TW202325846A - 用於治療周邊髓鞘蛋白22相關疾病的嗎啉代寡聚物 - Google Patents

用於治療周邊髓鞘蛋白22相關疾病的嗎啉代寡聚物 Download PDF

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Abstract

本文提供一種反義寡聚物，其包含經化學修飾之反義寡聚物，該經化學修飾之反義寡聚物具有與人類周邊髓鞘蛋白22 (PMP22)前驅mRNA之目標區域互補的靶向序列。該反義寡聚物可為肽核酸、鎖定核酸、二胺基磷酸酯嗎啉代寡聚物、2'-O-Me硫代磷酸酯寡聚物或其組合。在實施例中，該反義寡聚物共價連接至細胞穿透肽。該反義寡聚物適用於治療有需要之個體之各種疾病，包括(但不限於)與周邊髓鞘蛋白22之失調相關的疾病。

Description

用於治療周邊髓鞘蛋白22相關疾病的嗎啉代寡聚物
周邊髓鞘蛋白22 (PMP22)係由人類中之PMP22基因編碼的膜蛋白。許旺細胞展現出PMP22之較高表現，其中髓鞘中之總蛋白質含量的2-5%為PMP22。因此，PMP22在緊密髓鞘之形成及維護中起重要作用。
PMP22基因表現之改變與多種神經病相關，諸如1A型夏-馬-杜三氏症(CMT1A)。CMT1A通常由PMP22基因之過度表現或複製引起。CMT1A影響100,000人中之約6.9人。此疾病之進展的特徵在於全身肌肉組織及觸摸感覺之損失。當前，不存在用於CMT1A之治癒性治療。
仍需要有效治療CMT1A之治療性分子。
本文提供一種反義寡聚物，其包含經化學修飾之反義寡聚物，該經化學修飾之反義寡聚物具有與人類周邊髓鞘蛋白22 (PMP22)前驅mRNA之目標區域互補的靶向序列。該反義寡聚物可為任何經修飾之反義寡聚物，例如肽核酸、鎖定核酸、二胺基磷酸酯嗎啉代寡聚物、2'-O-Me硫代磷酸酯寡聚物或其組合。在實施例中，該反義寡聚物共價連接至細胞穿透肽。該反義寡聚物適用於治療有需要之個體之與周邊髓鞘蛋白22失調相關的疾病。
在某些實施例中，該反義寡聚物誘導該PMP22前驅mRNA之外顯子2 (SEQ ID NO: 2)、外顯子3 (SEQ ID NO: 3)、外顯子4 (SEQ ID NO: 4)或外顯子5 (SEQ ID NO: 5)中之一或多者的跳過。
在某些實施例中，該靶向序列與外顯子2 (SEQ ID NO: 2)、外顯子3 (SEQ ID NO: 3)、外顯子4 (SEQ ID NO: 4)或外顯子5 (SEQ ID NO: 5)中之一者內的區域互補。該靶向序列亦可與跨越外顯子2 (SEQ ID NO: 2)、外顯子3 (SEQ ID NO: 3)、外顯子4 (SEQ ID NO: 4)或外顯子5 (SEQ ID NO: 5)之外顯子/內含子接合點的區域互補。
在實施例中，該反義寡聚物為式I之肽-寡核苷酸結合物： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中A'、E'、R 1、R 2及z如本文所定義。
在某些實施例中，式I之反義寡聚物為選自以下之肽-寡核苷酸結合物： 其中A'、E'、G、J、L、R 1、R 2及z如本文所定義。
在某些實施例中，各R 1為N(CH 3) 2。在某些實施例中，各R 2獨立地選自天然或非天然存在之核鹼基，且由各R 2自5'至3'之組合形成的序列為靶向序列。在某些實施例中，該細胞穿透肽選自rTAT、Tat、R 9F 2、R 5F 2R 4、R 4、R 5、R 6、R 7、R 8、R 9、(RAhxR) 4、(RAhxR) 5、(RAhxRRBR) 2、(RAR) 4F 2及(RGR) 4F 2。
在另一態樣中，本文提供一種醫藥組合物，其包含本文所提供之反義寡聚物及醫藥學上可接受之載劑。
本文亦提供一種治療與周邊髓鞘蛋白22之失調相關之疾病的方法，其包含向有需要之個體投與本文所提供之反義寡聚物。
在另一態樣中，本文提供本文所提供之該反義寡聚物中之任一者之用途，其係用於治療有需要之個體之與周邊髓鞘蛋白22之失調相關的疾病。
在又一態樣中，本文提供本文所提供之反義寡聚物，其係用於製備用以治療與周邊髓鞘蛋白22之失調相關之疾病的藥劑。
相關申請案本申請案主張2021年10月22日申請之美國臨時申請案第63/262,907號及2022年9月26日申請之美國臨時申請案第63/377,066號的優先權。此等申請案之全部內容以引用的方式併入本文中。
序列表本申請案含有已以XML檔案格式以電子方式提交且特此以全文引用之方式併入之序列表。在2022年10月21日產生之該XML複本名為732901_SPT-8399PC_SL.xml且大小為105KB。
已研發出多種寡核苷酸類似物，其中天然DNA之磷酸二酯鍵置換為對核酸酶降解具有抗性之其他鍵聯。參見例如Barawkar and Bruice (1998) Proc Natl Acad Sci USA95(1): 11047-52；Linkletter等人. (2001) Nucleic Acids Res29(11):2370-6；及Micklefield (2001) Curr Med Chem8(10):1157-79。亦已製備具有除核苷間鍵以外之各種主鏈修飾的反義寡核苷酸(Crooke (2001) Antisense Drug Technology: Principles, Strategies, and Applications. New York, Marcel Dekker; Micklefield (2001))。此外，寡核苷酸已藉由肽結合修飾以增強細胞吸收。參見例如Moulton等人. (2004) Bioconjug Chem15(2):290-9及Nelson等人. (2005) Bioconjug Chem16(4):959-66。
基於嗎啉代之寡聚物(包括反義寡聚物)詳述於例如以下中：美國專利第5,698,685；5,217,866；5,142,047；5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,521,063；5,506,337號；及PCT公開案第WO/2009/064471、WO/2012/043730、WO 2008/036127號；及Summerton等人. 1997, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 7, 187-195；其全部以全文引用之方式併入本文中。
本文提供一種反義寡聚物，其包含經化學修飾之反義寡聚物，該經化學修飾之反義寡聚物具有與人類周邊髓鞘蛋白22 (PMP22)前驅mRNA之目標區域互補的靶向序列。該反義寡聚物可為任何經修飾之反義寡聚物，例如肽核酸、鎖定核酸、二胺基磷酸酯嗎啉代寡聚物、2'-O-Me硫代磷酸酯寡聚物或其組合。在實施例中，該反義寡聚物共價連接至細胞穿透肽。該反義寡聚物適用於治療有需要之個體之各種疾病，包括(但不限於)1A型夏-馬-杜三氏症(CMT1A)。
I. 定義除非另外定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解相同之含義。儘管可在本發明之實踐或測試中使用與本文所描述之方法及材料類似或等效的任何方法及材料，但描述較佳方法及材料。出於本發明之目的，以下術語定義如下。
術語「約(about)」應為一般熟習此項技術者理解，且將在其使用之上下文中在一定程度上變化。如本文中所使用，當提及可量測值，諸如量、持續時間及其類似者時，術語「約」意謂涵蓋自指定值之±10%(包括±5%、±1%及±0.1%)之變化，因此變化適於執行所揭示之方法。
術語「烷基(alkyl)」係指在某些實施例中分別地含有一個至六個碳原子或一個至八個碳原子之飽和烴部分、直鏈烴部分或分支鏈烴部分。C 1 - 6-烷基部分之實例包括(但不限於)甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、三級丁基、新戊基、正己基部分；且C 1 - 8-烷基部分之實例包括(但不限於)甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、三級丁基、新戊基、正己基、庚基及辛基部分。
烷基取代基中之碳原子數目可由字首「C x-y」指示，其中x為取代基中碳原子之最小數目且y為最大數目。同樣，C x鏈意謂含有x個碳原子之烷基鏈。
除非另外說明，否則本身或與另一術語組合的術語「雜烷基」意謂由所陳述數目之碳原子及一個或兩個選自由O、N及S組成之群之雜原子組成的穩定直鏈或分支鏈烷基，且其中氮及硫原子可視情況經氧化且氮雜原子可視情況經四級銨化。該等雜原子可置放於雜烷基之任何位置處，包括在雜烷基之其餘部分與其所附接至之片段之間，以及附接至雜烷基中之最遠端碳原子。實例包括：-O-CH 2-CH 2-CH 3、-CH 2-CH 2-CH 2-OH、-CH 2-CH 2-NH-CH 3、-CH 2-S-CH 2-CH 3及-CH 2-CH 2-S(=O)-CH 3。至多兩個雜原子可為連續的，諸如(例如)-CH 2-NH-OCH 3或-CH 2-CH 2-S-S-CH 3。
除非另外陳述，否則單獨或與其他術語組合使用之術語「芳基」意謂含有一或多個環(通常一個、兩個或三個環)之碳環芳族系統，其中此類環可以側接方式附接在一起(諸如聯苯)或可經稠合(諸如萘)。芳基之實例包括苯基、蒽基及萘基。在各種實施例中，芳基之實例可包括苯基(例如，C 6-芳基)及聯苯基(例如，C 12-芳基)。在一些實施例中，芳香基具有六個至十六個碳原子。在一些實施例中，芳香基具有六個至十二個碳原子(例如，C 6 - 12芳香基)。在一些實施例中，芳基具有六個碳原子(例如，C 6-芳基)。
如本文中所使用，術語「雜芳基(heteroaryl或heteroaromatic)」係指具有芳族特徵之雜環。雜芳基取代基可由碳原子數目定義，例如，C 1 - 9雜芳基指示含於雜芳基中之碳原子數目而不包括雜原子之數目。舉例而言，C 1-9-雜芳基將包括額外一至四個雜原子。多環雜芳基可包括一或多個部分飽和之環。雜芳基之非限制性實例包括：吡啶基、吡𠯤基、嘧啶基(包括，例如2-嘧啶基及4-嘧啶基)、嗒𠯤基、噻吩基、呋喃基、吡咯基(包括，例如2-吡咯基)、咪唑基、噻唑基、㗁唑基、吡唑基(包括，例如3-吡唑基及5-吡唑基)、異噻唑基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、1,3,4-三唑基、四唑基、1,2,3-噻二唑基、1,2,3-㗁二唑基、1,3,4-噻二唑基及1,3,4-㗁二唑基。
多環雜環及雜芳基之非限制性實例包括吲哚基(包括(例如)3-吲哚基、4-吲哚基、5-吲哚基、6-吲哚基及7-吲哚基)、二氫吲哚基、喹啉基、四氫喹啉基、異喹啉基(包括(例如)1-異喹啉基及5-異喹啉基)、1,2,3,4-四氫異喹啉基、㖕啉基、喹喏啉基(包括(例如)2-喹喏啉基及5-喹喏啉基)、喹唑啉基、呔𠯤基、1,8-㖠啶基、1,4-苯并二㗁烷基、香豆素(coumarin)、二氫香豆素、1,5-㖠啶基、苯并呋喃基(包括(例如)3-苯并呋喃基、4-苯并呋喃基、5-苯并呋喃基、6-苯并呋喃基及7-苯并呋喃基)、2,3-二氫苯并呋喃基、1,2-苯并異㗁唑基、苯并噻吩基(包括(例如)3-苯并噻吩基、4-苯并噻吩基、5-苯并噻吩基、6-苯并噻吩基及7-苯并噻吩基)、苯并㗁唑基、苯并噻唑基(包括(例如)2-苯并噻唑基及5-苯并噻唑基)、嘌呤基、苯并咪唑基(包括(例如)2-苯并咪唑基)、苯并三唑基、硫代黃嘌呤基、咔唑基、咔啉基、吖啶基、吡咯聯啶基及喹𠯤基。
如本文所用，縮寫字DBCO係指8,9-二氫-3H-二苯并[b,f] [1,2,3]三唑酮[4,5-d]辛因。
術語「保護基」或「化學保護基」係指阻斷化合物之一些或所有反應性部分且防止此類部分參與化學反應直至去除保護基為止之化學部分，例如T.W. Greene, P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 第3版. John Wiley & Sons (1999)中所列舉且描述之彼等部分。其可為有利的(在採用不同保護基團之情況下)，每一(不同)保護基團為藉由不同方式可移除的。在完全不同反應條件下裂解之保護基團允許此類保護基團之差異移除。舉例而言，保護基團可藉由酸、鹼基及氫解移除。諸如三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、縮醛及三級丁基二甲基矽烷基之基團為酸不穩定的且可用於在存在經Cbz基團(其可藉由氫解移除)及Fmoc基團(其為鹼基不穩定的)保護之胺基的情況下保護羧基及羥基反應性部分。羧酸部分可用諸如(但不限於)甲基或乙基之鹼不穩定基團來封閉，且羥基反應性部分可在存在用酸不穩定基團(諸如胺基甲酸三級丁酯)或用均為酸及鹼穩定但可水解移除之胺基甲酸酯封閉之胺的情況下用諸如乙醯基之鹼不穩定基團來封閉。
羧酸反應性部分及羥基反應性部分亦可用諸如苯甲基之可水解移除保護基團封閉，而胺基可用諸如Fmoc之鹼不穩定基團封閉。用於合成式(I)之化合物之尤其適用之胺保護基為三氟乙醯胺。羧酸反應性部分可用諸如2,4-二甲氧基苄基之可氧化移除保護基團封閉，而共存胺基可用氟不穩定胺基甲酸矽烷酯封閉。
烯丙基封閉基團適用於存在酸保護基團及鹼保護基團之情況下，由於前者穩定且隨後可藉由金屬或π-酸(pi-acid)催化劑移除。舉例而言，烯丙基封閉之羧酸可用鈀(0)-催化之反應在酸不穩定之胺基甲酸三級丁酯或鹼不穩定之乙酸酯胺保護基團存在下脫除保護基。保護基之又一個形式為化合物或中間物可附接之樹脂。只要殘基附接至樹脂，則官能基經阻斷且無法反應。一旦自樹脂釋放，則官能基可用於反應。
術語「核鹼基」、「鹼基配對部分(base-pairing moiety)」、「核鹼基配對部分(nucleobase-pairing moiety)」或「鹼」係指核苷、核苷酸及/或N-嗎啉代亞基之雜環部分。核鹼基可為天然存在核鹼基或可為經修飾之核鹼基或此等天然存在核鹼基之類似物，例如，核鹼基之一或多個氮原子可在每次出現時獨立地經碳置換。例示性類似物包括：次黃嘌呤(核苷肌苷之鹼基組分)、2,6-二胺基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、經C5-丙炔基修飾之嘧啶、10-(9-(胺基乙氧基)啡㗁𠯤基)(G形夾)及其類似者。
鹼基配對部分之另外實例包括(但不限於)：尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤及使其各別胺基藉由醯基保護基團保護之次黃嘌呤、2-氟尿嘧啶、2-氟胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、2,6-二胺基嘌呤、氮雜胞嘧啶、諸如假異胞嘧啶及假尿嘧啶之嘧啶類似物及諸如8-經取代嘌呤、黃嘌呤或次黃嘌呤(後兩者為天然降解產物)之其他經修飾之核鹼基。亦涵蓋揭示於Chiu and Rana (2003) RNA 9:1034-1048, Limbach等人. (1994) Nucleic Acids Res. 22:2183-2196 and Revankar and Rao, Comprehensive Natural Products Chemistry, 第7卷, 313中之經修飾之核鹼基，其內容以引用之方式併入本文中。
鹼基配對部分之其他實例包括(但不限於)其中已添加一或多個苯環之經擴增大小之核鹼基。以下中所描述之核鹼基置換：Glen Research catalog (www.glenresearch.com); Krueger AT等人. (2007) Acc . Chem . Res .40:141-150; Kool ET (2002) Acc . Chem . Res .35:936-943; Benner SA等人. (2005) Nat . Rev . Genet .6:553-543; Romesberg FE等人. (2003) Curr . Opin . Chem . Biol .7:723-733; Hirao, I (2006) Curr . Opin . Chem . Biol .10:622-627，其內容以引用之方式併入本文中，涵蓋為適用於合成本文所描述之寡聚物。大小經擴增之核鹼基之實例展示如下：
術語「寡核苷酸」或「寡聚物」指代包含複數個經連接核苷、核苷酸或核苷及核苷酸兩者之組合的化合物。在本文中所提供之具體實施例中，寡核苷酸為嗎啉代寡核苷酸。
片語「嗎啉代寡核苷酸」或「PMO」係指藉由胺基磷酸酯鍵或二胺基磷酸酯鍵使嗎啉代亞基連接在一起、一個亞基之嗎啉代氮接合至鄰近亞基之5'-環外碳之經修飾之寡核苷酸。每一嗎啉代亞基包含藉由核鹼基特異性氫鍵結有效地與目標中之核鹼基鍵結之核鹼基配對部分。
如本文所用，術語「反義寡聚物」或「反義化合物」可互換使用且係指次單元序列，其各自具有在由核糖或其他戊糖或N-嗎啉代構成之主鏈次單元上攜帶的鹼基，且其中主鏈基團藉由允許化合物中之鹼基與核酸(通常為RNA)中之目標序列經由華特生-克里克鹼基配對雜交的次單元間鍵聯而連接，以在目標序列內形成核酸:寡聚物雜雙螺旋。寡聚物可具有與目標序列準確互補或幾乎準確互補的序列。此類反義寡聚物經設計以阻斷或抑制含有目標序列之mRNA的轉譯，且可稱為「導向」與其雜交之序列。
本文亦涵蓋作為「反義寡聚物」或「反義化合物」之類型為經硫代磷酸酯修飾之寡聚物、肽核酸(PNAs)、鎖定核酸(LNAs)、經2'-氟-修飾之寡聚物、2'-O,4'-C-伸乙基-橋接之核酸(ENAs)、三環-DNAs、三環-DNA硫代磷酸酯-修飾之寡聚物、2'-O-[2-(N-甲基胺甲醯基)乙基]修飾之寡聚物、2'-O-甲基硫代磷酸酯修飾之寡聚物、2'-O-甲氧基乙基(2'-O-MOE)修飾之寡聚物及2'-O-甲基寡核苷酸或其組合，以及此項技術中已知之其他反義劑。
若寡聚物在生理條件下與目標雜交，Tm大於37℃、大於45℃、較佳至少50℃且通常60℃、80℃或更高，則反義寡聚物與目標聚核苷酸「特異性雜交」。寡聚物之「Tm」為50%與互補聚核苷酸雜交之溫度。Tm在標準條件下在生理鹽水中確定，如例如Miyada等人. (1987) Methods Enzymol. 154:94-107中所描述。此類雜交可同與目標序列之反義寡聚物「幾乎」或「實質上」互補以及準確互補發生。
如本文中所用，術語「外顯子/內含子間隔接合點」或「外顯子/內含子接合點」係指核酸序列區域，其對應於外顯子或內含子之3'端及內含子或外顯子之5'端，其直接繼續該外顯子或內含子。舉例而言，但決不限制，序列GATCGTCAGC (SEQ ID NO: 68) | GTGAGTGCCT (SEQ ID NO: 69)之外顯子/內含子接合點由「|」表示。因此，GATCGTCAGC (SEQ ID NO: 68)對應於外顯子之3'端的後十個核苷酸，且GTGAGTGCCT (SEQ ID NO: 69)對應於前進內含子之5'端的前10個核苷酸。類似地，序列TGTTTCTCATCATCACCAAACG (SEQ ID NO: 70) | GTG (SEQ ID NO: 71)之外顯子/內含子接合點由「|」表示。反義寡聚物CACCGTTTGGTGATGATGAGAAACA (SEQ ID NO: 38)與外顯子/內含子接合點TGTTTCTCATCATCACCAAACG (SEQ ID NO: 70) | GTG (SEQ ID NO: 71)互補。具有與跨越外顯子/內含子接合點之區域互補之靶向序列的反義寡聚物將具有至少一個與外顯子互補之核苷酸及至少一個與內含子互補之核苷酸。
術語「互補(complementary及complementarity)」係指由鹼基配對法則相關之寡核苷酸(亦即，核苷酸序列)。舉例而言，序列「T-G-A (5'-3')」與序列「T-C-A (5'-3')」互補。互補可為「不完全的/部分的」，其中僅一些核酸之鹼基根據鹼基配對法則匹配。或，在核酸之間可存在「完全」、「總體」或「完美」 (100%)的互補。核酸鏈間之間的互補程度對核酸鏈之間的雜交之效率及強度具有顯著影響。同時通常需要完美的互補，一些實施例可包括關於目標RNA之一或多個但較佳地6、5、4、3、2或1個錯配。此類雜交可同與目標序列之反義寡聚物「幾乎」或「實質上」互補以及準確互補發生。在一些實施例中，寡聚物可與目標序列以約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或100%互補來雜交。包括在寡聚物內之任何位置處之變化。在某些實施例中，靠近寡聚物之末端之序列中之變化一般比在內部中之變化更佳，且若存在通常在5'端、3'端或兩個末端之約6、5、4、3、2或1個核苷酸內。
天然存在之核苷酸鹼基包括腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶，其分別具有符號A、G、C、T及U。核苷酸鹼基亦可涵蓋天然存在之核苷酸鹼基的類似物。鹼基配對通常發生在嘌呤A與嘧啶T或U之間，及嘌呤G與嘧啶C之間。
寡核苷酸亦可包括核鹼基(此項技術中通常簡稱為「鹼基」)修飾或取代。含有經修飾之或經取代之鹼基之寡核苷酸包括寡核苷酸，該等寡核苷酸中一或多種最常發現於核酸中之嘌呤鹼基或嘧啶鹼基經較少常用或非天然鹼基置換。在一些實施例中，核鹼基在嘌呤鹼基之N9原子處或在嘧啶鹼基之N1原子處共價連接至核苷酸或核苷之嗎啉環。
嘌呤鹼基包含稠合於咪唑環之嘧啶環，如藉由通式所描述： 。
腺嘌呤及鳥嘌呤為最常發現於核酸中之兩種嘌呤核鹼基。此等可經其他天然存在之嘌呤(包括但不限於，N6-甲基腺嘌呤、N2-甲基鳥嘌呤、次黃嘌呤及7-甲基鳥嘌呤)取代。
嘧啶鹼基包含六員嘧啶環，如藉由通式所描述： 。
胞嘧啶、尿嘧啶及胸腺嘧啶為最常發現於核酸中之嘧啶鹼基。此等可經其他天然存在之嘧啶(包括但不限於，5-甲基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、假尿嘧啶及4-硫尿嘧啶)取代。在一個實施例中，本文所描述之寡核苷酸含有代替尿嘧啶之胸腺嘧啶鹼基。
其他經修飾或經取代之鹼基包括(但不限於)2,6-二胺基嘌呤、乳清酸(orotic acid)、阿格嗎特啶(agmatidine)、賴西啶(lysidine)、2-硫代嘧啶(例如2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶)、G形夾及其衍生物、5-經取代嘧啶(例如5-鹵代尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-胺基甲基尿嘧啶、5-羥甲基尿嘧啶、5-胺基甲基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、Super T)、7-去氮鳥嘌呤、7-去氮腺嘌呤、7-氮雜-2,6-二胺基嘌呤、8-氮雜-7-去氮鳥嘌呤、8-氮雜-7-去氮腺嘌呤、8-氮雜-7-去氮-2,6-二胺基嘌呤、Super G、Super A，及N4-乙基胞嘧啶或其衍生物；N2-環戊基鳥嘌呤(cPent-G)、N2-環戊基-2-胺基嘌呤(cPent-AP)及N2-丙基-2-胺基嘌呤(Pr-AP)、假尿嘧啶或其衍生物；以及簡併或通用鹼基，如2,6-二氟甲苯或不存在鹼，如無鹼基位點(例如1-去氧核苷、1,2-二去氧核糖、l-去氧-2-O-甲基核糖；或其中環氧已經氮置換之吡咯啶衍生物(氮雜核糖))。假尿嘧啶為尿嘧啶之天然存在之異構化型式，其在尿苷中具有C-糖苷而非常規N-糖苷。
某些經修飾或經取代之核鹼基特別適用於增加本發明之反義寡核苷酸之結合親和性。此等核鹼基包括在5號位經取代之嘧啶、6-氮雜嘧啶及在N-2、N-6及0-6號位經取代之嘌呤，包括2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶。在各種實施例中，核鹼基可包括5-甲基胞嘧啶取代，已展示該等取代將核酸雙螺旋穩定性增加0.6-1.2℃。
在一些實施例中，經修飾或經取代之核鹼基適用於便於反義寡核苷酸之純化。舉例而言，在某些實施例中，反義寡核苷酸可含有三個或更多個(例如，3、4、5、6或更多個)連續鳥嘌呤鹼基。在某些反義寡核苷酸中，一串三個或更多個連續鳥嘌呤鹼基可引起寡核苷酸之凝聚、併發純化。在此類反義寡核苷酸中，連續鳥嘌呤中之一或多者可經次黃嘌呤取代。用於一串三個或更多個連續鳥嘌呤鹼基中之一或多個鳥嘌呤之次黃嘌呤之取代可降低反義寡核苷酸之凝聚，由此便於純化。
