TW202334395A - 產生細胞之方法 - Google Patents

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蘇曼 沃德娜拉
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美商萊爾免疫藥物公司
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Abstract

本揭示案提供製備免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之方法，該等方法包括使該等細胞與可編程細胞信號傳導支架在包含至少約5 mM鉀離子之培養基中接觸。在一些態樣中，本文所揭示之方法增加細胞群體中的低分化細胞之數目。在一些態樣中，經培養細胞係經工程改造，例如以包含嵌合抗原受體(CAR)或經工程改造之T細胞受體(TCR)。在一些態樣中，將該等細胞投與至有需要之個體。

Description

產生細胞之方法
本揭示案係關於培養細胞，例如亞全能(pluripotent)、多能(multipotent)及/或免疫細胞(例如T細胞、NK細胞及/或TIL)之方法。在一些態樣中，本文所揭示之方法促進培養中之低分化細胞(less-differentiated cell)及/或未分化細胞的富集。使用本文所揭示之方法培養的細胞可用於多種細胞療法，包括但不限於嵌合抗原受體(CAR) T細胞療法及TCR T細胞療法，包括新抗原定向T細胞療法。
癌症免疫療法依賴於利用T細胞(免疫系統針對受感染及患病細胞的主要殺手)來攻擊及殺死腫瘤細胞。然而，關於免疫療法，存在一個重要的障礙物：T細胞之殺死能力可衰退，該現象通常稱作T細胞之耗竭或終末分化。免疫檢查點阻斷、離體擴增之腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)療法、嵌合抗原受體(CAR) T細胞療法及T細胞受體工程改造(TCR)之T細胞療法係利用自患者分離的功能活性T細胞且需要高度功能性T細胞方才有效之治療。此等T細胞係經工程改造且離體擴增以識別標靶癌細胞上之抗原。T細胞療法在治癒實體癌症方面並非始終有效，這部分地因為T細胞隨時間喪失其增殖或殺死能力。
一種克服T細胞耗竭之方式係選擇性地投與具有低分化狀態之T細胞。例如，T記憶幹細胞(T SCM)在投與之後在患者中持續之時期比高分化T中央記憶(T CM)或T效應子記憶(T EM)細胞更長，且與高分化細胞相比，T SCM對腫瘤大小之影響更顯著且更長。然而，此項技術中仍需要自經分離之T細胞的混合群體中有效富集低分化及/或幼稚T細胞之方法。
本揭示案之一些態樣係關於製備用於免疫療法之人類免疫細胞群體的方法，該等方法包括使人類免疫細胞與可編程細胞信號傳導支架(PCS)在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸。
本揭示案之一些態樣係關於活化用於免疫療法之人類免疫細胞群體的方法，該等方法包括使人類免疫細胞與可編程細胞信號傳導支架(PCS)在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸。
本揭示案之一些態樣係關於在離體或活體外培養期間增加經活化人類免疫細胞之產量之方法，該等方法包括使人類免疫細胞與可編程細胞信號傳導支架(PCS)在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸。
本揭示案之一些態樣係關於在離體或活體外培養期間增加用於免疫療法之經活化人類免疫細胞之幹細胞性、同時增加經活化人類免疫細胞之產量的方法，該等方法包括使人類免疫細胞與可編程細胞信號傳導支架(PCS)在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸。
本揭示案之一些態樣係關於離體或活體外擴增經活化幹細胞樣免疫細胞群體之方法，該等方法包括使免疫細胞與可編程細胞信號傳導支架(PCS)在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸。
在一些態樣中，PCS包含(i)包含高表面積中孔二氧化矽微棒(MSR)之基層；(ii)在該MSR基層上分層之連續、流體支撐脂質雙層(SLB)；(iii)裝載至該支架上之複數種表面指示物；及(iv)裝載至該支架上之複數種可溶性指示物。
在一些態樣中，表面指示物經裝載至SLB層上。在一些態樣中，可溶性指示物經裝載至MSR基層上。
在一些態樣中，可溶性指示物以控制釋放方式自支架釋放。在一些態樣中，可溶性指示物以持續方式自支架釋放持續至少30天。
在一些態樣中，該複數種可溶性指示物包含IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、轉化生長因子β (TGF-β)或其促效劑、其模擬物、其變異體、其功能片段或其組合。在一些態樣中，該複數種可溶性指示物包含(i) IL-2、其促效劑、其模擬物、其變異體、其功能片段或其組合，及(ii)包含IL-7、IL-21、IL-15、IL-15超促效劑或其任何組合之第二可溶性指示物。在一些態樣中，該複數種可溶性指示物包含(i) IL-2、其促效劑、其模擬物、其變異體、其功能片段或其組合，(ii)包含IL-7、IL-21、IL-15、IL-15超促效劑或其任何組合之第二可溶性指示物，及(iii)包含IL-7、IL-21、IL-15、IL-15超促效劑或其任何組合之第三可溶性指示物。在一些態樣中，該複數種可溶性指示物包括包含IL-2之前30個胺基酸(pl-30)的N端IL-2片段、IL-2超細胞介素肽、IL-2部分促效劑肽或其組合。
在一些態樣中，該複數種表面指示物包含T細胞刺激分子、T細胞共刺激分子或T細胞刺激分子及T細胞共刺激分子兩者。在一些態樣中，T細胞刺激分子及T細胞共刺激分子各自獨立地裝載至流體支撐之脂質雙層(SLB)上。
在一些態樣中，T細胞刺激分子及T細胞共刺激分子經由親和配對或化學偶合經裝載。在一些態樣中，親和偶合包含生物素-卵白素對、抗體-抗原對、抗體-半抗原對、親和對、捕捉蛋白對、Fc受體-IgG對、金屬螯合脂質對或其組合。在一些態樣中，化學偶合包含疊氮化物-炔烴化學(AAC)反應、二苯并-環辛炔接合(DCL)、四嗪-烯烴接合(TAL)或其任何組合。
在一些態樣中，T細胞刺激分子及T細胞共刺激分子各自獨立地經塗佈於流體支撐之脂質雙層(SLB)上。在一些態樣中，T細胞刺激分子及T細胞共刺激分子各自獨立地部分包埋於流體支撐之脂質雙層(SLB)上。在一些態樣中，T細胞刺激分子及T細胞共刺激分子各自獨立地裝載至中孔二氧化矽微棒(MSR)上。在一些態樣中，T細胞刺激分子及T細胞共刺激分子各自獨立地為抗體分子或其抗原結合片段。
在一些態樣中，T細胞刺激分子包含抗CD3抗體或其抗原結合部分、抗巨噬細胞清道夫受體(MSR1)抗體或其抗原結合部分、抗T細胞受體(TCR)抗體或其抗原結合部分、抗CD2抗體或其抗原結合部分、抗CD47抗體或其抗原結合部分、裝載有MHC肽之主要組織相容性複合物(MHC)分子或其多聚體、MHC-免疫球蛋白(Ig)結合物或其多聚體或其組合。
在一些態樣中，T細胞共刺激分子包含抗體或其抗原結合部分，其特異性結合於共刺激抗原，該共刺激抗原包含CD28、4.1BB (CD137)、OX40 (CD134)、CD27 (TNFRSF7)、GITR (CD357)、CD30 (TNFRSF8)、HVEM (CD270)、LTfiR (TNFRSF3)、DR3 (TNFRSF25)、ICOS (CD278)、CD226 (DNAM1)、CRTAM (CD355)、TIM1 (HAVCR1、KIM1)、CD2 (LFA2、0X34)、SLAM (CD150、SLAMF1)、2B4 (CD244、SLAMF4)、Lyl08 (NTBA、CD352、SLAMF6)、CD84 (SLAMF5)、Ly9 (CD229、SLAMF3)、CRACC (CD319、BLAME)或其任何組合。
在一些態樣中，T細胞刺激分子及T細胞共刺激分子包含雙特異性抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，T細胞刺激分子及T細胞共刺激分子包含一對，該對包含CD3/CD28、CD3/ICOS、CD3/CD27、CD3/CD137或其組合。
在一些態樣中，該支架進一步包含特異性結合於Fc融合蛋白之免疫球蛋白分子。
在一些態樣中，該支架進一步包含募集化合物，該募集化合物包含粒細胞巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、趨化介素(C-C模體)配位體21 (CCL-21)、趨化介素(C-C模體)配位體19 (CCL-19)、趨化介素(C-X-C模體)配位體12 (CXCL12)、干擾素γ (IFNy)、FMS樣酪胺酸激酶3 (Flt-3)配位體或其任何組合。在一些態樣中，募集化合物包含粒細胞巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)。
在一些態樣中，該支架進一步包含抗原。在一些態樣中，該抗原包含腫瘤抗原。在一些態樣中，該腫瘤抗原為腺瘤性結腸瘜肉蛋白(APC)、腺苷去胺酶結合蛋白(AD Abp)、a-胎兒蛋白、AFP (α-胎兒蛋白)、AIM-2、AIM-3及WT1、ART1、ART4、B7-H3、B7-H6、BAGE、BCMA、B-細胞週期蛋白、BMI1、Braf、腦糖原磷酸化酶、BRAP、C13orf24、C6orfl53、C9orf 112、CA-125、CA9 (碳酸酐酶9)、CASP-8、組織蛋白酶B、Cav-1、CCL-1 (C-C模體趨化介素配位體1)、CD123、CD138、CD171、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD352、CD38、CD40、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD45、CD47、CD5、CD56、CD66e、CD70、CD74、CD74、CD79a、CD79b、CD98、cdc27、CDK-1、CDK4、CEA、CEA (癌胚抗原)、c-erbB-2、Claudin 18.2、Claudin 6、c-MET、結腸直腸相關抗原(CRC)- C017-1A/GA733、連結蛋白37、COX-2、CT-7、親環素b、CYNL2、二肽基肽酶IV (DPPIV)、DLL3 (δ樣蛋白3)、DLL4、EBV編碼之核抗原(EBNA)-I、E-鈣黏蛋白、EGFRvIII、ENPP3 (外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員3)、EpCAM、EPG-2 (上皮醣蛋白2)、EPG-40、EPHa2 (腎上腺素受體A2)、EphA2/Eck、ephrinB2、ERBB二聚體、ESO-1、雌激素受體、ETBR (內皮素B受體)、EZH2、FAP-α (纖維母細胞活化蛋白α)、FBP (葉酸結合蛋白)、FCRL5、胎兒AchR (胎兒乙醯膽鹼受體)、胞襯蛋白、Fra-l/Fosl 1、FR-α (葉酸受體α)、GAGE-1、GAGE家族腫瘤抗原、神經節苷脂/GD2、GCC (鳥苷酸環化酶C)、GD2、GD2神經節苷脂、GD3、GLEA2、GM2、GnT-V、GnT-V、GOLGA、gp100 (醣蛋白100)、gp75、GPC2 (磷脂醯肌醇蛋白聚糖-2)、GPC3、gplOO、GPNMB (醣蛋白NMB)、GPRC5D (G蛋白偶合受體5D)、GUI、H60、B型肝炎表面抗原、HER2、HER3、HER4、與源自AFP之肽複合的HLA-A、HLA-A1 (人類白血球抗原Al)、HLA-A2 (人類白血球抗原A2)、HMW-MAA (人類高分子量黑色素瘤相關抗原)、HSPH1、Ig κ、Ig λ、IGF1R (胰島素樣生長因子1受體)、Ig-個體基因型、IL-13Ra2 (IL-13受體α 2)、IL13Rα、IL-22Ra (IL-22受體α)、ING4、KDR (激酶插入結構域受體)、Ki67、KIAA0376、KRAS、Ku70/80、LAGE-I、Lewis Y、LI細胞黏附分子(LI -CAM)、Liv-1、Livin、lmp-1、LRRC8A (含富含白胺酸重複序列之8家族成員A)、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-A、MAGE-A3、MAGE-A6、MART-1 (melan A)、MCSP (黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚醣)、黑色素瘤相關抗原(MAGE)-A1、間皮素、MHC/肽複合物(例如，MICA、MICB、midkin、MRP-3、MUC16、黏蛋白1 (MUC1)、MUM-1、鼠科動物巨細胞病毒(MCMV)、NAG、NCAM (神經細胞黏附分子)、Nectin-4、巢蛋白、NKG2D (天然殺手2族成員D)配位體、NKTR、NSEP1、NY-ESO、NY-ESO-1、OLIG2、致癌胎兒抗原、P1A、p53、PAP、PD-1、PD-L1、pl20ctn、pl5、Pmell l7、PRAME (優先表現之黑色素瘤抗原)、助孕酮受體、PROX1、PSA (前列腺特異性抗原)、PSCA (前列腺幹細胞抗原)、PSMA、PSMA (前列腺特異性膜抗原)、RAE-1蛋白、RAGE、ras、RBPSUH、RCAS1、ROR1、ROR2、RTN4、SART1、SART2、SART3、SCP-I、SIRPα (信號調節蛋白α)、SLIT、SLITRK6 (NTRK樣蛋白6)、Smad家族腫瘤抗原、SOX10、SOX11、SOX2、SSX-2 (HOM-MEL-40)、SSX-4、SSX-5、SSX-I、SSX-I、STEAP1 (前列腺六跨膜上皮抗原1)、存活素、存活素、TAG72 (腫瘤相關醣蛋白72)、T細胞受體/CD3-ζ鏈、TNKS2、TPBG (滋養層醣蛋白)、TPR、Trop-2、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶、U2AF1L、UL16結合蛋白樣轉錄物1 (Multl)、UPAR、VEGFR1 (血管內皮生長因子受體1)、VEGFR2、WT-1、αvβ6或另一整合素、β-鏈蛋白、β1,6-Ν、β-鏈蛋白、γ-鏈蛋白、ίίνίηβ以及來自HIV、HBV、HCV、HPV及其他病原體之抗原、患者特異性新抗原或其免疫原性肽及其任何組合。
在一些態樣中，支撐之脂質雙層(SLB)與中孔二氧化矽微棒(MSR)之重量比在約10:1與約1:20之間。在一些態樣中，該連續、流體支撐之脂質雙層(SLB)包含選自由以下組成之群的脂質：(DMPC)、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)、棕櫚醯-油醯磷脂醯膽鹼(POPC)、二油醯磷脂醯膽鹼(DOPC)、二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)、二肉豆蔻醯磷脂醯乙醇胺(DMPE)及二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺(DPPE)、1-硬脂醯-2-肉豆蔻醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(8:0-14:0 PC)或其組合。在一些態樣中，該中孔二氧化矽微棒-脂質雙層(MSR-SLB)支架保留連續、流體架構持續至少14天。在一些態樣中，中孔二氧化矽微棒(MSR)與T細胞活化/共刺激分子之乾重比在1:1至50:1之間。
在一些態樣中，該方法進一步包括用編碼配位體結合蛋白之聚核苷酸修飾免疫細胞。
在一些態樣中，免疫細胞包含編碼抗原受體之聚核苷酸。在一些態樣中，該抗原受體係選自抗體、經工程改造之抗體(諸如scFv)、CAR、經工程改造之TCR、TCR模擬物、嵌合信號傳導受體(CSR)或其任何組合。在一些態樣中，CAR係經設計為標準CAR、分裂CAR、斷開CAR、接通CAR、第一代CAR、第二代CAR、第三代CAR或第四代CAR。
在一些態樣中，該抗原受體包含(i)抗原結合結構域、(ii)跨膜結構域、(iii)共刺激結構域、(iv)細胞內信號傳導結構域或(v) (i)-(iv)之任何組合。
在一些態樣中，該抗原結合結構域特異性結合選自由以下組成之群的抗原：AFP (α-胎兒蛋白)、αvβ6或另一整合素、BCMA、Braf、B7-H3、B7-H6、CA9 (碳酸酐酶9)、CCL-1 (C-C模體趨化介素配位體1)、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD45、CD47、CD56、CD66e、CD70、CD74、CD79a、CD79b、CD98、CD123、CD138、CD171、CD352、CEA (癌胚抗原)、Claudin 18.2、Claudin 6、c-MET、DLL3 (δ樣蛋白3)、DLL4、ENPP3 (外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員3)、EpCAM、EPG-2 (上皮醣蛋白2)、EPG-40、ephrinB2、EPHa2 (腎上腺素受體A2)、ERBB二聚體、雌激素受體、ETBR (內皮素B受體)、FAP-α (纖維母細胞活化蛋白α)、胎兒AchR (胎兒乙醯膽鹼受體)、FBP (葉酸結合蛋白)、FCRL5、FR-α (葉酸受體α)、GCC (鳥苷酸環化酶C)、GD2、GD3、GPC2 (磷脂醯肌醇蛋白聚糖-2)、GPC3、gp100 (醣蛋白100)、GPNMB (醣蛋白NMB)、GPRC5D (G蛋白偶合受體5D)、HER2、HER3、HER4、B型肝炎表面抗原、HLA-A1 (人類白血球抗原Al)、HLA-A2 (人類白血球抗原A2)、HMW-MAA (人類高分子量黑色素瘤相關抗原)、IGF1R (胰島素樣生長因子1受體)、Ig κ、Ig λ、IL-22Ra (IL-22受體α)、IL-13Ra2 (IL-13受體α 2)、KDR (激酶插入結構域受體)、LI細胞黏附分子(LI -CAM)、Liv-1、LRRC8A (含富含白胺酸重複序列之8家族成員A)、Lewis Y、黑色素瘤相關抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MART-1 (melan A)、鼠科動物巨細胞病毒(MCMV)、MCSP (黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚醣)、間皮素、黏蛋白1 (MUC1)、MUC16、MHC/肽複合物(例如，與源自AFP、KRAS、NY-ESO、MAGE-A及WT1之肽複合的HLA-A)、NCAM (神經細胞黏附分子)、Nectin-4、NKG2D (天然殺手2族成員D)配位體、NY-ESO、致癌胎兒抗原、PD-1、PD-L1、PRAME (優先表現之黑色素瘤抗原)、助孕酮受體、PSA (前列腺特異性抗原)、PSCA (前列腺幹細胞抗原)、PSMA (前列腺特異性膜抗原)、ROR1、ROR2、SIRPα (信號調節蛋白α)、SLIT、SLITRK6 (NTRK樣蛋白6)、STEAP1 (前列腺六跨膜上皮抗原1)、存活素、TAG72 (腫瘤相關醣蛋白72)、TPBG (滋養層醣蛋白)、Trop-2、VEGFR1 (血管內皮生長因子受體1)、VEGFR2以及來自HIV、HBV、HCV、HPV及其他病原體之抗原及其任何組合。在一些態樣中，該抗原結合結構域特異性結合ROR1。在一些態樣中，該抗原結合結構域特異性結合GPC2。
在一些態樣中，該共刺激結構域包含以下各物之共刺激結構域：介白素-2受體(IL-2R)、介白素-12受體(IL-12R)、IL-7、IL-21、IL-23、IL-15、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD27、CD28、CD30、CD40、4-1BB/CD137、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1 (LFA-1)、LIGHT、NKG2C、OX40、DAP10或其任何組合。在一些態樣中，該共刺激結構域包含4-1BB/CD137共刺激結構域。在一些態樣中，該跨膜結構域包含以下各物之跨膜結構域：KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1 (CD11a、CD18)、ICOS (CD278)、4-1BB (CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C、CD19或其任何組合。在一些態樣中，該跨膜結構域包含CD28跨膜結構域。在一些態樣中，該細胞內信號傳導結構域包含源自以下各物之細胞內信號傳導結構域：CD3 ζ、FcR γ、普通FcR γ (FCER1G)、Fc γ RIIa、FcR β (Fc ε Rib)、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD22、CD79a、CD79b、CD278 (「ICOS」)、FcεRI、CD66d、CD32、DAP10、DAP12或其任何組合。在一些態樣中，該細胞內信號傳導結構域包含CD3 ζ細胞內信號傳導結構域。
在一些態樣中，該抗原受體包含經工程改造之TCR。在一些態樣中，經工程改造之TCR特異性結合腫瘤抗原/MHC複合物。在一些態樣中，該腫瘤抗原源自AFP、CD19、BCMA、CLL-1、CS1、CD38、CD19、TSHR、CD123、CD22、CD30、CD171、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、Tn Ag、PSMA、ROR1、ROR2、GPC1、GPC2、FLT3、FAP、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、間皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、葉酸受體α、ERBB2 (Her2/neu)、MUC1、MUC16、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受體、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪胺酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WTl、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-Al、豆莢蛋白、HPV E6,E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相關抗原1、p53、p53突變體、前列腺素、存活素、端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MARTl、Ras突變體、hTERT、肉瘤易位斷點、ML-IAP、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受體、細胞週期蛋白Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人類端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2、腸道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、APRIL蛋白之細胞外部分、新抗原或其任何組合。
在一些態樣中，該外源聚核苷酸包含調節元件，且其中載體包含該外源聚核苷酸。在一些態樣中，該載體為多順反子表現載體。在一些態樣中，該調節元件包含啟動子。在一些態樣中，該啟動子包含dl587rev引子結合位點取代(MND)啟動子、EF1a啟動子、泛素啟動子或其組合。在一些態樣中，該載體包含病毒載體、哺乳動物載體或細菌載體。在一些態樣中，該載體包含腺病毒載體、慢病毒、仙台病毒載體(Sendai virus vector)、桿狀病毒載體、Epstein Barr病毒載體、乳多泡病毒載體、牛痘病毒載體、單純疱疹病毒載體、雜合病毒載體或腺相關病毒(AAV)載體。在一些態樣中，該載體為慢病毒。
在一些態樣中，鉀離子之濃度高於約10 mM、約15 mM、約20 mM、約25 mM、約30 mM、約35 mM、約40 mM、約45 mM、約50 mM、約55 mM、約60 mM、約65 mM、約70 mM、約75 mM、約80 mM、約85 mM或約90 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度係選自由約40 mM、約45 mM、約50 mM、約55 mM、約60 mM、約65 mM、約70 mM、約75 mM及約80 mM組成之群。在一些態樣中，鉀離子之濃度係在約30 mM與約80 mM之間、約40 mM與約80 mM之間、約50 mM與80 mM之間、約60 mM與約80 mM之間、約70 mM與約80 mM之間、約40 mM與約70 mM之間、約50 mM與約70 mM之間、約60 mM與約70 mM之間、約40 mM與約60 mM之間、約50 mM與約60 mM之間或約40 mM與約50 mM之間。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM、約60 mM或約70 mM。
在一些態樣中，該培養基進一步包含鈉離子。在一些態樣中，該培養基進一步包含NaCl。在一些態樣中，該培養基包含小於約140 mM、約130 mM、約120 mM、約110 mM、約100 mM、約90 mM、約80 mM、約70 mM、約60 mM、約50 mM或約40 mM NaCl。
在一些態樣中，該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子濃度及NaCl濃度之總和乘以2係小於280。在一些態樣中，鉀離子濃度及NaCl濃度之總和乘以2係大於240且小於280。在一些態樣中，鉀離子濃度及NaCl濃度之總和乘以2係大於或等於280且小於300。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM，且NaCl之濃度係小於80 mM、小於75 mM、小於70 mM、小於65 mM或小於60 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約55 mM，且NaCl之濃度係小於85 mM、小於80 mM、小於75 mM、小於70 mM或小於65 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM，且NaCl之濃度係小於90 mM、小於85 mM、小於80 mM、小於75 mM或小於70 mM。
在一些態樣中，該培養基進一步包含一或多種細胞介素。在一些態樣中，該一或多種細胞介素包含介白素-2 (IL-2)、介白素-7 (IL-7)、介白素-21 (IL-21)、介白素-15 (IL-15)或其任何組合。在一些態樣中，該一或多種細胞介素包含IL-2、IL-7及IL-15。
在一些態樣中，該培養基進一步包含鈣離子、葡萄糖或鈣離子及葡萄糖兩者。
在一些態樣中，該培養基進一步包含細胞擴增劑。在一些態樣中，該細胞擴增劑包含GSK3B抑制劑、ACLY抑制劑、PI3K抑制劑、AKT抑制劑或其任何組合。在一些態樣中，PI3K抑制劑係選自羥基檸檬酸鹽、LY294002、匹替利司(pictilisib)、CAL101、IC87114及其任何組合。在一些態樣中，AKT抑制劑係選自MK2206、A443654、AKTi-VIII及其任何組合。
在一些態樣中，如與起始免疫細胞及/或在不含高濃度之鉀離子的培養基中培養之免疫細胞相比，該培養基能夠在最終細胞產物中：(a)增加低分化及/或未分化細胞之數目及/或百分率；(b)增加轉導效率；(c)增加幹細胞樣免疫細胞；(d)增加活體內活力；(e)增加細胞效能；(f)防止細胞耗竭；(g)增加效應子樣細胞之數目及/或百分率；或(h)其任何組合。
在一些態樣中，該培養基進一步包含葡萄糖。在一些態樣中，葡萄糖之濃度超過約10 mM。在一些態樣中，葡萄糖之濃度為約10 mM至約25 mM、約10 mM至約20 mM、約15 mM至約25 mM、約15 mM至約20 mM、約15 mM至約19 mM、約15 mM至約18 mM、約15 mM至約17 mM、約15 mM至約16 mM、約16 mM至約20 mM、約16 mM至約19 mM、約16 mM至約18 mM、約16 mM至約17 mM、約17 mM至約20 mM、約17 mM至約19 mM或約17 mM至約18 mM。在一些態樣中，葡萄糖之濃度為約10 mM、約11 mM、約12 mM、約13 mM、約14 mM、約15 mM、約16 mM、約17 mM、約18 mM、約19 mM、約20 mM、約21 mM、約22 mM、約23 mM、約24 mM或約25 mM。在一些態樣中，葡萄糖之濃度為約15.4 mM、約15.9 mM、約16.3 mM、約16.8 mM、約17.2 mM或約17.7 mM。
在一些態樣中，該培養基進一步包含鈣離子。在一些態樣中，鈣離子之濃度超過約0.4 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.4 mM至約2.5 mM、約0.5 mM至約2.0 mM、約1.0 mM至約2.0 mM、約1.1 mM至約2.0 mM、約1.2 mM至約2.0 mM、約1.3 mM至約2.0 mM、約1.4 mM至約2.0 mM、約1.5 mM至約2.0 mM、約1.6 mM至約2.0 mM、約1.7 mM至約2.0 mM、約1.8 mM至約2.0 mM、約1.2至約1.3 mM、約1.2至約1.4 mM、約1.2至約1.5 mM、約1.2至約1.6 mM、約1.2至約1.7 mM、約1.2至約1.8 mM、約1.3至約1.4 mM、約1.3至約1.5 mM、約1.3至約1.6 mM、約1.3至約1.7 mM、約1.3至約1.8 mM、約1.4至約1.5 mM、約1.4至約1.6 mM、約1.4至約1.7 mM、約1.4至約1.8 mM、約1.5至約1.6 mM、約1.5至約1.7 mM、約1.5至約1.8 mM、約1.6至約1.7 mM、約1.6至約1.8 mM或約1.7至約1.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.0 mM、約1.1 mM、約1.2 mM、約1.3 mM、約1.4 mM、約1.5 mM、約1.6 mM、約1.7 mM、約1.8 mM、約1.9 mM或約2.0 mM。
在一些態樣中，該培養基包含濃度為約0.1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約15 ng/mL、約1 ng/mL至約14 ng/mL、約1 ng/mL至約13 ng/mL、約1 ng/mL至約12 ng/mL、約1 ng/mL至約11 ng/mL、約1 ng/mL至約10 ng/mL、約1 ng/mL至約9 ng/mL、約1 ng/mL至約8 ng/mL、約1 ng/mL至約7 ng/mL、約1 ng/mL至約6 ng/mL、約1 ng/mL至約5 ng/mL、約1 ng/mL至約4 ng/mL、約1 ng/mL至約3 ng/mL、約1 ng/mL至約2 ng/mL、約5 ng/mL至約15 ng/mL、約5 ng/mL至約10 ng/mL、約10 ng/mL至約20 ng/mL、約10 ng/mL至約15 ng/mL或約15 ng/mL至約20 ng/mL之IL-2。在一些態樣中，IL-2之濃度為約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2 ng/mL、約3 ng/mL、約4 ng/mL、約5 ng/mL、約6 ng/mL、約7 ng/mL、約8 ng/mL、約9 ng/mL、約10 ng/mL、約11 ng/mL、約12 ng/mL、約13 ng/mL、約14 ng/mL、約15 ng/mL、約16 ng/mL、約17 ng/mL、約18 ng/mL、約19 ng/mL或約20 ng/mL。在一些態樣中，IL-2之濃度為約1.0 ng/mL。在一些態樣中，IL-2之濃度為約10 ng/mL。
在一些態樣中，該培養基包含濃度為約0.1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約15 ng/mL、約1 ng/mL至約14 ng/mL、約1 ng/mL至約13 ng/mL、約1 ng/mL至約12 ng/mL、約1 ng/mL至約11 ng/mL、約1 ng/mL至約10 ng/mL、約1 ng/mL至約9 ng/mL、約1 ng/mL至約8 ng/mL、約1 ng/mL至約7 ng/mL、約1 ng/mL至約6 ng/mL、約1 ng/mL至約5 ng/mL、約1 ng/mL至約4 ng/mL、約1 ng/mL至約3 ng/mL、約1 ng/mL至約2 ng/mL、約5 ng/mL至約15 ng/mL、約5 ng/mL至約10 ng/mL、約10 ng/mL至約20 ng/mL、約10 ng/mL至約15 ng/mL或約15 ng/mL至約20 ng/mL之IL-21。在一些態樣中，IL-21之濃度為約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2 ng/mL、約3 ng/mL、約4 ng/mL、約5 ng/mL、約6 ng/mL、約7 ng/mL、約8 ng/mL、約9 ng/mL、約10 ng/mL、約11 ng/mL、約12 ng/mL、約13 ng/mL、約14 ng/mL、約15 ng/mL、約16 ng/mL、約17 ng/mL、約18 ng/mL、約19 ng/mL或約20 ng/mL。在一些態樣中，IL-21之濃度為約1.0 ng/mL。在一些態樣中，IL-21之濃度為約10 ng/mL。
在一些態樣中，該培養基包含濃度為約0.1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約15 ng/mL、約1 ng/mL至約14 ng/mL、約1 ng/mL至約13 ng/mL、約1 ng/mL至約12 ng/mL、約1 ng/mL至約11 ng/mL、約1 ng/mL至約10 ng/mL、約1 ng/mL至約9 ng/mL、約1 ng/mL至約8 ng/mL、約1 ng/mL至約7 ng/mL、約1 ng/mL至約6 ng/mL、約1 ng/mL至約5 ng/mL、約1 ng/mL至約4 ng/mL、約1 ng/mL至約3 ng/mL、約1 ng/mL至約2 ng/mL、約5 ng/mL至約15 ng/mL、約5 ng/mL至約10 ng/mL、約10 ng/mL至約20 ng/mL、約10 ng/mL至約15 ng/mL或約15 ng/mL至約20 ng/mL之IL-7。在一些態樣中，IL-7之濃度為約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2 ng/mL、約3 ng/mL、約4 ng/mL、約5 ng/mL、約6 ng/mL、約7 ng/mL、約8 ng/mL、約9 ng/mL、約10 ng/mL、約11 ng/mL、約12 ng/mL、約13 ng/mL、約14 ng/mL、約15 ng/mL、約16 ng/mL、約17 ng/mL、約18 ng/mL、約19 ng/mL或約20 ng/mL。在一些態樣中，IL-7之濃度為約1.0 ng/mL。在一些態樣中，IL-7之濃度為約10 ng/mL。
在一些態樣中，該培養基包含濃度為約0.1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約15 ng/mL、約1 ng/mL至約14 ng/mL、約1 ng/mL至約13 ng/mL、約1 ng/mL至約12 ng/mL、約1 ng/mL至約11 ng/mL、約1 ng/mL至約10 ng/mL、約1 ng/mL至約9 ng/mL、約1 ng/mL至約8 ng/mL、約1 ng/mL至約7 ng/mL、約1 ng/mL至約6 ng/mL、約1 ng/mL至約5 ng/mL、約1 ng/mL至約4 ng/mL、約1 ng/mL至約3 ng/mL、約1 ng/mL至約2 ng/mL、約5 ng/mL至約15 ng/mL、約5 ng/mL至約10 ng/mL、約10 ng/mL至約20 ng/mL、約10 ng/mL至約15 ng/mL或約15 ng/mL至約20 ng/mL之IL-15。在一些態樣中，IL-15之濃度為約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2 ng/mL、約3 ng/mL、約4 ng/mL、約5 ng/mL、約6 ng/mL、約7 ng/mL、約8 ng/mL、約9 ng/mL、約10 ng/mL、約11 ng/mL、約12 ng/mL、約13 ng/mL、約14 ng/mL、約15 ng/mL、約16 ng/mL、約17 ng/mL、約18 ng/mL、約19 ng/mL或約20 ng/mL。在一些態樣中，IL-15之濃度為約1.0 ng/mL。在一些態樣中，IL-15之濃度為約10 ng/mL。
本揭示案之一些態樣係關於藉由本文所揭示之方法製備的人類免疫細胞群體。在一些態樣中，該等人類免疫細胞包含T細胞。在一些態樣中，該等免疫細胞為CD3 +、CD45RO -、CCR7 +、CD45RA +、CD62L +、CD27 +、CD28 +、TCF7 +或其任何組合。在一些態樣中，該人類免疫細胞群體中之T細胞總數的至少約10%至至少約70%為幹細胞樣T細胞。在一些態樣中，該人類免疫細胞群體中之T細胞總數的至少約10%至至少約40%為CD39 -/CD69 -T細胞。在一些態樣中，該人類免疫細胞群體中之T細胞總數的至少約10%至至少約70%為CD39 -/TCF7 +T細胞。在一些態樣中，該人類免疫細胞群體包含CD8 +T細胞。
本揭示案之一些態樣係關於一種醫藥組合物，其包含本文所揭示之人類免疫細胞群體及醫藥學上可接受之載劑。
本揭示案之一些態樣係關於一種殺死標靶細胞之方法，該方法包括使該等標靶細胞與本文所揭示之免疫細胞群體或本文所揭示之醫藥組合物在允許由該等免疫細胞殺死該等標靶細胞的條件下接觸。
本揭示案之一些態樣係關於一種治療有需要之患者的方法，該方法包括向該患者投與本文所揭示之人類免疫細胞群體或本文所揭示之醫藥組合物。
本揭示案之一些態樣係關於本文所揭示之人類免疫細胞群體的用途，其用於製造用以在本文所揭示之方法中治療有需要之患者的藥劑。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2021年10月28日提出申請之美國臨時申請案第63/273,137號之優先權權益，該案以引用之方式整體併入本文。
細胞免疫療法之功效取決於多種因素，包括輸注至患者體內之細胞產物的持久性、多能性及不對稱細胞分裂。用於細胞療法之細胞的培養及/或工程改造所用之培養基及方法可深刻影響此等細胞之代謝、表觀遺傳及表型屬性，由此影響其治療潛力。
本揭示案係關於培養細胞之方法、藉由該等方法製備之細胞及/或用於該等細胞培養方法之組合物或套組。本揭示案之一些態樣係關於製備用於免疫療法之人類免疫群體的方法、活化用於免疫療法之人類免疫細胞群體的方法、在離體或活體外培養期間增加經活化之人類免疫細胞的產量之方法、在離體或活體外培養期間增加用於免疫療法之經活化之人類免疫細胞的幹細胞性、同時增加經活化之人類免疫細胞的產量之方法以及離體或活體外擴增經活化之幹細胞樣免疫細胞群體的方法；該等方法包括使免疫細胞與可編程細胞信號傳導支架(PCS)在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸。
在一些態樣中，本揭示案提供產生用於過繼細胞療法(ACT)之免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞)群體之方法，其中該等免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞)具有低分化狀態且保留增殖能力。在一些態樣中，該等免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞)具有低分化狀態且維持靶向且殺死腫瘤細胞之能力。在一些態樣中，該等免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞)具有低分化狀態，保留增殖能力，且維持靶向且殺死腫瘤細胞之能力。在一些態樣中，如與根據習知方法(例如，在具有小於5 mM鉀離子之培養基中)培養的細胞相比，根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞)在ACT中具有增加之功效。在一些態樣中，如與根據習知方法(例如，在具有小於5 mM鉀離子之培養基中)培養的免疫細胞相比，根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞)在ACT中在投與至個體後具有增加之持久性。此類增加之持久性係指該等免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞)在腫瘤微環境中浸潤且發揮作用之能力，抵抗耗竭之能力，以及幹細胞性的持久性以確保持續擴增及反應之耐久性。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞)為幹細胞樣細胞。此類細胞能夠自更新、增殖及分化。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞)為幹細胞樣細胞，其亦表現效應子樣標記物。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞)為幹細胞樣細胞，其亦維持靶向且殺死腫瘤細胞之能力。
本揭示案之細胞培養方法能夠增加所培養細胞之多能性及/或亞全能性，或者當細胞正在用載體轉導時，能夠增加轉導效率。在一些態樣中，當培養細胞及/或將細胞用於活體內療法時，該等培養方法能夠減少及/或防止細胞耗竭。在一些態樣中，該等培養方法亦能夠增加活體內活力、活體內持久性、活體內效應子功能或其任何組合。在一些態樣中，本文所揭示之培養方法能夠富集寡株或多株腫瘤反應性幹細胞樣T細胞及/或CD8 +TIL。在一些態樣中，本文所揭示之培養方法能夠保持源自癌症患者之TIL的純系多樣性。
在更詳細闡述本揭示案之前應理解，本揭示案並不限於所述之特定組合物或製程步驟，因此其當然可發生變化。如熟習此項技術者在閱讀本揭示案之後應明瞭，本文所描述及說明之個別態樣中的每一者均具有個別組分及特徵，該等組分及特徵可在不背離本揭示案之範圍或精神之情形下容易地與其他若干態樣中之任一者之特徵分離或組合。任何所列舉之方法均可依所列舉事件之次序或依邏輯上可能之任何其他次序來進行。
本文所提供之標題並非對本揭示案之多個態樣的限制，該等態樣可藉由參考整個說明書來定義。亦應理解，本文所用之術語僅用於描述特定態樣之目的，且不意欲具有限制性。 I. 術語
為了可更容易地理解本揭示案，首先定義某些術語。如本申請案中所用，除非本文另外明確提供，否則以下術語中每一者均應具有下文所闡述之含義。額外定義在本申請案通篇中加以闡述。
在本揭示案通篇中，術語「一(a/an)」實體係指一或多個彼實體；例如，應理解「嵌合多肽」代表一或多種嵌合多肽。因而，術語「一(a/an)」、「一或多個」及「至少一個」在本文中可互換使用。此外，使用「或」意謂清單中之組分的開放清單。例如，「其中X包含A或B」意謂X包含A，X包含B，X包含A及B，或X包含A或B及任何其他組分。
此外，「及/或」當在本文中使用時，應視為特定揭示兩種指定特徵或組分中之每一者與另一者一起或不與另一者一起之情況。因此，如本文中諸如「A及/或B」之片語中所用，術語「及/或」意欲包括「A及B」、「A或B」、「A」(單獨)及「B」(單獨)。同樣，如諸如「A、B及/或C」之片語中所用，術語「及/或」意欲涵蓋以下態樣中之每一者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A (單獨)；B (單獨)；及C (單獨)。
應理解，在本文中以語言「包含」描述態樣之任何情況下，亦提供以「由……組成」及/或「基本上由……組成」描述之其他類似態樣。
除非另有定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語均具有與本揭示案相關領域之一般技術者通常所理解相同之含義。舉例而言，Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show,第2版, 2002, CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology,第3版, 1999, Academic Press；及Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology,修訂版, 2000, Oxford University Press向熟習此項技術者提供本揭示案中所用之許多術語之通用詞典。
單位、字首及符號係以其國際單位制(Système International de Unites，SI)接受之形式表示。除非另外明確規定，否則數值範圍包括界定該範圍之數字。
本文所用之縮寫在本揭示案通篇中加以定義。本揭示案之各個態樣更詳細地描述於以下子部分中。
術語「約」或「基本上由......組成」係指如一般技術者所確定在特定值或組成之可接受誤差範圍內之值或組成，此將部分取決於如何量測或確定該值或組成，亦即，量測系統之局限性。舉例而言，「約」或「基本上包含」可意謂根據此項技術中之實踐在1個或超過1個標準偏差內。或者，「約」或「基本上包含」可意謂高達10%之範圍(例如，除非另外規定或自上下文另外明顯可見(除非此類數字將超過可能值之100%)，否則在任一方向(大於或小於)上處於所陳述之參考值之10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、3%、2%、1%或更小值以內之值的範圍)。例如，如本文所用，「約55 mM」包括49.5 mM mM至60.5 mM。另外，尤其對於生物系統或過程，該等術語可意謂高達一個數量級或高達值之5倍。當本申請案及申請專利範圍中提供特定值或組成時，除非另有說明，否則「約」或「基本上包含」之含義應假設在彼特定值或組成之可接受誤差範圍內。
如本文所用，術語「大約」在應用於一或多個相關值時係指與所陳述之參考值相似的值。在一些態樣中，除非另外規定或自上下文另外明顯可見(除非此類數字將超過可能值之100%)，否則術語「大約」(如術語「約」)係指在任一方向(大於或小於)上處於所陳述之參考值之10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小值以內之值的範圍。
如本文所述，除非另有指示，否則任何濃度範圍、百分率範圍、比率範圍或整數範圍均應理解為包括在所陳述之範圍內的任何整數之值，及在適當時其分數(諸如整數之十分之一及百分之一)。
如本文所用，術語「對照培養基」、「習知培養基」或「參考培養基」係指與本文所揭示之代謝再編程培養基(MRM)相比的任何培養基。對照培養基可包含與代謝再編程培養基相同之組分，除了某些離子濃度，例如鉀離子。在一些態樣中，由對照培養基藉由調節如本文所述之一或多種離子濃度(例如，鉀離子濃度)來製備本文所述之代謝再編程培養基。在一些態樣中，對照培養基包含基礎培養基，例如CTS™ OPTMIZER™。在一些態樣中，對照培養基因此包含一或多種額外組分，包括但不限於胺基酸、葡萄糖、麩醯胺酸、T細胞刺激物、抗體、取代物等，該一或多種額外組分亦添加至代謝再編程培養基中，但對照培養基具有與代謝再編程培養基不同的某些離子濃度。在一些態樣中，對照培養基不包含如本文所揭示之可編程細胞信號傳導支架(PCS)。除非另有指示，否則術語「培養基(media)」及「培養基(medium)」可互換使用。
如本文所用，術語「培養」係指離體及/或活體外細胞之受控生長。如本文所用，「培養」包括細胞(例如免疫細胞，例如一或多種本文所揭示之經工程改造之免疫細胞)在細胞擴增或細胞工程改造(例如，用用於表現CAR、TCR或TCRm之構築體進行轉導)期間的生長。在一些態樣中，經培養之細胞係獲自個體，例如人類個體/患者。在一些態樣中，經培養之細胞包含獲自人類個體之免疫細胞。在一些態樣中，經培養之細胞包含一或多種本文所揭示之經工程改造之免疫細胞。在一些態樣中，經培養之細胞包含獲自人類個體/患者之T細胞或NK細胞。在一些態樣中，該等T細胞及/或NK細胞在培養之前經純化。在一些態樣中，該等T細胞及/或NK細胞為腫瘤浸潤T細胞及/或NK細胞。在一些態樣中，經培養之細胞包含一或多種本文所揭示之經工程改造之免疫細胞。
如本文所用，關於免疫細胞培養，術語「擴增(expand/expansion)」係指刺激或活化細胞且培養細胞之過程。在細胞經刺激或活化且經培養之後，擴增過程可導致所需細胞之比例或總數增加，例如在經培養之細胞群體中低分化免疫細胞之比例或總數增加。擴增不需要經培養之細胞群體中的所有細胞類型之數目均增加。更確切地，在一些態樣中，在擴增期間僅經培養之細胞群體中之細胞子集之數目增加，而其他細胞類型之數目可能未變化或可能減少。
如本文所用，術語「產量」係指根據培養方法或其一部分之細胞總數。在一些態樣中，術語「產量」係指特定細胞群體，例如T細胞群體中之幹細胞樣T細胞。產量可使用任何方法來確定，包括但不限於基於代表性樣品來估計產量。
如本文所用，術語「代謝再編程培養基(metabolic reprogramming media/metabolic reprogramming medium)」或「MRM」係指本揭示案之培養基，其中該培養基具有增加之鉀濃度。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含濃度高於5 mM之鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含濃度高於40 mM之鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約10 mM、至少約15 mM、至少約20 mM、至少約25 mM、至少約30 mM、至少約35 mM、至少約40 mM、至少約45 mM、至少約50 mM、至少約55 mM、至少約60 mM、至少約65 mM、至少約70 mM、至少約75 mM、至少約80 mM、至少約85 mM、至少約90 mM、至少約95 mM或至少約100 mM之鉀離子濃度。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約40 mM至約80 mM NaCl、約40 mM至約90 mM KCl、約0.5 mM至約2.8 mM鈣及約10 mM至約24 mM葡萄糖。在一些態樣中，代謝再編程培養基進一步包含約250至約300 mOsmol之重量滲透濃度。在一些態樣中，代謝再編程培養基進一步包含如本文所揭示之可編程細胞信號傳導支架(PCS)。
如本文所用，術語「高於」意謂大於但不等於。例如，「高於4 mM」意謂超過4 mM但不包括4 mM之任何量。
如本文所用，術語「張力」係指所計算的跨細胞膜之有效滲透壓梯度，由鉀離子濃度及氯化鈉(NaCl)濃度之總和乘以2表示。張力可用溶液(例如培養基)之重量滲透濃度(mOsm/kg)或容積滲透濃度(mOsm/L)表述。重量滲透濃度及容積滲透濃度係每質量(重量滲透濃度)及每體積(容積滲透濃度)溶劑之溶質滲透濃度的量測值。如本文所用，等張培養基具有約280 mOsm/L (例如，([K+]+ [NaCl])×2 = 280)之張力。
如本文所用，低張溶液具有小於280 mOsm/L (例如，([K+]+[NaCl])×2＜280)之張力。在一些態樣中，低張培養基具有至少約210 mOsm/L至小於約280 mOsm/L之張力。在一些態樣中，低張培養基具有至少約220 mOsm/L至小於約280 mOsm/L之張力。在一些態樣中，低張培養基具有至少約230 mOsm/L至小於約280 mOsm/L之張力。在一些態樣中，低張培養基具有至少約240 mOsm/L至小於約280 mOsm/L之張力。在一些態樣中，本文所述之低張培養基具有約250 mOsm/L之張力。
如本文所用，高張溶液具有大於300 mOsm/L (例如，([K+]+[NaCl])×2＞300)之張力。在一些態樣中，本文所述之高張培養基具有約320 mOsm/L之張力。在一些態樣中，藉由增加或降低鉀離子及NaCl之濃度來調節溶液(例如培養基)之張力。在一些態樣中，可藉由用第二溶質之減少抵消一種溶質之增加來維持培養基之張力。例如，在不改變鈉離子濃度之情況下增加培養基中之鉀離子濃度可增加培養基之張力。然而，若增加鉀離子濃度且減少鈉離子濃度，則可維持原始培養基之張力。
如本文所用，術語「鉀」、「鉀離子」、「鉀陽離子」及「K+」可互換使用以指代元素鉀。元素鉀作為陽離子存在於溶液中。然而，一般技術者將顯而易知，製備包含鉀離子之溶液之標準方式包括將含鉀鹽(例如KCl)稀釋至溶液中。因而，可將包含莫耳(M)濃度之鉀離子之溶液(例如培養基)描述為包含等莫耳(M)濃度之包含鉀之鹽。
如本文所用，術語「鈉離子」及「鈉陽離子」可互換使用以指代元素鈉。元素鈉作為單價陽離子存在於溶液中。然而，一般技術者將顯而易知，製備包含鈉離子之溶液之標準方式包括將含鈉鹽(例如NaCl)稀釋至溶液中。因而，可將包含莫耳(M)濃度之鈉離子之溶液(例如培養基)描述為包含等莫耳(M)濃度之包含鈉之鹽。
如本文所用，術語「鈣離子」及「鈣陽離子」可互換使用以指代元素鈣。元素鈣作為二價陽離子存在於溶液中。然而，一般技術者將顯而易知，製備包含鈣離子之溶液之標準方式包括將含鈣鹽(例如CaCl 2)稀釋至溶液中。因而，可將包含莫耳(M)濃度之鈣離子的溶液(例如培養基)描述為包含等莫耳(M)濃度之包含鈣之鹽。
如本文所用，術語「免疫細胞」係指免疫系統之細胞。在一些態樣中，免疫細胞係選自T淋巴細胞(「T細胞」)、B淋巴細胞(「B細胞」)、天然殺手(NK)細胞、天然殺手T淋巴細胞(NKT細胞)、巨噬細胞、嗜酸性球、肥大細胞、樹突狀細胞或嗜中性球。如本文所用，細胞「群體」係指超過一個細胞(例如，複數個細胞)之集合。在一些態樣中，細胞群體包含超過一個免疫細胞，例如複數個免疫細胞。在一些態樣中，細胞群體係包含細胞之異質混合物，該混合物包含多種類型之細胞，例如免疫細胞及非免疫細胞之異質混合物。在一些態樣中，細胞群體包含複數個T細胞。
如本文所用，術語「T細胞」及「T淋巴細胞」可互換且係指由胸腺產生或加工之任何淋巴細胞。T細胞之非限制性類別包括效應子T細胞及T輔助(Th)細胞(諸如CD4 +或CD8 +T細胞)。在一些態樣中，該T細胞為Th1細胞。在一些態樣中，該T細胞為Th2細胞。在一些態樣中，該T細胞為Tc17細胞。在一些態樣中，該T細胞為Th17細胞。在一些態樣中，該T細胞為T reg細胞。在一些態樣中，該T細胞為腫瘤浸潤細胞(TIL)。
如本文所用，術語「記憶」T細胞係指先前已遇到其同源抗原且對該抗原作出反應(例如，活體內、活體外或離體)或已例如用抗CD3抗體刺激(例如，活體外或離體)之T細胞。免疫細胞在二次暴露後具有「記憶樣」表型，此類記憶T細胞可繁殖以產生比初始暴露期間更快且強烈之免疫反應。在一些態樣中，記憶T細胞包含中央記憶T細胞(T CM細胞)、效應子記憶T細胞(T EM細胞)、組織駐留記憶T細胞(T RM細胞)、幹細胞樣記憶T細胞(T SCM細胞)或其任何組合。
如本文所用，術語「幹細胞樣記憶T細胞」、「T記憶幹細胞」或「T SCM細胞」係指表現CD95、CD45RA、CCR7及CD62L且被賦予幹細胞樣自更新能力及重構記憶及效應子T細胞子集之整個範圍的多能能力之記憶T細胞。
如本文所用，術語「中央記憶T細胞」或「T CM細胞」係指表現CD45RO、CCR7及CD62L之記憶T細胞。中央記憶T細胞通常發現於淋巴結內及外周循環中。
如本文所用，術語「效應子記憶T細胞」或「T EM細胞」係指表現CD45RO但缺乏CCR7及CD62L表現之記憶T細胞。因為效應子記憶T細胞缺乏淋巴結歸巢受體(例如，CCR7及CD62L)，故此等細胞通常發現於外周循環中及非淋巴組織中。
如本文所用，術語「組織駐留記憶T細胞」或「T RM細胞」係指不循環且保持駐留在諸如皮膚、肺及胃腸道之外周組織中的記憶T細胞。在一些態樣中，組織駐留記憶T細胞亦為效應子記憶T細胞。
如本文所用，術語「幼稚T細胞(naïve T cell)」或「T N細胞」係指表現CD45RA、CCR7及CD62L但不表現CD95之T細胞。T N細胞代表T細胞譜系中最高程度未分化之細胞。T N細胞與抗原呈遞細胞(APC)之間的相互作用誘導T N細胞分化為經活化T EFF細胞以及免疫反應。
如本文所用，術語「幹細胞性」、「幹細胞樣(stem cell-like/stem-like)」或「低分化」係指表現與更幼稚表型一致之標記物的免疫細胞(例如T細胞或NK細胞)。例如，低分化T細胞可表現T N或T SCM細胞所特有之一或多種標記物。在一些態樣中，「低分化」或「幹細胞樣」T細胞表現CD45RA、CCR7及CD62L。在一些態樣中，「低分化」或「幹細胞樣」T細胞表現CD45RA、CCR7、CD62L及TCF7。在一些態樣中，「低分化」或「幹細胞樣」T細胞不表現CD45RO，或為CD45RO 低。在一些態樣中，本文所揭示之方法促進具有低分化表型之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。不受任何特定機制之束縛，在一些態樣中，本文所揭示之方法阻斷、抑制或限制低分化免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)的分化，從而導致培養物中之幹細胞樣細胞之數目增加。例如，通常認為為了有效控制腫瘤，具有幹細胞樣記憶或中央記憶表型之低分化免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之過繼轉移為較佳的。參見Gattinoni, L.等人， J. Clin. Invest. 115:1616-1626 (2005)；Gattinoni, L.等人， Nat Med15(7):808-814 (2009)；Lynn, R.C.等人， Nature576(7786): 293-300 (2019)；Gattinoni, L.等人， Nat Rev12:671-684 (2012)；Klebanoff, C.等人， J. Immunother35(9):651-670 (2012)及Gattinoni, L.等人， Nat Med17(10): 1290-1297 (2011)。
幹細胞性之特徵在於自更新能力、多能性及增殖潛力之持久性。在一些態樣中，幹細胞性之特徵在於特定基因印記(gene signature)，例如多種基因之組合表現模式。在一些態樣中，可藉由轉錄體分析，例如使用本文所揭示之幹細胞性基因印記來鑑別幹細胞樣細胞。在一些態樣中，基因印記包含選自以下之一或多種基因：ACTN1、DSC1、TSHZ2、MYB、LEF1、TIMD4、MAL、KRT73、SESN3、CDCA7L、LOC283174、TCF7、SLC16A10、LASS6、UBE2E2、IL7R、GCNT4、TAF4B、SULT1B1、SELP、KRT72、STXBP1、TCEA3、FCGBP、CXCR5、GPA33、NELL2、APBA2、SELL、VIPR1、FAM153B、PPFIBP2、FCER1G、GJB6、OCM2、GCET2、LRRN1、IL6ST、LRRC16A、IGSF9B、EFHA2、LOC129293、APP、PKIA、ZC3H12D、CHMP7、KIAA0748、SLC22A17、FLJ13197、NRCAM、C5orf13、GIPC3、WNT7A、FAM117B、BEND5、LGMN、FAM63A、FAM153B、ARHGEF11、RBM11、RIC3、LDLRAP1、PELI1、PTK2、KCTD12、LMO7、CEP68、SDK2、MCOLN3、ZNF238、EDAR、FAM153C、FAAH2、BCL9、C17orf48、MAP1D、ZSWIM1、SORBS3、IL4R、SERPINF1、C16orf45、SPTBN1、KCNQ1、LDHB、BZW2、NBEA、GAL3ST4、CRTC3、MAP3K1、HLA-DOA、RAB43、SGTB、CNN3、CWH43、KLHL3、PIM2、RGMB、C16orf74、AEBP1、SNORD115-11、SNORD115-11、GRAP及其任何組合(參見例如Gattinoni等人， Nature Medicine 17(10):1290-97 (2011))。在一些態樣中，基因印記包含選自以下之一或多種基因：NOG、TIMD4、MYB、UBE2E2、FCER1G、HAVCR1、FCGBP、PPFIBP2、TPST1、ACTN1、IGF1R、KRT72、SLC16A10、GJB6、LRRN1、PRAGMIN、GIPC3、FLNB、ARRB1、SLC7A8、NUCB2、LRRC7、MYO15B、MAL、AEBP1、SDK2、BZW2、GAL3ST4、PITPNM2、ZNF496、FAM117B、C16orf74、TDRD6、TSPAN32、C18orf22、C3orf44、LOC129293、ZC3H12D、MLXIP、C7orf10、STXBP1、KCNQ1、FLJ13197、LDLRAP1、RAB43、RIN3、SLC22A17、AGBL3、TCEA3、NCRNA00185、FAM153B、FAM153C、VIPR1、MMP19、HBS1L、EEF2K、SNORA5C、UBASH3A、FLJ43390、RP6-213H19.1、INPP5A、PIM2、TNFRSF10D、SNRK、LOC100128288、PIGV、LOC100129858、SPTBN1、PROS1、MMP28、HES1、CACHD1、NSUN5C、LEF1、TTTY14、SNORA54、HSF2、C16orf67、NSUN5B、KIAA1257、NRG2、CAD、TARBP1、STRADB、MT1F、TMEM41B、PDHX、KDM6B、LOC100288322、UXS1、LGMN、NANOS2、PYGB、RASGRP2、C14orf80、XPO6、SLC24A6、FAM113A、MRM1、FBXW8、NDUFS2、KCTD12及其任何組合(參見例如Gattinoni, L.等人， Nat Med17(10): 1290-1297 (2011))。在一些態樣中，基因印記包含選自以下之一或多種基因：SELL、CCR7、S1PR1、KLF3、TCF7、GPR183、SC5D、FAAH2、LTB、SESN3、MAL、TSHZ2、LEF1、AP3M2、SLC2A3、ICAM2、PLAC8、SCML1、IL7R、ABLIM1、RASGRP2、TRABD2A、SATB1、ALG13、ARID5A、BACH2、PABPC1、GPCPD1、NELL2、TAF4B、FCMR、ARRDC2、C1orf162、FAM177A1、ANKRD12、TXK、SORL1、AQP3、ADTRP、FXYD7、CD28、P2RY8、CRYBG1、TNFSF8、BEX2、PGAP1、PTGER4、MAML2、BEX3、PCSK1N、INPP4B、AC119396.1、CXCR5、LINC00402、CCR4、IL6R、ZBTB10、ITGA6、ARMH1、RILPL2、FOXP1、TESPA1、YPEL5、LPAR6、CMSS1、RIPOR2、ZNF331、EMP3、GIMAP7、WDR74、RIC3、CYSLTR1、ITGB1、CD5、SAMHD1、SERINC5及其任何組合(參見例如Caushi等人， Nature596: 126-132 (2021))。
