TW202328436A - 具有減弱之TGF-β受體傳訊的工程化T細胞 - Google Patents

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Abstract

本發明提供包含TGFBR2基因之工程化基因體修飾之T細胞。基因體修飾可減弱受體表面表現及/或減弱TGF-β誘導之傳訊，且允許具有此TGFBR2破壞之T細胞繼續增殖且繼續殺死標靶腫瘤細胞，即使在生理學上相關水準之TGF-β存在下。在較佳實施例中，T細胞另經工程化以表現CAR或外源性TCR。亦提供用於製造工程化T細胞之方法、包含此類T細胞群體之醫藥組合物，及治療方法。

Description

具有減弱之TGF-β受體傳訊的工程化T細胞
本發明係關於具有減弱之TGF-β受體傳訊的工程化T細胞之技術領域。
已證實，經重新引導以經由嵌合抗原受體(「CAR」)之表現或外源性T細胞受體(TCR)之表現來識別表現於腫瘤細胞上之抗原的人類T細胞在治療某些血液癌中為有效的。然而，迄今為止，部分歸因於免疫抑制性腫瘤微環境之存在，CAR-T及TCR-T方法所展示之針對實體腫瘤之功效較差。需要經改良之能夠克服實體癌之抑制性腫瘤微環境的CAR-T及TCR-T細胞方法。
轉型生長因子β (「TGF-β」)係在一些實體癌(諸如晚期轉移性實體癌)之腫瘤微環境內發現之免疫抑制性細胞介素。在一些情況下，TGF-β可限制抗腫瘤免疫反應。TGF-β之一種可能的作用機制為遏制T細胞功能性，包括T細胞之細胞毒性、增殖及細胞介素產生。不對本發明造成限制，當前咸信TGF-β結合至轉型生長因子β受體2 (「TGFBR2」)之胞外域，從而促進TGFBR2與TGFBR1之二聚。在受體二聚之後，TGFBR2激酶域使TGFBR1轉磷酸化，引起SMAD2及SMAD3之下游磷酸化以及TGF-β反應性基因之後續表現。
吾人現已發現，TGFBR2基因之靶向分裂可減弱受體表面表現及/或減弱TGF-β誘導之傳訊，且允許具有此類TGFBR2分裂之TCR-T細胞即使在存在生理學上相關水準之TGF-β之情況下仍繼續增殖且繼續殺死標靶腫瘤細胞。
因此，在第一態樣中，本發明提供包含TGFBR2基因之工程化基因體修飾之T細胞，其中工程化基因體修飾造成表面表現之TGFBR2或其可偵測部分之水準在匹配的對照細胞上表面表現之TGFBR2之水準之約20%至約60%之間。在一些實施例中，基因體修飾係在TGFBR2基因之外顯子4中。在一些實施例中，T細胞表現外源性TCR或CAR，較佳為外源性TCR。
在另一態樣中，呈現包含TGFBR2基因之工程化基因體修飾之T細胞，其中該修飾產生截短之表面表現之TGFBR2。在一些實施例中，基因體修飾係在TGFBR2基因之外顯子4中。在一些實施例中，T細胞表現外源性TCR或CAR，較佳為外源性TCR。在一些實施例中，將TCR或CAR整合至T細胞之基因體中之限定位置中。在某些實施例中，使用CRISPR，視情況使用CRISPR-Cas9進行整合。
在另一態樣中，提供用於製造此類工程化T細胞之方法。在另一態樣中，提供包含此類工程化T細胞之醫藥組合物。在另一態樣中，提供用於治療患者之方法，該等方法包含向患者投與治療有效量之工程化T細胞或包含此類工程化T細胞之醫藥組合物。
4.1. 定義
「 匹配對照細胞」為與經修飾之細胞在科學上可接受及可實行之程度上完全一致以便進行科學上有效比較之細胞。除了作為比較之標的物之基因體修飾以外，適合之對照細胞應具有相同細胞類型、相同生長條件及/或相同其他修飾。熟習此項技術者應理解，在任何給定情況下何種變數、參數及條件為相關的以便確定任何由基因體修飾產生之差異(例如，表面表現量之變化)。本申請案之內容在某些情況下提供適合之對照細胞之實例。 4.2. 包含 TGFBR2 基因之工程化基因體修飾之 T 細胞
在第一態樣中，提供包含TGFBR2基因之工程化基因體修飾之T細胞。工程化基因體修飾產生表面表現之TGFBR2或其可偵測部分之水準，其在匹配對照細胞上表面表現之TGFBR2水準之約20%至約60%之間。
在一些實施例中，工程化基因體修飾產生表面表現之TGFBR2或其可偵測部分之水準，其為匹配對照細胞上表面表現之TGFBR2水準之約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%或60%。在一些實施例中，工程化基因體修飾產生表面表現之TGFBR2或其可偵測部分之水準，其不超過匹配對照細胞上表面表現之TGFBR2水準之約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%或60%。
在一些實施例中，T細胞為CD8+ αβ T細胞、CD4+ αβ T細胞或γδ T細胞。在一些實施例中，T細胞為人類T細胞。在一些人類T細胞實施例中，T細胞係獲自癌症患者。在一些人類T細胞實施例中，T細胞係獲自健康個體。在一些人類T細胞實施例中，T細胞為獲自癌症患者或獲自健康個體之T細胞的後代細胞。
在一些實施例中，表面表現之TGFBR2或其可偵測部分能夠結合TGF-β而不使TGFBR1磷酸化。在一些實施例中，T細胞無法回應於T細胞與生理學上相關水準之TGF-β之接觸而經由Smad2/3有效地傳訊。
在各種實施例中，工程化基因體修飾包含以下中之一或多者：(i) TGFBR2基因啟動子中之插入及/或缺失；(ii) TGFBR2基因之外顯子中之框移插入及/或缺失；(iii) TGFBR2基因之一部分而非全部編碼區之缺失；(iv)天然終止密碼子上游之外顯子中的產生終止密碼子之取代、插入及/或缺失，及(v)修飾TGFBR2基因內之一或多個供體及/或受體RNA剪接位點之取代、插入及/或缺失。
在某些實施例中，基因體修飾係在TGFBR2基因之外顯子1、TGFBR2基因之外顯子2、TGFBR2基因之外顯子3、TGFBR2基因之外顯子4、TGFBR2基因之外顯子5、TGFBR2基因之外顯子6或TGFBR2基因之外顯子7中。在特定實施例中，基因體修飾係在TGFBR2基因之外顯子4中。
在各種實施例中，基因體修飾係藉由經RNA引導之核酸酶實現。在一些實施例中，經RNA引導之核酸酶為雙股斷裂誘導之核酸酶。在一些實施例中，經RNA引導之核酸酶為單股斷裂誘導之核酸酶(切口酶)。在一些實施例中，經RNA引導之核酸酶與第二酶融合。在特定實施例中，第二酶為逆轉錄酶。
在特定實施例中，基因體修飾係由在TGFBR2基因之外顯子4 (SEQ ID NO: 2)之鹼基294與295、389與390、543與544、547與548或674與675之間的經RNA引導之核酸酶切割所引起之框移。
在一些實施例中，T細胞表現外源性TCR或CAR。在某些實施例中，使用病毒方法將TCR引入T細胞中。在某些實施例中，使用將用於表現外源性TCR之基因整合至T細胞基因體中之特異性位點中之方法(例如，CRISPR-Cas9或其他CRISPR酶)將TCR引入T細胞中。