合成本文提供之寡核苷酸且該等寡核苷酸不包括生物學來源之反義組合物。本發明之分子亦可與其他分子、分子結構或化合物之混合物(例如，脂質體、受體靶向分子、經口調配物、直腸調配物、局部調配物或其他調配物)混合、囊封、結合或以其他方式聯合使用，用於輔助攝取、分佈或吸收或其一組合。
如本文中所用，「核酸類似物」係指非天然存在之核酸分子。核酸為將一起連接至線性結構中之核苷酸次單元的聚合物。各核苷酸由附接於戊糖(五個碳)糖之含氮芳族鹼基組成，該含氮芳族鹼基又附接於磷酸酯基。連續磷酸酯基經由磷酸二酯鍵鍵聯在一起以形成聚合物。天然存在之核酸的兩種常見形式為去氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)。鏈之一端攜帶連接至糖部分之5'-碳原子的自由磷酸酯基；此稱為分子之5'端。另一端在糖部分之3'-碳處具有游離羥基(-OH)基團，且稱為分子之3'端。核酸類似物可包括一或多個非天然存在之核鹼基、糖及/或核苷酸間鍵，例如二胺基磷酸酯嗎啉代寡聚物( PMO)。如本文所揭示，在某些實施例中，「核酸類似物」為PMO，且在某些實施例中，「核酸類似物」為帶正電陽離子PMO。
「嗎啉代寡聚物」或「PMO」係指具有支援能夠與典型聚核苷酸氫鍵結之鹼基的主鏈的聚合分子，其中該聚合物缺乏戊糖主鏈部分，且更特定言之，作為核苷酸及核苷特有的藉由磷酸二酯鍵連接之核糖主鏈，但實際上含有具有經由環氮之偶合的環氮。例示性「嗎啉代」寡聚物包含藉由胺基磷酸酯或二胺基磷酸酯鍵連接在一起之嗎啉代次單元結構，從而使一個次單元之嗎啉代氮與相鄰次單元之5'環外碳連接，各次單元包含藉由與鹼基特異性氫鍵結有效地結合至聚核苷酸中之鹼基的嘌呤或嘧啶鹼基配對部分。嗎啉代寡聚物(包括反義寡聚物)詳述於例如美國專利第5,034,506；5,142,047；5,166,315；5,185,444；5,217,866；5,506,337；5,521,063；5,698,685；8,076,476及8,299,206號；及PCT公開案第WO 2009/064471號中，以上所有者以全文引用之方式併入本文中。
較佳嗎啉代寡聚物為二胺基磷酸酯連接之嗎啉代寡聚物，在本文中稱為PMO。此類寡聚物由嗎啉代次單位結構組成，諸如下文所示： 其中X為NH 2、NHR或NR 2(其中R為低碳數烷基，較佳甲基)，Y 1為O，且Z為O，且P i及P j為藉由與鹼基特異性氫鍵結有效地結合至聚核苷酸中之鹼基的嘌呤或嘧啶鹼基配對部分。亦較佳為具有替代性二胺基磷酸酯鍵之結構，其中X為低碳烷氧基，諸如甲氧基或乙氧基，Y 1為NH或NR，其中R為低碳烷基，且Z為O。
代表性PMO包括PMO，其中次單元間鍵聯為鍵聯(A1)。參見 表 1。 表 1.代表性次單元間鍵聯
編號 名稱 結構
A1 PMO
A2 PMO +(所描繪之非質子化形式)
A3 PMO +(所描繪之質子化形式)
「胺基磷酸酯」基團包含具有三個附接氧原子及一個附接氮原子之磷，而「二胺基磷酸酯」基團包含具有兩個附接氧原子及兩個附接氮原子之磷。代表性二胺基磷酸酯實例如下： 各P i獨立地選自H、核鹼基及經化學保護基團官能化之核鹼基，其中該核鹼基在每次出現時獨立地包含選自吡啶、嘧啶、三𠯤烷、嘌呤及去氮-嘌呤之C 3 - 6-雜環；及n為6-38之整數。
在本文中所描述之寡聚物的不帶電或經修飾之次單元間鍵聯中，一個氮始終側接於主鏈。二胺基磷酸酯鍵聯中之第二氮典型地為N-嗎啉代環結構中之環氮。
PMO為水溶性、不帶電或實質上不帶電之反義分子，其藉由防止剪接或轉譯機制組分之結合或進展而抑制基因表現。PMO亦已展示抑制或阻斷病毒複製(Stein, Skilling等人. 2001; McCaffrey, Meuse等人. 2003)。其對酶促消化具有高度抗性(Hudziak, Barofsky等人. 1996)。PMO已在無細胞及細胞培養模型中活體外(Stein, Foster等人. 1997; Summerton and Weller 1997)，及在斑馬魚中、蛙及海膽胚芽中(Heasman, Kofron等人. 2000; Nasevicius and Ekker 2000)，以及在成年動物模型(諸如，大鼠、小鼠、兔、狗及豬)中活體內(參見例如Arora and Iversen 2000; Qin, Taylor等人. 2000; Iversen 2001; Kipshidze, Keane等人. 2001; Devi 2002; Devi, Oldenkamp等人. 2002; Kipshidze, Kim等人. 2002; Ricker, Mata等人. 2002)展現出高反義特異性及功效。
已顯示，與其他廣泛使用之反義寡核苷酸相比，反義PMO寡聚物溶解於細胞中，且在活體內更一致地有效，而非特異性效果更少(參見例如P. Iversen, 「Phosphoramidite Morpholino Oligomers,」 in Antisense Drug Technology, S.T. Crooke, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 2001)。PMO與富含精胺酸之肽的結合已展示可增加其細胞吸收(參見例如美國專利第7,468,418號，其以全文引用的方式併入本文中)。
如本文所使用，「帶電」、「不帶電」、「陽離子」及「陰離子」係指在接近中性pH，例如約6至8下化學部分之主要狀態。舉例而言，該術語可指在生理pH值下之化學部分的主要狀態，亦即約7.4。
「陽離子PMO」或「PMO+」係指二胺基磷酸酯嗎啉代寡聚物，其包含任何數目之(1-哌𠯤基)亞膦醯氧、(1-(4-(ω-胍基-烷醯基))-哌𠯤基)亞膦醯氧鍵(A2及A3；參見 表 1)，其先前已描述(參見例如，PCT公開案WO 2008/036127，其以全文引用之方式併入本文中)。
寡核苷酸類似物之「主鏈」(例如，不帶電寡核苷酸類似物)係指支援鹼基配對部分之結構；例如，對於如本文所描述之嗎啉代寡聚物，「主鏈」包括藉由次單元間鍵聯(例如，磷基連結)連接之嗎啉代環結構。實質上不帶電主鏈係指寡核苷酸類似物之主鏈，其中低於50%之次單元間鍵聯在接近中性pH下充電。舉例而言，實質上不帶電主鏈可包含低於50%、低於40%、低於30%、低於20%、低於10%、低於5%或甚至0%在接近中性pH下帶電之次單元間鍵聯。在一些實施例中，實質上不帶電主鏈針對每四個不帶電(在生理pH下)鍵聯包含至多一個帶電(在生理pH下)次單元間鍵聯，每八個鍵聯有至多一個或每十六個不帶電鍵聯有至多一個。在一些實施例中，本文中所描述之核酸類似物完全不帶電。
術語「靶向鹼基序列」或僅「靶向序列」為核酸類似物中與目標序列互補(另外，意謂實質上互補)之序列，目標序列例如人類周邊髓鞘蛋白22之RNA基因體中的目標序列。類似物化合物之整個序列或僅一部分可與目標序列互補。舉例而言，在具有20個鹼基之類似物中，僅12至14個可為靶向序列。通常，靶向序列由類似物中之連續鹼基形成，但可替代地由非連續序列形成，該等非連續序列當例如自類似物之相對末端置放在一起時構成跨越目標序列之序列。
如本文中所用，「目標序列」係指在適用於此類結合之條件(例如，生理條件)下，反義化合物將結合之人類周邊髓鞘蛋白22之基因體內的核苷酸序列。潛在目標序列之實例包括包含5'端區域、轉錄調節序列(TRS)、轉譯起始區或AUG區之全部或至少一部分的序列。目標序列通常可涵蓋病毒基因體序列之約10至約30、約20至約30或約20至約25個連續核苷酸。
如本文中所用，「細胞穿透肽」(CPP)或「載體肽」為能夠促進藉由細胞攝取PMO之相對較短的肽，藉此將PMO遞送至細胞之內部(細胞質)。CPP或載體肽通常為約12個到約40個胺基酸長。載體肽之長度不受特別限制且在不同實施例中變化。在一些實施例中，載體肽包含4至40個胺基酸次單元。在其他實施例中，載體肽包含6至30個、6至20個、8至25個或10至20個胺基酸子單元。
在某些實施例中，載體肽當與具有實質上不帶電主鏈之反義寡聚物結合時，相對於呈未結合形式之反義寡聚物，有效增強反義寡聚物之活性，如由以下證明： (i)所編碼蛋白質之表現相對於由未結合寡聚物提供之表現降低，當該反義寡聚物與其目標序列之結合有效地阻斷所編碼蛋白質之轉譯起始密碼子時，或 (ii)所編碼蛋白質之表現相對於由未結合寡聚物提供之表現增加，當該反義寡聚物與其目標序列之結合有效阻斷當正確地剪接時編碼該蛋白質之前驅mRNA中的異常剪接位點。適於量測此等作用之分析在下文進一步描述。在一個實施例中，肽之結合在不含細胞之轉譯分析中提供此活性，如本文所描述。在一些實施例中，活性增強至少兩倍、至少五倍或至少十倍。
或者或另外，相對於未結合形式之類似物，載體肽有效增強核酸類似物向細胞中之轉運。在某些實施例中，運輸增強至少兩倍、至少兩倍、至少五倍或至少十倍。
如本文中所用，「肽結合之二胺基磷酸酯連接的嗎啉代寡聚物」或「PPMO」係指共價連接至肽之PMO(諸如，細胞穿透肽(CPP)或載體肽)。細胞穿透肽促進藉由細胞對PMO之攝取，藉此將PMO遞送至細胞之內部(細胞質)。視其胺基酸序列而定，CPP可一般有效或其可尤其或選擇性地有效於PMO遞送至特定類型或特定類型之細胞。PMO及CPP通常在其末端處連接，例如CPP之C端可連接至PMO之5'端，或PMO之3'端可連接至CPP之N端。PPMO可包括不帶電PMO、帶電(例如陽離子) PMO及其混合物。
載體肽可直接或經由視情況選用之連接子連接至核酸類似物，例如一或多種額外胺基酸，例如半胱胺酸(C)、甘胺酸(G)或脯胺酸(P)，或額外胺基酸類似物，例如6-胺基己酸(X)、β-丙胺酸(B)或XB。
胺基酸次單元通常為α-胺基酸殘基(-CO-CHR-NH-)；但亦可為β-或其他胺基酸殘基(例如，-CO-CH 2CHR-NH-)，其中R為胺基酸側鏈。
術語「天然存在之胺基酸」係指自然界中發現之蛋白質中存在的胺基酸；實例包括丙胺酸(A)、半胱胺酸(C)、天冬胺酸(D)、麩胺酸(E)、苯丙胺酸(F)、甘胺酸(G)、組胺酸(H)、異白胺酸(I)、離胺酸(K)、白胺酸(L)。甲硫胺酸(M)、天冬醯胺(N)、脯胺酸(P)、麩醯胺酸(Q)、精胺酸(R)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、纈胺酸(V)、色胺酸(W)及酪胺酸(Y)。術語「非天然胺基酸」係指自然界中發現之蛋白質中未存在的胺基酸；實例包括β-丙胺酸(β-Ala)及6-胺基己酸(Ahx)。
代表性寡聚物-肽結合物展示如下： 各嗎啉代寡聚物與在5'或3'端處之載體肽結合。W表示O；各X獨立地選自OH及-NR 3R 4，其中各R 3及R 4在各次出現時獨立地為-C 1 - 6烷基；Y表示O；各Pi獨立地選自由H、核鹼基及經化學保護基官能化之核鹼基，其中該核鹼基在各次出現時獨立地包含選自吡啶、嘧啶、三𠯤烷、嘌呤及去氮-嘌呤之C 3 - 6雜環；且x為6-38之整數。
當藥劑可藉由除橫越細胞膜之被動擴散以外的機制進入細胞時，藥劑「由哺乳動物細胞主動地吸收」。藥劑可例如藉由「主動輸送」，係指藉由例如ATP依賴性輸送機制使藥劑跨越哺乳動物細胞膜輸送，或藉由「促進輸送」，參考藉由需要將藥劑結合至轉運蛋白之輸送機制使反義藥劑跨越細胞膜輸送，隨後促進結合藥劑跨越膜傳遞。
如本文中所用，有效量係指足以達成所需生物結果之任何量的物質。「治療有效量」係指足以達成所需治療結果之任何量的物質。
如本文所使用，「個體」為哺乳動物，其可包括小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、兔、山羊、綿羊、貓、狗、豬、牛、馬、猴、非人類靈長類動物或人類。在某些實施例中，個體為人類。
個體(例如哺乳動物，諸如人類)或細胞之「治療」為用於改變個體或細胞之自然過程的任何類型之介入。在某些實施例中，治療包括(但不限於)投與醫藥組合物，且可在開始出現病理性事件或接觸病原體之後執行。
II. 化合物本文提供一種經化學修飾之反義寡聚物，其具有與人類周邊髓鞘蛋白22 (PMP22)前驅mRNA之目標區域互補的靶向序列。在實施例中，反義寡聚物為包含核酸類似物之化合物，該核酸類似物包含5'端、3'端及與人類周邊髓鞘蛋白22 (PMP22)前驅mRNA之目標區域互補的靶向鹼基序列。
在實施例中，該反義寡聚物誘導該PMP22前驅mRNA之外顯子2 (SEQ ID NO: 2)、外顯子3 (SEQ ID NO: 3)、外顯子4 (SEQ ID NO: 4)或外顯子5 (SEQ ID NO: 5)中之一或多者的跳過。
在另一實施例中，該反義寡聚物具有與外顯子2 (SEQ ID NO: 2)、外顯子3 (SEQ ID NO: 3)、外顯子4 (SEQ ID NO: 4)或外顯子5 (SEQ ID NO: 5)中之一者內之區域互補的靶向序列。
在另一實施例中，該反義寡聚物具有與跨越外顯子2 (SEQ ID NO: 2)、外顯子3 (SEQ ID NO: 3)、外顯子4 (SEQ ID NO: 4)或外顯子5 (SEQ ID NO: 5)之外顯子/內含子接合點之區域互補的靶向序列。
在另一實施例中，反義寡聚物具有與外顯子2 (SEQ ID NO: 2)、外顯子3 (SEQ ID NO: 3)、外顯子4 (SEQ ID NO: 4)或外顯子5 (SEQ ID NO: 5)之外顯子/內含子接合點附近之內含子區域互補的靶向序列。
在特定實施例中，靶向區域為PMP22 H2A (-25-1)、PMP22 H2A (+1+25)、PMP22 H2A (+25+49)、PMP22 H2A (+30+54)、PMP22 H2A (+35+59)、PMP22 H2A (+38+57)、PMP22 H2A (+40+59)、PMP22 H2A (+40+64)、PMP22 H2A (+42+61)、PMP22 H2A (+44+63)、PMP22 H2A (+45+69)、PMP22 H2A (+46+65)、PMP22 H2A (+48+67)、PMP22 H2A (+50+69)、PMP22 H2A (+50+74)、PMP22 H2A (+52+71)、PMP22 H2A (+54+73)、PMP22 H2A (+55+79)、PMP22 H2A (+56+75)、PMP22 H2A (+60+84)、PMP22 H2A (+65+89)、PMP22 H2A (+70+94)、PMP22 H2A (+75+99)、PMP22 H2D (+15-10)、PMP22 H3A (-15+10)、PMP22 H3A (+1+25)、PMP22 H3A (+15+39)、PMP22 H3A (+24+48)、PMP22 H3A (+48+72)、PMP22 H3A (+65+89)、PMP22 H3A (+74+98)、PMP22 H3D (+17-8)、PMP22 H3D (+22-3)、PMP22 H4A (-10+15)、PMP22 H4A (+30+54)、PMP22 H4A (+60+84)、PMP22 H4A (+90+114)、PMP22 H4A (+100+124)、PMP22 H4A (+110+134)、PMP22 H4D (+22-3)、PMP22 H5A (-8+17)、PMP22 H5A (+18+42)、PMP22 H5A (+37+61)、PMP22 H5A (+55+79)或PMP22 H5A (+1271+1295)。
在特定實施例中，該反義寡聚物具有選自SEQ ID NO: 6至50之靶向序列。在實施例中，該反義寡聚物包含與外顯子2之一部分互補或誘導外顯子2之跳過的靶向序列。
在另一實施例中，外顯子2之目標區域為PMP22 H2A (-25-1)、PMP22 H2A (+1+25)、PMP22 H2A (+25+49)、PMP22 H2A (+30+54)、PMP22 H2A (+35+59)、PMP22 H2A (+40+64)、PMP22 H2A (+45+69)、PMP22 H2A (+50+74)、PMP22 H2A (+55+79)、PMP22 H2A (+60+84)、PMP22 H2A (+65+89)、PMP22 H2A (+70+94)、PMP22 H2A (+75+99)或PMP22 H2D (+15-10)。
在特定實施例中，該反義寡聚物包含選自SEQ ID NO: 6至29之靶向序列。
在實施例中，該反義寡聚物包含與外顯子3之一部分互補或誘導外顯子3之跳過的靶向序列。
在另一實施例中，外顯子3之目標區域為PMP22 H3A (-15+10)、PMP22 H3A (+1+25)、PMP22 H3A (+15+39)、PMP22 H3A (+24+48)、PMP22 H3A (+48+72)、PMP22 H3A (+65+89)、PMP22 H3A (+74+98)、PMP22 H3D (+17-8)或PMP22 H3D (+22-3)。
在特定實施例中，該反義寡聚物包含選自SEQ ID NO: 30至38。
在實施例中，該反義寡聚物包含與外顯子4之一部分互補或誘導外顯子4之跳過的靶向序列。
在另一實施例中，外顯子4之目標區域為PMP22 H4A (-10+15)、PMP22 H4A (+30+54)、PMP22 H4A (+60+84)、PMP22 H4A (+90+114)、PMP22 H4A (+100+124)、PMP22 H4A (+110+134)或PMP22 H4D (+22-3)。
在特定實施例中，該反義寡聚物包含選自SEQ ID NO: 39至45之靶向序列。
在實施例中，該反義寡聚物包含與外顯子5之一部分互補或誘導外顯子5之跳過的靶向序列。
在另一實施例中，外顯子5之目標區域為PMP22 H5A (-8+17)、PMP22 H5A (+18+42)、PMP22 H5A (+37+61)、PMP22 H5A (+55+79)或PMP22 H5A (+1271+1295)。
在特定實施例中，該反義寡聚物包含選自SEQ ID NO: 46至50之靶向序列。
在實施例中，該反義寡聚物共價連接至細胞穿透肽。
在另一實施例中，該細胞穿透肽經由選自直接鍵、甘胺酸或脯胺酸之連接子共價連接至該反義寡聚物。
在又另一實施例中，該細胞穿透肽選自rTAT、Tat、R 9F 2、R 5F 2R 4、R 4、R 5、R 6、R 7、R 8、R 9、(RXR) 4、(RXR) 5、(RXRRBR) 2、(RAR) 4F 2及(RGR) 4F 2，其中A表示丙胺酸，B表示β丙胺酸，F表示苯丙胺酸，G表示甘胺酸，R表示精胺酸，且X表示6-胺基己酸。
在實施例中，該反義寡聚物選自肽核酸、鎖定核酸、二胺基磷酸酯嗎啉代寡聚物、2'-O-Me硫代磷酸酯寡聚物或其組合。
在特定實施例中，該反義寡聚物為二胺基磷酸酯嗎啉代寡聚物。
在另一態樣中，本發明提供一種反義寡聚物，其具有與該人類周邊髓鞘蛋白22前驅mRNA之外顯子2 (SEQ ID NO: 2)、外顯子3 (SEQ ID NO: 3)、外顯子4 (SEQ ID NO: 4)或外顯子5 (SEQ ID NO: 5)中之一或多者之一部分互補的靶向序列，其中該反義寡聚物為式I之二胺基磷酸酯嗎啉代寡核苷酸： 或其醫藥學上可接受之鹽， 其中： A'選自-NHCH 2C(O)NH 2、-N(C 1-6-烷基)CH 2C(O)NH 2、 ，其中 R 5為-C(O)(O-烷基) x-OH，其中x為3-10，且各烷基在各次出現時獨立地為C 2 - 6-烷基，或R 5選自-C(O)C 1 - 6烷基、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、-(C 1 - 6-烷基)R 6、-(C 1 - 6雜烷基)-R 6、芳基-R 6、雜芳基-R 6、-C(O)O-(C 1 - 6烷基)-R 6、-C(O)O-芳基-R 6、-C(O)O-雜芳基-R 6，及 ， 其中R 6選自OH、SH及NH 2，或R 6為共價連接至固體載體之O、S或NH； 各R 1獨立地選自OH及-NR 3R 4，其中各R 3及R 4在各次出現時獨立地為H、-C 1 - 6烷基，或其中R 3及R 4一起表示視情況經取代之哌𠯤、哌啶或吡咯啶，其中該哌𠯤具有下式： ； R 12為H、C 1-C 6烷基或電子對； R 13選自由以下組成之群：H、C 1-C 6烷基、C(=NH)NH 2、Z-L 2-NHC(=NH)NH 2及[C(O)CHR 'NH] mH； Z為羰基或直接鍵； L 2為選自C 1-C 18烷基、C 1-C 18烷氧基及C 1-C 18烷基胺基之視情況選用之連接子； R '為天然存在之胺基酸之側鏈或其單碳或雙碳同源物； m為1至6； 各R 2獨立地選自天然或非天然存在之核鹼基，且由各R 2自5'至3'之組合形成的序列為靶向序列； z為8至40； E'選自H、-C 1 - 6烷基、-C(O)C 1 - 6烷基、苯甲醯基、硬脂醯基、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、 ， 其中 R 11選自OH及-NR 3R 4； 其中L藉由醯胺鍵共價連接至J之羧基末端，且L選自-NH(CH 2) 1 - 6C(O)-、-NH(CH 2) 1 - 6C(O)NH(CH 2) 1 - 6C(O)-及 ； J為載體肽； G選自H、-C(O)C 1 - 6烷基、苯甲醯基及硬脂醯基，且G共價連接至J之胺基末端。
在式I之反義寡核苷酸的實施例中，該反義寡聚物誘導該PMP22前驅mRNA之外顯子2 (SEQ ID NO: 2)、外顯子3 (SEQ ID NO: 3)、外顯子4 (SEQ ID NO: 4)或外顯子5 (SEQ ID NO: 5)中之一或多者的跳過。
在式I之反義寡核苷酸的另一實施例中，該反義寡聚物具有與外顯子2 (SEQ ID NO: 2)、外顯子3 (SEQ ID NO: 3)、外顯子4 (SEQ ID NO: 4)或外顯子5 (SEQ ID NO: 5)中之一者內之區域互補的靶向序列。
在式I之反義寡核苷酸的另一實施例中，該反義寡聚物具有與跨越外顯子2 (SEQ ID NO: 2)、外顯子3 (SEQ ID NO: 3)、外顯子4 (SEQ ID NO: 4)或外顯子5 (SEQ ID NO: 5)之外顯子/內含子接合點之區域互補的靶向序列。
在式I之反義寡核苷酸的特定實施例中，該靶向區域為PMP22 H2A (-25-1)、PMP22 H2A (+1+25)、PMP22 H2A (+25+49)、PMP22 H2A (+30+54)、PMP22 H2A (+35+59)、PMP22 H2A (+38+57)、PMP22 H2A (+40+59)、PMP22 H2A (+40+64)、PMP22 H2A (+42+61)、PMP22 H2A (+44+63)、PMP22 H2A (+45+69)、PMP22 H2A (+46+65)、PMP22 H2A (+48+67)、PMP22 H2A (+50+69)、PMP22 H2A (+50+74)、PMP22 H2A (+52+71)、PMP22 H2A (+54+73)、PMP22 H2A (+55+79)、PMP22 H2A (+56+75)、PMP22 H2A (+60+84)、PMP22 H2A (+65+89)、PMP22 H2A (+70+94)、PMP22 H2A (+75+99)、PMP22 H2D (+15-10)、PMP22 H3A (-15+10)、PMP22 H3A (+1+25)、PMP22 H3A (+15+39)、PMP22 H3A (+24+48)、PMP22 H3A (+48+72)、PMP22 H3A (+65+89)、PMP22 H3A (+74+98)、PMP22 H3D (+17-8)、PMP22 H3D (+22-3)、PMP22 H4A (-10+15)、PMP22 H4A (+30+54)、PMP22 H4A (+60+84)、PMP22 H4A (+90+114)、PMP22 H4A (+100+124)、PMP22 H4A (+110+134)、PMP22 H4D (+22-3)、PMP22 H5A (-8+17)、PMP22 H5A (+18+42)、PMP22 H5A (+37+61)、PMP22 H5A (+55+79)或PMP22 H5A (+1271+1295)。