如本文所用，術語「效應子樣」或「效應細胞樣」係指腫瘤細胞殺死能力及細胞介素多功能性，例如細胞產生發炎性細胞介素及/或細胞毒性分子之能力。在一些態樣中，效應子樣細胞之特徵在於該細胞所表現之特定標記物。在一些態樣中，彼等效應子樣標記物包含pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+及STAT3+中之一或多者。在一些態樣中，效應子樣標記物包含選自由以下組成之群的STAT標靶：AKT1、AKT2、AKT3、BCL2L1、CBL、CBLB、CBLC、CCND1、CCND2、CCND3、CISH、CLCF1、CNTF、CNTFR、CREBBP、CRLF2、CSF2、CSF2RA、CSF2RB、CSF3、CSF3R、CSH1、CTF1、EP300、EPO、EPOR、GH1、GH2、GHR、GRB2、IFNA1、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA2、IFNA21、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNAR1、IFNAR2、IFNB1、IFNE、IFNG、IFNGR1、IFNGR2、IFNK、IFNL1、IFNL2、IFNL3、IFNLR1、IFNW1、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA1、IL13RA2、IL15、IL15RA、IL19、IL2、IL20、IL20RA、IL20RB、IL21、IL21R、IL22、IL22RA1、IL22RA2、IL23A、IL23R、IL24、IL26、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL3RA、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST、IL7、IL7R、IL9、IL9R、IRF9、JAK1、JAK2、JAK3、LEP、LEPR、LIF、LIFR、MPL、MYC、OSM、OSMR、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3、PIK3R5、PIM1、PRL、PRLR、PTPN11、PTPN6、SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS7、SOS1、SOS2、SPRED1、SPRED2、SPRY1、SPRY2、SPRY3、SPRY4、STAM、STAM2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、TPO、TSLP、TYK2及其任何組合。在一些態樣中，藉由轉錄體分析來表徵效應子樣細胞。在一些態樣中，效應子樣標記物包含Kaech等人， Cell 111: 837-51 (2002)；Tripathi等人， J. Immunology 185:2116-24 (2010)；及/或Johnnidis等人， Science Immunology 6: eabe3702 (2021年1月15日)中所揭示之標記物，該等文獻中之每一者均以引用之方式整體併入本文中。
在一些態樣中，使用Gattinoni, L.等人， Nat Med17(10):1290-97 (2011)中所述之效應子相關基因集合來表徵效應子樣細胞。在一些態樣中，效應子樣細胞之基因印記包含選自以下之一或多種基因：MTCH2、RAB6C、KIAA0195、SETD2、C2orf24、NRD1、GNA13、COPA、SELT、TNIP1、CBFA2T2、LRP10、PRKCI、BRE、ANKS1A、PNPLA6、ARL6IP1、WDFY1、MAPK1、GPR153、SHKBP1、MAP1LC3B2、PIP4K2A、HCN3、GTPBP1、TLN1、C4orf34、KIF3B、TCIRG1、PPP3CA、ATG4D、TYMP、TRAF6、C17orf76、WIPF1、FAM108A1、MYL6、NRM、SPCS2、GGT3P、GALK1、CLIP4、ARL4C、YWHAQ、LPCAT4、ATG2A、IDS、TBC1D5、DMPK、ST6GALNAC6、REEP5、ABHD6、KIAA0247、EMB、TSEN54、SPIRE2、PIWIL4、ZSCAN22、ICAM1、CHD9、LPIN2、SETD8、ZC3H12A、ULBP3、IL15RA、HLA-DQB2、LCP1、CHP、RUNX3、TMEM43、REEP4、MEF2D、ABL1、TMEM39A、PCBP4、PLCD1、CHST12、RASGRP1、C1orf58、C11orf63、C6orf129、FHOD1、DKFZp434F142、PIK3CG、ITPR3、BTG3、C4orf50、CNNM3、IFI16、AK1、CDK2AP1、REL、BCL2L1、MVD、TTC39C、PLEKHA2、FKBP11、EML4、FANCA、CDCA4、FUCA2、MFSD10、TBCD、CAPN2、IQGAP1、CHST11、PIK3R1、MYO5A、KIR2DL3、DLG3、MXD4、RALGDS、S1PR5、WSB2、CCR3、TIPARP、SP140、CD151、SOX13、KRTAP5-2、NF1、PEA15、PARP8、RNF166、UEVLD、LIMK1、CACNB1、TMX4、SLC6A6、LBA1、SV2A、LLGL2、IRF1、PPP2R5C、CD99、RAPGEF1、PPP4R1、OSBPL7、FOXP4、SLA2、TBC1D2B、ST7、JAZF1、GGA2、PI4K2A、CD68、LPGAT1、STX11、ZAK、FAM160B1、RORA、C8orf80、APOBEC3F、TGFBI、DNAJC1、GPR114、LRP8、CD69、CMI、NAT13、TGFB1、FLJ00049、ANTXR2、NR4A3、IL12RB1、NTNG2、RDX、MLLT4、GPRIN3,、ADCY9、CD300A、SCD5、ABI3、PTPN22、LGALS1、SYTL3、BMPR1A、TBK1、PMAIP1、RASGEF1A,、GCNT1、GABARAPL1、STOM、CALHM2、ABCA2、PPP1R16B、SYNE2、PAM、C12orf75、CLCF1、MXRA7、APOBEC3C、CLSTN3、ACOT9、HIP1、LAG3、TNFAIP3、DCBLD1、KLF6、CACNB3、RNF19A、RAB27A、FADS3、DLG5、APOBEC3D、TNFRSF1B、ACTN4、TBKBP1、ATXN1、ARAP2、ARHGEF12、FAM53B、MAN1A1、FAM38A、PLXNC1、GRLF1、SRGN、HLA-DRB5、B4GALT5、WIPI1、PTPRJ、SLFN11、DUSP2、ANXA5、AHNAK、NEO1、CLIC1、EIF2C4、MAP3K5、IL2RB、PLEKHG1、MYO6、GTDC1、EDARADD、GALM、TARP、ADAM8、MSC、HNRPLL、SYT11、ATP2B4、NHSL2、MATK、ARHGAP18、SLFN12L、SPATS2L、RAB27B、PIK3R3、TP53INP1、MBOAT1、GYG1、KATNAL1、FAM46C、ZC3HAV1L、ANXA2P2、CTNNA1、NPC1、C3AR1、CRIM1、SH2D2A、ERN1、YPEL1、TBX21、SLC1A4、FASLG、PHACTR2、GALNT3、ADRB2、PIK3AP1、TLR3、PLEKHA5、DUSP10、GNAO1、PTGDR、FRMD4B、ANXA2、EOMES、CADM1、MAF、TPRG1、NBEAL2、PPP2R2B、PELO、SLC4A4、KLRF1、FOSL2、RGS2、TGFBR3、PRF1、MYO1F、GAB3、C17orf66、MICAL2、CYTH3、TOX、HLA-DRA、SYNE1、WEE1、PYHIN1、F2R、PLD1、THBS1、CD58、FAS、NETO2、CXCR6、ST6GALNAC2、DUSP4、AUTS2、C1orf21、KLRG1、TNIP3、GZMA、PRR5L、PRDM1、ST8SIA6、PLXND1、PTPRM、GFPT2、MYBL1、SLAMF7、FLJ16686、GNLY、ZEB2、CST7、IL18RAP、CCL5、KLRD1、KLRB1及其任何組合(參見例如Gattinoni, L.等人， Nat Med17(10):1290-97 (2011))。
在一些態樣中，可使用轉錄體分析藉由比較與T細胞活化(本文中亦稱為「TACT基因」)、T細胞前驅細胞耗竭(本文中亦稱為「TPE基因」)、T細胞終末耗竭(本文中亦稱為「TTE基因」)相關之基因的不同集合之上調及/或下調來評估細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之特徵。
在一些態樣中，使用Oliveira等人， Nature596: 119-125 (2021)中所述之TTE相關基因集合來表徵終末耗竭T細胞。在一些態樣中，TTE細胞之基因印記包含一或多種或所有選自以下之基因：KRT86、RDH10、ACP5、CXCR6、HMOX1、LAYN、CLIC3、HAVCR2、AC243829.4、PRF1、SLC2A8、CHST12、GALNT2、ENTPD1、LAG3、GZMB、PDCD1、CARD16、CTLA4、SLA2、CD27、RALA、VCAM1、SYNGR2、NKG7、LSP1、CCL5、RARRES3、CD7、CTSW、MTSS1、PTMS、BATF、KIR2DL4、AKAP5、CD38、RAB27A、GZMH、IGFLR1、ATP8B4、CD63、HOPX、TNFRSF18、ADGRG1、PLPP1、CSF1、TNFSF10、SNAP47、LINC01871、MYO1E、ZBED2、AHI1、ABI3、FASLG、TYMP、ZBTB38、CTSB、PLSCR1、AFAP1L2、ITGAE、TNS3、DUSP16、CASP1、CARS、DUSP5、IFIT1、SLC1A4、GOLIM4、RSAD2、DNPH1、NBL1、ACOT9、ABHD6、OAS1、SLC27A2、ZBP1、CD200R1、OAS3、CMPK2、TNFSF4、POLR1E、CADM1、HELZ2、SYTL2、AGPAT2、UBE2F、GIMAP6、ZBTB32、RIN3、PLEKHF1、CHPF、PACSIN2、ABCB1、SPATS2L、USP18、TMEM9、KLRC1、MPST。在一些態樣中，使用Oliveira等人， Nature596: 119-125 (2021)中所述之TPE相關基因集合來表徵前驅細胞耗竭T細胞(TPE)。在一些態樣中，TPE細胞之基因印記包含一或多種或所有選自以下之基因：FXYD6、CAV1、GNG4、XCL1、CRTAM、CXCL13、GEM、XCL2、FXYD2、HLA-DRA、LANCL2、RASSF4、BAG3、HSPA1B、HLA-DQA1、HSPB1、FABP5、MS4A6A、SERPINH1、HLA-DPA1、HLA-DRB1、HSPA1A、RGS2、DRAIC、CD74、HSPD1、HSPA6、HSPE1、CD82、TOX、CD200、HLA-DPB1、NR4A2、VCAM1、BEX3、AIF1、DNAJA1、HSPH1、DNAJB1、HIPK2、LHFPL6、HLA-DMA、GK、TSHZ2、LPL、C16orf45、ZFAND2A、CD80、ETV1、NMB、DEDD2、CMC1、PON2、SEMA4A、ENC1、GRAMD1A、MYL6B、BCAT1、ARMH1、TIAM1、PIKFYVE、MRPL18、INPP5F、LMCD1、SESN3、CCDC6、KIAA1324、CHN1、ANKRD10、CD70、PRRG4、TNFSF4、CORO1B、DNAJB4、MAGEH1、ICAM1、GGT1、NINJ2、BLVRA、FAAH2、TOX2、SLK、CCDC141、ATF3、INPP1、FAM3C、GADD45G、APP、MAL、SIT1、DRAM1、CLECL1、MDFIC、PMCH、HLA-DMB、PHF6、AFAP1L2、BTN2A2、CCL4L2。在一些態樣中，使用Oliveira等人， Nature596: 119-125 (2021)中所述之TACT相關基因集合來表徵經活化T細胞(TACT)。在一些態樣中，經活化T細胞之基因印記包含一或多種或所有選自以下之基因：EGR1、HSPA6、FOS、HSPA1B、GADD45B、NR4A1、FOSB、ATF3、DNAJB1、DUSP1、JUNB、CD69、NR4A2、NFKBIA、PPP1R15A、KLF6、DNAJA1、JUN、SRSF7、SLC2A3、ZFP36L1、IER2、HSPA1A、EIF4A2、ID1、IFRD1、CCNL1、RSRP1、SERTAD1、DEDD2、KLF10、AL118516.1、KLF2、ZFAND2A、CLK1、RSRC2、IER3、BTG2、MYLIP、MAFF、CSRNP1、ID2、ZC3H12A、BAG3、SNHG12、TNF、DDIT4、SGK1、SNHG15、DNAJB4、NR4A3、NFKBID、SCML1、RASD1、ATF4、AREG、RASGEF1B、AC020916.1、DDIT3、SNHG8、CITED2、TXNIP、TOB1、PIM2、SOCS3、GADD45G、RGS16、TIPARP、NFKBIZ、CCL4、CD83、PPP1R10、CCL4L2、SESN2、CHMP1B、LEF1、CSKMT、HEXIM1、HSPA2、MRPL18、RBKS、CD55、ARRDC2、SC5D、FAM53C、ATP2B1-AS1、IFNG、MYC、TSC22D2、SERPINH1、LRIF1、ARRDC3、ILF3-DT、INTS6、ZNF10、PRMT9、ATM、SELL、AC243960.1。
在長期抗原暴露存在下，諸如在多種癌症中，高分化免疫細胞(例如，效應子及效應子記憶T細胞)通常會變得耗竭且失去其抗腫瘤功能。可使用任何方法來量測生物標記物，例如T細胞標記物。在一些態樣中，相繼使用抗體染色、閘控流式細胞術來鑑別T細胞。
如本文所用，術語「基礎」培養基係指補充有本文所揭示之一或多種額外元素，例如鉀、鈉、鈣、葡萄糖、IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、可編程細胞信號傳導支架(PCS)或其任何組合之任何起始培養基。基礎培養基可為用於培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之任何培養基。在一些態樣中，基礎培養基包含平衡鹽溶液(例如，PBS、DPBS、HBSS、EBSS)、杜氏改良伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM)、克氏培養基(Click’s medium)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾基礎培養基(Basal Medium Eagle，BME)、F-10、F-12、RPMI 1640、格拉斯哥最低必需培養基(Glasgow Minimal Essential Medium，GMEM)、α最低必需培養基(α MEM)、Iscove改良杜氏培養基(IMDM)、M199、OPTMIZER TMPro、OPTMIZER™ CTS™ T細胞擴增基礎培養基(ThermoFisher)、OPTMIZER TM、OPTMIZER™ Complete、IMMUNOCULT™ XF (STEMCELL™ Technologies)、AIM V™、TEXMACS™培養基、PRIME-XV® T細胞CDM、X-VIVO TM15 (Lonza)、TRANSACT™ TIL擴增培養基或其任何組合。在一些態樣中，基礎培養基不含血清。在一些態樣中，基礎培養基包含PRIME-XV® T細胞CDM。在一些態樣中，基礎培養基包含OPTMIZER TM。在一些態樣中，基礎培養基包含OPTMIZER TMPro。在一些態樣中，基礎培養基進一步包含免疫細胞血清替代物(ICSR)。例如，在一些態樣中，基礎培養基包含補充有ICSR之OPTMIZER™ Complete、補充有ICSR之AIM V™、補充有ICSR之IMMUNOCULT™ XF、補充有ICSR之RPMI、補充有ICSR之TEXMACS™或其任何組合。在一些態樣中，合適之基礎培養基包括克氏培養基、OPTMIZER™ (CTS™)培養基、STEMLINE® T細胞擴增培養基(Sigma-Aldrich)、AIM V™培養基(CTS™)、TEXMACS™培養基(Miltenyi Biotech)、IMMUNOCULT™培養基(Stem Cell Technologies)、PRIME-XV® T細胞擴增XSFM (Irvine Scientific)、Iscoves培養基及/或RPMI-1640培養基。在一些態樣中，基礎培養基包含不含NaCl之CTS™ OPTMIZER™。在一些態樣中，除了NaCl以外，基礎培養基亦包含一或多種鈉鹽。
如本文所用，術語「細胞介素」係指由細胞釋放之小的分泌蛋白，其對細胞之間的相互作用及通訊具有特定影響。細胞介素之非限制性實例包括介白素(例如，介白素(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-13、IL-15、IL-3、IL-5、IL-6、IL-11、IL-10、IL-20、IL-14、IL-16、IL-17、IL-21及IL-23)、干擾素(IFN；例如，IFN-α、IFN-β及IFN-γ)、腫瘤壞死因子(TNF)家族成員及轉化生長因子(TGF)家族成員。本揭示案之一些態樣係關於在包含細胞介素之培養基中培養及/或擴增免疫細胞(例如T細胞及/或NK細胞或一或多種本文所揭示之經工程改造之免疫細胞)的方法。在一些態樣中，細胞介素為介白素。在一些態樣中，細胞介素包含IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或其任何組合。IL-2 (UniProtKB-P60568)係由T細胞因應抗原或有絲分裂刺激而產生。已知IL-2刺激T細胞增殖及對於免疫反應之調節至關重要之其他活性。IL-7 (UniProtKB - P13232)係能夠刺激淋巴樣前驅細胞增殖之造血生長因子。咸信IL-7在B細胞成熟之某些階段期間在增殖中發揮作用。與IL-2一樣，IL-15 (UniProtKB - P40933)係刺激T淋巴細胞增殖之細胞介素。IL-21 (UniProtKB - Q9HBE4)係具有免疫調節活性之細胞介素。認為IL-21促進先天性與適應性免疫性之間之轉換且誘導B細胞中產生IgG1及IgG3。IL-21亦可與IL-15協同在天然殺手(NK)細胞之增殖及成熟中發揮作用，且IL-21可因應活化刺激而調節成熟B細胞及T細胞之增殖。與IL-15及IL-18協同，IL-15亦刺激T細胞及NK細胞中之干擾素γ產生，且IL-21亦可在T細胞介導之免疫反應期間抑制樹突狀細胞活化及成熟。
如本文所用，術語「轉導效率」係指：(i)可在一段確定時期內以物理方式引入至細胞中之材料(例如，外源聚核苷酸)的量；(ii)將既定量之材料以物理方式引入至細胞中所耗用的時間量；(iii)細胞群體吸收標靶材料(例如外源聚核苷酸，亦即轉殖基因)之水準(例如，表現該轉殖基因之細胞的百分率)；或(iv) (i)-(iii)之任何組合。在一些態樣中，藉由增加轉導效率，本文所提供之培養方法可允許將更大量之外源核苷酸序列引入至細胞中及/或減少引入既定量之外源核苷酸序列所需之時間量。不受任一理論束縛，在一些態樣中，此類效應可增加所編碼之蛋白質(例如，c-Jun多肽)在經修飾免疫細胞中之表現。
如本文所用，「投與」係指使用多種方法及遞送系統中的任一者將治療劑或包含治療劑之組合物物理引入至個體。本文所述之治療劑(例如，經修飾以表現嵌合結合蛋白及c-Jun多肽且如本文所述而培養之免疫細胞)的不同投與途徑包括靜脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、脊髓或其他非經腸投與途徑，例如藉由注射或輸注。
如本文所用，片語「非經腸投與(parenteral administration)」意謂除腸及表面投與以外之投與模式，通常藉由注射，且包括但不限於靜脈內、腹膜內、肌肉內、動脈內、鞘內、淋巴管內、病變內、囊內、眶內、心內、皮內、經氣管、氣管內、肺、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、室內、玻璃體內、硬膜外及胸骨內注射及輸注，以及活體內電穿孔。
或者，本文所述之治療劑(例如，經修飾以表現嵌合結合蛋白及/或結合腫瘤抗原之TCR且如本文所述而培養之免疫細胞)可經由非-非經腸途徑投與，諸如表面、表皮或黏膜投與途徑，例如鼻內、經口、經陰道、經直腸、舌下或經表面。亦可例如一次、複數次及/或經一或多個延長時期執行投與。
如本文所用，「細胞工程改造」或「細胞修飾」(包括其派生詞)係指細胞(例如，本文所揭示之免疫細胞)的靶向修飾。在一些態樣中，細胞工程改造包括病毒基因工程改造、非病毒基因工程改造、引入受體以允許腫瘤特異性靶向(例如，嵌合結合蛋白及/或TCR)、引入一或多種改良T細胞功能之內源基因、引入一或多種改良免疫細胞(例如T細胞)功能之合成基因(例如編碼c-Jun多肽之聚核苷酸，使得該免疫細胞展現增加的c-Jun表現)或其任何組合。
如本文所用，術語「抗原」係指任何天然或合成免疫原性物質，諸如蛋白質、肽或半抗原。如本文所用，術語「同源抗原」係指由免疫細胞(例如，T細胞)識別且由此誘導免疫細胞活化(例如觸發細胞內信號，該等信號誘導效應子功能，諸如細胞介素產生，及/或用於細胞增殖)之抗原。在一些態樣中，該抗原包含腫瘤抗原。在一些態樣中，該抗原包含新抗原。
「癌症」係指一大組之各種疾病，其特徵在於體內異常細胞之不受控生長。失調的細胞分裂及生長可形成惡性腫瘤，其侵入鄰近組織且亦可經由淋巴系統或血流轉移至身體之遠端部分。如本文所用，「癌症」包含原發性、轉移性及復發性癌症。除非另有指示，否則術語「癌症」及「腫瘤」可互換使用。
術語「血液惡性腫瘤」或「血液癌症」係指哺乳動物造血及淋巴組織之癌症以及腫瘤。血液惡性腫瘤之非限制性實例包括影響血液、骨髓、淋巴結及淋巴系統之組織之彼等，包括急性淋巴母細胞白血病(ALL)、慢性淋巴細胞淋巴瘤(CLL)、小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)、急性骨髓白血病(AML)、慢性骨髓白血病(CIVIL)、急性單核細胞白血病(AMoL)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)及非霍奇金氏淋巴瘤。血液惡性腫瘤亦稱作「液體腫瘤」。液體腫瘤癌症包括但不限於白血病、骨髓瘤及淋巴瘤，以及其他血液惡性腫瘤。
如本文所用，「實體腫瘤」係指異常組織塊。實體腫瘤可為良性或惡性的。實體腫瘤之非限制性實例包括肉瘤、癌瘤及淋巴瘤，諸如肺、乳房、前列腺、結腸、直腸及膀胱之癌症。實體腫瘤之組織結構包括相互依賴之組織隔室，包括實質(癌細胞)及其中分散有癌細胞且可提供支持性微環境之支持性基質細胞。
在一些態樣中，癌症係選自腎上腺皮質癌、晚期癌症、肛門癌、再生障礙性貧血、膽管癌、膀胱癌、骨癌、骨轉移、腦腫瘤、腦癌、乳癌、兒童癌症、原發灶不明之癌症、Castleman病、子宮頸癌、結腸/直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、尤文腫瘤家族(Ewing family of tumors)、眼癌、膽囊癌、胃腸類癌腫瘤、胃腸基質腫瘤、妊娠滋養細胞疾病、霍奇金病、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、腎細胞癌、喉及下咽癌、急性淋巴細胞白血病、急性骨髓白血病、慢性淋巴細胞白血病、慢性骨髓白血病、慢性骨髓單核細胞白血病、肝癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺類癌腫瘤、皮膚淋巴瘤、惡性間皮瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、鼻腔及鼻竇癌、鼻咽癌、神經母細胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔及口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰臟癌、陰莖癌、垂體腫瘤、前列腺癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、成人軟組織肉瘤、基底細胞及鱗狀細胞皮膚癌、黑色素瘤、小腸癌、胃癌、睪丸癌、喉癌、胸腺癌、甲狀腺癌、子宮肉瘤、陰道癌、陰門癌、華氏巨球蛋白血症(Waldenstrom macroglobulinemia)、威爾姆氏腫瘤(Wilms tumor)及由癌症治療引起之繼發性癌症。在一些態樣中，癌症係選自軟骨肉瘤、纖維肉瘤、淋巴肉瘤、黑素肉瘤、黏液肉瘤、骨肉瘤、艾伯內西氏肉瘤(Abemethy’s sarcoma)、脂肪肉瘤(adipose sarcoma/liposarcoma)、腺泡狀軟組織肉瘤、成釉細胞肉瘤、葡萄狀肉瘤、綠髓肉瘤、絨毛膜癌、胚胎肉瘤、威爾姆氏腫瘤肉瘤、子宮內膜肉瘤、間質肉瘤、尤文氏肉瘤、筋膜肉瘤、纖維母細胞肉瘤、巨細胞肉瘤、顆粒球性肉瘤、霍奇金氏肉瘤、特發性多發性色素出血性肉瘤、B細胞免疫母細胞肉瘤、淋巴瘤、T細胞免疫母細胞肉瘤、詹森氏肉瘤(Jensen’s sarcoma)、卡波西氏肉瘤、庫普弗細胞肉瘤(Kupffer cell sarcoma)、血管肉瘤、白血病性肉瘤、惡性間葉瘤肉瘤、骨旁肉瘤、網狀細胞肉瘤、勞斯肉瘤(Rous sarcoma)、漿液性肉瘤、滑膜肉瘤、黏液樣/圓細胞脂肪肉瘤或毛細管擴張性肉瘤。在一些態樣中，癌症係選自肢端著色斑性黑色素瘤、無黑色素性黑色素瘤、良性青少年性黑色素瘤、克勞德曼氏黑色素瘤(Cloudman’s melanoma)、S91黑色素瘤、哈-帕二氏黑色素瘤(Harding-Passey melanoma)、青少年性黑色素瘤、惡性雀斑樣痣性黑色素瘤、惡性黑色素瘤、轉移性黑色素瘤、結節性黑色素瘤、甲下黑色素瘤或淺表擴散性黑色素瘤。在一些態樣中，癌症係選自腺泡癌(acinar carcinoma)、腺泡狀癌(acinous carcinoma)、腺囊性癌(adenocystic carcinoma)、腺樣囊性癌(adenoid cystic carcinoma)、腺瘤性癌、腎上腺皮質癌、濾泡癌、濾泡細胞癌、基底細胞癌(basal cell carcinoma/carcinoma basocellulare)、基底細胞樣癌、基底鱗狀細胞癌、細支氣管肺泡癌、細支氣管癌、支氣管癌、髓樣癌、膽管細胞癌、絨毛膜癌、膠樣癌、粉刺癌、子宮體癌、篩狀癌、鎧甲狀癌、癌瘡、圓柱狀癌(cylindrical carcinoma)、圓柱狀細胞癌(cylindrical cell carcinoma)、導管癌、硬癌、胚胎癌、腦樣癌、表皮樣癌、腺樣上皮癌、外生性癌瘤、潰瘍性癌、纖維癌、膠樣癌(gelatiniform carcinoma)、膠質癌(gelatinous carcinoma)、巨細胞癌(giant cell carcinoma/carcinoma gigantocellulare)、腺癌、粒層細胞癌、髮母質癌(hair-matrix carcinoma)、血樣癌、肝細胞癌、許特耳細胞癌(Hurthle cell carcinoma)、玻質狀癌、腎上腺樣癌、幼稚型胚胎性癌、原位癌、表皮內癌、上皮內癌、克魯肯伯格氏癌(Krompecher’s carcinoma)、庫爾契茨基細胞癌(Kulchitzky-cell carcinoma)、大細胞癌、扁豆狀癌(lenticular carcinoma/carcinoma lenticulare)、脂瘤樣癌、淋巴上皮癌、髓樣癌(carcinoma medullare/medullary carcinoma)、黑色素癌、軟癌(carcinoma molle)、黏液癌(mucinous carcinoma)、黏液狀癌(carcinoma muciparum)、黏液細胞癌、黏液表皮樣癌、黏液性癌(carcinoma mucosum/mucous carcinoma)、黏液瘤樣癌、鼻咽癌、燕麥細胞癌、骨化性癌、骨樣癌、乳頭狀癌、門脈周癌、未侵襲癌、棘細胞癌、糜爛性癌、腎臟腎細胞癌、貯備細胞癌(reserve cell carcinoma)、肉瘤樣癌、施奈德癌(schneiderian carcinoma)、硬癌(scirrhous carcinoma)、陰囊癌、印戒細胞癌、單純癌、小細胞癌、馬鈴薯狀癌、球狀細胞癌、梭形細胞癌、海綿樣癌、鱗癌、鱗狀細胞癌、繩捆癌(string carcinoma)、血管擴張性癌(carcinoma telangiectaticum/carcinoma telangiectodes)、移行細胞癌、小管癌(carcinoma tuberosum)、結節性癌、疣贅性癌(verrucous carcinoma)或絨毛狀癌。在一些態樣中，癌症係選自白血病、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、多發性骨髓瘤、神經母細胞瘤、乳癌、卵巢癌、肺癌、橫紋肌肉瘤、原發性血小板增多症、原發性巨球蛋白血症、小細胞肺腫瘤、原發性腦腫瘤、胃癌、結腸癌、惡性胰臟胰島素瘤、惡性類癌、膀胱癌、癌前皮膚病變、睪丸癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、神經母細胞瘤、神經內分泌癌、食道癌、泌尿生殖道癌、惡性血鈣過多、子宮頸癌、子宮內膜癌、腎上腺皮質癌、前列腺癌、米勒管癌(Müllerian cancer)、卵巢癌、腹膜癌、輸卵管癌或子宮乳頭狀漿液性癌。在一些態樣中，癌症係選自轉移性黑色素瘤、非小細胞肺癌、骨髓瘤、食道癌、滑膜肉瘤、黏液樣/圓細胞脂肪肉瘤、胃癌、乳癌、肝細胞癌、頭頸部癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌或其任何組合。
如本文所用，術語「免疫反應」係指脊椎動物內針對外源劑之生物反應，該反應保護生物體抵抗此等劑及由其引起之疾病。免疫反應係由免疫系統細胞(例如，T淋巴細胞、B淋巴細胞、天然殺手(NK)細胞、NKT細胞、巨噬細胞、嗜酸性球、肥大細胞、樹突狀細胞或嗜中性球)及由此等細胞中之任一者或肝產生的可溶性巨分子(包括抗體、細胞介素及補體)之作用介導，該作用導致選擇性靶向、結合於、損害、破壞及/或自脊椎動物體內消除侵入性病原體、受病原體感染之細胞或組織、癌細胞或其他異常細胞，或在自體免疫或病理性發炎之情況下的正常人類細胞或組織。免疫反應包括例如活化或抑制T細胞，例如效應子T細胞或Th細胞，諸如CD4 +或CD8 +T細胞，或抑制Treg細胞。如本文所用，術語「T細胞」及「T淋巴細胞」可互換且係指由胸腺產生或加工之任何淋巴細胞。在一些態樣中，T細胞為CD4+ T細胞。在一些態樣中，T細胞為CD8+ T細胞。在一些態樣中，T細胞為NKT細胞。
如本文所用，術語「抗腫瘤免疫反應」係指針對腫瘤抗原之免疫反應。
「個體」包括任何人類或非人類動物。術語「非人類動物」包括但不限於脊椎動物，諸如非人類靈長類動物、綿羊、犬，及囓齒動物，諸如小鼠、大鼠及豚鼠。在一些態樣中，個體為人類。術語「個體(subject)」、「患者」、「個體(individual)」及「宿主」在本文中可互換使用。如本文所用，片語「有需要之個體」包括將受益於例如如本文所述之免疫細胞(例如，經修飾以表現c-Jun多肽及嵌合結合蛋白且使用本文所提供之方法進行培養)的投與以控制腫瘤生長之個體，諸如哺乳動物個體。
術語「治療有效量」或「治療有效劑量」係指提供所需生物、治療及/或預防結果之劑(例如，經修飾以表現c-Jun多肽及嵌合結合蛋白且如本文所述而培養的免疫細胞)之量。該結果可為疾病之一或多種徵象、症狀或病因的減少、改善、緩和、減弱、延遲及/或減輕，或者生物系統之任何其他所需改變。關於實體腫瘤，有效量包含足以引起腫瘤皺縮及/或足以減小腫瘤生長速率(例如抑制腫瘤生長)或足以防止或延遲其他不希望細胞增殖之量。在一些態樣中，有效量係足以延遲腫瘤發展之量。在一些態樣中，有效量係足以防止或延遲腫瘤復發之量。有效量可在一或多次投與中經投與。
有效量之組合物(例如，經修飾且如本文所述而培養之免疫細胞)可例如(i)減少癌細胞之數目；(ii)減少腫瘤大小；(iii)在某種程度上抑制、延遲、減慢且可停止癌細胞浸潤至周圍器官中；(iv)抑制(亦即，在某種程度上減慢且可停止腫瘤轉移)；(v)抑制腫瘤生長；(vi)預防或延遲腫瘤之發生及/或復發；及/或(vii)在某種程度上減輕與癌症相關之一或多種症狀。
在一些態樣中，「治療有效量」係本文所揭示之組合物(例如，經修飾以表現嵌合結合蛋白及c-Jun多肽且如本文所述而培養之免疫細胞)的量，其在臨床上證明顯著減少癌症或減慢癌症之進展(消退)，諸如晚期實體腫瘤。本揭示案之治療劑(例如，經修飾且如本文所述而培養之免疫細胞)促進疾病消退的能力可使用熟練從業人員已知之多種方法來評估，諸如在人類個體中在臨床試驗期間，在預測人類功效之動物模型系統中，或藉由在活體外分析中分析該劑的活性。
關於治療之術語「有效」及「有效性」包括藥理學有效性及生理安全性。藥理學有效性係指本文所揭示之組合物(例如，經修飾且如本文所述而培養之免疫細胞)促進患者之癌症消退的能力。生理安全性係指由於投與本文所揭示之組合物(例如，經修飾且如本文所述而培養之免疫細胞)而在細胞、器官及/或生物體層面上引起的毒性水準或其他不利的生理效應(副作用)。
如本文所用，術語「嵌合抗原受體」及「CAR」係指一組多肽，典型地呈最簡單形式之兩種多肽，當在免疫效應細胞中時，該等多肽向細胞提供對標靶細胞、典型地癌細胞之特異性，且產生細胞內信號。在一些態樣中，CAR至少包含細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域及細胞質信號傳導結構域(在本文中亦稱為「細胞內信號傳導結構域」)，包含源自如下文所定義之刺激分子及/或共刺激分子的功能性信號傳導結構域。在一些態樣中，該組多肽係在同一多肽鏈中，例如構成嵌合融合蛋白。在一些態樣中，該組多肽彼此不連續，例如在不同多肽鏈中。在一些態樣中，該組多肽包括二聚化開關，當存在二聚化分子時，該二聚化開關可使多肽彼此偶合，例如可將抗原結合結構域偶合至細胞內信號傳導結構域。在一些態樣中，CAR之刺激分子係與T細胞受體複合物相關之ζ鏈(例如CD3 ζ)。在一些態樣中，細胞質信號傳導結構域包含初級信號傳導結構域(例如 ，CD3-ζ之初級信號傳導結構域)。在一些態樣中，細胞質信號傳導結構域進一步包含一或多個源自至少一種如下文所定義之共刺激分子的功能性信號傳導結構域。在一些態樣中，共刺激分子係選自本文所述之共刺激分子，例如4-1BB(亦即，CD137)、CD27及/或CD28。
在一些態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含抗原結合結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域，該細胞內信號傳導結構域包含源自刺激分子之功能性信號傳導結構域，其中抗原結合結構域及跨膜結構域藉由CAR間隔子連接。在一些態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含經由CAR間隔子連接至跨膜結構域之抗原結合結構域以及細胞內信號傳導結構域，該細胞內信號傳導結構域包含一個源自共刺激分子之功能性信號傳導結構域及一個源自刺激分子之功能性信號傳導結構域。在一些態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含經由CAR間隔子連接至跨膜結構域之抗原結合結構域以及細胞內信號傳導結構域，該細胞內信號傳導結構域包含兩個源自一或多種共刺激分子之功能性信號傳導結構域及一個源自刺激分子之功能性信號傳導結構域。在一些態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白，其包含經由CAR間隔子連接至跨膜結構域之抗原結合結構域以及細胞內信號傳導結構域，該細胞內信號傳導結構域包含至少兩個源自一或多種共刺激分子之功能性信號傳導結構域及一個源自刺激分子之功能性信號傳導結構域。在一些態樣中，CAR在CAR之胺基末端(N末端)包含視情況選用之前導序列。在一些態樣中，CAR進一步包含在抗原結合結構域之N末端的前導序列，其中在CAR之細胞加工及定位至細胞膜期間，該前導序列視情況自抗原結合結構域(例如scFv)裂解。
嵌合抗原受體之抗原特異性細胞外結構域識別且特異性結合抗原，典型地惡性腫瘤之表面表現抗原。抗原特異性細胞外結構域特異性結合抗原，例如當其以介於約0.1 pM至約10 µM之間(例如約0.1 pM至約1 µM或約0.1 pM至約100 nM)之親和力常數或相互作用親和力(K D)結合抗原時。用於確定相互作用親和力之方法係此項技術中已知的。適用於本揭示案之CAR之抗原特異性細胞外結構域可為任何抗原結合多肽，其中多種係此項技術中已知的。在一些態樣中，抗原結合結構域為單鏈Fv (scFv)。其他基於抗體之識別結構域，諸如cAb VHH (駱駝科動物抗體可變結構域)及其人類化形式、lgNAR VH (鯊魚抗體可變結構域)及其人類化形式、sdAb VH (單一結構域抗體可變結構域)及「駱駝化」抗體可變結構域亦適用於本揭示案之CAR。在一些態樣中，基於T細胞受體(TCR)之識別結構域，諸如單鏈TCR (scTv，亦即含有VαVβ之單鏈雙結構域TCR)亦適用於本揭示案之嵌合結合蛋白。
如本文所用，術語「T細胞受體」或「TCR」係指由2條不同的跨膜多肽鏈構成之異二聚體：α鏈及β鏈，各鏈由恆定區及可變區組成，該恆定區將鏈錨定於T細胞表面膜內部，該可變區識別且結合於由MHC呈遞之抗原。TCR複合物與6個多肽締合，形成2種異二聚體CD3γε及CD3δε，及1種均二聚體CD3 ζ，其合起來形成CD3複合物。T細胞受體工程改造之T細胞療法利用保留此等複合物之T細胞修飾來特異性靶向由特定腫瘤細胞表現之抗原。如本文所用，術語「TCR」包括天然存在之TCR及經工程改造之TCR。
「TCR模擬物」或「TCRm」係指識別包含肽及MHC-I分子兩者之抗原決定基的抗體類型，類似於T細胞上之TCR對此類複合物之識別。
術語「核酸」、「核酸分子」、「核苷酸」、「核苷酸序列」及「聚核苷酸」可互換使用，且係指核糖核苷(腺苷、鳥苷、尿苷或胞苷；「RNA分子」)或去氧核糖核苷(去氧腺苷、去氧鳥苷、去氧胸苷或去氧胞苷；「DNA分子」)之磷酸酯聚合形式，或其任何磷酸酯類似物，諸如硫代磷酸酯及硫酯，其呈單股形式或雙股螺旋。單股核酸序列係指單股DNA (ssDNA)或單股RNA (ssRNA)。雙股DNA-DNA、DNA-RNA及RNA-RNA螺旋係可能的。術語核酸分子且詳言之DNA或RNA分子僅指該分子之一級及二級結構，且不將其限制為任何特定三級形式。因此，此術語包括尤其可見於線性或環狀DNA分子(例如限制性片段)、質體、超螺旋DNA及染色體中之雙股DNA。在討論特定雙股DNA分子之結構時，本文中可根據通常慣例描述序列，即僅沿非轉錄DNA股(亦即 ，具有與mRNA同源之序列的股)之5’至3’方向給出序列。「重組DNA分子」係已經歷分子生物學操作之DNA分子。DNA包括但不限於cDNA、基因體DNA、質體DNA、合成DNA及半合成DNA。本揭示案之「核酸組合物」包含一或多種如本文所述之核酸。如本文所述，在一些態樣中，本揭示案之聚核苷酸可包含編碼單一蛋白質之單一核苷酸序列(例如，經密碼子最佳化之c-Jun核苷酸序列) (「單順反子」)。在一些態樣中，本揭示案之聚核苷酸係多順反子的(亦即，包含兩個或兩個以上順反子)。在一些態樣中，多順反子聚核苷酸之每個順反子均可編碼本文所揭示之蛋白質(例如，c-Jun蛋白、嵌合結合蛋白或EGFRt)。在一些態樣中，每個順反子可彼此獨立地經轉譯。
除非另有說明，否則如本文所用，術語「多肽」涵蓋肽及蛋白質。多肽包括基因產物、天然存在之多肽、合成多肽、前述各物之同系物、異種同源物、同種同源物、片段及其他等效物、變異體及類似物。多肽可為單一多肽或可為多分子複合物，諸如二聚體、三聚體或四聚體。其亦可包含單鏈或多鏈多肽。最常見地，在多鏈多肽中發現二硫鍵聯。術語多肽亦可應用於胺基酸聚合物，其中一或多個胺基酸殘基為相應天然存在之胺基酸的人工化學類似物。在一些態樣中，「肽」可為小於或等於50個胺基酸長，例如約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸長。
如本文所用，術語多肽(例如c-Jun多肽)之「片段」係指多肽之胺基酸序列，其比天然存在之序列短、缺失N末端及/或C末端或與天然存在之多肽相比，缺失多肽之任何部分。因此，片段未必需要僅缺失N末端及/或C末端胺基酸。其中相對於天然存在之序列已缺失內部胺基酸之多肽亦被視為片段。
如本文所用，術語「功能片段」或「功能部分」係指保留多肽功能之多肽片段。因此，在一些態樣中，Ig鉸鏈之功能片段保留將抗原結合結構域(例如 ，scFv)定位於距標靶抗原決定基(例如 ，腫瘤抗原)一定距離處之嵌合結合蛋白中的能力，使得抗原結合結構域(例如 ，scFv)可有效地與標靶抗原決定基(例如 ，腫瘤抗原)相互作用。同樣，在一些態樣中，c-Jun功能片段為如下片段，當在免疫細胞(例如，CAR T細胞)中表現時，該片段導致免疫細胞具有例如表現相應全長c-Jun之參考免疫細胞的活性之至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或約100%。此類活性之非限制性實例進一步描述於本揭示案中之別處。
「重組」多肽或蛋白質係指經由重組DNA技術產生之多肽或蛋白質。出於本揭示案之目的，在經工程改造之宿主細胞中表現的重組產生之多肽及蛋白質被視為分離的，已藉由任何合適技術分離、分級分離或部分或實質上純化之原生或重組多肽亦是如此。由本文所揭示之聚核苷酸編碼的多肽(例如，嵌合結合蛋白及/或c-Jun)可使用此項技術中已知之方法重組產生。在一些態樣中，由本揭示案之聚核苷酸編碼的多肽(例如，嵌合結合蛋白及/或c-Jun)由細胞(例如T細胞)在用至少一種編碼本文所述之多肽的聚核苷酸或載體轉染或修飾之後產生。
如本文所用，「編碼區」、「編碼序列」或「可轉譯序列」係聚核苷酸之一部分，其由可轉譯成胺基酸之密碼子組成。雖然「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)典型地未轉譯成胺基酸，但其可被視為編碼區之一部分，而任何側接序列(例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子及其類似序列)並非編碼區之一部分。編碼區之邊界典型地由5’末端處之起始密碼子(編碼所得多肽之胺基末端)及3’末端處之轉譯終止密碼子(編碼所得多肽之羧基末端)確定。
術語「互補」及「互補性」係指兩種或更多種寡聚物(亦即，各自包含核鹼基序列)或寡聚物與標靶基因之間藉由Watson-Crick鹼基配對法則彼此相關。舉例而言，核鹼基序列「T-G-A (5’至3’)」與核鹼基序列「A-C-T (3’至5’)」互補。互補可為「部分」的，其中根據鹼基配對法則，既定核鹼基序列之少於所有核鹼基與另一核鹼基序列匹配。舉例而言，在一些態樣中，既定核鹼基序列與另一核鹼基序列之間的互補性可為約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。因此，在一些態樣中，術語「互補」係指與標靶核酸序列(例如，miR-485核酸序列)至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%匹配或互補。或者，在既定核鹼基序列與另一核鹼基序列之間可存在「完全」或「完美」(100%)互補性以使實例繼續。在一些態樣中，核鹼基序列之間之互補程度對序列之間之雜交效率及強度具有顯著效應。
如本文所用，術語「表現」係指聚核苷酸產生基因產物(例如c-Jun多肽)之過程。其包括但不限於將聚核苷酸轉錄成信使RNA (mRNA)及將mRNA轉譯成多肽。表現產生「基因產物」。如本文所用，基因產物可為核酸，例如藉由基因轉錄產生之信使RNA，或者由轉錄物轉譯之多肽。本文所述之基因產物進一步包括具有轉錄後修飾(例如，聚腺苷酸化或剪接)之核酸，或具有轉譯後修飾(例如，甲基化、糖基化、添加脂質、與其他蛋白質亞單元締合或蛋白水解裂解)之多肽。
如本文所用，術語「一致性」係指聚合物分子之間(例如聚核苷酸分子之間)的總體單體保守。無任何額外限定詞之術語「一致」(例如，聚核苷酸A與聚核苷酸B一致)意味著聚核苷酸序列為100%一致(100%序列一致性)。將兩個序列描述為例如「70%一致」等效於將其描述為具有例如「70%序列一致性」。「參考核苷酸序列」在本文中用作與本揭示案之核苷酸序列的比較時，係指與本揭示案之核苷酸序列基本上一致之聚核苷酸序列，除了序列未經最佳化。例如，在一些態樣中，參考核苷酸序列包含野生型 JUN核酸序列。
舉例而言，可藉由比對兩個多肽或聚核苷酸序列來執行兩個序列之一致性百分比的計算，以實現最佳比較目的(例如，可在第一及第二多肽或聚核苷酸序列中之一者或兩者中引入間隙以實現最佳比對且出於比較目的，可忽略非一致序列)。在一些態樣中，出於比較目的而比對之序列的長度為參考序列之長度之至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或約100%。接著比較相應胺基酸位置處之胺基酸，或在聚核苷酸之情形下比較鹼基。
當第一序列中之位置由與第二序列中之相應位置相同的胺基酸或核苷酸佔據時，則該等分子在彼位置處一致。兩個序列之間之一致性百分比隨該等序列所共享之一致位置的數目而變，其中考慮到間隙之數目及每個間隙之長度，需要引入該長度以實現兩個序列之最佳比對。可使用數學算法來完成序列之比較及兩個序列之間之一致性百分比的確定。
可用於比對不同序列(例如，聚核苷酸序列)之合適軟體程式可自各種來源獲得。一種確定序列一致性百分比之合適程式為bl2seq，其為BLAST程式套件之一部分，可自美國政府之國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information) BLAST網站(blast.ncbi.nlm.nih.gov)獲得。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法來執行兩個序列之間的比較。BLASTN用於比較核酸序列，而BLASTP用於比較胺基酸序列。其他合適程式為例如Needle、Stretcher、Water或Matcher，其為EMBOSS生物資訊學程式套件之一部分且亦可自European Bioinformatics Institute (EBI)在ebi.ac.uk/Tools/psa處獲得。
序列比對可使用此項技術中已知之方法，諸如MAFFT、Clustal (ClustalW、Clustal X或Clustal Omega)、MUSCLE等進行。
單一聚核苷酸或多肽標靶序列內與聚核苷酸或多肽參考序列比對之不同區域可各自具有其自身的序列一致性百分比。應注意，序列一致性百分比之值四捨五入至小數點後一位。例如，將80.11、80.12、80.13及80.14向下四捨五入至80.1，而將80.15、80.16、80.17、80.18及80.19向上四捨五入至80.2。亦應注意，長度值將始終為整數。
在一些態樣中，第一胺基酸序列(或核酸序列)相對於第二胺基酸序列(或核酸序列)之一致性百分比(ID%)係計算為ID%=100x(Y/Z)，其中Y係在第一及第二序列之比對(如藉由目視檢查或特定序列比對程式來比對)中作為一致匹配評分的胺基酸殘基(或核鹼基)之數目且Z係第二序列中的殘基之總數。若第一序列之長度比第二序列長，則第一序列相對於第二序列之一致性百分比將高於第二序列相對於第一序列之一致性百分比。
熟習此項技術者應理解，用於計算序列一致性百分比之序列比對的產生不限於僅由一級序列資料驅動之二元序列-序列比較。亦應理解，序列比對可藉由將序列資料與來自異類來源之資料，諸如結構資料 (例如 ，晶體學蛋白結構)、功能資料 (例如 ，突變之位置)或系統發生資料整合來產生。整合異類資料以產生多重序列比對之合適程式為T-Coffee，其可在tcoffee.org處獲得，且替代地可例如自EBI獲得。亦應瞭解，用於計算序列一致性百分比之最終比對可自動地或手動地進行。
如本文所用，術語「經分離」、「經純化」、「經提取」及其語法變化形式可互換使用，且係指已經歷一或多個純化過程之本揭示案之所需組合物的製劑狀態。在一些態樣中，如本文所用之分離或純化係移除、部分移除(例如 ，一部分)本揭示案之組合物之過程。
在一些態樣中，經分離之組合物不具有可偵測到的非所需活性，或替代地，非所需活性之水準或量係可接受之水準或量或低於可接受之水準或量。在一些態樣中，經分離之組合物所具有的本揭示案之所需組合物之量及/或濃度係可接受之量及/或濃度及/或活性，或高於可接受之量及/或濃度及/或活性。在一些態樣中，與獲得該組合物之起始材料相比，經分離之組合物係經富集。如與起始材料相比，此富集可為至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、至少約99.9%、至少約99.99%、至少約99.999%、至少約99.9999%或大於99.9999%。
在一些態樣中，經分離之製劑實質上不含殘餘生物產物。在一些態樣中，經分離之製劑100%不含、至少約99%不含、至少約98%不含、至少約97%不含、至少約96%不含、至少約95%不含、至少約94%不含、至少約93%不含、至少約92%不含、至少約91%不含或至少約90%不含任何污染性生物物質。殘餘生物產物可包括非生物性材料(包括化學品)或不需要之核酸、蛋白質、脂質或代謝物。
如本文所用，術語「經連接」係指第一胺基酸序列或聚核苷酸序列分別共價或非共價接合至第二胺基酸序列或聚核苷酸序列。第一胺基酸或聚核苷酸序列可與第二胺基酸或聚核苷酸序列直接接合或併置，或替代地，插入序列可將第一序列共價接合至第二序列。術語「經連接」不僅意謂第一聚核苷酸序列與第二聚核苷酸序列在5’端或3’端融合，而且包括將整個第一聚核苷酸序列(或第二聚核苷酸序列)插入至第二聚核苷酸序列(或分別地，第一聚核苷酸序列)中之任兩個核苷酸中。第一聚核苷酸序列可藉由磷酸二酯鍵或連接體連接至第二聚核苷酸序列。連接體可為例如聚核苷酸。
「投與」(及其語法變化形式)係指使用熟習此項技術者已知之多種方法及遞送系統中的任一者將治療劑(例如，本文所述之經工程改造細胞)物理引入至個體。例示性投與途徑包括靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、淋巴內、病變內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊椎內、硬膜外、胸骨內、經口、直腸、表面、表皮、黏膜、鼻內、陰道、直腸、舌下投與及其任何組合。亦可例如一次、複數次及/或經一或多個延長時期執行投與。
個體之「治療」或「療法」(包括其任何語法派生詞)係指對個體執行之任何類型的介入或過程或向個體投與活性劑，目的在於逆轉、減輕、改善、抑制、減緩或預防症狀、併發症、疾患之發作、進展、發展、嚴重性或復發，或與疾病相關之生物化學標記。在一些態樣中，該術語係指在個體中誘導針對抗原之免疫反應。
如本文所用，術語「預防(prevent/ preventing)」及其變化形式係指部分或完全地延遲疾病、病症及/或疾患之發作；部分或完全地延遲特定疾病、病症及/或疾患之一或多種症狀、特徵或臨床表現之發作；部分或完全地延遲特定疾病、病症及/或疾患之一或多種症狀、特徵或表現之發作；部分或完全地延遲自特定疾病、病症及/或疾患進展；及/或降低發展與疾病、病症及/或疾患相關之病理的風險。在一些態樣中，經由預防性治療達成預防結果。
如本文所用，術語「治療有效量」係包含本文所揭示之組合物(例如，本文所述之經修飾免疫細胞)之試劑或醫藥化合物足以對有需要之個體產生期望治療效應、藥理學及/或生理學效應之量。
治療有效量可為「預防有效量」，此乃因預防可被視為療法。如本文所用，「預防性」係指用於預防疾病或疾患之發作或用於預防或延遲與疾病或疾患相關之症狀之治療或作用過程。如本文所用，「預防」係指為維持健康且預防疾病或疾患之發作，或為預防或延遲與疾病或疾患相關之症狀而採取之措施。
如本文所用，術語「啟動子」係指能夠控制編碼序列或功能性RNA之表現之DNA序列。通常，編碼序列位於啟動子序列之3’。啟動子可全部源自原生基因，或者由源自自然界中發現之不同啟動子的不同元件構成，或者甚至包含合成DNA區段。熟習此項技術者應理解，不同啟動子可指導基因在不同組織或細胞類型中，或在不同發育階段，或因應於不同環境或生理條件之表現。大多數時候導致基因在大多數細胞類型中表現之啟動子通常稱為「組成型啟動子」。導致基因在特定細胞類型中表現之啟動子通常稱為「細胞特異性啟動子」或「組織特異性啟動子」。導致基因在特定發育或細胞分化階段表現之啟動子通常稱為「發育特異性啟動子」或「細胞分化特異性啟動子」。在用誘導啟動子之劑、生物分子、化學品、配位體、光或其類似物暴露或處理細胞之後經誘導且導致基因表現之啟動子通常稱為「誘導型啟動子」或「可調節之啟動子」。進一步認識到，由於在大多數情況下尚未完全確定調節序列之確切邊界，不同長度之DNA片段可具有一致的啟動子活性。
如本文所用，術語「ug」及「uM」可分別與「μg」及「μΜ」互換使用。
本揭示案之各個態樣更詳細地描述於以下子部分中。 II. 本揭示案之方法
本揭示案之一些態樣提供一種製備用於免疫療法之人類免疫細胞群體之方法，該方法包括使人類免疫細胞與可編程細胞信號傳導支架(PCS)在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸。本揭示案之一些態樣提供一種活化用於免疫療法之人類免疫細胞群體之方法，該方法包括使人類免疫細胞與可編程細胞信號傳導支架(PCS)在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸。本揭示案之一些態樣提供一種在離體或活體外培養期間增加經活化人類免疫細胞之產量之方法，該方法包括使人類免疫細胞與可編程細胞信號傳導支架(PCS)在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸。本揭示案之一些態樣提供一種在離體或活體外培養期間增加用於免疫療法之經活化人類免疫細胞之幹細胞性、同時增加經活化人類免疫細胞之產量的方法，該方法包括使人類免疫細胞與可編程細胞信號傳導支架(PCS)在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸。本揭示案之一些態樣提供一種離體或活體外擴增經活化幹細胞樣免疫細胞群體之方法，該方法包括使免疫細胞與可編程細胞信號傳導支架(PCS)在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸。
在一些態樣中，本揭示案係關於培養細胞(例如，免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞))之方法，該等方法包括將細胞置於包含濃度為至少約5 mM (例如，高於5 mM)之鉀的代謝再編程培養基中，其中該培養基並非高張的，例如低張或等張。本揭示案之一些態樣係關於培養細胞(例如，免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞))之方法，該等方法包括將細胞置於包含濃度高於40 mM (例如，約50 mM-80 mM)之鉀之培養基中。在一些態樣中，該等免疫細胞包含T細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、天然殺手(NK)細胞、調節性T (T reg)細胞或其任何組合。
本揭示案之一些態樣係關於一種在離體或活體外培養期間增加免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞)之產量、同時增加該等免疫細胞之幹細胞性的方法，該方法包括使免疫細胞與可編程細胞信號傳導支架(PCS)在包含濃度在40 mM與80 mM之間的鉀離子及濃度在30 mM與100 mM之間的NaCl之培養基中接觸，其中鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。本揭示案之一些態樣係關於一種製備用於免疫療法之免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞)群體之方法，該方法包括使免疫細胞與可編程細胞信號傳導支架(PCS)在包含濃度在40 mM與80 mM之間的鉀離子及濃度在30 mM與100 mM之間的NaCl之培養基中接觸，其中鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。本揭示案之一些態樣係關於一種在離體或活體外培養期間增加免疫細胞(例如，T細胞或NK細胞)之幹細胞性的方法，該方法包括使免疫細胞與可編程細胞信號傳導支架(PCS)在包含濃度在40 mM與80 mM之間的鉀離子及濃度在30 mM與100 mM之間的NaCl之培養基中接觸，其中鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，該等免疫細胞為T細胞。
在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，該培養基為等張的。在某些態樣中，該培養基進一步包含介白素(IL)-2、IL-21、IL-7、IL-15或其任何組合。在一些態樣中，該培養基包含IL-2、IL-7及IL-15。在一些態樣中，該培養基包含IL-2及IL-21。在一些態樣中，該培養基進一步包含鈉離子、鈣離子、葡萄糖或其任何組合。 II.A. 代謝再編程培養基
本揭示案之一些態樣係關於培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之方法，該等方法包括使免疫細胞與可編程細胞信號傳導支架(PCS)在培養條件下(例如，在培養基中)接觸，其中該培養條件(例如，某些離子濃度、培養基張力、細胞介素及/或其任何組合)能夠減少、限制或防止免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之分化，由此影響或改良其在細胞療法(例如，過繼細胞療法)中之用途。在一些態樣中，該等免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)在本文所揭示之代謝再編程培養基(MRM)中與PCS接觸且進行培養。在一些態樣中，如與使用習知方法，例如在具有小於5 mM鉀離子且不包含PCS之培養基中培養的細胞相比，在MRM中與PCS接觸且進行培養之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)具有更高比例之幹細胞樣細胞。在一些態樣中，如與使用習知方法，例如在具有小於5 mM鉀離子之培養基中培養的細胞相比，在MRM中與PCS接觸且進行培養之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)具有更高比例之效應子樣細胞。在一些態樣中，如與使用習知方法，例如在具有小於5 mM鉀離子之培養基中培養的細胞相比，在MRM中與PCS接觸且進行培養之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)具有更高比例之幹細胞樣及效應子樣細胞。在一些態樣中，如與使用習知方法，例如在具有小於5 mM鉀離子之培養基中培養的細胞相比，在MRM中與PCS接觸且進行培養之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)具有更高增殖潛力。
本揭示案之一些態樣係關於製備免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)群體之方法，該等方法包括使免疫細胞與PCS在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基(例如，本文所揭示之代謝再編程培養基)中接觸。本揭示案之一些態樣係關於製備T細胞群體之方法，該等方法包括使T細胞與PCS在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基(例如，本文所揭示之代謝再編程培養基)中接觸。在一些態樣中，本揭示案提供製備免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之方法，該等方法包括使免疫細胞與PCS在包含濃度高於5 mM (例如高於40 mM，例如在55 mM與70 mM之間)之鉀離子的培養基中接觸，其中該方法能夠保持經培養細胞之幹細胞樣表型(例如，最小分化)。在一些態樣中，本揭示案提供製備T細胞之方法，該等方法包括使T細胞與PCS在包含濃度高於5 mM (例如高於40 mM，例如在55 mM與70 mM之間)之鉀離子的培養基中接觸，其中該方法能夠保持經培養T細胞之幹細胞樣表型(例如，最小分化)。在一些態樣中，與在具有較低鉀濃度之培養基中生長的細胞相比，經培養細胞具有更具幹細胞樣表型(例如，低分化)。在一些態樣中，該培養基進一步包含介白素(IL)-2、IL-21、IL-7、IL-15或其任何組合。在一些態樣中，該培養基進一步包含鈉離子(例如，NaCl)、鈣離子、葡萄糖或其任何組合。
