核苷酸可結合至細胞穿透肽。細胞穿透肽為本領域中眾所周知的並且包括舉例而言 TAT 肽 (參見舉例而言 Bechara 及 Sagan, FEBS Lett.587(12):1693-1702, 2013)。 寡核苷酸藥劑向哺乳動物細胞之遞送
本揭露之寡核苷酸亦可使用多種膜分子組裝體遞送方法遞送，該等方法包括本領域中已知的聚合物、可生物降解的微粒或微膠囊遞送裝置。舉例而言，膠體分散系統可用於靶向遞送本文所描述之寡核苷酸藥劑。膠體分散系統包括巨分子復合物、奈米膠囊、微球、珠粒及基於脂質之系統，包括水包油乳液、微胞、混合微胞及脂質體。脂質體為人造膜囊泡，其可用為活體外及活體內的遞送載體。已經表明，大小範圍為 0.2 至 4.0 µm 之大單層囊泡 (LUV) 可封裝相當大比例的含有大巨分子的水性緩衝液。脂質體可用於將活性成分轉移及遞送至作用部位。因為脂質體膜在結構上類似於生物膜，所以當將脂質體應用於組織時，脂質體雙層與細胞膜之雙層融合。隨著脂質體與細胞之合併的進行，包括寡核苷酸之內部水性內含物被遞送到細胞中，寡核苷酸可在細胞中特異性結合於標靶 RNA 並可介導 RNase H 介導之基因緘默。在一些情況下，脂質體亦經特異性靶向以舉例而言將寡核苷酸導向特定的細胞類型。脂質體之組成物通常為磷脂之組合，通常與類固醇，尤其膽固醇組合。亦可使用其他磷脂或其他脂質。脂質體之物理特徵取決於 pH 值、離子強度及二價陽離子之存在。
可藉由多種方法製備含有寡核苷酸之脂質體。在一個實例中，將脂質體之脂質組分溶解於洗滌劑中，以便與脂質組分一起形成微胞。舉例而言，脂質組分可為兩親性陽離子脂質或脂質結合體。洗滌劑可具有高臨界微胞濃度並可為非離子的。示例性洗滌劑包括膽酸鹽、CHAPS、辛基葡糖苷、脫氧膽酸鹽及月桂酰肌胺酸。隨後將寡核苷酸製劑添加到包括脂質組分之微胞中。脂質上之陽離子基團與寡核苷酸相互作用並在寡核苷酸周圍縮合以形成脂質體。在縮合後，移除洗滌劑，舉例而言藉由滲析進行，以產生寡核苷酸之脂質體製劑。
若需要，可在縮合反應期間舉例而言藉由受控添加來添加有助於縮合之載劑化合物。舉例而言，載劑化合物可為不同於核酸之聚合物 (舉例而言，精胺或亞精胺)。亦可調節 pH 值以有利於縮合。
用於生產穩定的多核苷酸遞送載體的方法，其摻入多核苷酸/陽離子脂質複合物作為遞送載體的結構組分，在舉例而言WO 96/37194中進一步描述，其全部內容通過引用併入本文。脂質體形成亦可包括以下中描述的示例性方法的一個或多個態樣：Feigner, P. L. 等人, (1987) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8:7413-7417；美國專利號 4,897,355；美國專利號 5,171,678；Bangham 等人, (1965) M. Mol.Biol.23:238；Olson 等人, (1979) Biochim.Biophys.Acta 557:9；Szoka 等人, (1978) Proc.Natl.Acad.Sci.75：4194；Mayhew 等人, (1984) Biochim.Biophys.Acta 775:169；Kim 等人, (1983) Biochim.Biophys.Acta 728:339；及 Fukunaga 等人, (1984) Endocrinol.115:757。用於製備適當大小的脂質聚集體以用作遞送載體的常用技術包括超音波處理及凍融加擠壓 (參見舉例而言 Mayer 等人, (1986) Biochim.Biophys.Acta 858:161。當需要始終較小 (50 至 200 nm) 及相對均勻的聚集體時，可使用微流化 (Mayhew 等人, (1984) Biochim.Biophys.Acta 775:169。此等方法很容易適用於將寡核苷酸製劑包裝到脂質體中。
脂質體分為兩大類。陽離子脂質體為帶正電荷的脂質體，其與帶負電荷的核酸分子相互作用以形成穩定的複合物。帶正電荷的核酸/脂質體複合物結合於與帶負電荷的細胞表面，並被內化到核內體中。由於核內體內的酸性 pH 值，脂質體破裂，從而將其內含物釋放到細胞質中 (Wang 等人(1987) Biochem.Biophys.Res.Commun., 147:980-985)。
對 pH 敏感或帶負電荷的脂質體會截留核酸而非與其複合。由於核酸及脂質都帶有類似的電荷，因此會發生排斥而非複合物形成。然而，一些核酸被截留在這些脂質體之水性內部。pH 敏感性脂質體已用於將編碼胸苷激酶基因之核酸遞送至培養物中之細胞單層。在標靶細胞中偵測到外源基因之表現 (Zhou 等人(1992) Journal of Controlled Release, 19:269-274)。
一種主要類型的脂質體組成物包括不同於天然來源的磷脂醯膽鹼的磷脂。中性脂質體組成物舉例而言可由二肉荳蔻酰磷脂酰膽鹼 (DMPC) 或二棕櫚酰磷脂酰膽鹼 (DPPC) 形成。陰離子脂質體組成物通常由二肉荳蔻酰磷脂酰甘油形成，而陰離子融合脂質體主要由二油酰磷脂酰乙醇胺 (DOPE) 形成。另一種類型的脂質體組成物由磷脂酰膽鹼 (PC)，諸如舉例而言大豆 PC 及蛋 PC 形成。另一種類型由磷脂及/或磷脂酰膽鹼及/或膽固醇之混合物形成。
將脂質體活體外及活體內引入至細胞中的其他方法的實例包括美國專利號 5,283,185；美國專利號 5,171,678；WO 94/00569；WO 93/24640；WO 91/16024；Feigner, (1994) J. Biol.Chem.269:2550；Nabel, (1993) Proc.Natl.Acad.Sci.90:11307；Nabel, (1992) Human Gene Ther.3:649；Gershon, (1993) Biochem.32:7143；及 Strauss, (1992) EMBO J. 11:417。
脂質體亦可為空間穩定的脂質體，包括一種或多種專用脂質，其相對於缺乏此類專用脂質的脂質體，使得循環壽命延長。空間穩定的脂質體之實例為以下之彼等，其中脂質體之囊泡形成脂質部分中之部分 (A) 包括一種或多種醣脂，諸如單唾液酸神經節苷脂 G M1，或 (B) 用一種或多種親水性聚合物 (諸如聚乙二醇 (PEG) 部分) 衍生化。雖然不希望受任何特定理論的束縛，但本領域認為，至少對於含有神經節苷脂、鞘磷脂或 PEG 衍生脂質之空間穩定的脂質體而言，此等空間穩定的脂質體之循環半衰期延長源自網狀內皮系統 (RES) 之細胞的攝取減少 (Allen 等人, (1987) FEBS Letters, 223:42；Wu 等人, (1993) Cancer Research, 53:3765)。
包括一種或多種醣脂之各種脂質體為本領域中已知的。Papahadjopoulos 等人(Ann.N.Y.Acad.Sci., (1987), 507:64) 報導了單唾液酸神經節苷脂 G M1、硫酸半乳糖腦苷脂及磷脂酰肌醇改善脂質體之血液半衰期的能力。此等發現由以下闡述：Gabizon 等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., (1988), 85:6949)。美國專利之美國專利號 4,837,028 及 WO 88/04924 揭示了包括以下之脂質體：(1) 鞘磷脂及 (2) 神經節苷脂 G M1或半乳糖腦苷硫酸酯。美國專利號 5,543,152 (Webb 等人) 揭示了包括鞘磷脂之脂質體。WO 97/13499 (Lim 等人) 揭示了包括 1,2-sn-二肉荳蔻酰磷脂酰膽鹼之脂質體。
根據本揭露，陽離子脂質體可用作藥物遞送載體。陽離子脂質體具有能夠與細胞膜融合的優點。非陽離子脂質體雖然不能有效地與質膜融合，但會在活體內被巨噬細胞吸收，並可用於將寡核苷酸遞送至巨噬細胞。
脂質體之其他優點包括：(i) 從天然磷脂中獲得的脂質體具有生物相容性及可生物降解性；(ii) 脂質體可併入廣泛範圍之水溶性及脂溶性藥物；(iii) 脂質體可保護封裝在其內部隔室中的寡核苷酸免於代謝及降解 (Rosoff, 於「Pharmaceutical Dosage Forms」中, Lieberman, Rieger 及 Banker (編), 1988, 第 1 卷, 第 245 頁)。製備脂質體調配物之重要考慮因素為脂質表面電荷、囊泡大小及脂質體之水體積。
帶正電荷的合成陽離子脂質 N-[1-(2,3-二油氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨 (DOTMA) 可用於形成小脂質體，該等小脂質體自發地與核酸相互作用以形成脂質-核酸複合物，其能夠與組織培養細胞之細胞膜之帶負電荷的脂質融合，從而引起寡核苷酸之遞送 (關於 DOTMA 及其與 DNA 的使用的描述，請參見舉例而言 Feigner, P. L. 等人, (1987) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8:7413-7417 及美國專利號 4,897,355)。
DOTMA 類似物 1,2-雙(油酰氧基)-3-(三甲基氨)丙烷 (DOTAP) 可與磷脂組合使用以形成 DNA 複合囊泡。LIPOFECTIN TMBethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.) 為一種有效的藥劑，其用於將高度陰離子的核酸輸送至活的組織培養細胞中，該等組織培養細胞包括帶正電荷的 DOTMA 脂質體，其與帶負電荷的多核苷酸自發地相互作用以形成複合物。當使用足夠多的帶正電荷的脂質體時，所得複合物之淨電荷亦為正的。以這種方式製備的帶正電荷的複合物自發地附接至帶負電荷的細胞表面，與質膜融合，並有效地將功能性核酸遞送至舉例而言組織培養細胞中。另一種可商購的陽離子脂質 1,2-雙(油酰氧基)-3,3-(三甲基氨)丙烷 (「DOTAP」) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.) 與 DOTMA 的不同之處在於油酰基部分藉由酯而非醚鍵連接。
其他報導的陽離子脂質化合物包括那些已與多種部分結合的化合物，包括舉例而言羧基精胺，其已與兩種類型的脂質之一結合並包括諸如 5-羧基精酰甘胺酸二辛油酰胺 (「DOGS」) (TRANSFECTAM TM, Promega, Madison, Wis.) 及二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺 5-羧基精酰基-酰胺 (「DPPES」) 之化合物 (參見舉例而言美國專利號 5,171,678)。
另一種陽離子脂質結合體包括脂質與膽固醇的衍生化物 (derivatization) (「DC-Chol」)，其已與 DOPE 組合配製成脂質體 (參見 Gao, X. 及 Huang, L., (1991)Biophys.Res.Commun.179:280).已報導藉由將聚離胺酸與 DOPE 結合製成的脂聚離胺酸在血清存在下可有效轉染 (Zhou, X. 等人, (1991) Biochim.Biophys.Acta 1065:8)。對於某些細胞株，此等含有結合陽離子脂質之脂質體據稱比含有 DOTMA 之組成物表現出更低的毒性並提供更有效的轉染。其他市售陽離子脂質產品包括 DMRIE 及 DMRIE-HP (Vical, La Jolla, Calif.) 以及 Lipofectamine (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Md.)。WO 98/39359 及 WO 96/37194 中描述了適用於寡核苷酸遞送之其他陽離子脂質。
基於舉例而言器官特異性、細胞特異性及細胞器特異性，脂質體之靶向亦為可能的，並為本領域中已知的。在脂質體靶向遞送系統之情況下，脂質基團可併入至脂質體之脂質雙層中以便維持靶向配體與脂質體雙層之穩定締合。各種連接基團可用於將脂質鏈接合至靶向配體。另外的方法為本領域中已知的並描述於舉例而言美國專利申請公開號 20060058255，其連接基團藉由引用併入本文。
包括寡核苷酸之脂質體，舉例而言本文所描述之 ASO 藥劑，可以製成高度可變形的。這種可變形性可以能夠使脂質體穿透小於脂質體之平均半徑的孔隙。舉例而言，傳遞體為又另一種類型的脂質體，並為高度可變形的脂質聚集體，其為用於藥物遞送載體的有吸引力的候選物。傳遞體可被描述為高度可變形的脂滴，以使得其能夠很容易地穿透比液滴小的孔隙。傳遞體可藉由將表面邊緣活化劑 (通常為界面活性劑) 添加到標準脂質體組成物中來製成。包括寡核苷酸之傳遞體可舉例而言藉由感染皮下遞送以便將寡核苷酸遞送至皮膚中的角質細胞。為了穿過完整的哺乳動物皮膚，脂質囊泡必須在適當的透皮梯度的影響下通過一系列細孔，各孔具有小於 50 nm 之直徑。此外，由於脂質特性，此等傳遞體可自我最佳化 (適應舉例而言皮膚中孔隙之形狀)、自我修復，並可經常到達其標靶而不會碎片化，並且經常自我裝載。傳遞體已用於將血清白蛋白遞送至皮膚。傳遞體介導之血清白蛋白遞送已被證明與皮下注射含有血清白蛋白之溶液一樣有效。
適用於本揭露之其他調配物描述於 2008 年 1 月 2 日提交的美國臨時申請序號 61/018,616；2008 年 1 月 2 日提交的美國臨時申請序號 61/018,611；2008 年 3 月 26 日提交的美國臨時申請序號 61/039,748；2008 年 4 月 22 日提交的美國臨時申請序號 61/047,087 及 2008 年 5 月 8 日提交的美國臨時申請序號 61/051,528。2007 年 10 月 3 日提交的 PCT 申請號 PCT/US2007/080331 亦描述了適用於本揭露之調配物。
界面活性劑可廣泛應用於諸如乳液 (包括微乳液) 及脂質體之調配物中。對許多不同類型的天然及合成界面活性劑的特性進行分類及排序的最常用方式為藉由使用親水/親油平衡 (HLB) 進行。親水基團 (亦稱為「頭部基團」) 之性質提供了對配方中使用的不同界面活性劑進行分類的最有用的方式 (Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, 第 285 頁)。
若界面活性劑分子未經電離，則歸類為非離子界面活性劑。非離子界面活性劑可廣泛應用於醫藥及化妝品產品中，並可在廣泛範圍的 pH 值內使用。通常，其 HLB 值範圍為 2 至約 18，此取決於其結構。非離子界面活性劑包括非離子酯，諸如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脫水山梨糖醇酯、蔗糖酯及乙氧基化酯。非離子烷醇酰胺及醚，諸如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇及乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物亦包括於此類。聚氧乙烯界面活性劑為非離子界面活性劑類別中最受歡迎的成員。
若界面活性劑分子在溶解或分散於水中時帶有負電荷，則該界面活性劑被歸類為陰離子型。陰離子界面活性劑包括羧酸鹽諸如肥皂、酰基乳酸鹽、胺基酸之酰基酰胺、硫酸酯諸如烷基硫酸酯及乙氧基化烷基硫酸酯、磺酸鹽諸如烷基苯磺酸鹽、酰基羥乙磺酸鹽、酰基牛磺酸鹽及磺基琥珀酸鹽以及磷酸鹽。陰離子界面活性劑類別中最重要的成員為烷基硫酸酯及肥皂。
若界面活性劑分子在溶解或分散於水中時帶有正電荷，則該界面活性劑被歸類為陽離子型。陽離子界面活性劑包括四級銨鹽及乙氧基化胺。四級銨鹽為此類別中使用最多的成員。
若界面活性劑分子具有攜帶正電荷或負電荷的能力，則該界面活性劑被歸類為兩性的。兩性界面活性劑包括丙烯酸衍生物、經取代之烷基酰胺、N-烷基甜菜鹼及磷脂。
界面活性劑在藥物產品、調配物及乳液中的使用已被綜述 (Rieger, 於 Pharmaceutical Dosage Forms 中, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, 第 285 頁)。
用於本揭露之方法中的寡核苷酸亦可作為微胞調配物提供。微胞為一種特定類型的分子組裝體，其中兩親分子排列成球形結構以使得分子之所有疏水部分都向內，從而使得親水部分與周圍的水相接觸。若環境為疏水的，則存在相反的排列。 基於脂質奈米顆粒之遞送方法
本揭露之寡核苷酸可完全封裝在脂質調配物中，舉例而言脂質奈米顆粒 (LNP) 或另一種核酸-脂質顆粒。LNP 極其適用於全身應用，因為其在靜脈注射後表現出延長的循環壽命並在遠側部位 (舉例而言，與投予部位物理分離的部位) 積聚。LNP 包括「pSPLP」，其包括如 PCT 公開號 WO 00/03683 中所闡述之經封裝的縮合劑-核酸複合物。本揭露之顆粒通常具有約 50 nm 至約 150 nm、更通常約 60 nm 至約 130 nm、更通常約 70 nm 至約 110 nm、最通常約 70 nm 至約 90 nm 之平均直徑，且基本上為無毒的。此外，當存在於本揭露之核酸-脂質顆粒中時，核酸在水溶液中對核酸酶之降解具有抗性。核酸-脂質顆粒及其製備方法揭示於舉例而言美國專利號 5,976,567；5,981,501；6,534,484；6,586,410；6,815,432；美國專利號 2010/0324120 及 PCT 公開號 WO 96/40964。
脂質與藥物之比例 (質量/質量比) (舉例而言，脂質與寡核苷酸之比例) 可在約 1:1 至約 50:1、約 1:1 至約 25:1、約 3:1 至約 15:1、約 4:1 至約 10:1、約 5:1 至約 9:1 或約 6:1 至約 9:1 之範圍內。上述範圍的中間範圍亦經考慮為本揭露之一部分。
陽離子脂質之非限制性實例包括 N,N-二油基-N,N-二甲基氯化銨 (DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨 (DDAB)、N--(I-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨 (DOTAP)、N--(I-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化銨 (DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油基氧基)丙胺 (DODMA)、1,2-二亞油基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷 (DLinDMA)、1,2-二亞油烯基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷 (DLenDMA)、1,2-二亞油基胺甲醯基氧基-3-二甲胺基丙烷 (DLin-C-DAP)、1,2-二亞油基氧基-3-(二甲胺基)乙酰氧基丙烷 (DLin-DAC)、1,2-二亞油基氧基-3-嗎啉基丙烷 (DLin-MA)、1,2-二亞油酰基-3-二甲胺基丙烷 (DLinDAP)、1,2-二亞油基硫代-3-二甲胺基丙烷 (DLin-S-DMA)、1-亞油酰基-2-亞油基氧基-3-二甲胺基丙烷 (DLin-2-DMAP)、1,2-二亞油基氧基-3-三甲胺基丙烷氯化物鹽 (DLin-TMA.Cl)、1,2-二亞油酰基-3-三甲胺基丙烷氯化物鹽 (DLin-TAP.Cl)、1,2-二亞油基氧基-3-(N-甲基哌嗪基)丙烷 (DLin-MPZ) 或 3-(N,N-二亞油基胺基)-1,2-丙二醇 (DLinAP)、3-(N,N-二油基胺基)-1,2-丙二醇 (DOAP)、1,2-二亞油基氧基-3-(2-N,N-二甲基胺基)乙氧基丙烷 (DLin-EG-DMA)、1,2-二亞油烯基氧基-N,N-二甲胺基丙烷 (DLinDMA)、2,2-二亞油基-4-二甲胺基甲基-[1,3]-二氧雜環戊烷 (DLin-K-DMA) 或其類似物、(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯基四氫 (dienyetetrahydro)--3aH-環戊[d][1,3]二氧雜環戊-5-胺 (ALN100)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲胺基)丁酸酯 (MC3)、1,1'-(2-(4-(2-((2-(雙(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)(2-羥基十二烷基)胺基)乙基)哌嗪-1-基乙基氮烷二基二十二-2-醇 (Tech G1) 或其混合物。陽離子脂質可包括舉例而言顆粒中存在的總脂質之約 20 mol % 至約 50 mol % 或約 40 mol %。
可電離/非陽離子脂質可為陰離子脂質或中性脂質，包括但不限於二硬脂酰磷脂酰膽鹼 (DSPC)、二油酰磷脂酰膽鹼 (DOPC)、二棕櫚酰磷脂酰膽鹼 (DPPC)、二油酰磷脂酰甘油 (DOPG)、二棕櫚酰磷脂酰甘油 (DPPG)、二油酰-磷脂酰乙醇胺 (DOPE)、棕櫚酰油酰磷脂酰膽鹼 (POPC)、棕櫚酰油酰磷脂酰乙醇胺 (POPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺 4-(N-馬來酰亞胺甲基)-環己烷-1-甲酸酯 (DOPE-mal)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺 (DPPE)、二肉荳蔻酰磷酸乙醇胺 (DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺 (DSPE)、16-O-單甲基 PE、16-O-二甲基 PE、18-1-反式 PE、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺 (SOPE)、膽固醇或其混合物。非陽離子脂質可佔舉例而言顆粒中存在的總脂質的約 5 mol % 至約 90 mol %、約 10 mol % 或約 58 mol % (若包括膽固醇)。
抑制顆粒聚集之結合脂質可為舉例而言聚乙二醇 (PEG) 脂質，包括但不限於 PEG-二酰基甘油 (DAG)、PEG-二烷氧基丙基 (DAA)、PEG-磷脂、PEG-神經酰胺 (Cer) 或其混合物。PEG-DAA 結合體可為舉例而言 PEG-二月桂酰氧基丙基 (Ci 2)、PEG-二肉豆蔻酰氧基丙基 (Ci 4)、PEG-二棕櫚酰氧基丙基 (Ci 6) 或 PEG-二硬脂酰氧基丙基 (C] 8)。防止顆粒聚集之結合脂質可為舉例而言顆粒中存在之總脂質的 0 mol % 至約 20 mol % 或約 2 mol %。核酸-脂質顆粒可進一步包括佔顆粒中存在的總脂質的舉例而言約 10 mol % 至約 60 mol % 或約 50 mol % 的膽固醇。 與配體結合之寡核苷酸
本揭露之寡核苷酸可化學連接至增強寡核苷酸之活性、細胞分佈或細胞攝取的一種或多種配體、部分或結合體。此類部分包括但不限於脂質部分，諸如膽固醇部分 (Letsinger 等人, (1989) Proc.Natl.Acid.Sci.USA, 86: 6553-6556)、膽酸 (Manoharan 等人, (1994) Biorg.Med.Chem.Let., 4:1053-1060)、硫醚舉例而言鈹基-S-三苯甲基硫醇 (Manoharan 等人, (1992) Ann.N.Y.Acad.Sci., 660:306-309；Manoharan 等人, (1993) Biorg.Med.Chem.Let., 3:2765-2770)、硫代膽固醇 (Oberhauser 等人, (1992) Nucl.Acids Res., 20:533-538)、脂族鏈舉例而言十二烷二醇或十一烷基殘基 (Saison-Behmoaras 等人, (1991) EMBO J, 10:1111-1118；Kabanov 等人, (1990) FEBS Lett., 259:327-330；Svinarchuk 等人, (1993) Biochimie, 75:49-54)、磷脂舉例而言二-十六烷基-反消旋-甘油或三乙基-銨 1,2-二-O-十六烷基-反消旋-甘油-3-膦酸酯 (Manoharan 等人, (1995) Tetrahedron Lett., 36:3651-3654；Shea 等人, (1990) Nucl.Acids Res., 18:3777-3783)、多胺或聚乙二醇鏈 (Manoharan 等人, (1995) Nucleosides & Nucleotides, 14:969-973) 或金剛烷乙酸 (Manoharan 等人, (1995) Tetrahedron Lett., 36:3651-3654)、棕櫚基部分 (Mishra 等人, (1995) Biochim.Biophys.Acta, 1264:229-237) 或十八胺或己基胺基-羰氧基膽固醇部分 (Crooke 等人, (1996) J. Pharmacol.Exp.Ther., 277:923-937)。
配體可改變其所併入之寡核苷酸藥劑之分佈、靶向或壽命及/或提供針對所選標靶 (舉例而言，分子、細胞或細胞類型)、區室 (舉例而言，細胞或器官區室)、組織、器官或身體區域之增強的親和力，如舉例而言與不存在此類配體之物質相比。
配體可包括天然存在的物質，諸如蛋白質 (舉例而言人類血清白蛋白 (HSA)、低密度脂蛋白 (LDL) 或球蛋白)；碳水化合物 (舉例而言葡聚醣、聚三葡萄糖、幾丁質、幾丁聚醣、菊糖、環糊精、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺或透明質酸)；或脂質。配體亦可為重組分子或合成分子，諸如合成聚合物，舉例而言合成聚胺基酸。聚胺基酸之實例包括聚胺基酸，為聚離胺酸 (PLL)、聚 L-天門冬胺酸、聚 L-麩胺酸、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-馬來酸酐共聚物、N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺共聚物 (HMPA)、聚乙二醇 (PEG)、聚乙烯醇 (PVA)、聚胺酯、聚 (2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯酰胺聚合物或聚磷嗪。聚胺之實例包括：聚乙烯亞胺、聚離胺酸 (PLL)、精胺、亞精胺、多胺、偽肽-多胺、擬肽多胺、樹枝狀多胺、精胺酸、脒、魚精蛋白、陽離子脂質、陽離子卟啉、多胺之四級鹽或 α 螺旋肽。
配體亦可包括靶向基團，舉例而言細胞或組織靶向劑，舉例而言凝集素、糖蛋白、脂質或蛋白質，舉例而言結合特定細胞類型諸如腎細胞之抗體。靶向基團可為促甲狀腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、界面活性劑蛋白 A、粘蛋白碳水化合物、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多價甘露糖、多價岩藻糖、糖基化聚胺基酸、多價半乳糖、轉鐵蛋白、雙膦酸鹽、聚麩胺酸鹽、聚天門冬胺酸鹽、脂質、膽固醇、類固醇、膽汁酸、葉酸、維生素 B12、維生素 A、生物素或 RGD 肽或 RGD 肽模擬物。
配體之其他實例包括染料、嵌入劑 (舉例而言吖啶)、交聯劑 (舉例而言補骨脂素、絲裂黴素 C)、卟啉 (TPPC4、特沙弗林 (texaphyrin)、噻呋啉 (Sapphyrin))、多環芳烴 (舉例而言吩嗪、二氫吩嗪)、人工核酸內切酶 (舉例而言 EDTA)、親脂性分子 (舉例而言膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睾酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石膽酸、O3-(油酰基)膽酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪) 及肽結合體 (舉例而言觸角足肽、Tat 肽)、烷化劑、磷酸鹽、胺基、巰基、PEG (舉例而言 PEG-40K)、MPEG、[MPEG] 2、聚胺基、烷基、經取代之烷基、放射性標記物、酶、半抗原- (舉例而言生物素)、轉運/吸收促進劑 (舉例而言阿司匹林、維生素 E、葉酸酸)、合成核糖核酸酶 (舉例而言咪唑、雙咪唑、組胺、咪唑簇、吖啶-咪唑結合體、四氮雜巨環化合物之 Eu3+ 復合物)、二硝基苯基、HRP 或 AP。
配體可為蛋白質，舉例而言糖蛋白，或肽，舉例而言，對共配體具有特異性親和力之分子，或抗體，舉例而言與特定細胞類型諸如肝細胞結合之抗體。配體亦可包括激素及激素受體。其亦可包括非肽物質，諸如脂質、凝集素、碳水化合物、維生素、輔因子、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多價甘露糖或多價岩藻糖。
配體可為物質，舉例而言藥物，其可舉例而言藉由破壞細胞之細胞骨架，舉例而言藉由破壞細胞之微管、微絲及/或中間絲來增加寡核苷酸藥劑攝取到細胞中。藥物可為舉例而言 taxon、長春新鹼、長春鹼、細胞鬆弛素、諾考達唑、傑斯內酯 (japlakinolide)、紅海海綿蛋白 (latrunculin A)、毒蠅虎蕈鹼、swinholide A、indanocine 或 myoservin。
如本文所描述附接至寡核苷酸之配體可充當藥物動力學調節劑 (PK 調節劑)。PK 調節劑包括親脂物、膽汁酸、類固醇、磷脂類似物、肽、蛋白質結合劑、PEG、維生素等。示例性 PK 調節劑包括但不限於膽固醇、脂肪酸、膽酸、石膽酸、二烷基甘油酯、二酰基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬、維生素 E、生物素等。亦已知包括許多硫代磷酸酯鍵之寡核苷酸結合於血清蛋白，因此短寡核苷酸，舉例而言具有約 5 個鹼基、10 個鹼基、15 個鹼基或 20 個鹼基之寡核苷酸，在骨架中包括多個硫代磷酸酯鍵，亦適用於本揭露作為配體 (舉例而言作為 PK 調節配體)。此外，結合血清組分 (舉例而言血清蛋白) 之適體亦適合用作本文所描述之方法及組成物中之 PK 調節配體。
本揭露之配體結合的寡核苷酸可藉由使用帶有側接反應性官能基之寡核苷酸，諸如衍生自連接分子附接到寡核苷酸上的寡核苷酸 (如下所述) 來合成。此反應性寡核苷酸可直接與市售配體、合成的帶有任何多種保護基之配體或具有附接至其上的連接部分的配體反應。
本揭露之結合體中使用的寡核苷酸可經由熟知的固相合成技術方便且常規地製備。用於此類合成的設備由多家供應商出售，包括舉例而言 Applied Biosystems (Foster City, Calif.)。可以額外地或替代地使用本領域已知的用於此類合成的任何其他手段。亦已知使用類似技術來製備其他寡核苷酸，諸如硫代磷酸酯及烷基化衍生物。
在本揭露之配體結合的寡核苷酸中，諸如本揭露之帶有序列特異性連接的核苷的配體-分子，寡核苷酸及寡核苷可以利用標準核苷酸或核苷前驅物，或已帶有連接部分之核苷酸或核苷結合體前驅物，已帶有配體分子之配體-核苷酸或核苷-結合體前驅物或帶有非核苷配體之建構單元來在適合的 DNA 合成儀上組裝。
當使用已帶有連接部分之核苷酸結合體前驅物時，通常完成序列特異性連接的核苷之合成，隨後配體分子與連接部分反應以形成配體結合的寡核苷酸。本揭露之寡核苷酸或連接的核苷可藉由自動合成儀使用衍生自配體-核苷結合體之亞磷酰胺以及可商購併常規用於寡核苷酸合成中的標準亞磷酰胺及非標準亞磷酰胺來合成。 i. 脂質結合物
根據本揭露，配體或結合體可為脂質或基於脂質之分子。此類脂質或基於脂質之分子特異性結合於血清蛋白，舉例而言人類血清白蛋白 (HSA)。HSA 結合配體允許結合體分佈至標靶組織，舉例而言身體之非腎標靶組織。舉例而言，標靶組織可為肝臟，包括肝臟之器質性細胞。可結合 HSA 之其他分子亦可用作配體。舉例而言，可使用萘普生或阿司匹林。脂質或基於脂質之配體可 (a) 增加對結合體降解之抗性，(b) 增加靶向或轉運到標靶細胞或細胞膜中，及/或 (c) 可用於調節與血清蛋白 (舉例而言 HSA) 之結合。
基於脂質之配體可用於抑制，舉例而言，控制結合體與標靶組織之結合。舉例而言，與 HSA 結合強度較高之脂質或基於脂質之配體不太可能被靶向至腎臟，且因此不太可能從體內清除。與 HSA 結合強度較低之脂質或基於脂質之配體可用於將結合體靶向至腎臟。
在另一態樣，配體可為由標靶細胞舉例而言增殖細胞攝取之部分，舉例而言維生素。示例性維生素包括維生素 A、E 及 K。 ii. 細胞滲透劑
配體亦可為細胞滲透劑，舉例而言螺旋細胞滲透劑。在特定實例中，該藥劑為兩親性的。示例性藥劑為肽，諸如 tat 或 antennopedia。若該藥劑為肽，則其可經修飾，包括肽基模擬物、反演体、非肽或偽肽鍵，以及使用 D-胺基酸。螺旋劑可為 α-螺旋劑，其具有親脂相及疏脂相。
配體可為肽或擬肽物。擬肽物 (在本文中亦稱為寡肽模擬物) 為能夠折疊成類似於天然肽的確定的三維結構的分子。肽及擬肽物與寡核苷酸藥劑之附接可影響寡核苷酸之藥物動力學分佈，諸如藉由增強細胞識別及吸收而影響。肽或擬肽部分可為約 5 至 50 個胺基酸長，舉例而言約 5、10、15、20、25、30、35、40、45 或 50 個胺基酸長。
肽或擬肽物可為舉例而言細胞滲透肽、陽離子肽、兩親肽或疏水肽 (舉例而言，主要由 Tyr、Trp 或 Phe 組成)。肽部分可為樹枝狀聚合物肽、約束肽或交聯肽。在另一可替代方案中，肽部分可包括疏水性膜易位序列 (MTS)。示例性的疏水性含 MTS 肽為具有胺基酸序列 AAVALLPAVLLALLAP 之 RFGF。RFGF 類似物 (舉例而言，含有疏水性 MTS 之胺基酸序列 AALLPVLLAAP 亦可為靶向部分)。肽部分可為「遞送」肽，其可攜帶包括肽、寡核苷酸及蛋白質在內的大極性分子穿過細胞膜。舉例而言，來自 HIV Tat 蛋白 (GRKKRRQRRRPPQ) 及觸角足果蠅 (Drosophila Antennapedia) 蛋白 (RQIKIWFQNRRMKWKK) 之序列已被發現能夠作為遞送肽發揮作用。肽或擬肽物可由隨機的 DNA 序列編碼，諸如從噬菌體展示庫或一珠一化合物 (OBOC) 組合庫中鑒別的肽 (Lam 等人, Nature, 354:82-84, 1991)。經由併入之單體單元系栓至寡核苷酸藥劑以用於細胞靶向目的之肽或擬肽物之實例為精胺酸-甘胺酸-天門冬胺酸 (RGD)-肽或 RGD 模擬物。肽部分之長度範圍可為約 5 個胺基酸至約 40 個胺基酸。肽部分可具有結構修飾，諸如以增加穩定性或指導構象特性。可使用下文描述之任何結構修飾。
RGD 肽可用於本揭露之組成物中以將組成物導向細胞標靶。RGD 肽可為直鏈的或環狀的，並可經修飾，舉例而言經糖基化或甲基化，以促進靶向特定組織。含 RGD 之肽及擬肽物可包括 D-胺基酸，以及合成的 RGD 模擬物。除了 RGD 之外，亦可使用靶向整合素配體之其他部分。此配體之一些結合體靶向 PECAM-1 或 VEGF。
細胞滲透肽能夠滲透細胞，舉例而言微生物細胞，諸如細菌或真菌細胞，或哺乳動物細胞，諸如人類細胞。微生物細胞滲透肽可為舉例而言 α-螺旋線性肽 (舉例而言，LL-37 或 Ceropin P1)、含二硫鍵之肽 (舉例而言，α-防禦素、β-防禦素或牛抗菌肽 (bactenecin)) 或僅含一個或兩個主導胺基酸之肽 (舉例而言 PR-39 或 indolicidin)。細胞滲透肽亦可包括核定位訊號 (NLS)。舉例而言，細胞滲透肽可為二分兩親性肽，諸如 MPG，其衍生自 HIV-1 gp41 之融合肽域及 SV40 大 T 抗原之 NLS (Simeoni 等人, Nucl.Acids Res.31:2717-2724, 2003)。 iii. 碳水化合物結合物
根據本揭露之組成物及方法，寡核苷酸可進一步包括碳水化合物。如本文所描述，碳水化合物結合的寡核苷酸有利於核酸之活體內遞送，以及適用於活體內治療用途之組成物。如本文所用，「碳水化合物」係指一種化合物，其為本身由一個或多個具有至少 6 個碳原子之單醣單元構成的碳水化合物 (該化合物可為直鏈、支鏈或環狀的)，其中氧、氮或硫原子與各碳原子鍵合；或具有碳水化合物部分作為其一部分的化合物，該碳水化合物部分由一個或多個單醣單元構成，各單醣單元具有至少六個碳原子 (該化合物可為直鏈、支鏈或環狀的)，其中氧、氮或硫原子與各碳原子鍵合。代表性的碳水化合物包括糖 (含有約 4、5、6、7、8 或 9 個單醣單元之單醣、二醣、三醣及寡糖) 及多醣，諸如澱粉、糖原、纖維素及多醣膠。具體的單醣包括 C5 及以上 (舉例而言，C5、C6、C7 或 C8) 糖；二醣及三醣包括具有兩個或三個單醣單元 (舉例而言 C5、C6、C7 或 C8) 之糖。
在特定實例中，用於本揭露之組成物及方法中的碳水化合物結合體為單醣。碳水化合物結合體可進一步包括一種或多種如上文所描述之額外配體，諸如但不限於 PK 調節劑及/或細胞滲透肽。適用於本揭露之額外碳水化合物結合體 (及接頭) 包括 PCT 公開號 WO 2014/179620 及 WO 2014/179627 中所描述之彼等物，該等公開各自的全部內容藉由引用併入本文。 iv. 連接子
本文所描述之結合體或配體可用各種可切割或不可切割之接頭附接至寡核苷酸。
接頭通常包括直接鍵或原子，諸如氧或硫，單元，諸如 NR 8、C(O)、C(O)NH、SO、SO 2、SO 2NH，或原子鏈，諸如但不限於，經取代或未經取代之烷基、經取代或未經取代之烯基、經取代或未經取代之炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、雜芳基烷基、雜芳基烯基、雜芳基炔基、雜環基烷基、雜環基烯基、雜環基炔基、芳基、雜芳基、雜環基、環烷基、環烯基、烷芳基烷基、烷芳基烯基、烷芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基雜芳基烷基、烷基雜芳基烯基、烷基雜芳基炔基、烯基雜芳基烷基、烯基雜芳基烯基、烯基雜芳基炔基、炔基雜芳基烷基、炔基雜芳基烯基、炔基雜芳基炔基、烷基雜環基烷基、烷基雜環基烯基、烷基雜環基炔基、烯基雜環基烷基、烯基雜環基烯基、烯基雜環基炔基、炔基雜環基烷基、炔基雜環基烯基、炔基雜環基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基雜芳基、烯基雜芳基、炔基雜芳基，其中一個或多個亞甲基可經 O、S、S(O)、SO 2、N(R 8)、C(O)、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之雜芳基、經取代或未經取代之雜環基中斷或終止；其中 R 8為氫、酰基、脂族或經取代之脂族。在具體實例中，接頭可介於約 1 至 24 個原子、2 至 24、3 至 24、4 至 24、5 至 24、6 至 24、6 至 18、7 至 18、8 至 18 個原子、7 至 17、8 至 17、6 至 16、7 至 17 或 8 至 16 個原子。
可切割的連接基團為在細胞外足夠穩定，但在進入標靶細胞後被切割以釋放接頭結合在一起的兩個部分的連接基團。在一較佳實施例中，可切割的連接基團在標靶細胞中或在第一參考條件下 (其可舉例而言經選擇以模擬或代表細胞內條件) 比在個體之血液中或在第二參考條件下 (其可舉例而言經選擇以模擬或代表血液或血清中發現的條件) 更快地被切割至少約 10 倍、20 倍、30 倍、40 倍、50 倍、60 倍、70 倍、80 倍、90 倍或更多倍，或至少約 100 倍。
可切割的連接基團易受切割劑影響，舉例而言 pH 值、氧化還原電位或降解分子之存在。通常，切割劑在細胞內比在血清或血液中更普遍或以更高的水平或活性被發現。此類降解劑之實例包括：對特定受質具有選擇性或不具有受質特異性的氧化還原劑，包括舉例而言存在於細胞中的氧化或還原酶或還原劑 (諸如硫醇)，其可藉由以下方式降解氧化還原可切割的連接基團：還原；酯酶；可產生酸性環境的核內體或試劑，舉例而言，導致 pH 值為 5 或更低的彼等物；可藉由充當廣義酸、肽酶 (其可為受質特異性的) 及磷酸酶來水解或降解酸可切割的連接基團的酶。
可切割的連接基團，諸如二硫鍵，可能對 pH 值敏感。人類血清之 pH 值為 7.4，而細胞內的平均 pH 值略低，範圍為約 7.1 至 7.3。核內體具有更酸性的 pH 值，在 5.5 至 6.0 的範圍內，且溶酶體具有甚至更酸性的 pH 值，在 5.0 左右。一些接頭將具有可切割的連接基團，其在較佳 pH 值下被切割，從而從細胞內的配體釋放陽離子脂質，或釋放到細胞的所需區室中。
接頭可包括可被特定酶切割之可切割連接基團。併入接頭中之可切割連接基團之類型可取決於待靶向的細胞。舉例而言，肝臟靶向配體可經由包括酯基之接頭連接至陽離子脂質。肝細胞富含酯酶，且因此接頭在肝細胞中比在不富含酯酶之細胞類型中會更有效地被切割。富含酯酶的其他細胞類型包括肺、腎皮質及睾丸之細胞。
當靶向富含肽酶之細胞類型 (諸如肝細胞及滑膜細胞) 時，可使用含有肽鍵之接頭。
通常，可藉由測試降解劑 (或條件) 切割候選連接基團之能力來評估候選可切割連接基團之適用性。亦將希望還測試候選可切割連接基團在血液中或與其他非標靶組織接觸時抵抗切割的能力。因此，可判定第一條件與第二條件之間對切割的相對易感性，其中選擇第一條件以指示標靶細胞中之切割，並選擇第二條件以指示其他組織或生物體液 (舉例而言，血液或血清) 中之切割。評估可在無細胞系統、細胞、細胞培養物、器官或組織培養物或整個動物中進行。在無細胞或培養物條件下進行初步評估並藉由在整個動物中進一步評估進行確認可為有用的。在一些情況下，適用的候選化合物在細胞中 (或在經選擇以模擬細胞內條件之活體內條件下) 與在血液或血清中 (或在經選擇以模擬細胞外條件之活體外條件下) 相比更快被切割至少約 2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90 或約 100 倍。 a. 氧化還原可切割連接基團
可切割連接基團可為在還原或氧化後被切割的氧化還原可切割連接基團。可還原切割的連接基團之實例為二硫化物連接基團 (--S--S--)。為了判定候選可切割連接基團是否為合適的「還原可切割連接基團」，或舉例而言是否適合與特定寡核苷酸部分及特定靶向劑一起使用，可參照本文所描述之方法。舉例而言，可藉由使用本領域中已知之試劑與二硫赤藻糖醇 (DTE) 或其他還原劑一起孵育來評估候選物，其模擬將在細胞舉例而言標靶細胞中觀察到的切割速率。亦可在經選擇以模擬血液或血清條件之條件下評估候選物。候選化合物在血液中至多可被切割約 10%。在其他實例中，適用的候選化合物在細胞中 (或在經選擇以模擬細胞內條件之活體內條件下) 與在血液中 (或在經選擇以模擬細胞外條件之活體外條件下) 相比更快被降解至少約 2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90 或約 100 倍。候選化合物之切割速率可使用標準酶動力學測定在經選擇以模擬細胞內介質之條件下來判定並與經選擇以模擬細胞外介質之條件進行比較。 b. 基於磷酸鹽之可切割連接基團
可裂解連接子亦可包含基於磷酸酯的可裂解連接基團。基於磷酸酯的可裂解連接基團係由降解或水解磷酸酯基團的藥劑所裂解。裂解細胞中之磷酸酯基團的藥劑之實例為酶，諸如細胞中的磷酸酶。基於磷酸酯之連接基團之實例為 -O-P(O)(OR k)-O-、
‑O‑P(S)(OR k)‑O-、-O-P(S)(SR k)-O-、-S-P(O)(OR k)-O-、-O-P(O)(OR k)-S-、-S-P(O)(OR k)-S-、
‑O‑P(S)(OR k)‑S‑、-S-P(S)(OR k)-O-、-O-P(O)(R k)-O-、-O-P(S)(R k)-O-、-S-P(O)(R k)-O-、-S-P(S)(R k)-O-、
‑S‑P(O)(R k)-S-、-O-P(S)(R k)-S-。可以使用與上述彼等方法類似的方法評估此等候選者。 c. 酸可裂解連接基團
可裂解連接子亦可包括酸可裂解連接基團。酸可裂解連接基團為在酸性條件下經裂解的連接基團。在較佳之實施例中，酸可裂解連接基團在 pH 為約 6.5 或更低 (例如，約 6.0、5.75、5.5、5.25、5.0 或更低) 的酸性環境中裂解，或者由可作為通用酸之藥劑諸如酶裂解。在細胞中，特定之低 pH 細胞器，諸如胞內體及溶酶體，可以為酸可裂解連接基團提供裂解環境。酸可裂解連接基團之實例包括但不限於腙、酯及胺基酸之酯。酸可裂解基團可具有通式 –C=NN--、C(O)O 或--OC(O)。一較佳之實施例為當接附至酯之氧 (烷氧基基團) 的碳為芳基基團、經取代之烷基基團或三級烷基基團諸如二甲基戊基或三級丁基時。可以使用與上述彼等方法類似的方法評估此等候選者。 d. 基於酯之連接基團
可裂解連接子可包括基於酯的可裂解連接基團。基於酯的可裂解連接基團由細胞中的酶諸如酯酶及醯胺酶裂解。基於酯的可裂解連接基團之實例包括但不限於伸烷基、伸烯基及伸炔基基團之酯。酯可裂解連接基團具有通式 --C(O)O-- 或 --OC(O)--。可以使用與上述彼等方法類似的方法評估此等候選者。 e. 基於肽的裂解基團
可裂解連接子可進一步包括基於肽的可裂解連接基團。基於肽的可裂解連接基團由細胞中的酶諸如肽酶及蛋白酶裂解。基於肽的可裂解連接基團為在胺基酸之間形成以產生寡肽 (例如，二肽、三肽等) 及多肽的肽鍵。基於肽的可裂解基團不包括醯胺基團 (--C(O)NH--)。醯胺基團可在任何伸烷基、伸烯基或伸炔基之間形成。肽鍵為一種在胺基酸之間形成的以產生肽及蛋白質的特殊類型之醯胺鍵。基於肽的裂解基團通常限於產生肽及蛋白質的在胺基酸之間形成的肽鍵 (即醯胺鍵)，且不包括整個醯胺官能團。基於肽的可裂解連接基團具有通式 --NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)--，其中 RA 及 RB 為兩個相鄰胺基酸的 R 基團。可以使用與上述彼等方法類似的方法評估此等候選者。
本揭露之寡核苷酸可透過連接子與碳水化合物結合。連接子包括二價及三價分支的連接子基團。本揭露之組成物及方法的具有連接子的示例性寡核苷酸碳水化合物結合物包括但不限於，彼等在 PCT 公開號 WO 2018/195165 之式 24 至 35 中描述者。
教示寡核苷酸結合物之製備的代表性美國專利包括但不限於美國專利號4,828,979、4,948,882、5,218,105、5,525,465、5,541,313、5,545,730、5,552,538、5,578,717、5,580,731、5,591,584、5,109,124、5,118,802、5,138,045、5,414,077、5,486,603、5,512,439、5,578,718、5,608,046、4,587,044、4,605,735、4,667,025、4,762,779、4,789,737、4,824,941、4,835,263、4,876,335、4,904,582、4,958,013、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,245,022、5,254,469、5,258,506、5,262,536、5,272,250、5,292,873、5,317,098、5,371,241、5,391,723、5,416,203、5,451,463、5,510,475、5,512,667、5,514,785、5,565,552、5,567,810、5,574,142、5,585,481、5,587,371、5,595,726、5,597,696、5,599,923、5,599,928 及 5,688,941、6,294,664、6,320,017、6,576,752、6,783,931、6,900,297、7,037,646、8,106,022，其等中之各者的整體內容以引用方式併入本文。
在某些情況下，寡核苷酸之核苷酸可經非配體基團修飾。許多非配體分子已與寡核苷酸結合以便增強該寡核苷酸之活性、細胞分佈或細胞攝取，並且進行此類結合的程序可在科學文獻中獲得。此類非配體部分包括脂質部分，諸如膽固醇 (Kubo, T. 等人，Biochem.Biophys.Res.Comm, 2007, 365(1):54-61；Letsinger 等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1989, 86:6553)；膽酸 (Manoharan 等人，Bioorg.Med.Chem.Lett., 1994, 4:1053)；硫醚，諸如己基-S-三苯甲基硫醇 (Manoharan 等人，Ann.N.Y.Acad.Sci., 1992, 660:306；Manoharan 等人，Bioorg.Med.Chem.Let., 1993, 3:2765)；巰基膽固醇 (Oberhauser 等人，Nucl.Acids Res., 1992, 20:533)；脂族鏈，例如，十二烷二醇或十一烷基殘基 (Saison-Behmoaras 等人，EMBO J., 1991, 10:111；Kabanov 等人，FEBS Lett., 1990, 259:327；Svinarchuk 等人，Biochimie, 1993, 75:49)；磷脂質，例如，二-十六烷基-rac-甘油或三乙基銨 1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸鹽 (Manoharan 等人，Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651；Shea 等人，Nucl.Acids Res., 1990, 18:3777)；多胺或聚乙二醇鏈 (Manoharan 等人，Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969)；或金剛烷乙酸 (Manoharan 等人，Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651)；棕櫚基部分 (Mishra 等人，Biochim.Biophys.Acta, 1995, 1264:229)；或十八胺或己基胺基-羰基-氧膽固醇部分 (Crooke 等人，J. Pharmacol.Exp.Ther., 1996, 277:923)。上面列出了教示此類寡核苷酸結合物之製備的代表性美國專利。典型之結合方案涉及在序列之一個或多個位置帶有胺基連接子的寡核苷酸的合成。然後使用適當之偶聯劑或活化劑使胺基基团與正在經結合之分子反應。結合反應可在寡核苷酸仍結合至固體支持物上時或在寡核苷酸之裂解後在溶液相中進行。藉由 HPLC 純化寡核苷酸結合物通常提供純結合物。 核酸載體
本文所揭示之核酸劑的有效細胞內濃度可以經由編碼該藥劑的多核苷酸的穩定表現來實現 (例如，藉由整合到哺乳動物細胞之核或粒線體基因體中)。核酸為靶向 Grik2mRNA 的抑制性 RNA (例如，本文所揭示之 ASO 劑)。為了將此類外源核酸引入哺乳動物細胞內，可將該藥劑的多核苷酸序列併入載體內。可以藉由多種方法將載體引入細胞內，包括轉形、轉染、直接攝取、射彈轟擊及藉由將載體包裹在脂質體中。轉染或轉形細胞的合適方法之實例為磷酸鈣沉澱、電穿孔、顯微注射、感染、脂轉染及直接攝取。此類方法在例如以下文獻中更詳細的描述：Green 等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第四版 (Cold Spring Harbor University Press, New York (2014))；及 Ausubel 等人，Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York (2015))，其各者之揭露皆以引用方式併入本文。
亦可藉由使含有編碼此類藥劑的多核苷酸的載體靶向細胞膜磷脂，將本文所揭示的藥劑引入哺乳動物細胞內。例如，藉由將載體分子連接至 VSV-G 蛋白 (一種對全部細胞膜磷脂具有親及力的病毒蛋白)，可以使載體靶向細胞膜之細胞外表面上的磷脂質。因此，可以使用本領域的習用及常規方法產生構建體。
除了實現高轉錄及轉譯率外，外源多核苷酸在哺乳動物細胞中的穩定表現可藉由將含有該基因的多核苷酸整合到哺乳動物細胞的核基因體中來實現。已經開發了多種用於將編碼外源蛋白質的多核苷酸輸送並整合到哺乳動物細胞之核 DNA 中的載體。表現載體之實例在例如 WO 1994/011026 中揭示並且以引用方式併入本文。用於本文所述的組成物及方法中的表現載體含有編碼靶向 Grik2的 ASO 劑的多核苷酸序列以及例如用於表現此等藥劑及/或將此等多核苷酸序列整合到哺乳動物細胞之基因體內的額外序列元件。可使用的某些載體包括含有調節性序列的質體，諸如指導基因轉錄的啟動子及增強子區域。其他有用的載體含有增強此等藥劑之轉譯速率或改善由基因轉錄所產生的 mRNA 之穩定性或核輸出的多核苷酸序列。此等序列元件包括例如 5' 及 3' UTR 區域、IRES 及多腺苷酸化訊息位點，以便指導表現載體上所攜帶之基因的有效轉錄。適用於本文所述之組成物及方法的表現載體亦可含有編碼用於選擇含有此類載體的細胞的標記物的多核苷酸。合適標記之實例為編碼對抗生素如胺苄青黴素、氯黴素、康黴素、諾爾絲菌素之抗性的基因。 調節序列
本文所揭示之 ASO 劑可能需要以足夠高的水平表現以引發治療益處。據此，多核苷酸表現可由能夠驅動所揭示之 ASO 劑的穩健表現的啟動子序列介導。根據本文所揭示的方法及組成物，啟動子可為異源啟動子。如本文所用，術語「異源啟動子」指代在自然界中未發現與給定編碼序列可操縱地連接的啟動子。有用的異源控制序列通常包括彼等衍生自編碼哺乳動物或病毒基因的序列。
出於本揭露之目的，異源啟動子及其他控制元件兩者，諸如 CNS 特異性及誘導型啟動子、增強子等將為特別有用的。啟動子可以完整地衍生自天然基因 (例如， Grik2基因) 或可由衍生自不同天然存在之啟動子的不同元件構成。替代地，啟動子可包括合成多核苷酸序列。不同啟動子將會引導基因在不同組織或細胞類型中、或在不同發育階段、或因應於不同環境條件或藥物或轉錄輔因子之存在或不存在的表現。普存、細胞類型特異性、組織特異性、發育階段特異性及條件性啟動子，例如藥物反應性啟動子 (例如四環素反應性啟動子) 為本領域眾所習知的。
在哺乳動物系統中，存在三種啟動子，且它們為構建表現載體的候選啟動子：(i) Pol I 啟動子，其控制大核醣體 RNA 的轉錄；(ii) Pol II 啟動子，其控制 mRNA (轉譯為蛋白質)、小核 RNA (snRNA) 及內源性微小 RNA (例如，來自前驅 mRNA 的內含子) 的轉錄；及 (iii) Pol III 啟動子，其獨特地轉錄小的非編碼 RNA。在設計用於活體內 RNA 表現的構建體時，該等啟動子各自皆具有需要考慮的優點及限制。例如，Pol III 啟動子可用於在活體內從 DNA 模板合成 ASO 劑 (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA 或 shmiRNA)。為了更好地控制組織特異性表現，Pol II 啟動子為較佳者，但其僅可用於 miRNA 的轉錄。然而，當使用 Pol II 啟動子時，較佳係省略轉譯起始訊息，使得 RNA 發揮 siRNA、shRNA 或 miRNA 的作用且不在活體內轉譯成肽。
適合與本文所述的組成物及方法合用的多核苷酸亦包括彼等編碼在哺乳動物調控序列 (諸如啟動子序列及視情況選用的增強子序列) 之控制下靶向 Grik2mRNA 的 ASO 劑的多核苷酸。可用於在哺乳動物細胞中表現所揭示的 ASO 劑的示例性啟動子包括普存啟動子，例如 H1 啟動子、7SK 啟動子、載脂蛋白 E-人類-α 1-抗胰蛋白酶啟動子、CK8 啟動子、鼠 U1 啟動子 (mU1a)、延長因子 1α (EF-1α) 啟動子、甲狀腺素結合球蛋白 (TBG) 啟動子、磷酸甘油酸激酶 (PKG) 啟動子、CAG ((CMV) 巨細胞病毒增強子、雞 β 肌動蛋白啟動子 (CBA) 及兔 β 珠蛋白內含子組成的複合物)、SV40 早期啟動子、鼠乳腺腫瘤病毒 LTR 啟動子、腺病毒主要晚期啟動子 (Ad MLP)；單純皰疹病毒 (HSV) 啟動子、CMV 啟動子諸如 CMV 即刻早期啟動子區域 (CMV-IE)、rous 氏肉瘤病毒 (RSV) 啟動子及 U6 啟動子或其變體。為了驅動本文所揭示的抑制性 RNA 序列的細胞類型特異性表現，可以使用細胞類型特異性啟動子。例如，可以使用神經元特異性啟動子賦予 Grik2ASO 劑的神經元特異性表現，該等神經元特異性啟動子諸如人類突觸蛋白 1 (hSyn) 啟動子、六核糖核苷酸結合蛋白 3 (NeuN) 啟動子、Ca 2+/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶 II (CaMKII) 啟動子、微管蛋白 α I (Tα-1) 啟動子、神經元特異性烯醇酶 (NSE) 啟動子、血小板衍生生長因子 β 鏈 (PDGFβ) 啟動子、囊泡麩胺酸轉運蛋白 (VGLUT) 啟動子、體抑素 (SST) 啟動子、神經肽 Y (NPY) 啟動子、血管活性腸肽 (VIP) 啟動子、小白蛋白 (PV) 啟動子、麩胺酸去羧酶 (GAD65 或 GAD67) 啟動子、多巴胺 1 受體 (DRD1) 及多巴胺 2 受體 (DRD2) 啟動子、微管相關蛋白 1B (MAP1B)、補體組分 1 q 亞組分樣 2 (C1ql2) 啟動子、原腦啡黑皮質素 (POMC) 啟動子及 Prospero 同源異形盒蛋白 1 (PROX1) 啟動子。hSyn 及 CaMKII 啟動子之變體先前已在以下文獻中描述：Hioki 等人 Gene Therapy14:872-82 (2007) 及 Sauerwald 等人 J. Biol. Chem.265(25):14932-7 (1990)，其等之揭露以引用方式併入本文，因為它們涉及特定的 hSyn 及 CaMKII 啟動子序列。適用於在海馬 DG 細胞中特異性地驅動多核苷酸表現的啟動子包括 C1ql2、POMC 及 PROX1 啟動子。
在特定實例中，本揭露之表現載體包括 SYN 啟動子 (諸如人類 SYN 啟動子 (hSyn)，例如以下中之任一者：SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 682 至 682 及 790 中任一者之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)。在另一實例中，本揭露之表現載體包括 CAMKII 啟動子 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中任一者之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。在又一實例中，本揭露之表現載體包括 C1QL2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791 或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791 具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)。
合成啟動子、雜合啟動子等亦可與本文所揭示之方法及組成物結合使用。此外，衍生自非病毒基因諸如鼠金屬硫蛋白基因的序列亦可用於本文。此類啟動子序列可從例如 Stratagene (San Diego, CA) 商購獲得。適合與表現載體 (例如，質體或病毒載體，諸如 AAV 或慢病毒載體) 合用的示例性啟動子序列在下表 5 及表 6 中提供。 表 5 ：示例性神經元特異性啟動子序列
啟動子 SEQ ID NO 核 苷酸序列 GenBank RefSeq
Syn (short_1； 智人)    682 ctgcagagggccctgcgtatgagtgcaagtgggttttaggaccaggatgaggcggggtgggggtgcctacctgacgaccgaccccgacccactggacaagcacccaacccccattccccaaattgcgcatcccctatcagagagggggaggggaaacaggatgcggcgaggcgcgtgcgcactgccagcttcagcaccgcggacagtgccttcgcccccgcctggcggcgcgcgccaccgccgcctcagcactgaaggcgcgctgacgtcactcgccggtcccccgcaaactccccttcccggccaccttggtcgcgtccgcgccgccgccggcccagccggaccgcaccacgcgaggcgcgagataggggggcacgggcgcgaccatctgcgctgcggcgccggcgactcagcgctgcctcagtctgc M55301.1
Syn (short_2； 智人)    683 ctgcagagggccctgcgtatgagtgcaagtgggttttaggaccaggatgaggcggggtgggggtgcctacctgacgaccgaccccgacccactggacaagcacccaacccccattccccaaattgcgcatcccctatcagagagggggaggggaaacaggatgcggcgaggcgcgtgcgcactgccagcttcagcaccgcggacagtgccttcgcccccgcctggcggcgcgcgccaccgccgcctcagcactgaaggcgcgctgacgtcactcgccggtcccccgcaaactccccttcccggccaccttggtcgcgtccgcgccgccgccggcccagccggaccgcaccacgcgaggcgcgagataggggggcacgggcgcgaccatctgcgctgcggcgccggcgactcagcgctgcctcagtctgccaattgcagcggaggagtcgtgtcgtgcctgagagcgcag M55301.1
Syn (short_2.5； 智人) 790 CTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCCAATTGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGGGCGCGCC M55301.1
Syn (short_3； 智人) 684 CTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCG M55301.1
Syn (long_1； 智人) 685 ctgcagagggccctgcgtatgagtgcaagtgggttttaggaccaggatgaggcggggtgggggtgcctacctgacgaccgaccccgacccactggacaagcacccaacccccattccccaaattgcgcatcccctatcagagagggggaggggaaacaggatgcggcgaggcgcgtgcgcactgccagcttcagcaccgcggacagtgccttcgcccccgcctggcggcgcgcgccaccgccgcctcagcactgaaggcgcgctgacgtcactcgccggtcccccgcaaactccccttcccggccaccttggtcgcgtccgcgccgccgccggcccagccggaccgcaccacgcgaggcgcgagataggggggcacgggcgcgaccatctgcgctgcggcgccggcgactcagcgctgcctcagtctgcGGTGGgcagcggaggagtcgtgtcgtgcctgagagcgcagggcgcgcc M55301.1
NeuN ( 智人) 686 gaggaggaggagagagaccgggagggcgcccgggaggcagggcgcgcgcACACTCCGAGG NG_053112.1
CaMKII_1 802 CATTATGGCCTTAGGTCACTTCATCTCCATGGGGTTCTTCTTCTGATTTTCTAGAAAATGAGATGGGGGTGCAGAGAGCTTCCTCAGTGACCTGCCCAGGGTCACATCAGAAATGTCAGAGCTAGAACTTGAACTCAGATTACTAATCTTAAATTCCATGCCTTGGGGGCATGCAAGTACGATATACAGAAGGAGTGAACTCATTAGGGCAGATGACCAATGAGTTTAGGAAAGAAGAGTCCAGGGCAGGGTACATCTACACCACCCGCCCAGCCCTGGGTGAGTCCAGCCACGTTCACCTCATTATAGTTGCCTCTCTCCAGTCCTACCTTGACGGGAAGCACAAGCAGAAACTGGGACAGGAGCCCCAGGAGACCAAATCTTCATGGTCCCTCTGGGAGGATGGGTGGGGAGAGCTGTGGCAGAGGCCTCAGGAGGGGCCCTGCTGCTCAGTGGTGACAGATAGGGGTGAGAAAGCAGACAGAGTCATTCCGTCAGCATTCTGGGTCTGTTTGGTACTTCTTCTCACGCTAAGGTGGCGGTGTGATATGCACAATGGCTAAAAAGCAGGGAGAGCTGGAAAGAAACAAGGACAGAGACAGAGGCCAAGTCAACCAGACCAATTCCCAGAGGAAGCAAAGAAACCATTACAGAGACTACAAGGGGGAAGGGAAGGAGAGATGAATTAGCTTCCCCTGTAAACCTTAGAACCCAGCTGTTGCCAGGGCAACGGGGCAATACCTGTCTCTTCAGAGGAGATGAAGTTGCCAGGGTAACTACATCCTGTCTTTCTCAAGGACCATCCCAGAATGTGGCACCCACTAGCCGTTACCATAGCAACTGCCTCTTTGCCCCACTTAATCCCATCCCGTCTGTTAAAAGGGCCCTATAGTTGGAGGTGGGGGAGGTAGGAAGAGCGATGATCACTTGTGGACTAAGTTTGTTCGCATCCCCTTCTCCAACCCCCTCAGTACATCACCCTGGGGGAACAGGGTCCACTTGCTCCTGGGCCCACACAGTCCTGCAGTATTGTGTATATAAGGCCAGGGCAAAGAGGAGCAGGTTTTAAAGTGAAAGGCAGGCAGGTGTTGGGGAGGCAGTTACCGGGGCAACGGGAACAGGGCGTTTCGGAGGTGGTTGCCATGGGGACCTGGATGCTGACGAAGGCTCGCGAGGCTGTGAGCAGCCACAGTGCCCTGCTCAGAAGCCCCAAGCTCGTCAGTCAAGCCGGTTCTCCGTTTGCACTCAGGAGCACGGGCAGGCGAGTGGCCCCTAGTTCTGGGGGCAGC AJ222796.1
CaMKII (α； 智人) 687 gatgctgacgaaggctcgcgaggctgtgagcagccacagtgccctgctcAGAAGCCCCGG NM_171825
CaMKII (β1； 智人) 688 gtctcccgcgcccgcgcccgtgtcgccgccgtgcccgcgagcgggagccGGAGTCGCCGC NM_172084
CaMKII (β2； 智人) 689 cgtgtgcagatgcagggcgccggtgccctgcgggtgcgggtgcaggagcAGCGTGTGCAG NM_172084
CaMKII (δ； 智人) 690 ccccacgccaccctttctggtcatctcccctcccgccccgcccctgcgcACACTCCCTCG NM_172115
CaMKII (γ； 智人) 691 tctccccggtaaagtctcgcggtgctgccgggctcagccccgtctcctcCTCTTGCTCCC NM_172171
NSE/ENO2 (異構體 1； 智人) 692 cgcctcctccgcccgccgcccgggagccgcagccgccgccgccactgccACTCCCGCTCT NM_001975
NSE/ENO2 (異構體 2； 智人) 693 tgggtgcccccacccttcccccatcctcctcccttccccactccaccctCGTCGGTCCCC NM_001975
PDGFβ (異構體 1； 智人) 694 aaaaaaaaaaaaaaagcccaccctccagcctcgctgcaaagagaaaaccGGAGCAGCCGC NM_033016
PDGFβ (異構體 2； 智人) 695 tctcgcactctcccttctcctttataaaggccggaacagctgaaagggtGGCAACTTCTC NM_033016
PDGFβ (異構體 3； 智人) 696 gccgcgtccacctgtcggccgggcccagccgagcgcgcagcgggcacgcCGCGCGCGCGG NM_033016
VGluT1/SLC17A7 ( 智人) 697 gcgccccgcccccggcgctgagtcctgtgacagcccccgggccgcctgcACTTGCAGCCT NM_020309
VGluT2/SLC17A6 (異構體 1； 智人) 698 aaagaagagtcccctattcctgaaacttactctgtccgtggtgctgaaaCATTGTACCGA NM_020346
VGluT2/SLC17A6 (異構體 2； 智人) 699 cgtcctcaaagagcagcaagccttctccatcttaatttgactctaccgcAGAGCAGACTT NM_020346
VGluT2/SLC17A6 (異構體 3； 智人) 700 atgcagctattctgttgtattctcattctcactctccctcccttctctcACTCTCACTCT NM_020346
VGluT3/SLC17A8 ( 智人) 701 catgttagcgtccccagctgcagcccagggagggagagaggctgcgctcAGTCTGAGAGT NM_001145288
SST (異構體 1； 智人) 702 tgacgtcagagagagagtttaaaacagagggagacggttgagagcacacAAGCCGCTTTA NM_001048
SST (異構體 2； 智人) 703 gagtgaaaataaaagattgtataaatcgtggggcatgtggaattgtgtgTGCCTGTGCGT NM_001048
NPY ( 智人) 704 gccgcggcgaggaagctccataaaagccctgtcgcgacccgctctctgcACCCCATCCGC NM_000905
VIP (異構體 1； 智人) 705 cagtcctaagtataagccctataaaatgatgggctttgaaatgctggtcAGGGTAGAGTG NM_194435
VIP (異構體 2； 智人) 706 ttttccattaatgttttcagactgctgttgaccacaggtaactgaaatcATGGAAAGAGA NM_194435
PV (異構體 1； 智人) 707 tggtcatatgagcagaaatgatgagaaaagcactttttaatcttttcgcACTTGCTCTGC NM_002854
PV (異構體 2； 智人) 708 aatagccagagcagaagcctatataggtggccatcccacctccaggctcACTTCCCGACA NM_002854
PV (異構體 3； 智人) 709 cagcgctcagattttgcagcataaatttgcatccaggacagaccagagcAGAGGCTGAGG    NM_002854
GAD65/GAD2 (異構體 1； 智人) 710 gcacgcacgcgcgcgcagggccaagcccgaggcagctcgcccgcagctcGCACTCGCAGG NM_001134366
GAD65/GAD2 (異構體 2； 智人) 711 cccgcctctggctcgcccgaggacgcgctggcacgcctcccaccccctcACTCTGACTCC NM_001134366
GAD65/GAD2 (異構體 3； 智人) 712 cactgggctccctttccctcaaatgctctggggctctccgcgctttcctGAGTCCGGGCT NM_001134366
GAD65/GAD2 (異構體 4； 智人) 713 cacagaaaactcctctgggccacgcttcccgcctcgccgaggtctccccAGTCTGCCCCT NM_001134366
GAD67/GAD1 (異構體 1； 智人) 714 ctctgcccccgcctaccccggagccgtgcagccgcctctccgaatctctCTCTTCTCCTG NM_013445
GAD67/GAD1 (異構體 2； 智人) 715 ctggatttataatcgccctataaagctccagaggcggtcaggcacctgcAGAGGAGCCCC NM_013445
DRD1 ( 智人) 716 gggacgcgcgggcggggtgggctgtgccccgcgggaaccccgccggcctgtgcgcttgctg NM_000794
DRD2 (異構體 1； 智人) 717 ctccctcccgcgctccccgcgctcgggcgccgcagagctgtccagcttcAGTGCCGAACC NM_016574
DRD2 (異構體 2； 智人) 718 gtactggtgtacaaggacaaggtgactttttttcttttcccagattgaaAGGGCCAAAGA NM_016574
C1ql2 1 ( 智人) 719 cctccgccgctcagccccggactccttacgtcagggtagcggggtccccCCTCCGCGCGG NM_182528
C1ql2 2 ( 智人) 791 CGATCCTATCACGAGACTAGCCTCGAGAAGCTTGATATCAGCACCCACATAGCAGCTCACAAATGTCTGAAACTCCAATTCTTGGGAATCTGACACGATCACACATGCAGGCAAAATACCAATGTACATGAATTAAAAAAAAAAAAAACAACCTTTAAAAGAAACAAGGGTTCAGTACCACTACTGACATCTTGTTTCCCCAGAGGCCTTACTTTAATTATTTATTGTTTCCACTTAGTTGCTCAATTAATTAATTTAGAGGTTTTTTTCTTCCTTTCTTTTTCTTTTTTCTTTCTCTCTTTTTTTTCTTCTTAAGACAGGGTTTCTCTGTGTAGCTCAGGCTATCCTGGAACTCACTCTGTAGACCAGGCTGGCCTTGTACTCAAAGATCTGCCTGCCTCTGCCTCCCCAGTGCTGGGATTAAAGACATGCACCATCACTGCCCTGCTTTCCTCTTTTTATTTTGAAAATTGTTCATCAACAGTTACTAAACGTGTTCGAATTCCAAGAGCTGACTAGACATATAAGACCATTCAGCCTTCTGAATAAGATGTAGGTGTGCCCCTCCTCTTACTCCTCTATTTGGAAGTTGGTTACTTTCTGTATGTAGTATGCGAATCCCCCTCTGCCACCCCGCTTTCTGTTTTAAAACAGAAAAGGCTGCAACATACAGTGTGTGCTTCTGTTCTTGAACTGGAAGCTTAGGCTGTCCTGGACTTGGGTTGAGACCTGGGCTCATCCAGATAGGAAATGGATTTGGTGACCCCGCCAGGACTTCGCAGGCACCACATCGTGGTCGTGTGTGGGTGCTGTATGCACCCACTGATTGCGCGCGTGGGTTCCAGAGCTTGGTGGTCTGCGAGAGGAGAGTGGGCAAGAGTGGGTGTGTCTGTGGAGCCCCAGCTAGGGGCTGCTGCCCGCTGCTCCCACTTGTGGCTCCTGGGCGCCGCCAGCAGGCACATCTCCGGAGGACGCCGCGGGATGGGAGCTGATGACAGGAGAGCGCCGTCTCCCGAGTGATGGCAGCGCACGCTGCTGCCTCGCCGCCTCCGCCGCTCAGTCCTGATCTTACGTTAGGGTAGCTGGGTACCCCCTCCGCCCGGGAACCAGCTAGTAGAGGGAGAACAGAGCAGAGCGTGCGGCAGAGCCGATCCCGCGTCCCGCCGAACCCTGCCAAGCCCCGCCAATCCCAGCAGAGCAGGAACCAGCGCAGCTGAGCCAACACCGGACGCCGCACTGAGACCCAGCATTCCCCAGCCGCCACTACCCGGTCCCCGCCGGGGTGCCGGGCTCGTCCTGTGAGCCCCTCGTCATGCGTGTCGGGCTCTTCGACTCTCCAGATCAGTTCCAGAGCGCT AC01667.5 AC084310
POMC ( 智人) 720 ccaggagagctcggcaagtatataaggacagaggagcgcgggaccaagcGGCGGCGAAGG NM_001319204
PROX1 (異構體 1； 智人) 721 ttccttcagctgtgtcttaaagtaaatcttgttgtggagcggagccctcAGCTGAGGGAG NM_002763
PROX1 (異構體 2) 722 gtaagtatcttcttcttcccctcgtgagtccctccccttttccagaatcACTTGCACTGT NM_002763
MAP1B (異構體 1； 智人) 723 ggggcggagcggagacagtaccttcggagataatcctttctcctgccgcAGTGGAGAGGA NM_005909
MAP1B (異構體 2； 智人) 724 ccctgcctagtctccatataaaagcggcgccgcctccccgccctctctcACTCCCCGCTC NM_005909
MAP1B (異構體 3； 智人) 725 gggcggcccagccccaggttacgtcgtccccagaaagaatctggccaacAGTCTGGCCGT NM_005909
Tα-1/TUBA1A (異構體 1； 智人) 726 atgctaatacaccttaattttacgattttttcacttttcctccccacagCGTGAGTGCAT NM_006009
Tα-1/TUBA1A (異構體 1； 智人) 727 taaccccagtcccctttcttctccttccgcccctccccaaccccgccccATAATGGATGC NM_006009
在特定實例中，本揭露之病毒載體 (例如，AAV 載體) 併入了神經元特異性啟動子序列。在特定實例中，神經元特異性啟動子為人類 Syn 啟動子，諸如具有以下中之任一者之核酸序列的人類 Syn 啟動子：SEQ ID NO: 682 至 685 及 SEQ ID NO: 790 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 682 至 685 及 SEQ ID NO: 790。
在另一實例中，神經元特異性啟動子為 NeuN 啟動子序列，諸如 NeuN 啟動子序列 SEQ ID NO: 686 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 686。
在另一實例中，神經元特異性啟動子為 CaMKII 啟動子序列，諸如以下中之任一者的 CaMKII 啟動子序列 SEQ ID NO: 687 至 691 及 SEQ ID NO: 802 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 687 至 691 及 SEQ ID NO: 802。
額外的 CaMKII 啟動子可包括以下文獻中描述的人類 α CaMKII 啟動子序列：Wang 等人 ( Mol. Biol. Rep.35(1): 37-44, 2007)，其揭露以其整體併入本文，因為其涉及 CaMKII 啟動子序列。
在另一實例中，神經元特異性啟動子為 NSE 啟動子序列，諸如 NSE 啟動子序列 SEQ ID NO: 692 或 SEQ ID NO: 693 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 692 或 SEQ ID NO: 693。
在另一實例中，神經元特異性啟動子為 PDGFβ 啟動子序列，諸如 PDGFβ 啟動子序列 SEQ ID NO: 694 至 696 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 694 至 696。
在另一實例中，神經元特異性啟動子為 VGluT 啟動子序列，諸如 VGluT 啟動子序列 SEQ ID NO: 697 至 701 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 708 至 712。
在另一實例中，神經元特異性啟動子為 SST 啟動子序列，諸如 SST 啟動子序列 SEQ ID NO: 702 或 SEQ ID NO: 703 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 702 或 SEQ ID NO: 703。
在另一實例中，神經元特異性啟動子為 NPY 啟動子序列，諸如 NPY 啟動子序列 SEQ ID NO: 704 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 704。
在另一實例中，神經元特異性啟動子為 VIP 啟動子序列，諸如 VIP 啟動子序列 SEQ ID NO: 705 或 SEQ ID NO: 706 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 705 或 SEQ ID NO: 706。
在另一實例中，神經元特異性啟動子為 PV 啟動子序列，諸如 PV 啟動子序列 SEQ ID NO: 707 至 709 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 718 至 720。
在另一實例中，神經元特異性啟動子為 GAD65 啟動子序列，諸如 GAD65 啟動子序列 SEQ ID NO: 710 至 713 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 710 至 713。
在另一實例中，神經元特異性啟動子為 GAD67 啟動子序列，諸如 GAD67 啟動子序列 SEQ ID NO: 714 或 SEQ ID NO: 715 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 714 或 SEQ ID NO: 715。
在另一實例中，神經元特異性啟動子為 DRD1 啟動子序列，諸如 DRD1 啟動子序列 SEQ ID NO: 716 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 716。
在另一實例中，神經元特異性啟動子為 DRD2 啟動子序列，諸如 DRD2 啟動子序列 SEQ ID NO: 717 或 SEQ ID NO: 718 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 717 或 SEQ ID NO: 718。
在另一實例中，神經元特異性啟動子為 C1ql2 啟動子序列，諸如 C1ql2 啟動子序列 SEQ ID NO: 719 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791。
在另一實例中，神經元特異性啟動子為 POMC 啟動子序列，諸如 POMC 啟動子序列 SEQ ID NO: 720 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 720。
在另一實例中，神經元特異性啟動子為 PROX1 啟動子序列，諸如 PROX1 啟動子序列 SEQ ID NO: 721 或 SEQ ID NO: 722 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 737 或 738。
在又一實例中，神經元特異性啟動子為 MAP1B 啟動子序列，諸如 MAP1B 啟動子序列 SEQ ID NO: 723 至 725 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 723 至 725。
在又一實例中，神經元特異性啟動子為 Tα-1 啟動子序列，諸如 Tα-1 啟動子序列 SEQ ID NO: 726 或 SEQ ID NO: 727 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 726 或 SEQ ID NO: 727。 表 6 ：示例性普存啟動子序列
啟動子 SEQ ID NO 核 苷酸序列 RefSeq
U6 小核 1；智人    728 CCCCAGTGGAAAGACGCGCAGGCAAAACGCACCACGTGACGGAGCGTGACCGCGCGCCGAGCCCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGTGCTCGCTTCGGCAGCACATATACTAAAATTGGAACGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAGGATGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTCCATATTTTTACATCAGGTTGTTTTTCTGTTTTTACATCAGGTTGTTTTTCTGTTTGGTTTTTTTTTTACACCACGTTTATACGCCGGTGCACGGTTTACCA M14486.1
U6 短 249 bp       729 GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG M14486.1   
最小的 U6 111 bp 730 GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATAGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG M14486.1   
U6 變體 – 僅 TATA 46 bp 731 TTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG (Preece 等人，Gene Therapy, 2020)
U6 變體 - PSE+TATA 75 bp 732 ATACGATAGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG (Preece 等人，Gene Therapy, 2020)
U6 變體- SPH-OCT+TATA 82 bp 733 GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATTTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACG (Preece 等人，Gene Therapy, 2020)
U6 (小鼠) 772 ATCCGACGCCGCCATCTCTAGGCCCGCGCCGGCCCCCTCGCACAGACTTGTGGGAGAAGCTCGGCTACTCCCCTGCCCCGGTTAATTTGCATATAATATTTCCTAGTAACTATAGAGGCTTAATGTGCGATAAAAGACAGATAATCTGTTCTTTTTAATACTAGCTACATTTTACATGATAGGCTTGGATTTCTATAAGAGATACAAATACTAAATTATTATTTTAAAAAACAGCACAAAAGGAAACTCACCCTAACTGTAAAGTAATTGTGTGTTTTGAGACTATAAATATCCCTTGGAGAAAAGCCTTGTT   