在式I之反義寡核苷酸的特定實施例中，該反義寡聚物具有選自以下之靶向序列(R 2)： CTGCGAGGAGAGCGCTGGGCGTGAG (SEQ ID NO: 6)，z為25； AAGTTCTGCTCAGCGGAGTTTCTGC (SEQ ID NO: 7)，z為25； CAACAGGAGGAGCATTCTGGCGGCA (SEQ ID NO: 8)，z為25； CTCAGCAACAGGAGGAGCATTCTGG (SEQ ID NO: 9)，z為25； TGATACTCAGCAACAGGAGGAGCAT (SEQ ID NO: 10)，z為25； ATACTCAGCAACAGGAGGAG (SEQ ID NO: 11)，z為20； TGATACTCAGCAACAGGAGG (SEQ ID NO: 12)，z為20； GACGATGATACTCAGCAACAGGAGG (SEQ ID NO: 13)，z為25； GATGATACTCAGCAACAGGA (SEQ ID NO: 14)，z為20； ACGATGATACTCAGCAACAG (SEQ ID NO: 15)，z為20； TGGAGGACGATGATACTCAGCAACA (SEQ ID NO: 16)，z為25； GGACGATGATACTCAGCAAC (SEQ ID NO: 17)，z為20； GAGGACGATGATACTCAGCA (SEQ ID NO: 18)，z為20； TGGAGGACGATGATACTCAG (SEQ ID NO: 19)，z為20； CGACGTGGAGGACGATGATACTCAG (SEQ ID NO: 20)，z為25； CGTGGAGGACGATGATACTC (SEQ ID NO: 21)，z為20； GACGTGGAGGACGATGATAC (SEQ ID NO: 22)，z為20； CACCGCGACGTGGAGGACGATGATA (SEQ ID NO: 23)，z為25； GCGACGTGGAGGACGATGAT (SEQ ID NO: 24)，z為20； ACCAGCACCGCGACGTGGAGGACGA (SEQ ID NO: 25)，z為25； GCAGCACCAGCACCGCGACGTGGAG (SEQ ID NO: 26)，z為25； GAACAGCAGCACCAGCACCGCGACG (SEQ ID NO: 27)，z為25； GAGACGAACAGCAGCACCAGCACCG (SEQ ID NO: 28)，z為25； AGGCACTCACGCTGACGATCGTGGA (SEQ ID NO: 29)，z為25； CGATCCATTGCTAGAGAGAATCAGA (SEQ ID NO: 30)，z為25； CGTGTCCATTGCCCACGATCCATTG (SEQ ID NO: 31)，z為25； CCAGAGATCAGTTGCGTGTCCATTG (SEQ ID NO: 32)，z為25； ACAGTTCTGCCAGAGATCAGTTGCG (SEQ ID NO: 33)，z為25； GACATTTCCTGAGGAAGAGGTGCTA (SEQ ID NO: 34)，z為25； GATGAGAAACAGTGGTGGACATTTC (SEQ ID NO: 35)，z為25； TTTGGTGATGATGAGAAACAGTGGT (SEQ ID NO: 36)，z為25； AGCCTCACCGTTTGGTGATGATGAG (SEQ ID NO: 37)，z為25； CACCGTTTGGTGATGATGAGAAACA (SEQ ID NO: 38)，z為25； CAGACTGCAGCCATTCTGGGGGAAA (SEQ ID NO: 39)，z為25； GAATGCTGAAGATGATCGACAGGAT (SEQ ID NO: 40)，z為25； AGAGTTGGCAGAAGAACAGGAACAG (SEQ ID NO: 41)，z為25； TGTAAAACCTGCCCCCCTTGGTGAG (SEQ ID NO: 42)，z為25； ATTCCAGTGATGTAAAACCTGCCCC (SEQ ID NO: 43)，z為25； AATTTGGAAGATTCCAGTGATGTAA (SEQ ID NO: 44)，z為25； TACCAGCAAGAATTTGGAAGATTCC (SEQ ID NO: 45)，z為25； CACTCATCACGCACAGACCTGGGGAA (SEQ ID NO: 46)，z為26； GCCTCACCGTGTAGATGGCCGCAGC (SEQ ID NO: 47)，z為25； TTGAGATGCCACTCCGGGTGCCTCA (SEQ ID NO: 48)，z為25； CCGTAGGAGTAATCCGAGTTGAGAT (SEQ ID NO: 49)，z為25； CTCTGATGTTTATTTTAATGCATCT (SEQ ID NO: 50)，z為25。
在式I之反義寡核苷酸的實施例中，該反義寡聚物包含與外顯子2之一部分互補或誘導外顯子2之跳過的靶向序列。
在式I之反義寡核苷酸的另一實施例中，外顯子2之目標區域為PMP22 H2A (-25-1)、PMP22 H2A (+1+25)、PMP22 H2A (+25+49)、PMP22 H2A (+30+54)、PMP22 H2A (+35+59)、PMP22 H2A (+40+64)、PMP22 H2A (+45+69)、PMP22 H2A (+50+74)、PMP22 H2A (+55+79)、PMP22 H2A (+60+84)、PMP22 H2A (+65+89)、PMP22 H2A (+70+94)、PMP22 H2A (+75+99)或PMP22 H2D (+15-10)。
在式I之反義寡核苷酸的特定實施例中，該反義寡聚物包含選自SEQ ID NO: 6至29之靶向序列。
在式I之反義寡核苷酸的實施例中，該反義寡聚物包含與外顯子3之一部分互補或誘導外顯子3之跳過的靶向序列。
在式I之反義寡核苷酸的另一實施例中，外顯子3之目標區域為PMP22 H3A (-15+10)、PMP22 H3A (+1+25)、PMP22 H3A (+15+39)、PMP22 H3A (+24+48)、PMP22 H3A (+48+72)、PMP22 H3A (+65+89)、PMP22 H3A (+74+98)、PMP22 H3D (+17-8)或PMP22 H3D (+22-3)。
在式I之反義寡核苷酸的特定實施例中，該反義寡聚物包含選自SEQ ID NO: 30至38之靶向序列。
在式I之反義寡核苷酸的實施例中，該反義寡聚物包含與外顯子4之一部分互補或誘導外顯子4之跳過的靶向序列。
在式I之反義寡核苷酸的另一實施例中，外顯子4之目標區域為PMP22 H4A (-10+15)、PMP22 H4A (+30+54)、PMP22 H4A (+60+84)、PMP22 H4A (+90+114)、PMP22 H4A (+100+124)、PMP22 H4A (+110+134)或PMP22 H4D (+22-3)。
在式I之反義寡核苷酸的特定實施例中，該反義寡聚物包含選自SEQ ID NO: 39至45之靶向序列。
在式I之反義寡核苷酸的實施例中，該反義寡聚物包含與外顯子5之一部分互補或誘導外顯子5之跳過的靶向序列。
在式I之反義寡核苷酸的另一實施例中，外顯子5之目標區域為PMP22 H5A (-8+17)、PMP22 H5A (+18+42)、PMP22 H5A (+37+61)、PMP22 H5A (+55+79)或PMP22 H5A (+1271+1295)。
在式I之反義寡核苷酸的特定實施例中，該反義寡聚物包含選自SEQ ID NO: 46至50之靶向序列。
在實施例中，該二胺基磷酸酯嗎啉代寡聚物共價連接至細胞穿透肽，其中以下定義中之一者出現在式I之寡聚物中： 1) A'為 ；2) E'為 ；或3) E'為 。
在另一實施例中，E'選自H、-C 1 - 6烷基、-C(O)C 1 - 6烷基、苯甲醯基、硬脂醯基、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基及 。
在又另一實施例中，A'選自-N(C 1-6-烷基)CH 2C(O)NH 2、 。
在另一實施例中，E'選自H、-C(O)CH 3、苯甲醯基、硬脂醯基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基及 。
在另一實施例中，A'選自-N(C 1-6-烷基)CH 2C(O)NH 2、 ；及 E'為 。
在實施例中，A'為 ，及 E'選自H、-C(O)CH 3、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲醯基及硬脂醯基。
在特定實施例中，式I之肽-寡核苷酸結合物係選自以下之肽-寡核苷酸結合物： 其中E'選自H、C 1 - 6-烷基、-C(O)CH 3、苯甲醯基及硬脂醯基。
在實施例中，該肽-寡核苷酸結合物具有式(Ia)。在另一實施例中，該肽-寡核苷酸結合物具有式(Ib)。
在又另一實施例中，E'選自-C(O)(烷基) v(O-烷基) u-NHC(O)-R 9、-C(O)-R 9及-R 9，其中u為0-12，v為0-12，各烷基在各次出現時獨立地為C 2-6-烷基。
在實施例中，A'為 ，其中R 5選自-C(O)(烷基) w(O-烷基) y-NHC(O)-R 9、-C(O)-R 9及-R 9，其中y為0-12，w為0-12，各烷基在各次出現時獨立地為C 2-6-烷基。
在另一實施例中，E'為-C(O)(烷基) v(O-烷基) u-NHC(O)-R 9，其中u為0-12，v為0-12，各烷基在各次出現時獨立地為C 2-6-烷基。
在實施例中，A'為 ；及 E'為-C(O)(烷基) v(O-烷基) u-NHC(O)-R 9，其中u為0-12，v為0-12，各烷基在各次出現時獨立地為C 2-6-烷基。
在另一實施例中，A'為-C(O)(烷基) w(O-烷基) y-NHC(O)-R 9，其中y為0-12，w為0-12，各烷基在各次出現時獨立地為C 2-6-烷基；及E'選自H、-C(O)CH 3、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲醯基及硬脂醯基。
在另一實施例中，式I之結合物為選自以下之結合物： 其中E'為-C(O)(烷基) v(O-烷基) u-NHC(O)-R 9，其中u為0-12，v為0-12，各烷基在各次出現時獨立地為C 2-6-烷基； 其中E'為-C(O)(烷基) v(O-烷基) u-NHC(O)-R 9，其中u為0-12，v為0-12，各烷基在各次出現時獨立地為C 2-6-烷基； 其中R 5選自-C(O)(烷基) w(O-烷基) y-NHC(O)-R 9、-C(O)-R 9及-R 9，其中y為0-12，w為0-12，各烷基在各次出現時獨立地為C 2-6-烷基，且其中E'選自H、C 1 - 6-烷基、-C(O)CH 3、苯甲醯基及硬脂醯基；及 其中R 5選自-C(O)(烷基) w(O-烷基) y-NHC(O)-R 9、-C(O)-R 9及-R 9，其中y為0-12，w為0-12，各烷基在各次出現時獨立地為C 2-6-烷基。
在特定實施例中，該結合物具有式(Ic)： 。
在另一特定實施例中，該結合物具有式(Id)： 。
在實施例中，本文提供一種化合物，其具有以下結構： 。
在式I之反義寡核苷酸的實施例中，該細胞穿透肽選自rTAT、Tat、R 9F 2、R 5F 2R 4、R 4、R 5、R 6、R 7、R 8、R 9、(RAhxR) 4、(RAhxR) 5、(RAhxRRBR) 2、(RAR) 4F 2及(RGR) 4F 2。
在實施例中，各R 1為N(CH 3) 2。在另一實施例中，該靶向序列選自SEQ ID NO: 6至50。
在另一實施例中，各R 2在各次出現時獨立地為選自以下之核鹼基：腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶及次黃嘌呤。在又另一實施例中，L為甘胺酸。
在另一實施例中，G選自H、C(O)CH 3、苯甲醯基及硬脂醯基。
在實施例中，G為H或-C(O)CH 3。
在另一實施例中，G為H。
在另一實施例中，G為-C(O)CH 3。
在一態樣中，本文提供一種反義寡聚物化合物及醫藥學上可接受之載劑。
寡聚物化學特徵本發明之反義寡聚物可採用多種反義寡聚物化學物質。寡聚物化學物質之實例包括(但不限於)嗎啉代寡聚物、硫代磷酸酯修飾之寡聚物、2'-O-甲基修飾之寡聚物、肽核酸(PNA)、鎖定核酸(LNA)、硫代磷酸酯寡聚物、2'-O-MOE修飾之寡聚物、2'-氟-修飾之寡聚物、2'-O,4'-C-伸乙基-橋接之核酸(ENA)、三環-DNA、三環-DNA硫代磷酸酯次單元、2'-O-[2-(N-甲基胺甲醯基)乙基]修飾之寡聚物，包括前述任一者之組合。硫代磷酸酯及2'-O-Me-修飾之化學物質可組合以產生2'-O-Me-硫代磷酸酯主鏈。參見例如PCT公開案第WO/2013/112053及WO/2009/008725號，其以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，經修飾之反義寡聚物的核鹼基連接至嗎啉代環結構，其中嗎啉代環結構藉由將一個環結構之嗎啉代氮連接至相鄰環結構之5'環外碳的含磷次單元間鍵聯而被連接。
在一些實施例中，反義寡聚物之核鹼基連接至肽核酸(PNA)，其中磷酸-糖聚核苷酸主鏈經核鹼基所連接之可撓性假肽聚合物置換。在一些態樣中，反義寡聚物之核鹼基中之至少一者連接至鎖定核酸(LNA)，其中該鎖定核酸結構為經化學修飾之核苷酸類似物，其中核糖部分具有連接2'氧及4'碳之額外橋。
在一些實施例中，反義寡聚物之核鹼基中之至少一者連接至橋接之核酸(BNA)，其中藉由將另一橋接之結構引入呋喃醣骨架來限制或鎖定糖構形。在一些態樣中，反義寡聚物之核鹼基中之至少一者連接至2'-O,4'-C-伸乙基-橋接之核酸(ENA)。
在一些實施例中，經修飾之反義寡聚物可含有解鎖核酸(UNA)次單元。UNA及UNA寡聚物為RNA之類似物，其中次單元之C2'-C3'鍵已裂解。
在一些實施例中，經修飾之反義寡聚物含有一或多個硫代磷酸酯(或S-寡聚物)，其中非橋接氧中之一者經硫置換。在一些態樣中，經修飾之反義寡聚物含有一或多個2' O-甲基、2' O-MOE、MCE及2'-F，其中核糖之2'-OH分別經甲基、甲氧基乙基、2-(N-甲基胺甲醯基)乙基或氟基置換。
在一些實施例中，經修飾之反義寡聚物為三環DNA (tc-DNA)，其為受限的DNA類似物，其中各核苷酸藉由引入環丙烷環而經修飾，以約束主鏈之構形可撓性且最佳化扭轉角g之主鏈幾何結構。
在一些實施例中，反義寡聚物之核鹼基中之至少一者連接至橋接之核酸(BNA)，其中藉由將另一橋接之結構引入呋喃醣骨架來限制或鎖定糖構形。在一些態樣中，反義寡聚物之核鹼基中之至少一者連接至2'-O,4'-C-伸乙基-橋接之核酸(ENA)。在此類態樣中，連接至BNA或ENA之各核鹼基包含5-甲基。
1.肽核酸(PNAs) 肽核酸(PNA)為主鏈與去氧核苷主鏈結構上同形的DNA類似物，該去氧核糖主鏈由與嘧啶鹼基或嘌呤鹼基所連接之N-(2-胺基乙基)甘胺酸單元組成。含有天然嘧啶及嘌呤鹼基之PNA與互補寡聚物雜交，遵從華特生-克里克鹼基配對規則，且就鹼基對識別而言模擬DNA。PNA之主鏈藉由肽鍵而非磷酸二酯鍵形成，使其極適合於反義應用(參見以下結構)。主鏈不帶電，產生展現出大於正常熱穩定性之PNA/DNA或PNA/RNA雙螺旋體。PNA並未由核酸酶或蛋白酶識別。
PNA之非限制性實例描繪如下。
儘管天然結構發生基團結構變化，但PNA能夠以螺旋形式與DNA或RNA進行序列特異性結合。PNA之特徵包括：與互補DNA或RNA之較高結合親和力；由單鹼基錯配引起之去穩定化效應；對核酸酶及蛋白酶之抗性；與獨立於鹽濃度之DNA或RNA雜交且與同嘌呤DNA形成三螺旋體。PANAGENE™開發出其專用Bts PNA單體(Bts；苯并噻唑-2-磺醯基)及專用寡聚方法。使用Bts PNA單體之PNA寡聚係由去除保護基、偶合及封端之重複循環組成。PNA可使用此項技術中已知之任何技術以合成方式產生。參見例如美國專利第6,969,766；7,211,668；7,022,851；7,125,994；7,145,006及7,179,896號。針對PNA之製備亦參見美國專利第5,539,082；5,714,331及5,719,262號。PNA化合物之其他教示可見於Nielsen等人., Science, 254: 1497-1500, 1991。前述各者以全文引用的方式併入本文中。
2.鎖定核酸(LNAs) 反義寡聚物亦可含有「鎖定核酸次單元」(LNA)。「LNA」為一類稱為橋接之核酸(BNA)的修飾之成員。BNA之特徵在於在C30-內(northern)糖皺褶中鎖定核糖環之構形的共價鍵。對於LNA，橋係由2'-O及4'-C位置之間的亞甲基組成。LNA促進主鏈預組織及鹼基堆疊以增加雜交及熱穩定性。
LNA之結構可發現於例如以下中：Wengel,等人., Chemical Communications (1998) 455; Koshkin等人., Tetrahedron (1998) 54:3607; Jesper Wengel, Accounts of Chem. Research (1999) 32:301; Obika,等人, Tetrahedron Letters (1997) 38:8735; Obika,等人, Tetrahedron Letters (1998) 39:5401; and Obika,等人, Bioorganic Medicinal Chemistry (2008) 16:9230，其特此以全文引用之方式併入。LNA之非限制性實例描繪如下。
本發明之反義寡聚物可併入一或多個LNA；在一些情況下，反義寡聚物可完全由LNA構成。個別LNA核苷次單元之合成及其併入至寡聚物中之方法描述於例如以下中：美國專利第7,572,582；7,569,575；7,084,125；7,060,809；7,053,207；7,034,133；6,794,499及6,670,461號；其中各者以全文引用的方式併入本文中。典型次單元間連接子包括磷酸二酯及硫代磷酸酯部分；或者，可採用含有非磷之連接子。其他實施例包括含有反義寡聚物之LNA，其中各LNA子單元由DNA子單元隔開。某些反義寡聚物由交替的LNA及DNA子單元組成，其中子單元間連接子為硫代磷酸酯。
3.伸乙基橋接之核酸(ENAs) 2'- O,4'-C-伸乙基橋接之核酸(ENAs)為BNAs類別之另一成員。非限制性實例描繪如下。
ENA寡聚物及其製備描述於Obika等人., Tetrahedron Lett (1997) 38 (50): 8735中，其以全文引用之方式併入本文中。本發明之反義寡聚物可併入一或多種ENA次單位。
4.無鎖定核酸(UNAs) 反義寡聚物亦可含有無鎖定核酸(UNA)次單元。UNA及UNA寡聚物為RNA之類似物，其中次單元之C2'-C3'鍵已裂解。儘管LNA在構形上受限(相對於DNA及RNA)，UNA極具可撓性。UNA例如揭示於WO 2016/070166中。UNA之非限制性實例描繪如下。
典型次單元間連接子包括磷酸二酯及硫代磷酸酯部分；或者，可採用含有非磷之連接子。
5.硫代磷酸酯 硫代磷酸酯(或S-寡聚物)為正常DNA之變異體，其中一個非橋聯氧由硫置換。硫代磷酸酯之非限制性實例描繪如下。
核苷酸間鍵之硫化降低內切核酸酶及外切核酸酶之作用，包括5'至3'及3'至5' DNA POL 1外切核酸酶、核酸酶SI及PI、核糖核酸酶、血清核酸酶及蛇毒磷酸二酯酶。硫代磷酸酯藉由兩種主要途徑製備：藉由元素硫在二硫化碳中之溶液在膦酸氫上之作用，或藉由亞磷酸酯三酯與四乙基雙甲硫羰醯胺二硫化物(TETD)或3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮1,1-二氧化物(BDTD)之方法(參見例如Iyer等人, J. Org. Chem. 55, 4693-4699, 1990，其以全文引用之方式併入本文中)。後一方法避免元素硫在大部分有機溶劑中不可溶性及二硫化碳之毒性的問題。TETD及BDTD方法亦產生更高純度之硫代磷酸酯。
在反義寡聚物之特定實施例中，反義寡聚物為式II之硫代磷酸酯寡核苷酸結合物： 或其醫藥學上可接受之鹽， 其中： A'選自-NHCH 2C(O)NH 2、-N(C 1-6-烷基)CH 2C(O)NH 2、 ，其中 R 5為-C(O)(O-烷基) x-OH，其中x為3-10，且各烷基在各次出現時獨立地為C 2 - 6-烷基，或R 5選自-C(O)C 1 - 6烷基、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、-(C 1 - 6-烷基)R 6、-(C 1 - 6雜烷基)-R 6、芳基-R 6、雜芳基-R 6、-C(O)O-(C 1 - 6烷基)-R 6、-C(O)O-芳基-R 6、-C(O)O-雜芳基-R 6，及 ， 其中R 6選自OH、SH及NH 2，或R 6為共價連接至固體載體之O、S或NH； 各R 2獨立地選自天然或非天然存在之核鹼基，且由各R 2自5'至3'之組合形成的序列為靶向序列； z為8至40； E'選自H、-C 1 - 6烷基、-C(O)C 1 - 6烷基、苯甲醯基、硬脂醯基、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、 ， 其中 R 11選自OH及-NR 3R 4； 其中L藉由醯胺鍵共價連接至J之羧基末端，且L選自-NH(CH 2) 1 - 6C(O)-、-NH(CH 2) 1 - 6C(O)NH(CH 2) 1 - 6C(O)-及 ； J為載體肽； G選自H、-C(O)C 1 - 6烷基、苯甲醯基及硬脂醯基，且G共價連接至J之胺基末端。
6.三環-DNA及三環-硫代磷酸酯次單元 三環-DNAs (tc-DNA)為一類受限的DNA類似物，其中各核苷酸藉由引入環丙烷環而經修飾，以約束主鏈之構形可撓性且最佳化扭轉角g之主鏈幾何結構。含有同鹼性腺嘌呤及胸腺嘧啶之tc-DNA與互補RNA形成異常穩定的A-T鹼基對。三環DNA及其合成描述於國際專利申請公開案第WO 2010/115993號，其以全文引用之方式併入本文中。本發明之反義寡聚物可併入一或多個三環-DNA次單元；在一些情況下，反義寡聚物可全部由三環-DNA次單元構成。
三環硫代磷酸酯次單元為具有硫代磷酸酯次單元間鍵之三環DNA次單元。三環硫代磷酸酯次單元及其合成描述於國際專利申請公開案第WO 2013/053928號，其以全文引用之方式併入本文中。本發明之反義寡聚物可併入一或多個三環-DNA次單元；在一些情況下，反義寡聚物可全部由三環-DNA次單元構成。下文描繪三環-DNA/三環-硫代磷酸酯次單元之非限制性實例。 三環-DNA 7. 2'-O-甲基、2'-O-MOE及2'-F寡聚物 2'-O-Me寡聚物分子在核糖分子之2'-OH殘基處攜帶甲基。2'-O-Me-RNA展示與DNA相同(或類似)的行為，但受保護免於核酸酶降解。2'-O-Me-RNAs亦可與硫代磷酸酯寡聚物(PTO)組合用於進一步穩定化。2'-O-Me寡聚物(磷酸二酯或硫代磷酸酯)可根據此項技術中之常規技術合成(參見例如Yoo等人, Nucleic Acids Res. 32:2008-16, 2004，其以全文引用的方式併入本文中)。2'-O-Me寡聚物之非限制性實例描繪如下。 2'-O-甲氧基乙基寡聚物(2'-O-MOE)在核糖分子之2'-OH殘基處攜帶甲氧基乙基且論述於Martin等人., Helv. Chim. Acta, 78, 486- 504, 1995中，其以全文引用的方式併入本文中。2'-O-MOE之非限制性實例描繪如下。 2'-氟(2'-F)寡聚物在2'位置處具有氟基代替2'-OH。2'-F寡聚物之非限制性實例描繪如下。 2'-氟寡聚物進一步描述於WO 2004/043977中，其以全文引用之方式併入本文中。