在某些較佳實施例中，T細胞表現外源性TCR。在特定實施例中，T細胞繼續表現其內源性TCR。在特定實施例中，T細胞不表現其內源性TCR。
在某些實施例中，T細胞表現CAR。在特定實施例中，CAR為第一代CAR。在一些實施例中，CAR為第二代CAR。在一些實施例中，CAR為美國專利第10,703,794號中所描述之平行CAR，該專利之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，CAR為WO 2021/058563中所描述之基於NKG2D之CAR，該專利之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，外源性TCR或CAR識別腫瘤抗原。如熟習此項技術者所瞭解，由TCR識別之「抗原」為肽-HLA複合物(pHLA)。在一些實施例中，腫瘤抗原為亦由非腫瘤細胞表現之腫瘤相關抗原。在一些實施例中，腫瘤抗原為癌症/睪丸抗原。在一些實施例中，腫瘤抗原為新抗原。在某些實施例中，新抗原為共有或公共腫瘤新抗原。在某些實施例中，新抗原為非共有或私有新抗原。
在一些實施例中，T細胞在至少兩次針對靶細胞之暴露事件之後，在存在生理學上相關水準之TGF-β之情況下維持活體外殺死表現由外源性TCR或CAR識別之抗原之靶細胞群體的能力。在一些實施例中，T細胞在存在生理學上相關水準之TGF-β之情況下，維持活體外殺死表現由外源性TCR或CAR識別之抗原之靶細胞群體的能力達至少約72、80、90、100、110、120、130、140、144、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280或288小時。
在另一態樣中，提供包含TGFBR2基因之工程化基因體修飾之T細胞。修飾產生截短之表面表現之TGFBR2。
在一些實施例中，T細胞為CD8+ αβ T細胞、CD4+ αβ T細胞或γδ T細胞。在一些實施例中，T細胞為人類T細胞。在一些人類T細胞實施例中，T細胞係獲自癌症患者。在一些人類T細胞實施例中，T細胞係獲自健康個體。在一些人類T細胞實施例中，T細胞為獲自癌症患者或獲自健康個體之T細胞的後代細胞。
在一些實施例中，表面表現之截短TGFBR2能夠結合TGF-β而不使TGFBR1磷酸化。在一些實施例中，T細胞無法回應於T細胞與生理學上相關水準之TGF-β之接觸而經由Smad2/3有效地傳訊。
在一些實施例中，工程化基因體修飾包含以下中之一或多者：(i)TGFBR2基因之外顯子4中之框移插入及/或缺失；(ii)TGFBR2基因之外顯子5至7之缺失，視情況具有外顯子4之完全或部分缺失；及(iii)外顯子4中之產生提前終止密碼子之取代、插入及/或缺失。
在某些實施例中，基因體修飾係在TGFBR2基因之外顯子1、TGFBR2基因之外顯子2、TGFBR2基因之外顯子3、TGFBR2基因之外顯子4、TGFBR2基因之外顯子5、TGFBR2基因之外顯子6或TGFBR2基因之外顯子7中。在特定實施例中，基因體修飾係在TGFBR2基因之外顯子4中。
在各種實施例中，基因體修飾係藉由經RNA引導之核酸酶實現。在一些實施例中，經RNA引導之核酸酶為雙股斷裂誘導之核酸酶。在一些實施例中，經RNA引導之核酸酶為單股斷裂誘導之核酸酶(切口酶)。在一些實施例中，經RNA引導之核酸酶與第二酶融合。在特定實施例中，第二酶為逆轉錄酶。
在特定實施例中，基因體修飾係由在TGFBR2基因之外顯子4 (SEQ ID NO: 2)之鹼基294與295、389與390、543與544、547與548或674與675之間的經RNA引導之核酸酶切割所引起之框移。
在一些實施例中，T細胞表現外源性TCR或CAR。在某些實施例中，使用病毒方法將TCR引入T細胞中。在某些實施例中，使用將用於表現外源性TCR之基因整合至T細胞基因體中之特異性位點中之方法(例如，CRISPR-Cas9或其他CRISPR酶)將TCR引入T細胞中。
在某些較佳實施例中，T細胞表現外源性TCR。在特定實施例中，T細胞繼續表現其內源性TCR。在特定實施例中，T細胞不表現其內源性TCR。
在某些實施例中，T細胞表現CAR。在特定實施例中，CAR為第一代CAR。在一些實施例中，CAR為第二代CAR。在一些實施例中，CAR為美國專利第10,703,794號中所描述之平行CAR，該專利之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，CAR為WO 2021/058563中所描述之基於NKG2D之CAR，該專利之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，T細胞表現識別腫瘤抗原之外源性TCR或CAR。如熟習此項技術者所瞭解，由TCR識別之「抗原」為肽-HLA複合物(pHLA)。在一些實施例中，腫瘤抗原為亦由非腫瘤細胞表現之腫瘤相關抗原。在一些實施例中，腫瘤抗原為癌症/睪丸抗原。在一些實施例中，腫瘤抗原為新抗原。在某些實施例中，新抗原為共有或公共腫瘤新抗原。在某些實施例中，新抗原為非共有或私有新抗原。
在一些實施例中，T細胞在至少兩次靶細胞之暴露事件之後，在生理學上相關水準之TGF-β存在下維持活體外殺死表現外源性TCR或CAR所識別之抗原之靶細胞群體的能力。在一些實施例中，T細胞在生理學上相關水準之TGF-β存在下，維持活體外殺死表現外源性TCR或CAR所識別之抗原之靶細胞群體的能力至少約72、80、90、100、110、120、130、140、144、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280或288小時。
在一些實施例中，T細胞在接觸或暴露於呈現T細胞表現之TCR所識別之抗原之腫瘤或其他細胞株之後具有增強之細胞介素反應。在某些實施例中，細胞介素為干擾素-γ、介白素-2或腫瘤壞死因子-α。 4.3. 醫藥組合物
在另一態樣中，提供包含本文中所描述之T細胞及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。在較佳實施例中，T細胞表現外源性TCR或CAR。
在各種實施例中，醫藥組合物包含本文中所描述之T細胞群體。在某些實施例中，T細胞表現外源性TCR或CAR。在特定實施例中，群體中之所有T細胞表現相同外源性TCR。在特定實施例中，群體中之所有T細胞表現相同CAR。在特定實施例中，醫藥組合物包含本文中所描述之T細胞，其中群體中之T細胞共同地表現複數個CAR。
在一些實施例中，醫藥組合物適用於藉由靜脈內輸注進行之投藥。在一些實施例中，組合物適用於瘤內投藥。 4.4. 用於 對 T 細胞進行 工程化之方法
在另一態樣中，提供用於製造本文中所描述之經TGFBR2修飾之T細胞的方法。在一些實施例中，方法包含修飾T細胞基因體中之TGFBR2基因，其中在基因修飾之後，表面表現之TGFBR2或其可偵測部分之水準在匹配的對照細胞上之表面表現之TGFBR2水準之約20%至約60%之間。