H1 734 AATATTTGCATGTCGCTATGTGTTCTGGGAAATCACCATAAACGTGAAATGTCTTTGGATTTGGGAATCTTATAAGTTCTGTATGAGACCACTCTTTCCC X16612.1   
7SK 735 ctgcagtatttagcatgccccacccatctgcaagtgcattctggatagtgtcaaaacaggcggaaatcaagtccgtttatctcaaactttagcattttgggaataaatgatatttgctatgctggttaaattagattttagttaaatttcctgatgaagctctagtacgataagcaacttgacctaagtgtaaagttgagatttccttcaggtttatatagcttgtgcgccgcctgggta cctc X05490.1
ApoE.hAAT 736 AGGCTCAGAGGCACACAGGAGTTTCTGGGCTCACCCTGCCCCCTTCCAACCCCTCAGTTCCCATCCTCCAGCAGCTGTTTGTGTGCTGCCTCTGAAGTCCACACTGAACAAACTTCAGCCTACTCATGTCCCTAAAATGGGCAAACATTGCAAGCAGCAAACAGCAAACACACAGCCCTCCCTGCCTGCTGACCTTGGAGCTGGGGCAGAGGTCAGAGACCTCTCTGGGCCCATGCCACCTCCAACATCCACTCGACCCCTTGGAATTTCGGTGGAGAGGAGCAGAGGTTGTCCTGGCGTGGTTTAGGTAGTGTGAGAGGGGTACCCGGGGATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATACGGACGAGGACAGGGCCCTGTCTCCTCAGCTTCAGGCACCACCACTGACCTGGGACAGT
CAG 737 GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAG
CB/CBA 738 CGCGTGGTACCTCTGGTCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACTCGAGGCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGCGGGATCAGCCACCGCGG
CK8 739 CCACTACGGGTTTAGGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCAGACATGTGGCTGCCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTCTAAAAATAACCCTGTCCCTGGTGGATCCCACTACGGGTTTAGGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCAGACATGTGGCTGCCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTCTAAAAATAACCCTGTCCCTGGTGGATCCCACTACGGGTTTAGGCTGCCCATGTAAGGAGGCAAGGCCTGGGGACACCCGAGATGCCTGGTTATAATTAACCCAGACATGTGGCTGCCCCCCCCCCCCCCAACACCTGCTGCCTCTAAAAATAACCCTGTCCCTGGTGGATCCCCTGCATGCGAAGATCTTCGAACAAGGCTGTGGGGGACTGAGGGCAGGCTGTAACAGGCTTGGGGGCCAGGGCTTATACGTGCCTGGGACTCCCAAAGTATTACTGTTCCATGTTCCCGGCGAAGGGCCAGCTGTCCCCCGCCAGCTAGACTCAGCACTTAGTTTAGGAACCAGTGAGCAAGTCAGCCCTTGGGGCAGCCCATACAAGGCCATGGGGCTGGGCAAGCTGCACGCCTGGGTCCGGGGTGGGCACGGTGCCCGGGCAACGAGCTGAAAGCTCATCTGCTCTCAGGGGCCCCTCCCTGGGGACAGCCCCTCCTGGCTAGTCACACCCTGTAGGCTCCTCTATATAACCCAGGGGCACAGGGGCTGCCCTCATTCTACCACCACCTCCACAGCACAGACAGACACTCAGGAGCCAGCCAGCGTCGA
mU1a 740 ATGGAGGCGGTACTATGTAGATGAGAATTCAGGAGCAAACTGGGAAAAGCAACTGCTTCCAAATATTTGTGATTTTTACAGTGTAGTTTTGGAAAAACTCTTAGCCTACCAATTCTTCTAAGTGTTTTAAAATGTGGGAGCCAGTACACATGAAGTTATAGAGTGTTTTAATGAGGCTTAAATATTTACCGTAACTATGAAATGCTACGCATATCATGCTGTTCAGGCTCCGTGGCCACGCAACTCATACT
EF-1α 741 GGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAG
TBG 742 GGGCTGGAAGCTACCTTTGACATCATTTCCTCTGCGAATGCATGTATAATTTCTACAGAACCTATTAGAAAGGATCACCCAGCCTCTGCTTTTGTACAACTTTCCCTTAAAAAACTGCCAATTCCACTGCTGTTTGGCCCAATAGTGAGAACTTTTTCCTGCTGCCTCTTGGTGCTTTTGCCTATGGCCCCTATTCTGCCTGCTGAAGACACTCTTGCCAGCATGGACTTAAACCCCTCCAGCTCTGACAATCCTCTTTCTCTTTTGTTTTACATGAAGGGTCTGGCAGCCAAAGCAATCACTCAAAGTTCAAACCTTATCATTTTTTGCTTTGTTCCTCTTGGCCTTGGTTTTGTACATCAGCTTTGAAAATACCATCCCAGGGTTAATGCTGGGGTTAATTTATAACTAAGAGTGCTCTAGTTTTGCAATACAGGACATGCTATAAAAATGGAAAGAT
在另一實例中，本揭露之病毒載體 (例如，AAV 載體) 併入了能夠表現本揭露之反義構建體的普存啟動子序列。在一個實例中，普存啟動子為 RNA Pol II 或 RNA Pol III 啟動子。示例性 Pol II 及 Pol III 啟動子在以下文獻中描述：Preece 等人 Gene Ther. 27:451-8(2020) 及 Jawdekar 等人 Biochim. Biophys.Acta 1779(5):295-305 (2008)，其等之揭露以引用方式併入本文，因為它們涉及 RNA Pol II 及 RNA Pol III 啟動子。例如，適合包含在本揭露之載體中的 RNA Pol III 啟動子可為 U6 小核 1 啟動子，諸如具有下列中之任一者之核酸序列的 U6 小核 1 啟動子：SEQ ID NO: 728 至 733 或 772 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 728 至 733 或 772。
在另一實例中，RNA Pol III 啟動子為 H1 啟動子，諸如具有以下之核酸序列的 H1 啟動子：SEQ ID NO: 734 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 734。
在另一實例中，RNA Pol III 啟動子為 7SK 啟動子，諸如具有以下之核酸序列的 7SK 啟動子：SEQ ID NO: 735 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 735。
在另一實例中，普存啟動子為載脂蛋白 E (ApoE)-人類 α 1-抗胰蛋白酶 (hAAT；ApoE-hAAT) 啟動子，諸如具有以下之核酸序列的 ApoE-hAAT 啟動子：SEQ ID NO: 736 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 736。
在另一實例中，普存啟動子為 CAG 啟動子，其包括巨細胞病毒 (CMV) 早期增強子元件;雞 β-肌動蛋白基因之啟動子、第一外顯子及第一內含子；以及兔 β-珠蛋白基因之剪接受體，諸如具有以下之核酸序列的 CAG 啟動子：SEQ ID NO: 737 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 737。
在另一實例中，普存啟動子為雞 β 肌動蛋白 (CBA) 啟動子，諸如具有以下之核酸序列的 CBA 啟動子：SEQ ID NO: 738 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 738。
在另一實例中，普存啟動子為肌酸激酶啟動子的變體，CK8 啟動子，諸如具有以下之核酸序列的 CK8 啟動子：SEQ ID NO: 739 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 739。
在另一實例中，普存啟動子為小鼠 U1 小核 RNA (mU1a) 啟動子，諸如具有以下之核酸序列的 mU1a 啟動子：SEQ ID NO: 740 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 740。
在另一實例中，普存啟動子為延長因子 1α (EF-1α) 啟動子，例如具有以下之核酸序列的 EF-1α 啟動子：SEQ ID NO: 741 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 741。
在另一實例中，普存啟動子為甲狀腺素結合球蛋白 (TBG) 啟動子，諸如具有以下之核酸序列的 TBG 啟動子：SEQ ID NO: 742 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 742。
一旦編碼所揭示之 ASO 劑的多核苷酸已併入哺乳動物細胞之核 DNA 內，即可藉由本領域已知之方法誘導該多核苷酸的轉錄。例如，可以藉由將哺乳動物細胞暴露於外部化學試劑來誘導表現，該化學試劑諸如調節轉錄因子及/或 RNA 聚合酶與哺乳動物啟動子的結合並因此調節基因表現的試劑。化學試劑可用於促進 RNA 聚合酶及/或轉錄因子與哺乳動物啟動子的結合，例如，藉由去除已結合啟動子的阻遏蛋白。替代地，化學試劑可用於增強哺乳動物啟動子對 RNA 聚合酶及/或轉錄因子的親及力，使得位於啟動子下游之基因的轉錄速率在化學試劑存在下增加。藉由上述機制增強多核苷酸轉錄的化學試劑之實例為四環素及去氧羥四環素。此等試劑可商購 (Life Technologies, Carlsbad, CA) 並且可根據已確立之方案向哺乳動物細胞投予，以便促進基因表現。
可包含在用於本文所述的組成物及方法中的多核苷酸中的其他 DNA 序列元件為增強子序列。增強子代表另一類調節元件，其誘導含有目標基因的多核苷酸的構形變化，使得 DNA 採用有利於在轉錄起始位點結合轉錄因子及 RNA 聚合酶的三維取向。因此，用於本文所述的組成物及方法中的多核苷酸包括彼等編碼靶向 Grik2的 ASO 劑的多核苷酸並且另外包括哺乳動物增強子序列。許多增強子序列現在已知來自哺乳動物基因，且實例為來自編碼哺乳動物珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α 胎蛋白及胰島素的基因的增強子。用於本文所述的組成物及方法中的增強子亦包括彼等衍生自能夠感染真核細胞的病毒的遺傳物質者。實例為位於複製起點後側上之 SV40 增強子 (bp 100 至 270)、巨細胞病毒早期啟動子增強子、位於複製起點後側上之多瘤病毒增強子、及腺病毒增強子。在 Yaniv 等人，Nature 297:17 (1982) 中揭示了誘導真核基因轉錄之活化的其他增強子序列。可將增強子剪接至含有編碼本揭露之反義構建體的多核苷酸的載體中，例如，在該基因的 5' 或 3' 位置處。以特定之取向，增強子定位在啟動子的 5' 側，而啟動子又定位在相對於編碼本揭露之 ASO 劑的多核苷酸的 5' 側。增強子序列之非限制性實例提供於下表 7 中。
可包括在用於本文所述的組成物及方法中的多核苷酸中的額外調節元件為內含子序列。內含子序列為在前驅 mRNA 中發現的非蛋白質編碼 RNA 序列，其在 RNA 剪接過程中經去除以產生成熟的 mRNA 產物。內含子序列對於基因表現的調節很重要，因為它們可經進一步加工以產生其他非編碼 RNA 分子。選擇性剪接、無義介導的降解及 mRNA 輸出為已證明受內含子序列調節的生物過程。內含子序列亦可透過內含子介導的增強來促進轉基因的表現。內含子序列之非限制性實例提供於下表 7 中。
可與本揭露之載體結合使用的其他調控元件包括反向末端重複 (ITR) 序列。ITR 序列見於例如 AAV 基因體中的 5' 及 3' 端處，各自通常包含約 145 個鹼基對。AAV ITR 序列對於 AAV 基因體倍增特別重要，一旦 AAV 載體經併入細胞內，它就會促進互補股合成。此外，已證明 ITR 對於 AAV 基因體整合到宿主細胞基因體內及 AAV 基因體的殼體化至關重要。ITR 序列之非限制性實例提供於下表 7 中。
適合併入本揭露之載體中的額外調控元件包括多腺苷酸化序列 (亦即，polyA 序列)。PolyA 序列為含有一段腺嘌呤鹼基的 RNA 尾。此等序列附加到 RNA 分子之 3' 端以產生成熟的 mRNA 轉錄本。與 mRNA 加工及運輸相關的數個生物過程由多腺苷酸序列調節，包括核輸出、轉譯及穩定性。在哺乳動物細胞中，縮短多腺苷酸尾使得 mRNA 降解的可能性增加。多腺苷酸序列的非限制性實例提供於下表 7 中。 表 7 ：示例性調節序列
調節元件 SEQ ID NO 核 苷酸序列
嵌合內含子 743 GTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG
VH4 內含子 744 GTGAGTATCTCAGGGATCCAGACATGGGGATATGGGAGGTGCCTCTGATCCCAGGGCTCACTGTGGGTCTCTCTGTTCACAG
CMV 增強子 745 CGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATG
AAV 5'-ITR 746 CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT
經修飾之 AAV 5'-ITR (用於自互補 AAV 的 D 序列缺失) 747 CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGG
AAV 3'-ITR 1 748 GAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA
AAV 3'-ITR 2 789 AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG
經修飾之 AAV 3'-ITR (用於自互補 AAV 的 D 序列缺失) 749 TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG
兔 β-珠蛋白 (RBG) 多腺苷酸訊息 #1 750 ATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCA
RBG PolyA #2 751 GATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCG
RBG PolyA #3 792 GATCCGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCG
牛生長激素 (BGH) 多腺苷酸 793 TAGCAGGCATGCTGGGGAG
在其他實例中，本揭露之病毒載體 (例如，AAV 載體) 併入了一個或多個能夠促進本揭露之反義構建體表現的調節序列元件。在一個實例中，調節序列元件為內含子序列。例如，適合包含在本揭露之載體中的內含子序列可為嵌合內含子，諸如具有以下之核酸序列的嵌合內含子：SEQ ID NO: 743 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 743。
在另一實例中，內含子序列為免疫球蛋白重鏈可變 4 (VH4) 內含子，諸如具有以下之核酸序列的 VH4 序列：SEQ ID NO: 744 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 744。
在另一實例中，調節序列元件為增強子序列。例如，增強子序列可為 CMV 增強子，諸如具有以下之核酸序列的 CMV 增強子：SEQ ID NO: 745 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 745。
在另一實例中，調控序列元件為 ITR 序列，諸如 AAV ITR 序列。例如，ITR 序列可為 AAV 5' ITR 序列，諸如具有以下之核酸序列的 AAV 5' ITR 序列：SEQ ID NO: 746 或 SEQ ID NO: 747 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 746 或 SEQ ID NO: 747。
在另一實例中，ITR 序列為 AAV 3' ITR 序列，諸如具有以下之核酸序列的 AAV 3' ITR 序列：SEQ ID NO: 748 或 SEQ ID NO: 749 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 748 或 SEQ ID NO: 749。
在另一實例中，調控序列元件為多腺苷酸化訊息 (亦即，polyA 尾)。例如，適合與本文所揭示之載體合用的多腺苷酸化訊息包括兔 β-珠蛋白 (RBG) 多腺苷酸化訊息，諸如具有下列之核酸序列的 RBG 多腺苷酸化訊息：SEQ ID NO: 750、SEQ ID NO: 751 或 SEQ ID NO: 792 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 71%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 750、SEQ ID NO: 751 或 SEQ ID NO: 792。可與所揭露之組成物及方法結合使用的另一種多腺苷酸化訊息為牛生長激素 (BGH) 多腺苷酸化訊息，諸如以下之 BGH 多腺苷酸化訊息：SEQ ID NO: 793 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 70% (例如，至少 71%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 793. 病毒載體
病毒基因體提供豐富的載體來源，該等載體可用於將外源性多核苷酸有效輸送至哺乳動物細胞。病毒基因體為用於基因輸送的特別有用的載體，因為包含在此類基因體中的多核苷酸通常藉由普遍或專門的轉導併入哺乳動物細胞之核基因體中。此等過程作為自然病毒複製週期的一部分發生，且不需要添加蛋白質或試劑來誘導基因整合。病毒載體之實例為細小病毒 (例如，腺相關病毒 (AAV))、反轉錄病毒 (例如，反轉錄病毒科病毒載體)、腺病毒 (例如，Ad5、Ad26、Ad34、Ad35 及 Ad48)、冠狀病毒、負股 RNA 病毒諸如正黏液病毒 (例如，流感病毒)、棒狀病毒 (例如，狂犬病病毒及水皰性口炎病毒)、副黏液病毒 (例如，麻疹病毒及仙台病毒)、正股 RNA 病毒 (諸如小核糖核酸病毒及 α 病毒) 及雙股 DNA 病毒 (包括腺病毒、疱疹病毒 (例如，單純皰疹病毒第 1 型及第 2 型、艾司坦氏-巴爾氏病毒、巨細胞病毒) 及痘病毒 (例如，牛痘病毒、經修飾之安卡拉牛痘病毒 (MVA)、雞痘病毒及金絲雀痘病毒))。其他病毒包括，例如，Norwalk 病毒、披衣病毒、黃病毒、呼腸孤病毒、乳多泡病毒、嗜肝 DNA 病毒、人類乳突狀瘤病毒、人類泡沫病毒 (human foamy virus) 及肝炎病毒。反轉錄病毒之實例為鳥類白血病性肉瘤性病毒、鳥類 C 型病毒、哺乳動物 C 型、B 型病毒、D 型病毒、致癌反轉錄病毒、HTLV-BLV 組、慢病毒、α 反轉錄病毒、γ 反轉錄病毒、泡沫病毒 (spumavirus) (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, Virology, 第三版 (Lippincott-Raven, Philadelphia, (1996)))。其他實例為鼠類白血病病毒、鼠類肉瘤病毒、鼠類乳腺腫瘤病毒、牛白血病病毒、貓白血病病毒、貓肉瘤病毒、鳥類白血病病毒、人類 T 細胞白血病病毒、狒狒內源性病毒、長臂猿白血病病毒、Mason Pfizer 猴病毒、猿猴免疫缺乏病毒、猿猴肉瘤病毒、Rous 氏肉瘤病毒及慢病毒。載體之其他實例在例如 McVey 等人 (美國專利號 5,801,030) 中描述，其教示以引用方式併入本文。 AAV 載體
本文所述的組成物之核酸可併入 AAV 載體及/或 AAV 病毒顆粒中，以便促進它們引入細胞內，例如，結合本文所揭示之方法。AAV 載體可用於中樞神經系統，且適當的啟動子及血清型在例如 Pignataro 等人， J Neural Transm125(3):575-89 (2017) 中討論，其揭露以引用方式併入本文，因為它涉及在 CNS 基因治療中有用的啟動子及 AAV 血清型。可用於本文所述的組成物及方法中的 rAAV 載體為重組核酸構建體，其包括 (1) 待表現的異源序列 (例如，編碼靶向 Grik2mRNA 的 ASO 劑的多核苷酸) 及 (2) 促進異源基因整合及表現的病毒序列。該等病毒序列可包括順式複制及包裝 DNA 到病毒顆粒中所需的彼等 AAV 之序列 (例如，功能性 ITR)。此類 rAAV 載體亦可含有標記或報導基因。有用的 rAAV 載體具有一個或多個全部或部分缺失之 AAV WT 基因，但保留功能性側翼 ITR 序列。AAV ITR 可為適用於特定應用的任何血清型。使用 rAAV 載體的方法在例如 Tai 等人，J. Biomed.  Sci.7:279 (2000) 以及 Monahan 與 Samulski, Gene Delivery 7:24 (2000) 中描述，由於它們涉及用於基因輸送的 AAV 載體，其各自之揭露皆以引用方式併入本文。
可用作併入本文所述的 ASO 劑 (例如，本文所述的 siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA 或 shmiRNA) 的載體的 AAV 之實例包括，例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.EB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV-TT、AAV-DJ8 及 AAV.HSC16。
可以將本文所述的核酸及載體併入 rAAV 病毒顆粒中以促進將核酸或載體引入細胞內。AAV 之殼體蛋白構成病毒顆粒之外部非核酸部分，且由 AAV cap 基因編碼。cap 基因編碼病毒顆粒組裝所需的三種病毒外殼蛋白 VP1、VP2 及 VP3。rAAV 病毒顆粒的構建已在例如以下文獻中描述：US 5,173,414、US 5,139,941、US 5,863,541、US 5,869,305、US 6,057,152 及 US 6,376,237，以及 Rabinowitz 等人，J. Virol.76:791 (2002) 及 Bowles 等人，J. Virol.77:423 (2003)，其各自之揭露皆以引用方式併入本文，因為它們涉及用於基因輸送的 AAV 載體。
與本文所述的組成物及方法結合使用的 rAAV 病毒顆粒包括衍生自各種 AAV 血清型 (包括 AAV 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 及 rh74) 的彼等病毒顆粒。對於定位在或經輸送至中樞神經系統的靶向細胞，AAV2、AAV9 及 AAV10 可能特別有用。不同血清型的 AAV 載體及 AAV 蛋白的構建及使用在例如以下文獻中描述：Chao 等人，Mol. Ther. 2:619 (2000)；Davidson 等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:3428 (2000)；Xiao 等人，J. Virol.72:2224 (1998)；Halbert 等人，J. Virol.  74:1524 (2000)；Halbert 等人，J. Virol.75:6615 (2001)；及 Auricchio 等人，Hum. Molec. Genet. 10:3075 (2001)，其各自之揭露皆以引用方式併入本文，因為它們涉及用於基因輸送的 AAV 載體。
亦可與本文所述的組成物及方法結合使用者為經假型化之 rAAV 載體。經假型化之載體包括用衍生自給定血清型以外之血清型的殼體基因假型化的給定血清型之 AAV 載體 (AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.EB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV-TT、AAV-DJ8 或 AAV.HSC16)。例如，AAV 可包括經假型化之重組 AAV (rAAV) 載體，諸如 rAAV2/8 或 rAAV2/9 載體。產生及使用經假型化之 rAAV 的方法為本領域已知的 (參見，例如，Duan 等人，J. Virol., 75:7662-7671 (2001)；Halbert 等人，J. Virol., 74:1524-1532 (2000)；Zolotukhin 等人，Methods 28:158-167 (2002)；及 Auricchio 等人，Hum.Molec.Genet.10:3075-3081, (2001)。
在病毒顆粒殼體內具有突變的 AAV 病毒顆粒可用於比未經突變之殼體病毒顆粒有效地感染特定細胞類型。例如，合適之 AAV 突變體可具有配體插入突變，以促進使 AAV 靶向特定細胞類型。AAV 殼體突變體 (包括插入突變體、丙胺酸篩選突變體及表位標籤突變體) 的構建及表征在 Wu 等人，J. Virol.74:8635 (2000) 中描述。可用於本文所述方法中的其他 rAAV 病毒顆粒包括藉由病毒之分子育種並藉由外顯子改組產生的彼等殼體雜合體。參見，例如，Soong 等人，Nat. Genet., 25:436 (2000) 及 Kolman 與 Stemmer, Nat. Biotechnol. 19:423 (2001) 中描述。
在本揭露之組成物及方法中使用的 rAAV 可包括來自選自以下之 AAV 殼體血清型的殼體蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.EB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV.HSC16、AAV-TT、AAVDJ8 或其衍生物、修飾或假型，諸如與選自以下之 AAV 殼體血清型之 vp1、vp2 及/或 vp3 之序列至少 80% 或更多相同 (例如，85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5% 或更多，亦即，高達 100% 相同) 的殼體蛋白：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.EB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV-TT、AAV-DJ8 或 AAV.HSC16。
可用於本文所述方法中的 AAV 載體可為 Anc80 或 Anc80L65 載體，如 Zinn 等人，2015: 1056-1068 中所述，其以引用方式以其整體併入。AAV 載體可包括以下胺基酸插入中之一者：LGETTRP (‘956、‘517、‘282 或 ‘323 之 SEQ ID NO: 14) 或 LALGETTRP (‘956、‘517、‘282 或 ‘323 之 SEQ ID NO: 15)，如美國專利號 9,193,956、9458517 及 9,587,282以及美國專利申請公開號 2016/0376323 中所述，其各自皆以引用方式以其整體併入本文。替代地，用於本文所述方法中的 AAV 載體可為 AAV.7m8，如美國專利號 9,193,956、9,458,517 及 9,587,282以及美國專利申請公開號 2016/0376323 中所述，其各自皆以引用方式以其整體併入本文。再進一步，本文所述方法中使用的 AAV 載體可為美國專利號 9,585,971 中揭示的任何 AAV，諸如 AAV.PHP.B 載體。本文所述方法中使用的另一 AAV 載體可為 Chan 等人 ( Nat Neurosci.20(8):1172-1179, 2017) 中揭示的任何載體，諸如 AAV.PHP.eB，其包含具有插入在胺基酸位置 588 於 589 之間的肽及修飾 A587D/588G 的 AAV9 殼體蛋白。此外，本文所述方法中使用的 AAV 載體可為美國專利號 9,840,719 及 WO 2015/013313 中揭示的任何 AAV，諸如 AAV.Rh74 或 RHM4-1 載體，該等專利各自以引用方式以其整體併入本文。此外，本文所述方法中使用的 AAV 載體可為 WO 2014/172669 中揭示的任何 AAV，諸如 AAV rh.74，該專利以引用方式以其整體併入本文。本文所述方法中使用的 AAV 載體亦可為 AAV2/5 載體，如 Georgiadis 等人，2016, Gene Therapy 23: 857-862 及 Georgiadis 等人，2018, Gene Therapy 25: 450 中所述；該等文獻各自以引用方式以其整體併入。在又一實例中，本文所述方法中使用的 AAV 載體可為 WO 2017/070491 中揭示的任何 AAV，諸如 AAV2tYF 載體，該專利以引用方式以其整體併入本文。此外，本文所述方法中使用的 AAV 載體可為 AAVLK03 或 AAV3B 載體，如 Puzzo 等人，2017, Sci. Transl. Med.29(9): 418 中所述，其以引用方式以其整體併入。在其他實例中，本文所述方法中使用的 AAV 載體可為美國專利號 8,628,966、US 8,927,514、US 9,923,120 及 WO 2016/049230 中揭示的任何 AAV，諸如 HSC1、HSC2、HSC3、HSC4、HSC5、HSC6、HSC7、HSC8、HSC9、HSC10、HSC11、HSC12、HSC13、HSC14、HSC15 或 HSC16，該等專利各自以引用形式以其整體併入。
此外，本文所述方法中使用的 AAV 載體可為以下任何專利及專利申請中揭示的 AAV 載體，各專利及專利申請皆以引用方式以其整體併入本文：美國專利號 7,282,199、7,906,111、8,524,446、8,999,678、8,628,966、8,927,514、8,734,809、US 9,284,357、9,409,953、9,169,299、9,193,956、9458517 及 9,587,282；美國專利申請公開號2015/0374803、2015/0126588、2017/0067908、2013/0224836、2016/0215024、2017/0051257；以及國際專利申請號 PCT/US2015/034799、PCT/EP2015/053335。rAAV 載體可具有殼體蛋白，該殼體蛋白與以下專利及專利申請 (其各自以引用方式以其整體併入本文) 中所揭示的 AAV 殼體之 vp1、vp2 及/或 vp3 胺基酸序列至少 80% 或更多相同 (例如，85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5% 或更多)：美國專利號 7,282,199、7,906,111、8,524,446、8,999,678、8,628,966、8,927,514、8,734,809、US 9,284,357、9,409,953、9,169,299、9,193,956、9458517 及 9,587,282；美國專利申請公開號2015/0374803、2015/0126588、2017/0067908、2013/0224836、2016/0215024、2017/0051257；以及國際專利申請號 PCT/US2015/034799、PCT/EP2015/053335。
此外，rAAV 載體可具有以下文獻中揭示的殼體蛋白：國際申請  公開號 WO 2003/052051 (參見，例如，‘051 之 SEQ ID NO: 2)、WO 2005/033321 (參見，例如，‘321 之 SEQ ID NO: 123 及 88)、WO 03/042397 (參見，例如，‘397 之 SEQ ID NO: 2、81、85 及 97)、WO 2006/068888 (參見，例如，‘888 之 SEQ ID NO: 1 及 3 至 6)、WO 2006/110689 (參見，例如，‘689 之 SEQ ID NO: 5 至 38)、WO2009/104964 (參見，例如，‘964 之 SEQ ID NO: 1 至 5、7、9、20、22、24 及 31)，WO 2010/127097 (參見，例如，‘097 之 SEQ ID NO: 5 至 38) 及 WO 2015/191508 (參見，例如，‘058 之 SEQ ID NO: 80 至 294) 及美國申請公開號 20150023924 (參見，例如，'924 之 SEQ ID NO: 1、5 至 10)，其各自之內容皆以引用方式以其整體併入本文，例如，rAAV 載體具有與以下文獻中揭示之 AAV 殼體之 vp1、vp2 及/或 vp3 胺基酸序列至少 80% (例如 85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5% 或更多) 相同的殼體蛋白：國際申請  公開號 WO 2003/052051 (參見，例如，‘051 之 SEQ ID NO: 2)、WO 2005/033321 (參見，例如，‘321 之 SEQ ID NO: 123 及 88)、WO 03/042397 (參見，例如，‘397 之 SEQ ID NO: 2、81、85 及 97)、WO 2006/068888 (參見，例如，‘888 之 SEQ ID NO: 1 及 3 至 6)、WO 2006/110689 (參見，例如，‘689 之 SEQ ID NO: 5 至 38)、WO2009/104964 (參見，例如，‘964 之 SEQ ID NO: 1 至 5、7、9、20、22、24 及 31)，WO 2010/127097 (參見，例如，‘097 之 SEQ ID NO: 5 至 38) 及 WO 2015/191508 (參見，例如，‘508 之 SEQ ID NO: 80 至 294) 及美國申請公開號 20150023924 (參見，例如，'924 之 SEQ ID NO: 1、5 至 10)。
基於 AAV 之病毒載體的核酸序列以及製備重組 AAV 及 AAV 殼體的方法與以下文獻中教示：美國專利號 7,282,199、7,906,111、8,524,446、8,999,678、8,628,966、8,927,514、8,734,809、US 9,284,357、9,409,953、9,169,299、9,193,956、9458517 及 9,587,282；美國專利申請公開號2015/0374803、2015/0126588、2017/0067908、2013/0224836、2016/0215024、2017/0051257；國際專利申請號 PCT/US2015/034799、PCT/EP2015/053335、WO 2003/052051、WO 2005/033321、WO 03/042397、WO 2006/068888、WO 2006/110689、WO2009/104964、W0 2010/127097 及 WO 2015/191508；以及美國申請公開第 20150023924 號。
據此，rAAV 載體可包括殼體，該殼體含有來自兩種或更多種 AAV 殼體血清型的殼體蛋白，諸如選自以下的 AAV 血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.EB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、AAV-TT、AAV-DJ8 或 AAV.HSC16。
單股 AAV (ssAAV) 載體可與所揭示的方法及組成物結合使用。替代地，可使用自互補 AAV 載體 (scAAV) (參見，例如，Wu, 2007, Human Gene Therapy, 18(2):171-82、McCarty 等人 2001, Gene Therapy, 第 8 卷，第 16 期，第 1248-1254 頁；及美國專利號 6,596,535、7,125,717 及 7,456,683，其各自以引用方法以其整體併入本文)。
對中樞神經系統中之細胞具有趨向性的重組 AAV 載體，包括但不限於神經元及/或神經膠質細胞，可用於輸送本揭露之多核苷酸劑 (例如，ASO 劑)。此類載體可包括非複制性「rAAV」載體，特定而言，帶有 AAV9 或 AAVrh10 殼體的載體。可以使用 AAV 變體殼體，包括但不限於彼等由 Wilson 在美國專利號 7,906,111 (該專利以引用方式以其整體併入本文) 中描述者，其中以 AAV/hu.31 及 AAV/hu.32 為特別較佳者；以及由 Chatterjee 在以下文獻中描述的 AAV 變體殼體：美國專利號 8,628,966、美國專利號 8,927,514 及 Smith 等人，2014, Mol Ther 22: 1625-1634，其等各自以引用方式以其整體併入。此外，由 Tordo 等人( Brain141:2014-31, 2018；以引用方式以其整體併入本文) 揭示的 AAV-TT 載體併入了天然 AAV2 分離株中之保留式胺基酸序列，亦可與本揭露之組成物及方法結合使用。相較於 AAV2、AAV9 及 AAVrh10，AAV-TT 變體殼體在整個 CNS 中表現出提高的趨神經性及穩健分佈。類似地，Hammond 等人( PLoSONE 12(2):e0188830, 2017；以引用方式以其整體併入本文) 揭示的 AAV-DJ8 載體表現出優異之趨神經性並且可能適合與本揭露之組成物及方法合用。
在特定實例中，本揭露之特徵為 AAV9 載體，包括人工基因體，包括 (i) 含有編碼 ASO 序列 (例如，SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者) 之多核苷酸的表現匣，其處於調節元件之控制下且側接 ITR；及 (ii) 病毒殼體，其具有 AAV9 殼體蛋白之胺基酸序列或與 AAV9 殼體蛋白之胺基酸序列至少 95%、96%、97%、98%、99% 或 99.9% 相同，同時保留 AAV9 殼體之生物學功能。所編碼的 AAV9 殼體可具有美國專利號 7,906,111 (其以引用方式以其整體併入本文) 中提出的 SEQ ID NO: 116 之序列，其具有 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 個胺基酸取代並保留 AAV9 殼體之生物學功能。
本文亦提供包括人工基因體的 AAVrh10 載體，其包括 (i) 含有多核苷酸的表現匣，其處於調節元件控制下且側接 ITR；及 (ii) 病毒殼體，其具有 AAVrh10 殼體蛋白之胺基酸序列或與 AAVrh10 殼體蛋白之胺基酸序列至少 95%、96%、97%、98%、99% 或 99.9% 相同，同時保留 AAVrh10 殼體之生物學功能。所編碼的 AAVrh10 殼體可具有美國專利號 9,790,427 (其以引用方式以其整體併入本文) 中提出的 SEQ ID NO: 81 之序列，其具有 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 個胺基酸取代並保留 AAVrh10 殼體之生物學功能。
可選擇基因調節元件以在哺乳動物細胞 (例如，神經元) 中發揮功能。所得構建體含有可操縱地連接的組件，且側接 (5' 及 3') 功能性 AAV ITR 序列。特定實例包括衍生自 AAV 血清型的載體，該等 AAV 血清型具有哺乳動物 CNS 細胞 (特定而言，神經元) 之趨性及在該等細胞中之高轉導效率。本專利申請中提供對不同血清型轉導效率的回顧及比較。在某些實例中，基於 AAV2、AAV5、AAV9 及 AAVrh10 的載體引導多核苷酸在 CNS 中的長期表現，例如，藉由轉導神經元及/或神經膠質細胞。
可以藉由將所選序列直接插入主要 AAV 開讀框 (「ORF」) 已自其切除的 AAV 基因體內來構建側接 AAV ITR 的目標多核苷酸 (例如，編碼本文所述 ASO 劑的多核苷酸) 之 AAV 表現載體。AAV 基因體之其他部分也可缺失，只要保留足夠的 ITR 部分以允許複製及包裝功能。可使用本領域習知之技術設計此類構建體。參見，例如，美國專利號 5,173,414 及 5,139,941；國際公開號 WO 92/01070 (1992 年 1 月 23 日公開) 及 WO 93/03769 (1993 年 3 月 4 日公開)。替代地，AAV ITR 可使用標準核酸連接技術從病毒基因體或從含有該病毒基因體的 AAV 載體中切除，並融合到存在於另一載體中的所選核酸構建體之 5' 及 3' 端。含有 ITR 的 AAV 載體已在例如美國專利號 5,139,941 中描述。特定而言，其中描述了數種 AAV 載體，它們可從美國典型培養物保藏中心 (「ATCC」) 在登錄號 53222、53223、53224、53225 及 53226 下獲得。此外，可以合成地產生嵌合基因以包括相對於一個或多個所選核酸序列排列在 5' 及 3' 的 AAV ITR 序列。可以使用用於在哺乳動物 CNS 細胞中表現嵌合基因序列的較佳密碼子，並且在某些情況下，可以藉由習知的方法進行多核苷酸的密碼子優化。完全嵌合序列由藉由標準方法製備的重疊多核苷酸組裝而成。為了產生 AAV 病毒顆粒，使用已知技術諸如藉由轉染將 AAV 表現載體引入合適的宿主細胞內。多種轉染技術為本領域周知的。特別合適的轉染方法包括磷酸鈣共沉澱、直接顯微注射到經培養之細胞內、電穿孔、脂質體介導的基因轉移、脂質介導的轉導及使用高速微射彈粒的核酸輸送。
例如，本揭露之特定病毒載體除了包括本揭露之核酸序列 (例如，SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者) 之外，亦可包括具有源自 AAV2 病毒的 ITR 的 AAV 載體質體之主鏈；啟動子諸如 U6 小核 1 啟動子或其變體、H1 啟動子、7SK 啟動子、ApoE-hAAT 啟動子、CBA 啟動子、CK8 啟動子、mU1a 啟動子、EF-1α 啟動子、TBG 啟動子、鼠 PGK 啟動子或 CAG 啟動子，或任何神經元啟動子諸如 hSyn 啟動子、NeuN 啟動子、CaMKII 啟動子、Tα-1 啟動子、NSE 啟動子、PDGFβ 啟動子、VGLUT 啟動子、SST 啟動子、NPY 啟動子、VIP 啟動子、PV 啟動子、GAD65 or GAD67 啟動子、DRD1 啟動子、DRD2 啟動子、MAP1B 啟動子、C1ql2 啟動子、POMC 啟動子或 Prox1 啟動子，有或沒有野生型或突變形式的 WPRE；以及兔 β-珠蛋白 polyA 序列 (參見表 5 及表 6)。
本揭露進一步涉及一種 rAAV，其包括 (i) 含有多核苷酸的表現匣，其處於調節元件的控制下且側接 ITR，及 (ii) AAV 殼體，其中該多核苷酸編碼抑制性 RNA (例如，ASO，諸如 siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA 或 shmiRNA，特定而言，具有以下中之任一者之核酸序列的 ASO：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)1 至 100)，該抑制性 RNA 特異性地結合至 Grik2mRNA (例如，以下中描述的 Grik2mRNA 之部分或區域中之任一者：SEQ ID NO: 115 至 681) 至少一部分或區域並抑制 (例如，敲落) 在細胞 (例如，神經元) 中 GluK2 蛋白的表現。
AAV 載體可包括例如結合至 Grik2mRNA 的 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA 或 shmiRNA) 序列，及 hSyn 啟動子。例如，AAV 載體可含有：以下中之任一者的核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 hSyn 啟動子 (例如，具有以下中之任一者之核酸序列的 hSyn 啟動子：SEQ ID NO: 682 至 685 及 SEQ ID NO: 790 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 682 至 685 或 SEQ ID NO: 790)。
替代地，AAV 載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 NeuN 啟動子。例如，所揭示的 AAV 載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 NeuN 啟動子 (例如，具有以下之核酸序列的 NeuN 啟動子：SEQ ID NO: 686 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 686)。
替代地，AAV 載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 CaMKII 啟動子。例如，所揭示的 AAV 載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 CaMKII 啟動子 (例如，具有以下中之任一者之核酸序列的 CaMKII 啟動子：SEQ ID NO: 687 至 691 及 SEQ ID NO: 802 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 687 至 691 及 SEQ ID NO: 802)。
替代地，AAV 載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 NSE 啟動子。例如，所揭示的 AAV 載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 NSE 啟動子 (例如，具有以下之核酸序列的 NSE 啟動子：SEQ ID NO: 692 或 693 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 692 或 693)。
替代地，AAV 載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 PDGFβ 啟動子。例如，所揭示的 AAV 載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 PDGFβ 啟動子 (例如，具有以下中之任一者之核酸序列的 PDGFβ 啟動子：SEQ ID NO: 694 至 696 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 694 至 696)。
替代地，AAV 載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 VGluT 啟動子。例如，所揭示的 AAV 載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 VGluT 啟動子 (例如，具有以下中之任一者之核酸序列的 VGluT 啟動子：SEQ ID NO: 697 至 701 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 708 至 712)。
替代地，AAV 載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 SST 啟動子。例如，所揭示的 AAV 載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 SST 啟動子 (例如，具有以下之核酸序列的 SST 啟動子：SEQ ID NO: 702 或 SEQ ID NO: 703 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 702 或 SEQ ID NO: 703)。
替代地，AAV 載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 NPY 啟動子。例如，所揭示的 AAV 載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 NPY 啟動子 (例如，具有以下之核酸序列的 NPY 啟動子：SEQ ID NO: 704 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 704)。
替代地，AAV 載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 VIP 啟動子。例如，所揭示的 AAV 載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 VIP 啟動子 (例如，具有以下之核酸序列的 VIP 啟動子：SEQ ID NO: 705 或 SEQ ID NO: 706 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 705 或 SEQ ID NO: 706)。
替代地，AAV 載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 PV 啟動子。例如，所揭示的 AAV 載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 PV 啟動子 (例如，具有以下中之任一者之核酸序列的 PV 啟動子：SEQ ID NO: 707 至 709 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 707 至 709)。
替代地，AAV 載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 GAD65 啟動子。例如，所揭示的 AAV 載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 GAD65 啟動子 (例如，具有以下中之任一者之核酸序列的 GAD65 啟動子：SEQ ID NO: 710 至 713 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 710 至 713)。
替代地，AAV 載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 GAD67 啟動子。例如，所揭示的 AAV 載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 GAD67 啟動子 (例如，具有以下之核酸序列的 GAD67 啟動子：SEQ ID NO: 714 或 SEQ ID NO: 715 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 714 或 715)。
替代地，AAV 載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 DRD1 啟動子。例如，所揭示的 AAV 載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 DRD1 啟動子 (例如，具有以下之核酸序列的 DRD1 啟動子：SEQ ID NO: 716 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 716)。
替代地，AAV 載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 DRD2 啟動子。例如，所揭示的 AAV 載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 DRD2 啟動子 (例如，具有以下之核酸序列的 DRD2 啟動子：SEQ ID NO: 717 或 SEQ ID NO: 718 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 717 或 SEQ ID NO: 718)。
替代地，AAV 載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 C1ql2 啟動子。例如，所揭示的 AAV 載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 C1ql2 啟動子 (例如，具有以下之核酸序列的 C1ql2 啟動子：SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791)。
替代地，AAV 載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 POMC 啟動子。例如，所揭示的 AAV 載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 POMC 啟動子 (例如，具有以下之核酸序列的 POMC 啟動子：SEQ ID NO: 720 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 720)。
替代地，AAV 載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 PROX1 啟動子。例如，所揭示的 AAV 載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 PROX1 啟動子 (例如，具有以下之核酸序列的 PROX1 啟動子：SEQ ID NO: 721 或 SEQ ID NO: 722 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 721 或 SEQ ID NO: 722)。
替代地，AAV 載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 MAP1B 啟動子。例如，所揭示的 AAV 載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 MAP1B 啟動子 (例如，具有以下中之任一者之核酸序列的 MAP1B 啟動子：SEQ ID NO: 723 至 725 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 723 至 725)。
替代地，AAV 載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 Tα-1 啟動子。例如，所揭示的 AAV 載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 Tα-1 啟動子 (例如，具有以下之核酸序列的 Tα-1 啟動子：SEQ ID NO: 726 或 SEQ ID NO: 727 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 726 或 SEQ ID NO: 727)。
替代地，AAV 載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 U6 啟動子。例如，所揭示的 AAV 載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 U6 啟動子，諸如具有以下中之任一者之核酸序列的 U6 啟動子：SEQ ID NO: 728 至 733 或 772 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 728 至 733 或 772。
替代地，AAV 載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 H1 啟動子。例如，所揭示的 AAV 載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 H1 啟動子，諸如具有以下之核酸序列的 H1 啟動子：SEQ ID NO: 734 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 734。
替代地，AAV 載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 7SK 啟動子。例如，所揭示的 AAV 載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 7SK 啟動子，諸如具有以下之核酸序列的 7SK 啟動子：SEQ ID NO: 735 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 735。
替代地，AAV 載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 ApoE-hAAT 啟動子。例如，所揭示的 AAV 載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 ApoE-hAAT 啟動子，諸如具有以下之核酸序列的 ApoE-hAAT 啟動子：SEQ ID NO: 736 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 736。
替代地，AAV 載體可包含結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 CAG 啟動子。例如，所揭示的 AAV 載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 CAG 啟動子，諸如具有以下之核酸序列的 CAG 啟動子：SEQ ID NO: 737 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 737。
替代地，AAV 載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 CBA 啟動子。例如，所揭示的 AAV 載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 CBA 啟動子，諸如具有以下之核酸序列的 CBA 啟動子：SEQ ID NO: 738 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 738。
替代地，AAV 載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 CK8 啟動子。例如，所揭示的 AAV 載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 CK8 啟動子，諸如具有以下之核酸序列的 CK8 啟動子：SEQ ID NO: 739 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 739。
替代地，AAV 載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 mU1a 啟動子。例如，所揭示的 AAV 載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 mU1a 啟動子，諸如具有以下之核酸序列的 mU1a 啟動子：SEQ ID NO: 740 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 740。
替代地，AAV 載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 EF-1α 啟動子。例如，所揭示的 AAV 載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 EF-1α 啟動子，諸如具有以下之核酸序列的 EF-1α 啟動子：SEQ ID NO: 741 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 741。
替代地，AAV 載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 TBG 啟動子。例如，所揭示的 AAV 載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 TBG 啟動子，諸如具有以下之核酸序列的 TBG 啟動子：SEQ ID NO: 742 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 742。 反轉錄病毒載體
用於本文所述的方法及組成物中的輸送載體可為反轉錄病毒載體。可用於本文所述的方法及組成物的一個類型之反轉錄病毒載體為慢病毒載體。慢病毒載體 (LV) 為反轉錄病毒的一個子集，可高效轉導廣泛的分裂及非分裂細胞類型，賦予多核苷酸以穩定、長期的表現。關於包裝及轉導 LV 的優化策略之概述提供在 Delenda, The Journal of Gene Medicine 6: S125 (2004) 中，其揭露以引用方式併入本文。
基於慢病毒的基因轉移技術的使用依賴於攜帶高度缺失之病毒基因體的重組慢病毒顆粒的活體外產生，此等顆粒中容納有目標多核苷酸。特定而言，重組慢病毒係透過下在以下之允許細胞株中的反式共表現來回收：(1) 包裝構建體，亦即，同時表現 Gag-Pol 前體及 Rev 的載體 (或者以反式表現)；(2) 表現外膜受體的載體，通常具有異源屬性；及 (3) 轉移載體，由去除全部開讀框的病毒 cDNA 組成，但保留了複製、殼體化及表現所需的序列，其中插入了待表現的序列。
本文所述的方法及組成物中使用的 LV 可包括 5' 長末端重複序列 (LTR)、HIV 訊息序列、HIV Psi 訊息 5' 剪接位點 (SD)、δ-GAG 元件、Rev 響應序列元件 (RRE)、3' 剪接位點 (SA)、延長因子 (EF) 1-α 啟動子及 3'-自失活 LTR (SIN-LTR) 中之一者或多者。慢病毒載體視情況包括中央多聚嘌呤段 (cPPT) 及土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件 (WPRE)，如 US 6,136,597 中所述，由於其屬於 WPRE，其揭露以引用方式併入本文。慢病毒載體可進一步包括 pHR' 主鏈，其可包括例如如下所提供的。
Lu 等人，Journal of Gene Medicine 6:963 (2004) 中描述的 Lentigen LV 可用於表現 DNA 分子及/或轉導細胞。本文所述的方法及組成物中使用的 LV 可包括 5' 長末端重複序列 (LTR)、HIV 訊息序列、HIV Psi 訊息 5' 剪接位點 (SD)、δ-GAG 元件、Rev 響應序列元件 (RRE)、3' 剪接位點 (SA)、延長因子 (EF) 1-α 啟動子及 3'-自失活 L TR (SIN-LTR)。視情況，此等區域中之一者或多者經執行類似功能的另一區域取代。
增強子元件可用於增加經修飾之 DNA 分子的表現或增加慢病毒整合效率。用於本文所述的方法及組成物中的 LV 可包括 nef 序列。用於本文所述的方法及組成物中的 LV 可包括提高載體整合的 cPPT 序列。cPPT 用作 (+) 股 DNA 合成的第二起點，並在其天然 HIV 基因體的中部引入部分股重疊。在轉移載體主鏈中引入 cPPT 序列大大增加核轉運及整合到標靶細胞 DNA 中的基因體之總量。用於本文所述的方法及組成物中的 LV 可包括土撥鼠轉錄後調節元件 (WPRE)。WPRE 在轉錄水平上起作用，藉由促進轉錄本的核輸出及/或藉由增加新生轉錄本的多腺苷酸化效率，從而增加細胞中的 mRNA 之總量。將 WPRE 添加至 LV 導致來自數種不同啟動子的多核苷酸表現水平在活體外及活體內得到顯著增強。用於本文所述的方法及組成物中的 LV 可包括 cPPT 序列及 WPRE 序列兩者。載體亦可包括允許從單個啟動子表現多個多肽的 IRES 序列。
除了 IRES 序列之外，允許表現多個多核苷酸的其他元件也是有用的。用於本文所述的方法及組成物中的載體可包括允許表現超過一個多核苷酸的多個啟動子。允許表現未來鑑定的多個多核苷酸的其他元件是有用的，並且可用於適合與本文所述的組成物及方法合用的載體中。用於本文所述的方法及組成物的載體可為臨床級載體。
據此，反轉錄病毒載體可與所揭示的方法及組成物結合使用。由於反轉錄病毒能夠將其等之基因整合到宿主基因體中、轉移大量外來遺傳物質、感染廣泛的物種及細胞類型以及被包裝在特定細胞株中，故可選擇反轉錄病毒作為基因輸送載體。為了構建反轉錄病毒載體，將編碼目標基因的核酸插入病毒基因體中來代替特定的病毒序列，以產生複製缺陷型病毒。為了產生病毒顆粒，構建了含有 gag、pol 及/或 env 基因但不含 LTR 及/或包裝組分的包裝細胞株。當將含有 cDNA 的重組質體連同反轉錄病毒 LTR 及包裝序列引入該細胞株時 (例如，藉由磷酸鈣沉澱)，包裝序列允許重組質體的 RNA 轉錄本被包裝到病毒顆粒中，然後分泌到培養基中。然後收集含有重組反轉錄病毒的培養基，視情況濃縮，並用於基因轉移。反轉錄病毒載體能夠感染多種細胞類型。
此外，慢病毒載體可與本文所揭示的方法及組成物結合使用。據此，本揭露之一個目的涉及包括 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA 或 shmiRNA) 序列 (例如，以下中所述的 ASO 序列中之任一者：SEQ ID NO: 1 至 100) 的慢病毒載體，該慢病毒載體結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現。
據此，慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)。慢病毒載體可包括結合 Grik2mRNA 並抑制其表現的 ASO 序列 (例如 siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA 或 shmiRNA)，以及 hsyn 啟動子。
慢病毒載體可包括例如結合至 Grik2mRNA 的 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA 或 shmiRNA) 序列，及 hSyn 啟動子。例如，慢病毒載體可含有：以下中之任一者的核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 hSyn 啟動子 (例如，具有以下中之任一者之核酸序列的 hSyn 啟動子：SEQ ID NO: 682 至 685 及 SEQ ID NO: 790 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 682 至 685 及 SEQ ID NO: 790)。
替代地，慢病毒載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 NeuN 啟動子。例如，所揭示的慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 NeuN 啟動子 (例如，具有以下之核酸序列的 NeuN 啟動子：SEQ ID NO: 686 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 686)。
替代地，慢病毒載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 CaMKII 啟動子。例如，所揭示的慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 CaMKII 啟動子 (例如，具有以下中之任一者之核酸序列的 CaMKII 啟動子：SEQ ID NO: 687 至 691 及 SEQ ID NO: 802 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 687 至 691 及 SEQ ID NO: 802)。
替代地，慢病毒載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 NSE 啟動子。例如，所揭示的慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 NSE 啟動子 (例如，具有以下之核酸序列的 NSE 啟動子：SEQ ID NO: 692 或 SEQ ID NO: 693 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 692 或 SEQ ID NO: 693)。
替代地，慢病毒載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 PDGFβ 啟動子。例如，所揭示的慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 PDGFβ 啟動子 (例如，具有以下中之任一者之核酸序列的 PDGFβ 啟動子：SEQ ID NO: 694 至 696 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 694 至 696)。
替代地，慢病毒載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 VGluT 啟動子。例如，所揭示的慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 VGluT 啟動子 (例如，具有以下中之任一者之核酸序列的 VGluT 啟動子：SEQ ID NO: 697 至 701 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 697 至 701)。
替代地，慢病毒載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 SST 啟動子。例如，所揭示的慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 SST 啟動子 (例如，具有以下中之任一者之核酸序列的 SST 啟動子：SEQ ID NO: 702 或 SEQ ID NO: 703 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 702 或 SEQ ID NO: 703)。
替代地，慢病毒載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 NPY 啟動子。例如，所揭示的慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 NPY 啟動子 (例如，具有以下之核酸序列的 NPY 啟動子：SEQ ID NO: 704 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 704)。
替代地，慢病毒載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 VIP 啟動子。例如，所揭示的慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 VIP 啟動子 (例如，具有以下之核酸序列的 VIP 啟動子：SEQ ID NO: 705 或 SEQ ID NO: 706 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 705 或 SEQ ID NO: 706)。
替代地，慢病毒載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 PV 啟動子。例如，所揭示的慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 PV 啟動子 (例如，具有以下中之任一者之核酸序列的 PV 啟動子：SEQ ID NO: 707 至 709 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 707 至 709)。
替代地，慢病毒載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 GAD65 啟動子。例如，所揭示的慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 GAD65 啟動子 (例如，具有以下中之任一者之核酸序列的 GAD65 啟動子：SEQ ID NO: 710 至 713 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 710 至 713)。
替代地，慢病毒載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 GAD67 啟動子。例如，所揭示的慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 GAD67 啟動子 (例如，具有以下之核酸序列的 GAD67 啟動子：SEQ ID NO: 714 或 SEQ ID NO: 715 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 714 或 SEQ ID NO: 715)。
替代地，慢病毒載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 DRD1 啟動子。例如，所揭示的慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 DRD1 啟動子 (例如，具有以下之核酸序列的 DRD1 啟動子：SEQ ID NO: 716 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 716)。
替代地，慢病毒載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 DRD2 啟動子。例如，所揭示的慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 DRD2 啟動子 (例如，具有以下之核酸序列的 DRD2 啟動子：SEQ ID NO: 717 或 SEQ ID NO: 718 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 717 或 SEQ ID NO: 718)。
替代地，慢病毒載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 C1ql2 啟動子。例如，所揭示的慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 C1ql2 啟動子 (例如，具有以下之核酸序列的 C1ql2 啟動子：SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791)。
替代地，慢病毒載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 POMC 啟動子。例如，所揭示的慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 POMC 啟動子 (例如，具有以下之核酸序列的 POMC 啟動子：SEQ ID NO: 720 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 720)。
替代地，慢病毒載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 PROX1 啟動子。例如，所揭示的慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 PROX1 啟動子 (例如，具有以下之核酸序列的 PROX1 啟動子：SEQ ID NO: 721 或 SEQ ID NO: 722 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 721 或 SEQ ID NO: 722)。
替代地，慢病毒載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 MAP1B 啟動子。例如，所揭示的慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 MAP1B 啟動子 (例如，具有以下中之任一者之核酸序列的 MAP1B 啟動子：SEQ ID NO: 723 至 725 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 723 至 725)。
替代地，慢病毒載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 Tα-1 啟動子。例如，所揭示的慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 Tα-1 啟動子 (例如，具有以下之核酸序列的 Tα-1 啟動子：SEQ ID NO: 726 或 SEQ ID NO: 727 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 726 或 SEQ ID NO: 727)。
替代地，慢病毒載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 U6 啟動子。例如，所揭示的慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 U6 啟動子，諸如具有以下中之任一者之核酸序列的 U6 啟動子：SEQ ID NO: 728 至 733 或 772 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 728 至 733 或 772。
替代地，慢病毒載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 H1 啟動子。例如，所揭示的慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 H1 啟動子，諸如具有以下中之任一者之核酸序列的 H1 啟動子：SEQ ID NO: 734 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 734。
替代地，慢病毒載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 7SK 啟動子。例如，所揭示的慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 7SK 啟動子，諸如具有以下之核酸序列的 7SK 啟動子：SEQ ID NO: 735 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 735。
替代地，慢病毒載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 ApoE-hAAT 啟動子。例如，所揭示的慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 ApoE-hAAT 啟動子，諸如具有以下之核酸序列的 ApoE-hAAT 啟動子：SEQ ID NO: 736 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 736。
替代地，慢病毒載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 CAG 啟動子。例如，所揭示的慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 CAG 啟動子，諸如具有以下之核酸序列的 CAG 啟動子：SEQ ID NO: 737 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 737。
替代地，慢病毒載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 CBA 啟動子。例如，所揭示的慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 CBA 啟動子，諸如具有以下之核酸序列的 CBA 啟動子：SEQ ID NO: 738 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 738。
替代地，慢病毒載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 CK8 啟動子。例如，所揭示的慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 CK8 啟動子，諸如具有以下之核酸序列的 CK8 啟動子：SEQ ID NO: 739 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 739。
替代地，慢病毒載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 mU1a 啟動子。例如，所揭示的慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 mU1a 啟動子，諸如具有以下之核酸序列的 mU1a 啟動子：SEQ ID NO: 740 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 740。
替代地，慢病毒載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 EF-1α 啟動子。例如，所揭示的慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 EF-1α 啟動子，諸如具有以下之核酸序列的 EF-1α 啟動子：SEQ ID NO: 741 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 741。
替代地，慢病毒載體可包括結合至 Grik2mRNA 並抑制其表現 ASO (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA) 序列，及 TBG 啟動子。例如，所揭示的慢病毒載體可包括以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)及 TBG 啟動子，諸如具有以下之核酸序列的 TBG 啟動子：SEQ ID NO: 742 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 742。
慢病毒為複雜的反轉錄病毒，其除了包括常見的反轉錄病毒基因 gag、pol 及 env 外，亦包含其他具有調節或結構功能的基因。更高之複雜性使病毒能夠調節其生命週期，就像在潛伏感染過程中一樣。慢病毒的一些實例包括人類免疫缺乏病毒 (HIV1、HIV2) 及猿猴免疫缺乏病毒 (SIV)。慢病毒載體已經藉由多重減弱 HIV 毒力基因來產生，例如，使基因 env、vif、vpr、vpu 及 nef 缺失，從而使得載體為生物學上安全的。慢病毒載體為本領域已知的，參見，例如，美國專利號 6,013,516 及 5,994,136，其兩者皆以引用方式併入本文。一般而言，載體為基於質體或基於病毒的，並且經組態為攜帶用於併入外來核酸以及用於選擇核酸及將其轉移到宿主細胞內的必需序列。目標載體之 gag、pol 及 env 基因亦為本領域已知的。因此，相關基因經選殖到所選載體中，然後用於使目標標靶細胞轉形。能夠感染非分裂細胞的重組慢病毒，其中合適之宿主細胞經兩個或多個攜帶包裝蛋白 (亦即，gag、pol 及 env) 以及 rev 及 tat 的載體轉染，描述於美國專利號 5,994,136 中，其以引用方式併入本文。該公開提供了可提供編碼病毒 gag 及 pol 基因的核酸的第一載體以及可提供編碼病毒 env 的核酸以產生包裝細胞的第二載體。將提供異源基因的載體引入該包裝細胞內，得到生產者細胞，其釋放攜帶目標外源基因的感染性病毒顆粒。env 可為允許人類及其他物種細胞之轉導的兩性外膜蛋白。通常，本揭露之核酸分子或載體包括「控制序列」，其統指啟動子序列、多腺苷酸化訊息序列、轉錄終止序列、上游調節域、複製起點、內部核醣體進入位點 (「IRES」)、增強子等，其等共同提供受體細胞中編碼序列的複制、轉錄及轉譯。並非全部此等控制序列皆需要始終存在，只要所選編碼序列能夠在適當的宿主細胞中複製、轉錄及轉譯即可。 病毒調節元件
病毒調節元件為用於將核酸分子引入宿主細胞內的輸送載體之組分。病毒調節元件視情況為反轉錄病毒調節元件。例如，病毒調節元件可為來自 HSC1 或 MSCV 的 LTR 及 gag 序列。反轉錄病毒調節元件可來自慢病毒，或者它們可為從其他基因體區域鑑定的異源序列。隨著其他病毒調節元件變得已知，此等病毒調節元件可與本文描述的方法及組成物合用。 編碼 Grik2 反義寡核苷酸的病毒載體