2'-O-甲基、2'-O-MOE及2'-F寡聚物亦可包含一或多個如下文所描繪之硫代磷酸酯(PS)鍵。
另外，2'-O-甲基、2'-O-MOE及2'-F寡聚物在整個寡聚物，例如如在以下所描繪之2'-O-甲基PS寡聚物屈沙培森中可包含PS次單元間鍵。
或者，2'-O-甲基、2'-O-MOE及/或2'-F寡聚物可包含在寡聚物末端處之PS鍵，如下文所描繪。 其中： R為CH 2CH 2OCH 3(甲氧基乙基或MOE)；及 X、Y及Z分別表示名為5'-翼、中心間隙及3'-翼區中之各者內含有的核苷酸數目。
本發明之反義寡聚物可併入一或多個2'-O-甲基、2'-O-MOE及2'-F次單元且可利用本文所描述之次單元間鍵中之任一者。在一些情況下，本發明之反義寡聚物可完全由2'-O-甲基、2'-O-MOE或2'-F次單元形成。本發明之反義寡聚物的一個實施例由2'-O-甲基次單元形成。
8. 2'-O-[2-(N-甲基胺甲醯基)乙基]寡聚物(MCEs) MCE為適用於本發明之反義寡聚物中的2'-O修飾之核糖核苷的另一實例。在本文中，2'-OH衍生為2-(N-甲基胺甲醯基)乙基部分以增加核酸酶抗性。MCE寡聚物之非限制性實例描繪如下。 MCE及其合成描述於Yamada等人, J. Org. Chem. (2011) 76(9):3042- 53中，其以全文引用之方式併入本文中。本發明之反義寡聚物可併入一或多種MCE次單位。
III. 周邊髓鞘蛋白 22 之 剪接調節的序列在反義應用之一些實施例中，寡聚物可與核酸目標序列100%互補，或其可包括錯配，例如以適應變異體，只要在寡聚物與核酸目標序列之間形成的異雙螺旋足夠穩定以耐受活體內可發生之細胞核酸酶及其他降解模式之作用即可。朝向雜交雙螺旋之末端區域之錯配(若存在)，比在中間之錯配更穩定。所允許錯配之數目將取決於寡聚物之長度、雙螺旋中G:C鹼基對之百分比及雙螺旋中錯配之位置，根據雙螺旋穩定性之充分理解原理。儘管此類反義寡聚物未必與核酸目標序列100%互補，但其可有效地穩定且特異性結合至目標序列，使得核酸目標之生物活性(例如經編碼蛋白質之表現)受到調節。
形成於寡聚物與目標序列之間的雙螺旋之穩定性與結合T m與雙螺旋對蜂巢式酶促裂解之易感性有關。反義化合物關於互補序列RNA之T m可藉由習知方法來量測，該等方法諸如由Hames等人，Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, 1985,第107至108頁所描述或如Miyada CG.及Wallace RB (1987) Oligonucleotide hybridization techniques, Methods Enzymol. 第154卷，第94-107頁中所描述之彼等。
在一些實施例中，各反義寡聚物具有大於體溫或在其他實施例中大於50℃之關於互補序列RNA的結合T m。在其他實施例中，T m's在範圍60-80℃或更大。根據充分理解原理，寡聚物化合物相對於基於互補之RNA雜交的T m可藉由增加雙螺旋中之C:G成對鹼基的比率及/或藉由增加異雙螺旋之長度(以鹼基對計)而增加。同時，出於最佳化細胞攝取之目的，限制寡聚物之大小可為有利的。出於此原因，一般偏好在20個鹼基或更少之長度下展現出較高T m(50℃或更高)之化合物更甚於那些為了較高T m值而需要大於20個鹼基的化合物。對於一些應用，較長寡聚物(例如，長於20個鹼基)可具有某些優點。
靶向序列鹼基可為正常DNA鹼基或其類似物，例如能夠與目標序列RNA鹼基之華特生-克里克鹼基配對的尿嘧啶及肌苷。
反義寡聚物可經設計以阻斷或抑制或調節mRNA之轉譯或抑制或調節前驅mRNA剪接處理，或誘導靶向mRNA之降解，且可稱為針對與其雜交之目標序列加以「引導」或「靶向」。在某些實施例中，目標序列包括區域，該區域包括經預處理之mRNA的3'或5'剪接位點、分支點或涉及剪接調節之其他序列。目標序列可在外顯子內或內含子內或跨越內含子/外顯子接合點。
具有與目標RNA序列互補之充足序列以調節目標RNA之剪接的反義寡聚物意謂反義藥劑具有足以觸發天然蛋白質之結合位點之掩蔽的序列，從而以其他方式調節剪接及/或改變靶向RNA之三維結構。同樣地，具有與目標RNA序列互補之足以調節目標RNA之剪接的序列的寡聚物藥劑意謂寡聚物藥劑具有足以觸發天然蛋白質之結合位點之掩蔽的序列，從而將以其他方式調節剪接及/或改變目標RNA之三維結構。
在某些實施例中，反義寡聚物具有足夠的長度且與PMP22前驅mRNA中之序列互補，該序列提供於下 表 2A中。
表 2A PMP22 前驅mRNA (SEQ ID NO: 1)
AATAAACTGGAAAGACGCCTGGTCTGGCTTCAGTTACAGGGAGCACCACCAGGGAACATCTCGGGGAGCCTGGTTGGAAGCTGCAGGCTTAGTCTGTCGGCTGCGGGTCTCTGACTGCCCTGTGGGGAGGGTCTTGCCTTAACATCCCTTGCATTTGGCTGCAAAGAAATCTGCTTGGAAGAAGGGGTTACGCTGTTTGGCCGGGTGAGTTTTATTGGCAAACTGTGCCTCTGGGTGATGTGTGCCTATGCTTTACAAGAATTGCCTAATTTCCCACCCCCTGCAAGCCGCAAATGAAAAGGATTGCAGGAGAGATGGTGCATTTGTGTTGGAATTGACTGGAGATTCAGAGGGCTTTTTATATCCTTGGTTAAAAGGTGGATATATACTCTGGCTGGGGAGGTGGGGGGCCATCTGAGAGCATCTAGAAACCCTAATGCATCCAGATTGAAAGGAAGAAAGGAATCTAGATGCTTTTTCCCCCATGGAAAATAGCTGTGCACACACAGCTGGCAGGTGGCCTTGGTAAGCAGGTTAGGGAGAAGCTGCCACCTGTGGCAGAGCCTTGGCCAGCCGGGCTCTGGGTGTGGCAAGCCTGGTCAGCAGGCACTGAGTAGCACTTCCTCTGCCACCATTGAGAACCAGGCAGGAGGCCAGAGGCAGTGAGGGACAGATGGGTTGGGTTTACCTGTCTGGCAGTATATGGTGTGGCTGTGACCTGGGTGGTTATTGATTAAACTATTGGGTTCAAAAGAAAGGAAGAAGCGAGCTGTAGCACCCAATATATGCACTTTTCTGTATGTGTATTAGACTTTATTAAAAAGTTTATTTGAAAATCACAAAGGAAGGGAAAGAAAACCCTGAGTTAGATATGCTCATATTTCTAAAGTGCTTACTTAGAACAGTCCTGAGTATGTTGTGATCACATAAGTGTTGGTTAAATAAATAAATGTCCAAATGGCATAAAACAAAGTAATAATTTCTAGAGCAAATCTAACTTATAAAATGACCTGTGGAGGAAAGAAAACACTGCCATGTCTTTAGACTTTTTTTTCTACTTGCATATGCACTTTCATTTATAAATCTTTATCTATCTATCTATATCTATCTATCTATCTATCTATCTACCTACCTACCTACCTACCTATCAGAGTTACAAGCTACTTTAGTGCAGAGGTGGTCAGGTCTTCCCTGAAAGGTTGATGTGAGAGTTAAATGTGATATAATAATAGTGGTGGCAATTTGGGCACTGGGCCCTTATTATGTTGCAGACACGATGTTAACTGCTTTGTACATATTGTCTCCTTCAATCACCACCATAAACCTTTAAAGCAGGCATTACTATTTCCTTTTGCACCTGAGAAAACTGAAGCTCAGTGAACTTGAGAAATTGCCCAAATTCACAACAAAAGTAAGCAGGGTGATTAGGTTTGTTGGAGCCCAGAGCCAGAGTGCCTAACCACTGCACCATACTGCCTCTCACAGACCATGCATATAAAGTCCAGGCAAAGTGCTTGGCATATAACGGGCACTGTAAATGCAGTGTTTACAAGTACACTTCATTTTAATCTGATAACACGATAGTTTTAAAAAGATCATTGTTTGAAGATCTTTTTCAAATTTATTTTTACTTACCGTAAGAATATACAATTAGCTAAAATAGCAGCTCCTTTCAAATCGTAAAATAATATAGAATTATTTGAATCATTGAGAGTGATGAGCTTCTATGACACAGTACACTAGAGGTAGGGAAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGCGCGCGTGCGTGAACTGCTGCATTTTCAGGCAGAAACCTTTAACATCCACATTCCTGCTCCCTGTCCCGTGCCTCAAGGCTGGCCTGCGCACGGGAGTCTCAGTTGGGCGCGCCTCTGCCAAGCCGAGACTGAAGGGGGCTAGCCTCTCTCCCTGTAACGCTGGGCGGGCCACGTTAGGAGGCTATGAATCAGCTGATTTCCTTGGCTGCTCCAACCCCACCTCAAATGGCCACCTCGCACCCGCCCGCCAAACCCCATGGCCAGGACTCCAGCCAAGGCTGACAGCCAAGCCCGACTGCTGCAGGAACACTTTGCCTAGAGCTTATTCGGTGGTAGTCTGGTTTTGCCTAGGCTAGGAGGAGCCCAATCCCAGACCATGCTATCCAGTAGTCGGCCGGACTTTTCTTCCCCTAATTCGCACCCAAGAGGAGCCCGCTAGATCAATCCCCGCCAATCCTAGGAAGCTGGCATGCTTCGTAGGTGCAGACAGTAATAGCGGGGACCGGCGCGGGGCAGGTGTGTCCGGCTAAGACGCCAGGACAGGGCAGGGGCTCCAGGACCCGAGAGGAGAGGGACTTCTTCCAGCGCTCAAGCGCCCGCTGCCCTCTATTAGTGGGAAAGGAATCCAGCCTCAGCCCCGCGCGGGCGCGGTCGGCGTCGGCGGGCCCAGAAGCCCAGCCCTGGGCATCCGCTGAGCTACATTTGGCTGGGTCTTCCCAGAGTGGGCTGAGGAGCCAGTTTCTCGGTCAACACTAGGTCTCCACGGGGCCAGGGGAGAAGGGAGGTGGGAGGTGAGAAAGCTCAGCCGCCTCTGGTTTCGAGTAAAAGTCGCCGCGGTTTTGCAGGGACCGACTTTTTCTTGAGGCGCATTTAAGGCCAAGTGACTGTCTCCTGCCCTCCCTCTCTCCTGCCCCCTCTCCTCCCTGAGTCCCGCCCTCCCGCACACGCTGACCCAGGGACACACCCTACTGCAGCGACGCAAACAGGGCGTTGTTCCCGTTAAAGGGGAACGCCAGGAGCCTCCCACTGCCCCCTTGCTTCGCGCGCGCGCAGCCCCGCAGCGCAGCTTTGGCGGCGCCAGCAGCGGAGCCAACGCACCCGAGTTTGTGTTTGAGGCCACCCTGAGGATCGGGACAGCTGTTCCTTTGGGCTGTAAGTGATTTGGTGGGGAGAGTGAAGGAGATGGAGGAGAAATGTGGGCATCTTCCAGTGAGGGTGCCAGAAAGCGCAGCGCAGGCGCGGGGCTTTGGCCAGCTCCCTGGGGCTTCTGTTTAGGGGCACAGGGTCCCCTGTGTGTCCTGTTTCCCTCCAATGGGTCTTGGAGTAATACAACGAGGAGAGCCTTTATGGTCTATAAGACCTTACAGGGCAAGGGTGATGGTGCTGGTGTCTGGATAGCGGATAAGGGCGGCCCAGTTCTCGCCTTGCTGAAGAGGCGTTGACTCTGGGACACACTGGCAAAACAGTCCCTGTGGCGGACATCCCGAGAGTGTTGGACTCCTGTGGTTCCCCAGTTCCCAGCCTCCTGCCATCGGCTTAATTCAAACCCTCTGGGAGTCATCAGAAATCCTTGTTTATTTCTTCCAGTGCATTCCAGAGTTTCTTTGAATGTGATGCTTGTGGAGAGGAACAGAGGGGCCTGGGATTGGGTACTTTCCAAACTGGGTTATTGAAACGTTGTCTCCCTGGCCCAAGACTCTGCCTAAAATGGTCCCCAGAGTCTCAGCCAGATCTTTCACAGCCATGCATGTCCTCTAACAGGTCATCCCAGCCTTCAGTTCCCCCAAAGTTTAAAATGAGGGGCGAGGACCGCATTACTTGGGATAAATGTCCTGCCGGCTCTGACCGGCTGAAATTCTCGGACTCAGCCTTTTACCCTCTGTCTCTCTCTCCCGTCCGCTGGACATCTACTCCCTTCGGTCCAGGCTCCTGGGCTCCTGTCCCACCGCACCCAGACCGGAGCTCAGGCTTGTTGGGGTTCGTGTCCTGGCTTTGAGTGCCTGGGGTGCAGACTGGACCCCTAGGCGAGCACGTGGGTCTAGCGCAAGAGCAGAATGCCCCCTGACCCCAGGGGCTGCCTGGGGAAGCGCGCGGTGGACGGGAAGCGCAGGGTCCGGGCAACCCTCTCGAGCCATTCTTTTCTTTCCACACTACTCTGGCTCTGCACCACCTCTCCGGAGCCGCCAGAGTCTGCGCGAGGCTGAGCTGGGGCCAGGACCGTTCCTCTACGCTGGCAGAGTTGGGTGGAAACTTGGAGACAAACGGAATGCGGAGAGCACTGGGGTCTGGGAAACCAGCCTCCTCGCCGCTGTCTCCCCCACCGCATGCCACGGCTGTCTCCAGGTCTCAGACGGAAATCTGGGCACCTACTCCCCTCACCCCTACCTCCACCCCATAGGGGAATTCACCATCTGAACCGGGGTCTCGGAGAACGTGACCTCTCACCTTCCAGGGAGGTCGCCGGGAGGTGCTTGGGGTGGGTGGAAGCGTGCAGTGGCCTCTGCTCATATTTTCTGGAAACCCCTCCGTTCCCTGGGTGGTTTTAGACGTGCGAACCGCTTGTTTTGTTTCCAAAAGCAAAAGATGTTCCGTTGCAGGCGGGCCCGGCTGGGCGCTGGGCACTGGGCGCTGGTCCTGCAGGCGGCTGCTGCCCCCTCTCGGCGGCAGGCGGCGCGAAGGCTCCTGACCCGCGCGGGCGGTCGGGCTGCGGGCGCTGGGCCAGGCCGGGCCTTCCGCTAGTGCGCGGGACCCTCCCTCTGCGCGCGCCTCCGTCGCTCGGCCCAGTGCGTTCGGCCTCACGCCCAGCGCTCTCCTCGCAGGCAGAAACTCCGCTGAGCAGAACTTGCCGCCAGAATGCTCCTCCTGTTGCTGAGTATCATCGTCCTCCACGTCGCGGTGCTGGTGCTGCTGTTCGTCTCCACGATCGTCAGCGTGAGTGCCTGGCGGGGAGGCTCCCTGCGCGGCCCGCCCTTCCCCATCTGGGTTCCCAGCCCGTGCTCCTGCTGGTTCAGGACTGTGTTATTTGCAGACAGTTGGAAGTCTCAGACGTCCCAGGGAAGTTTCTGGCAATCTGCCCCCTTCCAGTTGCTTTGAGAAAACGAGAGCAGATTCAGTGATAGGAACCAAGCGAGCGCTGGGCTGGGTTAGCTGCGCAGGTCTCTATTTAAGCCAAGTAACTTCAGAGCCGATCTAGGGTCCCCGACCTTCATTTGACAAGATTGTT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GCCCAAACTGGAGCCCTTGCAAAAACACGGCTTGTGGCATTGGCATACTTGCCCTTACAGGTGGAGTATCTTCGTCACACATCTAAATGAGAAATCAGTGACAACAAGTCTTTGAAATGGTGCTATGGATTTACCATTCCTTATTATCACTAATCATCTAAACAACTCACTGGAAATCCAATTAACAATTTTACAACATAAGATAGAATGGAGACCTGAATAATTCTGTGTAATATAAATGGTTTATAACTGCTTTTGTACCTAGCTAGGCTGCTATTATTACTATAATGAGTAAATCATAAAGCCTTCATCACTCCCACATTTTTCTTACGGTCGGAGCATCAGAACAAGCGTCTAGACTCCTTGGGACCGTGAGTTCCTAGAGCTTGGCTGGGTCTAGGCTGTTCTGTGCCTCCAAGGACTGTCTGGCAATGACTTGTATTGGCCACCAACTGTAGATGTATATATGGTGCCCTTCTGATGCTAAGACTCCAGACCTTTTGTTTTTGCTTTGCATTTTCTGATTTTATACCAACTGTGTGGACTAAGATGCATTAAAATAAACATCAGAGTAACTCACT
在某些實施例中，反義寡聚物具有足夠的長度，且與PMP22前驅mRNA之外顯子2、PMP22前驅mRNA之外顯子3、PMP22前驅mRNA之外顯子3、PMP22前驅mRNA之外顯子4或PMP22前驅mRNA之外顯子5中之序列互補。亦包括與跨越PMP22前驅mRNA之外顯子2/內含子接合點的區域、跨越PMP22前驅mRNA之外顯子3/內含子接合點的區域、跨越PMP22前驅mRNA之外顯子4/內含子接合點的區域或跨越PMP22前驅mRNA之外顯子5/內含子接合點的區域互補之反義寡聚物。PMP22基因之外顯子2 (SEQ ID NO: 2)、外顯子3 (SEQ ID NO: 3)、外顯子4 (SEQ ID NO: 4)或外顯子5 (SEQ ID NO: 5)(寄存編號NM_000304.4)展示於下 表 2B中。
表 2B PMP22 基因之目標序列
名稱 序列 (5 ' -3 ' ) SEQ ID NO
PMP-22 外顯子2 GCAGAAACTCCGCTGAGCAGAACTTGCCGCCAGAATGCTCCTCCTGTTGCTGAGTATCATCGTCCTCCACGTCGCGGTGCTGGTGCTGCTGTTCGTCTCCACGATCGTCAGC 2
PMP-22 外顯子3 CAATGGATCGTGGGCAATGGACACGCAACTGATCTCTGGCAGAACTGTAGCACCTCTTCCTCAGGAAATGTCCACCACTGTTTCTCATCATCACCAAACG 3
PMP-22 外顯子4 AATGGCTGCAGTCTGTCCAGGCCACCATGATCCTGTCGATCATCTTCAGCATTCTGTCTCTGTTCCTGTTCTTCTGCCAACTCTTCACCCTCACCAAGGGGGGCAGGTTTTACATCACTGGAATCTTCCAAATTCTTGCTG 4
PMP-22 外顯子5 GTCTGTGCGTGATGAGTGCTGCGGCCATCTACACGGTGAGGCACCCGGAGTGGCATCTCAACTCGGATTACTCCTACGGTTTCGCCTACATCCTGGCCTGGGTGGCCTTCCCCCTGGCCCTTCTCAGCGGTGTCATCTATGTGATCTTGCGGAAACGCGAATGAGGCGCCCAGACGGTCTGTCTGAGGCTCTGAGCGTACATAGGGAAGGGAGGAAGGGAAAACAGAAAGCAGACAAAGAAAAAAGAGCTAGCCCAAAATCCCAAACTCAAACCAAACCAAACAGAAAGCAGTGGAGGTGGGGGTTGCTGTTGATTGAAGATGTATATAATATCTCCGGTTTATAAAACCTATTTATAACACTTTTTACATATATGTACATAGTATTGTTTGCTTTTTATGTTGACCATCAGCCTCGTGTTGAGCCTTAAAGAAGTAGCTAAGGAACTTTACATCCTAACAGTATAATCCAGCTCAGTATTTTTGTTTTGTTTTTTGTTTGTTTGTTTTGTTTTACCCAGAAATAAGATAACTCCATCTCGCCCCTTCCCTTTCATCTGAAAGAAGATACCTCCCTCCCAGTCCACCTCATTTAGAAAACCAAAGTGTGGGTAGAAACCCCAAATGTCCAAAAGCCCTTTTCTGGTGGGTGACCCAGTGCATCCAACAGAAACAGCCGCTGCCCGAACCTCTGTGTGAAGCTTTACGCGCACACGGACAAAATGCCCAAACTGGAGCCCTTGCAAAAACACGGCTTGTGGCATTGGCATACTTGCCCTTACAGGTGGAGTATCTTCGTCACACATCTAAATGAGAAATCAGTGACAACAAGTCTTTGAAATGGTGCTATGGATTTACCATTCCTTATTATCACTAATCATCTAAACAACTCACTGGAAATCCAATTAACAATTTTACAACATAAGATAGAATGGAGACCTGAATAATTCTGTGTAATATAAATGGTTTATAACTGCTTTTGTACCTAGCTAGGCTGCTATTATTACTATAATGAGTAAATCATAAAGCCTTCATCACTCCCACATTTTTCTTACGGTCGGAGCATCAGAACAAGCGTCTAGACTCCTTGGGACCGTGAGTTCCTAGAGCTTGGCTGGGTCTAGGCTGTTCTGTGCCTCCAAGGACTGTCTGGCAATGACTTGTATTGGCCACCAACTGTAGATGTATATATGGTGCCCTTCTGATGCTAAGACTCCAGACCTTTTGTTTTTGCTTTGCATTTTCTGATTTTATACCAACTGTGTGGACTAAGATGCATTAAAATAAACATCAGAGTAACTCA 5
在某些實施例中，反義靶向序列經設計以雜合至 表 2A 及表 2B中所列出之目標序列中之一或多者的區域。可使所選反義靶向序列更短，例如約12個鹼基或更長，例如約40個鹼基，且包括少數錯配，只要序列在與目標序列雜交時充分互補以實現剪接調節，且視情況與RNA形成具有45℃或更大之Tm的異雙螺旋。
在某些實施例中，靶序列與反義靶向序列之間的互補程度足以形成穩定雙螺旋。反義寡聚物與目標RNA序列之互補區可能短至8-11個鹼基，但可為12-15個鹼基或更多，例如10-40個鹼基、12-30個鹼基、12-25個鹼基、15-25個鹼基、12-20個鹼基或15-20個鹼基，包括此等範圍之間的所有整數。約14-15個鹼基之反義寡聚物一般足夠長以具有獨特互補序列。在某些實施例中，如本文所論述，可能需要最小長度之互補鹼基來達成必需的結合Tm。
在某些實施例中，只要40個鹼基可為適合的，其中至少最小數目個鹼基(例如，10至12個鹼基)，寡聚物與目標序列互補。在一些實施例中，在低於約30個鹼基之寡聚物長度下最佳化細胞中之促進或活性吸收。對於PMO寡聚物，本文進一步描述，結合穩定性及吸收之最優平衡一般在18至25個鹼基之長度下發生。本發明中包括由約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個鹼基組成之反義寡聚物(例如，PMOs、PMO-X、PNAs、LNAs、2'-OMe)，其中至少約6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個連續或非連續鹼基與表2A及2B之目標序列互補。