在一些實施例中，工程化基因體修飾產生表面表現之TGFBR2或其可偵測部分之水準，其為匹配的對照細胞上之表面表現之TGFBR2水準之約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%或60%。在一些實施例中，工程化基因體修飾產生表面表現之TGFBR2或其可偵測部分之水準，其不超過匹配的對照細胞上之表面表現之TGFBR2水準之約20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%或60%。
在一些實施例中，T細胞為CD8+ αβ T細胞、CD4+ αβ T細胞或γδ T細胞。在一些實施例中，T細胞為人類T細胞。在一些人類T細胞實施例中，T細胞係獲自癌症患者。在一些人類T細胞實施例中，T細胞係獲自健康個體。在一些人類T細胞實施例中，T細胞為獲自癌症患者或獲自健康個體之T細胞的後代細胞。
在一些實施例中，表面表現之TGFBR2或其可偵測部分能夠結合TGF-β而不使TGFBR1磷酸化。在一些實施例中，T細胞無法回應於T細胞與生理學上相關水準之TGF-β之接觸而經由Smad2/3有效地傳訊。
在一些實施例中，修飾為以下中之一或多者：(i) TGFBR2基因啟動子中之插入及/或缺失；(ii) TGF-βIIR基因之外顯子中之框移插入及/或缺失；(iii) TGFBR2基因之一部分而非全部編碼區之缺失；(iv)天然終止密碼子上游之外顯子中的產生終止密碼子之取代、插入及/或缺失，及(v)修飾TGFBR2基因內之一或多個供體及/或受體RNA剪接位點之取代、插入及/或缺失。在特定實施例中，修飾係在TGFBR2基因之外顯子4中。
在一些實施例中，修飾包含將經RNA引導之核酸酶及至少一個引導RNA引入T細胞中。在一些實施例中，經RNA引導之核酸酶為雙股斷裂誘導之核酸酶。在一些實施例中，經RNA引導之核酸酶為單股斷裂誘導之核酸酶(切口酶)。在一些實施例中，經RNA引導之核酸酶與第二酶融合。在特定實施例中，第二酶為逆轉錄酶。
在一些實施例中，經RNA引導之核酸酶在TGFBR2基因之外顯子4 (SEQ ID NO: 2)之鹼基294與295、389與390、543與544、547與548或674與675之間切割。在某些實施例中，至少一個引導RNA具有SEQ ID NO: 8-12之序列。
在一些實施例中，方法進一步包含選擇具有所需基因體修飾之T細胞的後續步驟。
在一些實施例中，方法進一步包含在修飾TGFBR2基因之前或之後，對T細胞進行工程化以表現CAR或外源性TCR之步驟。在某些實施例中，T細胞經工程化以表現外源性TCR。在某些實施例中，使用病毒方法將TCR引入T細胞中。在某些實施例中，使用將用於表現外源性TCR之基因整合至T細胞基因體中之特異性位點中之方法(例如，CRISPR-Cas9或其他CRISPR酶)將TCR引入T細胞中。在一些實施例中，T細胞同時表現其內源性TCR。在一些實施例中，T細胞已經進一步工程化以免表現其內源性TCR。
在一些實施例中，外源性TCR或CAR識別腫瘤抗原。在一些實施例中，腫瘤抗原為亦由非腫瘤細胞表現之腫瘤相關抗原。在一些實施例中，腫瘤抗原為癌症/睪丸抗原。在一些實施例中，腫瘤抗原為新抗原。在某些實施例中，新抗原為共有或公共腫瘤新抗原。在某些實施例中，新抗原為非共有或私有新抗原。
在各種實施例中，在修飾TGFBR2基因且進一步將T細胞工程化以表現CAR或外源性TCR之後，T細胞在至少兩次針對靶細胞之暴露事件之後，在存在生理學上相關水準之TGF-β之情況下維持活體外殺死表現由外源性TCR或CAR識別之抗原之靶細胞群體的能力。在一些實施例中，T細胞在存在生理學上相關水準之TGF-β之情況下，維持活體外殺死表現由外源性TCR或CAR識別之抗原之靶細胞群體的能力達至少約72、80、90、100、110、120、130、140、144、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280或288小時。
在另一態樣中，提供用於製造本文中所描述之經TGFBR2修飾之T細胞的方法，其中修飾係在外顯子4內且產生截短之表面表現之TGFBR2。
在一些實施例中，T細胞為CD8+ αβ T細胞、CD4+ αβ T細胞或γδ T細胞。在一些實施例中，T細胞為人類T細胞。在一些人類T細胞實施例中，T細胞係獲自癌症患者。在一些人類T細胞實施例中，T細胞係獲自健康個體。在一些人類T細胞實施例中，T細胞為獲自癌症患者或獲自健康個體之T細胞的後代細胞。
在一些實施例中，表面表現之截短TGFBR2能夠結合TGF-β而不使TGFBR1磷酸化。在一些實施例中，T細胞無法回應於T細胞與生理學上相關水準之TGF-β之接觸而經由Smad2/3有效地傳訊。
在一些實施例中，經截短之表面表現之TGFBR2係以等於或大於存在於未經修飾之T細胞中的TGFBR2之量的水準存在。在一些實施例中，經截短之表面表現之TGFBR2係以存在於未經修飾之T細胞中的TGFBR2之水準的約20%至60%之間的水準存在。
在一些實施例中，工程化基因體修飾包含以下中之一或多者：(i)TGFBR2基因之外顯子4中之框移插入及/或缺失；(ii)TGFBR2基因之外顯子5至7之缺失，視情況具有外顯子4之完全或部分缺失；及(iii)外顯子4中之產生提前終止密碼子之取代、插入及/或缺失。
在一些實施例中，修飾包含將經RNA引導之核酸酶及至少一個引導RNA引入T細胞中。在一些實施例中，經RNA引導之核酸酶為雙股斷裂誘導之核酸酶。在一些實施例中，經RNA引導之核酸酶為單股斷裂誘導之核酸酶(切口酶)。在一些實施例中，經RNA引導之核酸酶與第二酶融合。在特定實施例中，第二酶為逆轉錄酶。
在一些實施例中，經RNA引導之核酸酶在TGFBR2基因之外顯子4 (SEQ ID NO: 2)之鹼基294與295、389與390、543與544、547與548或674與675之間切割。在某些實施例中，至少一個引導RNA具有SEQ ID NO: 8-12之序列。
在一些實施例中，方法進一步包含選擇具有所需基因體修飾之T細胞的後續步驟。
在一些實施例中，方法進一步包含在修飾TGFBR2基因之前或之後，使T細胞工程化以表現CAR或外源性TCR之步驟。在某些實施例中，T細胞經工程化以表現外源性TCR。在某些實施例中，使用病毒方法將TCR引入T細胞中。在某些實施例中，使用將用於表現外源性TCR之基因整合至T細胞基因體中之特異性位點中之方法(例如，CRISPR-Cas9或其他CRISPR酶)將TCR引入T細胞中。在一些實施例中，T細胞同時表現其內源性TCR。在一些實施例中，T細胞已經進一步工程化以免表現其內源性TCR。
在一些實施例中，外源性TCR或CAR識別腫瘤抗原。在一些實施例中，腫瘤抗原為亦由非腫瘤細胞表現之腫瘤相關抗原。在一些實施例中，腫瘤抗原為癌症/睪丸抗原。在一些實施例中，腫瘤抗原為新抗原。在某些實施例中，新抗原為共有或公共腫瘤新抗原。在某些實施例中，新抗原為非共有或私有新抗原。