本揭露涉及用於輸送異源多核苷酸的核酸載體，其中該多核苷酸編碼特異性地結合 Grik2mRNA 並抑制 GluK2 蛋白在細胞中之表現的 ASO 劑 (例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA 或 shmiRNA) 構建體。據此，本揭露之一個目的為提供包含寡核苷酸序列的載體，該寡核苷酸序列與 Grik2mRNA 之至少一個區域或部分 (例如，選自下列中之任一者的 Grik2mRNA 之區域或部分中之任一者：SEQ ID NO: 115 至 681 或其變體，該變體與下列之任一者具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 115 至 681) 完全或基本上互補。本揭露之載體可包括與 Grik2mRNA 之一個或多個區域完全或基本上互補的寡核苷酸序列的任何變體。此外，本揭露之載體可包括與編碼 GluK2 蛋白的任何變體的 Grik2mRNA 完全或基本上互補的寡核苷酸序列的任何變體。
據此，將編碼目標雙股 RNA 的 DNA 併入基因匣例如表現匣內，其中 DNA 之轉錄由啟動子及/或其他調節元件控制。將 DNA 併入表現目標 Grik2ASO (例如，SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者) 的載體之此類表現匣內，並藉由目標病毒載體封裝以輸送至標靶細胞。因此，本揭露之病毒載體編碼與任何 Grik2mRNA 轉錄本異構體 (例如，SEQ ID NO: 115 至 124 中之任一者) 雜交的反義 RNA。病毒載體編碼例如表 2 或表 3 中所列的 siRNA 中之任一者。
本揭露之載體輸送編碼 ASO 的多核苷酸，該 ASO 辨識或結合至 Grik2mRNA 之至少一部分或區域 (例如，以下中所述的 Grik2mRNA 之區域或部分中之任一者：SEQ ID NO: 115 至 681 或其變體，該變體與下列之任一者具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 115 至 681)。編碼 ASO 劑的異源多核苷酸可為更大的構建體或支架之一部分，該構建體或支架確保此類 ASO 在細胞 (例如，哺乳動物細胞，諸如人類細胞，諸如神經元細胞，諸如 DGC) 中的加工。編碼表 2 或表 3 中所列的 siRNA 中之任一者的多核苷酸可包括微小 RNA 基因 (例如，E-miR-30、miR-155、E-miR-281-1 或 E-miR-124-3 等) 之前驅物或一部分，諸如微小 RNA 基因之 5' 側翼序列、3' 側翼序列或環序列。
據此，本揭露之一個目的涉及一種表現載體，其包括異源多核苷酸並含有：從 5' 到 3'，例如，啟動子 (例如，表 5 及表 6 中所述的啟動子中之任一者)；視情況選用的內含子 (例如，表 7 中所述的內含子中之任一者)；核苷酸序列，其編碼抑制 Grik2mRNA 表現的 ASO 劑 (例如，具有以下中之任一者之核酸序列的 ASO 劑：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)1 至 100)；及 polyA 序列 (例如，表 7 中描述的 polyA 序列中之任一者)。表現載體亦可包括：從 5' 反向末端重複序列 (ITR) 到 3' ITR，5' ITR (例如，表 7 中所述的 5' 或 3' ITR 序列中之任一者)、啟動子、視情況選用的內含子、編碼抑制 Grik2mRNA 表現的 ASO 的核苷酸序列、polyA 序列及 3' ITR。表現載體可進一步含有與任何前述載體元件鄰接的間隔子及/或連接子序列。
在特定實例中，表現載體或多核苷酸可包括編碼形成莖環結構的莖及環的核苷酸序列，其中該環包括編碼表 2 或表 3 中所列的 ASO 劑中之任一者的核苷酸序列。例如，表現載體或多核苷酸可包括編碼環區域的核酸序列，其中該環區域可全部或部分地源自野生型微小 RNA 序列基因 (例如，miR-30、miR-155、miR -281-1 或 miR-124-3 等) 或為完全人工的。在特定實例中，環區域可為 miR-30a 環序列。此外，莖環結構可包括引導序列 (例如，反義 RNA 序列，諸如 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者) 以及與引導序列之全部或部分互補的隨從序列。例如，隨從序列可與除了引導序列之 10、9、8、7、6、5、4、3、2 或 1 個核苷酸之外的引導序列之全部核苷酸互補，或隨從序列可以與以下中之任一者互補：SEQ ID NO: 1 至 100。
前驅 miRNA 或初級 miRNA (pri-miRNA) 支架包括本揭露之引導 (亦即，反義) 序列。初級 miRNA 支架包括前驅 miRNA 支架，且初級 miRNA 之長度可為 50 至 800 個核苷酸 (例如，50 至 800、75 至 700、100 至 600、150 至 500、200 至 400、或 250 至 300 個核苷酸)。在特定實例中，前驅 mRNA 可為 50 至 100 個核苷酸 (例如，介於 50 至 60、60 至 70、70 至 80、80 至 90、或 90 至 100 個核苷酸之間)、100 至 200 個核苷酸 (例如，藉由 110 至 120、120 至 130、130 至 140、140 至 150、150 至 160、160 至 170、170 至 180、180 至 190、或 190 至 200 個核苷酸之間)、200 至 300 個核苷酸(例如，介於 200 至 210、210 至 220、220 至 230、230 至 240、240 至 250、250 至 260、260 至 270、270 至 280、280 至 290、或 290 至 300 個核苷酸之間)、300 至 400 個核苷酸 (例如，介於 300 至 310、310 至 320、320 至 330、330 至 340、340 至 350、350 至 360、360 至 370、370 至 380、380 至 390、或 390 至 400 個核苷酸之間)、400 至 500 個核苷酸 (例如，介於 400 至 410、410 至 420、420 至 430、430 至 440、440 至 450、450 至 460、460 至 470、470 至 480、480 至 490、或 490 至 500 個核苷酸之間)、500 至 600 個核苷酸 (例如，介於 500 至 510、510 至 520、520 至 530、530 至 540、540 至 550、550 至 560、560 至 570、570 至 580、580 至 590、或 590 至 600 個核苷酸)、600 至 700 個核苷酸 (例如，介於 600 至 610、610 至 620、620 至 630、630 至 640、640 至 650、650 至 660、660 至 670、670 至 680、680 至 690、或 690 至 700 個核苷酸)、或 700 至 800 個核苷酸 (例如，介於 700 至 710、710 至 720、720 至 730、730 至 740、740 至 750、750 至 760、760 至 770、770 至 780、780 至 790、或 790 至 800 個核苷酸之間)。此等經工程化之支架允許將前驅 miRNA 加工為包含引導股及隨從股的雙股 RNA。因此，前驅 miRNA 包括：5' 臂，其包括編碼引導 (亦即，反義) RNA 的序列；環序列，其通常衍生自野生型 miRNA (例如，miR-30、miR-155、miR-281-1 或 miR-124-3 等)；及 3' 臂，其包括編碼與引導股完全或基本上互補的隨從 (亦即，正義) 股的序列。前驅 miRNA「莖環」結構之長度一般長於 50 個核苷酸，例如 50 至 150 個核苷酸 (例如，50 至 60、60 至 70、70 至 80、80 至 90、90 至 100、100 至 110、110 至 120、120 至 130、130 至 140、或 140 至 150 個核苷酸)、50 至 110 個核苷酸 (例如，50 至 60、60 至 70、70 至 80、80 至 90、90 至 100、100 至 110 個核苷酸)、或 50 至 80 個核苷酸 (例如，50 至 60、60 至 70、70 至 80 核苷酸)。初級 miRNA 進一步包括 5' 側翼及 3' 側翼序列，分別位於 5' 及 3' 臂的側翼。側翼序列不一定與其他序列 (臂區或引導序列) 相鄰，為非結構化、未配對區域，亦可全部或部分地衍生自一個或多個野生型初級 miRNA 支架 (例如，初級 miRNA 支架全部或部分地衍生自 miR-30、miR-155、miR-281-1 或 miR-124-3 等)。側翼序列各自之長度為至少 4 個核苷酸，或長達 300 個核苷酸或更多 (例如，4 至 300、10 至 275、20 至 250、30 至 225、40 至 200、50 至 175、60 至 150 、70 至 125、80 至 100、或 90 至 95 個核苷酸)。間隔子序列可以插入前述序列結構之間，並且在大多數情況下提供連接多核苷酸，例如，1 至 30 個核苷酸 (例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 個核苷酸)，以向整體前驅 miRNA 結構提供撓性而不干擾功能。間隔子可以衍生自來自天然存在之 RNA 的天然存在之連接基團、天然存在之連接基團的一部分、多腺苷酸或多尿苷酸、或核苷酸之隨機序列，只要間隔子既不干擾與雙股 RNA 之加工也不干擾引導 RNA 與標靶 mRNA 序列的結合/交互作用。
根據本文揭示的方法及組成物，包括核苷酸序列的表現載體或多核苷酸可進一步編碼 (i) 5' 莖環臂，其包括引導 (例如，反義) 股及視情況選用的 5' 間隔子序列 ；及 (ii) 3' 莖環臂，其包括隨從 (例如，正義) 股及視情況選用的 3' 間隔子序列。在另一實例中，包括核苷酸序列的表現載體或多核苷酸可進一步編碼 (i) 5' 莖環臂，其包括隨從股及視情況選用的 5' 間隔子序列；及 (ii) 3' 莖環臂，其包括引導股及視情況選用的 3' 間隔子序列。在另一實例中，尿苷搖擺鹼基存在於引導股之 5' 端。在又一實例中，表現載體或多核苷酸包括位於引導序列上游的前導 5' 側翼區域，並且該側翼區域可為任何長度並且可以全部或部分地衍生自野生型微小 RNA 序列，可為異源的或衍生自與其他側翼區域或環不同來源的 miRNA，或者可為完全人工的。3' 側翼區域的大小及起源可為 5' 側翼區域之鏡像，且 3' 側翼區域可位於引導序列的下游 (亦即 3')。在又一實例中，5' 側翼序列及 3' 側翼序列中之一者或兩者不存在。
表現載體或多核苷酸可包括進一步編碼第一側翼區域 (例如，表 8 中所述的 5' 側翼區域中之任一者) 的核苷酸序列，該第一側翼區域包括 5' 側翼序列及視情況選用的 5' 間隔子序列。在特定實例中，第一側翼區域位於該隨從股的上游 (亦即，5')。在另一實例中，包括核苷酸序列的表現載體或多核苷酸編碼第二側翼區域 (例如，表 8 中所述的 3' 側翼區域中之任一者)，該第二側翼區域包括 3' 側翼序列及視情況選用的 3' 間隔子序列。在特定實例中，第一側翼區域位於引導股之 5'。
根據本文所揭示的方法及組成物，表現載體或多核苷酸可包括編碼以下的核苷酸序列： (a) 莖環序列，其包括，從 5' 到 3'： (i) 5' 莖環臂，其包括引導核苷酸序列，該引導核苷酸序列與以下中之任一者至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 相同：表 2 或表 3 中所列的 ASO 序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)； (ii) 微小 RNA 環區域，其中該環區域包括微小 RNA 環序列 (例如，miR-30a、miR-155、miR-218-1 或 miR-124-3 環序列 (例如，微小 RNA 環序列，其具有選自以下中之任一者的核酸：SEQ ID NO: 758、764、767 或 770))； (iii) 3' 莖環臂，其包括與引導股互補或基本上互補的隨從核苷酸序列， (b) 位於引導股 5' 的第一側翼區域 (例如，表 8 中所述的 5' 側翼區域中之任一者)，其中該第一側翼區域包括 5' 側翼序列及視情況選用的 5' 間隔子序列；及 (c) 位於隨從股 3' 的第二側翼區域 (例如，表 8 中所述的 3' 側翼區域中之任一者)，其中該第二側翼區域包括 3' 側翼序列及視情況選用的 3' 間隔子序列。
在另一實例中，表現載體或多核苷酸包括編碼以下的核苷酸序列： (a) 莖環序列，其包括，從 5' 到 3'： (i) 5' 莖環臂，其包括與引導核苷酸序列互補或基本上互補的隨從核苷酸序列； (ii) 微小 RNA 環區域，其中該環區域包括微小 RNA 環序列 (例如，miR-30a、miR-155、miR-218-1 或 miR-124-3 環序列 (例如，微小 RNA 環序列，其具有選自以下中之任一者的核酸：SEQ ID NO: 758、764、767 或 770))； (iii) 3' 莖環臂，其包括引導核苷酸序列，該引導核苷酸序列與以下中之任一者至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 相同：表 2 或表 3 中所列的 ASO 序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)； (b) 位於隨從股 5' 的第一側翼區域 (例如，表 8 中所述的 5' 側翼區域中之任一者)；及 (c) 位於引導股 3' 的第二側翼區域 (例如，表 8 中所述的 3' 側翼區域中之任一者)，其中該第二側翼區域包括 3' 側翼序列及視情況選用的 3' 間隔子序列。
在另一實例中，表現載體或多核苷酸包括編碼以下的核苷酸序列： (a) 莖環序列，其包括，從 5' 到 3'： (i) 5' 莖環臂，其包括引導核苷酸序列，該引導核苷酸序列與以下中之任一者至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 相同：表 2 或表 3 中所列的 ASO 序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)； (ii) 微小 RNA 環區域，其中該環區域包括微小 RNA 環序列 (例如，miR-30a、miR-155、miR-218-1 或 miR-124-3 環序列 (例如，微小 RNA 環序列，其具有選自以下中之任一者的核酸：SEQ ID NO: 758、764、767 或 770))； (iii) 3' 莖環臂，其包括與引導核苷酸序列互補或基本上互補的隨從核苷酸序列； (b) 位於引導股 5' 的 5' 側翼區域 (例如，表 8 中所述的 5' 側翼區域中之任一者)；及 (c) 位於隨從股 3' 的 3' 側翼區域 (例如，表 8 中所述的 3' 側翼區域中之任一者)，其中該第二側翼區域包括 3' 側翼序列及視情況選用的 3' 間隔子序列。
前述引導股及隨從股之長度可為介於 19 至 50 (例如，19、20、21、22、23、24、25、26 至 30、31 至 35、36 至 40、41 至 45、或 46 至 50) 個核苷酸之間。在特定實例中，引導股之長度為 19 個核苷酸。在另一實例中，引導股之長度為 20 個核苷酸。在另一實例中，引導股之長度為 21 個核苷酸。在另一實例中，引導股之長度為 22 個核苷酸。在另一實例中，引導股之長度為 23 個核苷酸。在另一實例中，引導股之長度為 24 個核苷酸。在另一實例中，引導股之長度為 25 個核苷酸。在另一實例中，引導股之長度為 26 至 30 個核苷酸。在另一實例中，引導股之長度為 31 至 35 個核苷酸。在另一實例中，引導股之長度為 36 至 40 個核苷酸。在另一實例中，引導股之長度為 41 至 45 個核苷酸。在另一實例中，引導股之長度為 46 至 50 個核苷酸。在特定實例中，隨從股之長度為 19 個核苷酸。在另一實例中，隨從股之長度為 20 個核苷酸。在另一實例中，隨從股之長度為 21 個核苷酸。在另一實例中，隨從股之長度為 22 個核苷酸。在另一實例中，隨從股之長度為 23 個核苷酸。在另一實例中，隨從股之長度為 24 個核苷酸。在另一實例中，隨從股之長度為 25 個核苷酸。在另一實例中，隨從股之長度為 26 至 30 個核苷酸。在另一實例中，隨從股之長度為 31 至 35 個核苷酸。在另一實例中，隨從股之長度為 36 至 40 個核苷酸。在另一實例中，隨從股之長度為 41 至 45 個核苷酸。在另一實例中，隨從股之長度為 46 至 50 個核苷酸。
引導及隨從序列至長度可基於將引導股及隨從股引入期內的 miRNA 支架而有所不同。當給定之引導適應 miRNA 支架時，可以延長引導之長度以適應給定 miRNA 支架之自然結構及加工。例如，由 E-miR-30 支架產生的引導序列通常為 22 個核苷酸長。對於大多數支架，引導序列在 3' 端延長，以額外地與標靶 mRNA 序列互補，但在一些情況下可能涉及修飾引導之 5' 起始位點，取決於 miRNA 支架之序列。
在某些情況下，可能需要修飾 miRNA 引導及隨從股表現水平及/或加工模式，以增強或修改給定構建體的靶向能力。因此，在給定的 miRNA 框架/支架內，引導股與隨從股之位置可以交換 (圖 6G)；這可發生在包括填充序列的設計情境中，亦可發生在沒有填充序列的設計情境中。這可另外發生在雙構建體 (如圖 8G 所示) 或多聯構建體 (例如圖 8F) 的情境中。為了適應這種改變，可以從模板「親代」設計修飾引導股及/或隨從股之序列。替代地，可以對引導股及/或隨從股序列進行修飾以影響引導股及隨從股表現/或加工模式的改變。
在特定實例中，載體或多核苷酸包括 miR-30a 序列，其中第一側翼區域包括與以下中之任一者至少 90% (例如，至少 90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 相同的核苷酸序列：SEQ ID NO: 752、754、756 及 759 (參見表 8)。
在以下實施例中，載體或多核苷酸包括 miR-30a 序列，其中第二側翼區域包括與以下中之任一者至少 90% (例如，至少 90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 相同的核苷酸序列：SEQ ID NO: 753、755、757 及 760 (參見表 8)。
在另一實例中，載體或多核苷酸包括 miR-30a 結構，其中環區域包括以下之核苷酸序列：SEQ ID NO: 758 或 SEQ ID NO: 761，或與以下序列至少 90% (例如，至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 相同的序列：SEQ ID NO: 758 或 SEQ ID NO: 761 (參見表 8)。
在特定實例中，載體或多核苷酸包括 miR-155 序列，其中第一側翼區域包括與以下序列至少 90% (例如，至少 90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 相同的核苷酸序列：SEQ ID NO: 762 (參見表 8)。
在一些實施例中，載體或多核苷酸包括 miR-155 序列，其中第二側翼區域包括與以下序列至少 90% (例如，至少 90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 相同的核苷酸序列：SEQ ID NO: 763 (參見表 6)。
在另一實例中，載體或多核苷酸包括 miR-155 結構，其中環區域包括以下之核苷酸序列：SEQ ID NO: 764，或與以下序列至少 90% (例如，至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 相同的序列：SEQ ID NO: 764 (參見表 8)。
在特定實例中，載體或多核苷酸包括 miR-218-1 序列，其中第一側翼區域包括與以下序列至少 90% (例如，至少 90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 相同的核苷酸序列：SEQ ID NO: 765 (參見表 8)。
在一些實施例中，載體或多核苷酸包括 miR-218-1 序列，其中第二側翼區域包括與以下序列至少 90% (例如，至少 90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 相同的核苷酸序列：SEQ ID NO: 766 (參見表 8)。
在另一實例中，載體或多核苷酸包括 miR-218-1 結構，其中環區域包括以下之核苷酸序列：SEQ ID NO: 767，或與以下序列至少 90% (例如，至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 相同的序列：SEQ ID NO: 767 (參見表 8)。
在特定實例中，載體或多核苷酸包括 miR-124-3 序列，其中第一側翼區域包括與以下序列至少 90% (例如，至少 90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 相同的核苷酸序列：SEQ ID NO: 768 (參見表 8)。
在一些實施例中，載體或多核苷酸包括 miR-124-3 序列，其中第二側翼區域包括與以下序列至少 90% (例如，至少 90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 相同的核苷酸序列：SEQ ID NO: 769 (參見表 8)。
在另一實例中，載體或多核苷酸包括 miR-124-3 結構，其中環區域包括以下之核苷酸序列：SEQ ID NO: 770，或與以下序列至少 90% (例如，至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 相同的序列：SEQ ID NO: 770 (參見表 8)。
表現載體可為質體並且可包括例如以下中之一者或多者：內含子序列 (例如，以下之內含子序列：SEQ ID NO: 743 或 SEQ ID NO: 744 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 743 或 SEQ ID NO: 744)、連接子序列、或填充序列。 表 8. 微小 RNA 序列
說明 SEQ ID NO 核苷酸序列
A-hsa-miR-30a 5' 側翼區域 #1 752 GTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGC
A-hsa-miR-30a 3' 側翼區域 #1 753 TTGCCTACTGCCTCGGAATTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTA
A-hsa-miR-30a 5' 側翼區域 #2 754 GTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAC
A-hsa-miR-30a 3' 側翼區域 #2 755 GCTGCCTACTGCCTCGGAATTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTA
A-hsa-miR-30a 5' 側翼區域 #3 756 gtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcttcaggttaacccaacagaaggctcgagaaggtatattgctgttgacagtgagcgA
A-hsa-miR-30a 3' 側翼區域 #3 757 TGCCTACTGCCTCGGAATTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTA   
A-hsa-miR-30a 環區域 758 tagtgaagccacagatg
E-hsa-miR-30a 5' 側翼區域 759 gtttgaatgaggcttcagtactttacagaatcgttgcctgcacatcttggaaacacttgctgggattacttcttcaggttaacccaacagaaggctAAagaaggtatattgctgttgacagtgagcgac
E-hsa-miR-30a 3' 側翼區域 760 gctgcctactgcctcggaCttcaaggggctactttaggagcaattatcttgtttactaaaactgaataccttgctatctctttgatacatttttacaaagctgaattaaaatggtataaatta
E-hsa-miR-30a 環區域 761 ctgtgaagccacagatggg
E-hsa-miR-155 5' 側翼區域 762 caaaccaggaaggggaaatctgtggtttaaattctttatgcctcatcctctgagtgctgaaggcttgctgtaggctgtatgctg
E-hsa-miR-155 3' 側翼區域 763 Cagtgtatgatgcctgttactagcattcacatggaacaaattgctgccgtgggaggatgacaaagaagcatgagtcaccctgctggataaacttagacttcaggctttatcatttttcaatctgttaatcataatctggtcactgggatgttcaaccttaaactaagttttgaaagtaaggttatttaaaagatttatcagta
E-hsa-miR-155 環區域 764 tttgcctccaact
E-hsa-miR-218-1 5' 側翼區域 765 acgtttccagaacgtctgtagcttttctcctccttccctccattttcctcttggtcttacctttggcctagtggttggtgtagtgataatgtagcgagattttctg
E-hsa-miR-218-1 3' 側翼區域 766 tggaacgtcacgcagctttctacagcatgacaagctgctgaggcttaaatcaggattttcctgtctctttctacaaaatcaaaatgaaaaaagagggctttttaggcatctccgagattatgtg
E-hsa-miR-218-1 環區域 767 ggttgcgaggtatgagtaaa
E-hsa-miR-124-3 5' 側翼區域 768 tctgccgcggaaaggggagaagtgtgggctcctccgagtcgggggcggactgggacagcacagtcggctgagcgcagcgcccccgccctgcccgccacgcggcgaagacgcctgagcgttcgcgcccctcgggcgaggaccccacgcaagcccgagccggtcccgaccctggccccgacgctcgccgcccgccccagccctgagggcccctc
E-hsa-miR-124-3 3' 側翼區域 769 gagaggcgcctccgccgctcctttctcatggaaatggcccgcgagcccgtccggcccagcgcccctcccgcgggaggaaggcgagcccggcccccggcggccattcgcgccgcggacaaatccggcgaacaatgcgcccgcccagagtgcggcccagctgccgggccggggatctggccgcgggacacaaaggggcccgcacgcctctggcgt
E-hsa-miR-124-3 環區域 770 atttaatgtctatacaat
據此，本揭露之一個目的涉及包括多核苷酸的載體，該多核苷酸具有以下中之任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性)1 至 100。例如，該載體可包括與以下中之任一者之核酸序列具有至少 90% (例如，至少 90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的多核苷酸：SEQ ID NO: 1 至 100。在另一實例中，該載體可包括與以下中之任一者之核酸序列具有至少 95% (例如，至少 95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的多核苷酸：SEQ ID NO: 1 至 100。本揭露之載體可進一步包括具有以下中之任一者之核酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO: 1 至 100。
特定而言，該載體可包括以下中之任一者之序列：SEQ ID NO: 1 至 100 或其變體，該變體與以下中之任一者之核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 及啟動子 (例如，表 5 或表 6 中列出的啟動子中之任一者，或 a)。
上面討論的變體可包括，例如，由於個體之間的等位基因變異 (例如，多形性)、選擇性剪接形式等而天然存在之變體。術語變體亦包括來自其他來源或生物體的本揭露之基因序列。變體可以與根據本揭露的序列基本上同源。本揭露之基因的變體亦包括核酸序列，其在嚴格雜交條件下與如上定義的序列 (或其互補股) 雜交。典型的嚴格雜交條件包括溫度高於 30℃、高於 35℃ 或高於 42℃，及/或鹽度低於約 500 mM 或低於 200 mM。雜交條件可以藉由例如改變溫度、鹽度及/或其他試劑諸如 SDS、SSC 等的濃度來調整。
本揭露進一步提供用於將異源多核苷酸輸送至目標標靶細胞的非病毒載體 (例如，含有編碼本文所揭示的靶向 Grik2的 ASO 劑的多核苷酸的質體)。在其他情況下，本揭露之病毒載體可為 AAV 載體腺病毒、反轉錄病毒、慢病毒或疱疹病毒載體。
可採用一個或多個表現匣。各表現匣可包括至少一啟動子序列 (例如，神經元細胞啟動子)，其可操縱地連接至編碼目標 RNA 的序列。各表現匣可由額外調節元件、間隔子、內含子、UTR、多腺苷酸化位點等組成。表現匣相對於編碼例如兩個或多個 ASO 劑的多核苷酸可為多基因的。表現匣可進一步包括啟動子、編碼一種或多種目標 ASO 劑的核酸、及 polyA 序列。在特定實例中，表現匣包括 5' - 啟動子序列、編碼第一目標 ASO 劑的多核苷酸序列 (例如，SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者)、編碼第二目標 ASO 劑的序列 (例如，SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者)、及 polyA 序列 - 3'。
病毒載體可進一步包括編碼抗生素抗性基因的核酸序列，諸如 AmpR、康黴素、潮黴素 B、遺傳黴素 (geneticin)、殺稻瘟菌素 S、僅大黴素、卡本西林、氯黴素、諾爾絲菌素或嘌呤黴素的抗性基因。 示例性表現匣
本揭露提供表現匣，其在併入表現載體 (例如，質體或病毒載體 (例如，AAV 或慢病毒載體)) 內時，促進編碼 ASO 劑 (例如，具有以下中之任一者之核酸序列的 ASO 劑：SEQ ID NO: 1 至 100) 的異源多核苷酸的表現，該 ASO 劑與 Grik2mRNA 雜交並抑制其表現。通常，併入核酸載體內的表現匣將會包括：異源多核苷酸，其含有異源基因調控序列 (例如，啟動子 (例如，表 5 或表 6 中描述的啟動子中之任一者) 及視情況選用的增強子序列 (例如，表 7 中描述的增強子序列))；5' 側翼序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768)；莖環序列，其含有莖環 5' 臂；環序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770)；莖環 3' 臂；3' 側翼序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769)；視情況，土撥鼠肝炎轉錄後調控元件 (WRPE)；及 polyA 序列 (例如，SEQ ID NO: 750、751、792 或 793)。在 AAV 載體的情況下，表現匣可分別在其 5' 及 3' 末側接 5' ITR 及 3' ITR 序列 (例如，表 7 中描述的 5' 或 3' ITR 序列中之任一者)。通常，考慮將 AAV2 ITR 序列與本文所揭示的方法及組成物結合使用，然而，也可採用來自本文所揭示的其他 AAV 血清型的 ITR 序列 (參見上文「 AAV 載體」部分)。不限制本揭露之範圍並且僅舉例說明適合與所揭示的方法及組成物合用的表現匣，表 9 及表 10 來自以引用方式以其整體併入本文的美國臨時專利申請號：63/050,742並提出示例性表現匣構建體，其中在從 5' 到 3' 方向上移動的表現匣元件分別用於在神經元中或普存地誘導轉殖基因表現。該構建體的一般架構至少包括以下元件，從 5' 到 3' 方向： (i)                   5' ITR 序列 (僅適用於 AAV 載體；例如，SEQ ID NO: 746 或 SEQ ID NO: 747)； (ii)                 啟動子序列 (例如，表 5 或表 6 中列出的啟動子序列中之任一者)； (iii)             5' 側翼序列 (例如，SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768 中之任一者)； (iv)             莖環序列，其包括，從 5' 到 3' 方向： a.      莖環 5' 臂，其中該莖環 5' 臂包括至少含有 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者的 ASO 序列的引導序列，或與以下中之任一者的 ASO 序列互補或基本上互補 (例如，包含不多於 10 個、不多於 9 個、不多於 8 個、不多於 7 個、不多於 6 個、5 個、不多於 4 個、不多於不多於 3 個、不多於 2 個或不多於 1 個經錯配之核苷酸) 的隨從序列：SEQ ID NO: 1 至 100； b.     環序列 (例如，miR-30、miR-155、miR-218-1 或 miR-124-3 環序列，諸如以下中之任一者的環序列：SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770)；及 c.      莖環 3' 臂，其中該莖環 3' 臂包括至少含有 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者的 ASO 序列的引導序列，或與以下中之任一者的 ASO 序列實質上互補 (例如，包含不多於 10 個、不多於 9 個、不多於 8 個、不多於 7 個、不多於 6 個、5 個、不多於 4 個、不多於不多於 3 個、不多於 2 個或不多於 1 個經錯配之核苷酸) 的隨從序列：SEQ ID NO: 1 至 100； (v)                 3' 側翼序列 (例如，SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769 中之任一者)； (vi)             視情況，WPRE 序列； (vii)           polyA 序列 (例如，SEQ ID NO: 750、SEQ ID NO: 751、SEQ ID NO: 792 或 SEQ ID NO: 793)；及 (viii)         3' ITR 序列 (僅適用於 AAV 載體；例如，SEQ ID NO: 748、SEQ ID O：749 或 SEQ ID NO: 789)。
在特定態樣中，本揭露提供一種表現匣，其包括 hSyn 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者)，該啟動子可操縱地連接至包括抗 Grik2引導序列的多核苷酸，該引導序列與選自由以下所組成之群組的 Grik2mRNA 標靶序列完全或實質上互補：表 4 中所述之標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中之任一者或其變體，該變體與表 4 中所述之標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中之任一者具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，以及與引導序列完全或實質上互補之隨從序列。
在另一實例中，本揭露提供一種表現匣，其包括 CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者)，該啟動子可操縱地連接至包括抗 Grik2引導序列的多核苷酸，該引導序列與選自由以下所組成之群組的 Grik2mRNA 標靶序列完全或實質上互補：表 4 中所述之標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中之任一者或其變體，該變體與表 4 中所述之標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中之任一者具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，以及與引導序列完全或實質上互補之隨從序列。
在另一實例中，本揭露提供一種表現匣，其包括 CAG 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 737)，該啟動子可操縱地連接至包括抗 Grik2引導序列的多核苷酸，該引導序列與選自由以下所組成之群組的 Grik2mRNA 標靶序列完全或實質上互補：表 4 中所述之標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中之任一者或其變體，該變體與表 4 中所述之標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中之任一者具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，以及與引導序列完全或實質上互補之隨從序列。
在另一實例中，本揭露提供一種表現匣，其包括 CBA 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 738)，該啟動子可操縱地連接至包括抗 Grik2引導序列的多核苷酸，該引導序列與選自由以下所組成之群組的 Grik2mRNA 標靶序列完全或實質上互補：表 4 中所述之標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中之任一者或其變體，該變體與表 4 中所述之標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中之任一者具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，以及與引導序列完全或實質上互補之隨從序列。
在另一實例中，本揭露提供一種表現匣，其包括 U6 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 728 至 733 中之任一者)，該啟動子可操縱地連接至包括抗 Grik2引導序列的多核苷酸，該引導序列與選自由以下所組成之群組的 Grik2mRNA 標靶序列完全或實質上互補：表 4 中所述之標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中之任一者或其變體，該變體與表 4 中所述之標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中之任一者具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，以及與引導序列完全或實質上互補之隨從序列。
在另一實例中，本揭露提供一種表現匣，其包括 H1 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 734)，該啟動子可操縱地連接至包括抗 Grik2引導序列的多核苷酸，該引導序列與選自由以下所組成之群組的 Grik2mRNA 標靶序列完全或實質上互補：表 4 中所述之標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中之任一者或其變體，該變體與表 4 中所述之標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中之任一者具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，以及與引導序列完全或實質上互補之隨從序列。
在另一實例中，本揭露提供一種表現匣，其包括 7SK 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 735)，該啟動子可操縱地連接至包括抗 Grik2引導序列的多核苷酸，該引導序列與選自由以下所組成之群組的 Grik2mRNA 標靶序列完全或實質上互補：表 4 中所述之標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中之任一者或其變體，該變體與表 4 中所述之標靶序列或 SEQ ID NO: 164 至 681 中之任一者具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，以及與引導序列完全或實質上互補之隨從序列。
在另一實例中，本揭露提供一種表現匣，其包括 hSyn 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中任一者)，該啟動子可操縱地連接至包括抗 Grik2引導序列的多核苷酸，該引導序列係選自由以下所組成之群組：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，以及與引導序列完全或實質上互補之隨從序列。
在另一實例中，本揭露提供一種表現匣，其包括 CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中任一者)，該啟動子可操縱地連接至包括抗 Grik2引導序列的多核苷酸，該引導序列係選自由以下所組成之群組：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，以及與引導序列完全或實質上互補之隨從序列。
在另一實例中，本揭露提供一種表現匣，其包括 CAG 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 737)，該啟動子可操縱地連接至包括抗 Grik2引導序列的多核苷酸，該引導序列係選自由以下所組成之群組：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，以及與引導序列完全或實質上互補之隨從序列。
在另一實例中，本揭露提供一種表現匣，其包括 CBA 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 738)，該啟動子可操縱地連接至包括抗 Grik2引導序列的多核苷酸，該引導序列係選自由以下所組成之群組：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，以及與引導序列完全或實質上互補之隨從序列。
在另一實例中，本揭露提供一種表現匣，其包括 U6 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 728 至 733 中之任一者)，該啟動子可操縱地連接至包括抗 Grik2引導序列的多核苷酸，該引導序列係選自由以下所組成之群組：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，以及與引導序列完全或實質上互補之隨從序列。
在另一實例中，本揭露提供一種表現匣，其包括 H1 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 734)，該啟動子可操縱地連接至包括抗 Grik2引導序列的多核苷酸，該引導序列係選自由以下所組成之群組：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，以及與引導序列完全或實質上互補之隨從序列。
在另一實例中，本揭露提供一種表現匣，其包括 7SK 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 735)，該啟動子可操縱地連接至包括抗 Grik2引導序列的多核苷酸，該引導序列係選自由以下所組成之群組：SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者或其變體，該變體與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者具有至少 85% (至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96 %、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，以及與引導序列完全或實質上互補之隨從序列。
在另一實例中，本揭露提供一種表現匣，該表現匣選自下表 9 中所述之表現匣中之任一者。 表 9 ：示例性表現匣
5' ---------------------------------------------------------------------------------------------- à 3'
AAV 5' ITR 啟動子 5' 側翼 5p 莖環臂 環 3p 莖環臂 3' 側翼 3' UTR AAV 3' ITR
A hSyn (例如，SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者) B 引導序列 (例如，SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者) C 隨從序列 (例如與引導序列完全或實質上互補的序列) D E F
A CaMKII (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802) B 引導序列 (例如，SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者) C 隨從序列 (例如與引導序列完全或實質上互補的序列) D E F
A CAG (例如，SEQ ID NO: 737) B 引導序列 (例如，SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者) C 隨從序列 (例如與引導序列完全或實質上互補的序列) D E F
A CBA (例如，SEQ ID NO: 738) B 引導序列 (例如，SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者) C 隨從序列 (例如與引導序列完全或實質上互補的序列) D E F
A U6 (例如，SEQ ID NO: 728 至 733 中之任一者) B 引導序列 (例如，SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者) C 隨從序列 (例如與引導序列完全或實質上互補的序列) D E F
A H1 (例如，SEQ ID NO: 734) B 引導序列 (例如，SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者) C 隨從序列 (例如與引導序列完全或實質上互補的序列) D E F
A 7SK (例如，SEQ ID NO: 735) B 引導序列 (例如，SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者) C 隨從序列 (例如與引導序列完全或實質上互補的序列) D E F
A hSyn (例如，SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者) B 隨從序列 (例如與引導序列完全或實質上互補的序列) C 引導序列 (例如，SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者) D E F
A CaMKII (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802) B 隨從序列 (例如與引導序列完全或實質上互補的序列) C 引導序列 (例如，SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者) D E F
A CAG (例如，SEQ ID NO: 737) B 隨從序列 (例如與引導序列完全或實質上互補的序列) C 引導序列 (例如，SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者) D E F
A CBA (例如，SEQ ID NO: 738) B 隨從序列 (例如與引導序列完全或實質上互補的序列) C 引導序列 (例如，SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者) D E F
A U6 (例如，SEQ ID NO: 728 至 733 中之任一者) B 隨從序列 (例如與引導序列完全或實質上互補的序列) C 引導序列 (例如，SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者) D E F
A H1 (例如，SEQ ID NO: 734) B 隨從序列 (例如與引導序列完全或實質上互補的序列) C 引導序列 (例如，SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者) D E F
A 7SK (例如，SEQ ID NO: 735) B 隨從序列 (例如與引導序列完全或實質上互補的序列) C 引導序列 (例如，SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者) D E F
表 9 索引：A = 選自以下的 AAV 5' ITR 序列：SEQ ID NO: 746 及 747； B = 選自由以下所組成之群組的莖環 5' 側翼序列：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 及 768； C = 選自由以下所組成之群組的微小 RNA 環序列：SEQ ID NO: 758、761、764、767 及 770； D = 選自由以下所組成之群組的莖環 3' 側翼序列：SEQ ID NO: 753、754、757、760、763、766 及 769； E = 3' 非轉譯區 (UTR)，其含有選自以下的多核苷酸：SEQ ID NO: 750 及 751； F = 選自以下的 AAV 3' ITR 序列：SEQ ID NO: 748 及圖 749 中。
在另一實例中，與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者之 ASO 序列實質上互補的隨從序列相對於以下中之任一者之 ASO 序列具有不多於 5 個 (例如，不多於 5、4、3、2 或 1 個) 經錯配之核苷酸 (亦即，錯配)：SEQ ID NO: 1 至 100。在另一實例中，與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者之 ASO 序列實質上互補的隨從序列相對於以下中之任一者之 ASO 序列具有不多於 4 個 (例如，不多於 4、3、2 或 1 個) 錯配：SEQ ID NO: 1 至 100。在另一實例中，與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者之 ASO 序列實質上互補的隨從序列相對於以下中之任一者之 ASO 序列具有不多於 3 個 (例如，不多於 3、2 或 1 個) 錯配：SEQ ID NO: 1 至 100。在另一實例中，與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者之 ASO 序列實質上互補的隨從序列相對於以下中之任一者之 ASO 序列具有不多於 2 個 (例如，不多於 2 或 1 個) 錯配：SEQ ID NO: 1 至 100。在又一實例中，與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者之 ASO 序列實質上互補的隨從序列相對於以下中之任一者之 ASO 序列具有不多於 1 個錯配：SEQ ID NO: 1 至 100。
在另一實例中，與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者之 ASO 序列實質上互補的隨從序列相對於以下中之任一者之 ASO 序列具有不多於 10 個 (例如，不多於 10、9、8、7 或 6 個) 經錯配之核苷酸 (亦即，錯配)：SEQ ID NO: 1 至 100。在另一實例中，與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者之 ASO 序列實質上互補的隨從序列相對於以下中之任一者之 ASO 序列具有不多於 9 個 (例如，不多於 9、8、7 或 6 個) 錯配：SEQ ID NO: 1 至 100。在另一實例中，與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者之 ASO 序列實質上互補的隨從序列相對於以下中之任一者之 ASO 序列具有不多於 8 個 (例如，不多於 8、7 或 6 個) 錯配：SEQ ID NO: 1 至 100。在另一實例中，與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者之 ASO 序列實質上互補的隨從序列相對於以下中之任一者之 ASO 序列具有不多於 7 個 (例如，不多於 7 或 6 個) 錯配：SEQ ID NO: 1 至 100。在另一實例中，與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者之 ASO 序列實質上互補的隨從序列相對於以下中之任一者之 ASO 序列具有不多於 6 個錯配：SEQ ID NO: 1 至 100。在另一實例中，與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者之 ASO 序列實質上互補的隨從序列相對於以下中之任一者之 ASO 序列具有不多於 5 個錯配：SEQ ID NO: 1 至 100。在另一實例中，與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者之 ASO 序列實質上互補的隨從序列相對於以下中之任一者之 ASO 序列具有不多於 4 個錯配：SEQ ID NO: 1 至 100。在另一實例中，與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者之 ASO 序列實質上互補的隨從序列相對於以下中之任一者之 ASO 序列具有不多於 3 個錯配：SEQ ID NO: 1 至 100。在另一實例中，與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者之 ASO 序列實質上互補的隨從序列相對於以下中之任一者之 ASO 序列具有不多於 2 個錯配：SEQ ID NO: 1 至 100。在另一實例中，與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者之 ASO 序列實質上互補的隨從序列相對於以下中之任一者之 ASO 序列具有不多於 1 個錯配：SEQ ID NO: 1 至 100。
美國臨時專利號：63/050,742 (其以引用方式以其整體併入本文) 之表 9 或表 10 中所例舉的表現構建體可進一步包括額外載體元件諸如調節序列 (例如，一個或多個增強子序列、終止子序列或 WPRE 序列)，任何所述元件之間或之內的填充序列及連接子序列，以及本領域已知的可用於促進異源多核苷酸在細胞中之表現的任何其他習用表現構建元件。表 9 及表 10 提供示例性表現匣，其各者皆顯示在單列內並由標識符數字指定 (例如，表 9 的示例性表現匣組態 1 至 3800 及表 10 的組態 1 至 2000)，並且表現匣之各元件以 5' 到 3' 方向的一系列欄表示。
本揭露之示例性單順反子 (亦即，單一 ASO 編碼) 構建體可包括 AAV (例如，AAV9) 構建體，其含有 hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790) 及併入 A-miR-30 支架中的 ASO G9 (SEQ ID NO: 68) (構建體 1；參見圖 6A)。此類構建體可具有 SEQ ID NO: 775 之核酸序列或可為其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 775 (參見下文)。 CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACCAGGGTAATGGGGATCCTCTAGATCCGGTCGGGCCCGCGGTACCGTCGAGAAGCTTGATGTGGGCGGAGCTTCGAAGGGGCGGGCGCCCGTGGGGCGGGTCCTGAGTGGGGGCGGGACCGGGGCCGGCACCTGGGTGAGGTT CTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCCAATTGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGGGCGCGCCTAGCCCGGGCTAGGTCGACTCGACTAGGGATAACAGGGTAATT GTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCT AAAACAGGCATTAGCTATGGGTAGTGAAGCCACAGATG CCCATAGCTAATGCCTGTTTTA TTGCCTACTGCCTCGGAATTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTA TCACGG GATCCGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGCGGCCGCCCGAGTTTAATTGGTTTATAGAACTCTTCAAGCTAGCGAAGCAATTCGTTGATCTGAATTTCGACCACCCATAATACCCATTACCCTGGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACA aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag(SEQ ID NO: 775) 索引： 粗體= 5' ITR 序列； 單下劃線= 啟動子序列； 斜體= 5' 側翼序列-引導序列-微小 RNA 環序列-隨從序列-3' 側翼序列； 斜體 + 粗體 + 單下劃線 ：編碼 G9 引導序列的 DNA； 斜體 + 波浪下劃線：編碼 G9 隨從序列的 DNA； 雙下劃線：polyA 序列； 粗體 + 小寫字母：3' ITR 序列 (SEQ ID NO: 789)。
上述示例性單順反子、抗 Grik2構建體可包括併入 A-miR-30 支架中的 Grik2反義引導序列 (例如，G9，SEQ ID NO: 68)，使得微小 RNA 編碼序列為具有 SEQ ID NO: 795 之核酸序列的多核苷酸或為其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 795. GTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGC TAAAACAGGCATTAGCTATGGGTAGTGAAGCCACAGATG CCCATAGCTAATGCCTGTTTTA TTGCCTACTGCCTCGGAATTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTA (SEQ ID NO: 795) 索引： 斜體= 5' 側翼序列-引導序列-微小 RNA 環序列-隨從序列-3' 側翼序列； 斜體 + 波浪下劃線 ：編碼隨從序列的 DNA； 斜體 + 粗體 + 單下劃線 ：編碼 G9 引導序列的 DNA。
本揭露之另一示例性單順反子、抗 Grik2構建體可包括 AAV (例如，AAV9) 構建體，其含有串接之 C1ql2 啟動子 (SEQ ID NO: 791) 及 hSyn啟動子 (SEQ ID NO: 790) 以及併入 A-miR-30 支架中的 ASO G9 (SEQ ID NO: 68) (構建體 2；參見圖 6B)。此類構建體可具有 SEQ ID NO: 777 的核酸序列或可為其變體中，該變體與 SEQ ID NO: 777 的核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更多) 的序列同一性(參見下文)。 CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACCAGGGTAATGGGGATCCTCTAGATCCGGTCGGGCCCGCGGTACCGTCGAGAAGCTTGATGTGGGCGGAGCTTCGAAGGGGCGGGCGCCCGTGGGGCGGGTCCTGAGTGGGGGCGGGACCGGGGCCGGCACCTGGGTGAGGTT CGATCCTATCACGAGACTAGCCTCGAGAAGCTTGATATCAGCACCCACATAGCAGCTCACAAATGTCTGAAACTCCAATTCTTGGGAATCTGACACGATCACACATGCAGGCAAAATACCAATGTACATGAATTAAAAAAAAAAAAAACAACCTTTAAAAGAAACAAGGGTTCAGTACCACTACTGACATCTTGTTTCCCCAGAGGCCTTACTTTAATTATTTATTGTTTCCACTTAGTTGCTCAATTAATTAATTTAGAGGTTTTTTTCTTCCTTTCTTTTTCTTTTTTCTTTCTCTCTTTTTTTTCTTCTTAAGACAGGGTTTCTCTGTGTAGCTCAGGCTATCCTGGAACTCACTCTGTAGACCAGGCTGGCCTTGTACTCAAAGATCTGCCTGCCTCTGCCTCCCCAGTGCTGGGATTAAAGACATGCACCATCACTGCCCTGCTTTCCTCTTTTTATTTTGAAAATTGTTCATCAACAGTTACTAAACGTGTTCGAATTCCAAGAGCTGACTAGACATATAAGACCATTCAGCCTTCTGAATAAGATGTAGGTGTGCCCCTCCTCTTACTCCTCTATTTGGAAGTTGGTTACTTTCTGTATGTAGTATGCGAATCCCCCTCTGCCACCCCGCTTTCTGTTTTAAAACAGAAAAGGCTGCAACATACAGTGTGTGCTTCTGTTCTTGAACTGGAAGCTTAGGCTGTCCTGGACTTGGGTTGAGACCTGGGCTCATCCAGATAGGAAATGGATTTGGTGACCCCGCCAGGACTTCGCAGGCACCACATCGTGGTCGTGTGTGGGTGCTGTATGCACCCACTGATTGCGCGCGTGGGTTCCAGAGCTTGGTGGTCTGCGAGAGGAGAGTGGGCAAGAGTGGGTGTGTCTGTGGAGCCCCAGCTAGGGGCTGCTGCCCGCTGCTCCCACTTGTGGCTCCTGGGCGCCGCCAGCAGGCACATCTCCGGAGGACGCCGCGGGATGGGAGCTGATGACAGGAGAGCGCCGTCTCCCGAGTGATGGCAGCGCACGCTGCTGCCTCGCCGCCTCCGCCGCTCAGTCCTGATCTTACGTTAGGGTAGCTGGGTACCCCCTCCGCCCGGGAACCAGCTAGTAGAGGGAGAACAGAGCAGAGCGTGCGGCAGAGCCGATCCCGCGTCCCGCCGAACCCTGCCAAGCCCCGCCAATCCCAGCAGAGCAGGAACCAGCGCAGCTGAGCCAACACCGGACGCCGCACTGAGACCCAGCATTCCCCAGCCGCCACTACCCGGTCCCCGCCGGGGTGCCGGGCTCGTCCTGTGAGCCCCTCGTCATGCGTGTCGGGCTCTTCGACTCTCCAGATCAGTTCCAGAGCGCT GAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCCAATTGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGGGCGCGCCTAGCCCGGGCTAGGTCGACTCGACTAGGGATAACAGGGTAATT GTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCT AAAACAGGCATTAGCTATGGGTAGTGAAGCCACAGATG CCCATAGCTAATGCCTGTTTT ATTGCCTACTGCCTCGGAATTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTA TCACGG GATCCGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGCGGCCGCCCGAGTTTAATTGGTTTATAGAACTCTTCAAGCTAGCGAAGCAATTCGTTGATCTGAATTTCGACCACCCATAATACCCATTACCCTGGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACA aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag(SEQ ID NO: 777) 索引： 粗體= 5' ITR 序列； 單下劃線 + 斜體 = C1ql2 啟動子序列； 單下劃線：hSyn 啟動子序列； 斜體= 5' 側翼序列-引導序列-微小 RNA 環序列-隨從序列-3' 側翼序列； 斜體 + 波浪下劃線 ：編碼隨從序列的 DNA； 斜體 + 粗體 + 單下劃線 ：編碼 G9 引導序列的 DNA； 雙下劃線：polyA 序列； 粗體 + 小寫字母：3' ITR 序列 (SEQ ID NO: 789)。
上述示例性單順反子、抗 Grik2構建體可包括併入微小 RNA 支架中的 Grik2反義引導序列 (例如，G9，SEQ ID NO: 68)，使得微小 RNA 編碼序列為具有 SEQ ID NO: 778 之核酸序列的多核苷酸或為其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 778. GTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCTA AAACAGGCATTAGCTATGGGTAGTGAAGCCACAGATG CCCATAGCTAATGCCTGTTTT ATTGCCTACTGCCTCGGAATTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTA (SEQ ID NO: 778) 索引： 斜體= 5' 側翼序列-引導序列-微小 RNA 環序列-隨從序列-3' 側翼序列； 斜體 + 波浪下劃線 ：編碼隨從序列的 DNA； 斜體 + 粗體 + 單下劃線 ：編碼 G9 引導序列的 DNA。
本揭露之另一示例性單順反子、抗 Grik2構建體可包括自互補 (sc)AAV (例如，scAAV9) 構建體，其含有位於 5' ITR 序列下游的 hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790) 及併入 A-miR-30 支架中的 ASO G9 (SEQ ID NO: 68) (構建體 3；參見圖 6C)。此類構建體可具有 SEQ ID NO: 779 的核酸序列或可為其變體中，該變體與 SEQ ID NO: 779 的核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更多) 的序列同一性(參見下文)。 CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGAATTCACGCGTGGTACC CTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCCAATTGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGGGCGCGCCTAGCCCGGGCTAGGTCGACTCGACTAGGGATAACAGGGTAATT GTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCT AAAACAGGCATTAGCTATGGGTAGTGAAGCCACAGATG CCCATAGCTAATGCCTGTTTTA TTGCCTACTGCCTCGGAATTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTA TCACGGGATCCAAGCTT GATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGCTAGCGAAGCAATTC TAGCAGGCATGCTGGGGAG AGATCGATCTGAG gaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaa(SEQ ID NO: 779) 索引： 粗體= 5' ITR 序列； 單下劃線 + 斜體 = hSyn 啟動子序列； 單下劃線：hSyn 啟動子序列； 斜體= 5' 側翼序列-引導序列-微小 RNA 環序列-隨從序列-3' 側翼序列； 斜體 + 波浪下劃線 ：編碼隨從序列的 DNA； 斜體 + 粗體 + 單下劃線 ：編碼 G9 引導序列的 DNA； 雙下劃線：RBG 多腺苷酸序列； 雙下劃線 + 粗體 = BGH polyA 序列 (SEQ ID NO: 793)； 粗體 + 小寫字母：3' ITR 序列 (SEQ ID NO: 748)。
上述示例性單順反子、抗 Grik2構建體可包括併入微小 RNA 支架中的 Grik2反義引導序列 (例如，G9，SEQ ID NO: 68)，使得微小 RNA 編碼序列為具有 SEQ ID NO: 780 之核酸序列的多核苷酸或為其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 780. GTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCT AAAACAGGCATTAGCTATGGGTAGTGAAGCCACAGATG CCCATAGCTAATGCCTGTTTT ATTGCCTACTGCCTCGGAATTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTA (SEQ ID NO: 780) 索引： 斜體= 5' 側翼序列-引導序列-微小 RNA 環序列-隨從序列-3' 側翼序列； 斜體 + 波浪下劃線 ：編碼隨從序列的 DNA； 斜體 + 粗體 + 單下劃線 ：編碼 G9 引導序列的 DNA。
本揭露之另一示例性單順反子、抗 Grik2構建體可包括 scAAV (例如，scAAV9) 構建體，其含有鄰近 3' ITR (「FLIP」) 之 hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790) 及併入 A-miR-30 支架中的 ASO G9 (SEQ ID NO: 68) (構建體 4；參見圖 6D)。此類構建體可具有 SEQ ID NO: 781 的核酸序列或可為其變體中，該變體與 SEQ ID NO: 781 的核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更多) 的序列同一性(參見下文)。 CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGAATTCACGCGTGGTACCCGGCCGC CGAGTGAGAGACACAAAAAATTCCAACACACTATTGCAATGAAAATAAATTTCCTTTATTAGCCAGAAGTCAGATGCTCAAGGGGCTTCATGATGTCCCCATAATTTTTGGCAGAGGGAAAAAGATCGGATCCCGTGA TAATTTATACCATTTTAATTCAGCTTTGTAAAAATGTATCAAAGAGATAGCAAGGTATTCAGTTTTAGTAAACAAGATAATTGCTCCTAAAGTAGCCCCTTGAATTCCGAGGCAGTAGGCAAT AAAACAGGCATTAGCTATGGGCATCTGTGGCTTCACTA CCCATAGCTAATGCCTGTTTT AGCGCTCACTGTCAACAGCAATATACCTTCTCGAGCCTTCTGTTGGGTTAACCTGAAGAAGTAATCCCAGCAAGTGTTTCCAAGATGTGCAGGCAACGATTCTGTAAAGTACTGAAGCCTCATTCAAAC AATTACCCTGTTATCCCTAGTCGAGTCGACCTAGCCCGGGCTAGGCGCGCCCTGCGCTCTCAGGCACGACACGACTCCTCCGCTGCAATTG GCAGACTGAGGCAGCGCTGAGTCGCCGGCGCCGCAGCGCAGATGGTCGCGCCCGTGCCCCCCTATCTCGCGCCTCGCGTGGTGCGGTCCGGCTGGGCCGGCGGCGGCGCGGACGCGACCAAGGTGGCCGGGAAGGGGAGTTTGCGGGGGACCGGCGAGTGACGTCAGCGCGCCTTCAGTGCTGAGGCGGCGGTGGCGCGCGCCGCCAGGCGGGGGCGAAGGCACTGTCCGCGGTGCTGAAGCTGGCAGTGCGCACGCGCCTCGCCGCATCCTGTTTCCCCTCCCCCTCTCTGATAGGGGATGCGCAATTTGGGGAATGGGGGTTGGGTGCTTGTCCAGTGGGTCGGGGTCGGTCGTCAGGTAGGCACCCCCACCCCGCCTCATCCTGGTCCTAAAACCCACTTGCACTCATACGCAGGGCCCTCTGCAGGCTAGCGAAGCAATTC TAGCAGGCATGCTGGGGAG AGATCGATCTGAG gaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaa(SEQ ID NO: 781) 索引： 粗體= 5' ITR 序列； 單下劃線 + 斜體 = hSyn 啟動子序列； 單下劃線：hSyn 啟動子序列； 斜體= 5' 側翼序列-引導序列-微小 RNA 環序列-隨從序列-3' 側翼序列； 斜體 + 波浪下劃線 ：編碼隨從序列的 DNA； 斜體 + 粗體 + 單下劃線 ：編碼 G9 引導序列的 DNA； 雙下劃線：RBG polyA 序列； 雙下劃線 + 粗體 = BGH 多腺苷酸序列 (SEQ ID NO: 793)； 粗體 + 小寫字母：3' ITR 序列 (SEQ ID NO: 748)。請注意，在這種情況下，引導序列為「反向」，因為整個匣係從 3' ITR 到 5' ITR 讀取，而非從 5' ITR 到 3' ITR 讀取。
上述示例性單順反子、抗 Grik2構建體可包括併入微小 RNA 支架中的 Grik2反義引導序列 (例如，G9，SEQ ID NO: 68)，使得微小 RNA 編碼序列為具有 SEQ ID NO: 782 (頂部股) 或 SEQ ID NO: 794 (底部股)，或為其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 782 或 SEQ ID NO: 794。 TAATTTATACCATTTTAATTCAGCTTTGTAAAAATGTATCAAAGAGATAGCAAGGTATTCAGTTTTAGTAAACAAGATAATTGCTCCTAAAGTAGCCCCTTGAATTCCGAGGCAGTAGGCAAT AAAACAGGCATTAGCTATGGGCATCTGTGGCTTCACTA CCCATAGCTAATGCCTGTTTT AGCGCTCACTGTCAACAGCAATATACCTTCTCGAGCCTTCTGTTGGGTTAACCTGAAGAAGTAATCCCAGCAAGTGTTTCCAAGATGTGCAGGCAACGATTCTGTAAAGTACTGAAGCCTCATTCAAAC (SEQ ID NO: 782) TCGACTAGGGATAACAGGGTAATTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCT AAAACAGGCATTAGCTATGGGTAGTGAAGCCACAGATG CCCATAGCTAATGCCTGTTTT ATTGCCTACTGCCTCGGAATTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTATCAC (SEQ ID NO: 794) 索引： 斜體= 5' 側翼序列-引導序列-微小 RNA 環序列-隨從序列-3' 側翼序列； 斜體 + 波浪下劃線 ：編碼隨從序列的 DNA； 斜體 + 粗體 + 單下劃線 ：編碼 G9 引導序列的 DNA。
本揭露之另一示例性單順反子、抗 Grik2構建體可包括 AAV (例如，AAV9) 構建體，其含有 hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790) 及併入 A-miR-30 支架中的 ASO G9 (SEQ ID NO: 68) 之三個多聯體複本 (構建體 5；參見圖 6E)。此類構建體可具有 SEQ ID NO: 783 的核酸序列或可為其變體中，該變體與 SEQ ID NO: 783 的核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更多) 的序列同一性(參見下文)。 CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACCAGGGTAATGGGGATCCTCTAGATCCGGTCGGGCCCGCGGTACCGTCGAGAAGCTTGATGTGGGCGGAGCTTCGAAGGGGCGGGCGCCCGTGGGGCGGGTCCTGAGTGGGGGCGGGACCGGGGCCGGCACCTGGGTGAGGTT CTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCCAATTGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGGGCGCGCCTAGCCCGGGCTAGGTCGAC^ TCGACTAGGGATAACAGGGTAATTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCT AAAACAGGCATTAGCTATGGGTAGTGAAGCCACAGATG CCCATAGCTAATGCCTGTTTTA TTGCCTACTGCCTCGGAATTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTATCACGGGATCC ^GGTCGAC* TCGACTAGGGATAACAGGGTAATTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCT AAAACAGGCATTAGCTATGGGTAGTGAAGCCACAGATG CCCATAGCTAATGCCTGTTTTA TTGCCTACTGCCTCGGAATTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTATCACGGGATCC *GGTCGAC# TCGACTAGGGATAACAGGGTAATTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCT AAAACAGGCATTAGCTATGGGTAGTGAAGCCACAGATG CCCATAGCTAATGCCTGTTTTA TTGCCTACTGCCTCGGAATTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTATCACGGGATCC # GATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGCGGCCGCCCGAGTTTAATTGGTTTATAGAACTCTTCAAGCTAGC gaagcaattcgttgatctgaatttcgaccacccataatacccattaccctggtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag(SEQ ID NO: 783) 索引： 粗體= 5' ITR 序列； 單下劃線= 啟動子序列； 斜體= 5' 側翼序列-引導序列-微小 RNA 環序列-隨從序列-3' 側翼序列； 斜體 + 波浪下劃線 ：編碼隨從序列的 DNA； 斜體 + 粗體 + 單下劃線 ：編碼 G9 引導序列的 DNA； 雙下劃線：polyA 序列； 粗體 + 小寫字母：3' ITR 序列 (SEQ ID NO: 789)；^ = 第一多聯體之邊界；* = 第二多聯體之邊界；且 # = 第三多聯體之邊界。
本揭露之另一示例性單順反子、抗 Grik2構建體可包括 AAV (例如，AAV9) 構建體，其含有 hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790) 及不同反義序列的三個多聯體複本，包括 G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MU (SEQ ID NO: 96)，其各自併入 A-miR-30 支架中 (構建體 6；參見圖 6E)。此類構建體可具有 SEQ ID NO: 784 的核酸序列或可為其變體中，該變體與 SEQ ID NO: 784 的核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更多) 的序列同一性(參見下文)。 CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACCAGGGTAATGGGGATCCTCTAGATCCGGTCGGGCCCGCGGTACCGTCGAGAAGCTTGATGTGGGCGGAGCTTCGAAGGGGCGGGCGCCCGTGGGGCGGGTCCTGAGTGGGGGCGGGACCGGGGCCGGCACCTGGGTGAGGTT CTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCCAATTGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGGGCGCGCCTAGCCCGGGCTAGGTCGAC^ TCGACTAGGGATAACAGGGTAATTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGCT AAAACAGGCATTAGCTATGGGTAGTGAAGCCACAGATG CCCATAGCTAATGCCTGTTTT ATTGCCTACTGCCTCGGAATTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTATCACGGGATCC ^GGTCGAC* TCGACTAGGGATAACAGGGTAATTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAC ATGGGTTCTCCATATCGAGACTAGTGAAGCCACAGATG GTCTCGATATGGAGAACCCAT GCTGCCTACTGCCTCGGAATTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTATCACGGGATCC *GGTCGAC# TCGACTAGGGATAACAGGGTAATTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAA ATCCTTGGCTTTACATATGAATAGTGAAGCCACAGATG TTCATATGTAAAGCCAAGGAT TCTGCCTACTGCCTCGGAATTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTATCACGGGATCC # GATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGCGGCCGCCCGAGTTTAATTGGTTTATAGAACTCTTCAAGCTAGC gaagcaattcgttgatctgaatttcgaccacccataatacccattaccctggtagataagtagcatggcgggttaatcattaactacaaggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag(SEQ ID NO: 784) 索引： 粗體= 5' ITR 序列； 單下劃線= 啟動子序列； 斜體= 5' 側翼序列-引導序列-微小 RNA 環序列-隨從序列-3' 側翼序列； 斜體 + 波浪下劃線 ：編碼與引導序列互補的隨從序列的 DNA (G9、GI、MU - 按此順序)； 斜體 + 粗體 + 單下劃線 ：編碼引導序列的 DNA (G9、GI、MU - 按此順序)； 雙下劃線：polyA 序列； 粗體 + 小寫字母：3' ITR 序列 (SEQ ID NO: 789)；^ = 第一多聯體之邊界；* = 第二多聯體之邊界；且 # = 第三多聯體之邊界。
