TW202323519A

TW202323519A - 無標記ｄｎａ產生

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Publication number: TW202323519A
Application number: TW111139535A
Authority: TW
Inventors: 凱文史密斯; 喬瑟夫薩爾奇斯; 斯托爾迪米特羅夫
Original assignee: 美商現代公司
Priority date: 2021-10-18
Filing date: 2022-10-18
Publication date: 2023-06-16
Also published as: WO2023069895A1

Abstract

本文提供經遺傳修飾之微生物，其包含編碼外排性幫浦或輸入蛋白之基因中之無義突變，及編碼使得能夠轉譯該外排性幫浦或輸入蛋白之壓制型tRNA之載體，此減輕該無義突變之效應。亦提供使用本文所提供之該等經遺傳修飾之微生物產生載體或無標記DNA之方法。

Description

無標記DNA產生

出於基因表現或基因體編輯之目的，將DNA成功遞送至細胞中需要克服三個明顯的障礙：1)細胞攝取後有效遞送至細胞質；2)避免細胞DNA活化之先天性免疫反應之活化；及3) DNA經由核套膜輸入核。將DNA併入至腺相關病毒(AAV)粒子中容許將病毒基因體(及由此所併入之DNA)有效遞送至細胞核中。然而，僅有限量之DNA (大約4.5 kb)可併入至AAV粒子中，且因此基於AAV之載體在可行性上無法遞送較大之DNA構築體。此外，對AAV衣殼蛋白產生之免疫反應限制了將來用相同衣殼蛋白投與AAV載體時DNA遞送之效率，此阻止涉及多劑量之治療方法。因此，基於AAV載體之方法不適於遞送大的DNA序列或多次遞送DNA構築體。

微生物可用於複製DNA載體，從而產生大量DNA以供遞送至細胞，用作活體外轉錄之模板，以及其他應用。此等DNA載體通常編碼抗生素抗性標記物，使得可在抗生素存在下培養微生物，以在發酵期間維持DNA存在於微生物細胞中。然而，抗生素抗性標記物通常為大的蛋白質，其對於微生物表現而言係負擔。此外，納入抗性標記物增加DNA載體之總長度，從而降低總產率。

本文提供不使用抗生素抗性基因用於DNA產生之經工程改造之細菌菌株及載體。在微生物中產生DNA通常涉及在所產生之DNA上使用抗生素抗性標記物，從而容許將抗生素添加至微生物生長培養基中以便進行正向選擇並維持宿主微生物中之該DNA。然而，抗生素抗性標記物對於細菌細胞表現而言耗費能量，且增加所複製DNA序列之長度。該等適應成本及增加之DNA長度降低DNA產生之效率。另外，抗生素抗性標記物之表現可能在使用DNA之下游應用中具有不期望之生物效應。因此，在宿主微生物中維持DNA模板之正向選擇之替代方法可提高DNA產生之效率且避免抗生素抗性標記物之不期望表現。將終止密碼子引入至編碼外排性幫浦之基因中可阻止細菌表現該外排性幫浦(efflux pump)之全長功能形式，使得其對多種抗微生物劑(諸如萘啶酮酸)敏感。然而，若細菌細胞表現攜帶胺基酸且包含與所引入之終止密碼子互補的反密碼子之壓制型tRNA，則所引入之終止密碼子有效地編碼由該壓制型tRNA攜帶之該胺基酸，且該細菌細胞可轉譯外排性幫浦之全長功能形式。若將終止密碼子引入至細菌之基因體中，且在載體(諸如質體)上包含編碼壓制型tRNA之核酸序列，則僅含有此一載體之細菌細胞將能夠在萘啶酮酸存在下生長。如本文所證明，此種將終止密碼子引入至細菌之編碼外排性幫浦之基因(諸如 tolC)中且將具有編碼壓制型tRNA之核酸之載體引入至細菌細胞群體中的方法容許正向選擇細菌。或者，將終止密碼子引入至編碼輸入蛋白之基因中阻止細菌自環境中輸入必需營養物，此對於無法合成營養物之營養缺陷型而言係致死的。因此，若輸入蛋白之表現由壓制型tRNA修復，則含有輸入蛋白無義突變之營養缺陷型將能夠生長。可使用多種對細菌具有毒性之化合物(諸如萘啶酮酸)來選擇含有該載體之細菌。重要的是，此方法容許複製不包含抗生素抗性標記物之載體，該等抗生素抗性標記物較大，減少載體拷貝數，且通常對於細菌表現而言在代謝上係負擔。此外，編碼壓制型tRNA之核酸序列相對較短，且因此該方法可用於產生較需要使用抗生素抗性標記物之彼等載體更小的載體。減小載體大小且使用負擔較少之正向選擇元件容許微生物生長更強勁且增加DNA之產率。

因此，本揭示案之一些態樣係關於經遺傳修飾之微生物，其包含 (i) 基因體，其在編碼外排性幫浦或輸入蛋白之基因中包含無義突變；及 (ii) 載體，其包含編碼壓制型tRNA之核酸序列，其中該無義突變包含第一終止密碼子，且該壓制型tRNA包含與該第一終止密碼子互補之反密碼子。

在一些實施例中，編碼外排性幫浦或輸入蛋白之基因包含位於第一終止密碼子下游之第二終止密碼子，其中該第二終止密碼子包含不為該第一終止密碼子之核酸序列之核酸序列。在一些實施例中，第一終止密碼子包含核酸序列TAG或UAG。在一些實施例中，第一終止密碼子包含核酸序列TAA或UAA。在一些實施例中，第一終止密碼子包含核酸序列TGA或UGA。在一些實施例中，第一終止密碼子位於編碼外排性幫浦或輸入蛋白之基因中之開放閱讀框的前400、前300、前250、前200、前150、前100、前90、前80、前70、前60、前50、前40、前30、前20、前10或前5個密碼子中。在一些實施例中，第一終止密碼子位於編碼外排性幫浦或輸入蛋白之基因中之開放閱讀框的前10個密碼子中。

在一些實施例中，壓制型tRNA為組胺酸tRNA。

在一些實施例中，基因體包含編碼 pir之核酸序列。在一些實施例中，第一啟動子可操作地連接至編碼 pir之核酸序列。在一些實施例中，第一啟動子選自由以下組成之群：Kan啟動子、LacIq啟動子、trc啟動子、Lpp啟動子及J23107啟動子。在一些實施例中，第一啟動子包含與SEQ ID NO: 3-7中之任一者之核酸序列具有至少90%序列一致性之核酸序列。

在一些實施例中，載體包含R6Kγ複製起點。

在一些實施例中，載體包含少於1,000、少於900、少於800、少於700、少於600或少於500個核苷酸。

在一些實施例中，基因體為大腸桿菌( E. coli)基因體。

在一些實施例中，基因體在編碼外排性幫浦之基因中包含無義突變，其中該編碼外排性幫浦之基因為 acrAB、 acrD、 acrEF、 emrD、 emrE、 emrKY、 mdfA、 tehAB、 tolC、 ybhGFSR、 ybjY、 ybjZ、 yegM、 yegNO、 yhiUV、 yjcP、 ylcB或 yohG。在一些實施例中，編碼外排性幫浦之基因為 tolC。在一些實施例中，微生物能夠在選擇劑存在下生長。在一些實施例中，選擇劑為胺苄青黴素(ampicillin)、氯黴素(chloramphenicol)、氟苯尼考(florfenicol)、克黴唑(clotrimazole)、嘌呤黴素(puromycin)、紅黴素(erythromycin)、胺甲喋呤(methotrexate)、新生黴素(novobiocin)、環丙沙星(ciprofloxacin)、諾氟沙星(norfloxacin)、萘啶酮酸、雷發平(rifampin)、梭鏈孢酸(fusidic acid)、鏈黴素(streptomycin)、磺乙醯胺、四環素、去氧膽酸鹽、膽酸鈉、牛磺去氧膽酸鈉、草酸鈉、原黃素(proflavine)、結晶紫、吖啶黃(acriflavin)、溴乙錠、四苯基鏻、玫瑰紅6G、氯化四苯基鉮、地喹氯銨(dequalinium chloride)、苯扎氯銨(benzalkonium chloride)、道諾黴素(daunomycin)、白花丹素(plumbagin)或甲基紫精。在一些實施例中，選擇劑為萘啶酮酸。在一些實施例中，選擇劑為去氧膽酸鹽。

在一些實施例中，基因體在編碼輸入蛋白之基因中包含無義突變。在一些實施例中，輸入蛋白選自由 mppA及 oppBCDF組成之群。在一些實施例中，微生物為營養缺陷型，其中該營養缺陷型不能合成一或多種營養物。在一些實施例中，營養缺陷型不能合成一或多種胺基酸。

在一些態樣中，本揭示案係關於在微生物群體中富集本文所提供之任一經遺傳修飾之微生物之方法，該方法包括使微生物群體暴露於選擇劑，其中在暴露於該選擇劑後，該群體中經遺傳修飾之微生物之頻率增加。在一些實施例中，選擇劑為胺苄青黴素、氯黴素、氟苯尼考、克黴唑、嘌呤黴素、紅黴素、胺甲喋呤、新生黴素、環丙沙星、諾氟沙星、萘啶酮酸、雷發平、梭鏈孢酸、鏈黴素、磺乙醯胺、四環素、去氧膽酸鹽、膽酸鈉、牛磺去氧膽酸鈉、草酸鈉、原黃素、結晶紫、吖啶黃、溴乙錠、四苯基鏻、玫瑰紅6G、氯化四苯基鉮、地喹氯銨、苯扎氯銨、道諾黴素、白花丹素或甲基紫精。在一些實施例中，選擇劑為萘啶酮酸。在一些實施例中，選擇劑為去氧膽酸鹽。

在一些態樣中，本揭示案係關於在微生物群體中富集本文所提供之任一經遺傳修飾之微生物之方法，該方法包括使微生物群體在營養物存在下生長，其中在該營養物存在下生長後，該群體中經遺傳修飾之微生物之頻率增加。在一些實施例中，營養物為胺基酸。

在一些態樣中，本揭示案係關於產生無標記DNA之方法，該方法包括 (i) 在適於載體複製之條件下培養本文所提供之任一經遺傳修飾之微生物；及 (ii) 自該微生物中分離該載體以獲得無標記DNA。

在一些態樣中，本揭示案係關於藉由本文所提供之任一方法產生之無標記DNA。在一些實施例中，無標記DNA進一步包含編碼蛋白質之開放閱讀框。在一些實施例中，無標記DNA進一步包含可操作地連接至編碼蛋白質之開放閱讀框之第二啟動子。在一些實施例中，開放閱讀框經密碼子最佳化以在細胞中表現。在一些實施例中，開放閱讀框經密碼子最佳化以在人類細胞中表現。

在一些態樣中，本揭示案係關於無標記DNA，其包含： (i) 複製起點； (ii) 編碼壓制型tRNA之核酸序列；及 (iii) 與SEQ ID NO: 19具有至少90%序列一致性之核酸序列，其中該壓制型tRNA包含與終止密碼子互補之反密碼子。在一些實施例中，複製起點包含少於600、少於500、少於400或少於350個核苷酸。在一些實施例中，複製起點為R6Kγ複製起點。在一些實施例中，終止密碼子包含核酸序列TAG或UAG。在一些實施例中，終止密碼子包含核酸序列TAA或UAA。在一些實施例中，終止密碼子包含核酸序列TGA或UGA。在一些實施例中，壓制型tRNA為組胺酸tRNA。

在一些實施例中，無標記DNA進一步包含編碼蛋白質之開放閱讀框。在一些實施例中，無標記DNA進一步包含可操作地連接至編碼蛋白質之開放閱讀框之啟動子。在一些實施例中，開放閱讀框經密碼子最佳化以在細胞中表現。在一些實施例中，開放閱讀框經密碼子最佳化以在人類細胞中表現。在一些實施例中，無標記DNA編碼mRNA。

在一些態樣中，本揭示案係關於包含本文所提供之任一無標記DNA之組合物，其調配於脂質奈米粒子中。在一些實施例中，脂質奈米粒子包含可電離脂質、中性脂質、固醇及聚乙二醇(PEG)修飾之脂質。在一些實施例中，脂質奈米粒子包含：40 mol%-55 mol%之可電離胺基脂質；5 mol%-15 mol%之非陽離子脂質；35 mol%-45 mol%之固醇；及1 mol%-5 mol%之PEG修飾之脂質。

在一些態樣中，本揭示案係關於包含本文所提供之任一無標記DNA或組合物之醫藥組合物。在一些實施例中，醫藥組合物進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑。

在一些態樣中，本揭示案係關於一種方法，其包括向有需要之個體投與本文所提供之無標記DNA、組合物或醫藥組合物中之任一者。

在一些態樣中，本揭示案係關於向有需要之個體中的特定細胞類型中遞送無標記DNA之方法，該方法包括向有需要之個體投與本文所提供之無標記DNA、組合物或醫藥組合物中之任一者。

在一些態樣中，本揭示案係關於治療有需要之個體之疾病或疾患的方法，該方法包括向有需要之個體投與本文所提供之無標記DNA、組合物或醫藥組合物中之任一者。

在一些實施例中，個體為哺乳動物。在一些實施例中，個體為人類。

相關申請案

本申請案根據35 U.S.C. § 119(e)主張2021年10月18日提出申請之美國臨時申請案第63/257,054號及2022年5月27日提出申請之美國臨時申請案第63/346,414號之較早申請日期之權益，該等臨時申請案之內容係以全文引用的方式併入本文中。 無義突變及壓制型 tRNA

本揭示案之一些態樣係關於經遺傳修飾之微生物，其中基因體在編碼外排性幫浦或輸入蛋白之基因中包含無義突變。如本文所用之「編碼蛋白質之基因」係指包含編碼序列或開放閱讀框之核酸序列，其在該基因表現時產生蛋白質。核酸序列可為DNA序列，在該情形下，當RNA聚合酶使用該DNA序列轉錄以轉錄出包含與該DNA序列互補之RNA序列之RNA分子，且該RNA序列之轉譯產生具有蛋白質胺基酸序列之多肽時，產生蛋白質。核酸序列可為RNA序列，在該情形下，該RNA序列之轉譯產生具有蛋白質胺基酸序列之多肽。基因中之無義突變係指在該基因之編碼序列的起始與終止密碼子之間引入框內終止密碼子之突變。基因之編碼序列通常以起始密碼子開始，諸如DNA序列中之ATG (RNA序列中之AUG)，且以終止密碼子結束，諸如DNA序列中之TAG、TAA或TGA (RNA序列中之UAG、UAA或UGA)，其中起始密碼子之G與終止密碼子之T或U之間的鹼基數為3的倍數(例如3、6、9)。若起始密碼子之G與所引入終止密碼子之T或U之間的鹼基數為3的倍數，則認為該所引入終止密碼子位於框內。

基因之表現始於轉錄，其中RNA聚合酶將DNA模板轉錄成RNA分子，其可轉譯成多肽或蛋白質，或在轉譯前藉由一或多個加工步驟(諸如加帽、多聚腺苷酸化及/或剪接)進行修飾。可轉譯之RNA分子稱為信使RNA或mRNA。DNA或RNA序列經由密碼子編碼基因。密碼子係指核酸(諸如DNA或RNA)序列內之一組三個核苷酸。反密碼子係指核酸(諸如轉移RNA (tRNA))內之一組三個核苷酸，其與密碼子互補，使得第一核酸之密碼子與第二核酸之反密碼子經由該密碼子與該反密碼子之鹼基間的氫鍵結締合。舉例而言，mRNA上之密碼子5’-AUG-3’在tRNA上具有相應之反密碼子3’-UAC-5’。在轉譯期間，具有與待轉譯密碼子互補的反密碼子之tRNA與mRNA上之密碼子締合，通常以遞送與待轉譯密碼子對應之胺基酸，或以促進轉譯終止並自核糖體釋放經轉譯之多肽。

轉譯係使用RNA編碼序列指導多肽產生之過程。轉譯之第一步為起始，其中核糖體與mRNA締合，且攜帶第一胺基酸之第一轉移RNA (tRNA)與第一密碼子或起始密碼子締合。轉譯之下一階段為延伸，其涉及三個步驟。首先，第二tRNA與mRNA締合，該第二tRNA具有與起始密碼子後之密碼子(或第二密碼子)互補的反密碼子且攜帶第二胺基酸。其次，第一胺基酸之末端非側鏈羧酸部分之碳原子與所攜帶之第二胺基酸之末端非側鏈胺基部分之氮反應，從而在該兩個胺基酸之間形成肽鍵，其中第二胺基酸與第二tRNA結合，且第一胺基酸與第二胺基酸結合，但不與第一tRNA結合。第三，第一tRNA自mRNA解離，且核糖體沿著mRNA前進，使得第一tRNA與核糖體締合之位置現在被第二tRNA佔據，且先前被第二tRNA佔據之位置現在空置，用於攜帶另一胺基酸之另一tRNA與mRNA締合。該三個步驟1)締合攜帶胺基酸之tRNA，2)形成肽鍵，其將另一胺基酸添加至生長中之多肽上，及3)核糖體沿著mRNA前進，持續直至核糖體到達終止密碼子，此導致轉譯終止。通常，與終止密碼子締合之tRNA不攜帶胺基酸，因此，不攜帶胺基酸之tRNA在延伸步驟期間之締合導致多肽與攜帶該多肽中最後一個胺基酸之tRNA之間的鍵斷裂，使得該多肽自核糖體釋放。

已引入框內終止密碼子之基因之轉譯較該基因之未突變形式之轉譯更早終止，此導致形成更短之多肽。相對於由基因之未突變形式編碼之多肽，此更短之多肽可能具有受損之功能或無功能。

壓制型tRNA係指藉由阻止所引入之終止密碼子終止轉譯而壓制無義突變之效應的tRNA，諸如本文所闡述之彼等tRNA。由於與終止密碼子締合之tRNA不攜帶胺基酸，故轉譯在該終止密碼子處終止，此導致多肽自核糖體釋放。然而，若與所引入之終止密碼子締合之tRNA攜帶胺基酸，則延伸可繼續進行，且引入將導致該tRNA所攜帶之胺基酸併入至多肽中，而非終止。若所引入之終止密碼子所具有之序列與位於基因未經修飾形式之編碼序列末端之終止密碼子不同，則儘管已引入終止密碼子，但細胞中壓制型tRNA之存在將容許延伸繼續進行，而不影響終止，此乃因mRNA仍將由不攜帶胺基酸之不同tRNA結合。

遺傳密碼、或密碼子及其相應tRNA或胺基酸之集合含有三種習用終止密碼子：琥珀型、赭石型及乳白型(或者「棕土型」)。在本文所提供之無義突變之一些實施例中，所引入之終止密碼子為琥珀型終止密碼子。琥珀型終止密碼子包含DNA序列TAG或RNA序列UAG。在一些實施例中，壓制型tRNA為琥珀壓制型tRNA。琥珀壓制型tRNA包含反密碼子AUC。在一些實施例中，終止密碼子為赭石型終止密碼子。赭石型終止密碼子包含DNA序列TAA或RNA序列UAA。在一些實施例中，壓制型tRNA為赭石壓制型tRNA。乳白型壓制子包含反密碼子AUU。在一些實施例中，終止密碼子為乳白型或棕土型終止密碼子。乳白型或棕土型終止密碼子包含DNA序列TGA或RNA序列UGA。在一些實施例中，壓制型tRNA為乳白壓制型tRNA或棕土壓制型tRNA。乳白及琥珀壓制型tRNA包含反密碼子ACU。

可在起始密碼子下游之任何框內位置處(亦即與起始密碼子相隔0、3、6、9個或任何3的倍數個核苷酸)將第一終止密碼子引入至基因之開放閱讀框中。轉譯起始於起始密碼子且一直進行至到達終止密碼子，此時轉譯終止。在更靠近起始密碼子處引入終止密碼子導致轉譯出更短之蛋白質片段。較長之蛋白質片段可保留一些功能性或定位序列，該等定位序列使得所轉譯之片段保留在細胞中，或在外排性幫浦或輸入蛋白之情形下輸出至外膜。因此，在更靠近開放閱讀框之起始密碼子處引入第一終止密碼子降低所轉譯之蛋白質片段干擾細胞中之其他生物學過程之可能性，同時仍容許壓制型tRNA促進全長蛋白質之轉譯。在一些實施例中，第一終止密碼子位於編碼外排性幫浦或輸入蛋白之基因中之開放閱讀框的前400、前300、前250、前200、前150、前100、前90、前80、前70、前60、前50、前40、前30、前20、前10或前5個密碼子中。在一些實施例中，第一終止密碼子位於編碼外排性幫浦或輸入蛋白之基因中之開放閱讀框的前100個密碼子中。在一些實施例中，第一終止密碼子位於編碼外排性幫浦或輸入蛋白之基因中之開放閱讀框的前50個密碼子中。在一些實施例中，第一終止密碼子位於編碼外排性幫浦或輸入蛋白之基因中之開放閱讀框的前25個密碼子中。在一些實施例中，第一終止密碼子位於編碼外排性幫浦或輸入蛋白之基因中之開放閱讀框的前10個密碼子中。在一些實施例中，第一終止密碼子位於編碼外排性幫浦或輸入蛋白之基因中之開放閱讀框的前5個密碼子中。

在一些實施例中，壓制型tRNA為組胺酸tRNA。組胺酸tRNA係攜帶胺基酸組胺酸之tRNA。tRNA基於其RNA序列由細胞酶(如合成酶)裝載胺基酸，使得特定序列之tRNA特異性地裝載特定胺基酸。裝載係指胺基酸共價鍵結至tRNA，從而形成胺醯基-tRNA或攜帶胺基酸之tRNA之過程。基於壓制型tRNA由諸如合成酶等細胞酶裝載某些胺基酸之相對能力，包含相同反密碼子但不同RNA序列之不同壓制型tRNA可因此攜帶不同的胺基酸。SEQ ID NO: 13給出代表性組胺酸壓制型tRNA序列。在一些實施例中，壓制型tRNA為琥珀壓制型tRNA。在一些實施例中，琥珀壓制型tRNA包含SEQ ID NO: 13之核酸序列。在一些實施例中，壓制型tRNA為赭石壓制型tRNA。在一些實施例中，壓制型tRNA包含SEQ ID NO: 14之核酸序列。在一些實施例中，壓制型tRNA為乳白壓制型tRNA。在一些實施例中，壓制型tRNA包含SEQ ID NO: 15之核酸序列。 外排性幫浦、輸入蛋白及選擇

本揭示案之一些態樣係關於在編碼外排性幫浦之基因中包含無義突變的經遺傳修飾之微生物。外排性幫浦或外排性轉運蛋白係一種涉及將潛在毒性受質自細胞內部轉移至細胞外環境中之蛋白質。編碼外排性幫浦之基因在微生物基因體中係常見的，其中許多微生物產生多個外排性幫浦。通常，外排性幫浦嵌入在微生物之細胞膜及/或細胞壁中，且藉由將有毒物質自細胞內部輸出來防止該等物質干擾細胞代謝及其他功能。因此，外排性幫浦之作用在一定程度上賦予對許多有毒物質(諸如抗生素)之效應之抗性。相反，外排性幫浦活性降低(諸如經由喪失一或多種外排性幫浦之表現)之微生物可對有毒物質(諸如抗生素)之作用更敏感(例如，參見Webber等人， J Antimicrob Chemother. 2003. 51(1):9-11)。

外排性幫浦通常分類為屬於以下類別中之一或多者：抗性-結節-細胞分裂(RND)、主要易化子(MF)、小多藥抗性(SMR)、ATP結合盒(ABC)或多藥及毒物外排(MATE) (例如，參見Amaral等人， Front Pharmacol. 2013. 4:168)。

RND外排性幫浦作為三結合聯合體之一部分起作用，該三結合聯合體包括內膜中之RND外排性幫浦、位於內膜與外膜之間的周質中之轉接MF外排性幫浦及位於外膜中之外膜蛋白(OMP)。RND外排性幫浦將包括重金屬、疏水性及兩親性化合物在內之眾多種化合物自細胞質輸出至周質空間中。化合物在進入周質空間後由MF外排性幫浦輸出(例如，參見Kumar等人， Int J Mol Sci. 2012. 13(4):4484-4495)。最終，OMP將物質輸出至細胞外環境中。如同RND及MF外排性幫浦，SMR外排性幫浦係由質子驅動力驅動，且因此依賴於細胞膜、細胞壁或外膜之間的pH梯度，而MATE外排性幫浦利用Na ⁺或H ⁺反向轉運機制輸出物質以擠出化合物(例如，參見Delmar等人， Annu Rev Biophys. 2016. 43:97-117)。ABC外排性幫浦使用ATP作為能量來源，以將有毒化合物自細胞中擠出。在ATP水解後，ABC外排性幫浦經歷構形變化，此促進化合物自細胞質向質膜外部擠出。

外排性幫浦之非限制性實例包括由以下基因編碼之彼等外排性幫浦： acrAB 、 acrD、 acrEF、 emrD、 emrE、 emrKY、 mdfA、 tehAB、 tolC、 ybhGFSR、 ybjY、 ybjZ、 yegM、 yegNO、 yhiUV、 yjcP、 ylcB及 yohG。毒性活性可藉由外排性幫浦之活性減輕的物質之非限制性實例包括胺苄青黴素、氯黴素、氟苯尼考、克黴唑、嘌呤黴素、紅黴素、胺甲喋呤、新生黴素、環丙沙星、諾氟沙星、萘啶酮酸、雷發平、梭鏈孢酸、鏈黴素、磺乙醯胺、四環素、去氧膽酸鹽、膽酸鈉、牛磺去氧膽酸鈉、草酸鈉、原黃素、結晶紫、吖啶黃、溴乙錠、四苯基鏻、玫瑰紅6G、氯化四苯基鉮、地喹氯銨、苯扎氯銨、道諾黴素、白花丹素及甲基紫精。

本揭示案之一些態樣係關於經遺傳修飾之微生物，其包含在編碼外排性幫浦之基因中包含無義突變之基因體；及包含編碼壓制型tRNA之核酸序列之載體，該壓制型tRNA具有與由該無義突變所引入之終止密碼子互補之反密碼子。壓制型tRNA之表現容許微生物表現外排性幫浦，而非在不存在壓制型tRNA之情形下將表現之截短形式。因此，基因體包含無義突變且表現壓制型tRNA之經遺傳修飾之微生物能夠在選擇劑存在下生長。選擇劑係抑制微生物之一或多種生物學過程之物質，諸如蛋白質、脂質、碳水化合物、抗生素或小分子。選擇劑可用於選擇性地殺死具有在編碼外排性幫浦之基因中包含無義突變之基因體且不表現壓制型tRNA之微生物或抑制其生長，此乃因該等微生物自細胞內環境中輸出有毒物質之能力較低。

