TW202321289A

TW202321289A - 鑑別ｍｈｃ相關聯抗原以進行治療干預的系統及方法

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Publication number: TW202321289A
Application number: TW111141261A
Authority: TW
Inventors: 亨姆拉吉古隆; 班傑明約瑟夫海莉; 艾米珍妮海德斯巴奇; 娟李; 克里斯托弗麥克爾羅斯; 恩介湯; 克雷格布蘭切特; 沛峰陳; 馬丁內亞伯拉罕達爾維什
Original assignee: 美商建南德克公司
Priority date: 2021-10-28
Filing date: 2022-10-28
Publication date: 2023-06-01
Also published as: WO2023077038A2; WO2023077038A3; CA3235177A1; AU2022375793A1

Abstract

本揭露涉及使用單等位基因 MHC 表現細胞株之組合物及方法，以及鑑別新抗原決定位-MHC 結合對之方法，以及治療患有表現新抗原及 MHC 等位基因的癌症或腫瘤的個體之方法。

Description

鑑別　MHC　相關聯抗原以進行治療干預的系統及方法

主要組織相容性複合物-I (MHCI) 是一種幾乎廣泛存在之蛋白複合物，其負責將抗原呈現細胞表面上之自身及外源來源之展示肽呈現至淋巴細胞。藉由 MHCI 之展示肽呈現是後天免疫反應朝破壞病變細胞或保護健康細胞的第一步。MHCI 複合物為一種非共價連接之蛋白異二聚體，其由重鏈 (α) 及輕鏈 (β2 微球蛋白，B2M) 所組成；一般而言，MHCI 複合物在沒有肽配體的情況下是不穩定的。展示肽生成路徑利用將經泛素化之細胞質蛋白降解成潛在展示肽的蛋白酶體。此等展示肽隨後經輸入至內質網中，在那裡其經進一步改質 (refine)，且活性 MHCI/展示肽複合物在運送至細胞表面以呈現至細胞毒性或 CD8(+) T 細胞前，係經由蛋白質伴護蛋白 (chaperone) 輔助過程形成，以辨識並確定細胞命運。

MHCI 蛋白由主要組織相容性複合物基因複合物所編碼，亦已知為人類白血球抗原 (HLA) 系統的成員。雖然總計有大約 24 個已知的 HLA 家族成員，但最常見之 HLA 家族成員由 HLA-A、HLA-B 及 HLA-C 基因座所編碼。各 HLA 群組含有至少一打或更多個等位基因，且此等等位基因之差異表現導致蛋白輸出的豐富多樣性 (HLA 等位基因變異體)。事實上，存在＞20,000 種可能的不同 HLA-A、HLA-B 及 HLA-C 蛋白複合物，各者皆具有其自己的穩定性及典型配體特異性。HLA 蛋白系統的高度多樣性使該系統能夠作為整體來辨識大量可能的抗原，包括源自非人類來源的肽、經轉譯後修飾之自身肽及經離體合成之肽。

腫瘤組織中出現的體細胞突變，例如新抗原，可能在多個患者中發現，或者為個體之腫瘤所特有。對於例如藉由透過使用疫苗或經工程改造之 T 細胞療法誘導 T 細胞反應來研發針對此等新抗原之療法的需求尚未得到滿足。

本申請涉及鑑定主要組織相容性 I 類 (MHCI) 相關抗原及相關系統、方法及套組。由於發現了抗原與 MHCI 複合物之間的特異性結合，在人類中，MHCI 複合物由源自多型性 HLA 基因的 HLA 蛋白及保守 B2M 蛋白組成，可以從複數個個體中篩選出具有特定 HLA 等位基因以及表現可經切割為複數個新抗原決定位之新抗原的腫瘤或癌症的個體以進行免疫療法。例如，癌症疫苗可經設計為編碼新抗原決定位，該等新抗原決定位在個體中的 MHCI (例如，HLA) 複合物內結合，因此在該個體中誘導免疫反應。T 細胞療法亦可用於辨識個體中的特定新抗原決定位-HLA 結合對。

在一個態樣中，本揭露提供一種產生單等位基因 MHC 表現細胞株之方法。在一些實施例中，該方法包含： i) 獲得不表現內源性 MHC 等位基因 (allele) 的細胞； ii) 將編碼外源性 MHC 等位基因多肽的多核苷酸引入該細胞中，使得該外源性 MHC 等位基因多肽由該細胞表現，以製造單等位基因 MHC 表現細胞；以及 iii) 在用以獲得單等位基因 MHC 表現細胞株的條件下擴增該單等位基因 MHC 表現細胞。

在一些實施例中，步驟 i) 中的細胞經遺傳修飾以使一個或多個內源性 MHC 等位基因突變或缺失。在一些實施例中，步驟 i) 中的細胞經遺傳修飾以使一內源性 MHC 等位基因突變或缺失。

在一些實施例中，步驟 i) 包含遺傳地修飾細胞以使一個或多個內源性 MHC 等位基因突變或缺失。在一些實施例中，步驟 i) 包含遺傳地修飾細胞以使一內源性 MHC 等位基因突變或缺失。

在一些實施例中，本文所述的 MHC 等位基因為 MHCI 等位基因。

在一些實施例中，單等位基因 MHC 表現細胞株表現 β2-微球蛋白 (B2M)。

在一些實施例中，MHCI 等位基因由以下基因座中之任一者編碼：HLA-A、HLA-B 及 HLA-C。本文所述的示例性 MHCI 等位基因可包括本領域已知的彼等 MHCI 等位基因 (例如，公共資料庫中的 HLA 等位基因)。在一些實施例中，MHCI 等位基因係選自 A*01.01、A*02.01、A*03.01、A*11.01、A*24.02、B*07.02、B*08.01、B*35.01、B*44.02、B*51.01、C*03.04、C*04.01、C*05.01、C*06.02、C*07.01、C*07.02 及 C*08.02。

在一些實施例中，本文所述的方法進一步包含將編碼複數個新抗原相關聯肽的多核苷酸卡匣引入到單等位基因 MHC 表現細胞株中。在一些實施例中，該複數個新抗原相關聯肽係在單等位基因 MHC 表現細胞株中表現並且經切割為複數個新抗原決定位，其中至少一個新抗原決定位特異性地結合至外源性 MHC 等位基因多肽。在一些實施例中，該至少一種新抗原決定位的長度為 8、9、10、11、12 或 13 個胺基酸。在一些實施例中，藉由生物資訊學及/或腫瘤突變之臨床分析來鑑別新抗原相關聯肽。在一些實施例中，該等新抗原相關聯肽中之至少一者與 SEQ ID NO: 1 至 72、75 至 191 及 195 至 222 中之至少一者具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高 (加上所提供之範圍內的任何值或子範圍，包括端點) 序列同一性。在一些實施例中，該等新抗原相關聯肽中之至少一者由 SEQ ID NO: 1 至 72、75 至 191 及 195 至 222 中之至少一者組成。在一些實施例中，該複數個新抗原相關聯肽中之各者的長度為在約 20 與約 50 個胺基酸之間、在約 25 與約 45 個胺基酸之間、在約 30 與約 40 個胺基酸之間、在約 20 與約 30 個胺基酸之間、在約 30 與約 40 個胺基酸之間、在約 40 與約 50 個胺基酸之間，加上所提供之範圍 (包括端點) 內的任何值或子範圍。

在一些實施例中，該等新抗原相關聯肽中之至少一者係選自本說明書、序列表及/或附圖中列出的新抗原。

在一些實施例中，本文所述之細胞為抗原呈現細胞 (APC)。在一些實施例中，該細胞為 HMy2.C1R 細胞。在一些實施例中，該細胞為 K562 細胞 (例如，ATCC 產品 CCL-243™)。

在另一態樣中，本揭露提供藉由本文所述的方法產生的單等位基因 MHC 表現細胞株。

在另一態樣中，本揭露提供一種系統，其包含複數個單等位基因 MHC 表現細胞株，其中各細胞株不表現內源性 MHC 等位基因，並且其中各細胞株表現外源性 MHC 等位基因，使得各細胞株表現不同的外源性 MHC 等位基因。

在一些實施例中，單等位基因 MHC 表現細胞株中之各者係經過基因修飾，以使一個或多個內源性 MHC 等位基因突變或缺失。在一些實施例中，單等位基因 MHC 表現細胞株中之各者係經過基因修飾，以使內源性 MHC 等位基因突變或缺失。

在一些實施例中，經表現之 MHC 等位基因中之各者為 MHCI 等位基因。

本文所述的示例性 MHCI 等位基因可包括本領域已知的彼等 MHCI 等位基因 (例如，公共資料庫中的 HLA 等位基因)。在一些實施例中，MHCI 等位基因由以下基因座中之任一者編碼：HLA-A、HLA-B 及 HLA-C。在一些實施例中，MHC 等位基因係選自 A*01.01、A*02.01、A*03.01、A*11.01、A*24.02、B*07.02、B*08.01、B*35.01、B*44.02、B*51.01、C*03.04、C*04.01、C*05.01、C*06.02、C*07.01、C*07.02 及 C*08.02。

在一些實施例中，各細胞株包含編碼複數個新抗原相關聯肽的多核苷酸卡匣。在一些實施例中，該複數個新抗原相關聯肽係在複數個單等位基因 MHC 表現細胞株中表現並且經切割為複數個新抗原決定位，其中至少一個新抗原決定位特異性地結合至外源性 MHC 等位基因多肽。在一些實施例中，該至少一種新抗原決定位的長度為 8、9、10、11、12 或 13 個胺基酸。在一些實施例中，藉由生物資訊學及/或腫瘤突變之臨床分析來鑑別該複數個新抗原相關聯肽。在一些實施例中，該複數個新抗原相關聯肽中之至少一者與 SEQ ID NO: 1 至 72、75 至 191 及 195 至 222 中之至少一者具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高 (加上所提供之範圍內的任何值或子範圍，包括端點) 序列同一性。在一些實施例中，該等新抗原相關聯肽中之至少一者由 SEQ ID NO: 1 至 72、75 至 191 及 195 至 222 中之至少一者組成。在一些實施例中，該複數個新抗原相關聯肽中之各者的長度為在約 20 與約 50 個胺基酸之間、在約 25 與約 45 個胺基酸之間、在約 30 與約 40 個胺基酸之間、在約 20 與約 30 個胺基酸之間、在約 30 與約 40 個胺基酸之間、在約 40 與約 50 個胺基酸之間，加上所提供之範圍 (包括端點) 內的任何值或子範圍。在一些實施例中，該等新抗原相關聯肽中之至少一者係選自本說明書、序列表及/或附圖中列出的新抗原。

在一些實施例中，單等位基因 MHC 表現細胞株中之各者為抗原呈現細胞 (APC)。在一些實施例中，該細胞為 HMy2.C1R 細胞。在一些實施例中，該細胞為 K562 細胞 (例如，ATCC 產品 CCL-243™)。

在另一態樣中，本揭露提供一種編碼複數個新抗原相關聯肽的分離之多核苷酸卡匣。在一些實施例中，該複數個新抗原相關聯肽中之各者的長度為在約 20 與約 50 個胺基酸之間、在約 25 與約 45 個胺基酸之間、在約 30 與約 40 個胺基酸之間、在約 20 與約 30 個胺基酸之間、在約 30 與約 40 個胺基酸之間、在約 40 與約 50 個胺基酸之間，加上所提供之範圍 (包括端點) 內的任何值或子範圍。在一些實施例中，藉由生物資訊學及/或腫瘤突變之臨床分析來鑑別該複數個新抗原相關聯肽。

在一些實施例中，該分離之多核苷酸卡匣進一步包含在兩個新抗原相關聯肽之間的至少一個連接子。在一些實施例中，該連接子包含肽連接子，諸如甘胺酸-絲胺酸 (GS) 連接子中之一者。

在一些實施例中，該分離之多核苷酸卡匣進一步包含至少一個啟動子，該至少一個啟動子能夠在細胞中啟動該複數個新抗原相關聯肽轉譯為單一多肽。在一些實施例中，該單一多肽在細胞中經切割成複數個新抗原決定位。在一些實施例中，該複數個新抗原決定位經呈現在細胞表面上。

在一些實施例中，該複數個新抗原相關聯肽中之至少一者與 SEQ ID NO: 1 至 72、75 至 191 及 195 至 222 中之至少一者具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高 (加上所提供之範圍內的任何值或子範圍，包括端點) 序列同一性。

在另一態樣中，本揭露提供一種鑑定新抗原決定位-MHC 結合對的方法。在一些實施例中，該方法包含： i) 提供包含細胞的單等位基因 MHC 表現細胞株，其中各細胞表現第一外源性 MHC 等位基因且包含編碼複數個新抗原相關聯肽的多核苷酸卡匣； ii) 在各細胞中表現該複數個新抗原相關聯肽，其中藉由在各細胞內使複數個新抗原相關聯肽裂解來產生複數個新抗原決定位，使得一個或多個新抗原決定位與在細胞表面處的該第一外源性 MHC 結合； iii) 從該新抗原決定位的在該細胞表面處的所結合的第一外源性 MHC 中溶析該新抗原決定位；以及 iv) 鑑別來自步驟 iii) 溶析的新抗原決定位，從而鑑別新抗原決定位-MHC 結合對。

在另一態樣中，本揭露提供一種鑑定新抗原決定位-MHC 結合對的方法，其包含： i) 提供包含細胞的單等位基因 MHC 表現細胞株，其中各細胞表現第一外源性 MHC 等位基因； ii) 使該細胞與合成的新抗原決定位接觸； iii) 溶析在細胞表面結合至該第一外源性 MHC 等位基因的肽；及 iv) 鑑別來自步驟 iii) 溶析的新抗原決定位，從而鑑別新抗原決定位-MHC 結合對。

在一些實施例中，藉由肽交換測定來確定該複數個新抗原相關聯肽與一個或多個 MHC 結合。

在一些實施例中，藉由生物資訊學及/或腫瘤突變之臨床分析來鑑別該複數個新抗原相關聯肽。

在一些實施例中，該複數個新抗原決定位中之至少一者的長度為 8、9、10、11、12 或 13 個胺基酸。

在一些實施例中，該複數個新抗原相關聯肽中之各者的長度為在約 20 與約 50 個胺基酸之間、在約 25 與約 45 個胺基酸之間、在約 30 與約 40 個胺基酸之間、在約 20 與約 30 個胺基酸之間、在約 30 與約 40 個胺基酸之間、在約 40 與約 50 個胺基酸之間，加上所提供之範圍 (包括端點) 內的任何值或子範圍。

在一些實施例中，該複數個新抗原相關聯肽中之至少一者係選自本說明書、序列表及/或附圖中列出的新抗原。

在一些實施例中，該複數個新抗原相關聯肽係在單一多肽中表現。在一些實施例中，該單一多肽包含在兩個新抗原相關聯肽之間的至少一個連接子。在一些實施例中，該連接子包含肽連接子，諸如甘胺酸-絲胺酸 (GS) 連接子中之一者。

在一些實施例中，藉由肽交換檢定來確定合成的新抗原決定位結合至一個或多個 MHC 等位基因多肽。

在一些實施例中，本文所述方法的步驟 i) 至 iv) 在包含細胞的第二單等位基因 MHC 表現細胞株中重複，其中各細胞表現第二外源性 MHC 等位基因多肽。

在一些實施例中，在本文所述方法的步驟 i) 中，單等位基因 MHC 表現細胞株之各細胞經遺傳修飾以使一內源性 MHC 等位基因突變或缺失。

在一些實施例中，本文所述方法的步驟 i) 包含遺傳地修飾單等位基因 MHC 表現細胞株的一個或多個細胞以使一個或多個 (例如一) 內源性 MHC 等位基因突變或缺失。在一些實施例中，MHC 等位基因為 MHCI 等位基因。在一些實施例中，單等位基因 MHC 表現細胞株表現 β2-微球蛋白 (B2M)。本文所述的示例性 MHCI 等位基因可包括本領域已知的彼等 MHCI 等位基因 (例如，公共資料庫中的 HLA 等位基因)。在一些實施例中，MHCI 等位基因由以下基因座中之任一者編碼：HLA-A、HLA-B 及 HLA-C。在一些實施例中，MHC 等位基因係選自 A*01.01、A*02.01、A*03.01、A*11.01、A*24.02、B*07.02、B*08.01、B*35.01、B*44.02、B*51.01、C*03.04、C*04.01、C*05.01、C*06.02、C*07.01、C*07.02 及 C*08.02。

在另一態樣中，本揭露提供一種疫苗，諸如癌症疫苗。在一些實施例中，該癌症疫苗包含分離之多肽或編碼該多肽之分離之多核苷酸，其中該多肽包含藉由本文所述的方法鑑別的新抗原決定位-MHC 結合對中之新抗原決定位。

在另一態樣中，本揭露提供一種製備表現 T 細胞受體 (TCR) 及/或嵌合抗原受體 (CAR) 的 T 細胞之方法，其包含將 TCR 及/或 CAR 引入 T 細胞內，其中該 TCR 及/或 CAR 特異性地結合至新抗原決定位-MHC 複合物，該複合物由藉由本文所述方法鑑別的新抗原決定位-MHC 結合對形成。

在另一態樣中，本揭露提供一種表現 T 細胞受體 (TCR) 及/或嵌合抗原受體 (CAR) 的重組 T 細胞。在一些實施例中，TCR 及/或 CAR 特異性地結合至新抗原決定位-MHC 結合對，該結合對包含：新抗原決定位，其藉由使腫瘤或癌症所表現的新抗原相關聯肽裂解而產生；以及由該腫瘤或癌症表現的 MHC 等位基因。

在一些實施例中，MHC 等位基因肽為 MHCI 等位基因多肽。

本文所述的示例性 MHCI 等位基因可包括本領域已知的彼等 MHCI 等位基因 (例如，公共資料庫中的 HLA 等位基因)。在一些實施例中，MHCI 等位基因由以下基因座中之任一者編碼：HLA-A、HLA-B 及 HLA-C。在一些實施例中，MHC 等位基因肽係由選自以下之 MHC 等位基因編碼：A*01.01、A*02.01、A*03.01、A*11.01、A*24.02、B*07.02、B*08.01、B*35.01、B*44.02、B*51.01、C*03.04、C*04.01、C*05.01、C*06.02、C*07.01、C*07.02 及 C*08.02。

在一些實施例中，新抗原相關聯肽係藉由腫瘤突變的生物資訊學及/或臨床分析來鑑別。

在一些實施例中，新抗原決定位的長度為 8、9、10、11、12 或 13 個胺基酸。

在一些實施例中，該新抗原相關聯肽與 SEQ ID NO: 1 至 72、75 至 191 及 195 至 222 中之至少一者具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高 (加上所提供之範圍內的任何值或子範圍，包括端點) 序列同一性。

在一些實施例中，該新抗原相關聯肽的長度為在約 20 與約 50 個之間的胺基酸、在約 25 與約 45 個之間的胺基酸、在約 30 與約 40 個之間的胺基酸、在約 20 與約 30 個之間的胺基酸、在約 30 與約 40 個之間的胺基酸、在約 40 與約 50 個之間的胺基酸，加上所提供之範圍 (包括端點) 內的任何值或子範圍。

在另一態樣中，本揭露提供一種選擇患有癌症或腫瘤的個體以藉由表現 T 細胞受體 (TCR) 及/或嵌合抗原受體 (CAR) 的 T 細胞進行治療之方法。在一些實施例中，該方法包含 (i) 對該個體進行基因分型，以鑑別由該個體所表現的 MHC 等位基因及由該癌症或腫瘤所表現的新抗原，其中該新抗原可由細胞裂解以產生複數個新抗原決定位；以及 (ii) 確定所表現的 MHC 是否能夠結合該等新抗原決定位中之一者或多者，其中如果所鑑別的 MHC 與複數個該等新抗原決定位中之新抗原決定位形成新抗原決定位-MHC 結合對，則該個體被確定為能夠藉由該 T 細胞治療，其中該 TCR 及/或該 CAR 與該新抗原決定位-MHC 結合對特異性結合。

在另一態樣中，本揭露提供一種選擇患有癌症或腫瘤的個體以藉由癌症疫苗進行治療的方法，其包含 (i) 對該個體進行基因分型，以鑑別由該個體所表現的 MHC 蛋白及由該癌症或腫瘤所表現的新抗原其中該新抗原可由細胞裂解以產生複數個新抗原決定位；以及 (ii) 確定該 MHC 是否能夠結合該等新抗原決定位中之一者或多者，其中，如果所鑑別的 MHC 蛋白及該複數個新抗原決定位中之一新抗原決定位形成新抗原決定位-MHC 結合對，則確定個體可藉由包含該新抗原決定位或編碼該新抗原決定位的多核苷酸之癌症疫苗進行治療。

在另一態樣中，本揭露提供一種治療患有表現新抗原相關聯肽及 MHC 的癌症或腫瘤之個體的方法，其中 MHC 經確定為結合至來自該新抗原的新抗原決定位，該方法包含向個體投予治療有效量之表現 T 細胞受體 (TCR) 及/或嵌合抗原受體 (CAR) 的 T 細胞，其中 TCR 及/或 CAR 特異性地結合至包含 MHC 及該新抗原決定位的新抗原決定位-MHC 結合對。

在另一態樣中，本揭露提供一種治療患有癌症或腫瘤的個體之方法。在一些實施例中，該方法包含 (i) 選擇表現 MHC 等位基因且患有表現新抗原的癌症之個體，其中 MHC 經確定為結合至來自新抗原的新抗原決定位，及 (ii) 向該個體投予治療有效量之表現 T 細胞受體 (TCR) 及/或嵌合抗原受體 (CAR) 的 T 細胞，其中該 TCR 及/或該 CAR 與包含該 MHC 及該新抗原決定位的新抗原決定位-MHC 結合對特異性結合。

在另一態樣中，本揭露提供一種治療患有表現新抗原及 MHC 等位基因的癌症或腫瘤之個體之方法，其中 MHC 經確定為結合至來自該新抗原的新抗原決定位，該方法包含向個體投予治療有效量之包含新抗原決定位或編碼該新抗原決定位的多核苷酸之疫苗。

在一些實施例中，藉由肽交換測定來確定該新抗原決定位與一個或多個 MHC 結合。

在一些實施例中，藉由生物資訊學及/或腫瘤突變之臨床分析來鑑別新抗原。

在一些實施例中，該新抗原為在本說明書、序列表及/或圖示中列出的新抗原。

在一些實施例中，該新抗原決定位與 SEQ ID NO: 1 至 72、75 至 191 及 195 至 222 中之至少一者具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高 (加上所提供之範圍內的任何值或子範圍，包括端點) 序列同一性。

在一些實施例中，MHC 等位基因為 MHCI 等位基因。

相關申請的交叉引用

本申請要求 2021 年 10 月 28 日提交的美國臨時申請 63/272,933、2022 年 6 月 6 日提交的美國臨時申請第 63/349,525 號及 2022 年 9 月 22 日提交的美國臨時申請第 63/409,072 號之優先權權益。此等申請之全部內容藉由引用以其整體併入本文。序列表

本申請含有已經由 EFS-Web 提交的序列表。名為「048893-559001WO_Sequence_Listing.xml」之文本文件的內容創建於 2022 年 10 月 26 日，大小為 193,168 位元組，係藉由引用以其整體併入本文。

在閱讀本描述之後，對於熟習此項技術者而言，如何在各種替代實施例及替代應用中實施本揭示內容將變得顯而易見。然而，本文將不描述本發明之所有各種實施例。應理解，本文呈現之實施例僅以實例之方式呈現，而非限制性的。因此，各種替代實施例之此詳細描述不應解釋為限制如本文所闡述之本揭示內容的範疇或廣度。

在揭示及描述本技術之前，應理解，以下描述之態樣不限於特定組成物、製備該等組合物之方法或其用途，當然可改變。亦應理解，本文所使用之術語僅出於描述特定態樣之目的，而無意於進行限制。

僅為了讀者之方便而將詳細描述分為多個部分，見於任何部分之揭示內容均可與另一部分中之內容組合。為了方便讀者，可在說明書中使用標題或副標題，其不意欲影響本揭示內容之範疇。 I. 定義

除非另有定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本揭示內容所屬技術者通常所理解相同的含義。在本說明書及隨後之申請專利範圍中，將參考許多術語，該等術語應定義為具有以下含義：

如本文所述，除非另外指示，否則任何濃度範圍、百分比範圍、比率範圍或整數範圍應理解為包括在所引述範圍及 (在適當時) 其分數部分 (諸如整數之十分之一及百分之一) 內的任何整數值。

本文所使用之術語僅用於描述特定實施例之目的，而無意於進行限制。除非上下文另外明確指出，否則如本文中所使用，單數形式「一(a/an)」及「該 (the)」亦意欲包括複數形式。

「視情況存在/發生的（optional）」或「視情況（optionally）」意指隨後描述之事件或情況可能發生或可能不發生，且該描述包括事件或情況發生之情形以及事件或情況不發生之情形。

術語「約」當在數字名稱，例如溫度、時間、量、濃度等 (包括範圍) 之前使用時，指示可能變化 (+) 或 (-) 10%、5%、1% 之近似值或其之間的任何子範圍或子值。較佳，術語「約」在關於一量使用時意指該量可能變化+/- 10％。

「包含（comprising/comprises）」旨在意指組合物及方法包括所列舉之要素，但不排除其他要素。當用於定義組合物及方法時，「基本上由……組成」應意指排除對於所述目的而言對組合具有任何實質意義之其他要素。因此，基本上由如本文所定義之要素組成的組合物將不排除不會實質上影響所主張之發明的基本及新穎特徵的其他物質或步驟。「由……組成」應意指排除超過痕量要素的其他成分及實質性的方法步驟。此等過渡術語之每一者定義的實施例皆落於本揭露之範疇內。

如本文中所使用，術語「癌症」係指在哺乳動物 (例如人) 中發現的所有類型之癌症、腫瘤或惡性腫瘤，包括白血病、淋巴瘤、癌瘤及肉瘤。可使用本文提供的化合物或方法治療的實例性癌症包括腦癌、神經膠質瘤、神經膠質母細胞瘤、神經母細胞瘤、前列腺癌、大腸直腸癌、胰腺癌、神經管胚細胞瘤、黑色素瘤、子宮頸癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、頭癌、霍奇金氏病及非霍奇金氏淋巴瘤。可用本文提供的化合物或方法治療的示例性癌症包括甲狀腺癌、內分泌系統癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、頭頸癌、肝癌、腎癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、直腸癌、胃癌和子宮癌.另外的示例包括甲狀腺癌、膽管癌、胰臟癌、皮膚惡性黑色素瘤、大腸腺癌、直腸腺癌、胃腺癌、食道癌、頭頸部鱗狀細胞癌、浸潤性乳癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌、間皮瘤、多發性骨髓瘤、神經母細胞瘤、神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、卵巢癌、橫紋肌肉瘤、原發性血小板增多症、原發性巨球蛋白血症、原發性腦腫瘤、惡性胰腺胰島瘤、惡性類癌、尿路膀胱癌、癌前皮膚病變、睾丸癌、甲狀腺癌、神經母細胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、惡性高鈣血症、子宮內膜癌、腎上腺皮質癌、內分泌或外分泌胰腺腫瘤、甲狀腺髓樣癌症、甲狀腺髓樣癌、黑色素瘤、大腸直腸癌、乳頭狀甲狀腺癌、肝細胞癌或前列腺癌。