在各種實施例中，在修飾TGFBR2基因且進一步使T細胞工程化以表現CAR或外源性TCR之後，T細胞在至少兩次針對靶細胞之暴露事件之後，在存在生理學上相關水準之TGF-β之情況下維持活體外殺死表現由外源性TCR或CAR識別之抗原之靶細胞群體的能力。在一些實施例中，T細胞在存在生理學上相關水準之TGF-β之情況下，維持活體外殺死表現由外源性TCR或CAR識別之抗原之靶細胞群體的能力達至少約72、80、90、100、110、120、130、140、144、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280或288小時。
在另一態樣中，提供藉由本文中所描述之方法產生之工程化T細胞。 4.5. 用於治療疾病之方法
在另一態樣中，提供用於治療需要治療之個體之方法。在典型實施例中，個體為人類患者。方法包含向個體(通常為人類患者)投與治療有效量之本文中所描述之工程化T細胞或本文中所描述之包含此類工程化T細胞之醫藥組合物。
在一些實施例中，工程化T細胞係由獲自所治療之患者(自體治療)之T細胞或獲自所治療之患者(自體治療)之T細胞後代進行工程化。在一些實施例中，工程化T細胞係由獲自一或多個除所治療之患者(異體治療)以外之個體的T細胞或獲自一或多個除所治療之患者(異體治療)以外之個體的T細胞後代進行工程化。
在一些實施例中，工程化T細胞係藉由靜脈內輸注進行投與。在一些實施例中，工程化T細胞係藉由瘤內投藥進行投與。
在一些實施例中，工程化T細胞在接觸或暴露於腫瘤或其他細胞株之後具有增強之細胞介素反應，該腫瘤或其他細胞株呈遞由T細胞表現之TCR所識別之抗原。在某些實施例中，細胞介素為干擾素-γ或腫瘤壞死因子-α。 4.6. 實例 4.6.1. 實例 1 ： TGFBR2 分裂 、 表現 TCR 之 T 細胞對 TGF- β 傳訊具有抗性
此實例展示，在經進一步工程化以表現外源性TCR之T細胞中分裂TGFBR2基因會減弱TGFBR2之表面表現且使得T細胞對TGF-β傳訊具有抗性。
合成將基因編輯核酸酶靶向人類TGFBR2外顯子1 (TGFBR2之胞外域)或外顯子4 (TGFBR2之激酶域)中之各種位點的gRNA。 圖 1為展示由各gRNA引導之核酸酶裂解位點之位置的示意圖。外顯子1及4之序列呈現於以下表1中。外顯子序列係自Ensembl典型轉錄物ENST00000295754.10提取。gRNA之標靶序列呈現於以下表2中，其中展示TGFBR2 gRNA標靶序列(5'-3')，其中預測切割位點用(|)描繪且PAM位點以粗體表示。表2亦指示標靶是否在TGFBR2基因之正義(+)或反義(-)股上。
表1 TGFBR2 標靶外顯子序列
TGFBR2 標靶外顯子 序列(5'-3')
外顯子1 (SEQ ID NO:1) ACTCGCGCGCACGGAGCGACGACACCCCCGCGCGTGCACCCGCTCGGGACAGGAGCCGGACTCCTGTGCAGCTTCCCTCGGCCGCCGGGGGCCTCCCCGCGCCTCGCCGGCCTCCAGGCCCCCTCCTGGCTGGCGAGCGGGCGCCACATCTGGCCCGCACATCTGCGCTGCCGGCCCGGCGCGGGGTCCGGAGAGGGCGCGGCGCGGAGGCGCAGCCAGGGGTCCGGGAAGGCGCCGTCCGCTGCGCTGGGGGCTCGGTCTATGACGAGCAGCGGGGTCTGCCATGGGTCGGGGGCTGCTCAGGGGCCTGTGGCCGCTGCACATCGTCCTGTGGACGCGTATCGCCAGCACGATCCCACCGCACGTTCAGAAGTCGG
外顯子4 (SEQ ID NO:2) AATATAACACCAGCAATCCTGACTTGTTGCTAGTCATATTTCAAGTGACAGGCATCAGCCTCCTGCCACCACTGGGAGTTGCCATATCTGTCATCATCATCTTCTACTGCTACCGCGTTAACCGGCAGCAGAAGCTGAGTTCAACCTGGGAAACCGGCAAGACGCGGAAGCTCATGGAGTTCAGCGAGCACTGTGCCATCATCCTGGAAGATGACCGCTCTGACATCAGCTCCACGTGTGCCAACAACATCAACCACAACACAGAGCTGCTGCCCATTGAGCTGGACACCCTGGTGGGGAAAGGTCGCTTTGCTGAGGTCTATAAGGCCAAGCTGAAGCAGAACACTTCAGAGCAGTTTGAGACAGTGGCAGTCAAGATCTTTCCCTATGAGGAGTATGCCTCTTGGAAGACAGAGAAGGACATCTTCTCAGACATCAATCTGAAGCATGAGAACATACTCCAGTTCCTGACGGCTGAGGAGCGGAAGACGGAGTTGGGGAAACAATACTGGCTGATCACCGCCTTCCACGCCAAGGGCAACCTACAGGAGTACCTGACGCGGCATGTCATCAGCTGGGAGGACCTGCGCAAGCTGGGCAGCTCCCTCGCCCGGGGGATTGCTCACCTCCACAGTGATCACACTCCATGTGGGAGGCCCAAGATGCCCATCGTGCACAGGGACCTCAAGAGCTCCAATATCCTCGTGAAGAACGACCTAACCTGCTGCCTGTGTGACTTTGGGCTTTCCCTGCGTCTGGACCCTACTCTGTCTGTGGATGACCTGGCTAACAGTGGGCAG
表 2 TGFBR2 gRNA 標靶序列
TGFBR2 gRNA ID 標靶序列(5 '-3 ') 靶向TGFBR2 外顯子 正義 (+) 或反義 (-) 股 靶向TGFBR2 域 SEQ ID NO:
TGFBR2 gRNA 1 TGCTGGCGATACGCGTC |CAC AGG 1 - ECD 3
TGFBR2 gRNA 4 TCGGTCTATGACGAGCA |GCG GGG 1 + ECD 4
TGFBR2 gRNA 5 AACGTGCGGTGGGATCG |TGC TGG 1 - ECD 5
TGFBR2 gRNA 6 GGACGATGTGCAGCGGC |CAC AGG 1 - ECD 6
TGFBR2 gRNA 7 CTCGGTCTATGACGAGC |AGC GGG 1 + ECD 7
TGFBR2 gRNA 15 CAAGAGGCATACTCCTC |ATA GGG 4 - ICD 8
TGFBR2 gRNA 16 CCACGCCAAGGGCAACC |TAC AGG 4 + ICD 9
TGFBR2 gRNA 17 CCAAGATGCCCATCGTG |CAC AGG 4 + ICD 10
TGFBR2 gRNA 20 AAAGCGACCTTTCCCCA |CCA GGG 4 - ICD 11
TGFBR2 gRNA 22 GCCGCGTCAGGTACTCC |TGT AGG 4 - ICD 12