在一些實施例中，經遺傳修飾之微生物能夠在選擇劑存在下生長。若觀察到微生物在含有選擇劑之環境中複製，則認為該微生物能夠在該選擇劑存在下生長。含有選擇劑之環境之非限制性實例包括其中溶解有選擇劑之液體培養基(諸如LB肉湯)或固體瓊脂(諸如LB瓊脂)。確定微生物是否能夠在選擇劑存在下生長之方法為此項技術中所已知。舉例而言，可將相同微生物引入至含有相同液體培養基(例如LB肉湯)之單獨管中，其中每一管含有不同濃度之選擇劑或沒有選擇劑。接著可將管在適於微生物複製之條件(例如37℃)下培育既定時間段(例如12小時)，在該時間段內及/或在培育結束時監測每一管中所存在之微生物之數量。接著可計算每一管中微生物之生長速率及/或微生物之最終群體大小。若微生物在選擇劑存在下生長時之生長速率及/或最終群體大小為該微生物在不存在選擇劑之情形下生長的生長速率之至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%，則認為該微生物能夠在選擇劑存在下生長。

本揭示案之一些態樣係關於在微生物群體中富集本文所提供之經遺傳修飾之微生物之一的方法，其包括使微生物群體暴露於選擇劑，其中在暴露於該選擇劑後，該群體中經遺傳修飾之微生物之頻率增加。經遺傳修飾之微生物之頻率可藉由此項技術中已知之多種方法來測定。舉例而言，可藉由以下來估計群體中存在的經遺傳修飾之微生物之數量：自包含該群體之培養基或組合物中獲得樣品，且在將該樣品引入至含有選擇劑之瓊脂板中使得僅經遺傳修飾之微生物在瓊脂上形成菌落後對菌落形成單位(CFU)數量進行計數。接著，可在將樣品引入至不包含選擇劑之瓊脂板後藉由對菌落形成單位數量進行計數來量化群體中所存在的微生物之總數量。接著可藉由將群體中經遺傳修飾之微生物之數量除以群體中經遺傳修飾之微生物之總數量來計算頻率。確定暴露於選擇劑是否增加群體中經遺傳修飾之微生物之頻率可藉由以下來達成：量測暴露前之頻率，向包含該群體之培養基或組合物中引入該選擇劑，使該群體與該選擇劑一起培育既定時間段，且量測暴露或培育後之頻率。

在一些實施例中，選擇劑為胺苄青黴素、氯黴素、氟苯尼考、克黴唑、嘌呤黴素、紅黴素、胺甲喋呤、新生黴素、環丙沙星、諾氟沙星、萘啶酮酸、雷發平、梭鏈孢酸、鏈黴素、磺乙醯胺、四環素、去氧膽酸鹽、膽酸鈉、牛磺去氧膽酸鈉、草酸鈉、原黃素、結晶紫、吖啶黃、溴乙錠、四苯基鏻、玫瑰紅6G、氯化四苯基鉮、地喹氯銨、苯扎氯銨、道諾黴素、白花丹素或甲基紫精。在一些實施例中，選擇劑為萘啶酮酸。萘啶酮酸係具有強效抗微生物活性之喹啉酮化合物。喹啉酮(諸如萘啶酮酸)結合至DNA迴旋酶-DNA複合物，此抑制DNA複製，且藉此阻止細菌複製。另外，喹啉酮可抑制大腸桿菌拓撲異構酶之活性(例如，參見Hooper. Drugs. 1995. 49增刊2:10-15)。在一些實施例中，選擇劑為去氧膽酸鹽。

本揭示案之一些態樣係關於在編碼輸入蛋白之基因中包含無義突變的經遺傳修飾之微生物。輸入蛋白係涉及將諸如脂質、碳水化合物、胺基酸及/或肽等分子自細胞外環境轉移至細菌細胞之周質或細胞質中之蛋白質。舉例而言，胞壁質肽通透酶A (MppA)係一種周質結合蛋白，其對於肽L-丙胺醯基-γ-D-麩胺醯基-內消旋二胺基庚二酸鹽之輸入必不可少，且寡肽通透酶(Opp)參與小肽之輸入。若細菌為無法合成必需營養物(諸如脯胺酸)之營養缺陷型，則OppBCDF或MppA輸入蛋白容許細菌自細胞外環境中輸入營養物。例如，參見Park等人， J Bacteriol. 1998. 180(5):1215-1223。

阻止輸入蛋白之功能形式轉譯之無義突變可阻止細菌自環境中輸入營養物。不能自環境中輸入營養物給細菌帶來適應成本。若營養物係必需的，且細菌為無法自身合成營養物之營養缺陷型，則此一無義突變係致死的。然而，使用壓制型tRNA來壓制無義突變之效應容許細菌產生功能性輸入蛋白且輸入所需要之營養物。因此，向在輸入蛋白中具有無義突變之營養缺陷型細菌提供編碼壓制型tRNA之載體，且在必須輸入之營養物存在下培養該等細菌容許正向選擇含有該載體之細菌。輸入蛋白之非限制性實例包括 mppA及 oppBCDF。

在一些實施例中，經遺傳修飾之微生物係不能合成營養物之營養缺陷型。若觀察到微生物在含有營養物之環境中複製，但在不含該營養物之環境中不複製，則認為該微生物不能合成該營養物，且關於該營養物為營養缺陷型。營養物之非限制性實例包括胺基酸、單醣及脂質。確定微生物是否能夠在營養物存在或不存在下生長之方法為此項技術中所已知。舉例而言，可將相同微生物引入至含有相同的成分確定培養基之單獨管中，該成分確定培養基中個別化合物之確切濃度係已知的，其中向一個管中添加營養物，且一個管不含營養物。接著可將管在適於微生物複製之條件(例如37℃)下培育既定時間段(例如12小時)，在該時間段內及/或在培育結束時監測每一管中所存在之微生物之數量。接著可計算每一管中微生物之生長速率及/或微生物之最終群體大小。若微生物在營養物存在下生長時之生長速率及/或最終群體大小較微生物在不存在該營養物之情形下生長之生長速率及/或最終群體大小高至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少100%，則微生物關於該營養物為營養缺陷型。

本揭示案之一些態樣係關於在微生物群體中富集本文所提供之經遺傳修飾之微生物之一的方法，其包括使微生物群體在營養物存在下生長，其中在該營養物存在下生長後，該群體中經遺傳修飾之微生物之頻率增加。經遺傳修飾之微生物之頻率可藉由此項技術中已知之多種方法來測定。舉例而言，可藉由以下來估計群體中存在的經遺傳修飾之微生物之數量：自包含該群體之培養基或組合物中獲得樣品，且在將該樣品引入至含有營養物之瓊脂板中使得僅經遺傳修飾之微生物在瓊脂上形成菌落後對菌落形成單位(CFU)數量進行計數。由於缺少載體之細菌無法輸入營養物，故可改為藉由不依賴於培養之方法來量化樣品中細菌之總數量，諸如對基因體靶標進行qPCR以量測細菌基因體之數量。接著可藉由將群體中經遺傳修飾之微生物之數量除以細菌基因體之總數量來計算頻率。確定在營養物中生長是否增加群體中經遺傳修飾之微生物之頻率可藉由以下來達成：量測生長前之頻率，向包含該群體之成分確定培養基或組合物中引入該營養物，使該群體與該營養物一起培育既定時間段，且量測暴露或培育後之頻率。

本揭示案之一些態樣係關於產生無標記DNA之方法，該方法包括在適於載體複製之條件下培養本文所提供之任一經遺傳修飾之微生物；及自該微生物中分離載體以獲得無標記DNA。可藉由本文所提供之任一方法，使用正向選擇以有利於含有載體之微生物之複製來培養微生物。一旦微生物達到適宜群體大小(諸如微生物在培養環境中之承載容量)，則使微生物細胞溶解以將載體釋放至細胞外空間中，且自細胞碎片中純化載體。自微生物中分離載體之方法為此項技術中所已知。通常，藉由暴露於鹼性環境或加熱使細菌細胞溶解，藉由離心及/或過濾自上清液中分離細胞碎片，且藉由鹽沈澱或基於管柱之方法純化載體DNA。 R6K 複製起點及 pir

在一些實施例中，壓制型tRNA係由載體(諸如質體)編碼。質體係一種環狀DNA多核苷酸，其能夠獨立於細胞之染色體而複製。DNA多核苷酸之複製起點(ori)係指DNA多核苷酸在此起始複製之DNA序列。質體之複製起點影響該質體在細菌細胞或含有該質體之其他細胞中之拷貝數。質體之拷貝數係指每個細胞中之質體分子數。具有pUC複製起點之質體之拷貝數為約500-700個拷貝/細胞，而具有R6Kγ複製起點之質體之拷貝數為約15-20個拷貝/細胞。

在一些實施例中，本文所提供之經遺傳修飾之微生物之基因體包含編碼π (Pi)蛋白之核酸序列。π蛋白由基因 pir編碼，其為複製起點源自R6K複製子之質體之複製所必需(例如，參見Rakowski等人， Plasmid. 2013. 69(3):231-242)。SEQ ID NO: 9給出編碼 pir基因之代表性核苷酸序列，且SEQ ID NO: 10給出π (Pi)蛋白之代表性胺基酸序列。在一些實施例中，微生物之基因體包含可操作地連接至編碼 pir基因或Pi蛋白之核酸序列之啟動子。若啟動子控制基因之表現程度，則認為該啟動子可操作地連接至該基因。在一些實施例中，啟動子可調控與其可操作地連接之開放閱讀框之條件性表現，使得所編碼之蛋白質在某些期望條件下(諸如在特定環境信號之存在或不存在下)或在某一細胞類型中選擇性地產生。啟動子之非限制性實例包括Kan啟動子、LacIq啟動子、trc啟動子、Lpp啟動子及J23107啟動子。在一些實施例中，啟動子選自由以下組成之群：Kan、LacIq、trc、Lpp及J23107啟動子。在一些實施例中，啟動子包含與SEQ ID NO: 3-7中之任一者具有至少90%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，啟動子為Kan啟動子。在一些實施例中，Kan啟動子包含與SEQ ID NO: 4之核酸序列具有至少90%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，啟動子為LacIq啟動子。在一些實施例中，LacIq啟動子包含與SEQ ID NO: 5之核酸序列具有至少90%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，啟動子為trc啟動子。在一些實施例中，trc啟動子包含與SEQ ID NO:6之核酸序列具有至少90%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，啟動子為Lpp啟動子。在一些實施例中，Lpp啟動子包含與SEQ ID NO: 7之核酸序列具有至少90%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，啟動子為J23107啟動子。在一些實施例中，J23107啟動子包含與SEQ ID NO: 3之核酸序列具有至少90%序列一致性之核酸序列。

R6K複製子包含三個不同的複製起點：R6Kα、R6Kβ及R6Kγ。SEQ ID NO: 16 (R6Kα)、17 (R6Kβ)及18 (R6Kγ)給出R6Kα、R6Kβ及R6Kγ複製起點之代表性核苷酸序列。π蛋白結合至R6Kα、R6Kβ及R6Kγ複製起點中之每一者且在其上起始複製，但若質體含有該三個複製起點中之任一者，其亦可複製。

在一些實施例中，載體包含少於1,000、少於900、少於800、少於700、少於600或少於500個核苷酸。在一些實施例中，載體之複製起點包含少於600、少於500、少於400或少於350個核苷酸。最小的R6K源性複製起點為R6Kγ，其包含382 bp。因此，用R6Kγ複製起點取代質體之複製起點往往減小質體之大小。較小質體之複製快於較大質體，且包含更少之CpG模體。CpG模體係DNA分子中之二核苷酸序列，其包含胞嘧啶，之後為鳥嘌呤，其中磷酸酯部分鍵結至胞嘧啶之3’碳及鳥嘌呤之5’碳。類鐸受體(TLR) (諸如類鐸受體9 (TLR9))結合至DNA上之CpG模體，且在受體與CpG模體結合後起始發炎反應。因此，具有較少CpG模體之載體或質體當存在於個體(諸如人類個體)中時誘發此一發炎反應之可能性較低，或誘發較少之發炎。 編碼蛋白質及壓制型 tRNA 之載體

在一些實施例中，本文所提供之載體及無標記DNA包含編碼蛋白質之開放閱讀框。如本文所用，「無標記DNA」係指不編碼抗生素抗性標記物之DNA。開放閱讀框係以起始密碼子(例如甲硫胺酸(ATG))開始且以終止密碼子(例如TAA、TAG或TGA)結束並編碼多肽之鄰接DNA區段。若在開放閱讀框之DNA序列轉錄後，所得RNA可轉譯成多肽，則認為該開放閱讀框編碼該多肽。開放閱讀框可包含當由RNA聚合酶轉錄時可轉譯成多肽之DNA序列。或者，開放閱讀框可包含一或多個內含子，使得當該開放閱讀框經轉錄以產生RNA時，該RNA必須經剪接，之後其才可轉譯成多肽。在一些實施例中，載體或無標記DNA編碼mRNA。

可將本揭示案之核酸(例如載體及無標記DNA)調配於適當載劑或遞送媒劑(例如脂質奈米粒子)中，使得該等核酸(例如無標記DNA)適於在活體內使用。當經適當調配時，核酸(例如無標記DNA)能夠被遞送至個體(例如人類個體)體內之細胞及/或組織，以實現由該等核酸編碼之蛋白質之轉譯。如本文所用，術語「核酸」係指多個核苷酸(亦即，包含與磷酸酯基及可交換之有機鹼基連接之糖(例如核糖或去氧核糖)的分子，該有機鹼基為經取代之嘧啶(例如胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))或經取代之嘌呤(例如腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G)))。如本文所用，術語核酸係指多核糖核苷酸以及多去氧核糖核苷酸。術語核酸亦應包括多核苷(亦即多核苷酸減去磷酸酯)及任何其他含有有機鹼基之聚合物。核酸之非限制性實例包括染色體、基因體基因座、編碼多核苷酸或多肽之基因或基因區段、基因之編碼序列、非編碼序列(例如內含子、5'-UTR或3'-UTR)、初級mRNA、前mRNA、cDNA、mRNA等。核酸可包括取代及/或修飾。在一些實施例中，取代及/或修飾位於一或多個鹼基及/或糖中。舉例而言，在一些實施例中，核酸包括具有共價連接至低分子量有機基團之主鏈糖之核酸，該等低分子量有機基團不為2'位之羥基且不為5'位之磷酸酯基或羥基。因此，在一些實施例中，經取代或經修飾之核酸包括2'-O-烷基化核糖基團。在一些實施例中，經修飾之核酸包括糖，諸如己糖、2'-氟己糖、2'-胺基核糖、受約束乙基(cEt)、鎖核酸(LNA)、阿拉伯糖或2'-氟阿拉伯糖，而不為核糖。因此，在一些實施例中，核酸之主鏈組成為異質的，藉此含有連接在一起的聚合物單元之任何可能的組合，諸如肽-核酸(其具有帶核酸鹼基之胺基酸主鏈)。

核酸序列包括已自其天然環境中移除之核酸序列、重組或選殖DNA分離物以及化學合成類似物或藉由異源系統生物合成之類似物。

「經工程改造之核酸」係在自然界中不存在之核酸。然而，應理解，雖然經工程改造之核酸整體並非天然的，但其可包括自然界中存在之核苷酸序列。在一些實施例中，經工程改造之核酸包含來自不同生物體(例如來自不同物種)之核苷酸序列。舉例而言，在一些實施例中，經工程改造之核酸包括細菌核苷酸序列、人類核苷酸序列及/或病毒核苷酸序列。經工程改造之核酸包括重組核酸及合成核酸。「重組核酸」係藉由將核酸(例如經分離之核酸、合成核酸或其組合)接合而構築之分子，且在一些實施例中，可在活細胞中複製。「合成核酸」係經擴增或化學合成或藉由其他方式合成之分子。合成核酸包括經化學修飾或以其他方式經修飾、但可與天然核酸分子鹼基配對之彼等核酸。重組及合成核酸亦包括由前述任一者複製產生之彼等分子。核酸可包含天然核苷酸及/或非天然核苷酸，諸如經修飾之核苷酸。

當應用於核酸序列時，術語「經分離」表示多核苷酸序列已自其天然遺傳環境中移除，且因此不含其他外來或不需要之編碼序列(但可包括天然5'及3'非轉譯區，諸如啟動子及終止子)，且呈適用於經遺傳工程改造之蛋白質產生系統之形式。此等經分離分子係與其天然環境分離之彼等分子。

核酸載體或無標記DNA可包括插入序列，其可為表現盒或開放閱讀框(ORF)。「開放閱讀框」係以起始密碼子(例如甲硫胺酸(ATG))開始且以終止密碼子(例如TAA、TAG或TGA)結束並編碼蛋白質或肽(例如治療性蛋白質或治療性肽)之鄰接DNA區段。在一些實施例中，表現盒編碼至少包括以下元件之RNA (例如mRNA)：5'非轉譯區、編碼mRNA之開放閱讀框區、3'非轉譯區及聚A尾。開放閱讀框可編碼任何mRNA序列，或其一部分。

在一些實施例中，核酸載體或無標記DNA編碼包含5'非轉譯區(UTR)之mRNA。「5'非轉譯區(UTR)」係指位於起始密碼子(亦即由核糖體轉譯之mRNA轉錄本之第一個密碼子)正上游(亦即5')且不編碼蛋白質或肽之mRNA區域。

在一些實施例中，核酸載體或無標記DNA編碼包含3'非轉譯區(UTR)之mRNA。「3'非轉譯區(UTR)」係指位於終止密碼子(亦即mRNA轉錄本中發出終止轉譯信號之密碼子)正下游(亦即3')且不編碼蛋白質或肽之mRNA區域。

術語5'及3'在本文中用於描述與遺傳元件之位置及/或事件方向(5'至3')相關之核酸序列之特徵，諸如藉由RNA聚合酶之轉錄或藉由核糖體之轉譯，其係以5'至3'方向進行。同義詞為上游(5')及下游(3')。按慣例，DNA序列、基因圖譜、載體卡及RNA序列自左至右以5'至3'繪製，或用箭頭指示5'至3'方向，其中箭頭指向3'方向。因此，當遵循此慣例時，5' (上游)指示定位於左手側之遺傳元件，且3' (下游)指示定位於右手側之遺傳元件。

核酸(例如DNA或mRNA)通常包含複數個核苷酸。核苷酸包括含氮鹼基、五碳糖(核糖或去氧核糖)及至少一個磷酸酯基團。核苷酸包括核苷單磷酸、核苷二磷酸及核苷三磷酸。核苷單磷酸(NMP)包括與核糖及單個磷酸酯連接之核鹼基；核苷二磷酸(NDP)包括與核糖及兩個磷酸酯連接之核鹼基；且核苷三磷酸(NTP)包括與核糖及三個磷酸酯連接之核鹼基。核苷酸類似物係具有核苷酸之一般結構或在結構上與核苷酸類似之化合物。舉例而言，核苷酸類似物包括核苷酸的核鹼基之類似物、糖之類似物及/或磷酸酯基之類似物。

核苷包括含氮鹼基及5-碳糖。因此，核苷加上磷酸酯基產生核苷酸。核苷類似物係具有核苷之一般結構或在結構上與核苷類似之化合物。舉例而言，核苷類似物包括核苷的核鹼基之類似物及/或糖之類似物。

應理解，除非另有指示，否則術語「核苷酸」包括天然核苷酸、合成核苷酸及經修飾之核苷酸。如本文所提供之用於產生RNA (例如在IVT反應中)之天然核苷酸之實例包括腺苷三磷酸(ATP)、鳥苷三磷酸(GTP)、胞苷三磷酸(CTP)、尿苷三磷酸(UTP)及5-甲基尿苷三磷酸(m5UTP)。在一些實施例中，使用腺苷二磷酸(ADP)、鳥苷二磷酸(GDP)、胞苷二磷酸(CDP)及/或尿苷二磷酸(UDP)。

核苷酸類似物之實例包括(但不限於)抗病毒核苷酸類似物、磷酸酯類似物(可溶性或固定化的、可水解或不可水解的)、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸(例如帽類似物)或用於酶促加帽之前體/受質(牛痘或連接酶)、經官能基標記以有助於帽或5'部分之連接/結合之核苷酸(IRES)、經5' PO4標記以有助於帽或5'部分之連接之核苷酸或經可化學或酶促裂解之官能基/保護基團標記之核苷酸。抗病毒核苷酸/核苷類似物之實例包括但不限於更昔洛韋(Ganciclovir)、恩替卡韋(Entecavir)、替比夫定(Telbivudine)、阿糖腺苷及西多福韋(Cidofovir)。經修飾之核苷酸可包括經修飾之核鹼基。舉例而言，RNA轉錄本(例如mRNA轉錄本)可包括選自以下之經修飾之核鹼基：假尿苷(ψ)、1-甲基假尿苷(m1ψ)、1-乙基假尿苷、2-硫尿苷、4'-硫尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-5-氮雜-尿苷、2-硫基-二氫假尿苷、2-硫基-二氫尿苷、2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、4-硫基-假尿苷、5-氮雜-尿苷、二氫假尿苷、5-甲基尿苷、5-甲氧基尿苷(mo5U)及2’-O-甲基尿苷。在一些實施例中，RNA轉錄本(例如mRNA轉錄本)、載體或無標記DNA包括前述經修飾之核鹼基中至少兩者(例如2者、3者、4者或更多者)之組合。

一些實施例包含具有至少約0.25 mg/mL核酸(例如DNA)、諸如0.5 mg/mL、0.75 mg/mL、1 mg/mL、1.25 mg/mL、1.5 mg/mL或2 mg/mL核酸之組合物。

在一些實施例中，載體或無標記DNA包含可操作地連接至編碼蛋白質之開放閱讀框之啟動子。若啟動子控制基因之表現程度，則認為該啟動子可操作地連接至該基因。在一些實施例中，啟動子可調控與其可操作地連接之開放閱讀框之條件性表現，使得所編碼之蛋白質在某些期望條件下(諸如在特定環境信號之存在或不存在下)或在某一細胞類型中選擇性地產生。啟動子之非限制性實例包括Kan啟動子、LacIq啟動子、trc啟動子、Lpp啟動子及J23107啟動子。在一些實施例中，啟動子選自由以下組成之群：Kan、LacIq、trc、Lpp及J23107啟動子。在一些實施例中，啟動子包含與SEQ ID NO: 3-7中之任一者具有至少90%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，啟動子為Kan啟動子。在一些實施例中，Kan啟動子包含與SEQ ID NO: 4之核酸序列具有至少90%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，啟動子為LacIq啟動子。在一些實施例中，LacIq啟動子包含與SEQ ID NO: 5之核酸序列具有至少90%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，啟動子為trc啟動子。在一些實施例中，trc啟動子包含與SEQ ID NO: 6之核酸序列具有至少90%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，啟動子為Lpp啟動子。在一些實施例中，Lpp啟動子包含與SEQ ID NO: 7之核酸序列具有至少90%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，啟動子為J23107啟動子。在一些實施例中，J23107啟動子包含與SEQ ID NO: 3之核酸序列具有至少90%序列一致性之核酸序列。

在一些實施例中，編碼蛋白質之開放閱讀框經密碼子最佳化以在細胞中表現。在一些實施例中，編碼蛋白質之開放閱讀框經密碼子最佳化以在細菌細胞中表現。在一些實施例中，開放閱讀框經密碼子最佳化以在人類細胞中表現。密碼子最佳化方法為此項技術中所已知。舉例而言，本文所提供序列中之任一或多者之ORF可經密碼子最佳化。在一些實施例中，密碼子最佳化可用於匹配目標及宿主生物體中之密碼子頻率以確保正確摺疊；偏置GC含量以增加mRNA穩定性或減少二級結構；使可能損害基因構築或表現之串聯重複密碼子或鹼基連串降至最低；定製轉錄及轉譯控制區；插入或去除蛋白質輸送序列；在編碼蛋白質中去除/添加轉譯後修飾位點(例如糖基化位點)；添加、去除或改組蛋白質結構域；插入或缺失限制位點；修飾核糖體結合位點及mRNA降解位點；調整轉譯速率以容許蛋白質之各個結構域正確摺疊；或減少或消除多核苷酸內之問題二級結構。密碼子最佳化工具、演算法及服務為此項技術中所已知，非限制性實例包括來自GeneArt (Life Technologies)、DNA2.0 (Menlo Park CA)及/或專有方法之服務。在一些實施例中，使用最佳化演算法使開放閱讀框(ORF)序列最佳化。

在一些實施例中，本文所提供之載體或無標記DNA包含編碼壓制型tRNA之核酸序列。在一些實施例中，壓制型tRNA為琥珀壓制型tRNA。在一些實施例中，編碼琥珀壓制型tRNA之核酸序列包含SEQ ID NO: 13之核酸序列。在一些實施例中，壓制型tRNA為赭石壓制型tRNA。在一些實施例中，編碼赭石壓制型tRNA之核酸序列包含SEQ ID NO: 14之核酸序列。在一些實施例中，壓制型tRNA為乳白壓制型tRNA。在一些實施例中，編碼乳白壓制型tRNA之核酸序列包含SEQ ID NO: 15之核酸序列。

在一些實施例中，載體或無標記DNA包含可操作地連接至編碼壓制型tRNA之核酸序列之啟動子。在一些實施例中，啟動子選自由以下組成之群：Kan、LacIq、trc、Lpp及J23107啟動子。在一些實施例中，啟動子包含與SEQ ID NO: 3-7中之任一者具有至少90%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，啟動子為Kan啟動子。在一些實施例中，Kan啟動子包含與SEQ ID NO: 4之核酸序列具有至少90%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，啟動子為LacIq啟動子。在一些實施例中，LacIq啟動子包含與SEQ ID NO: 5之核酸序列具有至少90%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，啟動子為trc啟動子。在一些實施例中，trc啟動子包含與SEQ ID NO: 6之核酸序列具有至少90%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，啟動子為Lpp啟動子。在一些實施例中，Lpp啟動子包含與SEQ ID NO: 7之核酸序列具有至少90%序列一致性之核酸序列。在一些實施例中，啟動子為J23107啟動子。在一些實施例中，J23107啟動子包含與SEQ ID NO: 3之核酸序列具有至少90%序列一致性之核酸序列。包含載體或無標記DNA之組合物

本文所提供之載體可調配於包含載體及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥組合物中。本文所提供之無標記DNA可調配於包含無標記DNA及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥組合物中。醫藥學上可接受之賦形劑亦可併入在調配物中，且可為此項技術中已知之任何賦形劑(例如載劑)。非限制性實例包括水、低級醇、高級醇、多元醇、單醣、二醣、多醣、烴油、脂肪及油類、蠟、脂肪酸、聚矽氧油、非離子型表面活性劑、離子型表面活性劑、聚矽氧表面活性劑以及此等賦形劑之水基混合物及乳液基混合物。