如本文所用之「樣品」或「生物樣品」指代意欲用於分析之任何樣品。在一些實施例中，樣品係自患者獲取。在一些實施例中，樣品為「生物流體樣品」。本文所用之「生物流體樣品」係指來自生物體或個體的任何生物流體。實例包括全血、血漿、淚液、唾液、淋巴液、尿液、血清、腦脊髓液、胸膜滲出液及腹水。

術語「免疫反應」及諸如此類在常用及慣常意義上係指抵抗疾病之生物體反應。該反應可由先天性免疫系統或由適應性免疫系統所產生，如業內眾所周知。

術語「調節免疫反應」及諸如此類係指因投予藥劑 (例如如本文所揭示之化合物，包括其實施例) 而改變個體之免疫反應。據此，免疫反應可因投予藥劑 (例如如本文所揭示之化合物，包括其實施例) 而活化或鈍化。

「B 細胞」或「B 淋巴球」指代其等在本領域中之標準使用。B 細胞係淋巴球中之一類白血球 (white blood cell、leukocyte)，其可發育成漿細胞 (「成熟 B 細胞」) 以產生抗體。「未成熟 B 細胞」係可發育成成熟 B 細胞之細胞。通常，祖-B 細胞發生免疫球蛋白重鏈重排而變成祖 B 前 B 細胞，且另外發生免疫球蛋白輕鏈重排而變成未成熟 B 細胞。未成熟 B 細胞包括 T1 及 T2 B 細胞。

本文所用之「T 細胞」或「T 淋巴球」係在細胞媒介之免疫性中發揮核心作用的一類淋巴球 (白血球之亞型)。其與其他淋巴球 (諸如 B 細胞及自然殺手細胞) 之區別可在於在細胞表面上存在 T 細胞受體。T 細胞包括例如天然殺手 T (NKT) 細胞、細胞毒性 T 淋巴球 (CTL)、調控性 T (Treg) 細胞及 T 輔助細胞。可藉由使用 T 細胞檢測劑來區分不同類型之 T 細胞。

「調控性 T 細胞」或「抑制性 T 細胞」係調節免疫系統、維持自體抗原耐受性及預防自體免疫疾病之淋巴球。

胺基酸在本文中可以用它們一般已知的三個字母符號或 IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission 推薦的單一字母符號來指稱。同樣地，核苷酸可用它們一般被接受的單個字母代碼來指稱。

術語「多肽 (polypeptide)」、「肽 (peptide)」及「蛋白質 (protein)」在本文中可互換使用且係指胺基酸殘基的聚合物，其中該聚合物可在實施例中與不由胺基酸組成的部分結合。該等術語適用於胺基酸聚合物，其一個或多個胺基酸殘基是對應天然存在的胺基酸的人工化學模擬物，以及天然存在的胺基酸聚合物和非天然存在的胺基酸聚合物。「融合蛋白」涉及編碼兩個或更多個單獨蛋白質序列的嵌合蛋白，該兩個或更多個單獨蛋白質序列重組表現為單一部分。

胺基酸或核苷酸鹼基的「位置」由一個數字表示，該數字基於其相對於 N-末端 (或 5’-端) 的位置依序鑑別參考序列中的每一胺基酸 (或核苷酸鹼基)。由於在確定最佳比對時必須考慮缺失、插入、截短、融合等，因此，一般而言藉由簡單從 N 端計數而確定的測試序列中的胺基酸殘基數目不一定與參考序列中其對應位置的數目相同。例如，在變異體相對於比對參考序列而具有缺失的情況下，在變異體中將不存在與參考序列中相對應缺失位點之位置處的胺基酸。在比對的參考序列中有插入的情況下，該插入將不對應於參考序列中的經編號之胺基酸位置。在截短或融合的情況下，參考序列或比對序列中可能存在不對應於對應序列中任何胺基酸的胺基酸序列。

當在編號給定胺基酸或多核苷酸序列的背景中使用時，術語「參考編號」或「對應於」涉及當將給定胺基酸或多核苷酸序列與參考序列進行比較時編號特定參考序列的殘基。

術語「胺基酸側鏈」係指含於胺基酸上之功能性取代基。舉例而言，胺基酸側鏈可為天然胺基酸之側鏈。天然胺基酸係彼等由基因代碼編碼者 (例如丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸或纈胺酸) 以及彼等隨後經修飾之胺基酸 (例如羥基脯胺酸、γ-羧基麩胺酸鹽及 O-磷酸絲胺酸)。在實施例中，胺基酸側鏈可為非天然胺基酸側鏈。

術語「UV-可切割胺基酸側鏈」或「UV-可切割胺基酸」指代具有與天然胺基酸相同的基本化學結構 (亦即結合至氫、羧基、胺基及 R 基團的 α 碳) 之化合物的功能性取代基。UV-可裂解胺基酸係天然出現或以化學方式合成之非蛋白原性胺基酸。該等類似物可具有經修飾的 R 基團或經修飾的肽主鏈，但保留了與天然胺基酸相同的基本化學結構。UV-可裂解胺基酸包括但不限於 2-硝基苯基甘胺酸 (NPG)、擴展鄰-硝基苄基連接子、鄰-硝基苄基籠形酚、鄰-硝基苄基籠形硫醇、32 硝基藜蘆基氧羰基 (NVOC) 籠形苯胺、鄰-硝基苄基籠形硒化物、雙-偶氮苯、香豆素、桂醯基、螺吡喃、2-硝基苯丙胺酸 (2-nF) 及 3-胺基-3-(2-硝基苯基)丙酸 (ANP) 胺基酸類似物。

如本文所提供的術語「MHC」或「主要組織相容性複合物」包括脊椎動物 DNA 上的大基因座，該基因座含有一組緊密連接的多型性基因，該等基因編碼對於適應性免疫系統至關重要的細胞表面蛋白。此等細胞表面蛋白為 MHC 分子。在本申請中，MHC 可以指代含有相關基因的 DNA 或多核苷酸，或由相關 DNA 或多核苷酸所編碼的蛋白質或多肽。

如本文所提供的術語「MHCI」或「主要組織相容性複合物 I 類」或「主要組織相容性複合物 I」或「MHCI 單體」包括任一重組或天然形式之主要組織相容性複合物-1 (MHCI) 蛋白或維持 MHCI 活性 (例如與 MHCI 相比具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100% 或更高之活性) 的其變異體、同種同源物或同源物。在一些態樣中，與天然 MHCI 多肽相比，變異體或同系物在整個序列或部分序列 (例如 50 個、100 個、150 個或 200 個連續胺基酸部分) 中具有至少 50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 之胺基酸序列同一性。在實施例中，MHCI 為兩種以非共價方式結合之蛋白質重鏈 (α) 及輕鏈 (β2-微球蛋白) 的異二聚體、其同源物或功能片段。在實施例中，MHCI 包括肽配體。在一些實施例中，術語「MHCI」或「主要組織相容性複合物 I 類」亦可指代編碼本文所述的重組或天然存在形式之 MHCI 蛋白的 DNA 或多核苷酸。

術語「HLA」或「人類白血球抗原」指代由 MHC 基因複合物編碼的一組蛋白質，或一組含有編碼此類蛋白質的人類第 6 號染色體上之基因的 DNA 或多核苷酸。在一些實施例中，MHC 基因複合物編碼 HLA-A、HLA-B 及 HLA-C 蛋白質群組。

術語「β-2 微球蛋白」或「B2M」或「β2 微球蛋白」或「β 鏈」指代細胞表面 MHCI 或 HLA 蛋白複合物之無變的較小或輕鏈蛋白質。B2M 與一條 α 鏈 (重鏈) 形成異源二聚體複合物。B2M 係由 B2M 基因編碼。

術語「α 鏈」或「阿爾法鏈」指代 MHCI 或 HLA 蛋白複合物之較大或重鏈蛋白質。α 鏈進一步分成次單元 α1、α2 及 α3 且含有一個跨膜螺旋。α 鏈經由 α3 次單元結合 B2M 以形成稱為 MHCI 或 HLA 複合物之異二聚體。α 鏈係多型的，且主要由 HLA-A、HLA-B 及 HLA-C 基因編碼，並在較小程度上由 HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-K 及 HLA-L 編碼。

如本文中所使用，術語「抗原」用於描述在投予免疫活性個體時誘導免疫反應 (例如，細胞毒性 T 淋巴球 (CTL) 反應、B 細胞反應 (例如，產生特異性地結合表位之抗體)、NK 細胞反應或其任何組合) 之化合物、組成物或化學物。因此，免疫原性或抗原性組成物係能夠在免疫活性個體中誘發免疫反應之組成物。

如本文所用，術語「新抗原」或「新抗原相關聯肽」用於描述可能被宿主免疫系統辨識為「非自身」的新形成之抗原或抗原相關聯肽。新抗原可起因於因腫瘤突變而形成的經改變之腫瘤蛋白、或細菌或其他病原體 (例如，來自病毒蛋白)。或者，其亦可衍生自移植物，例如組織移植物或同種異體移植物或其他移植細胞。新抗原的非限制性示例列於下表 2 或本說明書他處及圖示中。

如本文中所使用，術語「腫瘤相關抗原」或「TAA」用於闡述與正常細胞相比顯著過度表現於癌症中且由此亦大量呈現於癌細胞表面上之蛋白質。TAA 的非限制性示例列於下表 1 或本說明書他處及圖示中。

表 1. 說明性腫瘤相關抗原WT1 MAGEA1 MSLN PRAME CTAG1A (NY-ESO)

表 2. 說明性共有的新抗原

JAK2 V617F	PIK3CA H1047R	IDH2 R140Q	KRAS G13D	MYD88 L265P
BRAF V600E	EGFR L858R	FLT3 D835Y	NRAS Q61R	DNMT3A R882H
BRAF V600M	EGFR E746_A750del	ERBB2 S310F	NRAS Q61K	IDH1 R132H
KRAS G12V	TP53 R175H	FGFR3 S249C	PIK3CA E542K	SF3B1 R625C
KRAS G12C	TP53 R248Q	PTEN R130Q	PIK3CA E545K	GTF2I L424H
KRAS G12D	TP53 R273C	PTEN R130G	TP53 R273L	GNAQ Q209P
KRAS G12R	TP53 R273H	SF3B1 R625H	TP53 R282W	GNAQ Q209L
				GNA11 Q209L

如本文所用之術語「結合」及「結合的」根據其等之簡單及普通的含義使用且指代原子或分子之間的締合。締合可以是直接締合或間接締合。例如，結合的原子或分子可以是直接的，例如藉由共價鍵或連接子（例如第一連接子或第二連接子）；或是間接的，例如藉由非共價鍵（例如靜電相互作用（例如離子鍵、氫鍵、鹵鍵）、凡得瓦相互作用（例如偶極-偶極、偶極誘導偶極、倫敦分散）、環堆積（π 效應）、疏水相互作用等）。

術語「抗體」係指由免疫球蛋白基因或其功能性片段編碼的多肽，其特異性地結合並辨識抗原。免疫球蛋白基因包括 κ (kappa)、λ (lambda)、α (alpha)、γ (gamma)、δ (delta)、ε (epsilon) 及 μ(mu) 恆定區基因，以及無數的免疫球蛋白可變區基因。輕鏈分為 κ 或 λ。重鏈被分類為 γ、μ、α、δ 或 ε，其依次分別定義了免疫球蛋白類別，IgG、IgM、IgA、IgD 及 IgE。

在片語「特異性地 (或選擇性地) 結合」至抗體或「特異性地 (或選擇性地) 與其發生免疫反應」提及蛋白質或肽時，其係指確定蛋白質存在的結合反應，通常係在蛋白質及其他生物製劑的異質群體中。因此，在指定的免疫檢定條件下，指定的抗體與特定蛋白質的結合至少為背景的兩倍，更通常為背景的 10 到 100 倍以上。在此類條件下與抗體的特異性結合需要選擇針對特定蛋白質具有特異性的抗體。例如，可選擇多克隆抗體以僅獲得與所選抗原而非其他蛋白質發生特異性免疫反應的抗體的子集。該選擇可通過減去與其他分子交叉反應的抗體來實現。可使用各種免疫測定形式來選擇與特定蛋白質發生特異性免疫反應的抗體。例如，常規地，使用固相 ELISA 免疫測定來選擇與蛋白質發生特異性免疫反應的抗體（請參閱例如 Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998) 之可用於確定特異性免疫反應性的免疫測定形式及條件的描述）。

術語「變性」係指蛋白質、多肽、DNA、RNA 或其他生物聚合物之三維結構藉由化學或機械方式或藉由加熱或冷卻破壞的過程。

「肽交換」過程指代首先形成結合至肽之 MHCI 或 HLA 複合物，該肽能夠經替換為或交換為具有分析意義之另一肽 (諸如推定的新抗原相關聯肽)。在一些情形下，可藉由降低第一肽對所關注肽之結合親和力 (例如經由第一肽之化學裂解、酶促裂解或 UV-調介之裂解) 促進交換。

「1D-LC」或「一維液相層析」過程係指單液相層析分離，與之相比，「2D-LC」或「二維液相層析」係指執行兩次分離之層析方法。

「粒徑篩析層析法」或「SEC」係根據固相層析介質上之大小來分離分子的層析方式，其中較大分子以不同於較小分子之速率穿過固相管柱。在一些實施例中，SEC 用於 1D-LC 過程中。SEC 亦可用於與不同分離形式 (例如反相液相層析步驟) 組合之 2D-LC 過程中，或可採用離子交換或陽離子交換或親和分離作為第二維。

「毛細管電泳」或「CE」係指使用電流使分子移經毛細管之過程。每一分子之遷移率可取決於其電荷、大小及形狀。存在若干類型之 CE，尤其包括毛細管區帶電泳 (CZE)、毛細管凝膠電泳 (CGE)、膠粒電動力學毛細管層析 (MEKC)、毛細管電層析 (CEC)、毛細管等電聚焦 (CIEF) 及毛細管等電泳 (CITP)。

本文所用之「毛細管區帶電泳」或「CZE」係指可基於不同遷移率來分離緩衝溶液中之不同分子的一類 CE。

「質譜法」或「MS」係指量測樣品中之一種或多種分子之質荷比 (m/z) 的技術。如本文所用，「串聯式 MS」或「MS/MS」係指將單個離子、多個離子或整個質量包絡 (前驅體) 移動至片段化腔室且接著將片段化產物送至質量分析儀。根據質譜儀之設計，片段化事件可能發生在單個質量分析儀之前、兩個或多個不同分析儀之間或單個質量分析儀內。

MS 分析可能有多種選擇。在一些實施例中，MS 儀器不包含四極杆。在一些實施例中，MS 儀器包含至少一個四極杆。在一些實施例中，MS 儀器包含至少 2 個四極分析儀。在一些情形下，MS 儀器包含八極。在一些實施例中，MS 儀器包含至少 3 個四極分析儀。在某些 MS 中，偵測器為離子阱、四極杆、軌道阱或 TOF。在一些實施例中，MS儀器或方法為多重反應監測 (MRM)、單一離子監測 (SIM)、三級四極杆 (TSQ)、四極杆/飛行時間 (QTOF)、四極杆線性離子阱 (QTRAP)、混合離子阱/ FTMS、飛行時間/飛行時間 (TOF/TOF)、Orbitrap 儀器、離子阱儀器、平行反應監測 (PRM)、資料相關采集 (DDA)、資料獨立採集 (DIA)、多級片段化或串聯時間 MS/MS。在一些實施例中，使用電噴霧 Orbitrap 儀器。

「天然質譜法」係對呈天然狀態之分子執行的 MS 過程，亦即，其中該分子係未摺疊或變性的。

如本文所用，縮寫「SEC-MS」指代 SEC 後隨/串聯質譜 (MS) 過程。如本文所用，縮寫「CE-MS」及「CZE-MS」指代毛細管電泳 (CE) 或毛細管區帶電泳 (CZE) 後隨 MS 過程。「SEC-天然 MS」指代 SEC 後隨/串聯天然 MS 過程。「CE-天然 MS」及「CZE-天然 MS」指代毛細管電泳 (CE) 或毛細管區帶電泳 (CZE) 後隨/串聯天然 MS 過程。

術語「定量 (quantitation 或 quantitate)」在本文中意指以數值方式判定樣品中之分析物的水平或量或數量或濃度。

一般而言，本文所提及之「個體」為測試其生物樣品中分析物之存在的個體，及/或待評定及/或針對疾病進行治療的個體。在一些實施例中，個體為人類。然而，在一些實施例中，個體還可以是另一種哺乳動物，諸如馴養或家畜物種，例如犬、貓、兔、馬、豬、牛、山羊、綿羊等，或實驗動物，諸如小鼠或大鼠。例如，哺乳動物包括但不限於馴養的動物 (例如牛、綿羊、貓、犬和馬)、靈長類動物 (例如人及非人類靈長類動物諸如猴)、兔以及囓齒動物 (例如小鼠及大鼠)。

如本文中所使用，「自動化」或「自動控制」過程係能夠 (例如) 藉由具有適當軟體之電腦化控制系統運行者，此不同於在至少一個步驟期間或之間需要主動人工干預的系統，諸如將含有分析物之樣品自系統的一個部件移動到另一部件的系統。 II. 新抗原及新抗原決定位

將新抗原相關聯肽呈現給細胞毒性 T 淋巴球是引發抗腫瘤免疫反應的核心。然而，在正確的 HLA 環境中鑑定此等新抗原相關聯肽仍然是個挑戰。本揭露涉及一種免疫肽組學流程，以在廣泛的 HLA 等位基因中鑑定臨床相關的新抗原。可以基於未滿足的臨床需求選擇候選共有新抗原，而可以使用預測過程，例如人工類神經網路諸如 NetMHCpan4.0，來預測其等之肽-HLA 結合親和力。然後用一種新穎高通量活體外結合檢定獲得實驗結合資料。新抗原相關聯肽與目標所關注之 HLA 蛋白的預測結合親和力與藉由經由高通量結合檢定發現的所得實驗結合親和力高度相關。為了能夠藉由質譜偵測新抗原決定位，CRISPR/Cas9 工程改造的 HLA 缺陷抗原呈現細胞株 (例如，HMy2.C1R) 可以用含有一種或幾種共有癌症新抗原的小基因進行電穿孔，然後對所關注 HLA 進行轉導。然後可以加工含有新抗原小基因的經工程改造之單等位基因細胞株，用於自動化泛 I 類 HLA 富集及隨後的資料依賴性及靶向質譜檢定。細胞株的泛 HLA I 類富集可以產生數百或數千個具有匹配的肽模體，諸如約 850 至 7300 個獨特的 8 至 11 聚體 (8、9、10 及 11 聚體)。靶向質譜檢定鑑別了先前鑑別的新抗原-HLA 組合以及許多新穎組合。有趣的是，偵測到獨特的新抗原 HLA 組合具有不利的 NetMHC 結合評分，但基於活體外結合檢定性能進行了檢定。此等資料表明，表現所關注之新抗原的經工程改造之單等位基因細胞是研究新抗原呈現的優異模型系統。當前的新抗原預測演算法及結合檢定具有固有之局限性，可以藉由協同使用預測及高通量 (HTP) 結合檢定兩者來克服該等局限性。最後，透過活體外 T 細胞活化及 T 細胞定向腫瘤毒殺檢定來驗證在該等檢定中鑑別的選擇命中之免疫原性。

在一些態樣中，本揭露涉及鑑定新抗原決定位 (例如，從由癌症或腫瘤表現的單個或複數個新抗原切割的肽)，該等新抗原決定位能夠特異性地結合至主要組織相容性 I 類 (MHCI) 肽 (例如，HLA 肽) 以形成新抗原決定位-HLA 複合物，用於將該等新抗原決定位作為外來抗原呈現在表現 HLA 的細胞表面上。在一些實施例中，表現對應的 T 細胞受體 (TCR) 或嵌合抗原受體 (CAR) 的免疫細胞 (諸如經工程改造或天然的 T 細胞) 可以藉由結合至 HLA-新抗原決定位複合物來辨識所呈現的外來抗原，而此類辨識可能導致 T 細胞活化及增生以產生抗癌細胞激素或發揮細胞毒性以毒殺或抑制癌症或腫瘤之生長。

在一些實施例中，本文所述的新抗原指代先前未被免疫系統辨識之新形成的抗原或肽。新抗原可起因於因腫瘤突變而形成的經改變之腫瘤蛋白、或細菌或其他病原體 (例如，來自病毒蛋白)。其等亦可源自移植物，諸如組織移植物或同種異體移植物或其他移植細胞。新抗原之非限制性實例列示於表 2 中。

在一些實施例中，本文所述的新抗原包含由個體中之腫瘤或癌細胞表現的肽。在一些實施例中，相較於由野生型細胞、健康細胞或非腫瘤或非癌細胞表現的對應野生型肽之序列，新抗原相關聯肽包含對至少一個胺基酸殘基的至少一個突變 (包括，例如，取代、缺失、插入、交聯等)。新抗原相關聯肽與野生型肽之序列之間的差異，例如，由至少一個突變引起，可能導致新抗原相關聯肽「以前未被個體的免疫系統辨識」，且因此能夠在個體中誘導免疫反應。在一些實施例中，本文所述的新抗原之長度在介於約 5 與約 100、約 5 與約 90、約 5 與約 80、約 5 與約 70、約 5 與約 60、約 5 與約 50、約 5 與約 40、約 5 與約 30、約 5 與約 20、約 10 與約 100、約 10 與約 90、約 10 與約 80、約 10 與約 70、約 10 與約 60、約 10 與約 50、約 10 與約 40、約 10 與約 30、約 10 與約 20、約 20 與約 90、約 20 與約 80、約 20 與約 70、約 20 與約 60、約 20 與約 50、約 20 與約 40、或約 20 與約 30 (以及其等之間的所有子值及子範圍，包括端點) 個胺基酸之間。在一些實施例中，本文所述的新抗原之長度在介於約 20 與約 50 個胺基酸之間。

在一些實施例中，本文所述的新抗原由個體中的腫瘤或癌細胞表現並在該腫瘤或癌細胞內進一步經切割。此類切割可以藉由各種蛋白酶或透過蛋白酶體系統來誘導。在一些實施例中，可以藉由切割新抗原來產生複數個肽。例如，可以藉由切割產生複數個肽，該等肽含有至少一個使新抗原與對應野生型肽區分開來的突變。在一些實施例中，此等複數個肽隨後經分泌出細胞並由所表現的 HLA 等位基因肽呈現在細胞表面上以被免疫細胞 (例如，T 細胞) 辨識。在該複數個肽中，彼等在辨識所呈現的肽後具有活化免疫細胞並因此在個體中誘導免疫反應的潛在能力者可經確定為新抗原決定位。

在一些實施例中，本文所述的新抗原決定位之長度為約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 或更多個胺基酸。在一些實施例中，本文所述的新抗原決定位之長度為約 8、9、10、11、12 或 13 個胺基酸。在一些實施例中，本文所述的新抗原決定位之長度在介於 8 與 13 個胺基酸之間。在一些實施例中，本文所述的新抗原決定位之長度在介於 8 與 11 個胺基酸之間。

新抗原及新抗原決定位序列之示例可以在本說明書及圖示中找到。

本文所述的新抗原及新抗原決定位可能對於個體的腫瘤或癌症具有特異性。在一些實施例中，複數個個體可具有相同的新抗原及/或相同的複數個新抗原決定位 (共有的「新抗原/新抗原決定位」情境)。在一些實施例中，個體可具有特定新抗原及/或特定複數個新抗原決定位 (例如，至少一個不同於其他個體中者的新抗原或新抗原決定位) (「個性化新抗原/新抗原決定位」情境)。本揭露的一個態樣係關於鑑定由特異性地辨識單個或複數個體中之新抗原決定位-HLA 結合對的免疫細胞所表現的特定 MHC (例如，MHCI 或 HLA) 等位基因。此類資訊可用於在表現特定新抗原及/或新抗原決定位的個體中設計癌症/腫瘤疫苗或 T 細胞療法。

在一些實施例中，特定 HLA 等位基因為已知者 (例如，藉由對個體進行基因分型)，並且特異性地結合至 HLA 蛋白的新抗原決定位為待發現者。在一些實施例中，肽交換檢定可用於鑑定此類新抗原決定位。例如，藉由單個或複數個新抗原切割的複數個新抗原決定位可用於肽交換檢定。為了製備複數個新抗原決定位，由具有特定 HLA 等位基因的個體中之癌症或腫瘤細胞所表現的單個或複數個新抗原可經隨機組合及切割以產生複數個新抗原決定位 (「非靶向」)。替代性地，可以進行各種分析 (例如，生物資訊學分析、臨床分析等) 以篩選出所關注之新抗原決定位及/或新抗原決定位或可能在癌症/腫瘤盛行率及/或臨床價值中有作用的指示物，以製備用於肽交換檢定的複數個新抗原決定位 (「靶向」)。 肽交換檢定

在一些態樣中，本揭露提供用於確定主要組織相容性複合物 I 類 (MHCI) 等位基因與測試肽之結合的肽交換檢定，其包括：提供第一混合物，其含有游離測試肽及含有 α 鏈、β 鏈及在序列內含有非天然、紫外線 (UV)-可切割胺基酸之肽配體的 MHCI/配體 (例如，HLA/配體) 複合物；將第一混合物暴露於 UV 光以在 UV-可切割胺基酸處切割肽配體；以及將第一混合物孵育一定時間段以形成含有第二 MHCI (例如，HLA) 複合物之第二混合物，該第二 MHCI 複合物含有 α 鏈、β 鏈及測試肽；及確定 MHCI (例如，HLA) 等位基因是否結合至測試肽。

在實施例中，相較於 HLA/配體複合物，第一混合物中之游離測試肽的量為 1:100 至 100:1。在一些實施例中，相較於 HLA/配體複合物，第一混合物中之游離測試肽的量為 1:10 至 10:1。在實施例中，相較於 HLA/配體複合物，第一混合物中之游離測試肽的量為 1:1 至 100:1。在實施例中，與 HLA/配體複合物相比，第一混合物中之游離測試肽的量為 10:1 至 100:1。在實施例中，相較於 HLA/配體複合物，第一混合物中之游離測試肽的量為約 10:1。比率可為所提供範圍內之任何值或子範圍，包括端點。

在實施例中，藉由測量第二混合物中之 HLA/測試肽複合物之含量來確定 HLA 等位基因結合至測試肽。在一些實施例中，該檢定中之 HLA 複合物在第二混合物中部分地由所結合的測試肽佔據 (第二混合物中之總 HLA 複合物的一部分由測試肽結合)。在一些實施例中，HLA 複合物在第二混合物中完全由所結合的測試肽佔據 (第二混合物中之總 HLA 複合物皆由測試肽結合)。