在一些態樣中，相對於使用習知方法，例如在具有小於5 mM鉀離子之培養基中培養的細胞群體，使用本文所揭示之方法培養的免疫細胞群體(例如，T細胞及/或NK細胞)展現增加之幹細胞樣細胞數目。在一些態樣中，相對於使用習知方法，例如在具有小於5 mM鉀離子之培養基中培養的T細胞群體，使用本文所揭示之方法培養的T細胞群體展現增加之幹細胞樣T細胞數目。在一些態樣中，該等免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)相對於起始免疫細胞群體(亦即，在培養之前)展現幹細胞樣細胞所特有之標記物的增加之表現。在一些態樣中，該等T細胞相對於起始T細胞群體(亦即，在培養之前)展現幹細胞樣細胞所特有之標記物的增加之表現。在一些態樣中，起始免疫細胞群體包含獲自個體之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，起始免疫細胞群體包含獲自人類個體之T細胞。在一些態樣中，起始免疫T細胞群體包含T N細胞、T SCM細胞、T CM細胞、T EM細胞或其任何組合。在一些態樣中，起始免疫細胞群體包含在用編碼如本文所述之配位體結合蛋白之構築體轉染/修飾之前的T細胞。
可使用此項技術中已知之任何方法來量測增加之細胞多能性。在一些態樣中，相繼藉由抗體染色、閘控流式細胞術來量測細胞幹細胞性。在一些態樣中，藉由自噬通量來量測細胞幹細胞性。在一些態樣中，藉由葡萄糖攝取來量測細胞幹細胞性。在一些態樣中，藉由脂肪酸攝取來量測細胞幹細胞性。在一些態樣中，藉由粒線體生物質量來量測細胞幹細胞性。在一些態樣中，藉由RNA量化/表現分析(例如微陣列、qPCR (taqman)、RNA-Seq.、單細胞RNA-Seq.或其任何組合)來量測細胞幹細胞性。在一些態樣中，藉由與代謝分析(例如seahorse代謝分析、細胞外酸化速率分析(ECAR)；氧消耗速率分析(OCR)；備用呼吸量分析；及/或粒線體膜電位分析)相關之轉錄物來量測細胞幹細胞性。在一些態樣中，使用一或多種活體內或活體外功能分析(例如，分析細胞持久性、抗腫瘤能力、抗腫瘤清除、病毒清除、多能性、細胞介素釋放、細胞殺死或其任何組合)來量測幹細胞性。
在一些態樣中，該等免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之分化狀態的特徵在於表現低分化細胞所特有之標記物的細胞之數目增加。在一些態樣中，T細胞之分化狀態的特徵在於表現低分化T細胞所特有之標記物的細胞之數目增加。在一些態樣中，幹細胞樣細胞之數目增加的特徵在於表現T N及/或T SCM細胞所特有之標記物的T細胞之數目增加。在一些態樣中，幹細胞樣T細胞之數目增加的特徵在於表現T SCM細胞所特有之標記物的細胞之數目增加。在一些態樣中，T細胞群體展現表現CD45RA之細胞之數目增加。在一些態樣中，T細胞群體展現表現CCR7之細胞之數目增加。在一些態樣中，T細胞群體展現表現CD62L之細胞之數目增加。在一些態樣中，T細胞群體展現表現CD28之細胞之數目增加。在一些態樣中，T細胞群體展現表現CD95之細胞之數目增加。在一些態樣中，該等細胞為CD45RO 低。在一些態樣中，該等細胞不表現CD45RO。在一些態樣中，該細胞群體展現CD45RA +、CCR7 +及CD62L +細胞之數目增加。在一些態樣中，該細胞群體展現CD95 +、CD45RA +、CCR7 +及CD62L +細胞之數目增加。在一些態樣中，該細胞群體展現表現TCF7之細胞之數目增加。在一些態樣中，該T細胞群體展現CD45RA +、CCR7 +、CD62L +及TCF7 +細胞之數目增加。在一些態樣中，該T細胞群體展現CD95 +、CD45RA +、CCR7 +、CD62L +及TCF7 +細胞之數目增加。在一些態樣中，該T細胞群體展現CD3 +、CD45RA +、CCR7 +、CD62L +及TCF7 +細胞之數目增加。在一些態樣中，該T細胞群體展現CD3 +、CD95 +、CD45RA +、CCR7 +、CD62L +及TCF7 +細胞之數目增加。在一些態樣中，該等細胞表現CD27。在一些態樣中，該T細胞群體展現CD27 +、CD3 +、CD45RA +、CCR7 +、CD62L +及TCF7 +細胞之數目增加。在一些態樣中，該T細胞群體展現CD27 +、CD3 +、CD95 +、CD45RA +、CCR7 +、CD62L +及TCF7 +細胞之數目增加。在一些態樣中，該T細胞群體展現CD39 -及CD69 -細胞之數目增加。在一些態樣中，該T細胞群體展現TCF7 +及CD39 -細胞之數目增加。在一些態樣中，該細胞群體展現T SCM細胞之數目增加。在一些態樣中，該細胞群體展現T N細胞之數目增加。在一些態樣中，該細胞群體展現T SCM及T N細胞之數目增加。在一些態樣中，該細胞群體展現幹細胞樣T細胞之數目增加。在一些態樣中，T細胞為CD4+細胞；在一些態樣中，T細胞為CD8+細胞。
在一些態樣中，相對於用MRM培養之前的幹細胞樣細胞之數目，培養物中之幹細胞樣細胞的數目增加至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%。在一些態樣中，相對於用MRM培養之前的幹細胞樣細胞之數目，培養物中之幹細胞樣細胞的數目增加至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍或至少約20倍。
在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞之後，幹細胞樣T細胞構成培養物中之CD8 +T細胞的總數之至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約10%或至少約15%。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞之後，幹細胞樣T細胞構成培養物中之CD4 +T細胞的總數之至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約10%或至少約15%。
在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞之後，幹細胞樣T細胞構成培養物中之T細胞的總數之至少約10%至至少約70%。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞之後，幹細胞樣T細胞構成培養物中之CD8 +T細胞的總數之至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%或至少約70%。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞之後，幹細胞樣T細胞構成培養物中之CD4 +T細胞的總數之至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%或至少約70%。
在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞之後，培養物中之T細胞的總數之至少約10%至至少約40%為CD39 -/CD69 -T細胞。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞之後，培養物中之T細胞的總數之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%或至少約40%為CD39 -/CD69 -T細胞。
在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞之後，培養物中之T細胞的總數之至少約10%至至少約70%為CD39 -/TCF7 +T細胞。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞之後，培養物中之T細胞的總數之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%或至少約40%為CD39 -/TCF7 +T細胞。在一些態樣中，T細胞為CD4 +T細胞。在一些態樣中，T細胞為CD8 +T細胞。
在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的本揭示案之免疫細胞(例如，經工程改造之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞))展現增加之轉導效率。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的經工程改造之T細胞展現增加之轉導效率。在一些態樣中，如與使用習知方法類似地轉導且培養之細胞(例如，在含有小於5 mM K +之培養基中)相比，更大百分率之細胞在轉導之後表現例如編碼配位體結合蛋白之標靶轉殖基因，其中該等細胞係根據本文所揭示之方法進行培養。在某些態樣中，如與使用習知方法培養之類似轉導細胞(例如，在含有小於5 mM K +之培養基中)相比，根據本文所揭示之方法培養的更大百分率之細胞在細胞之慢病毒轉導之後表現配位體結合蛋白。在一些態樣中，相對於使用習知方法培養之類似轉導細胞(例如，在含有小於5 mM K +之培養基中)，轉導效率增加至少約1.5倍。在一些態樣中，相對於使用習知方法培養之類似轉導細胞(例如，在含有小於5 mM K +之培養基中)，轉導效率增加至少約2倍。
在一些態樣中，免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)係在根據本文所揭示之方法培養之前經轉導。在一些態樣中，免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)係在根據本文所揭示之方法培養之後經轉導。在一些態樣中，免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)係在轉導之前、期間及之後根據本文所揭示之方法，例如藉由使免疫細胞與APC-MS在包含至少5 mM鉀離子之培養基中接觸來進行培養。
在某些態樣中，使用病毒載體來轉導免疫細胞。在一些態樣中，載體包含慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、牛痘載體、單純疱疹病毒載體及Epstein-Barr病毒載體。在一些態樣中，病毒載體包含逆轉錄病毒。在一些態樣中，病毒載體包含慢病毒。在一些態樣中，病毒載體包含AAV。
在一些態樣中，使用非病毒方法來轉導免疫細胞。在一些態樣中，非病毒方法包括使用轉位子。在一些態樣中，使用非病毒遞送方法允許免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之再編程，及將細胞直接輸注至個體中。在一些態樣中，可藉由使用CRISPR/Cas系統及基因體編輯替代方案，諸如鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化子樣效應子核酸酶(TALEN)及大範圍核酸酶(MN)，將聚核苷酸插入至標靶細胞(例如，T細胞)或宿主細胞(例如，用於重組表現所編碼蛋白質之細胞)之基因體中。
在一些態樣中，在過繼轉移根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞(例如T細胞及/或NK細胞，視情況表現配位體結合蛋白)後，如與使用習知方法，例如在含有小於5 mM K +之培養基中培養的細胞相比，經轉移之細胞展現減少之細胞耗竭。在一些態樣中，在過繼轉移根據本文所揭示之方法培養的T細胞(視情況表現配位體結合蛋白)後，如與使用習知方法，例如在含有小於5 mM K +之培養基中培養的T細胞相比，經轉移之T細胞展現減少之細胞耗竭。在一些態樣中，在過繼轉移根據本文所揭示之方法培養的細胞後，如與使用習知方法培養的細胞(例如，在含有小於5 mM K +之培養基中)相比，經轉移之細胞在活體內持續一段更長時期。在一些態樣中，如與使用習知方法培養的細胞(例如，在含有小於5 mM K +之培養基中)相比，經轉移之細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)具有更大活體內功效，例如腫瘤殺死活性。在一些態樣中，如與使用習知方法培養的細胞(例如，在含有小於5 mM K +之培養基中)相比，需要更低劑量之根據本文所揭示之方法培養的細胞以在個體中引起反應，例如減少之腫瘤體積。
在一些態樣中，在自個體分離後立即根據本文所揭示之方法，例如藉由使免疫細胞與PCS在包含至少5 mM鉀離子之培養基中接觸來培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，在細胞擴增期間根據本文所揭示之方法培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，在細胞之工程改造期間，例如在用編碼轉殖基因(例如配位體結合蛋白)之構築體進行轉導期間，根據本文所揭示之方法培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，在細胞之工程改造之後，例如在用編碼轉殖基因(例如配位體結合蛋白)之構築體進行轉導之後，根據本文所揭示之方法培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，在擴增及工程改造之整個過程中根據本文所揭示之方法培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，在病毒基因工程改造之整個過程中根據本文所揭示之方法培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，在非病毒基因工程改造之整個過程中根據本文所揭示之方法培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，在將配位體結合蛋白引入至免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)以允許腫瘤特異性靶向(例如，CAR、TCR或TCR模擬物)期間，根據本文所揭示之方法培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，在引入一或多種改良T細胞功能之內源基因的整個過程中，根據本文所揭示之方法培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，在引入一或多種改良T細胞功能之合成基因的整個過程中，根據本文所揭示之方法培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。
在一些態樣中，根據本文所揭示之方法，例如藉由使免疫細胞與PCS在包含至少5 mM鉀離子之培養基中接觸來培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，例如自個體分離免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之時，通過生長、擴增、工程改造，且直至投與至需要過繼細胞療法之個體中。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法，例如藉由使免疫細胞與PCS在包含至少5 mM鉀離子之培養基中接觸來培養T細胞，持續整個離體培養，例如自個體分離T細胞之時，通過生長、擴增、工程改造，且直至投與至需要過繼細胞療法之個體中。在一些態樣中，免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)係根據本文所揭示之方法，例如藉由使免疫細胞與PCS在包含至少5 mM鉀離子之培養基中接觸來進行培養，持續擴增之持續時間。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法，例如藉由使免疫細胞與PCS在包含至少5 mM鉀離子之培養基中接觸來培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，直至活免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之總數為至少約10 4、至少約5×10 4、至少約10 5、至少約5×10 5、至少約10 6或至少約5×10 6、至少約1×10 7、至少約5×10 7、至少約1×10 8、至少約5×10 8、至少約1×10 9、至少約5×10 9、至少約1×10 10、至少約5×10 10、至少約1×10 11、至少約5×10 11、至少約1×10 12或至少約5×10 12個總細胞。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養T細胞，直至活T細胞之總數為至少約10 4、至少約5×10 4、至少約10 5、至少約5×10 5、至少約10 6或至少約5×10 6、至少約1×10 7、至少約5×10 7、至少約1×10 8、至少約5×10 8、至少約1×10 9、至少約5×10 9、至少約1×10 10、至少約5×10 10、至少約1×10 11、至少約5×10 11、至少約1×10 12或至少約5×10 12個總T細胞。
在一些態樣中，該培養基進一步包含細胞擴增劑。如本文所用，「細胞擴增劑」係指促進經培養細胞，例如免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之活體外及/或離體生長及增殖之劑，例如小分子、多肽或其任何組合。在一些態樣中，該細胞擴增劑包含PI3K抑制劑。在一些態樣中，該培養基進一步包含AKT抑制劑。在一些態樣中，該培養基進一步包含PI3K抑制劑及AKT抑制劑。在一些態樣中，PI3K抑制劑包含LY294002。在一些態樣中，PI3K抑制劑包含IC87114。在一些態樣中，PI3K抑制劑包含艾代拉利司(idelalisib) (參見例如Peterson等人， Blood Adv. 2(3):210-23 (2018))。在一些態樣中，該培養基進一步包含GSK3B抑制劑。在一些態樣中，GSK3B抑制劑包含TWS119。在一些態樣中，該培養基進一步包含ACLY抑制劑。在一些態樣中，ACLY抑制劑包含羥基檸檬酸三鉀單水合物。在一些態樣中，PI3K抑制劑包含羥基檸檬酸鹽。在一些態樣中，PI3K抑制劑包含匹替利司(pictilisib)。在一些態樣中，PI3K抑制劑包含CAL-101。在一些態樣中，AKT抑制劑包含MK2206、A443654或AKTi-VIII (CAS 612847-09-3)。在一些態樣中，該細胞擴增劑與PCS連接或締合。
在一些態樣中，代謝再編程培養基包含粒線體燃料。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含O-乙醯基-L-肉鹼鹽酸鹽。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約0.1 mM、至少約0.5 mM、至少約1.0 mM、至少約5 mM或至少約10 mM O-乙醯基-L-肉鹼鹽酸鹽。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約1.0 mM O-乙醯基-L-肉鹼鹽酸鹽。在一些態樣中，粒線體燃料與PCS連接或締合。
在一些態樣中，代謝再編程培養基進一步包含以下一或多者：(i)一或多種細胞擴增劑，(ii)鈉離子(例如，NaCl)，(iii)一或多種醣，(iv)鈣離子，及(v)一或多種細胞介素。 II.A.1. 鉀
本揭示案之一些態樣係關於培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之方法，該等方法包括使免疫細胞與PCS在培養基(亦即，本文所揭示之代謝再編程培養基)中接觸，相對於對照培養基，該培養基包含增加之鉀離子濃度(例如，大於約5 mM、大於約40 mM、大於約45 mM、大於約50 mM、大於約55 mM、大於約60 mM、大於約65 mM或大於約70 mM)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約5 mM至至少約100 mM鉀離子、至少約5 mM至至少約90 mM鉀離子、至少約5 mM至至少約80 mM鉀離子、至少約5 mM至至少約75 mM鉀離子、至少約5 mM至至少約70 mM鉀離子、至少約5 mM至至少約65 mM鉀離子、至少約5 mM至至少約60 mM鉀離子、至少約5 mM至至少約55 mM鉀離子、至少約5 mM至至少約50 mM鉀離子、至少約5 mM至至少約45 mM鉀離子、至少約5 mM至至少約40 mM鉀離子、至少約10 mM至至少約80 mM鉀離子、至少約10 mM至至少約75 mM鉀離子、至少約10 mM至至少約70 mM鉀離子、至少約10 mM至至少約65 mM鉀離子、至少約10 mM至至少約60 mM鉀離子、至少約10 mM至至少約55 mM鉀離子、至少約10 mM至至少約50 mM鉀離子、至少約10 mM至至少約45 mM鉀離子、至少約10 mM至至少約40 mM鉀離子、至少約20 mM至至少約80 mM鉀離子、至少約20 mM至至少約75 mM鉀離子、至少約20 mM至至少約70 mM鉀離子、至少約20 mM至至少約65 mM鉀離子、至少約20 mM至至少約60 mM鉀離子、至少約20 mM至至少約55 mM鉀離子、至少約20 mM至至少約50 mM鉀離子、至少約20 mM至至少約45 mM鉀離子、至少約20 mM至至少約40 mM鉀離子、至少約30 mM至至少約80 mM鉀離子、至少約30 mM至至少約75 mM鉀離子、至少約30 mM至至少約70 mM鉀離子、至少約30 mM至至少約65 mM鉀離子、至少約30 mM至至少約60 mM鉀離子、至少約30 mM至至少約55 mM鉀離子、至少約30 mM至至少約50 mM鉀離子、至少約30 mM至至少約45 mM鉀離子、至少約30 mM至至少約40 mM鉀離子、至少約40 mM至至少約80 mM鉀離子、至少約40 mM至至少約75 mM鉀離子、至少約40 mM至至少約70 mM鉀離子、至少約40 mM至至少約65 mM鉀離子、至少約40 mM至至少約60 mM鉀離子、至少約40 mM至至少約55 mM鉀離子、至少約40 mM至至少約50 mM鉀離子、至少約40 mM至至少約45 mM鉀離子、至少約45 mM至至少約80 mM鉀離子、至少約45 mM至至少約75 mM鉀離子、至少約45 mM至至少約70 mM鉀離子、至少約45 mM至至少約65 mM鉀離子、至少約45 mM至至少約60 mM鉀離子、至少約45 mM至至少約55 mM鉀離子、至少約45 mM至至少約50 mM鉀離子、至少約50 mM至至少約80 mM鉀離子、至少約50 mM至至少約75 mM鉀離子、至少約50 mM至至少約70 mM鉀離子、至少約50 mM至至少約65 mM鉀離子、至少約50 mM至至少約60 mM鉀離子或至少約50 mM至至少約55 mM鉀離子。
在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約5 mM、至少約10 mM、至少約15 mM、至少約20 mM、至少約25 mM、至少約30 mM、至少約35 mM、至少約40 mM、至少約45 mM、至少約50 mM、至少約55 mM、至少約60 mM、至少約65 mM、至少約70 mM、至少約75 mM或至少約80 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約5 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約10 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約15 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約20 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約25 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約30 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約35 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約40 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約45 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約50 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約55 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約60 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約65 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約70 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約75 mM鉀離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約80 mM鉀離子。
在一些態樣中，代謝再編程培養基包含增加濃度之鉀離子，例如至少約5 mM鉀離子，且該培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含濃度在約40 mM與約80 mM之間的鉀離子及濃度在約30 mM與約100 mM之間的NaCl，其中鉀離子及NaCl之總濃度係在約110 mM與約140 mM之間。
在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約5 mM至約100 mM。在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約5 mM至約100 mM，其中該培養基為低張的。在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約5 mM至約90 mM、約5 mM至約80 mM、約5 mM至約70 mM、約5 mM至約60 mM或約5 mM至約50 mM。在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約5 mM至約90 mM、約5 mM至約80 mM、約5 mM至約70 mM、約5 mM至約60 mM或約5 mM至約50 mM，其中該培養基為低張的。在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約25 mM至約100 mM。在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約25 mM至約100 mM，其中該培養基為低張的。在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約25 mM至約90 mM、約25 mM至約80 mM、約25 mM至約70 mM、約25 mM至約60 mM或約25 mM至約50 mM。在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約25 mM至約90 mM、約25 mM至約80 mM、約25 mM至約70 mM、約25 mM至約60 mM或約25 mM至約50 mM，其中該培養基為低張的。在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約40 mM至約100 mM。在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約40 mM至約100 mM，其中該培養基為低張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約40 mM至約90 mM、約40 mM至約85 mM、約40 mM至約80 mM、約40 mM至約75 mM、約40 mM至約70 mM、約40 mM至約65 mM、約40 mM至約60 mM、約40 mM至約55 mM或約40 mM至約50 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約40 mM至約90 mM、約40 mM至約85 mM、約40 mM至約80 mM、約40 mM至約75 mM、約40 mM至約70 mM、約40 mM至約65 mM、約40 mM至約60 mM、約40 mM至約55 mM或約40 mM至約50 mM，其中該培養基為低張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約90 mM、約50 mM至約85 mM、約50 mM至約80 mM、約50 mM至約75 mM、約50 mM至約70 mM、約50 mM至約65 mM、約50 mM至約60 mM或約50 mM至約55 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約90 mM、約50 mM至約85 mM、約50 mM至約80 mM、約50 mM至約75 mM、約50 mM至約70 mM、約50 mM至約65 mM、約50 mM至約60 mM或約50 mM至約55 mM，且其中該培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約50 mM鉀離子及小於約90 mM NaCl。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約50 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約115 mM、約50 mM至約110 mM、約50 mM至約105 mM、約50 mM至約100 mM、約50 mM至約95 mM、約50 mM至約90 mM、約50 mM至約85 mM、約50 mM至約80 mM、約50 mM至約75 mM、約50 mM至約70 mM、約50 mM至約65 mM、約50 mM至約60 mM或約50 mM至約55 mM。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，該培養基包含至少約50 mM至約120 mM鉀離子及小於約90 mM至約20 mM NaCl。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約55 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約55 mM至約115 mM、約55 mM至約110 mM、約55 mM至約105 mM、約55 mM至約100 mM、約55 mM至約95 mM、約55 mM至約90 mM、約55 mM至約85 mM、約55 mM至約80 mM、約55 mM至約75 mM、約55 mM至約70 mM、約55 mM至約65 mM或約55 mM至約60 mM。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約55 mM至約120 mM鉀離子及小於約85 mM至約20 mM NaCl。在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約60 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約115 mM、約60 mM至約110 mM、約60 mM至約105 mM、約60 mM至約100 mM、約60 mM至約95 mM、約60 mM至約90 mM、約60 mM至約85 mM、約60 mM至約80 mM、約60 mM至約75 mM、約60 mM至約70 mM或約60 mM至約65 mM。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約60 mM至約120 mM鉀離子及小於約80 mM至約20 mM NaCl。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約65 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約65 mM至約115 mM、約65 mM至約110 mM、約65 mM至約105 mM、約65 mM至約100 mM、約65 mM至約95 mM、約65 mM至約90 mM、約65 mM至約85 mM、約65 mM至約80 mM、約65 mM至約75 mM或約65 mM至約70 mM。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約65 mM至約120 mM鉀離子及小於約75 mM至約20 mM NaCl。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約70 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約70 mM至約115 mM、約70 mM至約110 mM、約70 mM至約105 mM、約70 mM至約100 mM、約70 mM至約95 mM、約70 mM至約90 mM、約70 mM至約85 mM、約70 mM至約80 mM或約70 mM至約75 mM。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約70 mM至約120 mM鉀離子及小於約70 mM至約20 mM NaCl。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約75 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約75 mM至約115 mM、約75 mM至約110 mM、約75 mM至約105 mM、約75 mM至約100 mM、約75 mM至約95 mM、約75 mM至約90 mM、約75 mM至約85 mM或約75 mM至約80 mM。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約75 mM至約120 mM鉀離子及小於約65 mM至約20 mM NaCl。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約80 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約80 mM至約115 mM、約80 mM至約110 mM、約80 mM至約105 mM、約80 mM至約100 mM、約80 mM至約95 mM、約80 mM至約90 mM或約80 mM至約85 mM。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約80 mM至約120 mM鉀離子及小於約60 mM至約20 mM NaCl。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約85 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約85 mM至約115 mM、約85 mM至約110 mM、約85 mM至約105 mM、約85 mM至約100 mM、約85 mM至約95 mM或約85 mM至約90 mM。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約85 mM至約120 mM鉀離子及小於約65 mM至約20 mM NaCl。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約90 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約90 mM至約115 mM、約90 mM至約110 mM、約90 mM至約105 mM、約90 mM至約100 mM或約90 mM至約95 mM。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約90 mM至約120 mM鉀離子及小於約50 mM至約20 mM NaCl。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約95 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約95 mM至約115 mM、約95 mM至約110 mM、約95 mM至約105 mM或約95 mM至約100 mM。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約95 mM至約120 mM鉀離子及小於約55 mM至約20 mM NaCl。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約100 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約100 mM至約115 mM、約100 mM至約110 mM或約100 mM至約105 mM。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約100 mM至約120 mM鉀離子及小於約50 mM至約20 mM NaCl。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約105 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約105 mM至約115 mM或約105 mM至約110 mM。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約105 mM至約120 mM鉀離子及小於約35 mM至約20 mM NaCl。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約110 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約110 mM至約115 mM。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約110 mM至約120 mM鉀離子及小於約30 mM至約20 mM NaCl。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約50 mM至約90 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約80 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約90 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約80 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約70 mM至約90 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約70 mM至約80 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約80 mM至約90 mM。
在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約50 mM至約90 mM，且NaCl之濃度為小於約90 mM至約50 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約80 mM，且NaCl之濃度為小於約90 mM至約60 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約90 mM，且NaCl之濃度為小於約90 mM至約60 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約80 mM，且NaCl之濃度為小於約80 mM至約60 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約70 mM至約90 mM，且NaCl之濃度為小於約70 mM至約50 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約70 mM至約80 mM，且NaCl之濃度為小於約70 mM至約60 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約80 mM至約90 mM，且NaCl之濃度為小於約60 mM至約50 mM。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鉀離子之濃度為約50 mM至約55 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約55 mM，且NaCl之濃度為小於約90 mM至約85 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約55 mM至約60 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約55 mM至約60 mM，且NaCl之濃度為小於約85 mM至約80 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約65 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約65 mM，且NaCl之濃度為小於約80 mM至約75 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約65 mM至約70 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約65 mM至約70 mM，且NaCl之濃度為小於約75 mM至約70 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約70 mM至約75 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約70 mM至約75 mM，且NaCl之濃度為小於約70 mM至約65 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約75 mM至約80 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約75 mM至約80 mM，且NaCl之濃度為小於約65 mM至約60 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約80 mM至約85 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約80 mM至約85 mM，且NaCl之濃度為小於約60 mM至約55 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約85 mM至約90 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約85 mM至約90 mM，且NaCl之濃度為小於約55 mM至約50 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約90 mM至約95 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約90 mM至約95 mM，且NaCl之濃度為小於約50 mM至約45 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約95 mM至約100 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約95 mM至約100 mM，且NaCl之濃度為小於約45 mM至約40 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約100 mM至約105 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約100 mM至約105 mM，且NaCl之濃度為小於約40 mM至約35 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約105 mM至約110 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約105 mM至約110 mM，且NaCl之濃度為小於約35 mM至約30 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約110 mM至約115 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約110 mM至約115 mM，且NaCl之濃度為小於約30 mM至約25 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約115 mM至約120 mM。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約115 mM至約120 mM，且NaCl之濃度為小於約25 mM至約20 mM。在一些態樣中，鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，鉀離子之濃度為約40 mM至約90 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約40 mM至約80 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約40 mM至約70 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約90 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約80 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約50 mM至約70 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約55 mM至約90 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約55 mM至約80 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約55 mM至約70 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約90 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約80 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約60 mM至約70 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約65 mM至約90 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約65 mM至約80 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約65 mM至約70 mM，其中該培養基為低張或等張的。
在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約4 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約4 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約5 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約5 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約6 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約6 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約7 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約7 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約8 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約8 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約9 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約9 mM，其中該培養基為低張或等張的。
在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約10 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約10 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約11 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約11 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約12 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約12 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約13 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約13 mM，其中該培養基為低張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約14 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約14 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約15 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約15 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約16 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約16 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約17 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約17 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約18 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約18 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約19 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約19 mM，其中該培養基為低張或等張的。
在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約20 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約20 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約21 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約21 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約22 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約22 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約23 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約23 mM，其中該培養基為低張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約24 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約24 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約25 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約25 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約26 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約26 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約27 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約27 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約28 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約28 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約29 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約29 mM，其中該培養基為低張或等張的。
在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約30 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約30 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約31 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約31 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約32 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約32 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約33 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約33 mM，其中該培養基為低張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約34 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約34 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約35 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約35 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約36 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約36 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約37 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約37 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約38 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約38 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約39 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約39 mM，其中該培養基為低張或等張的。
在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約40 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約40 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約41 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約41 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約42 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約42 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約43 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約43 mM，其中該培養基為低張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約44 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約44 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約45 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約45 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約46 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約46 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約47 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約47 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約48 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約48 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為高於約49 mM，其中該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，鉀離子之濃度為約49 mM，其中該培養基為低張或等張的。
在一些態樣中，藉由將足量鉀鹽添加至培養基中來製備包含高濃度之鉀離子之代謝再編程培養基。在一些態樣中，鉀鹽之非限制性實例包括三氯一胺鉑酸鉀、水合五氯釕酸鉀、雙(草酸)鉑(II)酸鉀二水合物、硫酸氫鉀、硼氫化鉀、溴化鉀、碳酸鉀、氯化鉀、鉻酸鉀、重鉻酸鉀、氰化銀鉀、氰化亞金鉀、氟化鉀、氟硫酸鉀、六氯銥酸鉀、六氯鋨酸鉀、六氯鈀酸鉀、六氯鉑酸鉀、六氯錸酸鉀、六氰鉻酸鉀、六氰高鐵酸鉀、六氰釕(II)酸鉀水合物、六氟銻酸鉀、六氟鎳酸鉀、六氟磷酸鉀、六氟鈦酸鉀、六氟鋯酸鉀、六羥基銻酸鉀、六碘鉑酸鉀、六碘錸酸鉀、氫氧化鉀、碘酸鉀、碘化鉀、錳酸鉀、偏釩酸鉀、鉬酸鉀、硝酸鉀、亞硝基二磺酸鉀、鋨(VI)酸鉀二水合物、五氯亞硝醯基釕酸鉀、過氯酸鉀、過錸酸鉀、過釕酸鉀、過硫酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、焦磷酸鉀、硒氰酸鉀、硒氰酸鉀、錫酸鉀三水合物、硫酸鉀、碲酸鉀水合物、亞碲酸鉀、四硼酸鉀四水合物、四溴金酸鉀、四溴鈀酸鉀、四氯鈀酸鉀、四氯鉑酸鉀、四氰鈀酸鉀、四氰鉑酸鉀、四氟硼酸鉀、四硝基鉑酸鉀、連四硫酸鉀、對甲苯硫代磺酸鉀、羥基檸檬酸三鉀單水合物或其任何組合。在某些態樣中，鉀鹽包含氯化鉀(KCl)。在某些態樣中，鉀鹽包含葡萄糖酸鉀。在某些態樣中，鉀鹽包含檸檬酸鉀。在某些態樣中，鉀鹽包含羥基檸檬酸鉀。 II.A.2. 鈉
本揭示案之一些態樣係關於培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之方法，該等方法包括使免疫細胞與PCS在包含(i)濃度為至少約5 mM之鉀離子及(ii)濃度小於約115 mM之鈉離子(例如NaCl)的培養基中接觸。在一些態樣中，該培養基為低張或等張的。在一些態樣中，藉由以包含較高濃度之鈉離子(例如，NaCl)的基礎培養基為起始物，且稀釋溶液以實現鈉離子(例如，NaCl)之標靶濃度來實現鈉(例如，NaCl)之標靶濃度。在一些態樣中，藉由添加一或多種鈉鹽(例如，更多NaCl)來實現鈉離子(例如，NaCl)之標靶濃度。鈉鹽之非限制性實例包括(偏)過碘酸鈉、酒石酸甲基砷酸二鈉水合物、疊氮化鈉、苄氧化鈉、溴化鈉、碳酸鈉、氯化鈉、鉻酸鈉、環己烷丁酸鈉、乙硫醇鈉、氟化鈉、氟磷酸鈉、甲酸鈉、六氯銥(III)酸鈉水合物、六氯銥(IV)酸鈉六水合物、六氯鉑(IV)酸鈉六水合物、六氯銠(III)酸鈉、六氟鋁酸鈉、六氟銻(V)酸鈉、六氟砷(V)酸鈉、六氟高鐵(III)酸鈉、六氟磷酸鈉、六氟矽酸鈉、六羥基鉑(IV)酸鈉、六偏磷酸鈉、二氟化氫鈉、硫酸氫鈉、氰胺一鈉、氫氧化鈉、碘化鈉、偏硼酸鈉四水合物、偏矽酸鈉九水合物、偏釩酸鈉、鉬酸鈉、硝酸鈉、亞硝酸鈉、草酸鈉、過硼酸鈉單水合物、過碳酸鈉、過氯酸鈉、過碘酸鈉、過錳酸鈉、過錸酸鈉、磷酸鈉、焦磷酸鈉、硒酸鈉、亞硒酸鈉、錫酸鈉、硫酸鈉、亞碲酸鈉、四硼酸鈉、四氯鋁酸鈉、四氯金(III)酸鈉、四氯鈀(II)酸鈉、四氯鉑(II)酸鈉、硫代磷酸鈉、硫代硫酸鈉、硫代硫酸鈉五水合物、氧氟化釔鈉、三偏磷酸三鈉或其任何組合。在一些態樣中，鈉鹽包含氯化鈉(NaCl)。在一些態樣中，鈉鹽包含葡萄糖酸鈉。在一些態樣中，鈉鹽包含碳酸氫鈉。在一些態樣中，鈉鹽包含羥基檸檬酸鈉。在一些態樣中，鈉鹽包含磷酸鈉。