在其他情況下，G9 ASO 序列 (SEQ ID NO: 68) 可以併入 E-miR-124-3 支架中，使得微小 RNA 編碼序列為具有SEQ ID NO: 801 之核酸序列的多核苷酸或為其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 801. TCTGCCGCGGAAAGGGGAGAAGTGTGGGCTCCTCCGAGTCGGGGGCGGACTGGGACAGCACAGTCGGCTGAGCGCAGCGCCCCCGCCCTGCCCGCCACGCGGCGAAGACGCCTGAGCGTTCGCGCCCCTCGGGCGAGGACCCCACGCAAGCCCGAGCCGGTCCCGACCCTGGCCCCGACGCTCGCCGCCCGCCCCAGCCCTGAGGGCCCCTCTA CAATGGGCACTAGACATGGGATTTAATGTCTATACAAT CCCATAGCTAATGCCTGTTTT AGAGAGGCGCCTCCGCCGCTCCTTTCTCATGGAAATGGCCCGCGAGCCCGTCCGGCCCAGCGCCCCTCCCGCGGGAGGAAGGCGAGCCCGGCCCCCGGCGGCCATTCGCGCCGCGGACAAATCCGGCGAACAATGCGCCCGCCCAGAGTGCGGCCCAGCTGCCGGGCCGGGGATCTGGCCGCGGGACACAAAGGGGCCCGCACGCCTCTGGCGT (SEQ ID NO: 801) 索引： 斜體= 5' 側翼序列-引導序列-微小 RNA 環序列-隨從序列-3' 側翼序列； 斜體 + 波浪下劃線 ：編碼 G9 隨從序列的 DNA； 斜體 + 粗體 + 單下劃線 ：編碼 G9 引導序列的 DNA。
本揭露之另一單順反子、抗 Grik2構建體為 AAV (例如，AAV9) 構建體，其含有 hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790)、併入 E-miR-124-3 支架中的抗 Grik2反義序列 G9 (SEQ ID NO: 68)。此類構建體可具有 SEQ ID NO: 809 的核酸序列或可為其變體中，該變體與 SEQ ID NO: 809 的核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更多) 的序列同一性(參見下文)。SEQ ID NO: 809 的表現構建體可以併入具有以下之核酸序列的載體中：SEQ ID NO: 810 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 810. CTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGGGCGCGCCTGAAT TCTCTGCCGCGGAAAGGGGAGAAGTGTGGGCTCCTCCGAGTCGGGGGCGGACTGGGACAGCACAGTCGGCTGAGCGCAGCGCCCCCGCCCTGCCCGCCACGCGGCGAAGACGCCTGAGCGTTCGCGCCCCTCGGGCGAGGACCCCACGCAAGCCCGAGCCGGTCCCGACCCTGGCCCCGACGCTCGCCGCCCGCCCCAGCCCTGAGGGCCCCTCTACAATGGGCACTAGACATGGGATTTAATGTCTATACAATCCCATAGCTAATGCCTGTTTTAGAGAGGCGCCTCCGCCGCTCCTTTCTCATGGAAATGGCCCGCGAGCCCGTCCGGCCCAGCGCCCCTCCCGCGGGAGGAAGGCGAGCCCGGCCCCCGGCGGCCATTCGCGCCGCGGACAAATCCGGCGAACAATGCGCCCGCCCAGAGTGCGGCCCAGCTGCCGGGCCGGGGATCTGGCCGCGGGACACAAAGGGGCCCGCACGCCTCTGGCGTCTCGAGGG GATCCGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGCGGCCGC ATAGTCTATCCAGGTTGAGCATCCTGCTGGTGGTTACAAGAAACTGTTTGAAACTGTGGAGGAACTGTCCTCGCCGCTCACAGCTCATGTAACAGGCAGGATCCCCCTCTGGCTCACCGGCAGTCTCCTTCGATGTGGGCCAGGACTCTTTGAAGTTGGATCTGAGCCATTTTACCACCTGTTTGATGGGCAAGCCCTCCTGCACAAGTTTGACTTTAAAGAAGGACATGTCACATACCACAGAAGGTTCATCCGCACTGATGCTTACGTACGGGCAATGACTGAGAAAAGGATCGTCATAACAGAATTTGGCACCTGTGCTTTCCCAGATCCCTGCAAGAATATATTTTCCAGGTTTTTTTCTTACTTTCGAGGAGTAGAGGTTACTGACAATTGCCCTTGTTAATGTCTACCCAGTGGGGGAAGATTACTACGCTTGCACAGAGACCAACTTTATTACAAAGATTAATCCAGAGACCTTGGAGACAATTAAGCAGGTTGATCTTTGCAACTAAGTCTCTGTCAATGGGGCCACTGCTCACCCCCACATTGAAAATGATGGAACCGTTTACAATATTGGTAATTGCTTTGGAAAAAATTTTTCAATTGCCTACAACATTGTAAAGATCCCACCACTGCAAGCAGACAAGGAAGATCCAATAAGCAAGTCAGAGATCGTTGTACAATTCCCCTGCAGTGACCGATTCAAGCCATCTTACGTTCATAGTTTTGGTCTGACTCCCAACTATATCGTTTTTGTGGAGACACCAGTCAAAATTAACCTGTTCAAGTTCCTTTCTTCATGGAGTCTTTGGGGAGCCAACTACATGGATTGTTTTGAGTCCAATGAAACCATGGGGTTTGGCTTCATATTGCTGACAAAAAAAGGAAAAAGTACCTCAATAATAAATACAGAACTTCTCCTTTCAACCTCTTCCATCACATCAACACCTATGAAGACAATGGGTTTCTGATTGTGGATCTCTGCTGCTGGAAAGGATTTGAGTTTGTTTATAATTACTTATATTTAGCCAATTTACGTGAGAACTGGGAAGAGGTGAAAAAAAATGCCAGAAAGGCTCCCCAACCTGAAGTTAGGAGATATGTACTTCCTTTGAATATTGACAAGGCTGACACAGGCAAGAATTTAGTCAGCTCCCCAATACAACTGCCACTGCAATTCTGTGCAGTGACGAGACTATCTGGCTGGAGCCTGAAGTTCTCTTTTCAGGGCCTCGTCAAGCATTTGAGTTTCCTCAAATCAATTACCAGAAGTATTGTGGGAAACCTTACACATATGCGTATGGACTTGGCTTGAATCACTTTGTTCCAGATAGGCTCTGTAAGCTGAATGTCAAAACTAAAGAAACTTGGGTTTGGCAAGAGCCTGATTCATACCCATCAGAACCCATCTTTGTTTCTCACCCAGATGCCTTGGAAGAAGATGATGGTGTAGTTCTGAGTGTGGTGGTGAGCCCAGGAGCAGGACAAAAGCCTGCTTATCTCCTGATTCTGAATGCCAAGGACTTAAGTGAAGTTGCCCGGGCTGAAGTGGAGATTAACATCCCTGTCACCTTTCATGGACTGTTCAAAAAATCTTGAccggccgcc CGAGTTTAATTGGTTTATAGAACTCTTCA (SEQ ID NO: 809) 索引： 單下劃線：啟動子序列； 粗體：含有引導序列及隨從序列的微小 RNA 莖環結構； 雙下劃線：polyA 序列； 斜體 ：填充序列 1； 斜體 + 下劃線 ：填充序列 2。
本揭露之另一單順反子、抗 Grik2構建體為 AAV (例如，AAV9) 構建體，其含有 hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790) 及併入 A-miR-30 支架中的 ASO GI (SEQ ID NO: 77)。此類構建體可具有 SEQ ID NO: 796 的核酸序列或可為其變體中，該變體與 SEQ ID NO: 817 的核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更多) 的序列同一性(參見下文)。 CTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGGGCGCGCCTAGCCCGGGCTAGG TCGACTCGACTAGGGATAACAGGGTAATTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTAAAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAC GTCTCGATATGGAGAACCCATG CTGTGAAGCCACAGATGGG CATGGGTTTTATATCGAGACGCTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTATCAC GGGATCC GATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCG(SEQ ID NO: 817) 索引： 單下劃線= 啟動子序列； 斜體=5' 側翼序列-引導序列-微小 RNA 環序列-隨從序列-3' 側翼序列； 斜體 + 波浪下劃線 ：編碼 GI 隨從序列的 DNA； 斜體 + 粗體 + 單下劃線 ：編碼 GI 引導序列的 DNA； 雙下劃線：polyA 序列。 SEQ ID NO: 817 的構建體可以併入進一步包含 5' 及 3' ITR 序列的載體中，如下面的 SEQ ID NO: 796 中所示。 CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACCAGGGTAATGGGGATCCTCTAGATCCGGTCGGGCCCGCGGTACCGTCGAGAAGCTTGATGTGGGCGGAGCTTCGAAGGGGCGGGCGCCCGTGGGGCGGGTCCTGAGTGGGGGCGGGACCGGGGCCGGCACCTGGGTGAGGTT CTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCCAATTGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGGGCGCGCCTAGCCCGGGCTAGGTCGAC TCGACTAGGGATAACAGGGTAATTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAC ATGGGTTCTCCATATCGAGACTAGTGAAGCCACAGATG GTCTCGATATGGAGAACCCATG CTGCCTACTGCCTCGGAATTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTATCAC GGGATCC GATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGCGGCCGCCCGAGTTTAATTGGTTTATAGAACTCTTCAAGCTAGCGAAGCAATTCGTTGATCTGAATTTCGACCACCCATAATACCCATTACCCTGGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACA aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag(SEQ ID NO: 796) 索引： 粗體= 5' ITR 序列； 單下劃線= 啟動子序列； 斜體= 5' 側翼序列-引導序列-微小 RNA 環序列-隨從序列-3' 側翼序列； 斜體 + 波浪下劃線 ：編碼 GI 隨從序列的 DNA； 斜體 + 粗體 + 單下劃線 ：編碼 GI 引導序列的 DNA； 雙下劃線：polyA 序列； 粗體 + 小寫字母：3' ITR 序列 (SEQ ID NO: 789)。
上述示例性單順反子、抗 Grik2構建體可包括併入微小  A-miR-30 支架中的 Grik2反義引導序列 (例如，GI，SEQ ID NO: 77)，使得微小 RNA 編碼序列為具有 SEQ ID NO: 797 之核酸序列的多核苷酸或為其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 797。 TCGACTAGGGATAACAGGGTAATTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAC ATGGGTTCTCCATATCGAGACTAGTGAAGCCACAGATG GTCTCGATATGGAGAACCCATG CTGCCTACTGCCTCGGAATTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTATCAC (SEQ ID NO: 797) 索引： 斜體= 5' 側翼序列-引導序列-微小 RNA 環序列-隨從序列-3' 側翼序列； 斜體 + 波浪下劃線 ：編碼 GI 隨從序列的 DNA； 斜體 + 粗體 + 下劃線 ：編碼 GI 引導序列的 DNA。
另一抗 Grik2構建體併入了 GI 抗 Grik2序列 (SEQ ID NO：77)，該構建體可以包括 E-miR-30 支架，使得微小 RNA 編碼序列為具有SEQ ID NO: 798 之核酸序列的多核苷酸或為其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 798. TCGACTAGGGATAACAGGGTAATTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTAAAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAC GTCTCGATATGGAGAACCCATG CTGTGAAGCCACAGATGGG CATGGGTTTTATATCGAGACGCTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTATCAC (SEQ ID NO: 798) 索引： 斜體= 5' 側翼序列-引導序列-微小 RNA 環序列-隨從序列-3' 側翼序列； 斜體 + 粗體 + 單下劃線 ：編碼 GI 引導序列的 DNA； 斜體 + 波浪下劃線 ：編碼 GI 隨從序列的 DNA。
本揭露之另一單順反子、抗 Grik2構建體為 AAV (例如，AAV9) 構建體，其含有 hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790)、併入 E-miR-30 支架中的 ASO GI (SEQ ID NO: 77)、及填充序列 (SEQ ID NO: 815 及 816）。此類構建體可具有 SEQ ID NO: 803 的核酸序列或可為其變體中，該變體與 SEQ ID NO: 803 的核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更多) 的序列同一性(參見下文)。SEQ ID NO: 803 或其變體的表現載體可併入具有以下之核酸序列的載體中：SEQ ID NO: 804 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 804. CTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGGGCGCGCCTAGCCCGGGCTAGGTCGAC TCGACTAGGGATAACAGGGTAATTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTAAAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGACGTCTCGATATGGAGAACCCATGCTGTGAAGCCACAGATGGGCATGGGTTTTATATCGAGACGCTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTATCACGGGATCC GATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGCGGCCGC ATAGTCTATCCAGGTTGAGCATCCTGCTGGTGGTTACAAGAAACTGTTTGAAACTGTGGAGGAACTGTCCTCGCCGCTCACAGCTCATGTAACAGGCAGGATCCCCCTCTGGCTCACCGGCAGTCTCCTTCGATGTGGGCCAGGACTCTTTGAAGTTGGATCTGAGCCATTTTACCACCTGTTTGATGGGCAAGCCCTCCTGCACAAGTTTGACTTTAAAGAAGGACATGTCACATACCACAGAAGGTTCATCCGCACTGATGCTTACGTACGGGCAATGACTGAGAAAAGGATCGTCATAACAGAATTTGGCACCTGTGCTTTCCCAGATCCCTGCAAGAATATATTTTCCAGGTTTTTTTCTTACTTTCGAGGAGTAGAGGTTACTGACAATTGCCCTTGTTAATGTCTACCCAGTGGGGGAAGATTACTACGCTTGCACAGAGACCAACTTTATTACAAAGATTAATCCAGAGACCTTGGAGACAATTAAGCAGGTTGATCTTTGCAACTAAGTCTCTGTCAATGGGGCCACTGCTCACCCCCACATTGAAAATGATGGAACCGTTTACAATATTGGTAATTGCTTTGGAAAAAATTTTTCAATTGCCTACAACATTGTAAAGATCCCACCACTGCAAGCAGACAAGGAAGATCCAATAAGCAAGTCAGAGATCGTTGTACAATTCCCCTGCAGTGACCGATTCAAGCCATCTTACGTTCATAGTTTTGGTCTGACTCCCAACTATATCGTTTTTGTGGAGACACCAGTCAAAATTAACCTGTTCAAGTTCCTTTCTTCATGGAGTCTTTGGGGAGCCAACTACATGGATTGTTTTGAGTCCAATGAAACCATGGGGTTTGGCTTCATATTGCTGACAAAAAAAGGAAAAAGTACCTCAATAATAAATACAGAACTTCTCCTTTCAACCTCTTCCATCACATCAACACCTATGAAGACAATGGGTTTCTGATTGTGGATCTCTGCTGCTGGAAAGGATTTGAGTTTGTTTATAATTACTTATATTTAGCCAATTTACGTGAGAACTGGGAAGAGGTGAAAAAAAATGCCAGAAAGGCTCCCCAACCTGAAGTTAGGAGATATGTACTTCCTTTGAATATTGACAAGGCTGACACAGGCAAGAATTTAGTCAGCTCCCCAATACAACTGCCACTGCAATTCTGTGCAGTGACGAGACTATCTGGCTGGAGCCTGAAGTTCTCTTTTCAGGGCCTCGTCAAGCATTTGAGTTTCCTCAAATCAATTACCAGAAGTATTGTGGGAAACCTTACACATATGCGTATGGACTTGGCTTGAATCACTTTGTTCCAGATAGGCTCTGTAAGCTGAATGTCAAAACTAAAGAAACTTGGGTTTGGCAAGAGCCTGATTCATACCCATCAGAACCCATCTTTGTTTCTCACCCAGATGCCTTGGAAGAAGATGATGGTGTAGTTCTGAGTGTGGTGGTGAGCCCAGGAGCAGGACAAAAGCCTGCTTATCTCCTGATTCTGAATGCCAAGGACTTAAGTGAAGTTGCCCGGGCTGAAGTGGAGATTAACATCCCTGTCACCTTTCATGGACTGTTCAAAAAATCTTGAccggccgcc CGAGTTTAATTGGTTTATAGAACTCTTCA (SEQ ID NO: 803) 索引： 單下劃線：啟動子序列； 粗體：含有引導序列及隨從序列的微小 RNA 莖環結構； 雙下劃線：polyA 序列； 斜體 ：填充序列 1 (SEQ ID NO: 815)； 斜體 + 下劃線 ：填充序列 2 (SEQ ID NO: 816)。
在其中反義構建體含有 ASO 序列 MW (SEQ ID NO: 80) 情況下，構建體可包括 E-miR-218-1 支架，使得微小 RNA 編碼序列為具有 SEQ ID NO: 799 之核酸序列的多核苷酸或為其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 799. ACGTTTCCAGAACGTCTGTAGCTTTTCTCCTCCTTCCCTCCATTTTCCTCTTGGTCTTACCTTTGGCCTAGTGGTTGGTGTAGTGATAATGTAGCGAGATTTTCTG CAGAGCATTGCAGATGGACTG GGTTGCGAGGTATGAGTAAA CAGTCCATACGCAATGCTCCGTGGAACGTCACGCAGCTTTCTACAGCATGACAAGCTGCTGAGGCTTAAATCAGGATTTTCCTGTCTCTTTCTACAAAATCAAAATGAAAAAAGAGGGCTTTTTAGGCATCTCCGAGATTATGTG (SEQ ID NO: 799) 索引： 斜體= 5' 側翼序列-引導序列-微小 RNA 環序列-隨從序列-3' 側翼序列； 斜體 + 粗體 + 單下劃線 ：編碼 GI 引導序列的 DNA； 斜體 + 波浪下劃線 ：編碼 GI 隨從序列的 DNA。 SEQ ID NO: 799 的構建體可進一步包括 hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790) 及 polyA 序列，如下面的 SEQ ID NO: 819 中所示。 CTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGGGCGCGCCTGAATTCACGTTTCCAGAACGTCTGT AGCTTTTCTCCTCCTTCCCTCCATTTTCCTCTTGGTCTTACCTTTGGCCTAGTGGTTGGTGTAGTGATAATGTAGCGAGATTTTCTG CAGAGCATTGCAGATGGACTG GGTTGCGAGGTATGAGTAAA CAGTCCATACGCAATGCTCCG TGGAACGTCACGCAGCTTTCTACAGCATGACAAGCTGCTGAGGCTTAAATCAGGATTTTCCTGTCTCTTTCTACAAAATCAAAATGAAAAAAGAGGGCTTTTTAGGCATCTCCGAGATTATGTG CTCGAGGGGATCC GATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCG(SEQ ID NO: 819) 索引： 單下劃線= 啟動子序列； 斜體=5' 側翼序列-引導序列-微小 RNA 環序列-隨從序列-3' 側翼序列； 斜體 + 波浪下劃線 ：編碼 GI 隨從序列的 DNA； 斜體 + 粗體 + 單下劃線 ：編碼 GI 引導序列的 DNA； 雙下劃線：polyA 序列。
本揭露之另一單順反子、抗 Grik2構建體為 AAV (例如，AAV9) 構建體，其含有 hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790)、併入 E-miR-218-1 支架中的 ASO MW (SEQ ID NO: 80)、及一個或多個填充序列 (例如，SEQ ID NO：815 及/或 SEQ ID NO: 816)。此類構建體可具有 SEQ ID NO: 805 的核酸序列或可為其變體中，該變體與 SEQ ID NO: 805 的核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更多) 的序列同一性(參見下文)。SEQ ID NO: 805 或其變體的表現載體可併入具有以下之核酸序列的載體中：SEQ ID NO: 806 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 806. CTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGGGCGCGCCTGAATTC ACGTTTCCAGAACGTCTGTAGCTTTTCTCCTCCTTCCCTCCATTTTCCTCTTGGTCTTACCTTTGGCCTAGTGGTTGGTGTAGTGATAATGTAGCGAGATTTTCTGCAGAGCATTGCAGATGGACTGGGTTGCGAGGTATGAGTAAACAGTCCATACGCAATGCTCCGTGGAACGTCACGCAGCTTTCTACAGCATGACAAGCTGCTGAGGCTTAAATCAGGATTTTCCTGTCTCTTTCTACAAAATCAAAATGAAAAAAGAGGGCTTTTTAGGCATCTCCGAGATTATGTGCTCGAGGG GATCCGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGCGGCCGC ATAGTCTATCCAGGTTGAGCATCCTGCTGGTGGTTACAAGAAACTGTTTGAAACTGTGGAGGAACTGTCCTCGCCGCTCACAGCTCATGTAACAGGCAGGATCCCCCTCTGGCTCACCGGCAGTCTCCTTCGATGTGGGCCAGGACTCTTTGAAGTTGGATCTGAGCCATTTTACCACCTGTTTGATGGGCAAGCCCTCCTGCACAAGTTTGACTTTAAAGAAGGACATGTCACATACCACAGAAGGTTCATCCGCACTGATGCTTACGTACGGGCAATGACTGAGAAAAGGATCGTCATAACAGAATTTGGCACCTGTGCTTTCCCAGATCCCTGCAAGAATATATTTTCCAGGTTTTTTTCTTACTTTCGAGGAGTAGAGGTTACTGACAATTGCCCTTGTTAATGTCTACCCAGTGGGGGAAGATTACTACGCTTGCACAGAGACCAACTTTATTACAAAGATTAATCCAGAGACCTTGGAGACAATTAAGCAGGTTGATCTTTGCAACTAAGTCTCTGTCAATGGGGCCACTGCTCACCCCCACATTGAAAATGATGGAACCGTTTACAATATTGGTAATTGCTTTGGAAAAAATTTTTCAATTGCCTACAACATTGTAAAGATCCCACCACTGCAAGCAGACAAGGAAGATCCAATAAGCAAGTCAGAGATCGTTGTACAATTCCCCTGCAGTGACCGATTCAAGCCATCTTACGTTCATAGTTTTGGTCTGACTCCCAACTATATCGTTTTTGTGGAGACACCAGTCAAAATTAACCTGTTCAAGTTCCTTTCTTCATGGAGTCTTTGGGGAGCCAACTACATGGATTGTTTTGAGTCCAATGAAACCATGGGGTTTGGCTTCATATTGCTGACAAAAAAAGGAAAAAGTACCTCAATAATAAATACAGAACTTCTCCTTTCAACCTCTTCCATCACATCAACACCTATGAAGACAATGGGTTTCTGATTGTGGATCTCTGCTGCTGGAAAGGATTTGAGTTTGTTTATAATTACTTATATTTAGCCAATTTACGTGAGAACTGGGAAGAGGTGAAAAAAAATGCCAGAAAGGCTCCCCAACCTGAAGTTAGGAGATATGTACTTCCTTTGAATATTGACAAGGCTGACACAGGCAAGAATTTAGTCAGCTCCCCAATACAACTGCCACTGCAATTCTGTGCAGTGACGAGACTATCTGGCTGGAGCCTGAAGTTCTCTTTTCAGGGCCTCGTCAAGCATTTGAGTTTCCTCAAATCAATTACCAGAAGTATTGTGGGAAACCTTACACATATGCGTATGGACTTGGCTTGAATCACTTTGTTCCAGATAGGCTCTGTAAGCTGAATGTCAAAACTAAAGAAACTTGGGTTTGGCAAGAGCCTGATTCATACCCATCAGAACCCATCTTTGTTTCTCACCCAGATGCCTTGGAAGAAGATGATGGTGTAGTTCTGAGTGTGGTGGTGAGCCCAGGAGCAGGACAAAAGCCTGCTTATCTCCTGATTCTGAATGCCAAGGACTTAAGTGAAGTTGCCCGGGCTGAAGTGGAGATTAACATCCCTGTCACCTTTCATGGACTGTTCAAAAAATCTTGAccggccgcc CGAGTTTAATTGGTTTATAGAACTCTTCA (SEQ ID NO: 805) 索引： 單下劃線：啟動子序列； 粗體：含有引導序列及隨從序列的微小 RNA 莖環結構； 雙下劃線：polyA 序列； 斜體 ：填充序列 1 (SEQ ID NO: 815)； 斜體 + 下劃線 ：填充序列 2 (SEQ ID NO: 816)。
替代地，含有 ASO 序列 MW (SEQ ID NO: 80) 的反義構建體可包括 E-miR-124-3 支架，使得微小 RNA 編碼序列為具有 SEQ ID NO: 800 之核酸序列的多核苷酸或為其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 800. TCTGCCGCGGAAAGGGGAGAAGTGTGGGCTCCTCCGAGTCGGGGGCGGACTGGGACAGCACAGTCGGCTGAGCGCAGCGCCCCCGCCCTGCCCGCCACGCGGCGAAGACGCCTGAGCGTTCGCGCCCCTCGGGCGAGGACCCCACGCAAGCCCGAGCCGGTCCCGACCCTGGCCCCGACGCTCGCCGCCCGCCCCAGCCCTGAGGGCCCCT CGACGTTTATCTACAACACTCTGATTTAATGTCTATACAAT CAGAGCATTGCAGATGGACTGC GAGAGGCGCCTCCGCCGCTCCTTTCTCATGGAAATGGCCCGCGAGCCCGTCCGGCCCAGCGCCCCTCCCGCGGGAGGAAGGCGAGCCCGGCCCCCGGCGGCCATTCGCGCCGCGGACAAATCCGGCGAACAATGCGCCCGCCCAGAGTGCGGCCCAGCTGCCGGGCCGGGGATCTGGCCGCGGGACACAAAGGGGCCCGCACGCCTCTGGCGT (SEQ ID NO: 800) 索引： 斜體= 5' 側翼序列-引導序列-微小 RNA 環序列-隨從序列-3' 側翼序列； 斜體 + 波浪下劃線 ：編碼 MW 隨從序列的 DNA； 斜體 + 下劃線 + 灰色高亮 ：編碼 MW 引導序列的 DNA。 SEQ ID NO: 800 的構建體可進一步包括 hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790) 及 polyA 序列，如下面的 SEQ ID NO: 821. CTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGGGCGCGCCTGAATTC TCTGCCGCGGAAAGGGGAGAAGTGTGGGCTCCTCCGAGTCGGGGGCGGACTGGGACAGCACAGTCGGCTGAGCGCAGCGCCCCCGCCCTGCCCGCCACGCGGCGAAGACGCCTGAGCGTTCGCGCCCCTCGGGCGAGGACCCCACGCAAGCCCGAGCCGGTCCCGACCCTGGCCCCGACGCTCGCCGCCCGCCCCAGCCCTGAGGGCCCCTCGA CGTTTATCTACAACACTCTGATTTAATGTCTATACAAT CAGAGCATTGCAGATGGACTGC GAGAGGCGCCTCCGCCGCTCCTTTCTCATGGAAATGGCCCGCGAGCCCGTCCGGCCCAGCGCCCCTCCCGCGGGAGGAAGGCGAGCCCGGCCCCCGGCGGCCATTCGCGCCGCGGACAAATCCGGCGAACAATGCGCCCGCCCAGAGTGCGGCCCAGCTGCCGGGCCGGGGATCTGGCCGCGGGACACAAAGGGGCCCGCACGCCTCTGGCGT CTCGAGGGGATCC GATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCG(SEQ ID NO: 821) 索引： 單下劃線= 啟動子序列； 斜體=5' 側翼序列-引導序列-微小 RNA 環序列-隨從序列-3' 側翼序列； 斜體 + 波浪下劃線 ：編碼 GI 隨從序列的 DNA； 斜體 + 粗體 + 單下劃線 ：編碼 GI 引導序列的 DNA； 雙下劃線：polyA 序列。
本揭露之另一單順反子、抗 Grik2構建體為 AAV (例如，AAV9) 構建體，其含有 hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790)、併入 E-miR-124-3 支架中的 ASO MW (SEQ ID NO: 80)、及一個或多個填充序列 (SEQ ID NO: 815 及/或 SEQ ID NO: 816)。此類構建體可具有 SEQ ID NO: 807 的核酸序列或可為其變體中，該變體與 SEQ ID NO: 807 的核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更多) 的序列同一性(參見下文)。SEQ ID NO: 807 或其變體的表現載體可併入具有以下之核酸序列的載體中：SEQ ID NO: 808 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 808. CTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGGGCGCGCCTGAATTC TCTGCCGCGGAAAGGGGAGAAGTGTGGGCTCCTCCGAGTCGGGGGCGGACTGGGACAGCACAGTCGGCTGAGCGCAGCGCCCCCGCCCTGCCCGCCACGCGGCGAAGACGCCTGAGCGTTCGCGCCCCTCGGGCGAGGACCCCACGCAAGCCCGAGCCGGTCCCGACCCTGGCCCCGACGCTCGCCGCCCGCCCCAGCCCTGAGGGCCCCTCGACGTTTATCTACAACACTCTGATTTAATGTCTATACAATCAGAGCATTGCAGATGGACTGCGAGAGGCGCCTCCGCCGCTCCTTTCTCATGGAAATGGCCCGCGAGCCCGTCCGGCCCAGCGCCCCTCCCGCGGGAGGAAGGCGAGCCCGGCCCCCGGCGGCCATTCGCGCCGCGGACAAATCCGGCGAACAATGCGCCCGCCCAGAGTGCGGCCCAGCTGCCGGGCCGGGGATCTGGCCGCGGGACACAAAGGGGCCCGCACGCCTCTGGCGTCTCGAGGGGATCC GATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGCGGCCGC ATAGTCTATCCAGGTTGAGCATCCTGCTGGTGGTTACAAGAAACTGTTTGAAACTGTGGAGGAACTGTCCTCGCCGCTCACAGCTCATGTAACAGGCAGGATCCCCCTCTGGCTCACCGGCAGTCTCCTTCGATGTGGGCCAGGACTCTTTGAAGTTGGATCTGAGCCATTTTACCACCTGTTTGATGGGCAAGCCCTCCTGCACAAGTTTGACTTTAAAGAAGGACATGTCACATACCACAGAAGGTTCATCCGCACTGATGCTTACGTACGGGCAATGACTGAGAAAAGGATCGTCATAACAGAATTTGGCACCTGTGCTTTCCCAGATCCCTGCAAGAATATATTTTCCAGGTTTTTTTCTTACTTTCGAGGAGTAGAGGTTACTGACAATTGCCCTTGTTAATGTCTACCCAGTGGGGGAAGATTACTACGCTTGCACAGAGACCAACTTTATTACAAAGATTAATCCAGAGACCTTGGAGACAATTAAGCAGGTTGATCTTTGCAACTAAGTCTCTGTCAATGGGGCCACTGCTCACCCCCACATTGAAAATGATGGAACCGTTTACAATATTGGTAATTGCTTTGGAAAAAATTTTTCAATTGCCTACAACATTGTAAAGATCCCACCACTGCAAGCAGACAAGGAAGATCCAATAAGCAAGTCAGAGATCGTTGTACAATTCCCCTGCAGTGACCGATTCAAGCCATCTTACGTTCATAGTTTTGGTCTGACTCCCAACTATATCGTTTTTGTGGAGACACCAGTCAAAATTAACCTGTTCAAGTTCCTTTCTTCATGGAGTCTTTGGGGAGCCAACTACATGGATTGTTTTGAGTCCAATGAAACCATGGGGTTTGGCTTCATATTGCTGACAAAAAAAGGAAAAAGTACCTCAATAATAAATACAGAACTTCTCCTTTCAACCTCTTCCATCACATCAACACCTATGAAGACAATGGGTTTCTGATTGTGGATCTCTGCTGCTGGAAAGGATTTGAGTTTGTTTATAATTACTTATATTTAGCCAATTTACGTGAGAACTGGGAAGAGGTGAAAAAAAATGCCAGAAAGGCTCCCCAACCTGAAGTTAGGAGATATGTACTTCCTTTGAATATTGACAAGGCTGACACAGGCAAGAATTTAGTCAGCTCCCCAATACAACTGCCACTGCAATTCTGTGCAGTGACGAGACTATCTGGCTGGAGCCTGAAGTTCTCTTTTCAGGGCCTCGTCAAGCATTTGAGTTTCCTCAAATCAATTACCAGAAGTATTGTGGGAAACCTTACACATATGCGTATGGACTTGGCTTGAATCACTTTGTTCCAGATAGGCTCTGTAAGCTGAATGTCAAAACTAAAGAAACTTGGGTTTGGCAAGAGCCTGATTCATACCCATCAGAACCCATCTTTGTTTCTCACCCAGATGCCTTGGAAGAAGATGATGGTGTAGTTCTGAGTGTGGTGGTGAGCCCAGGAGCAGGACAAAAGCCTGCTTATCTCCTGATTCTGAATGCCAAGGACTTAAGTGAAGTTGCCCGGGCTGAAGTGGAGATTAACATCCCTGTCACCTTTCATGGACTGTTCAAAAAATCTTGAccggccgcc CGAGTTTAATTGGTTTATAGAACTCTTCA (SEQ ID NO: 807) 索引： 單下劃線：啟動子序列； 粗體：含有引導序列及隨從序列的微小 RNA 莖環結構； 雙下劃線：polyA 序列； 斜體 ：填充序列 1 (SEQ ID NO: 815)； 斜體 + 下劃線 ：填充序列 2 (SEQ ID NO: 816)。 多基因 miRNA 匣
側翼/莖環/側翼構建體 (例如，pri-miRNA) 可視為單個 miRNA「匣」並且可為多聯體 (例如，以由一個或多個啟動子驅動的多基因排列提供)。超過一個 (例如，至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10 或更多個) 前驅 miR 莖環序列可以嵌入較長轉錄本 (諸如內含子) 內或在內源性微小 RNA 側翼序列 (各莖環的 5' 及 3'，諸如 -5p 及 -3p 序列) 之間。各前驅 miR 莖環序列可在專用啟動子的控制下表現 (例如，作為具有單獨啟動子序列的多基因構建體，各啟動子序列獨立地調節單個前驅 miR 莖環序列的表現；亦即，各啟動子皆獨立於另一個啟動子來產生單獨的微小 RNA)。已經表明，可以提供至少 5-bp 經延伸之莖的側翼序列足以加工莖環 (Sun, 等人 BioTechniques.41:59-63，2006 年 7 月，以引用方式併入本文)。間隔子序列可位於第一 miRNA 表現匣的 3' 側翼序列與第二 miRNA 表現匣的 5' 側翼序列之間。間隔子序列可源自編碼或非編碼 (例如，內含子) 序列並且具有各種長度，但不視為莖-環-側翼序列的一部分 (Rousset, F. 等人， Molecular Therapy: Nucleic Acids, 14:352-63, 2019,，以引用方式併入本文)。
示例性表現匣可包括含有以下的核苷酸序列：(a) 第一多核苷酸，其編碼含有與 Grik2mRNA 雜交的引導 RNA 序列的第一 miRNA 序列；(b) 第二多核苷酸，其編碼含有與 Grik2mRNA 雜交的引導 RNA 序列的第二 miRNA 序列。例如，表現匣可包括，從 5' 到 3'：(a) 位於引導股的 5' 的第一 5' 側翼區域，該第一側翼區域包括第一 5' 側翼序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 及 768 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；(b) 第一莖環結構，其包括：(i) 5' 莖環臂，其包括與以下中之任一者具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列的引導序列 (例如，SEQ ID NO: 1 至 100)；(ii) 環區域，其包括選自表 6 的微小 RNA 序列或其與其具有至少85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體；(iii) 3' 莖環臂，其包括與引導股互補或實質上互補的隨從核苷酸序列；(c) 第一 3' 側翼區域 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 及 769 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)，其位於該隨從股及 3' 間隔子序列的 3'；(d) 第二 5' 側翼區域 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 及 768 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)，其位於引導股的 5'；(e) 第二莖環結構，其包括：(i) 5' 莖環臂，其包括與以下中之任一者具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列的引導序列 (例如，SEQ ID NO: 1 至 100)；(ii) 環區域，其含有選自表 6 的微小 RNA 序列或其與其具有至少85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體；(iii) 3' 莖環臂，其 包括與引導股互補或實質上互補的隨從核苷酸序列；(f) 第二 3' 側翼區域，其包括位於隨從股的 3' 的 3' 側翼序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 及 769 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)。
第一 5' 側翼序列、第一 3' 側翼序列、第二 5' 側翼序列及第二 3' 側翼序列可選自表 6。 雙 miRNA 、單啟動子表現匣
多基因或多基因 rAAV 表現構建體可包括由順序的 (例如連續或非連續的) 編碼 miRNA 的多核苷酸 X 1，諸如 (X 1) n組成的轉殖基因。X 1多核苷酸包括表 2 及/或表 3 中所列的引導序列中之任一者、與該引導序列完全或實質上互補的隨從序列、表 6 中所列的 5' 及 3' 側翼序列中之任一者、及表 6 中列出環序列中之任一者。具有式 (X 1) n的多基因轉殖基因處於位於該轉殖基因之 5' 端的單個啟動子的控制下，因此該啟動子及轉殖基因具有式啟動子-(X 1) n，其中 n 為 1 至 10 之整數 (例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10)。
本揭露之多微小 RNA 建體的非限制性實例包括單個啟動子，例如，hSyn 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 790)、嵌入內源性 (E)-miR-30 支架中的 GI 反義序列 (SEQ ID NO: 77)、及嵌入 E-miR-218-1 支架中的 MW 反義序列 (SEQ ID NO: 80)。此類構建體可具有 SEQ ID NO: 811 之核酸序列或可為其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 811 (參見下文)。SEQ ID NO: 811 或其變體的表現載體可併入具有以下之核酸序列的載體中：SEQ ID NO: 812 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 812. CTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGGGCGCGCCTAGCCCGGGCTAGGTCGA c TCGACTAGGGATAACAGGGTAATTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTAAAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGACGTCTCGATATGGAGAACCCATGCTGTGAAGCCACAGATGGGCATGGGTTTTATATCGAGACGCTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTATCACGGGATCCGAATTCACGTTTCCAGAACGTCTGTAGCTTTTCTCCTCCTTCCCTCCATTTTCCTCTTGGTCTTACCTTTGGCCTAGTGGTTGGTGTAGTGATAATGTAGCGAGATTTTCTGCAGAGCATTGCAGATGGACTGGGTTGCGAGGTATGAGTAAACAGTCCATACGCAATGCTCCGTGGAACGTCACGCAGCTTTCTACAGCATGACAAGCTGCTGAGGCTTAAATCAGGATTTTCCTGTCTCTTTCTACAAAATCAAAATGAAAAAAGAGGGCTTTTTAGGCATCTCCGAGATTATGTGCTCGAGGG GATCCGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGCGGCCGC ATAGTCTATCCAGGTTGAGCATCCTGCTGGTGGTTACAAGAAACTGTTTGAAACTGTGGAGGAACTGTCCTCGCCGCTCACAGCTCATGTAACAGGCAGGATCCCCCTCTGGCTCACCGGCAGTCTCCTTCGATGTGGGCCAGGACTCTTTGAAGTTGGATCTGAGCCATTTTACCACCTGTTTGATGGGCAAGCCCTCCTGCACAAGTTTGACTTTAAAGAAGGACATGTCACATACCACAGAAGGTTCATCCGCACTGATGCTTACGTACGGGCAATGACTGAGAAAAGGATCGTCATAACAGAATTTGGCACCTGTGCTTTCCCAGATCCCTGCAAGAATATATTTTCCAGGTTTTTTTCTTACTTTCGAGGAGTAGAGGTTACTGACAATTGCCCTTGTTAATGTCTACCCAGTGGGGGAAGATTACTACGCTTGCACAGAGACCAACTTTATTACAAAGATTAATCCAGAGACCTTGGAGACAATTAAGCAGGTTGATCTTTGCAACTAAGTCTCTGTCAATGGGGCCACTGCTCACCCCCACATTGAAAATGATGGAACCGTTTACAATATTGGTAATTGCTTTGGAAAAAATTTTTCAATTGCCTACAACATTGTAAAGATCCCACCACTGCAAGCAGACAAGGAAGATCCAATAAGCAAGTCAGAGATCGTTGTACAATTCCCCTGCAGTGACCGATTCAAGCCATCTTACGTTCATAGTTTTGGTCTGACTCCCAACTATATCGTTTTTGTGGAGACACCAGTCAAAATTAACCTGTTCAAGTTCCTTTCTTCATGGAGTCTTTGGGGAGCCAACTACATGGATTGTTTTGAGTCCAATGAAACCATGGGGTTTGGCTTCATATTGCTGACAAAAAAAGGAAAAAGTACCTCAATAATAAATACAGAACTTCTCCTTTCAACCTCTTCCATCACATCAACACCTATGAAGACAATGGGTTTCTGATTGTGGATCTCTGCTGCTGGAAAGGATTTGAGTTTGTTTATAATTACTTATATTTAGCCAATTTACGTGAGAACTGGGAAGAGGTGAAAAAAAATGCCAGAAAGGCTCCCCAACCTGAAGTTAGGAGATATGTACTTCCTTTGAATATTGACAAGGCTGACACAGGCAAGAATTTAGTCAGCTCCCCAATACAACTGCCACTGCAATTCTGTGCAGTGACGAGACTATCTGGCTGGAGCCTGAAGTTCTCTTTTCAGGGCCTCGTCAAGCATTTGAGTTTCCTCAAATCAATTACCAGAAGTATTGTGGGAAACCTTACACATATGCGTATGGACTTGGCTTGAATCACTTTGTTCCAGATAGGCTCTGTAAGCTGAATGTCAAAACTAAAGAAACTTGGGTTTGGCAAGAGCCTGATTCATACCCATCAGAACCCATCTTTGTTTCTCACCCAGATGCCTTGGAAGAAGATGATGGTGTAGTTCTGAGTGTGGTGGTGAGCCCAGGAGCAGGACAAAAGCCTGCTTATCTCCTGATTCTGAATGCCAAGGACTTAAGTGAAGTTGCCCGGGCTGAAGTGGAGATTAACATCCCTGTCACCTTTCATGGACTGTTCAAAAAATCTTGA(SEQ ID NO: 811) 索引： 單下劃線：啟動子序列； 粗體：含有引導序列及隨從序列的微小 RNA 莖環結構； 雙下劃線：polyA 序列； 斜體 ：填充序列 (SEQ ID NO: 815)。 雙 miRNA 、雙啟動子表現匣
含有超過一個 (例如，至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10 或更多個) 前驅 miR 莖環序列的多基因表現匣可包括超過一個啟動子序列以調節各個別前驅 miR 莖環序列的表現，使得各個別前驅 miR 莖環序列可操縱地連接至專用啟動子序列。在這種情況下，表現構建體具有式 (啟動子-X 1) n之結構，其中 X 1為含有表 2 及/或表 3 中列出的引導序列中之任一者的多核苷酸，且 n 為 1 至 10 之整數 (例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10)。額外調節元件，諸如增強子序列、終止子序列、多腺苷酸化訊息、內含子及/或能夠形成二級結構的序列，諸如本文所揭示的調節元件中之任一者，可以可操縱地連接至該啟動子-X 1結構的 5' 端及/或 3' 端。
在特定實例中，雙 miRNA 表現匣包括兩個前驅 miR 莖環序列，各自在個別啟動子序列 (例如，本文所揭示的啟動子序列) 的控制下。雙 miRNA 匣中的兩個啟動子可為相同的啟動子或不同的啟動子。
在具體實例中，雙 miRNA 表現匣包括核苷酸序列，該核苷酸序列包含，從 5' 到 3'：(a) 第一啟動子序列 (例如，本文例如表 5 中所揭示的啟動子序列中之任一者，例如，hSyn 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者)、CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者) 或 C1ql2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；(b) 第一 5' 側翼區域，其位於第一隨從核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768) 之 5'；(c) 第一莖環序列，其包括，從 5' 至 3'：(i) 第一 5' 莖環臂，其包括與第一引導序列互補或實質上互補的第一隨從核苷酸序列；(ii) 第一環區域，其含有第一微小 RNA 環序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770)；(iii) 第一 3' 莖環臂，其含有與以下中之任一者具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的第一引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列的引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；(d) 第一 3' 側翼區域，其位於第一引導核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769) 之 3'；(e) 視情況，第二啟動子序列 (例如，本文例如表 5 所揭示之啟動子序列中之任一者，例如，hSyn 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者)、CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者) 或 C1ql2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；(f) 第二 5' 側翼區域，其位於第二隨從核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768) 之 5'；(g) 第二莖環序列，其包括，從 5' 至 3'：(i) 第二 5' 莖環臂，其含有與第二引導序列互補或實質上互補的第二隨從核苷酸序列；(ii) 第二環區域，其含有第二微小 RNA 環序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770)；(iii) 第二 3' 莖環臂，其含有與以下中之任一者具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的第二引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列的引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；及 (h) 第二 3' 側翼區域，其位於第二引導核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769) 之 3'。
在另一實例中，雙 miRNA 表現匣包括核苷酸序列，該核苷酸序列包括，從 5' 到 3'：(a) 第一啟動子序列 (例如，本文例如表 5 中所揭示的啟動子序列中之任一者，例如，hSyn 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者)、CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者) 或 C1ql2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；(b) 第一 5' 側翼區域，其位於第一隨從核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768) 之 5'；(c) 第一莖環序列，其包括，從 5' 至 3'：(i) 第一 5' 莖環臂，其含有與第一引導序列互補或實質上互補的第一隨從核苷酸序列；(ii) 第一環區域，其含有第一微小 RNA 環序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770)；(iii) 第一 3' 莖環臂，其含有與以下中之任一者具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的第一引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列的引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；(d) 第一 3' 側翼區域，其位於第一引導核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769) 之 3'；(e) 視情況，第二啟動子序列 (例如，本文例如表 5 所揭示之啟動子序列中之任一者，例如，hSyn 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者)、CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者) 或 C1ql2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；(f) 第二 5' 側翼區域，其位於第二引導核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768) 之 5'；(g) 第二莖環序列，其包括，從 5' 至 3'：(i) 第二 5' 莖環臂，其含有與以下中之任一者具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列的引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；(ii) 第二環區域，其含有第二微小 RNA 環序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770)；(iii) 第二 3' 莖環臂，其含有與第二引導序列互補或基本互補的第二隨從核苷酸序列；及 (h) 第二 3' 側翼區域，其位於第二隨從核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769) 之 3'。
在另一實例中，雙 miRNA 表現匣包括核苷酸序列，該核苷酸序列包括，從 5' 到 3'：(a) 第一啟動子序列 (例如，本文例如表 5 中所揭示的啟動子序列中之任一者，例如，hSyn 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者)、CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者) 或 C1ql2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；(b) 第一 5' 側翼區域，其位於第一引導核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768) 之 5'；(c) 第一莖環序列，其包括，從 5' 至 3'：(i) 第一 5' 莖環臂，其含有與以下中之任一者具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的第一引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列的引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；(ii) 第一環區域，其含有第一微小 RNA 環序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770)；(iii) 第一 3' 莖環臂，其含有與第一引導序列互補或基本互補的第一隨從核苷酸序列；(d) 第一 3' 側翼區域，其位於第一隨從核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769) 之 3'；(e) 視情況，第二啟動子序列 (例如，本文例如表 5 所揭示之啟動子序列中之任一者，例如，hSyn 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者)、CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者) 或 C1ql2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；(f) 第二 5' 側翼區域，其位於第二隨從核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768) 之 5'；(g) 第二莖環序列，其包括，從 5' 至 3'：(i) 第二 5' 莖環臂，其含有與第二引導序列互補或實質上互補的第二隨從核苷酸序列；(ii) 第二環區域，其含有第二微小 RNA 環序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770)；(iii) 第二 3' 莖環臂，其含有與以下中之任一者具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的第二引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列的引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；及 (h) 第二 3' 側翼區域，其位於第二引導核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769) 之 3'。
在另一實例中，雙 miRNA 表現匣包括核苷酸序列，該核苷酸序列包括，從 5' 到 3'：(a) 第一啟動子序列 (例如，本文例如表 5 中所揭示的啟動子序列中之任一者，例如，hSyn 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者)、CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者) 或 C1ql2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；(b) 第一 5' 側翼區域，其位於第一引導核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768) 之 5'；(c) 第一莖環序列，其包括，從 5' 至 3'：(i) 第一 5' 莖環臂，其含有與以下中之任一者具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的第一引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列的引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；(ii) 第一環區域，其含有第一微小 RNA 環序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770)；(iii) 第一 3' 莖環臂，其含有與第一引導序列互補或基本互補的第一隨從核苷酸序列；(d) 第一 3' 側翼區域，其位於第一隨從核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769) 之 3'；(e) 視情況，第二啟動子序列 (例如，本文例如表 5 所揭示之啟動子序列中之任一者，例如，hSyn 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者)、CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者) 或 C1ql2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；(f) 第二 5' 側翼區域，其位於第二引導核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768) 之 5'；(g) 第二莖環序列，其包括，從 5' 至 3'：(i) 第二 5' 莖環臂，其含有與以下中之任一者具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列的引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；(ii) 第二環區域，其含有第二微小 RNA 環序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770)；(iii) 第二 3' 莖環臂，其含有與第二引導序列互補或基本互補的第二隨從核苷酸序列；及 (h) 第二 3' 側翼區域，其位於第二隨從核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769) 之 3'。
在另一實例中，雙 miRNA 表現匣包括核苷酸序列，該核苷酸序列包括，從 5' 到 3'：(a) 5' ITR 序列 (例如，具有以下之核酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO: 746 或 SEQ ID NO: 747 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 746 或 SEQ ID NO: 747)；(b) 第一啟動子序列 (例如，本文表 5 中所揭示的啟動子序列中之任一者或其變體，該變體與表 5 中列出的啟動子序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，例如，hSyn 啟動子 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者)、CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者) 或 C1ql2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；(c) 第一 5' 側翼區域，其位於第一隨從核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768 或其變體，該變體與以下中之任一者具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768)；(d) 第一莖環序列，其包括，從 5' 至 3'：(i) 第一 5' 莖環臂，其含有與第一引導序列互補或實質上互補的第一隨從核苷酸序列；(ii) 第一環區域，其含有第一微小 RNA 環序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770 或其變體，該變體與以下序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770)；(iii) 第一 3' 莖環臂，其含有與以下中之任一者具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的第一引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列的引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；(e) 第一 3' 側翼區域，其位於第一引導核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769 或其變體，該變體與以下序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769) 之 3'；(f) BGH polyA 序列 (例如，SEQ ID NO: 793 或其變體，該變體與以下序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 793)；(g) 視情況，第二啟動子序列 (例如，本文表 5 中所揭示的啟動子序列中之任一者或其變體，該變體與表 5 中列出的啟動子序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，例如，hSyn 啟動子 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者)、CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者) 或 C1ql2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；(h) 第二 5' 側翼區域，其位於第二隨從序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768 或其變體，該變體與以下中之任一者具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768) 之 5'；(i) 第二莖環序列，其包括，從 5' 至 3'：(i) 第二 5' 莖環臂，其含有與第二引導序列互補或實質上互補的第二隨從核苷酸序列；(ii) 第二環區域，其含有第二微小 RNA 環序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770 或其變體，該變體與以下序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770)；(iii) 第二 3' 莖環臂，其含有與以下中之任一者具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列的引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；及 (j) 第二 3' 側翼區域，其位於第二引導核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769 或其變體，該變體與以下序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769) 之 3'；(k) RBG polyA 序列 (例如，SEQ ID NO: 750、SEQ ID NO: 751 或 SEQ ID NO: 792 或其變體，該變體與以下序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 750、SEQ ID NO: 751 或 SEQ ID NO: 792)；及 3' ITR 序列 (例如，SEQ ID NO: 748、SEQ ID NO: 749 或 SEQ ID NO: 789 或其變體，該變體與以下序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 748、SEQ ID NO: 749 或 SEQ ID NO: 789)。
在另一實例中，雙 miRNA 表現匣包括核苷酸序列，該核苷酸序列包括，從 5' 到 3'：(a) 5' ITR 序列 (例如，具有以下之核酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO: 746 或 SEQ ID NO: 747 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 746 或 SEQ ID NO: 747)；(b) 第一啟動子序列 (例如，本文表 5 中所揭示的啟動子序列中之任一者或其變體，該變體與表 5 中列出的啟動子序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，例如，hSyn 啟動子 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者)、CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者) 或 C1ql2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；(c) 第一 5' 側翼區域，其位於第一隨從核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768 或其變體，該變體與以下中之任一者具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768)；(d) 第一莖環序列，其包括，從 5' 至 3'：(i) 第一 5' 莖環臂，其含有與第一引導序列互補或實質上互補的第一隨從核苷酸序列；(ii) 第一環區域，其含有第一微小 RNA 環序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770 或其變體，該變體與以下序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770)；(iii) 第一 3' 莖環臂，其含有與以下中之任一者具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的第一引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列的引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；(e) 第一 3' 側翼區域，其位於第一引導核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769 或其變體，該變體與以下序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769) 之 3'；(f) BGH polyA 序列 (例如，SEQ ID NO: 793 或其變體，該變體與以下序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 793)；(g) 視情況，第二啟動子序列 (例如，本文表 5 中所揭示的啟動子序列中之任一者或其變體，該變體與表 5 中列出的啟動子序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，例如，hSyn 啟動子 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者)、CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者) 或 C1ql2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；(h) 第二 5' 側翼區域，其位於第二隨從序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768 或其變體，該變體與以下中之任一者具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768) 之 5'；(i) 第二莖環序列，其包括，從 5' 至 3'：(i) 第二 5' 莖環臂，其含有與第二引導序列互補或實質上互補的第二隨從核苷酸序列；(ii) 第二環區域，其含有第二微小 RNA 環序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770 或其變體，該變體與以下序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770)；(iii) 第二 3' 莖環臂，其含有與以下中之任一者具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列的引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；及 (j) 第二 3' 側翼區域，其位於第二隨從核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769 或其變體，該變體與以下序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769) 之 3'；(k) RBG polyA 序列 (例如，SEQ ID NO: 750、SEQ ID NO: 751 或 SEQ ID NO: 792 或其變體，該變體與以下序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 750、SEQ ID NO: 751 或 SEQ ID NO: 792)；及 3' ITR 序列 (例如，SEQ ID NO: 748、SEQ ID NO: 749 或 SEQ ID NO: 789 或其變體，該變體與以下序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 748、SEQ ID NO: 749 或 SEQ ID NO: 789)。
在另一實例中，雙 miRNA 表現匣包括核苷酸序列，該核苷酸序列包括，從 5' 到 3'：(a) 5' ITR 序列 (例如，具有以下之核酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO: 746 或 SEQ ID NO: 747 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 746 或 SEQ ID NO: 747)；(b) 第一啟動子序列 (例如，本文表 5 中所揭示的啟動子序列中之任一者或其變體，該變體與表 5 中列出的啟動子序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，例如，hSyn 啟動子 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者)、CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者) 或 C1ql2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；(c) 第一 5' 側翼區域，其位於第一引導核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768 或其變體，該變體與以下中之任一者具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768)；(d) 第一莖環序列，其包括，從 5' 至 3'：(i) 第一 5' 莖環臂，其含有與以下中之任一者具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的第一引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列的引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；(ii) 第一環區域，其含有第一微小 RNA 環序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770 或其變體，該變體與以下序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770)；(iii) 第一 3' 莖環臂，其含有與第一引導序列互補或實質上互補的第一隨從核苷酸序列；(e) 第一 3' 側翼區域，其位於第一隨從核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769 或其變體，該變體與以下序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769) 之 3'；(f) BGH polyA 序列 (例如，SEQ ID NO: 793 或其變體，該變體與以下序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 793)；(g) 視情況，第二啟動子序列 (例如，本文表 5 中所揭示的啟動子序列中之任一者或其變體，該變體與表 5 中列出的啟動子序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，例如，hSyn 啟動子 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者)、CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者) 或 C1ql2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；(h) 第二 5' 側翼區域，其位於第二隨從序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768 或其變體，該變體與以下中之任一者具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768) 之 5'；(i) 第二莖環序列，其包括，從 5' 至 3'：(i) 第二 5' 莖環臂，其含有與第二引導序列互補或實質上互補的第二隨從核苷酸序列；(ii) 第二環區域，其含有第二微小 RNA 環序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770 或其變體，該變體與以下序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770)；(iii) 第二 3' 莖環臂，其含有與以下中之任一者具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列的引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；及 (j) 第二 3' 側翼區域，其位於第二引導核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769 或其變體，該變體與以下序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769) 之 3'；(k) RBG polyA 序列 (例如，SEQ ID NO: 750、SEQ ID NO: 751 或 SEQ ID NO: 792 或其變體，該變體與以下序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 750、SEQ ID NO: 751 或 SEQ ID NO: 792)；及 3' ITR 序列 (例如，SEQ ID NO: 748、SEQ ID NO: 749 或 SEQ ID NO: 789 或其變體，該變體與以下序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 748、SEQ ID NO: 749 或 SEQ ID NO: 789)。