在實施例中，藉由第二混合物之 2 維液相層析-質譜 (2D LC/MS) 來測量 HLA/第二肽複合物之含量。在一些實施例中，2D LC/MS 包括自第二混合物去除游離測試肽。在一些實施例中，藉由粒徑篩析層析法去除游離測試肽。在一些實施例中，藉由尺寸截留過濾去除游離測試肽。在一些實施例中，藉由透析去除游離肽。

在實施例中，使用高效液相層析 (HPLC) 及質譜 (MS) 來區分 HLA 及測試肽之身份。在一些實施例中，在配備有粒徑篩析管柱之 HPLC (或 FPLC) 上運行第二混合物。在一些實施例中，HPLC (或 FPLC) 經配備以收集餾分。在一些實施例中，HLA 及測試肽經鑑別為溶析於同一 HPLC 流份中。在一些實施例中，游離測試肽溶析於與游離 HLA 及 HLA/測試肽複合物不同的流份中。在一些實施例中，HLA 及測試肽之共溶析指示，HLA 能夠結合測試肽。

在實施例中，向第一 HLA/測試肽混合物中添加超過一種測試肽 (例如，超過一種肽序列)。在一些實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在兩種或更多種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在三種或更多種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在四種或更多種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在五種或更多種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在六種或更多種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在七種或更多種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在八種或更多種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在九種或更多種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在十種或更多種測試肽。

在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在 10 至 1000 種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在 10 至 500 種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在 10 至 200 種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在 10 至 20 種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在 20 至 30 種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在 30 至 40 種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在 40 至 50 種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在 50 至 60 種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在 60 至 70 種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在 70 至 80 種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在 80 至 90 種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在 90 至 100 種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在 100 至 110 種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在 110 至 120 種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在 120 至 130 種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在 130 至 140 種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在 140 至 150 種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在 150 至 200 種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在 200 至 300 種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在 300 至 400 種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在 400 至 500 種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在 500 至 600 種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在 600 至 700 種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在 700 至 800 種測試肽。在實施例中，在第一HLA/測試肽混合物中存在 800 至 900 種測試肽。在實施例中，在第一 HLA/測試肽混合物中存在 900 至 1000 種測試肽。測試肽之數量可為所提供範圍內之任何值或子範圍，包括端點。測試肽之數量僅受限於由熟習此項技術者辨識為可用於交換測定中之測試肽的數量。

在實施例中，存在超過一種共溶析於 HLA/肽複合物 HPLC 流份中之測試肽。

在實施例中，使用質譜來鑑定第二混合物中之 HLA 及/或測試肽的身份。在一些實施例中，質譜儀與 HPLC 串聯。在一些實施例中，首先收集 HPLC 餾分，然後藉由質譜分析。在實施例中，在 HLA 複合物之質譜偵測之前去除游離測試肽。在實施例中，使用質譜藉由與內部標準肽進行比較來量化存在於餾分或第二混合物中之測試肽的量。

在實施例中，HLA/測試肽複合物經標記。在一些實施例中，以螢光方式標記 HLA/測試肽。在一些實施例中，藉由接觸經螢光標記之抗體來標記 HLA/測試肽複合物。在一些實施例中，藉由接觸螢光抗體來標記 HLA/測試肽複合物，其中螢光抗體為抗 HLA。在一些實施例中，藉由 α 蛋白之生物素化來標記 HLA/肽複合物。

在實施例中，藉由以下方式來確定肽交換程度：使經標記之 HLA/肽複合物與抗體複合物 (含有共價接附至螢光共振能量轉移 (FRET) 供體之抗 HLA 抗體) 及 FRET 受體複合物 (包含與第二標記結合之 FRET 受體) 接觸，由此形成反應組成物；及偵測反應組成物中之第二標記的 FRET 發射，由此偵測穩定 HLA 之形成，該形成係肽結合之替代量度。在一些實施例中，第一標記為抗 HLA 抗體：抗-B2M。在一些實施例中，第一標記為螯合銪離子之抗 HLA 抗體。在一些實施例中，HLA/肽複合物之 α 蛋白經生物素化。在一些實施例中，經生物素化之 HLA/肽複合物結合第二標記。在一些實施例中，第二標記為鏈球親生物素蛋白。在一些實施例中，第二標記為共價連接至別藻藍蛋白之鏈球親生物素蛋白。在一些實施例中，在存在含有第一標記及第二標記之 HLA/肽複合物時，第一標記及第二標記具有適用於 FRET 之光譜重疊積分。在一些實施例中，FRET 供體/受體對標記包括螢光素及四甲基玫瑰紅。在一些實施例中，FRET 供體/受體對標記包括 5-({2-[(碘乙醯基)胺基]乙基}胺基)萘-1 磺酸 (IAEDANS) 及螢光素。在一些實施例中，FRET 供體/受體對標記包括 (5-((2-胺基乙基)胺基)萘-1-磺酸 (EDANS) 及 4-((4-(二甲基胺基)苯基)偶氮)苯甲酸 (Dabcyl)。在一些實施例中，FRET 供體/受體對標記包括 Alexa Fluor 488 及 Alexa Fluor 555。在一些實施例中，供體/受體對標記包括 Alexa Fluor 594 及 Alexa Fluor 647。在一些實施例中，供體/受體對標記包括銪 (Eu-穴狀化合物) 及別藻藍蛋白 (XL665)。在一些實施例中，供體/受體對標記包括鋱及螢光素。第一標記及第二標記可為業內已知之任何適宜標記對。

在實施例中，將肽交換偵測檢定試劑及 HLA/肽複合物一起孵育約 1 小時至約 48 小時。在實施例中，將肽交換偵測檢定試劑及 HLA/肽複合物一起孵育至少約 1 小時。在一些實施例中，將肽交換偵測檢定試劑及 HLA/肽複合物一起培育孵育約 5 小時。在實施例中，將肽交換偵測檢定試劑及 HLA/肽複合物一起孵育至少約 10 小時。在實施例中，將肽交換偵測檢定試劑及 HLA/肽複合物一起孵育至少約 12 小時。在一些實施例中，將肽交換偵測檢定試劑及 HLA/肽複合物一起培育孵育約 15 小時。在一些實施例中，將肽交換偵測檢定試劑及 HLA/肽複合物一起培育孵育約 20 小時。在一些實施例中，將肽交換偵測檢定試劑及 HLA/肽複合物一起培育孵育約 24 小時。培育時間可為所提供範圍內之任何值或子範圍，包括端點。

在一些實施例中，第一標記含有鏈球親生物素蛋白。在一些實施例中，第一標記含有抗 HLA 抗體。在一些實施例中，第一標記含有單體 (monobody)。在一些實施例中，第一標記含有部分抗體。在一些實施例中，第一標記含有 scFv 域。在一些實施例中，第一標記含有抗體片段。

在一些實施例中，第二標記為鏈球親生物素。

在實施例中，來自 FRET 受體之發射指示測試肽與 HLA 複合物的結合。在一些實施例中，藉由時間解析 (TR) FRET 檢測來確定結合肽之含量。在一些實施例中，來自 TR-FRET 受體標記之訊號指示所存在 HLA 複合物的含量。在一些實施例中，所存在 HLA 複合物之含量指示是否存在 HLA/肽複合物。在一些實施例中，HLA/肽複合物含有測試肽。在一些實施例中，在兩種或更多種 HLA 等位基因之間歸一化來自 FRET 發射之訊號。在一些實施例中，在介於約 4℃ 與約 50℃ 之間的溫度執行 TR-FRET 檢定。在一些實施例中，在室溫執行 TR-FRET 檢定。在一些實施例中，在約 37℃ 執行 TR-FRET 檢定。

肽交換檢定及 FRET 檢定亦描述於 2021 年 8 月 25 日提交並以 WO 2022/046895 公開的 PCT 申請號 PCT/US21/47537，其中教示之每一項，包括但不限於全部方法、試劑、新抗原、新抗原決定位、實例、系統等，藉由引用併入本文。 III. MHC 等位基因

在一些態樣中，本揭露涉及鑑定新抗原決定位 (例如，從由癌症或腫瘤表現的單個或複數個新抗原切割的肽)，該等新抗原決定位能夠特異性地結合至主要組織相容性 I 類 (MHCI) 肽 (例如，HLA 肽) 以形成新抗原決定位-MHCI 複合物 (在人類中，新抗原決定位-HLA 複合物)，用於將該等新抗原決定位作為外來抗原呈現在表現 MHCI 的細胞表面上。在一些實施例中，表現對應的 T 細胞受體 (TCR) 或嵌合抗原受體 (CAR) 的免疫細胞 (諸如經工程改造或天然的 T 細胞) 可以藉由結合至 MHCI-新抗原決定位複合物來辨識所呈現的外來抗原 (亦即，新抗原決定位)，而此類辨識可能導致 T 細胞活化及增生以產生抗癌細胞激素或發揮細胞毒性以毒殺或抑制癌症或腫瘤之生長。

在實施例中，HLA/配體複合物含有 α 鏈，其中 α 鏈係由下列基因座中之任一者編碼：HLA-A、HLA-B 及 HLA-C。在一些實施例中，α 鏈係由 HLA-A 基因座編碼。在一些實施例中，α 鏈係由 HLA-B 基因座編碼。在一些實施例中，α 鏈係由 HLA-C 基因座編碼。

在實施例中，HLA/配體複合物含有 β-2微球蛋白域 (B2M)，其中 B2M 域係由 HLA 基因複合物編碼。

在實施例中，HLA/配體複合物含有肽配體，例如，從本文所述的新抗原切割的新抗原決定位。在實施例中，肽配體 (例如，新抗原決定位) 之長度為介於 8 與 13 個胺基酸殘基之間。在一些實施例中，肽配體 (例如，新抗原決定位) 之長度為 8 個胺基酸殘基。在一些實施例中，肽配體 (例如，新抗原決定位) 之長度為 9 個胺基酸殘基。在一些實施例中，肽配體 (例如，新抗原決定位) 之長度為 10 個胺基酸殘基。在一些實施例中，肽配體 (例如，新抗原決定位) 之長度為 11 個胺基酸殘基。在一些實施例中，肽配體 (例如，新抗原決定位) 之長度為 12 個胺基酸殘基。在一些實施例中，肽配體 (例如，新抗原決定位) 之長度為 13 個胺基酸殘基。

在實施例中，HLA/配體複合物含有肽配體，其中該肽配體含有非天然胺基酸 (例如，用於肽交換檢定)。在一些實施例中，非天然胺基酸由 UV 輻射活化。在一些實施例中，含有非天然胺基酸之肽配體在藉由 UV 光輻照之後發生裂解。在一些實施例中，非天然胺基酸係選自 2-硝基苯基甘胺酸 (NPG)、擴展鄰-硝基苄基連接子、鄰-硝基苄基籠形酚、鄰-硝基苄基籠形硫醇、32 硝基藜蘆基氧羰基 (NVOC) 籠形苯胺、鄰-硝基苄基籠形硒化物、雙-偶氮苯、香豆素、桂醯基、螺吡喃、2-硝基苯丙胺酸 (2-nF) 及 3-胺基-3-(2-硝基苯基)丙酸 (ANP) 胺基酸類似物。在一些實施例中，非天然胺基酸為 3-胺基-3-(2-硝基苯基)丙酸 (ANP)。

在實施例中，非天然胺基酸可位於肽配體之 N-末端與 C-末端之間的任何位置處。在一些實施例中，非天然胺基酸位於肽配體之 N-末端處。在一些實施例中，非天然胺基酸位於肽配體之第二位置 (亦即自 N-末端起之第二位置) 處。在一些實施例中，非天然胺基酸位於肽配體之第三位置處。在一些實施例中，非天然胺基酸位於肽配體之第四位置處。在一些實施例中，非天然胺基酸位於肽配體之第五位置處。在一些實施例中，非天然胺基酸位於肽配體之第六位置處。在一些實施例中，非天然胺基酸位於肽配體之第七位置處。在一些實施例中，非天然胺基酸位於肽配體之第八位置處。在一些實施例中，非天然胺基酸位於肽配體之第九位置處。在一些實施例中，非天然胺基酸位於肽配體之第十位置處。在一些實施例中，非天然胺基酸位於肽配體之 C-末端處。

HLA 等位基因之非限制性示例可以在本說明書及圖示中找到。額外的等位基因為本領域中已知者。

大多數哺乳動物具有與人類之彼等相似的 MHC 變異體，人類具有很大的等位基因多樣性，尤其在九個經典基因中——似乎主要是由於基因重複——但人類 MHC 區域具有許多假基因 (Sznarkowska 等人，「MHC Class I Regulation: The Origin Perspective」. Cancers. 2020; 12(5): 1155)。最多樣化的基因座，即 HLA-A、HLA-B 及 HLA-C，分別具有大約 6000、7200 及 5800 個已知等位基因 (參見全球資訊網網站 hla.alleles.org 上的「HLA 等位基因編號」)。許多 HLA 等位基因是古老的，有時與黑猩猩 MHC 等位基因的同源性比與相同基因的其他一些人類等位基因更接近。

人類白血球抗原 (HLA) 系統或複合物為人類第 6 號染色體上的基因複合物，其編碼負責調節免疫系統的細胞表面蛋白 (Choo.「The HLA system: genetics, immunology, clinical testing, and clinical implications」. Yonsei Medical Journal.2007; 48(1):11-23)。HLA 系統亦作為在許多動物中發現的主要組織相容性複合體 (MHC) 的人類版本而為人所知。

在一些實施例中，本文所述的 MHC 等位基因 (例如，MHCI 等位基因) 包括人類個體中的 HLA 等位基因。在一些實施例中，本文所述的 MHC 等位基因 (例如，MHCI 等位基因) 包括非人類 MHC 等位基因。

本文所述的 MHC 等位基因可由患有表現新抗原的腫瘤或癌症之個體攜帶，該新抗原可經切割為複數個新抗原決定位。在一些實施例中，複數個個體 (或腫瘤/癌症) 可能具有相同的新抗原 (「共有的新抗原」情境)。在一些實施例中，個體 (或腫瘤/癌症) 可具有特定新抗原及/或複數個特定新表位 (例如，至少一個不同於其他個體中者的新抗原或新表位) (「個性化新抗原/新表位」情境)。本揭露之一個態樣關於鑑定在單個或複數個個體中由特定 MHC (例如，MHCI 或 HLA) 等位基因特異性地辨識且呈現的新抗原決定位。此類資訊可用於在表現特定 MHC 等位基因肽的個體中設計癌症/腫瘤疫苗或 T 細胞療法。

在一些實施例中，複數個患有腫瘤或癌症的個體可具有相同或不同的 HLA 等位基因，該等等位基因可以藉由例如對此等個體進行基因分型來鑑別。此等個體可能具有由腫瘤或癌細胞表現的不同新抗原相關聯肽 (例如，不同的人可能具有不同的腫瘤/癌症相關突變)。在一些實施例中，篩選方法 (靶向的或非靶向的) 可用於透過鑑定特定新抗原決定位-HLA 結合對來鑑定該複數個個體中的一個體以進行免疫療法。例如，如果個體具有從由腫瘤或癌細胞表現的新抗原切割的新抗原決定位，能夠藉由形成新抗原決定位-HLA 複合物而由同一個體中的特定 HLA 蛋白辨識及呈現，則該個體經確定為可藉由 T 細胞療法 (例如，透過 TCR 或 CAR) 利用能夠辨識新抗原決定位-HLA 複合物並由其活化的 T 細胞進行治療。在一些實施例中，對於具有相同 HLA 蛋白的單個或複數個個體，如果透過本文所述的相同方法鑑別出至少一個新抗原決定位用於與特定 HLA 蛋白形成新抗原決定位-HLA 複合物，則癌症/腫瘤疫苗可以經製備為含有至少一個新抗原決定位以向個體投予，從而誘導針對該腫瘤或癌症的免疫反應。

在一些態樣中，本揭露提供一種用於複數個患有腫瘤或癌症的個體之一般治療策略/計劃/方法。例如，可以確定該複數個個體中之各者的 HLA 等位基因 (例如，藉由對個體進行基因分型)。在一些實施例中，從任何先前的分析中獲知該等個體中之各者的 HLA 等位基因資訊。然後藉由將該等個體之新抗原中之全部 (例如，在「非靶向」分析中) 或一些 (例如，在「靶向」分析中) 所切割的新抗原決定位中之全部 (例如，在「非靶向」分析中) 或一些 (例如，在「靶向」分析中) 與此等個體中之特定 HLA 等位基因組合來鑑別至少一個特定新抗原決定位-HLA 結合對。任何已知的方法皆可用於測試是否形成了特定新抗原決定位-HLA 結合對，該方法諸如肽交換檢定、螢光檢定、免疫檢定等。具有特定 HLA 等位基因 (其與特定新抗原決定位形成新抗原決定位-HLA 結合對) 的個體可以經確定為潛在可治療者，然後視情況藉由靶向該新抗原決定位-HLA 結合對的癌症/腫瘤疫苗或 T 細胞療法進行治療。

本文揭露鑑定特定新抗原決定位-HLA 結合對的方法。在一些實施例中，可以使用肽交換檢定或其他基於細胞的檢定。檢定之其他示例可包括，例如，複合物偵測檢定、HLA 結合配體鑑定檢定、天然 SEC-MS 及 CE-MS 方法，或 PCT 申請第 PCT/EP2019/066811 號 (公開為 WO 2020/002320) 中描述的其他方法，該申請之內容藉由引用整體併入本文。

在一些實施例中，單等位基因細胞用於測試 HLA 蛋白與新抗原決定位之間的結合。例如，單等位基因細胞可以藉由下述製備：敲低或剔除細胞中之內源性 HLA 等位基因，然後將單個 HLA 等位基因轉導至細胞中以進行表現。可以製備複數個單等位基因細胞，使得各細胞表現不同的 HLA 等位基因，從而形成一組單等位基因細胞，用於鑑定單個或複數個新抗原決定位的特定新抗原決定位-HLA 結合對。 IV. 組成物 新抗原及新抗原決定位

揭露了針對編碼新抗原及/或新抗原決定位序列的核酸的核酸組成物。在一些實施例中，本文所述組成物中之至少一種核酸編碼與在本說明書及圖示中所述的新抗原及/或新抗原決定位序列具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% (以及其等之間的全部子值及子範圍，包括端點) 序列同一性的新抗原及/或新抗原決定位。在一些實施例中，本文所述組成物中之至少一種核酸與在本說明書及圖示中所述的新抗原及/或新抗原決定位核酸序列具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% (以及其等之間的全部子值及子範圍，包括端點) 序列同一性。

在一些實施例中，本文所述的組成物包含編碼複數個新抗原或新抗原決定位的分離之多核苷酸卡匣。例如，該複數個新抗原可以由一個體或複數個個體中之腫瘤或癌細胞表現。在其他實例中，該複數個新抗原決定位可以從由單個或複數個個體中之腫瘤或癌細胞表現的單個新抗原或複數個新抗原切割。該分離之多核苷酸卡匣可以編碼包含多個新抗原或新抗原決定位之融合物的多肽，在兩個相鄰的新抗原或新抗原決定位之間有或沒有連接子 (例如，肽襯墊，例如甘胺酸-絲胺酸 (GS) 連接子)。在一些實施例中，由該分離之多核苷酸卡匣編碼的新抗原/新抗原決定位中之各者之長度在介於約 5 與約 100、約 5 與約 90、約 5 與約 80、約 5 與約 70、約 5 與約 60、約 5 與約 50、約 5 與約 40、約 5 與約 30、約 5 與約 20、約 10 與約 100、約 10 與約 90、約 10 與約 80、約 10 與約 70、約 10 與約 60、約 10 與約 50、約 10 與約 40、約 10 與約 30、約 10 與約 20、約 20 與約 90、約 20 與約 80、約 20 與約 70、約 20 與約 60、約 20 與約 50、約 20 與約 40、或約 20 與約 30 (以及其等之間的所有子值及子範圍，包括端點) 個胺基酸之間。在一些實施例中，由該分離之多核苷酸卡匣編碼的新抗原/新抗原決定位中之各者之長度在約 20 與約 50 個胺基酸之間。在一些實施例中，由該分離之多核苷酸卡匣編碼的新抗原中之各者可以在細胞中經切割以產生複數個新抗原決定位，該等新抗原決定位中之各者之長度可以為約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 或更多個胺基酸。在一些實施例中，由該分離之多核苷酸卡匣編碼的新抗原中之各者可以在細胞中經切割以產生複數個新抗原決定位，該等新抗原決定位中之各者之長度可以為約 8、9、10、11、12 或 13 個胺基酸。在一些實施例中，該分離之多核苷酸卡匣編碼複數個新抗原決定位，該等新抗原決定位中之各者之長度可以為約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 或更多個胺基酸。在一些實施例中，該分離之多核苷酸卡匣編碼複數個新抗原決定位，該等新抗原決定位中之各者之長度可以為約 8、9、10、11、12 或 13 個胺基酸。

在一些實施例中，本文所述的分離之多核苷酸卡匣可編碼任何數量之本文所述的新抗原或新抗原決定位。例如，在實例及圖示所示的實驗中，在含有串接新抗原表現陣列 (具有或不具有肽連接子) 的 piggybac 匣中製備 24 或 47 個新抗原。通常對待結合至多核苷酸卡匣中之新抗原的確切數量沒有限制，除非該匣不能經轉導至細胞或在細胞中表現。在一些實施例中，分離之多核苷酸卡匣編碼至少 2 種新抗原，諸如 2 與 200 種之間的新抗原，例如 20 與 100 種之間、20 與 75 種之間或 30 與 50 種之間的新抗原 (以及介於其間的全部子值及子範圍，包括端點)。在一些實施例中，分離之多核苷酸卡匣編碼 2、5、10、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80 或更多種新抗原。

在一些實施例中，本文所述的核酸組成物 (例如，分離之多核苷酸卡匣) 可以插入到表現載體 (例如，質體或病毒載體) 中。在一些實施例中，表現載體可以進一步包含至少一個啟動子，該啟動子能夠啟動轉殖基因表現並啟動複數個新抗原或新抗原決定位在細胞中轉譯為單一多肽。在一些實施例中，可以將可選擇標記添加到表現載體中，包括表現標記及/或抗生素抗性標記。在一些實施例中，使用本文所述或本領域技術人員已知的方法，將本文所述的表現載體穩定地或瞬時地遞送至細胞中。

在一些實施例中，本文所述的新抗原包含由個體中之腫瘤或癌細胞表現的肽。在一些實施例中，相較於由野生型細胞、健康細胞或非腫瘤或非癌細胞表現的對應野生型肽之序列，新抗原相關聯肽包含對至少一個胺基酸殘基的至少一個突變 (包括，例如，取代、缺失、插入、交聯等)。新抗原相關聯肽與野生型肽之序列之間的差異，例如，由至少一個突變引起，可能導致新抗原相關聯肽「以前未被個體的免疫系統辨識」(「非自身」)，且因此能夠在個體中誘導免疫反應。在一些實施例中，本文所述的新抗原之長度在介於約 5 與約 100、約 5 與約 90、約 5 與約 80、約 5 與約 70、約 5 與約 60、約 5 與約 50、約 5 與約 40、約 5 與約 30、約 5 與約 20、約 10 與約 100、約 10 與約 90、約 10 與約 80、約 10 與約 70、約 10 與約 60、約 10 與約 50、約 10 與約 40、約 10 與約 30、約 10 與約 20、約 20 與約 90、約 20 與約 80、約 20 與約 70、約 20 與約 60、約 20 與約 50、約 20 與約 40、或約 20 與約 30 (以及其等之間的所有子值及子範圍，包括端點) 個胺基酸之間。在一些實施例中，本文所述的新抗原之長度在介於約 20 與約 50 個胺基酸之間。

在一些實施例中，本文所述的新抗原包含由個體中的腫瘤或癌細胞表現並且可在該腫瘤或癌細胞內進一步經切割的新抗原。此類切割可以藉由各種蛋白酶或透過蛋白酶體系統來誘導。在一些實施例中，可以藉由切割新抗原來產生複數個肽。例如，可以藉由切割產生複數個肽，該等肽含有至少一個使新抗原與對應野生型肽區分開來的突變。在一些實施例中，該複數個肽隨後由所表現的 HLA 等位基因肽呈現在細胞表面上以被免疫細胞 (例如，T 細胞) 辨識。在該複數個肽中，彼等在辨識所呈現的肽後具有活化免疫細胞並因此在個體中誘導免疫反應的潛在能力者可經確定為新抗原決定位。

在一些實施例中，本文所述的新抗原決定位之長度為約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30 或更多個胺基酸。在一些實施例中，本文所述的新抗原決定位之長度為約 8、9、10、11、12 或 13 個胺基酸。

本文所述的組成物中之新抗原及新抗原決定位序列之示例可以在本說明書及圖示中找到。在一些實施例中，本文所述組成物中之新抗原相關聯肽中的至少一者與 SEQ ID NO: 1 至 72、75 至 191 及 195 至 222 中之至少一者具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% (以及其等之間的全部子值及子範圍，包括端點) 序列同一性。在一些實施例中，本文所述組成物中之新抗原決定位中的至少一者與 SEQ ID NO: 75 至 111 中之至少一者具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% (以及其等之間的全部子值及子範圍，包括端點) 序列同一性。

在一些實施例中，本文所述的新抗原及/或新抗原決定位為技術人員已知的或藉由生物資訊學及/或腫瘤突變之臨床分析來鑑別。 MHC 等位基因

本文所述的 MHC 等位基因 (例如，MHC I 類或 MHCI 等位基因) 可以包括 MHC 分子 (例如，MHCI 或 HLA 分子)，其包括 α 鏈、β 鏈及配體，其中所述配體「肽」為包含非天然 UV 可切割胺基酸 (例如，用於肽交換檢定) 或包含本文所述的新抗原決定位 (例如，用於發現或利用新抗原決定位-HLA 結合對) 的肽。

在實施例中，本文所述的 HLA 包含 α 鏈。在一些實施例中，α 鏈由以下基因座中之任一者編碼：HLA-A、HLA-B 及 HLA-C。在一些實施例中，α 鏈係由 HLA-A 基因座編碼。在一些實施例中，α 鏈係由 HLA-B 基因座編碼。在一些實施例中，α 鏈係由 HLA-C 基因座編碼。在實施例中，本文所述的 HLA 進一步含有 β 鏈。例如，本文所述的 HLA 可以在單一多肽中包含 α 鏈及 β 鏈 (例如，作為融合蛋白)。在實施例中，本文所述的 HLA 不含 β 鏈。例如，本文所述的 HLA (例如，編碼 HLA 多肽的核酸) 可以經引入表現 β 鏈的細胞中。本文所述的 β 鏈可以包含 β2-微球蛋白 (B2M)。除非明確說明，在本揭露中，在細胞中表現 HLA 一般指代在細胞中表現 HLA 之 α 鏈。