醫藥學上可接受之賦形劑為此項技術中所已知(例如，參見Remington, The Science and Practice of Pharmacy (第21版，Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, Pa.)及The National Formulary (American Pharmaceutical Association, Washington, D.C.))，且包括糖(例如乳糖、蔗糖、甘露醇及山梨醇)、澱粉、纖維素製劑、磷酸鈣(例如磷酸二鈣、磷酸三鈣及磷酸氫鈣)、檸檬酸鈉、水、水溶液(例如鹽水、氯化鈉注射液、林格氏注射液(Ringer's injection)、右旋糖注射液、右旋糖及氯化鈉注射液、乳酸林格氏注射液)、醇類(例如乙醇、丙醇及苯甲醇)、多元醇(例如甘油、丙二醇及聚乙二醇)、有機酯(例如油酸乙酯及甘油三酯)、生物可降解聚合物(例如聚乳酸-聚乙交酯、聚(原酸酯)及聚(酸酐))、彈性基質、脂質體、微球體、油類(例如玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油、芝麻油、棉籽油及花生油)、可可脂、蠟(例如栓劑蠟)、石蠟、聚矽氧、滑石及矽酸鹽(silicylate)。用於醫藥組合物中之每一醫藥學上可接受之賦形劑在與調配物中之其他成分相容之意義上必須為「可接受」的，且不損害個體。適於所選劑型及預期投與途徑之賦形劑為此項技術中所熟知，且可使用此項技術中之一般技術來確定用於選定劑型及投與方法之可接受之稀釋劑或載劑。

除傳統賦形劑(諸如任何及所有溶劑、分散介質、稀釋劑或其他液體媒劑、分散或懸浮助劑、表面活性劑、等滲劑、增稠劑或乳化劑、防腐劑)以外，賦形劑亦可包括(但不限於)類脂質、脂質體、脂質奈米粒子、聚合物、脂質複合物(lipoplex)、核心-殼體奈米粒子、肽、蛋白質、經DNA或RNA轉染之細胞(例如用於移植至個體中)、玻尿酸酶、奈米粒子模擬物及其組合。

本文所提供之載體及無標記DNA之投與途徑包括(例如)靜脈內、肌內、腹膜內、皮下或鼻內。因此，在一些實施例中，包含載體或無標記DNA之組合物可經調配以用於靜脈內、肌內、腹膜內、皮下或鼻內遞送。治療方法

本揭示案之一些態樣係關於包括向有需要之個體投與本文所提供之載體、無標記DNA或醫藥組合物之方法。有效量亦可稱為治療有效量，其係指在個體中達成期望臨床結果(例如蛋白質表現)之量(例如劑量)。有效量至少部分地基於靶組織、靶細胞類型、投與方式、抑制劑之物理特性、組合物之其他組分及其他決定性因素，諸如個體之年齡、體重、身高、性別及一般健康狀況。

本揭示案之一些態樣係關於治療個體之疾病或疾患之方法。在一些實施例中，個體患有疾病或疾患或處於患有疾病或疾患之風險下。

個體可為哺乳動物，諸如人類、非人類靈長類動物(例如恆河猴(Rhesus monkey)、黑猩猩)或齧齒類動物(例如小鼠或大鼠)。在一些實施例中，個體為人類個體。

在本文所提供之方法之一些實施例中，經由注射或輸注投與載體或無標記DNA。注射投與係一種經由器具將載體或無標記DNA遞送給個體之過程。注射可將組合物遞送至肌肉(肌內)、遞送至腹腔中(腹膜內)或皮膚下方(皮下)。輸注投與係在一定時間段內以受控方式(諸如藉由針或導管)將載體或無標記DNA遞送給個體之過程。輸注可將組合物直接遞送至血流中(靜脈內)或皮膚下方(皮下)。 脂質組合物

在一些實施例中，將核酸調配為脂質組合物，諸如包含脂質奈米粒子、脂質體及/或脂質複合物之組合物。在一些實施例中，將核酸調配為脂質奈米粒子(LNP)組合物。脂質奈米粒子通常包含胺基脂質、非陽離子脂質、結構脂質及PEG脂質組分以及所關注之核酸貨物。脂質奈米粒子可使用此項技術中眾所周知之組分、組合物及方法來生成，例如參見PCT/US2016/052352；PCT/US2016/068300；PCT/US2017/037551；PCT/US2015/027400；PCT/US2016/047406；PCT/US2016000129；PCT/US2016/014280；PCT/US2017/038426；PCT/US2014/027077；PCT/US2014/055394；PCT/US2016/052117；PCT/US2012/069610；PCT/US2017/027492；PCT/US2016/059575；PCT/US2016/069491；PCT/US2016/069493；及PCT/US2014/066242，所有該等專利均係以全文引用的方式併入本文中。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含至少一種可電離胺基脂質、至少一種非陽離子脂質、至少一種固醇及/或至少一種聚乙二醇(PEG)修飾之脂質。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含莫耳比為20%-60%之可電離胺基脂質、5%-25%之非陽離子脂質、25%-55%之結構脂質及0.5%-15%之PEG修飾之脂質。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含莫耳比為20%-60%之可電離胺基脂質、5%-30%之非陽離子脂質、10%-55%之結構脂質及0.5%-15%之PEG修飾之脂質。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含40 mol%-50 mol%之可電離脂質，視情況45 mol%-50 mol%，例如45 mol%-46 mol%、46 mol%-47 mol%、47 mol%-48 mol%、48 mol%-49 mol%或49 mol%-50 mol%，例如約45 mol%、45.5 mol%、46 mol%、46.5 mol%、47 mol%、47.5 mol%、48 mol%、48.5 mol%、49 mol%或49.5 mol%。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含20 mol%-60 mol%之可電離胺基脂質。舉例而言，脂質奈米粒子可包含20 mol%-50 mol%、20 mol%-40 mol%、20 mol%-30 mol%、30 mol%-60 mol%、30 mol%-50 mol%、30 mol%-40 mol%、40 mol%-60 mol%、40 mol%-50 mol%或50 mol%-60 mol%之可電離胺基脂質。在一些實施例中，脂質奈米粒子包含20 mol%、30 mol%、40 mol%、50 mol%或60 mol%之可電離胺基脂質。在一些實施例中，脂質奈米粒子包含35 mol%、36 mol%、37 mol%、38 mol%、39 mol%、40 mol%、41 mol%、42 mol%、43 mol%、44 mol%、45 mol%、46 mol%、47 mol%、48 mol%、49 mol%、50 mol%、51 mol%、52 mol%、53 mol%、54 mol%或55 mol%之可電離胺基脂質。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含45-55莫耳百分比(mol%)之可電離胺基脂質。舉例而言，脂質奈米粒子可包含45 mol%、46 mol%、47 mol%、48 mol%、49 mol%、50 mol%、51 mol%、52 mol%、53 mol%、54 mol%或55 mol%之可電離胺基脂質。 可電離胺基脂質

在一些實施例中，可電離胺基脂質為式(AI)化合物：

(AI)或其N-氧化物，或其鹽或異構物，其中R’ ^a為R’ ^分支；其中 R’ ^分支為：

；其中

表示連接點；其中R ^aα、R ^aβ、R ^aγ及R ^aδ各自獨立地選自由H、C _2-12烷基及C _2-12烯基組成之群； R ²及R ³各自獨立地選自由C _1-14烷基及C _2-14烯基組成之群； R ⁴選自由以下組成之群：-(CH ₂) _nOH，其中n選自由1、2、3、4及5組成之群；及

，其中

表示連接點；其中 R ¹⁰為N(R) ₂；每一R獨立地選自由C _1-6烷基、C _2-3烯基及H組成之群；且n2選自由1、2、3、4、5、6、7、8、9及10組成之群；每一R ⁵獨立地選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群；每一R ⁶獨立地選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群； M及M’各自獨立地選自由-C(O)O-及-OC(O)-組成之群； R’為C _1-12烷基或C _2-12烯基； l選自由1、2、3、4及5組成之群；且 m選自由5、6、7、8、9、10、11、12及13組成之群。

在式(AI)化合物之一些實施例中，R’ ^a為R’ ^分支；R’ ^分支為

；

表示連接點；R ^aα、R ^aβ、R ^aγ及R ^aδ各自為H；R ²及R ³各自為C _1-14烷基；R ⁴為-(CH ₂) _nOH；n為2；每一R ⁵為H；每一R ⁶為H；M及M’各自為-C(O)O-；R’為C _1-12烷基；l為5；且m為7。

；

表示連接點；R ^aα、R ^aβ、R ^aγ及R ^aδ各自為H；R ²及R ³各自為C _1-14烷基；R ⁴為-(CH ₂) _nOH；n為2；每一R ⁵為H；每一R ⁶為H；M及M’各自為-C(O)O-；R’為C _1-12烷基；l為3；且m為7。

；

表示連接點；R ^aα為C _2-12烷基；R ^aβ、R ^aγ及R ^aδ各自為H；R ²及R ³各自為C _1-14烷基；R ⁴為

；R ¹⁰為NH(C _1-6烷基)；n2為2；R ⁵為H；每一R ⁶為H；M及M’各自為-C(O)O-；R’為C _1-12烷基；l為5；且m為7。

在式(I)化合物之一些實施例中，R’ ^a為R’ ^分支；R’ ^分支為

；

表示連接點；R ^aα、R ^aβ及R ^aδ各自為H；R ^aγ為C _2-12烷基；R ²及R ³各自為C _1-14烷基；R ⁴為-(CH ₂) _nOH；n為2；每一R ⁵為H；每一R ⁶為H；M及M’各自為-C(O)O-；R’為C _1-12烷基；l為5；且m為7。

在一些實施例中，式(I)化合物選自：

、

、

，及

。

在一些實施例中，可電離胺基脂質為式(AIa)化合物：

(AIa)或其N-氧化物，或其鹽或異構物，其中R’ ^a為R’ ^分支；其中 R’ ^分支為：

；其中

表示連接點；其中R ^aβ、R ^aγ及R ^aδ各自獨立地選自由H、C _2-12烷基及C _2-12烯基組成之群； R ²及R ³各自獨立地選自由C _1-14烷基及C _2-14烯基組成之群； R ⁴選自由以下組成之群：-(CH ₂) _nOH，其中n選自由1、2、3、4及5組成之群；及

，其中

在一些實施例中，可電離胺基脂質為式(AIa)化合物：

(AIb)或其N-氧化物，或其鹽或異構物，其中R’ ^a為R’ ^分支；其中 R’ ^分支為：

；其中

表示連接點；其中R ^aα、R ^aβ、R ^aγ及R ^aδ各自獨立地選自由H、C _2-12烷基及C _2-12烯基組成之群； R ²及R ³各自獨立地選自由C _1-14烷基及C _2-14烯基組成之群； R ⁴為-(CH ₂) _nOH，其中n選自由1、2、3、4及5組成之群；每一R ⁵獨立地選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群；每一R ⁶獨立地選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群； M及M’各自獨立地選自由-C(O)O-及-OC(O)-組成之群； R’為C _1-12烷基或C _2-12烯基； l選自由1、2、3、4及5組成之群；且 m選自由5、6、7、8、9、10、11、12及13組成之群。

在式(AI)或(AIb)之一些實施例中，R’ ^a為R’ ^分支；R’ ^分支為

；

表示連接點；R ^aβ、R ^aγ及R ^aδ各自為H；R ²及R ³各自為C _1-14烷基；R ⁴為-(CH ₂) _nOH；n為2；每一R ⁵為H；每一R ⁶為H；M及M’各自為-C(O)O-；R’為C _1-12烷基；l為5；且m為7。

；

表示連接點；R ^aβ、R ^aγ及R ^aδ各自為H；R ²及R ³各自為C _1-14烷基；R ⁴為-(CH ₂) _nOH；n為2；每一R ⁵為H；每一R ⁶為H；M及M’各自為-C(O)O-；R’為C _1-12烷基；l為3；且m為7。

；

表示連接點；R ^aβ及R ^aδ各自為H；R ^aγ為C _2-12烷基；R ²及R ³各自為C _1-14烷基；R ⁴為-(CH ₂) _nOH；n為2；每一R ⁵為H；每一R ⁶為H；M及M’各自為-C(O)O-；R’為C _1-12烷基；l為5；且m為7。

在一些實施例中，可電離胺基脂質為式(AIc)化合物：

(AIc)或其N-氧化物，或其鹽或異構物，其中R’ ^a為R’ ^分支；其中 R’ ^分支為：

；其中

表示連接點；其中R ^aα、R ^aβ、R ^aγ及R ^aδ各自獨立地選自由H、C _2-12烷基及C _2-12烯基組成之群； R ²及R ³各自獨立地選自由C _1-14烷基及C _2-14烯基組成之群； R ⁴為

，其中

表示連接點；其中R ¹⁰為N(R) ₂；每一R獨立地選自由C _1-6烷基、C _2-3烯基及H組成之群；n2選自由1、2、3、4、5、6、7、8、9及10組成之群；每一R ⁵獨立地選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群；每一R ⁶獨立地選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群； M及M’各自獨立地選自由-C(O)O-及-OC(O)-組成之群； R’為C _1-12烷基或C _2-12烯基； l選自由1、2、3、4及5組成之群；且 m選自由5、6、7、8、9、10、11、12及13組成之群。

在一些實施例中，R’ ^a為R’ ^分支；R’ ^分支為

；

表示連接點；R ^aβ、R ^aγ及R ^aδ各自為H；R ^aα為C _2-12烷基；R ²及R ³各自為C _1-14烷基；R ⁴為

；

表示連接點；R ¹⁰為NH(C _1-6烷基)；n2為2；每一R ⁵為H；每一R ⁶為H；M及M’各自為-C(O)O-；R’為C _1-12烷基；l為5；且m為7。

在一些實施例中，式(AIc)化合物為：

。

在一些實施例中，可電離胺基脂質為式(AII)化合物：

(AII)或其N-氧化物，或其鹽或異構物，其中R’ ^a為R’ ^分支或R’ ^環狀；其中 R’ ^分支為：

且R’ ^環狀為：

；且 R’ ^b為：

或

；其中

表示連接點； R ^aγ及R ^aδ各自獨立地選自由H、C _1-12烷基及C _2-12烯基組成之群，其中R ^aγ及R ^aδ中之至少一者選自由C _1-12烷基及C _2-12烯基組成之群； R ^bγ及R ^bδ各自獨立地選自由H、C _1-12烷基及C _2-12烯基組成之群，其中R ^bγ及R ^bδ中之至少一者選自由C _1-12烷基及C _2-12烯基組成之群； R ²及R ³各自獨立地選自由C _1-14烷基及C _2-14烯基組成之群； R ⁴選自由以下組成之群：-(CH ₂) _nOH，其中n選自由1、2、3、4及5組成之群；及

，其中

表示連接點；其中R ¹⁰為N(R) ₂；每一R獨立地選自由C _1-6烷基、C _2-3烯基及H組成之群；且n2選自由1、2、3、4、5、6、7、8、9及10組成之群；每一R’獨立地為C _1-12烷基或C _2-12烯基； Y ^a為C _3-6碳環； R*” ^a選自由C _1-15烷基及C _2-15烯基組成之群；且 s為2或3； m選自1、2、3、4、5、6、7、8及9； l選自1、2、3、4、5、6、7、8及9。

在一些實施例中，可電離胺基脂質為式(AII-a)化合物：

(AII-a)或其N-氧化物，或其鹽或異構物，其中R’ ^a為R’ ^分支或R’ ^環狀；其中 R’ ^分支為：

且R’ ^b為：

或

；其中

，其中

表示連接點；其中R ¹⁰為N(R) ₂；每一R獨立地選自由C _1-6烷基、C _2-3烯基及H組成之群；且n2選自由1、2、3、4、5、6、7、8、9及10組成之群；每一R’獨立地為C _1-12烷基或C _2-12烯基； m選自1、2、3、4、5、6、7、8及9； l選自1、2、3、4、5、6、7、8及9。

在一些實施例中，可電離胺基脂質為式(AII-b)化合物：

(AII-b)或其N-氧化物，或其鹽或異構物，其中R’ ^a為R’ ^分支或R’ ^環狀；其中 R’ ^分支為：

且R’ ^b為：

或

；其中

表示連接點； R ^aγ及R ^bγ各自獨立地選自由C _1-12烷基及C _2-12烯基組成之群； R ²及R ³各自獨立地選自由C _1-14烷基及C _2-14烯基組成之群； R ⁴選自由以下組成之群：-(CH ₂) _nOH，其中n選自由1、2、3、4及5組成之群；及

，其中

在一些實施例中，可電離胺基脂質為式(AII-c)化合物：

(AII-c)或其N-氧化物，或其鹽或異構物，其中R’ ^a為R’ ^分支或R’ ^環狀；其中 R’ ^分支為：

且R’ ^b為：

；其中

表示連接點；其中R ^aγ選自由C _1-12烷基及C _2-12烯基組成之群； R ²及R ³各自獨立地選自由C _1-14烷基及C _2-14烯基組成之群； R ⁴選自由以下組成之群：-(CH ₂) _nOH，其中n選自由1、2、3、4及5組成之群；及

，其中

表示連接點；其中R ¹⁰為N(R) ₂；每一R獨立地選自由C _1-6烷基、C _2-3烯基及H組成之群；且n2選自由1、2、3、4、5、6、7、8、9及10組成之群； R’為C _1-12烷基或C _2-12烯基； m選自1、2、3、4、5、6、7、8及9； l選自1、2、3、4、5、6、7、8及9。

在一些實施例中，可電離胺基脂質為式(AII-d)化合物：

(AII-d)或其N-氧化物，或其鹽或異構物，其中R’ ^a為R’ ^分支或R’ ^環狀；其中 R’ ^分支為：

且R’ ^b為：

；其中

表示連接點；其中R ^aγ及R ^bγ各自獨立地選自由C _1-12烷基及C _2-12烯基組成之群； R ⁴選自由以下組成之群：-(CH ₂) _nOH，其中n選自由1、2、3、4及5組成之群；及

，其中

在一些實施例中，可電離胺基脂質為式(AII-e)化合物：

(AII-e)或其N-氧化物，或其鹽或異構物，其中R’ ^a為R’ ^分支或R’ ^環狀；其中 R’ ^分支為：

且R’ ^b為：

；其中

表示連接點；其中R ^aγ選自由C _1-12烷基及C _2-12烯基組成之群； R ²及R ³各自獨立地選自由C _1-14烷基及C _2-14烯基組成之群； R ⁴為-(CH ₂) _nOH，其中n選自由1、2、3、4及5組成之群； R’為C _1-12烷基或C _2-12烯基； m選自1、2、3、4、5、6、7、8及9； l選自1、2、3、4、5、6、7、8及9。

在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)化合物之一些實施例中，m及l各自獨立地選自4、5及6。在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)化合物之一些實施例中，m及l各自為5。

在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)化合物之一些實施例中，每一R’獨立地為C _1-12烷基。在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)化合物之一些實施例中，每一R’獨立地為C _2-5烷基。

在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)化合物之一些實施例中，R’ ^b為：

，且R ²及R ³各自獨立地為C _1-14烷基。在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)化合物之一些實施例中，R’ ^b為：

且R ²及R ³各自獨立地為C _6-10烷基。在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)化合物之一些實施例中，R’ ^b為：

且R ²及R ³各自為C ₈烷基。

在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)化合物之一些實施例中，R’ ^分支為：

且R’ ^b為：

，R ^aγ為C _1-12烷基，且R ²及R ³各自獨立地為C _6-10烷基。在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)化合物之一些實施例中，R’ ^分支為：

且R’ ^b為：

，R ^aγ為C _2-6烷基，且R ²及R ³各自獨立地為C _6-10烷基。在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)化合物之一些實施例中，R’ ^分支為：

且R’ ^b為：

，R ^aγ為C _2-6烷基，且R ²及R ³各自為C ₈烷基。

，R’ ^b為：

，且R ^aγ及R ^bγ各自為C _1-12烷基。在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)化合物之一些實施例中，R’ ^分支為：

，R’ ^b為：

，且R ^aγ及R ^bγ各自為C _2-6烷基。

在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)化合物之一些實施例中，m及l各自獨立地選自4、5及6，且每一R’獨立地為C _1-12烷基。在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)化合物之一些實施例中，m及l各自為5，且每一R’獨立地為C _2-5烷基。

在(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)化合物之一些實施例中，R’ ^分支為：

，R’ ^b為：

，m及l各自獨立地選自4、5及6，每一R’獨立地為C _1-12烷基，且R ^aγ及R ^bγ各自為C _1-12烷基。在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)化合物之一些實施例中，R’ ^分支為：

，R’ ^b為：

，m及l各自為5，每一R’獨立地為C _2-5烷基，且R ^aγ及R ^bγ各自為C _2-6烷基。

且R’ ^b為：

，m及l各自獨立地選自4、5及6，R’為C _1-12烷基，R ^aγ為C _1-12烷基，且R ²及R ³各自獨立地為C _6-10烷基。

且R’ ^b為：

，m及l各自為5，R’為C _2-5烷基，R ^aγ為C _2-6烷基，且R ²及R ³各自為C ₈烷基。

在(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)化合物之一些實施例中，R ⁴為

，其中R ¹⁰為NH(C _1-6烷基)且n2為2。在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)化合物之一些實施例中，R ⁴為

，其中R ¹⁰為NH(CH ₃)且n2為2。

，R’ ^b為：

，m及l各自獨立地選自4、5及6，每一R’獨立地為C _1-12烷基，R ^aγ及R ^bγ各自為C _1-12烷基，且R ⁴為

，其中R ¹⁰為NH(C _1-6烷基)，且n2為2。在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)化合物之一些實施例中，R’ ^分支為：

，R’ ^b為：

，m及l各自為5，每一R’獨立地為C _2-5烷基，R ^aγ及R ^bγ各自為C _2-6烷基，且R ⁴為

，其中R ¹⁰為NH(CH ₃)且n2為2。

且R’ ^b為：

，m及l各自獨立地選自4、5及6，R’為C _1-12烷基，R ²及R ³各自獨立地為C _6-10烷基，R ^aγ為C _1-12烷基，且R ⁴為

，其中R ¹⁰為NH(C _1-6烷基)且n2為2。在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)化合物之一些實施例中，R’ ^分支為：

且R’ ^b為：

，m及l各自為5，R’為C _2-5烷基，R ^aγ為C _2-6烷基，R ²及R ³各自為C ₈烷基，且R ⁴為

，其中R ¹⁰為NH(CH ₃)且n2為2。

在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)化合物之一些實施例中，R ⁴為-(CH ₂) _nOH且n為2、3或4。在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)化合物之一些實施例中，R ⁴為-(CH ₂) _nOH且n為2。

，R’ ^b為：

，m及l各自獨立地選自4、5及6，每一R’獨立地為C _1-12烷基，R ^aγ及R ^bγ各自為C _1-12烷基，R ⁴為-(CH ₂) _nOH，且n為2、3或4。在式(AII)、(AII-a)、(AII-b)、(AII-c)、(AII-d)或(AII-e)化合物之一些實施例中，R’ ^分支為：

，R’ ^b為：

，m及l各自為5，每一R’獨立地為C _2-5烷基，R ^aγ及R ^bγ各自為C _2-6烷基，R ⁴為-(CH ₂) _nOH，且n為2。

在一些實施例中，可電離胺基脂質為式(AII-f)化合物：

(AII-f)或其N-氧化物，或其鹽或異構物，其中R’ ^a為R’ ^分支或R’ ^環狀；其中 R’ ^分支為：

且R’ ^b為：

；其中

表示連接點； R ^aγ為C _1-12烷基； R ²及R ³各自獨立地為C _1-14烷基； R ⁴為-(CH ₂) _nOH，其中n選自由1、2、3、4及5組成之群； R’為C _1-12烷基； m選自4、5及6；且 l選自4、5及6。

在式(AII-f)化合物之一些實施例中，m及l各自為5，且n為2、3或4。

在式(AII-f)化合物之一些實施例中，R’為C _2-5烷基，R ^aγ為C _2-6烷基，且R ²及R ³各自為C _6-10烷基。

在式(AII-f)化合物之一些實施例中，m及l各自為5，n為2、3或4，R’為C _2-5烷基，R ^aγ為C _2-6烷基，且R ²及R ³各自為C _6-10烷基。

在一些實施例中，可電離胺基脂質為式(AII-g)化合物：

(AII-g)，其中 R ^aγ為C _2-6烷基； R’為C _2-5烷基；且 R ⁴選自由以下組成之群：-(CH ₂) _nOH，其中n選自由3、4及5組成之群；及

，其中

表示連接點，R ¹⁰為NH(C _1-6烷基)，且n2選自由1、2及3組成之群。

在一些實施例中，可電離胺基脂質為式(AII-h)化合物：

(AII-h)，其中 R ^aγ及R ^bγ各自獨立地為C _2-6烷基；每一R’獨立地為C _2-5烷基；且 R ⁴選自由以下組成之群：-(CH ₂) _nOH，其中n選自由3、4及5組成之群；及

，其中

在式(AII-g)或(AII-h)化合物之一些實施例中，R ⁴為

，其中 R ¹⁰為NH(CH ₃)且n2為2。

在式(AII-g)或(AII-h)化合物之一些實施例中，R ⁴為-(CH ₂) ₂OH。

在一些實施例中，可電離胺基脂質可為式(VI)化合物中之一或多者：

(VI)，或其N-氧化物，或其鹽或異構物，其中： R ₁選自由以下組成之群：C _5-30烷基、C _5-20烯基、-R*YR”、-YR”及-R”M’R’； R ₂及R ₃獨立地選自由以下組成之群：H、C _1-14烷基、C _2-14烯基、-R*YR”、-YR”及-R*OR”，或R ₂及R ₃與其所連接之原子一起形成雜環或碳環； R ₄選自由以下組成之群：氫、C _3-6碳環、-(CH ₂) _nQ、-(CH ₂) _nCHQR、-CHQR、-CQ(R) ₂及未經取代之C _1-6烷基，其中Q選自碳環、雜環、-OR、-O(CH ₂) _nN(R) ₂、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX ₃、-CX ₂H、-CXH ₂、-CN、-N(R) ₂、-C(O)N(R) ₂、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O) ₂R、-N(R)C(O)N(R) ₂、-N(R)C(S)N(R) ₂、-N(R)R ₈、-N(R)S(O) ₂R ₈、-O(CH ₂) _nOR、-N(R)C(=NR ₉)N(R) ₂、-N(R)C(=CHR ₉)N(R) ₂、-OC(O)N(R) ₂、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O) ₂R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R) ₂、-N(OR)C(S)N(R) ₂、-N(OR)C(=NR ₉)N(R) ₂、-N(OR)C(=CHR ₉)N(R) ₂、-C(=NR ₉)N(R) ₂、-C(=NR ₉)R、-C(O)N(R)OR及-C(R)N(R) ₂C(O)OR，且每一n獨立地選自1、2、3、4及5；每一R ₅獨立地選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群；每一R ₆獨立地選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群； M及M’獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O) ₂-、-S-S-、芳基及雜芳基，其中M”為鍵、C _1-13烷基或C _2-13烯基； R ₇選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群； R ₈選自由C _3-6碳環及雜環組成之群； R ₉選自由以下組成之群：H、CN、NO ₂、C _1-6烷基、-OR、-S(O) ₂R、-S(O) ₂N(R) ₂、C _2-6烯基、C _3-6碳環及雜環；每一R獨立地選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群；每一R’獨立地選自由C _1-18烷基、C _2-18烯基、-R*YR”、-YR”及H組成之群；每一R”獨立地選自由C _3-15烷基及C _3-15烯基組成之群；每一R*獨立地選自由C _1-12烷基及C _2-12烯基組成之群；每一Y獨立地為C _3-6碳環；每一X獨立地選自由F、Cl、Br及I組成之群；且 m選自5、6、7、8、9、10、11、12及13；且其中當R ₄為-(CH ₂) _nQ、-(CH ₂) _nCHQR、-CHQR或-CQ(R) ₂時，則(i)當n為1、2、3、4或5時，Q不為-N(R) ₂，或(ii)當n為1或2時，Q不為5員、6員或7員雜環烷基。