用抗CD3/CD28珠粒(Thermo Fisher，#40203D)以3:1比率(珠粒:CD3 +細胞)活化健康供體人類T細胞48小時，接著使用Lonza 4D核轉染(nucleofector)系統、程式EH-115，用1 μM 靶向TGFBR2之RNP (CRISPR-Cas9 gRNA核糖核蛋白)進行電穿孔。同時，剔除內源性TCR且誘發外源性TCR (1G4)之表現。在T細胞於含有5%人類血清(Sigma-Aldrich, #H4522)、1% glutamax (Thermo Fisher, #35050061)、5 μg/mL之慶大黴素(gentamicin) (Thermo Fisher, #15750037)、IL-7 (5 ng/mL) (Peprotech, #200-07)及IL-15 (5 ng/mL) (Peprotech, #200-15)之AIM-V培養基(Thermo Fisher, #A3830801)中擴增7天後，T細胞用或不用TGF-β (20 ng/mL) (R&D systems, #240-B-010/CF)處理30分鐘，隨後用偵測磷酸化SMAD2/3蛋白質之抗體(BD Bioscience, #562696)進行細胞內染色。
如 圖 2A及 圖 2B中所示，缺乏TGFBR2編輯及1G4 TCR表現(「未經編輯」)之T細胞及缺乏TGFBR2編輯但表現外源性1G4 TCR(「僅1G4」)之T細胞在TGF-β處理之後顯示磷酸化SMAD2/3增加，而許多TGFBR2破壞、表現1G4 TCR之T細胞未顯示任何增加。一些TGFBR2外顯子1經編輯、表現1G4 TCR之T細胞及所有TGFBR2外顯子4經編輯、表現1G4 TCR之T細胞完全對TGF-β傳訊具有抗性。
如 圖 3中所示，gRNA 4及7引導對TGFBR2基因之編輯，其在減弱表現1G4 TCR之T細胞上之TGFBR2表面表現為無效的。所有其他測試之TGFBR2 gRNA造成TGFBR2表面表現減弱，包括所有靶向外顯子4之gRNA (圖3)。儘管與對照細胞相比，所有靶向胞內激酶域(外顯子4)之TGFBR2 gRNA均使TGFBR2之表面表現減弱，但與表面表現成功減弱(gRNA TGFBR2-1、TGFBR2-5及TGFBR2-6)之外顯子1 (胞外域)經編輯之細胞相比，外顯子4經編輯之T細胞顯示較高之TGFBR2表面表現之趨勢。表面表現資料呈現於以下表3中。
表 3 經 TGFBR2 編輯之 T 細胞之 TGFBR2 中值螢光強度 (MFI)
樣品 TGFBR2 MFI
複本 1 複本2 平均值
僅1G4 TCR 606 671 638.5
TGFBR2-1 248 244 246
TGFBR2-4 733 707 720
TGFBR2-5 277 237 257
TGFBR2-6 253 250 251.5
TGFBR2-7 628 660 644
TGFBR2-13 320 322 321
TGFBR2-15 352 371 361.5
TGFBR2-16 299 362 330.5
TGFBR2-17 345 325 335
TGFBR2-20 347 293 320
TGFBR2-22 302 306 304
4.6.2. 實例 2 ： TGFBR2 分裂、表現 TCR 之 T 細胞在存在 TGF- β 之情況下展現優良功能性
此實例展示TGFBR2分裂之T細胞在多輪抗原暴露後維持細胞毒性活性之能力。
如實例1自健康人類供體產生表現1G4 TCR、TGFBR2分裂之T細胞。T細胞在含有5%人類血清(Sigma-Aldrich, #H4522)、1% glutamax (Thermo Fisher, #35050061)、5 μg/mL之慶大黴素(Thermo Fisher, #15750037)、IL-7 (5 ng/mL) (Peprotech, #200-07)及IL-15 (5 ng/mL) (Peprotech, #200-15)之AIM-V培養基(Thermo Fisher, #A3830801)中擴增14天後，使用IncuCyte平台使T細胞經歷重複細胞毒性分析法。
在存在或不存在外源性TGF-β (20 ng/mL) (R&D systems, #240-B-010/CF)之情況下，以5:1之效應子與標靶之比率將T細胞與表現GFP之A375細胞共同培養約72小時，該等表現GFP之A375細胞表現1G4 TCR同源抗原，即NY-ESO-1與HLA-A*02:01之肽HLA (pHLA)複合物。接著，收集T細胞且與新鮮的A375-GFP +細胞共同培養總共4輪之腫瘤攻擊。每2小時使用10X物鏡獲得影像且藉由量測共培養物中之剩餘GFP +A375細胞之數目來測定T細胞之細胞毒性。
在第1輪期間，所有表現1G4 TCR之T細胞能夠在存在或不存在TGF-β之情況下控制A375-GFP +細胞生長( 圖 4A 至圖 4D)。
在第2輪期間，TGFBR2未分裂、表現1G4之T細胞(「僅1G4 TCR」)在存在TGF-β之情況下無法再控制A375-GFP +細胞之生長( 圖 4A)。在第二及後續腫瘤細胞攻擊輪次期間，無論在存在或不存在TGF-β之情況下，具有減弱之TGFBR2表現及減弱之TGF-β傳訊能力的TGFBR2分裂之T細胞能夠繼續殺死A375-GFP +細胞( 圖 4B，外顯子1分裂； 圖 4C，外顯子4分裂)。在存在TGF-β之情況下，仍保留一些功能性TGF-β傳訊( 圖 2)之經TGFBR2 gRNA 4編輯及經TGFBR2 gRNA 7編輯之T細胞在第二輪殺死開始具有減弱之控制A375-GFP +細胞生長之能力( 圖 4B)。
在不存在外源性TGF-β之情況下，僅表現1G4 TCR之T細胞在第3輪及第4輪腫瘤細胞攻擊期間喪失其細胞毒性功能，而在不存在TGF-β之情況下，TGFBR2分裂之T細胞繼續控制A375-GFP +細胞之生長( 圖 4A、 圖 4B及 圖 4C)。最終第4輪之A375-GFP +細胞計數展示於 圖 4D中。
此等資料證實，TGFBR2分裂之T細胞對TGF-β介導之細胞毒性功能之抑制具有抗性，且在存在或不存在外源性TGF-β之情況下在殺死抗原陽性腫瘤細胞方面更強效。 4.6.3. 實例 3 ： TGFBR2 分裂、表現 TCR 之 T 細胞在存在 TGF- β 之情況下維持增殖能力
此實例展示，TGFBR2分裂之T細胞能夠在存在TGF-β之情況下繼續增殖。
在存在或不存在TGF-β (20 ng /mL) (R&D systems, #240-B-010/CF)之情況下，使用ImmunoCult (抗CD3/CD28/CD2) (Stem Cell Technologies, #10990)使表現1G4 TCR、TGFBR2分裂之T細胞經歷重複再刺激。藉由每週對T細胞進行計數來定量T細胞增殖( 圖 5)。儘管僅表現1G4 TCR之T細胞無法在存在TGF-β之情況下擴增，但TGFBR2分裂之T細胞維持其增殖能力達到與在不存在TGF-β之情況下相同之程度。與其他TGFBR2分裂之T細胞相比，仍保留一些功能性TGF-β傳訊之經TGFBR2 gRNA 4編輯及經TGFBR2 gRNA 7編輯之T細胞在存在TGF-β之情況下更緩慢地擴增( 圖 2)。