在實施例中，HLA 可特異性地結合至肽配體，例如從本文所述的新抗原切割之新抗原決定位，並將肽配體呈現在表現 HLA 的細胞表面上。在實施例中，肽配體 (例如，新抗原決定位) 之長度為介於 8 與 13 個胺基酸殘基之間。在一些實施例中，肽配體 (例如，新抗原決定位) 之長度為 8 個胺基酸殘基。在一些實施例中，肽配體 (例如，新抗原決定位) 之長度為 9 個胺基酸殘基。在一些實施例中，肽配體 (例如，新抗原決定位) 之長度為 10 個胺基酸殘基。在一些實施例中，肽配體 (例如，新抗原決定位) 之長度為 11 個胺基酸殘基。在一些實施例中，肽配體 (例如，新抗原決定位) 之長度為 12 個胺基酸殘基。在一些實施例中，肽配體 (例如，新抗原決定位) 之長度為 13 個胺基酸殘基。

在實施例中，肽配體包含如本文所述的非天然胺基酸 (例如，用於肽交換檢定)。在一些實施例中，非天然胺基酸由 UV 輻射活化。在一些實施例中，含有非天然胺基酸之肽配體在藉由 UV 光輻照之後發生裂解。在一些實施例中，非天然胺基酸係選自 2-硝基苯基甘胺酸 (NPG)、擴展鄰-硝基苄基連接子、鄰-硝基苄基籠形酚、鄰-硝基苄基籠形硫醇、32 硝基藜蘆基氧羰基 (NVOC) 籠形苯胺、鄰-硝基苄基籠形硒化物、雙-偶氮苯、香豆素、桂醯基、螺吡喃、2-硝基苯丙胺酸 (2-nF) 及 3-胺基-3-(2-硝基苯基)丙酸 (ANP) 胺基酸類似物。在一些實施例中，非天然胺基酸為 3-胺基-3-(2-硝基苯基)丙酸 (ANP)。

HLA 等位基因序列的示例可以在本說明書及圖示中找到。

大多數哺乳動物具有與人類之彼等相似的 MHC 變異體，人類具有很大的等位基因多樣性，尤其在九個經典基因中——似乎主要是由於基因重複——但人類 MHC 區域具有許多假基因 (Sznarkowska 等人，「MHC Class I Regulation: The Origin Perspective」. Cancers.2020; 12(5): 1155)。最多樣化的基因座，即 HLA-A、HLA-B 及 HLA-C，分別具有大約 6000、7200 及 5800 個已知等位基因 (參見全球資訊網網站 hla.alleles.org 上的「HLA 等位基因編號」)。許多 HLA 等位基因是古老的，有時與黑猩猩 MHC 等位基因的同源性比與相同基因的其他一些人類等位基因更接近。在新抗原決定位-MHC 結合對中鑑別的 HLA 蛋白之示例可包括 A*01.01、A*02.01、A*03.01、A*11.01、A*24.02、B*07.02、B*08.01、B*35.01、B*44.02、B*51.01、C*03.04、C*04.01、C*05.01、C*06.02、C*07.01、C*07.02 及 C*08.02。

在一些實施例中，本文所述的包含 MHC 分子 (例如，MHCI 或 HLA) 的組成物包括包含人類個體中之 HLA 分子的組成物。在一些實施例中，本文所述的包含 MHC 分子 (例如，MHCI) 的組成物包括包含非人類 MHC 分子的組成物。

亦針對編碼 MHC 分子的核酸揭露核酸組成物。在一些實施例中，本文所述組成物中之至少一種核酸編碼與在本說明書及圖示中所述的 HLA 等位基因肽序列具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% (以及其等之間的全部子值及子範圍，包括端點) 序列同一性的 HLA 等位基因肽。在一些實施例中，本文所述組成物中之至少一種核酸與在本說明書及圖示中所述的 HLA 等位基因核酸序列具有至少 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% (以及其等之間的全部子值及子範圍，包括端點) 序列同一性。

在一些實施例中，本文所述的組成物包含編碼單個或複數個 HLA 等位基因肽的分離之多核苷酸。例如，複數個 HLA 等位基因肽可以在一個體或複數個個體中表現。分離之多核苷酸可以編碼包含多個 HLA 等位基因肽融合物的多肽。在新抗原決定位-MHC 結合對中鑑別的 MHC 蛋白 (諸如 HLA) 之示例可包括 A*01.01、A*02.01、A*03.01、A*11.01、A*24.02、B*07.02、B*08.01、B*35.01、B*44.02、B*51.01、C*03.04、C*04.01、C*05.01、C*06.02、C*07.01、C*07.02 及 C*08.02。可以明確排除任何一個或多個等位基因，包括由以下基因座中之任一者編碼的 HLA I 等位基因：HLA-A、HLA-B 及 HLA-C。

在一些實施例中，本文所述的核酸組成物 (例如，分離之多核苷酸) 可以插入到表現載體 (例如，質體或病毒載體) 中。在一些實施例中，表現載體可以進一步包含至少一種能夠在細胞中啟動 HLA 等位基因肽轉移為單一多肽的啟動子。在一些實施例中，可以將可選擇標記添加到表現載體中，包括表現標記及/或抗生素抗性標記。在一些實施例中，使用本文所述或本領域技術人員已知的方法，將本文所述的表現載體穩定地或瞬時地遞送至細胞中。

如以下表現細胞之部分中更詳細揭露，單等位基因細胞可以藉由敲低或剔除細胞中之內源性 HLA 等位基因並進一步表現藉由表現載體 (例如，質體或病毒載體) 引入該細胞內的外源性 HLA 蛋白。此類單等位基因細胞或複數個單等位基因細胞 (其各者皆表現不同的 HLA 蛋白) 可用於接觸複數個新抗原決定位以鑑定特定的新抗原決定位-HLA 結合對。 經工程改造之單等位基因細胞及細胞株

在一態樣中，提供一種經工程改造之細胞以表現至少一個 MHC 等位基因，例如，MHCI 或 HLA 等位基因，如本文所述。在一態樣中，提供一種經工程改造之細胞以表現單個 MHC 等位基因，例如，MHCI 或 HLA 等位基因，如本文所述。

在一些實施例中，向經工程改造之細胞引入用於表現 MHC 等位基因肽的 MHC 等位基因多核苷酸 (例如，MHC 等位基因或外顯子的全部或部分)。在一些實施例中，MHC 等位基因多核苷酸或肽為 MHCI 等位基因多核苷酸或肽。在一些實施例中，MHCI 等位基因肽由人類或非人類動物之 MHC 等位基因中之任一者編碼，包括例如基因座諸如 HLA-A、HLA-B 及 HLA-C。在一些實施例中，HLA 等位基因多核苷酸編碼 α 鏈。在一些實施例中，經工程改造之細胞表現 HLA 肽之 β 鏈，諸如 β2-微球蛋白 (B2M)。在一些實施例中，將 HLA 等位基因多核苷酸作為本文所述的 HLA 組成物引入到經工程改造之細胞內。在一些實施例中，HLA 等位基因多核苷酸在本文所述的表現載體中。用於引入的 HLA 等位基因多核苷酸或肽對於細胞可以為內源性的或外源性的。在實施例中，用於引入的 HLA 等位基因多核苷酸或肽對於細胞為外源性的。

在一些實施例中，經工程改造之細胞為單等位基因細胞，換言之，僅表現一個 MCHI 等位基因。非限制性地，細胞可以經工程改造以降低或完全抑制除一個以外的全部內源性 HLA 等位基因之表現，導致細胞僅表現一種類型的 HLA 等位基因肽。在其他實例中，細胞可以經工程改造以降低或完全抑制全部內源性 HLA 等位基因之表現，然後經引入用於表現的 HLA 等位基因多核苷酸或 HLA 等位基因肽，導致細胞僅表現一種類型的 HLA 等位基因肽。降低或完全抑制內源性 HLA 等位基因表現的示例可以至少包括剔除方法 (例如，CRISPR 技術) 及敲低方法 (例如，siRNA、shRNA、反義寡核苷酸、miRNA 等)。在實施例中，HLA 等位基因經瞬時地表現。在實施例中，HLA 等位基因經穩定地表現。

在一些實施例中，向經工程改造之細胞進一步引入包含單個或複數個新抗原或新抗原決定位的多肽或編碼此類多肽的多核苷酸。當引入到經工程改造之細胞內時，該單個或複數個新抗原可經切割以產生複數個新抗原決定位。在一些實施例中，新抗原決定位結合至由經工程改造之細胞表現的 HLA 等位基因肽並且經呈現在細胞表面上。在一些實施例中，至少一個新抗原決定位結合至由經工程改造之單等位基因細胞所表現的單一類型之 HLA 並且經呈現在細胞表面上。在一些實施例中，多肽或編碼此類多肽的多核苷酸包含單一多肽或多核苷酸鏈 (其包含複數個新抗原或新抗原決定位之融合物，在兩個相鄰的新抗原或新抗原決定位之間具有或不具有本文所述的連接子) 或其等之編碼多核苷酸。

在一些實施例中，向經工程改造之細胞進一步引入編碼複數個新抗原相關聯肽或新抗原決定位的多核苷酸卡匣，如本文所述。多核苷酸卡匣之示例可包括 piggybac 表現構建體，如實例部分所述，其包含 24 或 47 個新抗原。通常對融合到多核苷酸卡匣內的新抗原或新抗原決定位之確切數量沒有具體限制，除非對細胞中的該匣之轉導或表現受到不利影響或抑制。在一些實施例中，分離之多核苷酸卡匣編碼至少 2 種新抗原，諸如 2 與 200 種之間的新抗原，例如 20 與 100 種之間、20 與 75 種之間或 30 與 50 種之間的新抗原 (以及介於其間的全部子值及子範圍，包括端點)。在一些實施例中，分離之多核苷酸卡匣編碼 2、5、10、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80 或更多種新抗原。

通常，對本文所述的經工程改造之細胞類型沒有具體限制。在一些實施例中，經工程改造之細胞為任何類型的有核細胞。在一些實施例中，經工程改造之細胞為昆蟲細胞。在一些實施例中，經工程改造之細胞為哺乳動物細胞，諸如人類細胞或非人類哺乳動物細胞。在一些實施例中，經工程改造之細胞為抗原呈現細胞 (APC) 或能夠將抗原 (例如，在細胞中表現的及/或從細胞中所表現之新抗原相關聯肽切割的新抗原決定位) 呈現在細胞表面上，以用於被免疫細胞 (例如 T 細胞) 辨識。在一些實施例中，經工程改造之細胞為 HMy2.C1R 細胞。在一些實施例中，經工程改造之細胞為 K562 細胞 (例如，ATCC 產品 CCL-243™)。

在一態樣中，提供一種細胞株，其包括複數個本文所述的單等位基因細胞。在實施例中，該細胞株之細胞穩定地或瞬時地表現單個 HLA 等位基因。

在一態樣中，提供複數個細胞株。在實施例中，各細胞株包括穩定地或瞬時地表現單個 HLA 等位基因的細胞。在實施例中，細胞株表現不同的 HLA 等位基因。在實施例中，各細胞株表現不同的 HLA 等位基因。在實施例中，各細胞株表現至少一種不同的 HLA 等位基因。腫瘤 / 癌症疫苗

在一態樣中，提供腫瘤疫苗或癌症疫苗，用於在患有腫瘤或癌症或易患腫瘤或癌症的個體或複數個個體中誘導免疫反應。腫瘤/癌症疫苗之示例至少包括能夠防止癌症復發、誘導靶向/破壞在治療結束後仍在體內的任何癌細胞、終止腫瘤生長或擴散等的治療疫苗或治療性疫苗。

在一些實施例中，本文所述的腫瘤/癌症疫苗包含多肽或編碼此類多肽的多核苷酸，其包含從由腫瘤或癌細胞表現的新抗原切割之新抗原或新抗原決定位。在一些實施例中，本文所述的腫瘤/癌症疫苗包含本文所述的新抗原或新抗原決定位組成物。

在一些實施例中，本文所述的新抗原決定位中之至少一者或從腫瘤/癌症疫苗中之新抗原切割的新抗原決定位與由待投予該疫苗之個體中之腫瘤或癌細胞或另一 APC 細胞表現的 HLA 形成特定新抗原決定位-HLA 結合對。在非限制性實例中，在投予疫苗之前，在個體中表現的 HLA 等位基因之一部分或全部是已知的。鑑定個體中的 HLA 等位基因亞型之示例可以至少包括基因分型或技術人員已知的其他定序方法。提供個體中 HLA 等位基因亞型之資訊，本文描述的方法可用於鑑定新抗原決定位-HLA 結合對，該等結合對包含由個體中之 HLA 等位基因亞型特異性地辨識的新抗原決定位。此類新抗原決定位或自其切割該等新抗原決定位的對應新抗原可用於製備用於向個體投予的本文所述的腫瘤/癌症疫苗。

在一些實施例中，可以對單個或複數個個體進行定序或基因分型以提供關於個體中特定 HLA 等位基因亞型之資訊，用於鑑別針對特定 HLA 等位基因亞型的新抗原決定位-HLA 結合對，同時所鑑別的新抗原決定位或自其切割該等新抗原決定位的對應新抗原可用於製備用於向個體投予的本文所述的腫瘤/癌症疫苗。

在一些實施例中，包含本文所述的新抗原或新抗原決定位的腫瘤/癌症疫苗是技術人員已知的。在非限制性實例中，可以對單個或複數個個體進行定序或基因分型以提供關於個體中特定 HLA 等位基因亞型之資訊，用於藉由本文所述的方法鑑定針對特定 HLA 等位基因亞型的新抗原決定位-HLA 結合對。具有所鑑別的結合對中之特定 HLA 等位基因亞型的任何個體可以經確定為投予疫苗以用於治療或預防的個體，該等所鑑別的結合對包含腫瘤/癌症疫苗中 (或可由腫瘤/癌症疫苗中所包含之新抗原切割) 之特定新抗原決定位。在非限制性實例中，本文所述的篩選方法可施加至單個或複數個個體以鑑定待投予疫苗的個體亞組。 經工程改造之 T 細胞

在一方面，提供經工程改造之 T 細胞。在實施例中，經工程改造之 T 細胞包括編碼包含外源性 TCR-β 及外源性 TCR-α (VJ) 域之多肽的核酸序列。在實施例中，核酸序列插入經工程改造之 T 細胞之 TCR-α 基因座中。在實施例中，經工程改造之 T 細胞包括編碼嵌合抗原受體 (CAR) 多肽的核酸序列。

在另一相關態樣中，提供包含經分離 T 細胞之組成物，其中至少 5% 之細胞為經工程改造之 T 細胞，各經工程改造之 T 細胞包括編碼包含外源性 TCR-β 及外源性 TCR-α (VJ) 域之多肽的核酸序列。在實施例中，核酸序列插入經工程改造之 T 細胞之 TCR-α 基因座中。

在實施例中，藉由基因編輯來破壞內源性 TCR-β 基因之表現。

在實施例中，外源性 TCR-α (VJ) 域形成包含 T 細胞之內源性 TCR-α 之至少一部分之異源性 TCR-α 的一部分。在實施例中，TCR-α 基因座為 TCR-α 恆定區。在實施例中，外源性 TCR-β 及異源性 TCR-α 係自核酸表現並形成功能性 TCR。在實施例中，經工程改造之 T 細胞與抗原結合。在實施例中，經工程改造之 T 細胞與癌細胞結合。在實施例中，TCR 與呈現於主要組織相容性複合體第 I 類 (MHCI) 分子上之抗原結合。

在實施例中，抗原為新抗原 (例如，腫瘤相關抗原 (TAA)) 或從新抗原切割或可切割的新抗原決定位。在實施例中，抗原為新抗原。在實施例中，抗原為新抗原決定位。在實施例中，新抗原或 TAA 係選自 WT1、JAK2、NY-ISO1、PRAME、KRAS 或來自表 1 或表 2 之抗原。在實施例中，抗原對擬投予經工程改造之 T 細胞之個體的癌症具有特異性。在實施例中，抗原由擬投予經工程改造之 T 細胞之個體的癌症表現或與其有關之。

在實施例中，核酸序列進一步編碼自我切割肽。在實施例中，自我切割肽為自我切割病毒肽。在實施例中，自我切割病毒肽為 T2A。在實施例中，自我切割病毒肽為 P2A。在實施例中，自我切割病毒肽為 E2A。在實施例中，自我切割病毒肽為 F2A。

在實施例中，經工程改造之 T 細胞表現 CD45RO、C-C 趨化介素受體 7 型 (CCR7) 及 L-選擇素 (CD62L)。在實施例中，經工程改造之 T 細胞具有中央記憶 (CM) T 細胞表現型。在實施例中，經工程改造之 T 細胞具有初始 T 細胞表現型。在實施例中，具有初始 T 細胞表現型的經工程改造之 T 細胞為 CD45RA+ CD45RO- CD27+ CD95- (亦即，該細胞表現 CD45RA 及 CD27 且不表現可偵測含量之 CD45RO 及 CD95)。在實施例中，經工程改造之 T 細胞具有幹細胞記憶 T 細胞表現型。在實施例中，具有幹細胞記憶 T 細胞表現型之經工程改造之 T 細胞為 CD45RA+ CD45RO- CD27+ CD95+ CD58+ CCR7-Hi TCF1+。在實施例中，經工程改造之 T 細胞具有中央記憶 T 細胞表現型。在實施例中，具有中央記憶 T 細胞表現型之經工程改造之 T 細胞為 CD45RO+ CD45RA- CD27+ CD95+ CD58+。在實施例中，經工程改造之 T 細胞具有前驅細胞耗盡的 T 細胞表現型。在實施例中，具有前驅細胞耗盡的 T 細胞表現型之經工程改造之 T 細胞為 PD-1+ SLAMF6+ TCF1+ TIM3- CD39-。在實施例中，具有前驅細胞耗盡的 T 細胞表現型之經工程改造之 T 細胞以低或中間水平表現 PD-1。可以將各標記的表現水平與對照進行比較，諸如 (但不限於) 已知表現該標記的細胞類型、已知不表現該標記的細胞類型、細胞群、T 細胞群等。

在實施例中，T 細胞係有需要之個體自體的。在實施例中，T 細胞為有需要之個體同種異體的。

在另一相關方面，提供醫藥組成物。醫藥組成物包括如本文 (包括實施例) 所述的複數個經工程改造之 Ti9 細胞及醫藥上可接受之賦形劑。

在實施例中，包含經分離 T 細胞之組成物中之至少 10% 的細胞為經工程改造之 T 細胞。在實施例中，至少 20% 之細胞為經工程改造之 T 細胞。在實施例中，至少 30% 之細胞為經工程改造之 T 細胞。在實施例中，至少 40% 之細胞為經工程改造之 T 細胞。在實施例中，至少 50% 之細胞為經工程改造之 T 細胞。在實施例中，至少 60% 之細胞為經工程改造之 T 細胞。在實施例中，至少 70% 之細胞為經工程改造之 T 細胞。在實施例中，至少 80% 之細胞為經工程改造之 T 細胞。在實施例中，至少 90% 之細胞為經工程改造之 T 細胞。

在實施例中，組成物包括約 0.1 × 10 ⁵至約 1 × 10 ⁹個經工程改造之 T 細胞。在實施例中，組成物包括至少 1 × 10 ⁸個經工程改造之 T 細胞。在實施例中，組成物包括至少 1 × 10 ⁹個經工程改造之 T 細胞。細胞數可為包括端點之引述範圍之間的任何值或子範圍。

在實施例中，組成物進一步包括醫藥上可接受之賦形劑。製備此一組成物或植入物之方式已闡述於業內 (例如參見 Remington's Pharmaceutica Sciences，第 16 版，Mack 編輯 (1980))。在適當之情形下，經工程改造之 T 細胞可以用於其各別投予途徑之常用l方式調配成呈半固體或液體形式的製劑，例如膠囊、溶液、注射劑、吸入劑或氣溶膠。在實施例中，賦形劑係平衡鹽溶液 (例如漢克氏平衡鹽溶液 (Hanks' balanced salt solution)) 或生理鹽水。亦應理解，若期望，則本發明組成物亦可與其他藥劑組合投予，例如細胞激素、生長因子、激素、小分子、化學治療劑、前藥、藥物、抗體或其他各種醫藥活性劑。對亦可包括於組成物中之其他組分實際上並無限制，條件係其他藥劑並不不良地影響組成物遞送預期療法之能力。

在非限制性實例中，本文所述的經工程改造之 T 細胞表現 TCR (內源性或外源性) 或 CAR 分子，該分子特異性地辨識以上部分所述的經工程改造之細胞 (例如，單等位基因細胞) 上的新抗原決定位-HLA 結合對。在一些實施例中，新抗原決定位-HLA 結合對將新抗原決定位呈現在細胞表面上，該新抗原決定位被 TCR 或 CAR 分子之胞外抗原結合域辨識且透過該胞外抗原結合域結合至 TCR 或 CAR 分子。此類辨識可導致經工程改造之 T 細胞的活化及增生，這可能進一步增加其等產生抗腫瘤/癌症細胞激素及/或對腫瘤/癌細胞之細胞毒性的能力。

在非限制性實例中，可以對單個或複數個個體進行定序或基因分型以提供關於個體中特定 HLA 等位基因亞型之資訊，用於藉由本文所述的方法鑑定針對特定 HLA 等位基因亞型的新抗原決定位-HLA 結合對。本文所述的經工程改造之 T 細胞可經製備以特異性地辨識新抗原決定位-HLA 結合對，因此用作針對具有至少一個已鑑別的新抗原決定位-HLA 結合對之個體的療法。

在一些實施例中，本文所述的篩選方法可施加至單個或複數個個體以鑑別待投予經工程改造之 T 細胞的個體亞組，其特異性地辨識個體中的新抗原決定位-HLA 結合對，使用個體的 HLA 等位基因亞型資訊進行鑑別。 V. 系統

在一態樣中，本文提供包含複數個本文所述的表現單等位基因 HLA 的細胞株的系統。在一些實施例中，各細胞株中之細胞不表現內源性 HLA 等位基因。在一些實施例中，各細胞株中之細胞表現本文所述的外源性 HLA 等位基因。在一些實施例中，各細胞株表現本文所述的不同外源性 HLA 等位基因。在一些實施例中，各細胞株中之細胞表現 HLA 複合物之 β 鏈，諸如 β2-微球蛋白 (B2M)。在一些實施例中，各細胞株包含編碼如本文所述的複數個新抗原相關聯肽的多核苷酸卡匣。

在一些實施例中，本文所述的系統包含待經工程化改造以使用本文所述的方法產生單等位基因細胞株的親代細胞。在一些實施例中，本文所述的系統進一步包含編碼如本文所述的複數個新抗原相關聯肽的多核苷酸卡匣。

在一些實施例中，本文所述的系統包含 MHC (例如，MHCI) 等位基因之陣列或文庫及/或已知或例如基於致病性疾病、腫瘤類型等推定的新抗原或新抗原決定位之文庫，及/或表現 HLA 及/或新抗原或新抗原決定位的細胞。此類 HLA 等位基因及新抗原或新抗原決定位可用於鑑定本文所述的特定新抗原決定位-HLA 結合對。 VI. 套組

在一態樣中，本文提供含有本文所述的系統或組成物的套組或試劑組成物。如本文所述，本文的套組或試劑組成物亦可包括試劑，該等試劑用於製備經工程改造之細胞株、執行用於鑑定特定新抗原決定位-HLA 結合對的檢定及/或分析新抗原決定位與 HLA 蛋白之間的結合。本文之套組或試劑組成物亦可包括關於執行本文之方法或部分該等方法的指令。 VII. 製備方法

在一態樣中，本文提供一種產生本文所述的組成物之方法。

在一態樣中，本申請提供一種產生本文所述的新抗原及/或新抗原決定位組成物或 HLA 組成物之方法。可以使用合適的方法或本領域技術人員已知的方法對編碼新抗原或新抗原決定位或 HLA 肽的單個或複數個多核苷酸進行工程改造 (例如，分離、選殖等)。表現載體 (例如，質體、病毒載體等) 可用於將新抗原、新抗原決定位及/或 HLA 組成物引入到細胞內。可選擇標記可用於鑑定含有此類表現載體或用於表現的多核苷酸的經工程改造之細胞。在一些實施例中，使用本文所述或本領域技術人員已知的方法，將本文所述的表現載體穩定地或瞬時地遞送至細胞中。

在另一相關態樣中，提供一種製備經工程改造之 (例如，單等位基因) 細胞及/或細胞株之方法。在一些實施例中，透過合適的方法或技術人員已知的方法，向經工程改造之細胞引入 HLA 等位基因多核苷酸 (例如，HLA 等位基因或外顯子的全部或部分) 以表現 HLA 等位基因肽。在一些實施例中，細胞經工程改造以降低或完全抑制除一個以外的全部內源性 MHC 等位基因 (例如，MHCI 等位基因) 之表現，導致細胞僅表現一種類型的 HLA 等位基因肽。在一些實施例中，細胞經工程改造以降低或完全抑制全部內源性 MHC 等位基因 (例如，MHCI 等位基因) 之表現，然後經引入用於表現 MHC 等位基因肽的 MHC 等位基因多核苷酸，導致細胞僅表現一種類型的 MHC 等位基因肽。降低或完全抑制內源性 HLA 等位基因表現的示例可以至少包括剔除方法 (例如，CRISPR 技術) 及敲低方法 (例如，siRNA、shRNA、反義寡核苷酸、miRNA 等)。

在一些實施例中，向經工程改造之細胞進一步引入包含單個或複數個新抗原或新抗原決定位的多肽或編碼此類多肽的多核苷酸。當引入到經工程改造之細胞內時，該單個或複數個新抗原可經切割以產生複數個新抗原決定位。在一些實施例中，向經工程改造之細胞進一步引入編碼複數個新抗原相關聯肽或新抗原決定位的多核苷酸卡匣，如本文所述。

在另一相關態樣中，提供一種用於製備腫瘤/癌症疫苗之方法。在一些實施例中，本文所述的腫瘤/癌症疫苗包含多肽或編碼此類多肽的多核苷酸，其包含可從由腫瘤或癌細胞表現的新抗原切割之新抗原或新抗原決定位。在一些實施例中，本文所述的腫瘤/癌症疫苗包含本文所述的新抗原或新抗原決定位組成物。在一些實施例中，本文所述的新抗原決定位中之至少一者或可從腫瘤/癌症疫苗中之新抗原切割的新抗原決定位與由待投予該疫苗之單個或複數個個體中之腫瘤或癌細胞或另一 APC 細胞表現的 HLA 形成特定新抗原決定位-HLA 結合對。

在非限制性實例中，新抗原可以由單個或複數個個體中的腫瘤或癌細胞表現。基於個體的特定 HLA 等位基因之資訊，使用本文描述的方法鑑別特定的新抗原決定位-HLA 結合對。在一些實施例中，本文所述的腫瘤/癌症疫苗經產生以在所鑑別的新抗原決定位-HLA 結合對中包含新抗原決定位或從其切割新抗原決定位的新抗原。在一些實施例中，至少一種腫瘤/癌症疫苗係選自複數種疫苗，用於在所鑑別的新抗原決定位-HLA 結合對中具有新抗原決定位或從其切割新抗原決定位的新抗原。在一些實施例中，至少一個個體係選自待投予腫瘤/癌症疫苗的複數個個體，而個體中的 HLA 及疫苗中的新抗原決定位或從其切割新抗原決定位的新抗原能夠形成所鑑別的新抗原決定位 HLA 結合對。