在一些態樣中，本揭示案之代謝再編程培養基中的鈉離子(例如，NaCl)之濃度係低於基礎培養基之濃度。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度隨著鉀離子之濃度增加而降低。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約25 mM至約115 mM。在一些態樣中，鈉(例如，NaCl)離子之濃度為約25 mM至約100 mM、約30 mM至約40 mM、約30 mM至約50 mM、約30 mM至約60 mM、約30 mM至約70 mM、約30 mM至約80 mM、約40 mM至約50 mM、約40 mM至約60 mM、約40 mM至約70 mM、約40 mM至約80 mM、約50 mM至約55 mM、約50 mM至約60 mM、約50 mM至約65 mM、約50 mM至約70 mM、約50 mM至約75 mM、約50 mM至約80 mM、約55 mM至約60 mM、約55 mM至約65 mM、約55 mM至約70 mM、約55 mM至約75 mM、約55 mM至約80 mM、約60 mM至約65 mM、約60 mM至約70 mM、約60 mM至約75 mM、約60 mM至約80 mM、約70 mM至約75 mM、約70 mM至約80 mM或約75 mM至約80 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約40 mM至約80 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約50 mM至約85 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約55 mM至約80 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約30 mM至約35 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約35 mM至約40 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約40 mM至約45 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約45 mM至約50 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約50 mM至約55 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約55 mM至約60 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約60 mM至約65 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約65 mM至約70 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約70 mM至約75 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約75 mM至約80 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約80 mM至約85 mM。
在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約30 mM、約35 mM、約40 mM、約45 mM、約50 mM、約55 mM、約60 mM、約65 mM、約70 mM、約75 mM、約80 mM、約85 mM或約90 mM。在某些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約40 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約45 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約50 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約55 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約55.6 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約59.3 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約60 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約63.9 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約65 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約67.6 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約70 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約72.2 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約75 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約76 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約80 mM。在一些態樣中，鈉離子(例如，NaCl)之濃度為約80.5 mM。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約40 mM至約90 mM鉀離子及約40 mM至約80 mM鈉離子(例如，NaCl)。
在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約50 mM至約75 mM鉀離子及約80 mM至約90 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約55 mM至約75 mM鉀離子及約80 mM至約90 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約60 mM至約75 mM鉀離子及約80 mM至約90 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約65 mM至約75 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約65 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約66 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約67 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約68 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約69 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約70 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約71 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約72 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約73 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約74 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約75 mM鉀離子及約80 mM至約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約65 mM鉀離子及約80 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約65 mM鉀離子及約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約65 mM鉀離子及約90 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約70 mM鉀離子及約80 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約70 mM鉀離子及約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約70 mM鉀離子及約90 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約75 mM鉀離子及約80 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約75 mM鉀離子及約85 mM鈉離子(例如，NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約75 mM鉀離子及約90 mM鈉離子(例如，NaCl)。
在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約40 mM至約90 mM鉀離子及約30 mM至約109 mM NaCl，其中NaCl濃度(mM)係等於或低於(135-鉀離子濃度，意味著135減去鉀離子濃度)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約40 mM鉀離子及小於或等於約95 mM NaCl (例如，約95 mM、約94 mM、約93 mM、約92 mM、約91 mM、約90 mM、約85 mM、約80 mM、約75 mM、約70 mM、約65 mM、約60 mM、約55 mM或約50 mM NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約45 mM鉀離子及小於或等於約90 mM NaCl (例如，約90 mM、約89 mM、約88 mM、約87 mM、約86 mM、約85 mM、約80 mM、約75 mM、約70 mM、約65 mM、約60 mM、約55 mM或約50 mM NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約50 mM鉀離子及小於或等於約85 mM NaCl (例如，約85 mM、約84 mM、約83 mM、約82 mM、約81 mM、約80 mM、約75 mM、約70 mM、約65 mM、約60 mM、約55 mM或約50 mM NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約55 mM鉀離子及小於或等於約80 mM NaCl (例如，約80 mM、約79 mM、約78 mM、約77 mM、約76 mM、約75 mM、約70 mM、約65 mM、約60 mM、約55 mM或約50 mM NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約60 mM鉀離子及小於或等於約75 mM NaCl (例如，約75 mM、約74 mM、約73 mM、約72 mM、約71 mM、約70 mM、約65 mM、約60 mM、約55 mM或約50 mM NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約65 mM鉀離子及小於或等於約70 mM NaCl (例如，約70 mM、約69 mM、約68 mM、約67 mM、約66 mM、約65 mM、約60 mM、約55 mM或約50 mM NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約70 mM鉀離子及小於或等於約70 mM NaCl (例如，約65 mM、約64 mM、約63 mM、約62 mM、約61 mM、約60 mM、約55 mM或約50 mM NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約75 mM鉀離子及小於或等於約60 mM NaCl (例如，約60 mM、約59 mM、約58 mM、約57 mM、約56 mM、約55 mM、約50 mM、約45 mM或約40 mM NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約80 mM鉀離子及小於或等於約55 mM NaCl (例如，約55 mM、約54 mM、約53 mM、約52 mM、約51 mM、約50 mM、約45 mM、約40 mM或約35 mM NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約85 mM鉀離子及小於或等於約50 mM NaCl (例如，約50 mM、約49 mM、約48 mM、約47 mM、約46 mM、約45 mM、約40 mM、約35 mM或約30 mM NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約90 mM鉀離子及小於或等於約45 mM NaCl (例如，約45 mM、約44 mM、約43 mM、約42 mM、約41 mM、約40 mM、約35 mM、約30 mM或約25 mM NaCl)。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約70 mM鉀離子及約60 mM NaCl。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約70 mM鉀離子及約61 mM NaCl。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約70 mM鉀離子及約62 mM NaCl。
在一些態樣中，該培養基包含約50 mM鉀離子及約75 mM NaCl。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，該培養基為等張的。
本揭示案之一些態樣係關於培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之方法，該等方法包括使免疫細胞與PCS在包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)濃度小於約135 mM之NaCl的培養基中接觸。本揭示案之一些態樣係關於培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之方法，該等方法包括使免疫細胞與PCS在包含(i)濃度高於40 mM之鉀離子及(ii)濃度小於約100 mM之NaCl的培養基中接觸。本揭示案之一些態樣係關於培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之方法，該等方法包括使免疫細胞與PCS在包含(i)濃度高於50 mM之鉀離子及(ii)濃度小於約90 mM之NaCl的培養基中接觸。本揭示案之一些態樣係關於培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之方法，該等方法包括使免疫細胞與PCS在包含(i)濃度高於55 mM之鉀離子及(ii)濃度小於約70 mM之NaCl的培養基中接觸。本揭示案之一些態樣係關於培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之方法，該等方法包括使免疫細胞與PCS在包含(i)濃度高於60 mM之鉀離子及(ii)濃度小於約70 mM之NaCl的培養基中接觸。 II.A.3. 張力
在本揭示案之一些態樣中，基於鉀離子及/或NaCl之濃度來調節代謝再編程培養基之張力(例如，(鉀離子濃度加NaCl濃度)×2)。在一些態樣中，代謝再編程培養基之張力係低於基礎培養基之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基之張力係高於基礎培養基之張力。在一些態樣中，培養基之張力與基礎培養基之張力相同。代謝再編程培養基之張力可藉由修飾培養基中之鉀離子及/或NaCl之濃度而受影響。在一些態樣中，增加之鉀離子濃度與NaCl濃度之增加或減少配對。在一些態樣中，此配對影響代謝再編程培養基之張力。在一些態樣中，鉀離子濃度增加，而NaCl濃度減少。
在一些態樣中，基於鉀離子及張力之功能來製備可用於本揭示案培養基之培養基。例如，在一些態樣中，若可用於本揭示案之培養基為低張的(例如，小於280 mOsm)且包含至少約50 mM鉀離子，則可基於下式來確定足以維持低張培養基之NaCl濃度：NaCl濃度=(所需張力(280)/2)-鉀離子濃度。(亦即，NaCl濃度(mM)係等於或低於(140-鉀離子濃度))。在一些態樣中，本文所揭示之低張培養基包含總濃度在110 mM與140 mM之間的鉀離子及NaCl。因此，對於低張培養基，可將鉀離子濃度設定於50 mM與90 mM之間的濃度下，且NaCl濃度可在90 mM與50 mM之間，或者更低，只要鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間即可。在一些態樣中，本文所揭示之低張培養基包含總濃度在115 mM與140 mM之間的鉀離子及NaCl。在一些態樣中，本文所揭示之低張培養基包含總濃度在120 mM與140 mM之間的鉀離子及NaCl。
在一些態樣中，代謝再編程培養基為等張的(在280 mOsm與300 mOsm之間)且包含濃度在約50 mM與70 mM之間的鉀離子。可基於下式再次計算相應之NaCl濃度：NaCl濃度=(所需張力/2)-鉀離子濃度。例如，若鉀濃度為50 mM且所需張力為300 mOsm，則NaCl濃度可為100 mM。
在一些態樣中，代謝再編程培養基為等張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約280 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有280 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有280 mOsm/L±1 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有280 mOsm/L±2 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有280 mOsm/L±3 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有280 mOsm/L± 4 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有280 mOsm/L±5 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有280 mOsm/L±6 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有280 mOsm/L±7 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有280 mOsm/L± 8 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有280 mOsm/L±9 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有280 mOsm/L±10 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約280 mOsm/L至約285 mOsm/L、約280 mOsm/L至約290 mOsm/L、約280 mOsm/L至約295 mOsm/L、約280 mOsm/L至約300 mOsm/L、約280 mOsm/L至約305 mOsm/L、約280 mOsm/L至約310 mOsm/ L、約280 mOsm/L至約315 mOsm/L或約280 mOsm/L至小於320 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約285 mOsm/L、約290 mOsm/L、約295 mOsm/L、約300 mOsm/L、約305 mOsm/L、約310 mOsm/L或約315 mOsm/L之張力。
在一些態樣中，代謝再編程培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約280 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約280 mOsm/L之張力；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於280 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於280 mOsm/L之張力；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於275 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於275 mOsm/L之張力；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於270 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於270 mOsm/L之張力；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於265 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於265 mOsm/L之張力；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於260 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於260 mOsm/L之張力；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於265 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於265 mOsm/L之張力；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於260 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於260 mOsm/L之張力；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於255 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於255 mOsm/L之張力；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約250 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約250 mOsm/L之張力；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約245 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約245 mOsm/L之張力；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約240 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約240 mOsm/L之張力；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約235 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約235 mOsm/L之張力；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約230 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約230 mOsm/L之張力；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約225 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約225 mOsm/L之張力。在一些態樣中，張力係高於約220 mOsm/L；如藉由使鉀離子濃度及NaCl濃度相加且乘以2來量測。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約230 mOsm/L至約280 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約240 mOsm/L至約280 mOsm/L之張力。
在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約220 mOsm/L之重量滲透濃度。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約215 mOsm/L之重量滲透濃度。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約210 mOsm/L之重量滲透濃度。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約205 mOsm/L之重量滲透濃度。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有低於約200 mOsm/L之重量滲透濃度。
在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約100 mOsm/L至約280 mOsm/L、約125 mOsm/L至約280 mOsm/L、約150 mOsm/L至約280 mOsm/L、約175 mOsm/L至約280 mOsm/L、約200 mOsm/L至約280 mOsm/L、約210 mOsm/L至約280 mOsm/L、約220 mOsm/L至約280 mOsm/L、約225 mOsm/L至約280 mOsm/L、約230 mOsm/L至約280 mOsm/L、約235 mOsm/L至約280 mOsm/L、約240 mOsm/L至約280 mOsm/L、約245 mOsm/L至約280 mOsm/L、約250 mOsm/L至約280 mOsm/L、約255 mOsm/L至約280 mOsm/L、約260 mOsm/L至約280 mOsm/L、約265 mOsm/L至約280 mOsm/L、約270 mOsm/L至約280 mOsm/L或約275 mOsm/L至約280 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約250 mOsm/L至約270 mOsm/ L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約250 mOsm/L至約255 mOsm/L、約250 mOsm/L至約260 mOsm/ L、約250 mOsm/L至約265 mOsm/L、約255 mOsm/L至約260 mOsm/L、約255 mOsm/L至約265 mOsm/L、約255 mOsm/L至約265 mOsm/L、約260 mOsm/L至約265 mOsm/L或約254 mOsm/L至約263 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約254 mOsm/L至約255 mOsm/ L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約255 mOsm/L至約256 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約256 mOsm/L至約257 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約257 mOsm/L至約258 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約258 mOsm/L至約259 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約260 mOsm/L至約261 mOsm/ L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約261 mOsm/L至約262 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約262 mOsm/L至約263 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約263 mOsm/L至約264 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約264 mOsm/L至約265 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約220 mOsm/L至約280 mOsm/L之張力。
在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約100 mOsm/L、約125 mOsm/L、約150 mOsm/L、約175 mOsm/L、約200 mOsm/L、約210 mOsm/L、約220 mOsm/L、約225 mOsm/L、約230 mOsm/L、約235 mOsm/L、約240 mOsm/L、約245 mOsm/L、約250 mOsm/L、約255 mOsm/L、約260 mOsm/L、約265 mOsm/L、約270 mOsm/L或約275 mOsm/L之張力。
在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約250 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約262.26 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約260 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約259.7 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約257.5 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約257.2 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約255.2 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約254.7之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約255 mOsm/L之張力。在一些態樣中，代謝再編程培養基具有約260 mOsm/L之張力。
在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約50 mM鉀離子及(i)約80.5 mM NaCl；(ii)約17.7 mM葡萄糖；及(iii)約1.8 mM鈣離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約55 mM鉀離子及(i)約76 mM NaCl；(ii)約17.2 mM葡萄糖；及(iii)約1.7 mM鈣離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約60 mM鉀離子及(i)約72.2 mM NaCl；(ii)約16.8 mM葡萄糖；及(iii)約1.6 mM鈣離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約65 mM鉀離子及(i)約67.6 mM NaCl；(ii)約16.3 mM葡萄糖；及(iii)約1.5 mM鈣離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約70 mM鉀離子及(i)約63.9 mM NaCl；(ii)約15.9 mM葡萄糖；及(iii)約1.4 mM鈣離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約75 mM鉀離子及(i)約59.3 mM NaCl；(ii)約15.4 mM葡萄糖；及(iii)約1.3 mM鈣離子。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約80 mM鉀離子及(i)約55.6 mM NaCl；(ii)約15 mM葡萄糖；及(iii)約1.2 mM鈣離子。可在任何時刻將代謝再編程培養基之張力調節至例如本文所揭示之等張或低張狀態。在一些態樣中，在將細胞添加至代謝再編程培養基中之前，可將代謝再編程培養基之張力調節至例如本文所揭示之等張或低張狀態。在一些態樣中，在細胞工程改造之前，例如在用表現CAR、TCR或TCR模擬物之構築體進行轉導之前，在低張或等張培養基中培養細胞。在一些態樣中，在細胞工程改造期間，例如在用表現CAR、TCR或TCR模擬物之構築體進行轉導期間，在低張或等張培養基中培養細胞。在一些態樣中，在細胞工程改造之後，例如在用表現CAR、TCR或TCR模擬物之構築體進行轉導之後，在低張或等張培養基中培養細胞。在一些態樣中，在整個細胞擴增中在低張或等張培養基中培養細胞。 II.A.4. 醣
本揭示案之一些態樣係關於培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之方法，該等方法包括使免疫細胞與PCS在包含(i)濃度為至少約5 mM之鉀離子及(ii)醣的培養基中接觸。在一些態樣中，該培養基為低張或等張的。
在一些態樣中，藉由以包含較高濃度之醣的基礎培養基為起始物，且稀釋溶液以實現醣之標靶濃度來實現標靶醣濃度。在一些態樣中，藉由添加醣來升高醣之濃度，直至實現所需濃度，從而實現醣之標靶濃度。在一些態樣中，醣為單醣、二醣或多醣。在一些態樣中，醣係選自葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖或其任何組合。在某些態樣中，醣為葡萄糖。在一些態樣中，該培養基包含(i)濃度至少約5 mM之鉀離子及(ii)葡萄糖。在一些態樣中，該培養基包含(i)濃度高於40 mM之鉀離子及(ii)葡萄糖。在一些態樣中，該培養基包含(i)濃度至少約5 mM之鉀離子及(ii)甘露糖。在一些態樣中，該培養基包含(i)濃度至少約50 mM之鉀離子及(ii)甘露糖。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，該培養基為等張的。在一些態樣中，該培養基包含(i)濃度高於40 mM之鉀離子及(ii)葡萄糖；其中鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，該培養基包含(i)濃度高於50 mM之鉀離子及(ii)葡萄糖；其中鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，該培養基包含(i)濃度至少約40 mM之鉀離子及(ii)甘露糖；其中鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，該培養基包含(i)濃度至少約50 mM之鉀離子及(ii)甘露糖；其中鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)葡萄糖。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度為至少約30 mM至至少約100 mM之鉀離子及(ii)葡萄糖。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於40 mM之鉀離子及(ii)葡萄糖。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)甘露糖。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度為至少約30 mM至至少約100 mM之鉀離子及(ii)甘露糖。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於40 mM之鉀離子及(ii)甘露糖。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度為至少約50 mM之鉀離子及(ii)甘露糖。在一些態樣中，代謝再編程培養基為低張的。在一些態樣中，該培養基為等張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於40 mM之鉀離子及(ii)葡萄糖；其中鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於50 mM之鉀離子及(ii)葡萄糖；其中鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度為至少約40 mM之鉀離子及(ii)甘露糖；其中鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度為至少約50 mM之鉀離子及(ii)甘露糖；其中鉀離子及NaCl之總濃度係在110 mM與140 mM之間。
在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約10 mM至約24 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度係低於約4.29 g/L。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度係低於約24 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度超過約5 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約5 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約5 mM至約20 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約10 mM至約20 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約10 mM至約25 mM、約10 mM至約20 mM、約10 mM至約5 mM、約15 mM至約25 mM、約15 mM至約20 mM、約15 mM至約19 mM、約15 mM至約18 mM、約15 mM至約17 mM、約15 mM至約16 mM、約16 mM至約20 mM、約16 mM至約19 mM、約16 mM至約18 mM、約16 mM至約17 mM、約17 mM至約20 mM、約17 mM至約19 mM或約17 mM至約18 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約5 mM至約20 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約10 mM至約20 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約10 mM至約15 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約14 mM至約14.5 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約14.5 mM至約15 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約15 mM至約15.5 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約15.5 mM至約16 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約16 mM至約16.5 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約16.5 mM至約17 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約17 mM至約17.5 mM。在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約17.5 mM至約18 mM。
在一些態樣中，醣(例如葡萄糖)之濃度為約5 mM、約6 mM、約7 mM、約8 mM、約9 mM、約10 mM、約10.5 mM、約11 mM、約11.5 mM、約12 mM、約12.5 mM、約13 mM、約13.5 mM、約14 mM、約14.5 mM、約15 mM、約15.5 mM、約16 mM、約16.5 mM、約17 mM、約17.5 mM、約18 mM、約18.5 mM、約19 mM、約19.5 mM、約20 mM、約20.5 mM、約21 mM、約22 mM、約23 mM、約24 mM或約25 mM。 II.A.5. 鈣
本揭示案之一些態樣係關於培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之方法，該等方法包括使免疫細胞與PCS在包含(i)濃度為至少約5 mM之鉀離子及(ii)鈣離子的培養基中接觸。在一些態樣中，該培養基為低張或等張的。
在一些態樣中，藉由以包含較高濃度之鈣離子的基礎培養基為起始物，且稀釋溶液以實現鈣離子之標靶濃度來實現標靶鈣濃度。在一些態樣中，藉由添加一或多種鈣鹽來提高鈣離子之濃度，從而實現標靶鈣濃度。鈣鹽之非限制性實例包括溴化鈣、碳酸鈣、氯化鈣、氰胺化鈣、氟化鈣、氫化鈣、氫氧化鈣、碘酸鈣、碘化鈣、硝酸鈣、亞硝酸鈣、草酸鈣、過氯酸鈣四水合物、磷酸二氫鈣、磷酸三鈣、硫酸鈣、硫氰酸鈣四水合物、羥基磷灰石或其任何組合。在一些態樣中，鈣鹽包含氯化鈣(CaCl 2)。在一些態樣中，鈣鹽包含葡萄糖酸鈣。
在一些態樣中，鈣離子之濃度係低於基礎培養基之濃度。在一些態樣中，鈣離子之濃度係高於基礎培養基之濃度。在一些態樣中，鈣離子之濃度超過約0.4 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度係低於約2.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度係低於約2.5 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度係低於約2.0 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度係低於約1.9 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度係低於約1.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度係低於約1.7 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度係低於約1.6 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度係低於約1.5 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度係低於約1.4 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度係低於約1.3 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度係低於約1.2 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度係低於約1.1 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度係低於約1.0 mM。
在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.4 mM至約2.8 mM、約0.4 mM至約2.7 mM、約0.4 mM至約2.5 mM、約0.5 mM至約2.0 mM、約1.0 mM至約2.0 mM、約1.1 mM至約2.0 mM、約1.2 mM至約2.0 mM、約1.3 mM至約2.0 mM、約1.4 mM至約2.0 mM、約1.5 mM至約2.0 mM、約1.6 mM至約2.0 mM、約1.7 mM至約2.0 mM、約1.8 mM至約2.0 mM、約0.8至約0.9 mM、約0.8至約1.0 mM、約0.8至約1.1 mM、約0.8至約1.2 mM、約0.8至約1.3 mM、約0.8至約1.4 mM、約0.8至約1.5 mM、約0.8至約1.6 mM、約0.8至約1.7 mM、約0.8至約1.8 mM、約0.9至約1.0 mM、約0.9至約1.1 mM、約0.9至約1.2 mM、約0.9至約1.3 mM、約0.9至約1.4 mM、約0.9至約1.5 mM、約0.9至約1.6 mM、約0.9至約1.7 mM、約0.9至約1.8 mM、約1.0至約1.1 mM、約1.0至約1.2 mM、約1.0至約1.3 mM、約1.0至約1.4 mM、約1.0至約1.5 mM、約1.0至約1.6 mM、約1.0至約1.7 mM、約1.0至約1.8 mM、約1.1至約1.2 mM、約1.1至約1.3 mM、約1.1至約1.4 mM、約1.1至約1.5 mM、約1.1至約1.6 mM、約1.1至約1.7 mM、約1.1至約1.8 mM、約1.2至約1.3 mM、約1.2至約1.4 mM、約1.2至約1.5 mM、約1.2至約1.6 mM、約1.2至約1.7 mM、約1.2至約1.8 mM、約1.3至約1.4 mM、約1.3至約1.5 mM、約1.3至約1.6 mM、約1.3至約1.7 mM、約1.3至約1.8 mM、約1.4至約1.5 mM、約1.4至約1.6 mM、約1.4至約1.7 mM、約1.4至約1.8 mM、約1.5至約1.6 mM、約1.5至約1.7 mM、約1.5至約1.8 mM、約1.6至約1.7 mM、約1.6至約1.8 mM或約1.7至約1.8 mM。
在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.8 mM至約1.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.9 mM至約1.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.0 mM至約1.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.1 mM至約1.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.2 mM至約1.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.8 mM至約1.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.8 mM至約0.9 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.9 mM至約1.0 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.0 mM至約1.1 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.1 mM至約1.2 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.2 mM至約1.3 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.3 mM至約1.4 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.4 mM至約1.5 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.5 mM至約1.6 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.7 mM至約1.8 mM。
在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.6 mM、約0.7 mM、約0.8 mM、約0.9 mM、約1.0 mM、約1.1 mM、約1.2 mM、約1.3 mM、約1.4 mM、約1.5 mM、約1.6 mM、約1.7 mM、約1.8 mM、約1.9 mM或約2.0 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.6 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.7 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.8 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約0.9 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.0 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.1 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.2 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.3 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.4 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.5 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.6 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.7 mM。在一些態樣中，鈣離子之濃度為約1.8 mM。 II.A.6. 細胞介素
在一些態樣中，代謝再編程培養基包含細胞介素。在一些態樣中，該培養基為低張的。在一些態樣中，該培養基為等張的。在一些態樣中，該培養基為高張的。在一些態樣中，該細胞介素係選自IL-2、IL-7、IL-15、IL-21及其任何組合。在一些態樣中，代謝再編程培養基不包含IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含IL2及IL21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含IL2、IL21及IL15。在一些態樣中，細胞介素與PCS連接或締合。
細胞介素可在任何時刻添加至培養基中。在一些態樣中，在將免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)添加至培養基中之前，將細胞介素添加至培養基中。在一些態樣中，在細胞工程改造之前，例如在用編碼配位體結合蛋白之構築體進行轉導之前，使免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)在包含(i)本文所揭示之濃度之鉀及(ii)細胞介素的培養基中與PCS接觸且進行培養。在一些態樣中，在細胞工程改造期間，例如在用配位體結合蛋白進行轉導期間，使免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)在包含(i)本文所揭示之濃度之鉀及(ii)細胞介素的培養基中與PCS接觸且進行培養。在一些態樣中，在細胞工程改造之後，例如在用編碼多肽配位體結合蛋白之構築體進行轉導之後，使免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)在包含(i)本文所揭示之濃度之鉀及(ii)細胞介素的培養基中與PCS接觸且進行培養。在一些態樣中，在整個細胞擴增中，使免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)在包含(i)本文所揭示之濃度之鉀及(ii)細胞介素的培養基中與PCS接觸且進行培養。在一些態樣中，在整個細胞工程改造及細胞擴增中，使免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)在包含(i)本文所揭示之濃度之鉀及(ii)細胞介素的培養基中與PCS接觸且進行培養。
在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約5 mM鉀離子及(ii) IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)超過40 mM鉀離子及(ii) IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約50 mM鉀離子及(ii) IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約5 mM鉀離子及(ii) IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)超過40 mM鉀離子及(ii) IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約50 mM鉀離子及(ii) IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約5 mM鉀離子及(ii) IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)超過40 mM鉀離子及(ii) IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約50 mM鉀離子及(ii) IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約5 mM鉀離子及(ii) IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)超過40 mM鉀離子及(ii) IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約50 mM鉀離子及(ii) IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約5 mM鉀離子及(ii) IL-2，且代謝再編程培養基不包含IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)超過40 mM鉀離子及(ii) IL-2，且代謝再編程培養基不包含IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約50 mM鉀離子及(ii) IL-2，且代謝再編程培養基不包含IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約5 mM鉀離子及(ii) IL-2，且代謝再編程培養基不包含IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)超過40 mM鉀離子及(ii) IL-2，且代謝再編程培養基不包含IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約50 mM鉀離子及(ii) IL-2，且代謝再編程培養基不包含IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約5 mM鉀離子及(ii) IL-2，且代謝再編程培養基不包含IL-7及IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)超過40 mM鉀離子及(ii) IL-2，且代謝再編程培養基不包含IL-7及IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約50 mM鉀離子及(ii) IL-2，且代謝再編程培養基不包含IL-7及IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約5 mM鉀離子及(ii) IL-2及IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)超過40 mM鉀離子及(ii) IL-2及IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約50 mM鉀離子及(ii) IL-2及IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約5 mM鉀離子及(ii) IL-7及IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)超過40 mM鉀離子及(ii) IL-7及IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約50 mM鉀離子及(ii) IL-7及IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約5 mM鉀離子及(ii) IL-15及IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)超過40 mM鉀離子及(ii) IL-15及IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約50 mM鉀離子及(ii) IL-15及IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基為低張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基為等張的。在一些態樣中，代謝再編程培養基進一步包含NaCl，其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。
在一些態樣中，本文所述之代謝再編程培養基(例如，包含濃度高於5 mM之鉀離子)包含在約50 IU/mL至約500 IU/mL之間的IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約50 IU/mL、約60 IU/mL、約70 IU/mL、約80 IU/mL、約90 IU/mL、約100 IU/mL、約125 IU/mL、約150 IU/mL、約175 IU/mL、約200 IU/mL、約225 IU/mL、約250 IU/mL、約275 IU/mL、約300 IU/mL、約350 IU/mL、約400 IU/mL、約450 IU/mL或約500 IU/mL IL-2。