在另一實例中，雙 miRNA 表現匣包括核苷酸序列，該核苷酸序列包括，從 5' 到 3'：(a) 5' ITR 序列 (例如，具有以下之核酸序列的多核苷酸：SEQ ID NO: 746 或 SEQ ID NO: 747 或其變體，該變體與以下之核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 746 或 SEQ ID NO: 747)；(b) 第一啟動子序列 (例如，本文表 5 中所揭示的啟動子序列中之任一者或其變體，該變體與表 5 中列出的啟動子序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，例如，hSyn 啟動子 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者)、CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者) 或 C1ql2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；(c) 第一 5' 側翼區域，其位於第一引導核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768 或其變體，該變體與以下中之任一者具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768)；(d) 第一莖環序列，其包括，從 5' 至 3'：(i) 第一 5' 莖環臂，其含有與以下中之任一者具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的第一引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列的引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；(ii) 第一環區域，其含有第一微小 RNA 環序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770 或其變體，該變體與以下序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770)；(iii) 第一 3' 莖環臂，其含有與第一引導序列互補或實質上互補的第一隨從核苷酸序列；(e) 第一 3' 側翼區域，其位於第一隨從核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769 或其變體，該變體與以下序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769) 之 3'；(f) BGH polyA 序列 (例如，SEQ ID NO: 793 或其變體，該變體與以下序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 793)；(g) 視情況，第二啟動子序列 (例如，本文表 5 中所揭示的啟動子序列中之任一者或其變體，該變體與表 5 中列出的啟動子序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性，例如，hSyn 啟動子 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者)、CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者) 或 C1ql2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719 或 SEQ ID NO: 791) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；(h) 第二 5' 側翼區域，其位於第二引導核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768 或其變體，該變體與以下中之任一者具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768) 之 5'；(i) 第二莖環序列，其包括，從 5' 至 3'：(i) 第二 5' 莖環臂，其含有與以下中之任一者具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的引導核苷酸序列：表 2 及/或表 3 中所列的引導序列 (例如，G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80) 或 MU (SEQ ID NO: 96) 或其與其具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性的變體)；(ii) 第二環區域，其含有第二微小 RNA 環序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770 或其變體，該變體與以下序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770)；(iii) 第二 3' 莖環臂，其含有與第二引導序列互補或實質上互補的第二隨從核苷酸序列；及 (j) 第二 3' 側翼區域，其位於第二隨從核苷酸序列 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769 或其變體，該變體與以下序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769) 之 3'；(k) RBG polyA 序列 (例如，SEQ ID NO: 750、SEQ ID NO: 751 或 SEQ ID NO: 792 或其變體，該變體與以下序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 750、SEQ ID NO: 751 或 SEQ ID NO: 792)；及 3' ITR 序列 (例如，SEQ ID NO: 748、SEQ ID NO: 749 或 SEQ ID NO: 789 或其變體，該變體與以下序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 序列同一性：SEQ ID NO: 748、SEQ ID NO: 749 或 SEQ ID NO: 789)。
在一個實例中，第一引導序列為 G9 序列 (SEQ ID NO: 68) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，且第二引導序列為 GI 序列 (SEQ ID NO: 77) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。在另一實例中，第一引導序列為 G9 序列 (SEQ ID NO: 68) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，且第二引導序列為 MW 序列 (SEQ ID NO: 80) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。在另一實例中，第一引導序列為 GI 序列 (SEQ ID NO: 77) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，且第二引導序列為 G9 序列 (SEQ ID NO: 68) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。在又一實例中，第一引導序列為 GI 序列 (SEQ ID NO: 77) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，且第二引導序列為 MW 序列 (SEQ ID NO: 80) 或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。
在另一實例中，第一啟動子為 SYN 啟動子 (例如，以下中之任一者：SEQ ID NO: 682 至 685 及 790 中之任一者或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性，且視情況，第二啟動子為 CAMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者或其變體，該變體與之具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。
可以在 10 至 1500 (例如，20 至 1400、30 至 1300、40 至 1200、50 至 1100、60 至 1000、70 至 900、80 至 800、90 至 700、100 至 600、200 至 500、或 300 至 400) 個核苷酸之範圍內確定前述雙 miRNA 表現匣中所述的序列的序列同一性。例如，可在 10 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 20 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 30 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 40 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 50 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 60 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 70 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 80 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 90 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 100 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 150 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 200 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 250 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 300 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 350 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 400 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 450 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 500 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 550 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 600 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 650 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 700 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 750 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 800 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 850 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 900 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 950 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 1000 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 1100 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 1200 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 1300 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在另一實例中，在 1400 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。在又一實例中，在 1500 個核苷酸上判定與前述雙 miRNA 表現匣的序列同一性。
如上述之雙重 miRNA 表現匣可包括啟動子，其係選自由下列所組成之群組：U6 啟動子、H1 啟動子、7SK啟動子、載脂蛋白 E-人α1-抗胰蛋白酶啟動子、CAG啟動子、CBA啟動子、CK8 啟動子、mU1a 啟動子、延伸因子 1α 啟動子、甲狀腺素結合球蛋白啟動子、突觸蛋白啟動子、RNA 結合 Fox-1 同源物 3 啟動子、鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶 II 啟動子、神經元特異性烯醇酶啟動子、血小板衍生生長因子次單元 β、囊泡麩胺酸轉運蛋白啟動子、體抑素啟動子、神經肽 Y 啟動子、血管活性腸肽啟動子、小白蛋白啟動子、麩胺酸去羧酶 65 啟動子、麩胺酸去羧酶 67 啟動子、多巴胺受體 D1 啟動子、多巴胺受體 D2 啟動子、補體 C1q 樣 2 啟動子 (Complement C1q Like 2 promoter)、原腦啡黑皮質素啟動子 (Proopiomelanocortin promoter)、Prospero 同源異形盒 1 啟動子、微管相關蛋白 1B 啟動子、及 微管蛋白 α 1 啟動子。
適用於與本文所揭示之雙重 miRNA 表現匣結合使用之微小 RNA 環序列可為 miR-30、miR-155、miR-218-1、或 miR-124-3 環序列。
本揭露之雙重 miRNA 表現匣亦可併入 5'-ITR (例如，SEQ ID NO: 746 或 SEQ ID NO: 747) 在表現匣的 5' 端及 3'-ITR 在 (例如，SEQ ID NO: 748、749、及 789 之任一者) 在表現匣的 3' 端。
此外，本文揭示之雙重 miRNA 表現匣構建體可包括可操蹤地連接介於該第一 3' 側翼區域的 3' 端與該第二啟動子的 5' 端之間的第一多腺苷酸化 (多腺苷酸 (polyA)) 訊息及/或可操蹤地連接介於該第二 3' 側翼區域的 3' 端與該 3' ITR 之間的第二 polyA 訊息。該第一 polyA 訊息及該第二 polyA 訊息可相同 (例如，兩者均為 RBG 或 BGH polyA 訊息) 或不同 (例如，該第一 polyA 訊息為 RBG polyA，且第二 polyA 訊息為 BGH polyA；或者該第一 polyA 訊息為BGH polyA，且該第二 polyA 訊息為 RBG polyA)。
本揭露之例示性雙重 miRNA、抗 Grik2構建體可包括 AAV (例如，AAV9) 構建體，其含有 hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790)，其可操縱地連接至 G9 (SEQ ID NO: 68) ASO 序列，其經併入至 A-miR-30 支架中，其接以 CaMKII 啟動子 (SEQ ID NO: 802)，其可操縱地連接至 GI (SEQ ID NO: 77) ASO 序列，其經併入至 A-miR-30 支架 (DMTPV1) 中。此類構建體可具有 SEQ ID NO: 785 的核酸序列或可為其變體中，該變體與 SEQ ID NO: 785 的核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更多) 的序列同一性(參見下文)。 CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACCAGGGTAATGGGGATCCTCTAGATCCGGTCGGGCCCGCGGTACCGTCGAGAAGCTTGATGTGGGCGGAGCTTCGAAGGGGCGGGCGCCCGTGGGGCGGGTCCTGAGTGGGGGCGGGACCGGGGCCGGCACCTGGGTGAGGTT CTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGGGCGCGCCTGAATTC TCTGCCGCGGAAAGGGGAGAAGTGTGGGCTCCTCCGAGTCGGGGGCGGACTGGGACAGCACAGTCGGCTGAGCGCAGCGCCCCCGCCCTGCCCGCCACGCGGCGAAGACGCCTGAGCGTTCGCGCCCCTCGGGCGAGGACCCCACGCAAGCCCGAGCCGGTCCCGACCCTGGCCCCGACGCTCGCCGCCCGCCCCAGCCCTGAGGGCCCCTCTA CAATGGGCACTAGACATGGGATTTAATGTCTATACAAT CCCATAGCTAATGCCTGTTTTA GAGAGGCGCCTCCGCCGCTCCTTTCTCATGGAAATGGCCCGCGAGCCCGTCCGGCCCAGCGCCCCTCCCGCGGGAGGAAGGCGAGCCCGGCCCCCGGCGGCCATT C GCGCCGCGGACAAATCCGGCGAACAATGCGCCCGCCCAGAGTGCGGCCCAGCTGCCGGGCCGGGGATCTGGCCGCGGGACACAAAGGGGCCCGCACGCCTCTGGCGTCTCGAGGGGATCC CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGGCGGCCGCCCGAGTTTAATTGGTTTATAGAACTCTTCAAGCTAGCACTAGTGAAGCAATTCGTTG CATTATGGCCTTAGGTCACTTCATCTCCATGGGGTTCTTCTTCTGATTTTCTAGAAAATGAGATGGGGGTGCAGAGAGCTTCCTCAGTGACCTGCCCAGGGTCACATCAGAAATGTCAGAGCTAGAACTTGAACTCAGATTACTAATCTTAAATTCCATGCCTTGGGGGCATGCAAGTACGATATACAGAAGGAGTGAACTCATTAGGGCAGATGACCAATGAGTTTAGGAAAGAAGAGTCCAGGGCAGGGTACATCTACACCACCCGCCCAGCCCTGGGTGAGTCCAGCCACGTTCACCTCATTATAGTTGCCTCTCTCCAGTCCTACCTTGACGGGAAGCACAAGCAGAAACTGGGACAGGAGCCCCAGGAGACCAAATCTTCATGGTCCCTCTGGGAGGATGGGTGGGGAGAGCTGTGGCAGAGGCCTCAGGAGGGGCCCTGCTGCTCAGTGGTGACAGATAGGGGTGAGAAAGCAGACAGAGTCATTCCGTCAGCATTCTGGGTCTGTTTGGTACTTCTTCTCACGCTAAGGTGGCGGTGTGATATGCACAATGGCTAAAAAGCAGGGAGAGCTGGAAAGAAACAAGGACAGAGACAGAGGCCAAGTCAACCAGACCAATTCCCAGAGGAAGCAAAGAAACCATTACAGAGACTACAAGGGGGAAGGGAAGGAGAGATGAATTAGCTTCCCCTGTAAACCTTAGAACCCAGCTGTTGCCAGGGCAACGGGGCAATACCTGTCTCTTCAGAGGAGATGAAGTTGCCAGGGTAACTACATCCTGTCTTTCTCAAGGACCATCCCAGAATGTGGCACCCACTAGCCGTTACCATAGCAACTGCCTCTTTGCCCCACTTAATCCCATCCCGTCTGTTAAAAGGGCCCTATAGTTGGAGGTGGGGGAGGTAGGAAGAGCGATGATCACTTGTGGACTAAGTTTGTTCGCATCCCCTTCTCCAACCCCCTCAGTACATCACCCTGGGGGAACAGGGTCCACTTGCTCCTGGGCCCACACAGTCCTGCAGTATTGTGTATATAAGGCCAGGGCAAAGAGGAGCAGGTTTTAAAGTGAAAGGCAGGCAGGTGTTGGGGAGGCAGTTACCGGGGCAACGGGAACAGGGCGTTTCGGAGGTGGTTGCCATGGGGACCTGGATGCTGACGAAGGCTCGCGAGGCTGTGAGCAGCCACAGTGCCCTGCTCAGAAGCCCCAAGCTCGTCAGTCAAGCCGGTTCTCCGTTTGCACTCAGGAGCACGGGCAGGCGAGTGGCCCCTAGTTCTGGGGGCAGCGAATTCCAATTGGCGCGCCTAGCCCGGGCTAGG TCGACTCGACTAGGGATAACAGGGTAATTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTAAAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAC GTCTCGATATGGAGAACCCAT GCTGTGAAGCCACAGATGGG CATGGGTTTTATATCGAGACGCTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTA TCACACCGGTCTCGAGGGATCC GATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGCGGCCGCCCGAGTTTAATTGGTTTATAGAACTCTTCAAGCTAGCGAAGCAATTCGTTGATCTGAATTTCGACCACCCATAATACCCATTACCCTGGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACA aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag(SEQ ID NO: 785) 索引： 粗體= 5' ITR 序列； 單下劃線= 啟動子序列； 斜體= 5' 側翼序列-引導序列-微小 RNA 環序列-隨從序列-3' 側翼序列； 斜體 + 波浪下劃線 ：編碼與引導序列互補的過客序列的 DNA (G9 及 GI - 按此順序)； 斜體 + 粗體 + 單底線 ：編碼引導序列的 DNA (G9 及 GI - 按此順序)； 雙底線：polyA 序列； 粗體 + 小寫字母：3' ITR 序列 (SEQ ID NO: 789)。
本揭露之另一例示性雙重 miRNA、抗 Grik2構建體可包括 AAV (例如，AAV9) 構建體，其含有 hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790)，其可操縱地連接至 G9 (SEQ ID NO: 68) ASO 序列，其經併入至 E-miR-124-3 支架中，其接以 CaMKII 啟動子 (SEQ ID NO: 802)，其可操縱地連接至 MW (SEQ ID NO: 80) ASO 序列併入 E-miR-218 支架 (DMTPV2)。此類構建體可具有 SEQ ID NO: 786 的核酸序列或可為其變體中，該變體與 SEQ ID NO: 786 的核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更多) 的序列同一性(參見下文)。 CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACCAGGGTAATGGGGATCCTCTAGATCCGGTCGGGCCCGCGGTACCGTCGAGAAGCTTGATGTGGGCGGAGCTTCGAAGGGGCGGGCGCCCGTGGGGCGGGTCCTGAGTGGGGGCGGGACCGGGGCCGGCACCTGGGTGAGGTT CTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGGGCGCGCCTGAAT TCTCTGCCGCGGAAAGGGGAGAAGTGTGGGCTCCTCCGAGTCGGGGGCGGACTGGGACAGCACAGTCGGCTGAGCGCAGCGCCCCCGCCCTGCCCGCCACGCGGCGAAGACGCCTGAGCGTTCGCGCCCCTCGGGCGAGGACCCCACGCAAGCCCGAGCCGGTCCCGACCCTGGCCCCGACGCTCGCCGCCCGCCCCAGCCCTGAGGGCCCCTCTA CAATGGGCACTAGACATGGGATTTAATGTCTATACAAT CCCATAGCTAATGCCTGTTTTA GAGAGGCGCCTCCGCCGCTCCTTTCTCATGGAAATGGCCCGCGAGCCCGTCCGGCCCAGCGCCCCTCCCGCGGGAGGAAGGCGAGCCCGGCCCCCGGCGGCCATTCGCGCCGCGGACAAATCCGGCGAACAATGCGCCCGCCCAGAGTGCGGCCCAGCTGCCGGGCCGGGGATCTGGCCGCGGGACACAAAGGGGCCCGCACGCCTCTGGCGT CTCGAGGGGATCC CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGGCGGCCGCCCGAGTTTAATTGGTTTATAGAACTCTTCAAGCTAGCACTAGTGAAGCAATTCGTTG CATTATGGCCTTAGGTCACTTCATCTCCATGGGGTTCTTCTTCTGATTTTCTAGAAAATGAGATGGGGGTGCAGAGAGCTTCCTCAGTGACCTGCCCAGGGTCACATCAGAAATGTCAGAGCTAGAACTTGAACTCAGATTACTAATCTTAAATTCCATGCCTTGGGGGCATGCAAGTACGATATACAGAAGGAGTGAACTCATTAGGGCAGATGACCAATGAGTTTAGGAAAGAAGAGTCCAGGGCAGGGTACATCTACACCACCCGCCCAGCCCTGGGTGAGTCCAGCCACGTTCACCTCATTATAGTTGCCTCTCTCCAGTCCTACCTTGACGGGAAGCACAAGCAGAAACTGGGACAGGAGCCCCAGGAGACCAAATCTTCATGGTCCCTCTGGGAGGATGGGTGGGGAGAGCTGTGGCAGAGGCCTCAGGAGGGGCCCTGCTGCTCAGTGGTGACAGATAGGGGTGAGAAAGCAGACAGAGTCATTCCGTCAGCATTCTGGGTCTGTTTGGTACTTCTTCTCACGCTAAGGTGGCGGTGTGATATGCACAATGGCTAAAAAGCAGGGAGAGCTGGAAAGAAACAAGGACAGAGACAGAGGCCAAGTCAACCAGACCAATTCCCAGAGGAAGCAAAGAAACCATTACAGAGACTACAAGGGGGAAGGGAAGGAGAGATGAATTAGCTTCCCCTGTAAACCTTAGAACCCAGCTGTTGCCAGGGCAACGGGGCAATACCTGTCTCTTCAGAGGAGATGAAGTTGCCAGGGTAACTACATCCTGTCTTTCTCAAGGACCATCCCAGAATGTGGCACCCACTAGCCGTTACCATAGCAACTGCCTCTTTGCCCCACTTAATCCCATCCCGTCTGTTAAAAGGGCCCTATAGTTGGAGGTGGGGGAGGTAGGAAGAGCGATGATCACTTGTGGACTAAGTTTGTTCGCATCCCCTTCTCCAACCCCCTCAGTACATCACCCTGGGGGAACAGGGTCCACTTGCTCCTGGGCCCACACAGTCCTGCAGTATTGTGTATATAAGGCCAGGGCAAAGAGGAGCAGGTTTTAAAGTGAAAGGCAGGCAGGTGTTGGGGAGGCAGTTACCGGGGCAACGGGAACAGGGCGTTTCGGAGGTGGTTGCCATGGGGACCTGGATGCTGACGAAGGCTCGCGAGGCTGTGAGCAGCCACAGTGCCCTGCTCAGAAGCCCCAAGCTCGTCAGTCAAGCCGGTTCTCCGTTTGCACTCAGGAGCACGGGCAGGCGAGTGGCCCCTAGTTCTGGGGGCAGCGAATTCCAATTGGCGCGCCTAGCCCGGGCTAGGTCGAC ACGTTTCCAGAACGTCTGTAGCTTTTCTCCTCCTTCCCTCCATTTTCCTCTTGGTCTTACCTTTGGCCTAGTGGTTGGTGTAGTGATAATGTAGCGAGATTTTCTG CAGAGCATTGCAGATGGACTG GGTTGCGAGGTATGAGTAAA CAGTCCATACGCAATGCTCCGTGGAACGTCACGCAGCTTTCTACAGCATGACAAGCTGCTGAGGCTTAAATCAGGATTTTCCTGTCTCTTTCTACAAAATCAAAATGAAAAAAGAGGGCTTTTTAGGCATCTCCGAGATTATGTG ACCGGTCTCGAGGGATCC GATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGCGGCCGCCCGAGTTTAATTGGTTTATAGAACTCTTCAAGCTAGCGAAGCAATTCGTTGATCTGAATTTCGACCACCCATAATACCCATTACCCTGGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACA aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag(SEQ ID NO: 786) 索引： 粗體= 5' ITR 序列； 單下劃線= 啟動子序列； 斜體= 5' 側翼序列-引導序列-微小 RNA 環序列-隨從序列-3' 側翼序列； 斜體 + 波浪下劃線 ：編碼與引導序列互補的過客序列的 DNA (G9 及 MW - 按此順序)； 斜體 + 粗體 + 單底線 ：編碼引導序列的 DNA (G9 及 MW - 按此順序)； 雙底線：polyA 序列； 粗體 + 小寫字母：3' ITR 序列 (SEQ ID NO: 789)。
本揭露之另一例示性雙重 miRNA、抗 Grik2構建體可包括 AAV (例如，AAV9) 構建體，其含有 hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790)，其可操縱地連接至 GI (SEQ ID NO: 77) ASO 序列，其經併入至 E-miR-30-3 支架中，其接以 CaMKII 啟動子 (SEQ ID NO: 802)，其可操縱地連接至 G9 (SEQ ID NO: 68) ASO 序列併入 E-miR-124-3 支架 (DMTPV3)。此類構建體可具有 SEQ ID NO: 787 的核酸序列或可為其變體中，該變體與 SEQ ID NO: 787 的核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更多) 的序列同一性(參見下文)。 CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACCAGGGTAATGGGGATCCTCTAGATCCGGTCGGGCCCGCGGTACCGTCGAGAAGCTTGATGTGGGCGGAGCTTCGAAGGGGCGGGCGCCCGTGGGGCGGGTCCTGAGTGGGGGCGGGACCGGGGCCGGCACCTGGGTGAGGTT CTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGGGCGCGCCTAGCCCGGGCTAGGTCGAC TCGACTAGGGATAACAGGGTAATTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTAAAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAC GTCTCGATATGGAGAACCCATG CTGTGAAGCCACAGATGGG CATGGGTTTTATATCGAGACGCTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTATCAC GGGATCC CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGGCGGCCGCCCGAGTTTAATTGGTTTATAGAACTCTTCAAGCTAGCACTAGTGAAGCAATTCGTTG CATTATGGCCTTAGGTCACTTCATCTCCATGGGGTTCTTCTTCTGATTTTCTAGAAAATGAGATGGGGGTGCAGAGAGCTTCCTCAGTGACCTGCCCAGGGTCACATCAGAAATGTCAGAGCTAGAACTTGAACTCAGATTACTAATCTTAAATTCCATGCCTTGGGGGCATGCAAGTACGATATACAGAAGGAGTGAACTCATTAGGGCAGATGACCAATGAGTTTAGGAAAGAAGAGTCCAGGGCAGGGTACATCTACACCACCCGCCCAGCCCTGGGTGAGTCCAGCCACGTTCACCTCATTATAGTTGCCTCTCTCCAGTCCTACCTTGACGGGAAGCACAAGCAGAAACTGGGACAGGAGCCCCAGGAGACCAAATCTTCATGGTCCCTCTGGGAGGATGGGTGGGGAGAGCTGTGGCAGAGGCCTCAGGAGGGGCCCTGCTGCTCAGTGGTGACAGATAGGGGTGAGAAAGCAGACAGAGTCATTCCGTCAGCATTCTGGGTCTGTTTGGTACTTCTTCTCACGCTAAGGTGGCGGTGTGATATGCACAATGGCTAAAAAGCAGGGAGAGCTGGAAAGAAACAAGGACAGAGACAGAGGCCAAGTCAACCAGACCAATTCCCAGAGGAAGCAAAGAAACCATTACAGAGACTACAAGGGGGAAGGGAAGGAGAGATGAATTAGCTTCCCCTGTAAACCTTAGAACCCAGCTGTTGCCAGGGCAACGGGGCAATACCTGTCTCTTCAGAGGAGATGAAGTTGCCAGGGTAACTACATCCTGTCTTTCTCAAGGACCATCCCAGAATGTGGCACCCACTAGCCGTTACCATAGCAACTGCCTCTTTGCCCCACTTAATCCCATCCCGTCTGTTAAAAGGGCCCTATAGTTGGAGGTGGGGGAGGTAGGAAGAGCGATGATCACTTGTGGACTAAGTTTGTTCGCATCCCCTTCTCCAACCCCCTCAGTACATCACCCTGGGGGAACAGGGTCCACTTGCTCCTGGGCCCACACAGTCCTGCAGTATTGTGTATATAAGGCCAGGGCAAAGAGGAGCAGGTTTTAAAGTGAAAGGCAGGCAGGTGTTGGGGAGGCAGTTACCGGGGCAACGGGAACAGGGCGTTTCGGAGGTGGTTGCCATGGGGACCTGGATGCTGACGAAGGCTCGCGAGGCTGTGAGCAGCCACAGTGCCCTGCTCAGAAGCCCCAAGCTCGTCAGTCAAGCCGGTTCTCCGTTTGCACTCAGGAGCACGGGCAGGCGAGTGGCCCCTAGTTCTGGGGGCAGCGAATTCCAATTGGCGCGCCTAGCCCGGGCTAGGTCGAC TCTGCCGCGGAAAGGGGAGAAGTGTGGGCTCCTCCGAGTCGGGGGCGGACTGGGACAGCACAGTCGGCTGAGCGCAGCGCCCCCGCCCTGCCCGCCACGCGGCGAAGACGCCTGAGCGTTCGCGCCCCTCGGGCGAGGACCCCACGCAAGCCCGAGCCGGTCCCGACCCTGGCCCCGACGCTCGCCGCCCGCCCCAGCCCTGAGGGCCCCTCTA CAATGGGCACTAGACATGGGATTTAATGTCTATACAAT CCCATAGCTAATGCCTGTTTTA GAGAGGCGCCTCCGCCGCTCCTTTCTCATGGAAATGGCCCGCGAGCCCGTCCGGCCCAGCGCCCCTCCCGCGGGAGGAAGGCGAGCCCGGCCCCCGGCGGCCATTCGCGCCGCGGACAAATCCGGCGAACAATGCGCCCGCCCAGAGTGCGGCCCAGCTGCCGGGCCGGGGATCTGGCCGCGGGACACAAAGGGGCCCGCACGCCTCTGGCGT ACCGGTCTCGAGGGATCC GATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGCGGCCGCCCGAGTTTAATTGGTTTATAGAACTCTTCAAGCTAGCGAAGCAATTCGTTGATCTGAATTTCGACCACCCATAATACCCATTACCCTGGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACA aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag(SEQ ID NO: 787) 索引： 粗體= 5' ITR 序列； 單下劃線= 啟動子序列； 斜體= 5' 側翼序列-引導序列-微小 RNA 環序列-隨從序列-3' 側翼序列； 斜體 + 波浪下劃線 ：編碼與引導序列互補的過客序列的 DNA (GI 及 G9 - 按此順序)； 斜體 + 粗體 + 單底線 ：編碼引導序列的 DNA (GI 及 G9 - 按此順序)； 雙底線：polyA 序列； 粗體 + 小寫字母：3' ITR 序列 (SEQ ID NO: 789)。
本揭露之另一例示性雙重 miRNA、抗 Grik2構建體可包括 AAV (例如，AAV9) 構建體，其含有 hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790)，其可操縱地連接至 GI (SEQ ID NO: 77) ASO 序列，其經併入至 E-miR-30-3 支架中，其接以 CaMKII 啟動子 (SEQ ID NO: 802)，其可操縱地連接至 MW (SEQ ID NO: 80) ASO 序列併入 E-miR-124-3 支架 (DMTPV4)。此類構建體可具有 SEQ ID NO: 788 的核酸序列或可為其變體中，該變體與 SEQ ID NO: 788 的核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更多) 的序列同一性(參見下文)。 CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGCTACTTATCTACCAGGGTAATGGGGATCCTCTAGATCCGGTCGGGCCCGCGGTACCGTCGAGAAGCTTGATGTGGGCGGAGCTTCGAAGGGGCGGGCGCCCGTGGGGCGGGTCCTGAGTGGGGGCGGGACCGGGGCCGGCACCTGGGTGAGGTT CTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGGGCGCGCCTAGCCCGGGCTAGGTCGAC TCGACTAGGGATAACAGGGTAATTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTAAAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAC GTCTCGATATGGAGAACCCATG CTGTGAAGCCACAGATGGG CATGGGTTTTATATCGAGACGCTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTATCAC GGGATCC CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGGCGGCCGCCCGAGTTTAATTGGTTTATAGAACTCTTCAAGCTAGCACTAGTGAAGCAATTCGTTG CATTATGGCCTTAGGTCACTTCATCTCCATGGGGTTCTTCTTCTGATTTTCTAGAAAATGAGATGGGGGTGCAGAGAGCTTCCTCAGTGACCTGCCCAGGGTCACATCAGAAATGTCAGAGCTAGAACTTGAACTCAGATTACTAATCTTAAATTCCATGCCTTGGGGGCATGCAAGTACGATATACAGAAGGAGTGAACTCATTAGGGCAGATGACCAATGAGTTTAGGAAAGAAGAGTCCAGGGCAGGGTACATCTACACCACCCGCCCAGCCCTGGGTGAGTCCAGCCACGTTCACCTCATTATAGTTGCCTCTCTCCAGTCCTACCTTGACGGGAAGCACAAGCAGAAACTGGGACAGGAGCCCCAGGAGACCAAATCTTCATGGTCCCTCTGGGAGGATGGGTGGGGAGAGCTGTGGCAGAGGCCTCAGGAGGGGCCCTGCTGCTCAGTGGTGACAGATAGGGGTGAGAAAGCAGACAGAGTCATTCCGTCAGCATTCTGGGTCTGTTTGGTACTTCTTCTCACGCTAAGGTGGCGGTGTGATATGCACAATGGCTAAAAAGCAGGGAGAGCTGGAAAGAAACAAGGACAGAGACAGAGGCCAAGTCAACCAGACCAATTCCCAGAGGAAGCAAAGAAACCATTACAGAGACTACAAGGGGGAAGGGAAGGAGAGATGAATTAGCTTCCCCTGTAAACCTTAGAACCCAGCTGTTGCCAGGGCAACGGGGCAATACCTGTCTCTTCAGAGGAGATGAAGTTGCCAGGGTAACTACATCCTGTCTTTCTCAAGGACCATCCCAGAATGTGGCACCCACTAGCCGTTACCATAGCAACTGCCTCTTTGCCCCACTTAATCCCATCCCGTCTGTTAAAAGGGCCCTATAGTTGGAGGTGGGGGAGGTAGGAAGAGCGATGATCACTTGTGGACTAAGTTTGTTCGCATCCCCTTCTCCAACCCCCTCAGTACATCACCCTGGGGGAACAGGGTCCACTTGCTCCTGGGCCCACACAGTCCTGCAGTATTGTGTATATAAGGCCAGGGCAAAGAGGAGCAGGTTTTAAAGTGAAAGGCAGGCAGGTGTTGGGGAGGCAGTTACCGGGGCAACGGGAACAGGGCGTTTCGGAGGTGGTTGCCATGGGGACCTGGATGCTGACGAAGGCTCGCGAGGCTGTGAGCAGCCACAGTGCCCTGCTCAGAAGCCCCAAGCTCGTCAGTCAAGCCGGTTCTCCGTTTGCACTCAGGAGCACGGGCAGGCGAGTGGCCCCTAGTTCTGGGGGCAGCGAATTCCAATTGGCGCGCCTAGCCCGGGCTAGGTCGAC TCTGCCGCGGAAAGGGGAGAAGTGTGGGCTCCTCCGAGTCGGGGGCGGACTGGGACAGCACAGTCGGCTGAGCGCAGCGCCCCCGCCCTGCCCGCCACGCGGCGAAGACGCCTGAGCGTTCGCGCCCCTCGGGCGAGGACCCCACGCAAGCCCGAGCCGGTCCCGACCCTGGCCCCGACGCTCGCCGCCCGCCCCAGCCCTGAGGGCCCCTCGA CGTTTATCTACAACACTCTGATTTAATGTCTATACAAT CAGAGCATTGCAGATGGACTGC GAGAGGCGCCTCCGCCGCTCCTTTCTCATGGAAATGGCCCGCGAGCCCGTCCGGCCCAGCGCCCCTCCCGCGGGAGGAAGGCGAGCCCGGCCCCCGGCGGCCATTCGCGCCGCGGACAAATCCGGCGAACAATGCGCCCGCCCAGAGTGCGGCCCAGCTGCCGGGCCGGGGATCTGGCCGCGGGACACAAAGGGGCCCGCACGCCTCTGGCGT ACCGGTCTCGAGGGATCC GATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGCGGCCGCCCGAGTTTAATTGGTTTATAGAACTCTTCAAGCTAGCGAAGCAATTCGTTGATCTGAATTTCGACCACCCATAATACCCATTACCCTGGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACA aggaacccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcag(SEQ ID NO: 788) 索引： 粗體= 5' ITR 序列； 單下劃線= 啟動子序列； 斜體= 5' 側翼序列-引導序列-微小 RNA 環序列-隨從序列-3' 側翼序列； 斜體 + 波浪下劃線 ：編碼與引導序列互補的過客序列的 DNA (GI 及 MW - 按此順序)； 斜體 + 粗體 + 單底線 ：編碼引導序列的 DNA (GI 及 MW - 按此順序)； 雙底線：polyA 序列； 粗體 + 小寫字母：3' ITR 序列 (SEQ ID NO: 789)。
本揭露之另一例示性雙重 miRNA、抗 Grik2構建體可包括 AAV (例如，AAV9) 構建體，其含有 hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790)，其可操縱地連接至 GI (SEQ ID NO: 77) ASO 序列，其經併入至 E-miR-30-3 支架中，其接以 CaMKII 啟動子 (SEQ ID NO: 802)，其可操縱地連接至 MW (SEQ ID NO: 80) ASO 序列併入 E-miR-218-1 支架 (DMTPV8)。此類構建體可具有 SEQ ID NO: 813 的核酸序列或可為其變體中，該變體與 SEQ ID NO: 813 的核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更多) 的序列同一性(參見下文)。此表現匣可併入具有 SEQ ID NO: 的核酸序列之載體或其變體中，該變體與 SEQ ID NO: 814 的核酸序列具有至少 85% (至少 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更多) 的序列同一性。 CTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAGGGCGCGCCTAGCCCGGGCTAGGTCGAC TCGACTAGGGATAACAGGGTAATTGTTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTTGCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTAAAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGACGTCTCGATATGGAGAACCCATGCTGTGAAGCCACAGATGGGCATGGGTTTTATATCGAGACGCTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCAATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTATCACGGGATCC CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGGCGGCCGCCCGAGTTTAATTGGTTTATAGAACTCTTCAAGCTAGCACTAGTGAAGCAATTCGTTG CATTATGGCCTTAGGTCACTTCATCTCCATGGGGTTCTTCTTCTGATTTTCTAGAAAATGAGATGGGGGTGCAGAGAGCTTCCTCAGTGACCTGCCCAGGGTCACATCAGAAATGTCAGAGCTAGAACTTGAACTCAGATTACTAATCTTAAATTCCATGCCTTGGGGGCATGCAAGTACGATATACAGAAGGAGTGAACTCATTAGGGCAGATGACCAATGAGTTTAGGAAAGAAGAGTCCAGGGCAGGGTACATCTACACCACCCGCCCAGCCCTGGGTGAGTCCAGCCACGTTCACCTCATTATAGTTGCCTCTCTCCAGTCCTACCTTGACGGGAAGCACAAGCAGAAACTGGGACAGGAGCCCCAGGAGACCAAATCTTCATGGTCCCTCTGGGAGGATGGGTGGGGAGAGCTGTGGCAGAGGCCTCAGGAGGGGCCCTGCTGCTCAGTGGTGACAGATAGGGGTGAGAAAGCAGACAGAGTCATTCCGTCAGCATTCTGGGTCTGTTTGGTACTTCTTCTCACGCTAAGGTGGCGGTGTGATATGCACAATGGCTAAAAAGCAGGGAGAGCTGGAAAGAAACAAGGACAGAGACAGAGGCCAAGTCAACCAGACCAATTCCCAGAGGAAGCAAAGAAACCATTACAGAGACTACAAGGGGGAAGGGAAGGAGAGATGAATTAGCTTCCCCTGTAAACCTTAGAACCCAGCTGTTGCCAGGGCAACGGGGCAATACCTGTCTCTTCAGAGGAGATGAAGTTGCCAGGGTAACTACATCCTGTCTTTCTCAAGGACCATCCCAGAATGTGGCACCCACTAGCCGTTACCATAGCAACTGCCTCTTTGCCCCACTTAATCCCATCCCGTCTGTTAAAAGGGCCCTATAGTTGGAGGTGGGGGAGGTAGGAAGAGCGATGATCACTTGTGGACTAAGTTTGTTCGCATCCCCTTCTCCAACCCCCTCAGTACATCACCCTGGGGGAACAGGGTCCACTTGCTCCTGGGCCCACACAGTCCTGCAGTATTGTGTATATAAGGCCAGGGCAAAGAGGAGCAGGTTTTAAAGTGAAAGGCAGGCAGGTGTTGGGGAGGCAGTTACCGGGGCAACGGGAACAGGGCGTTTCGGAGGTGGTTGCCATGGGGACCTGGATGCTGACGAAGGCTCGCGAGGCTGTGAGCAGCCACAGTGCCCTGCTCAGAAGCCCCAAGCTCGTCAGTCAAGCCGGTTCTCCGTTTGCACTCAGGAGCACGGGCAGGCGAGTGGCCCCTAGTTCTGGGGGCAGCGAATTCCAATTGGCGCGCCTAGCCCGGGCTAGGTCGAC ACGTTTCCAGAACGTCTGTAGCTTTTCTCCTCCTTCCCTCCATTTTCCTCTTGGTCTTACCTTTGGCCTAGTGGTTGGTGTAGTGATAATGTAGCGAGATTTTCTGCAGAGCATTGCAGATGGACTGGGTTGCGAGGTATGAGTAAACAGTCCATACGCAATGCTCCGTGGAACGTCACGCAGCTTTCTACAGCATGACAAGCTGCTGAGGCTTAAATCAGGATTTTCCTGTCTCTTTCTACAAAATCAAAATGAAAAAAGAGGGCTTTTTAGGCATCTCCGAGATTATGTGACCGGTCTCGAGG GATCCGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGCGGCCGCC CGAGTTTAATTGGTTTATAGAACTCTTCA(SEQ ID NO: 813) 索引： 單下劃線：啟動子序列； 粗體：含有引導序列及隨從序列的微小 RNA 莖環結構； 雙下劃線：多腺苷酸序列； 斜體 ：填充序列 (SEQ ID NO: 816)。 改善含有多個 miRNA 序列的 AAV 載體的製造
使用編碼單一 miRNA 表現匣 (例如，本文揭示之表現匣) 的質體製備 AAV 載體可能會因不正確的 AAV 基因體包裝而受阻礙。首先，pri-miRNA 序列為短 (＜200 個鹼基)，並且，取決於啟動子長度，設計具有控制單一 miRNA 表現的單個啟動子的轉殖基因匣，可能導致 AAV 基因體明顯短於 AAV 最大包裝容量 (~4.8 kb)。因此，如果預期的全基因體長度為 ＜2.4 kb (AAV 包裝容量的一半)，則單個殼體可能會加載多於一個載體。這可藉由聚合酶通讀 (read-through) 來介導，而無需適當的核酸內切酶切口來從而產生 AAV 基因體二聚體 (或三聚體)，如果它們的長度合適，則可以將經包裝到 AAV 殼體中。這隨後在 AAV 載體顆粒群中引入顯著的異質性，這使得藥物產品的製造及表徵變得更加困難。
其次，由於包含 miRNA 髮夾，基於 shRNA 及 miRNA 的轉殖基因本身具有顯著的二級結構。經顯示，AAV 基因體內的這些內部二級結構可在 AAV 基因體複製及包裝過程中充當“假”ITR，導致截斷事件及含有完整及部分載體混合的 AAV 載體顆粒的異質群體。
業經發現，用額外的序列 (例如，額外的 pre-miRNA 莖環序列、第二啟動子序列、填充序列 (例如，SEQ ID NO: 815 及/或 SEQ ID NO: 816)，使用自互補 AAV 載體等)，藉由避免部分 (即截短的) AAV 基因體拷貝的摻入，大大改善 AAV 包裝。因此，本文所述的構建體，藉由將上述序列併入 AAV 表現匣，以將載體大小增加到更接近最大 AAV 包裝容量的值，來避免 AAV 基因體的不當包裝。
例如，在有表現一個受單個啟動子控制的 miRNA 或來自兩個獨立啟動子的兩個 miRNA 的構建體 (雙重構建方法) 情況，可能無法像 體外 / 離體 / 電腦模擬評估所預測的那樣在體內執行。在這些情況下，可實施以下策略來建立基因體長度，從而產生同質的、全長的、單個包裝的 AAV 載體顆粒群。
首先，如果表現單一 miRNA“引導”係所欲者，填充序列 (例如，SEQ ID NO: 815 及/或 SEQ ID NO: 816) 可加入，以增加 AAV 載體的總長度而不破壞啟動子.miR 匣本身。此填充可加入至轉殖基因匣的下游 (polyA 序列的 3') (參見例如圖 6F 及圖 6G) 。該填充的長度及內容可改變，同時保留其提高 AAV 包裝同質性的能力。此外，該填充可放置在啟動子的上游 (5')。填充序列可用於 scAAV 載體或單股 (ss) AAV 載體的情況下。在一些實施例中，本揭露之載體包括一個或多個填充序列 (例如，1、2、或更多個填充序列)。在一些實施例中，該等一個或多個填充序列與 SEQ ID NO: 815 之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。在一些實施例中，該等一個或多個填充序列與 SEQ ID NO: 815 之核酸序列具有至少 90% (例如，至少 91%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。在一些實施例中，該等一個或多個填充序列與 SEQ ID NO: 815 之核酸序列具有至少 95% (例如，至少 96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。在一些實施例中，該等一個或多個填充序列與 SEQ ID NO: 815 之核酸序列具有至少 99% 序列同一性。在一些實施例中，該等一個或多個填充序列具有 SEQ ID NO: 815。在一些實施例中，該等一個或多個填充序列與 SEQ ID NO: 816 之核酸序列具有至少 85% (例如，至少 86%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。在一些實施例中，該等一個或多個填充序列與 SEQ ID NO: 816 之核酸序列具有至少 90% (例如，至少 91%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。在一些實施例中，該等一個或多個填充序列與 SEQ ID NO: 816 之核酸序列具有至少 95% (例如，至少 96%、97%、98%、99% 或更高) 序列同一性。在一些實施例中，該等一個或多個填充序列與 SEQ ID NO: 816 之核酸序列具有至少 99% 序列同一性。在一些實施例中，該等一個或多個填充序列具有 SEQ ID NO: 816 之核酸序列。
其次，如果要表現多於一個的 miRNA 但選擇單個啟動子策略，則可藉由多個 miRNA 匣的串聯來製備載體。雖然使用相同支架的多個 miRNA 匣 (例如，達至 5 個 miRNA 匣) 的串聯可導致載體內同源序列之間的重組 (圖 7) ，但使用具有非同源側翼及環序列的不同支架的 miRNA 匣的串聯可改善此包裝問題 (圖 8F) 。如果包含額外的 miRNA 匣不會產生適當長度的載體，填充序列 (例如，SEQ ID NO: 815 及/或 SEQ ID NO: 816)可如上所述併入以增加長度以提高包裝效率。 醫藥組成物
本文所述之寡核苷酸或編碼彼之核酸載體可配製成醫藥組成物，以適於 體內投予的生物相容形式投予至哺乳動物 (例如人) 個體。
本文揭示之組成物可配製於任何適合的媒劑中以遞送至個體 (例如，人) 。例如，它們可配製成醫藥上可接受之懸浮液、分散液、溶液、或乳液。適合的介質包括鹽水及脂質體製劑。更具體地，醫藥上可接受之載劑可包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液、及乳液。重組人白蛋白 (rAlbumin Human NF RECOMBUMIN® Prime) 也可用作 AAV 載體的穩定劑 (Albumedix, Nottingham UK)。非水性溶劑的實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油 (諸如橄欖油)、及可注射的有機酯 (諸如油酸乙酯)。水性載劑包括水、醇/水性溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水及緩衝介質。適合靜脈內投予的媒劑包括流體及營養補充液、電解質補充液 (諸如基於林格氏葡萄糖者)，及類似者。
也可存在防腐劑及其他添加劑，諸如像是抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、及惰性氣體及類似者。
膠體分散系統也可用於靶向基因遞送。膠體分散系統包括巨分子復合物、奈米膠囊、微球、珠粒及基於脂質之系統，包括水包油乳液、微胞、混合微胞及脂質體。
本文所述之組成物可用游離鹼的形式、用鹽、溶劑化物的形式、及作為前藥來使用。所有形式都在本文所述之方法內。根據本揭露之方法，所述之化合物或其鹽、溶劑化物或前藥可根據選擇的投予途徑以各種形式投予患者。
因此，本文所述之組成物可經配製以用於例如藉由口服、腸胃外、鞘內、腦室內、腦實質內、口腔、舌下、鼻腔、直腸、貼劑、泵、或透皮投予，並且相應地配製醫藥組成物。腸胃外投予包括靜脈內、腹膜內、皮下、肌內、經上皮、鼻內、肺內、鞘內、腦室內、腦實質內、直腸、及局部投予模式。腸胃外投予可藉由在選定的時間段內連續輸注。
本文所述之劑溶液可在水中與介面活性劑 (諸如羥丙基纖維素) 適當混合來製備。分散體亦可在甘油、液體聚乙二醇、DMSO、及其具有或未有醇之混合物、及油中製備。在一般儲存及使用條件下，這些製劑可含有防腐劑以防止微生物生長。用於選擇及製備適合製劑的習用程序及成分在例如以下中有描述：Remington's Pharmaceutical Sciences (2012，第 22 版) 及 The United States Pharmacopeia: The National Formulary (USP 41 NF 36)，2018年出版。適用於注射使用的醫藥形成包括無菌水性溶液或分散液，以及用於即時調配無菌注射溶液或分散液的無菌粉劑。在所有情況下，該形式必須是無菌的，並且必須是可容易地經由注射器投予程度之流體。局部、區域、或全身性投予亦可能是合適的。本文所述之組成物可有利地藉由向目標部位間隔例如大約 1 cm 間距投予注射或多次注射來接觸。
如本文所述，本文所述之組成物可單獨或與醫藥上可接受之載體組合投予動物，例如人，其比例由化合物的溶解度及化學性質、選擇的投予途徑、及標準製藥實務來判定。
因此，本揭露涉及含有本文揭示之 ASO 劑 (例如 siRNA、shRNA、miRNA、或 shmiRNA、或 shmiRNA) 的醫藥組成物。特別地，本揭露涉及包含載體之組成物，該載體包含本揭露之 ASO 劑。在特定實例中，本揭露內容提供含有載體 (例如，慢病毒或 AAV 載體) 的醫藥組成物，該載體包括本揭露之 ASO，其可操縱地連接至如本文所揭示之啟動子。醫藥組成物可包括 AAV 載體，其包括 (a) 病毒殼體；(b) 人工多核苷酸，其包括側翼為 AAV ITR 的表現匣，其中表現匣包括編碼寡核苷酸的多核苷酸，該寡核苷酸結合並抑制 Grik2mRNA 的表現，其可操縱地連接至一個或多個調節序列，其控制 CNS 細胞中的多核苷酸的表現。
本文揭示之 ASO 劑可與醫藥上可接受之賦形劑及視情況緩釋基質 (例如像是生物可降解聚合物) 組合，以形成醫藥組成物。「醫藥上」或「醫藥上可接受之」是指當適當投予哺乳動物、特別是人時，不產生不良、過敏性、或其他不良反應的分子實體及組成物。醫藥上可接受之載劑或賦形劑是指任何類型的無毒固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、包封材料或製劑助劑。本文揭示之醫藥組成物可配製用於腦內 (例如，腦實質內或腦室內)、肌內、靜脈內、透皮、局部、口服、舌下、皮下、或直腸投予。組成物的活性組分 (例如，靶向 Grik2的 ASO劑)，可單獨或與另一治療劑組合，以單位投予形式投予有需要的個體，作為與習用醫藥支持的混合物。適合的單位投予形式包括口服途徑形式，諸如片劑、凝膠膠囊、粉劑、顆粒劑、及口服懸浮液或溶液、舌下及口腔投予形式、氣霧劑、植入物、皮下、透皮、局部、腹膜內、肌內、靜脈內、表皮下、透皮、鞘內、腦內、立體定向、及鼻內投予形式及直腸投予形式。通常，醫藥組成物含有對於能夠被注射的製劑而言係醫藥上可接受之媒劑。這些可特別為等張的、無菌的、鹽溶液 (磷酸一鈉或磷酸二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣或氯化鎂及類似者或這些鹽的混合物)，或乾燥的、特別是冷凍乾燥的組成物，其在添加時，取決於是無菌水或生理鹽水情況下，可組構成注射液。適用於注射的藥物劑型包括無菌水溶液或分散液，包括芝麻油、花生油或丙二醇水溶液的製劑，以及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液的無菌粉劑。在所有情況下，形式必須是無菌的並且必須是以利於容易注射程度之流體。其必須在製造及儲存條件下保持穩定，並且必須能夠抵抗諸如細菌及真菌等微生物的污染作用。包括本揭露之化合物作為游離鹼或醫藥上可接受之鹽的溶液可在水中與介面活性劑 (諸如羥丙基纖維素) 適當地混合來製備。分散體亦可在甘油、液體聚乙二醇、及其混合物及油中製備。在一般儲存及使用條件下，這些製劑可含有防腐劑以防止微生物生長。本文所揭示之寡核苷酸可用中性或鹽形式配製成組成物。醫藥上可接受之鹽包括酸加成鹽 (與蛋白質的游離胺基形成) 及與無機酸 (例如像是鹽酸或磷酸) 或有機酸 (諸如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸、及類似者) 形成者。與游離羧基形成的鹽類還可以衍生自：無機鹼，例如像是氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；及有機鹼，諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸、普魯卡因、及類似者。載劑亦可為溶劑或分散介質，含有例如水、乙醇、多元醇 (例如甘油、丙二醇、及液態聚乙二醇、及類似者)、其適當混合物、及植物油。合適的流動性可藉由使用塗覆 (例如卵磷脂)、藉由保持所需的粒徑 (對於分散體)、及藉由使用界面活性劑來保持。可藉由各種抗細菌劑及抗真菌劑 (例如像是對羥基苯甲酸酯、三氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞、及類似者) 來防止微生物的作用。在一些情況下，本揭露之醫藥組成物可包括等張劑，例如像是糖或氯化鈉。可藉由使用延遲吸收的劑 (例如像是單硬脂酸鋁及明膠) 來延長可注射組成物的吸收。藉由將所需量的活性劑摻入適當的溶劑以及所需的以下枚舉之數種其他成分中，隨後過濾除菌，來製備無菌可注射溶液。通常，分散液係藉由將各種滅菌後的活性成分併入含有來自本中所揭示之基本分散介質及所需額外成分的無菌媒劑中來製備。對於用於製備無菌注射液的無菌粉末，較佳的製備方法可為真空乾燥及冷凍乾燥技術，該技術可從先前過濾後的無菌溶液中得到活性成分與任何其他所需成分的粉末。配製後，溶液將以與劑量要求相容的方式及治療有效的量投予。該等製劑容易以各種劑型投予，諸如上述可注射溶液的類型，但也可利用藥物釋放膠囊及類似者。例如，對於在水性溶液中的腸胃外投予，如果需要，溶液應經適當地緩衝並且首先用足夠的鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等張。這些特定的水性溶液特別適用於靜脈內、肌內、皮下、及腹膜內投予。可使用的無菌水性介質係本技術領域眾所周知的。例如，可以將一個劑量溶解在 1 mL 等張 NaCl 溶液中，並加到 1000 mL 注入皮下法流體中，或在指定的輸注部位注射。取決於接受治療的個體的情況，劑量必然會發生一些改變。在任何事件下，負責投予的從業者可使用適當的患者資訊及本技術領域所理解之方法來判定個體的適當劑量。 診斷方法
個體 (例如，人個體) 可例如使用本技術領域熟知的方法經診斷為患有癲癇 (例如，TLE)，並且因此被鑑定為需要使用本文揭示之組成物及方法之治療。例如，個體癲癇的診斷可藉由神經生理學測試來指導，以鑑定個體大腦中的致癲癇病灶及癲癇樣活動的嚴重度。本技術領域熟知的例示性神經生理學測試方法包括腦波術 (EEG)、腦磁波術 (MEG)、功能性MRI (fMRI)、單光子激發斷層掃描 (SPECT)、及正電子發射斷層攝影術 (PET)。EEG 及 MEG 提供具有高時間分辨率的皮層功能的連續測量，並有助於檢測發作間期 (癲癇發作之間的時期) 癲癇樣放電，這可能表明對個體的癲癇病症的陽性診斷。可比較個體的大腦活動與適合個體年齡、病史、及生活方式的標準 (例如，參考人群，例如像是非癲癇患者群) 以判定診斷個體患有癲癇。
個體可經診斷為患有多種癲癇病症中的任何一種，其包括但不限於 TLE (例如，mTLE 或 lTLE)、良性 Rolandic 癲癇、額葉癲癇、嬰兒痙攣症、青少年肌陣攣性癲癇、青少年癲癇失神性癲癇、兒童失神性癲癇 (pyknolepsy)、熱水性癲癇、Lennox-Gastaut 症候群、Landau-Kleffner 症候群、Dravet 症候群、進行性肌陣攣性癲癇、反射性癲癇、Rasmussen 症候群、邊緣性癲癇、癲癇持續狀態、腹部癲癇、大規模雙側肌陣攣、月經性癲癇、傑克遜癲癇 (Jacksonian seizure disorder)、拉福拉病 (Lafora disease)、及光敏性癲癇。在癲癇病症是 TLE 的情況下，TLE 的特徵可能是局灶性或全身性癲癇發作。
基於使用所揭示之方法將致癲癇病灶定位到特定大腦區域 (例如，內側顳葉、外側額葉、額葉等)，可診斷患者的癲癇類型。癲癇大腦活動的電生理學特徵也可用於識別個體中癲癇的特定類型或亞型。例如，皮層區域 (例如，海馬或大腦皮層) 中存在快速 (250-600 Hz) 尖波紋波 (SPW-Rs) 可能表明個體的 TLE 診斷陽性。在另一實例中，Lennox-Gastaut 症候群的特徵通常是在新皮質及丘腦中記錄到快速電圖振盪 (10-15 Hz)。此外，如果病人出現明顯的癲癇發作的行為表現，對住院患者個體視訊監測可能表明對患者癲癇診斷，例如像是全身性抽搐、暫時失神 (意識水平下降持續約 10 秒) 、緊張、肌陣攣、腸或膀胱失控、咬舌頭、疲勞、頭痛、說話困難、異常行為 (例如，一動不動地凝視或手或嘴的自動運動) 、精神病、及/或局部疲軟 (localized weakness)。經診斷為癲癇的個體自我報告的症狀也可能指示陽性診斷。此類自我報告的症狀可能包括似曾相識或從未見過的感覺、先兆、健忘症、自發及無緣由的恐懼及焦慮、噁心、聽覺、視覺、嗅覺、味覺、或觸覺幻覺、視覺扭曲 (例如，大視覺或小視覺)、解離或現實感喪失、聯覺、煩躁或欣快的感覺、恐懼、憤怒、或無法形容的感覺。 醫藥用途
本文揭示藉由投予上述組成物 (例如，ASO劑或編碼彼之核酸載體) 來治療經診斷患有或有風險發展為癲癇病症的個體的癲癇 (例如，TLE) 之方法.  投予後，本揭露的 ASO 劑能夠結合並抑制 Grik2mRNA 的表現。本文揭示之 ASO 劑對 Grik2的靶向可顯示為第一細胞或細胞群組 (例如神經元細胞；此類細胞可能存在於例如個體或在源自個體的樣品中) 所表現的 Grik2mRNA 量降低，其中 Grik2被轉錄並且已經或已經被處理 (例如，藉由將一個或多個細胞與本揭露之寡核苷酸接觸，或藉由向體內存在或曾經存在細胞的個體投予用本揭露之寡核苷酸)。在一個具體實例中，相較於第一細胞或細胞群組基本相同但尚未或尚未如此處理 (未用寡核苷酸處理或未用靶向目標基因的寡核苷酸處理的對照細胞) 的第二細胞或細胞群組， Grik2的表現在第一細胞或細胞組中降低 。所關注之基因 (例如 Grik2) 的 mRNA 量降低程度可以表示為：
基因 (例如 Grik2基因) 表現量的變化可以根據與所關注之基因的表現功能相關的參數的減少來評估，例如所關注之基因的蛋白質表現或蛋白質下游的傳訊。所關注之基因表現量的變化，可在表現所關注之基因的任何細胞中、無論是內源的還是來自表現構建體的異源、並且藉由本技術領域已知的任何檢定法來判定。
Grik2表現量的變化可顯示為細胞或細胞群組表現的 GluK2 蛋白量的降低 (例如，來自個體的樣品中所表現的 GluK2 蛋白量)。如上所說明，為了評估 Grik2mRNA抑制，處理細胞或細胞群組中 GluK2 蛋白表現量的變化可類似地表示為對照細胞或細胞群組中蛋白質量的百分比。
可用於評估 Grik2基因表現變化的對照細胞或細胞群組包括尚未與本揭露之寡核苷酸接觸的細胞或細胞群組。例如，對照細胞或細胞群組可來源於用寡核苷酸治療個體之前之個體 (例如，人或動物個體)。
由一個細胞或細胞群組所表現的 Grik2mRNA的量，可使用本技術領域已知的用於評估 mRNA 表現的任何方法來判定。例如，樣品中 Grik2mRNA 的表現量可藉由檢測所轉錄的多核苷酸或其部分，例如 mRNA 來判定。RNA 可使用 RNA 萃取技術從細胞中萃取，該萃取技術包括例如使用酸酚/異硫氰酸胍萃取 (RNAzol B; Biogenesis)、RNEASY TMRNA 製備套組 (Qiagen) 或 PAXgene (PreAnalytix, Switzerland)。利用核糖核酸雜交的典型檢定法形式包括核轉錄活性測定法 (nuclear run-on assay)、RT-PCR、RNase 保護檢定法、北方印漬術、原位雜交、及微陣列分析。循環 mRNA 可使用 PCT 公開 WO2012/177906 中描述的方法檢測，其全部內容係以引用併入本文。所關注之基因的表現量也可使用核酸探針來判定。用語“探針”，如本文中所使用，是指能夠選擇性結合特定序列的任何分子，例如結合 mRNA。探針可使用本技術領域熟知及習用方法合成或衍生自適當的生物製劑。探針可專門設計用於標記。可用作探針的分子的實例包括但不限於 RNA、DNA、蛋白質、抗體、及有機分子。
分離的 mRNA 可用於雜交或擴增檢定法，其包括但不限於南方或北方分析、聚合酶鏈反應 (PCR) 分析、及探針陣列。一種用於判定 mRNA 量的方法涉及將分離的 mRNA 與可與所關注之基因的 mRNA 雜交的核酸分子 (探針) 接觸。mRNA 可經固定在固體表面上並與探針接觸，例如藉由在瓊脂糖凝膠上運行分離的 mRNA 並將 mRNA 從凝膠轉移至膜，例如硝酸纖維素。探針也可以固定在固體表面上，並且 mRNA 與探針接觸，例如，在 AFFYMETRIX 基因晶片陣列中。本技術領域已知的 mRNA 檢測方法可適用於判定所關注之基因的 mRNA 量。
用於判定樣品中所關注之基因表現量的替代方法涉及樣品中例如 mRNA 的核酸擴增及/或反轉錄酶 (以製備 cDNA) 過程，例如藉由 RT-PCR (實驗例述於 Mullis, 1987，美國專利第 4,683,202 號)、連接酶鏈式反應 (Barany (1991) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:189-193)、自主序列複製 (Guatelli 等人，(1990) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-1878)、轉錄放大系統 (Kwoh 等人，(1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173-1177)、Q-Beta 複製酶 (Lizardi 等人，(1988) Bio/Technology 6:1197)、滾環式複製 (Lizardi 等人，美國專利第 5,854,033 號) 或任何其他核酸擴增方法，然後使用本技術領域眾所周知的技術檢測擴增的分子。如果核酸分子的數量非常少，這些檢測方案對於檢測核酸分子尤其有用。在本揭露之特定態樣中，所關注之基因的表現量藉由定量螢光 RT-PCR(i.e., the TAQMAN TMSystem) 或 DUAL-GLO® 螢光素酶檢定法來判定。
所關注之基因的 mRNA 的表現量可用膜印漬 (諸如用於雜交分析，諸如北方、南方、點式、及類似者)、或微孔、樣品管、凝膠、珠或纖維 (或任何包括結合核酸的固體支持物) 來監測。參見美國專利第 5,770,722；5,874,219；5,744,305；5,677,195；及 5,445,934 號，其係以引用方式併入本文。基因表現量的測定亦可包括使用溶液中的核酸探針。
mRNA 表現量也可使用分支 DNA (bDNA) 檢定法或實時 PCR (qPCR) 評估。此 PCR 方法的使用在本文提供的實施例中描述及舉例說明。此類方法也可用於檢測所關注之基因的核酸。
此外，表現 Grik2基因所產生的 GluK2 蛋白的量可用本技術領域中已知的測量蛋白量的任何方法來判定。此類方法包括例如電泳、毛細管電泳、高效液相層析法 (HPLC)、薄層層析法 (TLC)、超擴散層析法、流體或凝膠沉澱反應、吸收光譜、比色檢定法、分光光度檢定法、流式細胞術、免疫擴散 (單或雙) 、免疫電泳、西方印漬術、放射免疫檢定法 (RIA) 、酶聯免疫吸附檢定法 (ELISA) 、免疫螢光檢定法、電化學發光檢定法及類似者。此類檢定法也可用於檢測指示由所關注之基因產生的蛋白質的存在或複製的蛋白質。此外，上述檢定法可用於報告導致蛋白質功能的恢復或改變的所關注之 mRNA 序列的變化，從而為個體提供治療效果及益處、治療個體的病症、及或減少個體的病症症狀。
因此，上述測量 Grik2mRNA或 GluK2 蛋白表現的檢定法，可用於判定個體 (例如，患有癲癇 (例如，TLE) 的個體) 需要用本文揭示之一種或多種 ASO 劑 (例如，表 2 中所述的任何一種ASO劑) 或編碼彼之核酸載體治療性治療。例如，被判定為患有 TLE 的患者可能在大腦的一個半球的顳葉內表現出致癲癇病灶，導致無法控制的 (例如，治療抵抗性，例如慢性) 癲癇發作。如本文所討論的，這種致癲癇病灶可能源自例如復發性齒狀顆粒細胞苔蘚纖維的異常萌發及 Grik2在所述苔蘚纖維所形成的複發性突觸處的異常 (即，增加) 表現。使用上述檢定法，例如，藉由對從致癲癇半球的海馬體及健康半球的相同區域收集的腦組織進行小型活檢，可判定個體是否會受益於使用一種或多種本文揭示之 Grik2ASO 劑的治療。相較於未受影響的半球，顯示致癲癇半球表現出更高 (例如，至少 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 量 Grik2mRNA 或 GluK2 蛋白的表現，表明患者可能受益於使用本文揭示之方法及組成物的療法。如果患有 TLE 的個體在兩個大腦半球都出現了致癲癇病灶，那麼可用上文揭示之檢定法，比較從 TLE 個體的一個或多個半球所獲得的海馬迴組織及從健康對照個體的相同半球 (例如，從沒有 TLE 的個體的死後組織) 所獲得的 Grik2mRNA 或 GluK2 蛋白量。相較於健康個體的相同半球，顯示患有 TLE 個體致癲癇半球表現出更高 (例如，至少 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多) 量 Grik2mRNA 或 GluK2 蛋白的表現，表明患有 TLE 個體可能受益於本文揭示之組成物及方法的治療性治療。懷疑需要治療的個體的神經元細胞中的 Grik2mRNA 量或 GluK2 蛋白量也可與已知指示疾病狀態的這些分析物的標準或參考量比較。
此外，上述檢定法可用於判定個體 (例如患有癲癇，例如 TLE 的個體) 是否對使用本文揭示之組成物及方法的治療有反應。例如，如上所述，在用本文揭示之組成物及方法治療之前，可藉由小型活檢的方式從患有 TLE 的個體獲得致癲癇腦半球的海馬迴腦組織，且 Grik2mRNA 或 GluK2 蛋白的表現可使用上述檢定法評估。接著，可根據本文揭示之方法及組成物對個體投予治療。在用所揭示之方法及組成物治療後 (例如，治療後 1、5、10、15、30、60、90、或更多天)，患者恢復後，可對治療前評估的相同腦區域進行第二次活檢，並再次評估 Grik2mRNA 或 GluK2 蛋白的量。如果顯示患有 TLE 的個體表現出較低 (例如，至少 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或更多) 的 Grik2mRNA 或 GluK2 蛋白的表現量，則表明該個體對治療有反應。或者，可將 Grik2mRNA 或 GluK2 蛋白量與來自一名或多名健康對照個體的表現進行比較。如果顯示治療後患TLE 的患者的 Grik2mRNA 或 GluK2 蛋白量在統計學上與一個或多個健康對照個體沒有區別，則表明該患者對治療有反應。接受治療的個體的神經元細胞中的 Grik2mRNA 量或 GluK2 蛋白量也可以與這些分析物的標準准或參考量比較，這些分析物是已知的表明沒有疾病狀態者。 治療方法
患有癲癇 (例如，TLE) 的個體可使用本文所述的組成物及方法來治療。組成物 (例如，含有 ASO 劑的組成物或含有彼之載體) 可作為預防性治療投予有需要的個體 (例如，經診斷為患有或有風險患有癲癇的個體 (例如，TLE)。有患癲癇風險的個體可能顯示癲癇的早期症狀，或者在投予治療時可能尚未有症狀。 投予途徑
本文揭示之組成物可使用標準方法投予個體 (例如，鑑定為患有 TLE 的個體)。例如，本文揭示之組成物可藉由多種不同途徑中的任一種投予，包括例如全身投予。全身投予的非限制性實例包括腸內 (例如，口服) 或腸胃外 (例如，靜脈內、動脈內、經黏膜、腹膜內、表皮、黏膜內 (例如，鼻內或舌下)、肌內、或經皮) 投予。其他投予途徑可包括皮內、皮下、及經皮注射。
本文揭示之組成物也可以使用適合於局部遞送 ASO 劑或編碼彼之核酸載體的方法來投予。局部投予的非限制性實例包括表皮 (例如局部)、關節內、及吸入途徑。特別地，所揭示之組成物可局部投予個體的腦組織 (例如神經細胞，諸如神經元及/或星狀膠質細胞)。
特別地，ASO 劑及編碼彼之核酸載體可局部投予個體的腦組織，諸如經判定表現出增加的癲癇樣活動的腦組織。對大腦的局部投予通常包括適用於將 ASO 劑或編碼 彼之核酸載體遞送至腦細胞 (例如，神經細胞) 的任何方法，使得選定的突觸連接的細胞群組的至少一部分細胞是與組成物接觸。可將載體遞送至 CNS 的任何細胞，包括神經元、星狀膠質細胞或兩者。通常，載體被遞送至 CNS 的細胞，包括例如脊髓、腦幹 (髓質、腦橋、及中腦)、小腦、間腦 (例如丘腦及下視丘)、終腦 (紋狀體、腦皮質 (例如，枕葉、顳葉、頂葉、或額葉中的皮質區域) 的細胞或其組合，或其中任何合適的細胞亞群。其他遞送部位包括紅核、杏仁核、內嗅皮質及、及丘腦腹外側核或前核中的神經元。
本揭露之載體可藉由立體定向注射或顯微注射的方式直接遞送到 CNS 的實質或腦室中。在一特定實例中，本揭露之載體可直接遞送至個體大腦中的一個或多個癲癇病灶。例如，可以藉由立體定向注射直接向異皮層 (例如，海馬迴) 或新皮質 (例如，額葉) 的一個或兩個半球投予施用本揭露之載體。在一特定實例中，藉由直接向海馬迴的一個或兩個半球進行立體定向注射向個體投予本揭露之載體。或者，本揭露之載體可藉由靜脈內注射投予，例如在表現出對 CNS 組織的趨向性的載體的情況下，包括但不限於 AAV9 或 AAVrh10。
為了將本揭露之載體特異性地遞送至特定區域及特定的 CNS 細胞群，可藉由立體定向顯微注射來投予載體。例如，個體可能有立體定向框架底座，藉由手術固定到位 (擰入頭骨)。使用高分辨率 MRI 對具有立體定向框架底座 (例如，具有基準標記的 MRI 兼容立體定向框架底座) 的大腦進行成像。然後將 MRI 影像傳輸到運行立體定向軟體的電腦。使用一系列冠狀、矢狀及軸向影像來判定用於將本揭露之組成物注射到大腦中的插管或注射針的目標注射部位及軌跡。該軟體直接將軌跡轉換為適合立體定向框架的三維座標。在入口點上方鑽孔，並使用植入給定深度的注射針定位立體定向儀器。可將組成物 (諸如本文揭示之組成物) 注射到目標部位。在組成物包括整合載體而不是產生病毒顆粒的情況下，載體的傳播較小並且主要是從注射部位被動擴散的功能。擴散程度可以藉由調整載體對流體載劑的比率來控制。
其他投予途徑亦可包括在直接可視化下局部投予載體，例如，淺表皮層投予，或其他非立體定向投予。載體可以藉由鞘內 (例如，直接進入小腦延髓池)、腦室內 (例如，使用腦室內 (ICV)注射) 或藉由靜脈內註射來遞送。
在一個實例中，本揭露之方法包括透過立體定向注射進行腦內或腦室內投予。然而，也可以根據本揭露修改其他已知的遞送方法。例如，為了使組成物更廣泛地分佈在整個 CNS 中，可以將其注射到腦脊液中，例如藉由腰椎穿刺。為了將組成物引導至外周神經系統，可將其注入脊髓、一個或多個外周神經節，或目標身體部位的皮膚下 (皮下或肌內)。在某些情況下，組成物可經由血管內途徑投予。例如，在血腦屏障受到干擾或未受到干擾下，組成物可以動脈內 (頸動脈) 投予。此外，為了更全面地遞送，可在藉由輸注包括甘露醇的高張溶液實現的血腦屏障“打開”期間投予組成物。
在任何給定情況下最合適的投予途徑將取決於所投予的特定組成物、個體、所治療的特定癲癇、醫藥配製方法、投予方法 (例如，投予時間及投予途徑)、個體的年齡、體重、性別、所治療疾病的嚴重程度、個體的飲食、及個體的排泄率。 組合療法
可將本文揭示之組成物投予於有此需要的個體 (例如，人個體) 以與一種或多種另外的治療方式 (例如，1、2、3、或更多種其他治療方式)，包括其他治療劑或物理性干預 (例如，康復治療或手術干預)，以治療癲癇 (例如，TLE)。兩種或更多種劑可同時投予 (例如，所有劑的投予發生在 15 分鐘、10 分鐘、5 分鐘、2 分鐘或更短時間內)。該等劑也可以經由共同配製同時投予。兩種或多種藥劑也可依次投予，使得兩種或更多種劑的作用重疊，並且它們的組合效果，使得症狀或與病症相關的其他參數的減少為大於以一種劑或治療單獨遞送或在沒有另一種的情況下進行所觀察到者。兩種或更多種治療的效果可以是部分累加、完全累加或大於累加 (例如增效)。各治療劑的順序或實質上同時投予可藉由任何適當的途徑進行，其包括但不限於口服途徑、靜脈內注射途徑、肌內途徑、局部途徑、及透過黏膜組織直接吸收。治療劑可藉由相同途徑或不同途徑投予。例如，組合的第一治療劑可藉由靜脈內注射投予，而組合的第二治療劑可以在化合物浸漬的微匣中局部投予。第一治療劑可在第二治療劑之前或之後達至 1 小時、達至 2 小時、達至 3 小時、達至 4 小時、達至 5 小時、達至 6 小時、達至 7 小時、達至 8 小時、達至 9 小時、達至 10 小時、達至 11 小時、達至 12 小時、達至 13 小時，14 小時、達至 16 小時、達至 17 小時、達至 18 小時、達至 19 小時、達至 20 小時、達至 21 小時、達至 22 小時、達至 23 小時、達至 24 小時或達至 1-7、1-14、1-21 或 1-30 天立即投予。
在個體經診斷為患有或處於發展癲癇 (例如，TLE) 風險中的情況下，第二治療劑可包括一種或多種抗癲癇藥 (AED)，其包括但不限於丙戊酸、拉莫趨靜 (lamotrigine)、甲乙琥珀亞胺 (ethosuximide)、托比拉邁 (topiramate)、拉考沙胺 (lacosamide)、左旋乙拉西坦 (levetiracetam)、氯巴占 (clobazam)、司替戊醇 (stiripentol)、苯二氮平 (benzodiazepine)、二苯乙內醯脲 (phenytoin)、卡巴氮平 (carbamazepine)、乙苯嘧啶二酮 (primidone)、苯巴比妥 (phenobarbital)、巴本汀 (gabapentin)、普瑞巴林 (pregabalin)、噻加賓(tiagabine)、唑尼沙胺 (zonisamide)、菲胺酯 (felbamate)、及/或威嘎巴純 (vigabatrin)。在一些情況下，第二治療方式可為手術干預，例如，使用本技術領域眾所周知的方法 (例如像是放射手術 (例如，伽馬刀或雷射剝蝕)) 對致癲癇腦區進行手術切除 (例如，顳葉切除)。可與本揭露之方法及組成物一起投予的其他治療方式包括迷走神經刺激、深部腦刺激、經顱磁刺激、及生酮飲食。
在具體實例中，個體可經投予免疫抑制劑，其包括單獨使用皮質類固醇、或他克莫司或雷帕黴素 (西羅莫司) 的給藥方案例如與黴酚酸組合或與皮質類固醇諸如培尼皮質醇及/或甲基培尼皮質醇組合。本技術領域熟知的其他免疫抑制方案可與本揭露之方法及組成物結合使用。此類免疫抑制治療可在基因治療之前、之後或同時進行。 給藥
可如本文所述來治療的個體係經診斷為患有癲癇或處於發生癲癇 (例如，TLE) 的風險中的個體。可使用所揭示之方法及組成物治療的個體包括例如以前有過一次或多次與治療癲癇有關的先前治療干預的個體、或先前沒有治療癲癇的治療干預的個體。
本揭露之 ASO 劑可用有效導致以下的一種或多種 (例如，2種或多種、3種或多種、4種或多種) 的量及時間投予：(a) 降低個體細胞中 Grik2mRNA 及/或 GluK2 蛋白的量，(b) 病症的延遲發作，(c) 個體存活率增加，(d) 個體無進展存活率增加，(e) GluK2 蛋白功能的恢復或改變，(f) 降低癲癇發作復發的風險；(g) 減少 CNS 的興奮性毒性及相關的神經元細胞死亡；(h) 恢復中樞神經系統受影響區域 (例如海馬迴) 的生理興奮-抑制平衡；及/或 (i) 減少一種或多種癲癇狀 (例如，癲癇發作的頻率、持續時間、或強度、虛弱、失神、突然意識模糊、理解或產生言語困難、認知障礙、行動不便、頭暈、或失去平衡或協調、癱瘓、及情緒失調)。
因此，本揭露涉及一種在有此需要的個體中治療癲癇 (例如，TLE) 之方法，其中該方法包括投予有效量的載體，該載體包括編碼抑制性 RNA (例如，ASO，例如像是 siRNA、shRNA、miRNA、或 shmiRNA，或 shmiRNA) 之寡核苷酸，其特異性結合 Grik2mRNA 並抑制個體中 GluK2 蛋白的表現。特別地，本發明提供了一種在有此需要的個體中治療癲癇之方法，其包括向個體投予治療有效量的本文揭示之ASO劑或編碼彼之核酸載體。
利用所揭示之方法及組成物所治療的癲癇可能是 TLE (例如，mTLE 或 lTLE)、良性 Rolandic 癲癇、額葉癲癇、嬰兒痙攣症、青少年肌陣攣性癲癇、青少年癲癇失神性癲癇、兒童失神性癲癇、熱水性癲癇、Lennox-Gastaut 症候群、Landau-Kleffner 症候群、Dravet 症候群、進行性肌陣攣性癲癇、反射性癲癇、Rasmussen 症候群、邊緣性癲癇、癲癇持續狀態、腹部癲癇、大規模雙側肌陣攣、月經性癲癇、傑克遜癲癇病症、拉福拉病、及光敏性癲癇。例如，個體可能經診斷患有 TLE (例如，mTLE 或 lTLE)，諸如以局灶性或全身性癲癇發作為特徵的 TLE。在一些情況下，癲癇可為慢性癲癇，例如像是難治性癲癇 (即耐藥性癲癇，諸如耐藥性 TLE)。
如本文所討論，為了治療癲癇及改善癲癇發作及癲癇樣放電的症狀，可用的多核苷酸可藉由編碼功能性 RNA 的載體來利用，例如，siRNA、shRNA、miRNA 或 shmiRNA，其抑制 Grik2mRNA 表現。