在另一相關方面，提供製備經工程改造之 T 細胞的方法。在實施例中，經工程改造之 T 細胞包括編碼包含外源性 TCR-β 及外源性 TCR-α (VJ) 域之多肽的核酸序列。在實施例中，核酸序列插入經工程改造之 T 細胞之 TCR-α 基因座中。在實施例中，經工程改造之 T 細胞包括編碼嵌合抗原受體 (CAR) 多肽的核酸序列。

在非限制性實例中，本文所述的經工程改造之 T 細胞表現 TCR (內源性或外源性) 或 CAR 分子，該分子特異性地辨識以上部分所述的經工程改造之細胞 (例如，單等位基因細胞) 上的新抗原決定位-HLA 結合對。在非限制性實例中，可以對單個或複數個個體進行定序或基因分型以提供關於個體中特定 HLA 等位基因亞型之資訊，用於藉由本文所述的方法鑑定針對特定 HLA 等位基因亞型的新抗原決定位-HLA 結合對。本文所述的經工程改造之 T 細胞可以藉由引入具有 TCR 或 CAR 分子的 T 細胞來製備，該等分子特異性地辨識新抗原決定位-HLA 結合對。在一些實施例中，本文所述的篩選方法可施加至單個或複數個個體以鑑別待投予經工程改造之 T 細胞的個體亞組，其特異性地辨識個體中的新抗原決定位-HLA 結合對，使用個體的 HLA 等位基因亞型資訊進行鑑別。 VIII. 使用方法 鑑定新抗原決定位 -HLA 結合對的方法

在一態樣中，本文提供一種鑑定新抗原決定位-HLA 結合對的方法。

在一些實施例中，該方法之第一視情況選用的步驟包括提供或收集經工程改造之細胞，諸如包含多個細胞的表現單等位基因 HLA 的細胞株，其中各細胞表現第一外源性 HLA 並包含編碼複數個新抗原相關聯肽或新抗原決定位的多核苷酸，例如多核苷酸卡匣。該方法之第二視情況選用的步驟包括在各細胞中表現該複數個新抗原相關聯肽，其中藉由在各細胞內切割該複數個新抗原相關聯肽來產生複數個新抗原決定位，使得一個或多個新抗原決定位在細胞表面結合至第一外源性 HLA 等位基因。該方法之第三視情況選用的步驟包括使用合適的溶析溶液將在細胞表面結合至第一外源性 HLA 的新抗原決定位從該 HLA 溶析。該方法之第四視情況選用的步驟包括鑑別來自第三視情況選用的步驟的經溶析之新抗原決定位，從而鑑別新抗原決定位-HLA 結合對。此類複數個新抗原相關聯肽結合至一個或多個 HLA 可以藉由肽交換檢定來確定，或藉由生物資訊學及/或腫瘤突變之臨床分析來鑑別。

在一些實施例中，該方法之第一視情況選用的步驟包括提供或收集經工程改造之細胞，諸如包含多個細胞的表現單等位基因 HLA 的細胞株，其中各細胞表現第一外源性 HLA 等位基因。該方法之第二視情況選用的步驟包括使細胞與合成的新抗原決定位接觸。該方法之第三視情況選用的步驟包括使用合適的溶析溶液將在細胞表面結合至第一外源性 HLA 等位基因的肽從該 HLA 等位基因溶析。該方法之第四視情況選用的步驟包括鑑別來自第三視情況選用的步驟的經溶析之新抗原決定位，從而鑑別新抗原決定位-HLA 結合對。在一些實施例中，在第二視情況選用的步驟中使用複數個經合成之新抗原決定位，提供對能夠與特定 HLA 蛋白形成結合對之新抗原決定位的篩選。

在實施例中，單等位基因細胞株為如本文所述 (或如所述製造) 的單等位基因細胞株。在實施例中，多核苷酸卡匣為如本文所述的多核苷酸卡匣。

在實施例中，經合成之新抗原決定位包含可偵測之部分。在實施例中，可偵測之部分為重胺基酸。術語「重胺基酸」指代存在一種或多種重同位素，諸如非放射性同位素。合適的同位素包括，例如， ²H、 ¹³C、 ¹⁵N 或 ¹⁸O。在實施例中，對經溶析之新抗原決定位的鑑別包括對可偵測之部分的偵測。

在實施例中，藉由肽交換檢定將經合成之新抗原決定位確定為結合至一個或多個 HLA。

在實施例中，在包含細胞的表現第二單等位基因 HLA 的細胞株中重複該等步驟，其中各細胞表現第二外源性 HLA 等位基因多肽。在實施例中，在多個細胞株中重複該等步驟，其中各細胞株表現不同的外源性 HLA 等位基因多肽。 選擇進行治療之個體的方法

在一態樣中，本文提供一種選擇患有癌症或腫瘤的個體進行免疫療法的方法。在一些實施例中，該方法用於選擇個體進行 T 細胞療法，諸如使用表現 T 細胞受體 (TCR) 及/或嵌合抗原受體 (CAR) 的 T 細胞。

在一些實施例中，該方法之第一視情況選用的步驟包括對單個或複數個個體進行基因分型，以鑑定由個體表現的 HLA 等位基因及由該個體中的或傾向於在該個體中發展的癌症或腫瘤表現的新抗原或可從該等新抗原切割的新抗原決定位。在一些實施例中，個體的此類 HLA 等位基因及新抗原/新抗原決定位資訊是技術人員已知的。該方法之第二視情況選用的步驟包括確定個體中所表現的 HLA 蛋白中之任一者是否能夠與同一個體中的一個或多個新抗原決定位形成特定結合對。在非限制性實例中，如果鑑別出至少一新抗原決定位-HLA 結合對，則具有新抗原決定位或從其切割該新抗原決定位之新抗原及 HLA 等位基因兩者的個體可經確定為可藉由包含特異性地結合至新抗原決定位-HLA 結合對的 TCR 或 CA 之 T 細胞治療，並且視情況藉由該 T 細胞進行治療。

在一些實施例中，該方法用於選擇個體進行癌症/腫瘤疫苗療法。

在一些實施例中，該方法之第一視情況選用的步驟包括對單個或複數個個體進行基因分型，以鑑定由個體表現的 HLA 等位基因及由該個體中的或傾向於在該個體中發展的癌症或腫瘤表現的新抗原或可從該等新抗原切割的新抗原決定位。在一些實施例中，個體的此類 HLA 等位基因及新抗原/新抗原決定位資訊是技術人員已知的。該方法之第二視情況選用的步驟包括確定個體中所表現的 HLA 等位基因中之任一者是否能夠與一個或多個新抗原決定位形成特定結合對。在非限制性實例中，如果鑑別出至少一新抗原決定位-HLA 結合對，則具有該 HLA 的個體可經確定為可藉由腫瘤/癌症疫苗治療，並且視情況藉由該疫苗進行治療，該疫苗包含在所鑑別的新抗原決定位-HLA 結合對 (其具有個體中之 HLA 等位基因) 中之新抗原決定位或從其切割該新抗原決定位的新抗原。

在實施例中，新抗原決定位是否與 HLA 形成新抗原決定位-HLA 結合對 (例如，新抗原決定位-HLA 結合對的鑑定) 係藉由分析此類相互作用的資料庫來確定。在實施例中，至少部分地使用其中描述的方法來確定資料庫中的結合對。 治療個體的方法

在一態樣中，本文提供一種治療患有癌症或腫瘤的個體或預防個體患有/發展癌症或腫瘤之方法。

在一些實施例中，該方法包含向個體投予治療有效量之表現 T 細胞受體 (TCR) 及/或嵌合抗原受體 (CAR) 的 T 細胞。在一些實施例中，TCR 及/或 CAR 特異性地結合至新抗原決定位-HLA 結合對，該結合對包含在個體中表現的 HLA 及由個體中的或易於在個體中發展的腫瘤或癌細胞表現的新抗原決定位。

在一些實施例中，該方法包含選擇個體進行如以上部分所述的治療並且用本文所述的組成物治療所選個體，包括腫瘤/癌症疫苗或用經工程改造之 T 細胞進行的 T 細胞療法。

在一些實施例中，該方法之第一視情況選用的步驟包括選擇表現 HLA 等位基因並且患有表現新抗原之癌症的個體。視情況，HLA 已知或經確定為結合至可從新抗原切割的新抗原決定位。在一些實施例中，該方法之第二視情況選用的步驟包括向個體投予治療有效量之表現本文所述 T 細胞受體 (TCR) 及/或嵌合抗原受體 (CAR) 的 T 細胞。此類 TCR 及/或 CAR 可以特異性地結合至包含 HLA 及新抗原決定位的新抗原決定位-HLA 結合對。

在一些實施例中，該方法包含向個體投予治療有效量之包含新抗原決定位或編碼新抗原決定位之多核苷酸的疫苗。此類新抗原決定位可以特異性地結合至在個體中表現的 HLA 以形成特定新抗原決定位-HLA 結合對。

可用於本文所述治療的製劑及投予途徑的劑量可以由醫生確定為合適的。對於經工程改造之 T 細胞，可以以任何合適的量，諸如約 1×10 ⁵與 1×10 ⁹個之間的細胞，向個體投予經擴增之複數個經工程改造之 T 細胞。在實施例中，經擴增之複數個經工程改造之 T 細胞包含至少 1 ×10 ⁸個經工程改造之 T 細胞。在實施例中，經擴增之複數個經工程改造之 T 細胞包含至少 1 ×10 ⁹個經工程改造之 T 細胞。該數量可為包括端點之引述範圍內的任何值或子範圍。

應理解，本文所描述之實例及實施例僅用於說明目的，且熟習此項技術者將提出根據其之各種修改或改變且該等修改或改變將包括在本申請之精神及範圍內以及所附申請專利範圍之範疇內。本文引用之所有出版物、專利及專利申請出於所有目的以引用之方式整體併入本文。

熟習此項技術者將理解，製備及使用本文所闡述之複合物的說明僅出於闡釋目的，且本揭露不受該闡釋之限制。

本文所論述之出版物僅由於其揭示內容先於本申請案的申請日期而提供。本文中之內容皆不應視為承認該等出版物構成隨附申請專利範圍的先前技術。本文所提及之所有出版物之所有教示內容 (包括但不限於所有組成物、組分、試劑及方法) 皆以全文引用方式併入本文中。實例

在以下實例中進一步詳細地揭露額外的實施例，該等實施例以說明的方式提供並且不以任何方式旨在限制本揭露或申請專利範圍之範圍。

實例 1 ：共有新抗原中的新抗原決定位發現：生化、細胞工程及質譜分析

新抗原特異性 T 細胞在免疫媒介之腫瘤消除中發揮關鍵作用，且大量資源已經致力於研發臨床活性藥物，該等藥物擴大癌症免疫性週期以改良所誘發之免疫反應的量級及廣度 (Chen 與 Mellman, Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity2013; 39(1):1-10；Rosenberg, Decade in review-cancer immunotherapy: entering the mainstream of cancer treatment. Nat Rev Clin Oncol.2014; 11(11):630-2)。無論單獨使用亦或與廣泛的免疫系統活化配對使用，靶向免疫療法皆可以使得能夠增強效力及安全概況 (Melero 等人，Evolving synergistic combinations of targeted immunotherapies to combat cancer. Nat Rev Cancer. 2015; 15(8):457-72；Panchal 等人，Role of targeted immunotherapy for pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) treatment: An overview. Int Immunopharmacol. 2021; 95:107508)。此外，經程式化以根除表現新抗原之細胞的 T 細胞可能有助於次世代細胞療法，尤其針對實體瘤的細胞療法之設計 (Leidner 等人，Neoantigen T-Cell Receptor Gene Therapy in Pancreatic Cancer. N Engl J Med. 2022; 386(22):2112-2119；Yang 與 Rosenberg, Adoptive T-Cell Therapy for Cancer. Adv Immunol.2016; 130:279-94)。

在過去 10 年間，源自癌症特異性突變 (例如，新抗原決定位) 之表位的主要組織相容性複合物 I 類 (MHCI) 呈現已成為免疫系統可控制腫瘤生長之關鍵作用模式。已顯示此等非自身新抗原決定位的呈現經由可驅動抗腫瘤免疫反應的癌症免疫性週期誘導新抗原特異性 T 細胞反應。因新抗原特異性 T 細胞在毒殺腫瘤中發揮作用，故學術界及生物技術中之大量資源已致力於研發將擴大癌症免疫性週期且改良新抗原特異性 T 細胞反應之量級及廣度的臨床活性藥物，包括查核點抑制劑、細胞激素及 TNF 超家族拮抗劑。對於此等治療方式，主要目標為擴大整個免疫反應而非選擇性地增強特定新抗原 T 細胞反應的靶向療法，故此等治療對於經呈現在給定腫瘤上的實際新抗原及新抗原決定位為拮抗性的。

已經有研究透過使用疫苗及經工程改造之 T 細胞療法來擴大特定新抗原 T 細胞反應。此等類型之療法靶向兩大類新抗原：共有的新抗原或個性化/私有新抗原 (Zhang 等人，Neoantigen: A New Breakthrough in Tumor Immunotherapy. Front Immunol.2021; 12:672356)。私有 (又名，個性化) 新抗原代表癌症進展過程中出現的絕大多數突變並且為個體之腫瘤特有的體細胞突變，且未見於多個患者或適應症 (Jhunjhunwala 等人，Antigen presentation in cancer: insights into tumour immunogenicity and immune evasion. Nat Rev Cancer.2021; 21(5):298-312)。研發針對私有新抗原的治療劑需要研發個性化藥物，這帶來幾個獨特的挑戰，並且需要對患者的生檢、HLA 分型及基於生物資訊學的新抗原預測進行基因體分析之複雜過程，以便在設計及生產治療劑之前對表位進行排序 (Capietto 等人，Characterizing neoantigens for personalized cancer immunotherapy. Curr Opin Immunol. 2017; 46:58-65；Lang 等人，Identification of neoantigens for individualized therapeutic cancer vaccines. Nat Rev Drug Discov.2022; 21(4):261-282)。儘管在這一領域取得了一些成功 (Ott 等人，An immunogenic personal neoantigen vaccine for patients with melanoma. Nature2017; 547(7662):217-221；Sahin 等人，Personalized RNA mutanome vaccines mobilize poly-specific therapeutic immunity against cancer. Nature2017; 547(7662):222-226)，但尚未建立廣泛可用的個性化新抗原靶向療法的道路。

與個性化新抗原的個體化性質相反，在廣泛的患者及適應症中鑑別了愈來愈多之突變，該等突變指代為共有的新抗原 (Zhang 等人， Front Immunol.2021).。共有的新抗原之盛行率與其等之生物學功能有關，且許多推定的共有的新抗原源自蛋白質諸如 KRAS、EGFR、TP53 及 BRAF 內的致癌突變 (Klebanoff 與 Wolchok, Shared cancer neoantigens: Making private matters public. J Exp Med.2018; 215(1):5-7)。對特定突變的先驗知識能夠發現並驗證標靶表位以及通往「現成」治療劑的途徑，該等治療劑可向其腫瘤荷有標靶突變及適當 HLA 單倍型的任何患者投予。靶向共有的新抗原的疫苗之早期示例已顯示出有希望的臨床前功效，包括靶向 IDH1 (Schumacher等人， Nature2014; 512(7514):324-327)、KRAS (Wang 等人， Cancer Immunol Res. 2016; 4(3):204-214) 及 H3.3K27M (Chheda 等人， JExp Med.2018; 215(1):141-157) 的疫苗。除了疫苗之外，靶向共有的新抗原的 T 細胞療法最近亦顯示出臨床功效。一些早期證據表明，特異於 KRAS G12D HLA-C*08:02 限制性新抗原決定位的 T 細胞能夠在患有肺轉移性腫瘤的人類患者中產生有效的抗腫瘤反應 (Tran 等人， N Engl J Med. 2016; 375(23):2255-2262；Leidner 等人，Neoantigen T-Cell Receptor Gene Therapy in Pancreatic Cancer. NEngl J Med. 2022; 386(22):2112-2119)。亦在 KRAS G12V/G12D HLA-A*11:01 限制性新抗原決定位的臨床前模型中證明了療效 (Wang 等人， Cancer Immunol Res. 2016; 4(3):204-214)。然而，儘管有「現成」疫苗及 T 細胞療法的潛力，但鑑定共有的新抗原表位及呈現其等的 HLA 環境仍然是藥物研發之主要挑戰。

新抗原特異性 T 細胞對腫瘤相關突變的反應需要將新抗原加工成新抗原決定位，亦即源自經突變之蛋白質的肽，然後該等新抗原決定位必須經由細胞表面相關的 I 類 HLA 分子 (HLA-I) 呈現。T 細胞受體 (TCR) 與特定新抗原決定位-HLA 複合物相互作用，因此治療標靶定義包含新抗原決定位序列及呈現該新抗原決定位之 HLA-I 亞型兩者。新抗原決定位之長度通常為 8 至 11 個胺基酸，因此單個胺基酸取代可能存在於 38 個可能的新抗原決定位內 (亦即，八 (8) 聚體、九 (9) 聚體、十 (10) 聚體及十一 (11) 聚體)。此外，HLA-I 分子具有高度多型性，有超過 1000 種已記錄的變異體，各變異體皆能夠結合不同子集的肽。因此，潛在新抗原決定位-HLA 標靶的數量迅速增加，並且即使研發聚焦於源自跨最盛行之 15 個 HLA 等位基因中最常見之 50 種癌症新抗原的新抗原決定位上，仍可形成＞28,000 個新抗原決定位-HLA 對。然而，並非全部此等組合皆具有治療相關性，因為即使新抗原決定位可以結合 HLA 分子，也不能保證特定新抗原決定位會呈現在腫瘤細胞的生物學環境中。此等等位基因中之大多數非常罕見，並且鑒於同時攜帶新抗原突變及此等罕見等位基因兩者的患者很少見，該等等位基因不會構成藥物研發之有力候選者。

因此，測試了前 15 種最常見的 HLA 與 38 個新抗原決定位中之各者的相互作用，從而產生了 570 種可能的 HLA-新抗原決定位組合，該等組合可以源自單個新抗原。此外，為了對全部臨床相關新抗原的新抗原決定位標靶在盛行率及臨床發展方面執行全面分析，組合的數量增長至超過 28,000 種 (假設約 50 個臨床相關新抗原標靶)，這對於評定而言是一個非常大的組合數量。然而，並非全部此等組合皆具有治療相關性，因為即使新抗原決定位可以結合 HLA 分子，也不能保證特定新抗原決定位可用於在腫瘤細胞的生物學環境中結合。

從 28,000 種可能的組合中快速選擇生物學相關的標靶新抗原決定位-HLA 對的一種方法為使用新抗原決定位預測演算法。已經研發了數種不同的演算法來對給定新抗原之新抗原決定位-HLA 對進行排序。然而，此等演算法無法準確地預測 HLA 對新抗原決定位的呈現。儘管新抗原決定位-HLA 預測演算法的準確性取得了重大進展，但不能僅依靠此等方法來鑑定經呈現之新抗原決定位，此等新抗原決定位為新抗原靶向疫苗及 T 細胞療法的真正標靶。

新抗原決定位的生成依賴於抗原加工途徑 (APP)，因為癌症新抗原由蛋白酶體降解，且所得之肽經導入 ER 內，該等肽於該處由 ER 駐留的胺肽酶進一步加工，然後最終經加載至 HLA 分子中進行呈現 (Pishesha 等人，A guide to antigen processing and presentation. Nat Rev Immunol.2022 Apr 13. doi: 10.1038/s41577-022-00707-2)。因此，合成的新抗原決定位可能會在活體外結合 HLA 分子，但在細胞或活體內環境中不會作為經呈現之肽而觀察到。一個主要示例為對靶向 KRAS G12V (KLVVVGAVGV，SEQ ID NO: 191) 的 A*02:01 限制性新抗原決定位的雙特異性抗體之描述 (參見 Skora 等人 2015 Proc Natl Acad Sci USA112(32):9967-9972；Douglass 等人，Bispecific antibodies targeting mutant RASneoantigens. Sci Immunol.2021 Mar 1;6(57):eabd5515)。當 HLA 分子經加載合成肽時，該分子在活體外表現出結合，但在攜帶 KRAS 突變的細胞株中測試時未能誘導細胞毒殺。出於該原因，透過基於質譜 (MS) 的免疫肽組學方法對所呈現之肽進行直接鑑定是新抗原標靶驗證的關鍵態樣。例如，使用靶向 MS 方法來進一步證明前述 KRAS A*02:01 新抗原決定位不在細胞環境中呈現 (Choi 等人，Systematic discovery and validation of T cell targets directed against oncogenic KRAS mutations. Cell Rep Methods. 2021; 1(5):100084)。雖然極其敏感，但此類靶向 MS 檢定需要經重同位素標記之肽用於各潛在新抗原決定位以及表現所關注之癌症新抗原的細胞株。由於此等限制，靶向 MS 檢定通常用於評定給定研究中的少量癌症新抗原。

為了解決這一限制，本文提出了一種用於全面發現並驗證經呈現於細胞表面上的新抗原決定位-HLA 對的流程。該過程之第一步是對全部已知新抗原執行臨床基因體學分析，以鑑定具有作為臨床靶標之高價值的新抗原。在該分析中，評定了適應症內及跨適應症的盛行率以及臨床可研發性。從該分析中選擇了 48 種新抗原。

下一步是研發一種高通量 HLA 結合檢定來篩選經呈現於細胞表面上的新抗原決定位-HLA 組合 (例如，48 個新抗原、38 個新抗原決定位/新抗原及 15 個 HLA 等位基因的 27,360 種組合，或如表 3所示之 47 個新抗原、38 個新抗原決定位/新抗原及如表 4所示之 15 個 HLA 等位基因的 26,220 種新抗原決定位-HLA 組合)。使用臨床基因體學方法，選擇了 47 個常見的癌症點突變和 15 個盛行之 HLA-I 等位基因，以使得能夠表徵臨床上可操作的新抗原標靶之新抗原決定位景觀。然後使用一種新穎高通量 HLA 結合檢定對全部潛在的 24,149 個新抗原決定位-HLA 組合進行活體外穩定化實驗篩選，以鑑定 587 個穩定複合物 (Darwish 等人， Protein Sci.2021; 30(6):1169-1183；Rodenko 等人，Generation of peptide-MHC class I complexes through UV-mediated ligand exchange. Nat Protoc.2006; 1(3):1120-32)。為了理解新抗原決定位-HLA 複合物的活體外與電腦模擬鑑定的互補性，來自高通量結合檢定之結果由新抗原決定位-HLA 組合的額外子集補充，該等組合在活體外不能形成穩定的複合物但藉由 NetMHCpan4.0 預測為結合 (Jurtz 等人，NetMHCpan-4.0: Improved Peptide-MHC Class I Interaction Predictions Integrating Eluted Ligand and Peptide Binding Affinity Data. J Immunol.2017; 199(9):3360-3368)。使用 HLA-I 單等位基因細胞株的非靶向及靶向質譜分析兩者來檢定所得新抗原決定位-HLA 對的呈現，該等細胞株同時表現對應於 47 個癌症新抗原中之各者的約 25 個胺基酸鏈段。該分析產生了 84 個新抗原決定位-HLA 對之列表，據了解，該列表為經實驗驗證的經呈現之新抗原決定位的最廣泛列表。最後，對此等標靶之治療潛力的表征利用在平行治療劑發現工作中使用已確立的 T 細胞受體抗原多工鑑定 (MIRA) 檢定發現的 TCR 進行，以證明對於表現 A*02:01 FLT3 D835Y 或 A*11:01 PIK3CA E454K 新抗原決定位之細胞的突變體選擇性 T 細胞活化及毒殺。例如，在一個示例性實驗中，透過研發高通量肽-HLA 結合檢定，表征了 26,790 種肽-HLA 組合的結合，產生 643 個穩定複合物。此等結果用於構建靈敏的靶向質譜檢定，以驗證 15 個單等位基因細胞株上的新抗原決定位呈現，該等細胞株含有編碼 47 個癌症新抗原的構建體。該分析偵測到 79 種獨特的肽-HLA 對，該等肽-HLA 對源自 34 個共有的癌症新抗原，並且跨 12 個 HLA 等位基因經呈現。此等資料共同代表了治療相關新抗原決定位的寶貴資源以及其等可以作為標靶的 HLA 環境。

材料與方法

共有癌症新抗原的臨床基因體學分析

常見癌症突變 (SNV 及插入缺失) 之盛行率資料獲自癌症熱點資料庫 (全球資訊網網站 cancerhotspots.org；參見 Chang 等人，2018 Cancer Discov.8(2):174-183) 並與獲自 cBioPortal for Cancer Genomics (全球資訊網網站 cbioportal.org) 的 TCGA 資料進行交叉引用。來自一般人群的常見 HLA 等位基因的盛行率資料獲自等位基因頻率網路資料庫 (全球資訊網網站 allelefrequencies.net) 以及對＞8,000 例 TCGA 病例的 HLA 分型。從此等資料集中，確定了 48 種最常見的癌症突變 (基於每種癌症類型的盛行率)，並確定了 48 個最常見的 HLA-I 等位基因。對此等突變執行額外的排序，該排序慮及各癌症類型之總體盛行率，以及是否可以在臨床環境中容易地研發新抗原特異性療法。

預測的新抗原決定位景觀分析

在將突變轉譯為肽序列後，使用 NetMHCpan-4.0 (Jurtz 等人，NetMHCpan-4.0: Improved Peptide-MHC Class I Interaction Predictions Integrating Eluted Ligand and Peptide Binding Affinity Data. J Immunol. 2017; 199(9):3360-3368) 對源自 47 個癌症新抗原的 8、9、10、11、12 或 13 聚體肽與 15 個最盛行之 HLA 等位基因組合的全部組合生成新抗原決定位-HLA 結合預測。獲得了結合親和力 (BA) 及經溶析之配體 (EL) 預測兩者，然後將其用於下游分析。預測的新抗原決定位經定義為突變型 EL 百分等級＜ 2 的新抗原決定位-HLA 組合。