因此，在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約50 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約60 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約70 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約80 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約90 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約100 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約125 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約150 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約175 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約200 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約225 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約250 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約275 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約300 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約350 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約400 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約450 IU/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約500 IU/mL IL-2。在一些態樣中，包含鉀離子及IL-2之代謝再編程培養基進一步包含濃度低於約115 nM之NaCl。
在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約0.1 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約0.1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約15 ng/mL、約1 ng/mL至約14 ng/mL、約1 ng/mL至約13 ng/mL、約1 ng/mL至約12 ng/mL、約1 ng/mL至約11 ng/mL、約1 ng/mL至約10 ng/mL、約1 ng/mL至約9 ng/mL、約1 ng/mL至約8 ng/mL、約1 ng/mL至約7 ng/mL、約1 ng/mL至約6 ng/mL、約1 ng/mL至約5 ng/mL、約1 ng/mL至約4 ng/mL、約1 ng/mL至約3 ng/mL、約1 ng/mL至約2 ng/mL、約5 ng/mL至約15 ng/mL、約5 ng/mL至約10 ng/mL、約10 ng/mL至約20 ng/mL、約10 ng/mL至約15 ng/mL或約15 ng/mL至約20 ng/mL IL-2。
在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約0.1 ng/mL、至少約0.5 ng/mL、至少約1 ng/mL、至少約2 ng/mL、至少約3 ng/mL、至少約4 ng/mL、至少約5 ng/mL、至少約6 ng/mL、至少約7 ng/mL、至少約8 ng/mL、至少約9 ng/mL、至少約10 ng/mL、至少約11 ng/mL、至少約12 ng/mL、至少約13 ng/mL、至少約14 ng/mL、至少約15 ng/mL、至少約16 ng/mL、至少約17 ng/mL、至少約18 ng/mL、至少約19 ng/mL或至少約20 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約1.0 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約2.0 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約3.0 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約4.0 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約5.0 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約6.0 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約7.0 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約8.0 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約9.0 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約10 ng/mL IL-2。
在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約0.1 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約50 ng/mL至約600 ng/mL、約50 ng/mL至約500 ng/mL、約50 ng/mL至約450 ng/mL、約50 ng/mL至約400 ng/mL、約50 ng/mL至約350 ng/mL、約50 ng/mL至約300 ng/mL、約100 ng/mL至約600 ng/mL、約100 ng/mL至約500 ng/mL、約100 ng/mL至約450 ng/mL、約100 ng/mL至約400 ng/mL、約100 ng/mL至約350 ng/mL、約100 ng/mL至約300 ng/mL、約200 ng/mL至約500 ng/mL、約200 ng/mL至約450 ng/mL、約200 ng/mL至約400 ng/mL、約200 ng/mL至約350 ng/mL、約200 ng/mL至約300 ng/mL、約250 ng/mL至約350 ng/mL、約300 ng/mL至約600 ng/mL、約300 ng/mL至約500 ng/mL、約300 ng/mL至約450 ng/mL、約300 ng/mL至約400 ng/mL、約300 ng/mL至約350 ng/mL、約250 ng/mL至約300 ng/mL或約275 ng/mL至約325 ng/mL IL-2。
在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約50 ng/mL、至少約60 ng/mL、至少約70 ng/mL、至少約80 ng/mL、至少約90 ng/mL、至少約100 ng/mL、至少約110 ng/mL、至少約120 ng/mL、至少約130 ng/mL、至少約140 ng/mL、至少約150 ng/mL、至少約160 ng/mL、至少約170 ng/mL、至少約180 ng/mL、至少約190 ng/mL、至少約200 ng/mL、至少約210 ng/mL、至少約220 ng/mL、至少約230 ng/mL、至少約240 ng/mL、至少約250 ng/mL、至少約260 ng/mL、至少約270 ng/mL、至少約280 ng/mL、至少約290 ng/mL、至少約300 ng/mL、至少約310 ng/mL、至少約320 ng/mL、至少約330 ng/mL、至少約340 ng/mL、至少約350 ng/mL、至少約360 ng/mL、至少約370 ng/mL、至少約380 ng/mL、至少約390 ng/mL、至少約400 ng/mL、至少約410 ng/mL、至少約420 ng/mL、至少約430 ng/mL、至少約440 ng/mL、至少約450 ng/mL、至少約460 ng/mL、至少約470 ng/mL、至少約480 ng/mL、至少約490 ng/mL、至少約500 ng/mL、至少約510 ng/mL、至少約520 ng/mL、至少約530 ng/mL、至少約540 ng/mL、至少約550 ng/mL、至少約560 ng/mL、至少約570 ng/mL、至少約580 ng/mL、至少約590 ng/mL或至少約600 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約50 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約60 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約70 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約73.6 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約75 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約80 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約90 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約100 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約200 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約300 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約400 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約500 ng/mL IL-2。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約600 ng/mL IL-2。
在一些態樣中，本文所述之代謝再編程培養基(例如，包含濃度高於5 mM之鉀離子)包含在約50 IU/mL至約500 IU/mL之間的IL-21。在一些態樣中，該培養基包含約50 IU/mL、約60 IU/mL、約70 IU/mL、約80 IU/mL、約90 IU/mL、約100 IU/mL、約125 IU/mL、約150 IU/mL、約175 IU/mL、約200 IU/mL、約225 IU/mL、約250 IU/mL、約275 IU/mL、約300 IU/mL、約350 IU/mL、約400 IU/mL、約450 IU/mL或約500 IU/mL IL-21。
在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約50 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約60 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約70 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約80 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約90 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約100 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約125 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約150 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約175 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約200 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約225 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約250 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約275 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約300 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約350 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約400 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約450 IU/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約500 IU/mL IL-21。在一些態樣中，包含鉀離子及IL-21之代謝再編程培養基進一步包含濃度低於約115 nM之NaCl。
在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約0.1 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約0.1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約15 ng/mL、約1 ng/mL至約14 ng/mL、約1 ng/mL至約13 ng/mL、約1 ng/mL至約12 ng/mL、約1 ng/mL至約11 ng/mL、約1 ng/mL至約10 ng/mL、約1 ng/mL至約9 ng/mL、約1 ng/mL至約8 ng/mL、約1 ng/mL至約7 ng/mL、約1 ng/mL至約6 ng/mL、約1 ng/mL至約5 ng/mL、約1 ng/mL至約4 ng/mL、約1 ng/mL至約3 ng/mL、約1 ng/mL至約2 ng/mL、約5 ng/mL至約15 ng/mL、約5 ng/mL至約10 ng/mL、約10 ng/mL至約20 ng/mL、約10 ng/mL至約15 ng/mL或約15 ng/mL至約20 ng/mL IL-21。
在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約0.1 ng/mL、至少約0.5 ng/mL、至少約1 ng/mL、至少約2 ng/mL、至少約3 ng/mL、至少約4 ng/mL、至少約5 ng/mL、至少約6 ng/mL、至少約7 ng/mL、至少約8 ng/mL、至少約9 ng/mL、至少約10 ng/mL、至少約11 ng/mL、至少約12 ng/mL、至少約13 ng/mL、至少約14 ng/mL、至少約15 ng/mL、至少約16 ng/mL、至少約17 ng/mL、至少約18 ng/mL、至少約19 ng/mL或至少約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約1.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約2.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約3.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約4.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約5.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約6.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約7.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約8.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約9.0 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約10 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約10 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約15 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約20 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約25 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約30 ng/mL IL-21。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約35 ng/mL IL-21。
在一些態樣中，本文所述之代謝再編程培養基(例如，包含濃度高於5 mM之鉀離子)包含在約500 IU/mL至約1,500 IU/mL之間的IL-7。在一些態樣中，該培養基包含約500 IU/mL、約550 IU/mL、約600 IU/mL、約650 IU/mL、約700 IU/mL、約750 IU/mL、約800 IU/mL、約850 IU/mL、約900 IU/mL、約950 IU/mL、約1,000 IU/mL、約1,050 IU/mL、約1,100 IU/mL、約1,150 IU/mL、約1,200 IU/mL、約1,250 IU/mL、約1,300 IU/mL、約1,350 IU/mL、約1,400 IU/mL、約1,450 IU/mL或約1,500 IU/mL IL-7。
在一些態樣中，可用於本揭示案之代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約500 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約550 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約600 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約650 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約700 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約750 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約800 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約850 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約900 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約950 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約1,000 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約1,050 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約1,100 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約1,150 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約1,200 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約1,250 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約1,300 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約1,350 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約1,400 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約1,450 IU/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約1,500 IU/mL IL-7。在一些態樣中，包含鉀離子及IL-7之代謝再編程培養基進一步包含濃度低於約115 nM之NaCl。
在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約0.1 ng/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約0.1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約15 ng/mL、約1 ng/mL至約14 ng/mL、約1 ng/mL至約13 ng/mL、約1 ng/mL至約12 ng/mL、約1 ng/mL至約11 ng/mL、約1 ng/mL至約10 ng/mL、約1 ng/mL至約9 ng/mL、約1 ng/mL至約8 ng/mL、約1 ng/mL至約7 ng/mL、約1 ng/mL至約6 ng/mL、約1 ng/mL至約5 ng/mL、約1 ng/mL至約4 ng/mL、約1 ng/mL至約3 ng/mL、約1 ng/mL至約2 ng/mL、約5 ng/mL至約15 ng/mL、約5 ng/mL至約10 ng/mL、約10 ng/mL至約20 ng/mL、約10 ng/mL至約15 ng/mL或約15 ng/mL至約20 ng/mL IL-7。
在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約0.1 ng/mL、至少約0.5 ng/mL、至少約1 ng/mL、至少約2 ng/mL、至少約3 ng/mL、至少約4 ng/mL、至少約5 ng/mL、至少約6 ng/mL、至少約7 ng/mL、至少約8 ng/mL、至少約9 ng/mL、至少約10 ng/mL、至少約11 ng/mL、至少約12 ng/mL、至少約13 ng/mL、至少約14 ng/mL、至少約15 ng/mL、至少約16 ng/mL、至少約17 ng/mL、至少約18 ng/mL、至少約19 ng/mL或至少約20 ng/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約1.0 ng/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約2.0 ng/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約3.0 ng/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約4.0 ng/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約5.0 ng/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約6.0 ng/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約7.0 ng/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約8.0 ng/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約9.0 ng/mL IL-7。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約10 ng/mL IL-7。
在一些態樣中，本文所述之代謝再編程培養基(例如，包含濃度高於5 mM之鉀離子)包含在約50 IU/mL至約500 IU/mL之間的IL-15。在一些態樣中，該培養基包含約50 IU/mL、約60 IU/mL、約70 IU/mL、約80 IU/mL、約90 IU/mL、約100 IU/mL、約125 IU/mL、約150 IU/mL、約175 IU/mL、約200 IU/mL、約225 IU/mL、約250 IU/mL、約275 IU/mL、約300 IU/mL、約350 IU/mL、約400 IU/mL、約450 IU/mL或約500 IU/mL IL-15。
因此，在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約50 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約60 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約70 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約80 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約90 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約100 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約125 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約150 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約175 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約200 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約225 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約250 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約275 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約300 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約350 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約400 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約450 IU/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)濃度高於5 mM之鉀離子及(ii)約500 IU/mL IL-15。在一些態樣中，包含鉀離子及IL-15之代謝再編程培養基進一步包含濃度低於約115 nM之NaCl。
在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約0.1 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含約0.1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約15 ng/mL、約1 ng/mL至約14 ng/mL、約1 ng/mL至約13 ng/mL、約1 ng/mL至約12 ng/mL、約1 ng/mL至約11 ng/mL、約1 ng/mL至約10 ng/mL、約1 ng/mL至約9 ng/mL、約1 ng/mL至約8 ng/mL、約1 ng/mL至約7 ng/mL、約1 ng/mL至約6 ng/mL、約1 ng/mL至約5 ng/mL、約1 ng/mL至約4 ng/mL、約1 ng/mL至約3 ng/mL、約1 ng/mL至約2 ng/mL、約5 ng/mL至約15 ng/mL、約5 ng/mL至約10 ng/mL、約10 ng/mL至約20 ng/mL、約10 ng/mL至約15 ng/mL或約15 ng/mL至約20 ng/mL IL-15。
在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約0.1 ng/mL、至少約0.2 ng/mL、至少約0.3 ng/mL、至少約0.4 ng/mL、至少約0.5 ng/mL、至少約0.6 ng/mL、至少約0.7 ng/mL、至少約0.8 ng/mL、至少約0.9 ng/mL、至少約1 ng/mL、至少約2 ng/mL、至少約3 ng/mL、至少約4 ng/mL、至少約5 ng/mL、至少約6 ng/mL、至少約7 ng/mL、至少約8 ng/mL、至少約9 ng/mL、至少約10 ng/mL、至少約11 ng/mL、至少約12 ng/mL、至少約13 ng/mL、至少約14 ng/mL、至少約15 ng/mL、至少約16 ng/mL、至少約17 ng/mL、至少約18 ng/mL、至少約19 ng/mL或至少約20 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約1.0 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約2.0 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約3.0 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約4.0 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約5.0 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約6.0 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約7.0 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約8.0 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約9.0 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約10 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基進一步包含NaCl，其中鉀離子及NaCl之總濃度為110 mM至140 mM。
在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約30 mM至至少約100 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含超過40 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約45 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約50 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約55 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約60 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約65 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約70 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約75 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約80 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約85 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含至少約90 mM鉀離子、約300 ng/mL IL-2及約0.4 ng/mL IL-15。在一些態樣中，代謝再編程培養基包含(i)至少約70 mM鉀離子，(ii)約60 mM NaCl，(iii)約1.4 mM鈣，(iv)約16 mM葡萄糖，(v)約300 ng/mL IL-2，及(vi)約0.4 ng/mL IL-15。 II.A.7. 基礎培養基
在一些態樣中，基礎培養基包含平衡鹽溶液(例如，PBS、DPBS、HBSS、EBSS)、杜氏改良伊格爾培養基(DMEM)、最低必需培養基(MEM)、伊格爾基礎培養基(BME)、F-10、F-12、RPMI 1640、格拉斯哥最低必需培養基(GMEM)、α最低必需培養基(α MEM)、Iscove改良杜氏培養基(IMDM)、M199、OPTMIZER™ CTS™ T細胞擴增基礎培養基(ThermoFisher)、OPTMIZER™ Complete、IMMUNOCULT™ XF (STEMCELL™ Technologies)、IMMUNOCULT™、AIM V、TEXMACS™培養基、PRIME-XV® T細胞CDM、X-VIVO TM15 (Lonza)、TRANSACT™ TIL擴增培養基或其任何組合。在一些態樣中，基礎培養基包含PRIME-XV T細胞CDM。在一些態樣中，基礎培養基包含OPTMIZER TM。在一些態樣中，基礎培養基包含OPTMIZER TMPro。在一些態樣中，基礎培養基不含血清。在一些態樣中，基礎培養基進一步包含免疫細胞血清替代物(ICSR)。例如，在一些態樣中，基礎培養基包含補充有ICSR之OPTMIZER™ Complete、補充有ICSR之AIM V、補充有ICSR之IMMUNOCULT™ XF、補充有ICSR之RPMI、補充有ICSR之TEXMACS™或其任何組合。在特定態樣中，基礎培養基包含OPTMIZER™ complete。
在一些態樣中，該培養基(例如MRM)進一步包含約2.5%血清補充劑(CTS™ Immune Cell SR, Thermo Fisher)、2 mM L-麩醯胺酸、2 mM L-glutamax、MEM非必需胺基酸溶液、Pen-strep、20 μg/ml fungin™、丙酮酸鈉或其任何組合。在一些態樣中，該培養基進一步包含O-乙醯基-L-肉鹼鹽酸鹽。在一些態樣中，該培養基進一步包含激酶抑制劑。
在一些態樣中，該培養基進一步包含CD3促效劑。在一些態樣中，CD3促效劑為抗CD3抗體。在一些態樣中，抗CD3抗體包含OKT-3。
在一些態樣中，該培養基進一步包含CD28促效劑。在一些態樣中，CD28促效劑為抗CD28抗體。在一些態樣中，該培養基進一步包含CD27配位體(CD27L)。在一些態樣中，該培養基進一步包含4-1BB配位體(4-1BBL)。
在一些態樣中，本揭示案包括包含本文所揭示之培養基的細胞培養物、包含本文所揭示之培養基的細胞袋或包含本文所揭示之培養基的生物反應器。 II.B. 可編程細胞信號傳導支架 (PCS)
在一些態樣中，本文所述之方法包括使人類免疫細胞與可編程細胞信號傳導支架(PCS)在代謝再編程培養基(MRM)中接觸，如本文所述。可編程細胞信號傳導支架(PCS)之非限制性實例描述於WO2018/013797及Chung等人( Nature Biotechnology36(2): 160-169 (2018)中，該等文獻之內容以引用之方式併入。在一些態樣中，本揭示案之可編程細胞信號傳導支架包含第一層，其包含高表面積中孔二氧化矽微棒(MSR)；第二層，其包含塗覆該第一層之脂質；及裝載至該支架上之複數種功能性分子。在一些態樣中，該等支架為生物可降解的。
本文所述之支架能夠模擬通常與抗原呈遞細胞(APC)相關之功能，這允許該等支架在標靶細胞上引發各種功能，例如引發T細胞之效應子功能。如本文所預期，該等支架經由存在於標靶細胞(例如，T細胞)中之細胞表面分子與由該等支架呈遞之各種功能性分子之間的直接或間接相互作用來介導此等效應。在一些態樣中，支架經由支架自身之物理或化學特徵來調節標靶細胞(例如，T細胞)之存活、標靶細胞(例如，T細胞)之生長及/或標靶細胞(例如，T細胞)之功能。
在一些態樣中，支架組合物係經修飾以包含一或多種表面指示物及/或可溶性指示物(例如，細胞信號傳導分子)。在一些態樣中，該等表面指示物及/或可溶性指示物用於介導各種效應子功能。可受該等表面指示物及/或可溶性指示物影響之效應子功能之非限制性實例包括活化、分裂、促進分化、生長、擴增、存活、增加產量、再編程、無反應、靜止、衰老、細胞凋亡、標靶細胞死亡或其任何組合。在一些態樣中，該一或多種表面指示物及/或可溶性指示物用於增加「幹細胞性」。在一些態樣中，與接觸其他受質平台(諸如磁珠，例如DYNABEADS™，或商業粒子，例如TRANSACT™ (Miltenyi Biotech))之細胞(例如，免疫細胞)相比，在本文所述之培養基中與本文所述之PCS接觸的細胞(例如，免疫細胞)展現優異生長及功能。
在一些態樣中，本文所述之方法包括使人類免疫細胞與PCS在代謝再編程培養基中接觸，且進一步使免疫細胞與一或多種刺激分子、細胞介素及/或其他輔因子接觸。在一些態樣中，該一或多種刺激分子、細胞介素及/或其他輔因子存在於該培養基中。在一些態樣中，該一或多種刺激分子、細胞介素及/或其他輔因子存在於該支架中。在一些態樣中，使用負選擇劑、指示物或經由被動非刺激來拒絕或移除非靶向細胞(例如，除T細胞以外之細胞)，該等非靶向細胞已以其他方式滲入支架。 PCS 之組分
在一些態樣中，支架之特定組分係經調節。例如，可藉由選擇或工程改造用於更大或更小孔大小、密度、聚合物交聯、剛度、韌性、延展性或彈性之材料來調節支架組合物之滲透性。支架組合物可含有物理通道或路徑，靶向細胞經由該等物理通道或路徑與支架相互作用及/或移動至支架之特定隔室或區域中。根據需要，為了促進隔室化，可視情況將支架組合物組織成隔室或層，每個隔室或層具有不同的滲透性，使得可對細胞進行分選或過濾以允許僅接近某一細胞亞群。亦可藉由支架組合物之降解、脫水、再水合、氧化、化學改變、pH改變、正在進行之自組裝或其任何組合來調節該支架中之標靶細胞群體的隔絕。此外，支架之功能性分子可在類型及相對豐度方面有所不同，以引發與所需細胞之特定相互作用。
在一些態樣中，PCS包含(i)包含高表面積中孔二氧化矽微棒(MSR)之基層；(ii)在該MSR基層上分層之連續、流體支撐脂質雙層(SLB)；(iii)裝載至該支架上之複數種表面指示物；及/或(iv)裝載至該支架上之複數種可溶性指示物。 II.B.1. 中孔二氧化矽
在一些態樣中，該支架包含中孔二氧化矽。中孔二氧化矽為一種多孔體，具有六方密排、圓柱形、均勻孔。在一些態樣中，藉由使用界面活性劑之棒狀膠束作為模板來合成中孔二氧化矽，該模板藉由在水或醇中在酸或鹼催化劑存在下溶解且水解二氧化矽來源(例如烷氧基矽烷、矽酸鈉溶液、水矽鈉石、二氧化矽精細粒子)而在水中形成。參見美國公開案第2015-0072009號及Hoffmann等人， Angewandte Chemie International Edition,45, 3216-3251, 2006，該等文獻中之每一者均以引用之方式整體併入本文中。多種界面活性劑可用於中孔二氧化矽之合成，包括但不限於陽離子、陰離子及非離子界面活性劑。在一些態樣中，界面活性劑為陽離子界面活性劑之烷基三甲基銨鹽。陽離子界面活性劑之烷基三甲基銨鹽可生成具有增加之比表面積及孔體積的中孔二氧化矽。參見美國公開案第2013/0052117號及Katiyar等人( Journal of Chromatography1122 (1-2): 13-20)，該等文獻中之每一者均以引用之方式整體併入本文中。如本文所用，術語「中尺度」、「中孔(mesopore)」、「中孔(mesoporous)」及其類似術語係指特徵大小在約1 nm至約60 nm範圍內之結構。在一些態樣中，中孔材料包括直徑在約1 nm至約50 nm範圍內之孔。在一些態樣中，中孔材料包括直徑在約5 nm至約60 nm範圍內之孔。在一些態樣中，中孔材料包括直徑在約2 nm至約50 nm範圍內之孔。在一些態樣中，該等孔係有序分佈的。在一些態樣中，該等孔係隨機分佈的。
本揭示案之支架中所用的中孔二氧化矽可以多種形式提供。在一些態樣中，該等支架以選自微球、不規則粒子、矩形棒、圓形奈米棒及其任何組合之形式提供。在一些態樣中，該等支架作為結構化棒狀形式(MSR)提供。該等粒子可具有任何預定形狀。在一些態樣中，該等粒子具有球體形狀。在一些態樣中，該等粒子具有橢圓體形狀。在一些態樣中，該等粒子具有棒狀形狀。在一些態樣中，該等粒子具有完全圓柱形。組裝中孔二氧化矽以產生微棒之方法的非限制性實例可見於例如Wang等人， Journal of Nanoparticle Research,15:1501, 2013中，該文獻以引用之方式整體併入本文中。在一些態樣中，藉由使原矽酸四乙酯與由膠束棒製成之模板反應來合成中孔二氧化矽奈米粒子。接著，可藉由用經調節至適當pH之溶劑洗滌來移除該模板。在此實例中，在移除界面活性劑模板之後，製備以均勻、有序且連通中孔性為特徵之親水性二氧化矽奈米粒子，其比表面積為例如約600 m 2/g至約1200 m 2/g、尤其約800 m 2/g至約1000 m 2/g且尤其約850 m 2/g至約950 m 2/g。在一些態樣中，使用簡單溶膠-凝膠方法或噴霧乾燥方法來合成中孔粒子。原矽酸四乙酯亦可與額外聚合物單體一起使用(例如，作為模板)。在一些態樣中，一或多種四烷氧基-矽烷及一或多種(3-氰基丙基)三烷氧基-矽烷共縮合以提供呈棒狀之中孔矽酸鹽粒子。參見美國公開案第2013-0145488號、第2012-0264599號及第2012-0256336號，其中每一者由此以引用之方式整體併入。
MSR可包含1-60 nm之間直徑之孔，例如2-5 nm、10-20 nm、10-30 nm、10-40 nm、20-30 nm、30-50 nm、30-40 nm、40-50 nm、50-60 nm之間之孔。在一些態樣中，微棒包含大約1 nm、2 nm、3 nm、4 nm、5 nm、6 nm、7 nm、8 nm、9 nm、10 nm、11 nm、12 nm、13 nm、14 nm、15 nm或更大直徑之孔。孔大小可視應用類型而發生改變。
在一些態樣中，MSR之長度係在微米範圍內，介於約5 µm至約500 µm範圍內。在一些態樣中，微棒包含約5-50 µm之長度，例如約10-20 µm、約10-30 µm、約10-40 µm、約20-30 µm、約30-50 µm、約30-40 µm或約40-50 µm。在一些態樣中，MSR包含約50 µm至約250 µm之長度，例如約60 µm、約70 µm、約80 µm、約90 µm、約100 µm、約120 µm、約150 µm、約180 µm、約200 µm、約225 µm或更大。對於細胞募集，可使用具有更高縱橫比之MSR組合物，例如其中棒包含50 µm至200 µm之長度、尤其80 µm至120 µm之長度、尤其約100 µm或更大長度。
在一些態樣中，MSR之寬度係在微米範圍內，介於約0.1 µm至約100 µm範圍內。在一些態樣中，微棒包含約0.1-75 µm之寬度，例如約1-55 µm、約1-50 µm、約2-50 µm、約1-40 µm。在一些態樣中，MSR包含約1.0 µm、約2 µm、約5 µm、約10 µm、約15 µm、約20 µm、約25 µm、約30 µm、約35 µm、約40 µm、約45 µm、約50 µm、約55 µm或更大寬度。
在一些態樣中，MSR提供高表面積以用於附著及/或結合於標靶細胞，例如T細胞。獲得高表面積中孔矽酸鹽之非限制性方法可見於例如美國專利第8,883,308號及美國公開案第2011-0253643號中，該等文獻中之每一者均以引用之方式整體併入本文中。在一些態樣中，高表面積係歸因於奈米粒子之纖維形態，這使得有可能在表面上獲得高濃度之高度分散且易於接近的部分。在一些態樣中，MSR具有至少約100 m 2/g、至少150 m 2/g、至少約200 m 2/g、至少約250 m 2/g或至少300 m 2/g之表面積。在一些態樣中，MSR具有約100 m 2/g至約1500 m 2/g之表面積，包括其間所有值或子範圍，例如50 m 2/g、100 m 2/g、200 m 2/g、300 m 2/g、400 m 2/g、500 m 2/g、600 m 2/g、700 m 2/g、800 m 2/g、100-500 m 2/g、100-300 m 2/g、500-800 m 2/g、100-700 m 2/g、200-600 m 2/g、500-1000 m 2/g或500-1500 m 2/g。
在一些態樣中，MSR為足夠多孔的，使得支架維持抗原呈遞且吸引及操縱免疫細胞。在一些態樣中，支架含有多孔基質，其中孔具有至少10 nm之直徑。在一些態樣中，孔具有至少500 µm之直徑。在一些態樣中，孔具有10 nm至500 µm之直徑。在一些態樣中，孔具有100 nm至100 µm之直徑。在此等態樣中，支架包含中孔支架。在一些態樣中，支架含有多孔基質，其中孔與滲入支架之細胞群體一樣大或更大。製備具有所需孔大小及孔排列之聚合物基質的方法之非限制性實例描述於例如美國公開案第2011/0020216號及美國專利第6,511,650號中，該等文獻中之每一者均以引用之方式整體併入本文中。 II.B.2. 脂質
本揭示案之支架包含第二層，該第二層包含塗覆該第一層之脂質。術語「脂質」通常表示與生命系統相關之一組異質物質，該等物質具有不溶於水之共同特性，可藉由低極性有機溶劑(諸如氯仿及乙醚)自細胞中提取。在一些態樣中，「脂質」係指包含長脂肪酸鏈之任何物質，較佳地含有10-30個碳單元，特別含有14-23個碳單元，尤其含有16-18個碳單元。
在一些態樣中，包含脂質之層作為單層提供。在一些態樣中，包含脂質之層作為雙層提供。較佳地，脂質雙層為流體，其中個別脂質分子能夠在雙層內擴散。膜脂分子較佳為兩親性的。
在一些態樣中，包含脂質之層包含一或多個連續雙層，例如類似於在天然生物膜(諸如細胞質膜)中發現之彼等。在一些態樣中，包含脂質之層以支撐雙層之形式提供。在一些態樣中，包含脂質之層為連續、流體支撐之脂質體。在一些態樣中，包含脂質之層為連續、流體支撐之脂質雙層。如本文所用，支撐雙層係位於固體支撐物上之平面結構。在此類佈置中，支撐雙層之上表面暴露，而支撐雙層之內表面與該支撐物接觸。本揭示案之支架通常為穩定的且即使在經受高流動速率或振動時，亦保持大致完整。本揭示案之支架之包含脂質的層亦可進行修飾、衍生化及/或與任何化學及/或生物部分化學結合。
在一些態樣中，本揭示案之支架之包含脂質的層係固定於MSR層上。脂質層可使用任何方法固定於MSR上，包括但不限於共價及非共價相互作用。在一些態樣中，包含脂質之層經吸附於MSR層上。在一些態樣中，包含脂質之層經由一或多種共價相互作用附著或繫栓至MSR。用於將脂質附著至矽酸鹽之方法的非限制性實例包括表面吸收及物理固定，例如使用相變將物質截留於支架材料中。在一些態樣中，使包含脂質之層分層至MSR層上。例如，可將脂質膜(含有例如77.5:20:2.5之莫耳比的DPPC/膽固醇/DSPE-PEG於氯仿中之溶液)滴於MSR層上且使用旋轉蒸發器蒸發溶劑。參見Meng等人， ACS Nano,9 (4), 3540-3557, 2015。在一些態樣中，藉由將水合脂質膜擠壓通過具有例如約100 nm之孔大小的過濾器來製備脂質雙層。接著，可例如藉由移液管混合使經過濾之脂質膜與多孔粒子核心融合。
在一些態樣中，使用經由烷基化劑或醯化劑進行之共價偶合來提供包含脂質之層在MSR層上的穩定、結構化且長期保留。在一些態樣中，脂質雙層係可逆地或不可逆地固定至MSR層上。例如，MSR層可為親水性的且可例如經氫氧化銨及過氧化氫進一步處理以提供更具親水性表面。脂質雙層可例如使用任何偶合技術融合至多孔MSR層上以形成本揭示案之支架。
在一些態樣中，包含脂質之層包含磷脂。此類脂質之代表性實例包括但不限於美國專利第9,066,867號及第8,3676,28號中所述之兩性脂質體，該等文獻中之每一者均以引用之方式整體併入本文中。在一些態樣中，包含脂質之層包含選自以下之脂質：二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼(DMPC)、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)、棕櫚醯-油醯磷脂醯膽鹼(POPC)、二油醯磷脂醯膽鹼(DOPC)、二油醯-磷脂醯乙醇胺(DOPE)、二肉豆蔻醯-磷脂醯乙醇胺(DMPE)、二棕櫚醯-磷脂醯乙醇胺(DPPE)、1-硬脂醯-2-肉豆蔻醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(8:0-14:0 PC)及其任何組合。在一些態樣中，包含脂質之層包含棕櫚醯-油醯磷脂醯膽鹼(POPC)。在一些態樣中，包含脂質之層包含模擬哺乳動物細胞膜(例如，人類細胞質膜)之脂質組成的脂質組合物。許多哺乳動物細胞膜之脂質組成已經表徵且可容易由熟習此項技術者確定(參見例如Essaid等人， Biochim. Biophys. Acta1858(11): 2725-36 (2016)，其完整內容以引用之方式併入本文中)。可改變包含脂質之層的組成以修改脂質雙層之電荷或流動性。在一些態樣中，包含脂質之層包含膽固醇。在一些態樣中，包含脂質之層包含神經鞘脂。在一些態樣中，包含脂質之層包含磷脂。在一些態樣中，脂質為磷脂醯乙醇胺、磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲胺酸、磷酸肌醇、具有包含6-20個碳之飽和或不飽和尾部的磷酸神經鞘脂或其組合。在一些態樣中，脂質為DIYNE PC脂質。在一些態樣中，包含脂質之層包含有利於脂質物質自發分配至液體有序結構域中之脂質組合物(參見例如Wang T-Y等人， Biochemistry40(43): 1303 1-40 (2001)，其以引用之方式整體併入本文中)。
在一些態樣中，藉由諸如離子或非離子界面活性劑之化合物使包含脂質之層穩定化。可用於本文所揭示之組合物的界面活性劑之非限制性實例包括：合成磷脂、其氫化衍生物及其混合物；神經鞘脂及醣神經鞘脂；飽和或不飽和脂肪酸；脂肪醇；聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物；乙氧基化脂肪酸以及其酯或醚；二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼；二肉豆蔻醯磷脂醯甘油；或其組合。在一些態樣中，界面活性劑包含二肉豆蔻醯磷脂醯甘油。
在一些態樣中，一旦與細胞接觸，本揭示案之支架即保留連續流體架構持續至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少15天、至少16天、至少17天、至少18天、至少19天、至少20天、至少2 1天、至少25天、至少30天、至少35天、至少40天、至少50天或更久。 II.B.3. 生物可降解支架
在一些態樣中，本揭示案之支架為生物可降解的。在一些態樣中，該支架結構在暴露於生物環境時實質上降解。在一些態樣中，該生物環境包含組織培養條件，例如已視情況經調適以培養淋巴細胞(諸如T細胞)之組織培養基。在一些態樣中，該生物環境包含生物流體，例如血液、淋巴液、CSF、腹膜液或其類似物。在一些態樣中，該生物環境為植入位點(例如，血管、淋巴系統、脂肪組織或其類似位點)處之組織環境。
在一些態樣中，生物可降解支架在活體內與生物環境接觸1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、20天、30天、45天、60天、90天或更久後實質上降解。在一些態樣中，生物可降解支架在活體內與生物環境接觸不到1週後實質上降解。在一些態樣中，生物可降解支架在活體外與生物環境接觸1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、20天、30天、45天、60天、90天或更久後實質上降解。在一些態樣中，生物可降解支架在活體外與生物環境接觸不到1週後實質上降解。如本文所用，「實質降解」意謂當支架組合物與生物環境接觸時，至少30%、至少50%、至少60%、至少70%、至少90%、至少95%或更多之支架組合物降解。
因此，在一些態樣中，有利的是藉由修改中孔二氧化矽棒之特性(諸如大小、幾何形狀及/或多孔性)來調整支架組合物之降解動力學。或者，可藉由改變培養條件(例如 ，藉由調節培養基之pH)來修改支架組合物之降解動力學。
根據前述態樣，本揭示案之支架可包含複數種功能性分子，該等功能性分子為視情況生物可降解的。在一些態樣中，本揭示案之支架經囊封至其他生物可降解支架中。可用於製備此類複合生物可降解支架組合物之試劑及技術的非限制性實例描述於Liao等人， J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater.,102(2):293-302, 2014中，其以引用之方式整體併入本文中。在一些態樣中，該等支架由生理學上可相容且視情況生物可降解之聚合物構成。可用於支架之聚合物的非限制性實例描述於美國專利第6,642,363號、美國公開案第2011/0020216號，Martinsen等人， Biotech. & Bioeng.,33 (1989) 79-89)，(Matthew等人， Biomateriah,16 (1995) 265-274)，Atala等人， J Urology,152 (1994) 641-643)，及Smidsrod, TIBTECH8 (1990) 71-78)中，該等文獻之完整內容以引用之方式併入本文中。
本文所述之態樣進一步關於可編程細胞信號傳導支架，該等支架具有一或多種功能性分子，例如表面指示物及可溶性指示物，視情況連同一或多種額外劑。在一些態樣中，本揭示案提供包含支架及叢集於其中之T細胞之組合物。在一些態樣中，該等組合物及/或支架與一或多種用於選擇、培養、擴增、維持及/或移植所關注之細胞之試劑一起提供。 II.B.4. 功能性分子
在一些態樣中，該等支架包含一或多種功能性分子。在一些態樣中，該功能性分子與細胞(例如，T細胞)相互作用以引起相互作用及/或激起或抑制反應。在一些態樣中，該功能性分子為表面指示物。在一些態樣中，該功能性分子為可溶性指示物。在一些態樣中，支架包含至少一種表面指示物。在一些態樣中，支架包含至少一種可溶性指示物。在一些態樣中，支架包含至少一種表面指示物及至少一種可溶性指示物。
此類功能性分子之非限制性實例包括多肽、抗原、抗體、DNA、RNA、碳水化合物、半抗原、其他小分子及其任何組合。在一些態樣中，本揭示案之功能性分子包含多肽(本文中與蛋白質及肽可互換使用)。 II.B.5. 表面指示物
在一些態樣中，該等支架包含一或多種表面指示物。如本文所用，「表面指示物」係指能夠結合於細胞表面受體之分子。在一些態樣中，該表面指示物與支架結構之包含脂質之層接觸或偶合。在一些態樣中，該表面指示物介導標靶細胞群體(例如，T細胞)之一或多種生物活性的直接、間接或半直接調節。在一些態樣中，該表面指示物介導T細胞之直接活化。在一些態樣中，該表面指示物直接活化T細胞，例如經由結合於標靶T細胞上之細胞表面受體。在一些態樣中，該表面指示物包含作為T細胞之活化信號之刺激分子。如本文所用，T細胞「刺激分子」係指增加一或多種T細胞活性、增加T細胞中之一或多種細胞介素的表現、增加T細胞之細胞毒性、增加T細胞增殖、減少T細胞死亡或其任何組合之任何劑。在一些態樣中，該表面指示物包含共刺激分子。
在一些態樣中，本揭示案之支架之表面指示物為抗體或其抗原結合部分。如本文所用，術語「抗體」泛指包含一或多條多肽鏈之任何免疫球蛋白(Ig)分子。在一些態樣中，抗體包含兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈，或其任何功能片段、突變體、變異體或衍生物，其保留Ig分子之基本抗原決定基結合特徵。如本文所用，「抗體片段」係指抗體之一部分，其能夠結合抗原上之抗原決定基。如本文所用，術語抗體之「抗原結合部分」係指抗體中促進識別抗原及/或結合於抗原之一或多個部分。
本揭示案之範圍內的抗原結合部分之非限制性實例包括(i) Fab片段，由VL、VH、CL及CHI結構域組成之單價片段；(ii) F(ab’) 2片段，包含在鉸鏈區藉由二硫橋連接之兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH及CHI結構域組成之Fd片段；(iv)由抗體單臂之VL及VH結構域組成之Fv片段，(v) dAb片段；及(vi)經分離之互補決定區(CDR)。在一些態樣中，抗體包含VHH抗體、vNAR抗體、IgNAR抗體、駱駝科動物抗體、雙功能抗體、單功能抗體或其任何組合。
在本揭示案之表面指示物的一些態樣中，抗體為單特異性、雙特異性、雙重特異性或多特異性形式；特異性結合於一種或兩種或兩種以上不同抗原。
在一些態樣中，該等表面指示物包括但不限於活化T細胞之刺激分子(T細胞活化分子)。在一些態樣中，刺激分子藉由銜接及/或叢集T細胞受體複合物之組分來活化T細胞。在一些態樣中，刺激分子包含抗CD3抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，刺激分子包含抗CD2抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，刺激分子包含抗CD47抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，刺激分子包含抗CD81抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，刺激分子包含抗巨噬細胞清道夫受體(MSR1)抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，刺激分子包含抗T細胞受體(TCR)抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，表面指示物包含主要組織相容性複合物(MHC)分子或其多聚體。在一些態樣中，主要組織相容性複合物(MHC)分子或其多聚體裝載有MHC肽。在一些態樣中，表面指示物包含含有MHC及免疫球蛋白(Ig)之結合物或其多聚體。
T細胞可以CD3依賴性或非依賴性方式，例如經由CD3或除CD3之外的一或多種細胞表面受體之結合及/或接合經活化。此類CD3非依賴性細胞表面分子之代表性實例包括例如CD2、CD47、CD81、MSR1等。T細胞活化之過程例如在Ryan等人， Nature Reviews Immunology10, 7, 2010中經描述，該文獻以引用之方式整體併入。
在一些態樣中，本揭示案之支架中所用的表面指示物為抗CD3抗體或其抗原結合部分。抗CD3抗體之代表性實例包括但不限於莫羅單抗(muromonab，OKT3)、奧昔珠單抗(otelixizumab，TRX4)、替利珠單抗(teplizumab，hOKT3yl(Ala- Ala))、維西珠單抗(visilizumab)、識別CD3抗原/T細胞抗原受體(TCR)複合物內之CD3的17-19 kD C鏈之抗體(HIT3a)以及識別CD3e內之TCR複合物的20 kDa次單元之抗體(UCHT1)或其抗原結合部分。抗CD3抗體及其抗原結合部分之額外非限制性實例描述於美國專利公開案第2014-0088295號中，該案以引用之方式整體併入本文中。
在一些態樣中，本揭示案之支架中所用的表面指示物包含抗CD2抗體或其抗原結合部分。抗CD2抗體之代表性實例包括但不限於希普珠單抗(siplizumab，MEDI-507)及LO-CD2b或其抗原結合部分。參見例如ATCC寄存編號PTA-802；1999年6月22日寄存。
在一些態樣中，本揭示案之支架中所用的表面指示物包含抗CD47抗體或其抗原結合部分。抗CD47抗體之代表性實例包括但不限於單株抗體Hu5F9-G4、單株抗體MABL-1及單株抗體MABL-2 (FERM寄存編號BP-6100及BP-6101)或其抗原結合部分。參見例如WO1999/1 2973，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
在一些態樣中，本揭示案之支架中所用的表面指示物包含抗CD81抗體或其抗原結合部分。抗CD81抗體之代表性實例包括但不限於單株抗體5A6或其抗原結合部分。參見例如Maecker等人， BMC Immunol.,4:1, 2003，其揭示內容以引用之方式併入本文中。
在一些態樣中，本揭示案之支架中所用的表面指示物包含抗MSRI抗體或其抗原結合部分。抗MSRI抗體之代表性實例包括但不限於大鼠抗人類CD204抗體(Thermo目錄號MA5-16494)及山羊抗人類CD204/MSR1抗體(Biorad目錄號AHP563)或其抗原結合部分。
在一些態樣中，本揭示案之支架中所用的表面指示物包含抗TCR抗體或其抗原結合部分。抗TCR抗體之代表性實例包括但不限於小鼠抗人類TCR單株抗體IMMU510 (Immunotech, Beckman Coulter, Fullerton, CA) (描述於Zhou等人， Cell Mol Immunol.,9(1): 34-44, 2012中)及限定α/β TCR之單株抗體WT31 (描述於Gupta等人， Cell Immunol,132(l):26-44, 1991中)或其抗原結合部分。
在一些態樣中，表面指示物包含雙特異性抗體。在一些態樣中，使用雙特異性抗體使所關注之細胞(例如 ，癌細胞或病原體)與本揭示案之標靶效應細胞(例如 ，細胞毒性T細胞)緊密接近，使得在所關注之細胞上特異性地介導標靶效應細胞之效應子功能。在一些態樣中，表面指示物包含雙特異性抗體，其中該抗體之一個臂對T細胞抗原具有特異性，而該抗體之另一個臂對腫瘤相關抗原或病原體特異性抗原或其突變體具有特異性。
在一些態樣中，雙特異性抗體在活化及共刺激能力方面起作用。在一些態樣中，雙特異性抗體特異性結合CD3及CD28。此類表面指示物可在本文中稱為例如「抗CD3/抗CD28」或「抗CD3×CD28」或「CD3×CD28」雙特異性分子，或其他類似術語。人類CD28蛋白具有以GENBANK寄存編號NP_001230006.1、NP_001230007.1或NP_006130.1顯示之胺基酸序列。小鼠CD28蛋白具有以GENBANK寄存編號NP_031668.3顯示之胺基酸序列。上述寄存編號所涵蓋之各種多肽序列包括相應mRNA及基因序列，且以引用之方式整體併入本文中。本揭示案之範圍內所設想的雙特異性抗體之額外實例包括但不限於索利托單抗(solitomab，CD3xEpCAM)、博納吐單抗(blinatumomab，CD3xCD19)、MAB MT-111 (CD3xCEA)及BAY- 2010112 (CD3xPSMA)。