反義寡聚物通常包含與PMP22基因之前驅mRNA序列之外顯子2、外顯子3、外顯子4或外顯子5內或與其相鄰之序列或區域充分互補的鹼基序列。理想地，反義寡聚物能夠有效調節PMP22前驅mRNA之異常剪接，且藉此增加活性PMP22蛋白質之表現。當寡聚物化合物具有由哺乳動物細胞主動吸收之能力，且一旦吸收，則視情況與目標mRNA形成穩定的雙螺旋(或異雙螺旋)，視情況Tm大於約40℃或45℃時，滿足此要求。
在某些實施例中，反義寡聚物可與目標序列100%互補，或可包括錯配，例如以適應變異體，只要在寡聚物與目標序列之間形成的異雙螺旋足夠穩定，以耐受細胞核酸酶之作用及活體內可發生之其他降解模式。因此，某些寡聚物可具有在寡聚物與目標序列之間實質互補性，意謂約或至少約70%序列互補，例如70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列互補。本文中論述對核酸酶裂解較不敏感之寡聚物主鏈。朝向雜交雙螺旋之末端區域之錯配(若存在)，通常比在中間之錯配更穩定。所允許錯配之數目將取決於寡聚物之長度、雙螺旋中G:C鹼基對之百分比及雙螺旋中錯配之位置，根據雙螺旋穩定性之充分理解原理。儘管此類反義寡聚物未必與v目標序列100%互補，但其有效地穩定且特異性結合至目標序列，使得目標前驅RNA之剪接受到調節。
形成於寡聚物與目標序列之間的雙螺旋之穩定性與結合Tm與雙螺旋對細胞酶促裂解之易感性有關。寡聚物相對於互補序列RNA之Tm可藉由習知方法量測，諸如藉由Hames等人., Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, 1985, 第107-108頁描述或在Miyada C. G. and Wallace R. B., 1987, Oligomer Hybridization Techniques, Methods Enzymol. 第154卷，第94-107頁中所描述之彼等方法。在某些實施例中，反義寡聚物可具有相對於互補序列RNA而言大於體溫且較佳大於約45℃或50℃之結合Tm。亦包括在60℃至80℃或更高範圍內之Tm。根據公認原理：寡聚物(關於基於互補RNA雜交)之Tm可藉由增加雙螺旋中之C:G配對鹼基之比率及/或藉由增加異雙螺旋之長度(以鹼基對計)來增加。同時，出於最佳化細胞攝取之目的，限制寡聚物之大小可為有利的。出於此原因，一般偏好在25個鹼基或更少之長度下展現出較高Tm (45-50℃或更高)之化合物更甚於那些為了較高Tm值而需要大於25個鹼基的化合物。 下 表 3展示與PMP22基因之前驅mRNA序列互補的例示性靶向序列(以5'-至-3'定向)。
表 3 PMP22 靶向之寡聚物的反義寡聚物序列
序列 (5 ' -3 ' ) 基因位置 SEQ ID NO
CTGCGAGGAGAGCGCTGGGCGTGAG PMP22 H2A (-25-1) 6
AAGTTCTGCTCAGCGGAGTTTCTGC PMP22 H2A (+1+25) 7
CAACAGGAGGAGCATTCTGGCGGCA PMP22 H2A (+25+49) 8
CTCAGCAACAGGAGGAGCATTCTGG PMP22 H2A (+30+54) 9
TGATACTCAGCAACAGGAGGAGCAT PMP22 H2A (+35+59) 10
ATACTCAGCAACAGGAGGAG PMP22 H2A (+38+57) 11
TGATACTCAGCAACAGGAGG PMP22 H2A (+40+59) 12
GACGATGATACTCAGCAACAGGAGG PMP22 H2A (+40+64) 13
GATGATACTCAGCAACAGGA PMP22 H2A (+42+61) 14
ACGATGATACTCAGCAACAG PMP22 H2A (+44+63) 15
TGGAGGACGATGATACTCAGCAACA PMP22 H2A (+45+69) 16
GGACGATGATACTCAGCAAC PMP22 H2A (+46+65) 17
GAGGACGATGATACTCAGCA PMP22 H2A (+48+67) 18
TGGAGGACGATGATACTCAG PMP22 H2A (+50+69) 19
CGACGTGGAGGACGATGATACTCAG PMP22 H2A (+50+74) 20
CGTGGAGGACGATGATACTC PMP22 H2A (+52+71) 21
GACGTGGAGGACGATGATAC PMP22 H2A (+54+73) 22
CACCGCGACGTGGAGGACGATGATA PMP22 H2A (+55+79) 23
GCGACGTGGAGGACGATGAT PMP22 H2A (+56+75) 24
ACCAGCACCGCGACGTGGAGGACGA PMP22 H2A (+60+84) 25
GCAGCACCAGCACCGCGACGTGGAG PMP22 H2A (+65+89) 26
GAACAGCAGCACCAGCACCGCGACG PMP22 H2A (+70+94) 27
GAGACGAACAGCAGCACCAGCACCG PMP22 H2A (+75+99) 28
AGGCACTCACGCTGACGATCGTGGA PMP22 H2D (+15-10) 29
CGATCCATTGCTAGAGAGAATCAGA PMP22 H3A (-15+10) 30
CGTGTCCATTGCCCACGATCCATTG PMP22 H3A (+1+25) 31
CCAGAGATCAGTTGCGTGTCCATTG PMP22 H3A (+15+39) 32
ACAGTTCTGCCAGAGATCAGTTGCG PMP22 H3A (+24+48) 33
GACATTTCCTGAGGAAGAGGTGCTA PMP22 H3A (+48+72) 34
GATGAGAAACAGTGGTGGACATTTC PMP22 H3A (+65+89) 35
TTTGGTGATGATGAGAAACAGTGGT PMP22 H3A (+74+98) 36
AGCCTCACCGTTTGGTGATGATGAG PMP22 H3D (+17-8) 37
CACCGTTTGGTGATGATGAGAAACA PMP22 H3D (+22-3) 38
CAGACTGCAGCCATTCTGGGGGAAA PMP22 H4A (-10+15) 39
GAATGCTGAAGATGATCGACAGGAT PMP22 H4A (+30+54) 40
AGAGTTGGCAGAAGAACAGGAACAG PMP22 H4A (+60+84) 41
TGTAAAACCTGCCCCCCTTGGTGAG PMP22 H4A (+90+114) 42
ATTCCAGTGATGTAAAACCTGCCCC PMP22 H4A (+100+124) 43
AATTTGGAAGATTCCAGTGATGTAA PMP22 H4A (+110+134) 44
TACCAGCAAGAATTTGGAAGATTCC PMP22 H4D (+22-3) 45
CACTCATCACGCACAGACCTGGGGAA PMP22 H5A (-8+17) 46
GCCTCACCGTGTAGATGGCCGCAGC PMP22 H5A (+18+42) 47
TTGAGATGCCACTCCGGGTGCCTCA PMP22 H5A (+37+61) 48
CCGTAGGAGTAATCCGAGTTGAGAT PMP22 H5A (+55+79) 49
CTCTGATGTTTATTTTAATGCATCT PMP22 H5A (+1271+1295) 50
對於表3中之序列中之任一者，可使用本文所揭示之反義寡聚物化學物質中之任一者或本文所揭示之反義寡聚物載體肽結合物中之任一者。
因此，某些反義寡聚物包含表3中之序列(例如，SEQ ID NO: 6-50)或其變異體或連續或非連續部分，由其組成或基本上由其組成。舉例而言，某些反義寡聚物包含SEQ ID NO: 6-50中之任一者的約或至少約6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個連續或非連續核苷酸。對於非連續部分，插入核苷酸可缺失或經不同核苷酸取代，或可添加插入核苷酸。變異體之其他實例包括在SEQ ID NO: 6-50中之任一者之全長上具有約或至少約70%序列一致性或同源性，例如70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性或同源性的寡聚物。在一些實施例中，根據本文所描述之實例或方法中的至少一種，具有包含此類變異體序列、由其組成或基本上由其組成之靶向序列的反義寡聚物或化合物增加、提高或促進PMP22 mRNA中之外顯子2、外顯子3、外顯子4或外顯子5排除，相對於對照視情況至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%或65%或更高。在一些實施例中，根據本文所描述之實例或方法中的至少一種，具有包含、由或基本上由此類變異體序列組成之靶向序列的反義寡聚物或化合物降低細胞中之PMP22蛋白質表現，相對於對照視情況至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%或65%或更高。在一些實施例中，根據本文所描述之實例或方法中的至少一種，包含此類變異體序列、由其組成或基本上由其組成之反義寡聚物或化合物在細胞中降低PMP22活性，相對於對照視情況至少約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%或65%或更高。
在各種態樣中，提供反義寡聚物或化合物，其包含與PMP22前驅mRNA之目標區域互補(例如，至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%互補)的靶向序列，視情況其中該等靶向序列如表3中所闡述。在另一態樣中，提供包含變異靶向序列之反義寡聚物或化合物，諸如本文中所描述之彼等序列中之任一者，其中變異靶向序列結合至PMP22前驅mRNA之目標區域，該目標區域與表3中所闡述之靶向序列中之一或多者互補(例如，80%至100%互補)。在一些實施例中，反義寡聚物或化合物結合至包含PMP22前驅mRNA之至少10個(例如，至少11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個)連續鹼基的目標序列(例如，SEQ ID NO: 2、3、4或5中之任一者或跨越由SEQ ID NO: 2及在SEQ ID NO: 2之前或前列的內含子、SEQ ID NO: 3及在SEQ ID NO: 3之前或前列的內含子、SEQ ID NO: 4及在SEQ ID NO: 4之前或前列的內含子或SEQ ID NO: 5及在SEQ ID NO: 5之前或前列的內含子定義之PMP22前驅mRNA剪接接合點的序列)。在一些實施例中，目標序列與表3中闡述之靶向序列中之一或多者互補(例如，至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%互補)。在一些實施例中，目標序列與表3中所闡述之靶向序列中之一或多者的至少10 (例如，至少11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28)個連續鹼基互補(例如，至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%互補)。
可根據此項技術中之常規技術分析反義寡聚物及其變異體之活性。舉例而言，調查之RNA及蛋白質的剪接形式及表現量可藉由用於偵測剪接形式及/或經轉錄核酸或蛋白質之表現的廣泛多種熟知方法中之任一者來評定。此類方法之非限制性實例包括RNA之剪接形式的RT-PCR，接著為PCR產物之尺寸分離；核酸雜交方法，例如北方墨點及/或核酸陣列之使用；核酸擴增方法；用於偵測蛋白質之免疫方法；蛋白質純化方法；及蛋白質功能或活性檢定。
RNA表現量可藉由自細胞、組織或生物體製備mRNA/cDNA (亦即，經轉錄聚核苷酸)及藉由使mRNA/cDNA與參考聚核苷酸雜交來評估，該參考聚核苷酸為所分析之核酸或其片段的補體。cDNA可視情況在與互補聚核苷酸雜交之前使用多種聚合酶鏈反應或活體外轉錄方法中之任一者擴增；較佳地，其未擴增。亦可使用定量PCR偵測一或多種轉錄物之表現，以評估轉錄物之表現量。
IV. 肽轉運體在一些實施例中，本發明寡聚物與肽轉運體部分，例如細胞穿透肽轉運部分(亦稱為細胞穿透肽)結合，其有效增強寡聚物傳遞至細胞中。舉例而言，在一些實施例中，肽轉運體部分為富含精胺酸肽。在其他實施例中，轉運體部分連接至寡聚物之5'或3'端。當此類肽結合至任一端時，則相對端可供用於進一步結合至如本文所描述之經修飾之端基。
在前述內容之一些實施例中，肽轉運體部分包含6至16個次單元，其選自X'次單元、Y'次單元及Z'次單元， 其中 (a)各X'次單元獨立地表示離胺酸、精胺酸或精胺酸類似物，該類似物為包含R 33N=C(NH 2)R 34結構之側鏈的陽離子α-胺基酸，其中R 33為H或R；R 34為R 35、NH 2、NHR或NR 34，其中R 35為低碳數烷基或低碳數烯基，且可進一步包括氧或氮；R 33及R 34可共同形成環；且該側鏈經由R 33或R 34連接至該胺基酸； (b)各Y'次單元獨立地表示中性胺基酸-C(O)-(CHR) n-NH-，其中n為2至7且各R獨立地為H或甲基；及 (c)各Z'次單元獨立地表示具有中性芳烷基側鏈之α-胺基酸； 其中該肽包含由(X'Y'X') p、(X'Y') m及(X'Z'Z') p中之一者表示的序列，其中p為2至5且m為2至8。
在所選實施例中，對於各X'，側鏈部分為胍基，如在胺基酸次單元精胺酸(Arg)中。在其他實施例中，各Y'為-CO-(CH 2) n -CHR-NH-，其中n為2至7且R為H。舉例而言，當n為5且R為H時，Y'為6-胺基己酸次單元，本文中縮寫為Ahx (或簡稱為X)；當n為2且R為H時，Y'為β-丙胺酸次單元(在本文中稱為B)。
在某些實施例中，此類型之肽包括包含與單一Y'次單元交替之精胺酸二聚體的彼等肽，其中Y'為Ahx。實例包括具有式(RY'R) p或式(RRY') p之肽，其中Y'為Ahx。在一個實施例中，Y'為6-胺基己酸次單元，R為精胺酸，且p為4。
在另一實施例中，各Z'為苯丙胺酸，且m為3或4。
在一些實施例中，經結合肽經由連接子Ahx-B連接至寡聚物之末端，其中Ahx係6-胺基己酸次單元，且B為β-丙胺酸次單元。
在所選實施例中，對於各X'，側鏈部分獨立地選自由以下組成之群：胍基(HN=C(NH 2)NH-)、脒基(HN=C(NH 2)C-)、2-胺基二氫嘧啶基、2-胺基四氫嘧啶基、2-胺基吡啶基及2-胺基嘧啶酮基，且其較佳地選自胍基及脒基。在一個實施例中，側鏈部分為胍基，如胺基酸次單元精胺酸(Arg (R))中。
在一些實施例中，Y'次單元為連續的，因為X'次單元不插入Y'次單元之間或單獨穿插X'次單元之間。然而，在一些實施例中，連接次單元可在Y'次單元之間。在一個實施例中，Y'次單元在肽轉運體之末端；在其他實施例中，其側接X'次單元。在其他實施例中，各Y'為-CO-(CH 2) n -CHR-NH-，其中n為2至7且R為H。舉例而言，當n為5且R為H時，Y'為6-胺基己酸次單元，本文中縮寫為Ahx。在此基團之所選擇實施例中，各X'包含胍基側鏈部分，如在精胺酸次單元中。此類型之例示性肽包括包含與單一Y'次單元交替之精胺酸二聚體的彼等肽，其中Y'為Ahx。實例包括具有式(RY'R) 4或式(RRY') 4之肽(SEQ ID NO: 72)，其中Y'較佳為Ahx。在一些實施例中，核酸類似物連接至末端Y'次單元，較佳在C端處。在其他實施例中，連接子具有結構AhxB，其中Ahx為6-胺基己酸次單元，且B為β-丙胺酸次單元。
相對於在不存在附接轉運體部分之情況下寡聚物之攝取且相對於不存在疏水性次單元Y'之附接轉運體部分的攝取，已展示如上文所描述之肽轉運體部分極大地增強附接寡聚物之細胞進入。此類增強之吸收可藉由相對於缺乏疏水性次單元Y'之附接轉運體部分吸收試劑，化合物吸收至哺乳動物細胞中之至少兩倍增加或在其他實施例中四倍增加來證明。在一些實施例中，相對於未結合化合物，攝取增強至少兩倍或至少三倍。
肽轉運體部分之另一益處為其預期的使反義寡聚物與其目標核酸序列之間的雙螺旋穩定化之能力。雖然不希望受理論束縛，但此使雙螺旋體穩定之能力可由帶正電之轉運體部分與帶負電之核酸之間的靜電相互作用產生。在一些實施例中，轉運體中之帶電子單元之數目小於14，或在其他實施例中，在8與11之間，因為過高數目個帶電子單元可能引起序列特異性降低。
例示性富含精胺酸細胞穿透肽轉運體提供於下 表 4中。 表 4： 富含精胺酸之細胞穿透肽轉運體
名稱(命名) 序列 SEQ ID NO
rTAT RRRQRRKKR 51
Tat RKKRRQRRR 52
R 9F 2 RRRRRRRRRFF 53
R 5F 2R 4 RRRRRFFRRRR 54
R 4 RRRR 55
R 5 RRRRR 56
R 6 RRRRRR 57
R 7 RRRRRRR 58
R 8 RRRRRRRR 59
R 9 RRRRRRRRR 60
(RXR) 4 RXRRXRRXRRXR 61
(RXR) 5 RXRRXRRXRRXRRXR 62
(RXRRBR) 2 RXRRBRRXRRBR 63
(RAR) 4F 2 RARRARRARRARFF 64
(RGR) 4F 2 RGRRGRRGRRGRFF 65
a經指派給SEQ ID NO之序列不包括鍵聯部分(例如，脯胺酸及甘胺酸)。X及B分別係指6-胺基己酸及β-丙胺酸。
V. 醫藥組合物本發明亦提供所揭示之寡聚物的調配及遞送。因此，本發明之一態樣為一種醫藥組合物，其包含如本文所揭示之反義化合物及醫藥學上可接受之載劑。
反義寡聚物與目標核酸之有效遞送為治療之重要態樣。反義寡聚物遞送途徑包括(但不限於)各種全身性途徑，包括經口及非經腸途徑，例如靜脈內、皮下、腹膜內及肌肉內，以及吸入、經皮及局部遞送。適當途徑可由熟習此項技術者視需要根據治療下之個體的病況確定。舉例而言，用於在治療皮膚病毒感染中遞送反義寡聚物之適當途徑為局部遞送，而用於治療病毒性呼吸道感染之反義寡聚物的遞送可為靜脈內或藉由吸入。寡聚物亦可直接遞送至病毒感染之任何特定部位。
反義寡聚物可在生理學上及/或醫藥學上可接受之任何便利媒劑中投與。此類組合物可包括一般熟習此項技術者所採用之多種標準醫藥學上可接受之載劑中之任一者。實例包括(但不限於)鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、水(例如，用於注射之無菌水)、含水乙醇、乳液(諸如，油/水乳液或三酸甘油酯乳液)、錠劑及膠囊。適合之生理學上可接受之載劑的選擇將視所選擇投與模式而變化。
本發明化合物(例如，寡聚物)一般可用作游離酸或游離鹼。或者，本發明化合物可以酸或鹼加成鹽形式使用。游離胺基化合物之酸加成鹽可藉由此項技術中熟知之方法來製備，且可由有機酸及無機酸形成。適合的有機酸包括順丁烯二酸、反丁烯二酸、苯甲酸、抗壞血酸、丁二酸、甲烷磺酸、乙酸、三氟乙酸、草酸、丙酸、酒石酸、水楊酸、檸檬酸、葡萄糖酸、乳酸、杏仁酸、肉桂酸、天冬胺酸、硬脂酸、十六酸、乙醇酸、麩胺酸及苯磺酸。適合的無機酸包括鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸及硝酸。鹼加成鹽包括用羧酸鹽陰離子形成之彼等鹽且包括用有機及無機陽離子，諸如選自鹼金屬及鹼土金屬(例如鋰、鈉、鉀、鎂、鋇及鈣)之彼等者以及銨離子及其經取代之衍生物(例如二苯甲基銨、苯甲基銨、2-羥基乙銨及其類似者)形成。因此，結構(I)之術語「醫藥學上可接受之鹽」意欲涵蓋任何及所有可接受之鹽形式。
另外，前藥亦包括在本發明之上下文內。前藥係向患者投與時在活體內釋放結構(I)之化合物的任何共價鍵結載劑。前藥通常藉由修飾官能基來製備，其方式為使得修飾藉由常規操作或活體內裂解，得到親本化合物。前藥包括例如本發明化合物，其中羥基、胺或硫氫基鍵結至當向患者投與時裂解以形成羥基、胺或硫氫基之任何基團。因此，前藥之代表性實例包括(但不限於)結構(I)之化合物之醇及胺官能基的乙酸鹽、甲酸鹽及苯甲酸鹽衍生物。此外，在羧酸(-COOH)之情況下，可使用酯，諸如甲酯、乙酯及其類似物。
在一些情況下，可採用脂質體以便於將反義寡核苷酸吸收至細胞中。(參見例如Williams, S.A., Leukemia 10(12):1980-1989, 1996; Lappalainen等人. (1994) Antiviral Res.23:119; Uhlmann等人. (1990) Antisense Oligonucleotides: A New Therapeutic Principle, Chemical Reviews, 第90卷, 第4號, 第544-584頁; Gregoriadis, G., 第14章, Liposomes, Drug Carriers in Biology and Medicine, 第287-341頁, Academic Press, 1979)。水凝膠亦可用作例如WO 93/01286中所描述之反義寡聚物投與的媒劑。或者，寡核苷酸可以微球體或微米粒子形式投與。(參見例如Wu, GY及Wu CH (1987) J Biol Chem.262:4429-4432)。或者，使用與反義寡聚物錯合之充氣微泡可增強遞送至目標組織，如美國專利第6,245,747號中所描述。亦可使用持續釋放組合物。此等基質可包括呈成形製品形式之半滲透聚合基質，諸如薄膜或微膠囊。
VI. 製備方法 用鹼性氮核苷間連接子製備寡聚物嗎啉代次單元、經修飾之次單元間鍵聯及包含其之寡聚物可如例如美國專利第5,185,444號及第7,943,762號中所描述製備，該等專利以全文引用之方式併入本文中。嗎啉代次單元可根據以下通用反應流程1製備。
反應流程1.嗎啉代次單元之製備 參考反應流程1，其中B表示鹼基配對部分且PG表示保護基，嗎啉代次單元可如所示自對應核苷 ( 1 )製備。嗎啉代次單元(2)可視情況藉由與適合之保護基前驅體(例如，三苯甲基氯化物)反應保護。3'保護基一般在如下文更詳細地描述之固態寡聚物合成期間移除。鹼基配對部分可適合地受保護以用於出售相位寡聚物合成。適合保護基包括腺嘌呤及胞嘧啶之苯甲醯基、鳥嘌呤之苯基乙醯基及次黃嘌呤(I)之特戊醯氧甲基。特戊醯氧甲基可引入至次黃嘌呤雜環鹼基之N1位置上。儘管可採用未受保護之次黃嘌呤次單元，但活化反應之產率在鹼受保護時極優良。其他適合之保護基包括美國專利第8,076,476號中所揭示之彼等，其以全文引用之方式併入本文中。
3與活化磷化合物 4反應產生具有所需鍵聯部分 5之嗎啉代次單元。結構 4之化合物可使用熟習此項技術者已知之多種方法製備。舉例而言，此類化合物可藉由相應胺及氧氯化磷之反應製備。就此而言，胺起始物質可使用此項技術中已知之任何方法製備，例如實例及美國專利第7,943,762號中所描述之彼等方法。
結構 5之化合物可用於固相自動化寡聚物合成，以製備包含次單元間鍵之寡聚物。此類方法為此項技術中所熟知。簡言之，結構 5之化合物可在5'端處改質以含有針對固體載體之連接子。舉例而言，化合物5可藉由連接子連接至固體載體。一旦負載，保護基(例如，三苯甲基)便移除且游離胺與結構 5之第二化合物的經活化磷部分反應。重複此序列直至獲得寡核苷酸之所需長度。若需要3'-修飾，則可移除終端3'端之保護基或保留該保護基。
在實例中更詳細地描述經修飾之嗎啉代次單元及嗎啉代寡聚物的製備。含有任何數目個經修飾鍵聯之嗎啉代寡聚物可使用本文所描述之方法、此項技術中已知及/或藉由參考本文所描述來製備。亦描述於實例中之為如先前所描述製備之嗎啉代寡聚物的整體修飾(參見例如，PCT公開案WO 2008/036127)。