蛋白質表現及純化

如前所述，將重組 HLA 及 B2M 在大腸桿菌 ( E. coli) 中過表現，從包涵體純化，並於 -80℃ 儲存在變性緩衝液 (6 M 鹽酸胍、25 mM Tris，pH 8) 中 (Darwish 等人， Protein Sci.2021; 30(6):1169-1183)。簡而言，將 B2M 及 HLA 生物質沉澱物以 5 mL/g 重新懸浮在溶胞緩衝液 (PBS + 1% Triton X-114) 中，並在 1000 bar 的微流化器中均質化兩次。將所得懸浮液在超離心器中以 30000 g 旋轉 20 分鐘。收集沉澱物並用 500 ml 的 0.5% Triton X-114 在 PBS 中之溶液洗滌。然後將收集的樣品以 30000 g 離心 20 分鐘。再次收集沉澱物並如上所述洗滌。將經純化之包涵體以 10 ml/g 之濃度溶於變性緩衝液 (20 mM MES (pH 6.0)、6M 胍) 中並在 4℃ 攪拌越夜。將經溶解之沉澱物以 40000 g 離心 60 分鐘，收集上清液並透過 0.22 mm 過濾器過濾。藉由 UV-Vis 在 280 nm 使用蛋白質之消光係數來確定濃度。然後將樣品速凍並儲存於 -80℃，然後生成複合物。

HLA-I- 肽再摺疊、生物素化及純化

如前所述，在再摺疊緩衝液 (100 mM Tris、pH 8.0、400 mM L-精胺酸、2 mM EDTA) 中的 5L 再摺疊反應中產生條件性 HLA-I 複合物 (Darwish 等人，2021)。簡而言，再摺疊反應由含有非天然 UV 可切割胺基酸 (0.01 mM) 的條件 HLA-I 配體肽、氧化和還原型麩胱甘肽 (分別為 0.5 mM 及 4.0 mM)、重組 HLA (0.03 mg/ml) 及 β2M (0.01 mg/ml) 組成。將再摺疊混合物在 4℃ 攪拌 3 至 5 天，經由 0.22 µm 過濾器過濾，並濃縮且藉由切向流過濾 (TFF) (Millipore P2C010C01) 緩衝液交換至 25 mM Tris pH 7.5 中。然後透過添加 BirA [酶:HLA 比率為 1:50 (wt:wt)]、100 mM ATP 及 10X 反應緩衝液 (100 mM MgOAc、0.5 mM 生物素)，在室溫進行為期 2 小時之孵育來使經濃縮及再摺疊之 HLA-I 複合物生物素化。透析樣品並藉由 LC/MS 分析以量化生物素化。藉由陰離子交換層析，使用 1 ml HiTrap Q HP 管柱在 AKTA Avant FPLC 上純化經生物素化之 HLA-I 複合物。使用 10 管柱體積 (CV) 之 25 mM Tris HCl (pH 7.5) 以 5 ml/min 之流速來平衡管柱。將經再摺疊之 HLA-I 樣品以 5 ml/min 流速加載於管柱上並使用超過 30 CV 之 0 至 60% 2.5 mM TrisHCl (pH 7.5)、1 M NaCl 梯度溶析。在 SDS-PAGE 上運行溶析峰之餾分，且彙集含有 B2M 帶及 HLA 帶之餾分。將所彙集餾分緩衝液-交換至儲存緩衝液 (25 mM Tris HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl) 中。藉由 280 nm 下之 UV 吸光度確定蛋白質濃度，且將樣品速凍並於 -80℃ 儲存。

用於 活體外結合檢定的肽合成

用於結合篩選的肽由 JPT Peptide Technologies GmbH (德國) 合成，並藉由 HPLC 純化至＞70% 純度。將肽以 1 mg/mL 溶解在乙二醇 (Sigma) 中，並於 -80℃ 儲存在 Matrix 1.0 mL 2D 螺旋蓋管 (Thermo Fisher Scientific) 中。由 Elim Biopharm 用 3-胺基-3-(2-硝基苯基)丙酸合成 UV 可切割肽，並藉由 HPLC 純化至＞70% 純度。

自動化高通量新抗原決定位交換

使用 Biomek i5 自動液體處理器 (Beckman Coulter) 在 96 深孔平板 (VWR) 中，將肽在 25 mM TRIS pH 8.0、150 mM NaCl、4 mM EDTA、4.35% 乙二醇中稀釋至 10 µM。將肽-緩衝液混合物以每孔 47.5 µl 的體積分配並重新格式化到 384 孔平板 (Labcyte) 中，產生多達 352 個獨特新抗原決定位的相同平板，用於篩選 15 個 HLA 等位基因中之各者。平板之前兩列保留用於對照。各平板上包括具有及不具有交換肽的 HLA A*02:01，分別作為交換的陽性及陰性對照。將經充分表征之 HLA A*02:01 特異性病毒表位 CMV pp65 肽 (NLVPMVATV，SEQ ID NO: 76，Elim Biopharm) 一式四份進行平板接種，作為肽交換的陽性對照。交換的陰性對照包括未添加肽且反而在肽稀釋步驟期間僅接受乙二醇的孔。將正在篩選的 HLA 等位基因的陰性對照孔一式八份進行平板接種。

使用 Mantis 液體處理器 (Formulatrix)，將 2.5 µl 的 0.1 mg/ml UV 肽-HLA 複合物添加到各孔中，每個平板篩選一個 HLA 等位基因進行結合。陽性對照孔接受 HLA A*02:01，且陰性對照孔接受 HLA A*02:01 或特定於平板的 HLA 等位基因。所得之肽交換反應混合物含有 10 µM 肽、0.1 µM UV-HLA 複合物及 5% 乙二醇 v/v。

肽交換方案修改自先前描述的方法 (Rodenko 等人， Nat Protoc.2006; 1(3):1120-1132)，藉由減少 UV 曝露時間並在 UV 曝露後添加孵育步驟進行修改。含有肽交換反應混合物的平板在 UV 燈 (UVP 3UV 燈，Analytik Jena) 下使用每個平板一盞燈孵育 25 分鐘。然後將平板密封並在室溫孵育 18 小時。

TR-FRET 檢定

為了確定 HLA 結合物，研發僅在 B2M 及 HLA 複合物緊鄰時提供訊號之 TR-FRET 檢定。此檢定使用含有 TR-FRET 供體之針對 B2M 的抗體 (抗 B2M-供體) 及鏈球親生物素蛋白，該鏈球親生物素蛋白與複合物之生物素化 HLA 組分結合且經 TR-FRET 受體標記 (鏈球親生物素蛋白-別藻藍蛋白 (SA)-受體)。若 B2M 及 HLA 複合至一起，則抗 B2M 供體及 SA-受體將在溶液中靠近以產生 TR-FRET 訊號。與之相比，若複合物發生分解，則該等試劑將均勻分佈且並無 TR-FRET 訊號。

將含有 UV-交換之 HLA/肽複合物之 384 孔源平板 (Echo 合格 384 孔聚丙烯 2.0 Plus 微量平板，Labcyte PPL-0200) 在 37℃ 孵育越夜。將盤在室溫下平衡 1 小時，隨後離心。使用自動化聲學分配器 (Echo 550，Labcyte) 將源平板之各孔以不同體積 (160 nL、80 nL、40 nL 及 20 nL) 分配至目標平板 (MAKO 1536 孔白色固體底，Aurora Microplates, Whitefish, MT) 的回填孔 (具有測定緩衝液) 中四次，總體積為 4 µL/孔 (2 µL 經稀釋之樣品及 2 µL 試劑混合物) 且最終樣品濃度為 10、5、2.5 及 1.25 nM。簡而言，藉由 Multidrop™ Combi nL 分配器 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 將 1.8 µL 每孔的檢定稀釋液 (PBS、0.5% BSA + 0.05% Tween 20 +10 PPM Proclin，建南德克公司) 添加至 1536 孔目標平板。然後藉由 Echo 550 聲學液體分配器 (Beckman Coulter Life Sciences, Indianapolis, IN) 將 200 nL 的 5 µg/mL HLA 複合物樣品從 Echo 合格的 384 孔源平板e (Beckman Coulter Life Sciences, Indianapolis, IN) 分配到目標平板中。離心三分鐘後，使用 Multidrop™ Combi nL 分配器將兩 µL 的 2 nM 預混液供體 (銪小鼠抗人 β2-微球蛋白 (β2M)，Biolegend, San Diego, CA，由 Perkin Elmer, Waltham, MA 定制標記) 及處於檢定稀釋液中的 40 nM 受體 (SureLight 別藻藍蛋白結合之鏈球親生物素蛋白 (SA-APC)，PerkinElmer, Waltham, MA) 分配至目標平板的各孔中。然後將目標平板離心並在室溫孵育一小時，使用配備有 HTRF 模塊 (Eu 供體激發：337 nm，Eu 供體發射：615 nm；APC 受體發射：660/20 nm，例如，665 nm) 之 PHERAstar FSX 讀板儀 (BMG Labtech, Cary, NC) 記錄 TR-FRET 訊號。TR-FRET 原始訊號表示為相對螢光單位之比率 (RFU 比率 = (RFU[665 nm]/RFU[615 nm] × 10 ⁴)。藉由自不存在 HLA/肽複合物下之測定混合物扣除背景訊號來計算偵測窗口。為了將結合物排序，施加雙重歸一化以獲得 % ΔF。ΔF(%) = {(RFU [樣品] – 平均 RFU [陰性])/平均 RFU[陰性]} * 100。穩健 Z 評分是以樣品平板為基準而計算的。為了篩選質量控制，將大規模製備的陽性對照 (具有 pp65 之 A*02:01) 及陰性對照 (僅 A*02:01) 添加到各樣品平板的設計孔中。篩選的接受度藉由從檢定對照計算的 Z 因子確定 (Z 因子 = 1-{(3SD [陽性] – 3SD [陰性])/(平均 [陽性] – 平均 [陰性]}。Z 因子＞ 0.4 的樣品平板符合資料處理要求。

基於與預測結合親和力 (使用結合預測演算法基於 Andreatta M 及 Nielsen, M. Gapped sequence alignment using artificial neural networks: application to the MHC class I system.Bioinformatics (2016) Feb 15;32(4):511-517 所計算) 的比較將肽確定為真實結合物。使用 TR-FRET 及 2D LC/MS 測定來鑑別肽結合物及對應 HLA 等位基因。將肽序列提交至預測演算法，且向每一序列指派百分等級。2 或更小之百分等級可視為結合物。

工程改造表現單等位基因及多抗原卡匣的 HMy2.CR1 細胞株

藉由 CRISPR/Cas9 媒介之 HMy2.C1R 細胞中內源性 HLA-C 基因座的基因破壞，生成有效的 HLA I 類剔除細胞群。野生型 HMy2.C1R 細胞用 gRNA (Synthego；HLA-C 特異性 sgRNA 序列：TTCATCGCAGTGGGCTACG (SEQ ID NO: 74) (參見圖 6A))/Cas9 (Invitrogen) RNP 使用 Amaxa V 系統 (程式 D-023) 進行電穿孔。在擴增期之後，用抗泛 HLA (W6/32) 抗體對細胞進行染色，並經由 FACS 來富集抗原陰性細胞 (參見圖 6B) 以生成 I 類剔除群體。

HLA-I 無效 HMy2.C1R 細胞使用 piggyBac 新抗原表現質體系統穩定地進行工程改造，該系統經設計為共表現 47 個共有的癌症新抗原及 7 個 HLA-A*02:01 對照抗原。簡而言，新抗原鏈段 (各約 25 個胺基酸) 經串接並轉化為經密碼子優化之 DNA 鏈段 (IDT)，具有或不具有分隔大多數新抗原序列的柔性連接子。多抗原卡匣經合成並選殖至組成型人類 EF1a 下游的 piggyBac 轉座子質體中，並與 IRES-TagBFP2 報告元件轉錄地連接。一單獨的 hPGK 啟動子驅動之嘌呤黴素抗性基因經包括在同一載體上用於選擇目的。為了生成穩定地表現 47 個所關注之新抗原的細胞株，使用 NEON (Invitrogen) 電穿孔裝置對 I 類剔除 HMy2.C1R 細胞進行電穿孔。執行 Piggybac 質體 (新抗原匣) 之共同遞送，該質體含有具有或不具有連接子的 47 聚體。藉由在 1 μg/mL 嘌呤黴素 (Gibco) 中培養來富集含有新抗原匣的細胞，並藉由 tagBFP 陽性細胞的 FACS 富集進行進一步純化。將兩百萬個 C1R I 類 KO 細胞重新懸浮在 120 緩衝液 R 中。添加 3.0 µg piggybac 表現構建體及 0.5 µg 的 piggbac 轉座酶，並使用 100 µl Neon 套組進行電穿孔 (緩衝液 R，1230 V，20 ms，3 個脈衝)。藉由在 1 µg/ml 嘌呤黴素 (Gibco) 中培養來選擇表現多抗原的細胞，並藉由 TagBFP2 陽性群體的 FACS 富集進行進一步純化。電穿孔後，立即將細胞添加至 6 孔平板中的 5 ml 無抗生素培養基中。電穿孔後 7 天，添加 1 µg/ml 嘌呤黴素。在嘌呤黴素中 3 天后，分析細胞，然後分選 BFP 陽性細胞。

表現 HLA 的慢病毒係藉由使用 lipofectamine 2000 (Invitrogen) 將 Ef1a-HLA 表現構建體連同 δ8.9 及 VSVG 包裝質體一起 (脂質:DNA= 2:1) 共轉染到 293 細胞中而生成。轉染後 72 小時收集病毒上清液並透過 0.45 µM 過濾器過濾，並遵循製造商推薦的方案經由 LentiX 濃縮器試劑 (Takara) 進行濃縮。

為了生成表現新抗原的單等位基因細胞株，經由自旋感染來轉導表現連接子或無連接子 47 聚體的 I 類剔除 HMy2.C1R 細胞。經由基於磁珠的富集 (SA-MACS) 來純化表現 HLA 的細胞 (生物素-W6/32)。經由條形碼定序來確認 HLA 等位基因鑑定，並經由流式細胞分析術來確認 HLA 等位基因及新抗原匣的均勻表現，然後經由質譜進行分析。詳而言，獨特的 HLA-I 等位基因 ORF (各自帶有不同的 19 bp DNA 條形碼) 經選殖至經定制修飾的 pLenti6.3 主鏈 (ThermoFisher) 中之人類 EF1a 啟動子 (Genscript) 的下游。慢病毒係藉由 lipofectamine 2000 (Invitrogen) 媒介之 HEK293T 細胞與個別慢病毒 HLA 表現構建體及包裝質體的共轉染生成的。轉染後 72 小時收集病毒上清液，透過 0.45 µM 過濾器過濾，並遵循製造商推薦的方案經由 LentiX 濃縮器試劑 (Takara) 進行濃縮。使用 HLA 表現載體經由自旋感染 (使用 8 µg/ml 聚凝胺，室溫，800 x g，30 分鐘) 來轉導表現連接子或無連接子多抗原的 HLA-I 無效 HMy2.C1R 細胞。然後經由基於磁珠的富集 (生物素-W6/32 Biolegend /SA-MACS) 來純化轉基因之表現 HLA 的細胞。HLA 等位基因鑑定係經由條形碼定序 (擴增子引子：Fwd-CTCCCAGAGCCACCGTTACAC (SEQ ID NO: 192)、Rev-GACTTAACGCGTCCTGGTTGC (SEQ ID NO: 193)；定序引子：CTGGTTGCAGGCGTTTAGCGT；SEQ ID NO: 194) 來確認，並且 HLA 等位基因及多抗原卡匣兩者之均勻表現係在質譜分析之前經由流式細胞分析術 ( 圖 6B、 6F及 6G) 進行確認。

除了 HMy2.C1R 細胞之外，使用 K562 細胞的實驗亦偵測到類似的結果。

抗體偶合及交聯

泛 HLA I 類特異性抗體 (殖株 W6/32) 與包裝在 AssayMAP Bravo 兼容之大容量筒 (PA-W 25 µL) (Agilent，零件編號 G5496-60018) 中的蛋白 A 樹脂偶合。然後在偶聯步驟結束後，立即使經偶合之抗體與 20 mM 庚二亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽 (DMP) (Sigma-Aldrich，目錄號D8388-25O MG) 在 100 mM 硼酸鈉交聯緩衝液中在 pH 9.0 交聯。在同時分配 200 mM 乙醇胺 (Sigma-Aldrich，目錄號E9508-100ML) pH 8.0 及去離子 H ₂O 的情形下，將該筒中之雜質洗除。AssayMAP Bravo 軟體 (VWorks) 中之親和純化應用程序的流速及其他參數在預設設置下使用。抗體交聯蛋白 A 筒儲存在填充有 TBS/0.025% 疊氮化鈉的架子中，用石蠟膜密封，並保持在 4℃。

HLA- 肽複合物的親和純化

經工程改造之單等位基因細胞沉澱物 (5 億個細胞/樣品) 在 4℃ 在 1% CHAPS (Roche Diagnostics，目錄號 10810126001) 溶胞緩衝液 pH 8.0 (含有 20 mM TRIS、150 mM NaCl、一錠完全蛋白酶抑制劑錠劑 (羅氏，目錄號4693159001) 每 10 mL 溶胞緩衝液) 及 0.2 mM 苯甲基磺醯氟 (PMSF) (Sigma) 中溶胞。藉由在 4℃ 每 5 分鐘渦旋一次，持續 20 分鐘，用 2 mL 溶胞緩衝液溶解細胞沉澱物。然後將溶胞產物轉移到 LoBind 管中並在 4℃ 以 20,000 g 離心 20 分鐘。然後將上清液小心地轉移到 0.45 µm 聚醚砜過濾器 (Pall，目錄號MCPM45C68)。然後將樣品在 4℃ 以 7000 g 離心 30 分鐘。將各樣品之濾液小心地轉移到與 AssayMAP Bravo 相容之 96 孔深孔平板中，確保不會干擾可能沉澱在錐形管底部的任何顆粒。將含有 HLA-肽複合物的深孔平板轉移到 AssayMAP Bravo 樣品加載平台，以便透過 W6/32 交聯蛋白 A 筒自動分配樣品。用 20 mM Tris pH 8.0 及 150 mM NaCl 水溶液對筒進行灌注及平衡。用 20 mM Tris pH 8.0 及 400 mM NaCl 水溶液之自動分配將筒內的樣品雜質洗除，之後用 20 mM Tris pH 8.0 的水溶液清洗。經抗體結合之 HLA-肽複合物用 0.1% 三氟乙酸 (TFA) 中的 0.1 M 乙酸溶析。流速及洗滌週期在預設設置下使用。

將溶析液轉移至超低吸附 ProteoSave自動進樣器小瓶 (AMR Incorporated 目錄號PSVial100) 並在高速真空中乾燥。然後將經乾燥之樣品在 100 µL 20 mM HEPES pH 8.0 中重建，用 5 mM 二硫蘇糖醇 (DTT) (Thermofisher，目錄號A39255) 在黑暗中在 65℃ 還原 30 分鐘，然後用 15 mM 碘乙醯胺 (IAA) (Sigma，目錄號I1149-5G) 在黑暗中在室溫烷基化 30 分鐘。然後用 50% TFA 酸化樣品以降低其等之 pH 值 ~ 3.0，渦旋並在室溫以 14,000 g 離心 5 分鐘以沉澱任何碎片。然後將樣品小心地轉移到 96 孔 PCR、Full Skirt、PolyPro 平板 (Eppendorf，部件號 30129300) 並加載到 AssayMAP Bravo 平台上進行最終淨化，然後再注入質譜儀。每個樣品使用四個 C18 筒 (Agilent，部件號 5190-6532)。使用 80% 乙腈 (ACN) 0.1% TFA 對筒進行灌注，並使用 0.1% TFA 進行平衡。然後透過該等筒加載樣品，用 0.1% TFA 洗滌，並用 30% ACN 0.1% TFA 溶析。在高速真空中乾燥樣品後，將樣品在 6 µL 0.1% 甲酸 (FA) 及 0.05% 七氟丁酸 (HFBA) (Thermo Fisher Scientific，目錄號25003) 中重建。

非靶向質譜及資料庫搜尋

將各樣品的三分之一以 400 nL/min 的流速加載到 Thermo UltiMate 3000 高效液相色譜 (HPLC) 系統 (Thermo Fisher Scientific) 上的 25 cm x 75 µm ID，1.6 µm C18 IonOpticks Aurora 系列管柱 (IonOpticks, Part Number AUR2-25075C18A) 內。使用 2% 至 35% 或 40% 緩衝液 B (98% ACN、2% H2O 及 0.1% FA) 的 90 分鐘梯度以 300 nL/min 的流速分離肽。以相同流速將梯度進一步提高到 75% 緩衝液 B 持續 5 分鐘及 90% 緩衝液 B 持續 4 分鐘，然後用 98% 緩衝液 A (98% H2O、2% ACN 及 0.1% FA) 及 2% 緩衝液 B 以 400 nL/min 的流速最終平衡 10 分鐘。

肽質譜係使用 Orbitrap Fusion Lumos 或 Orbitrap Eclipse Tribrid 質譜儀 (Thermo Fisher Scientific) 獲取，其中 MS ¹Orbitrap 解析度為 240000，且前驅物離子藉由碰撞誘導解離 (CID) 進行 MS/MS 碎裂，之後以 15000 的 MS ²Orbitrap 解析度進行光譜採集。在 PEAKSOnline (Bioinformatics Solutions Inc.) 中針對 Uniprot 來源的智人人類蛋白質體 (2019 年 10 月 3 日下載) 檢索全部資料依賴性採集 (DDA) 光譜原始文件，該蛋白質組含有 47 個最常見突變的附加串接序列，該等突變之側翼為位於各突變之任一端的 13 聚體序列，具有或不具有甘胺酸及絲胺酸殘基 (GS) 連接子的延伸連同藍色螢光蛋白 (BFP) 之序列。在 PEAKSOnline 內，由於 HLA 肽為非胰蛋白酶的，因此酶特異性設置為無，選擇 CID 作為活化方法，並選擇 Orbitrap (Orbi-Orbi) 作為儀器參數。執行深度從頭輔助資料庫檢索及量化，其中前驅物質量誤差容限為 15 百萬分點 (ppm)，片段質量誤差容限為 0.02 Da，且錯過切割容限為 3。脲基甲基化 (Cys+57.02) 設置為固定修飾，而去醯胺 (Asn+0.98、Gln+0.98) 及氧化 (Met+15.99) 設置為可變轉譯後修飾 (PTM)，每個肽最多允許 3 個可變 PTM。其他報告過濾器包括 1% 的肽譜匹配 (PSM) 錯誤發現率 (FDR)、蛋白質 -10LgP ≥ 20 及 50% 的僅從頭胺基酸殘基平均局部信賴度 (ALC)。對於無標記分析，為各樣品創建了一個新群組，並使用預設參數執行運行之間的匹配，但滯留時間 (RT) 偏移容限設置為 4 分鐘，且基礎樣品經選擇為「平均」。將輸出 csv 文件導出並在 R 中進一步分析。

靶向質譜

將具有 TR-FRET RZ 評分 ≥ 5 (亦即 RobustzScore ≥ 5) 或預測的 NetMHC %Rank ≤ 2 (對於突變子集) 的全部 47 個突變來源的新抗原之絕對量化 (AQUA) 合成重肽 (8 至 11 聚體) (Elim Biopharm) 在 30% ACN 0.1% FA 中重建。對於不易溶於 30% ACN 0.1% FA 的肽，添加二甲基亞砜 (DMSO)。為各 AQUA 肽製備 25 µM 的工作溶液，自其製備 25 pmol/肽的等位基因特異性預混液。在 AssayMAP Bravo 上使用 C18 筒對肽進行還原/烷基化及淨化。乾燥後，將肽在 0.1% FA 0.05% HFBA 中以 100 fmol/肽重建。對於各等位基因特異性檢定，使用 TomahaqCompanion 軟體 (Rose 等人， J Proteome Res.2019; 18(2):594-605) 計算該檢定中各肽的完整修飾質量，然後將其用於為搜索運行構建包涵列表質譜方法以獲得各標靶肽的 RT 及質荷比 (m/z)。將 1 µL 的各檢定物注入 IonOpticks C18 管柱並噴入質譜儀，如上所述運行 125 分鐘，然後導入原始文件並在 Skyline (64 位元，19.1.0.193) 中分析以為各肽選擇合適的電荷。為各檢定建立一個質量列表之表，其中在 RT 兩側為各標靶肽創建 4 分鐘 RT 窗口，然後將其導入 Xcalibur 儀器方法應用程式並保存為等位基因特異性平行反應監測 (PRM) 方法。對於 Fusion Lumos 及 Eclipse 儀器兩者，以 240000 的Orbitrap 解析度及 50 ms 的最大進樣時間獲取 MS ¹，然後是 1.2 m/z 的四極桿分離窗口，母離子的 CID 碎裂，最大進樣時間為 300 ms，且以 60000 的 Orbitrap 解析度採集 MS ²。對於 Eclipse 採集，MS ¹及 MS ²AGC 標靶分別設置為 250% 及 400%。向各單等位基因樣品的三分之一加標 100 fmol 的對應 AQUA 預混液，並使用與上述相同的 HPLC 裝置注入質譜儀。在 Skyline 中以等位基因特異性方式導入並分析原始 PRM 資料。將樣品中輕肽與其等之重對應體的比率導出為 csv 文件，並在 R 中進一步分析。對於各新抗原決定位，在計算最終阿托莫耳量之前，從內源性肽訊號中減去僅合成肽分析中偵測到的背景訊號。

對於 dox 誘導型 C1R A*11:01 KRAS 全長 (FL) 細胞株及 C1R A*11:01 47-neo 樣品重組重同位素編碼肽 MHC (hipMHC) 中的 KRAS 野生型 (WT) 及 G12C/D/V 突變體複本數呈現量化 (Stopfer 等人，Multiplexed relative and absolute quantitative immunopeptidomics reveals MHC I repertoire alterations induced by CDK4/6 inhibition. Nat Commun.2020; 11(1):2760)，針對 A*11:01 等位基因及 KRAS WT/G12C/D/V (每個標靶 9 及 10 聚體) 進行單體之內部製備。在泛 HLA I 類親和純化步驟之前，此等單體以 1 pmol 每 5 億細胞裂解物 (KRAS FL 樣品) 或 4.7 pmol 每 5 億細胞裂解物 (47-neo 樣品) 的濃度加標。與共有的新抗原樣品類似，我們為 A*11:01 KRAS FL 樣品研發了一種包涵方法及 125 分鐘 PRM 方法，其中 hipMHC 偵測混合物中只有 8 個 AQUA 肽。原始資料用額外的步驟如上所述進行分析，其中考慮了管柱上 AQUA 肽濃度及輸入細胞計數以計算每個細胞的抗原複本數。

對於 dox 誘導型 C1R A*11:01 KRAS FL 細胞株中總 KRAS WT 及 G12C/D/V 蛋白的絕對量化，將每個樣品 2000 萬個細胞在 1 mL 8M 尿素溶胞緩衝液 20 mM HEPES pH 8.0 中溶胞。向酵母消化液 (25 µg) 及來自各樣品中的 50 µg 用 2.5 pmol KRAS 量化多聯體 (QconCAT) 多肽 (Polyquant) 加標，該多肽由重 WT 及選擇的突變型 RAS 胰蛋白酶蛋白型肽串接生成。將樣品在黑暗中於 56℃ 用 5 mM DTT 在搖晃下還原 10 分鐘，並在黑暗中在室溫用 15 mM IAA 烷基化 15 分鐘。用 20 mM HEPES pH 8.0 將對照及样品管中的尿素濃度降至約 2M，並在 37℃ 的章動器 (nutator) 中用 1 µg 定序級胰蛋白酶 (Promega) 消化越夜。第二天，用 50% TFA 淬滅胰蛋白酶，樣品在 C18 筒上淨化，乾燥，並在 0.1% FA 中以 100 fmol/µL (酵母消化對照) 或 50 fmol/µL (樣品) 重建。經消化之樣品在 Fusion Lumos 質譜儀上用特定於 QconCAT 多肽上存在之 RAS 胰蛋白酶肽的 65 分鐘 PRM 方法進行分析。在 skyline 上分析資料，並且計算標靶 KRAS 肽中之各者的絕對量化。