所揭示之組成物可用熟習本技術領域者判定合適的量投予。在一些情況下，rAAV 以每個個體為 10 5、10 6、10 7、10 8、10 9、10 10、10 11、10 12、10 13、10 14、或 10 15個基因體拷貝 (GC) 的劑量來投予。在一些實施例中，rAAV 以 10 5、10 6、10 7、10 8、10 9、10 10、10 11、10 12、10 13、或 10 14個 GC/kg (個體總體重) 的劑量來投予。
在一些情況下，係投予 1 x 10 12至 5 x 10 14個 GC。在一些情況下，將 1 x 10 12至 5 x 10 14個 GC 的固定劑量投予於孩童患者或成人患者。
在一些情況下，劑量是藉由每克患者腦質量投予患者腦脊液 (CSF) (例如鞘內注射，例如經由枕下穿刺或腰椎穿刺) 的 GC 數量來測量。在一些情況下，係投予每克患者腦質量 10 5、10 6、10 7、10 8、10 9、10 9 、10 10、10 11、10 12、10 13、10 14、或 10 15個基因體拷貝。在一些情況下，係投予每克患者腦質量 1 × 10 5個基因體拷貝。在一些情況下，係投予每克患者腦質量 1 × 10 6個基因體拷貝。在一些情況下，係投予每克患者腦質量 1 × 10 7個基因體拷貝。在一些情況下，係投予每克患者腦質量 1 × 10 8個基因體拷貝。在一些情況下，係投予每克患者腦質量 1 × 10 9個基因體拷貝。在一些情況下，係投予每克患者腦質量 1 × 10 10個基因體拷貝。在一些情況下，係投予每克患者腦質量 5 × 10 10個基因體拷貝。在一些情況下，係投予每克患者腦質量 1 x 10 9至 1 x 10 11個基因體拷貝。在一些情況下，係投予每克患者腦質量 1 x 10 9至 5 x 10 10個基因體拷貝。在一些情況下，係投予每克患者腦質量 2 x 10 9至 9 x 10 10個基因體拷貝。在一些情況下，係投予每克患者腦質量 5 x 10 9至 1 x 10 11個基因體拷貝。在一些情況下，係投予每克患者腦質量 1 x 10 10至 5 x 10 10個基因體拷貝。在其他實施例中，係投予每克患者腦質量 1 x 10 10至 9 x 10 10個基因體拷貝。患者 (個體) 的腦重量估計是從 MRI 腦體積判定中所獲得的，該腦體積被轉換為腦質量並用於計算所投予之藥物精確劑量。腦重量亦可使用已發布的資料庫根據年齡範圍估計。
視情況，所揭示之劑可作為適於遞送給個體的醫藥上可接受之組成物的一部分來投予，如本文所述。所揭示之劑以足以提供所欲劑量及/或引起治療有益效果的量來包括在這些組成物中，如熟習本技術領域者可容易地判定者。
本文描述的所揭示之組成物可用一定量 (例如，有效量) 及足以治療個體或實現上述結果之一者 (例如，減輕個體一種或多種疾病症狀) 的時間來投予。所揭示之組成物可用一次或多於一次來投予。所揭示之組成物可每天一次、每天兩次、每天三次、每兩天一次、每週一次、每週兩次、每週三次、每兩週一次、每月一次、每兩個月一次、每年兩次、或每年一次來投予。治療可為不連續的 (例如注射) 或連續的 (例如經由植入物或輸液泵治療)。取決於所使用的組成物及投予途徑，可在投予本揭露之組成物後 1 週、2 週、1 個月、2 個月、3 個月、4 個月、5 個月、6 個月或更長時間評估個體的治療療效。本文揭示評估治療療效之方法 (參見例如“醫藥用途”)。根據評估的結果，可繼續或停止治療，可改變治療頻率或劑量，或者可用不同的所揭示之組成物來治療患者。個體可接受一段不連續的時間 (例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 或 12 個月) 或直到疾病或病症緩解，或治療可能是慢性的，這取決於所治療疾病或病症的嚴重度及性質。例如，如果初始或後續幾輪治療不會引起治療益處 (例如，本文揭示之任何一種症狀的減少或個體患病腦區中 Grik2mRNA 量或 GluK2 蛋白量的降低)，可給予診斷患有 TLE 並用本文揭示之組成物治療的個體一種或多種 (例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 或更多) 額外的治療。 套組
本揭露亦提供套組，其包括本文揭示之抑制個體中 Grik2基因的表現之組成物 (例如，靶向 Grik2mRNA 的 ASO)，用於預防或治療癲癇 (例如，TLE，諸如難治性 TLE)。套組可視情況包括用於將組成物遞送至個體之劑或裝置。在其他實例中，套組可包括一個或多個無菌施用器，諸如注射器或針頭。此外，套組可視情況包括其他劑，例如麻醉劑或抗生素。該套組亦可包括指導套組使用者 (諸如醫生) 執行本文揭示之方法的藥品仿單。 實例
提出以下實施例是為了向本技術領域中具有普通知識者提供如何使用、製造及評估本文所述的組成物及方法的描述，並且旨在純粹是本揭露的例示，並非旨在限制發明人考量其揭露的範圍。 實例 1A ： Grik2 mRNA 靶向反義寡核苷酸的設計及選擇 Grik2 mRNA 靶向反義寡核苷酸的設計
為了開發能夠靶向及抑制 Grik2mRNA表現的反義寡核苷酸 (ASO)，從智人 ( Homo sapiens) 以及包括家鼷鼠 ( Mus musculus)、溝鼠 ( Rattus norvegicus) 及恆河獼猴 ( Macaca mulatta) 等其他動物模型物種之 NCBI GenBank 資料庫中獲得 Grik2mRNA序列 (5'非轉譯區 (UTR)、編碼區 (CDS) 及3' UTR) 的採集物。著重在最長的轉錄本變體 (即SEQ ID NO: 115)，但其他轉錄本變體包含在該採集物中。評估的序列包括：SEQ ID NO: 115 (NM_021956 ( 智人))、SEQ ID NO: 117 (NM_175768 ( 智人))、SEQ ID NO: 118 (NM_001166247 ( 智人))、SEQ ID NO: 119 (NM_001111268 ( 家鼷鼠))、SEQ ID NO: 120 (NM_010349 ( 家鼷鼠))、SEQ ID NO: 121 (NM_001358866 ( 家鼷鼠))、SEQ ID NO: 122 (XM_015136995( 恆河獼猴))、SEQID NO：123 (XM_015136997( 恆河獼猴))、SEQID NO：124 (NM_019309.2 ( 溝鼠))。使用序列比對程式 MUSCLE 進行序列比對，以識別物種之間具有顯著序列同源性的區域，並且為了增加給定導引序列在整個治療開發過程中有效靶向每個感興趣物種所需轉錄本的可能性，對這些區域給予導引 RNA (即涉及與 Grik2mRNA 的互補鹼基配對的ASO序列)設計取向。
文獻建議，mRNA 的二級結構可對 RNA 干擾 (RNAi) 的靶向效率具有顯著影響，不包含二級結構的區域更容易被RNAi機制影響，因此被假設為更有效的靶向。相反地，預測參與鹼基配對、形成 RNA-RNA 雙股的 mRNA 區域不太容易被 RNAi 機制影響，並且被假設為 RNAi 方法的低效靶向。 Grik2mRNA 的二級結構未針對任何物種進行表徵。因此，設計了一種策略來使用預測軟體，該軟體採用基於減少折疊 RNA 的自由能 (即最小自由能結構或MFE) 或與所有其他可能的折疊方向 (質心) 相比減少鹼基對距離的算法。該評估是使用RNAfold WebServer (rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)，對來自智人、家鼷鼠及恆河獼猴的 Grik2mRNA變體1進行的。每個轉錄本具有低鹼基配對機率及/或高位置熵 (圖1A中黃色至藍色著色) 的區域被識別並優先用於導引設計。這些區域包括明確描繪的環區域 (在圖1B中指定為阿拉伯數字 1 至 14，其分別對應於 SEQ ID NO: 145-158)，以及描述為莖樣區域但具有低鹼基配對機率的區域 (在圖 1B 中指定為阿拉伯數字 15 至 19，其對應於 SEQ ID NO: )。優先考慮預測在一個以上的物種中具有低鹼基配對機率及/或高位置熵的區域。各種鑑定的RNAi導引序列與 Grik2mRNA的比對 (SEQ ID NO: 115) 顯示於圖 1C 至圖 1G。
然後以電腦模擬評估藉由上述方法選擇的 Grik2mRNA 中感興趣的區域，以預測性地確定設計用於靶向這些區域的小抑制性 RNA 亦有可能靶向其他轉錄本的可能性，從而導致基於非標靶基因錯誤調節的非期望脫靶效應。為了預測性地評估藉由針對 Grik2轉錄本上特定區域設計的導引RNA所介導的脫靶效應的機率，使用線上工具siSPOTR (「siRNA Sequence Probability-of-Off-Targeting Reduction」可在sispotr.icts.uiowa.edu/sispotr/index.html_獲得)。輸入感興趣的轉錄本後，此程式會識別一系列 siRNA 或 shRNA (其中任何一者都可轉化為合成 ASO 並按原樣遞送)，這些 siRNA 或 shRNA 被預計靶向感興趣的轉錄本，同時最大限度地降低 siRNA 或 shRNA 將靶向其他轉錄本的可能性。siSPOTR 亦表明來自建議的小 RNA 分子的種子序列(例如，涉及與標靶DNA或mRNA序列互補鹼基配對的序列，例如 Grik2mRNA 序列)是否亦對應於已知的內源性表現之 微小 RNA (miRNA) 的種子序列，表明候選分子可能錯誤調節通常藉由天然 miRNA 調節的路徑。這些候選者被避開了。
如同使用 RNAfold WebServer 的情況，使用針對人類及小鼠二者的總轉錄本的 siSPOTR，評估 智人、 家鼷鼠及 恆河獼猴的轉錄本變體1。這允許識別來自每個轉錄本的候選小RNA，其被預測在人類細胞(例如，用於 活體外的細胞株或用於離體標靶驗證的人類切除物) 或在鼠類細胞中 (例如， 活體內之功效鼠類模型) 靶向 mRNA 的可能性很低。這也允許識別與它們在所有三個輸入轉錄本中靶向的序列同源的候選小 RNA，這些轉錄本亦被預測會在人類及鼠類細胞中引起最小的脫靶效應，這對於在藥物開發過程中最大限度地減少各種模型的功效差異及脫靶型態特別有意義。
最後，為了在螢光素酶報告系統中使用合成RNA導引篩選候選標靶序列，使用BLASTn的「Somewhat similar sequences」(可在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch獲得)評估對應的21 bp標靶序列，以判定從人類基因體表現的任何RNA是否與建議的標靶具有顯著相似性 (例如＞90%，然後＞80%)，因此有可能成為針對 Grik2設計的導引的標靶。 使用細胞株報導基因檢定活體外篩選 GluK2 反義寡核苷酸
用於人類 Grik2(轉錄變體1) mRNA (包括5'及3' UTR) 的序列獲自NCBI GenBank (NM_021956.4；SEQ ID NO: 115)，在 pMIR-GLO (Promega，Catalog No. E1330) 雙螢光素酶報導基因質體的背景下，在磷酸甘油酯激酶 (PGK) 啟動子的控制下合成並選殖至螢火蟲螢光素酶的 3' UTR，稱為pmiR-GLO -hGluK2。因此，來自PGK啟動子的表現產生了雜交螢火蟲螢光素酶-人類 Grik2mRNA，其允許用於評估靶向人類 Grik2 mRNA的小RNA導引，因為在 Grik2mRNA 表現中 RNAi 介導的減少亦導致螢火蟲螢光素酶 (ffluc) 報導蛋白的減少。螢光素酶可藉由本領域熟知的多種方法進行定量。該報導基因質體亦在 SV40 啟動子的控制下編碼水母螢光素酶報導基因，其之表現用作標準化對照，因為它在其3' UTR 中不包含任何感興趣的靶向序列。然後報導螢火蟲螢光素酶：水母螢光素酶訊號的比率 (以 RLU 表示)，並與以相同方式評估不相關的小 RNA 導引 (用作陰性對照) 時獲得的比率進行比較。因此， Grik2mRNA減弱的結果被報導為「% GluK2減弱」(亦稱為% Kd)，且對 GluK2 蛋白表現的任何非特異性影響被測量為相對於從陰性對照獲得之比率的「% 殘留表現」，如下。
於此，將5 ng pmiR-GLO-hGluK2 與小RNA導引共轉染至 WT 293T 細胞的 96孔盤中，在此特定情況下，是針對 Grik2mRNA設計的 10 pg 合成 siRNA 或不相關的陰性對照 ASO。作為額外的對照並判定 ASO 本身的轉染是否對蛋白質表現具有更普遍的全面影響，每個 ASO 額外與空的 pmiR-GLO 質體共轉染(在單獨的孔中)，該質體在螢光素酶的 3' UTR中不包含 Grik2 mRNA序列，因此不產生 ffluc-hGluK2 雜合 mRNA。轉染後 48 小時，裂解細胞，使用 Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega) 檢定螢火蟲及水母螢光素酶的表現，並記述為相對光單位 (RLU)。如上所述，計算了在接受實驗性 ASO 的孔中產生的螢火蟲螢光素酶：水母螢光素酶與 Grik2mRNA 結合 pmiR-GLO-hGluK2 報導基因的比率，並將其與從接受不相關的陰性對照 siRNA 的孔中獲得的比率進行比較，並記述為標靶 mRNA 的「減弱百分比」(% Kd)，在本例中為 fluc-hGluK2 (圖 1H；表 2)。這些值用於判定哪些小 RNA 導引有效地靶向 Grik2mRNA 序列。此外，計算了在接受實驗性 ASO 的孔中產生的螢火蟲螢光素酶：水母螢光素酶與 Grik2結合 pmiR-GLO-空報導基因的比率，並將其與從接受不相關的陰性對照 ASO 的孔中獲得的比率進行比較，並記述為來自非靶向 ffluc mRNA 的「殘留 ffluc 表現百分比」(圖 1I)。這些值用於判定哪些小 RNA 導引對轉染細胞中的蛋白質表現具有非特異性影響，使用非靶向 ffluc 作為蛋白質表現的替代物。為每個導引候選者繪製這些數值，以確定顯著降低 ffluc-hGluK2 mRNA 表現但不以非特異性方式干擾非靶向 ffluc 表現的導引 (圖 1J)。從該圖中，為導引選擇建立了截止值，即 ＞66% GluK2 減弱及 ＞66% 殘留非靶向 ffluc 表現 (圖中的虛線)。 實例 1B ： Grik2 標靶的熱力學性質： siRNA 雙股
使用 RNAup WebServer 預測 RNA-RNA 相互作用及其熱力學性質，如下表 10 及 11 所示。查詢19個鹼基對 (bp) siRNA (具有 19 個與 GluK2 mRNA 同源的鹼基) 及 21 個鹼基對 Grik2 siRNA (具有 21 個鹼基導引，其具有 19 個與 GluK2 mRNA 同源的鹼基)，以藉由 RNAup 評估熱力學性質，如下所示：結合的總自由能、來自雙股形成的能量及標靶打開能 (打開能 Grik2mRNA)，並將這些計算值與每個導引的減弱百分比 (% KD，參見實施例1A)及GC%的判定值進行比較，以便相關聯有利的導引性質。RNAup 基本上分兩個階段計算RNA-RNA相互作用的熱力學。首先，計算潛在結合位點保持未配對的機率(例如打開標靶位點所需的自由能)，然後將這種「可及性」與相互作用能結合以獲得總結合能。 表 10 ： 19-Bp 合成的 RNA 導引的熱力學性質計算
siRNA ID SEQ ID NO 對應 19 bp 導引的 % KD 導引序列 (19 個鹼基 ) %GC (19 bp) 結合的總自由能 (kcal/mol) (19 bp 導引 ) 雙股形成產生的能量 (kcal/mol) (19 bp 導引 ) 打開能 GluK2 mRNA (kcal/mol) Grik2 標靶區域
MD 70 0*** CAUUCCCAUAGCUAAUGCC 47.4 -24.33* -34.51 9.12* 外顯子 3
G5 15 89 UGAUAUUCCAUCUCCUGGC 47.4 -28.88** -35.12* 5.36 3' UTR 質心未配對 3 外顯子 16
Y9 88 87 CAUAGGUAAUAGCCAGUGG 47.4 -23.71 -33.91 6.64 外顯子 5
TO 14 86 CGUUCCACUGUCAGAAAGG 52.6* -27.58* -33.3 5.36 外顯子 13 質心未配對 1
TK 74 85 AGUCGAUGACCUUCUCUCG 52.6* -25.77* -35* 8.16* 5' UTR 外顯子 1
TL 20 85 UGUCGAUUACACUGCAAGG 47.4 -26.52* -33.4 6.66 外顯子 7
GI 77 83 GUCUCGAUAUGGAGAACCC 52.6* -25.35* -37.02* 7.22 與外顯子 3 及外顯子 4 重疊
G0 1 83 AAGGGUAGUAUUGGGUAGC 47.4 -32.78** -34.52 17.24** 外顯子 2 質心環 1
TT 4 83 UGUUAACACCACUGUAUCG 42.1 -26.56* -31.41 4.49 外顯子 6 質心環 2
TP 13 82 uGUUCCACUGUCAGAAAGG 47.4 -27.57* -33.3 5.36 外顯子 13 質心未配對 1
MU 96 82 UUCAUAUGUAAAGCCAAGG 36.8 -25.88* -29.81 3.88 外顯子 10 質心環 5
Y5 60 81 UUGAGUCGAAGAUUAUACC 36.8 -23.74 -29.91 5.79 5' UTR 外顯子 1
TJ 21 80 GAUGCGUCGAGUGGUGACC 63.2** -27.16* -39.7** 10.53** 外顯子 11
ML 85 80 AGAGCUCCAACUCCAAACC 52.6* -24.8* -35.72* 9.63* 外顯子 11
CW 41 80 AUAAACGCAGUCCACUUCC 47.4 -24.29* -32.82 8.51* 外顯子 7
Y8 87 80 uAUAGGUAAUAGCCAGUGG 42.1 -23.25 -32.31 6.64 與外顯子 4 及外顯子 5 重疊
MW 80 79 CAGAGCAUUGCAGAUGGAC 52.6* -26.29* -36.8* 9.82* 外顯子 4
TM 17 78 UAUUUCCUUGAUAAUUGGC 31.6 -23.42 -27.73 3.91 3' UTR
G9 68 77 CCCAUAGCUAAUGCCUGUU 47.4 -27.7* -34.91 5.54 與外顯子 14 及 15 重疊
ME 69 77 uUGUCAUCAUUCCCAUAGC 42.1 -21.76 -32 10.17** 外顯子 14
GE 65 76 UUAGUCGGAGAGCAUCCGG 57.9* -26.97* -37.8* 5.42 外顯子 13 質心未配對 1
G6 18 76 uAUCCUCAAUUCUUCUACC 36.8 -24.73* -30.02 5.29 外顯子 16
MH 94 74 uGUCAUAAAUCCAUCCAGC 42.1 -24.6* -31.82 7.21 外顯子 6
TN 16 73 AUAAGUGAUGAACAUCUGC 36.8 -25.22* -29.71 3.91 3' UTR 質心未配對 4 外顯子 16
TU 3 72 AGCAUUGCAGAUGGACUGC 52.6* -22.63 -35.92* 10.24** 外顯子 3
GD 7 72 UGUAGAUAACUCUCUGAGG 42.1 -26.46* -32.9 5.08 外顯子 10 質心環 5
MG 95 71 uAUCAGUCGUCAUAAAUCC 36.8 -23.67 -29.32 5.64 外顯子 6
TR 11 71 UUAUUAUUUGGGAUAUGGG 31.6 -26.86* -28.01 0.88 3' UTR 質心環 12 外顯子 16
TH 22 70 CUCGAACAUAGGUAAUAGC 42.1 -23.63 -31.62 7.86* 5' UTR 外顯子 1
CL 30 69 uAGCGGGUCUGUAUGUGGG 57.9* -28.93** -38.4* 8.84* 3' UTR 外顯子 16
MF 93 69 UAGAGACUGACAUAGAAGG 42.1 -23.86 -32.6 8.39* 外顯子 3
XU 51 68 UGUCUCGAUAUGGAGAACC 47.4 -22.97 -34.42 7 5' UTR 外顯子 1
XY 83 67 CACCACGUCUGAGUCAGGG 63.2** -29.29** -40.7** 9.92* 外顯子 6
XX 82 67 uACCACGUCUGAGUCAGGG 57.9* -27.65* -37.6* 8.47* 外顯子 6
YA 63 67 GGUUGCAUAUUUCCACAGG 47.4 -27.06* -34.01 6.42 與外顯子 4 及外顯子 5 重疊
GG 91 67 AGUCGUCAUAAAUCCAUCC 42.1 -24.54* -31.82 7.28 外顯子 11
CP 34 66* uUCGAUGGUUGUUGACUCC 47.4 -24.97* -33.12 6.48 外顯子 3
G8 92 66* ACUGACAUAGAAGGAAUCU 36.8 -21.89 -30.51 8.19* 與外顯子 14 及 15 重疊
CX 42 65* GACCGCAGACACGAUCACG 63.2** -28.01** -39.7** 10.48** 5' UTR 外顯子 1
G1 5 64* AAUCGGGUUUCGGAGGUGC 57.9* -30.11** -36.52* 5.58 外顯子 6 質心環 3
GF 64 63* UGCGUCGAGUGGUGACCGC 68.4** -26.88* -41.02** 10.61** 外顯子 13 質心未配對 1
TI 75 63* uUCGAACAUAGGUAAUAGC 36.8 -21.37 -28.92 7.44 5' UTR 外顯子 1
MM 84 62* uUGAGUCAGGGUUGCAAGG 52.6* -30.36** -36.1* 5.59 外顯子 11
TQ 12 61* GAUGUUCGCUGGCUUUCCC 57.9* -35.06** -38.51* 3.08 外顯子 9
CQ 35 61* CUCGAUGGUUGUUGACUCC 52.6* -26.97* -35.12* 6.48 外顯子 7
CY 43 59* UUCGGCUCCUGGGUUCGGG 68.4** -28.2** -41.9** 10.6** 5' UTR 外顯子 1
G3 8 59* UUAGUUCACGAACCAUUCC 42.1 -25.28* -30.62 5.17 外顯子 10 質心環 6
MQ 73 59* AUGAUAAGUGUGAAAAACC 31.6 -20.68 -26.63 5.8 外顯子 12
XT 50 57* AGCCUCGUGGAAACCAGGG 63.2** -22.87 -40.2** 13.29** 外顯子 16 CDS 之 3' 末端
YB 67 56* uAUCCGGGAGAAAUCCAGC 52.6* -22.64 -32.82 7.41 外顯子 3
MI 90 55* AGGUAAUAGCCAGUGGAGC 52.6* -28.09** -36.82* 6.47 外顯子 3
CM 31 54* CAGCGGGUCUGUAUGUGGG 63.2** -30.86** -40.5** 8.84* 3' UTR 外顯子 16
TE 25 52* CUAGCGUUCGGCUCCUGGG 68.4** -28.19** -42** 11.18** 3' UTR 外顯子 16
G2 6 52* AUCGGGUUUCGGAGGUGCC 63.2** -32.31** -39.1** 5.5 外顯子 6 質心環 3
G4 9 52* AAUAACUGGGGCCUGUGGC 57.9* -31.54** -37.8* 4.83 外顯子 16 質心環 8
MN 79 51* GAUAUGGAGAACCCAUGGG 52.6* -26.6* -37.5* 7.33 外顯子 12
XS 49 51* GACGACAGUUUGUGCUUGG 52.6* -27.79* -35.41* 6.21 外顯子 16 CDS 之 3' 末端
Y7 62 50* AGAUAUCAGGGGAGAGAGG 52.6* -33.03** -37.5* 4.26 5' UTR 外顯子 1
D2 47 50* AGCGCCAGGGUUUAUGUCG 57.9* -26.66* -35.8* 8.46* 3' UTR 外顯子 16
TF 24 49* uUAGCGUUCGGCUCCUGGG 63.2** -26.17* -39.7** 11.18** 5' UTR 外顯子 1
CZ 44 47* UAAAGCGGGUCCCGAAGCG 63.2** -28.97** -37.5* 6.72 外顯子 7
GJ 27 45* AACGUUGGUGGUGCACACG 57.9* -25.23* -34.6 6.5 外顯子 1 訊息肽
MO 78 43* uGAUAUGGAGAACCCAUGG 47.4 -23.5 -34.4 7.32 外顯子 12
CV 40 43* AAACGAAUGAGACCAGUGC 47.4 -24.81* -33.51 8.57* 5' UTR 外顯子 1
CU 39 42* AGACGCCUGGGUUUGUACC 57.9* -25.59* -37.22* 9.84* 5' UTR 外顯子 1
Y6 61 41* GGCUAGUAACAUCAUCACC 47.4 -28.14** -34.5 6.33 5' UTR 外顯子 1
Y1 56 40* UGCAAUCGUUCCAUCGACC 52.6* -25.73* -35.32* 8.25* 3' UTR 外顯子 16
MR 72 39* AAACCACCAAAUGCCUCCC 52.6* -22.95 -35.32* 12.37** 外顯子 3
Y2 57 39* uUGAAUCGGGUUUCGGAGG 52.6* -26.46* -34.7 6.37 外顯子 11
CN 32 34* uACGCACUACCAUUCAUGC 47.4 -16.4 -32.8 16.16** 外顯子 14
CR 36 33* AGCGGGUCUGUAUGUGGGG 63.2** -30.76** -40.4** 8.96* 外顯子 7
MV 81 31** CCCAGAGCAUUGCAGAUGG 57.9* -24.69* -38.5* 12.07** 外顯子 11
G7 19 31** CAUCCUCAAUUCUUCUACC 42.1 -26.33* -31.62 5.29 外顯子 16
D1 46 29** CACGGCACCCACUUCCCCG 73.7** -24.74* -42.7** 17.19** 3' UTR 外顯子 16
D0 45 28** uACGGCACCCACUUCCCCG 68.4** -23.65 -40.5** 16.09** 5' UTR 外顯子 1
D3 48 28** GUCUCCGCUUCCCAAACCC 63.2** -22.74 -40.02** 17.24** 外顯子 15
MJ 89 26** GAGCAACUGCAAGGUCAGC 57.9* -28.57** -38.2* 8.19* 外顯子 6
MK 86 26** UGAUGGAGCUUUGAUGAGC 47.4 -22.88 -34.81 9.56* 外顯子 11
TS 10 26** UUAGUGACACUUUUAUUGG 31.6 -24.84* -27.71 1.97 3' UTR 質心環 11 外顯子 16
Y3 58 22** CUGAAUCGGGUUUCGGAGG 57.9* -26.82* -37.61* 7.03 3' UTR 外顯子 16 質心環 9
GH 66 21** AUGCGUCGAGUGGUGACCG 63.2** -25.31* -38.4* 10.56** 外顯子 11
MP 76 14** GACACCUGGUGCUUCCAGC 63.2** -26.12* -41.6** 11.36** 外顯子 12
TG 23 14** GGUUCGGGUAGAAAUGAGG 52.6* -24.65* -35.41* 9.72* 5' UTR 外顯子 1
XZ 54 12** AGACACGAUCACGGCAUGG 57.9* -28.13** -37.9* 9.44* 外顯子 3
XW 53 9** CGACGCUGGCACUUCAGGG 68.4** -28.79** -41.5** 10.55** 外顯子 6
Y0 55 7** UUCCCCGAUCUAGCGUUCG 57.9* -21.81 -37.2* 14.33** 外顯子 4
CK 29 6** CGGUGCGCCUGAAGACUGG 68.4** -31.67** -40.8** 7.01 外顯子 3
MT 98 4** AAUGGACAAUGGAAUGGAA 36.8* -9.89 -12.92 2.94 外顯子 10 質心環 6
TC 28 3** uGGUGCGCCUGAAGACUGG 63.2** -31.78** -39.3** 6.63 外顯子 3
CT 38 2** AAAGCGGGUCCCGAAGCGC 68.4** -28.56** -40.62** 9.87* 3' UTR 外顯子 16
TD 26 0** GUUCGGCUCCUGGGUUCGG 68.4** -29.76** -42.3** 10.6** 外顯子 1 訊息肽
TV 2 0** AGGCCCGAAGAUGGCAGCC 68.4** -30.02** -41.92** 7.99* 外顯子 3
Y4 59 0** AAGGCCCGAAGAUGGCAGC 63.2** -30.44** -40.02** 6.53 5' UTR 外顯子 1
XV 52 0** uGACGCUGGCACUUCAGGG 63.2** -27.2* -39.3** 9.94* 5' UTR 外顯子 1
CS 37 0** UUGAACGGCCACAGACACC 57.9* -26.83* -37.12* 10.11** 外顯子 11
CO 33 0** CACGCACUACCAUUCAUGC 52.6* -17.25 -35.2* 17.71** 外顯子 14
MS 99 0** AUGGAAUGGAAUGGUUCGU 42.1 -10.58 -14.6 1.9 外顯子 10 質心環 6
表 11 ： 21 bp 成熟 miRNA 導引的熱力學性質計算
siRNA ID 對應 21 bp 導引的 % KD 導引序列 (21 個鹼基 ) %GC (21 bp) 結合的總自由能 (kcal/mol) (21 bp 導引 ) 雙股形成產生的能量 (kcal/mol) (21 bp 導引 ) 打開能 GluK2 mRNA (kcal/mol) Grik2 標靶區域
MD 0** CAUUCCCAUAGCUAAUGCCUG 47.6 -28.72* -39.04* 9.13* 外顯子 3
G5 89 UGAUAUUCCAUCUCCUGGCAA 42.9 -31.31** -37.7 5.41 3' UTR 質心未配對 3 外顯子 16
Y9 87 CAUAGGUAAUAGCCAGUGGAG 47.6 -14.06 -23.76 8.7 外顯子 5
TO 86 CGUUCCACUGUCAGAAAGGCG 57.1** -31.37** -39.2* 6.15 外顯子 13 質心未配對 1
TL 85 UGUCGAUUACACUGCAAGGAA 42.9 -29.31* -36.31 6.72 外顯子 7
TK 85 AGUCGAUGACCUUCUCUCGAA 47.6 -26.58 -37.9 8.25* 5' UTR 外顯子 1
G0 83 AAGGGUAGUAUUGGGUAGCAA 42.9 -35.17** -37.31 1.74 外顯子 2 質心環 1
TT 83 UGUUAACACCACUGUAUCGGU 42.9 -30.19* -36.31 4.49 外顯子 6 質心環 2
GI 83 GUCUCGAUAUGGAGAACCCAU 47.6 -28.24* -40* 7.3 與外顯子 3 及外顯子 4 重疊
MU 82 UUCAUAUGUAAAGCCAAGGAU 33.3 -28.52* -32.31 3.67 外顯子 10 質心環 5
TP 82 uGUUCCACUGUCAGAAAGGCG 52.4* -31.61** -39.4* 6.15 外顯子 13 質心未配對 1
Y5 81 UUGAGUCGAAGAUUAUACCUU 33.3 -26.28 -32.51 5.81 5' UTR 外顯子 1
CW 80 AUAAACGCAGUCCACUUCCAA 42.9 -26.87 -35.41 8.52* 外顯子 7
Y8 80 uAUAGGUAAUAGCCAGUGGAG 42.9 -27.01* -36.01 8.7* 與外顯子 4 及外顯子 5 重疊
ML 80 AGAGCUCCAACUCCAAACCAG 52.4* -29.07* -40.01* 9.64** 外顯子 11
TJ 80 GAUGCGUCGAGUGGUGACCGC 66.7** -31.07** -45.22** 10.61** 外顯子 11
MW 79 CAGAGCAUUGCAGAUGGACUG 52.4* -25.99 -39* 9.82** 外顯子 4
TM 78 UAUUUCCUUGAUAAUUGGCAU 28.6 -25.71 -30.71 4.58 3' UTR
G9 77 CCCAUAGCUAAUGCCUGUUUU 42.9 -29.4* -36.61 5.54 與外顯子 14 及 15 重疊
ME 77 uUGUCAUCAUUCCCAUAGCUA 38.1 -24.39 -34.7 10.25** 外顯子 14
G6 76 uAUCCUCAAUUCUUCUACCAU 33.3 -25.34 -25.34 5.27 外顯子 16
GE 76 UUAGUCGGAGAGCAUCCGGGA 57.1** -31.16** -42.3** 5.42 外顯子 13 質心未配對 1
MH 74 uGUCAUAAAUCCAUCCAGCAA 38.1 -26.41 -34.41 7.98 外顯子 6
TN 73 AUAAGUGAUGAACAUCUGCUU 33.3 -26.75 -32.31 3.94 3' UTR 質心未配對 4 外顯子 16
GD 72 UGUAGAUAACUCUCUGAGGAG 42.9 -29.58* -37.4 5.74 外顯子 10 質心環 5
TU 72 AGCAUUGCAGAUGGACUGCAC 52.4* -24.17 -40.4* 10.78** 外顯子 3
TR 71 UUAUUAUUUGGGAUAUGGGGG 38.1 -33.64** -34.81 0.89 3' UTR 質心環 12 外顯子 16
MG 71 uAUCAGUCGUCAUAAAUCCAU 33.3 -25.01 -30.71 5.69 外顯子 6
TH 70 CUCGAACAUAGGUAAUAGCCA 42.9 -25.56 -36.61 8.79* 5' UTR 外顯子 1
MF 69 UAGAGACUGACAUAGAAGGAA 38.1 -26.72 -35.6 8.52* 外顯子 3
CL 69 uAGCGGGUCUGUAUGUGGGGA 57.1** -32.51** -42.4** 9.01* 3' UTR 外顯子 16
XU 68 UGUCUCGAUAUGGAGAACCCA 47.6 -27.87* -39.6* 7.27 5' UTR 外顯子 1
YA 67 GGUUGCAUAUUUCCACAGGAA 42.9 -28.12* -36.81 7.2 與外顯子 4 及外顯子 5 重疊
GG 67 AGUCGUCAUAAAUCCAUCCAG 42.9 -28.84* -36.21 7.36 外顯子 11
XX 67 uACCACGUCUGAGUCAGGGUU 52.4* -28.99* -39.4* 8.47* 外顯子 6
XY 67 CACCACGUCUGAGUCAGGGUU 57.1** -30.66** -43.1** 10.36** 外顯子 6
CP 66* uUCGAUGGUUGUUGACUCCAU 42.9 -27.3* -35.7 6.32 外顯子 3
G8 66* ACUGACAUAGAAGGAAUCUUU 33.3 -23.31 -32.31 8.22* 與外顯子 14 及 15 重疊
CX 65* GACCGCAGACACGAUCACGGC 66.7** -29.57* -46.12** 14.57** 5' UTR 外顯子 1
G1 64* AAUCGGGUUUCGGAGGUGCCU 57.1** -32.35** -41.4** 6.19 外顯子 6 質心環 3
TI 63* uUCGAACAUAGGUAAUAGCCA 38.1 -23.18 -33.71 8.26 5' UTR 外顯子 1
GF 63* UGCGUCGAGUGGUGACCGCAG 66.7** -28.78* -45.3** 10.72** 外顯子 13 質心未配對 1
MM 62* uUGAGUCAGGGUUGCAAGGGU 52.4* -34.81** -40.5* 5.56 外顯子 11
TQ 61* GAUGUUCGCUGGCUUUCCCUU 52.4* -37.53** -41.11** 3.08 外顯子 9
CQ 61* CUCGAUGGUUGUUGACUCCAU 47.6 -29.47* -38.1* 6.49 外顯子 7
G3 59* UUAGUUCACGAACCAUUCCAU 38.1 -28.19* -33.61 5.23 外顯子 10 質心環 6
MQ 59* AUGAUAAGUGUGAAAAACCAC 33.3 -23.62 -30.93 6.35 外顯子 12
CY 59* UUCGGCUCCUGGGUUCGGGUA 61.9** -30.21* -44.5** 10.62** 5' UTR 外顯子 1
XT 57* AGCCUCGUGGAAACCAGGGGU 61.9** -24.03 -45.2** 13.35** 外顯子 16 CDS 之 3' 末端
YB 56* uAUCCGGGAGAAAUCCAGCAC 52.4* -26.46 -39.6* 10.38** 外顯子 3
MI 55* AGGUAAUAGCCAGUGGAGCAA 47.6 -29.53* -38.3* 6.47 外顯子 3
CM 54* CAGCGGGUCUGUAUGUGGGGA 61.9** -35.53** -45.6** 9.07* 3' UTR 外顯子 16
G2 52* AUCGGGUUUCGGAGGUGCCUG 61.9** -32.87** -41.7** 4.35 外顯子 6 質心環 3
G4 52* AAUAACUGGGGCCUGUGGCUU 52.4* -31.27** -41.2** 5.75 外顯子 16 質心環 8
TE 52* CUAGCGUUCGGCUCCUGGGUU 61.9** -30.05* -43.9** 11.18** 3' UTR 外顯子 16
XS 51* GACGACAGUUUGUGCUUGGGU 52.4* -32.54** -40.41* 6.29 外顯子 16 CDS 之 3' 末端
MN 51* GAUAUGGAGAACCCAUGGGAG 52.4* -29.9* -42.4** 8.92* 外顯子 12
Y7 50* AGAUAUCAGGGGAGAGAGGAU 47.6 -36.18** -40.7* 4.28 5' UTR 外顯子 1
D2 50* AGCGCCAGGGUUUAUGUCGAU 52.4* -29.53* -39.01* 8.47* 3' UTR 外顯子 16
TF 49* uUAGCGUUCGGCUCCUGGGUU 57.1** -27.5* -41* 11.11** 5' UTR 外顯子 1
CZ 47* UAAAGCGGGUCCCGAAGCGCC 66.7** -32.36** -45.12** 10.05** 外顯子 7
GJ 45* AACGUUGGUGGUGCACACGCA 57.1** -25.32 -40.4* 11.59** 外顯子 1 訊息肽
MO 43* uGAUAUGGAGAACCCAUGGGA 47.6 -28* -38.9* 7.33 外顯子 12
CV 43* AAACGAAUGAGACCAGUGCUG 47.6 -29.23* -38.01* 8.61* 5' UTR 外顯子 1
CU 42* AGACGCCUGGGUUUGUACCAU 52.4* -27.53* -40.2* 9.85** 5' UTR 外顯子 1
Y6 41* GGCUAGUAACAUCAUCACCUC 47.6 -30.87** -39* 8.03* 5' UTR 外顯子 1
Y1 40* UGCAAUCGUUCCAUCGACCAC 52.4* -30.09* -39.8* 8.27* 3' UTR 外顯子 16
Y2 39* uUGAAUCGGGUUUCGGAGGUG 52.4* -30.59** -38.51 6.45 外顯子 11
MR 39* AAACCACCAAAUGCCUCCCAC 52.4* -24.42 -36.81 12.37** 外顯子 3
CN 34* uACGCACUACCAUUCAUGCUU 42.9 -18.32 -35.3 16.16** 外顯子 14
CR 33* AGCGGGUCUGUAUGUGGGGAA 57.1** -33.16** -43.2** 9.01* 外顯子 7
G7 31** CAUCCUCAAUUCUUCUACCAU 38.1 -27.81* -33.11 5.29 外顯子 16
MV 31** CCCAGAGCAUUGCAGAUGGAC 57.1** -27.12* -43.2** 13.26** 外顯子 11
D1 29** CACGGCACCCACUUCCCCGAU 66.7** -27.54* -46** 17.33** 3' UTR 外顯子 16
D0 28** uACGGCACCCACUUCCCCGAU 61.9** -26.46 -43.7** 16.11** 5' UTR 外顯子 1
D3 28** GUCUCCGCUUCCCAAACCCAU 57.1** -25.72 -43** 17.25** 外顯子 15
TS 26** UUAGUGACACUUUUAUUGGUU 28.6 -26.47 -29.61 1.97 3' UTR 質心環 11 外顯子 16
MJ 26** GAGCAACUGCAAGGUCAGCUU 52.4* -29.33* -40.8* 8.2* 外顯子 6
MK 26** UGAUGGAGCUUUGAUGAGCUC 47.6 -22.76 -39.31* 9.87** 外顯子 11
Y3 22** CUGAAUCGGGUUUCGGAGGUG 57.1** -30.57** -41.61** 7.28 3' UTR 外顯子 16 質心環 9
GH 21** AUGCGUCGAGUGGUGACCGCA 61.9** -27.23* -43.3** 10.61** 外顯子 11
TG 14** GGUUCGGGUAGAAAUGAGGAU 47.6 -27.7* -38.61* 9.73** 5' UTR 外顯子 1
MP 14** GACACCUGGUGCUUCCAGCGG 66.7** -31.64** -47.3** 11.46** 外顯子 12
XZ 12** AGACACGAUCACGGCAUGGUC 57.1** -30.15* -42.02** 9.58** 外顯子 3
XW 9** CGACGCUGGCACUUCAGGGAC 66.7** -32.76** -46.02** 11.1** 外顯子 6
Y0 7** UUCCCCGAUCUAGCGUUCGGC 61.9** -21.79 -43.8** 17.49** 外顯子 4
CK 6** CGGUGCGCCUGAAGACUGGAU 61.9** -34.73** -44** 7.04 外顯子 3
MT 4** AAUGGACAAUGGAAUGGAAUG 38.1 -27.94* -34.81 4.66 外顯子 10 質心環 6
TC 3** uGGUGCGCCUGAAGACUGGAU 57.1** -34.65** -42.7** 6.65 外顯子 3
CT 2** AAAGCGGGUCCCGAAGCGCCA 66.7** -32.68** -45.6** 10.01** 3' UTR 外顯子 16
MS 0** AUGGAAUGGAAUGGUUCGUGA 42.8 -30.67** -36.71 1.92 外顯子 10 質心環 6
Y4 0** AAGGCCCGAAGAUGGCAGCCA 61.9** -31.24** -44.3** 7.99 5' UTR 外顯子 1
TV 0** AGGCCCGAAGAUGGCAGCCAC 66.7** -32.37** -46.22** 8.78* 外顯子 3
XV 0** uGACGCUGGCACUUCAGGGAC 61.9** -31.7** -44.02** 10.16** 5' UTR 外顯子 1
CS 0** UUGAACGGCCACAGACACCAC 57.1** -30.92** -41.42** 10.17** 外顯子 11
TD 0** GUUCGGCUCCUGGGUUCGGGU 66.7** -32.95** -47.2** 10.62** 外顯子 1 訊息肽
CO 0** CACGCACUACCAUUCAUGCUU 47.6 -19.24 -37.81 17.74** 外顯子 14
表 10 及表 11 的欄定義：
% KD: 藉由與候選 siRNA 共轉染所實現的螢光素酶-GluK2 mRNA (Grik2 mRNA，變體1，SEQ ID NO: 122) 報導基因表現的減弱百分比 (對於藉由實施例1A中描述的檢定所判定的等效 19 bp RNA導引)；帶有兩個星號 (**) 的表格 = 低於 33% 減弱 (KD)，帶有 1 個星號 (*) 的表格 = 33-66% KD，沒有星號的表格 = 大於 66% KD。
%GC：為鳥嘌呤及胞嘧啶之 siRNA 的導引序列中鹼基的組合百分比；表 10：具有兩個星號 (**) 的表格＝大於 60% Gc，具有一個星號 (*) 的表格＝50-60% GC，沒有星號的表格＝小於 50% Gc；表 11：帶有兩個星號 (**) 的表格 = 大於 55% GC，帶有一個星號 (*) 的表格 = 50-55% GC，沒有星號的表格 = 小於 55% GC。
粗體字母的 Grik2標靶區域表示本揭露的已識別環或未配對區域。
結合的總自由能 (kcal/mol)：siRNA與其在 Grik2 mRNA (SEQ ID NO: 122) 上對應標靶序列雜交的過程的自由能，包括打開 mRNA 上標靶區域，生成單股導引，及單股 siRNA 導引與其單股 mRNA 標靶序列的雜交；表10：帶有兩個星號 (**) 的 = 小於 -28 kcal/mol (最大ΔG；最負值表格)，帶有一個星號 (*) 的表格 = -23 至 -24 kcal/mol，以及沒有星號的表格= -24 kcal/mol (最低ΔG；最接近於零)；表 11：帶有兩個星號 (**) 的表格 = 小於 -30.5 kcal/mol (最大ΔG；最負值)，帶有一個星號 (*) 的表格 = -30.5 至 -27 kcal/mol，及沒有星號的表格= -27 kcal/mol (最低ΔG；最接近零)。
來自雙股形成的能量 (kcal/mol)：單股siRNA導引與單股mRNA標靶序列雜交的自由能；表 10：帶有兩個星號 (**) 的表格 = 小於-38 kcal/mol (最大ΔG；最負值)，帶有一個星號 (*) 的表格 = -38 至 -35 kcal/mol，以及沒有星號的表格 = -35 kcal/mol (最低ΔG；最接近於零)；表 11：帶有兩個星號 (**) 的表格 = 小於 -41 kcal/mol (最大ΔG；最負值)，帶有一個星號 (*) 的表格 = -41 至 -38 kcal/mol，以及沒有星號的表格= -38 kcal/mol (最低ΔG；最接近於零)。
打開能 Gluk2 mRNA (kcal/mol) (亦稱為標靶打開能)：在標靶位置處解析RNA二級結構所需的能量 (可能包括解析附近的二級結構或涉及與標靶序列形成二級結構的遠端序列)；表 10：帶有兩個星號(**)的表格 = 最高能量需求 (＞10 kcal/mol = 最正數/最不利)，帶有一個星號 (*) 的表格 = 中等能量需求 (在7.5 及 10 kcal/mol 之間；適度有利)，沒有星號的表格 =最低能量需求 (＜7.5 kcal/mol；最接近零/最有利)；表 11：具有兩個星號 (**) 的表格 = 最高能量需求 (＞9.5 kcal/mol = 最正數/最不利)，具有一個星號 (*) 的表格 = 中等能量需求 (在 8 及 9.5 kcal/mol 之間；適度有利)，沒有星號的表格 = 最低能量需求 (＜8 kcal/mol；最接近零/最有利)。
為了判定 GluK2 mRNA 的打開能、雙股形成的能量及結合的總自由能，使用 RNAup WebServer (rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAup.cgi, part of the ViennaRNA Web Services軟體套件) (Lorenz, R., Bernhart, S.H., Höner zu Siederdissen, C., Tafer, H., Flamm, C., Stadler, P.F., and Hofacker, Ivo L. ViennaRNA Package 2.0, Algorithms for Molecular Biology, 6:1 26, 2011, doi:10.1186/1748-7188-6-26)。RNAup 折疊兩個輸入RNA中的每一個(由 RNAfold 伺服器執行，rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)，然後基於每個折疊RNA的熱力學，計算與輸入RNA雜交有關的各種熱力學值。這些包括打開任一RNA (例如，標靶 RNA 及 siRNA)上的二級結構所需的能量(以 kcal/mol 為單位)、雙股形成產生的能量(一個未折疊的 RNA 與另一個未折疊的 RNA 雜交)，以及結合的總能量，其既考慮了打開每個RNA所需之能量，亦考慮了雜交本身的能量。
此處，RNAup用於計算與人類 Grik2mRNA (SEQID NO：122) 結合的 siRNA 導引序列的熱力學參數，以判定可在活體外或活體內實驗環境中預測 siRNA 活性 (例如，減弱的功效) 的閾值。19 bp 合成 RNA 導引的結果列於表10，21 bp 成熟 miRNA 導引的結果列於表 11。出於此實施例的目的，針對全長人類 Grik2mRNA 查詢與 Grik2mRNA 序列同源/互補的 21 鹼基 siRNA 序列中的 19 個鹼基 (如實施例1A中所述在活體外螢光素酶報導基因檢定中測試的那些 siRNA)。雖然此方法是針對 siRNA 序列的 19 個鹼基所採用的，但其亦可用於查詢更長的 ASO、shRNA、miRNA 或 shmiRNA，就像對 21 bp 成熟 miRNA 所進行的那樣，因為折疊/展開的原理及雜交一般被認為是可比較的。記錄上述熱力學參數 (參見表10 及 11)，並評估它們與螢光素酶報導基因檢定中的減弱百分比 (KD) 的相關性，因此評估它們對於預測給定導引序列功效的能力。 標靶打開能
當根據預測在 GluK2 mRNA 中打開其對應標靶序列所需之能量對候選導引序列進行排序時，具有打開能需求低 (最接近0 kcal/mol) 的導引靶向區域與判定具有更大報導基因減弱能力的那些導引之間存在明顯的相關性。標靶打開能範圍為 0.88 至 17.71 kcal/mol，平均值為 8.12 kcal/mol，中位數為 7.41 kcal/mol；將報導基因表現減弱 ＞66% 的 siRNA 傾向於具有較低的標靶打開能 (平均值 = 7.12 kcal/mol，中位數 = 6.66 kcal/mol)，而那些沒有有效減弱報導基因表現的 siRNA 具有更高的標靶打開能 (平均值=8.74 kcal/mol，中位數=8.34 kcal/mol)。雖然兩組中都有離群值 (例如，G0：%KD=83，而打開能=17.24 kcal/mol；及MT：%KD=4，而打開能=1.9 kcal/mol)，在siRNA導引中具有較低打開能的靶標明顯富集，並以大於66%的程度減弱報導基因表現。從機制上而言，需要較少能量輸入來展開的標靶序列更易於展開，因此可被認為是「更容易用於」siRNA 結合。此外，預測的二級 Grik2環及未配對結構更豐富，如圖 1B 及表 4 所示。例如，在 Grik2mRNA 的單股區域內特異性雜交的長度不多於 23 個核苷酸的 RNA 導引呈現至少 ＜10 kcal/mol，且在某些情況下為 ＜7.5 kcal/mol 的有利打開能。siRNA 之富集群集，如圖 1B 所示包括本揭露的那些與預測的二級 Grik2環及未配對結構結合的導引，其具有小於 10 kcal/mol的標靶打開能，並與大於 66% 之 Gluk2 減弱相關。標靶打開能預測值 ＜7.5 kcal/mol 的 19 bp Grik2靶向導引更有可能有效；而 ＞10 kcal/mol 的標靶打開能預測值在某些情況下不太有利。標靶打開能預測值 ＜8.0 kcal/mol 的 21 bp Grik2靶向導引更有可能有效；而 ＞9.5 kcal/mol 的標靶打開能預測值在一些實施例中不太有利(圖1J 及 1K)。 雙股形成的能量
然後查詢相同的 Grik2mRNA/siRNA導引序列對以判定雙股形成的預測能量。具有較高報導基因減弱的導引與具有較高雙股形成能量 (接近於零) 的導引之間存在明顯的相關性。高雙股形成的能量範圍為 -42.7 至 -12.92 kcal/mol，平均值為 35.28 kcal/mol，且中位數為 -35.41 kcal/mol。具有 ＞66% KD 的導引 siRNA 序列平均具有更高的雙股形成能量(平均值=-33.5 kcal/mol，中位數=-33.3 kcal/mol)，而具有 ＜66% KD 的導引 siRNA 序列平均具有更低的雙股形成能量(平均值=-36.4 kcal/mol，中位數=-37.5 kcal/mol)。對比於雙股形成能量更高/更接近於零之雙股的形成，更大負值/更低的雙股形成能量表明給定的雙股的形成更為有利。因此，雙股形成的有利程度與 siRNA 導引序列減弱的效率之間存在負相關，這似乎有悖常理。然而，這表明在判定雙股分離(其之反向)而不是雙股形成的有利性時，雙股形成的能量更為關鍵。在此情況下，我們將此數值稱為雙股穩定性測量；數值越低，雙股越穩定。如果標靶：siRNA 雙股不太穩定，則由於 siRNA 持續合成能力增加，因此從減弱的角度來看 siRNA 可能更有效。也就是說，其更有可能脫離不太穩定的雙股，以便靶向不同 mRNA 分子上的相同區域，此直接關係到它的效率。相反地，如果標靶：siRNA 雙股太穩定，則 siRNA (與RISC結合) 不太可能脫離其標靶。
具有雙股形成能量預測值 ＞ -35 kcal/mol 的 19 bp Grik2 靶向導引更有可能有效；而 ＞-39 kcal/mol 的雙股形成能量預測值在一些實施例中不太有利。具有雙股形成能量預測值 ＞ -38 kcal/mol 的 21 bp Grik2 靶向導引更可能有效；而 ＞ -41 kcal/mol 的雙股形成能量預測值在一些實施例中不太有利(圖1L 及圖 1M)。 結合總能量
最後，判定每個 siRNA/miRNA 導引序列與標靶 GluK2 mRNA 的結合總能量。對於 19 bp siRNA 導引，結合總能量範圍為 -35.06 至 -9.89 kcal/mol，平均值為 -25.93 kcal/mol，中位數為 -26.29 kcal/mol。雖然具有 ＞66% KD 或 ＜66% KD 的 siRNA 的結合總能量平均值沒有顯著差異 (-25.65 vs -26.25 kcal/mol)，但中位數差異更大 (-25.35 vs -26.66 kcal/mol)，幾乎沒有具有 ＞66% Kd 的 siRNA 導引具有小於 -30 kcal/mol 的總結合能(37 個中僅有 1 個，與 ＜66% KD 導引相比，其中 61 個導引中有 13 個具有結合總能量小於 -30 kcal/mol)。因此，這暗示著在某些情況下小於 -30 kcal/mol 的結合總能量表明給定的導引序列更有可能有效地減弱標靶 mRNA。
結合總能量預測值 ＞-24 kcal/mol 的 19 bp Grik2 靶向導引更有可能是有效的；而 ＞-28 kcal/mol 的結合總能量預測值在一些實施例中不太有利。結合總能量預測值 ＞ -27 kcal/mol 的 21 bp Grik2 靶向導引更有可能是有效的；而 ＞-30.5 kcal/mol 的結合總能量預測值在一些實施例中不太有利 (圖1N 及 1O)。 鳥嘌呤 - 胞嘧啶 (GC) 含量 (% GC)
最後，判定 siRNA 或 miRNA 導引序列的 GC 含量。在報導基因檢定中導致 ＞66% KD 的 siRNA 導引組別比具有 ＜66% KD 的其餘導引 (平均值 = 56.4%，中位數=57.9%) 具有更低的平均GC含量 (平均值 = 46.23%，中位數 = 47.4%)。因此，低 GC 含量是導引效率的有力預測因子，相反地，高 GC 含量是導引效率的禁忌因子。促成這種相關性的因子可能很複雜，並且與許多熱力學參數有關。首先，導引序列的低 GC 含量亦表明 siRNA 雙股 (或前驅物 shRNA 或 miRNA 莖) 的乘客序列 (passenger sequence) 包含低百分比的 Gc；因此，這種雙股更容易分離成導引股及乘客股，由於富含來自 A:U 配對的「較弱」鹼基配對的貢獻，使導引股「成熟」。mRNA 中的標靶序列與靶向它的導引序列相關；因此，若給定的導引具有低 GC 含量，則標靶序列即使不是完美地互補，也可能具有低 GC 含量。如果在該標靶序列的位點處預測到顯著的二級結構，則需要更少的能量來“打開”以便被反義 RNA 獲取，我們也判定這是 siRNA 靶向的有利參數。siRNA：標靶雙股中較低的 GC 含量亦導致雙股的穩定性較低(藉由雙股形成的能量測量)，同樣是由於缺乏更穩定的 G：C 鹼基配對，允許反義 RNA 脫離以允許靶向額外的 mRNA分子。總之，siRNA 的 GC 含量與此處描述的其他熱力學參數直接相關，並且可能與上述建立的相關性密不可分。
GC 含量值 ＜50% 的 19 bp Grik2 靶向導引更有可能是有效的；而 ＞60% 的 GC 含量值在一些實施例中不太有利。GC 含量值 ＜50% 的 21 bp Grik2 靶向導引更有可能是有效的；然而，＞55% 的GC含量值在一些實施例中不太有利 (圖1P 及圖 1Q)。 實例 2 ：在鼠類、囓齒動物及人類模型系統中驗證 Grik2 靶向反義寡核苷酸構築體的抗癲癇作用 材料與方法
對於使用小鼠的協議，實驗得到國家衛生醫學研究所 (INSERM) 動物護理及使用委員會的批准，並得到 Ministère de l'Education Nationale、de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche 的授權符合歐洲共同體理事會指令 (2010/63/UE)。 鼠類海馬迴器官型切片
如前所述，使用 McIlwain 組織切碎機從野生型瑞士小鼠 (P9-10) 製備器官型海馬迴切片培養物 (350 µm) (Peret et al.2014)。切片被放置在含有 1 mL 以下培養基的培養皿內的網狀插入物 (Millipore) 上：MEM 50%、HS 25%、HBSS 25%、HEPES 15 mM、葡萄糖 6.5 mg/mL及胰島素0.1 mg/mL。每兩到三天更換一次培養基，並將切片保存在 37℃/5% CO2 的培養箱中。 電生理記錄
將小鼠器官型切片單獨轉移到保持在 30-32℃ 的記錄室中，並連續灌注 (2-3 mL/min) 充氧的 (95% O 2及5% CO2) ACSF (生理條件)，或含 GABA A受體拮抗劑的 ACSF、加巴嗪 (gabazine) (5 µM；過度興奮狀態)、或含 5 µM 加巴嗪及 50 µM 4-AP 的 ACSF (高度過度興奮狀態)。局部場電位 (LFP) 記錄是用放置在 DG 之顆粒細胞層中的單極鎳鉻合金線進行的。使用 DAM-80 放大器 (低通濾波器：0.1 赫茲；高通濾波器：3 赫茲；World Precision Instruments, Sarasota, FL)。使用 Digidata 1440A (Molecular Devices) 將數據數位化 (20 kHz) 到電腦，並使用 Clampex 10.1 軟體 (PClamp，Molecular Devices) 獲取。使用 Clampfit 9.2 (Pclamp) 及 MiniAnalysis 6.0.1 (Synaptosoft, Decatur, GA) 離線分析訊號。 藉由 RNAi 設計及生產靶向 Grik2 mRNA 的病毒載體
使用 Smart selection design (Dharmacon) (Birmingham et. al., 2007) 設計 RNAi (例如，ASO) 序列。比較了使用 miR-30 結構作為 shRNA 或作為 miRNA 的 RNAi 序列的效率。使用在 CAG (SEQ ID NO:737) 啟動子或 hSyn 啟動子控制下編碼人類 Grik2反義序列 (G9；SEQ ID NO: 68) 的慢病毒載體或 AAV9 載體。 神經元細胞培養
Gestant 雌性大鼠購自 Janvier Labs (Saint-Berthevin, France)，並生產野生型小鼠。根據歐洲倫理規則對動物進行處理及安樂死。如Kaech S. & Banker G (Culturing hippocampal neurons.Nat. Protoc.1, 2406–2415 (2006)) 所述製備 E18 Sprague-Dawley 大鼠胚胎分離的海馬迴神經元或 P0 小鼠分離的皮質神經元。將神經元以每孔 500,000 個細胞的濃度接種在塗覆 1 mg/mL 聚離胺酸的六孔盤中兩小時。神經元在條件性 Neurobasal 培養基 (大鼠) 或 Neurobasal-A 培養基 (小鼠) 中培養，並補充 2 mM L-麩醯胺酸及 1 NeuroCult SM1 Neuronal supplement (STEMCELL Technologies)，每三至四天更新一次。平板接種後二至三天，移除一半的培養基並添加病毒構築體及 MOI 75000 四小時。在減少的培養基體積中與病毒構築體接觸四個小時後，添加補充 Ara-C (3.4 mM) 的新培養基以防止神經膠質細胞生長。 西方墨點法
感染十天後，將DIV 12-13 鼠類或大鼠神經元培養物在冰冷的 PBS 中沖洗，然後刮入 150 µ 裂解緩衝液 (50 mM HEPES、100 mM NaCl、1%甘油、0.5%正十二烷基 β- D-麥芽糖苷，pH 7.2；抗蛋白酶及抗磷酸酶)。將勻漿在低溫下保持在轉輪上 2 小時，並在 4℃ 下以8000g離心 15 分鐘以去除細胞碎屑。總蛋白質含量藉由 Pierce BCA 蛋白質檢定套組 (23225，ThermoScientific) 在各條件下以 10 µL 一式兩份進行定量。
將每種條件下 10 µg 的蛋白質加載至 SDS-PAGE 凝膠上進行西方墨點法分析。加載預染蛋白質梯度物 (26619，ThermoScientific) 以控制重量。樣品在 4-15% 梯度預製凝膠 (Bio-Rad) 上分離，然後轉移至硝酸纖維素膜上進行免疫墨點分析。在在以含 5% 牛血清白蛋白 (BSA；Sigma) 之 Tris 緩衝食鹽水 Tween-20 (TBST；28 mM Tris、136.7 mM NaCl、0.05% Tween-20，pH 7.4) 阻斷後，將樣品在室溫下於震盪器平台上保持一小時。根據梯度物在 72Kda 標記之高度處將膜切成兩部分。每個部分在 4℃ 下培育隔夜，將各自的一級抗體在阻斷試劑 (37516，ThermoScientific；抗體溶液可重複使用 3 次) 中稀釋。將具有重蛋白 (72-250 kDa) 的膜部分與以 1：2000 稀釋的兔抗 GluK2 抗體 (04-921；Merck) 培育，並將具有較輕蛋白 (17-72 kDa) 的膜與鼠類抗　肌動蛋白抗體 (A5316；Sigma) 一起培育。次日，將膜以 TBST 洗滌 3 次，每次 15 分鐘。將在驢 (Jackson ImmunoResearch) 中產生的合適的 HRP 複合二級抗體按 1：5000 稀釋於 5% BSA–TBST 中，並在室溫下與膜一起培育一小時。在 ChemiDoc Touch 系統 (Bio-Rad) 上藉由清晰度 Western ECL 之化學螢光 (170-5060, Bio-Rad) 檢測標靶蛋白。GluK2 的理論分子量為 103 kDa。為了定量，將每條泳道的化學螢光信號強度標準化為對照條件，然後標準化為肌動蛋白條帶。 器官型切片的病毒轉導
對於鼠類切片的轉導，將 1 μL 含慢病毒或 AAV 構築體的 PBS 直接滴加於 DIV0 的切片上，用於鼠類切片。Lv-對照的病毒力價為 8×10 8基因體拷貝 (GC)/mL，LV-G9-shRNA 為 7.9×10 8GC/mL，LV-G9-miRNA 為 3.0×10 9GC/mL，AAV9-G9-miRNA 為 2.8×10 13GC/mL，AAV9-GFP-GC 為 9.0×10 12。 免疫標記
對於 Prox1 及 GFP 免疫染色，固定切片，然後在室溫下在 0.5% Triton 中含 5% 正常山羊血清 (NGS) 之封閉溶液中透化 (0.5% Triton) 一小時。然後將切片與多株兔抗 Prox1 抗體 (Millipore) 以 1:2000 在 5% NGS 中培育，並與多株雞抗 EGFP (Abcam，Cambridge，UK；RRID：AB-300798) 以 1:1000 在 0.5% Triton 中於 4℃ 隔夜。將切片在二級抗體Alexa488 (Invitrogen 1:500) 中培育兩個小時，然後在 Fluoromount (Thermo Fisher) 中蓋上蓋玻片。使用 10X/0.3NA 及 20X/0.8NA 物鏡的 LSM800 Zeiss 共聚焦顯微鏡採集螢光影像。使用 NIH ImageJ 軟體處理影像。 統計分析
所有值均以平均值 ±SEM 的形式給出，除非另有說明。使用 Graphpad Prism 7 (GraphPad Software, La Jolla, CA) 進行統計分析。Shapiro-Wilk 檢定用於判定資料的常態性。Student t 檢定 (配對及未配對，雙尾) 用於比較常態分佈的資料組。Mann-Whitney 檢定 (未配對資料，雙尾) 及 Wilcoxon Signed Rank 檢定 (配對資料) 用於非常態分佈資料。為了比較累積分佈，使用 Kolmogorov-Smirnoff 檢定。對於多個組的比較，使用單因子及雙因子變異數分析檢定。顯著性程度設定為 p＜0.05。組測量值表示為平均值 ±SEM；誤差線亦表示 SEM。 結果 藉由 RNA 干擾下調 GluK2 的病毒載體的設計及驗證
為了進一步證實 GluK2/GluK5 KAR 在腦切片中癲癇樣放電 (ED) 產生中的特定角色，開發了一種病毒介導的RNA干擾 (RNAi) 策略來下調含有 GluK2/GluK5 之 KAR 的程度。
使用智能選擇設計 (Smart selection design) 設計幾個針對人類 Grik2mRNA 的導引 RNA 序列 (Birmingham et al.Nature Methods 9:2068-78, 2007)。最初的實驗允許鑑定一個 RNAi 序列 (G9；SEQ ID NO: 68) 可能能夠下調神經元中 GluK2 的表現。首先使用 U6 啟動子控制下的 shRNA 評估此 RNAi 序列的功效，及使用 hSyn1 啟動子控制下的人類 miR-30 結構評估 miRNA。這些構築體藉由 LV 或 AAV9 載體 (圖 2A 至圖 2D)遞送，並藉由西方免疫墨點法在大鼠海馬迴神經元及大鼠海馬迴神經元中進行測試。這些實驗中使用的慢病毒載體及 AAV9 載體的實例在下表 12 中描述： 表 12 ：慢病毒載體及 AAV9 載體構築的描述
ID 構建體 質體 ID 啟動子 標籤 病毒力價 GC/mL
LV-控制/加擾 (圖 2A) LV.hSyn1.eGFP CM845 hSyn (SEQ ID NO: 682) eGFP 8E+08   
LV-U6-G9/LV-G9-shRNA (shRNA：圖 2B) LV.hSyn1.TdTomato.U6.shRNAi#h CM946 hSyn (SEQ ID NO: 683) 用於 TdTomato；U6 (SEQ ID NO: 772) 用於 shRNA TdTomato 7.9E+08   
LV-hSyn-G9/LV-G9-miRNA (miRNA：圖 2C) LV.hSyn1.TdTomato.miRNAi#h CM962 hSyn (SEQ ID NO: 683) TdTomato 3.0E+09   
AAV9-GFP-GC AAV9.hSyn.EGFP_miR30.Scramble N/A hSyn (SEQ ID NO: 682) eGFP 9E+12   
AAV-G9-miRNA AAV9.hSyn.miR30.miRNAi#h N/A hSyn (SEQ ID NO: 683) N/A 2.8E+13   
感染十天後，將 GluK2 蛋白的總量標準化為肌動蛋白，並與加擾對照構造 (LV: TTTGTGAGGGTCTGGTC (SEQ ID NO: 771)；AAV9: GC (SEQ ID NO: 101)，以及 AAV-CAG (SEQ ID NO: 737)-EGFP 構建體相比確定。LV-hSyn (SEQ ID NO: 682)-EGFP 構造允許以 LV 載體估計神經元的感染率，這在鼠類器官型切片中約為 40-50% (圖 2E)。用於細胞中 AAV 介導的病毒轉導的AAV 表現匣的例示性示意圖顯示於圖 2G。觀察到反義序列 G9 (SEQ ID NO: 68) 有效降低總 GluK2 蛋白的程度，作為shRNA，作為 miRNA 以及在 LV 載體及AAV9 載體中 (圖 2F)。在大鼠海馬迴培養物(未顯示)中，編碼抗 Grik2mRNA 序列(G9；SEQ ID NO: 68) 的不同病毒構築體顯著降低了 GluK2 蛋白的程度，而 LV-加擾(SEQ ID NO: 771) 顯示並未顯著降低。在大鼠海馬迴神經元(圖 2H)中，編碼抗 Grik2序列(G9；SEQ ID NO: 68) 的不同病毒構築體顯著降低了 GluK2 蛋白的程度，而 LV-加擾(SEQ ID NO: 771) 顯示並未顯著降低。
編碼抗 Grik2序列的其他幾種病毒載體(G9 (SEQ ID NO: 68); GI (SEQ ID NO: 77); XY (SEQ ID NO: 83); Y9 (SEQ ID NO: 88); GG (SEQ ID NO: 91)，及一個陰性對照序列(GC；UAAUGUUAGUCAUGUCCACcg；SEQ ID NO: 101)測試了它們在鼠類初代皮質神經元中減弱GluK2蛋白表現的能力(圖2I)。在DIV3以7.5×10 4的感染多重性的編碼抗 Grik2序列之病毒載體轉導培養的皮質神經元，每個構築體以一式三份進行測試。轉導後10天裂解細胞。以下之表13提供對圖2I中顯示的資料進行的統計分析的總結。所有反義構築體都表現出GluK2蛋白程度的統計學顯著降低，而對照序列並未產生顯著的減弱。 表 13. 各種抗 Grik2 ASO 序列在減弱 GluK2 蛋白表現上之功效的比較統計分析。
治療條件 平均 GluK2 程度 GluK2 程度範圍 統計顯著性程度 P 值
G9 (SEQ ID NO: 68) 29.91 14.89 至 44.94 **** ＜ 0.0001
GI (SEQ ID NO: 77) 39.07 24.05 至 54.10 **** ＜ 0.0001
XY (SEQ ID NO: 83) 27.87 12.59 至 43.15 **** ＜ 0.0001
Y9 (SEQ ID NO: 88) 29.61 14.58 至 44.63 **** ＜ 0.0001
GG (SEQ ID NO: 91) 18.47 3.868 至 33.08 ** 0.0073
GC (SEQ ID NO: 101) -8.327 -25.65 至 9.000 n.s. 0.6425
在旨在評估 Grik2mRNA於內源性表現細胞中表現的一組獨立實驗中，將誘導性富潛能幹細胞(iPSC)衍生的麩胺酸神經元(iCell® GlutaNeurons – FCDI)以編碼五種 Grik2mRNA反義寡核苷酸中之一者的質體轉染(G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、Y9 (SEQ ID NO: 88)、XY (SEQ ID NO: 83) 或 MU (SEQ ID NO: 96)) 中之一者或加擾對照序列 (GC; SEQ ID NO: 101)，在摻入基於脂質之轉染試劑的hSyn 啟動子的調節控制下。使用2：1及4：1比例的DNA：基於脂質的轉染試劑來比較轉染效率。TaqMan TM單基因偵測(single-plex)即時定量聚合酶連鎖反應(RT-qPCR)用於量化在384孔盤中於GlutaNeurons中的 Grik2減弱的程度，轉染後重複三次。GlutaNeurons以17,500個細胞/孔 (17.5k c/w) 的密度接種。將 Grik2mRNA表現標準化為GAPDH信號。編碼 Grik2反義構築體的質體轉染顯示在5天後對於構築體以4：1的DNA與脂質試劑的比率顯著降低GlutaNeurons中的 Grik2mRNA表現，該構築體包含G9(SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77) 及 Y9 (SEQ ID NO: 88) (圖2J)。這些發現證實 Grik2反義寡核苷酸在內源性表現 Grik2基因的細胞中有效減弱 Grik2mRNA表現。 GluK2 減弱抑制鼠類器官型海馬迴切片中的癲癇樣活動
為了確認AAV9構築體在標靶細胞中的表現，在以AAV9-加擾-eGFP載體轉導的鼠類海馬迴切片上進行Prospero Homeobox 1 (Prox1；Millipore)及綠色螢光蛋白(GFP)免疫組織化學。事實上，在DG神經元中觀察到Prox1及GFP的廣泛共同標記(圖3A)，表明AAV9載體可有效地轉導鼠類DG神經元並表現感興趣的多核苷酸。在產生過度興奮性的細胞外介質中，測試編碼 Grik2反義序列(G9，SEQ ID NO: 68)的LV或AAV構築體在作為shRNA或miRNA於減少記錄於鼠類海馬迴器官型切片中的ED頻率的有效性(圖3B中所示的例示性細胞外電壓軌跡)(參見方法)，如前所述(Peret et al., 2014)。LV-hSyn (SEQ ID NO: 682)--G9-miRNA (SEQ ID NO: 68)強烈降低ED頻率，當相較於對照條件(V-hSyn (SEQ ID NOQ ID NO: 682)-加擾；SEQ ID NO: 771) (0.041 ± 0.006 Hz，使用LV-G9-miRNA，n=24；0.066 ± 0.009 Hz，使用LV-hSyn (SEQ ID No: 682)-加擾 (SEQ ID NO: 771)，n= 12，p =0.0246，Mann-Whitney 檢定；圖3C)。接下來，測試了具有 AAV 的構築體，因為這些病毒載體通常被選擇用於人類基因治療。在這些實驗中使用AAV9血清型。AAV9-hSyn (SEQ ID NO: 683)-G9 (SEQ ID NO: 68)有效降低 ED 的頻率，當相較於對照條件(AAV9-hSyn (SEQ ID NO: 682)-GC; SEQ ID NO: 101) (0.025 ± 0.007 Hz，使用AAV9-G9-miRNA，n=18；0.061 ± 0.007 Hz，使用AAV9-GFP-GC，n= 32，p=0.0004，單因子ANOVA；圖3C)。
測試了編碼各種抗 Grik2ASO序列的其他AAV9構築體在鼠類器官型切片中抑制ED的能力。簡而言之，編碼各種不同抗 Grik2ASO序列的AAV9載體在DIV0以9×10 9基因體拷貝/mL的病毒力價轉導至野生型鼠類器官型切片(參見方法)中。在DIV10-11進行含有5 µM加巴嗪的過度可被激發之介質中的電生理記錄。在測試的五個(全部五個)構築體中觀察到在去抑制的器官型切片製備中產生的ED抑制(即G9 (SEQ ID NO: 76)、XY (SEQ ID NO: 83)、GI (SEQ ID NO: 477)、Y9 (SEQ ID NO: 88)、及GG (SEQ ID NO: 91；圖3D)。下表14提供圖3D中所示資料的統計分析總結。 表 14 ：編碼抗 Grik2 RNA 序列的 AAV9 載體在抑制鼠類器官型腦切片癲癇樣活動中的功效的比較統計分析。
   AAV9- 對照 AAV9-GFP-GC (SEQ ID NO: 101) AAV9-G9 (SEQ ID NO: 68) AAV9-XY (SEQ ID NO: 83) AAV-GI (SEQ ID NO: 77) AAV9-Y9 (SEQ ID NO: 88) AAV9-GG (SEQ ID NO.91)
均值 0.07655 0.06116 0.02529 0.02459 0.03352 0.04183 0.04207
SEM 0.0127 0.007364 0.006768 0.00324 0.005286 0.005991 0.004087
樣品大小 11 32 18 19 20 18 15
杜恩氏 (Dunn) 多重比較檢定 與AAV9-GFP-GC相比。
P 值 ＞0.9999 N/A 0.0004 0.0008 0.0478 0.7569 ＞0.9999
實例 3 ：在顳葉癲癇之小鼠模型中 Grik2 靶向反義構築體的活體內功效 方法與材料
為了評估 Grik2靶向ASO藥劑的活體內功效，將TLE之毛果芸香鹼誘導模型用於小鼠並結合病毒編碼的加擾序列(GC；SEQ ID NO: 101) 在 hSyn 啟動子的控制下(SEQ ID NO: 682)，或病毒編碼的抗 Grik2ASO藥劑(G9；SEQ ID NO: 68) 在 hSyn 啟動子的控制下(SEQ ID NO: 683)。在第0天(D0)，給小鼠雙側海馬迴內注射毛果芸香鹼至背側(1 mL/半球)及腹側(1 mL/半球；共4 mL/小鼠)以誘導癲癇持續狀態。然後給於小鼠3-4週以允許發生海馬迴路的病理生理組織再生。在注射病毒編碼的ASO藥劑(D60)前7天，對小鼠進行行為評估。如本文所討論，TLE病因學的神經解剖學基礎是海馬迴，這是一個以其在記憶及學習中起關鍵作用而聞名的大腦區域。為了評估將 Grik2靶向ASO藥劑投予至海馬迴中對學習及記憶的影響，首先在新物體識別(NOR)任務中測試了10隻經毛果芸香鹼處理的小鼠識別新物體及熟悉物體的能力。NOR任務的基本結構包括在第一時段期間向小鼠展示兩個相似的物體，並允許小鼠自由探索及自我熟悉這兩個物體。隨著小鼠對這些物體的熟悉，探索這些以前新奇物體的傾向就會減弱。在第二時段開始之前，其中一個物體被新物體替換，並再次允許小鼠探索這兩個物體。通常，探索新物體的延遲為識別記憶提供了代理，亦即，與熟悉的物體相比，小鼠探索新物體的延遲更短。初始行為評估(D67)後7天，小鼠接受雙側海馬迴內注射9×10 12基因體拷貝/mL的AAV載體，該載體編碼加擾對照序列(GC；SEQ ID NO: 101)，或為在 hSyn 啟動子(SEQ ID NO: 682) 或抗 Grik2序列 (G9; SEQ ID NO: 68) 在 hSyn 啟動子的控制下(SEQ ID NO: 683)。下表15中描述上述ASO編碼載體的詳細訊息。 表 15 ：研究中使用的反義構築體的詳細訊息
構築體 ID 基因體含量 原始力價 (GC/mL) 體積 GC 數 / 腦
G9 hSyn.miR30.G9 (SEQ ID NO: 68) 9E+12 1 µL × 4 3.6E+10
GC hSyn.GFP.miR30.GC (SEQ ID NO: 101) 9E+12 1 µL × 4 3.6E+10
在接受病毒構築體(D82)注射後7天，小鼠再次接受NOR任務。注射後NOR評估(D89) 7天後，在小鼠海馬迴內植入腦波圖(EEG)電極，並記錄從D96至D103的五天癲癇發作。由於COVID-19，錄音不再繼續。電圖癲癇發作定義為EEG振幅至少為EEG基線兩倍且持續時間至少為6秒的陣發性事件。 結果
被診斷患有TLE的患者經常表現出與癲癇發作相關的其他合併症，例如學習及記憶缺陷等。為了判定是否藉由投予施用病毒編碼的 Grik2-靶向反義構築體抑制 Grik2在活體內的表現，在注射反義構築體之前及之後對以用促驚厥的毛果芸香鹼預處理的小鼠進行了NOR任務(圖4A)。由鑑別指數(DI)量測，該指數量測在測試及訓練階段期間探索兩個物體所花費的時間與行進的總距離之間的差異，這也是探索新穎或熟悉物體之傾向的代理，隨後以編碼加擾對照序列(GC；SEQ ID NO: 101) 的AAV載體處理的對照小鼠與後來以編碼抗Grik2序列之AAV載體處理的小鼠表現相似(G9；SEQ ID NO: 76；圖 4B)。在病毒載體注射後，與對照小鼠相比，以抗 Grik2構築體處理的小鼠表現出對新物體與熟悉物體的更好辨別力。類似地，在載體注射之前，對照小鼠及後來以抗 Grik2序列處理的小鼠在探索熟悉及新奇的物體時行進了相似的距離。在病毒載體注射後，對照小鼠(即，注射編碼GC之病毒載體的小鼠；SEQ ID NO: 101) 相比，以抗 Grik2構築體 (G9；SEQ ID NO: 68) 處理的小鼠顯示減少旅行時間，這表明參與運動性探索的傾向降低，且探索新物體的傾向增加 (圖4C)。NOR任務資料的定量分析在以下表16及表17中提供。 表 16 ： NOR 任務資料量化總結
非癲癇 預注射 GC- 注射後 G9- 注射後
值數 15 17 9 8
平均鑑別指數 0.3558 0.1705 0.04853 0.3162
SEM 0.05569 0.05334 0.05029 0.08498
表 17 ：表 16 中資料的顯著性分析 (p 值； ANOVA)
G9- 注射後 vsGC- 注射後 p ＜ 0.05
G9- 注射後 vs 注射前 p ＜ 0.05
GC- 注射後 vs 注射前 (p ≤ 0.05)
隨後從植入海馬迴內EEG電極的小鼠身上記錄自發性電圖癲癇發作。圖4D中提供電圖癲癇發作的例示性電壓軌跡。相對於對照小鼠，以編碼Grik2靶向ASO藥劑劑的AAV載體 (G9；SEQ ID NO: 68) 處理的小鼠在5天期間內呈現出累積發作持續時間 (圖4E) 及累計發作次數 (圖4F) 顯著減少，該對照小鼠係接受加擾序列 (GC；SEQ ID NO: 101)。下表18提供上述實驗的定量總結。 表 18 ： EEG 資料的定量總結
GC G9
值數 5 6
每天平均發作次數 22.17 2.988
SEM 8.365 2.038
結合起來，這些發現表明使用病毒編碼的 Grik2靶向抑制 Grik2mRNA的表現在TLE鼠類模型中可有效減少癲癇發作頻率及持續時間。因此，抑制性 Grik2靶向ASO藥劑是治療人類患者TLE的一種有前途的治療途徑。 實例 4 ：藉由投予編碼靶向 Grik2 mRNA 之反義寡核苷酸的病毒載體治療人類個體的癲癇症
可以用本文所述之組成物治療被診斷為患有癲癇症(例如，TLE，諸如，例如mTLE或ITLE)的個體，例如人類個體(例如，兒童或成人個體)以減少以下一種或多種癲癇症狀，包括但不限於以下一種或多種(例如2種或2種以上、3種或3種以上、4種或4種以上)：(a) 癲癇發作復發的風險；(b) 減少CNS中興奮性毒性及相關的神經元細胞死亡；(c) 恢復中樞神經系統受影響區域的生理興奮-抑制平衡；(d) 減少一種或多種癲癇症狀(例如，癲癇發作的頻率、持續時間或強度、虛弱、失神、突然意識模糊、理解或產生言語困難、認知障礙、行動不便、頭暈或失去平衡或協調、麻痺及情緒失調)，及(e) 海馬迴中齒狀迴顆粒細胞的複發性苔狀纖維的病理性萌芽。治療方法可選擇地包括將患者診斷或鑑定為以本揭露的組成物治療對象的候選者。該組成物可包含靶向 Grik2mRNA或包含相同編碼的多核苷酸的核酸載體(例如，病毒載體，諸如AAV載體，例如具有選自以下任一血清型的AAV載體：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15、AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.EB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、 AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10 、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15、或AAV.HSC16或慢病毒載體)。例示性的ASO可具與SEQ ID NO:1 至 100 的任一核酸序列有不少於85% (例如，至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%或更多)的序列同一性，或它們可具有一個或多個序列SEQ ID NO: 1 至 100。此外，病毒載體(例如，AAV載體)可包含選自表9或表10中所提供之列表的表現匣，其藉由引用併入美國臨時專利申請號: 63/050,742 或圖 30 或表 9 中所述之任何一種構築體。
可藉由任何合適的方式向個體投予組成物，包括例如靜脈內、腹膜內、皮下或經皮投予，或藉由直接投予至動物的中樞神經系統(例如，立體定位、腦實質內、鞘內或腦室內注射)。可以治療有效量投予組成物，例如每位個體投予10 5、10 6、10 7、10 8、10 9、10 10、10 11、10 12、10 13、10 14、或10 15個基因體拷貝的劑量，投予10 5、10 6、10 7、10 8、10 9、10 10、10 11、10 12、10 13、或10 14Gc/kg (個體的總重)的劑量，以每克患者腦質量投予10 5, 10 6, 10 7, 10 8, 10 9, 10 10, 10 11, 10 12, 10 13, 10 14, 或10 15GC的劑量。個體的腦重量估計是從MRI腦容量測定中獲得的，該腦容量被轉換為腦質量並用於計算精確的給藥劑量。腦重量亦可使用已發布的資料庫根據年齡範圍估計。藥劑可以每兩個月投予一次、每月一次、每兩週一次或至少每週一次或更多次(例如，每週1、2、3、4、5、6或7次或更多次)。組成物可與第二治療方式組合投予，例如第二治療劑(例如，抗癲癇藥)、手術介入(例如，手術切除、放射外科手術、伽馬刀或雷射消融)、迷走神經刺激、深部腦刺激或跨顱磁刺激。
組成物可以足以減少以下一種或多種(例如，2種或2種以上、3種或3種以上、4種或4種以上)的量投予個體：(a) 癲癇發作復發的風險；(b) 減少CNS中興奮性毒性及相關的神經元細胞死亡；(c) 恢復中樞神經系統受影響區域的生理興奮-抑制平衡；(d) 減少一種或多種癲癇症狀(例如，癲癇發作的頻率、持續時間或強度、虛弱、失神、突然意識模糊、理解或產生言語困難、認知障礙、行動不便、頭暈或失去平衡或協調、麻痺及情緒失調)，及(e) 海馬迴中齒狀迴顆粒細胞的複發性苔狀纖維的病理性萌芽10%或更多(例如，10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多)。可使用標準方法評估上面列出的癲癇症狀，諸如神經學檢查、腦波圖、腦磁圖、CT掃描、PET掃描、fMRI掃描、錄像及視覺觀察。可比較投予組成物之前及之後的癲癇症狀測量值以評價治療的功效。上述癲癇症狀減輕的發現表明該組成物已成功治療個體的癲癇症。 實例 5 ：使用 微小 RNA 支架設計靶向 Grik2 mRNA 的反義表現構築體