在一些實施例中，式(VI)化合物之另一子集包括如下情形之彼等化合物： R ₁選自由以下組成之群：C _5-30烷基、C _5-20烯基、-R*YR”、-YR”及-R”M’R’； R ₂及R ₃獨立地選自由以下組成之群：H、C _1-14烷基、C _2-14烯基、-R*YR”、-YR”及-R*OR”，或R ₂及R ₃與其所連接之原子一起形成雜環或碳環； R ₄選自由以下組成之群：C _3-6碳環、-(CH ₂) _nQ、-(CH ₂) _nCHQR、-CHQR、-CQ(R) ₂及未經取代之C _1-6烷基，其中Q選自C _3-6碳環、具有一或多個選自N、O及S之雜原子之5員至14員雜芳基、-OR、-O(CH ₂) _nN(R) ₂、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX ₃、-CX ₂H、-CXH ₂、-CN、-C(O)N(R) ₂、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O) ₂R、-N(R)C(O)N(R) ₂、-N(R)C(S)N(R) ₂、-CRN(R) ₂C(O)OR、-N(R)R ₈、-O(CH ₂) _nOR、-N(R)C(=NR ₉)N(R) ₂、-N(R)C(=CHR ₉)N(R) ₂、-OC(O)N(R) ₂、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O) ₂R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R) ₂、-N(OR)C(S)N(R) ₂、-N(OR)C(=NR ₉)N(R) ₂、-N(OR)C(=CHR ₉)N(R) ₂、-C(=NR ₉)N(R) ₂、-C(=NR ₉)R、-C(O)N(R)OR及具有一或多個選自N、O及S之雜原子之5員至14員雜環烷基，其經一或多個選自側氧基(=O)、OH、胺基、單-或二-烷基胺基及C _1-3烷基之取代基取代，且每一n獨立地選自1、2、3、4及5；每一R ₅獨立地選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群；每一R ₆獨立地選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群； M及M’獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O) ₂-、-S-S-、芳基及雜芳基； R ₇選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群； R ₈選自由C _3-6碳環及雜環組成之群； R ₉選自由以下組成之群：H、CN、NO ₂、C _1-6烷基、-OR、-S(O) ₂R、-S(O) ₂N(R) ₂、C _2-6烯基、C _3-6碳環及雜環；每一R獨立地選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群；每一R’獨立地選自由C _1-18烷基、C _2-18烯基、-R*YR”、-YR”及H組成之群；每一R”獨立地選自由C _3-14烷基及C _3-14烯基組成之群；每一R*獨立地選自由C _1-12烷基及C _2-12烯基組成之群；每一Y獨立地為C _3-6碳環；每一X獨立地選自由F、Cl、Br及I組成之群；且 m選自5、6、7、8、9、10、11、12及13，或其鹽或異構物。

在一些實施例中，式(VI)化合物之另一子集包括如下情形之彼等化合物： R ₁選自由以下組成之群：C _5-30烷基、C _5-20烯基、-R*YR”、-YR”及-R”M’R’； R ₂及R ₃獨立地選自由以下組成之群：H、C _1-14烷基、C _2-14烯基、-R*YR”、-YR”及-R*OR”，或R ₂及R ₃與其所連接之原子一起形成雜環或碳環； R ₄選自由以下組成之群：C _3-6碳環、-(CH ₂) _nQ、-(CH ₂) _nCHQR、-CHQR、-CQ(R) ₂及未經取代之C _1-6烷基，其中Q選自C _3-6碳環、具有一或多個選自N、O及S之雜原子之5員至14員雜環、-OR、-O(CH ₂) _nN(R) ₂、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX ₃、-CX ₂H、-CXH ₂、-CN、-C(O)N(R) ₂、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O) ₂R、-N(R)C(O)N(R) ₂、-N(R)C(S)N(R) ₂、-CRN(R) ₂C(O)OR、-N(R)R ₈、-O(CH ₂) _nOR、-N(R)C(=NR ₉)N(R) ₂、-N(R)C(=CHR ₉)N(R) ₂、-OC(O)N(R) ₂、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O) ₂R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R) ₂、-N(OR)C(S)N(R) ₂、-N(OR)C(=NR ₉)N(R) ₂、-N(OR)C(=CHR ₉)N(R) ₂、-C(=NR ₉)R、-C(O)N(R)OR及-C(=NR ₉)N(R) ₂，且每一n獨立地選自1、2、3、4及5；且當Q為5員至14員雜環且(i) R ₄為-(CH ₂) _nQ，其中n為1或2，或(ii) R ₄為-(CH ₂) _nCHQR，其中n為1，或(iii) R ₄為-CHQR及-CQ(R) ₂時，則Q為5員至14員雜芳基或8員至14員雜環烷基；每一R ₅獨立地選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群；每一R ₆獨立地選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群； M及M’獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O) ₂-、-S-S-、芳基及雜芳基； R ₇選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群； R ₈選自由C _3-6碳環及雜環組成之群； R ₉選自由以下組成之群：H、CN、NO ₂、C _1-6烷基、-OR、-S(O) ₂R、-S(O) ₂N(R) ₂、C _2-6烯基、C _3-6碳環及雜環；每一R獨立地選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群；每一R’獨立地選自由C _1-18烷基、C _2-18烯基、-R*YR”、-YR”及H組成之群；每一R”獨立地選自由C _3-14烷基及C _3-14烯基組成之群；每一R*獨立地選自由C _1-12烷基及C _2-12烯基組成之群；每一Y獨立地為C _3-6碳環；每一X獨立地選自由F、Cl、Br及I組成之群；且 m選自5、6、7、8、9、10、11、12及13，或其鹽或異構物。

在一些實施例中，式(VI)化合物之另一子集包括如下情形之彼等化合物： R ₁選自由以下組成之群：C _5-30烷基、C _5-20烯基、-R*YR”、-YR”及-R”M’R’； R ₂及R ₃獨立地選自由以下組成之群：H、C _1-14烷基、C _2-14烯基、-R*YR”、-YR”及-R*OR”，或R ₂及R ₃與其所連接之原子一起形成雜環或碳環； R ₄選自由以下組成之群：C _3-6碳環、-(CH ₂) _nQ、-(CH ₂) _nCHQR、-CHQR、-CQ(R) ₂及未經取代之C _1-6烷基，其中Q選自C _3-6碳環、具有一或多個選自N、O及S之雜原子之5員至14員雜芳基、-OR、-O(CH ₂) _nN(R) ₂、-C(O)OR、-OC(O)R、-CX ₃、-CX ₂H、-CXH ₂、-CN、-C(O)N(R) ₂、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O) ₂R、-N(R)C(O)N(R) ₂、-N(R)C(S)N(R) ₂、-CRN(R) ₂C(O)OR、-N(R)R ₈、-O(CH ₂) _nOR、-N(R)C(=NR ₉)N(R) ₂、-N(R)C(=CHR ₉)N(R) ₂、-OC(O)N(R) ₂、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O) ₂R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R) ₂、-N(OR)C(S)N(R) ₂、-N(OR)C(=NR ₉)N(R) ₂、-N(OR)C(=CHR ₉)N(R) ₂、-C(=NR ₉)R、-C(O)N(R)OR及-C(=NR ₉)N(R) ₂，且每一n獨立地選自1、2、3、4及5；每一R ₅獨立地選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群；每一R ₆獨立地選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群； M及M’獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O) ₂-、-S-S-、芳基及雜芳基； R ₇選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群； R ₈選自由C _3-6碳環及雜環組成之群； R ₉選自由以下組成之群：H、CN、NO ₂、C _1-6烷基、-OR、-S(O) ₂R、-S(O) ₂N(R) ₂、C _2-6烯基、C _3-6碳環及雜環；每一R獨立地選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群；每一R’獨立地選自由C _1-18烷基、C _2-18烯基、-R*YR”、-YR”及H組成之群；每一R”獨立地選自由C _3-14烷基及C _3-14烯基組成之群；每一R*獨立地選自由C _1-12烷基及C _2-12烯基組成之群；每一Y獨立地為C _3-6碳環；每一X獨立地選自由F、Cl、Br及I組成之群；且 m選自5、6、7、8、9、10、11、12及13，或其鹽或異構物。

在一些實施例中，式(VI)化合物之另一子集包括如下情形之彼等化合物： R ₁選自由以下組成之群：C _5-30烷基、C _5-20烯基、-R*YR”、-YR”及-R”M’R’； R ₂及R ₃獨立地選自由以下組成之群：H、C _2-14烷基、C _2-14烯基、-R*YR”、-YR”及-R*OR”，或R ₂及R ₃與其所連接之原子一起形成雜環或碳環； R ₄為-(CH ₂) _nQ或-(CH ₂) _nCHQR，其中Q為-N(R) ₂，且n選自3、4及5；每一R ₅獨立地選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群；每一R ₆獨立地選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群； M及M’獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O) ₂-、-S-S-、芳基及雜芳基； R ₇選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群；每一R獨立地選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群；每一R’獨立地選自由C _1-18烷基、C _2-18烯基、-R*YR”、-YR”及H組成之群；每一R”獨立地選自由C _3-14烷基及C _3-14烯基組成之群；每一R*獨立地選自由C _1-12烷基及C _1-12烯基組成之群；每一Y獨立地為C _3-6碳環；每一X獨立地選自由F、Cl、Br及I組成之群；且 m選自5、6、7、8、9、10、11、12及13，或其鹽或異構物。

在一些實施例中，式(VI)化合物之另一子集包括如下情形之彼等化合物： R ₁選自由以下組成之群：C _5-30烷基、C _5-20烯基、-R*YR”、-YR”及-R”M’R’； R ₂及R ₃獨立地選自由以下組成之群：C _1-14烷基、C _2-14烯基、-R*YR”、-YR”及-R*OR”，或R ₂及R ₃與其所連接之原子一起形成雜環或碳環； R ₄選自由-(CH ₂) _nQ、-(CH ₂) _nCHQR、-CHQR及-CQ(R) ₂組成之群，其中Q為-N(R) ₂，且n選自1、2、3、4及5；每一R ₅獨立地選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群；每一R ₆獨立地選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群； M及M’獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O) ₂-、-S-S-、芳基及雜芳基； R ₇選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群；每一R獨立地選自由C _1-3烷基、C _2-3烯基及H組成之群；每一R’獨立地選自由C _1-18烷基、C _2-18烯基、-R*YR”、-YR”及H組成之群；每一R”獨立地選自由C _3-14烷基及C _3-14烯基組成之群；每一R*獨立地選自由C _1-12烷基及C _1-12烯基組成之群；每一Y獨立地為C _3-6碳環；每一X獨立地選自由F、Cl、Br及I組成之群；且 m選自5、6、7、8、9、10、11、12及13，或其鹽或異構物。

在某些實施例中，式(VI)化合物之子集包括式(VI-A)之彼等化合物：

(VI-A)，或其N-氧化物，或其鹽或異構物，其中l選自1、2、3、4及5；m選自5、6、7、8及9；M ₁為鍵或M’；R ₄為氫、未經取代之C _1-3烷基或-(CH ₂) _nQ，其中Q為OH、-NHC(S)N(R) ₂、-NHC(O)N(R) ₂、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O) ₂R、-N(R)R ₈、-NHC(=NR ₉)N(R) ₂、-NHC(=CHR ₉)N(R) ₂、-OC(O)N(R) ₂、-N(R)C(O)OR、雜芳基或雜環烷基；M及M’獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基及雜芳基；且R ₂及R ₃獨立地選自由H、C _1-14烷基及C _2-14烯基組成之群。舉例而言，m為5、7或9。舉例而言，Q為OH、-NHC(S)N(R) ₂或-NHC(O)N(R) ₂。舉例而言，Q為-N(R)C(O)R或-N(R)S(O) ₂R。

在某些實施例中，式(VI)化合物之子集包括式(VI-B)之彼等化合物：

(VI-B)，或其N-氧化物，或其鹽或異構物，其中所有變數均如本文所定義。舉例而言，m選自5、6、7、8及9；R ₄為氫、未經取代之C _1-3烷基或-(CH ₂) _nQ，其中Q為H、-NHC(S)N(R) ₂、-NHC(O)N(R) ₂、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O) ₂R、-N(R)R ₈、-NHC(=NR ₉)N(R) ₂、-NHC(=CHR ₉)N(R) ₂、-OC(O)N(R) ₂、-N(R)C(O)OR、雜芳基或雜環烷基；M及M’獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基及雜芳基；且R ₂及R ₃獨立地選自由H、C _1-14烷基及C _2-14烯基組成之群。舉例而言，m為5、7或9。舉例而言，Q為OH、-NHC(S)N(R) ₂或-NHC(O)N(R) ₂。舉例而言，Q為-N(R)C(O)R或-N(R)S(O) ₂R。

在某些實施例中，式(VI)化合物之子集包括式(VII)之彼等化合物：

(VII)，或其N-氧化物，或其鹽或異構物，其中l選自1、2、3、4及5；M ₁為鍵或M’；R ₄為氫、未經取代之C _1-3烷基或-(CH ₂) _nQ，其中n為2、3或4，且Q為OH、-NHC(S)N(R) ₂、-NHC(O)N(R) ₂、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O) ₂R、-N(R)R ₈、-NHC(=NR ₉)N(R) ₂、-NHC(=CHR ₉)N(R) ₂、-OC(O)N(R) ₂、-N(R)C(O)OR、雜芳基或雜環烷基；M及M’獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基及雜芳基；且R ₂及R ₃獨立地選自由H、C _1-14烷基及C _2-14烯基組成之群。

在一些實施例中，式(VI)化合物為式(VIIa)化合物，

(VIIa)，或其N-氧化物，或其鹽或異構物，其中R ₄係如本文所闡述。

在另一實施例中，式(VI)化合物為式(VIIb)化合物，

(VIIb)，或其N-氧化物，或其鹽或異構物，其中R ₄係如本文所闡述。

在另一實施例中，式(VI)化合物為式(VIIc)或(VIIe)化合物：

(VIIc)或

(VIIe)，或其N-氧化物，或其鹽或異構物，其中R ₄係如本文所闡述。

在另一實施例中，式(VI)化合物為式(VIIf)化合物：

(VIIf)或其N-氧化物，或其鹽或異構物，其中M為-C(O)O-或-OC(O)-，M”為C _1-6烷基或C _2-6烯基，R ₂及R ₃獨立地選自由C _5-14烷基及C _5-14烯基組成之群，且n選自2、3及4。

在另一實施例中，式(VI)化合物為式(VIId)化合物，

(VIId)，或其N-氧化物，或其鹽或異構物，其中n為2、3或4；且m、R’、R”及R ₂至R ₆係如本文所闡述。舉例而言，R ₂及R ₃各自可獨立地選自由C _5-14烷基及C _5-14烯基組成之群。

在一些實施例中，本揭示案之可電離胺基脂質包含具有如下結構之化合物：

(化合物I)。

(化合物II)。

在另一實施例中，式(VI)化合物為式(VIIg)化合物，

(VIIg)，或其N-氧化物，或其鹽或異構物，其中l選自1、2、3、4及5；m選自5、6、7、8及9；M ₁為鍵或M’；M及M’獨立地選自-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)-M”-C(O)O-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基及雜芳基；且R ₂及R ₃獨立地選自由H、C _1-14烷基及C _2-14烯基組成之群。舉例而言，M”為C _1-6烷基(例如C _1-4烷基)或C _2-6烯基(例如C _2-4烯基)。舉例而言，R ₂及R ₃獨立地選自由C _5-14烷基及C _5-14烯基組成之群。

在一些實施例中，可電離胺基脂質為美國申請案第62/220,091號、第62/252,316號、第62/253,433號、第62/266,460號、第62/333,557號、第62/382,740號、第62/393,940號、第62/471,937號、第62/471,949號、第62/475,140號及第62/475,166號以及PCT申請案第PCT/US2016/052352號中所闡述化合物中之一或多者。

根據式(VI)、(VI-A)、(VI-B)、(VII)、(VIIa)、(VIIb)、(VIIc)、(VIId)、(VIIe)、(VIIf)或(VIIg)之脂質之中心胺部分可在生理pH下質子化。因此，脂質在生理pH下可具有正電荷或部分正電荷。此等胺基脂質可稱為陽離子脂質、可電離脂質、陽離子胺基脂質或可電離胺基脂質。胺基脂質亦可為兩性離子的，亦即具有正電荷及負電荷二者之中性分子。

在一些實施例中，可電離胺基脂質可為式(VIII)化合物中之一或多者，

(VIII)，或其鹽或異構物，其中 W為

或

，環A為

或

； t為1或2； A ₁及A ₂各自獨立地選自CH或N； Z為CH ₂或不存在，其中當Z為CH ₂時，虛線(1)及(2)各自表示單鍵；且當Z不存在時，虛線(1)及(2)均不存在； R ₁、R ₂、R ₃、R ₄及R ₅獨立地選自由C _5-20烷基、C _5-20烯基、-R”MR’、-R*YR”、-YR”及-R*OR”組成之群； R _X1及R _X2各自獨立地為H或C ₁- ₃烷基；每一M獨立地選自由-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-C(O)N(R’)-、-N(R’)C(O)-、-C(O)-、-C(S)-、-C(S)S-、-SC(S)-、-CH(OH)-、-P(O)(OR’)O-、-S(O) ₂-、-C(O)S-、-SC(O)-、芳基及雜芳基組成之群； M*為C ₁-C ₆烷基， W ¹及W ²各自獨立地選自由-O-及-N(R ₆)-組成之群；每一R ₆獨立地選自由H及C _1-5烷基組成之群； X ¹、X ²及X ³獨立地選自由以下組成之群：鍵、-CH ₂-、-(CH ₂) ₂-、-CHR-、-CHY-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-(CH ₂) _n-C(O)-、-C(O)-(CH ₂) _n-、-(CH ₂) _n-C(O)O-、-OC(O)-(CH ₂) _n-、-(CH ₂) _n-OC(O)-、-C(O)O-(CH ₂) _n-、-CH(OH)-、-C(S)-及-CH(SH)-；每一Y獨立地為C _3-6碳環；每一R*獨立地選自由C _1-12烷基及C _2-12烯基組成之群；每一R獨立地選自由C _1-3烷基及C _3-6碳環組成之群；每一R’獨立地選自由C _1-12烷基、C _2-12烯基及H組成之群；每一R”獨立地選自由C _3-12烷基、C _3-12烯基及-R*MR’組成之群；且 n為1至6之整數；其中當環A為

時，則 i) X ¹、X ²及X ³中之至少一者不為-CH ₂-；及/或 ii) R ₁、R ₂、R ₃、R ₄及R ₅中之至少一者為-R”MR’。

在一些實施例中，化合物為式(VIIIa1)至(VIIIa8)中之任一者之化合物：

(VIIIa1)、

(VIIIa2)、

(VIIIa3)、

(VIIIa4),

(VIIIa5')、

(VIIIa6)、

(VIIIa7)，或

(VIIIa8)。

在一些實施例中，可電離胺基脂質為

，或其鹽。

根據式(VIII)、(VIIIa1)、(VIIIa2)、(VIIIa3)、(VIIIa4)、(VIIIa5)、(VIIIa6)、(VIIIa7)或(VIIIa8)之脂質之中心胺部分可在生理pH下質子化。因此，脂質在生理pH下可具有正電荷或部分正電荷。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含具有如下結構之脂質：

(III-L)，或其醫藥學上可接受之鹽、互變異構物或立體異構物，其中： R ¹為視情況經取代之C ₁-C ₂₄烷基或視情況經取代之C ₂-C ₂₄烯基； R ²及R ³各自獨立地為視情況經取代之C ₁-C ₃₆烷基； R ⁴及R ⁵各自獨立地為視情況經取代之C ₁-C ₆烷基，或R ⁴及R ⁵連同其所連接之N一起接合形成雜環基或雜芳基； L ¹、L ²及L ³各自獨立地為視情況經取代之C ₁-C ₁₈伸烷基； G ¹為直接鍵、-(CH ₂) _nO(C=O)-、-(CH ₂) _n(C=O)O-或-(C=O)-； G ²及G ³各自獨立地為-(C=O)O-或-O(C=O)-；且n為大於0之整數。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含具有如下結構之脂質：

(IV-L) 或其醫藥學上可接受之鹽、互變異構物或立體異構物，其中： G ¹為-N(R ³)R ⁴或-OR ⁵； R ¹為視情況經取代之具支鏈飽和或不飽和C ₁₂-C ₃₆烷基；當L為-C(=O)-時，R ²為視情況經取代之具支鏈或無支鏈飽和或不飽和C ₁₂-C ₃₆烷基；或當L為C ₆-C ₁₂伸烷基、C ₆-C ₁₂伸烯基或C ₂-C ₆伸炔基時，R ²為視情況經取代之具支鏈或無支鏈飽和或不飽和C ₄-C ₃₆烷基； R ³及R ⁴各自獨立地為H、視情況經取代之具支鏈或無支鏈飽和或不飽和C ₁-C ₆烷基；或當L為C ₆-C ₁₂伸烷基、C ₆-C ₁₂伸烯基或C ₂-C ₆伸炔基時，R ³及R ⁴各自獨立地為視情況經取代之具支鏈或無支鏈飽和或不飽和C ₁-C ₆烷基；或R ³及R ⁴與其所連接之氮一起接合形成雜環基； R ⁵為H或視情況經取代之C ₁-C ₆烷基； L為-C(=O)-、C ₆-C ₁₂伸烷基、C ₆-C ₁₂伸烯基或C ₂-C ₆伸炔基；且 n為1至12之整數。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含具有如下結構之脂質：

(V-L)，或其醫藥學上可接受之鹽，其中：每一R ^1a獨立地為氫、R ^1c或R ^1d；每一R ^1b獨立地為R ^1c或R ^1d；每一R ^1c獨立地為-[CH ₂] ₂C(O)X ¹R ³；每一R ^1d獨立地為-C(O)R ⁴；每一R ²獨立地為-[C(R ^2a) ₂] _cR ^2b；每一R ^2a獨立地為氫或C ₁-C ₆烷基； R ^2b為-N(L ₁-B) ₂；-(OCH ₂CH ₂) ₆OH；或-(OCH ₂CH ₂) _bOCH ₃；每一R ³及R ⁴獨立地為C ₆-C ₃₀脂肪族；每一I. ₃獨立地為C ₁-C ₁₀伸烷基；每一B獨立地為氫或可電離含氮基團；每一X ¹獨立地為共價鍵或O；每一a獨立地為1至10之整數；每一b獨立地為1至10之整數；且每一c獨立地為1至10之整數。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含具有如下結構之脂質：

(VI-L)，或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物，其中： X為N，且Y不存在；或X為CR，且Y為NR； L ¹為-O(C-O)R ¹、-(C=O)OR ¹、-C(=O)R ¹、-OR ¹、-S(O) _xR ¹、-S-SR ¹、-C(=O)SR ¹、-SC(=O)R ¹、-NR ^aC(=O)R ¹、-C(=O)NR ^bR ^c、-NR ^aC(=O)NR ^bR ^c、-OC(=O)NR ^bR ^c或-NR ^aC(=O)OR ¹； L ²為-O(C=O)R ²、-(C=O)OR ²、-C(=O)R ²、-OR ²、-S(O) _xR ²、-S-SR ²、-C(=O)SR ²、-SC(=O)R ²、-NR ^dC(=O)R ²、-C(=O)NR ^eR ^f、-NR ^dC(=O)NR ^eR ^f、-OC(=O)NR ^eR ^f；-NR ^dC(=O)OR ²或與R ²之直接鍵； L ³為-O(C=O)R ³或-(C=O)OR ³； G ¹及G ²各自獨立地為C ₂-C ₁₂伸烷基或C ₂-C ₁₂伸烯基；當X為CR，且Y為NR時，G ³為C ₁-C ₂₄伸烷基、C ₂-C ₂₄伸烯基、C ₁-C ₂₄伸雜烷基或C ₂-C ₂₄伸雜烯基；且當X為N，且Y不存在時，G ³為C ₁-C ₂₄伸雜烷基或C ₂-C ₂₄伸雜烯基； R ^a、R ^b、R ^d及R ^e各自獨立地為H或C ₁-C ₁₂烷基或C ₁-C ₁₂烯基； R ^c及R ^f各自獨立地為C ₁-C ₁₂烷基或C ₂-C ₁₂烯基；每一R獨立地為H或C ₁-C ₁₂烷基； R ¹、R ²及R ³各自獨立地為C ₁-C ₂₄烷基或C ₂-C ₂₄烯基；且x為0、1或2，且除非另外指定，否則其中每一烷基、烯基、伸烷基、伸烯基、伸雜烷基及伸雜烯基獨立地經取代或未經取代。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含具有如下結構之脂質：

(VII-L)，或其醫藥學上可接受之鹽、互變異構物、前藥或立體異構物，其中： L ¹及L ²各自獨立地為-O(C=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)-、-O-、-S(O)x- _s-S-S-、-C(=O)S-、-SC(=O)-、-NR ^aC(=O)-、-C(=O)NR ^a-、-NR ^aC(=O)NR ^a-、-OC(=O)NR ^a-、-NR ^aC(=O)O-或直接鍵； G ¹為C,-C ₂伸烷基、-(C=O)-、-O(C=O)-、-SC(=O)-、-NR ^aC(=O)-或直接鍵； G ²為-C(O)-、-(CO)O-、-C(=O)S-、-C(=O)NR ^a-或直接鍵； G ³為C ₁-C ₆伸烷基； R ^a為H或C ₁-C ₁₂烷基； R ^1a及R ^1b在每次出現時獨立地為：(a) H或C ₁-C ₁₂烷基；或(b) R ^1a為H或C ₁-C ₁₂烷基，且R ^1b與其所結合之碳原子一起連同毗鄰R ^1b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵； R ^2a及R ^2b在每次出現時獨立地為：(a) H或C ₁-C ₁₂烷基；或(b) R ^2a為H或C ₁-C ₁₂烷基，且R ^2b與其所結合之碳原子一起連同毗鄰R ^2b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵； R ^3a及R ^3b在每次出現時獨立地為：(a) H或C ₁-C ₁₂烷基；或(b) R ^3a為H或C ₁-C ₁₂烷基，且R ^3b與其所結合之碳原子一起連同毗鄰R及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵； R ^4A及R ^4B在每次出現時獨立地為：(a) H或C ₁-C ₁₂烷基；或(b) R ^4A為H或C ₁-C ₁₂烷基，且R ^4B與其所結合之碳原子一起連同毗鄰R ^4B及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵； R ⁵及R ⁶各自獨立地為H或甲基； R ⁷為H或C,-C ₂₀烷基； R ⁸為OH、-N(R ⁹)(C=O)R ¹⁰、-(C=O)NR ⁹R ¹⁰、-NR ⁹R ¹⁰、-(C=O)OR" ¹或-O(C=O)R"，前提係當R ⁸為-NR ⁹R ¹⁰時，G ³為C ₄-C ₆伸烷基， R ⁹及R ¹⁰各自獨立地為H或C ₁-C ₁₂烷基； R"為芳烷基； a、b、c及d各自獨立地為1至24之整數；且x為0、1或2，其中每一烷基、伸烷基及芳烷基視情況經取代。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含具有如下結構之脂質：