TCR 發現

合成了 376 個經預測及經質譜鑑別之新抗原來源肽 (GenScript)，其各自經添加至 11 個肽庫中的 6 個，使得各新抗原決定位 (或類似的新抗原決定位之群組) 佔據 6 個庫的獨特組合 (Klinger 等人 2015 PLoS One.10(10):e0141561)。從健康的人類供體白血球單採樣品 (leukopak) 中分離出 CD8+ T 細胞 (StemCell)，並在抗 CD3 塗覆平板 (+ 抗 CD28/IL-2，BioLegend) 上或在匹配的供體來源之單核細胞來源的樹突狀細胞存在下擴增 (Wölfl 與 Greenberg. 2014 Nat Protoc.9(4):950-966) 及全部 376 個新抗原決定位之庫。在第 10 至 15 天，回收 T 細胞，以 11 個新抗原決定位庫中之 1 者補充，孵育 8 至 14 小時，富集 (Miltenyi)，然後使用抗 CD137 抗體 (BioLegend) 進行分選。然後對經分選之細胞進行 immunoSEQ 或 pairSEQ (Adaptive Biotechnologies) 以分別鑑定展示新抗原決定位特異性反應性的 TCRβ 序列並將 TCRβ 與 TCRα 序列平行關聯。TCR 序列在 pcDNA 載體中作為單個開讀框而經編碼，其形式為完整的 TCRβ 序列，後隨 RAKR 模體及豬 teschovirus 2a 切割肽，其中完整的 TCRA 序列後隨在框內。然後使用編碼 TCR 的 pcDNA 載體作為模板來生成編碼 TCR 的活體外轉錄 RNA (ivtRNA；mMessage mMachine，ThermoFisher)，用於原代人 T 細胞的電穿孔。

TCR 反應性檢定

使用 EasySep 人類 CD8+ T 細胞分離套組 (Stemcell) 從人類 PBMC 中富集 CD8+ 細胞，並用 5 µg/mL Ultra-LEAF 抗人類 CD3 (Biolegend) 及 2.5 µg/mL Ultra-LEAF 抗人類 CD28 (Biolegend) 進行刺激。細胞在 20 ng/mL 重組人類 IL-2 存在下培養 6 天。使用 Lonza 4D-Nucleofector、P3 原代細胞 4D-nucleofector 套組、程式 EO-115 (Lonza) 用 FLT3-p.D835Y 特異性或 PIK3CA-p.E545K 特異性 TCR RNA 轉染人類經擴增之 CD8+ T 細胞。RNA 購自 Trilink 或經活體外轉錄。將 FLT3-p.D835Y 特異性 TCR 與用 YIMSDSNYV (SEQ ID NO: 116) 脈衝的表現 HLA-A*02:01 的 T2 細胞或用編碼突變體或野生型序列之構建體轉染的表現 HLA-A*02:01 的 K562 細胞共培養越夜。使用 Lonza 4D-Nucleofector、SF 細胞株 4D-nucleofector 套組、程式 FF-120 (Lonza) 轉染 K562 細胞。為了確定特異性細胞溶解，將經轉染之 HLA-A*02:01+ K562 細胞及未經轉染之 cellTrace FarRed (Thermofisher) 標記的 HLA-A*02:01+ K562 細胞與 T 細胞以 2:1 E:T 比率供培養越夜。% 特異性細胞溶解 = (P _{經模擬轉染的} _T _細胞– P _經 _TCR _轉染的 _T _細胞)/(P _{經模擬轉染的} _T _細胞)) x 100，其中 P 為經轉染之 K562 靶標相對於未經轉染之 K562 細胞的比例，如藉由流式細胞分析術所測量。在與抗 CD137 PE 抗體 (BD Biosciences) 共培養越夜後，評估 CD8+ T 細胞上的 CD137 表現。TNF 及 IFNg 含量用流式細胞微珠陣列 (BD Biosciences) 確定。

將 PIK3CA-p.E545K 特異性 TCR 與用 STRDPLSEITK (SEQ ID NO: 169) 脈衝的或用編碼突變體或野生型序列之構建體轉染的表現 HLA-A*11:01 的 K562 細胞共培養越夜。將 cellTrace Far Red 標記的 HLA-A*11:01+ K562 細胞的等量混合物添加至各孔。如上所述評估 T 細胞對呈現 PIK3CA 的 K562 細胞的反應。

結果及論述

共有癌症新抗原的臨床基因體學分析

圖 1A中突出顯示的示意圖提供為在本研究中發現新抗原決定位而研發的工作流程的高層面概述。該過程之第一步是對全部已知新抗原執行臨床基因體學分析，以鑑定具有作為臨床靶標之高價值的新抗原。在該示例性分析中，跨來自腫瘤之大型彙編的癌症類型及正常定序資料來鑑別最常見的復現點突變 (參見，例如，Chang 等人，Accelerating Discovery of Functional Mutant Alleles in Cancer. Cancer Discov.2018; 8(2):174-183)，以 2% 的按適應症病例盛行率進行過濾。由於基因融合物之斷點及所得編碼序列的高度多樣性而將基因融合排除在外，得到 37 個共有的癌症新抗原之的列表 ( 表 3)。獨立地，跨人群鑑別出最常見的 HLA-I 等位基因，以 10% 的載劑頻率進行過濾。亦經證實，此等等位基因在來自癌症基因組圖譜 (TCGA) 的患者中以相同的頻率存在。該額外的過濾導致了 15 個 HLA 等位基因的列表。分析了 TCGA 資料中此等共有的癌症新抗原與 HLA-I 等位基因的共盛行率，以確保防止復現突變基因及常見 HLA-I 變異體的偏向共表現。發現，各共有的新抗原的共盛行率與作為個別新抗原與 HLA-I 等位基因盛行率的乘積而計算的預期值相匹配。此等 37 個新抗原及 15 個 HLA 等位基因共同為當前平台的研發奠定了基礎。

表 3示例性共有的新抗原 47 個癌症新抗原之列表：

KRAS G12C	KRAS G12R	TP53 R273H
KRAS G12D	PIK3CA E545K	TP53 R273L
KRAS G12V	PIK3CA H1047L	TP53 R282W
KRAS G13D	PIK3CA H1047R	CALR fs
KRAS G12A	ERBB2 S310F	ESR1 K303R
KRAS G12S	BRAF V600E	FLT3 D835Y
KRAS G13C	BRAF V600M	GNA11/GNAQ Q209L
JAK2 V617F	DNMT3A R882H	GNA11/GNAQ Q209P
NRAS Q61K	FGFR3 S249C	IDH1 R132C
NRAS Q61R	PIK3CA E542K	IDH1 R132G
EGFR E746_A750de	MYD88 L265P	IDH1 R132H
EGFR G719A	PTEN R130G	IDH2 R140Q
EGFR L858R	PTEN R130Q	SF3B1 R625C
EGFR T790M	TP53 R175H	SF3B1 R625H
EGFR C797S	TP53 R248Q	HRAS Q61R
EGFR T790M_C797S	TP53 R273C

過濾後的 37 個共有的癌症新抗原之列表：

肽	類型	映射	抗原	連接子
ELAGIGILTV (SEQ ID NO: 75)	對照	MART-1	對照
NLVPMVATV (SEQ ID NO: 76)	對照	pp65	對照
ATVQGQNLK (SEQ ID NO: 77)	對照	pp65	對照
ELAGIGILT (SEQ ID NO: 78)	對照	MART-1	對照
VLEETSVML (SEQ ID NO: 79)	對照	IE-1	對照
FLYGSKTFI (SEQ ID NO: 80)	標籤	BFP	對照
GTVDNHHFK (SEQ ID NO: 81)	標籤	BFP	對照
TSNGPVMQK (SEQ ID NO: 82)	標籤	BFP	對照
IYNVKIRGVNF (SEQ ID NO: 83)	標籤	BFP	對照
VKIRGVNF (SEQ ID NO: 84)	標籤	BFP	對照
KPYEGTQTM (SEQ ID NO: 85)	標籤	BFP	對照
GPVMQKKTL (SEQ ID NO: 86)	標籤	BFP	對照
YRLERIKEA (SEQ ID NO: 87)	標籤	BFP	對照
ATSFLYGSK (SEQ ID NO: 88)	標籤	BFP	對照
GSHLIANAK (SEQ ID NO: 89)	標籤	BFP	對照
KPYEGTQT (SEQ ID NO: 90)	標籤	BFP	對照
GTVDNHHF (SEQ ID NO: 91)	標籤	BFP	對照
MEGTVDNHHF (SEQ ID NO: 92)	標籤	BFP	對照
KMDWIFHTA (SEQ ID NO: 93)	結	PIK3CA H1047L – ERBB2 S310F	結	否
ATDFVKLKK (SEQ ID NO: 94)	結	IDH1 R132G – IDH2 R140Q	結	否
RATDFVKLK (SEQ ID NO: 95)	結	IDH1 R132G – IDH2 R140Q	結	否
SYVKVLHSI (SEQ ID NO: 96)	結	MAGE A3 – NYESO 1	結	否
SPARPGKVV (SEQ ID NO: 97)	結	CALR fs – FLT3 D835Y	結	否
DQYMRTIL (SEQ ID NO: 98)	結	NRAS/HRAS Q61R – EGFR G719A	結	否
VTDLTVKI (SEQ ID NO: 99)	結	ERBB2 S10F – BRAF V600m	結	否
RATDFVRLV (SEQ ID NO: 100)	結	IDH1 R132G – IDH2 R140Q	結	否
LTIQLIQEQLK (SEQ ID NO: 101)	結	KRAS G12S – PIK3CA E542K	結	否
LTIQLIQNK (SEQ ID NO: 102)	結	KRAS G13C – PIK3CA E545K	結	否
AMTEYKLVVV (SEQ ID NO: 103)	結	SF3B1 R625C – KRAS G12C	結	否
LLHRGNYMC (SEQ ID NO: 104)	結	PTEN R130Q – TP53 R248Q	結	否
PARPGKVV (SEQ ID NO: 105)	結	CALR fs – FLT3 D835Y	結	否
YLLHRGNYM (SEQ ID NO: 106)	結	PTEN R130Q – TP53 248Q	結	否
YVKVLHSI (SEQ ID NO: 107)	結	Mart1 – MAGE A3	結	否
YVVRGNAL (SEQ ID NO: 108)	結	FLT3 D835Y – GNAQ Q209L	結	否
SGSGSLSHK (SEQ ID NO: 109)	結	連接子 – JAK2 V617F	結	是
GSGGEALEY (SEQ ID NO: 110)	結	連接子 – PIK3CA H1047R	結	是
FPNHVAAIH (SEQ ID NO: 111)	結	MYD88 L265P – PTEN R130Q	結	否

新抗原決定位交換和新抗原決定位 -HLA 穩定性的高通量 TR-FRET 分析

T 細胞媒介之新抗原特異性療法需要新抗原決定位與 HLA 分子形成穩定的複合物，該複合物可以經呈現在腫瘤細胞表面上。計算演算法可以預測新抗原決定位是否將結合至特定 HLA，但實驗證據增加了對潛在新抗原決定位沒有因預測模型之不合適而被錯過的信賴度 (例如，對特定等位基因的訓練不足或對特定胺基酸殘基有偏倚)。新抗原決定位-HLA 發現過程的下一步是對源自 48 個新抗原之優先列表的全部新抗原決定位的 15 個最普遍的 HLA 等位基因應用高通量 (HTP) 新抗原決定位結合篩選，該篩選產生總計 27,360 種需要篩選的新抗原決定位-HLA 組合。出於此等目的，研發了一種定制高通量 (HTP) TR-FRET 結合檢定以採用條件 HLA 複合物。該檢定之示意圖顯示於圖 1B中。在示例性實驗中，對藉由上述臨床基因體學分析 ( 表 3) 鑑別的 37 個盛行之共有的癌症新抗原以及 11 個額外抗原的子集進行針對結合的測試。關於 HLA 等位基因覆蓋率，在電腦模擬篩選中鑑別的 15 個 HLA 等位基因中，只有 15 個可用於 TR-FRET 檢定所需的適當條件 HLA 複合物格式 ( 圖 1B) 。因此，最終 TR-FRET 檢定用於探測來自 47 個共有的癌症新抗原的新抗原決定位跨 15 個最盛行之 HLA 等位基因的穩定結合 ( 表 4)，從而對 24,149 個新抗原決定位-HLA 複合物進行表征。

表 4示例性的 15 個 HLA 等位基因

A*01:01	B*07:02	C*03:04
A*02:01	B*08:01	C*04:01
A*03:01	B*35:01	C*05:01
A*11:01	B*51:01	C*06:02
A*24:02		C*07:01
		C*07:02

TR-FRET 檢定利用先前所述之條件 HLA 配體 (亦即含有 UV 可切割非天然胺基酸的肽) 為 15 個 HLA 等位基因創建條件 HLA 複合物 (HLA α 鏈及 β-2-微球蛋白 [B2M]) (Darwish 等人，2021)。在 TR-FRET 檢定中，將條件 HLA 複合物與所關注之新抗原決定位以 100 倍莫耳過量孵育並曝露於 UV 光 25 分鐘，預計將切割該條件配體並將肽從穩定的高親和力「結合物」轉化為從該 HLA 叢 (grove) 解離的不穩定結合物。在結合新抗原決定位存在下，發生肽交換並穩定化 HLA 複合物 (亦即，條件配體、HLA α 鏈及 β-2-微球蛋白 [B2M]；圖 1B，上圖)。在非結合新抗原決定位存在下，不發生肽交換，並且 HLA 複合物解離 ( 圖 1B，下圖)。使用簡單的 TR-FRET 檢定來監測此等兩種不同的結果，其中 TR-FRET 供體 (銪) 與抗 B2M 抗體結合，且 TR-FRET 受體與鏈球親生物素蛋白結合，鏈球親生物素蛋白結合至經生物素化之 HLA α 鏈。在此等檢定中，僅當 HLA 複合物由於結合新抗原決定位存在而保持完整時才會出現 TR-FRET 訊號。在分析之前，亦將樣品在 37℃ 加熱 24 小時，以確保所鑑別之結合物在生理溫度形成穩定的複合物。TR-FRET 訊號係基於相對螢光單位的比率進行量化，並對訊號進行雙重歸一化以生成穩健 Z 評分 (RZ 評分)，用於新抗原決定位比較及排序，如本文材料與方法部分所述。在目前的分析中，任何具有 RZ 評分 ≥ 5 的新抗原決定位-HLA 組合皆認為是「穩定結合物」，而該截止值導致鑑定出 587 個獨特的新抗原決定位-HLA 對。該截止導致鑑定出表 5中所示的獨特新抗原決定位-HLA 對。為了將 TR-FRET 檢定之結果與計算預測方法進行比較，使用 NetMHCpan 4.0 (又名 NetMHC) 來預測藉由 TR-FRET 檢定的 24,149 個新抗原決定位-HLA 對的新抗原決定位呈現。對於該分析，「經溶析之配體」百分等級 (%Rank) 值用於確定新抗原決定位是否為「結合物」(例如，%Rank ≤ 2)，從而鑑定出 408 個獨特的經預測之新抗原決定位-HLA 對。

表 5靶向檢定含有經證明為活體外結合的肽及經預測為結合的肽之混合物

等位基因	# 結合物 ( 穩健 Z 評分＞= 5)	# 所靶向之肽
A*01:01	76	88
A*02:01	45	52
A*03:01	61	82
A*11:01	42	57
A*24:02	40	47
B*07:02	57	70
B*08:01	55	79
B*35:01	40	46
B*51:01	19	21
C*07:01	13	36
C*07:02	9	28
C*04:01	28	38
C*06:02	34	54
C*05:01	34	53
C*03:04	34	49
	SUM = 587	SUM = 800

TR-FRET 穩健 Z 評分及反向百分等級評分的比較顯示在圖 2A及 2E中。具有大於 5 之值的穩健 Z 評分被認為是結合物 (黑色虛線上方)，且如圖 2A中所示，NetMHC 4 結合預測 (虛線上方) 與 TR-FRET 分析之間存在強相關性，其中兩者皆將相同的兩個 KRAS G12R 新抗原決定位鑑別為與 B*07:02 的穩定結合物 ( 圖 2E)。並未始終觀察到跨全部新抗原-等位基因組合的該相關性。因為 TR-FRET 通常鑑別出更穩定的新抗原決定位-HLA 對，因此有幾種情況下 NetMHC 無法預測藉由 TR-FRET 鑑別的相同結合事件。例如，在跨 B*07:02 等位基因的 ESR K303R 新抗原決定位之比較分析中，TR-FRET 檢定鑑別了 9 個穩定結合新抗原決定位，而 NetMHC 4.0 僅預測了這些結合物中的 2 個 ( 圖 2B及 2F)。當使用上述標準 (穩健 Z 評分＞5 及百分位等級＜ 2) 來區分結合物與非結合物新抗原決定位時，藉由 TR-FRET 及 NetMHCpan 4.0 鑑別的 % 結合物分別為所測試之全部新抗原決定位-HLA 組合的 2.45% 及 1.72%。圖 2C顯示 TR-FRET 及 NetMHC 4.0 分析兩者的跨不同等位基因的 % 結合物之分佈，且平均而言，相較於 TR-FRET 分析，NetMHC 4.0 得到較低的結合物百分比。圖 2D亦顯示，當測量為全部潛在新抗原決定位-HLA 複合物的百分比時，相較於 NetMHC，TR-FRET 通常鑑別出更多的穩定結合物，特別是對於 HLA-A 及 HLA-B 等位基因。

為了更好地理解 NetMHC 4.0 預測與 TR-FRET 測量之間的總體相關性，對兩種方法將結合物及非結合物分類的 % 一致性進行比較 ( 圖 3A)。跨全部等位基因，此等方法之間的 % 一致性非常強，範圍在 95.1% 至 98.6% 之間，取決於等位基因 ( 圖 3A)。為了進一步評估此等兩種方法之間的相關性，評定了藉由兩種方法分類為結合物的新抗原決定位之重疊。與當將全部新抗原決定位 (結合物 + 非結合物) 進行比較時不同，如果僅慮及結合物的鑑定，兩種方法之間的重疊顯著下降 ( 圖 3E)，且表現最佳的等位基因在兩種方法之間的一致性約為 40% 至 60%，並且一些等位基因低至 10% (參見，例如，圖 3D中的僅 2.04% 至 40% 的一致性)。相較於 HLA-C 等位基因，HLA-A 及 HLA-B 等位基因的一致性通常更高 ( 圖 3D)。然而，A*24:02 展現出最低的一致性，為 2.04% ( 圖 3E)。當僅慮及非接合物而執行相同的分析時，有非常強的一致性，範圍為 94.1% 至 98.4% ( 圖 3C)。此等結果表明，兩種方法在非結合事件中通常具有一致性，而發現陽性相互作用具有最小的重疊。這證實了將兩種方法組合來鑑定並優先考慮獨特的新抗原決定位-HLA 對以進行進一步表徵的能力。此等結果並不令人驚訝，因為絕大多數新抗原決定位經歸類為非結合物。

為了更好地可視化藉由 TR-FRET 及 NetMHC 鑑定結合物的互補性，為全部候選新抗原決定位-HLA 對繪製了 TR-FRET RZ 評分及 NetMHC %Rank ( 圖 10)。兩種方法皆發現大約 0.63% 的候選新抗原決定位-HLA 對為結合物。當在等位基因層面查看資料時，全部潛在新抗原決定位-HLA 對的一致性從 0.06% 到 1.49% 不等 ( 圖 10及 11)。有趣的是，各方法鑑別出幾乎相同百分比的新抗原決定位-HLA 對的額外結合事件，NetMHC 為 1.06%，而 TR-FRET 為 1.81%，表明各方法皆具有鑑別獨特結合組合的潛力 ( 圖 10)。

為了更清楚地顯示藉由 TR-FRET 及 NetMHC 分析觀察到的差異結合物，生成熱圖以展示 TR-FRET 分析 ( 圖 4A) 及 NetMHC 分析 ( 圖 4B) 的各 HLA 等位基因與新抗原組合的結合物數量。測試 47 個候選新抗原 (亦即，不包括 GTF2I L424H 新抗原) 的類似實驗產生了類似的結果 ( 圖 4C及 4D)。基於該分析，不同分析之間存在明顯的重疊區域以及顯著差距。例如，TR-FRET 將 11 個表位鑑別為 EGFR C797S 及 A*01:01 的結合物，而 NetMHC 僅預測了 3 個結合表位 ( 圖 4C及 4D)。有趣的是，此等綜合結果表明，兩種檢定皆可以可靠地區分具有高相關性的非結合物，但當對結合物執行分析時，這種情況會顯著下降。此等發現亦進一步證明，當選擇新抗原決定位以包括在靶向質譜分析中以測量新抗原決定位呈現時，除了預測演算法之外，也藉由包括生化結合篩選而增加價值。此等發現強調了高通量生化檢定在鑑定一組潛在互補的新抗原決定位-HLA 對方面的能力，並建議同時使用這兩種方法可以導致更全面的新抗原決定位發現。

細胞工程改造 - 生成共表現 47 個共有的癌症新抗原的 HLA-I 單等位基因細胞株

儘管在活體外觀察到肽-HLA 穩定性，但經突變之蛋白質的表現及加工可能不會導致在細胞環境中新抗原決定位之呈現 (Jappe 等人，2018 Immunology154(3):407-417；Garstka 等人，2015 Proc Natl Acad Sci U S A. 112(5):1505-1510)。出於該原因，候選新抗原決定位的驗證通常需要標靶新抗原的基因表現，然後讀出與表面結合之 HLA 的締合。新抗原-HLA 的發現過程已經透過使用經工程改造之「HLA 單等位基因」細胞株而得以增強，儘管遲到細胞株在很大程度上依賴於內源性突變型蛋白表現或相對較少的突變型轉殖基因之表現，因此限制了通量 (Wang 等人，Direct Detection and Quantification of Neoantigens. Cancer Immunol Res.2019; 7(11):1748-1754；Bear 等人，2021 Nat Commun12(1):4365；Abelin 等人，Mass Spectrometry Profiling of HLA-Associated Peptidomes in Mono-allelic Cells Enables More Accurate Epitope Prediction. Immunity2017; 46(2):315-326)。

在經由高通量 TR-FRET 結合檢定來偵測肽-HLA 複合物之後，此等經鑑別之表位在細胞環境中得到驗證。在單個 HLA 無效細胞株內同時編碼全部 47 個候選新抗原將會顯著改良細胞株生成的通量以及隨後藉由靶向質譜對經 TR-FRET 鑑別之新抗原決定位-HLA 對的驗證。因為沒有細胞株表現全部 47 個新抗原，所以生成 piggybac 匣以含有串接的新抗原表現陣列 ( 圖 5A)。由於局部序列環境可能潛在地影響新抗原加工，因此在新抗原經串接 (無連接子) 或由富含 g/s 之連接子序列 (連接子) 分隔的情況下使用載體。已知在 C 末端由 A*02:01 呈現的數種病毒肽用作對照，以確認整個多肽序列得到有效地表現。

為了驗證表現新抗原策略，將一系列 Piggybac 新抗原表現構建體引入穩定地表現 A*02:01 等位基因的 K562 細胞株內 ( 圖 5A及 5B)。HLA IP+LC-MS 用於偵測預期病毒對照肽的呈現 ( 圖 5C)。雖然在新抗原層面觀察到連接子/無連接子匣之間的一些變異性，但沒有出現明顯的趨勢來指示哪種表現策略更好。此外，表現 23、24 或 47 個新抗原的細胞株之間的對照肽偵測沒有顯著差異。基於此等資料，選擇 47 聚體新抗原構建體在連接子及無連接子序列環境兩者中進行進一步實驗。

由於內源性 HLA 表現水平低，K562 細胞株歷來已經作為模型細胞株用於 HLA 抗原呈現研究。然而，雖然相對較低，但該株表現可偵測水平的 HLA-C*05:01 及 C*03:04。此外，HLA 表現可能因應於某些刺激而上調。初步研究表明，在 HLA-A*02:01「單等位基因」細胞株中存在推定的 HLA-C*05:01 肽，指示 K562 可能不是該測定的理想模型系統。

在另一示例性實驗中，選擇 HMy2.CIR 淋巴母細胞株 (又名 C1R) 作為模型系統，因為它是一種穩健、快速生長的細胞株，其內源性 HLA-A 或 B 蛋白幾乎沒有表現，但保持培養中懸浮細胞的易於處理及穩健表現 ( 圖 6B) (對於 HLA-C*04:01 等位基因，參見 Creary 等人，2019 Hum Immunol80(7):449-460)。使用 CRISPR/Cas9 剔除策略，從 HMy2.C1R 細胞中破壞剩餘的 HLA-C 等位基因 (HLA-C*04:01) ( 圖 6A)，生成 HLA-I 類剔除 (I 類 KO) HMy2 .C1R 群體 ( 圖 6B及 6C)。使用泛 HLA-I 抗體及螢光活化細胞分選 (FACS) 藉由細胞表面染色來富集所得 HLA 無效 (C1R ^HLAnull) 群體。文獻中優先表明 B*35:03 在 C1R 細胞株中的表現 (Schittenhelm 等人，A comprehensive analysis of constitutive naturally processed and presented HLA-C*04:01 (Cw4)-specific peptides. Tissue Antigens.2014; 83(3):174-9)。然而，在本研究中，在所得 C1R ^HLAnull細胞的免疫肽組學分析中沒有觀察到 B*35:03 模體的證據。為了生成所需的表現新抗原的單等位基因細胞株組，首先生成 I 類 KO 群體以穩定地表現連接子或無連接子 Piggybac 新抗原匣。17 種所關注之 HLA 變異體經慢病毒轉導至此等親代細胞內以生成 34 個總群體用於進一步分析 ( 圖 6D)。對於 17 種所關注之 HLA 變異體，每個等位基因的 8 至 11 聚體獨特肽的總結顯示在圖 7中。