此資料證實，TGFBR2 KO T細胞對經TGF-β介導之增殖抑制具有抗性，且可在存在TGF-β之情況下維持其增殖能力。 4.6.4. 實例 4 ： TGFBR2 分裂、表現 TCR 之 T 細胞具有類似之 TCR 表現量。
此實例展示，TGFBR2分裂之T細胞表現與非分裂細胞類似的水準之外源性TCR。
藉由使用用於插入TRAC基因座中之同源臂對靶向TGFBR2、TRAC及TRBC之Cas9-gRNA核糖核蛋白複合物(RNP)及編碼對甲胺喋呤具有抗性之突變型DHFR基因的同源定向修復DNA模板及在Cβ域中含有mur6抗原決定基之外源性TCR進行共電穿孔來將TCR植入、TGFBR2分裂之T細胞工程化(如美國專利申請案第17/557,514號中所描述，其以全文引用之方式併入本文中)。
細胞在電穿孔之後擴增七天，且接著根據美國專利公開案第2022/0041999號(以全文引用之方式併入本文中)中所描述之方法使用甲胺喋呤來選擇。藉由用識別人類TCRαβ複合物(抗體純系IP26)之抗體進行染色來測定內源性TCR之表現。用識別mur6抗原決定基(H57)之抗體來偵測外源性TCR之表現。
在電穿孔之後七天，在電穿孔之後七天之選擇之前及在電穿孔之後14天之選擇之後，T細胞在所有測試條件(無TGFBR2分裂、具有三種不同目標序列之TGFBR2分裂及AAVS1對照KO)下以等效水準表現外源性TCR ( 圖 5)。
此資料證實，TGFBR2 KO T細胞不具有減弱之表現外源性TCR之能力。 5. 等效物及以引用之方式併入
儘管已參考較佳實施例及各種替代實施例來特定展示且描述本發明，但將理解，在不脫離本發明之精神及範疇之情況下，熟習相關技術者可在其中對形式及細節作出各種改變。
本說明書正文內所引用之所有參考文獻、所頒予專利及專利申請案均以全文引用之方式併入本文中以用於所有目的。
根據以下說明及隨附圖式將更好地理解本發明之此等及其他特徵、態樣及優點，其中：
圖 1提供描繪人類TGF-β受體2基因(「TGFBR2」)之外顯子結構之示意圖。人類TGFBR2基因包含7個外顯子，其自N端至C端編碼胞外域、跨膜域及激酶域。展示用於將經RNA引導之核酸酶分別靶向外顯子1 (TGFBR2 gRNA1-gRNA7)及外顯子4 (TGFBR2 gRNA15-gRNA22)之引導RNA (「gRNA」)的結合位點。gRNA標靶序列呈現於表2中。
圖 2A及 圖 2B呈現資料，其展示使TGFBR2基因分裂之經RNA引導之核酸酶編輯使得T細胞對經TGF-β誘導之磷酸化Smad2/3上調具有抗性。健康供體人類T細胞經工程化以表現1G4 TCR，且接著用各種TGFBR2 gRNA RNP複合物電穿孔。接著，在存在或不存在TGF-β (20 ng/mL)之情況下，將表現1G4 TCR之經TGFBR2編輯之T細胞一式兩份地培養30分鐘，且接著用偵測磷酸化Smad2/3蛋白質之抗體進行細胞內染色。 圖 2A呈現流式細胞分析技術直方圖，其描繪在用(灰色)或不用(黑色) TGF-β處理之後的磷酸化Smad2/3表現。峰尺寸係相對於各曲線之眾數值而標準化。 圖 2B概述TGF-β處理後之磷酸化Smad2/3中值螢光強度(「MFI」)之倍數變化。誤差條表示兩個複本之標準差。
圖 3呈現資料，其展示藉由經RNA引導之核酸酶編輯來分裂T細胞中之TGFBR2基因會引起TGFBR2表面表現減弱。健康供體人類T細胞經工程化以表現1G4 TCR，且接著用靶向TGFBR2之胞外域(「ECD」) (gRNA 1及4-7)或胞內激酶域(「ICD」) (gRNA 15-17、20及22)之各種臨床級TGFBR2 gRNA RNP複合物電穿孔。在編輯之後四天，藉由用抗TGFBR2抗體進行表面染色來分析TGFBR2表面表現。TGFBR2表現係相對於在無TGFBR2基因編輯之情況下經工程化以表現1G4 TCR的T細胞中之TGFBR2中值螢光強度而標準化。誤差條表示兩個複本之標準差。
圖 4A 至圖 4D呈現資料，其展示在存在TGF-β之情況下，在TGFBR2基因中具有經核酸酶介導之分裂的T細胞在重複腫瘤細胞攻擊之後具有優良的細胞毒性功能。使用IncuCyte平台使表現1G4 TCR之T細胞(對照)及具有各種針對TGFBR2基因之經編輯之分裂的表現1G4 TCR之T細胞經歷重複細胞毒性分析法。在存在或不存在外源性TGF-β (20 ng/mL)之情況下，以5:1之效應子與標靶之比率將T細胞與A375-GFP +靶細胞一起培養約72小時，隨後捕獲T細胞且與新鮮的A375-GFP +細胞再一起培養總共4輪。A375-GFP +細胞殺死係每2小時使用10X物鏡進行成像且藉由對培養物中之剩餘GFP +細胞進行計數來定量。 圖 4A展示，在存在及不存在TGF-β之情況下，當A375-GFP +靶細胞在存在不含外源性1G4 TCR且不具有任何針對TGFBR2基因之編輯之T細胞(「未經編輯」)、不具有針對TGFBR2基因之編輯的表現1G4之T細胞(「僅1G4 TCR」)及不存在T細胞(「無T細胞」)之情況下培養時的A375-GFP +細胞計數。 圖 4B展示，在存在及不存在TGF-β之情況下，當A375-GFP +靶細胞在存在T細胞之情況下培養時的A375-GFP +細胞計數，該等T細胞表現外源性1G4 TCR且其中使用靶向外顯子1之gRNA分裂TGFBR2基因(TGFBR2-1至TGFBR2-7)。 圖 4C展示，在存在及不存在TGF-β之情況下，當A375-GFP +靶細胞在存在T細胞之情況下培養時的A375-GFP +細胞計數，該等T細胞表現外源性1G4 TCR且其中使用靶向外顯子4之gRNA分裂TGFBR2基因(TGFBR2-15、TGFBR2-16、TGFBR2-17、TGFBR2-20、TGFBR2-22)。誤差條表示三個複本之標準差。 圖 4D係編輯在4輪攻擊之後的A375-GFP +細胞計數的直方圖。誤差條表示三個複本之標準差。
圖 5呈現表明在TGFBR2基因中具有經核酸酶介導之分裂的T細胞在存在TGF-β之情況下維持其增殖能力的資料。在存在或不存在外源性TGF-β (20 ng/mL)之情況下，使用ImmunoCult (10 µL/mL)使TGFBR2分裂、表現1G4 TCR之T細胞經歷重複再刺激。藉由每週對T細胞進行計數來定量T細胞增殖。誤差條表示兩個複本之標準差。
圖 6呈現表明TGFBR2基因之經核酸酶介導之分裂不會改變外源性TCR之表現的資料。細胞用偵測內源性TCR (「huTCR」)或經mur6抗原決定基標記之外源性TCR (「mur6」)之抗體進行染色。在電穿孔之後7天以及在電穿孔及含有TCR修復模板之細胞之選擇之後14天，在三個不同分裂位點中之經植入之TCR之FACS圖為類似的。