(VIII-L)，或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物，其中： X及X'各自獨立地為N或CR； Y及Y'各自獨立地為不存在、-O(C=O)-、-(C=O)O-或NR，前提係： a) 當X為N時，Y不存在； b) 當X'為N時，Y'不存在； c) 當X為CR時，Y為-O(C=O)-、-(C=O)O-或NR；且 d) 當X'為CR時，Y'為-O(C=O)-、-(C=O)O-或NR， L ¹及L ^1'各自獨立地為-O(C=O)R'、-(C=O)OR'、-C(=O)R'、-OR ¹、-S(O) _zR'、-S-SR ¹、-C(=O)SR'、-SC(=O)R'、-NR ^aC(=O)R'、-C(=O)NR ^bR ^c、-NR ^aC(=O)NR ^bR ^c、-OC(=O)NR ^bR ^c或-NR ^aC(=O)OR'； L ²及L ^2’各自獨立地為-O(C=O)R ²、-(C=O)OR ²、-C(=O)R ²、-OR ²、-S(O) _zR ²、-S-SR ²、-C(=O)SR ²、-SC(=O)R ²、-NR ^dC(=O)R ²、-C(=O)NR ^eR ^f、-NR ^dC(=O)NR ^eR ^f、-OC(=O)NR ^eR ^f；-NR ^dC(=O)OR ²或與R ²之直接鍵； G ¹、G ^1’、G ²及G ^2’各自獨立地為C ₂-C ₁₂伸烷基或C ₂-C ₁₂伸烯基； G為C ₂-C ₂₄伸雜烷基或C ₂-C ₂₄伸雜烯基； R ^a、R ^b、R ^d及R ^e在每次出現時獨立地為H、C ₁-C ₁₂烷基或C ₂-C ₁₂烯基； R ^c及R ^f在每次出現時獨立地為C ₁-C ₁₂烷基或C ₂-C ₁₂烯基； R在每次出現時獨立地為H或C ₁-C ₁₂烷基； R ¹及R ²在每次出現時獨立地為具支鏈C ₆-C ₂₄烷基或具支鏈C ₆-C ₂₄烯基； z為0、1或2，且除非另外指定，否則其中每一烷基、烯基、伸烷基、伸烯基、伸雜烷基及伸雜烯基獨立地經取代或未經取代。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含具有如下結構之脂質：

(IX-L)，或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物，其中： L ¹為-O(C=O)R ¹、-(C=O)OR ¹、-C(=O)R ¹、-OR ¹、-S(O) _xR ¹、-S-SR ¹、-C(=O)SR ¹、-SC(=O)R ¹、-NR ^aC(=O)R ¹、-C(=O)NR ^bR ^c、-NR ^aC(=O)NR ^bR ^c、-OC(=O)NR ^bR ^c或-NR ^aC(=O)OR ¹； L ²為-O(C=O)R ²、-(C=O)OR ²、-C(=O)R ²、-OR ²、-S(O) _xR ²、-S-SR ²、-C(=O)SR ²、-SC(=O)R ²、-NR ^dC(=O)R ²、-C(=O)NR ^eR ^f、-NR ^dC(=O)NR ^eR ^f、-OC(=O)NR ^eR ^f；-NR ^dC(=O)OR ²或與R ²之直接鍵； G ¹及G ²各自獨立地為C ₂-C ₁₂伸烷基或C ₂-C ₁₂伸烯基； G ³為C ₁-C ₂₄伸烷基、C ₂-C ₂₄伸烯基、C ₃-C ₈伸環烷基或C ₃-C ₈伸環烯基； R ^a、R ^b、R ^d及R ^e各自獨立地為H或C ₁-C ₁₂烷基或C ₁-C ₁₂烯基； R ^c及R ^f各自獨立地為C ₁-C ₁₂烷基或C ₂-C ₁₂烯基； R ¹及R ²各自獨立地為具支鏈C ₆-C ₂₄烷基或具支鏈C ₆-C ₂₄烯基； R ³為-N(R ⁴)R ⁵； R ⁴為C ₁-C ₁₂烷基； R ⁵為經取代之C ₁-C ₁₂烷基；且 x為0、1或2，且除非另外指定，否則其中每一烷基、烯基、伸烷基、伸烯基、伸環烷基、伸環烯基、芳基及芳烷基獨立地經取代或未經取代。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含具有如下結構之脂質：

(Xa-L)或

(Xb-L)，或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物，其中： L ¹為-O(C=O)R ¹、-(C=O)OR ¹、-C(=O)R ¹、-OR ¹、-S(O) _xR ¹、-S-SR ¹、-C(=O)SR ¹、-SC(=O)R ¹、-NR ^aC(=O)R ¹、-C(=O)NR ^bR ^c、-NR ^aC(=O)NR ^bR ^c、-OC(=O)NR ^bR ^c或-NR ^aC(=O)OR ¹； L ²為-O(C=O)R ²、-(C=O)OR ²、-C(=O)R ²、-OR ²、-S(O) _xR ²、-S-SR ²、-C(=O)SR ²、-SC(=O)R ²、-NR ^dC(=O)R ²、-C(=O)NR ^eR ^f、-NR ^dC(=O)NR ^eR ^f、-OC(=O)NR ^eR ^f；-NR ^dC(=O)OR ²或與R ²之直接鍵； G ^1a及G ^2b各自獨立地為C ₂-C ₁₂伸烷基或C ₂-C ₁₂伸烯基； G ^1b及G ^2b各自獨立地為C ₁-C ₁₂伸烷基或C ₂-C ₁₂伸烯基； G ³為C ₁-C ₂₄伸烷基、C ₂-C ₂₄伸烯基、C ₃-C ₈伸環烷基或C ₃-C ₈伸環烯基； R ^a、R ^b、R ^d及R ^e各自獨立地為H或C ₁-C ₁₂烷基或C ₂-C ₁₂烯基； R ^c及R ^f各自獨立地為C ₁-C ₁₂烷基或C ₂-C ₁₂烯基； R ¹及R ²各自獨立地為具支鏈C ₆-C ₂₄烷基或具支鏈C ₆-C ₂₄烯基； R ^3a為-C(=O)N(R ^4a)R ^5a或-C(=O)OR ⁶； R ^3b為-NR ^4bC(=O)R ^5b； R ^4a為C ₁-C ₁₂烷基； R ^4b為H、C ₁-C ₁₂烷基或C ₂-C ₁₂烯基； R ^5a為H、C ₁-C ₈烷基或C ₂-C ₈烯基；當R ^4b為H時，R ^5b為C ₂-C ₁₂烷基或C ₂-C ₁₂烯基；或當R ^4b為C ₁-C ₁₂烷基或C ₂-C ₁₂烯基時，R ^5b為C ₁-C ₁₂烷基或C ₂-C ₁₂烯基； R ⁶為H、芳基或芳烷基；且 x為0、1或2，且其中每一烷基、烯基、伸烷基、伸烯基、伸環烷基、伸環烯基、芳基及芳烷基獨立地經取代或未經取代。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含具有如下結構之脂質：

(XI-L)，或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物，其中： G ¹為-OH、-R ³R ⁴、-(C=O)R ⁵或-R ³(C=O)R ⁵； G ²為-CH ₂-或-(C=O)-； R在每次出現時獨立地為H或OH； R ¹及R ²各自獨立地為視情況經取代之具支鏈飽和或不飽和C ₁₂-C ₃₆烷基； R ³及R ⁴各自獨立地為H或視情況經取代之直鏈或具支鏈飽和或不飽和C ₁-C ₆烷基； R ⁵為視情況經取代之直鏈或具支鏈飽和或不飽和C ₁-C ₆烷基；且 n為2至6之整數。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含具有如下結構之脂質：

(XII-L)，或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物，其中： G ¹或G ²中之一者在每次出現時為-O(C=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)-、-O-、-S(O)、-S-S-、-C(=O)S-、SC(=O)-、-N(R ^a)C(=O)-、-C(=O)N(R ^a)-、-N(R ^a)C(=O)N(R ^a)-、-OC(=O)N(R ^a)-或-N(R ^a)C(=O)O-，且G ¹或G ²中之另一者在每次出現時為-O(C=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)-、-O-、-S(O)、-S-S-、-C(=O)S-、-SC(=O)-、-N(R ^a)C(=O)-、-C(=O)N(R ^a)-、-N(R ^a)C(=O)N(R ^a)-、-OC(=O)N(R ^a)-或-N(R ^a)C(=O)O-或直接鍵； L在每次出現時為~O(C=O)-，其中~表示與X之共價鍵；X為CR ^a；當n為1時，Z為烷基、環烷基或包含至少一個極性官能基之單價部分；或當n大於1時，Z為伸烷基、伸環烷基或包含至少一個極性官能基之多價部分； R ^a在每次出現時獨立地為H、C ₁-C ₁₂烷基、C ₁-C ₁₂羥基烷基、C ₁-C ₁₂胺基烷基、C ₁-C ₁₂烷基胺基烷基、C ₁-C ₁₂烷氧基烷基、C ₁-C ₁₂烷氧基羰基、C ₁-C ₁₂烷基羰基氧基、C ₁-C ₁₂烷基羰基氧基烷基或C ₁-C ₁₂烷基羰基； R在每次出現時獨立地為：(a) H或C ₁-C ₁₂烷基；或(b) R與其所結合之碳原子一起連同毗鄰R及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵； R ¹及R ²在每次出現時分別具有以下結構：

a ¹及a ²在每次出現時獨立地為3至12之整數；b ¹及b ²在每次出現時獨立地為0或1； c ¹及c ²在每次出現時獨立地為5至10之整數；d ¹及d ²在每次出現時獨立地為5至10之整數；y在每次出現時獨立地為0至2之整數；且n為1至6之整數，其中每一烷基、伸烷基、羥基烷基、胺基烷基、烷基胺基烷基、烷氧基烷基、烷氧基羰基、烷基羰基氧基、烷基羰基氧基烷基及烷基羰基視情況經一或多個取代基取代。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含具有如下結構之脂質：

(XIII-L)，或其醫藥學上可接受之鹽、前藥或立體異構物，其中： L ¹或L ²中之一者為-O(C=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)-、-O-、-S(O) _x-、-S-S-、-C(=O)S-、-SC(=O)-、-R ^aC(=O)-、-C(=O)R ^a-、R ^aC(=O)R ^a-、-OC(=O)R ^a-或-R ^aC(=O)O-，且L ¹或L ²中之另一者為-O(C=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)-、-O-、-S(O) _x-、-S-S-、-C(=O)S-、SC(=O)-、-R ^aC(=O)-、-C(=O)R ^a-、R ^aC(=O)R ^a-、-OC(=O)R ^a-或-NR ^aC(=O)O-或直接鍵； G ¹及G ²各自獨立地為未經取代之C ₁-C ₁₂伸烷基或C ₁-C ₁₂伸烯基； G ³為C ₁-C ₂₄伸烷基、C ₁-C ₂₄伸烯基、C ₃-C ₈伸環烷基、C ₃-C ₈伸環烯基； R ^a為H或C ₁-C ₁₂烷基； R ¹及R ²各自獨立地為C ₆-C ₂₄烷基或C ₆-C ₂₄烯基； R ³為H、OR ⁵、CN、-C(=O)OR ⁴、-OC(=O)R ⁴或-R ⁵C(=O)R ⁴； R ⁴為C ₁-C ₁₂烷基； R ⁵為H或C ₁-C ₆烷基；且 x為0、1或2。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含具有如下結構之脂質：

(XIV-L)，或其醫藥學上可接受之鹽、互變異構物、前藥或立體異構物，其中： L ¹及L ²各自獨立地為-O(C=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)-、-O-、-S(O) _x-、-S-S-、-C(=O)S-、-SC(=O)-、-R ^aC(=O)-、-C(=O)R ^a-、-R ^aC(=O)R ^a-、-OC(=O)R ^a-、-R ^aC(=O)O-或直接鍵； G ¹為C1-C ₂伸烷基、-(C=O)-、-O(C=O)-、-SC(=O)-、-R ^aC(=O)-或直接鍵； G ²為-C(=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)S-、-C(=O)NR ^a-或直接鍵； G ³為C ₁-C ₆伸烷基； R ^a為H或C ₁-C ₁₂烷基； R ^1a及R ^1b在每次出現時獨立地為：(a) H或C ₁-C ₁₂烷基；或(b) R ^1a為H或C ₁-C ₁₂烷基，且R ^1b與其所結合之碳原子一起連同毗鄰R ^1b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵； R ^2a及R ^2b在每次出現時獨立地為：(a) H或C ₁-C ₁₂烷基；或(b) R ^2a為H或C ₁-C ₁₂烷基，且R ^2b與其所結合之碳原子一起連同毗鄰R ^2b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵； R ^3a及R ^3b在每次出現時獨立地為：(a) H或C ₁-C ₁₂烷基；或(b) R ^3a為H或C ₁-C ₁₂烷基，且R ^3b與其所結合之碳原子一起連同毗鄰R及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵； R ^4a及R ^4b在每次出現時獨立地為：(a) H或C ₁-C ₁₂烷基；或(b) R ^4a為H或C ₁-C ₁₂烷基，且R ^4b與其所結合之碳原子一起連同毗鄰R ^4b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵； R ⁵及R ⁶各自獨立地為H或甲基； R ⁷為C ₄-C ₂₀烷基； R ⁸及R ⁹各自獨立地為C ₁-C ₁₂烷基；或R ⁸及R ⁹與其所連接之氮原子一起形成5員、6員或7員雜環； a、b、c及d各自獨立地為1至24之整數；且x為0、1或2。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含具有如下結構之脂質：

(XV-L)，或其醫藥學上可接受之鹽、互變異構物、前藥或立體異構物，其中： L ¹及L ²各自獨立地為-O(C=O)-、-(C=O)O-或碳-碳雙鍵； R ^1a及R ^1b在每次出現時獨立地為(a) H或C ₁-C ₁₂烷基，或(b) R ^1a為H或C ₁-C ₁₂烷基，且R ^1b與其所結合之碳原子一起連同毗鄰R ^1b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵； R ^2a及R ^2b在每次出現時獨立地為(a) H或C ₁-C ₁₂烷基，或(b) R ^2a為H或C ₁-C ₁₂烷基，且R ^2b與其所結合之碳原子一起連同毗鄰R ^2b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵； R ^3a及R ^3b在每次出現時獨立地為(a) H或C ₁-C ₁₂烷基，或(b) R ^3a為H或C ₁-C ₁₂烷基，且R ^3b與其所結合之碳原子一起連同毗鄰R ^3b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵； R ^4a及R ^4b在每次出現時獨立地為(a) H或C ₁-C ₁₂烷基，或(b) R ^4a為H或C ₁-C ₁₂烷基，且R ^4b與其所結合之碳原子一起連同毗鄰R ^4b及其所結合之碳原子一起形成碳-碳雙鍵； R ⁵及R ⁶各自獨立地為甲基或環烷基； R ⁷在每次出現時獨立地為H或C ₁-C ₁₂烷基；R ⁸及R ⁹各自獨立地為未經取代之C ₁-C ₁₂烷基；或R ⁸及R ⁹與其所連接之氮原子一起形成包含一個氮原子之5員、6員或7員雜環； a及d各自獨立地為0至24之整數；b及c各自獨立地為1至24之整數；且e為1或2，前提係： R ^1a、R ^2a、R ^3a或R ^4a中之至少一者為C ₁-C ₁₂烷基，或L ¹或L ²中之至少一者為-O(C=O)-或-(C=O)O-；且 R ^1a及R ^1b在a為6時不為異丙基，或在a為8時不為正丁基。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含具有如下結構之脂質：

(XVI-L)，或其醫藥學上可接受之鹽，其中 R ₁與R ₂相同或不同，各自為具有1-9個碳之直鏈或具支鏈烷基，或為具有2至11個碳原子之烯基或炔基， L ₁與L ₂相同或不同，各自為具有5至18個碳原子之直鏈烷基，或與N形成雜環， X ₁為鍵，或為-CG-G-，藉此形成L ₂-CO-O-R ₂， X ₂為S或O， L ₃為鍵或低碳數烷基，或與N形成雜環， R ₃為低碳數烷基，且 R ₄與R ₅相同或不同，各自為低碳數烷基。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含具有如下結構之可電離脂質：

(XVII-L)，或其醫藥學上可接受之鹽。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含具有如下結構之脂質：

(XVIII-L)，或其醫藥學上可接受之鹽。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含具有如下結構之脂質：

(XIX-L)，或其醫藥學上可接受之鹽。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含具有如下結構之脂質：

(XX-L)，或其醫藥學上可接受之鹽。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含具有如下結構之脂質：

(XXI-L)，或其醫藥學上可接受之鹽。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含具有如下結構之脂質：

(XXII-L)，或其醫藥學上可接受之鹽。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含具有如下結構之脂質：

(XXIII-L)，或其醫藥學上可接受之鹽。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含具有如下結構之脂質：

(XXIV-L)，或其醫藥學上可接受之鹽。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含具有如下結構之脂質：

(XXV-L)，或其醫藥學上可接受之鹽。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含具有如下結構之脂質：

(XXVI-L)，或其醫藥學上可接受之鹽。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含具有如下結構之脂質：

(XXVII-L)，或其醫藥學上可接受之鹽。 非陽離子脂質

在某些實施例中，本文所闡述之脂質奈米粒子包含一或多種非陽離子脂質。非陽離子脂質可為磷脂。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含5 mol%-25 mol%之非陽離子脂質。舉例而言，脂質奈米粒子可包含5 mol%-20 mol%、5 mol%-15 mol%、5 mol%-10 mol%、10 mol%-25 mol%、10 mol%-20 mol%、10 mol%-25 mol%、15 mol%-25 mol%、15 mol%-20 mol%或20 mol%-25 mol%之非陽離子脂質。在一些實施例中，脂質奈米粒子包含5 mol%、10 mol%、15 mol%、20 mol%或25 mol%之非陽離子脂質。

在一些實施例中，本揭示案之非陽離子脂質包含1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1,2-二油醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二亞油醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DLPC)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油基-磷酸膽鹼(DMPC)、1,2-二油醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DOPC)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DPPC)、1,2-二-十一醯基-sn-甘油基-磷酸膽鹼(DUPC)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(18:0二醚PC)、1-油醯基-2膽固醇基半琥珀醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(C16 Lyso PC)、1,2-二亞麻醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼、1,2-二花生四烯醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼、1,2-二-二十二碳六烯醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼、1,2-二植烷醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0 PE)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亞油醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亞麻醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二-二十二碳六烯醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油醯基-sn-甘油基-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)鈉鹽(DOPG)、鞘磷脂或其混合物。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含5 mol%-15 mol%、5 mol%-10 mol%或10 mol%-15 mol%之DSPC。舉例而言，脂質奈米粒子可包含5 mol%、6 mol%、7 mol%、8 mol%、9 mol%、10 mol%、11 mol%、12 mol%、13 mol%、14 mol%或15 mol%之DSPC。

在某些實施例中，本文所揭示之脂質奈米粒子組合物之脂質組成可包含一或多種磷脂，例如一或多種飽和或(聚)不飽和磷脂或其組合。一般而言，磷脂包含磷脂部分及一或多種脂肪酸部分。

磷脂部分可選自(例如)由以下組成之非限制性群：磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯甘油、磷脂醯絲胺酸、磷脂酸、2-溶血磷脂醯膽鹼及鞘磷脂。

脂肪酸部分可選自(例如)由以下組成之非限制性群：月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻油酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、α-亞麻酸、芥子酸、植烷酸、花生酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、山崳酸、二十二碳五烯酸及二十二碳六烯酸。

特定磷脂可促進與膜之融合。舉例而言，陽離子磷脂可與膜(例如細胞膜或細胞內膜)之一或多種帶負電荷之磷脂相互作用。磷脂與膜之融合可容許含脂質組合物(例如LNP)之一或多種元件(例如治療劑)穿過膜，從而允許例如將一或多種元件遞送至靶組織。

亦考慮非天然磷脂種類，包括具有包括分支、氧化、環化及炔烴在內之修飾及取代之天然種類。舉例而言，磷脂可經一或多種炔烴(例如一或多個雙鍵經三鍵置換之烯基)官能化或與其交聯。在適當反應條件下，炔基可在暴露於疊氮化物時經歷銅催化之環加成。此等反應可用於官能化奈米粒子組合物之脂質雙層以有助於膜滲透或細胞識別，或可用於使奈米粒子組合物與諸如靶向或成像部分(例如染料)等可用組分結合。

磷脂包括(但不限於)甘油磷脂，諸如磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯肌醇、磷脂醯甘油及磷脂酸。磷脂亦包括磷酸鞘脂，諸如鞘磷脂。

在一些實施例中，磷脂包含1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DSPC)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二油醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二亞油醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DLPC)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油基-磷酸膽鹼(DMPC)、1,2-二油醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DOPC)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DPPC)、1,2-二-十一醯基-sn-甘油基-磷酸膽鹼(DUPC)、1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(18:0二醚PC)、1-油醯基-2膽固醇基半琥珀醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(C16 Lyso PC)、1,2-二亞麻醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼、1,2-二花生四烯醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼、1,2-二-二十二碳六烯醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼、1,2-二植烷醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0 PE)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亞油醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亞麻醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二-二十二碳六烯醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油醯基-sn-甘油基-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)鈉鹽(DOPG)、鞘磷脂或其混合物。

在某些實施例中，磷脂為DSPC之類似物或變異體。在某些實施例中，磷脂為式(IX)化合物：

(IX)，或其鹽，其中：每一R ¹獨立地為視情況經取代之烷基；或視情況兩個R ¹與插入原子一起接合形成視情況經取代之單環碳環基或視情況經取代之單環雜環基；或視情況三個R ¹與插入原子一起接合形成視情況經取代之二環碳環基或視情況經取代之二環雜環基； n為1、2、3、4、5、6、7、8、9或10； m為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10； A具有式：

或

； L ²之每一情況獨立地為鍵或視情況經取代之C _1-6伸烷基，其中視情況經取代之C _1-6伸烷基之一個亞甲基單元視情況經以下置換：-O-、-N(R ^N)-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(R ^N)-、-NR ^NC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(R ^N)-、-NR ^NC(O)O-或-NR ^NC(O)N(R ^N)-； R ²之每一情況獨立地為視情況經取代之C _1-30烷基、視情況經取代之C _1-30烯基或視情況經取代之C _1-30炔基；視情況其中R ²之一或多個亞甲基單元獨立地經以下置換：視情況經取代之伸碳環基、視情況經取代之伸雜環基、視情況經取代之伸芳基、視情況經取代之伸雜芳基、-N(R ^N)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(R ^N)-、-NR ^NC(O)-、-NR ^NC(O)N(R ^N)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(R ^N)-、-NR ^NC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(=NR ^N)-、-C(=NR ^N)N(R ^N)-、-NR ^NC(=NR ^N)-、-NR ^NC(=NR ^N)N(R ^N)-、-C(S)-、-C(S)N(R ^N)-、-NR ^NC(S)-、-NR ^NC(S)N(R ^N)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O) ₂-、-S(O) ₂O-、-OS(O) ₂O-、-N(R ^N)S(O)-、-S(O)N(R ^N)-、-N(R ^N)S(O)N(R ^N)-、-OS(O)N(R ^N)-、-N(R ^N)S(O)O-、-S(O) ₂-、-N(R ^N)S(O) ₂-、-S(O) ₂N(R ^N)-、-N(R ^N)S(O) ₂N(R ^N)-、-OS(O) ₂N(R ^N)-或-N(R ^N)S(O) ₂O-； R ^N之每一情況獨立地為氫、視情況經取代之烷基或氮保護基團；環B為視情況經取代之碳環基、視情況經取代之雜環基、視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基；且 p為1或2；條件係該化合物不具有下式：

，其中R ²之每一情況獨立地為未經取代之烷基、未經取代之烯基或未經取代之炔基。

在一些實施例中，磷脂可為PCT申請案第PCT/US2018/037922號中所闡述之磷脂中之一或多者。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含相對於其他脂質組分莫耳比為5%-25%之非陽離子脂質。舉例而言，脂質奈米粒子可包含莫耳比為5%-30%、5%-15%、5%-10%、10%-25%、10%-20%、10%-25%、15%-25%、15%-20%、20%-25%或25%-30%之非陽離子脂質。在一些實施例中，脂質奈米粒子包含莫耳比為5%、10%、15%、20%、25%或30%之非陽離子脂質。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含相對於其他脂質組分莫耳比為5%-25%之磷脂。舉例而言，脂質奈米粒子可包含莫耳比為5%-30%、5%-15%、5%-10%、10%-25%、10%-20%、10%-25%、15%-25%、15%-20%、20%-25%或25%-30%之磷脂。在一些實施例中，脂質奈米粒子包含莫耳比為5%、10%、15%、20%、25%或30%之磷脂脂質。 結構脂質

本文所揭示之醫藥組合物之脂質組成可包含一或多種結構脂質。如本文所用，術語「結構脂質」包括固醇且亦包括含有固醇部分之脂質。

將結構脂質併入脂質奈米粒子中可有助於減輕粒子中其他脂質之聚集。結構脂質可選自包括(但不限於)以下之群：膽固醇、糞固醇、麥固醇、麥角固醇、菜油固醇、豆固醇、蕓苔固醇、番茄鹼、番茄苷、熊果酸、α-生育酚、類藿烷、植固醇、類固醇及其混合物。在一些實施例中，結構脂質為固醇。如本文所定義，「固醇」係由類固醇組成之類固醇子群。在某些實施例中，結構脂質為類固醇。在某些實施例中，結構脂質為膽固醇。在某些實施例中，結構脂質為膽固醇之類似物。在某些實施例中，結構脂質為α-生育酚。

在一些實施例中，結構脂質可為美國申請案第16/493,814號中所闡述之結構脂質中之一或多者。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含相對於其他脂質組分莫耳比為25%-55%之結構脂質。舉例而言，脂質奈米粒子可包含莫耳比為10%-55%、25%-50%、25%-45%、25%-40%、25%-35%、25%-30%、30%-55%、30%-50%、30%-45%、30%-40%、30%-35%、35%-55%、35%-50%、35%-45%、35%-40%、40%-55%、40%-50%、40%-45%、45%-55%、45%-50%或50%-55%之結構脂質。在一些實施例中，脂質奈米粒子包含莫耳比為10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或55%之結構脂質。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含30 mol%-45 mol%之固醇，視情況35 mol%-40 mol%，例如30 mol%-31 mol%、31 mol%-32 mol%、32 mol%-33 mol%、33 mol%-34 mol%、34 mol%-35 mol%、35 mol%-36 mol%、36 mol%-37 mol%、37 mol%-38 mol%、38 mol%-39 mol%或39 mol%-40 mol%。在一些實施例中，脂質奈米粒子包含25 mol%-55 mol%之固醇。舉例而言，脂質奈米粒子可包含25 mol%-50 mol%、25 mol%-45 mol%、25 mol%-40 mol%、25 mol%-35 mol%、25 mol%-30 mol%、30 mol%-55 mol%、30 mol%-50 mol%、30 mol%-45 mol%、30 mol%-40 mol%、30 mol%-35 mol%、35 mol%-55 mol%、35 mol%-50 mol%、35 mol%-45 mol%、35 mol%-40 mol%、40 mol%-55 mol%、40 mol%-50 mol%、40 mol%-45 mol%、45 mol%-55 mol%、45 mol%-50 mol%或50 mol%-55 mol%之固醇。在一些實施例中，脂質奈米粒子包含25 mol%、30 mol%、35 mol%、40 mol%、45 mol%、50 mol%或55 mol%之固醇。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含35 mol%-40 mol%之膽固醇。舉例而言，脂質奈米粒子可包含35 mol%、35.5 mol%、36 mol%、36.5 mol%、37 mol%、37.5 mol%、38 mol%、38.5 mol%、39 mol%、39.5 mol%或40 mol%之膽固醇。 聚乙二醇 (PEG)- 脂質