在一些態樣中，本揭示案之支架中所用的表面指示物包含結合於CD3之主要組織相容性複合物(MHC)分子。代表性實例包括但不限於結合於TCR及CD8之MHC I型，及結合於TCR及CD4之MHC II型。在一些態樣中，MHC分子包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、DP、DQ及DR或其組合。在一些態樣中，表面指示物包含兩個或兩個以上附接至連接體之MHC分子。在一些態樣中，MHC分子為單價的。在一些態樣中，MHC分子為二價的。
在一些態樣中，MHC分子裝載有特定肽(例如 ，衍生自病毒抗原、細菌抗原、過敏原抗原或腫瘤相關抗原之肽)。
在一些態樣中，表面指示物包含融合蛋白。在一些態樣中，融合蛋白具有T細胞刺激特性。T細胞刺激特性可藉由使用連接體來構建，該連接體除了經由TCR遞送之信號以外，亦允許向T細胞遞送第二信號。這可藉由使用對另一細胞上之細胞表面結構具有結合親和力之連接體來實現，該細胞能夠將第二信號遞送至T細胞。因此，該連接體用於橋接T細胞及另一細胞。藉由使該另一細胞密切接近T細胞，該另一細胞可向T細胞遞送第二信號。
在一些態樣中，本揭示案之表面指示物包含一或多種共刺激分子。如本文所用，「共刺激分子」係指結合於細胞(諸如免疫細胞，例如T細胞)且向細胞提供次級或共刺激信號之多肽。一些共刺激分子包括免疫細胞表面受體/配位體，其在T細胞與抗原呈遞細胞之間銜接且在T細胞中產生刺激信號，該刺激信號與T細胞中由T細胞受體(「TCR」)識別抗原呈遞細胞上之抗原而產生的刺激信號(亦即，「共刺激」)組合。如本文所用，「源自APC」之共刺激分子的可溶性形式係指通常由B細胞、巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞及其他APC表現之共刺激分子。參見Huppa等人， Nature Reviews Immunology.3, 973-983 (2003)。「T細胞活化之共刺激物」係指共刺激配位體結合且活化已經由任何上述機制或路徑(例如 ，經由CD3依賴性或CD3非依賴性T細胞活化)活化之T細胞的能力。可藉由細胞介素之產生且藉由熟知之增殖分析(例如 ，CFSE染色)來量測T細胞之共刺激活化。
此類共刺激分子可介導對標靶細胞群體之直接、間接或半直接刺激。在一些態樣中，共刺激分子在一或多種表面指示物存在下介導T細胞之活化。
在一些態樣中，共刺激分子包含特異性地結合於共刺激受體(例如 ，重組配位體、經純化之天然配位體或其衍生物)之分子。在一些態樣中，共刺激分子包含抗體或其抗原結合部分，該抗體或其抗原結合部分特異性地結合於一或多種共刺激抗原。共刺激分子之代表性實例包括但不限於特異性結合於CD28、4. IBB (CD137)、OX40 (CD134)、CD27 (TNFRSF7)、GITR (CD357)、CD30 (TNFRSF8)、HVEM (CD270)、LT R (TNFRSF3)、DR3 (TNFRSF25)、ICOS (CD278)、CD226 (DNAM1)、CRTAM (CD355)、TIM1 (HAVCR1、KIM1)、CD2 (LFA2、0X34)、SLAM (CD150、SLAMF1)、2B4 (CD244、SLAMF4)、Lyl08 (NTBA、CD352、SLAMF6)、CD84 (SLAMF5)、Ly9 (CD229、SLAMF3)、CD279 (PD-1)及/或CRACC (CD319、BLAME)之分子。
在此情況下，CD28為原型T細胞共刺激受體且與在APC (諸如樹突狀細胞及經活化之B細胞)上表現之B7家族分子結合。CD28之配位體包括CD80 (B7-1)及CD86 (B7-2)，該等配位體為免疫球蛋白超家族單體跨膜醣蛋白。
在一些態樣中，共刺激分子包含抗CD28抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，共刺激分子包含抗ICOS (CD278)抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，共刺激分子包含抗CD152 (CTLA4)抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，共刺激分子包含抗CD81抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，共刺激分子包含抗CD137抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，共刺激分子包含抗OX40 (CD134)抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，共刺激分子包含抗CD27 (TNFRSF7)抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，共刺激分子包含抗GITR (CD357)抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，共刺激分子包含抗CD30 (TNFRSF8)抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，共刺激分子包含抗HVEM (CD270)抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，共刺激分子包含抗LTpR (TNFRSF3)抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，共刺激分子包含抗DR3 (TNFRSF25)抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，共刺激分子包含抗CD226 (DNAM1)抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，共刺激分子包含抗CRTAM (CD355)抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，共刺激分子包含抗TIM1 (HAVCR1、KIM1)抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，共刺激分子包含抗SLAM (CD 150、SLAMF1)抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，共刺激分子包含抗2B4 (CD244、SLAMF4)抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，共刺激分子包含抗Lyl08 (NTBA、CD352、SLAMF6)。在一些態樣中，共刺激分子包含抗CD84 (SLAMF5)抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，共刺激分子包含抗CD229 (Ly9、SLAMF3)抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，共刺激分子包含抗PD-1 (CD279)。在一些態樣中，共刺激分子包含抗CRACC (CD319、BLAME)抗體或其抗原結合部分。共刺激分子之代表性實例包括但不限於例如美國專利第8.785,604號；國際公開案第WO 2010/078526號；Maecker等人， BMC Immunol.,4:1, (2003)；Ramakrishna等人， Journalfor ImmunoTherapy of Cancer,3:37, (2015)；Cheung等人， J. Immunol,185:1949, (2010)；Hobo等人， J. Immunol.189:39, (2012)；Reddy等人， J. Virol ,86 (19) 10606- 10620, (2012)；Wolf等人， Transplantation,27;94(6):569-74, (2012)；Flaig等人， J. Immunol.172:6524-6527, (2004)；及Stark等人， J. Immunol.Methods 296: 149-158, (2005)中所引用之彼等分子，該等文獻中之每一者均以引用之方式整體併入本文中。在一些態樣中，共刺激分子包含重組或經純化之天然配位體或其衍生物。
在一些態樣中，該等支架包含一對表面指示物。在一些態樣中，一對表面指示物向標靶細胞(諸如T細胞)提供初級刺激信號及共刺激信號。此類對之代表性實例包括但不限於能夠結合於CD3/CD28、CD3/ICOS、CD3/CD27及CD3/CD137或其組合之抗體。
在一些態樣中，該等支架包含結合對，該結合對包含結合於CD3之抗體及至少一種共刺激分子。在一些態樣中，該至少一種共刺激分子包含抗CD28抗體。在一些態樣中，該至少一種共刺激分子包含抗CD28抗體及第二共刺激分子。在一些態樣中，該第二共刺激分子包含特異性結合ICOS、CD27或CD137之抗體。在一些態樣中，該支架包含選自以下組合之功能性分子的組合：(a)特異性結合CD3、CD28及ICOS之抗體，(b)特異性結合於CD3、CD28及CD27之抗體，(c)特異性結合於CD3、CD28及CD137之抗體，(d)特異性結合於CD3、CD28、ICOS及CD27之抗體。
在一些態樣中，該等支架包含結合對，該結合對包含至少兩種單特異性抗體，其中第一抗體結合於該對之第一成員，例如CD3，且第二抗體結合於該對之第二成員，例如CD28。在一些態樣中，該結合對包含雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含特異性結合CD3之抗原結合結構域及特異性結合CD28之抗原結合結構域。
或者，在一些態樣中，該結合對包含至少兩種單特異性抗體，其中第一抗體結合於CD3且第二抗體結合於ICOS。在一些態樣中，該結合對包含特異性結合於ICOS之抗體或其抗原結合部分。在一些態樣中，該抗體為中和ICOS之拮抗性抗體或抗原結合部分。
在一些態樣中，該結合對包含至少兩種單特異性抗體，其中第一抗體結合於CD3且第二抗體結合於CD27。在一些態樣中，兩種抗體均為刺激性抗體。在一些態樣中，兩種抗體均為促效劑抗體。在一些態樣中，該結合支架包含雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含促效劑抗CD3結合結構域及促效劑CD27結合結構域。
在一些態樣中，該結合對包含至少兩種單特異性抗體，其中第一抗體結合於CD3且第二抗體結合於CD137。在一些態樣中，兩種抗體均為刺激性抗體。在一些態樣中，兩種抗體均為促效劑抗體。在一些態樣中，該結合支架包含雙特異性抗體，該雙特異性抗體包含促效劑抗CD3結合結構域及促效劑抗CD137結合結構域。
在一些態樣中，該支架包含複數種表面指示物。在一態樣中，該支架包含多種抗體，其中每種抗體優先結合於標靶細胞之表面上的不同受體。
該等支架上存在之不同表面指示物分子之量(例如表面指示物1/表面指示物2)可理解為功能性分子密度，經計算為每個表面積或支架之理論分子數，或基於用於功能性分子呈遞的包覆脂質之mol%或該等功能性分子之化學計量來計算。表面指示物密度可藉由包含脂質之層中用於功能性分子親和配對之脂質的百分率來確定，其中表面指示物經固定至包含脂質之層。該等功能性分子之比率或化學計量可表述為經固定之各種功能性分子的相對比例。功能性分子呈遞之密度亦可藉由MSR之乾重與經組合之表面指示物的乾重之比率來確定。
如本文所用，術語「親和對」包括抗原-抗體、受體-激素、受體-配位體、促效劑-拮抗劑、凝集素-碳水化合物、核酸(RNA或DNA)雜交序列、Fc受體或小鼠IgG-蛋白A、抗生物素蛋白-生物素、卵白素-生物素、生物素/生物素結合劑、Ni2+或Cu2+螯合劑(例如NTA或其他螯合劑/金屬對)/HisTag (6x組胺酸或其他聚組胺酸標籤)及病毒-受體相互作用。預期各種其他特異性結合對用於實踐本揭示案之方法。
如本文所用，「生物素結合劑」涵蓋抗生物素蛋白、卵白素及其他抗生物素蛋白類似物，諸如卵白素或抗生物素蛋白結合物、高度純化且分級分離之抗生物素蛋白或卵白素物質以及非或部分胺基酸變異體、重組或化學合成之具有胺基酸或化學取代之抗生物素蛋白類似物，其仍適應生物素結合。
在一些態樣中，每個生物素結合劑分子結合至少兩個生物素部分。在一些態樣中，每個生物素結合劑分子結合至少四個生物素部分。如本文所用，「生物素」涵蓋生物素以及生物胞素及其他生物素類似物，諸如生物素醯胺基己酸酯N-羥基琥珀醯亞胺酯、生物素4-醯胺基苯甲酸、生物素醯胺己醯肼及其他生物素衍生物及結合物。其他衍生物包括生物素-葡聚醣、生物素-二硫化物-N-羥基琥珀醯亞胺酯、生物素-6醯胺基喹啉、生物素醯肼、d-生物素-N羥基琥珀醯亞胺酯、生物素馬來醯亞胺、d-生物素對硝基苯酯、生物素化核苷酸及生物素化胺基酸(諸如Nε-生物素-l -離胺酸)。
可經由親和配對官能化之配位體包括但不限於受體、單株或多株抗體、病毒、化學治療劑、受體促效劑及拮抗劑、抗體片段、凝集素、白蛋白、肽、蛋白質、激素、胺基糖、脂質、脂肪酸、核酸及自天然或合成來源製備或分離之細胞。可使用欲經由本揭示案之實踐偵測的任何分子抗原決定基或受體之任何位點特異性配位體。在一些態樣中，該配位體為膜錨定蛋白。
如上文所述之功能性分子可為任何蛋白質或肽。在一些態樣中，該等蛋白質參與配位體-受體相互作用。例如，T細胞活化之重要事件係T細胞與APC之間的膜-膜接觸之結果，其中在兩個相對的膜之間發生各種配位體-受體相互作用，包括MHC-肽及TCR、LFA-1及ICAM-1、CD2及CD48以及B7或CTLA-4及CD28。
將預定量之生物素化磷脂併入脂質體調配物中使得能夠經由卵白素-生物素相互作用實現生物素化表面指示物之精確表面附著，從而模擬天然APC對T細胞進行之細胞表面指示物呈遞。
在一些態樣中，藉由支架中所使用之親和配對(例如，生物素化)脂質的百分率來確定表面指示物或表面指示物之組合的密度。在一些態樣中，生物素化脂質之百分率在約0.01%至約1.1%之間。在一些態樣中，生物素化脂質之百分率在約0.1%至約0.9%之間。在一些態樣中，生物素化脂質之百分率在約0.1%至約2.5%之間。在一些態樣中，生物素化脂質之百分率為約0.01%。在一些態樣中，生物素化脂質之百分率為約0.05%。在一些態樣中，生物素化脂質之百分率為約0.1%。在一些態樣中，生物素化脂質之百分率為約0.2%。在一些態樣中，生物素化脂質之百分率為約0.25%。在一些態樣中，生物素化脂質之百分率為約0.3%。在一些態樣中，生物素化脂質之百分率為約0.4%。在一些態樣中，生物素化脂質之百分率為約0.5%。在一些態樣中，生物素化脂質之百分率為約0.6%。在一些態樣中，生物素化脂質之百分率為約0.7%。在一些態樣中，生物素化脂質之百分率為約0.8%。在一些態樣中，生物素化脂質之百分率為約0.9%。在一些態樣中，生物素化脂質之百分率為約1.0%。在一些態樣中，生物素化脂質之百分率為約1.1%。在一些態樣中，生物素化脂質之百分率為約1.5%。在一些態樣中，生物素化脂質之百分率為約2.0%。在一些態樣中，生物素化脂質之百分率為約2.5%。
在一些態樣中，表面指示物或表面指示物之組合的密度由在支架裝載期間添加之每個親和配對表面指示物之質量決定，其限制條件在於在支架中存在過量親和配對脂質，例如當使用金屬螯合脂質及his標記之表面指示物時。
在一些態樣中，MSR與表面指示物之乾重比(化學計量)為約1:1至約100:1。在一些態樣中，MSR與表面指示物之乾重比(化學計量)為約10:1至約50:1。在一些態樣中，MSR與表面指示物之乾重比(化學計量)為約20:1至約50:1。在一些態樣中，該等支架之MSR與表面指示物之乾重比為約10,000:1至約1:1。在一些態樣中，該等支架之MSR與表面指示物之乾重比為約5,000:1至約1:1、約1,000:1至約1:1、約500:1至約1:1或約100:1至約1:1。在一些態樣中，該等支架之MSR與表面指示物之乾重比為約10,000:1、約5,000:1、約2,500:1、約1,000:1、約750:1、約500:1、約250:1、約100:1、約75:1、約50:1、約40:1、約30:1、約25:1、約20:1、約10:1或約1:1。 II.B.6. 可溶性指示物
在一些態樣中，該等支架包含複數種可溶性指示物。如本文所用，「可溶性指示物」係指與支架結構接觸之細胞信號傳導分子。在一些態樣中，該等可溶性指示物與支架結構之包含MSR之層接觸或偶合。在一些態樣中，本揭示案之支架含有複數種可溶性指示物，該複數種可溶性指示物選自由IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、Wnt蛋白及轉化生長因子β (TGF- β)或其促效劑、其模擬物、其變異體、其功能片段或其組合組成之群。
代表性可溶性指示物包括但不限於人類及/或其小鼠同系物之以下NCBI寄存編號：IL-1，NP_000566.3 (人類)；IL-1α，NP_034684.2 (小鼠)；IL-1，NP_000567.1 (人類)；IL-1β，NP_032387.1 (小鼠)；IL-2，NP_000577.2 (人類)及NP_032392.1 (小鼠)；IL-4，NP_000580.1、NP_758858.1 (人類)及NP_067258.1 (小鼠)；IL-5，NP_000870.1 (人類)及NP_034688.1 (小鼠)；IL-7，NP_000871.1、NP_001186815.1、NP_001186816.1、NP_001186817.1 (人類)及NP_032397.1 (小鼠)；IL-10，NP_000563 (人類)及NP_034678.1 (小鼠)；IL-12A，NP_000873.2 (人類)及NP_001152896.1、NP_032377.1 (小鼠)；IL-12B，NP_002178.2 (人類)及NP_001290173.1 (小鼠)；IL-15，NP_000576.1、NP_751915.1 (人類)及NP_001241676.1、NP_032383.1 (小鼠)；IL-17(a)，NP_002181.1、NP_034682.1 (人類)；NP_002181.1；NP_034682.1 (小鼠)；TGF-β 1，NP_000651.3 (人類)及NP_035707.1 (小鼠)；TGF-β 2，NP_001129071.1、NP_003229.1 (人類)及NP_033393.2 (小鼠)；及TGF-β，NP_003230.1 (人類)。上述可溶性指示物之片段及變異體的非限制性實例在例如資料庫UNIPROT中呈遞。
在一些態樣中，可溶性指示物包含介白素-2 (IL-2)或其促效劑、其模擬物、其變異體、其功能片段或其與上文所列出之一或多種額外可溶性指示物之組合。IL-2促效劑、其模擬物、其變異體及其功能片段之非限制性實例包括美國專利第5,496,924號；美國專利第6,955,807號；Margolin等人， Clin Cancer Res.1;13(11):33 12-9 (2007)；Eckenberg等人， J Immunol165:4312-4318 (2000)；Levin等人， Nature484, 529-533, (2012)；及Zurawski等人， EMBO Journal,9(12): 3899-3905 (1990)中所提供之彼等，該等文獻中之每一者均以引用之方式整體併入本文中。
在一些態樣中，該等支架包含複數種可溶性指示物。在一些態樣中，該支架包括包含IL-2之第一可溶性指示物及包含IL-7、IL-21、IL-15或IL-15超促效劑之第二可溶性指示物。IL-15超促效劑(IL-15 SA)係IL-15與可溶性IL-15受體-a之組合，其具有大於單獨IL-15之生物活性。在一些態樣中，該支架包括包含IL-2之第一可溶性指示物、包含IL-7之第二可溶性指示物及包含IL-15之第三可溶性指示物。在一些態樣中，該支架包括包含IL-2之第一可溶性指示物及包含IL-7、IL-21、IL-15或IL-15超促效劑之第二及第三可溶性指示物。
在一些態樣中，總可溶性指示物輸入與MSR之質量比(μg總可溶性指示物輸入: µg MSR)為約0.001至約0.005。在一些態樣中，總可溶性指示物輸入與MSR之質量比為約0.001。在一些態樣中，總可溶性指示物輸入與MSR之質量比為約0.002。在一些態樣中，總可溶性指示物輸入與MSR之質量比為約0.003。在一些態樣中，總可溶性指示物輸入與MSR之質量比為約0.004。在一些態樣中，總可溶性指示物輸入與MSR之質量比為約0.005。在一些態樣中，其中支架包含超過一種可溶性提示物，該等指示物以等量存在。在一些態樣中，該支架包含超過一種可溶性提示物，其中該等指示物以不等量存在。 II.B.7. 支架之其他態樣
在一些態樣中，該等支架包含複數種表面指示物及可溶性指示物。典型支架可包含至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個或更多個上述功能性分子中之每一者。
在一些態樣中，該等功能性分子為重組的。在一些態樣中，該等功能性分子為哺乳動物配對物之人類化衍生物。衍生出功能性分子之例示性哺乳動物物種包括但不限於小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、雪貂、貓、犬、猴或靈長類動物。在一些態樣中，該等功能性分子為上述功能性分子之人類或人類化形式。
該等功能性分子可經修飾以增加活體內蛋白質穩定性。或者，該等功能性分子可經工程改造為或多或少具免疫原性。例如，只要已知各種功能性分子之結構，可在一或多個胺基酸殘基(例如，糖基化位點)處修飾該等序列，以產生免疫原性變異體。
可使用常規技術將任何功能性分子(例如，任何抗原、抗體、蛋白質、酶、其片段、重組或經純化之天然配位體或其衍生物或其任何組合)直接地或間接地固定至包含MSR之層及/或包含脂質之層上。在一些態樣中，該等功能性分子在胞器(例如 ，高爾基體膜或質膜)、細胞、細胞簇、組織、微生物、動物、植物或其提取物中提供，後者又固定至包含MSR之層或包含脂質之層上。在一些態樣中，藉由在所需位置(例如，包含脂質之層的外表面)處進行基因工程改造或化學反應來合成功能性分子。
上述功能性分子中之每一者(例如，表面指示物及可溶性指示物)可彼此獨立地裝載、吸附或整合至包含MSR之層或包含脂質之層中/上。因此，在一些態樣中，該等表面指示物經裝載、吸附或整合至支架中包含MSR之層中/上。在一態樣中，該等表面指示物經裝載、吸附或整合至包含脂質之層中/上。在一些態樣中，該等表面指示物經裝載、吸附或整合至包含MSR之層以及包含脂質之層中/上。在一些態樣中，表面指示物包含經裝載、吸附或整合至包含MSR之層中/上之共刺激分子。在一些態樣中，該共刺激分子經裝載、吸附或整合至包含脂質之層中/上。在一些態樣中，表面指示物包含共刺激分子，該共刺激分子經裝載、吸附或整合至包含MSR之層以及包含脂質之層中/上。在一些態樣中，該等可溶性指示物經裝載、吸附或整合至包含MSR之層中/上。在一些態樣中，該等可溶性指示物經裝載、吸附或整合至包含脂質之層中/上。在一些態樣中，該等可溶性指示物經裝載、吸附或整合至包含MSR之層以及包含脂質之層中/上。
通常，可藉由使用反應性基團使該等功能性分子及包含MSR之層及/或包含脂質之層連接在一起，該等反應性基團通常藉由連接過程轉化為新的有機官能基或非反應性物質。該(等)反應性官能基可位於任何上述組分中。可用於實踐本揭示案之反應性基團及反應類別通常為生物結合物化學領域中熟知之彼等。目前，可利用反應性螯合物之所青睞的反應類別係在相對溫和條件下進行之彼等反應。此等反應包括但不限於親核取代(例如 ，胺及醇與醯基鹵、活性酯之反應)、親電子取代(例如 ，烯胺反應)及對碳-碳及碳-雜原子多個鍵之加成(例如 ，Michael反應、Diels-Alder加成)。在一些態樣中，化學偶合包含例如clickchemistrytools.com中所論述之點擊化學。在一些態樣中，化學偶合包含點擊化學試劑(例如，DBCO或疊氮化物)。此等及其他可用反應論述於例如March, Advanced Organic Chemistry,第3版, John Wiley & Sons, New York, 1985；Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996；及Feeney等人， Modification of Proteins;第198卷, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982中。
在一些態樣中，該等支架包含一或多種額外分子。在一些態樣中，該一或多種額外分子為天然存在、合成產生或重組化合物。在一些態樣中，該一或多種額外分子包含肽、多肽、核酸、小分子、半抗原、碳水化合物或劑，包括其片段或其組合。
在一些態樣中，使用錨將功能性分子連接至孔壁。然而，該錨並非必要組分。在一些態樣中，中孔二氧化矽之每個孔容納至少一個功能性分子。孔大小取決於欲固定之功能性分子的大小。在一些態樣中，該功能性分子經固定於孔中。在一些態樣中，該功能性分子藉由靜電鍵結經裝載或吸附於孔之內表面上。在一些態樣中，該功能性分子藉由非共價鍵經裝載或吸附於孔之內表面上。
在一些態樣中，該錨減少功能性分子之大結構變化以穩定地固持該分子。在一些態樣中，該錨包含與中孔材料實質上相同之組分。在一些態樣中，該錨包含一或多個官能基以允許結合於所需功能性分子：羥基、醯胺基、胺基、吡啶基、脲基、胺基甲酸酯基、羧基、酚基、偶氮基、羥基、馬來醯亞胺基、矽烷衍生物、胺基伸烷基或其組合。
在一些態樣中，支架包含抗原。在一些態樣中，該抗原包含多肽。在一些態樣中，該抗原係經純化。在一些態樣中，該抗原為自體抗原。在一些態樣中，該抗原為非自體抗原。自體抗原與包括但不限於自體免疫病症及癌症之人類疾病或病症特別相關。非自體抗原與包括但不限於病毒、細菌、原生動物、寄生蟲或真菌之病原體特別相關。在一些態樣中，將抗原裝載至例如HLA-A、HLA-B、HLA-C、DP、DQ及DR之MHC分子上，接著將該等MHC分子併入支架中/上。
在一些態樣中，抗原經調配成經由直接結合或間接結合與免疫細胞相互作用。直接結合之類型包括例如抗原與同源受體(例如 ，T細胞受體)之銜接或偶合。間接結合可經由一或多種第二劑或細胞類型之中介而發生。例如，抗原可首先結合於B細胞或抗原呈遞細胞(APC)，得到處理 (例如 ，降解)且呈遞於細胞表面主要組織相容性複合物(MHC)上，標靶細胞群體(例如 ，T細胞)與之結合。或者，抗原可募集分泌各種細胞介素、生長因子、趨化介素等之其他中間細胞，該等中間細胞又吸引標靶免疫細胞群體。在一些態樣中，抗原為CD19、CD22或其片段。
在一些態樣中，該支架包含膜相關蛋白，其直接地或間接地錨定至包含脂質之層。在一些態樣中，該膜相關蛋白包含選擇性或非選擇性膜轉運蛋白、離子通道、成孔蛋白、膜駐留受體或其任何組合。
在一些態樣中，該支架包含生長因子、細胞介素(例如 ，IL-2、IL-7、IL-15及/或IL-21)、趨化介素、介白素、黏附信號傳導分子、整合素信號傳導分子、其片段或其任何組合。在一些態樣中，此等分子可用作可溶性指示物及/或表面指示物，且可裝載至包含MSR之層或包含脂質之層。
在一些態樣中，該支架包含黏附分子。在一些態樣中，該等黏附分子進一步用作信號傳導劑。黏附信號傳導分子之代表性實例包括但不限於纖維連接蛋白、層連結蛋白、膠原蛋白、血小板反應蛋白1、玻連蛋白、彈性蛋白、肌腱蛋白、聚集蛋白聚醣、集聚蛋白、骨唾液蛋白、軟骨基質蛋白、纖維蛋白原、纖維蛋白、纖蛋白、黏蛋白、巢蛋白、骨橋蛋白、纖維蛋白溶酶原、限制蛋白、絲甘蛋白、SPARC/骨連接蛋白、多功能蛋白聚醣、馮威里氏因子(von Willebrand Factor)、多醣硫酸肝素、連接蛋白、膠原蛋白、RGD (Arg-Gly-Asp)及YIGSR (Tyr-Ile-Gly- Ser-Arg)肽及環狀肽、醣胺聚醣(GAG)、透明質酸(HA)、6-硫酸軟骨素、整合素配位體、選擇素、鈣黏蛋白及免疫球蛋白超家族成員。
在一些態樣中，該等功能性分子與膜相關蛋白結合，該等膜相關蛋白與包含脂質之層締合及/或插入其中，例如短桿菌素；α-螺旋束，例如菌視紫蛋白或K+通道；β桶，例如α-溶血素、殺白血球素或大腸桿菌孔蛋白；或其組合。
在一些態樣中，該支架進一步包含一或多種募集劑。在一些態樣中，該募集劑包含選自由以下組成之群的劑：T細胞募集劑、B細胞募集劑、樹突狀細胞募集劑及巨噬細胞募集劑。此類募集劑之實例包括但不限於趨化介素、趨化介素配位體或其片段、變異體、同系物及組合。優先募集之特徵在於與其他類型之免疫細胞相比，一或多種特定類型之免疫細胞積聚至少10%、至少20%、至少30%、至少50%、至少75%、至少100%、至少2倍、至少5倍、至少8倍、至少10倍或更多增加。
根據需要，可將該等支架特定地調配為包含募集劑及黏附分子之子集，以便操縱特定免疫細胞子集，例如泛T細胞或特定T細胞亞群。在一些態樣中，使用特異性結合於標靶細胞中表現之細胞表面標記物之劑來調配/製造該等支架。例如，在T細胞之背景下，該等支架可經調適以優先募集輔助T細胞(CD4 +T細胞)、細胞毒性T細胞(CD8 +T細胞)、記憶T細胞(CD45RO +T細胞)、抑制性T細胞(Ts細胞)、調節性T細胞(Treg；進一步表徵為FOXP3+ Treg細胞及FOXP3- Treg)、天然殺手T細胞(NK細胞；差異性表現CDld+)、黏膜相關不變量(MAIT；差異性表現MR1)、γδ T細胞(γδ T細胞；包含含有一條γ鏈及一條δ鏈之TCR)。結合於細胞表面標記物之此類劑可包括例如半抗原、肽、配位體、抗體或其類似物，或其任何組合。可原位或非原位使用其他常規技術來富集具有一或多種細胞亞型之分離物。 II.B.8. 製造方法
本揭示案之支架可以多種方式產生且用於多種應用，包括但不限於根據支架調節功能性分子或額外劑之類型及豐度、用於操縱標靶效應細胞(例如T細胞)、分離特定效應細胞群體(例如CD8+ T細胞亞群)、疾病療法以及產生組合物及套組。製造及使用此類支架之方法的實例描述於PCT公開案第WO 2018/013797 A1號及Chung等人( Nature Biotechnology36(2): 160-169 (2018))中，該等文獻之完整內容以引用之方式併入本文中。
為了分離及/或擴增所需細胞群體，可改變細胞濃度及支架表面。在一些態樣中，減少混合之支架及細胞的體積(亦即，增加細胞濃度)，以確保細胞及支架之最大接觸。在一些態樣中，使用20億個細胞/ml之濃度。在一些態樣中，使用1億個細胞/ml之濃度。在另一態樣中，使用超過1億個細胞/ml。在另一態樣中，使用1000萬、1500萬、2000萬、2500萬、3000萬、3500萬、4000萬、4500萬或5000萬細胞/ml之細胞濃度。在另一態樣中，使用7500萬、8000萬、8500萬、9000萬、9500萬或1億細胞/ml之細胞濃度。在其他態樣中，使用1.25億或1.5億個細胞/ml之濃度。使用高濃度可導致增加之細胞產量、細胞活化及細胞擴增。此外，使用高細胞濃度可允許更有效地捕捉可微弱地表現所關注之標靶抗原的細胞，諸如CD28-陰性T細胞，或自存在許多腫瘤細胞之樣品(亦即，白血病血液、腫瘤組織等)捕捉。此類細胞群體可具有治療價值且將為期望獲得的。例如，使用高濃度之細胞允許更有效地選擇通常具有較弱CD28表現之CD8+ T細胞。
在其他態樣中，期望使用較低濃度之細胞。這可藉由降低支架:細胞比率來實現，使得支架與細胞之間的相互作用降至最低。此方法選擇表現大量所需抗原之細胞與支架結合。例如，CD4+ T細胞表現較高水準之CD28，且在稀釋濃度下比CD8+ T細胞更有效地經捕捉。在一些態樣中，所使用之細胞濃度為5×10 6/ml。在其他態樣中，所用濃度可為約1×10 4/ml至1×10 9/ml，及其間任何整數值，例如1×10 5/ml至1×10 8/ml、1×10 6/ml至1×10 7/ml、1×10 7/ml至1×10 9/ml。 II.C. 細胞
本揭示案之一些態樣係關於培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)之方法，該等方法包括使免疫細胞與可編程細胞信號傳導支架(PCS)在如本文所揭示包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸。置於該培養基中之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)可為自需要療法之個體收集及/或分離的細胞。在一些態樣中，置於該培養基中之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)在培養之前已經工程改造。在一些態樣中，置於該培養基中之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)已進行擴增。置於該培養基中之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)可稱作起始(初始，亦即患者樣品、血球分離樣品、膚色血球層)細胞。藉由在本文所揭示之代謝再編程培養基中培養免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)所產生之免疫細胞可稱作所得(經培養或經擴增)細胞。
本文所揭示之方法提供促進經培養之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)的低分化表型之培養條件。在一些態樣中，自人類個體分離起始免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，自人類個體分離起始免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)以用於同種異體細胞療法。在一些態樣中，自人類個體分離起始免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)以用於自體細胞療法。在一些態樣中，該等免疫細胞為T細胞。在一些態樣中，該等免疫細胞為NK細胞。在一些態樣中，該等免疫細胞為TIL。在一些態樣中，該等免疫細胞為Treg。在一些態樣中，自人類個體分離免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，該等免疫細胞為腫瘤浸潤T細胞或腫瘤浸潤NK細胞。在某些態樣中，該等免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)係經工程改造。在一些態樣中，該等免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)係經工程改造以包含嵌合抗原受體(CAR)。在一些態樣中，該等免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)係經工程改造以包含經工程改造之T細胞受體(TCR)。
在一些態樣中，該等細胞(例如，T細胞、NK細胞及/或TIL)係在根據本文所揭示之方法培養之前經工程改造。在一些態樣中，該等細胞(例如，T細胞、NK細胞及/或TIL)係在根據本文所揭示之方法培養之後經工程改造。在一些態樣中，該等細胞(例如，T細胞、NK細胞及/或TIL)係在細胞工程改造之前、期間及之後根據本文所揭示之方法，例如在包含至少5 mM鉀離子之低張或等張培養基中進行培養。在一些態樣中，該等細胞(例如，T細胞、NK細胞及/或TIL)係經工程改造以表現嵌合抗原受體(CAR)。在一些態樣中，該等細胞(例如，T細胞、NK細胞及/或TIL)係經工程改造以表現經工程改造之T細胞受體(TCR)。在某些態樣中，在本文所揭示之條件下，例如在包含至少約5 mM鉀離子之低張或等張培養基中培養該等細胞(例如，T細胞、NK細胞及/或TIL)導致更高轉導效率。在一些態樣中，如與在包含4 mM或更少鉀離子之培養基中培養的細胞(例如，T細胞、NK細胞及/或TIL)相比，根據本文所揭示之方法在包含至少約60 mM鉀離子之低張或等張培養基中培養的細胞(例如，T細胞、NK細胞及/或TIL)中之轉導效率為至少約2倍高。在一些態樣中，如與在包含4 mM或更少鉀離子之培養基中培養的細胞(例如，T細胞、NK細胞及/或TIL)相比，根據本文所揭示之方法在包含至少約65 mM鉀離子之低張或等張培養基中培養的細胞(例如，T細胞、NK細胞及/或TIL)中之轉導效率為至少約2.5倍高。
在一些態樣中，該細胞包含表現抗原受體及/或另一額外多肽之構築體。在一些態樣中，該抗原受體包含抗體、經工程改造之抗體(諸如scFv)、CAR、經工程改造之TCR、TCR模擬物(例如，抗體-T細胞受體(abTCR)或嵌合抗體-T細胞受體(caTCR))或嵌合信號傳導受體(CSR)。舉例而言，TCR可包含經工程改造之TCR，其中TCR之抗原結合結構域(例如，α/β TCR或γ/δ TCR)已由抗體之彼結構域(具有或不具有該抗體之恆定結構域)置換；該經工程改造之TCR接著變得對該抗體的抗原具特異性，同時保持TCR之信號傳導功能。嵌合信號傳導受體可包含(1)細胞外結合結構域(例如，天然/經修飾之受體細胞外結構域、天然/經修飾之配位體細胞外結構域、scFv、奈米抗體、Fab、DARPin及親和體)，(2)跨膜結構域，及(3)細胞內信號傳導結構域(例如，活化轉錄因子，或募集及/或活化JAK/STAT、激酶、磷酸酶及泛素之結構域；SH3；SH2；及PDZ)。參見例如EP340793B1、WO 2017/070608、WO 2018/200582、WO 2018/200583、WO 2018/200585及Xu等人，Cell Discovery (2018) 4:62。
在一些態樣中，該表現抗原受體及/或另一額外多肽之構築體包含調節元件，且其中載體包含該外源聚核苷酸。在一些態樣中，該載體為多順反子表現載體。在一些態樣中，該調節元件包含啟動子。在一些態樣中，該啟動子包含dl587rev引子結合位點取代(MND)啟動子、EF1a啟動子、泛素啟動子或其組合。在一些態樣中，該載體包含病毒載體、哺乳動物載體或細菌載體。在一些態樣中，該載體包含腺病毒載體、慢病毒、仙台病毒載體(Sendai virus vector)、桿狀病毒載體、Epstein Barr病毒載體、乳多泡病毒載體、牛痘病毒載體、單純疱疹病毒載體、雜合病毒載體或腺相關病毒(AAV)載體。在一些態樣中，該載體為慢病毒。
在一些態樣中，該抗原受體靶向所關注之抗原(例如，腫瘤抗原或病原體之抗原)。該等抗原可包括但不限於AFP (α-胎兒蛋白)、αvβ6或另一整合素、BCMA、B7-H3、B7-H6、Braf、CA9 (碳酸酐酶9)、CCL-1 (C-C模體趨化介素配位體1)、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD45、CD47、CD56、CD66e、CD70、CD74、CD79a、CD79b、CD98、CD123、CD138、CD171、CD352、CEA (癌胚抗原)、Claudin 18.2、Claudin 6、c-MET、DLL3 (δ樣蛋白3)、DLL4、ENPP3 (外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員3)、EpCAM、EPG-2 (上皮醣蛋白2)、EPG-40、ephrinB2、EPHa2 (腎上腺素受體A2)、ERBB二聚體、雌激素受體、ETBR (內皮素B受體)、FAP-α (纖維母細胞活化蛋白α)、胎兒AchR (胎兒乙醯膽鹼受體)、FBP (葉酸結合蛋白)、FCRL5、FR-α (葉酸受體α)、GCC (鳥苷酸環化酶C)、GD2、GD3、GPC2 (磷脂醯肌醇蛋白聚糖-2)、GPC3、gp100 (醣蛋白100)、GPNMB (醣蛋白NMB)、GPRC5D (G蛋白偶合受體5D)、HER2、HER3、HER4、B型肝炎表面抗原、HLA-A1 (人類白血球抗原Al)、HLA-A2 (人類白血球抗原A2)、HMW-MAA (人類高分子量黑色素瘤相關抗原)、IGF1R (胰島素樣生長因子1受體)、Ig κ、Ig λ、IL-22Ra (IL-22受體α)、IL-13Ra2 (IL-13受體α 2)、KDR (激酶插入結構域受體)、LI細胞黏附分子(LI -CAM)、Liv-1、LRRC8A (含富含白胺酸重複序列之8家族成員A)、Lewis Y、黑色素瘤相關抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MART-1 (黑色素A)、鼠科動物巨細胞病毒(MCMV)、MCSP (黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚醣)、間皮素、黏蛋白1 (MUC1)、MUC16、MHC/肽複合物(例如，與源自AFP、KRAS、NY-ESO、MAGE-A及WT1之肽複合的HLA-A)、NCAM (神經細胞黏附分子)、Nectin-4、NKG2D (天然殺手2族成員D)配位體、NY-ESO、致癌胎兒抗原、PD-1、PD-L1、PRAME (優先表現之黑色素瘤抗原)、助孕酮受體、PSA (前列腺特異性抗原)、PSCA (前列腺幹細胞抗原)、PSMA (前列腺特異性膜抗原)、ROR1、ROR2、SIRPα (信號調節蛋白α)、SLIT、SLITRK6 (NTRK樣蛋白6)、STEAP1 (前列腺六跨膜上皮抗原1)、存活素、TAG72 (腫瘤相關醣蛋白72)、TPBG (滋養層醣蛋白)、Trop-2、VEGFR1 (血管內皮生長因子受體1)、VEGFR2以及來自HIV、HBV、HCV、HPV及其他病原體之抗原。
在某些態樣中，該抗原受體靶向hTERT。在一些態樣中，該抗原受體靶向KRAS。在一些態樣中，該抗原受體靶向Braf。在一些態樣中，該抗原受體靶向TGFβRII。在一些態樣中，該抗原受體靶向MAGE A10/A4。在一些態樣中，該抗原受體靶向AFP。在一些態樣中，該抗原受體靶向PRAME。在一些態樣中，該抗原受體靶向MAGE A1。在一些態樣中，該抗原受體靶向WT-1。在一些態樣中，該抗原受體靶向NY-ESO。在一些態樣中，該抗原受體靶向PRAME。在一些態樣中，該抗原受體靶向NY-ESO。在一些態樣中，該抗原受體靶向CD19。
在一些態樣中，該抗原受體靶向BCMA。在一些態樣中，該抗原受體靶向CD147。在一些態樣中，該抗原受體靶向CD19。在一些態樣中，該抗原受體靶向CD19及CD22。在一些態樣中，該抗原受體靶向CD19及CD28。在一些態樣中，該抗原受體靶向CD20。在一些態樣中，該抗原受體靶向CD20及CD19。在一些態樣中，該抗原受體靶向CD22。在一些態樣中，該抗原受體靶向CD30。在一些態樣中，該抗原受體靶向CEA。在一些態樣中，該抗原受體靶向DLL3。在一些態樣中，該抗原受體靶向EGFRvIII。在一些態樣中，該抗原受體靶向GD2。在一些態樣中，該抗原受體靶向HER2。在一些態樣中，該抗原受體靶向IL-1RAP。在一些態樣中，該抗原受體靶向間皮素。在一些態樣中，該抗原受體靶向methothelin。在一些態樣中，該抗原受體靶向NKG2D。在一些態樣中，該抗原受體靶向PSMA。在一些態樣中，該抗原受體靶向TnMUC1。
在一些態樣中，該等細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)係在根據本文所揭示之方法培養之前經工程改造。在一些態樣中，該等細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)係在根據本文所揭示之方法培養之後經工程改造。在一些態樣中，該等細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)係在細胞工程改造之前、期間及之後根據本文所揭示之方法，例如在包含至少5 mM鉀離子之低張或等張培養基中進行培養。在一些態樣中，該等細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)係經工程改造以表現嵌合抗原受體(CAR)。在一些態樣中，該等細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)係經工程改造以表現經工程改造之T細胞受體(TCR)。在某些態樣中，在本文所揭示之條件下，例如在包含至少約5 mM鉀離子之低張或等張培養基中培養細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)導致更高轉導效率。在一些態樣中，如與在包含4 mM或更少鉀離子之培養基中培養的細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)相比，根據本文所揭示之方法在包含至少約60 mM鉀離子之低張或等張培養基中培養的細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)中之轉導效率為至少約2倍高。在一些態樣中，如與在包含4 mM或更少鉀離子之培養基中培養的細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)相比，根據本文所揭示之方法在包含至少約65 mM鉀離子之低張或等張培養基中培養的細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)中之轉導效率為至少約2.5倍高。
原代免疫細胞(包括原代T細胞)可獲自多種組織來源，包括外周血單核細胞(PBMC)、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、胸膜積水、脾組織及/或腫瘤組織。可藉由熟知技術，例如FICOLL™分離及白血球分離術自其他血球分離白血球，包括PBMC。白血球分離術產物通常含有淋巴細胞(包括T及B細胞)、單核細胞、顆粒球及其他有核白血球。進一步自其他白血球分離T細胞，例如藉由經由PERCOLL™梯度離心或藉由逆流離心淘析。可進一步藉由陽性或陰性選擇技術(例如，使用基於螢光或基於磁性之細胞分選)來分離T細胞之特定亞群，諸如CD3 +、CD25 +、CD28 +、CD4 +、CD8 +、CD45RA +、GITR +及CD45RO +T細胞。例如，可藉由用多種市售抗體結合之珠粒中的任一種，諸如Dynabeads®、CELLection TM、DETACHaBEAD TM(Thermo Fisher)或MACS®細胞分離產物(Miltenyi Biotec)培育，持續足以對所需T細胞進行陽性選擇或足以進行陰性選擇以移除不想要的細胞之一段時期來分離T細胞。
在一些情況下，在癌症治療之後直接自癌症患者獲得自體T細胞。據觀察，在某些癌症治療、尤其損害免疫系統之彼等治療之後，治療之後不久所收集的T細胞之品質可具有改良能力以進行離體擴增及/或在離體經工程改造之後進行植入。 II.C.1. 嵌合抗原受體 (CAR)
在一些態樣中，該細胞(例如人類免疫細胞，例如T細胞及/或NK細胞)包含CAR。在一些態樣中，可製備成表現CAR之細胞(例如CAR T細胞)為例如CD8+ T細胞或CD4+ T細胞。在一些態樣中，本文所揭示之表現CAR之細胞為CAR T細胞，例如單CAR T細胞、基因體編輯之CAR T細胞、雙CAR T細胞或串聯CAR T細胞。此類CAR T細胞之實例在國際申請案第PCT/US2019/044195號中提供。
在一些態樣中，CAR係經設計為標準CAR、分裂CAR、斷開CAR、接通CAR、第一代CAR、第二代CAR、第三代CAR或第四代CAR。在一些態樣中，CAR包含抗原結合結構域、跨膜結構域、共刺激結構域、細胞內信號傳導結構域或其組合。
在一些態樣中，CAR特異性結合(亦即，靶向)在腫瘤細胞(諸如惡性B細胞、惡性T細胞或惡性漿細胞)上表現之一或多種抗原。
在一些態樣中國，CAR特異性結合於(亦即，靶向)選自由以下組成之群的抗原：AFP (α-胎兒蛋白)、αvβ6或另一整合素、BCMA、Braf、B7-H3、B7-H6、CA9 (碳酸酐酶9)、CCL-1 (C-C模體趨化介素配位體1)、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD45、CD47、CD56、CD66e、CD70、CD74、CD79a、CD79b、CD98、CD123、CD138、CD171、CD352、CEA (癌胚抗原)、Claudin 18.2、Claudin 6、c-MET、DLL3 (δ樣蛋白3)、DLL4、ENPP3 (外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員3)、EpCAM、EPG-2 (上皮醣蛋白2)、EPG-40、ephrinB2、EPHa2 (腎上腺素受體A2)、ERBB二聚體、雌激素受體、ETBR (內皮素B受體)、FAP-α (纖維母細胞活化蛋白α)、胎兒AchR (胎兒乙醯膽鹼受體)、FBP (葉酸結合蛋白)、FCRL5、FR-α (葉酸受體α)、GCC (鳥苷酸環化酶C)、GD2、GD3、GPC2 (磷脂醯肌醇蛋白聚糖-2)、GPC3、gp100 (醣蛋白100)、GPNMB (醣蛋白NMB)、GPRC5D (G蛋白偶合受體5D)、HER2、HER3、HER4、B型肝炎表面抗原、HLA-A1 (人類白血球抗原Al)、HLA-A2 (人類白血球抗原A2)、HMW-MAA (人類高分子量黑色素瘤相關抗原)、IGF1R (胰島素樣生長因子1受體)、Ig κ、Ig λ、IL-22Ra (IL-22受體α)、IL-13Ra2 (IL-13受體α 2)、KDR (激酶插入結構域受體)、LI細胞黏附分子(LI -CAM)、Liv-1、LRRC8A (含富含白胺酸重複序列之8家族成員A)、Lewis Y、黑色素瘤相關抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MART-1 (melan A)、鼠科動物巨細胞病毒(MCMV)、MCSP (黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚醣)、間皮素、黏蛋白1 (MUC1)、MUC16、MHC/肽複合物(例如，與源自AFP、KRAS、NY-ESO、MAGE-A及WT1之肽複合的HLA-A)、NCAM (神經細胞黏附分子)、Nectin-4、NKG2D (天然殺手2族成員D)配位體、NY-ESO、致癌胎兒抗原、PD-1、PD-L1、PRAME (優先表現之黑色素瘤抗原)、助孕酮受體、PSA (前列腺特異性抗原)、PSCA (前列腺幹細胞抗原)、PSMA (前列腺特異性膜抗原)、ROR1、ROR2、SIRPα (信號調節蛋白α)、SLIT、SLITRK6 (NTRK樣蛋白6)、STEAP1 (前列腺六跨膜上皮抗原1)、存活素、TAG72 (腫瘤相關醣蛋白72)、TPBG (滋養層醣蛋白)、Trop-2、VEGFR1 (血管內皮生長因子受體1)、VEGFR2以及來自HIV、HBV、HCV、HPV及其他病原體之抗原及其任何組合。
在一些態樣中，CAR特異性結合ROR1。可在本文所述之免疫細胞中表現之例示性抗ROR1 CAR描述於Hudecek等人，Clin. Cancer Res. 19.12(2013):3153-64中，該文獻以引用之方式整體併入本文中。在一些態樣中，經修飾為包含抗ROR1 CAR之免疫細胞係如Hudecek等人(例如，如Hudecek等人，第3155頁，第一完整段落中所述，以引用之方式整體併入本文中)中所述而產生。在一些態樣中，Hudecek中所揭示之間隔子已由不同間隔子(例如本文所述之彼等)置換。在一些態樣中，可用於本揭示案之抗ROR1 CAR包含抗體或其片段，該抗體或其片段包含以下文獻中所述之2A2、R11及R12抗ROR1單株抗體之VH及/或VL序列：Hudecek等人，段落橋接頁3154-55；Baskar等人，MAbs 4(2012):349-61；及Yang等人，PLoS ONE 6(2011):e21018，其中每一者均以引用之方式整體併入本文中。
在一些態樣中，CAR特異性結合GPC2。
在一些態樣中，該共刺激結構域包含以下各物之共刺激結構域：介白素-2受體(IL-2R)、介白素-12受體(IL-12R)、IL-7、IL-21、IL-23、IL-15、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD27、CD28、CD30、CD40、4-1BB/CD137、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1 (LFA-1)、LIGHT、NKG2C、OX40、DAP10或其任何組合。在一些態樣中，該共刺激結構域包含4-1BB/CD137共刺激結構域。
在一些態樣中，該跨膜結構域包含以下各物之跨膜結構域：KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1 (CD11a、CD18)、ICOS (CD278)、4-1BB (CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C、CD19或其任何組合。在一些態樣中，該跨膜結構域包含CD28跨膜結構域。
在一些態樣中，該細胞內信號傳導結構域包含源自以下各物之細胞內信號傳導結構域：CD3 ζ、FcR γ、普通FcR γ (FCER1G)、Fc γ RIIa、FcR β (Fc ε Rib)、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD22、CD79a、CD79b、CD278 (「ICOS」)、FcεRI、CD66d、CD32、DAP10、DAP12或其任何組合。在一些態樣中，該細胞內信號傳導結構域包含CD3 ζ細胞內信號傳導結構域。 II.C.2. T 細胞受體工程改造 (TCR) 之細胞
在一些態樣中，本文所揭示之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)包含T細胞受體(TCR)，例如經工程改造之TCR。在一些態樣中，TCR特異性結合於腫瘤抗原。如本文所用，術語「經工程改造之TCR」或「經工程改造之T細胞受體」係指T細胞受體(TCR)經工程改造，以所需親和力特異性結合於主要組織相容性複合物(MHC)/肽標靶抗原，經選擇、選殖及/或隨後引入至免疫細胞(例如，T細胞、NK細胞及/或TIL)群體中。在一些態樣中，TCR特異性結合自癌症患者中鑑別之新抗原。
在一些態樣中，TCR特異性結合(亦即，靶向)在腫瘤細胞(諸如惡性B細胞、惡性T細胞或惡性漿細胞)上表現之一或多種抗原。在一些態樣中，TCR特異性結合腫瘤抗原/MHC複合物。在一些態樣中，該腫瘤抗原源自AFP、CD19、BCMA、CLL-1、CS1、CD38、CD19、TSHR、CD123、CD22、CD30、CD171、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、Tn Ag、PSMA、ROR1、ROR2、GPC1、GPC2、FLT3、FAP、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、間皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、葉酸受體α、ERBB2 (Her2/neu)、MUC1、MUC16、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受體、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪胺酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WTl、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-Al、豆莢蛋白、HPV E6,E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相關抗原1、p53、p53突變體、前列腺素、存活素、端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MARTl、Ras突變體、hTERT、肉瘤易位斷點、ML-IAP、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受體、細胞週期蛋白Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人類端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2、腸道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、APRIL蛋白之細胞外部分、新抗原或其任何組合。在一些態樣中，TCR特異性結合(亦即，靶向)源自NY-ESO-1之腫瘤抗原。
在某些態樣中，本揭示案之經工程改造細胞可表現靶向抗原之T細胞受體(TCR)。在一些態樣中，TCR工程改造之細胞可靶向主要類型：共享腫瘤相關抗原(共享TAA)及獨特腫瘤相關抗原(獨特TAA)，或腫瘤特異性抗原。前者可包括但不限於癌症-睪丸(CT)抗原、過表現抗原及分化抗原，而後者可包括但不限於新抗原及致癌病毒抗原。人類乳頭瘤病毒(HPV) E6蛋白及HPV E7蛋白屬於致癌病毒抗原之類別。
在一些態樣中，TCR工程改造之細胞可靶向CT抗原，例如黑色素瘤相關抗原(MAGE)，包括但不限於MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A8、MAGE-A9.23、MAGE-A10及MAGE-A12。在一些態樣中，TCR工程改造之細胞可靶向主要發現於黑色素瘤及正常黑色素細胞中的醣蛋白(gp100)、由T細胞識別之黑色素瘤抗原(MART-1)及/或酪胺酸酶。在一些態樣中，TCR工程改造之細胞可靶向威爾姆氏腫瘤1 (WT1)，亦即一種在大多數急性骨髓白血病(AML)、急性淋巴性白血病、幾乎每一種類型的實體腫瘤及數種關鍵組織(諸如心臟組織)中高度表現之過表現抗原。在一些態樣中，TCR工程改造之細胞可靶向間皮素，即在間皮瘤中高度表現但亦存在於包括氣管在內的數種組織之間皮細胞上的另一種過表現抗原。
在一些態樣中，TCR工程改造之細胞可靶向任何新抗原，該等新抗原可由對個別腫瘤具特異性之隨機體細胞突變形成。在一些態樣中，TCR特異性結合於(亦即，靶向)選自由以下組成之群的癌症抗原：AFP、Braf、CD19、TRAC、TCRβ、BCMA、CLL-1、CS1、CD38、CD19、TSHR、CD123、CD22、CD30、CD171、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、Tn Ag、PSMA、ROR1、ROR2、GPC1、GPC2、FLT3、FAP、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、間皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、葉酸受體α、ERBB2 (Her2/neu)、MUC1、MUC16、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受體、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪胺酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WTl、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-Al、豆莢蛋白、HPV E6,E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相關抗原1、p53、p53突變體、前列腺素、存活素、端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MARTl、Ras突變體、hTERT、肉瘤易位斷點、ML-IAP、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受體、細胞週期蛋白Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人類端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2、腸道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、APRIL蛋白之細胞外部分或其任何組合。
在某些態樣中，TCR特異性結合(亦即，靶向) hTERT。在一些態樣中，TCR特異性結合(亦即，靶向) KRAS。在一些態樣中，TCR特異性結合(亦即，靶向) Braf。在一些態樣中，TCR特異性結合(亦即，靶向) TGFβRII。在一些態樣中，TCR特異性結合(亦即，靶向) MAGE A10/A4。在一些態樣中，TCR特異性結合(亦即，靶向) AFP。在一些態樣中，TCR特異性結合(亦即，靶向) PRAME。在一些態樣中，TCR特異性結合(亦即，靶向) MAGE A1。在一些態樣中，TCR特異性結合(亦即，靶向) WT-1。在一些態樣中，TCR特異性結合(亦即，靶向) NY-ESO。在一些態樣中，TCR特異性結合(亦即，靶向) PRAME。在一些態樣中，TCR特異性結合(亦即，靶向) NY-ESO。在一些態樣中，TCR特異性結合(亦即，靶向) CD19。在某些態樣中，TCR特異性結合自癌症患者中鑑別之新抗原。
在一些態樣中，TCR包含細胞內γ/δ結構域。在一些態樣中，TCR為抗體-T細胞受體(AbTCR) (參見例如Xu等人， Cell Discovery 4:62 (2018)，其以引用之方式整體併入本文中)。 II.C.3. T 細胞受體模擬物 (TCRm)
在一些態樣中，本文所揭示之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)包含T細胞受體模擬物(TCRm)，亦稱作TCR樣抗體。TCRm係識別包含肽及MHC-I分子兩者之抗原決定基的抗體類型，類似於T細胞上之TCR對此類複合物之識別(參見例如Traneska等人， Front. Immunol. 8(1001):1-12 (2017)，其以引用之方式整體併入本文中)。在一些態樣中，TCRm特異性結合於腫瘤抗原。在某些態樣中，TCRm特異性結合自癌症患者中鑑別之新抗原。