如本文所描述之含有PMO、PMO+、PPMO及PMO-X的其他鍵聯修飾之合成使用此項技術中已知且描述於先前美國專利第8,299,206及8,076,476號及PCT公開案第WO 2009/064471、WO 2011/150408及WO 2012/150960號中之方法進行，其以全文引用之方式併入本文中。
基本上如PCT公開案第WO 2009/064471號中所描述合成具有3'三苯甲基修飾之PMO，不同之處在於省略掉去三苯甲基化步驟。
VII. 處理方法本文提供一種治療與周邊髓鞘蛋白22之失調相關之疾病的方法。該方法包含向有需要之患者投與治療有效量之本文所揭示之反義化合物或其醫藥組合物。在實施例中，與周邊髓鞘蛋白22之失調相關的該疾病為1A型夏-馬-杜三氏症(CMT1A)。
在某些實施例中，該方法為活體外方法。在某些其他實施例中，該方法係活體內方法。
在某些實施例中，宿主細胞為哺乳動物細胞。在某些實施例中，宿主細胞為非人類靈長類細胞。在某些實施例中，宿主細胞為人類細胞。
在某些實施例中，宿主細胞為天然存在之細胞。在某些其他實施例中，宿主細胞為經工程化細胞。
在某些實施例中，反義化合物在適合之醫藥載劑中投與哺乳動物個體，例如人類或實驗室或家畜。
在某些實施例中，反義化合物與額外藥劑一起投與哺乳動物個體，例如人類或實驗室或家畜動物。反義化合物及其他藥劑可經由相同或不同投藥途徑及/或位點同時或依序進行投與。在某些實施例中，反義化合物及其他藥劑可共調配且共同投與。在某些實施例中，反義化合物及其他藥劑可共同提供於套組中。
在一個實施例中，寡聚物為包含於醫藥學上可接受之載劑中且經肌肉內遞送之二胺基磷酸酯嗎啉代寡聚物。在另一實施例中，寡聚物為包含於醫藥學上可接受之載劑中且肌肉內遞送之肽結合之二胺基磷酸酯嗎啉代寡聚物。
在另一實施例中，寡聚物為包含於醫藥學上可接受之載劑中且經靜脈內(i.v.)遞送之二胺基甲酸酯嗎啉代寡聚物。在另一實施例中，寡聚物為包含於醫藥學上可接受之載劑中且靜脈內遞送之肽結合之二胺基磷酸酯嗎啉代寡聚物。
本發明亦涵蓋額外投與途徑，例如經口、皮下、腹膜內及經肺。
使用反義寡核苷酸之有效活體內治療方案可根據持續時間、劑量、頻率及投與途徑，以及進行治療之個體之病況(亦即，響應於局部或全身性感染之投與的預防性投與)而變化。因此，此類活體內療法通常將需要藉由在治療下之測試監測及對應的劑量或治療方案調整，以獲得最佳治療性結果。
在一些實施例中，寡聚物藉由哺乳動物細胞主動吸收。在其他實施例中，寡聚物可與如本文所描述之轉運體部分(例如，轉運體肽)結合以促進此類攝取。
本文亦提供一種降低有需要之患者之周邊髓鞘蛋白22表現的方法，其包含投與治療有效量之本文所揭示之反義寡聚物。
在實施例中，該患者患有與有需要之個體之周邊髓鞘蛋白22之失調相關的疾病。在另一實施例中，該患者患有1A型夏-馬-杜三氏症。
參考文獻併入本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案均以引用之方式併入本文中，其引用的程度如同各個別公開案、專利或專利申請案經特定及個別地指示以引用的方式併入一般。
實例 實例 1 - 寡聚物合成各合成管柱在1% DVB交聯下用30 +/-2 mg官能化之胺基甲基聚苯乙烯樹脂填充。寡聚物以可裂解二硫化物(DSA)或硝基羧基苯基丙基(NCP2)錨建構於樹脂上，其允許自樹脂進行寡聚物分離且進一步純化及改性。視需要而定，樹脂亦可具有聚乙二醇尾間隔子。樹脂負載視需要而定介於325至475 µmol/g之範圍內。因此，各合成管柱具有12 µmol之最大產率。此等量典型地足以進行生物高通量篩選。當需要更多材料時，方法轉移至大規模內部生產小組以按比例擴大。
舉例而言，負載DSA之樹脂負載有342.6 µmol/g之起始負載。 表5：合成循環資訊的表
步驟 體積 遞送 保持時間
去三苯甲基化溶液 1.5 mL 歧管 15秒
去三苯甲基化溶液 1.5 mL 歧管 15秒
去三苯甲基化溶液 1.5 mL 歧管 15秒
去三苯甲基化溶液 1.5 mL 歧管 15秒
去三苯甲基化溶液 1.5 mL 歧管 15秒
去三苯甲基化溶液 1.5 mL 歧管 15秒
去三苯甲基化溶液 1.5 mL 歧管 15秒
DCM 1.5 mL 歧管 30秒
中和溶液 1.5 mL 歧管 30秒
中和溶液 1.5 mL 歧管 30秒
中和溶液 1.5 mL 歧管 30秒
中和溶液 1.5 mL 歧管 30秒
中和溶液 1.5 mL 歧管 30秒
中和溶液 1.5 mL 歧管 30秒
DCM 1.5 mL 歧管 30秒
偶合 350 uL - 500 uL 注射器歧管 40分鐘
DCM 1.5 mL 歧管 30秒
中和溶液 1.5 mL 歧管 30秒
中和溶液 1.5 mL 歧管 30秒
DCM 1.5 mL 歧管 30秒
DCM 1.5 mL 歧管 30秒
DCM 1.5 mL 歧管 30秒
30 mg管柱之偶合溶液的起始量為350 µL。每一依序鹼基使用偶合溶液之2%增加以維持在樹脂床上之偶合溶液覆蓋。
在合成完成之後，使寡聚物自樹脂裂解出。在純化之前，使用DTT裂解溶液(含0.1 M二硫蘇糖醇之10%三乙胺/NMP，25℃，53 mL/g起始樹脂)，自雜環鹼基移除保護基。在30分鐘培育之後，將溶液過濾至12 mL閃爍小瓶中且用額外裂解溶液沖洗樹脂。裂解之PMO隨後用濃氫氧化銨稀釋2倍，緊緊地密封，且在烘箱中在45℃下培育16至18小時。在培育之後，使溶液冷卻至室溫。若繼續，藉由強陰離子交換(SAX)純化來純化寡聚物，則用緩衝液A (1%氫氧化銨)稀釋樣品4倍，且使用BioRad LP 10 (兩者均來自Bio-Rad，Hercules，CA)上之Macro-Prep High Q載體樹脂純化。
若該樣品稍後純化，或僅進行粗物質分離，則其藉由固相萃取(SPE) (Amberchrom CG300M，Dow Chemicals，MI)分離，且用1% NH 4OH水溶液稀釋20x。一旦負載，則用1%氫氧化銨洗滌產物3 x 8 mL，且隨後使用2 x 3 mL 45%乙腈溶離至乾淨閃爍蒸發器中。隨後冷凍樣品且凍乾至乾燥持續至少兩天。
實例2. -  PMO之強陰離子交換(SAX)純化 使用SAX梯度用1%氫氧化銨中之1 M氯化鈉作為緩衝液B純化PMO樣品。緩衝液B之梯度量視序列中之鳥嘌呤及胸腺嘧啶鹼基之百分比而定。在接近30分鐘操作處靶向主峰，選擇X=40、60、80或100%緩衝液B之梯度(參見下表6)。純化以7 mL/min之流動速率運作，其中每一分鐘收集溶離份(每溶離份7 mL)。使用50 mL管柱，在約9管柱體積(CV)上使用60 min梯度溶離，選擇溶離份且基於UV吸光度混合。 表6：SAX純化梯度之表
時間 %A %B
0 100 0
0 100 0
60 100-X X
65 100-X X
66 100 0
75 100 0
緩衝液A：1% NH 4OH 緩衝液B：1% NH 4OH/1M NaCl
舉例而言，梯度在60分鐘線性梯度上運行至多60%緩衝液B。
藉由添加五倍體積過量之水稀釋經冷卻之溶離份。隨後將結合物/鹽溶液裝載至SPE管柱(Amberchrom CG300M, Dow Chemicals, MI, SP20SS Seprabeads, Sorbent Technologies, Norcross GA)上，隨後用3 x 8 mL-1%氫氧化銨洗滌以移除鹽。最後，用2 x 3 mL 45%乙腈自SPE管柱溶離寡聚物，隨後將寡聚物凍乾至乾燥持續兩天。隨後將樣品再懸浮於已知量之1%氫氧化銨中且在1 mL比色管中稀釋500倍。在Cary 100 UV-Vis分光光度計(Agilent, Wilmington, DE)上量測在260 nm下之OD吸收率。
實例 3. - 肽結合將1.00當量之來自實例2之PMO與1.25當量之細胞穿透胜肽(CPP)及1.875當量之DIPEA作為鹼及1.875當量之TBTU作為偶合劑組合，引起肽之C端的去質子化，從而允許其藉由偶合劑活化。此經活化CPP中間產物隨後在寡核苷酸之3'端與嗎啉胺反應以形成醯胺鍵，由此產生PPMO產物。此粗產物隨後藉由強陽離子交換(SCX)捕獲及釋放層析純化，去鹽，且凍乾成乾粉。
藉由首先稱重出計算量之CPP及偶合劑來製備經活化偶合溶液。CPP及偶合劑隨後使用NMP合併，且此溶液經加熱至45℃。將DIPEA鹼基添加至此溶液中且添加至適當寡核苷酸中，且使其在室溫下反應3小時。
在反應3小時之後，使樣品用Milli-Q水稀釋至20 mL，且藉由SCX層析(Source 30S Resin，GE HealthCare)在BioRad Biologic LP MPLC系統(Bio-Rad, Hercules, CA)上純化。X=30或50%之緩衝液B之百分比的SCX梯度係基於待結合之肽序列中帶正電殘基之數目來選擇。對於含有五個精胺酸殘基之SEQ ID NO: 56的CPP，使用30%緩衝液B之梯度。對於含有八個精胺酸殘基之SEQ ID NO: 61之CPP，使用50%緩衝液B之梯度。純化以5 mL/min之流動速率運作，其中每0.53分鐘收集溶離份(每溶離份2.65 mL)。使用5 mL管柱，在約30管柱體積(CV)上使用30 min梯度溶離，選擇溶離份且基於UV吸光度混合。收集負載流出物且藉由SPE使負載流出物及產物脫鹽。溶離樣品，隨後用乾冰冷凍且凍乾48小時，隨後進行HPLC及質譜分析。 表7：SCX純化梯度
時間(min) %A %B
0 100 0
1 100 0
30 100-X X
32 0 100
37 0 100
42 100 0
緩衝液A：20mM NaH 2PO 4/25% ACN；pH 6.5 緩衝液B：1.5 M胍HCl/20mM NaH 2PO 4/25% ACN；pH 6.5
實例 4. - 活體外分析1.在正常纖維母細胞中藉由2'OMe AO之 PMP22的外顯子跳過
化合物編號 序列 目標區域 SEQ ID NO 外顯子跳過
1 CTGCGAGGAGAGCGCTGGGCGTGAG PMP22 H2A (-25-1) 6 +
2 AAGTTCTGCTCAGCGGAGTTTCTGC PMP22 H2A (+1+25) 7 ++
3 CTCAGCAACAGGAGGAGCATTCTGG PMP22 H2A (+30+54) 9 ++
4 GACGATGATACTCAGCAACAGGAGG PMP22 H2A (+40+64) 13 ++
5 GAACAGCAGCACCAGCACCGCGACG PMP22 H2A (+70+94) 27 +++
6 AGGCACTCACGCTGACGATCGTGGA PMP22 H2D (+15-10) 29 +
7 CGATCCATTGCTAGAGAGAATCAGA PMP22 H3A (-15+10) 30 ++
8 CGTGTCCATTGCCCACGATCCATTG PMP22 H3A (+1+25) 31 ++
9 ACAGTTCTGCCAGAGATCAGTTGCG PMP22 H3A (+24+48) 33 -
10 GATGAGAAACAGTGGTGGACATTTC PMP22 H3A (+65+89) 35 +
11 CACCGTTTGGTGATGATGAGAAACA PMP22 H3D (+22-3) 38 +
12 CAGACTGCAGCCATTCTGGGGGAAA PMP22 H4A (-10+15) 39 -
13 GAATGCTGAAGATGATCGACAGGAT PMP22 H4A (+30+54) 40 +
14 AGAGTTGGCAGAAGAACAGGAACAG PMP22 H4A (+60+84) 41 +
15 TGTAAAACCTGCCCCCCTTGGTGAG PMP22 H4A (+90+114) 42 -
在轉染前一天，將正常纖維母細胞接種於24孔盤中。在轉染當天，根據製造商的指令(3µl脂染胺3000/1 mL總轉染混合物)，將2`OMe反義寡核苷酸(「AOs」)在50 µl Opti-MEM (Life Technologies)中與脂染胺3000 (L2K) (Life Technologies)錯合。錯合物用Opti-MEM注滿至1 mL，且添加至兩個孔(500 µl/孔)。在培育24小時之後收集細胞。
使用具有Platinum ®Taq DNA Polymerase (ThermoFisher Scientific, Australia)之Superscript III One-Step RT-PCR系統對50 ng RNA模板進行RT-PCR。循環條件包括55℃持續30分鐘、94℃持續2分鐘，接著94℃持續30秒、55℃持續30秒及68℃持續1分鐘，循環28次。所用引子為外顯子1正向(GGAAGAAGGGGTTACGCTGT (SEQ ID NO: 66))及外顯子5反向(GGAAGAAGGGGTTACGCTGT (SEQ ID NO: 67))。
進行密度測定法，且外顯子跳過計算為經跳過轉錄與總轉錄物之比率。-指示＜20%外顯子跳過，+指示在20-40%之間的外顯子跳過，++指示在40-80%之間的外顯子跳過，且+++指示＞80%外顯子跳過。
2.由在正常纖維母細胞中具有SEQ ID NO: 61之CPP的PPMO外顯子跳過 PMP22
化合物編號 序列 目標區域 SEQ ID NO 外顯子跳過
16 CACCGCGACGTGGAGGACGATGATA PMP22 H2A (+55+79) 23 ++
17 CGATCCATTGCTAGAGAGAATCAGA PMP22 H3A (-15+10) 30 ++
18 CGTGTCCATTGCCCACGATCCATTG PMP22 H3A (+1+25) 31 -
19 AGAGTTGGCAGAAGAACAGGAACAG PMP22 H4A (+60+84) 41 ++
在生長培養基(10% FCS DMEM)中前一天接種正常纖維母細胞，且用稀釋於Opti-MEM中之具有SEQ ID NO: 61之CPP的PPMO轉染，且在收集細胞之前保持3-5天。
使用具有Platinum ®Taq DNA Polymerase (ThermoFisher Scientific, Australia)之Superscript III One-Step RT-PCR系統對50 ng RNA模板進行RT-PCR。循環條件包括55℃持續30分鐘、94℃持續2分鐘，接著94℃持續30秒、55℃持續30秒及68℃持續1分鐘，循環28次。所用引子為外顯子1正向(GGAAGAAGGGGTTACGCTGT (SEQ ID NO: 66))及外顯子5反向(GGAAGAAGGGGTTACGCTGT (SEQ ID NO: 67))。
進行密度測定法，且外顯子跳過計算為經跳過轉錄與總轉錄物之比率。-指示＜20%外顯子跳過，+指示在20-40%之間的外顯子跳過，++指示在40-80%之間的外顯子跳過，且+++指示＞80%外顯子跳過。
3.由在正常纖維母細胞中具有SEQ ID NO: 56之CPP的PPMO外顯子跳過 PMP22
化合物編號 序列 目標區域 SEQ ID NO 外顯子跳過
20 CTCAGCAACAGGAGGAGCATTCTGG PMP22 H2A (+30+54) 9 ++
21 TGATACTCAGCAACAGGAGGAGCAT PMP22 H2A (+35+59) 10 +++
22 GACGATGATACTCAGCAACAGGAGG PMP22 H2A (+40+64) 13 ++
23 TGGAGGACGATGATACTCAGCAACA PMP22 H2A (+45+69) 16 ++
24 CGACGTGGAGGACGATGATACTCAG PMP22 H2A (+50+74) 20 ++
25 CACCGCGACGTGGAGGACGATGATA PMP22 H2A (+55+79) 23 ++
26 ACCAGCACCGCGACGTGGAGGACGA PMP22 H2A (+60+84) 25 +++
27 GCAGCACCAGCACCGCGACGTGGAG PMP22 H2A (+65+89) 26 ++
28 GAACAGCAGCACCAGCACCGCGACG PMP22 H2A (+70+94) 27 ++
29 GAGACGAACAGCAGCACCAGCACCG PMP22 H2A (+75+99) 28 ++
在生長培養基(10%FCS DMEM)中前一天接種正常纖維母細胞，且用稀釋於Opti-MEM中之具有SEQ ID NO: 56之CPP的PPMO轉染，且在收集細胞之前保持3-5天。
使用具有Platinum® Taq DNA Polymerase (ThermoFisher Scientific, Australia)之Superscript III One-Step RT-PCR系統對50 ng RNA模板進行RT-PCR。循環條件包括55℃持續30分鐘、94℃持續2分鐘，接著94℃持續30秒、55℃持續30秒及68℃持續1分鐘，循環28次。所用引子為外顯子1正向(GGAAGAAGGGGTTACGCTGT (SEQ ID NO: 66))及外顯子5反向(GGAAGAAGGGGTTACGCTGT (SEQ ID NO: 67))。
進行密度測定法，且外顯子跳過計算為經跳過轉錄與總轉錄物之比率。-指示＜20%外顯子跳過，+指示在20-40%之間的外顯子跳過，++指示在40-80%之間的外顯子跳過，且+++指示＞80%外顯子跳過。
4.由在CMT1A患者纖維母細胞中PMO之PMP22的外顯子跳過
化合物編號 序列 目標區域 SEQ ID NO 外顯子跳過
30 CAACAGGAGGAGCATTCTGGCGGCA PMP22 H2A (+25+49) 8 +
31 CTCAGCAACAGGAGGAGCATTCTGG PMP22 H2A (+30+54) 9 ++
32 TGATACTCAGCAACAGGAGGAGCAT PMP22 H2A (+35+59) 10 ++
33 CACCGCGACGTGGAGGACGATGATA PMP22 H2A (+55+79) 23 ++
34 CGATCCATTGCTAGAGAGAATCAGA PMP22 H3A (-15+10) 30 ++
35 CGTGTCCATTGCCCACGATCCATTG PMP22 H3A (+1+25) 31 ++
36 AGAGTTGGCAGAAGAACAGGAACAG PMP22 H4A (+60+84) 41 +
將CMT1a纖維母細胞再懸浮於20 uL含有補充劑之初級溶液中，且使用核轉染/Neon電穿孔將PMO遞送至細胞中，且在補充有5% FCS之DMEM中培育24小時，隨後使用RT-PCR收穫細胞用於PMP22轉錄物分析。
使用具有Platinum® Taq DNA Polymerase (ThermoFisher Scientific, Australia)之Superscript III One-Step RT-PCR系統對50 ng RNA模板進行RT-PCR。循環條件包括55℃持續30分鐘、94℃持續2分鐘，接著94℃持續30秒、55℃持續30秒及68℃持續1分鐘，循環28次。所用引子為外顯子1正向(GGAAGAAGGGGTTACGCTGT (SEQ ID NO: 66))及外顯子5反向(GGAAGAAGGGGTTACGCTGT (SEQ ID NO: 67))。
進行密度測定法，且外顯子跳過計算為經跳過轉錄與總轉錄物之比率。-指示＜20%外顯子跳過，+指示在20-40%之間的外顯子跳過，++指示在40-80%之間的外顯子跳過，且+++指示＞80%外顯子跳過。
5.由在CMT1A患者纖維母細胞中具有SEQ ID NO: 61之CPP的PPMO外顯子跳過 PMP22
化合物編號 序列 目標區域 SEQ ID NO 外顯子跳過
37 CACCGCGACGTGGAGGACGATGATA PMP22 H2A (+55+79) 23 ++
38 CGATCCATTGCTAGAGAGAATCAGA PMP22 H3A (-15+10) 30 ++
39 CGTGTCCATTGCCCACGATCCATTG PMP22 H3A (+1+25) 31 -
40 AGAGTTGGCAGAAGAACAGGAACAG PMP22 H4A (+60+84) 41 +
在生長培養基(10%FCS DMEM)中前一天接種CMT1a纖維母細胞，且用稀釋於Opti-MEM中之具有SEQ ID NO: 61之CPP的PPMO轉染，且在收集細胞之前保持3-5天。
使用具有Platinum ®Taq DNA Polymerase (ThermoFisher Scientific, Australia)之Superscript III One-Step RT-PCR系統對50 ng RNA模板進行RT-PCR。循環條件包括55℃持續30分鐘、94℃持續2分鐘，接著94℃持續30秒、55℃持續30秒及68℃持續1分鐘，循環28次。所用引子為外顯子1正向(GGAAGAAGGGGTTACGCTGT (SEQ ID NO: 66))及外顯子5反向(GGAAGAAGGGGTTACGCTGT (SEQ ID NO: 67))。
進行密度測定法，且外顯子跳過計算為經跳過轉錄與總轉錄物之比率。-指示＜20%外顯子跳過，+指示在20-40%之間的外顯子跳過，++指示在40-80%之間的外顯子跳過，且+++指示＞80%外顯子跳過。
6.由在CMT1A患者纖維母細胞中具有SEQ ID NO: 56之CPP的PPMO外顯子跳過 PMP22
化合物編號 序列 目標區域 SEQ ID NO 外顯子跳過
41 CAACAGGAGGAGCATTCTGGCGGCA PMP22 H2A (+25+49) 8 ++
42 CTCAGCAACAGGAGGAGCATTCTGG PMP22 H2A (+30+54) 9 ++
43 TGATACTCAGCAACAGGAGGAGCAT PMP22 H2A (+35+59) 10 ++
44 TGATACTCAGCAACAGGAGG PMP22 H2A (+40+59) 12 ++
45 GACGATGATACTCAGCAACAGGAGG PMP22 H2A (+40+64) 13 ++
46 GATGATACTCAGCAACAGGA PMP22 H2A (+42+61) 14 ++
47 ACGATGATACTCAGCAACAG PMP22 H2A (+44+63) 15 ++
48 TGGAGGACGATGATACTCAGCAACA PMP22 H2A (+45+69) 16 ++
49 GAGGACGATGATACTCAGCA PMP22 H2A (+48+67) 18 ++
50 TGGAGGACGATGATACTCAG PMP22 H2A (+50+69) 19 ++
51 CGACGTGGAGGACGATGATACTCAG PMP22 H2A (+50+74) 20 ++
52 CGTGGAGGACGATGATACTC PMP22 H2A (+52+71) 21 ++
53 GACGTGGAGGACGATGATAC PMP22 H2A (+54+73) 22 ++
54 CACCGCGACGTGGAGGACGATGATA PMP22 H2A (+55+79) 23 ++
55 GCGACGTGGAGGACGATGAT PMP22 H2A (+56+75) 24 ++
56 ACCAGCACCGCGACGTGGAGGACGA PMP22 H2A (+60+84) 25 ++
57 GCAGCACCAGCACCGCGACGTGGAG PMP22 H2A (+65+89) 26 ++
58 GAACAGCAGCACCAGCACCGCGACG PMP22 H2A (+70+94) 27 ++
59 GAGACGAACAGCAGCACCAGCACCG PMP22 H2A (+75+99) 28 ++
在生長培養基(10%FCS DMEM)中前一天接種CMT1a正常纖維母細胞，且用稀釋於Opti-MEM中之具有SEQ ID NO: 56之CPP的PPMO轉染，且在收集細胞之前保持3-5天。