基於先前描述的來自實施例1A及實施例1B中所述之siRNA篩選的選擇標準(圖6A-6E)，設計了額外的構築體，併入其他所述的導引A-miR-30支架(S1)。這些額外的導引序列的一個子集被併入額外的miRNA「支架」(包含來自內源性miRNA的5'側翼區域、環序列及3'側翼區域)，以改善成熟miRNA表現及加工(S2 = E-miR-30支架；S3 = E-miR-155 支架；S4 = E-miR-218-1支架；S5 = E-miR-124-3支架)。這個更大的表達 miRNA的質體組，在hSyn 啟動子(SEQ ID NO: 790)的控制下，被轉染至誘導性富潛能幹細胞(iPSC)衍生的麩胺酸神經元(GlutaNeurons)中，並藉由qPCR評估它們降低 Grik2mRNA程度的能力。當與未轉染的細胞(虛線)相比並使用兩個的中位數絕對偏差(MAD)來識別功能性構築體(虛線)時，大多數構築體被判定為功能性的(即，它們表現出低於MAD的減弱 Grik2mRNA) (圖5)。測試的反義序列包括G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80)、GU (SEQ ID NO: 96)、TO (SEQ ID NO: 14)、TK (SEQ ID NO: 74)、TH (SEQ ID NO: 22)、CQ (SEQ ID NO: 35)、XU (SEQ ID NO: 51)、XY (SEQ ID NO: 83)、Y9 (SEQ ID NO: 88)、YA (SEQ ID NO: 63)、GG (SEQ ID NO: 91)、G8 (SEQ ID NO: 92)、ME (SEQ ID NO: 69) 及 MD (SEQ ID NO: 70)。其中，GI (SEQ ID NO: 77)-S2 (SEQ ID NO: 798)、MW (SEQ ID NO: 80)-S4 (SEQ ID NO: 799)、MW-S5 (SEQ ID NO: 800) 及 G9 (SEQ ID NO: 68)-S5 (SEQ ID NO: 801)被發現可以最大程度地減弱 Grik2mRNA，因此被確定為最具功能性的構築體(即20%或更高的減弱)。
由於以下原因，使用編碼單一miRNA的質體製備的AAV載體可能會導致AAV包裝不當。首先，pri-miRNA 序列為短 (＜200 個鹼基)，並且，取決於啟動子長度，設計具有控制單一 miRNA 表現的單個啟動子的轉殖基因匣，可能導致 AAV 基因體明顯短於 AAV 最大包裝容量 (~4.8 kb)。因此，如果預期的全基因體長度為 ＜2.4 kb (AAV 包裝容量的一半)，則單個殼體可能會加載多於一個載體。這可藉由聚合酶通讀 (read-through) 來介導，而無需適當的核酸內切酶切口來從而產生 AAV 基因體二聚體 (或三聚體)，如果它們的長度合適，則可以將經包裝到 AAV 殼體中。這隨後在 AAV 載體顆粒群中引入顯著的異質性，這使得藥物產品的製造及表徵變得更加困難。
其次，由於包含 miRNA 髮夾，基於 shRNA 及 miRNA 的轉殖基因本身具有顯著的二級結構。已顯示，AAV基因體內的這些內部二級結構可在AAV基因體複製及包裝期間充當「假的」ITR，導致不希望的截斷事件及包含完整及部分載體混合物的AAV載體顆粒非均一群體。
我們測試幾種構築體產生正確包裝之AAV的能力。在這些構築體的設計中實施的這些策略克服了上述AAV基因體包裝不當的挑戰。
產生了編碼多種不同長度及形式的合成miRNA的AAV載體(圖6A-6E)，萃取基因體並藉由鹼性凝膠電泳評估以評估基因體長度及完整性(圖7)。由編碼單一啟動子及單一miRNA匣的質體所產生的載體製備物的基因體含量(預期長度：1.5 kb)被發現由單一(1.5 kb)、雙重(3.0 kb)及三重(4.5 kb)包裝的基因體的混合物組成，表明啟動子-miRNA轉基因匣的短的長度允許包裝單體、二聚體及三聚體基因體，只有57%的載體是所需的單體(藉由密度測定法，表19)。 表 19 ：單一包裝之載體基因體的百分比作為基因體長度的函數
構建體 單一基因體長度 (kb) 單一包裝之全長基因體的估計百分比
pCis-hSyn (SEQ ID NO: 790)-G9 (SEQ ID NO: 68).miR30(S1) 1.5 57
pCis-C1ql2 (SEQ ID NO: 791)-hSyn-G9.miR30(S1) 2.8 97
pCis-scAAV9-FLIP-hSyn-G9.mir30(S1) 2.6 65
pCis-scAAV9-hSyn-G9.mir30(S1) 2.6 56
pCis-hSyn-(G9) 3.miR30(S1) 2.3 30
pCis-hSyn-miRNA1-miRNA2-miRNA3.miR30(S1) 2.3 30
當第二個啟動子添加至第一啟動子上游時(產生串聯啟動子並將全長基因體長度擴展至2.9kb，略多於AAV包裝容量的一半，幾乎所有載體製備基因體都是全長的(97%)。包含miRNA髮夾不會在這兩種基因體形式中導入截斷事件，因為包裝的基因體長度都是單體全長形式的倍數。
增加有效基因體長度的一種方法是藉由生產具有雙股、自互補基因體的AAV，從而使載體的有效長度加倍。這是藉由導入突變體ITR (mITR) 實現的，在本例中為5' ITR。評估兩個scAAV載體(每個都有單一啟動子及單一miRNA)的基因體完整性：一個具有與野生型(wt) ITR相鄰的啟動子，另一個具有與mITR相鄰的啟動子。用於每個定向的大多數載體被發現是全長的(分別為2.6kb 65%及56%)；然而，有證據表明發生重大的基因體截斷事件，導致較小分子量的基因體片段，以及可能由部分二聚體基因體組成的較大分子量基因體(例如，一個全長基因體 + 一個部分截斷的片段)。一個不太顯著的~5.2 kb種類也很明顯，證明全長二聚體scAAV基因體也是存在的。
另一種增加基因體長度同時也增加miRNA表現的方法是導入額外的miRNA基序(單一miRNA的多個拷貝，多個miRNA的單一拷貝，或這些的組合)；多個miRNA的表現，產生不同的成熟、功能性miRNA，也導入了靶向給定mRNA遠端區域的潛力。測試兩種具有串聯miRNA的構築體：一種具有G9 (SEQ ID NO: 68)-S1的三個拷貝，另一種具有G9-S1、GI (SEQ ID NO: 77)-S1及MU (SEQ ID NO: 96)-S1各一個拷貝，每個都產生2.2kb的預期全長基因體中(圖7)。由於這些基因體的包裝容量達不到AAV的一半以上，因此有證據表明存在雙重包裝，只有30%的基因體群體是所需的單體全長基因體。此外，檢測到許多部分基因體，其長度暗示著是個別miRNA匣側翼序列中同源序列之間的重組事件，因為所有三個匣都包含S1支架，從而將顯著的異質性導入整個基因體群體。這些發現表明，將額外序列導入單一miRNA表現構築體以使載體長度更接近最大載體容量可減少由此產生的基因體異質性，並更可靠地產生全長載體。 實例 6 ：靶向 Grik2 mRNA 的雙反義表現構築體單獨包裝在 AAV9 載體中
基於實施例5中的上述發現，此設置中AAV基因體群體的同質性由長度以及ssAAV形式的使用驅動。為了建構滿足這些要求的構築體，同時避免串聯相似序列的 miRNA 的陷阱，採用兩個啟動子、兩個miRNA匣策略。在此形式中，一個啟動子，在此例示為hSyn (SEQ ID NO: 790)，在一個支架中驅動單一miRNA的表現，終止於一個polyA序列，隨後是第二啟動子，此處例示為CaMKII，驅動另一個miRNA在不同支架中的表現，終止於第二個polyA序列。
這種方法最大限度地減少基因體內的序列同源性，並產生足夠長的基因體，以避免包裝二聚或三聚基因體(~3.7 kb，完全符合全長、單獨包裝的AAV的長度要求)。根據圖7所示的質體篩選結果，使用頂部「命中」(DMTPV1-4)的獨特miRNA支架的組合製成四個此類「雙重構築體」。
DMTPV1從5'至3'包含一個5' ITR序列(SEQ ID NO: 746)、hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790)、E-miR-124-3 5' 側翼序列 (SEQ ID NO: 768)、與 G9 之反義序列實質上互補的有義隨從股序列 (SEQ ID NO: 68)、E-miR-124-3 環序列 (SEQ ID NO: 770)、G9 之反義引導序列、E-miR-124-3 3' 側翼序列 (SEQ ID NO: 769)，牛生長激素(BGH) polyA序列(SEQ ID NO: 793)、CaMKII 啟動子序列 (SEQ ID NO: 802)、E-miR-30 5' 側翼序列 (SEQ ID NO: 759)、與 GI 互補的有義隨從股序列 (SEQ ID NO: 77)、E-miR-30 環序列 (SEQ ID NO: 761)、GI 之反義引導序列 (SEQ ID NO: 77)、E-miR-30 3' 側翼序列 (SEQ ID NO: 760)，兔β-珠蛋白(RBG) polyA序列(SEQ ID NO: 792) 及 3' ITR 序列 (SEQ ID NO: 748)(圖8A)。
DMTPV2 從 5' 至 3' 包含一個 5' ITR 序列(SEQ ID NO: 746)、hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790)、E-miR-124-3 5' 側翼序列 (SEQ ID NO: 768)、與 G9 之反義序列實質上互補的有義隨從股序列 (SEQ ID NO: 68)、E-miR-124-3 環序列 (SEQ ID NO: 770)、G9 之反義引導序列、E-miR-124-3 3' 側翼序列 (SEQ ID NO: 769)、BGH polyA 序列 (SEQ ID NO: 793)、CaMKII 啟動子序列 (SEQ ID NO: 802)、E-miR-218 5' 側翼序列 (SEQ ID NO: 765)、與 MW 互補的有義隨從股序列 (SEQ ID NO: 80)、E-miR-218 環序列 (SEQ ID NO: 767)、MW 之反義引導序列 (SEQ ID NO: 80)、E-miR-218 3' 側翼序列 (SEQ ID NO: 766)、RBG polyA 序列 (SEQ ID NO: 792) 及 3' ITR 序列 (SEQ ID NO: 748)(圖 8B)。
DMTPV3從5'至3'包含一個5' ITR序列(SEQ ID NO: 746)、hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790)、E-miR-30 5' 側翼序列 (SEQ ID NO: 759)、與 GI 互補的有義隨從股序列 (SEQ ID NO: 77)、E-miR-30 環序列 (SEQ ID NO: 761)、GI 之反義引導序列 (SEQ ID NO: 77)、E-miR-30 3' 側翼序列 (SEQ ID NO: 760)、BGH polyA 序列 (SEQ ID NO: 793)、CaMKII 啟動子序列 (SEQ ID NO: 802)、E-miR-124-3 5' 側翼序列 (SEQ ID NO: 768)、與 G9 之反義序列實質上互補的有義隨從股序列 (SEQ ID NO: 68)、E-miR-124-3 環序列 (SEQ ID NO: 770)、G9 之反義引導序列、E-miR-124-3 3' 側翼序列 (SEQ ID NO: 769)、RBG polyA 序列 (SEQ ID NO: 792) 及 3' ITR 序列 (SEQ ID NO: 748)(圖8C)。
DMTPV4 從 5' 至 3' 包含一個 5' ITR 序列(SEQ ID NO: 746)、hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790)、E-miR-30 5' 側翼序列 (SEQ ID NO: 759)、與 GI 互補的有義隨從股序列 (SEQ ID NO: 77)、E-miR-30 環序列 (SEQ ID NO: 761)、GI 之反義引導序列 (SEQ ID NO: 77)、E-miR-30 3' 側翼序列 (SEQ ID NO: 760)、BGH polyA 序列 (SEQ ID NO: 793)、CaMKII 啟動子序列 (SEQ ID NO: 802)、E-miR-124-3 5' 側翼序列 (SEQ ID NO: 768)、與 MW 之反義序列實質上互補的有義隨從股序列 (SEQ ID NO: 80)、E-miR-124-3 環序列 (SEQ ID NO: 770)、MW 之反義引導序列 (SEQ ID NO: 80)、E-miR-124-3 3' 側翼序列 (SEQ ID NO: 769)、RBG polyA 序列 (SEQ ID NO: 792) 及 3' ITR 序列 (SEQ ID NO: 748)(圖8D)。
產生這些雙重構築體作為AAV9載體，並評估兩個啟動子、兩個miRNA匣策略對基因體完整性的影響。當與兩個單一啟動子、單一miRNA載體(全長 = 1.5 kb，顯示二聚體及三聚體包裝的證據)相比時，這些雙構築體載體的基因體含量顯示為同質的，正如預期全長大小為~3.7 kb時存在單一條帶所證明的那樣(圖9A及圖9B)。因此，導入第二啟動子及第二miRNA匣是增加AAV基因體長度的有效方法，這樣的基因體被包裝為單體，同時保持基因體完整性及避免截斷事件並允許表現多個miRNA提高靶向效率及總miRNA表現的目標。 實例 7 ：使用兩種不同的抗 Grik2 miRNA 序列組合之 Grik2 mRNA 減弱的活體外功效
我們首先測試兩種不同的miRNA導引，當在相同載體系統中表現或作為兩個單獨的載體表現時，是否可以有效(如果不等同)介導 Grik2表現的減弱。選擇四種質體構築體組成雙構築體載體(基於圖7中的發現)。雙構築體載體的miRNA成分在GlutaNeurons中單獨轉染或彼此組合轉染(保持轉染的質體總量恆定)，並藉由qPCR測量 Grik2mRNA程度(圖10)。當一起轉染時，抗 Grik2miRNA的組合(均在突觸蛋白啟動子的控制下)能夠介導強大的 Grik2mRNA減弱，支持使用表現不止一種針對 Grik2的獨特導引的載體。
然後，我們測試了抗 Grik2miRNA編碼載體製劑的能力，這些載體製劑包含具有單一啟動子(hSyn)的不同的單一miRNA匣，以抑制癲癇樣活動，如下所示： 小鼠海馬迴器官切片：
如前所述，使用McIlwain組織切碎器從WT Swiss小鼠(P9-P10)製備器官切片(Peret et al.2014)。切片被置於含有1 mL以下培養基之培養皿內的網狀插入物(Millipore)上：MEM 50%、HS 25%、HBSS 25%、HEPES 15 mM、葡萄糖6.5 mg/mL及胰島素 0.1 mg/mL。每2-3天更換一次培養基，並將切片保存在37℃/5% CO 2的培養箱中。將毛果芸香鹼(0.5 µM)在5 DIV添加至培養基中，並在7 DIV去除；切片用於從9 DIV至11 DIV的實驗。 器官切片的病毒感染
對於小鼠器官切片的感染，將含有AAV9構築體的1 µL培養基(磷酸鹽緩衝食鹽水)直接滴加至DIV0的切片上。 電生理記錄
將小鼠器官切片個別轉移至保持在30-32℃的記錄室中，並在存在5 µM加巴嗪的情況下，以含氧(95% O 2及 5% CO 2) ACSF連續灌注(2-3 mL/min)；ACSF包含(以mM為單位)：NaCl、3.5 KCl、1.2 NaH 2PO 4、26 NaHCO 3、1.3 MgCl 2、2.0 CaCl 2、及10 葡萄糖(pH ~7.4)( Sigma-Aldrich)。局部場電位(LFP)記錄是用放置在齒狀回之顆粒細胞層中的單極鎳鉻合金線進行的。DAM-80放大器用於記錄(低濾波器，0.1 Hz；高通量濾波器，3 KHz；World Precision Instruments, Sarasota, FL)；使用Digidata 1440A (Molecular Devices)將資料數位化(20 kHz)至電腦，並使用Clampex 10.1軟體(PClamp，Molecular Devices)獲取。使用Clampfit 9.2 (PClamp)及MiniAnalysis 6.0.1 (Synaptosoft, Decatur, GA)離線分析訊號。 統計
所有數值均以平均值±SEM的形式給出。使用GraphPad Prism (GraphPad軟體5.01)進行統計分析。 測試構築體： G9 、 GI 、 G9+GI
測試的載體G9及GI (參見下表20)對應於在hSyn啟動子下由AAV9病毒載體遞送的miRNA序列。對照載體GC包括GFP並加擾由在hSyn啟動子控制下的AAV9病毒載體遞送之miRNA 序列(GC，SEQ ID NO: 101)。 表 20 ：切片電生理學實驗的載體細節
病毒 ＃ 基因體內容 原始力價 (GC/mL) 體積 / 切片 /mL 最終力價 (GC/mL)
GC hSyn.GFP.miR30.scr2 9E+12 1μL 9E+9
G9 hSyn.miR30.hu1010 9E+12 1μL 9E+9
GI hSyn.miR30.amiR38 6.50E+12 1μL 6.50E+9
G9 + GI hSyn.miR30.hu1010 + hSyn.miR30.amiR38    4.5E+12 + 4.5 E+12 1μL 9E+9
G9及GI編碼結構，當混合(等份，與單獨遞送者相同的總載體拷貝)並應用於小鼠器官切片時，顯示將癲癇樣活動減少到至少與每個載體個別製備相當的程度(圖11及下表21及22)。 表 21 ：切片電生理資料匯總
GC G9 GI G9 + GI
切片數 32 39 27 16
癲癇樣放電的平均 # 0.06116 0.02377 0.02989 0.02008
SEM 0.007364 0.0037 0.004403 0.002089
表 22 ：使用 ANOVA 對表 21 中的資料進行統計分析
分組比較 P 值
G9 vs. GC p ＜ 0.0001
GI vs GC p ＜ 0.001
G9+GI vs GC p ＜ 0.0001
然後在人類iPSC衍生的GlutaNeurons中評估雙miRNA AAV9載體介導 Grik2mRNA減弱的能力。將細胞以17,500個細胞/孔的密度接種至預塗覆PEI及層連結蛋白的384孔盤中，培養11天，以AAV載體以3×10 5GC/細胞的MOI進行轉導，並轉導後8天收穫用於qPCR分析。與以AAV9.null載體轉導的細胞(AAV9包含不產生RNA的全長基因組，黑條帶)相比，並使用2的中位數絕對偏差(MAD)來識別功能性構築體(虛線，值 = 0.9)，判定了雙AAV9構築體(檢查條帶)介導顯著的 Grik2mRNA減弱，至少是相當的程度，若不是更高的程度，則在此時間點與這個MOI相比，它們的單一構築體組件分開(hSyn組件=灰色條帶，CaMKII組件=白色條帶)(圖12)。 實例 8 ： Grik2 mRNA 靶向單 miRNA 及雙 miRNA AAV9 表現構築體在毛果芸香鹼誘導的顳葉癲癇鼠類模型中的活體內功效
我們使用鼠類毛果芸香鹼誘導的TLE 模型來評估 Grik2mRNA靶向雙miRNA AAV 表現載體在活體內結合誘導癲癇持續狀態後投予各種表現構築體的功效。 材料與方法 倫理
所有實驗均經法國國家醫藥衛生研究院(INSERM) 動物照護及使用委員會批准，並根據歐洲共同體理事會指令 (2010/63/UE)經當地倫理委員會評估後獲得國家教育部、高等研究與研究部授權(協議編號 APAFIS#9896-201605301121497v11)。 慢性癲癇小鼠
使用雄性Swiss小鼠進行實驗。小鼠在室溫 (20-22ºC) 下保持 12 小時光/暗循環，隨意獲取食物及水。腹膜內給予毛果芸香鹼 (300-350 mg/kg) 前 30 分鐘，皮下(s.c.)給予小鼠(30-40 g)東莨菪鹼(1 mg/kg)。使用斜線上升方案，動物被給予300 mg/kg 的初始劑量，然後每30分鐘減半劑量，直到出現癲癇發作。WT小鼠在進入癲癇持續狀態(SE)之前通常經歷至少兩次癲癇發作。第一次癲癇發作後10分鐘給予咖啡因(40 mg/kg)。癲癇持續狀態 (SE) 發作後 1 小時給予二氮平(Diazepam) (10 mg/kg)。 AAV 注射
癲癇小鼠(SE後＞ 2個月)在異氟醚麻醉下麻醉(5%用於誘導，2%用於維持，在100% O 2下)。使用加熱墊保持體溫，並將它們放置在立體定位框架中。在局部施用利多卡因(2%)的情況下，鑽四個孔將AAV雙側注射到海馬迴的背側及腹側齒狀回(AP -1.8 mm、ML ±1 mm、DV - 2 mm 及 AP - 3.3 mm，ML ± 2.3 mm，DV - 2.5 mm)。每次注射都使用漢彌爾頓(Hamilton)注射器。延遲5分鐘讓腦組織滑過插管後，緩慢注入體積 = 1.0 µL/注射部位 × 4 個注射部位的含有AAV的溶液(速率：0.2 µL/分鐘)。輸注後，將注射器留在原處另外5分鐘，以防止溶液沿注射器軌道回流。在恢復期間，動物在24小時及48小時後，皮下給予給動物皮下注射5 mg/kg卡普芬(carprofen) (Rimadyl®)。 自發活動
在AAV注射前1週及注射後2週評估非癲癇及癲癇小鼠(SE後 ＞ 2個月)的運動。在實驗前1天將小鼠轉移到行為分析室以適應環境；小鼠在9:00-18:00光照/黑暗循環中保持在室溫(20-22ºC)，隨意獲取食物及水。此後，所有與測試動物接觸過的材料都用醋酸清洗，以防止嗅覺線索。首先，通過開放空間測試測試自發探索行為。簡而言之，將小鼠放入 50 × 50 × 50 cm藍色聚氯乙烯盒的中心10分鐘，並使用連接到跟踪軟體EthoVision Color (Noldus，The Netherlands)的相機記錄軌跡；分析小鼠在5分鐘探索期間的速度及總距離。 EEG
癲癇小鼠(SE後2個月以上)在AAV注射後3週植入一個深度線電極；如上所述，手術是在異氟醚麻醉下進行的。電極被立體定位到齒狀回(DG) (來自前囟的Paxinos及Watson坐標：AP -2.55 mm，ML +1.65 mm，DV -2.25 mm)。放置在小腦上的額外螺釘用作接地電極。電極及螺釘用牙科黏合劑固定在顱骨上。在恢復期間，動物在24小時及48小時後，皮下給予給動物皮下注射5 mg/kg卡普芬(carprofen) (Rimadyl®)。使用遙測系統(Data Sciences International, St. Paul, MN)每天24小時監測EEG(放大(1000X)，以0.16–97 Hz通過濾波，以500 Hz採集) 5天。海馬迴內EEG跡線表示插入DG的電極與位於小腦上方的電極之間的電位差。 統計
所有數值均以平均值±SEM的形式給出。使用 Graphpad Prism 7 (GraphPad Software, La Jolla, CA) 進行統計分析。對於組間比較，藉由Mann-Whitney檢定分析原始數據。對於多組比較，藉由單因子變異數檢定 (one-way ANOVA test)分析原始數據。顯著性程度設定為p ＜ 0.05。*p＜ 0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。 結果 測試項目
被測載體 G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)對應於在 hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790) 下由 AAV9 病毒載體遞送的 miRNA 序列。GC (SEQ ID NO: 101)及AAV9.GFP對應控制載體；GC及AAV9.GFP分別包括GFP及加擾miRNA序列，以及GFP序列，它們由AAV9病毒載體在hSyn啟動子下遞送(參見下表23)。 表 23 ： miRNA 單一構築體的詳細訊息
載體 ID 基因體含量 原始力價 (GC/mL) 體積 GC 數 / 腦
G9 hSyn (SEQ ID NO: 790).miR30.G9 (SEQ ID NO: 68) 9E+12 1μL x 4 3.6E+10
GI hSyn.miR30.GI (SEQ ID NO: 77) 6.5E+12 1μL x 4 2.6E+10
GC hSyn.GFP.miR30.GC (SEQ ID NO: 101) 9E+12 1μL x 4 3.6E+10
AAV9.GFP hSyn.GFP 5.11E+13 1μL x 4 3.6E+10
評估 G9 及 GI miRNA 構築體的功效
評估了G9及GI對運動過度、癲癇行為標誌物及慢性癲癇小鼠(癲癇持續狀態後＞2個月)自發性複發性癲癇發作的療效。在這組實驗中，GC被用作對照載體。 運動過度
G9及GI編碼載體表現出朝向與非癲癇小鼠相似程度之運動過度的顯著減少(參見圖13A及圖13B)。於對照載體GC沒有觀察到顯著變化(見下表24)。 表 24 ：開放空間測試的總移動距離
非癲癇 GC 前 GC 後 G9 前 G9 後 GI 前 GI 後
小鼠數量 20 11 11 8 8 8 8
平均移動距離 (cm) 3085 6450 6945 5789 4183 6730 4618
標準均值誤差 135.4 595.4 658.6 393.6 243.3 430.6 265.4
EEG
與GC編碼構築體、對照載體相比，G9及GI編碼構築體展現對癲癇發作的抑制(參見下圖14及表25)。 表 25 ：每天的癲癇發作次數
GC G9 GI
小鼠數量 5 6 5
均值 22.17 2.988 3.426
標準均值誤差 8.365 2.038 1.256
G9 編碼 AAV9 構築體的劑量反應
在慢性癲癇小鼠(SE後 ＞ 2個月)中使用AAV9表現載體中編碼的G9進行劑量反應測試。不同稀釋度下的G9劑量反應的功效(見下表26)在運動過度、癲癇的行為標誌物及自發性複發性癲癇發作上進行了評估。在這組實驗中，AAV9-GC被用作對照載體。 表 26 ：此研究中使用的 miRNA 構築體的詳細信息
載體 # 基因體含量 原始力價 (GC/mL) 體積 GC 數 / 腦
G9 (SEQ ID NO: 68) hSyn (SEQ ID NO: 790).miR30.G9 9E+12 1μL x 4 3.6E+10
G9/10 hSyn.miR30.G9 9E+11 1μL x 4 3.6E+9
G9/100 hSyn.miR30.G9 9E+10 1μL x 4 3.6E+8
G9/1000 hSyn.miR30.G9 9E+9 1μL x 4 3.6E+7
GC hSyn.GFP.mir30.GC 9E+12 1μL x 4 3.6E+10
運動過度
G9表現出劑量反應功效；我們觀察到G9及G9/10的功效相似，而G9/1000的功效在注射前後與GC相比有所下降(參見下圖15及表27)。 表 27 ：總移動距離
  GC 前 GC 後 G9 前 G9 後 G9/ 10 前 G9/ 10 後 G9/ 100 前 G9/ 100 後 前 - G9/1000 G9/ 1000 後
小鼠數量 9 9 8 8 5 5 5 5 5 5
平均距離 (cm) 6294 6676 5789 4183 5862 4015 6553 5154 6551 6522
SEM 595.4 658.6 393.6 243.3 441.9 312.9 162.9 378.5 636.3 831.7
EEG
初始數據暗示小鼠中G9編碼構築體對癲癇發作的劑量依賴性抑制(參見下圖16及表28)。 表 28 ：每天的癲癇發作次數
G9 G9/10 G9/100 G9/1000
小鼠數量 6 4 2 2
均值 2.988 2.01 4.78 11
SEM 2.038 1.356 0.62 5
雙 miRNA AAV9 表現構築體
為了判定 Grik2mRNA靶向雙miRNA AAV表現載體在活體內的功效，採用鼠類毛果芸香鹼誘導的TLE模型，並在誘導癲癇發作狀態後結合施用各種單一siRNA及雙miRNA AAV表現構築體。
實驗的一般結構如下。首先，通過全身給藥毛果芸香鹼在小鼠中誘導癲癇持續狀態，隨後用二氮平終止。給小鼠大約一周的時間來恢復。在接下來的三週內，監測毛果芸香鹼處理的小鼠的癲癇發作發展，直到它們表現出穩定、自發的癲癇發作復發(從毛果芸香鹼治療開始約＞2個月)。一旦達到此基準，小鼠就會在癲癇發作復發後的第一週內在開放空間中進行運動測試。在第2-3週期間，用多種單一siRNA或雙miRNA AAV表現載體之一者處理小鼠。單一siRNA表現載體包括加擾對照siRNA序列(GC，SEQ ID NO: 101)，為兩個 Grik2靶向序列之一(G9，SEQ ID NO: 68；或GI，SEQ ID NO: 77)，或為在hSyn 啟動子(SEQ ID NO:790)控制下的GFP轉基因。790) 下由 AAV9 病毒載體遞送的 miRNA 序列。雙miRNA表現構築體包括DSPTV1-4構築體之一者，如上所述並詳細地示於下表29中。 表 29 ： miRNA 雙構築體的詳細訊息
載體 # 基因體含量 原始力價 (GC/mL) 體積 GC 數 / 腦
DMTPV1 (SEQ ID NO: 785) hSyn.G9.E-miR-124-3.CaMKII.GI.E-miR-30 1.21E+14 1μL x 4 3.6E+10
DMTPV2 (SEQ ID NO: 786) hSyn.G9.E-miR-124-3.CaMKII.MW.E-miR-218-1 1.29E+14 1μL x 4 3.6E+10
DMTPV3 (SEQ ID NO: 787) hSyn.GI.E-miR-30.CaMKII.G9.E-miR-124-3 1.45E+14 1μL x 4 3.6E+10
DMTPV4 (SEQ ID NO: 788) hSyn.GI.E-miR-30.CaMKII.MW.E-miR-124-3 1.62E+14 1μL x 4 3.6E+10
治療後約15天後，再次評估用毛果芸香鹼及幾種siRNA表現構築體之一者治療的小鼠的運動能力，使用開放空間試驗。DSPTV3及DSPTV4構築體表現出對毛果芸香鹼誘導的小鼠運動過度的顯著抑制(下圖17及表30)。AAV9-GFP用作對照載體。 表 30 ：總移動距離
非癲癇 AAV9-GFP- 前 AAV9-GFP- 後 DMTPV1- 前 DMTPV1- 後 DMTPV2- 前 DMTPV2- 後 DMTPV3- 前 DMTPV3- 後 DMTPV4- 前 DMTPV4- 後
小鼠數量 20 6 6 5 5 6 6 6 6 6 6
平均移動距離(cm) 3085 6956 6630 7877 6860 7755 7857 7208 3249 6866 4304
標準均值誤差 135.4 727.6 506.3 461.5 653.4 751.2 576.2 420.6 228.9 650.3 403.5
癲癇發作與運動過度之間的相關性
為了得出關於 Grik2靶向、AAV編碼的miRNA構築體的抗癲癇效果的結論，通過在小鼠的開放空間試驗中測量運動過度，分析了癲癇發作次數與運動過度處理後之間的相關性。基於異常值分析ROUT (Q = 1.000%)，排除了癲癇發作的極值。在上述實驗條件下，每天的癲癇發作次數與實驗小鼠在開放空間測試中行走的總距離之間存在顯著相關性(R 2= 0.7388，p ＜ 0.0001) (圖18)。因此，運動過度的測量可以用作小鼠癲癇狀態的指標，從而能夠以快速及人道的方法來測試 Grik2靶向反義構築體的抗癲癇效果。 結論
此等數據表明，使用攜帶靶向 Grik2mRNA 的RNAi序列的AAV載體， Grik2基因沉默是預防TLE中自發性慢性癲癇發作的有效策略。 實例 9 ：編碼雙重抗 Grik2 構築體的載體在小鼠活體外及活體內功效
在旨在評估含有抗Grik2序列的雙miRNA編碼載體在內源性表現 Grik2的細胞中之功效的第一組實驗中，以下列轉導 GlutaNeurons：編碼單一抗 Grik2miRNA序列G9 (SEQ ID NO: 68) 或 GI (SEQ ID NO: 77)、雙抗 Grik2序列編碼載體DMTPV1 (SEQ ID NO: 785)、DMTPV2 (SEQ ID NO: 786)、DMTPV3 (SEQ ID NO: 787) 或 DMTPV4 (SEQ ID NO: 788)，或摻入基於脂質的轉染試劑中的RNA-null載體。TaqMan TM單基因偵測(single-plex)即時定量聚合酶連鎖反應(RT-qPCR)用於量化在384孔盤中於GlutaNeurons中的 Grik2減弱的程度，轉染後重複三次。GlutaNeurons以17,500個細胞/孔 (17.5k c/w) 的密度接種。將 Grik2mRNA表現標準化為GAPDH信號。對於含有G9、GI及DMTPV1-4的構築體，編碼 Grik2反義構築體的AAV9載體的轉導顯示在5天後顯著降低GlutaNeurons中的 Grik2mRNA表現(圖19)。這些發現證實靶向 Grik2的雙miRNA編碼載體在內源性表現 Grik2基因的細胞中減弱 Grik2mRNA表現方面的有效性。
在第二組實驗中，在以以下處理的小鼠中以開放空間測試來測試自發探索行為：編碼G9之載體(SEQ ID NO: 68)、DMTPV3 (SEQ ID NO: 787)、AAV9.hSyn.GFP、或在未處理小鼠中歷史對照。簡而言之，將小鼠放入 50 × 50 × 50 cm藍色聚氯乙烯盒的中心10分鐘，並使用連接到跟踪軟體EthoVision Color (Noldus，The Netherlands)的相機記錄軌跡；分析小鼠在10分鐘探索期間的總距離。以G9及DMTPV3處理的小鼠表現出過度運動活動的顯著降低(p ＜ 0.01) (圖20)。
在下表31中所示的四種劑量中測試了DMTPV3對於小鼠過度運動活動之影響的劑量依賴性。 表 31： 此研究中使用的 miRNA 構築體的詳細信息
載體 # 基因體含量 體積 最終病毒濃度
DMTPV3 hSyn-GI-AmiR30a-CAMKII-G9-miR124-3 1μL x 4 3.6E+10
DMTPV3/10 hSyn-GI-AmiR30a-CAMKII-G9-miR124-3 1μL x 4 3.6E+9
DMTPV3/100 hSyn-GI-AmiR30a-CAMKII-G9-miR124-3 1μL x 4 3.6E+8
DMTPV3/1000 hSyn-GI-AmiR30a-CAMKII-G9-miR124-3 1μL x 4 3.6E+7
對照 AAV9.hSyn.GFP 1μL x 4 3.6E+10
DMTPV3及DMTPV3/10載體在投予小鼠後顯著降低運動過度活動(p ＜ 0.05；Mann-Whitney檢定；圖21)，從而顯示雙反義載體對小鼠運動活動的劑量依賴性影響。
還在毛果芸香鹼處理的小鼠中測試了編碼靶向Grik2 mRNA的單一及雙miRNA的載體的抗癲癇作用，其使用編碼單一G9 (SEQ ID NO: 68) 及GI (SEQ ID NO: 77) 反義序列的載體，雙 miRNA DMTPV3 (SEQ ID NO: 787) 載體，或編碼加擾序列GC (SEQ ID NO: 101) 的對照載體或 AAV9.hSyn.GFP。以G9、GI及 DMTPV3治療的小鼠顯示每天經歷的癲癇發作次數顯著減少，以DMTPV3治療顯示比單獨使用G9或GI顯著更大的減少(圖22)。這些發現證實靶向 Grik2mRNA的雙miRNA構築體在抑制小鼠癲癇發作方面表現出高效力。 實例 10 ：在人類癲癇患者的器官型海馬切片中使用 Grik2 mRNA 靶向 AAV 編碼的反義構築體減弱 GluK2 蛋白表現
為了評估編碼 Grik2mRNA 靶向反義寡核苷酸的 AAV9 表現載體在減弱人類腦組織中 GluK2 蛋白表現方面的功效，從七名人類 TLE 患者 (H7、H8、H10、H13、52、CBR15 及 H14) 獲得海馬迴器官切片。下表32中提供患者訊息 。 表 32 ：患者訊息
患者代碼 年齡、性別
H7 未知
H8 未知
H10 13, F
H13 未知
H14 未知
52 47, M
CBR15 11, M
首先，從單一人類TLE患者獲得海馬迴器官切片，在ACSF中活體外培養11-12天，並用AAV9.GC (SEQ ID NO: 101).GFP處理。隨後對切片進行Prox1免疫染色以識別齒狀顆粒細胞，GFP以識別用載體轉導的細胞，並疊加以判定Prox1及GFP訊號之間的重疊程度。超過50%的齒狀顆粒細胞以GFP標記，並觀察到GFP及Prox1之間的大量重疊(圖23)。此等結果表明編碼RNA寡核苷酸的AAV9載體可穩健地轉染人類齒狀顆粒細胞。
以 Grik2mRNA靶向反義構築體G9 (SEQ ID NO: 68；來自六名TLE患者的17個切片)或反義構築體GI (SEQ ID NO: 77；來自兩個TLE患者的兩個切片)處理人類器官切片。對來自載體處理的切片的蛋白質裂解物進行西方墨點法。GluK2 蛋白水平被標準化為肌動蛋白並量化。在以G9處理的五組人類海馬迴器官切片中的五組中觀察到GluK2蛋白表現的減弱(圖24)。將以G9處理的人類切片上所進行的例示性西方墨點法顯示於圖25中，與未處理的切片相比，其顯示GluK2水平降低了大約40%。 實例 11 ： Grik2 mRNA 靶向雙反義表現構築體在人類海馬迴切片中的活體外功效
使用從人類個體獲得的海馬迴器官切片在活體外測試 Grik2mRNA靶向 雙miRNA AAV表現載體的功效。 倫理
對於使用人類腦組織的實驗，所有患者都給出了書面同意，並且協議在CRB TBM/AP-HM (N° 271KAI) 的監督下獲得了INSERM (N° 2017-00031)及AP-HM (N° M17-06)的批准。 來自癲癇患者之培養的人類海馬迴切片：
人類器官型切片是通過外科手術切除四名被診斷患有耐藥性TLE的患者(11-58 歲)的海馬迴製備( Hôpital de La Timone, Marseille, France)。組織塊在低溫(2-5℃)、含氧改質人工腦脊液(mACSF)中小心地從醫院運送到實驗室；mACSF含有(以 mM 為單位)：132 膽鹼、2.5 KCl、1.25 NaH 2PO 4、25 NaHCO 3、7 MgCl 2、0.5 CaCl 2及8葡萄糖)，在生物安全櫃下使用振動切片機(Leica VT1200S)在相同溶液中製備300-400 μm厚的切片。切割後，切片在同一天記錄(急性切片)或在記錄前在活體外培養幾天(器官型切片，參見下文)。對於培養，將切片在室溫(22℃)的含氧「洗滌介質」中漂洗15分鐘；洗滌介質包含Hanks平衡鹽溶液(HBSS)，並添加了HEPES (20 mM)。添加葡萄糖(17 mM)及抗生素(1% Anti-Anti)用於電生理記錄。將器官型切片放置在6孔平盤(30 mm Transwell)中的單個細胞培養插入物(PICMORG50)上。每孔滴加培養基1 mL；培養基含有50% MEM、25%馬或人類血清、15% HBSS、2% B27、0.5%抗生素、11.8 mM葡萄糖及20 mM蔗糖。培養盤保持在 37℃/5% CO 2的培養箱中。培養基每兩天更換一次，第一週含有抗生素(Anti-Anti)。器官型切片的電生理記錄在11至15 DIV後進行。 人類器官型切片的病毒感染
對於感染，將含有AAV9構築體的PBS培養基直接添加到DIV1的人類器官型切片上。構築體GC(SEQ ID NO: 101) G9-S1 (SEQ ID NO: 775) 及 DMTPV3(SEQ ID NO: 787) 的最終病毒力價分別為 1.8E+10 GC/mL。AAV9.hSyn.GFP載體用作G9-S1及DMTPV3 實驗的對照。下表33中提供有關測試載體的詳細訊息。 表 33 ： miRNA 單一構築體及雙重構築體的詳細信息
載體 # 基因體含量 最終病毒濃度
G9-S1 (SEQ ID NO: 775) hSyn.G9-S1 1.8E+10
GC (SEQ ID NO: 101) hSyn.GFP.GC-S1 1.8E+10
DMTPV3 (SEQ ID NO: 787) hSyn-GI-AmiR30a-CAMKII-G9-miR124-3 1.8E+10
電生理記錄
人類器官型切片被單獨轉移到保持在30-32℃的記錄室中，並連續灌注(2-3 mL/min)含氧(95% O 2及5% CO 2) ACSF (生理條件)或過度興奮條件(含有5 µM加巴嗪及50 µM 4-AP的ACSF)。局部場電位(LFP)記錄是用放置在齒狀回之顆粒細胞層中的單極鎳鉻合金線進行的。LFP是用DAM-80放大器(低濾波器，0.1 Hz；高通量濾波器，3 KHz；World Precision Instruments, Sarasota, FL)；使用Digidata 1440A (Molecular Devices)將資料數位化(20 kHz)至電腦，並使用Clampex 10.1軟體(PClamp，Molecular Devices)獲取。使用Clampfit 9.2 (PClamp)及MiniAnalysis 6.0.1 (Synaptosoft, Decatur, GA)離線分析訊號。癲癇樣放電(ED)包括多單位放電的增加，LFP持續時間＞ 30 ms。 統計
所有數值均以平均值±SEM的形式給出。使用 Graphpad Prism 7 (GraphPad Software, La Jolla, CA) 進行統計分析。對於組間比較，藉由Mann-Whitney檢定分析原始數據。顯著性程度設定為p ＜ 0.05。 結果
編碼 Grik2靶向微小 RNA 序列G9-S1 (SEQ ID NO: 775)的AAV表現構築體、編碼一個加擾的對照序列的單獨的AAV構築體、GC (SEQ ID NO: 101)，以及編碼靶向 Grik2、DMTPV3的雙重miRNA構築體的第三個載體(SEQ ID NO: 787)，在生理條件下進行測試(參見方法)。首先，評估了使用超興奮溶液(參見方法)生成自發ED的網路功能；選擇對持續的自發ED做出反應的切片。然後將這些切片切換回標準生理培養基並洗滌30分鐘。在對照條件下(例如，用GC編碼構築體感染切片)，切片顯示出許多自發的複發性ED (0.3±0.11 Hz，n=6 切片；圖26A)。值得注意的是，當用G9-S1處理切片時，我們觀察到ED的抑制(大約93%；0.019±0.013 Hz，n=7個切片，p=0.0029，Mann-Whitney檢定；參見圖26B-26C，表34)。 表 34 ：癲癇樣放電 - 平均值 + SEM
GC G9-S1
切片數 6 7
均值 0.303 0.0198
SEM 0.1121 0.01355
此外，用雙反義載體DMTPV3處理人類海馬迴器官切片產生了 Grik2程度的顯著降低，如藉由qRT-PCR測量 (圖27A)。當在生理條件下(例如，在ACSF中)對切片施用時，與用AAV9.hSyn.GFP處理的切片(圖27C-27D)相比，DMTPV3產生癲癇樣放電的顯著減少(圖27B)。
因此，這些發現表明，編碼靶向 Grik2mRNA的單反義序列及雙反義序列的AAV載體對GluK2的向下調節是抑制難治性TLE患者海馬組織癲癇樣活動的有效策略。 實例 12 ：包裝之載體多重性分析
評估經由填充序列內涵物增加載體長度的影響。併入載體中的填充物(或填料)序列是一種非編碼序列，因為它在基因傳遞後明顯缺乏細胞毒性所以被選擇。去除非編碼序列中參與轉錄起始或完成的調節元件，使填充序列在轉錄活性方面呈惰性。
使用TapeStation方法，藉由電泳評估各種基因體大小的載體。根據製造商推薦的High Sensitivity (HS) D5000 ScreenTape (Agilent #5067-5592)方案，使用D5000 試劑(Agilent #5067-5593)對DNA分子進行分析。TapeStation測量雙股(ds)DNA(而不是單股(ss)DNA)，TapeStation評估依賴於兩個互補的ssAAV基因體的退火，以形成dsAAV基因體長度在鹼基對的等效近似值。編碼基因體的載體具有小於50%的AAV包裝能力，在表 35 中示例為SMSPV1 (SEQ ID NO: 818)、SMSPV2 (SEQ ID NO: 820) 及 SMSPV3(SEQ ID NO: 822)(SMSPV = Single MicroRNA Single Promoter Vector)，每個都編碼一個miRNA匣，具有1.5-1.7 kb之基因體長度，並有可能在每個殼體中包裝多個(例如2或3個)基因體。因此，只有44%-61%的來自SMSPV1、SMSPV2及SMSPV3製備物的「完整」殼體含有單一AAV基因體。添加填充序列(例如，SEQ ID NO: 815 及/或 SEQ ID NO: 816)到這些構築體中的每一個(SMSPV4 (SEQ ID NO: 804)、SMSPV5 (SEQ ID NO: 806) 及 SMSPV6(SEQ ID NO: 808)，分別)，將包含單一AAV基因體的每個載體製備物中的殼體百分比增加到72%-75%。最後，將填充序列添加到編碼兩個不同miRNA的串聯基因體 (例如，DMSPV1 (SEQ ID NO: 812)；DMSPV = Dual MicroRNA Single Promoter Vector) 導致 87% 的殼體含有單個全長 AAV 基因體 (參見表 35)。 表 35 ：具有及不具有填充序列的載體的基因體分析
構建體 SEQ ID NO 形式 基因體長度 (kb) % 單一全長基因體
SMSPV1 818 單一 miRNA 1.5 59
SMSPV4 804 單一 miRNA+填充序列 3.1 75
SMSPV2 820 單一 miRNA 1.5 61
SMSPV5 806 單一 miRNA+填充序列 3.1 77
SMSPV3 822 單一 miRNA 1.7 44
SMSPV6 808 單一 miRNA+填充序列 3.3 72
DMSPV1 812 雙miRNA+填充序列 3.45 87
實例 13 ：小鼠皮質神經元中 GluK2 表現的活體外減弱
製備來自出生後第0天(P0)-P1 C57Bl6/J小鼠的分離的皮質神經元，並以每孔5.5E+5個細胞的濃度接種在六孔盤中。接種後兩三天(活體內天數，DIV2-3)，去除一半培養基，並添加MOI 7.5E+4的病毒載體。在DIV 13，將小鼠神經元培養物裂解，裂解物用於SDS-PAGE及免疫墨點法。對於免疫染色，應用以下抗體：兔抗GluK2/3(殖株NL9 04-921；Merck-Millipore)以1：2000稀釋，小鼠抗　-肌動蛋白(A5316；Sigma)以1：5000 稀釋，用作一級抗體，及在山羊中產生的適當的800 nm螢光團結合的二級抗體(IRDye 800山羊抗小鼠Li-COR 926-32210或IRDye 800山羊抗兔Li-COR 926-32211)以1：15000稀釋用作二級抗體。藉由在Li-COR上測量800 nm處的螢光來檢測目標蛋白質。使用Empiria Studio軟體進行分析。為了量化，每條泳道的螢光信號強度通過　-肌動蛋白表現標準化，然後通過對照條件標準化。在這些實驗條件下，分別與對照載體相比下，表現構築體 DMTPV8(SEQ ID NO: 813) 及 DMSPV1 (SEQ ID NO: 812)呈現出 73±17% 及 71±4%的GluK2表現降低(平均值±S.E.M.；參見圖28)。 實例 14 ： GluK2 在顳葉癲癇小鼠模型中的 活體內減弱
使用6 至 9週齡Swiss雄性小鼠進行實驗。腹膜內給予毛果芸香鹼 (300-350 mg/kg) 前 30 分鐘，皮下 (s.c.)給予小鼠 (30-40 g) 東莨菪鹼 (1 mg/kg)。第一次癲癇發作後10分鐘給予咖啡因(40 mg/kg)。癲癇持續狀態發作一小時後給予二氮平(10 mg/kg)。對於AAV給藥，癲癇小鼠(癲癇持續狀態後＞ 2個月)在異氟醚麻醉下麻醉(5%用於誘導，2%用於維持，在100% O2下)。在局部施用利多卡因(2%)的情況下，鑽四個孔將AAV雙側注射到海馬迴的背側及腹側齒狀回(AP -1.8 mm、ML ±1 mm、DV - 2 mm 及 AP - 3.3 mm，ML ± 2.3 mm，DV - 2.5 mm)。對於每次注射，使用漢密爾頓注射器進行AAV遞送。在延遲5分鐘以使腦組織滑過插管後，緩慢注入體積 = 1.0 µL/注射部位 x 4個含有AAV的溶液注射部位(速率：0.2 µL/分鐘)。在AAV注射前一週及注射後兩週評估癲癇小鼠(癲癇持續狀態後＞ 2個月)的運動。還評估了非癲癇小鼠(野生型瑞士雄性小鼠，18-21週齡)的運動。在實驗前一天將小鼠轉移到行為分析室以適應環境；小鼠在 9:00 – 18:00光照/黑暗循環中保持在室溫(20–22℃) 下，可隨意獲取食物及水。此後，所有與測試動物接觸過的材料都用醋酸清洗，以防止嗅覺線索。首先，自發探索行為通過上述開放空間測試進行測試。簡而言之，將小鼠放入50 × 50 × 50 cm 藍色聚氯乙烯盒的中心10分鐘，並使用連接到跟踪軟體EthoVision Color(Noldus，Netherlands)的相機記錄軌跡；分析小鼠在10分鐘的自發探索過程中的速度及總距離。
用DMTPV8及DMSPV1治療小鼠導致運動過度減少，這是致癲癇行為的參考值。這種運動過度的減少是劑量依賴性的。雖然兩種劑量都顯示出對DMTPV8及DMSPV1的療效，但3.6xE+9 比3.6xE+8更為有效。於所有測試條件下，在3.6xE+9高劑量的DMSPV1具有最強的效果(圖29)。
在一組單獨的實驗中，用載體構築體 SMSPV4(SEQ ID NO: 804)、SMSPV5 (SEQ ID NO: 806) 或 SMSPV6 (SEQ ID NO: 808)處理小鼠，並以如上所述相同的方式測試運動。用這些構築體治療小鼠導致運動過度減少(致癲癇行為的參考值)，而用對照載體(CV)治療沒有任何效果(圖31)。CV 被設計用來模擬 AAV 殼體，該殼體含有不產生 mRNA 或蛋白質的基因組體，而是從 5' ITR 到 3' ITR 含有：RBG polyA (SEQ ID NO: 751)，CpG耗盡的雞β肌動蛋白內含子(SEQ ID NO: 824)，以及非編碼填充序列(SEQ ID NO: 823。上游RBG polyA序列允許與其他AAV載體進行準確的ddPCR力價比較，並消除來自5' ITR的任何潛在轉錄。用抗 Grik2構築體治療後運動過度的減少為劑量依賴性。雖然3.6xE+9及3.6xE+8這兩種劑量都顯示出對SMSPV6的效力，但3.6xE+9劑量比3.6xE+8對SMSPV4更為有效。對於SMSPV5，3.6xE+9及3.6xE+8劑量都顯示出相似的功效。在所有測試的條件下，SMSPV4在3.6xE+9的高劑量下具有最強的效果，而在3.6xE+8的低劑量下SMSPV4對運動過度沒有影響(圖31)。 其他實施例
在不脫離本揭露之範圍及精神的情況下，所述揭露的各種修飾及變化對於本領域技術人員來說將是顯而易見的。儘管已結合特定實施例描述本揭露，但應理解，所請求之揭露不應被不適當地限制於此類特定實施例。實際上，對本領域技術人員而言顯而易見的是用於執行本揭露所述模式的各種修飾旨在落入本揭示之範圍內。
其他實施例在申請專利範圍中。 參考文獻
在本案整體中，各參考資料描述了本揭露所屬的現有技術。這些參考文獻的揭露內容於此藉由引用併入本揭露中： Bahn S., Volk B., Wisden W. (1994).Kainate receptor gene expression in the developing rat brain.J. Neurosci.14 5525–5547.10.1523/JNEUROSCI.14-09-05525.1994. Boudreau Ryan L., Rodríguez-Lebrón Edgardo, Davidson Beverly L., RNAi medicine for the brain: progresses and challenges, Human Molecular Genetics, Volume 20, Issue R1, 15 April 2011, Pages R21–R27 Bouvier G., Larsen R. S., Rodríguez-Moreno A., Paulsen O., Sjostrom P. J. (2018).Towards resolving the presynaptic NMDA receptor debate.Curr.Opin.Neurobiol.51 1-7.10.1016/j.conb.2017.12.020 Crépel V, Mulle C (2015) Physiopathology of kainate receptors in epilepsy.Curr Opin Pharmacol 20:83–88; doi: 10.1016/j.coph.2014.11.012.Epub 2014 Dec 13. Englot, DJ., et al (2013) Seizure outcomes after resective surgery for extra–temporal lobe epilepsy in pediatric patients: A systematic review.J. Neurosurgery. 12(2):97-201 Fritsch B., Reis J., Gasior M., Kaminski R. M., Michael A., Rogawski M. A. (2014).Role of GluK1 kainate receptors in seizures, epileptic discharges, and epileptogenesis.J. Neurosci.34 5765-5775.10.1523/JNEUROSCI.5307-13.2014 Gabriel S, Njunting M, Pomper JK, Merschhemke M, Sanabria ERG, Eilers A, Kivi A, Zeller M, Meencke H-J, Cavalheiro E a, Heinemann U, Lehmann T-N (2004) Stimulus and potassium-induced epileptiform activity in the human dentate gyrus from patients with and without hippocampal sclerosis.J Neurosci 24:10416–10430. Gruber A., Lorenz R., Bernhart S.H., Neuböck R., Hofacker I.L (2008).The Vienna RNA Websuite.Nucleic Acids Research.36:W70-4 Hardy J. (2010).Genetic analysis of pathways to Parkinson disease.Neuron, 68(2), 201–206. doi:10.1016/j.neuron.2010.10.014 Melyan Z., Lancaster B., Wheal H. V. (2004).Metabotropic regulation of intrinsic excitability by synaptic activation of kainate receptors.J. Neurosci.24 4530-4534.10.1523/JNEUROSCI.5356-03.2004 Melyan Z., Wheal H. V., Lancaster B. (2002).Metabotropic-mediated kainate receptor regulation of isAHP and excitability in pyramidal cells.Neuron 34 107–114.10.1016/S0896-6273(02)00624-4 Mulle C., Sailer A., Pérez-Otaño I., Dickinson-Anson H., Castillo P. E., Bureau I., et al.(1998).Altered synaptic physiology and reduced susceptibility to kainate-induced seizures in GluR6-deficient mice.Nature 392 601–605. Peret A, Christie L a., Ouedraogo DW, Gorlewicz A, Epsztein J, Mulle C, Crépel V (2014) Contribution of Aberrant GluK2-Containing Kainate Receptors to Chronic Seizures in Temporal Lobe Epilepsy.Cell Rep 8:347–354. Reiner A, Arant RJ, and Isacoff EY (2012) Assembly Stoichiometry of the GluK2/GluK5 Kainate Receptor Complex.Cell Rep 1:234-240. Represa A, Le Gall La Salle G, Ben-Ari Y (1989a) Hippocampal plasticity in the kindling model of epilepsy in rats.Neurosci Lett 99:345–350. Represa A, Robain O, Tremblay E, Ben-Ari Y (1989b) Hippocampal plasticity in childhood epilepsy.Neurosci Lett 99:351-355. Rodríguez-Moreno A., Herreras O., Lerma J. (1997).Kainate receptors presynaptically downregulate GABAergic inhibition in the rat hippocampus.Neuron 19 893-901.10.1016/S0896-6273(00)80970-8. Rodríguez-Moreno A., Sihra T. S. (2007a).Kainate receptors with a metabotropic modus operandi.Trends Neurosci.30 630-637. Rodríguez-Moreno A., Sihra T. S. (2007b).Metabotropic actions of kainate receptors in the CNS.J. Neurochem.103 2121-2135. Sapru Mohan K., Yates Jonathan W., Hogan Shea, Jiang Lixin, Halter Jeremy, Bohn Martha C. (2006).Silencing of human α-synuclein in vitro and in rat brain using lentiviral-mediated RNAi.Neurology.198:382–390 Smolders I., Bortolotto Z. A., Clarke V. R., Warre R., Khan G. M., O'Neill M. J., et al.(2002).Antagonists of GLU(K5)-containing kainate receptors prevent pilocarpine-induced limbic seizures.Nat. Neurosci.5 796-804.10.1038/nn88 Sutula T, Cascino G, Cavazos J, Parada I, Ramirez L (1989) Mossy fiber synaptic reorganization in the epileptic human temporal lobe.Ann Neurol 26:321–330. Tauck DL, Nadler J V (1985) Evidence of functional mossy fiber sprouting in hippocampal formation of kainic acid-treated rats.J Neurosci 5:1016–1022 Valbuena S., Lerma J. (2016).Non-canonical signaling, the hidden life of ligand-gated ion channels.Neuron 92 316-329.10.1016/j.neuron.2016.10.016 Wang L., Bai J., and Hu Y. (2007) Identification of the RA Response Element and Transcriptional Silencer in Human alphaCaMKII Promoter. Mol. Biol. Rep. 35(1):37-44 Zinn, E., Pacouret, S., Khaychuk, V., Turunen, H. T., Carvalho, L. S., Andres-Mateos, E., … Vandenberghe, L. H. (2015).In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector.Cell reports, 12(6), 1056–1068. doi:10.1016/j.celrep.2015.07.019
圖 1A 至 1Q示出用於敲落 (KD) 細胞中 GluK2 蛋白之表現的麩胺酸離子型受體紅藻氨酸次單元 2 ( Grik2)mRNA 反義寡核苷酸 (ASO) 構建體之鑑別及評定。(圖 1A) 預測的人 Grik2mRNA 變體 1 (SEQ ID NO: 115) 的二級結構，如藉由 RNAfold (質心熵模型) 所預測。(圖 1B) 預測的多種抗 Grik2ASO 與 Grik2mRNA 結合的區域。示例性結合區域包含已鑑別的環區域 (1 = 環 1 (SEQ ID NO: 145)；2 = 環 2 (SEQ ID NO: 146)；3 = 環 3 (SEQ ID NO: 147)；4 = 環 4 (SEQ ID NO: 148)；5 = 環 5 (SEQ ID NO: 149)；6 = 環 6 (SEQ ID NO: 150)；7 = 未配對的 1 (SEQ ID NO: 159)；8 = 未配對的 2 (SEQ ID NO: 160)；9 = 環 7 (SEQ ID NO: 151)；10 = 環 8 (SEQ ID NO: 152)；11 = 環 9 (SEQ ID NO: 153)；12 = 環 10 (SEQ ID NO: 154)；13 = 未配對的 3 (SEQ ID NO: 161)；14 = 環 11 (SEQ ID NO: 155)；15 = 未配對的 4 (SEQ ID NO: 162)；16 = 未配對的 5 (SEQ ID NO: 163)；17 = 環 12 (SEQ ID NO: 156)；18 = 環 13 (SEQ ID NO: 157)；及 19 = 環 14 (SEQ ID NO: 158)) 及莖樣未配對區域 (由分別對應於 SEQ ID NO: 159 至 163 的阿拉伯數字 15 至 19 指定)。(圖 1C) 與以下內的預測結合區域對齊的抗 Grik2ASO 劑之示意圖：5' UTR (SEQ ID NO: 126；siRNA D3 (SEQ ID NO: 48)、siRNA XZ (SEQ ID NO: 54)、siRNA CY (SEQ ID NO: 43)、siRNA D1 (SEQ ID NO: 46)、siRNA GE (SEQ ID NO: 65)、siRNA CX (SEQ ID NO: 42)、siRNA Y0 (SEQ ID NO: 55)、siRNA TG (SEQ ID NO: 23)、siRNA D0 (SEQ ID NO: 45)、siRNA YB (SEQ ID NO: 67)、siRNA GF (SEQ ID NO: 64)、siRNA TD (SEQ ID NO: 26)、siRNA GH (SEQ ID NO: 66)、siRNA TE (SEQ ID NO: 25)、siRNA TJ (SEQ ID NO: 21)、siRNA TF (SEQ ID NO: 24)、siRNA YB/siSPOTR15 (SEQ ID NO: 67)、siRNA ZZ/siSPOTR16 (SEQ ID NO: 100)、siRNA GE/siSPOTR17 (SEQ ID NO: 65)、siRNA D3/siSPOTR18 (SEQ ID NO: 48)、siRNA CX/siSPOTR19 (SEQ ID NO: 42)、siRNA GF/siSPOTR20 (SEQ ID NO: 64)、siRNA GH/siSPOTR21 (SEQ ID NO: 66)、siRNA TJ/siSPOTR22 (SEQ ID NO: 21)、siRNA TG/siSPOTR23 (SEQ ID NO: 23)、siRNA TD/siSPOTR24 (SEQ ID NO: 26) 及 siRNA TF/siSPOTR25 (SEQ ID NO: 24)) 以及 Grik2mRNA (SEQ ID NO: 115) 之外顯子 1 的編碼序列 (CDS) (SEQ ID NO: 129；siRNA CK (SEQ ID NO: 29)、siRNA TC (SEQ ID NO: 28) 及 siRNA TC/siSPOTR1 (SEQ ID NO: 28))。(圖 1D) 示例性 ASO 劑 (G0; SEQ ID NO: 1) 之示意圖，其相對於 Grik2mRNA (SEQ ID NO: 115) 之外顯子 2 (SEQ ID NO: 130) 內的亦相對於已鑑別的環 1 區域 (SEQ ID NO: 145)對齊。(圖 1E) 五個示例性 ASO 序列 (GD (SEQ ID NO: 7)、MU (SEQ ID NO: 96)、MT (SEQ ID NO:99)、MS (SEQ ID NO: 99) 及 G3 (SEQ ID NO: 8)) 之示意圖，其相對於 Grik2mRNA (SEQ ID NO: 115) 的外顯子 10 (SEQ ID NO: 138) 內已鑑別的環 5 (SEQ ID NO: 149) 及環 6 (SEQ ID NO: 150) 區域對齊。(圖 1F) 示出示例性 ASO 劑 (MJ (SEQ ID NO: 89)、TH (SEQ ID NO: 22)、MI (SEQ ID NO: 90)、Y9 (SEQ ID NO: 88)、TK (SEQ ID NO: 74)、Y8 (SEQ ID NO: 87)、TI (SEQ ID NO: 76)、CU (SEQ ID NO: 39) 及 Y7 (SEQ ID NO: 62)) 之示意圖，其相對於 Grik2mRNA (SEQ ID NO: 115) 之外顯子 11 (SEQ ID NO: 139) 對齊。(圖 1G) 在雙螢光素酶報導子檢定中，各種候選 ASO 劑對 Grik2mRNA 之報導子敲落百分比 (亦見表 2)。(圖 1H) 在雙螢光素酶報導子檢定中，各種候選抗 Grik2ASO劑的非特異性螢火蟲螢光素酶 (ffluc) 減少。(圖 1I) 示出 Grik2mRNA 敲落百分比作為空對照載體的殘留 ffluc 表現的函數 (靶向與非特異性 ffluc 敲落的關係) 的散點圖。(圖 1J) 在雙螢光素酶報導子檢定中測試的所有 19 bp siRNA 的目標打開能平均值 (包含 SEM) 的條形圖，單位為 kcal/mol。資料條 (中間及右側條) 按將報導子誘導的 Gluk2 表現敲落大於 66% 的 siRNA 或將表現敲落少於 66% 的 siRNA 分開。目標打開能小於 10 kcal/mol 的富集 siRNA 簇與大於 66% 的 Gluk2 敲落相關。(圖 1K) 如雙螢光素酶報導子檢定中所測試的所有 21 bp 引導序列的目標打開能平均值 (包含 SEM) (單位為 kcal/mol) 對其 19 bp 等效物的敲落百分比的條形圖。資料條 (中間及右側條) 按將報導子誘導的 Gluk2 表現敲落大於 66% 的等效 siRNA 或將表現敲落少於 66% 的等效 siRNA 分開。目標打開能小於 9.5 kcal/mol 的富集 siRNA 簇與大於 66% 的 Gluk2 敲落相關。(圖 1L) 在螢光素酶報導子檢定中測試的所有 19 bp siRNA 的雙股形成能平均值 (包含 SEM) 的條形圖，單位為 kcal/mol。資料條從左到右表示：所有測試的 19 bp siRNA，將報導子表現敲落 ＞ 66% 的 siRNA，或將報導子表現敲落 ＜ 66% 的 siRNA。(圖 1M) 如雙螢光素酶報導子檢定中所測試的所有 21 bp 引導序列的雙股形成能平均值 (包含 SEM) (單位為 kcal/mol) 對其 19 bp 等效物的敲落百分比的條形圖。資料條 (中間及右側條) 按將報導子誘導的 Gluk2 表現敲落大於 66% 的等效 siRNA 或將表現敲落少於 66% 的等效 siRNA 分開。(圖 1N) 在螢光素酶報導子檢定中測試的所有 19 bp siRNA 的總結合能平均值 (包含 SEM) 的條形圖，單位為 kcal/mol。資料條從左到右表示：所有測試的 19 bp siRNA，將報導子表現敲落 ＞ 66% 的 siRNA，或將報導子表現敲落 ＜ 66% 的 siRNA。(圖 1O) 如雙螢光素酶報導子檢定中所測試的所有 21 bp 引導序列的總結合能平均值 (包含 SEM) (單位為 kcal/mol) 對其 19 bp 等效物的敲落百分比的條形圖。資料條 (中間，右側) 按將報導子誘導的 Gluk2 表現敲落大於 66% 的等效 siRNA 或將表現敲落少於 66% 的等效 siRNA 分開。(圖 1P) 在雙螢光素酶報導子檢定中，測試的 19 bp siRNA 中之各者被鑑別為 G 或 C 的鹼基百分比 (GC 含量) 平均值 (包含 SEM) 的條形圖。資料條從左到右表示：所有測試的 19 bp siRNA，將報導子表現敲落 ＞ 66% 的 siRNA，或將報導子表現敲落 ＜ 66% 的 siRNA。(圖 1Q) 如雙螢光素酶報導子檢定中所測試的所有 21 bp 引導序列的 GC 含量平均值 (包含 SEM) 對其 19 bp 等效物的敲落百分比的條形圖。資料條 (中間，右側) 按將報導子誘導的 Gluk2 表現敲落大於 66% 的等效 siRNA 或將表現敲落少於 66% 的等效 siRNA 分開。 圖 2A 至 2J示出藉由病毒載體媒介的 Grik2mRNA 沉默對 GluK2 敲落之驗證。(圖 2A 至 2D) 在圖 2A 至 2J 中所述之實驗中使用的示例性載體。(圖 2A) 慢病毒載體 (CM845) 的示例性慢病毒質粒圖譜，其在 hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 682) 的控制下編碼對照加擾序列 (SEQ ID NO: 771)。(圖 2B) 慢病毒載體 (CM946) 的示例性慢病毒質粒圖譜，其在 U6 啟動子 (SEQ ID NO: 772) 的控制下編碼作為 shRNA 的 Grik2反義序列 (G9; SEQ ID NO: 68)。(圖 2C) 慢病毒載體 (CM962) 的示例性慢病毒質粒圖譜，其在 hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 683) 的控制下編碼作為 miRNA 的 Grik2反義序列 (G9; SEQ ID NO: 68)。(圖 2D) AAV 載體的示例性質粒圖譜，其在 hSyn 啟動子 (pAAV-hSyn-EGFP; SEQ ID NO: 682) 的控制下編碼 GFP。(圖 2E) 用慢病毒 (LV)-人突觸蛋白啟動子(hSyn (SEQ ID NO: 682))-綠色螢光蛋白 (GFP) 質粒構建體感染的培養的大鼠海馬迴神經元的明場 (左圖) 及螢光 (右圖) 影像。在 ＞ 80% 的培養神經元中觀察到 GFP 免疫螢光。(圖 2F) 從大鼠海馬迴神經元獲得的 GluK2 蛋白及肌動蛋白之西方墨點法檢定結果，其用編碼 Grik2反義序列 (G9; SEQ ID NO: 68) 或對照序列 (SEQ ID NO: 771；在 hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 682) 的控制下) 的短髮夾 RNA (LV-U6 (SEQ ID NO: 772)-G9 (shRNA) 或微小 RNA (LV-hSyn (SEQ ID NO: 683)-G9 (miRNA) 構建體慢病毒媒介的 Grik2mRNA 之敲落後獲得。(圖 2G) 用於細胞中 AAV 媒介的病毒轉導的 AAV 表現匣之示意圖。(圖 2H) 表示 GluK2 蛋白與肌動蛋白的相對水平之條形圖，其標準化為編碼抗 Grik2ASO 序列 (G9; SEQ ID NO: 68) 或加擾控制序列 (LV: SEQ ID NO: 771; AAV: GC - SEQ ID NO: 101) 的慢病毒或 AAV9 載體感染的海馬迴神經元的對照條件下的值。(圖 2I) 示出在用不同病毒編碼的抗 Grik2ASO 序列 (G9 (SEQ ID NO: 68); GI (SEQ ID NO: 77); XY (SEQ ID NO: 83); Y9 (SEQ ID NO: 88); GG (SEQ ID NO: 91)) 及對照序列 (GC; SEQ ID NO: 101) 治療的小鼠初代皮質神經元中 GluK2 蛋白相對含量 (如西方墨點法所檢定) 的圖。(圖 2J) 示出在基於脂質轉染誘導多能幹細胞 (iPSC) 衍生的麩胺酸神經元 (GlutaNeurons) 後 5 天所測量之 Grik2mRNA 表現之倍數變化 (如藉由 RT-qPCR 所測量) 的條形圖，該等神經元以 17,500 個細胞/孔 (17.5k c/w) 的細胞密度與在 hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 683) 的調節性控制下編碼五種 Grik2mRNA 反義寡核苷酸 (G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、Y9 (SEQ ID NO: 88)、XY (SEQ ID NO: 83) 或 MU (SEQ ID NO: 96)) 中之一者或加擾對照序列 (GC; SEQ ID NO: 101)的質粒載體一起培養。 圖 3A 至 3D 示出在小鼠活體外模型中病毒編碼的抗 Grik2ASO 劑對海馬癲癇狀活動之影響。(圖 3A) 螢光圖像，示出器官型海馬腦切片，其經含有加擾序列 (SEQ ID NO: 101) 之 AAV9-hSyn (SEQ ID NO: 682)-GFP-加擾構建體感染。用 Prospero 同源匣蛋白 1 (Prox1) 抗體 (Millipore) 對切片進行免疫染色，以標記海馬迴之齒狀腦回 (DG) 細胞。(圖 3B) 從小鼠器官型海馬切片記錄的 ED 之示例性細胞外電壓軌跡。(圖 3C) 表示小鼠海馬切片中經以下感染的 ED 之頻率的條形圖：在 hSyn 啟動子 (LV 及 AAV9-GC：SEQ ID NO: 682；AAV9-hSyn-G9：SEQ ID NO: 683) 的控制下編碼作為 miRNA 構建體之抗 Grik2ASO (G9; SEQ ID NO: 68; ***, p ＜ 0.001; **, p ＜ 0.01) 或加擾對照序列 (AAV-GC (SEQ ID NO: 101)；LV-加擾 (SEQ ID NO: 771)) 的慢病毒或 AAV9 載體或AAV9-GFP 對照載體。(圖 3D) 表示小鼠器官型海馬切片中經以下處理的 ED 之頻率的條形圖：指定的 AAV9 編碼的抗 Grik2ASO 劑 (AAV9-hSyn (SEQ ID NO: 683)-G9 (SEQ ID NO: 68) – p = 0.0004; AAV9-hSyn (SEQ ID NO: 683)-XY (SEQ ID NO: 91) – p = 0.0008; AAV9-hSyn (SEQ ID NO: 683)-GI (SEQ ID NO: 85) – p = 0.0478); AAV9-hSyn (SEQ ID NO: 683)-Y9 (SEQ ID NO: 96)；及 AAV9-hSyn (SEQ ID NO: 683)-GG (SEQ ID NO: 91) 或對照加擾序列及 GFP 標籤 (AAV9-hSyn (SEQ ID NO: 682)-GFP-GC (SEQ ID NO: 101))。 圖 4A 至 4F示出 Grik2靶向 ASO 劑在顳葉癲癇 (TLE) 活體內小鼠模型中之功效。(圖 4A) 新物體識別 (NOR) 任務之實驗設計示意圖。(圖 4B) 示出經歷 NOR 任務的小鼠之鑑別指數 (DI) 的條形圖，如注射前 7 天或注射後 15 天用病毒編碼之加擾序列 (GC; SEQ ID NO: 101; AAV9-hSyn (SEQ ID NO: 682)-GFP-GC) 或抗 Grik2序列 (G9; SEQ ID NO: 68; AAV9-hSyn (SEQ ID NO: 683)-G9) 所測量。(圖 4C) 示出小鼠在 NOR 任務中之總行進距離 (cm) 的條形圖，如注射前 7 天或注射後 15 天用病毒編碼之加擾序列 (GC; SEQ ID NO: 101) 或抗 Grik2序列 (G9; SEQ ID NO: 68) 所測量。(圖 4D) 在 TLE 毛果芸香鹼模型中誘導的電圖癲癇發作的示例性電壓跡線，如從用毛果芸香鹼處理後之小鼠中所記錄。(圖 4E) 示出用以下治療的小鼠在 5 天內的累積癲癇發作持續時間 (分鐘) 之條形圖：病毒編碼的加擾對照序列 (GC; SEQ ID NO: 101; n = 3) 或病毒編碼抗 Grik2ASO 劑 (G9; SEQ ID NO: 68; n = 4)。(圖 4F) 示出用以下治療的小鼠在 5 天內的累積癲癇發作次數之條形圖：病毒編碼的加擾對照序列 (GC; SEQ ID NO: 101; n = 5) 或病毒編碼抗 Grik2ASO 劑 (G9; SEQ ID NO: 68; n = 6)。 圖 5為示出 AAV9 載體中編碼的各種 Grik2mRNA 靶向微小 RNA 構建體之敲落功效的條形圖。AAV9 載體整合 5 個微小 RNA 支架中之一者，該等支架含有 5' 側翼區域、微小 RNA 環序列及來自內源性微小 RNA 的 3' 側翼區域，包含 A-miR-30 (S1)、E-miR-30 (S2)、E -miR-155 (S3)、E-miR-218 (S4) 及 E-miR-124 (S5)。測試的反義序列為 G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、MW (SEQ ID NO: 80)、GU (SEQ ID NO: 96)、TO (SEQ ID NO: 14)、TK (SEQ ID NO: 74)、TH (SEQ ID NO: 22)、CQ (SEQ ID NO: 35)、XU (SEQ ID NO: 51)、XY (SEQ ID NO: 83)、Y9 (SEQ ID NO: 88)、YA (SEQ ID NO: 63)、GG (SEQ ID NO: 91)、G8 (SEQ ID NO: 92)、ME (SEQ ID NO: 69) 及 MD (SEQ ID NO: 70)。敲落功效表示為相對於「僅脂質」對照的 Grik2mRNA 中位數倍數變化。將該較大組之表現 miRNA 的質粒在 hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790) 的控制下轉染到誘導多能幹細胞 (iPSC) 衍生的麩胺酸神經元 (GlutaNeurons) 中，並藉由 RT-qPCR 評估它們降低 Grik2 mRNA 水平的能力。當與未轉染之細胞 (虛線) 相比並使用中位數絕對偏差 (MAD) = 2 來鑑別功能性結構 (虛線) 時，將大多數構建體判定為功能性的 (亦即，它們顯示出低於 MAD 的敲落之 Grik2mRNA)。在所有測試的構建體中，發現 GI (SEQ ID NO: 77)-S2 (SEQ ID NO: 798)、MW (SEQ ID NO: 80)-S4 (SEQ ID NO: 799)、MW-S5 (SEQ ID NO: 800) 及 G9 (SEQ ID NO: 68)-S5 (SEQ ID NO: 801) 將 Grik2mRNA 敲落至最高程度 (亦即，20% 或更大程度之敲落)。 圖 6A 至 6G示出合成 AAV9-miRNA 構建體組態之示意圖，其含有整合到 A-miR-30 (S1) 支架中的反義引導序列，該支架含有 5' 側翼區域、微小 RNA 環序列及來自內源性 miRNA 的 3' 側翼區域。構建體 1 (圖 6A) 為單 miRNA、單啟動子構建體 (SEQ ID NO: 775)，其從 5' 至 3' 含有：5' ITR 序列 (SEQ ID NO: 746)、hSyn 啟動子序列 (SEQ ID NO: 790)、miR-30 5' 側翼序列 (SEQ ID NO: 752)、與 G9 (SEQ ID NO: 68) 之抗 Grik2序列實質上互補的隨從股序列、miR-30 環序列 (SEQ ID NO: 758)、G9 之引導序列 (SEQ ID NO: 68)、miR-30 3' 側翼序列 (SEQ ID NO: 753)、兔 β-珠蛋白 (RBG) polyA 訊號 (SEQ ID NO: 792) 及 3' ITR 序列 (SEQ ID NO: 789)。構建體 2 (圖 6B) 為單 miRNA、雙啟動子構建體 (SEQ ID NO: 777)，其從 5' 至 3' 含有：5' ITR 序列 (SEQ ID NO: 746)、C1ql2 啟動子序列 (SEQ ID NO: 791)、hSyn 啟動子序列 (SEQ ID NO: 790)、miR-30 5' 側翼序列 (SEQ ID NO: 752)、與 G9 (SEQ ID NO: 68) 之抗 Grik2序列實質上互補的隨從股序列、miR-30 環序列 (SEQ ID NO: 785)、G9 之引導序列 (SEQ ID NO: 68)、miR-30 3' 側翼序列 (SEQ ID NO: 753)、RBG polyA 訊號 (SEQ ID NO: 792) 及 3' ITR 序列 (SEQ ID NO: 748)。構建體 3 (圖 6C) 為自互補之雙 miRNA (G9 的兩個拷貝，SEQ ID NO: 68)、單啟動子構建體 (SEQ ID NO: 779)，其含有在與 hSyn 啟動子(SEQ ID NO: 790) 相鄰 5' 末端 (亦即，5') 的 AAV (wt)ITR及 polyA 序列下游之突變 ITR (mITR)。構建體 4 (圖 6D；SEQ ID NO: 781) 與構建體 3 相似，不同之處在於 hSyn 啟動子(SEQ ID NO: 790) 與 mITR 相鄰，且 polyA 序列與 wtITR 相鄰。構建體 5 (SEQ ID NO: 783) 及構建體 6 (SEQ ID NO: 784) 與構建體 1 相似，不同之處在於 pre-miR 莖環結構 (5' 側翼、莖環及 3' 側翼) 連結 3 次，使得該構建體含有相同 miRNA 序列的三個拷貝 (例如，G9，SEQ ID NO: 68；構建體 5) 或不同 miRNA 序列的三個拷貝 (圖 6E；構建體 6；G9、GI (SEQ ID NO: 77)、MU (SEQ ID NO: 96))。構建體 7 (圖 6F；SEQ ID NO: 804) 為單 miRNA、單啟動子構建體，其從 5' 至 3' 含有：5' ITR 序列 (SEQ ID NO: 746)、hSyn 啟動子序列 (SEQ ID NO: 790)、miR-30 5' 側翼序列 (SEQ ID NO: 752)、與 G9 (SEQ ID NO: 68) 之抗 Grik2序列實質上互補的隨從股序列、miR-30 環序列 (SEQ ID NO: 758)、G9 之引導序列 (SEQ ID NO: 68)、miR-30 3' 側翼序列 (SEQ ID NO: 753)、RBG polyA 訊號 (SEQ ID NO: 792)、非編碼填充序列及 3' ITR 序列 (SEQ ID NO: 789)。構建體 8 (圖 6G；SEQ ID NO: 810) 為單 miRNA、單啟動子構建體，其從 5' 至 3' 含有：5' ITR 序列 (SEQ ID NO: 746)、hSyn 啟動子序列 (SEQ ID NO: 790)、E-miR-124-3 5' 側翼序列 (SEQ ID NO: 768)、與 G9 之反義序列實質上互補的有義隨從股序列 (SEQ ID NO: 68)、E-miR-124-3 環序列 (SEQ ID NO: 770)、G9 之反義引導序列、E-miR-124-3 3' 側翼序列 (SEQ ID NO: 769)、RBG polyA 訊號 (SEQ ID NO: 792)、非編碼填充序列及 3' ITR 序列 (SEQ ID NO: 789)。 圖 7為示出圖 6A 至 6E 中所述之單 miRNA 及雙 miRNA 表現構建體 (構建體 1 至 6) 的鹼性瓊脂糖凝膠電泳分析的照片。發現由編碼單個啟動子及單個 miRNA 匣的質粒所產生之載體的基因體內容物 (預期長度：1.5 kb) 係由單一 (1.5 kb)、雙重 (3.0 kb) 及三重 (4.5 kb) 包裝之基因體的混合物構成。泳道編號對應於以下載體構建體：1 = 構建體 1 (SEQ ID NO: 775)；2 = 構建體 2 (SEQ ID NO: 777)；3 = 構建體 3 (SEQ ID NO: 779)；4 = 構建體 4 (SEQ ID NO: 781)；5 = 構建體 5 (SEQ ID NO: 783)；6 = 構建體 6 (SEQ ID NO: 784)。 圖 8A 至 8G示出具有適用於 AAV 載體的雙啟動子的 AAV9 雙 miRNA 表現構建體的示意圖。圖 8A 示出雙 miRNA 雙啟動子載體 (DMTPV1) 表現構建體 (SEQ ID NO: 785)，其從 5' 至 3' 含有：5' ITR 序列 (SEQ ID NO: 746)、hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790)、E-miR-124-3 5' 側翼序列 (SEQ ID NO: 768)、與 G9 之反義序列實質上互補的有義隨從 (「P」) 股序列 (SEQ ID NO: 68)、E-miR-124-3 環序列 (SEQ ID NO: 770)、G9 之反義嚮導 (「G」) 序列、E-miR-124-3 3' 側翼序列 (SEQ ID NO: 769)、BGH polyA 序列 (SEQ ID NO: 793)、CaMKII 啟動子序列 (SEQ ID NO: 802)、E-miR-30 5' 側翼序列 (SEQ ID NO: 759)、與 GI 互補的有義隨從股序列 (SEQ ID NO: 77)、E-miR-30 環序列 (SEQ ID NO: 761)、GI 之反義引導序列 (SEQ ID NO: 77)、E-miR-30 3' 側翼序列 (SEQ ID NO: 760)、RBG polyA 序列 (SEQ ID NO: 792) 及 3' ITR 序列 (SEQ ID NO: 748)。