在一些態樣中，TCRm特異性結合(亦即，靶向)在腫瘤細胞(諸如惡性B細胞、惡性T細胞或惡性漿細胞)上表現之一或多種抗原。在一些態樣中，TCRm為單株抗體。在一些態樣中，TCRm特異性結合於WT1。在一些態樣中，TCRm特異性結合於WT1之片段。在一些態樣中，TCRm包含ESK1 (參見例如Ataie等人， J. Mol. Biol. 428(1):194-205 (2016)，其以引用之方式整體併入本文中)。在一些態樣中，TCRm特異性結合於MAGE-A1。在一些態樣中，TCRm特異性結合於p68 RNA解螺旋酶/HLA-A*02:01。在一些態樣中，TCRm特異性結合於hCG-b/HLAA*02:01。在一些態樣中，TCRm特異性結合於Her2-E75/HLA-A*02:01。在一些態樣中，TCRm在HLA-A*02:01之背景下特異性結合於PR-1 (參見例如 Oncoimmunology 5(1):e1049803 (2015年6月)，其以引用之方式整體併入本文中)。在一些態樣中，TCRm特異性結合於存活素-2B源性九聚體肽AYACNTSTL (SV2B80-88)，該肽在HLA-A*24上呈遞(SV2B80-88/HLA-A*24) (參見例如Kurosawa等人， Nature Scientific Reports 9(9827):1-11 (2019)，其以引用之方式整體併入本文中)。在一些態樣中，TCRm特異性結合一或多種腫瘤相關PRAME肽/HLA-I抗原(參見例如 J Clin Invest. 127(7):2705-18 (2017)，其以引用之方式整體併入本文中)。在一些態樣中，TCRm特異性結合於酪胺酸酶。在一些態樣中，TCRm特異性結合端粒酶催化次單元。在一些態樣中，TCRm特異性結合於醣蛋白100 (gp100)。在一些態樣中，TCRm特異性結合於黏蛋白1 (MUC1)。在一些態樣中，TCRm特異性結合於人類端粒酶逆轉錄酶(hTERT)。在一些態樣中，TCRm特異性結合於NYESO-1。在一些態樣中，TCRm特異性結合於MART-1。在一些態樣中，TCRm特異性結合於PRAME。
在一些態樣中，TCRm特異性結合於病毒抗原。在一些態樣中，TCRm特異性結合於Env183/A2 (Hep B/HLA-A*02:01)。在一些態樣中，TCRm特異性結合於KP14/1及KP15/11 (HIV包膜gp160/HLAA*02:01)。在一些態樣中，TCRm特異性結合於RL36A (西尼羅河病毒(West Nile Virus)/小鼠H-2Db)。在一些態樣中，TCRm特異性結合於源自HTLV之病毒抗原決定基。在一些態樣中，TCRm特異性結合於源自流行性感冒之病毒抗原決定基。在一些態樣中，TCRm特異性結合於源自CMV之病毒抗原決定基。在一些態樣中，TCRm特異性結合於源自HIV之病毒抗原決定基。 II.C.4. c-Jun 多肽
在一些態樣中，本文所述之免疫細胞(例如，使用本文所提供之方法進行培養)包含或能夠過表現c-Jun多肽。在一些情況下，內源c-Jun蛋白之表現經誘導，由此導致c-Jun多肽之增加或過表現。在一些態樣中，本文所揭示之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)係經轉錄活化子(例如，基於CRISPR/Cas系統)工程改造或修飾，其中該轉錄活化子能夠誘導及/或增加c-Jun多肽之內源性表現。在一些態樣中，c-Jun多肽係外源添加至細胞中(野生型人類c-Jun，可在GenBank以寄存編號AAA59197.1或在UniProtKB (以寄存編號P05412.2)獲得。在一些態樣中，c-Jun多肽在免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)中重組表現。在一些態樣中，c-Jun多肽在免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)中過表現，該免疫細胞已經工程改造以表現CAR、TCR、TCR模擬物或如本文所述之其他轉殖基因。因此，在一些態樣中，與未經修飾為過表現c-Jun多肽之相應細胞相比，本文所述之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞) (例如，使用本文所提供之方法進行培養)表現較高水準(例如，高至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100%，或高至少1.5、2、3、4、5或10倍)之c-Jun多肽。在一些態樣中，經工程改造細胞表現比參考細胞高至少約2-100倍、高約5-50倍、高約5-40倍、高約5-30倍、高約5-20倍、高約8-20倍或高約10-20倍之c-Jun多肽。在各種血基質及實體腫瘤模型中，c-Jun之過表現使CAR T細胞不易耗盡且因此增強抗腫瘤功效及持久性/擴增(Lynn等人，Nature 2019, 576:293-300)。 III. 本揭示案之組合物
本揭示案之某些態樣係關於一種細胞組合物，其包含根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)群體。如與根據習知方法(例如，在含有低於5 mM K +之培養基中)培養的可相當細胞相比，根據本文所揭示之方法及/或在本文所揭示之代謝再編程培養基中培養的細胞群體具有增加之低分化細胞數目。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的細胞展現幹細胞樣表型所特有之一或多種標記物的增加之表現。在一些態樣中，如與根據習知方法(例如，在含有低於5 mM K +之培養基中)培養的可相當細胞相比，根據本文所揭示之方法及/或在本文所揭示之代謝再編程培養基中培養的細胞群體具有增加之效應子樣細胞數目。在一些態樣中，如與根據習知方法(例如，在含有低於5 mM K +之培養基中)培養的可相當細胞相比，根據本文所揭示之方法及/或在本文所揭示之代謝再編程培養基中培養的細胞群體具有增加之幹細胞樣及效應子樣細胞數目。在一些態樣中，與根據習知方法培養之細胞相比，根據本文所揭示之方法培養的細胞展現較大增殖潛力。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的細胞展現增加之轉導效率。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的細胞在移植於個體中之後展現增加之活體內活力。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的細胞展現增加之細胞效能。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的細胞展現減少之細胞耗竭。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的細胞在移植於個體中之後展現增加之活體內持久性。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的細胞在移植於個體中之後展現增加之活體內活性。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的細胞在移植於個體中之後展現更持久之活體內反應。在一些態樣中，個體為人類。
在一些態樣中，細胞組合物中之至少約5%細胞具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，細胞組合物中之至少約10%細胞具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，細胞組合物中之至少約15%細胞具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，細胞組合物中之至少約20%細胞具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，細胞組合物中之至少約25%細胞具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，細胞組合物中之至少約30%細胞具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，細胞組合物中之至少約35%細胞具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，細胞組合物中之至少約40%細胞具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，細胞組合物中之至少約45%細胞具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，細胞組合物中之至少約50%細胞具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，細胞組合物中之至少約55%細胞具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，細胞組合物中之至少約60%細胞具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，細胞組合物中之至少約65%細胞具有幹細胞樣表型。在一些態樣中，細胞組合物中之至少約70%細胞具有幹細胞樣表型。
在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞之後，幹細胞樣T細胞構成培養物中之T細胞的總數之至少約10%至至少約70%。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞之後，幹細胞樣T細胞構成培養物中之CD8 +T細胞的總數之至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%或至少約70%。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞之後，幹細胞樣T細胞構成培養物中之CD4 +T細胞的總數之至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%或至少約70%。
在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約1.5倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約2.0倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約2.5倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約3.0倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約3.5倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約4.0倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約4.5倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約5.0倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約5.5倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約6.0倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約6.5倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約7.0倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約7.5倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約8.0倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約9.0倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約10倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約15倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約20倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約30倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約40倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約50倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約75倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約100倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約500倍。在一些態樣中，如與培養之前細胞組合物中之細胞數目相比，細胞組合物中具有幹細胞樣表型之細胞的數目增加至少約1000倍。
在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞之後，培養物中之T細胞的總數之至少約10%至至少約70%為CD39 -/TCF7 +T細胞。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞之後，培養物中之T細胞的總數之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%或至少約40%為CD39 -/TCF7 +T細胞。在一些態樣中，T細胞為CD4 +T細胞。在一些態樣中，T細胞為CD8 +T細胞。
在一些態樣中，該細胞組合物包含免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD95。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞不表現CD45R0。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD45RA。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CCR7。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD62L。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現TCF7。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD3。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD27。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD95及CD45RA。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD45RA及CCR7。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD95、CD45RA及CCR7。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD45RA、CCR7及CD62L。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD95、CD45RA、CCR7及CD62L。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD45RA、CCR7、CD62L及TCF7。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD95、CD45RA、CCR7、CD62L及TCF7。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD45RA、CCR7、CD62L、TCF7及CD27。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD95、CD45RA、CCR7、CD62L、TCF7及CD27。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD45RA、CCR7、CD62L、TCF7及CD27，且不表現CD45RO或為CD45RO 低。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD95、CD45RA、CCR7、CD62L、TCF7及CD27，且不表現CD45RO或為CD45RO 低。
在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞不表現CD39及CD69。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現CD8，且不表現CD39及CD69。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞之後，培養物中之T細胞的總數之至少約10%至至少約40%為CD39 -/CD69 -T細胞。在一些態樣中，在根據本文所揭示之方法培養T細胞之後，培養物中之T細胞的總數之至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%或至少約40%為CD39 -/CD69 -T細胞。
在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分率之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現(i)一或多種幹細胞樣標記物及(ii)一或多種效應子樣標記物。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分率之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現至少兩種幹細胞樣標記物及一或多種效應子樣標記物。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現至少三種幹細胞樣標記物及一或多種效應子樣標記物。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分率之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現至少四種幹細胞樣標記物及一或多種效應子樣標記物。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分率之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)，該等免疫細胞表現一或多種幹細胞樣標記物及至少兩種效應子樣標記物。
在一些態樣中，幹細胞樣標記物係選自CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+及其任何組合。在一些態樣中，幹細胞樣標記物包含CD45RA+、CD62L+、CCR7+及TCF7+，或其任何組合。在一些態樣中，該細胞表現CD45RO 低。在一些態樣中，幹細胞樣標記物包含本文中作為基因印記之一部分列出的一或多種基因(參見上文；參見例如Gattinoni, L.等人， Nat Med17(10): 1290-97 (2011)或Galletti等人，Nat Immunol 21, 1552-62 (2020))。
在一些態樣中，幹細胞樣標記物包含在WNT信號傳導路徑中表現之基因。在一些態樣中，幹細胞樣標記物包含選自以下之一或多種基因：GNG2、PSMC3、PSMB10、PSMC5、PSMB8、PSMB9、AKT1、MYC、CLTB、PSME1、DVL2、PFN1、H2AFJ、LEF1、CTBP1、MOV10、HIST1H2BD、FZD3、ITPR3、PARD6A、LRP5、HIST2H4A、HIST2H3C、HIST1H2AD、HIST2H2BE、HIST3H2BB、DACT1及其任何組合。在一些態樣中，幹細胞樣標記物包含選自以下之一或多種基因：MYC、AKT1、LEF1及其任何組合。
在一些態樣中，效應子樣標記物係選自pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+、STAT3+及其任何組合。在一些態樣中，效應子樣標記物包含選自由以下組成之群的STAT標靶：AKT1、AKT2、AKT3、BCL2L1、CBL、CBLB、CBLC、CCND1、CCND2、CCND3、CISH、CLCF1、CNTF、CNTFR、CREBBP、CRLF2、CSF2、CSF2RA、CSF2RB、CSF3、CSF3R、CSH1、CTF1、EP300、EPO、EPOR、GH1、GH2、GHR、GRB2、IFNA1、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA2、IFNA21、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNAR1、IFNAR2、IFNB1、IFNE、IFNG、IFNGR1、IFNGR2、IFNK、IFNL1、IFNL2、IFNL3、IFNLR1、IFNW1、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA1、IL13RA2、IL15、IL15RA、IL19、IL2、IL20、IL20RA、IL20RB、IL21、IL21R、IL22、IL22RA1、IL22RA2、IL23A、IL23R、IL24、IL26、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL3RA、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST、IL7、IL7R、IL9、IL9R、IRF9、JAK1、JAK2、JAK3、LEP、LEPR、LIF、LIFR、MPL、MYC、OSM、OSMR、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG、PIK3R1、PIK3R2、PIK3R3、PIK3R5、PIM1、PRL、PRLR、PTPN11、PTPN6、SOCS1、SOCS2、SOCS3、SOCS4、SOCS5、SOCS7、SOS1、SOS2、SPRED1、SPRED2、SPRY1、SPRY2、SPRY3、SPRY4、STAM、STAM2、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、TPO、TSLP、TYK2及其任何組合。
在一些態樣中，效應子樣標記物為效應子記憶相關基因，該等基因包含選自以下之一或多種基因：TBCD、ARL4C、KLF6、LPGAT1、LPIN2、WDFY1、PCBP4、PIK343、FAS、LLGL2、PPP2R2B、TTC39C、GGA2、LRP8、PMAIP1、MVD、IL15RA、FHOD1、EML4、PEA15、PLEKHA5、WSB2、PAM、CD68、MSC、TLR3、S1PR5、KLRB1、CYTH3、RAB27B、SCD5及其任何組合。在一些態樣中，效應子樣標記物包含選自以下之一或多種基因：KLF6、FAS、KLRB1、TLR3及其任何組合。
在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之CD45RA+、STAT5+及STAT3+免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之CD62L+、STAT5+及STAT3+免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之TCF7+、STAT5+及STAT3+免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、STAT5+及STAT3+免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+及STAT3+免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。在一些態樣中，該細胞組合物包含增加百分比之CD45RA+、CD45RO-、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+、pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+及STAT3+免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)。
在一些態樣中，免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)包含選自CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+及其任何組合之一或多種標記物以及選自pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+、STAT3+及其任何組合之一或多種標記物。在一些態樣中，該免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)表現CD45RO 低。在一些態樣中，免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)包含選自CD45RA+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD28+、BACH2+、LEF1+、TCF7+及其任何組合之一或多種標記物以及一或多種效應子樣標記物。在一些態樣中，免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)包含一或多種幹細胞樣標記物以及選自pSTAT5+、STAT5+、pSTAT3+、STAT3+及其任何組合之一或多種標記物。在一些態樣中，該免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)表現CD45RO 低。
本揭示案之一些態樣係關於一種包含免疫細胞群體之細胞組合物，其中該免疫細胞群體包含(i)表現一或多種幹細胞樣標記物之第一免疫細胞亞群(例如幹細胞樣免疫細胞)及(ii)表現一或多種效應子樣標記物之第二免疫細胞亞群(例如效應子樣免疫細胞)，其中如與使用習知方法(例如，在具有小於5 mM鉀離子之培養基中)培養的免疫細胞群體相比，該免疫細胞群體包含較高百分率(亦即，幹細胞樣免疫細胞之數目/免疫細胞之總數)的表現一或多種幹細胞樣標記物之第一免疫細胞亞群。在一些態樣中，該等免疫細胞為T細胞。在一些態樣中，該等免疫細胞為NK細胞。在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)產生此等細胞組合物。
在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)具有增加之表現(例如，更高百分率之表現GZMB、MHC-II、LAG3、TIGIT及/或NKG7之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞))，以及減少之表現(例如，更低百分率之表現IL-32之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞))。NKG7最高之細胞已顯示為較佳殺手(Malarkannan等人，2020 Nat. Immuno.)，而IL-32較高之細胞已顯示具有活化誘導之細胞死亡(Goda等人，2006 Int. Immunol)。在一些態樣中，具有較高GZMB、MHC-II、LAG3、TIGIT及/或NKG7表現之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)係表現效應子樣標記物之CD8+ T細胞。在一些態樣中，具有較低IL-32表現之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)係表現效應子樣標記物之CD8+ T細胞。
在一些態樣中，該細胞組合物包含一或多種免疫細胞(例如，T細胞、NK細胞及/或TIL)，該一或多種免疫細胞係經基因工程改造。在一些態樣中，該細胞組合物包含一或多種免疫細胞(例如，T細胞、NK細胞及/或TIL)，該一或多種免疫細胞係經工程改造以表現嵌合抗原受體(CAR)。本文(例如，上文II.G.1.部分)所揭示之任何CAR均可用於該細胞組合物之細胞中。
在一些態樣中，該細胞組合物包含一或多種免疫細胞(例如，T細胞、NK細胞及/或TIL)，該一或多種免疫細胞係經工程改造以表現T細胞受體(TCR)，例如經工程改造之TCR。本文(例如，下文II.C.2.部分)所揭示之任何TCR均可用於該細胞組合物之細胞中。
在一些態樣中，該細胞組合物包含一或多種免疫細胞(例如，T細胞、NK細胞及/或TIL)，該一或多種免疫細胞係經工程改造以表現TCRm。本文(例如，下文II.C.3.部分)所揭示之任何TCRm均可用於該細胞組合物之細胞中。
在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物(例如，用作療法之最終細胞產物的產量)包含至少約1×10 5、5×10 5、1×10 6、5×10 6、1×10 7、5×10 7、1×10 8、5×10 8、1×10 9或5×10 9個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約1×10 3、5×10 3、1×10 4、5×10 4、1×10 5、5×10 5、1×10 6、5×10 6、1×10 7、5×10 7、1×10 8、5×10 8、1×10 9或5×10 9個幹細胞樣細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約5×10 9、6×10 9、7×10 9、8×10 9、9×10 9、1×10 10、2×10 10、3×10 10、4×10 10、5×10 10、6×10 10、7×10 10、8×10 10、9×10 10、10×10 10、11×10 10、12×10 10、13×10 10、14×10 10或15×10 10個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約1×10 6個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約1×10 6個幹細胞樣細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約1×10 10個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約2×10 10個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約3×10 10個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約4×10 10個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約5×10 10個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約6×10 10個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約7×10 10個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約8×10 10個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約9×10 10個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約10×10 10個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約11×10 10個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約12×10 10個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約13×10 10個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約14×10 10個細胞。在一些態樣中，藉由本文所述之任何方法獲得的細胞組合物包含至少約15×10 10個細胞。在一些態樣中，細胞產量代表CD3+細胞之總數。
在一些態樣中，截至在目前所揭示之培養基中培養至少約第10天，本文所揭示之方法產生包含至少約1×10 10、至少約1.1×10 10、至少約1.2×10 10、至少約1.3×10 10、至少約1.4×10 10、至少約1.5×10 10、至少約1.6×10 10、至少約1.7×10 10、至少約1.8×10 10、至少約1.9×10 10或至少約2.0×10 10個細胞之組合物。在一些態樣中，截至在目前所揭示之培養基中培養至少約第10天，本文所揭示之方法產生包含至少約1.8×10 10個細胞之組合物。
在一些態樣中，該細胞組合物包含至少約1×10 10、至少約1.1×10 10、至少約1.2×10 10、至少約1.3×10 10、至少約1.4×10 10、至少約1.5×10 10、至少約1.6×10 10、至少約1.7×10 10、至少約1.8×10 10、至少約1.9×10 10或至少約2.0×10 10個幹細胞樣細胞。在一些態樣中，截至培養之至少約第10天，本文所揭示之方法產生包含至少約1×10 10、至少約1.1×10 10、至少約1.2×10 10、至少約1.3×10 10、至少約1.4×10 10、至少約1.5×10 10、至少約1.6×10 10、至少約1.7×10 10、至少約1.8×10 10、至少約1.9×10 10或至少約2.0×10 10個幹細胞樣細胞之組合物。在一些態樣中，截至在目前所揭示之培養基中培養至少約第10天，本文所揭示之方法產生包含至少約1.8×10 10個幹細胞樣細胞之組合物。
在一些態樣中，本文所揭示之方法產生包含至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%活力之免疫細胞之組合物。在一些態樣中，本文所揭示之方法產生包含至少約1.8×10 10個具有至少約94%細胞活力之幹細胞樣細胞的組合物。 IV. 治療方法
本揭示案之一些態樣係關於治療有需要之個體的方法，該等方法包括向該個體投與根據本文所揭示之方法(例如，在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中)培養之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)群體。
本揭示案亦提供刺激T細胞介導之個體對標靶細胞群體或組織之免疫反應的方法，該等方法包括投與有效量之根據本文所揭示之方法(例如，在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中)培養之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)群體。
本揭示案亦提供在有需要之個體中提供抗腫瘤免疫性之方法，該等方法包括投與根據本文所揭示之方法(例如，在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中)培養之免疫細胞(例如，T細胞及/或NK細胞)群體。
在一些態樣中，所投與之免疫細胞群體包含T細胞。在一些態樣中，該等T細胞為自體T細胞。在一些態樣中，該等T細胞為同種異體T細胞。在一些態樣中，該等T細胞包含CAR，亦即CAR-T細胞，如本文所述。在一些態樣中，該等T細胞包含異源TCR，如本文所述。在一些態樣中，該等T細胞包含經工程改造之TCR，如本文所述。在一些態樣中，該等T細胞包含TCR模擬物，如本文所述。
在一些態樣中，個體罹患癌症，例如腫瘤。在一些態樣中，與參考腫瘤體積相比，投與根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞群體(例如，藉由使免疫細胞與PCS在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸)降低個體之腫瘤體積。在一些態樣中，參考腫瘤體積係在投與經工程改造細胞之前個體之腫瘤體積。在其他態樣中，參考腫瘤體積係未接受投與之相應個體的腫瘤體積。在一些態樣中，與參考腫瘤體積相比，在投與之後，個體之腫瘤體積降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%。
在一些態樣中，治療腫瘤包括降低個體之腫瘤重量。在某些態樣中，當投與至個體時，投與根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞群體(例如，藉由使免疫細胞與PCS在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸)降低個體之腫瘤重量。在一些態樣中，與參考腫瘤重量相比，在投與之後，腫瘤重量降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%。在一些態樣中，參考腫瘤重量係在投與本揭示案之免疫細胞群體之前個體之腫瘤重量。在其他態樣中，參考腫瘤重量係未接受投與之相應個體的腫瘤重量。
在一些態樣中，向例如罹患腫瘤之個體投與根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞群體(例如，藉由使免疫細胞與PCS在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸)增加個體之腫瘤及/或腫瘤微環境(TME)中的TIL (例如CD4 +或CD8 +)數目及/或百分率。在某些態樣中，與參考(例如，未接受本揭示案之細胞組合物的個體或在投與本揭示案之細胞組合物之前同一個體中之相應值)相比，腫瘤及/或TME中的TIL數目及/或百分率增加至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約100%、至少約110%、至少約120%、至少約130%、至少約140%、至少約150%、至少約160%、至少約170%、至少約180%、至少約190%、至少約200%、至少約210%、至少220%、至少約230%、至少約240%、至少約250%、至少約260%、至少約270%、至少約280%、至少約290%或至少約300%或更多。
在一些態樣中，相對於投與包含根據習知方法製備(例如，在未包含至少50 mM濃度之鉀離子的培養基中培養)之細胞的相似細胞療法之個體之免疫反應持續時間，向例如罹患腫瘤之個體投與根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞群體(例如，藉由使免疫細胞與PCS在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸)可增加個體之免疫反應持續時間。在某些態樣中，與參考(例如，投與包含根據習知方法製備(例如，在未包含至少50 mM濃度之鉀離子的培養基中培養)之細胞的相似細胞療法之個體)相比，免疫反應持續時間增加至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約75%、至少約100%、至少約150%、至少約200%、至少約300%、至少約400%、至少約500%或至少約1000%或更多。在某些態樣中，與參考(例如，投與包含根據習知方法製備(例如，在未包含至少50 mM濃度之鉀離子的培養基中培養)之細胞的相似細胞療法之個體)相比，免疫反應持續時間增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍或至少約10倍或更多。
除上述之外，投與根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞群體(例如，藉由使免疫細胞與PCS在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸)具有有助於腫瘤治療之其他效應。
如本文所述，根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞群體(例如，藉由使免疫細胞與PCS在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸)可用於治療多種癌症類型，例如源自癌症之腫瘤，該癌症包含乳癌、頭頸部癌、子宮癌、腦癌、皮膚癌、腎癌、肺癌、結腸直腸癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、腎癌、胰臟癌、甲狀腺癌、食道癌、眼癌、胃癌、胃腸癌、卵巢癌、癌瘤、肉瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或其組合。
在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞群體(例如，藉由使免疫細胞與PCS在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸)可與其他治療劑(例如，抗癌劑及/或免疫調節劑)組合使用。因此，在某些態樣中，本文所揭示之治療腫瘤之方法包括投與本揭示案之免疫細胞群體與一或多種額外治療劑的組合。
在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞群體(例如，藉由使免疫細胞與PCS在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸)與一或多種抗癌劑組合使用，使得可靶向免疫路徑之多種元件。在一些態樣中，抗癌劑包含免疫檢查點抑制劑(亦即，阻斷通過特定免疫檢查點路徑之信號傳導)。
可用於本發明方法之免疫檢查點抑制劑的非限制性實例包含CTLA-4拮抗劑(例如，抗CTLA-4抗體)、PD-1拮抗劑(例如，抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體)、TIM-3拮抗劑(例如，抗TIM-3抗體)或其組合。在一些態樣中，檢查點抑制劑為PD-1拮抗劑。在一些態樣中，檢查點抑制劑為抗PD-1抗體。在一些態樣中，檢查點抑制劑為抗PD-L1抗體。組合治療之全面且非限制性清單詳細揭示於本申請案別處。
在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞群體(例如，藉由使免疫細胞與PCS在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸)係在投與另一治療劑之前或之後投與至個體。在其他態樣中，根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞群體係與另一治療劑並行地投與至個體。在某些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞群體及另一治療劑可作為醫藥學上可接受之載劑中的單一組合物並行地投與。在其他態樣中，本揭示案之免疫細胞群體及另一治療劑係作為單獨組合物並行地投與。
在一些態樣中，個體為非人類動物，諸如大鼠或小鼠。在一些態樣中，個體為人類。
在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞群體(例如，藉由使免疫細胞與PCS在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸)與其他治療劑(例如，抗癌劑及/或免疫調節劑)組合使用。因此，在某些態樣中，本文所揭示之治療腫瘤之方法包括向個體投與本揭示案之免疫細胞群體與一或多種額外治療劑的組合。此類劑可包括例如化學治療藥物、靶向抗癌療法、溶瘤藥物、細胞毒性劑、基於免疫之療法、細胞介素、手術程序、輻射程序、共刺激分子活化劑、免疫檢查點抑制劑、疫苗、細胞免疫療法或其任何組合。
在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞群體(例如，藉由使免疫細胞與PCS在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸)與標準照護治療(例如，手術、輻射及化學療法)組合使用。本文所述之方法亦可用作維持療法，例如意欲預防腫瘤發生或復發之療法。
在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞群體(例如，藉由使免疫細胞與PCS在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸)與一或多種抗癌劑組合使用，使得可靶向免疫路徑之多種元件。此類組合之非限制性包括：增強腫瘤抗原呈遞之療法(例如，樹突狀細胞疫苗、GM-CSF分泌細胞疫苗、CpG寡核苷酸、咪喹莫特(imiquimod))；抑制陰性免疫調節之療法，例如藉由抑制CTLA-4及/或PD-1/PD-L1/PD-L2路徑及/或耗盡或阻斷Treg或其他免疫抑制細胞(例如骨髓源性抑制細胞)；刺激陽性免疫調節之療法，例如使用刺激CD-137、OX-40及/或CD40或GITR路徑及/或刺激T細胞效應子功能之促效劑；全身性增加抗腫瘤T細胞頻率之療法；耗盡或抑制Treg (諸如腫瘤中之Treg)之療法，例如使用CD25拮抗劑(例如達利珠單抗(daclizumab))或藉由離體抗CD25珠粒清除；影響腫瘤中之抑制骨髓細胞的功能之療法；增強腫瘤細胞之免疫原性之療法(例如蒽環)；過繼性T細胞或NK細胞轉移，包括經遺傳工程改造之細胞，例如經工程改造以表現嵌合抗原受體之細胞(CAR-T療法)；抑制代謝酶(諸如吲哚胺雙加氧酶(IDO)、雙加氧酶、精胺酸酶或一氧化氮合成酶)之療法；逆轉/防止T細胞無反應性或耗竭之療法；觸發腫瘤位點處之先天性免疫活化及/或發炎之療法；投與免疫刺激細胞介素；阻斷免疫阻抑性細胞介素；或其任何組合。
在一些態樣中，抗癌劑包含免疫檢查點抑制劑(亦即，阻斷通過特定免疫檢查點路徑之信號傳導)。可用於本發明方法之免疫檢查點抑制劑的非限制性實例包含CTLA-4拮抗劑(例如，抗CTLA-4抗體)、PD-1拮抗劑(例如，抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體)、TIM-3拮抗劑(例如，抗TIM-3抗體)或其組合。此類免疫檢查點抑制劑之非限制性實例包括以下：抗PD1抗體(例如尼沃魯單抗(nivolumab，OPDIVO ®)、派姆單抗(pembrolizumab，KEYTRUDA ®；MK-3475)、匹利珠單抗(pidilizumab，CT-011)、PDR001、MEDI0680 (AMP-514)、TSR-042、REGN2810、JS001、AMP-224 (GSK-2661380)、PF-06801591、BGB-A317、BI 754091、SHR-1210及其組合)；抗PD-L1抗體(例如阿替珠單抗(atezolizumab，TECENTRIQ ®；RG7446；MPDL3280A；RO5541267)、德瓦魯單抗(durvalumab，MEDI4736、IMFINZI ®)、BMS-936559、阿維魯單抗(avelumab，BAVENCIO ®)、LY3300054、CX-072 (Proclaim-CX-072)、FAZ053、KN035、MDX-1105及其組合)；及抗CTLA-4抗體(例如伊匹單抗(ipilimumab，YERVOY ®)、曲美木單抗(tremelimumab，替西莫單抗(ticilimumab)；CP-675,206)、AGEN-1884、ATOR-1015及其組合)。
在一些態樣中，抗癌劑包含免疫檢查點活化劑(亦即，促進通過特定免疫檢查點路徑之信號傳導)。在某些態樣中，免疫檢查點活化劑包含OX40促效劑(例如抗OX40抗體)、LAG-3促效劑(例如抗LAG-3抗體)、4-1BB (CD137)促效劑(例如抗CD137抗體)、GITR促效劑(例如抗GITR抗體)、TIM3促效劑(例如抗TIM3抗體)或其組合。
在一些態樣中，根據本文所揭示之方法培養的免疫細胞群體(例如，藉由使免疫細胞與PCS在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸)係在投與另一治療劑之前或之後投與至個體。在其他態樣中，本文所揭示之免疫細胞群體係與另一治療劑並行地投與至個體。在某些態樣中，本文所揭示之免疫細胞群體及另一治療劑可作為醫藥學上可接受之載劑中的單一組合物並行地投與。在其他態樣中，本文所揭示之免疫細胞群體及另一治療劑係作為單獨組合物並行地投與。在一些態樣中，另一治療劑及本文所揭示之免疫細胞群體係依序投與。
本揭示案之某些態樣係關於治療自體免疫疾病之方法，該等方法包括投與根據任何本文所揭示之方法培養的免疫細胞群體(例如，包含Treg細胞)。本揭示案之其他態樣係關於治療發炎病理(inflammatory pathology)之方法，該等方法包括投與根據任何本文所揭示之方法培養的免疫細胞群體(例如，包含Treg細胞)。在一些態樣中，發炎病理包含細胞介素釋放症候群。在一些態樣中，發炎病理包含敗血症。在一些態樣中，發炎病理包含移植物抗宿主疾病。在一些態樣中，免疫細胞(例如，Treg細胞)係經工程改造。 實例 實例 1.
為了評估PCS產物之抗CD3/28密度對MRM產生期間抗ROR1 CAR T細胞擴增的影響，根據表1製備以下抗CD3/28密度之PCS產物。
在MRM中使用TRANSACT TM或具有不同抗CD3/28密度(0.1%-1%；表1)之PCS調配物來活化健康供體T細胞。用R12構築體轉導T細胞且在MRM中培養8天。第8天，對T細胞進行計數且確定自第0天起之總擴增( 圖 1)。與TRANSACT™活化之T細胞產物相比，所有PCS活化之T細胞產物均顯示較高擴增。當與TRANSACT™活化相比時，較低密度之PCS調配物產生2-3倍多之細胞。在MRM中產生之PCS產物內，較高抗CD3/28密度顯示以密度依賴性方式降低之T細胞擴增。 實例 2.
為了評估PCS中之抗CD3/CD28密度對MRM中之抗ROR1 CAR-T細胞產物的CD4:CD8比率之影響，使用TRANSACT™或具有不同抗CD3/28密度(0.1%-1%；表1)之PCS調配物來活化健康供體T細胞。用R12構築體轉導T細胞(參見例如Hudecek等人，Clin. Cancer Res. 19.12 (2013):3153-64)且在MRM中培養8天。第8天，對T細胞產物進行與T細胞表型及幹細胞性相關之表面標記物的染色。確定CD4陽性T細胞與CD8陽性T細胞之比率( 圖 2)。與TRANSACT TM活化之T細胞產物相比，所有PCS活化之T細胞產物均顯示較重CD4偏向。在PCS產物內，0.3% a-CD3/28 (PCS-2)顯示最高CD4偏向，其隨著a-CD3/28密度增加而減小。在較高密度(0.75%及1%)下，CD4偏向自較低密度顯著降低，且與TRANSACT TM產物更可相當。此等資料指示PCS能夠在MRM之背景下調整CD4及CD8比率。 實例 3.
為了確定PCS產物中之抗CD3/CD28密度的最佳範圍是否可富集MRM抗ROR1 CAR T細胞產物中之「幹細胞樣」T細胞，使用TRANSACT TM或具有不同抗CD3/28密度(0.1%-1%；表1)之PCS產物來活化健康供體T細胞。用R12構築體轉導T細胞且在MRM中培養8天。第8天，對T細胞產物進行與T細胞表型及幹細胞性相關之表面標記物的染色。
總之，與TRANSACT TM產物相比，密度為0.3%及0.5%之PCS產物(分別為PCS-2及PCS-3)顯示「幹細胞樣」T細胞之更多富集( 圖 3A)。當觀察PCS產物時，與其他密度相比，0.3%-0.5%密度(分別為PCS-2及PCS-3)顯示「幹細胞樣」T細胞之最高富集。此等觀察結果亦顯示於CD4 ( 圖 3B)及CD8群體( 圖 3C)中。
此外，在額外健康供體(n=5)中，使用更嚴格表面標記物組來評估aCD3/28密度為0.3%及0.5%之PCS產物(分別為PCS-2及PCS-3)，以鑑別產物中之「幹細胞樣」T細胞。與TRANSACT TM產物相比，兩種PCS產物(PCS-2及PCS-3)均顯示幹細胞樣T細胞之較強富集。特定言之，PCS-2在所有5個供體中顯示較強富集且PCS-3在5個供體中之4個中顯示較強富集( 圖 4)。總之，此等資料表明PCS可與MRM協同作用以增強T細胞幹細胞性。 實例 4.
為了進一步評估包含代謝再編程培養基與PCS之組合的條件對T細胞之影響，使用TRANSACT TM或a-CD3/28密度為0.3%或0.5%之PCS產物(分別為PCS-2及PCS-3)來活化健康供體T細胞。用R12構築體轉導T細胞且在MRM中培養7天。第7天，將T細胞產物冷凍保存。隨後，使T細胞解凍且評估其因應於標靶刺激而上調細胞介素表現之能力。
T細胞功能性可經描述為其因應於標靶刺激而表現IL-2及IFNg之能力。 圖 5A顯示細胞內IL-2及IFN-γ (IFNg)之代表性流式細胞術圖以及細胞內細胞介素分析之閘控策略。T細胞首先在活的EGFR+ CD45+ CD3+ T CAR-T細胞上進行閘控，且隨後藉由IFNg及IL-2表現進行閘控。在所有所測試之供體中，與TRANSACT TM產物相比，在0.5% aCD3/28 (PCS-3)下之PCS產物顯示較佳多功能性(IFN+及IL2+) ( 圖 5B)。與TRANSACT TM產物相比，使用PCS-3之PCS產物亦顯示較高單獨IL2+ ( 圖 5C)及可相當之單獨IFNg+ ( 圖 5D) T細胞。因此，使用PCS-3之PCS產物顯示最低非功能性T細胞，或既不表現IL2亦不表現IFNg之T細胞( 圖 5E)。總之，此等資料表明PCS可與MRM協同作用以產生更多的多功能性CAR T細胞。 實例 5.
為了評估PCS產生之CAR-T細胞在活體外的標靶清除率，使用TRANSACT TM或a-CD3/28密度為0.3%或0.5%之PCS產物(分別為PCS-2及PCS-3)來活化健康供體T細胞( 圖 6A- 圖 6C)。在另一項研究中，使用TRANSACT TM或a-CD3/28密度為0.5%、0.75%或1%之PCS產物(分別為PCS-3、PCS-4及PCS-5)來活化健康供體T細胞( 圖 6D- 圖 6F)。用R12構築體轉導T細胞且在MRM中培養7天。第7天，將T細胞產物冷凍保存。隨後，使T細胞解凍且使用順序刺激分析來評估其反復殺死標靶細胞之能力。簡言之，使冷凍保存之T細胞解凍，靜置且再懸浮於完全RP10培養基中。對T細胞進行計數。使4,000個EGFR+ CAR T細胞與20,000個ROR1+標靶(H1975)以1:5 E:T在平底96孔板中共培養。每3-4天，將25%之先前培養物轉移至新的板中，該板以初始接種密度接種新鮮標靶。另外，每3-4天，使用流式細胞術來確定EGFR+ CAR T細胞之數目。使用INCUCYTE®來量化標靶清除率。
在兩項研究中，與TRANSACT TM產物相比，aCD3/28密度為0.5%之PCS (PCS-3)在3/3供體中顯示較佳之持續標靶清除率( 圖 6A- 圖 6F)。aCD3/28密度為0.5%之PCS顯示優於0.3% aCD3/28密度之標靶清除率，其與TRANSACT TM產物可相當( 圖 6A- 圖 6C)。aCD3/28密度為0.5%之PCS亦顯示優於0.75%及1%調配物之標靶清除率，其亦超過TRANSACT TM產物( 圖 6D- 圖 6F)。總之，此等研究表明PCS可與MRM協同作用以產生功能強大之CAR T細胞。 實例 6.
為了進一步驗證PCS產物對CAR-T細胞介導之標靶清除顯示優異效能，使用TRANSACT TM或a-CD3/28密度為0.5%之PCS (PCS-3)來活化健康供體T細胞。用R12構築體轉導T細胞且在MRM中培養7天。第7天，將T細胞產物冷凍保存。
在實例5中，如與TRANSACT TM產物相比，PCS產物顯示優異之重複標靶清除率。隨後，對CAR-T細胞進行應力測試以評估其短期效能。為此，使T細胞解凍且與標靶以低效應子:標靶比率(E:T)共培養，簡要描述如下：使冷凍保存之T細胞解凍，靜置且再懸浮於完全RP10培養基中。對T細胞進行計數。將每孔20,000個NLR+ ROR1+標靶細胞(NLR+ H1975)接種於平底96孔板中且使其黏附2小時，接著添加T細胞。接著，將EGFR+ CAR T細胞以1:125 (1個T細胞對應125個標靶細胞，E:T)添加至共計200 ul培養基中之NLR+ H1975標靶中且轉移至INCUCYTE®。使用至少2個重複樣品。使用INCUCYTE®在4天內量化標靶清除率。
與實例5中所證實的一致，與TRANSACT TM產物相比，PCS CAR-T產物在2/3供體中顯示優異短期效能( 圖 7A- 圖 7B)。在另一供體中，PCS產物之表現類似於TRANSACT TM過程( 圖 7C)。
與PCS產物在順序刺激分析中顯示優異標靶清除率之觀察結果一致，與TransAct產物相比，PCS T細胞在3/3供體中亦隨時間顯示更快擴增( 圖 8A- 圖 8C)。 實例 7.
為了確定與TRANSACT TM+MRM或TRANSACT TM+TCM相比，PCS+MRM培養之T細胞是否展現優異擴增，使用TRANSACT TM或具有不同抗CD3/28密度(0.1%-0.3%)之PCS調配物在MRM中來活化健康供體T細胞。用R12構築體轉導T細胞且在TCM (包含約5 mM鉀離子之對照T細胞培養基)或MRM中培養8天。第8天，對T細胞進行計數且確定自第0天起之總擴增( 圖 9)。與TRANSACT TM+TCM相比，在TRANSACT TM+MRM中產生之T細胞顯示適度降低之擴增。另一方面，與TCM或MRM中TRANSACT TM活化之T細胞產物相比，PCS+MRM中產生之T細胞顯示較高擴增。 實例 8.
為了確定與TRANSACT TM+MRM或TRANSACT TM+TCM相比，PCS+MRM培養之T細胞在抗ROR1 CAR T細胞產物中是否展現「幹細胞樣」群體之增加，使用TCM中之TRANSACT TM、MRM中之TRANSACT TM或在MRM中具有不同抗CD3/28密度之PCS調配物來活化且培養健康供體T細胞。用R12構築體轉導T細胞且在TCM或MRM中培養8天。第8天，對T細胞產物進行與T細胞表型及幹細胞性相關之表面標記物的染色，如實例3所述。
在所測試之3個供體中的3者中，與TRANSACT TM+TCM相比，TRANSACT TM+MRM產物顯示較高「幹細胞樣」T細胞群體。相比TRANSACT TM+MRM產物，PCS+MRM產物進一步顯示「幹細胞樣」T細胞群體之富集( 圖 10)。此等資料表明，PCS+MRM至少顯示優於TRANSACT TM及MRM對照之附加益處。 實例 9.
為了評估PCS+MRM是否因應於標靶刺激而顯示多功能性CAR-T細胞之增強，使用TCM中之TRANSACT TM、MRM中之TRANSACT TM或MRM中之抗CD3/28密度為0.5%的PCS (PCS-3)在1M規模下活化且培養健康供體T細胞。用R12構築體轉導T細胞且在TCM或MRM中培養7天。第7天，將T細胞產物冷凍保存。隨後，使T細胞解凍且評估其因應於標靶刺激而上調細胞介素表現之能力。
T細胞功能性可經描述為其因應於標靶刺激而表現IL-2及IFNg之能力( 圖 5A)，且T細胞功能性已與臨床結果呈正相關。TRANSACT TM+MRM產物顯示高於TRANSACT TM+TCM產物之多功能性(IFN+及IL-2+)。此外，PCS+MRM產物顯示高於TRANSACT™+MRM產物之多功能性( 圖 11A)。相反，與TRANSACT TM+MRM產物及TRANSACT TM+TCM產物相比，PCS+MRM產物以逐步方式顯示最少「非功能性」T細胞(IFN-及IL-2) ( 圖 11B)。 實例 10.
為了評估PCS+MRM是否顯示活體外CAR-T細胞之持久標靶清除的增強，使用TCM中之TRANSACT TM、MRM中之TRANSACT TM或MRM中之抗CD3/28密度為0.5%的PCS (PCS-3)在1M規模下活化且培養健康供體T細胞。用R12構築體轉導T細胞且在TCM或MRM中培養7天。第7天，將T細胞產物冷凍保存。隨後，使T細胞解凍且使用順序刺激及連續刺激分析來評估其反復殺死標靶細胞之能力。順序刺激分析之目的係評估整個T細胞群體之功能效能，而連續刺激分析之目的係評估個別T細胞隨時間之效能。如下執行順序刺激分析。使冷凍保存之T細胞解凍，靜置且再懸浮於完全RP10培養基中。對T細胞進行計數。在連續刺激板中，使EGFR+ CAR T細胞與ROR1+標靶(H1975)以1:5之效應子:標靶比率共培養。使用培養容器之大小來確定細胞之數目。另外，在用於可視化及量化標靶清除率之INCUCYTE®板中，使4,000個EGFR+ CAR T細胞與20,000個ROR1+標靶(H1975)在平底96孔板中以1:5 E:T共培養。每3-4天，使用流式細胞術來確定連續刺激板中之EGFR+ CAR T細胞之數目。新鮮標靶細胞再次與EGFR+ CAR T細胞一起以1:5之效應子:標靶比率(重設E:T)接種於連續刺激板中。另外，使4,000個連續刺激之CAR T細胞與20,000個ROR1+標靶(H1975)在平底96孔板中以1:5 E:T共培養以用於INCUCYTE®分析。使用INCUCYTE®來量化標靶清除率。
在所測試之3個供體中的3者中，TRANSACT TM+MRM產物在順序及連續刺激設定中均優於TRANSACT TM+TCM產物(圖12A-圖13C)。在順序刺激分析中，在3個供體中之2者中，PCS+MRM產物進一步顯示優於TRANSACT TM+MRM之標靶清除率(圖12B-圖12C)，其中最後一個供體顯示與TRANSACT TM+MRM可相當之效應( 圖 12A)。在連續刺激分析中，在3個供體中之3者中，PCS+ MRM產物優於TRANSACT TM+MRM產物( 圖 13A- 圖 13C)。 實例 11.