本文所揭示之醫藥組合物之脂質組成可包含一或多種聚乙二醇(PEG)脂質。

如本文所用，術語「PEG-脂質」或「PEG修飾之脂質」係指聚乙二醇(PEG)修飾之脂質。PEG-脂質之非限制性實例包括PEG修飾之磷脂醯乙醇胺及磷脂酸、PEG-神經醯胺結合物(例如PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG修飾之二烷基胺及PEG修飾之1,2-二醯氧基丙-3-胺。此等脂質亦稱為聚乙二醇化脂質。舉例而言，PEG脂質可為PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂質。

在一些實施例中，PEG-脂質包括(但不限於) 1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[胺基(聚乙二醇)] (PEG-DSPE)、PEG-二硬脂基甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕櫚油基、PEG-二油基、PEG-二硬脂基、PEG-二醯基甘油醯胺(PEG-DAG)、PEG-二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺(PEG-DPPE)或PEG-1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。

在一些實施例中，PEG-脂質選自由以下組成之群：PEG修飾之磷脂醯乙醇胺、PEG修飾之磷脂酸、PEG修飾之神經醯胺、PEG修飾之二烷基胺、PEG修飾之二醯基甘油、PEG修飾之二烷基甘油及其混合物。在一些實施例中，PEG修飾之脂質為PEG-DMG、PEG-c-DOMG (亦稱為PEG-DOMG)、PEG-DSG及/或PEG-DPG。

在一些實施例中，PEG-脂質之脂質部分包括長度為約C ₁₄至約C ₂₂、較佳約C ₁₄至約C ₁₆之彼等脂質部分。在一些實施例中，PEG部分(例如mPEG-NH ₂)之大小為約1000、2000、5000、10,000、15,000或20,000道耳頓。在一些實施例中，PEG-脂質為PEG _2k-DMG。

在一些實施例中，本文所闡述之脂質奈米粒子可包含PEG脂質，其為不可擴散PEG。不可擴散PEG之非限制性實例包括PEG-DSG及PEG-DSPE。

PEG-脂質為此項技術中所已知，諸如美國專利第8158601號及國際公開案第WO 2015/130584 A2號中所闡述之彼等PEG-脂質，該等案件係以全文引用的方式併入本文中。

一般而言，本文所闡述之各式之一些其他脂質組分(例如PEG脂質)可如國際專利申請案第PCT/US2016/000129號中所闡述來合成，該國際專利申請案於2016年12月10日提出申請，標題為「治療劑之組合物及遞送方法(Compositions and Methods for Delivery of Therapeutic Agents)」，其係以全文引用的方式併入。

脂質奈米粒子組合物之脂質組分可包括一或多種包含聚乙二醇之分子，諸如PEG或PEG修飾之脂質。此等物質可替代地稱為聚乙二醇化脂質。PEG脂質係經聚乙二醇修飾之脂質。PEG脂質可選自包括以下之非限制性群：PEG修飾之磷脂醯乙醇胺、PEG修飾之磷脂酸、PEG修飾之神經醯胺、PEG修飾之二烷基胺、PEG修飾之二醯基甘油、PEG修飾之二烷基甘油及其混合物。舉例而言，PEG脂質可為PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂質。

在一些實施例中，PEG修飾之脂質為PEG DMG之經修飾形式。PEG-DMG具有以下結構：

在一些實施例中，PEG脂質可為國際公開案第WO2012099755號中所闡述之聚乙二醇化脂質，該國際公開案之內容係以全文引用的方式併入本文中。本文所闡述之該等例示性PEG脂質中之任一者均可經修飾以在PEG鏈上包含羥基。在某些實施例中，PEG脂質為PEG-OH脂質。如本文所一般定義，「PEG-OH脂質」(在本文中亦稱為「羥基-聚乙二醇化脂質」)係在脂質上具有一或多個羥基(-OH)之聚乙二醇化脂質。在某些實施例中，PEG-OH脂質在PEG鏈上包括一或多個羥基。在某些實施例中，PEG-OH或羥基-聚乙二醇化脂質在PEG鏈之末端包含-OH基團。每一可能性代表單獨實施例。

在某些實施例中，PEG脂質為式(X)化合物：

(X)，或其鹽，其中： R ³為-OR ^O； R ^O為氫、視情況經取代之烷基或氧保護基團； r為介於1與100之間的整數，包括端值； L ¹為視情況經取代之C _1-10伸烷基，其中該視情況經取代之C _1-10伸烷基之至少一個亞甲基獨立地經以下置換：視情況經取代之伸碳環基、視情況經取代之伸雜環基、視情況經取代之伸芳基、視情況經取代之伸雜芳基、-O-、-N(R ^N)-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(R ^N)-、-NR ^NC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(R ^N)-、-NR ^NC(O)O-或-NR ^NC(O)N(R ^N)-； D為藉由點擊化學獲得之部分或在生理條件下可裂解之部分； m為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10； A具有式：

或

； L ²之每一情況獨立地為鍵或視情況經取代之C _1-6伸烷基，其中視情況經取代之C _1-6伸烷基之一個亞甲基單元視情況經以下置換：-O-、-N(R ^N)-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(R ^N)-、-NR ^NC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(R ^N)-、-NR ^NC(O)O-或-NR ^NC(O)N(R ^N)-； R ²之每一情況獨立地為視情況經取代之C _1-30烷基、視情況經取代之C _1-30烯基或視情況經取代之C _1-30炔基；視情況其中R ²之一或多個亞甲基單元獨立地經以下置換：視情況經取代之伸碳環基、視情況經取代之伸雜環基、視情況經取代之伸芳基、視情況經取代之伸雜芳基、-N(R ^N)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(R ^N)-、-NR ^NC(O)-、-NR ^NC(O)N(R ^N)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(R ^N)-、-NR ^NC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(=NR ^N)-、-C(=NR ^N)N(R ^N)-、-NR ^NC(=NR ^N)-、-NR ^NC(=NR ^N)N(R ^N)-、-C(S)-、-C(S)N(R ^N)-、-NR ^NC(S)-、-NR ^NC(S)N(R ^N)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O) ₂-、-S(O) ₂O-、-OS(O) ₂O-、-N(R ^N)S(O)-、-S(O)N(R ^N)-、-N(R ^N)S(O)N(R ^N)-、-OS(O)N(R ^N)-、-N(R ^N)S(O)O-、-S(O) ₂-、-N(R ^N)S(O) ₂-、-S(O) ₂N(R ^N)-、-N(R ^N)S(O) ₂N(R ^N)-、-OS(O) ₂N(R ^N)-或-N(R ^N)S(O) ₂O-； R ^N之每一情況獨立地為氫、視情況經取代之烷基或氮保護基團；環B為視情況經取代之碳環基、視情況經取代之雜環基、視情況經取代之芳基或視情況經取代之雜芳基；且 p為1或2。

在某些實施例中，式(X)化合物為PEG-OH脂質(亦即R ³為-OR ^O且R ^O為氫)。在某些實施例中，式(X)化合物為式(X-OH)化合物：

(X-OH)，或其鹽。

在某些實施例中，PEG脂質為聚乙二醇化脂肪酸。在某些實施例中，PEG脂質為式(XI)化合物。本文提供式(XI)化合物：

(XI)，或其鹽，其中： R ³為-OR ^O； R ^O為氫、視情況經取代之烷基或氧保護基團； r為介於1與100之間的整數，包括端值； R ⁵為視情況經取代之C _10-40烷基、視情況經取代之C _10-40烯基或視情況經取代之C _10-40炔基；且視情況R ⁵之一或多個亞甲基經以下置換：視情況經取代之伸碳環基、視情況經取代之伸雜環基、視情況經取代之伸芳基、視情況經取代之伸雜芳基、-N(R ^N)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(R ^N)-、-NR ^NC(O)-、-NR ^NC(O)N(R ^N)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(R ^N)-、-NR ^NC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(=NR ^N)-、-C(=NR ^N)N(R ^N)-、-NR ^NC(=NR ^N)-、-NR ^NC(=NR ^N)N(R ^N)-、-C(S)-、-C(S)N(R ^N)-、-NR ^NC(S)-、-NR ^NC(S)N(R ^N)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O) ₂-、-S(O) ₂O-、-OS(O) ₂O-、-N(R ^N)S(O)-、-S(O)N(R ^N)-、-N(R ^N)S(O)N(R ^N)-、-OS(O)N(R ^N)-、-N(R ^N)S(O)O-、-S(O) ₂-、-N(R ^N)S(O) ₂-、-S(O) ₂N(R ^N)-、-N(R ^N)S(O) ₂N(R ^N)-、-OS(O) ₂N(R ^N)-或-N(R ^N)S(O) ₂O-；且 R ^N之每一情況獨立地為氫、視情況經取代之烷基或氮保護基團。

在某些實施例中，式(XI)化合物為式(XI-OH)化合物：

(XI-OH)，或其鹽。在一些實施例中，r為40至50。

在其他實施例中，式(XI)化合物為：

，或其鹽。

在一些實施例中，式(XI)化合物為

。

在一些實施例中，本文所揭示之醫藥組合物之脂質組成不包含PEG-脂質。

在一些實施例中，PEG-脂質可為美國申請案第US15/674,872號中所闡述之PEG脂質中之一或多者。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含相對於其他脂質組分莫耳比為0.5%-15%之PEG脂質。舉例而言，脂質奈米粒子可包含莫耳比為0.5%-10%、0.5%-5%、1%-15%、1%-10%、1%-5%、2%-15%、2%-10%、2%-5%、5%-15%、5%-10%或10%-15%之PEG脂質。在一些實施例中，脂質奈米粒子包含莫耳比為0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%或15%之PEG-脂質。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含1%-5% PEG修飾之脂質，視情況1 mol%-3 mol%，例如1.5 mol%至2.5 mol%、1 mol%-2 mol%、2 mol%-3 mol%、3 mol%-4 mol%或4 mol%-5 mol%。在一些實施例中，脂質奈米粒子包含0.5 mol%-15 mol%之PEG修飾之脂質。舉例而言，脂質奈米粒子可包含0.5 mol%-10 mol%、0.5 mol%-5 mol%、1 mol%-15 mol%、1 mol%-10 mol%、1 mol%-5 mol%、2 mol%-15 mol%、2 mol%-10 mol%、2 mol%-5 mol%、5 mol%-15 mol%、5 mol%-10 mol%或10 mol%-15 mol%。在一些實施例中，脂質奈米粒子包含0.5 mol%、1 mol%、2 mol%、3 mol%、4 mol%、5 mol%、6 mol%、7 mol%、8 mol%、9 mol%、10 mol%、11 mol%、12 mol%、13 mol%、14 mol%或15 mol% PEG修飾之脂質。

一些實施例包括將PEG添加至包含囊封核酸之LNP之組合物(例如其已以上文所列示之量包括PEG)中。不受理論束縛，據信，向LNP組合物中摻入額外PEG可在凍乾期間提供益處。因此，與非凍乾LNP組合物所用之量相比，一些實施例包括添加額外之PEG。在實施例中包括在形成LNP組合物(例如其已以本文中別處所列示之量含有PEG)後向LNP組合物中添加約0.5 mol%或更多之PEG，諸如約1 mol%、約1.5 mol%、約2 mol%、約2.5 mol%、約3 mol%、約3.5 mol%、約4 mol%、約5 mol%或更多。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含20 mol%-60 mol%之可電離胺基脂質、5 mol%-25 mol%之非陽離子脂質、25 mol%-55 mol%之固醇及0.5 mol%-15 mol% PEG修飾之脂質。

在一些實施例中，LNP包含化合物1之可電離胺基脂質，其中非陽離子脂質為DSPC；結構脂質為膽固醇；且PEG脂質為DMG-PEG。

在一些實施例中，LNP包含式VI、VII或VIIII中之任一者之可電離胺基脂質、包含DSPC之磷脂、結構脂質及包含PEG-DMG之PEG脂質。

在一些實施例中，LNP包含式VI、VII或VIII中之任一者之可電離胺基脂質、包含DSPC之磷脂、結構脂質及包含具有式XI之化合物之PEG脂質。

在一些實施例中，LNP包含式VI、VII或VIII之可電離胺基脂質、包含具有式VIII之化合物之磷脂、結構脂質及包含具有式X或XI之化合物之PEG脂質。

在一些實施例中，LNP包含式VI、VII或VIII之可電離胺基脂質、包含具有式IX之化合物之磷脂、結構脂質及包含具有式X或XI之化合物之PEG脂質。

在一些實施例中，LNP包含式VI、VII或VIII之可電離胺基脂質、具有式IX之磷脂、結構脂質及包含具有式XI之化合物之PEG脂質。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含49 mol%之可電離胺基脂質、10 mol%之DSPC、38.5 mol%之膽固醇及2.5 mol%之DMG-PEG。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含49 mol%之可電離胺基脂質、11 mol%之DSPC、38.5 mol%之膽固醇及1.5 mol%之DMG-PEG。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含48 mol%之可電離胺基脂質、11 mol%之DSPC、38.5 mol%之膽固醇及2.5 mol%之DMG-PEG。

在一些實施例中，LNP包含約2:1至約30:1之N:P比。

在一些實施例中，LNP包含約6:1之N:P比。

在一些實施例中，LNP包含約3:1、4:1或5:1之N:P比。

在一些實施例中，LNP包含約10:1至約100:1之可電離胺基脂質組分對RNA之wt/wt比。

在一些實施例中，LNP包含約20:1之可電離胺基脂質組分對RNA之wt/wt比。

在一些實施例中，LNP包含約10:1之可電離胺基脂質組分對RNA之wt/wt比。

一些實施例包含具有一或多種直徑為約150 nm或更小之LNP之組合物，諸如約140 nm、130 nm、120 nm、110 nm、100 nm、90 nm、80 nm、70 nm、60 nm、50 nm、40 nm、30 nm或20 nm或更小。一些實施例包含平均LNP直徑為約150 nm或更小之組合物，諸如約140 nm、130 nm、120 nm、110 nm、100 nm、90 nm、80 nm、70 nm、60 nm、50 nm、40 nm、30 nm或20 nm或更小。在一些實施例中，組合物之平均LNP直徑為約30 nm至約150 nm，或平均直徑為約60 nm至約120 nm。

LNP可包含一或多種類型之脂質，包括(但不限於)胺基脂質(例如可電離胺基脂質)、中性脂質、非陽離子脂質、帶電脂質、PEG修飾之脂質、磷脂、結構脂質及固醇。在一些實施例中，LNP可進一步包含一或多種貨物分子，包括(但不限於)核酸(例如mRNA、質體DNA、DNA或RNA寡核苷酸、siRNA、shRNA、snRNA、snoRNA、lncRNA等)、小分子、蛋白質及肽。

在一些實施例中，組合物包含脂質體。脂質體為包含脂質之脂質粒子，該等脂質圍繞中心區域排列成一或多個同心脂質雙層。脂質體之中心區域可包含水溶液、懸浮液或其他水性組合物。

在一些實施例中，脂質奈米粒子可包含兩種或更多種組分(例如胺基脂質及核酸、PEG-脂質、磷脂、結構脂質)。舉例而言，脂質奈米粒子可包含胺基脂質及核酸。包含脂質奈米粒子之組合物(諸如本文所闡述之彼等組合物)可用於眾多種應用，包括以最小之不利先天性免疫反應隱密遞送治療性有效載荷。

核酸之有效活體內遞送係一項持久之醫學挑戰。外源性核酸(亦即源自細胞或生物體外部)在體內易於由(例如)免疫系統降解。因此，核酸至細胞之有效遞送通常需要使用微粒載體(例如脂質奈米粒子)。該微粒載體應經調配以具有最低之粒子聚集、在細胞內遞送前相對穩定、有效地在細胞內遞送核酸且不引發或極少引發免疫反應。為達成最低粒子聚集以及遞送前穩定性，許多習用微粒載體依賴於某些組分(例如PEG-脂質)之存在及/或濃度。然而，已發現，某些組分可降低囊封核酸(例如DNA分子)之穩定性。降低之穩定性可能限制微粒載體之廣泛適用性。因此，業內仍需要改良囊封在脂質奈米粒子內之核酸(例如DNA)穩定性之方法。

在一些實施例中，脂質奈米粒子包含以下中之一或多者：可電離分子、多核苷酸及視情況選用的組分，諸如結構脂質、固醇、中性脂質、磷脂及能夠降低粒子聚集之分子(例如聚乙二醇(PEG)、PEG修飾之脂質)，諸如上文所闡述之彼等組分。

在一些實施例中，本文所闡述之LNP可包括一或多種可電離分子(例如胺基脂質或可電離脂質)。可電離分子可包含帶電基團且可具有一定pKa。在某些實施例中，可電離分子之pKa可大於或等於約6、大於或等於約6.2、大於或等於約6.5、大於或等於約6.8、大於或等於約7、大於或等於約7.2、大於或等於約7.5、大於或等於約7.8、大於或等於約8。在一些實施例中，可電離分子之pKa可小於或等於約10、小於或等於約9.8、小於或等於約9.5、小於或等於約9.2、小於或等於約9.0、小於或等於約8.8或小於或等於約8.5。上述參考範圍之組合亦有可能(例如大於或等於6且小於或等於約8.5)。其他範圍亦有可能。在粒子中存在一種以上類型之可電離分子之實施例中，每一類型之可電離分子可獨立地具有在上述範圍中之一或多者內之pKa。

一般而言，可電離分子包含一或多個帶電基團。在一些實施例中，可電離分子可帶正電荷或帶負電荷。舉例而言，可電離分子可帶正電荷。舉例而言，可電離分子可包含胺基。如本文所用，術語「可電離分子」具有其在此項技術中之通常含義，且可指包含一或多個帶電部分之分子或基質。如本文所用，「帶電部分」係攜載形式電子電荷之化學部分，例如單價(+1或-1)、二價(+2或-2)、三價(+3或-3)等。帶電部分可為陰離子(亦即帶負電荷)或陽離子(亦即帶正電荷)。帶正電荷之部分之實例包括胺基(例如一級胺、二級胺及/或三級胺)、銨基、吡啶鎓基、胍基及咪唑鎓基。在特定實施例中，帶電部分包含胺基。帶負電荷之基團或其前體之實例包括羧酸酯基、磺酸酯基、硫酸酯基、膦酸酯基、磷酸酯基、羥基及諸如此類。在一些情形下，帶電部分之電荷可隨環境條件而變化，例如，pH變化可改變部分之電荷，及/或使部分帶電或不帶電。一般而言，可視期望選擇分子及/或基質之電荷密度。

在一些情形下，可電離分子(例如胺基脂質或可電離脂質)可包括一或多個可轉化成帶電部分之前體部分。舉例而言，可電離分子可包括可水解形成帶電部分之中性部分，諸如上文所闡述之彼等部分。作為非限制性具體實例，分子或基質可包括醯胺，其可分別水解形成胺。熟習此項技術者將能夠確定給定化學部分是否攜載形式電子電荷(例如，藉由檢查、pH滴定、離子電導率量測等)，及/或給定化學部分是否可經反應(例如水解)形成攜載形式電子電荷之化學部分。

可電離分子(例如胺基脂質或可電離脂質)可具有任何適宜分子量。在某些實施例中，可電離分子之分子量小於或等於約2,500 g/mol、小於或等於約2,000 g/mol、小於或等於約1,500 g/mol、小於或等於約1,250 g/mol、小於或等於約1,000 g/mol、小於或等於約900 g/mol、小於或等於約800 g/mol、小於或等於約700 g/mol、小於或等於約600 g/mol、小於或等於約500 g/mol、小於或等於約400 g/mol、小於或等於約300 g/mol、小於或等於約200 g/mol或小於或等於約100 g/mol。在一些情況下，可電離分子之分子量大於或等於約100 g/mol、大於或等於約200 g/mol、大於或等於約300 g/mol、大於或等於約400 g/mol、大於或等於約500 g/mol、大於或等於約600 g/mol、大於或等於約700 g/mol、大於或等於約1000 g/mol、大於或等於約1,250 g/mol、大於或等於約1,500 g/mol、大於或等於約1,750 g/mol、大於或等於約2,000 g/mol或大於或等於約2,250 g/mol。上述範圍之組合(例如至少約200 g/mol且小於或等於約2,500 g/mol)亦有可能。在粒子中存在一種以上類型之可電離分子之實施例中，每一類型之可電離分子可獨立地具有上述範圍中之一或多者內之分子量。

在一些實施例中，粒子內之單一類型之可電離分子(例如胺基脂質或可電離脂質)及/或所有可電離分子之百分比(例如以重量計或以莫耳計)可大於或等於約15%、大於或等於約16%、大於或等於約17%、大於或等於約18%、大於或等於約19%、大於或等於約20%、大於或等於約21%、大於或等於約22%、大於或等於約23%、大於或等於約24%、大於或等於約25%、大於或等於約30%、大於或等於約35%、大於或等於約40%、大於或等於約42%、大於或等於約45%、大於或等於約48%、大於或等於約50%、大於或等於約52%、大於或等於約55%、大於或等於約58%、大於或等於約60%、大於或等於約62%、大於或等於約65%或大於或等於約68%。在一些情況下，百分比(例如以重量計或以莫耳計)可小於或等於約70%、小於或等於約68%、小於或等於約65%、小於或等於約62%、小於或等於約60%、小於或等於約58%、小於或等於約55%、小於或等於約52%、小於或等於約50%或小於或等於約48%。上述參考範圍之組合亦有可能(例如大於或等於20%且小於或等於約60%、大於或等於40%且小於或等於約55%等)。在粒子中存在一種以上類型之可電離分子之實施例中，每一類型之可電離分子可獨立地具有在上述範圍中之一或多者內之百分比(例如以重量計或以莫耳計)。百分比(例如以重量計或以莫耳計)可藉由使用(例如)有機溶劑自乾燥粒子中提取可電離分子且使用高壓液相層析(亦即HPLC)、液相層析-質譜法(LC-MS)、核磁共振(NMR)或質譜法(MS)量測該物質之量來確定。熟習此項技術者應知曉使用上文所提及之技術測定組分之量之技術。舉例而言，可使用HPLC來量化組分之量，例如藉由將HPLC層析圖之曲線下面積與標準曲線進行比較。

應理解，術語「帶電」或「帶電部分」不指分子上之「部分負電荷」或「部分正電荷」。術語「部分負電荷」及「部分正電荷」具有其在此項技術中之通常含義。當官能基包含極化鍵，使得電子密度被拉向該鍵之一個原子，從而在該原子上產生部分負電荷時，可產生「部分負電荷」。一般而言，熟習此項技術者應識別可以此方式極化之鍵。

根據本文之揭示內容，脂質組合物可包含一或多種如本文所闡述之脂質。此等脂質可包括可用於製備如上文所闡述或如此項技術中所已知之脂質奈米粒子調配物之彼等脂質。

在一些實施例中，投與包含核酸及脂質之組合物之個體為患有或處於患有疾病、病症或疾患風險下之個體，該疾病、病症或疾患包括可傳染或非傳染性疾病、病症或疾患。如本文所用，「治療」個體可包括與疾病、病症或疾患有關之治療性用途或預防性用途，且可用於描述用於緩和疾病、病症或疾患之症狀之用途、用於針對疾病、病症或疾患進行疫苗接種之用途及用於降低疾病、病症或疾患之接觸傳染性之用途以及其他用途。

在一些實施例中，核酸為經設計以達成特定生物效應之DNA疫苗。例示性疫苗以編碼所關注特定抗原之DNA (或編碼所關注抗原之一或多種DNA)為特徵。在例示性態樣中，疫苗以編碼源自傳染病或癌症之抗原之一或多種DNA為特徵。

在一些實施例中，疾病或疾患包括由傳染原(諸如細菌、病毒、真菌及寄生蟲)引起或與傳染原相關之彼等疾病或疾患。此等傳染原之非限制性實例包括革蘭氏(Gram)陰性細菌、革蘭氏陽性細菌、RNA病毒(包括(+)ssRNA病毒、(-)ssRNA病毒、dsRNA病毒)、DNA病毒(包括dsDNA病毒及ssDNA病毒)、反轉錄酶病毒(包括ssRNA-RT病毒及dsDNA-RT病毒)、原生動物、蠕蟲及體外寄生蟲。

因此，本揭示案亦涵蓋傳染病疫苗。傳染病疫苗之抗原為病毒性或細菌性抗原。

在一些實施例中，疾病、病症或疾患由病毒引起或與病毒相關。

組合物亦可用於治療或預防特徵在於蛋白質活性缺失或異常之疾病症狀，其係藉由替代缺失之蛋白質活性或克服異常之蛋白質活性來實施。多種疾病之特徵在於蛋白質活性缺失(或實質上減弱，使得不會發生適當的蛋白質功能)。此等蛋白質可能不存在，以極低量存在或基本上無功能。本揭示案之一些態樣係關於用於治療個體之此等疾患或疾病之方法，其係藉由引入多核苷酸或含有本文所提供之替代性多核苷酸之基於細胞之治療劑來實施，其中該等替代性多核苷酸編碼替代個體靶細胞中缺失之蛋白質活性之蛋白質。

以蛋白質活性功能障礙或異常為特徵之疾病包括(但不限於)癌症及其他增殖性疾病、遺傳性疾病(例如囊性纖維化)、自體免疫疾病、糖尿病、神經退化性疾病、心血管疾病及代謝性疾病。本揭示案之一些態樣係關於用於治療個體之此等疾患或疾病之方法，其係藉由引入多核苷酸或含有本文所提供之多核苷酸之基於細胞之治療劑來實施，其中該等多核苷酸編碼拮抗或以其他方式克服個體細胞中所存在之異常蛋白質活性之蛋白質。

在一些實施例中，本文所揭示之組合物不包含醫藥防腐劑。在其他實施例中，本文所揭示之組合物包含醫藥防腐劑。醫藥防腐劑之非限制性實例包括對羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸乙酯、對羥苯甲酸丙酯、對羥苯甲酸丁酯、苯甲醇、氯丁醇、苯酚、間甲酚(meta cresol、m-cresol)、氯甲酚、苯甲酸、山梨酸、硫柳汞、硝酸苯汞、佈羅波爾(bronopol)、丙二醇、苯扎氯銨(benzylkonium chloride)及苄索氯銨(benzethionium chloride)。在一些實施例中，本文所揭示之組合物不包含苯酚、間甲酚或苯甲醇。微生物生長受到抑制之組合物可用於製備可注射調配物，包括意欲自多劑量小瓶中分配之彼等調配物。多劑量小瓶係指醫藥組合物容器，自該同一容器中可重複取出多個劑量。意欲自多劑量小瓶中分配之組合物通常必須符合抗微生物有效性之USP要求。