圖 8B 示出雙 siRNA 表現構建體 (DMTPV2, SEQ ID NO: 786)，其從 5' 至 3' 含有：5' ITR 序列 (SEQ ID NO: 746)、hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790)、E-miR-124-3 5' 側翼序列 (SEQ ID NO: 768)、與 G9 之反義序列實質上互補的有義隨從股序列 (SEQ ID NO: 68)、E-miR-124-3 環序列 (SEQ ID NO: 770)、G9 之反義引導序列、E-miR-124-3 3' 側翼序列 (SEQ ID NO: 769)、BGH polyA 序列 (SEQ ID NO: 793)、CaMKII 啟動子序列 (SEQ ID NO: 802)、E-miR-218 5' 側翼序列 (SEQ ID NO: 765)、與 MW 互補的有義隨從股序列 (SEQ ID NO: 80)、E-miR-218 環序列 (SEQ ID NO: 767)、MW 之反義引導序列 (SEQ ID NO: 80)、E-miR-218 3' 側翼序列 (SEQ ID NO: 766)、RBG polyA 序列 (SEQ ID NO: 792) 及 3' ITR 序列 (SEQ ID NO: 748)。圖 8C 示出雙 siRNA 表現構建體 (DMTPV3, SEQ ID NO: 787)，其從 5' 至 3' 含有：5' ITR 序列 (SEQ ID NO: 746)、hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790)、E-miR-30 5' 側翼序列 (SEQ ID NO: 759)、與 GI 互補的有義隨從股序列 (SEQ ID NO: 77)、E-miR-30 環序列 (SEQ ID NO: 761)、GI 之反義引導序列 (SEQ ID NO: 77)、E-miR-30 3' 側翼序列 (SEQ ID NO: 760)、BGH polyA 序列 (SEQ ID NO: 793)、CaMKII 啟動子序列 (SEQ ID NO: 802)、E-miR-124-3 5' 側翼序列 (SEQ ID NO: 768)、與 G9 之反義序列實質上互補的有義隨從股序列 (SEQ ID NO: 68)、E-miR-124-3 環序列 (SEQ ID NO: 770)、G9 之反義引導序列、E-miR-124-3 3' 側翼序列 (SEQ ID NO: 769)、RBG polyA 序列 (SEQ ID NO: 792) 及 3' ITR 序列 (SEQ ID NO: 748)。圖 8D 示出雙 siRNA 表現構建體 (DMTPV4, SEQ ID NO: 788)，其從 5' 至 3' 含有：5' ITR 序列 (SEQ ID NO: 746)、hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790)、E-miR-30 5' 側翼序列 (SEQ ID NO: 759)、與 GI 互補的有義隨從股序列 (SEQ ID NO: 77)、E-miR-30 環序列 (SEQ ID NO: 761)、GI 之反義引導序列 (SEQ ID NO: 77)、E-miR-30 3' 側翼序列 (SEQ ID NO: 760)、BGH polyA 序列 (SEQ ID NO: 793)、CaMKII 啟動子序列 (SEQ ID NO: 802)、E-miR-124-3 5' 側翼序列 (SEQ ID NO: 768)、與 MW 之反義序列實質上互補的有義隨從股序列 (SEQ ID NO: 80)、E-miR-124-3 環序列 (SEQ ID NO: 770)、MW 之反義引導序列 (SEQ ID NO: 80)、E-miR-124-3 3' 側翼序列 (SEQ ID NO: 769)、RBG polyA 序列 (SEQ ID NO: 792) 及 3' ITR 序列 (SEQ ID NO: 748)。圖 8E 示出雙 siRNA 表現構建體 (DMTPV5)，其從 5' 至 3' 含有 5' ITR 序列 (SEQ ID NO: 746)、hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790)、E-miR-30 5' 側翼序列 (SEQ ID NO: 759)、與 GI 互補的有義隨從股序列 (SEQ ID NO: 77)、E-miR-30 環序列 (SEQ ID NO: 761)、GI 之反義引導序列 (SEQ ID NO: 77)、E-miR-30 3' 側翼序列 (SEQ ID NO: 760)、BGH polyA 序列 (SEQ ID NO: 793)、CaMKII 啟動子序列 (SEQ ID NO: 802)、E-miR-218 5' 側翼序列 (SEQ ID NO: 765)、與 MW 之反義序列實質上互補的有義隨從股序列 (SEQ ID NO: 80)、E-miR-218 環序列 (SEQ ID NO: 767)、MW 之反義引導序列 (SEQ ID NO: 80)、E-miR-218 3' 側翼序列 (SEQ ID NO: 766)、RBG polyA 序列 (SEQ ID NO: 792) 及 3' ITR 序列 (SEQ ID NO: 748)。圖 8F 示出雙 siRNA 表現構建體 (DMTPV6)，其從 5' 至 3' 含有 5' ITR 序列 (SEQ ID NO: 746)、hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790)、E-miR-30 5' 側翼序列 (SEQ ID NO: 759)、與 GI 互補的有義隨從股序列 (SEQ ID NO: 77)、E-miR-30 環序列 (SEQ ID NO: 761)、GI 之反義引導序列 (SEQ ID NO: 77)、E-miR-30 3' 側翼序列 (SEQ ID NO: 760)、E-miR-218 5' 側翼序列 (SEQ ID NO: 765)、與 MW 之反義序列實質上互補的有義隨從股序列 (SEQ ID NO: 80)、E-miR-218 環序列 (SEQ ID NO: 767)、MW 之反義引導序列 (SEQ ID NO: 80)、E-miR-218 3' 側翼序列 (SEQ ID NO: 766)、RBG polyA 序列 (SEQ ID NO: 792)、非編碼填充序列及 3' ITR 序列 (SEQ ID NO: 748)。圖 8G 示出雙 siRNA 表現構建體 (DMTPV7)，其從 5' 至 3' 含有 5' ITR 序列 (SEQ ID NO: 746)、hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790)、E-miR-30 5' 側翼序列 (SEQ ID NO: 759)、與 GI 互補的有義隨從股序列 (SEQ ID NO: 77)、E-miR-30 環序列 (SEQ ID NO: 761)、GI 之反義引導序列 (SEQ ID NO: 77)、E-miR-30 3' 側翼序列 (SEQ ID NO: 760)、BGH polyA 序列 (SEQ ID NO: 793)、CaMKII 啟動子序列 (SEQ ID NO: 802)、E-miR-124-3 5' 側翼序列 (SEQ ID NO: 768)、G9 之反義引導序列、E-miR-124-3 環序列 (SEQ ID NO: 770)、與 G9 之反義序列實質上互補的有義隨從股序列 (SEQ ID NO: 68)、E-miR-124-3 3' 側翼序列 (SEQ ID NO: 769)、RBG polyA 序列 (SEQ ID NO: 792) 及 3' ITR 序列 (SEQ ID NO: 748)。 圖 9A 及 9B為示出由單 siRNA 載體構建體 (圖 9A；G9，SEQ ID NO: 68 – 構建體 1 (SEQ ID NO: 775)；GC，SEQ ID NO: 101) 及雙 miRNA 載體構建體 (圖 9B；DMTPV1-4；分別為 SEQ ID NO: 785 至 788) 所產生之載體的 cDNA 的鹼性瓊脂糖凝膠分析的照片。所有四種雙 miRNA 載體構建體中的單個條帶指示雙表現構建體之載體被單獨包裝在 AAV9 載體中。 圖 10示出條形圖，證明使用單 miRNA AAV9 構建體單獨遞送或與另一種含有不同 miRNA 序列的單 miRNA AAV9 構建體組合遞送的 GluK2 蛋白敲落的 活體外功效 (G9-S1 (SEQ ID NO: 775)、GI-S1 (SEQ ID NO: 796)、GI-S2 (SEQ ID NO: 798)、MW-S4 (SEQ ID NO: 799)、G9-S5 (SEQ ID NO: 800) 或其組合)，如藉由 qPCR 所測量。用兩種不同的抗 Grik2miRNA 序列之組合轉染的 GlutaNeurons (皆在 hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790) 的控制下) 顯示出與用單一類型之抗 Grik2miRNA 序列轉染之 GlutaNeurons 類似的 GluK2 蛋白敲落，支持使用編碼多個針對 Grik2的獨特反義引導序列的載體來敲落 GluK2 表現。敲落功效作為相對於「僅脂質」對照組的中位數 Grik2mRNA 水平倍數變化之的倍數變化來測量。 圖 11示出用不同單 miRNA AAV9 表現載體 (GC (SEQ ID NO: 101)；G9-S1 (SEQ ID NO: 775)、GI-S1 (SEQ ID NO: 796) 或 G9-S1 + GI-S1) 之組合在 hSyn 啟動子 (SEQ ID NO: 790) 的控制下轉染去抑制小鼠器官型海馬切片中癲癇狀活動之頻率的條形圖。miRNA 構建體 G9-S1 與 GI-S1 之組合顯示出與各載體單獨相同程度的癲癇狀活動抑制，支持使用多於一種針對 Grik2的獨特反義引導序列來抑制海馬迴路中的癲癇狀活動。 圖 12示出條形圖，展示了在使用若干反義構建體對 GlutaNeurons 中之 Grik2進行 AAV9 載體媒介的敲除後的 Grik2mRNA 水平，如藉由 qPCR 所測量，該等反義構建體包含 hSyn.GI (SEQ ID NO: 77).S2 (SEQ ID NO: 798)、hSyn.MW (SEQ ID NO: 80).S4 (SEQ ID NO: 799)、hSyn.MW.S5 (SEQ ID NO: 800)、hSyn.G9 (SEQ ID NO: 68).S5 (SEQ ID NO: 801)、CaMKII.GI.S4、CaMKII.MW.S5、CaMKII.G9.S5、DMTPV1 (SEQ ID NO: 785)、DMTPV2 (SEQ ID NO: 786)、DMTPV3 (SEQ ID NO: 787) 及 DMTPV4 (SEQ ID NO: 788)。將 mRNA 水平與用含有不產生 RNA 的全長基因體的 AAV.null 載體轉導的 GlutaNeurons 進行比較。 圖 13A 及 13B示出用毛果芸香鹼及若干單 miRNA 載體構建體 (GC (SEQ ID NO: 101)、G9-S1 (SEQ ID NO: 775) 或 GI-S1 (SEQ ID NO: 796)) 中之一者治療的小鼠所實施的開放空間試驗的結果。圖 13A 示出單隻小鼠在開放空間中的示例性跟踪運動軌跡。圖 13B 示出條形圖，展示了用編碼抗 Grik2miRNA 序列的 AAV9 載體治療的小鼠在開放空間試驗中行進的總距離的條形圖。無癲癇小鼠 (亦即，未經毛果芸香鹼處理之小鼠；n = 20) 及接受 GC、G9-S1 或 GI-S1 治療的慢性癲癇小鼠 (分別為 n = 9、n = 8、n = 9)。使用 Mann-Whitney 檢驗比較注射前及注射後資料，*p ＜ 0.05 且 **p ＜ 0.01。注意到用 G9 及 GI 的快速運動顯著減少。 圖 14為示出用編碼抗 Grik2構建體 G9-S1 (SEQ ID NO: 775)、GI-S1 (SEQ ID NO: 796) 或加擾對照構建體 GC (SEQ ID NO: 101) (分別為 n = 5、n = 5、n = 5) 的 AAV9 載體治療的經毛果芸香鹼處理之小鼠每天癲癇發作的總數的條形圖。G9-S1 及 GI-S1 原始資料使用單向 ANOVA 與 GC 進行比較，p ＜ 0.01。注意到用 G9-S1 及 GI-S1 抑制癲癇發作。 圖 15為示出用不同劑量的編碼抗 Grik2構建體 G9 (SEQ ID NO: 68) 治療的小鼠在開放空間試驗中行進的總距離的條形圖。用不同劑量 G9 治療的慢性癲癇小鼠：G9/1、G9/10、G9/100 及 G9/1000 (分別為 n = 8、n = 5、n = 5、n = 5)。GC 為對照構建體 (n = 9)。使用 Mann-Whitney 檢驗比較注射前及注射後資料，*p ＜ 0.05 且 **p ＜ 0.01。注意到 G9 與 G9/10 具有類似的效果。 圖 16為示出用若干劑量中之一者的編碼抗 Grik2構建體 G9-S1/G9 (SEQ ID NO: 775) 治療的經毛果芸香鹼處理之小鼠每天癲癇發作的總數的條形圖：G9/1、G9/10、G9/100 及 G9/1000 (分別為 n = 6、n = 4、n = 2、n = 2)。注意到 G9 與 G9/10 具有類似的效果，但與 G9/1000 則不同。 圖 17為示出用編碼若干雙 miRNA、雙啟動子構建體 (DMTPV1-4) 中之一者的 AAV9 載體治療的經毛果芸香鹼處理之小鼠在開放空間試驗中行進的總距離的條形圖。無癲癇小鼠 (n = 20) 及慢性癲癇小鼠經 DMTPV1 (SEQ ID NO: 785)、DMTPV2 (SEQ ID NO: 786)、DMTPV3 (SEQ ID NO: 787) 或 DMTPV4 (SEQ ID NO: 788) (分別為 n = 6、n = 5、n = 6 及 n = 6) 治療。使用 Mann-Whitney 檢驗比較注射前及注射後資料，*p ＜ 0.05 且 **p ＜ 0.01。注意到用 DMTPV3 及 DMTPV4 的快速運動顯著減少。 圖 18為示出經毛果芸香鹼處理之小鼠在開放空間試驗中的總行進距離 (cm) 與每天自發性癲癇發作次數之關係的散點圖。回歸分析證明快速運動與癲癇發作易感性之間存在顯著的相關性 (R 2= 0.7388, p ＜ 0.0001)。 圖 19為示出在用若干抗 Grik2miRNA 序列 (包含 G9 (SEQ ID NO: 68)、GI (SEQ ID NO: 77)、DMTPV1 (SEQ ID NO: 785)、DMTPV2 (SEQ ID NO: 786)、DMTPV3 (SEQ ID NO: 787) 及 DMTPV4 (SEQ ID NO: 788)) 中之一者及對照 AAV9.hSyn.GFP 載體轉導 GlutaNeurons 後之 Grik2mRNA 表現的條形圖。所有測試的雙 miRNA 構建體皆降低了 GlutaNeurons 中之 Grik2mRNA 水平，如使用 RNA 定序所測量。倍數變化係相對於對照。 圖 20為示出用編碼單抗 Grik2miRNA 序列 G9 (SEQ ID NO: 68) 的載體、雙 miRNA 載體 DMTPV3 (SEQ ID NO: 787) 治療的小鼠或用對照 AAV9.hSyn.GFP 載體治療的小鼠在開放空間試驗中之運動的條形圖。將 WT 小鼠用為單獨的對照。前 = 治療前；後 = 治療後。G9 及 DMTPV3 編碼載體皆顯著抑制小鼠之快速運動活動 (p ＜ 0.01；Mann-Whitney 檢驗)，表明這些載體對抑制快速運動具有穩健的效應。 圖 21為示出在用不同劑量的 DMTPV3 (SEQ ID NO: 787) 治療的小鼠在開放空間試驗中的快速運動活動的劑量依賴性減少的條形圖，包含 DMTPV3 (3.6×10 10GC/腦)、DMTPV3/10 (3.6×10 9GC/腦)、DMTPV3/100 (3.6×10 8GC/腦) 及 DMTPV3/1000 (3.6×10 7GC/腦)。對照小鼠經 AAV9.hSyn.GFP 載體 (3.6×10 10GC/腦) 治療。前 = 治療前；後 = 治療後。與對照小鼠相比，用 DMTPV3 及 DMTPV3/10 劑量治療的小鼠表現出快速運動活動顯著減少 (p ＜ 0.01；Mann-Whitney 檢驗)。 圖 22為示出用編碼抗 Grik2單 miRNA 構建體 G9 (SEQ ID NO: 68) 或 GI (SEQ ID NO: 77) 或雙 miRNA 構建體 DMTPV3 (SEQ ID NO: 787) 的載體進一步治療經毛果芸香鹼處理之小鼠每天癲癇發作次數的條形圖。小鼠亦用編碼加擾 RNA 序列 GC (SEQ ID NO: 101) 的對照載體或 AAV9.hSyn.GFP 治療。用 G9、GI 及 DMTPV3 治療的小鼠每天癲癇發作次數顯著減少，與 G9 及 GI 相比，DMTPV 表現出更大幅度的減少 (* p ＜ 0.05；** p ＜ 0.01；Mann-Whitney 檢驗)。 圖 23示出從患有 TLE 的人類患者中切除的器官型海馬腦切片的螢光圖像，該切片遵循 DIV 1 用 AAV9.GC(SEQ ID NO: 101).GFP 感染並對齒狀顆粒細胞 (PROX1) 標記物進行染色。在齒狀腦回的齒狀顆粒細胞中觀察到 PROX1 標記。在齒狀顆粒細胞中亦觀察到 GFP 標記。許多細胞顯示出 PROX1 與 GFP 之共同標記，指示 AAV9.GC.GFP 能夠穩健地轉導齒狀顆粒細胞。 圖 24為示出在從患有 TLE 的人類患者中切除的海馬組織中使用編碼抗 Grik2miRNA 序列 (G9；SEQ ID NO: 68；n = 來自六例個體的 17 個切片) 或 GI (SEQ ID NO: 77；來自兩例個體的兩個切片) 的 AAV9 表現載體的 GluK2 蛋白敲落功效的散點圖。在用 G9 編碼載體處理的五組人類海馬組織中之五組中觀察到 GluK2 蛋白表現的敲落。 圖 25示出西方墨點法凝膠影像，示出從患有 TLE 的人類患者切除並用編碼 G9 (SEQ ID NO: 68) 的載體處理的器官型海馬切片中的 GluK2 蛋白表現。相對於未經處理之切片，G9 能夠將 GluK2 蛋白表現降低 40%。將 GluK2 表現標準化至對照。 圖 26A 至 26C示出來自患有 TLE 的人類患者在生理條件下 (ACSF) 的器官型海馬切片的說明性局部場電位記錄及所記錄的癲癇狀放電之量化。將切片用編碼抗 Grik2序列G9-S1 (SEQ ID NO: 775；7 個切片；圖 26A) 的載體或編碼加擾序列 GC 及 GFP 報導子 (SEQ ID NO: 101；6 個切片；圖 26B) 的載體進行處理。插圖示出具有更高時間分辨率的單個癲癇狀放電的電壓跡線。從四例人類 TLE 患者獲得的切片中，G9-S1 能夠有效減少或完全消除癲癇狀放電的發生 (圖 26C；**p ＜ 0.01)。 圖 27A 至 27D示出從人類 TLE 患者切除的器官型海馬切片中 Grik2表現的抑制。在用 DMTPV3 (SEQ ID NO: 787) 或 AAV.hSyn.GFP 對照載體處理的人類器官型海馬切片中 Grik2基因表現之散點圖。DMTPV3 示出 Grik2水平顯著降低，如藉由 qRT-PCR 所測量 (圖 27A)。從用編碼 DMTPV3 或加擾對照序列 GC (SEQ ID NO: 101；圖 27B) 的載體處理的獲得自人類 TLE 患者的切除器官型海馬腦切片中記錄的示例性電壓跡線。各星號代表癲癇狀放電。插圖示出單個癲癇狀放電的放大跡線。用 DMTPV3 處理的切片顯示癲癇狀放電完全消除 (圖 27C)。示出在用 GC、G9、AAV9.hSyn.GFP 或 DMTPV3 處理的切片中記錄的癲癇狀放電頻率之量化的條形圖 (圖 27D)。注意到前兩個條 (對應於 GC 及 G9 處理組) 與圖 26C 中所示的相同，並且包含在內以與 DMTPV3 處理組進行比較。 圖 28為描繪用表現載體 DMSPV1 (SEQ ID NO: 811) 及 DMTPV8 (SEQ ID NO: 813) 相對於對照 AAV9.hSyn.GFP 載體及 hSyn.G9-A-miR-30 基準載體 (SEQ ID NO: 775) 處理的小鼠皮質神經元中 GluK2 表現百分比的條形圖。資料表示為平均值 ± S.E.M.。表現構建體 DMSPV1 及 DMPTV8 導緻小鼠皮質神經元中 GluK2 敲落，與基準 hSyn.G9-A-miR-30 載體相當。 圖 29為描繪慢性癲癇小鼠在用對照載體 AAV9.hsyn.GFP (3.6E+9 MOI; n = 2)、DMSPV1 (3.6E+9 或 3.6E+8 MOI；對於各 MOI，n = 3)、DMTPV8 (3.6E+9 或 3.6E+8 MOI；對於各 MOI，n = 3) 治療前 (未填充條) 及治療後 (填充條) 在開放空間試驗箱中自發探索 10 分鐘期間行進的總距離的條形圖。DMSPV1 及 DMTPV8 在小鼠的快速運動活動 (其為癲癇發生的行為代表) 中產生劑量依賴性降低。 圖 30為本揭露之 AAV 載體的示意圖，其從 5' 至 3' 含有： (a) AAV 5' ITR 序列 (例如，SEQ ID NO: 746 及 747 中之任一者)； (b) 啟動子序列，諸如以下任一者： (i) hSyn 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 682、683、684 及 685 中之任一者)； (ii) NeuN 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 686)； (iii) CaMKII 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 687 至 691 及 802 中之任一者)； (iv) NSE 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 692 或 393)； (v) PDGF-β 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 694 至 696 中之任一者)； (vi) VGluT 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 697 至 701 中之任一者)； (vii) SST 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 702 或 703)； (viii) NPY 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 704)； (ix) VIP 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 705 或 706)； (x) PV 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 707 至 709 中之任一者)； (xi) GAD65 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 710 至 713 中之任一者)； (xii) GAD67 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 714 或 715)； (xiii) DRD1 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 716)； (xiv) DRD2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 717 或 718)； (xv) C1QL2 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 719)； (xvi) POMC 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 720)； (xvii) PROXl 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 721 或 722)； (xviii) MAP1B 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 723 至 725 中之任一者)； (xix) TUBA1A 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 726 或 727)； (xx) U6 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 728 至 733 中之任一者)； (xxi) H1 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 734)； (xxii) 7SK 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 735)； (xxiii) ApoE.hAAT 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 736)； (xxiv) CAG 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 737)； (xxv) CBA 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 738)； (xxvi) CK8 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 739)； (xxvii) MU1A 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 740)； (xxviii) EF1-α 啟動子 (例如，SEQ ID NO: 741)；及 (xxix) TBG 啟動子 (SEQ ID NO: 742)； (c) 莖環序列，其含有： (i) 5' 側翼序列 (例如，SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 及 768 中之任一者)； (ii) 5p 莖環臂，其含有引導股 (例如，SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者) 或隨從股序列 (例如，與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者實質上或完全互補的序列； (iii) 微小 RNA 環序列 (例如，SEQ ID NO: 758、761、764、767 及 770 中之任一者)；及 (iv) 3p 莖環臂，其含有隨從股 (例如，與 SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者實質上或完全互補的序列) 或引導股序列 (例如，SEQ ID NO: 1 至 100 中之任一者)；及 (v) 3' 側翼序列 (例如，SEQ ID NO: 753、754、757、760、763、766 及 769 中之任一者)； (d) 3' 非轉譯區域 (UTR；例如，SEQ ID NO: 750 及 751 中之任一者)；及 (e) AAV 3' ITR 序列 (例如，SEQ ID NO: 748 及 749 中之任一者)。含有上述元件中之任一者之組合的 AAV 載體可能適合根據本文所揭示之方法使用。 圖 31為示出慢性癲癇小鼠在用 3.6E+9 MOI 之對照載體 (CV; n = 3)、3.6E+9 MOI 之構建體 SMSPV4 (n = 4)、3.6E+8 MOI 之構建體 SMSPV4 (n = 4)、3.6E+9 MOI 之構建體 SMSPV5 (n = 4)、3.6E+8 MOI 之構建體 SMSPV5 (n = 4)、3.6E+9 MOI 之構建體 SMSPV6 (n = 4), 及 3.6E+8 MOI 之構建體 SMSPV6 (n = 4) 治療前 (空心條) 及治療後 (填充條) 在開放空間試驗箱中自發探索 10 分鐘期間行進的總距離的條形圖。用 SMSPV4、SMSPV5 及 SMSPV6 而非對照構建體治療小鼠，減少小鼠之快速運動 (其為癲癇行為的代表)。前 = 治療前；後 = 治療後；E8 = 3.6E+8 MOI；E9 = 3.6E+9 MOI。
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Claims (140)

  1. 一種具有不多於 800 個核苷酸之長度的分離之多核苷酸，其在 Grik2 mRNA 的單股區域內特異性雜交，其中雜交之多核苷酸具有小於 18 kcal/mol 的靶標打開能 (Target Opening Energy)，並且其中： (a) 該多核苷酸不包括下列中任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 772 至 774； (b) 該多核苷酸包含下列核酸序列：SEQ ID NO: 68 或SEQ ID NO: 68 及 SEQ ID NO: 649；或 (c) 該多核苷酸不具有介於 5.53 kcal/mol 與 5.55 kcal/mol 之間的總打開能 (Total Opening Energy)。
  2. 一種具有不多於 23 個核苷酸之長度的分離之 RNA 多核苷酸，其在 Grik2 mRNA 的單股區域內特異性雜交，其中雜交之多核苷酸具有小於 18 kcal/mol 的總打開能，其中該多核苷酸不包括下列中任一者之核酸序列：SEQ ID NO: 772 至 774。
  3. 如請求項 1 或 2 之多核苷酸，其中該多核苷酸具有大於 5.4 kcal/mol 或小於 5.4 kcal/mol 的總打開能。
  4. 如請求項 1 至 3 中任一項之多核苷酸，其中該雜交之多核苷酸具有大於 -35 kcal/mol 的雙股形成能 (Energy of Duplex Formation)。
  5. 如請求項 1 至 4 中任一項之多核苷酸，其中該雜交之多核苷酸具有大於 -24 kcal/mol 的總結合能 (Total Energy of Binding)。
  6. 如請求項 1 至 5 中任一項之多核苷酸，其中該雜交之多核苷酸具有小於 50% 的 GC 含量。
  7. 如請求項 1 至 6 中任一項之多核苷酸，其中該 Grik2 mRNA 之該單股區域係選自由以下所組成之群組：環區域 1 至 14。
  8. 如請求項 1 至 7 中任一項之多核苷酸，其中該多核苷酸在下列者內特異性雜交： (a) 該 Grik2 mRNA 的環 1 區域； (b) 該 Grik2 mRNA 的環 2 區域； (c) 該 Grik2 mRNA 的環 3 區域； (d) 該 Grik2 mRNA 的環 4 區域； (e) 該 Grik2 mRNA 的環 5 區域； (f) 該 Grik2 mRNA 的環 6 區域； (g) 該 Grik2 mRNA 的環 7 區域； (h) 該 Grik2 mRNA 的環 8 區域； (i) 該 Grik2 mRNA 的環 9 區域； (j) 該 Grik2 mRNA 的環 10 區域； (k) 該 Grik2 mRNA 的環 11 區域； (l) 該 Grik2 mRNA 的環 12 區域； (m) 該 Grik2 mRNA 的環 13 區域；或 (n) 該 Grik2 mRNA 的環 14 區域。
  9. 如請求項 7 或請求項 8 之多核苷酸，其中： (a) 該環 1 區域係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 145； (b) 該環 2 區域係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 146； (c) 該環 3 區域係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 147； (d) 該環 4 區域係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 148； (e) 該環 5 區域係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 149； (f) 該環 6 區域係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 150； (g) 該環 7 區域係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 151； (h) 該環 8 區域係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 152； (i) 該環 9 區域係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 153； (j) 該環 10 區域係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 154； (k) 該環 11 區域係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 155； (l) 該環 12 區域係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 156； (m) 該環 13 區域係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 157；及/或 (n) 該環 14 區域係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 158。
  10. 如請求項 9 之多核苷酸，其中該序列同一性係以下列中任一者的至少 15 個連續核苷酸來判定：SEQ ID NO: 145 至 158。
  11. 如請求項 10 之多核苷酸，其中該序列同一性係以下列中任一者的至少 30 個連續核苷酸來判定：SEQ ID NO: 145 至 158。
  12. 如請求項 11 之多核苷酸，其中序列同一性係以下列中任一者的至少 60 個連續核苷酸來判定：SEQ ID NO: 145 至 158。
  13. 如請求項 12 之多核苷酸，其中序列同一性係以下列中任一者的全長來判定：SEQ ID NO: 145 至 158。
  14. 如請求項 1 至 13 中任一項之多核苷酸，其中該多核苷酸包含：  (a)        與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 1； (b)       與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 4； (c)        (i) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 5；或 (ii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 6； (d)      與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 7； (e)        與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 96； (f)        (i) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 8； (ii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 98；或 (iii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 99； (g)      與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 9； (h)      與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 63； (i)        與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 10；或 (j)        與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 11。
  15. 如請求項 14 之多核苷酸，其中序列同一性係以下列中任一者的至少 10 個連續核苷酸上判定：SEQ ID NO: 1、4 至 11、63、96、98 或 99。
  16. 如請求項 15 之多核苷酸，其中序列同一性係以下列中任一者的至少 15 個連續核苷酸來判定：SEQ ID NO: 1、4 至 11、63、96、98 或 99。
  17. 如請求項 16 之多核苷酸，其中序列同一性係以下列中任一者的至少 20 個連續核苷酸來判定：SEQ ID NO: 1、4 至 11、63、96、98 或 99。
  18. 如請求項 17 之多核苷酸，其中序列同一性係以下列中任一者的全長來判定：SEQ ID NO: 1、4 至 11、63、96、98 或 99。
  19. 如請求項 1 至 18 中任一項之多核苷酸，其中該多核苷酸包含由該多核苷酸及該 Grik2 mRNA 之單股區域所形成之雙股結構，其中該雙股結構包含至少一個介於該多核苷酸的核苷酸與該 Grik2 mRNA 之該單股區域的核苷酸之間之錯配。
  20. 如請求項 19 之多核苷酸，其中該 Grik2 mRNA 之該單股區域係選自由以下所組成之群組：環區域 1 至 14。
  21. 如請求項 1 至 20 中任一項之多核苷酸，其中該總打開能、雙股形成能、總結合能及/或 GC 含量係以 23 至 79 個核苷酸來計算。
  22. 如請求項 1 至 7 中任一項之多核苷酸，其中該 Grik2 mRNA 之該單股區域係選自由以下所組成之群組：未配對區域 1 至 5。
  23. 如請求項 22 之多核苷酸，其中該多核苷酸在下列者內特異性雜交： (a) 該 Grik2 mRNA 的未配對區域 1； (b) 該 Grik2 mRNA 的未配對區域 2； (c) 該 Grik2 mRNA 的未配對區域 3； (d) 該 Grik2 mRNA 的未配對區域 4；或 (e) 該 Grik2 mRNA 的未配對區域 5。
  24. 如請求項 22 或 23 之多核苷酸，其中： (a) 該未配對區域 1 係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 159； (b) 該未配對區域 2 係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 160； (c) 該未配對區域 3 係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 161； (d) 該未配對區域 4 係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 162；及/或 (e) 該未配對區域 5 係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 163。
  25. 如請求項 24 之多核苷酸，其中序列同一性係以下列中任一者的至少 15 個連續核苷酸來判定：SEQ ID NO: 159 至 163。
  26. 如請求項 25 之多核苷酸，其中序列同一性係以下列中任一者的至少 30 個連續核苷酸來判定：SEQ ID NO: 159 至 163。
  27. 如請求項 26 之多核苷酸，其中序列同一性係以下列中任一者的至少 60 個連續核苷酸來判定：SEQ ID NO: 159 至 163。
  28. 如請求項 27 之多核苷酸，其中序列同一性係以下列中任一者的全長來判定：SEQ ID NO: 159 至 163。
  29. 如請求項 22 至 28 中任一項之多核苷酸，其中該多核苷酸包含：  (a)  (i) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 13； (ii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 14； (iii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 72；或 (iv) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 73； (b)   與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 15；或 (c)    與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 16。
  30. 如請求項 29 之多核苷酸，其中序列同一性係以下列中任一者的至少 10 個連續核苷酸來判定：SEQ ID NO: 13 至 16、72 或 73。
  31. 如請求項 30 之多核苷酸，其中序列同一性係以下列中任一者的至少 15 個連續核苷酸來判定：SEQ ID NO: 13 至 16、72 或 73。
  32. 如請求項 31 之多核苷酸，其中序列同一性係以下列中任一者的至少 20 個連續核苷酸來判定：SEQ ID NO: 13 至 16、72 或 73。
  33. 如請求項 32 之多核苷酸，其中序列同一性係以下列中任一者的全長來判定：SEQ ID NO: 13 至 16、72 或 73。
  34. 如請求項 29 至 33 中任一項之多核苷酸，其中序列同一性係以下列中任一者的不多於 30 個連續核苷酸來判定：SEQ ID NO: 13 至 16、72 或 73。
  35. 如請求項 34 之多核苷酸，其中序列同一性係以下列中任一者的不多於 25 個連續核苷酸來判定：SEQ ID NO: 13 至 16、72 或 73。
  36. 如請求項 22 至 35 中任一項之多核苷酸，其中該多核苷酸包含由該多核苷酸及該 Grik2 mRNA 之單股區域所形成之雙股結構，其中該雙股結構包含至少一個介於該多核苷酸的核苷酸與該 Grik2 mRNA 之該單股區域的核苷酸之間之錯配。
  37. 如請求項 22 至 36 中任一項之多核苷酸，其中平均位置熵 (average positional entropy) 係以 23 至 79 個核苷酸來計算。
  38. 如請求項 1 至 37 中任一項之多核苷酸，其中該多核苷酸與該 Grik2 mRNA 的編碼序列雜交。
  39. 如請求項 38 之多核苷酸，其中該多核苷酸與下列者雜交： (a) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 1 內之區域； (b) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 2 內之區域； (c) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 3 內之區域； (d) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 4 內之區域； (e) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 5 內之區域； (f) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 6 內之區域； (g) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 7 內之區域； (h) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 8 內之區域； (i) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 9 內之區域； (j) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 10 內之區域； (k) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 11 內之區域； (l) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 12 內之區域； (m) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 13 內之區域； (n) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 14 內之區域； (o) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 15 內之區域；及/或 (p) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 16 內之區域。
  40. 如請求項 39 之多核苷酸，其中： (a) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 1 係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 129； (b) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 2 係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 130； (c) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 3 係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 131； (d) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 4 係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 132； (e) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 5 係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 133； (f) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 6 係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 134； (g) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 7 係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 135； (h) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 8 係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 136； (i) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 9 係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 137； (j) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 10 係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 138； (k) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 11 係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 139； (l) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 12 係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 140； (m) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 13 係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 141； (n) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 14 係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 142； (o) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 15 係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 143；及/或 (p) 該 Grik2 mRNA 的外顯子 16 係由與下列的至少 10 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 144。
  41. 如請求項 40 之多核苷酸，其中該多核苷酸包含： (a) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 1； (b) (i) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 2； (ii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 3； (iii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 30； (iv) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 31； (v) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 36； (vi) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 40； (vii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 59； (viii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 76； (ix) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 80； (x) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 81； (xi) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 92；及/或 (xii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 93； (c)  (i) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 40； (ii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 60； (iii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 68； (iv) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 70；及/或 (v) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 86； (d)   (i) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 68； (ii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 69；及/或 (iii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 70； (e)  (i) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 4； (ii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 5； (iii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 6； (vi) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 56； (v) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 57； (vi) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 58； (vii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 91； (viii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 94；及/或 (ix) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 95； (f)  (i) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 20； (ii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 37； (iii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 38； (iv) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 44； (v) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 46； (g)   與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 12； (h)   (i) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 7； (ii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 8； (iii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 96； (iv) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 98；及/或 (v) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 99； (i)  (i) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 22； (ii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 39； (iii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 62； (vi) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 74； (v) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 75； (vi) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 87； (vii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 88； (viii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 89；及/或 (ix) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 90； (j)  (i) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 82； (ii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 83； (iii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 84；及/或 (iv) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 85； (k) (i) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 13； (ii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 14； (iii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 72；及/或 (iv) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 73； (l)  (i) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 34； (ii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 35； (iii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 77； (iv) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 78；及/或 (v) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 79； (m)  與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 51； 及/或 (n)   (i) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 9； (ii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 10； (iii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 11； (iv) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 15； (v) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 16； (vi) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 17； (vii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 18； (viii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 27； (ix) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 32； (x) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 33； (xi) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 41； (xii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 49； (xiii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 50； (xiv) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 52； (xv) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 53； (xvi) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 61；及/或 (xvii) 與下列的至少 5 個連續核苷酸具有至少 85%、90%、92%、95%、97%、99% 或 100% 序列同一性的核酸序列：SEQ ID NO: 63。
  42. 如請求項 41 之多核苷酸，其中序列同一性係以下列中任一者的至少 10 個連續核苷酸來判定：SEQ ID NO: 1 至 12、13 至 18、20、22、27、30 至 41、44、46、49 至 53、56 至 63、68 至 70、72 至 92 或 94 至 99。
  43. 如請求項 42 之多核苷酸，其中序列同一性係以下列中任一者的至少 15 個連續核苷酸來判定：SEQ ID NO: 1 至 12、13 至 18、20、22、27、30 至 41、44、46、49 至 53、56 至 63、68 至 70、72 至 92 或 94 至 99。
  44. 如請求項 43 之多核苷酸，其中序列同一性係以下列中任一者的至少 20 個連續核苷酸來判定：SEQ ID NO: 1 至 12、13 至 18、20、22、27、30 至 41、44、46、49 至 53、56 至 63、68 至 70、72 至 92 或 94 至 99。
  45. 如請求項 44 之多核苷酸，其中序列同一性係以下列中任一者的全長來判定：SEQ ID NO: 1 至 12、13 至 18、20、22、27、30 至 41、44、46、49 至 53、56 至 63、68 至 70、72 至 92 或 94 至 99。
  46. 如請求項 1 之多核苷酸，其中該多核苷酸包含下列核酸序列：SEQ ID NO: 68 及 SEQ ID NO: 649。
  47. 如請求項 1 至 46 中任一項之多核苷酸，其中該多核苷酸與該 Grik2 mRNA 的非編碼序列雜交。
  48. 如請求項 47 之多核苷酸，其中該非編碼序列包含該 Grik2 mRNA 的 5' 非轉譯區 (UTR)。
  49. 如請求項 48 之多核苷酸，其中該 5' UTR 係由與下列核酸序列具有至少 85% 序列同一性的多核苷酸所編碼：SEQ ID NO: 126。
  50. 如請求項 47 之多核苷酸，其中該非編碼序列包含該 Grik2 mRNA 的 3' UTR。
  51. 如請求項 50 之多核苷酸，其中該 3' UTR 係由與下列核酸序列具有至少 85% 序列同一性的核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 127。
  52. 如請求項 1 至 51 中任一項之多核苷酸，其中該多核苷酸與下列中任一者之核酸序列雜交：SEQ ID NO: 115 至 681。
  53. 如請求項 1 至 52 中任一項之多核苷酸，其中該多核苷酸與下列中任一者之核酸序列具有至少 85% 序列同一性：SEQ ID NO: 1 至 100。
  54. 如請求項 1 至 53 中任一項之多核苷酸，其中該多核苷酸為反義寡核苷酸 (ASO)。
  55. 如請求項 54 之多核苷酸，其中該 ASO 為短干擾 RNA (siRNA)、短髮夾 RNA (shRNA)、微小 RNA (miRNA) 或短髮夾適應型 miRNA (shmiRNA)。
  56. 如請求項 1 至 55 中任一項之多核苷酸，其中該多核苷酸係介於 19 至 21 個核苷酸之間。
  57. 如請求項 56 之多核苷酸，其中該多核苷酸為 19 個核苷酸。
  58. 如請求項 57 之多核苷酸，其中該多核苷酸為 20 個核苷酸。
  59. 如請求項 58 之多核苷酸，其中該多核苷酸為 21 個核苷酸。
  60. 如請求項 1 至 59 中任一項之多核苷酸，其中該 Grik2 mRNA 係由下列核酸序列所編碼：SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 123 或 SEQ ID NO: 124。
  61. 如請求項 1 至 60 中任一項之多核苷酸，其中該多核苷酸能夠降低細胞中 Gluk2 蛋白之水平。
  62. 如請求項 61 之多核苷酸，其中該多核苷酸將細胞中 GluK2 蛋白之水平降低至少 10%、至少至少 15%、至少 20%、至少 25%、至少 30%、至少 35%、至少 40%、至少 45%、至少 50%、至少 55%、至少 60%、至少 65%、至少 70% 或至少 75%。
  63. 如請求項 61 或 62 之多核苷酸，其中該細胞為神經元。
  64. 如請求項 63 之多核苷酸，其中該神經元為海馬神經元 (hippocampal neuron)。
  65. 如請求項 64 之多核苷酸，其中該海馬神經元為齒狀顆粒細胞 (DGC)。
  66. 一種載體，其包含如請求項 1 至 65 中任一項之多核苷酸。
  67. 如請求項 66 之載體，其中該載體為複製缺陷型。
  68. 如請求項 66 或 67 之載體，其中該載體為哺乳動物、細菌或病毒載體。
  69. 如請求項 66 至 68 中任一項之載體，其中該載體為表現載體。
  70. 如請求項 68 或請求項 69 之載體，其中該病毒載體係選自由以下所組成之群組：腺相關病毒 (AAV)、反轉錄病毒、腺病毒、小病毒、冠狀病毒、負股 RNA 病毒、正黏液病毒、棒狀病毒、副黏液病毒、正股 RNA 病毒、微小 RNA 病毒、α 病毒、雙股 DNA 病毒、疱疹病毒、艾司坦氏-巴爾氏病毒、巨細胞病毒、雞痘病毒及金絲雀痘病毒。
  71. 如請求項 70 之載體，其中該載體為 AAV 載體。
  72. 如請求項 71 之載體，其中該 AAV 載體為 AAV9 或 AAVrh10 載體。
  73. 如請求項 66 至 72 中任一項之載體，其中該載體包含選自表 9 之表現匣。
  74. 一種包含核苷酸序列之表現匣，其包含：  (a) 莖環序列，其從 5' 至 3' 包含： (i) 5' 莖環臂，其包含引導核苷酸序列 (guide nucleotide sequence)，該引導核苷酸序列與表 2 及/或表 3 中所列出的引導序列之任一者具有至少 85% 序列同一性； (ii) 環區域，其中該環區域包含微小 RNA 環序列； (iii) 3' 莖環臂，其包含與該引導序列互補或實質上互補的隨從 (passenger) 核苷酸序列， (b) 第一側翼區域，其位於該引導序列的 5'；及 (c) 第二側翼區域，其位於該隨從序列的 3'。
  75. 如請求項 74 之表現匣，其中該表現匣包含表 9 中所描述的結構之任一者。
  76. 一種包含核苷酸序列之表現匣，其包含： (a) 莖環序列，其從 5' 至 3' 包含： (i) 5' 莖環臂，其包含與引導序列互補或實質上互補的隨從核苷酸序列； (ii) 環區域，其中該環區域包含微小 RNA 環序列； (iii) 3' 莖環臂，其包含引導核苷酸序列，該引導核苷酸序列與表 2 及/或表 3 中所列出的引導序列之任一者具有至少 85% 序列同一性； (b) 第一側翼區域，其位於該引導序列的 5'；及 (c) 第二側翼區域，其位於該隨從序列的 3'。
  77. 如請求項 76 之表現匣，其中該表現匣包含表 9 中所描述的結構之任一者。
  78. 如請求項 74 至 77 中任一項之表現匣，其中該第一側翼區域包含與下列中任一者之核酸序列具有至少 85% 序列同一性之多核苷酸：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768。
  79. 如請求項 74 至 78 中任一項之表現匣，其中該第二側翼區域包含與下列中任一者之核酸序列具有至少 85% 序列同一性之多核苷酸：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769。
  80. 如請求項 74 至 79 中任一項之表現匣，其中該第一側翼區域包含 5' 間隔子序列及 5' 側翼序列。
  81. 如請求項 74 至 80 中任一項之表現匣，其中該第二側翼區域包含 3' 間隔子序列及 3' 側翼序列。
  82. 如請求項 74 至 81 中任一項之表現匣，其中該微小 RNA 環序列為 miR-30、miR-155、miR-218-1 或 miR-124-3 序列。
  83. 如請求項 82 之表現匣，其中該微小 RNA 環序列包含與下列中任一者之核酸序列具有至少 85% 序列同一性之多核苷酸：SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770。
  84. 如請求項 74 至 83中任一項之表現匣，其中該表現匣包含選自由以下所組成之群組之啟動子：U6 啟動子、H1 啟動子、7SK 啟動子、載脂蛋白 E-人 α1-抗胰蛋白酶啟動子、CAG 啟動子、CBA 啟動子、CK8 啟動子、mU1a 啟動子、延長因子 1α 啟動子、甲狀腺素結合球蛋白啟動子、突觸蛋白啟動子、RNA 結合 Fox-1 同源物 3 啟動子、鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶 II 啟動子、神經元特異性烯醇酶啟動子、血小板衍生生長因子次單元 β、囊泡麩胺酸轉運蛋白啟動子、體抑素啟動子、神經肽 Y 啟動子、血管活性腸肽啟動子、小白蛋白啟動子、麩胺酸去羧酶 65 啟動子、麩胺酸去羧酶 67 啟動子、多巴胺受體 D1 啟動子、多巴胺受體 D2 啟動子、補體 C1q 樣 2 啟動子 (Complement C1q Like 2 promoter)、原腦啡黑皮質素啟動子 (Proopiomelanocortin promoter)、Prospero 同源異形盒 1 啟動子、微管相關蛋白 1B 啟動子及微管蛋白 α 1 啟動子。
  85. 如請求項 76 之表現匣，其中該表現匣包含與下列中任一者之核酸序列具有至少 85% 序列同一性之多核苷酸：SEQ ID NO: 775、777、779、781、783 至 788、796、798 至 801、803、805、807、809、813、817、819 及 821。
  86. 一種表現匣，其從 5' 至 3' 包含： (a) 第一啟動子序列； (b) 第一引導核苷酸序列，其與表 2 及/或表 3 中所列出的引導序列之任一者具有至少 85% 序列同一性，其中該第一引導核苷酸序列係可操縱地連接至該第一啟動子； (c) 第二啟動子序列； (b) 第二引導核苷酸序列，其與表 2 及/或表 3 中所列出的引導序列之任一者具有至少 85% 序列同一性，其中該第二引導核苷酸序列係可操縱地連接至該第二啟動子。
  87. 如請求項 86 之表現匣，其進一步包含與該第一引導核苷酸序列互補或實質上互補的第一隨從核苷酸序列，其中該第一隨從核苷酸序列係位於相對於該第一引導核苷酸序列的 5' 或 3'。
  88. 如請求項 86 或 87 之表現匣，其進一步包含與該第二引導核苷酸序列互補或實質上互補的第二隨從核苷酸序列，其中該第二隨從核苷酸序列係位於相對於該第二引導核苷酸序列的 5' 或 3'。
  89. 如請求項 86 至 88 中任一項之表現匣，其進一步包含位於相對於該第一引導序列 5' 的第一 5' 側翼區域。
  90. 如請求項 86 至 89 中任一項之表現匣，其進一步包含位於相對於該第一引導序列 3' 的第一 3' 側翼區域。
  91. 如請求項 86 至 90 中任一項之表現匣，其進一步包含位於相對於該第二引導序列 5' 的第二 5' 側翼區域。
  92. 如請求項 86 至 91 中任一項之表現匣，其進一步包含位於相對於該第二引導序列 3' 的第二 3' 側翼區域。
  93. 如請求項 86 至 92 中任一項之表現匣，其進一步包含位於介於該第一引導序列與該第一隨從序列之間的第一環區域，其中該第一環區域包含第一微小 RNA 環序列。
  94. 如請求項 86 至 93 中任一項之表現匣，其進一步包含位於介於該第二引導序列與該第二隨從序列之間的第二環區域，其中該第二環區域包含第二微小 RNA 環序列。
  95. 如請求項 86 之表現匣，其中該表現匣包含與下列中任一者之核酸序列具有至少 85% 序列同一性之多核苷酸：SEQ ID NO: 785 至 788。
  96. 一種包含核苷酸序列之表現匣，其從 5' 至 3' 包含： (a) 第一啟動子序列； (b) 第一 5' 側翼區域，其位於第一隨從核苷酸序列的 5'； (c) 第一莖環序列，其從 5' 至 3' 包含： (i) 第一 5' 莖環臂，其包含與第一引導序列互補或實質上互補的第一隨從核苷酸序列； (ii) 第一環區域，其中該第一環區域包含第一微小 RNA 環序列； (iii) 第一 3' 莖環臂，其包含第一引導核苷酸序列，該第一引導核苷酸序列與表 2 及/或表 3 中所列出的引導序列之任一者具有至少 85% 序列同一性； (d) 第一 3' 側翼區域，其位於該第一引導核苷酸序列的 3'； (e) 第二啟動子序列； (f) 第二 5' 側翼區域，其位於第二隨從核苷酸序列的 5'； (g) 第二莖環序列，其從 5' 至 3' 包含： (i) 第二 5' 莖環臂，其包含與第二引導序列互補或實質上互補的第二隨從核苷酸序列； (ii) 第二環區域，其中該第二環區域包含第二微小 RNA 環序列； (iii) 第二 3' 莖環臂，其包含第二引導核苷酸序列，該第二引導核苷酸序列與表 2 及/或表 3 中所列出的引導序列之任一者具有至少 85% 序列同一性； 及 (h) 第二 3' 側翼區域，其位於該第二引導核苷酸序列的 3'。
  97. 一種包含核苷酸序列之表現匣，其從 5' 至 3' 包含： (a) 第一啟動子序列； (b) 第一 5' 側翼區域，其位於第一隨從核苷酸序列的 5'； (c) 第一莖環序列，其從 5' 至 3' 包含： (i) 第一 5' 莖環臂，其包含與第一引導序列互補或實質上互補的第一隨從核苷酸序列； (ii) 第一環區域，其中該第一環區域包含第一微小 RNA 環序列； (iii) 第一 3' 莖環臂，其包含第一引導核苷酸序列，該第一引導核苷酸序列與表 2 及/或表 3 中所列出的引導序列之任一者具有至少 85% 序列同一性； (d) 第一 3' 側翼區域，其位於該第一引導核苷酸序列的 3'； (e) 第二啟動子序列； (f) 第二 5' 側翼區域，其位於第二引導核苷酸序列的 5'； (g) 第二莖環序列，其從 5' 至 3' 包含： (i) 第二 5' 莖環臂，其包含引導核苷酸序列，該引導核苷酸序列與表 2 及/或表 3 中所列出的引導序列之任一者具有至少 85% 序列同一性； (ii) 第二環區域，其中該第二環區域包含第二微小 RNA 環序列； (iii) 第二 3' 莖環臂，其包含與該第二引導序列互補或實質上互補的第二隨從核苷酸序列； 及 (h) 第二 3' 側翼區域，其位於該第二隨從核苷酸序列的 3'。
  98. 一種包含核苷酸序列之表現匣，其從 5' 至 3' 包含： (a) 第一啟動子序列； (b) 第一 5' 側翼區域，其位於第一引導核苷酸序列的 5'； (c) 第一莖環序列，其從 5' 至 3' 包含： (i) 第一 5' 莖環臂，其包含第一引導核苷酸序列，該第一引導核苷酸序列與表 2 及/或表 3 中所列出的引導序列之任一者具有至少 85% 序列同一性； (ii) 第一環區域，其中該第一環區域包含第一微小 RNA 環序列； (iii) 第一 3' 莖環臂，其包含與該第一引導序列互補或實質上互補的第一隨從核苷酸序列； (d) 第一 3' 側翼區域，其位於該第一隨從核苷酸序列的 3'； (e) 第二啟動子序列； (f) 第二 5' 側翼區域，其位於第二隨從核苷酸序列的 5'； (g) 第二莖環序列，其從 5' 至 3' 包含： (i) 第二 5' 莖環臂，其包含與第二引導序列互補或實質上互補的第二隨從核苷酸序列； (ii) 第二環區域，其中該第二環區域包含第二微小 RNA 環序列； (iii) 第二 3' 莖環臂，其包含第二引導核苷酸序列，該第二引導核苷酸序列與表 2 及/或表 3 中所列出的引導序列之任一者具有至少 85% 序列同一性； 及 (h) 第二 3' 側翼區域，其位於該第二引導核苷酸序列的 3'。
  99. 一種包含核苷酸序列之表現匣，其從 5' 至 3' 包含： (a) 第一啟動子序列； (b) 第一 5' 側翼區域，其位於第一引導核苷酸序列的 5'； (c) 第一莖環序列，其從 5' 至 3' 包含： (i) 第一 5' 莖環臂，其包含第一引導核苷酸序列，該第一引導核苷酸序列與表 2 及/或表 3 中所列出的引導序列之任一者具有至少 85% 序列同一性； (ii) 第一環區域，其中該第一環區域包含第一微小 RNA 環序列； (iii) 第一 3' 莖環臂，其包含與該第一引導序列互補或實質上互補的第一隨從核苷酸序列； (d) 第一 3' 側翼區域，其位於該第一隨從核苷酸序列的 3'； (e) 第二啟動子序列； (f) 第二 5' 側翼區域，其位於第二引導核苷酸序列的 5'； (g) 第二莖環序列，其從 5' 至 3' 包含： (i) 第二 5' 莖環臂，其包含引導核苷酸序列，該引導核苷酸序列與表 2 及/或表 3 中所列出的引導序列之任一者具有至少 85% 序列同一性； (ii) 第二環區域，其中該第二環區域包含第二微小 RNA 環序列； (iii) 第二 3' 莖環臂，其包含與該第二引導序列互補或實質上互補的第二隨從核苷酸序列； 及 (h) 第二 3' 側翼區域，其位於該第二隨從核苷酸序列的 3'。
  100. 如請求項 86 至 99中任一項之表現匣，其中該第一啟動子及/或該第二啟動子係選自由以下所組成之群組：U6 啟動子、H1 啟動子、7SK 啟動子、載脂蛋白 E-人α1-抗胰蛋白酶啟動子、CAG 啟動子、CBA 啟動子、CK8 啟動子、mU1a 啟動子、延長因子 1α 啟動子、甲狀腺素結合球蛋白啟動子、突觸蛋白啟動子、RNA 結合 Fox-1 同源物 3 啟動子、鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶 II 啟動子、神經元特異性烯醇酶啟動子、血小板衍生生長因子次單元 β、囊泡麩胺酸轉運蛋白啟動子、體抑素啟動子、神經肽 Y 啟動子、血管活性腸肽啟動子、小白蛋白啟動子、麩胺酸去羧酶 65 啟動子、麩胺酸去羧酶 67 啟動子、多巴胺受體 D1 啟動子、多巴胺受體 D2 啟動子、補體 C1q 樣 2 啟動子、原腦啡黑皮質素啟動子、Prospero 同源異形盒 1 啟動子、微管相關蛋白 1B 啟動子及微管蛋白 α 1 啟動子。
  101. 如請求項 86 至 100 中任一項之表現匣，其中該第一 5' 側翼區域及/或該第二 5' 側翼區域包含與下列中任一者之核酸序列具有至少 85% 序列同一性之多核苷酸：SEQ ID NO: 752、754、756、759、762、765 或 768。
  102. 如請求項 86 至 101 中任一項之表現匣，其中該第一 3' 側翼區域及/或該第二 3' 側翼區域包含與下列中任一者之核酸序列具有至少 85% 序列同一性之多核苷酸：SEQ ID NO: 753、755、757、760、763、766 或 769。
  103. 如請求項 86 至 102 中任一項之表現匣，其中該第一微小 RNA 環序列及/或該第二微小 RNA 環序列為 miR-30、miR-155、miR-218-1 或 miR-124-3 序列。
  104. 如請求項 103 之表現匣，其中該微小 RNA 環序列包含與下列中任一者之核酸序列具有至少 85% 序列同一性之多核苷酸：SEQ ID NO: 758、761、764、767 或 770。
  105. 如請求項 74 至 104 中任一項之表現匣，其中該表現匣包含在該表現匣的 5' 端的 5'-反向末端重複 (ITR) 序列及在該表現匣的 3' 端的 3'-ITR 序列。
  106. 如請求項 105 之表現匣，其中該 5'-ITR 及 3'ITR 序列為 AAV2 5'-ITR 及 3'ITR 序列。
  107. 如請求項 105 或 106 之表現匣，其中該 5'-ITR 序列包含與下列核酸序列具有至少 85% 序列同一性的多核苷酸：SEQ ID NO: 746 或 SEQ ID NO: 747。
  108. 如請求項 105 至 107 中任一項之表現匣，其中該 3'-ITR 序列包含與下列核酸序列具有至少 85% 序列同一性的多核苷酸：SEQ ID NO: 748、SEQ ID NO: 749 或 789。
  109. 如請求項 74 至 108 中任一項之表現匣，其進一步包含增強子序列。
  110. 如請求項 109 之表現匣，其中該增強子序列包含與下列核酸序列具有至少 85% 序列同一性的多核苷酸：SEQ ID NO: 745。
  111. 如請求項 74 至 110 中任一項之表現匣，其進一步包含內含子序列。
  112. 如請求項 111 之表現匣，其中該內含子包含與下列核酸序列具有至少 85% 序列同一性的多核苷酸：SEQ ID NO: 743 或 SEQ ID NO: 744。
  113. 如請求項 74 至 112 中任一項之表現匣，其進一步包含一種或多種多腺苷酸化訊息。
  114. 如請求項 113 之表現匣，其中該一種或多種多腺苷酸化訊息為兔 β-珠蛋白 (RBG) 多腺苷酸化訊息或牛生長激素 (BGH) 多腺苷酸化訊息。
  115. 如請求項 114 之表現匣，其中該 RBG 多腺苷酸化訊息包含與下列核酸序列具有至少 85% 序列同一性的多核苷酸：SEQ ID NO: 750、SEQ ID NO: 751 或 SEQ ID NO: 792。
  116. 如請求項 114 之表現匣，其中該 BGH 多腺苷酸化訊息包含與下列核酸序列具有至少 85% 序列同一性的多核苷酸：793.
  117. 如請求項 74 至 116 中任一項之表現匣，其中該表現匣係經併入如請求項 66 至 73 中任一項之載體中。
  118. 如請求項 96 之表現匣，其中該表現匣包含與下列核酸序列具有至少 85% 序列同一性的多核苷酸：SEQ ID NO: 785、SEQ ID NO: 787 或 SEQ ID NO: 788。
  119. 如請求項 98 之表現匣，其中該表現匣包含與下列核酸序列具有至少 85% 序列同一性的多核苷酸：SEQ ID NO: 786。
  120. 如請求項 74 至 119 中任一項之表現匣，其進一步包含填充序列 (stuffer sequence)。
  121. 如請求項 120 之表現匣，其中該填充序列係位於該表現匣的 3' 端。
  122. 如請求項 120 或 121 之表現匣，其中該填充序列與下列核酸序列具有至少 85% 序列同一性：SEQ ID NO: 815 或 SEQ ID NO: 816；視情況，其中該填充序列與下列核酸序列具有至少 90% 序列同一性：SEQ ID NO: 815 或 SEQ ID NO: 816；視情況，其中該填充序列與下列核酸序列具有至少 95% 序列同一性：SEQ ID NO: 815 或 SEQ ID NO: 816；視情況，其中該填充序列與下列核酸序列具有至少 99% 序列同一性：SEQ ID NO: 815 或 SEQ ID NO: 816；視情況，其中該填充序列具有下列核酸序列：SEQ ID NO: 815 或 SEQ ID NO: 816。
  123. 一種抑制細胞中 Grik2 表現之方法，該方法包含使該細胞與如請求項 1 至 65 中任一項之該多核苷酸、如請求項 66 至 73 中任一項之載體、或如請求項 74 至 122 中任一項之表現匣的至少一者接觸。
  124. 如請求項 123 之方法，其中該多核苷酸與 Grik2 mRNA 特異性雜交並抑制或降低 Grik2 在該細胞中的表現。
  125. 如請求項 123 或 124 之方法，其中該方法降低該細胞中 Gluk2 蛋白之水平。
  126. 如請求項 125 之方法，其中該方法將該細胞中 GluK2 蛋白之水平降低至少 10%、至少 10%、至少至少 15%、至少 20%、至少 25%、至少 30%、至少 35%、至少 40%、至少 45%、至少 50%、至少 55%、至少 60%、至少 65%、至少 70% 或至少 75%。
  127. 如請求項 123 至 126 中任一項之方法，其中該細胞為神經元。
  128. 如請求項 127 之方法，其中該神經元為海馬神經元。
  129. 如請求項 128 之方法，其中該海馬神經元為 DGC。
  130. 如請求項 129 之方法，其中該 DGC 包含異常復發性苔狀纖維軸突 (aberrant recurrent mossy fiber axon)。
  131. 一種治療或改善有需要之個體的病症之方法，該方法包含將如請求項 1 至 65 中任一項之該多核苷酸、如請求項 66 至 73 中任一項之載體、或如請求項 74 至 122 中任一項之表現匣的至少一者投予該個體。
  132. 如請求項 131 之方法，其中該病症為癲癇。
  133. 如請求項 132 之方法，其中該癲癇為顳葉癲癇 (TLE)、慢性癲癇及/或難治性癲癇。
  134. 如請求項 133 之方法，其中該癲癇為 TLE。
  135. 如請求項 134 之方法，其中該 TLE 為外側 TLE (lTLE)。
  136. 如請求項 134 之方法，其中該 TLE 為內側 TLE (mTLE)。
  137. 如請求項 131 至 136 中任一項之方法，其中該個體為人。
  138. 一種醫藥組成物，其包含如請求項 1 至 65 中任一項之多核苷酸、如請求項 66 至 73 中任一項之載體、或如請求項 74 至 122 中任一項之表現匣，及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
  139. 一種套組，其包含如請求項 138 之醫藥組成物及藥品仿單。
  140. 如請求項 139 之套組，其中該藥品仿單包含於如請求項 131 至 137 中任一項之方法中使用該醫藥組成物之說明。
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