使用具有Platinum ®Taq DNA Polymerase (ThermoFisher Scientific, Australia)之Superscript III One-Step RT-PCR系統對50 ng RNA模板進行RT-PCR。循環條件包括55℃持續30分鐘、94℃持續2分鐘，接著94℃持續30秒、55℃持續30秒及68℃持續1分鐘，循環28次。所用引子為外顯子1正向(GGAAGAAGGGGTTACGCTGT (SEQ ID NO: 66))及外顯子5反向(GGAAGAAGGGGTTACGCTGT (SEQ ID NO: 67))。
進行密度測定法，且外顯子跳過計算為經跳過轉錄與總轉錄物之比率。-指示＜20%外顯子跳過，+指示在20-40%之間的外顯子跳過，++指示在40-80%之間的外顯子跳過，且+++指示＞80%外顯子跳過。
7.由在人類神經鞘細胞株中具有SEQ ID NO: 61之CPP的PPMO外顯子跳過PMP22
化合物編號 序列 目標區域 SEQ ID NO 外顯子跳過
60 CACCGCGACGTGGAGGACGATGATA PMP22 H2A (+55+79) 23 ++
61 CGATCCATTGCTAGAGAGAATCAGA PMP22 H3A (-15+10) 30 ++
62 CGTGTCCATTGCCCACGATCCATTG PMP22 H3A (+1+25) 31 +
63 AGAGTTGGCAGAAGAACAGGAACAG PMP22 H4A (+60+84) 41 +
在生長培養基(10%FCS DMEM)中前一天接種正常神經鞘細胞，且用稀釋於Opti-MEM中之具有SEQ ID NO: 61之CPP的PPMO轉染，且在收集細胞之前保持3-5天。
使用具有Platinum ®Taq DNA Polymerase (ThermoFisher Scientific, Australia)之Superscript III One-Step RT-PCR系統對50 ng RNA模板進行RT-PCR。循環條件包括55℃持續30分鐘、94℃持續2分鐘，接著94℃持續30秒、55℃持續30秒及68℃持續1分鐘，循環28次。所用引子為外顯子1正向(GGAAGAAGGGGTTACGCTGT (SEQ ID NO: 66))及外顯子5反向(GGAAGAAGGGGTTACGCTGT (SEQ ID NO: 67))。
進行密度測定法，且外顯子跳過計算為經跳過轉錄與總轉錄物之比率。-指示＜20%外顯子跳過，+指示在20-40%之間的外顯子跳過，++指示在40-80%之間的外顯子跳過，且+++指示＞80%外顯子跳過。
8.由在人類神經鞘細胞株中具有SEQ ID NO: 56之CPP的PPMO外顯子跳過 PMP22
化合物編號 序列 目標區域 SEQ ID NO 外顯子跳過
64 CAACAGGAGGAGCATTCTGGCGGCA PMP22 H2A (+25+49) 8 ++
65 CTCAGCAACAGGAGGAGCATTCTGG PMP22 H2A (+30+54) 9 ++
66 TGATACTCAGCAACAGGAGGAGCAT PMP22 H2A (+35+59) 10 ++
67 TGATACTCAGCAACAGGAGG PMP22 H2A (+40+59) 12 ++
68 GACGATGATACTCAGCAACAGGAGG PMP22 H2A (+40+64) 13 ++
69 GATGATACTCAGCAACAGGA PMP22 H2A (+42+61) 14 ++
70 ACGATGATACTCAGCAACAG PMP22 H2A (+44+63) 15 ++
71 TGGAGGACGATGATACTCAGCAACA PMP22 H2A (+45+69) 16 ++
72 GAGGACGATGATACTCAGCA PMP22 H2A (+48+67) 18 ++
73 TGGAGGACGATGATACTCAG PMP22 H2A (+50+69) 19 +
74 CGACGTGGAGGACGATGATACTCAG PMP22 H2A (+50+74) 20 ++
75 CGTGGAGGACGATGATACTC PMP22 H2A (+52+71) 21 ++
76 GACGTGGAGGACGATGATAC PMP22 H2A (+54+73) 22 ++
77 CACCGCGACGTGGAGGACGATGATA PMP22 H2A (+55+79) 23 ++
78 GCGACGTGGAGGACGATGAT PMP22 H2A (+56+75) 24 ++
79 ACCAGCACCGCGACGTGGAGGACGA PMP22 H2A (+60+84) 25 ++
80 GCAGCACCAGCACCGCGACGTGGAG PMP22 H2A (+65+89) 26 ++
81 GAACAGCAGCACCAGCACCGCGACG PMP22 H2A (+70+94) 27 ++
82 GAGACGAACAGCAGCACCAGCACCG PMP22 H2A (+75+99) 28 ++
在生長培養基(10%FCS DMEM)中前一天接種正常神經鞘細胞，且用稀釋於Opti-MEM中之具有SEQ ID NO: 56之CPP的PPMO轉染，且在收集細胞之前保持3-5天。
使用具有Platinum ®Taq DNA Polymerase (ThermoFisher Scientific, Australia)之Superscript III One-Step RT-PCR系統對50 ng RNA模板進行RT-PCR。循環條件包括55℃持續30分鐘、94℃持續2分鐘，接著94℃持續30秒、55℃持續30秒及68℃持續1分鐘，循環28次。所用引子為外顯子1正向(GGAAGAAGGGGTTACGCTGT (SEQ ID NO: 66))及外顯子5反向(GGAAGAAGGGGTTACGCTGT (SEQ ID NO: 67))。
進行密度測定法，且外顯子跳過計算為經跳過轉錄與總轉錄物之比率。-指示＜20%外顯子跳過，+指示在20-40%之間的外顯子跳過，++指示在40-80%之間的外顯子跳過，且+++指示＞80%外顯子跳過。
9.由在正常纖維母細胞中具有SEQ ID NO: 56之CPP之PPMO的PMP22之蛋白質降低
化合物編號 序列 目標區域 SEQ ID NO 外顯子跳過
83 CTCAGCAACAGGAGGAGCATTCTGG PMP22 H2A (+30+54) 9 -
84 TGATACTCAGCAACAGGAGGAGCAT PMP22 H2A (+35+59) 10 -
85 GCAGCACCAGCACCGCGACGTGGAG PMP22 H2A (+65+89) 26 +++
86 GAACAGCAGCACCAGCACCGCGACG PMP22 H2A (+70+94) 27 -
87 GAGACGAACAGCAGCACCAGCACCG PMP22 H2A (+75+99) 28 -
在生長培養基(10%FCS DMEM)中前一天接種正常纖維母細胞，且用稀釋於Opti-MEM中之具有SEQ ID NO: 56之CPP的PPMO轉染，且在收集細胞之前保持3-5天。
約30 µg總蛋白質用於各樣品，且使用iBlot™ 2凝膠傳送裝置(Thermo Fisher)轉移至PDVF膜上。用在4℃下在1:500之稀釋下施加48小時之多株抗PMP22 (Origene)偵測PMP22。β微管蛋白在4℃下在1:3000之稀釋度下偵測到單株抗β微管蛋白(Thermo Fisher)持續48小時。經HRP標記之抗兔及抗小鼠二級抗體分別在室溫下施用1小時。使用Immobilon西方化學發光HRP受質偵測墨點，且使用具有FusionCapt Advance軟體之融合FX凝膠文件系統(Vilber Lourmat)捕捉影像。使用影像J軟體(NIH)進行密度量測分析。
進行密度測定法，且相對蛋白質量藉由相對於β微管蛋白標準化來計算。自未經轉染之樣品的相對變化用於展示PMP22之蛋白質降低。-指示無蛋白質降低，+指示＜20%之間蛋白質降低，++指示20-50%之間蛋白質降低及+++指示＞50%蛋白質降低。
10.由在CMT1A患者纖維母細胞中具有SEQ ID NO: 56之CPP之PPMO的PMP22之蛋白質降低
化合物編號 序列 目標區域 SEQ ID NO 外顯子跳過
88 CGACGTGGAGGACGATGATACTCAG PMP22 H2A (+50+74) 20 -
89 CACCGCGACGTGGAGGACGATGATA PMP22 H2A (+55+79) 23 -
在生長培養基(10%FCS DMEM)中前一天接種CMT1A纖維母細胞，且用稀釋於Opti-MEM中之具有SEQ ID NO: 56之CPP的PPMO轉染，且在收集細胞之前保持3-5天。
約30 µg總蛋白質用於各樣品，且使用iBlot™ 2凝膠傳送裝置(Thermo Fisher)轉移至PDVF膜上。用在4℃下在1:500之稀釋下施加48小時之多株抗PMP22 (Origene)偵測PMP22。β微管蛋白在4℃下在1:3000之稀釋度下偵測到單株抗β微管蛋白(Thermo Fisher)持續48小時。經HRP標記之抗兔及抗小鼠二級抗體分別在室溫下施用1小時。使用Immobilon西方化學發光HRP受質偵測墨點，且使用具有FusionCapt Advance軟體之融合FX凝膠文件系統(Vilber Lourmat)捕捉影像。使用影像J軟體(NIH)進行密度量測分析。
進行密度測定法，且相對蛋白質量藉由相對於β微管蛋白標準化來計算。自未經轉染之樣品的相對變化用於展示PMP22之蛋白質降低。-指示無蛋白質降低，+指示＜20%之間蛋白質降低，++指示20-50%之間蛋白質降低及+++指示＞50%蛋白質降低。
11.由在CMT1A患者纖維母細胞中具有SEQ ID NO: 61之CPP之PPMO的PMP22之蛋白質降低
化合物編號 序列 目標區域 SEQ ID NO 外顯子跳過
90 CTCAGCAACAGGAGGAGCATTCTGG PMP22 H2A (+55+79) 9 +++
91 CGATCCATTGCTAGAGAGAATCAGA PMP22 H3A (-15+10) 30 +
92 AGAGTTGGCAGAAGAACAGGAACAG PMP22 H4A (+60+84) 41 ++
在生長培養基(10%FCS DMEM)中前一天接種CMT1A纖維母細胞，且用稀釋於Opti-MEM中之具有SEQ ID NO: 61之CPP的PPMO轉染，且在收集細胞之前保持3-5天。
約30 µg總蛋白質用於各樣品，且使用iBlot™ 2凝膠傳送裝置(Thermo Fisher)轉移至PDVF膜上。用在4℃下在1:500之稀釋下施加48小時之多株抗PMP22 (Origene)偵測PMP22。β微管蛋白在4℃下在1:3000之稀釋度下偵測到單株抗β微管蛋白(Thermo Fisher)持續48小時。經HRP標記之抗兔及抗小鼠二級抗體分別在室溫下施用1小時。使用Immobilon西方化學發光HRP受質偵測墨點，且使用具有FusionCapt Advance軟體之融合FX凝膠文件系統(Vilber Lourmat)捕捉影像。使用影像J軟體(NIH)進行密度量測分析。
進行密度測定法，且相對蛋白質量藉由相對於β微管蛋白標準化來計算。自未經轉染之樣品的相對變化用於展示PMP22之蛋白質降低。-指示無蛋白質降低，+指示＜20%之間蛋白質降低，++指示20-50%之間蛋白質降低及+++指示＞50%蛋白質降低。
12.由在人類神經鞘細胞株中具有SEQ ID NO: 61之CPP之PPMO的PMP22之蛋白質降低
化合物編號 序列 目標區域 SEQ ID NO 外顯子跳過
93 CTCAGCAACAGGAGGAGCATTCTGG PMP22 H2A (+55+79) 9 +
94 CGATCCATTGCTAGAGAGAATCAGA PMP22 H3A (-15+10) 30 ++
95 AGAGTTGGCAGAAGAACAGGAACAG PMP22 H4A (+60+84) 41 ++
在生長培養基(10%FCS DMEM)中前一天接種人類神經鞘細胞，且用稀釋於Opti-MEM中之具有SEQ ID NO: 61之CPP的PPMO轉染，且在收集細胞之前保持3-5天。
約30 µg總蛋白質用於各樣品，且使用iBlot™ 2凝膠傳送裝置(Thermo Fisher)轉移至PDVF膜上。用在4℃下在1:500之稀釋下施加48小時之多株抗PMP22 (Origene)偵測PMP22。β微管蛋白在4℃下在1:3000之稀釋度下偵測到單株抗β微管蛋白(Thermo Fisher)持續48小時。經HRP標記之抗兔及抗小鼠二級抗體分別在室溫下施用1小時。使用Immobilon西方化學發光HRP受質偵測墨點，且使用具有FusionCapt Advance軟體之融合FX凝膠文件系統(Vilber Lourmat)捕捉影像。使用影像J軟體(NIH)進行密度量測分析。
進行密度測定法，且相對蛋白質量藉由相對於β微管蛋白標準化來計算。自未經轉染之樣品的相對變化用於展示PMP22之蛋白質降低。-指示無蛋白質降低，+指示＜20%之間蛋白質降低，++指示20-50%之間蛋白質降低及+++指示＞50%蛋白質降低。
13.由在自CMT1A C3小鼠分離之神經鞘細胞中具有SEQ ID NO: 61之CPP的PPMO外顯子跳過PMP22
序列 目標區域 SEQ ID NO 外顯子跳過
GACGATGATACTCAGCAACAGGAGG PMP22 H2A (+40+64) 13 -
TGGAGGACGATGATACTCAGCAACA PMP22 H2A (+45+69) 16 ++
CGACGTGGAGGACGATGATACTCAG PMP22 H2A (+50+74) 20 +++
CACCGCGACGTGGAGGACGATGATA PMP22 H2A (+55+79) 23 +++
CGATCCATTGCTAGAGAGAATCAGA PMP22 H3A (-15+10) 30 +++
AGAGTTGGCAGAAGAACAGGAACAG PMP22 H4A (+60+84) 41 ++
自CMT1A C3小鼠中分離神經鞘細胞且在生長培養基(10%FCS DMEM)中前一天接種，且用稀釋於Opti-MEM中之具有SEQ ID NO: 61之CPP的PPMO轉染，且在收集細胞之前保持3-5天。
使用具有Platinum ®Taq DNA Polymerase (ThermoFisher Scientific, Australia)之Superscript III One-Step RT-PCR系統對50 ng RNA模板進行RT-PCR。循環條件包括55℃持續30分鐘、94℃持續2分鐘，接著94℃持續30秒、55℃持續30秒及68℃持續1分鐘，循環28次。所用引子為外顯子1正向(GGAAGAAGGGGTTACGCTGT)及外顯子5反向(GGAAGAAGGGGTTACGCTGT)。
進行密度測定法，且外顯子跳過計算為經跳過轉錄與總轉錄物之比率。-指示＜20%外顯子跳過，+指示在20-40%之間的外顯子跳過，++指示在40-80%之間的外顯子跳過，且+++指示＞80%外顯子跳過。
14.由在自CMT1A C3小鼠分離之神經鞘細胞中具有SEQ ID NO: 58之CPP的PPMO外顯子跳過PMP22
序列 目標區域 SEQ ID NO 外顯子跳過
GACGATGATACTCAGCAACAGGAGG PMP22 H2A (+40+64) 13 +++
TGGAGGACGATGATACTCAGCAACA PMP22 H2A (+45+69) 16 +++
CGATCCATTGCTAGAGAGAATCAGA PMP22 H3A (-15+10) 30 ++
AGAGTTGGCAGAAGAACAGGAACAG PMP22 H4A (+60+84) 41 ++
自CMT1A C3小鼠中分離神經鞘細胞且在生長培養基(10%FCS DMEM)中前一天接種，且用稀釋於Opti-MEM中之具有SEQ ID NO: 58之CPP的PPMO轉染，且在收集細胞之前保持3-5天。
使用具有Platinum ®Taq DNA Polymerase (ThermoFisher Scientific, Australia)之Superscript III One-Step RT-PCR系統對50 ng RNA模板進行RT-PCR。循環條件包括55℃持續30分鐘、94℃持續2分鐘，接著94℃持續30秒、55℃持續30秒及68℃持續1分鐘，循環28次。所用引子為外顯子1正向(GGAAGAAGGGGTTACGCTGT)及外顯子5反向(GGAAGAAGGGGTTACGCTGT)。
進行密度測定法，且外顯子跳過計算為經跳過轉錄與總轉錄物之比率。-指示＜20%外顯子跳過，+指示在20-40%之間的外顯子跳過，++指示在40-80%之間的外顯子跳過，且+++指示＞80%外顯子跳過。
15.由在自CMT1A C3小鼠分離之神經鞘細胞中具有SEQ ID NO: 61之CPP之PPMO的PMP22之蛋白質降低
序列 目標區域 SEQ ID NO 蛋白質降低
TGGAGGACGATGATACTCAGCAACA PMP22 H2A (+45+69) 16 +
自CMT1A C3小鼠中分離神經鞘細胞且在生長培養基(10%FCS DMEM)中前一天接種，且用稀釋於Opti-MEM中之具有SEQ ID NO: 61之CPP的PPMO轉染，且在收集細胞之前保持3-5天。
約30 µg總蛋白質用於各樣品，且使用iBlot™ 2凝膠傳送裝置(Thermo Fisher)轉移至PDVF膜上。用在4℃下在1:500之稀釋下施加48小時之多株抗PMP22 (Origene)偵測PMP22。β微管蛋白在4℃下在1:3000之稀釋度下偵測到單株抗β微管蛋白(Thermo Fisher)持續48小時。經HRP標記之抗兔及抗小鼠二級抗體分別在室溫下施用1小時。使用Immobilon西方化學發光HRP受質偵測墨點，且使用具有FusionCapt Advance軟體之融合FX凝膠文件系統(Vilber Lourmat)捕捉影像。使用影像J軟體(NIH)進行密度量測分析。
進行密度測定法，且相對蛋白質量藉由相對於β微管蛋白標準化來計算。自未經轉染之樣品的相對變化用於展示PMP22之蛋白質降低。-指示無蛋白質降低，+指示＜20%之間蛋白質降低，++指示20-50%之間蛋白質降低及+++指示＞50%蛋白質降低。
16.由在自CMT1A C3小鼠分離之神經鞘細胞中具有SEQ ID NO: 58之CPP之PPMO的PMP22之蛋白質降低
序列 目標區域 SEQ ID NO 蛋白質降低
TGGAGGACGATGATACTCAGCAACA PMP22 H2A (+45+69) 16 +
CGATCCATTGCTAGAGAGAATCAGA PMP22 H3A (-15+10) 30 +
自CMT1A C3小鼠中分離神經鞘細胞且在生長培養基(10%FCS DMEM)中前一天接種，且用稀釋於Opti-MEM中之具有SEQ ID NO: 58之CPP的PPMO轉染，且在收集細胞之前保持3-5天。
約30 µg總蛋白質用於各樣品，且使用iBlot™ 2凝膠傳送裝置(Thermo Fisher)轉移至PDVF膜上。用在4℃下在1:500之稀釋下施加48小時之多株抗PMP22 (Origene)偵測PMP22。β微管蛋白在4℃下在1:3000之稀釋度下偵測到單株抗β微管蛋白(Thermo Fisher)持續48小時。經HRP標記之抗兔及抗小鼠二級抗體分別在室溫下施用1小時。使用Immobilon西方化學發光HRP受質偵測墨點，且使用具有FusionCapt Advance軟體之融合FX凝膠文件系統(Vilber Lourmat)捕捉影像。使用影像J軟體(NIH)進行密度量測分析。
進行密度測定法，且相對蛋白質量藉由相對於β微管蛋白標準化來計算。自未經轉染之樣品的相對變化用於展示PMP22之蛋白質降低。-指示無蛋白質降低，+指示＜20%之間蛋白質降低，++指示20-50%之間蛋白質降低及+++指示＞50%蛋白質降低。
TW202325846A_111140325_SEQL.xml

Claims (78)

  1. 一種反義寡聚物，其包含經化學修飾之反義寡聚物，該經化學修飾之反義寡聚物具有與人類周邊髓鞘蛋白22 (PMP22)前驅mRNA之目標區域互補的靶向序列。
  2. 如請求項1之反義寡聚物，其中該反義寡聚物誘導該PMP22前驅mRNA之外顯子2 (SEQ ID NO: 2)、外顯子3 (SEQ ID NO: 3)、外顯子4 (SEQ ID NO: 4)或外顯子5 (SEQ ID NO: 5)中之一或多者的跳過。
  3. 如請求項1之反義寡聚物，其中該靶向序列與外顯子2 (SEQ ID NO: 2)、外顯子3 (SEQ ID NO: 3)、外顯子4 (SEQ ID NO: 4)或外顯子5 (SEQ ID NO: 5)中之一者內的區域互補。
  4. 如請求項1之反義寡聚物，其中該靶向序列與跨越外顯子2 (SEQ ID NO: 2)、外顯子3 (SEQ ID NO: 3)、外顯子4 (SEQ ID NO: 4)或外顯子5 (SEQ ID NO: 5)之外顯子/內含子接合點的區域互補。
  5. 如請求項1至4中任一項之反義寡聚物，其中該目標區域為PMP22 H2A (-25-1)、PMP22 H2A (+1+25)、PMP22 H2A (+25+49)、PMP22 H2A (+30+54)、PMP22 H2A (+35+59)、PMP22 H2A (+38+57)、PMP22 H2A (+40+59)、PMP22 H2A (+40+64)、PMP22 H2A (+42+61)、PMP22 H2A (+44+63)、PMP22 H2A (+45+69)、PMP22 H2A (+46+65)、PMP22 H2A (+48+67)、PMP22 H2A (+50+69)、PMP22 H2A (+50+74)、PMP22 H2A (+52+71)、PMP22 H2A (+54+73)、PMP22 H2A (+55+79)、PMP22 H2A (+56+75)、PMP22 H2A (+60+84)、PMP22 H2A (+65+89)、PMP22 H2A (+70+94)、PMP22 H2A (+75+99)、PMP22 H2D (+15-10)、PMP22 H3A (-15+10)、PMP22 H3A (+1+25)、PMP22 H3A (+15+39)、PMP22 H3A (+24+48)、PMP22 H3A (+48+72)、PMP22 H3A (+65+89)、PMP22 H3A (+74+98)、PMP22 H3D (+17-8)、PMP22 H3D (+22-3)、PMP22 H4A (-10+15)、PMP22 H4A (+30+54)、PMP22 H4A (+60+84)、PMP22 H4A (+90+114)、PMP22 H4A (+100+124)、PMP22 H4A (+110+134)、PMP22 H4D (+22-3)、PMP22 H5A (-8+17)、PMP22 H5A (+18+42)、PMP22 H5A (+37+61)、PMP22 H5A (+55+79)或PMP22 H5A (+1271+1295)。
  6. 如請求項1至5中任一項之反義寡聚物，其中該靶向序列選自SEQ ID NO: 6至50。
  7. 如請求項1至6中任一項之反義寡聚物，其中該反義寡聚物與外顯子2之一部分互補，或誘導外顯子2之跳過。
  8. 如請求項7之反義寡聚物，其中該目標區域為PMP22 H2A (-25-1)、PMP22 H2A (+1+25)、PMP22 H2A (+25+49)、PMP22 H2A (+30+54)、PMP22 H2A (+35+59)、PMP22 H2A (+40+64)、PMP22 H2A (+45+69)、PMP22 H2A (+50+74)、PMP22 H2A (+55+79)、PMP22 H2A (+60+84)、PMP22 H2A (+65+89)、PMP22 H2A (+70+94)、PMP22 H2A (+75+99)或PMP22 H2D (+15-10)。