為了評估MRM變異體中之PCS，使用兩種PCS調配物(0.1%密度及0.5%密度)、五種MRM變異體(MRM-1、MRM-2、MRM-3、MRM-4及標準MRM)及1種TCM培養基。用任一PCS調配物刺激T細胞，用R12轉導，且在TCM、MRM-1至MRM-4或標準MRM中培養。MRM變異體彼此之區別僅在於K +離子及NaCl濃度。K離子水準自MRM-1 (最高K +離子水準)減少至MRM-4 (最低K +離子水準)，而NaCl濃度自MRM-1 (最低NaCl濃度)增加至MRM-4 (最高NaCl濃度)。分析T細胞在刺激後之活化，以及在培養7天後之擴增及轉導效率。
使健康人類供體CD4及CD8 T細胞解凍，洗滌一次且再懸浮於預加溫之MRM中。接著使CD4及CD8 T細胞以1:1比率混合，接著離心且再懸浮於各別培養基中至2e6個總T細胞/ml。
使兩種不同PCS調配物之預凍乾PCS材料再懸浮於完全TCM中至10 mg/ml。隨後，藉由與20 ul PCS混合來活化在1:1 CD4:CD8下之1e6個T細胞。最後，用R12構築體以MOI 7.5轉導T細胞且使其不受干擾持續72小時。
將T細胞接種於完全TCM、MRM-1、MRM-2、MRM-3、MRM-4或標準MRM中，均補充IL2/7/15，使用任一PCS調配物刺激，且在第0天進行轉導。第2天，將T細胞轉移至GRex24中之5 ml完全TCM、MRM-1、MRM-2、MRM-3、MRM-4或標準MRM中，均補充IL2/7/15。第5天，將T細胞轉移至GRex6中之總計15或20 ml完全TCM、MRM-1、MRM-2、MRM-3、MRM-4或標準MRM中，均補充IL2/7/15。第2天及第7天，收集T細胞以用於表型分析。
在T細胞產生結束時，對T細胞進行計數。收集500,000個T細胞用於流式細胞術。在4℃下用表面抗體對T細胞染色持續20分鐘。洗滌細胞且使其在BioRad ZE5或Cytek Aurora流式細胞儀上可視化。
用任一PCS調配物刺激之T細胞在所有培養基調配物中均顯示成功活化、擴增及轉導。在用任一PCS調配物刺激T細胞之後第2天，在各種MRM調配物中培養之T細胞均顯示活化標記物CD25及CD69之相似表現，且兩種PCS調配物中之所有培養基調配物均導致成功T細胞活化(圖14A-圖14B)。
在用任一PCS調配物刺激T細胞之後7天，在Cellaca MX高通量自動計數器上對細胞進行計數。擴增係經計算為第7天之活細胞總數除以第0天之活細胞總數。兩種PCS調配物中之所有培養基調配物均導致成功T細胞擴增(圖14C-圖14D)。
在用任一PCS調配物刺激T細胞之後7天，收集細胞且評估轉導效率。使用活力染料將死細胞排除在分析之外。經轉導之T細胞係定義為CD3+EGFR+ T細胞。兩種PCS調配物中之所有培養基調配物均導致成功T細胞轉導(圖14E-圖14F)。 ***
應瞭解，意欲使用實施方式部分而非發明內容及摘要部分來解釋申請專利範圍。發明內容及摘要部分可闡述如本發明人所預期之本揭示案之一或多個但非所有例示性實施例，且因此不欲以任何方式限制本揭示案及隨附申請專利範圍。
上文已藉助說明規定功能及其關係之實施之功能結構單元來描述本揭示案。為便於描述，本文已任意限定該等功能構建塊之邊界。只要適當地執行規定功能及其關係，就可界定替代邊界。
特定實施例之前述說明將完整地揭露本揭示案之一般性質，使得他人可在不背離本揭示案之一般概念的情形下藉由應用此項技術中之知識即可容易地修改及/或調適此類特定實施例之各種應用，而無需過多實驗。因此，基於本文所呈遞之教示及指導，此類調適及修改意欲在所揭示實施例之等效物之意義及範圍內。應理解，本文之片語或術語係出於說明而非限制之目的，使得熟練技術人員應根據教示及指導理解本說明書之術語或片語。
本揭示案之廣度及範圍不應受上文所述之例示性實施例中的任一者限制，而應僅根據以下申請專利範圍及其等效物來界定。
在本申請案中通篇引用之所有經引用之參考文獻(包括文獻參考文獻、美國或外國專利或專利申請案以及網站)的內容由此以引用之方式明確併入，就好像出於任何目的將其全部寫入本文中一般，其中引用之參考文獻亦如此。當出現任何不一致時，以本文字面揭示之材料為準。
[圖1]顯示在8天產生過程結束時經組合之CD4 +及CD8 +T細胞的擴增倍數。擴增倍數藉由將第8天之T細胞總數除以第0天之T細胞總數來計算。每個點代表一個來自研究之供體。數據自三項獨立研究匯集。 [圖2]顯示在8天產生過程結束時EGFR +ROR1 CAR-T細胞群體內的CD4 +或CD8 +T細胞之百分率。顯示平均值及標準偏差。數據自三項獨立研究匯集。 [圖3A-圖3C]顯示在8天產生過程結束時，如藉由CD45RA+及CCR7+所定義之幹細胞樣CAR-T細胞之表型分析。(圖3A).所有CD3+ EGFR+ CAR-T細胞內之幹細胞樣CAR-T細胞之百分率。(圖3B). CD4+ EGFR+ CAR-T細胞內之幹細胞樣CAR-T細胞之百分率。(圖3C). CD8+ EGFR+ CAR-T細胞內之幹細胞樣CAR-T細胞之百分率。每個點代表一個來自研究之供體。數據自兩項獨立研究匯集。 [圖4]顯示在5個獨立供體中，如藉由更嚴格閘控策略(CCR7+ CD45RA+ CD62L+ CD45RO-)所定義之幹細胞樣CAR-T細胞之表型分析。在8天產生過程結束時，在所有CD3+ EGFR+ CAR-T細胞上進行細胞閘控。每個條形指示所有CAR-T細胞內之幹細胞樣T細胞之百分率。 [圖5A-圖5E]顯示抗ROR1 CAR T細胞因應於標靶細胞刺激之細胞內細胞介素表現。圖5A顯示細胞內IL-2及IFN-γ (IFNg)之代表性流式細胞術圖以及細胞內細胞介素分析之閘控策略，其中象限B、C、D及E分別對應於圖5B、圖5C、圖5D及圖5E。T細胞首先在活的EGFR+ CD45+ CD3+ T CAR-T細胞上進行閘控，且隨後藉由IFNg及IL-2表現進行閘控。圖5B顯示在CD3+ CAR-T細胞內，如藉由表現IFNg及IL-2兩者之T細胞所定義之多功能CAR-T細胞之百分率。圖5C顯示僅表現IL-2之CAR-T細胞之百分率。圖5D顯示僅表現IFNg之CAR-T細胞之百分率。圖5E顯示如藉由因應於標靶細胞刺激而既不表現IL-2亦不表現IFNg之彼等細胞所定義的「非功能性」CAR-T細胞之百分率。每種符號代表一個獨特供體。 [圖6A-圖6F]係在活體外順序刺激分析中因應於CAR-T細胞之標靶細胞清除曲線。使用組成性表現之螢光蛋白NLR對標靶細胞進行可視化及量化。培養中之活的標靶細胞之量係定義為總NLR強度且表述為「總標靶細胞強度」。總標靶細胞強度之降低表示標靶細胞死亡。圖6A-圖6C顯示在順序刺激期間，三個不同供體分別因應於使用transact過程(TA)、PCS 0.3% aCD3/28或PCS 0.5% aCD3/28過程產生之CAR-T細胞的標靶細胞死亡隨時間之動力學(供體6 (圖6A)、供體7 (圖6B)及供體8 (圖6C))。圖6D-圖6F顯示在順序刺激期間，三個不同供體分別因應於使用transact過程(TA)、PCS 0.5% aCD3/28、PCS 0.75% aCD3/28或PCS 1% aCD3/28過程產生之CAR-T細胞的標靶細胞死亡隨時間之動力學(供體6 (圖6D)、供體7 (圖6E)及供體8 (圖6F))。 [圖7A-圖7C]係三個不同供體分別在低效應子:標靶(E:T)比率(此處為1:125，亦即對於每125個標靶細胞，存在1個CAR-T細胞)下使用活體外效能分析因應於細胞之標靶細胞清除曲線(供體6 (圖7A)、供體7  (圖7B)及供體8 (圖7C))。使用組成性表現之螢光蛋白NLR對標靶細胞進行可視化及量化。培養中之活的標靶細胞之量係定義為總NLR強度且表述為「總標靶細胞強度」。總標靶細胞強度之降低表示標靶細胞死亡。該等圖顯示在順序刺激期間，因應於使用模擬transact過程(TA)、TA過程、模擬PCS過程及PCS 0.5% aCD3/28過程產生之CAR-T細胞的標靶細胞死亡隨時間之動力學。 [圖8A-圖8C]顯示三個不同供體在活體外順序刺激分析中分別因應於標靶細胞刺激之CAR-T細胞之累積數目(供體6 (圖8A)、供體7 (圖8B)及供體8 (圖8C))。CAR-T細胞之數目係藉由將活的EGFR+ CD45+ NLR-細胞之百分率乘以孔中之細胞總數而獲得的。 [圖9]係在8天產生過程結束時經組合之CD4+及CD8+ T細胞的擴增倍數之圖形表示。擴增倍數藉由將第8天之T細胞總數除以第0天之T細胞總數來計算。每個點代表一個獨特供體。 [圖10]為條形圖，該條形圖顯示在3個獨立供體中，如藉由CCR7+ CD45RA+ CD62L+ CD45RO-表現所定義之幹細胞樣CAR-T細胞之表型分析。在8天產生過程結束時，在所有CD3+ EGFR+ CAR-T細胞上進行細胞閘控。每個條形指示所有CAR-T細胞內之幹細胞樣T細胞之百分率。 [圖11A-圖11B]顯示抗ROR1 CAR T細胞因應於標靶細胞刺激之細胞內細胞介素表現。圖11A顯示在CD3+ CAR-T細胞內，如藉由在標靶細胞刺激後表現IFNg及IL-2兩者之T細胞所定義之多功能CAR-T細胞之百分率。圖11B顯示如藉由在標靶細胞刺激後既不表現IL-2亦不表現IFNg之彼等細胞所定義的「非功能性」CAR-T細胞之百分率。每種符號代表一個獨特供體。 [圖12A-圖12C]係三個獨立供體在活體外順序刺激分析中分別因應於CAR-T細胞之標靶細胞清除曲線(供體7 (圖12A)、供體8 (圖12B)及供體9 (圖12C))。使用組成性表現之螢光蛋白NLR對標靶細胞進行可視化及量化。培養中之活的標靶細胞之量係定義為總NLR強度且表述為「總標靶細胞強度」。總標靶細胞強度之降低表示標靶細胞死亡。 [圖13A-圖13C]係三個獨立供體在活體外連續刺激分析中分別因應於CAR-T細胞之標靶細胞清除曲線(供體7 (圖13A)、供體8 (圖13B)及供體9 (圖13C))。使用組成性表現之螢光蛋白NLR對標靶細胞進行可視化及量化。培養中之活的標靶細胞之量係定義為總NLR強度且表述為「總標靶細胞強度」。總標靶細胞強度之降低表示標靶細胞死亡。 [圖14A-圖14F]係在對照(TCM)及各種MRM (MRM-1、MRM-2、MRM-3、MRM-4及標準MRM)培養物中培養且經第一PCS (0.5%密度，1:1；圖14A、圖14C及圖14E)或第二PCS (0.1%密度，1:1；圖14B、圖14D及圖14F)組合物活化之細胞的細胞活化(圖14A-圖14B)、擴增(圖14C-圖14D)及轉導(圖14A-圖14F)之圖形表示。

Claims (120)

  1. 一種製備用於免疫療法之人類免疫細胞群體之方法，該方法包括使人類免疫細胞與可編程細胞信號傳導支架(PCS)在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸。
  2. 一種活化用於免疫療法之人類免疫細胞群體之方法，該方法包括使人類免疫細胞與可編程細胞信號傳導支架(PCS)在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸。
  3. 一種在離體或活體外培養期間增加經活化人類免疫細胞之產量之方法，該方法包括使人類免疫細胞與可編程細胞信號傳導支架(PCS)在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸。
  4. 一種在離體或活體外培養期間增加用於免疫療法之經活化人類免疫細胞之幹細胞性、同時增加經活化人類免疫細胞之產量的方法，該方法包括使人類免疫細胞與可編程細胞信號傳導支架(PCS)在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸。
  5. 一種離體或活體外擴增經活化幹細胞樣免疫細胞群體之方法，該方法包括使免疫細胞與可編程細胞信號傳導支架(PCS)在包含濃度高於5 mM之鉀離子的培養基中接觸。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該PCS包含(i)包含高表面積中孔二氧化矽微棒(MSR)之基層；(ii)在該MSR基層上分層之連續、流體支撐脂質雙層(SLB)；(iii)裝載至該支架上之複數種表面指示物；及(iv)裝載至該支架上之複數種可溶性指示物。
  7. 如請求項6之方法，其中該表面指示物經裝載至該SLB層上。
  8. 如請求項6之方法，其中該可溶性指示物經裝載至該MSR基層上。
  9. 如請求項6至8中任一項之方法，其中該可溶性指示物以控制釋放方式自該支架釋放。
  10. 如請求項6至9中任一項之方法，其中該可溶性指示物以持續方式自該支架釋放持續至少30天。
  11. 如請求項6至10中任一項之方法，其中該複數種可溶性指示物包含IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、轉化生長因子β (TGF-β)或其促效劑、其模擬物、其變異體、其功能片段或其組合。
  12. 如請求項6至11中任一項之方法，其中該複數種可溶性指示物包含(i) IL-2、其促效劑、其模擬物、其變異體、其功能片段或其組合，及(ii)包含IL-7、IL-21、IL-15、IL-15超促效劑或其任何組合之第二可溶性指示物。
  13. 如請求項6至12中任一項之方法，其中該複數種可溶性指示物包含(i) IL-2、其促效劑、其模擬物、其變異體、其功能片段或其組合，(ii)包含IL-7、IL-21、IL-15、IL-15超促效劑或其任何組合之第二可溶性指示物，及(iii)包含IL-7、IL-21、IL-15、IL-15超促效劑或其任何組合之第三可溶性指示物。
  14. 如請求項6至11中任一項之方法，其中該複數種可溶性指示物包括包含IL-2之前30個胺基酸(pl-30)的N端IL-2片段、IL-2超細胞介素肽、IL-2部分促效劑肽或其組合。
  15. 如請求項6至14中任一項之方法，其中該複數種表面指示物包含T細胞刺激分子、T細胞共刺激分子或T細胞刺激分子及T細胞共刺激分子兩者。
  16. 如請求項15之方法，其中該T細胞刺激分子及該T細胞共刺激分子各自獨立地裝載至該流體支撐之脂質雙層(SLB)上。
  17. 如請求項16之方法，其中該T細胞刺激分子及該T細胞共刺激分子經由親和配對或化學偶合經裝載。
  18. 如請求項17之方法，其中該親和偶合包含生物素-卵白素對、抗體-抗原對、抗體-半抗原對、親和對、捕捉蛋白對、Fc受體-IgG對、金屬螯合脂質對或其組合。
  19. 如請求項17或18之方法，其中該化學偶合包含疊氮化物-炔烴化學(AAC)反應、二苯并-環辛炔接合(DCL)、四嗪-烯烴接合(TAL)或其任何組合。
  20. 如請求項15至19中任一項之方法，其中該T細胞刺激分子及該T細胞共刺激分子各自獨立地經塗佈於該流體支撐之脂質雙層(SLB)上。
  21. 如請求項15至20中任一項之方法，其中該T細胞刺激分子及該T細胞共刺激分子各自獨立地部分包埋於該流體支撐之脂質雙層(SLB)上。
  22. 如請求項15至21中任一項之方法，其中該T細胞刺激分子及該T細胞共刺激分子各自獨立地裝載至該等中孔二氧化矽微棒(MSR)上。
  23. 如請求項15至22中任一項之方法，其中該T細胞刺激分子及該T細胞共刺激分子各自獨立地為抗體分子或其抗原結合片段。
  24. 如請求項15至23中任一項之方法，其中該T細胞刺激分子包含抗CD3抗體或其抗原結合部分、抗巨噬細胞清道夫受體(MSR1)抗體或其抗原結合部分、抗T細胞受體(TCR)抗體或其抗原結合部分、抗CD2抗體或其抗原結合部分、抗CD47抗體或其抗原結合部分、裝載有MHC肽之主要組織相容性複合物(MHC)分子或其多聚體、MHC-免疫球蛋白(Ig)結合物或其多聚體或其組合。
  25. 如請求項15至24中任一項之方法，其中該T細胞共刺激分子包含抗體或其抗原結合部分，其特異性結合於共刺激抗原，該共刺激抗原包含CD28、4.1BB (CD137)、OX40 (CD134)、CD27 (TNFRSF7)、GITR (CD357)、CD30 (TNFRSF8)、HVEM (CD270)、LTfiR (TNFRSF3)、DR3 (TNFRSF25)、ICOS (CD278)、CD226 (DNAM1)、CRTAM (CD355)、TIM1 (HAVCR1、KIM1)、CD2 (LFA2、0X34)、SLAM (CD150、SLAMF1)、2B4 (CD244、SLAMF4)、Lyl08 (NTBA、CD352、SLAMF6)、CD84 (SLAMF5)、Ly9 (CD229、SLAMF3)、CRACC (CD319、BLAME)或其任何組合。
  26. 如請求項15至25中任一項之方法，其中該T細胞刺激分子及該T細胞共刺激分子包含雙特異性抗體或其抗原結合部分。
  27. 如請求項15至26中任一項之方法，其中該T細胞刺激分子及該T細胞共刺激分子包含一對，該對包含CD3/CD28、CD3/ICOS、CD3/CD27、CD3/CD137或其組合。
  28. 如請求項6至27中任一項之方法，其中該支架進一步包含特異性結合於Fc融合蛋白之免疫球蛋白分子。
  29. 如請求項6至28中任一項之方法，其中該支架進一步包含募集化合物，該募集化合物包含粒細胞巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、趨化介素(C-C模體)配位體21 (CCL-21)、趨化介素(C-C模體)配位體19 (CCL-19)、趨化介素(C-X-C模體)配位體12 (CXCL12)、干擾素γ (IFNy)、FMS樣酪胺酸激酶3 (Flt-3)配位體或其任何組合。
  30. 如請求項6至29中任一項之方法，其中該募集化合物包含粒細胞巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)。
  31. 如請求項6至30中任一項之方法，其中該支架進一步包含抗原。
  32. 如請求項31之方法，其中該抗原包含腫瘤抗原。
  33. 如請求項32之方法，其中該腫瘤抗原為腺瘤性結腸瘜肉蛋白(APC)、腺苷去胺酶結合蛋白(AD Abp)、a-胎兒蛋白、AFP (α-胎兒蛋白)、AIM-2、AIM-3及WT1、ART1、ART4、B7-H3、B7-H6、BAGE、BCMA、B-細胞週期蛋白、BMI1、Braf、腦糖原磷酸化酶、BRAP、C13orf24、C6orfl53、C9orf 112、CA-125、CA9 (碳酸酐酶9)、CASP-8、組織蛋白酶B、Cav-1、CCL-1 (C-C模體趨化介素配位體1)、CD123、CD138、CD171、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD352、CD38、CD40、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD45、CD47、CD5、CD56、CD66e、CD70、CD74、CD74、CD79a、CD79b、CD98、cdc27、CDK-1、CDK4、CEA、CEA (癌胚抗原)、c-erbB-2、Claudin 18.2、Claudin 6、c-MET、結腸直腸相關抗原(CRC)- C017-1A/GA733、連結蛋白37、COX-2、CT-7、親環素b、CYNL2、二肽基肽酶IV (DPPIV)、DLL3 (δ樣蛋白3)、DLL4、EBV編碼之核抗原(EBNA)-I、E-鈣黏蛋白、EGFRvIII、ENPP3 (外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員3)、EpCAM、EPG-2 (上皮醣蛋白2)、EPG-40、EPHa2 (腎上腺素受體A2)、EphA2/Eck、ephrinB2、ERBB二聚體、ESO-1、雌激素受體、ETBR (內皮素B受體)、EZH2、FAP-α (纖維母細胞活化蛋白α)、FBP (葉酸結合蛋白)、FCRL5、胎兒AchR (胎兒乙醯膽鹼受體)、胞襯蛋白、Fra-l/Fosl 1、FR-α (葉酸受體α)、GAGE-1、GAGE家族腫瘤抗原、神經節苷脂/GD2、GCC (鳥苷酸環化酶C)、GD2、GD2神經節苷脂、GD3、GLEA2、GM2、GnT-V、GnT-V、GOLGA、gp100 (醣蛋白100)、gp75、GPC2 (磷脂醯肌醇蛋白聚糖-2)、GPC3、gplOO、GPNMB (醣蛋白NMB)、GPRC5D (G蛋白偶合受體5D)、GUI、H60、B型肝炎表面抗原、HER2、HER3、HER4、與源自AFP之肽複合的HLA-A、HLA-A1 (人類白血球抗原Al)、HLA-A2 (人類白血球抗原A2)、HMW-MAA (人類高分子量黑色素瘤相關抗原)、HSPH1、Ig κ、Ig λ、IGF1R (胰島素樣生長因子1受體)、Ig-個體基因型、IL-13Ra2 (IL-13受體α 2)、IL13Rα、IL-22Ra (IL-22受體α)、ING4、KDR (激酶插入結構域受體)、Ki67、KIAA0376、KRAS、Ku70/80、LAGE-I、Lewis Y、LI細胞黏附分子(LI -CAM)、Liv-1、Livin、lmp-1、LRRC8A (含富含白胺酸重複序列之8家族成員A)、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-A、MAGE-A3、MAGE-A6、MART-1 (melan A)、MCSP (黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚醣)、黑色素瘤相關抗原(MAGE)-A1、間皮素、MHC/肽複合物(例如，MICA、MICB、midkin、MRP-3、MUC16、黏蛋白1 (MUC1)、MUM-1、鼠科動物巨細胞病毒(MCMV)、NAG、NCAM (神經細胞黏附分子)、Nectin-4、巢蛋白、NKG2D (天然殺手2族成員D)配位體、NKTR、NSEP1、NY-ESO、NY-ESO-1、OLIG2、致癌胎兒抗原、P1A、p53、PAP、PD-1、PD-L1、pl20ctn、pl5、Pmell l7、PRAME (優先表現之黑色素瘤抗原)、助孕酮受體、PROX1、PSA (前列腺特異性抗原)、PSCA (前列腺幹細胞抗原)、PSMA、PSMA (前列腺特異性膜抗原)、RAE-1蛋白、RAGE、ras、RBPSUH、RCAS1、ROR1、ROR2、RTN4、SART1、SART2、SART3、SCP-I、SIRPα (信號調節蛋白α)、SLIT、SLITRK6 (NTRK樣蛋白6)、Smad家族腫瘤抗原、SOX10、SOX11、SOX2、SSX-2 (HOM-MEL-40)、SSX-4、SSX-5、SSX-I、SSX-I、STEAP1 (前列腺六跨膜上皮抗原1)、存活素、存活素、TAG72 (腫瘤相關醣蛋白72)、T細胞受體/CD3-ζ鏈、TNKS2、TPBG (滋養層醣蛋白)、TPR、Trop-2、TRP-1、TRP-2、酪胺酸酶、U2AF1L、UL16結合蛋白樣轉錄物1 (Multl)、UPAR、VEGFR1 (血管內皮生長因子受體1)、VEGFR2、WT-1、αvβ6或另一整合素、β-鏈蛋白、β1,6-Ν、β-鏈蛋白、γ-鏈蛋白、ίίνίηβ以及來自HIV、HBV、HCV、HPV及其他病原體之抗原、患者特異性新抗原或其免疫原性肽及其任何組合。
  34. 如請求項6至33中任一項之方法，其中該支撐之脂質雙層(SLB)與該等中孔二氧化矽微棒(MSR)之重量比在約10:1與約1:20之間。
  35. 如請求項6至34中任一項之方法，其中該連續、流體支撐之脂質雙層(SLB)包含選自由以下組成之群的脂質：(DMPC)、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)、棕櫚醯-油醯磷脂醯膽鹼(POPC)、二油醯磷脂醯膽鹼(DOPC)、二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)、二肉豆蔻醯磷脂醯乙醇胺(DMPE)及二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺(DPPE)、1-硬脂醯-2-肉豆蔻醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(8:0-14:0 PC)或其組合。
  36. 如請求項6至35中任一項之方法，其中該中孔二氧化矽微棒-脂質雙層(MSR-SLB)支架保留連續、流體架構持續至少14天。
  37. 如請求項6至36中任一項之方法，其中該等中孔二氧化矽微棒(MSR)與該等T細胞活化/共刺激分子之乾重比在1:1至50:1之間。
  38. 如請求項1至37中任一項之方法，該方法進一步包括用編碼配位體結合蛋白之聚核苷酸修飾該等免疫細胞。
  39. 如請求項1至38中任一項之方法，其中該等免疫細胞包含編碼抗原受體之聚核苷酸。
  40. 如請求項38或39之方法，其中該抗原受體係選自抗體、經工程改造之抗體(諸如scFv)、CAR、經工程改造之TCR、TCR模擬物、嵌合信號傳導受體(CSR)或其任何組合。
  41. 如請求項40之方法，其中該CAR係經設計為標準CAR、分裂CAR、斷開CAR、接通CAR、第一代CAR、第二代CAR、第三代CAR或第四代CAR。
  42. 如請求項38至41中任一項之方法，其中該抗原受體包含(i)抗原結合結構域、(ii)跨膜結構域、(iii)共刺激結構域、(iv)細胞內信號傳導結構域或(v) (i)-(iv)之任何組合。
  43. 如請求項42之方法，其中該抗原結合結構域特異性結合選自由以下組成之群的抗原：AFP (α-胎兒蛋白)、αvβ6或另一整合素、BCMA、Braf、B7-H3、B7-H6、CA9 (碳酸酐酶9)、CCL-1 (C-C模體趨化介素配位體1)、CD5、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD45、CD47、CD56、CD66e、CD70、CD74、CD79a、CD79b、CD98、CD123、CD138、CD171、CD352、CEA (癌胚抗原)、Claudin 18.2、Claudin 6、c-MET、DLL3 (δ樣蛋白3)、DLL4、ENPP3 (外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員3)、EpCAM、EPG-2 (上皮醣蛋白2)、EPG-40、ephrinB2、EPHa2 (腎上腺素受體A2)、ERBB二聚體、雌激素受體、ETBR (內皮素B受體)、FAP-α (纖維母細胞活化蛋白α)、胎兒AchR (胎兒乙醯膽鹼受體)、FBP (葉酸結合蛋白)、FCRL5、FR-α (葉酸受體α)、GCC (鳥苷酸環化酶C)、GD2、GD3、GPC2 (磷脂醯肌醇蛋白聚糖-2)、GPC3、gp100 (醣蛋白100)、GPNMB (醣蛋白NMB)、GPRC5D (G蛋白偶合受體5D)、HER2、HER3、HER4、B型肝炎表面抗原、HLA-A1 (人類白血球抗原Al)、HLA-A2 (人類白血球抗原A2)、HMW-MAA (人類高分子量黑色素瘤相關抗原)、IGF1R (胰島素樣生長因子1受體)、Ig κ、Ig λ、IL-22Ra (IL-22受體α)、IL-13Ra2 (IL-13受體α 2)、KDR (激酶插入結構域受體)、LI細胞黏附分子(LI -CAM)、Liv-1、LRRC8A (含富含白胺酸重複序列之8家族成員A)、Lewis Y、黑色素瘤相關抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MART-1 (melan A)、鼠科動物巨細胞病毒(MCMV)、MCSP (黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚醣)、間皮素、黏蛋白1 (MUC1)、MUC16、MHC/肽複合物(例如，與源自AFP、KRAS、NY-ESO、MAGE-A及WT1之肽複合的HLA-A)、NCAM (神經細胞黏附分子)、Nectin-4、NKG2D (天然殺手2族成員D)配位體、NY-ESO、致癌胎兒抗原、PD-1、PD-L1、PRAME (優先表現之黑色素瘤抗原)、助孕酮受體、PSA (前列腺特異性抗原)、PSCA (前列腺幹細胞抗原)、PSMA (前列腺特異性膜抗原)、ROR1、ROR2、SIRPα (信號調節蛋白α)、SLIT、SLITRK6 (NTRK樣蛋白6)、STEAP1 (前列腺六跨膜上皮抗原1)、存活素、TAG72 (腫瘤相關醣蛋白72)、TPBG (滋養層醣蛋白)、Trop-2、VEGFR1 (血管內皮生長因子受體1)、VEGFR2以及來自HIV、HBV、HCV、HPV及其他病原體之抗原及其任何組合。
  44. 如請求項43之方法，其中該抗原結合結構域特異性結合ROR1。
  45. 如請求項43之方法，其中該抗原結合結構域特異性結合GPC2。
  46. 如請求項42至45中任一項之方法，其中該共刺激結構域包含以下各物之共刺激結構域：介白素-2受體(IL-2R)、介白素-12受體(IL-12R)、IL-7、IL-21、IL-23、IL-15、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD27、CD28、CD30、CD40、4-1BB/CD137、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1 (LFA-1)、LIGHT、NKG2C、OX40、DAP10或其任何組合。
  47. 如請求項46之方法，其中該共刺激結構域包含4-1BB/CD137共刺激結構域。
  48. 如請求項42至47中任一項之方法，其中該跨膜結構域包含以下各物之跨膜結構域：KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1 (CD11a、CD18)、ICOS (CD278)、4-1BB (CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C、CD19或其任何組合。
  49. 如請求項42至48中任一項之方法，其中該跨膜結構域包含CD28跨膜結構域。
  50. 如請求項42至49中任一項之方法，其中該細胞內信號傳導結構域包含源自以下各物之細胞內信號傳導結構域：CD3 ζ、FcR γ、普通FcR γ (FCER1G)、Fc γ RIIa、FcR β (Fc ε Rib)、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD22、CD79a、CD79b、CD278 (「ICOS」)、FcεRI、CD66d、CD32、DAP10、DAP12或其任何組合。
  51. 如請求項50之方法，其中該細胞內信號傳導結構域包含CD3 ζ細胞內信號傳導結構域。
  52. 如請求項40之方法，其中該抗原受體包含經工程改造之TCR。
  53. 如請求項52之方法，其中該經工程改造之TCR特異性結合腫瘤抗原/MHC複合物。
  54. 如請求項53之方法，其中該腫瘤抗原源自AFP、CD19、BCMA、CLL-1、CS1、CD38、CD19、TSHR、CD123、CD22、CD30、CD171、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、Tn Ag、PSMA、ROR1、ROR2、GPC1、GPC2、FLT3、FAP、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、間皮素、IL-l lRa、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、葉酸受體α、ERBB2 (Her2/neu)、MUC1、MUC16、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受體、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪胺酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WTl、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-Al、豆莢蛋白、HPV E6,E7、MAGE Al、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相關抗原1、p53、p53突變體、前列腺素、存活素、端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MARTl、Ras突變體、hTERT、肉瘤易位斷點、ML-IAP、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受體、細胞週期蛋白Bl、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人類端粒酶逆轉錄酶、RU1、RU2、腸道羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、APRIL蛋白之細胞外部分、新抗原或其任何組合。
  55. 如請求項1至54中任一項之方法，其中該外源聚核苷酸包含調節元件，且其中載體包含該外源聚核苷酸。
  56. 如請求項55之方法，其中該載體為多順反子表現載體。
  57. 如請求項55或56之方法，其中該調節元件包含啟動子。
  58. 如請求項57之方法，其中該啟動子包含dl587rev引子結合位點取代(MND)啟動子、EF1a啟動子、泛素啟動子或其組合。
  59. 如請求項55至58中任一項之方法，其中該載體包含病毒載體、哺乳動物載體或細菌載體。
  60. 如請求項55至59中任一項之方法，其中該載體包含腺病毒載體、慢病毒、仙台病毒載體(Sendai virus vector)、桿狀病毒載體、Epstein Barr病毒載體、乳多泡病毒載體、牛痘病毒載體、單純疱疹病毒載體、雜合病毒載體或腺相關病毒(AAV)載體。
  61. 如請求項60之方法，其中該載體為慢病毒。
  62. 如請求項1至61中任一項之方法，其中該鉀離子之濃度高於約10 mM、約15 mM、約20 mM、約25 mM、約30 mM、約35 mM、約40 mM、約45 mM、約50 mM、約55 mM、約60 mM、約65 mM、約70 mM、約75 mM、約80 mM、約85 mM或約90 mM。
  63. 如請求項1至61中任一項之方法，其中該鉀離子之濃度係選自由約40 mM、約45 mM、約50 mM、約55 mM、約60 mM、約65 mM、約70 mM、約75 mM及約80 mM組成之群。
  64. 如請求項1至61中任一項之方法，其中該鉀離子之濃度係在約30 mM與約80 mM之間、約40 mM與約80 mM之間、約50 mM與80 mM之間、約60 mM與約80 mM之間、約70 mM與約80 mM之間、約40 mM與約70 mM之間、約50 mM與約70 mM之間、約60 mM與約70 mM之間、約40 mM與約60 mM之間、約50 mM與約60 mM之間或約40 mM與約50 mM之間。
  65. 如請求項1至61中任一項之方法，其中該鉀離子之濃度為約50 mM、約60 mM或約70 mM。
  66. 如請求項1至65中任一項之方法，其中該培養基進一步包含鈉離子。
  67. 如請求項1至66中任一項之方法，其中該培養基進一步包含NaCl。
  68. 如請求項1至67中任一項之方法，其中該培養基包含小於約140 mM、約130 mM、約120 mM、約110 mM、約100 mM、約90 mM、約80 mM、約70 mM、約60 mM、約50 mM或約40 mM NaCl。
  69. 如請求項1至68中任一項之方法，其中該培養基為低張或等張的。
  70. 如請求項1至69中任一項之方法，其中該鉀離子濃度及該NaCl濃度之總和乘以2係小於280。
  71. 如請求項1至70中任一項之方法，其中該鉀離子濃度及該NaCl濃度之總和乘以2係大於240且小於280。
  72. 如請求項1至70中任一項之方法，其中該鉀離子濃度及該NaCl濃度之總和乘以2係大於或等於280且小於300。
  73. 如請求項1至70中任一項之方法，其中該鉀離子之濃度為約60 mM，且該NaCl之濃度係小於80 mM、小於75 mM、小於70 mM、小於65 mM或小於60 mM。
  74. 如請求項1至70中任一項之方法，其中該鉀離子之濃度為約55 mM，且該NaCl之濃度係小於85 mM、小於80 mM、小於75 mM、小於70 mM或小於65 mM。
  75. 如請求項1至70中任一項之方法，其中該鉀離子之濃度為約50 mM，且該NaCl之濃度係小於90 mM、小於85 mM、小於80 mM、小於75 mM或小於70 mM。
  76. 如請求項1至75中任一項之方法，其中該培養基進一步包含一或多種細胞介素。
  77. 如請求項76之方法，其中該一或多種細胞介素包含介白素-2 (IL-2)、介白素-7 (IL-7)、介白素-21 (IL-21)、介白素-15 (IL-15)或其任何組合。
  78. 如請求項76之方法，其中該一或多種細胞介素包含IL-2、IL-7及IL-15。
  79. 如請求項1至77中任一項之方法，其中該培養基進一步包含鈣離子、葡萄糖或鈣離子及葡萄糖兩者。
  80. 如請求項1至78中任一項之方法，其中該培養基進一步包含細胞擴增劑。
  81. 如請求項80之方法，其中該細胞擴增劑包含GSK3B抑制劑、ACLY抑制劑、PI3K抑制劑、AKT抑制劑或其任何組合。
  82. 如請求項81之方法，其中該PI3K抑制劑係選自羥基檸檬酸鹽、LY294002、匹替利司(pictilisib)、CAL101、IC87114及其任何組合。
  83. 如請求項81之方法，其中該AKT抑制劑係選自MK2206、A443654、AKTi-VIII及其任何組合。
  84. 如請求項1至83中任一項之方法，其中如與起始免疫細胞及/或在不含該高濃度之鉀離子的培養基中培養之免疫細胞相比，該培養基能夠在最終細胞產物中： (a)  增加低分化及/或未分化細胞之數目及/或百分率； (b)  增加轉導效率； (c)  增加幹細胞樣免疫細胞； (d)  增加活體內活力； (e)  增加細胞效能； (f)   防止細胞耗竭； (g)  增加效應子樣細胞之數目及/或百分率；或 (h)  其任何組合。
  85. 如請求項1至84中任一項之方法，其中該培養基進一步包含葡萄糖。
  86. 如請求項85之方法，其中葡萄糖之濃度超過約10 mM。
  87. 如請求項85或86之方法，其中該葡萄糖之濃度為約10 mM至約25 mM、約10 mM至約20 mM、約15 mM至約25 mM、約15 mM至約20 mM、約15 mM至約19 mM、約15 mM至約18 mM、約15 mM至約17 mM、約15 mM至約16 mM、約16 mM至約20 mM、約16 mM至約19 mM、約16 mM至約18 mM、約16 mM至約17 mM、約17 mM至約20 mM、約17 mM至約19 mM或約17 mM至約18 mM。
  88. 如請求項85至87中任一項之方法，其中該葡萄糖之濃度為約10 mM、約11 mM、約12 mM、約13 mM、約14 mM、約15 mM、約16 mM、約17 mM、約18 mM、約19 mM、約20 mM、約21 mM、約22 mM、約23 mM、約24 mM或約25 mM。
  89. 如請求項85至88中任一項之方法，其中該葡萄糖之濃度為約15.4 mM、約15.9 mM、約16.3 mM、約16.8 mM、約17.2 mM或約17.7 mM。
  90. 如請求項1至89中任一項之方法，其中該培養基進一步包含鈣離子。
  91. 如請求項90之方法，其中鈣離子之濃度超過約0.4 mM。
  92. 如請求項90或91之方法，其中該鈣離子之濃度為約0.4 mM至約2.5 mM、約0.5 mM至約2.0 mM、約1.0 mM至約2.0 mM、約1.1 mM至約2.0 mM、約1.2 mM至約2.0 mM、約1.3 mM至約2.0 mM、約1.4 mM至約2.0 mM、約1.5 mM至約2.0 mM、約1.6 mM至約2.0 mM、約1.7 mM至約2.0 mM、約1.8 mM至約2.0 mM、約1.2至約1.3 mM、約1.2至約1.4 mM、約1.2至約1.5 mM、約1.2至約1.6 mM、約1.2至約1.7 mM、約1.2至約1.8 mM、約1.3至約1.4 mM、約1.3至約1.5 mM、約1.3至約1.6 mM、約1.3至約1.7 mM、約1.3至約1.8 mM、約1.4至約1.5 mM、約1.4至約1.6 mM、約1.4至約1.7 mM、約1.4至約1.8 mM、約1.5至約1.6 mM、約1.5至約1.7 mM、約1.5至約1.8 mM、約1.6至約1.7 mM、約1.6至約1.8 mM或約1.7至約1.8 mM。
  93. 如請求項90至92中任一項之方法，其中該鈣離子之濃度為約1.0 mM、約1.1 mM、約1.2 mM、約1.3 mM、約1.4 mM、約1.5 mM、約1.6 mM、約1.7 mM、約1.8 mM、約1.9 mM或約2.0 mM。
  94. 如請求項1至93中任一項之方法，其中該培養基包含濃度為約0.1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約15 ng/mL、約1 ng/mL至約14 ng/mL、約1 ng/mL至約13 ng/mL、約1 ng/mL至約12 ng/mL、約1 ng/mL至約11 ng/mL、約1 ng/mL至約10 ng/mL、約1 ng/mL至約9 ng/mL、約1 ng/mL至約8 ng/mL、約1 ng/mL至約7 ng/mL、約1 ng/mL至約6 ng/mL、約1 ng/mL至約5 ng/mL、約1 ng/mL至約4 ng/mL、約1 ng/mL至約3 ng/mL、約1 ng/mL至約2 ng/mL、約5 ng/mL至約15 ng/mL、約5 ng/mL至約10 ng/mL、約10 ng/mL至約20 ng/mL、約10 ng/mL至約15 ng/mL或約15 ng/mL至約20 ng/mL之IL-2。
  95. 如請求項94之方法，其中該IL-2之濃度為約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2 ng/mL、約3 ng/mL、約4 ng/mL、約5 ng/mL、約6 ng/mL、約7 ng/mL、約8 ng/mL、約9 ng/mL、約10 ng/mL、約11 ng/mL、約12 ng/mL、約13 ng/mL、約14 ng/mL、約15 ng/mL、約16 ng/mL、約17 ng/mL、約18 ng/mL、約19 ng/mL或約20 ng/mL。
  96. 如請求項94或95之方法，其中該IL-2之濃度為約1.0 ng/mL。
  97. 如請求項94或95之方法，其中該IL-2之濃度為約10 ng/mL。
  98. 如請求項1至97中任一項之方法，其中該培養基包含濃度為約0.1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約15 ng/mL、約1 ng/mL至約14 ng/mL、約1 ng/mL至約13 ng/mL、約1 ng/mL至約12 ng/mL、約1 ng/mL至約11 ng/mL、約1 ng/mL至約10 ng/mL、約1 ng/mL至約9 ng/mL、約1 ng/mL至約8 ng/mL、約1 ng/mL至約7 ng/mL、約1 ng/mL至約6 ng/mL、約1 ng/mL至約5 ng/mL、約1 ng/mL至約4 ng/mL、約1 ng/mL至約3 ng/mL、約1 ng/mL至約2 ng/mL、約5 ng/mL至約15 ng/mL、約5 ng/mL至約10 ng/mL、約10 ng/mL至約20 ng/mL、約10 ng/mL至約15 ng/mL或約15 ng/mL至約20 ng/mL之IL-21。
  99. 如請求項98之方法，其中該IL-21之濃度為約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2 ng/mL、約3 ng/mL、約4 ng/mL、約5 ng/mL、約6 ng/mL、約7 ng/mL、約8 ng/mL、約9 ng/mL、約10 ng/mL、約11 ng/mL、約12 ng/mL、約13 ng/mL、約14 ng/mL、約15 ng/mL、約16 ng/mL、約17 ng/mL、約18 ng/mL、約19 ng/mL或約20 ng/mL。
  100. 如請求項98或99之方法，其中該IL-21之濃度為約1.0 ng/mL。
  101. 如請求項98或99之方法，其中該IL-21之濃度為約10 ng/mL。
  102. 如請求項1至101中任一項之方法，其中該培養基包含濃度為約0.1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約15 ng/mL、約1 ng/mL至約14 ng/mL、約1 ng/mL至約13 ng/mL、約1 ng/mL至約12 ng/mL、約1 ng/mL至約11 ng/mL、約1 ng/mL至約10 ng/mL、約1 ng/mL至約9 ng/mL、約1 ng/mL至約8 ng/mL、約1 ng/mL至約7 ng/mL、約1 ng/mL至約6 ng/mL、約1 ng/mL至約5 ng/mL、約1 ng/mL至約4 ng/mL、約1 ng/mL至約3 ng/mL、約1 ng/mL至約2 ng/mL、約5 ng/mL至約15 ng/mL、約5 ng/mL至約10 ng/mL、約10 ng/mL至約20 ng/mL、約10 ng/mL至約15 ng/mL或約15 ng/mL至約20 ng/mL之IL-7。
  103. 如請求項102之方法，其中該IL-7之濃度為約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2 ng/mL、約3 ng/mL、約4 ng/mL、約5 ng/mL、約6 ng/mL、約7 ng/mL、約8 ng/mL、約9 ng/mL、約10 ng/mL、約11 ng/mL、約12 ng/mL、約13 ng/mL、約14 ng/mL、約15 ng/mL、約16 ng/mL、約17 ng/mL、約18 ng/mL、約19 ng/mL或約20 ng/mL。
  104. 如請求項102或103之方法，其中該IL-7之濃度為約1.0 ng/mL。
  105. 如請求項102或103之方法，其中該IL-7之濃度為約10 ng/mL。
  106. 如請求項1至105中任一項之方法，其中該培養基包含濃度為約0.1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約20 ng/mL、約1 ng/mL至約15 ng/mL、約1 ng/mL至約14 ng/mL、約1 ng/mL至約13 ng/mL、約1 ng/mL至約12 ng/mL、約1 ng/mL至約11 ng/mL、約1 ng/mL至約10 ng/mL、約1 ng/mL至約9 ng/mL、約1 ng/mL至約8 ng/mL、約1 ng/mL至約7 ng/mL、約1 ng/mL至約6 ng/mL、約1 ng/mL至約5 ng/mL、約1 ng/mL至約4 ng/mL、約1 ng/mL至約3 ng/mL、約1 ng/mL至約2 ng/mL、約5 ng/mL至約15 ng/mL、約5 ng/mL至約10 ng/mL、約10 ng/mL至約20 ng/mL、約10 ng/mL至約15 ng/mL或約15 ng/mL至約20 ng/mL之IL-15。
  107. 如請求項106之方法，其中該IL-15之濃度為約0.1 ng/mL、約0.5 ng/mL、約1 ng/mL、約2 ng/mL、約3 ng/mL、約4 ng/mL、約5 ng/mL、約6 ng/mL、約7 ng/mL、約8 ng/mL、約9 ng/mL、約10 ng/mL、約11 ng/mL、約12 ng/mL、約13 ng/mL、約14 ng/mL、約15 ng/mL、約16 ng/mL、約17 ng/mL、約18 ng/mL、約19 ng/mL或約20 ng/mL。
  108. 如請求項106或107之方法，其中該IL-15之濃度為約1.0 ng/mL。
  109. 如請求項106或107之方法，其中該IL-15之濃度為約10 ng/mL。
  110. 一種人類免疫細胞群體，其藉由如請求項1至109中任一項之方法加以製備。
  111. 如請求項110之人類免疫細胞群體，其中該等人類免疫細胞包含T細胞。
  112. 如請求項110或111之人類免疫細胞群體，其中該等免疫細胞為CD3 +、CD45RO -、CCR7 +、CD45RA +、CD62L +、CD27 +、CD28 +、TCF7 +或其任何組合。
  113. 如請求項111或112之人類免疫細胞群體，其中該人類免疫細胞群體中之T細胞總數的至少約10%至至少約70%為幹細胞樣T細胞。
  114. 如請求項111至113中任一項之人類免疫細胞群體，其中該人類免疫細胞群體中之T細胞總數的至少約10%至至少約40%為CD39 -/CD69 -T細胞。
  115. 如請求項111至114中任一項之人類免疫細胞群體，其中該人類免疫細胞群體中之T細胞總數的至少約10%至至少約70%為CD39 -/TCF7 +T細胞。
  116. 如請求項111至115中任一項之人類免疫細胞群體，其包含CD8 +T細胞。
  117. 一種醫藥組合物，其包含如請求項110至116中任一項之人類免疫細胞群體及醫藥學上可接受之載劑。
  118. 一種殺死標靶細胞之方法，該方法包括使該等標靶細胞與如請求項110至116中任一項之免疫細胞群體或如請求項117之醫藥組合物在允許由該等免疫細胞殺死該等標靶細胞的條件下接觸。
  119. 一種治療有需要之患者的方法，該方法包括向該患者投與如請求項110至116中任一項之人類免疫細胞群體或如請求項117之醫藥組合物。
  120. 一種如請求項110至116中任一項之人類免疫細胞群體的用途，其用於製造用以在如請求項119之方法中治療有需要之患者的藥劑。
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