在一些實施例中，「投與(administering或administration)」意指以藥理學有用之方式向個體提供材料。在一些實施例中，本文所揭示之組合物經腸投與給個體。在一些實施例中，組合物之經腸投與係經口的。在一些實施例中，本文所揭示之組合物非經腸投與給個體。在一些實施例中，本文所揭示之組合物皮下、眼內、玻璃體內、視網膜下、靜脈內(IV)、腦室內、肌內、鞘內(IT)、腦池內、腹膜內、經由吸入、外用或藉由直接注射至一或多種細胞、組織或器官投與給個體。

如本文所用之術語「治療」疾病意指降低個體所經歷疾病、病症或疾患之至少一種徵象或症狀之頻率或嚴重程度。上文或本文中別處所闡述之組合物通常以有效量投與給個體，亦即能夠產生合意結果之量。合意結果將取決於所投與之活性劑。舉例而言，包含核酸及脂質之組合物之有效量可為該組合物能夠增加蛋白質在個體中之表現之量。在治療上可接受之量可為能夠治療疾病或疾患之量，該疾病或疾患為例如可藉由增加蛋白質在個體中之表現而減輕之疾病或疾患。如醫學及獸醫技術中所眾所周知，針對任一個體之劑量取決於多種因素，包括個體之體型、體表面積、年齡、欲投與之特定組合物、組合物中之活性成分、預期投與結果、投與時間及途徑、一般健康狀況及同時投與之其他藥物。

在一些實施例中，以足以增加蛋白質在個體中之表現之量向該個體投與包含核酸及脂質I之組合物。

在某些實施例中，分析LNP製劑(例如群體或調配物)在大小(例如粒子直徑)及/或組成(例如胺基脂質量或濃度、磷脂量或濃度、結構脂質量或濃度、PEG-脂質量或濃度、DNA量(例如質量)或濃度)上之多分散性，且視情況進一步分析活體外及/或活體內活性。亦可分析該等LNP製劑之部分或集合之可及DNA及/或純度(例如如藉由反相(RP)層析所測定之純度)。

粒子大小(例如粒子直徑)可藉由動態光散射(DLS)來測定。DLS量測流體動力學直徑。較小之粒子擴散更快，導致散射強度之波動較快且自相關函數之衰減時間較短。較大之粒子擴散更慢，導致散射強度之波動較慢且自相關函數之衰減時間較長。

DNA純度可藉由反相高效液相層析(RP-HPLC)基於大小之分離來測定。此方法可用於藉由基於長度之梯度RP分離及260 nm下RNA之UV偵測來評價DNA完整性。如本文所用，「主峰」或「主峰純度」係指自對應於給定LNP調配物內所裝載之全大小DNA分子之DNA偵測到之RP-HPLC信號。DNA純度亦可藉由片段化分析來評價。片段化分析(FA)係一種可藉由毛細管電泳對核酸(例如DNA)片段進行分析之方法。片段化分析涉及對核酸(例如DNA)進行定大小及量化，例如藉由使用與LED光源耦合之嵌入染料。此分析可例如利用來自Advanced Analytical Technologies, Inc之片段分析儀來完成。

經由本文所闡述之方法形成之組合物可尤其用於向有需要之個體投與劑。在一些實施例中，組合物用於遞送醫藥活性劑。在一些情況下，組合物用於遞送預防劑。組合物可以藥物遞送技術中已知之任何方式來投與，例如經口、非經腸、靜脈內、肌內、皮下、真皮內、經皮、鞘內、黏膜下等。

在組合物製備後，其即可與醫藥學上可接受之賦形劑組合以形成醫藥組合物。如熟習此項技術者應瞭解，可基於如下文所闡述之投與途徑、所遞送之劑及劑之遞送時程選擇賦形劑。

本文所闡述且根據本文所闡述之實施例使用之醫藥組合物可包括醫藥學上可接受之賦形劑。如本文所用，術語「醫藥學上可接受之賦形劑」意指無毒、惰性固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、囊封材料或任何類型之調配助劑。可用作醫藥學上可接受之賦形劑之材料的一些實例為糖，諸如乳糖、葡萄糖及蔗糖；澱粉，諸如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、乙基纖維素及乙酸纖維素；粉末狀黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，諸如可可脂及栓劑蠟；油類，諸如花生油、棉籽油；紅花油；芝麻油；橄欖油；玉米油及大豆油；二醇，諸如丙二醇；酯，諸如油酸乙酯及月桂酸乙酯；瓊脂；清潔劑，諸如Tween 80；緩衝劑，諸如氫氧化鎂及氫氧化鋁；海藻酸；無熱原水；等滲鹽水；檸檬酸、乙酸鹽、林格氏溶液(Ringer’s solution)；乙醇；及磷酸鹽緩衝溶液，以及其他無毒相容性潤滑劑，諸如月桂基硫酸鈉及硬脂酸鎂，且根據調配師之判斷，組合物中亦可存在著色劑、釋放劑、包衣劑、甜味劑、矯味劑及芳香劑、防腐劑及抗氧化劑。醫藥組合物可經口、非經腸、腦池內、鼻內、腹膜內、外用(如藉由粉末、乳霜、軟膏或滴劑)、經頰或作為經口或經鼻噴霧投與給人類及/或動物。

用於經口投與之液體劑型包括醫藥學上可接受之乳液、微乳液、溶液、懸浮液、糖漿及酏劑。除活性成分(亦即粒子)以外，液體劑型亦可含有此項技術中常用之惰性稀釋劑，諸如水或其他溶劑、增溶劑及乳化劑，諸如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、油類(特定而言棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油及芝麻油)、甘油、四氫糠醇、聚乙二醇及去水山梨醇脂肪酸酯，及其混合物。除惰性稀釋劑以外，口服組合物亦可包括佐劑，諸如潤濕劑、乳化劑及懸浮劑、甜味劑、矯味劑及芳香劑。

可注射製劑(例如無菌可注射水性或油性懸浮液)可根據已知技術使用適宜分散劑或潤濕劑及懸浮劑來調配。無菌可注射製劑亦可為於無毒非經腸可接受之稀釋劑或溶劑中之無菌可注射溶液、懸浮液或乳液，例如作為於1,3-丁二醇中之溶液。可採用的可接受之媒劑及溶劑係水、林格氏溶液、乙醇U.S.P.及等滲氯化鈉溶液。另外，常採用無菌不揮發性油作為溶劑或懸浮介質。出於此目的，可採用任何溫和之不揮發性油，包括合成甘油單酯或甘油二酯。另外，使用諸如油酸等脂肪酸來製備可注射劑。

可注射調配物可例如藉由經由細菌截留過濾器過濾或藉由併入滅菌劑來滅菌，該等滅菌劑呈無菌固體組合物形式，可在使用前溶解或分散於無菌水或其他無菌可注射介質中。

用於經口投與之固體劑型包括膠囊、錠劑、丸劑、粉末及顆粒。在此等固體劑型中，將粒子與以下混合：至少一種惰性之醫藥學上可接受之賦形劑或載劑，諸如檸檬酸鈉或磷酸氫鈣，及/或a)填充劑或增量劑，諸如澱粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇及矽酸，b)黏合劑，諸如羧甲基纖維素、海藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯啶酮、蔗糖及阿拉伯膠，c)保濕劑，諸如甘油，d)崩解劑，諸如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯澱粉、海藻酸、某些矽酸鹽及碳酸鈉，e)緩溶劑，諸如石蠟，f)吸收促進劑，諸如四級銨化合物，g)潤濕劑，諸如鯨蠟醇及單硬脂酸甘油酯，h)吸收劑，諸如高嶺土(kaolin)及膨潤土，及i)潤滑劑，諸如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、月桂基硫酸鈉，及其混合物。在膠囊、錠劑及丸劑之情形下，劑型亦可包含緩衝劑。

在使用諸如乳糖(lactose或milk sugar)以及高分子量聚乙二醇及諸如此類等賦形劑之軟質及硬質填充明膠膠囊中，亦可採用相似類型之固體組合物作為填充劑。

錠劑、糖衣錠、膠囊、丸劑及顆粒之固體劑型可製備有包衣及包殼，諸如腸溶包衣及醫藥調配技術中眾所周知之其他包衣。其可視情況含有遮光劑，且亦可為視情況以延遲方式僅或優先在腸道的某一部分中釋放活性成分之組合物。可使用之包埋組合物之實例包括聚合物質及蠟。

用於外用或經皮投與醫藥組合物之劑型包括軟膏、糊劑、乳霜、洗劑、凝膠、粉末、溶液、噴霧、吸入劑或貼劑。視需要，可在無菌條件下將粒子與醫藥學上可接受之載劑及任何需要之防腐劑或緩衝劑混合。眼用調配物、滴耳劑及滴眼劑亦有可能。

除組合物以外，軟膏、糊劑、乳霜及凝膠亦可含有賦形劑，諸如動物及植物脂肪、油類、蠟、石蠟、澱粉、黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、聚矽氧、膨潤土、矽酸、滑石及氧化鋅，或其混合物。

除組合物以外，粉末及噴霧亦可含有賦形劑，諸如乳糖、滑石、矽酸、氫氧化鋁、矽酸鈣及聚醯胺粉末，或該等物質之混合物。噴霧可另外含有慣用推進劑，諸如氯氟烴類。

經皮貼劑具有額外優點，亦即將化合物受控遞送至體內。此等劑型可藉由將組合物溶解或分配於適當介質中來製得。吸收促進劑亦可用於增加化合物穿過皮膚之通量。可藉由提供速率控制膜或藉由將組合物分散於聚合物基質或凝膠中來控制速率。

在其他實施例中，將組合物裝載且儲存於用於患者友好型自動注射器及輸注幫浦裝置之預填充注射器及藥筒中。

亦提供用於製備或投與組合物之套組。用於形成組合物之套組可包括在組合物形成過程中所需要之任何溶劑、溶液、緩衝劑、酸、鹼、鹽、靶向劑等。不同的套組可用於不同的靶向劑。在某些實施例中，套組包括用於純化、定大小及/或表徵所得組合物之材料或試劑。套組亦可包括關於如何使用套組中之材料之說明。欲含於組合物內之一或多種劑(例如醫藥活性劑)通常由套組之使用者提供。

亦提供用於使用或投與組合物之套組。組合物可以便捷劑量單位提供，以供投與給個體。套組可包括多個劑量單位。舉例而言，套組可包括1-100個劑量單位。在某些實施例中，套組包括一週之劑量單位供應，或一個月之劑量單位供應。在某些實施例中，套組包括甚至更長時間之劑量單位供應。套組亦可包括用於投與組合物之裝置。例示性裝置包括注射器、匙、量測裝置等。套組可視情況包括關於投與組合物之說明(例如處方資訊)。

術語「醫藥學上可接受之鹽」係指彼等在合理的醫學判斷範圍內適用於與人類及低等動物之組織接觸而無過度毒性、刺激性、過敏反應及諸如此類且與合理益處/風險比相稱之鹽。醫藥學上可接受之鹽為此項技術中所熟知。舉例而言，Berge等人在J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19中詳細地闡述醫藥學上可接受之鹽，該文獻係以引用的方式併入本文中。化合物之醫藥學上可接受之鹽包括源自適宜無機及有機酸及鹼之彼等鹽。醫藥學上可接受之無毒酸加成鹽之實例為胺基與無機酸(諸如鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸及過氯酸)或與有機酸(諸如乙酸、草酸、馬來酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸或丙二酸)或藉由使用此項技術中已知之其他方法(諸如離子交換)所形成之鹽。其他醫藥學上可接受之鹽包括己二酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天門冬胺酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、甲酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、葡萄糖酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、已酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基-乙磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、對甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽及諸如此類。源自適當鹼之鹽包括鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽、銨鹽及N ⁺(C _1-4烷基) ₄ ^-鹽。代表性鹼金屬鹽或鹼土金屬鹽包括鈉鹽、鋰鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽及諸如此類。在適當時，其他醫藥學上可接受之鹽包括無毒銨、四級銨及胺陽離子，其係使用諸如鹵離子、氫氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低碳數烷基磺酸根及芳基磺酸根等相對離子來形成。

如本文所揭示，術語「組合物」及「調配物」可互換使用。序列一致性

術語「一致性」及「序列一致性」係指如藉由比較序列所確定的兩種或更多種多肽或多核苷酸(核酸)之序列之間的關係。序列一致性亦指如藉由兩個或更多個胺基酸殘基或核酸殘基之串之間的匹配數所確定的序列之間的序列相關性程度。序列一致性量測兩個或更多個序列中較小序列之間的一致性匹配之百分比，其中藉由特定數學模型或電腦程式(例如「演算法」)處理空位比對(若存在)。相關核酸或蛋白質之序列一致性可藉由已知方法容易地計算。「一致性百分比(%)」在應用於多肽或多核苷酸序列時定義為在將序列比對並引入空位(視需要)以達成最大一致性百分比後，候選胺基酸或核酸序列中與第二序列之胺基酸序列或核酸序列中之殘基一致的殘基(胺基酸殘基或核酸殘基)之百分比。用於比對之方法及電腦程式為此項技術中所熟知。應理解，一致性取決於一致性百分比之計算，但由於在計算中所引入之空位及罰分，其值可能不同。通常，如藉由本文所闡述且熟習此項技術者已知之序列比對程式及參數所測定，特定多核苷酸或多肽之變異體與該特定參考多核苷酸或多肽具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%但小於100%之序列一致性。此等用於比對之工具包括BLAST套件之彼等工具(Stephen F. Altschul等人(1997)，「Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs」, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)。另一常用之局部比對技術係基於Smith-Waterman演算法(Smith, T.F.及Watermann, M.S. (1981) 「Identification of common molecular subsequences.」J. Mol. Biol. 147:195-197)。基於動態編程之通用全域比對技術係Needleman-Wunsch演算法(Needleman, S.B.及Wunsch, C.D. (1970) 「A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins.」J. Mol. Biol. 48:443-453)。最近，已開發出快速最佳全域序列比對演算法(Fast Optimal Global Sequence Alignment Algorithm, FOGSAA)，據稱該演算法較其他最佳全域比對方法(包括Needleman-Wunsch演算法)更快地產生核苷酸及蛋白質序列之全域比對。

因此，啟動子及編碼相對於參考序列含有取代、插入及/或添加、缺失及共價修飾之肽或多肽之多核苷酸包括在本揭示案之範圍內。舉例而言，可將序列標籤或胺基酸(諸如一或多個離胺酸)添加至肽序列(例如在N末端或C末端)。序列標籤可用於肽偵測、純化或定位。離胺酸可用於增加肽溶解性或容許進行生物素化。或者，位於肽或蛋白質之胺基酸序列之羧基及胺基末端區域的胺基酸殘基可視情況缺失，從而提供截短序列。或者，端視於序列之用途，可缺失某些胺基酸(例如C末端或N末端殘基)，例如，將序列表現為可溶的或連接至固體支持物之較大序列之一部分。在一些實施例中，針對(或編碼)信號序列、終止序列、跨膜結構域、連接體、多聚化結構域(諸如摺疊區)及諸如此類之序列可經達成相同或類似功能之替代序列取代。在一些實施例中，可填充蛋白質核心中之空腔以提高穩定性，例如，藉由引入更大之胺基酸。在其他實施例中，埋藏之氫鍵網路可經疏水性殘基替代以提高穩定性。在其他實施例中，可將糖基化位點去除並用適當殘基替代。此等序列對於熟習此項技術者而言係容易鑑別出的。 等效內容及範圍

儘管本文已描述且說明若干本發明實施例，但熟習此項技術者將容易設想用於執行功能及/或獲得結果及/或一或多種本文所述之優勢的多種其他手段及/或結構，且此類變化及/或修改中之每一者均應視為在本文所述之本發明實施例的範圍內。更一般而言，熟習此項技術者將容易瞭解，本文所述之所有參數、尺寸、材料及組態均意欲為例示性的，且實際參數、尺寸、材料及/或組態將取決於使用本發明教示之一或多種特定應用。熟習此項技術者將認識到，或能夠僅使用常規實驗來確定本文所述之特定本發明實施例之許多等效形式。因此，應理解，前述實施例僅藉助實例呈現，且在隨附申請專利範圍及其等效形式之範圍內，本發明實施例可不同於如特定描述及主張之方式來實踐。本揭示案之本發明實施例係有關本文所述之每一個別特徵、系統、物件、材料、套組及/或方法。另外，若此類特徵、系統、物件、材料、套組及/或方法不相互矛盾，則兩個或更多個此類特徵、系統、物件、材料、套組及/或方法之任何組合均包括於本揭示案之發明範圍內。

應理解，如本文所定義且使用之所有定義均優先於字典定義、以引用方式併入之文件中之定義及/或所定義術語之通常含義。

本文所揭示之所有參考文獻、專利及專利申請案就各自所列舉之標的物而言均以引用的方式併入，該標的物在一些情形下可涵蓋文件之全部。

除非明確指示相反情形，否則如本文在說明書中及在申請專利範圍中所用之不定冠詞「一種/個(a及an)」應理解為意指「至少一種/個」。

如本文在說明書中及在申請專利範圍中所用，片語「及/或」應理解為意指如此結合之要素中之「任一者或兩者」，亦即，在一些情形下以結合方式存在且在其他情形下以分離方式存在之要素。以「及/或」列示之多個要素應以相同方式解釋，亦即，如此結合之要素中之「一或多者」。除由「及/或」子句特定鑑別之要素以外，可視情況存在其他要素，無論與特定鑑別之彼等要素相關抑或不相關。因此，作為非限制性實例，當與諸如「包含」之開放式語言聯合使用時，對「A及/或B」之提及在一些實施例中可指僅A (視情況包括除B以外之要素)；在另一實施例中，可指僅B (視情況包括除A以外之要素)；在另一實施例中，可指A及B兩者(視情況包括其他要素)；等。如本文在說明書中及在申請專利範圍中所用，「或」應理解為具有與如上文所定義之「及/或」相同之含義。舉例而言，在分離清單中之項目時，「或」或「及/或」應解釋為包括性的，亦即，包括多個要素或要素清單中之至少一者(而且包括一者以上)及視情況存在的其他未列示之項目。只有術語明確地指示相反情形，諸如「......中之僅一者」或「......中之恰好一者」或在用於申請專利範圍中時，「由......組成」將指包括多個要素或要素清單中之恰好一個要素。一般而言，當前面有排他性術語(諸如「任一」、「......中之一者」、「......中之僅一者」或「......中之恰好一者」)時，如本文所用之術語「或」應僅解釋為指示排他性替代選擇(亦即，「一者或另一者但非兩者」)。當在申請專利範圍中使用時，「基本上由......組成」應具有其在專利法領域中所用之通常含義。

如本文在說明書中及在申請專利範圍中所用，關於一或多個要素之清單之片語「至少一個」應理解為意指至少一個選自要素清單中之任一或多個要素之要素，但不一定包括要素清單內明確列示之每一及每個要素中之至少一者，且不排除要素清單中要素之任何組合。此定義亦容許可視情況存在除片語「至少一個」所指之要素清單內特定鑑別之要素以外之要素，無論與特定鑑別之彼等要素相關抑或不相關。因此，作為非限制性實例，「A及B中之至少一者」(或等效地，「A或B中之至少一者」，或等效地，「A及/或B中之至少一者」)在一些實施例中可指至少一個(視情況包括一個以上) A而不存在B (且視情況包括除B以外之要素)；在另一實施例中，可指至少一個(視情況包括一個以上) B而不存在A (且視情況包括除A以外之要素)；在另一實施例中，可指至少一個(視情況包括一個以上) A及至少一個(視情況包括一個以上) B (且視情況包括其他要素)；等。每一種可能性代表本發明之單獨實施例。

應理解，除非明確指示相反情形，否則如熟習此項技術者將理解，說明書中對數值及數值範圍之揭示包括i)所指定之確切值或範圍，及ii)「約」為所指定值或範圍之值(例如屬於合理範圍(例如約10%相似)內之值或範圍)。

亦應理解，除非明確指示相反情形，否則在本文所揭示之包括一個以上步驟或動作之任何方法中，該方法之步驟或動作的次序未必受限於揭示該方法之步驟或動作時的次序。

在申請專利範圍以及在上文說明書中，所有過渡性片語(諸如「包含」、「包括」、「攜帶」、「具有」、「含有」、「涉及」、「持有」、「由......構成」及諸如此類)均應理解為係開放式的，亦即意指包括但不限於。如美國專利局專利審查程序手冊(United States Patent Office Manual of Patent Examining Procedures)第2111.03節中所陳述，僅過渡性片語「由......組成」及「基本上由......組成」應分別為封閉式或半封閉式過渡性片語。實例實例1：針對DNA質體複製之菌株工程改造

使用γ複製起點(來自R6K)作為DNA載體之複製起點。將各種 pir表現盒整合至菌株4之基因體中，且測定其複製具有γ起點及康黴素抗性標記物之質體之能力。如圖 1中所示，含有 pir之菌株能夠複製γ起點質體且在LB +康黴素瓊脂板上產生菌落(注意，發現中等啟動子菌株已破壞，且因此不考慮關於該菌株之數據)。由於含有γ起點之質體之生長及轉型效率強勁，故選擇包含強啟動子構築體之菌株用於進一步開發產生無標記DNA。實例2：無標記DNA策略

已開發出一種無標記質體DNA系統，其利用質體攜帶之經修飾tRNA之表現來壓制已引入至必需基因中之琥珀型突變(例如，參見Marie等人， J Gene Med. 2010. 12(4):323-32)。在突變型細菌菌株中使用經修飾之tRNA用於琥珀、赭石或乳白壓制使得能夠正向選擇經質體轉型之大腸桿菌，而不需要抗生素抗性標記物，此係用於開發基於DNA之治療劑以供投與給個體之重要考慮因素。此外，與編碼抗生素抗性蛋白之ORF相比，tRNA通常極小。將琥珀型突變引入至僅在成分確定培養基中必需之基因中。對於在豐富或複雜培養基中實施之質體DNA發酵過程，無標記質體選擇方案應在所有培養基中均起作用。此係先前技術方法之一個重要問題，此乃因難以設計出有條件地不能在豐富培養基中生長但亦可藉由tRNA之表現而拯救之菌株。

將TAG琥珀型突變引入至質體DNA產生菌株(菌株4)之 tolCORF中( 圖 2)。TolC係大腸桿菌之主要外膜外排性幫浦組分。其不為必需基因，但其對於許多毒素之外排係必需的，且升高水準下之 tolC敲除係致死的。因此，由 tolC::琥珀型突變產生之 tolC突變型菌株對許多毒素(諸如低濃度之萘啶酮酸)高度敏感，此與生長培養基無關。雖然 tolC突變體對毒素高度敏感，但其可在豐富培養基(諸如LB或極品肉湯)中正常培養，其容許產生可用於生產中DNA合成之感受態細胞。實例3：無標記質體DNA

評估具有與 tolC琥珀型突變互補之反密碼子的突變型tRNA之質體攜帶表現是否將容許表現全長TolC蛋白，且因此容許菌株在原本致死濃度之萘啶酮酸存在下生長( 圖 2)。在此情形下，組胺酸tRNA hisR經與RNA上之 tolC琥珀型終止密碼子UAG互補的反密碼子環(由DNA上之TAG編碼)修飾。藉由向基因體中引入 tolC::K3_琥珀(稱為「K3」)或 tolC::H342_琥珀(稱為「H342」)琥珀型突變產生突變型大腸桿菌菌株( 圖 3A)。在開放閱讀框之靠前密碼子處引入終止密碼子阻止具有完整前導序列之無功能TolC肽之轉譯，該無功能TolC肽原本將穿過內細胞膜易位至周質空間或外膜中。每一菌株亦含有密碼子最佳化之 tolC編碼序列。兩種菌株均經編碼以下之質體轉型：i)攜帶組胺酸之琥珀壓制型tRNA (hisR)，或ii)作為對照質體之螢光素酶。兩種質體均攜帶康黴素抗性標記物，以容許生長期間之質體維持。接著將該等菌株接種至含有去氧膽酸鹽之LB培養基中，且在37℃下監測其生長。使每一經轉型之菌株在含有康黴素(Kan，圖 3B 、圖 3D)或去氧膽酸鹽(DOC 150，圖 3C- 圖 3D)之TBAF++培養基中生長超過24小時。所有菌株均在康黴素存在下生長，但缺少HisR tRNA之菌株較經HisR編碼質體轉型之彼等菌株生長更慢( 圖 3B 、圖 3D)。然而，DOC 150之存在對不表現HisR tRNA之菌株係致死的( 圖 3C- 圖 3D)。該等結果指示，去氧膽酸鹽容許高效正向選擇表現HisR tRNA之菌株。

細菌菌株與質體之組合提供用於產生無標記DNA之無標記DNA菌株及載體平台( 圖 4)。該無標記DNA產生平台藉由將上文所闡述之修飾整合至含有提高質體產生效率之其他修飾之單一菌株中得以進一步改良。該等新穎菌株所具有之突變提高質體DNA選殖效率及質體穩定性，增加拷貝數且降低純化期間之質體降解。菌株亦表現 pir基因，以容許攜帶小γ複製起點之DNA載體複製。最後，菌株具有 tolC::琥珀型突變，且因此依賴於載體主鏈上包含hisR*之DNA載體之存在。實例4：評估使用無標記DNA之質體生產率

使編碼螢光素酶及康黴素抗性標記物之質體經修飾，以去除編碼該康黴素抗性標記物之序列並插入編碼經修飾之 hisR序列之序列，以用於壓制 tolC中之基因體琥珀型突變，此使質體大小減小約550 bp。使含有 tolC::琥珀無義突變之大腸桿菌菌株經親代質體(Luc-KanR)或經修飾之質體(Luc-HisR)轉型。對於Luc-HisR及Luc-KanR菌株，將每一轉型體分別接種至含有含200 ng/µL DOC或50 µg/mL康黴素之極品肉湯之搖瓶中，且培育以開始種子培養。將每一菌株之種子培養物轉移至Ambr250生物反應器中以進行饋料批式發酵，以評估每一菌株之質體及生物量產率。生物反應器含有極品肉湯且運行超過120小時，其中肉湯含有200 ng/µL DOC以用於Luc-HisR轉型菌株之發酵以選擇表現hisR tRNA之細菌，或50 µg/mL康黴素以用於Luc-KanR轉型菌株之發酵。