  9. 如請求項8之反義寡聚物，其中該反義寡聚物包含選自SEQ ID NO: 6至29之靶向序列。
  10. 如請求項1至6中任一項之反義寡聚物，其中該反義寡聚物與外顯子3之一部分互補，或誘導外顯子3之跳過。
  11. 如請求項10之反義寡聚物，其中該目標區域為PMP22 H3A (-15+10)、PMP22 H3A (+1+25)、PMP22 H3A (+15+39)、PMP22 H3A (+24+48)、PMP22 H3A (+48+72)、PMP22 H3A (+65+89)、PMP22 H3A (+74+98)、PMP22 H3D (+17-8)或PMP22 H3D (+22-3)。
  12. 如請求項11之反義寡聚物，其中該反義寡聚物包含選自SEQ ID NO: 30至38之靶向序列。
  13. 如請求項1至6中任一項之反義寡聚物，其中該反義寡聚物與外顯子4之一部分互補，或誘導外顯子4之跳過。
  14. 如請求項13之反義寡聚物，其中該目標區域為PMP22 H4A (-10+15)、PMP22 H4A (+30+54)、PMP22 H4A (+60+84)、PMP22 H4A (+90+114)、PMP22 H4A (+100+124)、PMP22 H4A (+110+134)或PMP22 H4D (+22-3)。
  15. 如請求項14之反義寡聚物，其中該反義寡聚物包含選自SEQ ID NO: 39至45之靶向序列。
  16. 如請求項1至6中任一項之反義寡聚物，其中該反義寡聚物與外顯子5之一部分互補，或誘導外顯子5之跳過。
  17. 如請求項16之反義寡聚物，其中該目標區域為PMP22 H5A (-8+17)、PMP22 H5A (+18+42)、PMP22 H5A (+37+61)、PMP22 H5A (+55+79)或PMP22 H5A (+1271+1295)。
  18. 如請求項17之反義寡聚物，其中該反義寡聚物包含選自SEQ ID NO: 46至50之靶向序列。
  19. 如請求項1至18中任一項之反義寡聚物，其中該反義寡聚物共價連接至細胞穿透肽。
  20. 如請求項19之反義寡聚物，其中該細胞穿透肽經由選自直接鍵、甘胺酸或脯胺酸之連接子共價連接至該反義寡聚物。
  21. 如請求項19或請求項20之反義寡聚物，其中該細胞穿透肽選自rTAT、Tat、R 9F 2、R 5F 2R 4、R 4、R 5、R 6、R 7、R 8、R 9、(RXR) 4、(RXR) 5、(RXRRBR) 2、(RAR) 4F 2及(RGR) 4F 2，其中A表示丙胺酸，B表示β丙胺酸，F表示苯丙胺酸，G表示甘胺酸，R表示精胺酸，且X表示6-胺基己酸。
  22. 如請求項1至21中任一項之反義寡聚物，其中該反義寡聚物選自肽核酸、鎖定核酸、二胺基磷酸酯嗎啉代寡聚物、2'-O-Me硫代磷酸酯寡聚物或其組合。
  23. 如請求項22之反義寡聚物，其中該反義寡聚物為二胺基磷酸酯嗎啉代寡聚物。
  24. 一種反義寡聚物，其具有與該人類周邊髓鞘蛋白22前驅mRNA之外顯子2 (SEQ ID NO: 2)、外顯子3 (SEQ ID NO: 3)、外顯子4 (SEQ ID NO: 4)或外顯子5 (SEQ ID NO: 5)中之一或多者之一部分互補的靶向序列，其中該反義寡聚物為式I之二胺基磷酸酯嗎啉代寡核苷酸： (I) 或其醫藥學上可接受之鹽， 其中： A'選自-NHCH 2C(O)NH 2、-N(C 1 - 6烷基)CH 2C(O)NH 2、 ，其中 R 5為-C(O)(O-烷基) x-OH，其中x為3-10，且各烷基在各次出現時獨立地為C 2 - 6烷基，或R 5選自-C(O)C 1 - 6烷基、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、-(C 1 - 6烷基)R 6、-(C 1 - 6雜烷基)-R 6、芳基-R 6、雜芳基-R 6、-C(O)O-(C 1 - 6烷基)-R 6、-C(O)O-芳基-R 6、-C(O)O-雜芳基-R 6，及 ， 其中R 6選自OH、SH及NH 2，或R 6為共價連接至固體載體之O、S或NH； 各R 1獨立地選自OH及-NR 3R 4，其中各R 3及R 4在各次出現時獨立地為H、-C 1 - 6烷基，或其中R 3及R 4一起表示視情況經取代之哌𠯤、哌啶或吡咯啶，其中該哌𠯤具有下式： ； R 12為H、C 1-C 6烷基或電子對； R 13選自由以下組成之群：H、C 1-C 6烷基、C(=NH)NH 2、Z-L 2-NHC(=NH)NH 2及[C(O)CHR 'NH] mH； Z為羰基或直接鍵； L 2為選自C 1-C 18烷基、C 1-C 18烷氧基及C 1-C 18烷基胺基之視情況選用之連接子； R '為天然存在之胺基酸之側鏈或其單碳或雙碳同源物； m為1至6； 各R 2獨立地選自天然或非天然存在之核鹼基，且由各R 2自5'至3'之組合形成的序列為靶向序列； z為8至40； E'選自H、-C 1 - 6烷基、-C(O)C 1 - 6烷基、苯甲醯基、硬脂醯基、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、 ， 其中 R 11選自OH及-NR 3R 4； 其中L藉由醯胺鍵共價連接至J之羧基末端，且L選自-NH(CH 2) 1 - 6C(O)-、-NH(CH 2) 1 - 6C(O)NH(CH 2) 1 - 6C(O)-及 ； J為載體肽； G選自H、-C(O)C 1 - 6烷基、苯甲醯基及硬脂醯基，且G共價連接至J之胺基末端。
  25. 如請求項24之反義寡聚物，其中該反義寡聚物誘導該PMP22前驅mRNA之外顯子2 (SEQ ID NO: 2)、外顯子3 (SEQ ID NO: 3)、外顯子4 (SEQ ID NO: 4)或外顯子5 (SEQ ID NO: 5)中之一或多者的跳過。
  26. 如請求項24之反義寡聚物，其中該靶向序列與外顯子2 (SEQ ID NO: 2)、外顯子3 (SEQ ID NO: 3)、外顯子4 (SEQ ID NO: 4)或外顯子5 (SEQ ID NO: 5)中之一者內的區域互補。
  27. 如請求項24之反義寡聚物，其中該靶向序列與跨越外顯子2 (SEQ ID NO: 2)、外顯子3 (SEQ ID NO: 3)、外顯子4 (SEQ ID NO: 4)或外顯子5 (SEQ ID NO: 5)之外顯子/內含子接合點的區域互補。
  28. 如請求項24至27中任一項之反義寡聚物，其中該目標區域為PMP22 H2A (-25-1)、PMP22 H2A (+1+25)、PMP22 H2A (+25+49)、PMP22 H2A (+30+54)、PMP22 H2A (+35+59)、PMP22 H2A (+38+57)、PMP22 H2A (+40+59)、PMP22 H2A (+40+64)、PMP22 H2A (+42+61)、PMP22 H2A (+44+63)、PMP22 H2A (+45+69)、PMP22 H2A (+46+65)、PMP22 H2A (+48+67)、PMP22 H2A (+50+69)、PMP22 H2A (+50+74)、PMP22 H2A (+52+71)、PMP22 H2A (+54+73)、PMP22 H2A (+55+79)、PMP22 H2A (+56+75)、PMP22 H2A (+60+84)、PMP22 H2A (+65+89)、PMP22 H2A (+70+94)、PMP22 H2A (+75+99)、PMP22 H2D (+15-10)、PMP22 H3A (-15+10)、PMP22 H3A (+1+25)、PMP22 H3A (+15+39)、PMP22 H3A (+24+48)、PMP22 H3A (+48+72)、PMP22 H3A (+65+89)、PMP22 H3A (+74+98)、PMP22 H3D (+17-8)、PMP22 H3D (+22-3)、PMP22 H4A (-10+15)、PMP22 H4A (+30+54)、PMP22 H4A (+60+84)、PMP22 H4A (+90+114)、PMP22 H4A (+100+124)、PMP22 H4A (+110+134)、PMP22 H4D (+22-3)、PMP22 H5A (-8+17)、PMP22 H5A (+18+42)、PMP22 H5A (+37+61)、PMP22 H5A (+55+79)或PMP22 H5A (+1271+1295)。
  29. 如請求項24至28中任一項之反義寡聚物，其中該靶向序列係選自： CTGCGAGGAGAGCGCTGGGCGTGAG (SEQ ID NO: 6)，z為25； AAGTTCTGCTCAGCGGAGTTTCTGC (SEQ ID NO: 7)，z為25； CAACAGGAGGAGCATTCTGGCGGCA (SEQ ID NO: 8)，z為25； CTCAGCAACAGGAGGAGCATTCTGG (SEQ ID NO: 9)，z為25； TGATACTCAGCAACAGGAGGAGCAT (SEQ ID NO: 10)，z為25； ATACTCAGCAACAGGAGGAG (SEQ ID NO: 11)，z為20； TGATACTCAGCAACAGGAGG (SEQ ID NO: 12)，z為20； GACGATGATACTCAGCAACAGGAGG (SEQ ID NO: 13)，z為25； GATGATACTCAGCAACAGGA (SEQ ID NO: 14)，z為20； ACGATGATACTCAGCAACAG (SEQ ID NO: 15)，z為20； TGGAGGACGATGATACTCAGCAACA (SEQ ID NO: 16)，z為25； GGACGATGATACTCAGCAAC (SEQ ID NO: 17)，z為20； GAGGACGATGATACTCAGCA (SEQ ID NO: 18)，z為20； TGGAGGACGATGATACTCAG (SEQ ID NO: 19)，z為20； CGACGTGGAGGACGATGATACTCAG (SEQ ID NO: 20)，z為25； CGTGGAGGACGATGATACTC (SEQ ID NO: 21)，z為20； GACGTGGAGGACGATGATAC (SEQ ID NO: 22)，z為20； CACCGCGACGTGGAGGACGATGATA (SEQ ID NO: 23)，z為25； GCGACGTGGAGGACGATGAT (SEQ ID NO: 24)，z為20； ACCAGCACCGCGACGTGGAGGACGA (SEQ ID NO: 25)，z為25； GCAGCACCAGCACCGCGACGTGGAG (SEQ ID NO: 26)，z為25； GAACAGCAGCACCAGCACCGCGACG (SEQ ID NO: 27)，z為25； GAGACGAACAGCAGCACCAGCACCG (SEQ ID NO: 28)，z為25； AGGCACTCACGCTGACGATCGTGGA (SEQ ID NO: 29)，z為25； CGATCCATTGCTAGAGAGAATCAGA (SEQ ID NO: 30)，z為25； CGTGTCCATTGCCCACGATCCATTG (SEQ ID NO: 31)，z為25； CCAGAGATCAGTTGCGTGTCCATTG (SEQ ID NO: 32)，z為25； ACAGTTCTGCCAGAGATCAGTTGCG (SEQ ID NO: 33)，z為25； GACATTTCCTGAGGAAGAGGTGCTA (SEQ ID NO: 34)，z為25； GATGAGAAACAGTGGTGGACATTTC (SEQ ID NO: 35)，z為25； TTTGGTGATGATGAGAAACAGTGGT (SEQ ID NO: 36)，z為25； AGCCTCACCGTTTGGTGATGATGAG (SEQ ID NO: 37)，z為25； CACCGTTTGGTGATGATGAGAAACA (SEQ ID NO: 38)，z為25； CAGACTGCAGCCATTCTGGGGGAAA (SEQ ID NO: 39)，z為25； GAATGCTGAAGATGATCGACAGGAT (SEQ ID NO: 40)，z為25； AGAGTTGGCAGAAGAACAGGAACAG (SEQ ID NO: 41)，z為25； TGTAAAACCTGCCCCCCTTGGTGAG (SEQ ID NO: 42)，z為25； ATTCCAGTGATGTAAAACCTGCCCC (SEQ ID NO: 43)，z為25； AATTTGGAAGATTCCAGTGATGTAA (SEQ ID NO: 44)，z為25； TACCAGCAAGAATTTGGAAGATTCC (SEQ ID NO: 45)，z為25； CACTCATCACGCACAGACCTGGGGAA (SEQ ID NO: 46)，z為26； GCCTCACCGTGTAGATGGCCGCAGC (SEQ ID NO: 47)，z為25； TTGAGATGCCACTCCGGGTGCCTCA (SEQ ID NO: 48)，z為25； CCGTAGGAGTAATCCGAGTTGAGAT (SEQ ID NO: 49)，z為25； CTCTGATGTTTATTTTAATGCATCT (SEQ ID NO: 50)，z為25。
  30. 如請求項24至29中任一項之反義寡聚物，其中該反義寡聚物與外顯子2之一部分互補，或誘導外顯子2之跳過。
  31. 如請求項30之反義寡聚物，其中該目標區域為PMP22 H2A (-25-1)、PMP22 H2A (+1+25)、PMP22 H2A (+25+49)、PMP22 H2A (+30+54)、PMP22 H2A (+35+59)、PMP22 H2A (+40+64)、PMP22 H2A (+45+69)、PMP22 H2A (+50+74)、PMP22 H2A (+55+79)、PMP22 H2A (+60+84)、PMP22 H2A (+65+89)、PMP22 H2A (+70+94)、PMP22 H2A (+75+99)或PMP22 H2D (+15-10)。
  32. 如請求項31之反義寡聚物，其中該反義寡聚物包含選自SEQ ID NO: 6至29之靶向序列。
  33. 如請求項24至29中任一項之反義寡聚物，其中該反義寡聚物與外顯子3之一部分互補，或誘導外顯子3之跳過。
  34. 如請求項33之反義寡聚物，其中該目標區域為PMP22 H3A (-15+10)、PMP22 H3A (+1+25)、PMP22 H3A (+15+39)、PMP22 H3A (+24+48)、PMP22 H3A (+48+72)、PMP22 H3A (+65+89)、PMP22 H3A (+74+98)、PMP22 H3D (+17-8)或PMP22 H3D (+22-3)。
  35. 如請求項34之反義寡聚物，其中該反義寡聚物包含選自SEQ ID NO: 30至38之靶向序列。
  36. 如請求項24至29中任一項之反義寡聚物，其中該反義寡聚物與外顯子4之一部分互補，或誘導外顯子4之跳過。
  37. 如請求項36之反義寡聚物，其中該目標區域為PMP22 H4A (-10+15)、PMP22 H4A (+30+54)、PMP22 H4A (+60+84)、PMP22 H4A (+90+114)、PMP22 H4A (+100+124)、PMP22 H4A (+110+134)或PMP22 H4D (+22-3)。
  38. 如請求項37之反義寡聚物，其中該反義寡聚物包含選自SEQ ID NO: 39至45之靶向序列。
  39. 如請求項24至29中任一項之反義寡聚物，其中該反義寡聚物與外顯子5之一部分互補，或誘導外顯子5之跳過。
  40. 如請求項39之反義寡聚物，其中該目標區域為PMP22 H5A (-8+17)、PMP22 H5A (+18+42)、PMP22 H5A (+37+61)、PMP22 H5A (+55+79)或PMP22 H5A (+1271+1295)。
  41. 如請求項40之反義寡聚物，其中該反義寡聚物包含選自SEQ ID NO: 46至50之靶向序列。
  42. 如請求項24至41中任一項之反義寡聚物，其中該二胺基磷酸酯嗎啉代寡聚物共價連接至細胞穿透肽，且其中以下定義中之一者出現在式I之寡聚物中： 1) A'為 ；2) E'為 ；或3) E'為 。
  43. 如請求項24至41中任一項之反義寡聚物，其中E'選自H、-C 1 - 6烷基、-C(O)C 1 - 6烷基、苯甲醯基、硬脂醯基、三苯甲基、單甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基及 。
  44. 如請求項24至41中任一項之反義寡聚物，其中 A'選自-N(C 1 - 6-烷基)CH 2C(O)NH 2、 。
  45. 如請求項24至41中任一項之反義寡聚物，其中E'選自H、-C(O)CH 3、苯甲醯基、硬脂醯基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基及 。
  46. 如請求項24至41中任一項之反義寡聚物，其中A'選自-N(C 1 - 6-烷基)CH 2C(O)NH 2、 ；及 E'為 。
  47. 如請求項24至41中任一項之反義寡聚物，其中A'為 ，及 E'選自H、-C(O)CH 3、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲醯基及硬脂醯基。
  48. 如請求項24至41中任一項之反義寡聚物，其中式I之肽-寡核苷酸結合物係選自以下之肽-寡核苷酸結合物： 其中E'選自H、C 1 - 6烷基、-C(O)CH 3、苯甲醯基及硬脂醯基。
  49. 如請求項48之反義寡聚物，其中該肽-寡核苷酸結合物具有式(Ia)。
  50. 如請求項48之反義寡聚物，其中該肽-寡核苷酸結合物具有式(Ib)。
  51. 如請求項24至50中任一項之反義寡聚物，或其醫藥學上可接受之鹽，其中E'選自-C(O)(烷基) v(O-烷基) u-NHC(O)-R 9、-C(O)-R 9及-R 9，其中u為0-12，v為0-12，各烷基在各次出現時獨立地為C 2 - 6烷基。
  52. 如請求項24至51中任一項之反義寡聚物，或其醫藥學上可接受之鹽，其中 A'為 ，其中R 5選自-C(O)(烷基) w(O-烷基) y-NHC(O)-R 9、-C(O)-R 9及-R 9，其中y為0-12，w為0-12，各烷基在各次出現時獨立地為C 2 - 6烷基。
  53. 如請求項24至52中任一項之反義寡聚物，或其醫藥學上可接受之鹽，其中E'為-C(O)(烷基) v(O-烷基) u-NHC(O)-R 9，其中u為0-12，v為0-12，各烷基在各次出現時獨立地為C 2-6烷基。
  54. 如請求項24至53中任一項之反義寡聚物，或其醫藥學上可接受之鹽，其中A'為 ；及 E'為-C(O)(烷基) v(O-烷基) u-NHC(O)-R 9，其中u為0-12，v為0-12，各烷基在各次出現時獨立地為C 2-6烷基。
  55. 如請求項24至54中任一項之反義寡聚物，或其醫藥學上可接受之鹽，其中A'為-C(O)(烷基) w(O-烷基) y-NHC(O)-R 9，其中y為0-12，w為0-12，各烷基在各次出現時獨立地為C 2-6烷基；及E'選自H、-C(O)CH 3、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲醯基及硬脂醯基。
  56. 如請求項24至41中任一項之反義寡聚物，或其醫藥學上可接受之鹽，其中式I之結合物為選自以下之結合物： 其中E'為-C(O)(烷基) v(O-烷基) u-NHC(O)-R 9，其中u為0-12，v為0-12，各烷基在各次出現時獨立地為C 2-6烷基； 其中E'為-C(O)(烷基) v(O-烷基) u-NHC(O)-R 9，其中u為0-12，v為0-12，各烷基在各次出現時獨立地為C 2-6烷基； 其中R 5選自-C(O)(烷基) w(O-烷基) y-NHC(O)-R 9、-C(O)-R 9及-R 9，其中y為0-12，w為0-12，各烷基在各次出現時獨立地為C 2-6烷基，且其中E'選自H、C 1 - 6烷基、-C(O)CH 3、苯甲醯基及硬脂醯基；及 其中R 5選自-C(O)(烷基) w(O-烷基) y-NHC(O)-R 9、-C(O)-R 9及-R 9，其中y為0-12，w為0-12，各烷基在各次出現時獨立地為C 2-6烷基。
  57. 如請求項56之反義寡聚物，或其醫藥學上可接受之鹽，其中該結合物具有式(Ic)： 。
  58. 如請求項56之反義寡聚物，或其醫藥學上可接受之鹽，其中該結合物具有式(Id)： 。
  59. 如請求項24至58中任一項之反義寡聚物，或其醫藥學上可接受之鹽，其中該細胞穿透肽選自rTAT、Tat、R 9F 2、R 5F 2R 4、R 4、R 5、R 6、R 7、R 8、R 9、(RAhxR) 4、(RAhxR) 5、(RAhxRRBR) 2、(RAR) 4F 2及(RGR) 4F 2。
  60. 如請求項24至59中任一項之反義寡聚物，或其醫藥學上可接受之鹽，其中各R 1為N(CH 3) 2。
  61. 如請求項24至60中任一項之反義寡聚物，或其醫藥學上可接受之鹽，其中各R 2在各次出現時獨立地為選自以下之核鹼基：腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶及次黃嘌呤。
  62. 如請求項24至61中任一項之反義寡聚物，或其醫藥學上可接受之鹽，其中L為甘胺酸。
  63. 如請求項24至62中任一項之反義寡聚物，或其醫藥學上可接受之鹽，其中G選自H、C(O)CH 3、苯甲醯基及硬脂醯基。
  64. 如請求項24至63中任一項之反義寡聚物，或其醫藥學上可接受之鹽，其中G為H或-C(O)CH 3。
  65. 如請求項24至64中任一項之反義寡聚物，或其醫藥學上可接受之鹽，其中G為H。
  66. 如請求項24至65中任一項之反義寡聚物，或其醫藥學上可接受之鹽，其中G為-C(O)CH 3。
  67. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至66中任一項之寡聚物，及醫藥學上可接受之載劑。
  68. 如請求項1至66中任一項之化合物或如請求項67之組合物，其係用於治療有需要之個體之與周邊髓鞘蛋白22之失調相關的疾病。
  69. 如請求項68之供使用的化合物或組合物，其中與周邊髓鞘蛋白22之失調相關的疾病為1A型夏-馬-杜三氏症(CMT1A)。
  70. 一種治療與周邊髓鞘蛋白22之失調相關的疾病之方法，其包含向有需要之患者投與治療有效量之如請求項1至66中任一項之反義寡聚物或如請求項67之醫藥組合物。
  71. 如請求項70之方法，其中與周邊髓鞘蛋白22之失調相關的疾病為1A型夏-馬-杜三氏症(CMT1A)。
  72. 如請求項1至66中任一項之化合物或如請求項67之組合物，其係用作藥劑。
  73. 如請求項1至66中任一項之化合物或如請求項67之組合物，其係用於製備用以治療有需要之個體之與周邊髓鞘蛋白22之失調相關之疾病的藥劑。
  74. 如請求項73之供使用的化合物或組合物，其中與周邊髓鞘蛋白22之失調相關的該疾病為1A型夏-馬-杜三氏症(CMT1A)。
  75. 如請求項74之供使用的化合物或組合物，其中該疾病為1A型夏-馬-杜神經病變。
  76. 一種降低有需要之患者之周邊髓鞘蛋白22表現的方法，其包含向該患者投與治療有效量之如請求項1至66中任一項之反義寡聚物。
  77. 如請求項76之方法，其中該患者患有與周邊髓鞘蛋白22之失調相關的疾病。
  78. 如請求項76至77之方法，其中該患者患有1A型夏-馬-杜三氏症。
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