Claims (84)

  1. 一種T細胞，其包含TGFBR2基因之工程化基因體修飾， 其中該工程化基因體修飾造成表面表現之TGFBR2或其可偵測部分之水準在匹配的對照細胞上表面表現之TGFBR2之水準之約20%至約60%之間。
  2. 如請求項1之T細胞，其中該T細胞為CD8+ αβ T細胞、CD4+ αβ T細胞，或γδ T細胞。
  3. 如前述請求項中任一項之T細胞，其中該T細胞為人類T細胞。
  4. 如前述請求項中任一項之T細胞，其中該表面表現之TGFBR2或其可偵測部分能夠結合TGF-β而不使TGFBR1磷酸化。
  5. 如前述請求項中任一項之T細胞，其中該T細胞不能對於該T細胞與生理學上相關水準之TGF-β接觸反應而經由Smad2/3有效地傳訊。
  6. 如前述請求項中任一項之T細胞，其中該工程化基因體修飾包含以下中之一或多者：(i)在TGFBR2基因啟動子中之插入及/或缺失；(ii)在該TGFBR2基因之外顯子中之框移插入及/或缺失；(iii)該TGFBR2基因之一部分而非全部編碼區之缺失；(iv)在天然終止密碼子上游之外顯子中產生終止密碼子之取代、插入及/或缺失，及(v)修飾該TGFBR2基因內之一或多個供體及/或接受體位點RNA剪接位點之取代、插入及/或缺失。
  7. 如前述請求項中任一項之T細胞，其中該基因體修飾係在該TGFBR2基因之外顯子4中。
  8. 如請求項7之T細胞，其中該基因體修飾係由該TGFBR2基因之外顯子4 (SEQ ID NO: 2)之鹼基294與295、389與390、543與544、547與548、或674與675之間經RNA引導之核酸酶切割所引起之框移。
  9. 如前述請求項中任一項之T細胞，其中該T細胞表現外源性TCR或CAR，較佳為外源性TCR。
  10. 如請求項9之T細胞，其中該T細胞表現外源性TCR。
  11. 如請求項10之T細胞，其中該外源性TCR識別腫瘤抗原，較佳為腫瘤新抗原。
  12. 如請求項11之T細胞，其中該腫瘤抗原為新抗原。
  13. 如請求項12之T細胞，其中該腫瘤抗原為共有腫瘤新抗原。
  14. 如請求項12之T細胞，其中該腫瘤抗原為非共有腫瘤新抗原。
  15. 如請求項9至14中任一項之T細胞，其中該T細胞在至少兩次靶細胞之暴露事件之後，在生理學上相關水準之TGF-β存在下，維持活體外殺死表現該外源性TCR或CAR所識別之抗原之靶細胞群體的能力。
  16. 如請求項9至15中任一項之T細胞，其中該T細胞在生理學上相關水準之TGF-β存在下，維持活體外殺死表現該外源性TCR或CAR所識別之抗原之靶細胞群體的能力至少約72、80、90、100、110、120、130、140、144、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280或288小時。
  17. 一種包含TGFBR2基因之工程化基因體修飾之T細胞，其中該修飾產生截短之表面表現之TGFBR2。
  18. 如請求項17之T細胞，其中該T細胞為CD8+ αβ T細胞、CD4+ αβ T細胞，或γδ T細胞。
  19. 如請求項17或請求項18之T細胞，其中該T細胞為人類T細胞。
  20. 如請求項17至19中任一項之T細胞，其中該經截短之表面表現之TGFBR2能夠結合TGF-β而不使TGFBR1磷酸化。
  21. 如請求項17至20中任一項之T細胞，其中該T細胞不能對於該T細胞與生理學上相關水準之TGF-β接觸反應而經由Smad2/3有效地傳訊。
  22. 如請求項17至21中任一項之T細胞，其中該工程化基因體修飾包含以下中之一或多者：(i)在該TGFBR2基因之外顯子4中之框移插入及/或缺失；(ii)該TGFBR2基因之外顯子5至7之缺失，視情況具有外顯子4之完全或部分缺失；及(iii)在外顯子4中產生提前終止密碼子之取代、插入及/或缺失。
  23. 如請求項22之T細胞，其中該基因體修飾係由該TGFBR2基因之外顯子4 (SEQ ID NO: 2)之鹼基294與295、389與390、543與544、547與548、或674與675之間經RNA引導之核酸酶切割所引起之框移。
  24. 如請求項17至23中任一項之T細胞，其中該T細胞表現外源性TCR或CAR，較佳為外源性TCR。
  25. 如請求項24之T細胞，其中該T細胞表現外源性TCR。
  26. 如請求項25之T細胞，其中該外源性TCR識別腫瘤抗原，較佳為腫瘤新抗原。
  27. 如請求項26之T細胞，其中該腫瘤抗原為新抗原。
  28. 如請求項27之T細胞，其中該腫瘤抗原為共有腫瘤新抗原。
  29. 如請求項27之T細胞，其中該腫瘤抗原為非共有腫瘤新抗原。
  30. 如請求項24至29中任一項之T細胞，其中該T細胞在至少兩次靶細胞之暴露事件之後，在生理學上相關水準之TGF-β存在下，維持活體外殺死表現該外源性TCR或CAR所識別之抗原之靶細胞群體的能力。
  31. 如請求項24至30中任一項之T細胞，其中該T細胞在生理學上相關水準之TGF-β存在下，維持活體外殺死表現該外源性TCR或CAR所識別之抗原之靶細胞群體的能力至少約72、80、90、100、110、120、130、140、144、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280或288小時。
  32. 一種醫藥組合物，其包含如前述請求項中任一項之T細胞及醫藥學上可接受之載劑。
  33. 如請求項32之醫藥組合物，其中該組合物適於藉由靜脈內輸注投藥。
  34. 如請求項32之醫藥組合物，其中該組合物適於瘤內投藥。
  35. 一種對T細胞進行工程化之方法，其包含修飾T細胞基因體中之TGFBR2基因，其中在基因修飾之後，表面表現之TGFBR2或其可偵測部分之水準在匹配的對照細胞上表面表現之TGFBR2之水準之約20%至約60%之間。
  36. 如請求項35之方法，其中該T細胞為CD8+ αβ T細胞、CD4+ αβ T細胞，或γδ T細胞。
  37. 如請求項35或請求項36中任一項之方法，其中該T細胞為人類T細胞。
  38. 如請求項35至37中任一項之方法，其中該表面表現之TGFBR2或其可偵測部分能夠結合TGF-β而不使TGFBR1磷酸化。
  39. 如請求項35至38中任一項之方法，其中該修飾阻止該T細胞對於該T細胞與生理學上相關水準之TGF-β接觸反應而經由Smad2/3有效地傳訊。
  40. 如請求項35至39中任一項之方法，其中該修飾為以下中之一或多者：(i) 在TGFBR2基因啟動子中之插入及/或缺失；(ii)在該TGFBR2基因之外顯子中之框移插入及/或缺失；(iii)該TGFBR2基因之一部分而非全部編碼區之缺失；(iv)在天然終止密碼子上游之外顯子中產生終止密碼子之取代、插入及/或缺失，及(v)修飾該TGFBR2基因內之一或多個供體及/或接受體RNA剪接位點之取代、插入及/或缺失。