在發酵期間多次獲得樣品，以量測細菌生物量及質體DNA產生。該等實驗之結果連同來自使用含有Luc-KanR質體之菌株(「對照KanR」)之先前發酵實驗之歷史數據一起示於圖5A-圖5C中。每一菌株均達到大約200-220 g/L之相當生物量，但Luc-HisR轉型菌株較Luc-KanR轉型菌株更早達到峰值生物量，且Luc-HisR菌株之此峰值更高，此指示與康黴素選擇相比，使用基於琥珀壓制子 hisR之選擇使生長改良( 圖 5B)。另外，相對於Luc-KanR，產生更高量之Luc-HisR質體( 圖 5A)。因此，就每單位細菌生物量產生之質體DNA而言，產生Luc-HisR質體之細菌之總生產率高於產生Luc-KanR質體之細菌( 圖 5C)。該等結果證明，使用琥珀壓制型tRNA (例如hisR)代替抗生素(例如康黴素)抗性標記物顯著提高質體產率，同時亦減小總質體大小。此方法亦使得能夠對複製無標記質體之細菌進行無抗生素選擇，此降低發酵期間細菌之代謝負擔(例如表現抗生素抗性標記物之負擔)。例示性序列

SEQ ID NO	序列	描述
1	CTGATGGCTAGCTCAGTCCTAGGGATTATGCTAGC	J23113啟動子
2	TTTATGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAATGCTAGC	J23114啟動子
3	TTTACGGCTAGCTCAGCCCTAGGTATTATGCTAGC	J23017啟動子
4	TTGACATATGTATCCGCTCATGATATAATAACCC	Kan啟動子
5	TGGTGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGG	LacIq啟動子
6	TTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATG	trc啟動子
7	AAGTGCCTTCCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTAACG	Lpp啟動子
8	ATCTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTAAGGATTCTGCAGTGAGAGCAGAGGGCCAGCTAAGTGGTACTCTCCCAGAGACTGTCTGACTCACGCCACCCCCTCCACCTTGGACACAGGACGCTGTGGTTTCTGAGCCAGGTACAATGACTCCTTTCGGTAAGTGCAGTGGAAGCTGTACACTGCCCAGGCAAAGCGTCCGGGCAGCGTAGGCGGGCGACTCAGATCCCAGCCAGTGGACTTAGCCCCTGTTTGCTCCTCCGATAACTGGGGTGACCTTGGTTAATATTCACCAGCAGCCTCCCCCGTTGCCCCTCTGGATCCACTGCTTAAATA	hAAT啟動子
9	ATGCGTTTGAAGGTGATGATGGATGTCAATAAGAAGACCAAGATCCGTCACCGCAATGAACTTAATCATACCCTTGCACAGTTGCCATTACCAGCGAAACGCGTCATGTATATGGCCCTTGCCCCAATCGATAGTAAAGAGCCATTGGAGCGTGGGCGTGTGTTCAAAATCCGCGCTGAGGATCTTGCAGCCTTAGCAAAGATCACCCCCTCATTAGCTTACCGTCAGTTAAAGGAGGGTGGAAAACTGTTGGGAGCTTCAAAAATTTCGTTACGTGGAGACGACATCATCGCCCTTGCTAAGGAATTAAATTTACCTTTCACCGCGAAGAATTCTCCCGAAGAGCTTGACCTTAATATCATTGAGTGGATTGCATACTCTCCGGATGAAGGTTACCTTTCTTTGAAATTCACCCGCACGATCGAACCCTACATTAGTTCCCTGATCGGGAAGAAGAATAAATTCACGACCCAGTTATTGACTGCATCCCTGCGCCTGTCCTCGCAATACTCCAGTTCTCTGTACCAACTTATTCGTAAGCACTACTCAAACTTTAAGAAAAAAAACTATTTTATTATCAGTGTCGATGAGTTGAAGGAAGAGTTGATTGCGTACACCTTTGACAAGGACGGAAATATCGAATACAAATATCCAGACTTCCCCATCTTTAAGCGTGATGTCCTGAATAAAGCCATTGCAGAGATTAAAAAAAAAACGGAAATTTCATTCGTTGGATTTACAGTCCACGAGAAAGAGGGCCGCAAAATCAGTAAATTGAAGTTTGAATTTGTTGTTGATGAAGACGAGTTTTCTGGGGATAAAGATGATGAAGCATTTTTTATGAACCTGAGCGAAGCAGACGCAGCCTTTTTGAAGGTATTCGACGAAACGGTGCCGCCGAAAAAGGCAAAGGGATAA	pir之核苷酸序列(針對大腸桿菌K12進行密碼子最佳化)
10	MRLKVMMDVNKKTKIRHRNELNHTLAQLPLPAKRVMYMALAPIDSKEPLERGRVFKIRAEDLAALAKITPSLAYRQLKEGGKLLGASKISLRGDDIIALAKELNLPFTAKNSPEELDLNIIEWIAYSPDEGYLSLKFTRTIEPYISSLIGKKNKFTTQLLTASLRLSSQYSSSLYQLIRKHYSNFKKKNYFIISVDELKEELIAYTFDKDGNIEYKYPDFPIFKRDVLNKAIAEIKKKTEISFVGFTVHEKEGRKISKLKFEFVVDEDEFSGDKDDEAFFMNLSEADAAFLKVFDETVPPKKAKG	Pi蛋白之胺基酸序列(由 pir編碼)
11	ATGAAGAAATTGCTCCCCATTCTTATCGGCCTGAGCCTTTCTGGGTTCAGTTCGTTGAGCCAGGCCGAGAACCTGATGCAAGTTTATCAGCAAGCACGCCTTAGTAACCCGGAATTGCGTAAGTCTGCCGCCGATCGTGATGCTGCCTTTGAAAAAATTAATGAAGCGCGCAGTCCATTACTGCCACAGCTAGGTTTAGGTGCAGATTACACCTATAGCAACGGCTACCGCGACGCGAACGGCATCAACTCTAACGCGACCAGTGCGTCCTTGCAGTTAACTCAATCCATTTTTGATATGTCGAAATGGCGTGCGTTAACGCTGCAGGAAAAAGCAGCAGGGATTCAGGACGTCACGTATCAGACCGATCAGCAAACCTTGATCCTCAACACCGCGACCGCTTATTTCAACGTGTTGAATGCTATTGACGTTCTTTCCTATACACAGGCACAAAAAGAAGCGATCTACCGTCAATTAGATCAAACCACCCAACGTTTTAACGTGGGCCTGGTAGCGATCACCGACGTGCAGAACGCCCGCGCACAGTACGATACCGTGCTGGCGAACGAAGTGACCGCACGTAATAACCTTGATAACGCGGTAGAGCAGCTGCGCCAGATCACCGGTAACTACTATCCGGAACTGGCTGCGCTGAATGTCGAAAACTTTAAAACCGACAAACCACAGCCGGTTAACGCGCTGCTGAAAGAAGCCGAAAAACGCAACCTGTCGCTGTTACAGGCACGCTTGAGCCAGGACCTGGCGCGCGAGCAAATTCGCCAGGCGCAGGATGGTCACTTACCGACTCTGGATTTAACGGCTTCTACCGGGATTTCTGACACCTCTTATAGCGGTTCGAAAACCCGTGGTGCCGCTGGTACCCAGTATGACGATAGCAATATGGGCCAGAACAAAGTTGGCCTGAGCTTCTCGCTGCCGATTTATCAGGGCGGAATGGTTAACTCGCAGGTGAAACAGGCACAGTACAACTTTGTCGGTGCCAGCGAGCAACTGGAAAGTGCCCATCGTAGCGTCGTGCAGACCGTGCGTTCCTCCTTCAACAACATTAATGCATCTATCAGTAGCATTAACGCCTACAAACAAGCCGTAGTTTCCGCTCAAAGCTCATTAGACGCGATGGAAGCGGGCTACTCGGTCGGTACGCGTACCATTGTTGATGTGTTGGATGCGACCACCACGTTGTACAACGCCAAGCAAGAGCTGGCGAATGCGCGTTATAACTACCTGATTAATCAGCTGAATATTAAGTCAGCTCTGGGTACGTTGAACGAGCAGGATCTGCTGGCACTGAACAATGCGCTGAGCAAACCGGTTTCCACTAATCCGGAAAACGTTGCACCGCAAACGCCGGAACAGAATGCTATTGCTGATGGTTATGCGCCTGATAGCCCGGCACCAGTCGTTCAGCAAACATCCGCACGCACTACCACCAGTAACGGTCATAACCCTTTCCGTAACTGA	野生型 tolC之核酸序列
12	MKKLLPILIGLSLSGFSSLSQAENLMQVYQQARLSNPELRKSAADRDAAFEKINEARSPLLPQLGLGADYTYSNGYRDANGINSNATSASLQLTQSIFDMSKWRALTLQEKAAGIQDVTYQTDQQTLILNTATAYFNVLNAIDVLSYTQAQKEAIYRQLDQTTQRFNVGLVAITDVQNARAQYDTVLANEVTARNNLDNAVEQLRQITGNYYPELAALNVENFKTDKPQPVNALLKEAEKRNLSLLQARLSQDLAREQIRQAQDGHLPTLDLTASTGISDTSYSGSKTRGAAGTQYDDSNMGQNKVGLSFSLPIYQGGMVNSQVKQAQYNFVGASEQLESAHRSVVQTVRSSFNNINASISSINAYKQAVVSAQSSLDAMEAGYSVGTRTIVDVLDATTTLYNAKQELANARYNYLINQLNIKSALGTLNEQDLLALNNALSKPVSTNPENVAPQTPEQNAIADGYAPDSPAPVVQQTSARTTTSNGHNPFRN	野生型TolC之胺基酸序列(信號肽加下劃線)
13	GGTGGCTATAGCTCAGTTGGTAGAGCCCTGGATT CTAA ATCCAGTTGTCGTGGGTTCGAATCCCATTAGCCACCCCA	HisR琥珀壓制型tRNA (突變加下劃線)
14	GGTGGCTATAGCTCAGTTGGTAGAGCCCTGGATT TTAA ATCCAGTTGTCGTGGGTTCGAATCCCATTAGCCACCCCA	HisR赭石壓制型tRNA (突變加下劃線)
15	GGTGGCTATAGCTCAGTTGGTAGAGCCCTGGATT TCAA ATCCAGTTGTCGTGGGTTCGAATCCCATTAGCCACCCCA	HisR乳白壓制型tRNA (突變加下劃線)
16	TCTTACTTCTTTGCGTAGCTGTTAAATACAGCGTTGTTTTGATAAAATCATCATTATCATCGATAATGCTTTCTTCAATTTTTTTATCCTTACTCTTTAATAAAGCACTTGCTAATAACTTCATACCTTTTGCAACTGTCAAATTTGGTTCATCAGGGTAAATGCTTTTAAGGCATACTAACAAATAATCATGGTCTTCATCTTCAACTCTAAACTGAATTTTTTTCATCATAACTCCCAACAAGAACCGACTGTAGGTCACCGGGCAAACGCTGAAAAATAACGTCGAATGACGTCATTTTGCGGCGTTTGCCCTATCCTGCATCGCAGTAGAAAATGCCACAACTGAAATTGTGCTTCAGTATGTACAGAAATGCAAAATCTGAGGGATTTCGTAGCTGAAAGATCGCCAGTCTTCGACCGTAAGGATAGGAGTTGCTGTAAGACCTGTGCGGGGCTGTTCGCTTCGCGAACGGGTCTGGCAGGGGGCGCAAGCGCTGTGCTGTGATATATGCAAAAGAAGCACCTCCCGCAAACGGG	R6K α (R6K alpha)複製起點
17	AGATCTATGGATGTTGAGAATGTAGTATGGTTATACTGCGATGCAGGATAGGGCAAACGCCGTAAAATGACGTCTTTGACGTTATTTTTCAGCGCTTGCCCGGTGACCTACAGTCGGTTCTTGTTGGGAGATTTTATGAAGTTTATAGTAAAGGATTTTATCAGTGATAAATATGCAAAGGCTATTAACATTTTAAATGATAACCTTAAAGAAAACTACTATGTTTTTTATGGTGTAAGGTTAAGTGAAATTCTTTTTCCTGCAAGTGATTATGGTACAGATGATTTTTTTAAGGAGTTTGAGGAAATAAACAACGTTACCTTGCCTTTAGTTGTTTTTGAAATAAATGAACGTGAACCTGTGATTGTAATTGGTTTTGATGAAATAAATGGTGCGATTCTTATAGAGAAATCCGGTATAAAGGTTTTAGTAATCGATAATCTATCGGCGTTGCTGACCAATGAAACATTGGGTGTCTTCTTCAAGTAACAGATCTAGCTGAAAATCGTCATCAAAACTGTGCACCTTATCTG	R6K β (R6K beta)複製起點
18	AAGCTTTAAAAGCCTTATATATTCTTTTTTTTCTTATAAAACTTAAAACCTTAGAGGCTATTTAAGTTGCTGATTTATATTAATTTTATTGTTCAAACATGAGAGCTTAGTACGTGAAACATGAGAGCTTAGTACGTTAGCCATGAGAGCTTAGTACGTTAGCCATGAGGGTTTAGTTCGTTAAACATGAGAGCTTAGTACGTTAAACATGAGAGCTTAGTACGTGAAACATGAGAGCTTAGTACGTACTATCAACAGGTTGAACTGCTGATCTTCAGATCT	R6K γ (R6K gamma)複製起點
19	ATCCCTGGCTTGTTGTCCACAACCGTTAAACCTTAAAAGCTTTAAAAGCCTTATATATTCTTTTTTTTCTTATAAAACTTAAAACCTTAGAGGCTATTTAAGTTGCTGATTTATATTAATTTTATTGTTCAAACATGAGAGCTTAGTACGTGAAACATGAGAGCTTAGTACGTTAGCCATGAGAGCTTAGTACGTTAGCCATGAGGGTTTAGTTCGTTAAACATGAGAGCTTAGTACGTTAAACATGAGAGCTTAGTACGTGAAACATGAGAGCTTAGTACGTACTATCAACAGGTTGAACTGCGGATCTTGAAGTGCCTTCCCATCAAAAAAATATTCTCAACATAAAAAACTTTGTGTAATACTTGTAACGGGTGGCTATAGCTCAGTTGGTAGAGCCCTGGATTCTAAATCCAGTTGTCGTGGGTTCGAATCCCATTAGCCACCCCACCCGGGCGCCGAAAACCCCGCTTCGGCGGGGTTTTGCCGC	具有R6Kγ複製起點之HisR載體

附圖不意欲按比例繪製。在附圖中，各個圖中所圖解說明之每一相同或幾乎相同之組件均由類似的數量符號表示。為清晰起見，並非每個組件均可在每個圖中被標記。在附圖中：圖 1顯示經不同強度啟動子控制之 pir表現盒修飾之菌株4菌株之轉型效率及質體耐受性。圖 2顯示無標記DNA產生策略，其利用在 tolC中具有琥珀型突變之大腸桿菌菌株及編碼琥珀壓制型tRNA之eDNA載體。產生具有 tolC『TAG』琥珀型突變代替編碼組胺酸之密碼子的大腸桿菌之定製菌株。該 tolC突變體對低濃度之萘啶酮酸高度敏感，且因此依賴於質體攜帶之經修飾tRNA (HisR*)表現之存在，其容許轉譯全長TolC蛋白。示出SEQ ID NO: 20，其對應於壓制型tRNA之核苷酸序列。圖 3A- 圖 3D顯示琥珀型突變之用途，及琥珀壓制型tRNA之用途，其用於無標記游離型DNA之產生。圖 3A顯示在 tolC編碼序列中引入琥珀型終止密碼子，替代編碼TolC之殘基K3之密碼子。設計替代菌株，其中編碼TolC之殘基H342之密碼子經琥珀型終止密碼子替代。SEQ ID NO: 21顯示開放閱讀框之DNA序列。SEQ ID NO: 22顯示因引入終止密碼子而未轉譯之胺基酸序列，但其在細胞中存在琥珀壓制型tRNA時被轉譯。圖 3B顯示在每一菌株經編碼以下之質體轉型後，兩種菌株在含有康黴素(kanamycin)之極品肉湯培養基(Terrific Broth media)中之生長：i)攜帶組胺酸之琥珀壓制型tRNA，或ii)編碼螢光素酶之對照質體。圖 3C顯示在每一菌株經編碼以下之質體轉型後，兩種菌株在含有去氧膽酸鹽之極品肉湯培養基中之生長：i)攜帶組胺酸之琥珀壓制型tRNA，或ii)編碼螢光素酶之對照質體。圖 3D顯示在經編碼以下之質體轉型後，每一菌株在含有康黴素或去氧膽酸鹽之培養基中之生長：i)攜帶組胺酸之琥珀壓制型tRNA，或ii)編碼螢光素酶之對照質體。圖 4顯示以下過程：i)開發在 tolC中具有引入之終止密碼子之新穎菌株，但其可支持具有R6K複製起點之質體之複製，ii)開發具有R6K複製起點且編碼琥珀壓制型tRNA之質體，及iii)將ii)之質體引入至i)之菌株中以產生用於產生無標記DNA之系統。圖 5A- 圖 5C顯示發酵之結果，其中大腸桿菌菌株經發酵以產生編碼以下之質體：(i)螢光素酶及攜帶組胺酸之琥珀壓制型tRNA (hisR)，(ii)螢光素酶及康黴素抗性標記物，或(iii)單獨之康黴素抗性標記物。圖 5A顯示隨時間推移所產生之每種質體DNA之量(每公升培養基中之DNA毫克數)。圖 5B顯示攜帶每種質體之細菌菌株之生物量(每公升培養基中之細胞濕重公克數)。圖 5C顯示每種質體隨時間推移之生產率(每公克細胞濕重中之質體DNA毫克數)。

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Claims

一種經遺傳修飾之微生物，其包含 (i) 基因體，其在編碼外排性幫浦或輸入蛋白之基因中包含無義突變；及 (ii) 載體，其包含編碼壓制型tRNA之核酸序列，其中該無義突變包含第一終止密碼子，且該壓制型tRNA包含與該第一終止密碼子互補之反密碼子。
如請求項1之經遺傳修飾之微生物，其中該編碼外排性幫浦或輸入蛋白之基因包含位於該第一終止密碼子下游之第二終止密碼子，其中該第二終止密碼子包含不為該第一終止密碼子之核酸序列之核酸序列。
如請求項2之經遺傳修飾之微生物，其中該第一終止密碼子包含核酸序列TAG或UAG。
如請求項1至3中任一項之經遺傳修飾之微生物，其中該第一終止密碼子包含核酸序列TAA或UAA。
如請求項1至4中任一項之經遺傳修飾之微生物，其中該第一終止密碼子包含核酸序列TGA或UGA。
如請求項1至5中任一項之經遺傳修飾之微生物，其中該第一終止密碼子位於該編碼外排性幫浦或輸入蛋白之基因中之開放閱讀框的前400、前300、前250、前200、前150、前100、前90、前80、前70、前60、前50、前40、前30、前20、前10或前5個密碼子中。
如請求項1至6中任一項之經遺傳修飾之微生物，其中該第一終止密碼子位於該編碼外排性幫浦或輸入蛋白之基因中之開放閱讀框的前10個密碼子中。
如請求項1至7中任一項之經遺傳修飾之微生物，其中該壓制型tRNA為組胺酸tRNA。
如請求項1至8中任一項之經遺傳修飾之微生物，其中該基因體包含編碼 pir之核酸序列。
如請求項9之經遺傳修飾之微生物，其中第一啟動子可操作地連接至該編碼 pir之核酸序列。
如請求項10之經遺傳修飾之微生物，其中該第一啟動子選自由以下組成之群：Kan啟動子、LacIq啟動子、trc啟動子、Lpp啟動子及J23107啟動子。
如請求項10或11之經遺傳修飾之微生物，其中該第一啟動子包含與SEQ ID NO: 3-7中之任一者之核酸序列具有至少90%序列一致性之核酸序列。
如請求項1至12中任一項之經遺傳修飾之微生物，其中該載體包含R6Kγ複製起點。
如請求項1至13中任一項之經遺傳修飾之微生物，其中該載體包含少於1,000、少於900、少於800、少於700、少於600或少於500個核苷酸。
如請求項1至14中任一項之經遺傳修飾之微生物，其中該基因體為大腸桿菌( E. coli)基因體。
如請求項1至15中任一項之經遺傳修飾之微生物，其中該基因體在編碼外排性幫浦之基因中包含無義突變，其中該編碼外排性幫浦之基因為 acrAB、 acrD、 acrEF、 emrD、 emrE、 emrKY、 mdfA、 tehAB、 tolC、 ybhGFSR、 ybjY、 ybjZ、 yegM、 yegNO、 yhiUV、 yjcP、 ylcB或 yohG。
如請求項16之經遺傳修飾之微生物，其中該編碼外排性幫浦之基因為 tolC。
如請求項1至17中任一項之經遺傳修飾之微生物，其中該微生物能夠在選擇劑存在下生長。
如請求項18之經遺傳修飾之微生物，其中該選擇劑為胺苄青黴素(ampicillin)、氯黴素(chloramphenicol)、氟苯尼考(florfenicol)、克黴唑(clotrimazole)、嘌呤黴素(puromycin)、紅黴素(erythromycin)、胺甲喋呤(methotrexate)、新生黴素(novobiocin)、環丙沙星(ciprofloxacin)、諾氟沙星(norfloxacin)、萘啶酮酸、雷發平(rifampin)、梭鏈孢酸(fusidic acid)、鏈黴素(streptomycin)、磺乙醯胺、四環素、去氧膽酸鹽、膽酸鈉、牛磺去氧膽酸鈉、草酸鈉、原黃素(proflavine)、結晶紫、吖啶黃(acriflavin)、溴乙錠、四苯基鏻、玫瑰紅6G、氯化四苯基鉮、地喹氯銨(dequalinium chloride)、苯扎氯銨(benzalkonium chloride)、道諾黴素(daunomycin)、白花丹素(plumbagin)或甲基紫精。
如請求項19之經遺傳修飾之微生物，其中該選擇劑為萘啶酮酸。
如請求項19之經遺傳修飾之微生物，其中該選擇劑為去氧膽酸鹽。
如請求項1至21中任一項之經遺傳修飾之微生物，其中該基因體在編碼輸入蛋白之基因中包含無義突變。
如請求項22之經遺傳修飾之微生物，其中該輸入蛋白選自由 mppA及 oppBCDF組成之群。
如請求項22或23之經遺傳修飾之微生物，其中該微生物為營養缺陷型，其中該營養缺陷型不能合成一或多種營養物。
如請求項24之經遺傳修飾之微生物，其中該營養缺陷型不能合成一或多種胺基酸。
一種在微生物群體中富集如請求項16至21中任一項之經遺傳修飾之微生物的方法，該方法包括使微生物群體暴露於選擇劑，其中在暴露於該選擇劑後，該群體中該經遺傳修飾之微生物之頻率增加。
如請求項26之方法，其中該選擇劑為胺苄青黴素、氯黴素、氟苯尼考、克黴唑、嘌呤黴素、紅黴素、胺甲喋呤、新生黴素、環丙沙星、諾氟沙星、萘啶酮酸、雷發平、梭鏈孢酸、鏈黴素、磺乙醯胺、四環素、去氧膽酸鹽、膽酸鈉、牛磺去氧膽酸鈉、草酸鈉、原黃素、結晶紫、吖啶黃、溴乙錠、四苯基鏻、玫瑰紅6G、氯化四苯基鉮、地喹氯銨、苯扎氯銨、道諾黴素、白花丹素或甲基紫精。
如請求項27之方法，其中該選擇劑為萘啶酮酸。
如請求項27之方法，其中該選擇劑為去氧膽酸鹽。
一種在微生物群體中富集如請求項22至25中任一項之經遺傳修飾之微生物的方法，該方法包括使微生物群體在營養物存在下生長，其中在該營養物存在下生長後，該群體中該經遺傳修飾之微生物之頻率增加。
如請求項30之方法，其中該營養物為胺基酸。
一種產生無標記DNA之方法，該方法包括 (i) 在適於載體複製之條件下培養如請求項1至25中任一項之經遺傳修飾之微生物；及 (ii) 自該微生物中分離該載體以獲得無標記DNA。
一種無標記DNA，其係藉由如請求項32之方法產生。
如請求項33之無標記DNA，其進一步包含編碼蛋白質之開放閱讀框。
如請求項34之無標記DNA，其進一步包含第二啟動子，其中該第二啟動子可操作地連接至編碼該蛋白質之該開放閱讀框。
如請求項35之無標記DNA，其中該開放閱讀框經密碼子最佳化以在細胞中表現。
如請求項36之無標記DNA，其中該開放閱讀框經密碼子最佳化以在人類細胞中表現。
一種無標記DNA，其包含 (i) 複製起點； (ii) 編碼壓制型tRNA之核酸序列；及 (iii) 與SEQ ID NO: 19具有至少90%序列一致性之核酸序列，其中該壓制型tRNA包含與終止密碼子互補之反密碼子。
如請求項38之無標記DNA，其中該複製起點包含少於600、少於500、少於400或少於350個核苷酸。
如請求項39之無標記DNA，其中該複製起點為R6Kγ複製起點。
如請求項38至40中任一項之無標記DNA，其中該終止密碼子包含核酸序列TAG或UAG。
如請求項38至40中任一項之無標記DNA，其中該終止密碼子包含核酸序列TAA或UAA。
如請求項38至40中任一項之無標記DNA，其中該終止密碼子包含核酸序列TGA或UGA。
如請求項38至43中任一項之無標記DNA，其中該壓制型tRNA為組胺酸tRNA。
如請求項38至44中任一項之無標記DNA，其進一步包含編碼蛋白質之開放閱讀框。
如請求項45之無標記DNA，其進一步包含啟動子，其中該啟動子可操作地連接至編碼該蛋白質之該開放閱讀框。
如請求項45或46之無標記DNA，其中該開放閱讀框經密碼子最佳化以在細胞中表現。
如請求項47之無標記DNA，其中該開放閱讀框經密碼子最佳化以在人類細胞中表現。
如請求項38至48中任一項之無標記DNA，其中該無標記DNA編碼mRNA。
一種包含如請求項38至49中任一項之無標記DNA之組合物，其中將該無標記DNA調配於脂質奈米粒子中。
如請求項50之組合物，其中該脂質奈米粒子包含可電離脂質、中性脂質、固醇及聚乙二醇(PEG)修飾之脂質。
如請求項50或51之組合物，其中該脂質奈米粒子包含：40 mol%-55 mol%之可電離胺基脂質；5 mol%-15 mol%之非陽離子脂質；35 mol%-45 mol%之固醇；及1 mol%-5 mol%之PEG修飾之脂質。
一種醫藥組合物，其包含如請求項38至49中任一項之無標記DNA或如請求項50至52中任一項之組合物。
如請求項53之醫藥組合物，其進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑。
一種方法，其包括向有需要之個體投與如請求項38至49中任一項之無標記DNA、如請求項50至52中任一項之組合物或如請求項53或54之醫藥組合物。
一種向有需要之個體中的特定細胞類型遞送無標記DNA之方法，其包括向有需要之個體投與如請求項38至49中任一項之無標記DNA、如請求項50至52中任一項之組合物或如請求項53或54之醫藥組合物。
一種治療有需要之個體之疾病或疾患的方法，其包括向該個體投與如請求項38至49中任一項之無標記DNA、如請求項50至52中任一項之組合物或如請求項53或54之醫藥組合物。
如請求項55至57中任一項之方法，其中該個體為哺乳動物。
如請求項55至58中任一項之方法，其中該個體為人類。