  41. 如請求項40之方法，其中該修飾係在該TGFBR2基因之外顯子4中。
  42. 如請求項35至41中任一項之方法，其中修飾包含將經RNA引導之核酸酶及至少一個引導RNA引入該T細胞中。
  43. 如請求項42之方法，其中該經RNA引導之核酸酶在該TGFBR2基因之外顯子4 (SEQ ID NO: 2)之鹼基294與295、389與390、543與544、547與548、或674與675之間切割。
  44. 如請求項43之方法，其中該至少一個引導RNA中之至少一者具有SEQ ID NO: 8-12之序列。
  45. 如請求項35至44中任一項之方法，其進一步包含選擇具有所需基因體修飾之T細胞的後續步驟。
  46. 如請求項35至45中任一項之方法，其進一步包含在修飾該TGFBR2基因之前或之後，對該T細胞進行工程化以表現外源性TCR或CAR、較佳為外源性TCR之步驟。
  47. 如請求項46之方法，其中該T細胞經工程化以表現外源性TCR。
  48. 如請求項47之方法，其中該外源性TCR識別腫瘤抗原，較佳為腫瘤新抗原。
  49. 如請求項48之方法，其中該腫瘤抗原為新抗原。
  50. 如請求項49之方法，其中該腫瘤抗原為共有腫瘤新抗原。
  51. 如請求項49之方法，其中該腫瘤抗原為非共有腫瘤新抗原。
  52. 如請求項35至51中任一項之方法，其中該T細胞在至少兩次靶細胞之暴露事件之後，在生理學上相關水準之TGF-β存在下，維持活體外殺死表現該外源性TCR或CAR所識別之抗原之靶細胞群體的能力。
  53. 如請求項35至52中任一項之T細胞，其中該T細胞在生理學上相關水準之TGF-β存在下，維持活體外殺死表現該外源性TCR或CAR所識別之抗原之靶細胞群體的能力至少約72、80、90、100、110、120、130、140、144、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280或288小時。
  54. 一種對T細胞進行工程化之方法，其包含修飾該T細胞基因體中之TGFBR2基因，其中該修飾係在外顯子4內且產生截短之表面表現之TGFBR2。
  55. 如請求項54之方法，其中該T細胞為CD8+ αβ T細胞、CD4+ αβ T細胞，或γδ T細胞。
  56. 如請求項54或請求項55之方法，其中該T細胞為人類T細胞。
  57. 如請求項54至56中任一項之方法，其中該表面表現之TGFBR2或其可偵測部分能夠結合TGF-β而不使TGFBR1磷酸化。
  58. 如請求項54至57中任一項之方法，其中該修飾阻止該T細胞對於該T細胞與生理學上相關水準之TGF-β接觸反應而經由Smad2/3有效地傳訊。
  59. 如請求項54至58中任一項之方法，其中該經截短之表面表現之TGFBR2係以等於或大於未經修飾之T細胞中存在之TGFBR2量的水準存在。
  60. 如請求項54至58中任一項之方法，其中該經截短之表面表現之TGFBR2係以未經修飾之T細胞中存在的TGFBR2水準的約20%至60%之間的水準存在。
  61. 如請求項54至60中任一項之方法，其中該工程化基因體修飾包含以下中之一或多者：(i)在該TGFBR2基因之外顯子4中之框移插入及/或缺失；(ii)該TGFBR2基因之外顯子5至7之缺失，視情況具有外顯子4之完全或部分缺失；及(iii)在外顯子4中之產生提前終止密碼子之取代、插入及/或缺失。
  62. 如請求項54至61中任一項之方法，其中修飾包含將經RNA引導之核酸酶及至少一個引導RNA引入該T細胞中。
  63. 如請求項62之方法，其中該經RNA引導之核酸酶在該TGFBR2基因之外顯子4 (SEQ ID NO: 2)之鹼基294與295、389與390、543與544、547與548、或674與675之間切割。
  64. 如請求項63之方法，其中該至少一個引導RNA中之至少一者具有SEQ ID NO: 8-12之序列。
  65. 如請求項54至64中任一項之方法，其進一步包含選擇具有所需基因體修飾之T細胞的後續步驟。
  66. 如請求項54至65中任一項之方法，其進一步包含在修飾該TGFBR2基因之前或之後，對該T細胞進行工程化以表現外源性TCR或CAR、較佳為外源性TCR之步驟。
  67. 如請求項66之方法，其中該T細胞經工程化以表現外源性TCR。
  68. 如請求項67之方法，其中該外源性TCR識別腫瘤抗原，較佳為腫瘤新抗原。
  69. 如請求項68之方法，其中該腫瘤抗原為新抗原。
  70. 如請求項69之方法，其中該腫瘤抗原為共有腫瘤新抗原。
  71. 如請求項69之方法，其中該腫瘤抗原為非共有腫瘤新抗原。
  72. 如請求項54至71中任一項之方法，其中該T細胞在至少兩次靶細胞之暴露事件之後，在生理學上相關水準之TGF-β存在下，維持活體外殺死表現該外源性TCR或CAR所識別之抗原之靶細胞群體的能力。
  73. 如請求項35至52中任一項之方法，其中該T細胞在生理學上相關水準之TGF-β存在下，維持活體外殺死表現該外源性TCR或CAR所識別之抗原之靶細胞群體的能力至少約72、80、90、100、110、120、130、140、144、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280或288小時。
  74. 一種工程化T細胞，其係藉由如請求項35至73中任一項之方法產生。
  75. 一種醫藥組合物，其包含如請求項74之工程化T細胞及醫藥學上可接受之載劑。
  76. 一種用於治療患者之方法，其包含：向患者投與治療有效量之如請求項1至31中任一項之工程化T細胞或如請求項32或請求項75之醫藥組合物。
  77. 如請求項9至16、24至31中任一項之T細胞或如請求項74之工程化T細胞，其中該外源性TCR或CAR已使用位點特異性整合來工程化至該T細胞中。
  78. 如請求項77之T細胞或工程化T細胞，其中使用CRISPR，視情況使用CRISPR-Cas9，進行位點特異性整合。
  79. 如請求項9至16、24至31中任一項之T細胞或如請求項74之工程化T細胞，其中該外源性TCR或CAR係整合至該T細胞或工程化T細胞之基因體中之限定位置。
  80. 一種醫藥組合物，其包含如請求項77至79中任一項之T細胞或工程化T細胞及醫藥學上可接受之載劑。
  81. 如請求項80之醫藥組合物，其中該組合物適於藉由靜脈內輸注投藥。
  82. 如請求項80之醫藥組合物，其中該組合物適於瘤內投藥。
  83. 如請求項46至53或66至72中任一項之方法，其中該外源性TCR或CAR係整合至該T細胞之基因體中之限定位置。
  84. 如請求項83之方法，其中使用CRISPR，視情況使用CRISPR-Cas9，進行該整合。
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