在研發 C1R ^HLAnull細胞群後，piggyBac 表現載體的合成及遞送實現了穩定的轉殖基因整合。在示例性實驗中，生成如圖 6E所示之兩個基礎細胞株，各者以不同組態共表現去全部 47 個優先的新抗原，以測試局部序列環境是否具有影響抗原加工的潛力 (Gomez-Perosanz 等人，Identification of CD8 ⁺T cell epitopes through proteasome cleavage site predictions. BMC Bioinformatics. 2020; 21(增刊 17):484)。此等兩個細胞株的區別在於多抗原卡匣內的大多數新抗原鏈段之間存在 (「連接子」) 或不存在 (「無連接子」) 短胺基酸連接子序列；在下文中，此等細胞株分別稱為連接子及無連接子。使用單獨的 TagBFP2 (BFP) 標記來富集穩定的連接子及無連接子細胞群，以選擇轉殖基因陽性 C1R ^HLAnull細胞。然後透過表現連接子及非連接子新抗原的 C1R ^HLAnull細胞株的穩定慢病毒轉導，將 15 個 HLA 等位基因 ( 表 4) 作為單個轉殖基因引入，藉此產生 HLA-I 單等位基因細胞，產生 30 個總細胞群用於進一步分析。HLA 表現係藉由使用泛 HLA 抗體的細胞表面染色來確認 ( 圖 6F及 6G)。為了驗證此等多抗原卡匣的功能性，連接子及無連接子新抗原構建體含有一組對照抗原，其表位已知由 A*02:01 呈現。HLA 免疫肽組學證實，此等肽存在於經連接子及無連接子 HLA-A*02:01 工程改造之細胞中 ( 圖 6H)。

經工程改造之多抗原卡匣增強新抗原決定位呈現

上述方法的一個潛在問題是，源自含有 47 個經串接之新抗原的構建體的表位可能不反映源自全長突變型蛋白質的表位。由於最近描述了藉由靶向蛋白質體學檢定偵測到的 A*11:01 限制性 9 聚體及 10 聚體新抗原決定位，在 KRAS 環境中對此進行了進一步研究 (Bear 等人，2021 Nat Commun12(1):4365)。為此，研發了三種 C1R ^HLAnull細胞株來表現 HLA-A*11:01 以及去氧羥四環素 (dox) 誘導型全長、野生型、G12C、G12D 或 G12V 突變型 KRAS 蛋白。然後將來自此等細胞株的新抗原決定位呈現與來自表現多抗原卡匣之無連接子變異體的細胞株的呈現進行比較。

突變型蛋白質表現係藉由全細胞靶向蛋白質體檢定來確認，該檢定包含可以偵測總 KRAS 的肽以及測量個別 KRAS 突變體的三種獨特肽 ( 圖 12A)。該分析藉由證明當將 dox 添加到培養基中時偵測到的總 KRAS 增加來驗證 dox 誘導的 KRAS 等位基因的過度表現 ( 圖 12A)。注意，在含有多抗原卡匣的細胞株內，對於此等突變型肽，在穩態蛋白質層面上發現很少至沒有訊號。

然後使用靶向免疫肽組學檢定來量化先前鑑別的 9 聚體及 10 聚體 KRAS 表位在上述相同細胞株內的呈現水平 ( 圖 12B)。對於含有全長突變型蛋白質的細胞株，對於 G12V 表位以及 G12D 之 10 聚體表位皆觀察到對於新抗原決定位呈現的誘導 ( 圖 12B)。在對照及經 dox 處理的細胞株中偵測到 G12C 的 9 聚體表位之弱訊號。這可能是由於洩漏/基礎啟動子活性，因為在兩種條件下也在蛋白質層面上偵測到 G12C 的弱訊號 ( 圖 12A及 12B)。有趣的是，在表現多抗原卡匣的細胞株中偵測到全部 KRAS 突變體的 9 聚體及 10 聚體表位。此外，當相較於表現全長蛋白質的細胞時，經多抗原修飾之細胞株亦呈現更高的每個細胞之 KRAS 突變型表位絕對複本數 ( 圖 12B)。當與在蛋白質層面上未偵測到突變型 KRAS 肽組合時 ( 圖 12A)，此等結果表明多抗原卡匣的蛋白質產物可能不穩定並經有效地降解，使得表位呈現得以增強。先前已在使用經誘導之蛋白質降解來增加源自經降解之蛋白質的表位的呈現的系統中證明了該效應 (Moser 等人，2018 Front Immunol.8:1920；Jensen 等人 2018 Front Immunol.9:2697)。因此，含有多抗原卡匣的單等位基因細胞為從共有的癌症新抗原中發現新抗原決定位提供了更高通量及更靈敏的系統。

偵測經工程改造以呈現共有的新抗原的細胞株上的新抗原決定位呈現

在一個示例性實驗中，在生成表現具有或不具有連接子之多抗原卡匣的單等位基因細胞株之後，肽呈現係藉由 HLA 免疫沉澱後隨非靶向及靶向質譜 (MS) 分析來驗證。非靶向 MS 分析能夠無偏倚地鑑定來自整個免疫肽組的肽，包括源自我們的新抗原構建體的肽，但偵測敏感度有限。靶向分析能夠敏感地偵測每個細胞中以低複本呈現的肽，但僅限於在 TR-FRET 分析中被鑑別為結合物的肽以及藉由 NetMHC 預測為結合的選定肽。

非靶向 MS

非靶向 MS 資料跨全部樣品鑑別了 852 到 7342 個獨特的 8 至 11 聚體肽，其中在 HLA-A 等位基因中鑑別的肽數量最多，在 HLA-C 等位基因中鑑別的肽數量最少 ( 圖 7)。對於各等位基因序列，生成模體以證明所呈現的肽符合預期之模體，如從先前出版物中得出的。在非靶向分析中，從跨 4 個 HLA 等位基因的 15 個共有的新抗原中發現了 18 個新抗原決定位-HLA 對 ( 圖 8A)，代表 NetMHC 預測的約 3.455% 的新抗原決定位-HLA 對以及在 TR-FRET 檢定內鑑別的約 3.005% 的新抗原決定位-HLA 對。有趣的是，此等肽中之約 77.8% 展現出 NetMHC 呈現預測評分 ≤ 2，並且此等結合物中之 83.3% 具有經測量之穩健 Z 評分 ≥ 5 ( 圖 8B)。

除了新抗原來源的表位肽之外，非靶向分析亦能夠偵測到源自各新抗原 27 聚體區域之非突變部分的肽，以及連結連續 27 聚體的 49 聚體新抗原構建體之結 (junction) 區域。我們從非連接子及連接子構建體中發現了結肽。來自連接子構建體的肽數量較少可能是由於連接子包含 G 及 S 胺基酸之事實，而該等胺基酸通常不是錨定殘基。最後，亦鑑別了病毒對照肽以及起源於 BFP 的肽，指示新抗原構建體在所測試的細胞株中之各者中皆有所表現。

靶向 MS

雖然非靶向分析能夠鑑定數千種肽，但其面臨著肽的隨機取樣以進行鑑定以及要求在偵檢掃描中偵測完整肽種類的挑戰，這限制了對以低含量呈現之肽的偵測。相反，靶向 MS 分析將整個儀器工作週期用於分析少量肽 (例如約 100 個)，從而改良資料重現性並對以每個細胞低複本呈現之肽的偵測。由於合成經重胺基酸標記之標準肽的成本，靶向蛋白質體學的挑戰是測定合成何等肽以用於 MS 分析。在本文所述的單等位基因系統中，為我們的 48 種新抗原合成全部可能的 8 至 11 聚體肽需要合成約 1,800 種肽。為了限制用於分析的肽的數量，只合成了優先的肽，包括在上述 TR-FRET 分析中展現出穩健 Z 評分＞ 5 的肽。作為對照，從具有預測 NetMHC 呈現分數＜ 2% 但在 TR-FRET 檢定中未作為結合物而經發現的突變子集合成了額外的肽。總之，跨 17 個等位基因對肽進行分析，各個別檢定皆包含藉由靶向分析來分析的肽。

在靶向分析之後，鑑別了 81 個新抗原決定位-HLA 對。其中，除了一個表位 (BRAF 表位) 之外，其餘全部表位亦在非靶向分析中經鑑別。有趣的是，藉由靶向分析鑑別的新抗原決定位-HLA 對僅具有藉由 NetMHC 測得的增加之呈現評分以及在我們的 TR-FRET 分析中的略低之穩健 Z 評分 ( 圖 9)。執行靶向分析的一個優勢是計算肽之絕對含量的能力，表明表位呈現的中位水平從跨越約 50 amol 至 200 fmol。重要的是，絕對量化可以在免疫肽組分析 (即亦即，細胞培養、MHC-IP 及 MS 分析) 的獨立平行測定中進行比較，並且該等平行測定的比較證明了所呈現的肽之絕對量的普遍一致性。與對照肽分析一樣，沒有明確的趨勢將呈現水平與新抗原構建體中連接子的存在關聯起來。

藉由包涵包括同位素重胺基酸的合成肽，能夠在靶向蛋白質體學中進行絕對定量，然而，由於此類試劑的成本，從 48 種共有的新抗原合成全部可能的 HLA 肽是不切實際的。

在另一示例性實驗中，在生成攜帶具有或不具有連接子的 47 聚體共有的新抗原構建體的 15 個單等位基因細胞株之後，如上所述，肽呈現係藉由使用非靶向及靶向質譜 (MS) 兩者的質譜來驗證。非靶向 MS 分析能夠無偏倚地鑑定來自整個免疫肽組的肽，包括源自該等新抗原構建體的肽，但新抗原決定位偵測敏感度有限。靶向分析能夠敏感地偵測每個細胞中以低複本呈現的肽，但僅限於在 TR-FRET 分析中被鑑別為結合物的肽以及藉由 NetMHCpan-4.0 預測為結合的選定肽。

對於各單等位基因細胞株的非靶向 MS 分析，使用 PEAKS (Zhang 等人，PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Mol Cell Proteomics.2012; 11(4):M111.010587) 針對附加有連接子及無連接子多抗原卡匣構建體及 BFP 序列的人蛋白質體資料庫來檢索所得資料 ( 圖 13A)。根據該分析，在各單等位基因細胞株內鑑別了 218 至 6,663 個獨特的 8 至 11 聚體肽，其中在 HLA-A 等位基因中鑑別的肽數量最多，在 HLA-C 等位基因中鑑別的肽數量最少 ( 圖 13B)。此外，無論多抗原連接子狀態如何，各等位基因的 8 至 11 聚體肽之數量及一般序列特徵皆重疊，並證實所呈現的肽符合預期之模體 ( 圖 14 及 15A 至 15B)。

透過非靶向分析，從跨 5 個 HLA 等位基因的 15 個共有的新抗原中發現了 22 個新抗原決定位-HLA 對 (在圖 13C中由顏色方塊中之各者表示；大約 1% 的偽發現率 (FDR))，代表藉由 NetMHC 預測的約 5.4% 之新抗原決定位-HLA 對以及在 TR-FRET 檢定中鑑別的約 3.7% 之新抗原決定位-HLA 對 ( 圖 13C)。對於非靶向分析，強度測量結果不能直接轉換為絕對豐度，但相較於其他經偵測之新抗原決定位，來自 EGFR G719A (ASGAFGTVYK；SEQ ID NO: 113) 及 FGFR3 S249C (ERCPHRPIL；SEQ ID NO: 114) 的新抗原決定位表明更大的強度。對於此等 22 個新抗原決定位-HLA 對，TR-FRET 及 NetMHC 顯示出優異的一致性，因為兩種方法皆將 17 個鑑別為結合物 ( 圖 13D)。然而，亦分別有 1 個及 3 個新抗原決定位-HLA 對由 TR-FRET 及 NetMHC 獨特地鑑別為命中，表明各方法皆具有獨特地鑑別潛在新抗原決定位的能力 ( 圖 13D)。藉由非靶向 MS 鑑別的最終新抗原決定位-HLA 對係源自 TP53 R175H (HMTEVVRHC；SEQ ID NO: 128) 並在 A*02:01 上偵測到。該新抗原決定位-HLA 對的 RZ 評分為 3.9 且 NetMHC %Rank 為 3.98，且未被任一方法視其為命中。對該新抗原決定位-HLA 對的偵測表明，即使對於豐富的表位，為 TR-FRET 檢定及呈現預測演算法選擇的截止值亦將會產生一定程度的偽陰性結果。最後，在藉由非靶向分析偵測到的 22 個新抗原決定位-HLA 對中，有 10 個先前已在文獻中描述，其餘 12 個新抗原決定位-HLA 對經假定為新穎的，此係基於對 Tantigen (Olsen 等人，TANTIGEN: a comprehensive database of tumor T cell antigens. Cancer Immunol Immunother.2017; 66(6):731-735)、CAatlas (Yi 等人，caAtlas: An immunopeptidome atlas of human cancer. iScience. 2021; 24(10):103107) 兩者的檢索以及對文獻的粗略檢索。

除了新抗原決定位之外，非靶向分析亦能夠偵測起源於各 25 聚體新抗原序列的帶有非突變之部分的肽，以及藉由直接連結或由多抗原卡匣內之 GS 連接子分離的連續 25 聚體而產生的結肽。偵測到 27 個經呈現之表位對應於胺基酸，該等胺基酸位於癌症新抗原之突變殘基的側翼但不包含該癌症新抗原之突變殘基。由於此等肽與蛋白質的內源性型式具有相同的精確序列，因此可能無法確定此等表位係源自新抗原構建體亦或源自內源性基因體。然而，此等肽仍然提供關於蛋白質加工的資訊，包括此等常見癌症新抗原的潛在蛋白酶體切割位點。除了此等表位之外，分別從非連接子及連接子構建體中發現了 17 個及 2 個結肽 (參見表 3)。有理由認為，來自連接子構建體的肽數量較少是由於連接子包含 G 及 S 胺基酸之事實，而該等胺基酸通常不是錨定殘基。最後，從作為對照的抗原序列中鑑別出 5 個表位，以及源自 BFP 的 13 個表位 ( 表 3)，支持新抗原構建體在單等位基因細胞株中之各者內經表現。

雖然非靶向分析能夠鑑定數千種肽，但它面臨著隨機採樣及以每個細胞低複經呈現之肽的偵測受限的挑戰。相反，靶向 MS 分析將整個儀器工作週期用於分析少量肽，從而能夠偵測以每個細胞中低複經呈現之肽，並改良資料重現性。然而，靶向方法需要經重同位素標記之標準肽，而針對多抗原卡匣內 47 個癌症新抗原的全部潛在新抗原決定位的靶向分析將需要合成 1,748 種肽。相反，TR-FRET 檢定用作初步篩選，並在 TR-FRET 內合成了 397 個 RZ 評分 ≥ 5 的肽 (在從 TR-FRET 資料中去除 GTF2I L424H 後)。由於上述 TR-FRET 與 NetMHC 的互補性，亦合成了另外 81 種 RZ 評分＜ 5 但 NetMHC %Rank ≤ 2 的肽。包括此等肽允許確定是否存在由 NetMHC 預測的在 TR-FRET 檢定中不會發現的新抗原決定位。總計將 479 種肽分配到包含 21 至 88 種肽的等位基因特異性肽檢定中，該等檢定用於對 15 個單等位基因細胞株的新抗原決定位進行量化 ( 圖 16A及 16B)。

靶向 MS 分析鑑別了跨 12 個不同 HLA 等位基因的 84 個新抗原決定位-HLA 對及 37 個共有的癌症新抗原 (突變)，代表當相較於相同樣品的非靶向 MS 分析時的四倍改良 ( 圖 16B)。有趣的是，在 A*11:01 內鑑別了全部 84 個新抗原決定位-HLA 對中的 20 個 (約 24%) ( 圖 16B)。大量 A*11:01 表位可能是由於多抗原卡匣內存在八個不同的 KRAS 新抗原序列，因為 20 個 A*11:01 特異性新抗原決定位中有 14 個映射到 KRAS G12X 或 G13X 新抗原。在 A*03:01 中觀察到類似的模式，其中 14 個新抗原決定位中有 9 個屬於 KRAS 新抗原。對於 A*24:02、B*51:01 或 C*04:01，未發現命中。在檢索文獻及相關資料庫後，新抗原決定位-HLA 對中的 24 個先前已經有所描述，而 60 個是新穎的 (參見下表 6)。

表 6說明性的經鑑別之新抗原決定位-HLA 對

等位基因	新表位序列	新抗原	先前描述
A*01:01	YTDVSNMSH (SEQ ID NO: 135)	DNMT3A R882H	否
YTDVSNMSHLA (SEQ ID NO: 136)	DNMT3A R882H	否
ILDTAGKEEY (SEQ ID NO: 125)	NRAS Q61K	是
LDTAGKEEY (SEQ ID NO: 166)	NRAS Q61K	否
DTAGREEY (SEQ ID NO: 168)	NRAS Q61R/HRAS Q61R	否
ILDTAGREEY (SEQ ID NO: 126)	NRAS Q61R/HRAS Q61R	是
A*02:01	YTLDVLERC (SEQ ID NO: 115)	FGFR3 S249C	否
YIMSDSNYV (SEQ ID NO: 116)	FLT3 D835Y	否
YIMSDSNYVV (SEQ ID NO: 117)	FLT3 D835Y	否
HMTEVVRHC (SEQ ID NO: 128)	TP53 R175H	是
A*03:01	KIGDFGLATEK (SEQ ID NO: 131)	BRAF V600E	否
KIGDFGLATMK (SEQ ID NO: 133)	BRAF V600M	否
ASGAFGTVYK (SEQ ID NO: 113)	EGFR G719A	否
KITDFGRAK (SEQ ID NO: 222)	EGFR L858R	否
VVVGAAGVGK (SEQ ID NO: 118)	KRAS G12A	否
VVVGACGVGK (SEQ ID NO: 119)	KRAS G12C	是
VVVGADGVGK (SEQ ID NO: 120)	KRAS G12D	是
VVVGARGVGK (SEQ ID NO: 23)	KRAS G12R	是
VVGASGVGK (SEQ ID NO: 161)	KRAS G12S	否
VVVGASGVGK (SEQ ID NO: 121)	KRAS G12S	否
VVGAVGVGK (SEQ ID NO: 122)	KRAS G12V	是
VVVGAVGVGK (SEQ ID NO: 123)	KRAS G12V	是
VVGAGDVGK (SEQ ID NO: 164)	KRAS G13D	是
ALHGGWTTK (SEQ ID NO: 170)	PIK3CA H1047L	是
A*11:01	KIGDFGLATMK (SEQ ID NO: 133)	BRAF V600M	否
ASGAFGTVY (SEQ ID NO: 138)	EGFR G719A	否
ASGAFGTVYK (SEQ ID NO: 113)	EGFR G719A	否
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VVGAAGVGK (SEQ ID NO: 155)	KRAS G12A	是
VVVGAAGVGK (SEQ ID NO: 118)	KRAS G12A	否
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VVVGADGVGK (SEQ ID NO: 120)	KRAS G12D	是
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VVGAGCVGK (SEQ ID NO: 163)	KRAS G13C	否
VVVGAGCVGK (SEQ ID NO: 124)	KRAS G13C	否
VVGAGDVGK (SEQ ID NO: 164)	KRAS G13D	否
STRDPLSEITK (SEQ ID NO: 169)	PIK3CA E545K	否
SCMGGMNQR (SEQ ID NO: 129)	TP53 R248Q	否
B*07:02	MPFGSLLDY (SEQ ID NO: 137)	EGFR C797S	否
RSKRNSLAL (SEQ ID NO: 50)	ESR1 K303R	否
CPHRPILQA (SEQ ID NO: 144)	FGFR3 S249C	否
KPIIIGCH (SEQ ID NO: 148)	IDH1 R132C	否
SPNGTIQNIL (SEQ ID NO: 154)	IDH2 R140Q	是
GARGVGKSA (SEQ ID NO: 10)	KRAS G12R	是
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RPIPIKYKAM (SEQ ID NO: 165)	MYD88 L265P	是
B*08:01	KMRRKMSP (SEQ ID NO: 134)	CALR fs	否
FKKIKVLAS (SEQ ID NO: 139)	EGFR G719A	否
FGRAKLLGA (SEQ ID NO: 141)	EGFR L858R	否
MIKRSKRNSL (SEQ ID NO: 61)	ESR1 K303R	否
SKRNSLAL (SEQ ID NO: 46)	ESR1 K303R	否
ERCPHRPIL (SEQ ID NO: 114)	FGFR3 S249C	否
FGLARYIM (SEQ ID NO: 145)	FLT3 D835Y	否
WVKPIIIGC (SEQ ID NO: 149)	IDH1 R132C	否
DGVGKSAL (SEQ ID NO: 158)	KRAS G12D	否
AGREEYSAM (SEQ ID NO: 167)	NRAS Q61R/HRAS Q61R	否
FMKQMNDAL (SEQ ID NO: 127)	PIK3CA H1047L	否
B*35:01	MPFGSLLDY (SEQ ID NO: 137)	EGFR C797S	否
IIIGGHAY (SEQ ID NO: 150)	IDH1 R132G	否
IIIGHHAY (SEQ ID NO: 151)	IDH1 R132H	否
PIIIGHHAY (SEQ ID NO: 174)	IDH1 R132H	否
VKPIIIGHHAY (SEQ ID NO: 153)	IDH1 R132H	否
C*03:04	GACGVGKSAL (SEQ ID NO: 156)	KRAS G12C	是
GAVGVGKSAL (SEQ ID NO: 162)	KRAS G12V	是
C*05:01	IGDFGLATM (SEQ ID NO: 132)	BRAF V600M	否
STDVGFCTL (SEQ ID NO: 143)	ERBB2 S310F	否
YIMSDSNYVV (SEQ ID NO: 117)	FLT3 D835Y	否
GADGVGKSAL (SEQ ID NO: 159)	KRAS G12D	否
CNTTARAFAVV (SEQ ID NO: 171)	SF3B1 R625C	否
GRNSFEVCV (SEQ ID NO: 172)	TP53 R273C	否
C*06:02	KRNSLALSL (SEQ ID NO: 43)	ESR1 K303R	否
FRMVDVGGL (SEQ ID NO: 146)	GNAQ Q209L	否
VDVGGLRSER (SEQ ID NO: 147)	GNAQ Q209L	否
GRNSFEVHV (SEQ ID NO: 173)	TP53 R273H	否
C*07:01	EKSRWSGSHQF (SEQ ID NO: 130)	BRAF V600E	否
LTSTVQLIM (SEQ ID NO: 142)	EGFR T790M	否
KRNSLALSL (SEQ ID NO: 43)	ESR1 K303R	否
C*07:02	KRNSLALSL (SEQ ID NO: 43)	ESR1 K303R	否

為了說明使用 TR-FRET 檢定及 NetMHC 作為選擇用於靶向 MS 分析的肽之方法的相對價值，為藉由靶向 MS 偵測的 84 個新抗原決定位-HLA 對中之各者繪製了 RZ 評分與 NetMHC %Rank 之圖 ( 圖 16C)。該分析表明，53 個新抗原決定位為藉由 TR-FRET 鑑定之穩定結合物並藉由 NetMHC 預測為待呈現。此外，12 個新抗原決定位-HLA 對僅在 TR-FRET 中作為命中而經發現，而 17 個新抗原決定位-HLA 對僅由 NetMHC 鑑別為命中 ( 圖 16C)。此等資料再次表明，TR-FRET 及 NetMHC 兩者在將會經呈現之肽方面具有普遍一致性，但各方法亦鑑別了一組獨特的潛在新抗原決定位-HLA 組合。

為了說明藉由靶向分析鑑別的 62 個 (亦即，總計 84 個偵測到的表位減去 22 個資料依賴性採集 (DDA) 命中) 額外新抗原決定位-HLA 對的結合特徵，為在非靶向及靶向分析兩者中觀察到的肽繪製了 RZ 評分與 NetMHC %Rank 評分之圖，並將它們與僅在靶向分析中發現的肽進行比較 ( 圖 16D及 16E)。發現，相較於亦在非靶向分析中偵測到的新抗原決定位，僅藉由靶向分析鑑別出的新抗原決定位-HLA 對具有更寬範圍的 NetMHC %Rank 評分 ( 圖 16D)。此外，僅藉由靶向分析鑑別出的新抗原決定位-HLA 對在 TR-FRET 檢定中具有更廣泛的 RZ 評分之分佈 ( 圖 16E)。此等結果表明，相較於彼等透過非靶向分析鑑別者，靶向分析可以鑑別出作為較弱結合物的新抗原決定位。

與非靶向方法不同，靶向 MS 允許對肽呈現進行絕對量化，從而能夠跨新抗原決定位對呈現進行比較。在此，測得的新抗原決定位呈現量跨越 60 amol 到 2.5 pmol ( 圖 16F)。不出所料，藉由非靶向 MS 偵測到的肽通常具有更高的絕對量。例如，EGFR G719A (ASGAFGTVYK；SEQ ID NO: 113) 及 FGFR3 S249C (ERCPHRPIL；SEQ ID NO: 114) 兩者皆展現出最高的絕對豐度 - 與來自非靶向分析的測量強度的結果相匹配 ( 圖 16F)。然而，一些表位諸如 PIK3CA H1047L (ALHGGWTTK；SEQ ID NO: 170) 在靶向分析中展現出高絕對豐度，但在非靶向分析中未偵測到 ( 圖 16F)。當將偵測到的新抗原決定位之絕對量與各等位基因之 RZ 評分 ( 圖 17，下屏) 或 NetMHC %Rank 評分 ( 圖 17，上屏) 進行比較時，沒有發現明確的相關性。這表明各評分皆可以預測是否有潛在的新抗原決定位經呈現，但不能預測經呈現的絕對數量。

新抗原決定位絕對含量的測量結果亦能夠比較來自含有連接子或無連接子構建體的細胞的呈現，以及表征跨不同分析批次的測量結果之可重複性。為了說明新抗原構建體內連接子的影響，針對來自含有連接子或無連接子新抗原構建體的單等位基因細胞株中之各癌症新抗原的新抗原決定位繪製了所偵測的肽之最高絕對量之圖 ( 圖 18及 19)。在該分析中，新抗原決定位呈現與多抗原卡匣中存在或不存在連接子之間的一致相關性得以證明 ( 圖 18及 19)。最後，在細胞株生長及樣品製備的 2 至 3 個獨立平行測定 (亦即，HLA-IP 及 MS 分析) 中收集絕對量化測量結果，並且肽呈現的絕對測量結果的在此等平行測定之間匹配良好 ( 圖 20)。

新型腫瘤相關抗原 -HLA-I 對的功能驗證

上面鑑別的 84 個新抗原決定位-HLA 對中的大多數代表新穎候選新抗原決定位。然而，單獨呈現新抗原決定位並不能確保它能夠引發 T 細胞反應。為了確定所鑑別的新抗原決定位是否可以被人類 T 細胞辨識，利用了一種由 Klinger 等人 2015 PLoS One.10(10):e0141561 描述的改進多工 TCR 發現方法。聚焦於 2 個已鑑別的新抗原決定位-HLA 對 (Flt3-p.D835Y/HLA-A*02:01、PIK3CA-p.E545K/HLA-A*11:01)，簡而言，在使用自體單核球來源的樹突狀細胞分離並擴增健康人類供體 CD8+ T 細胞之前，首先將新抗原決定位以獨特的組合分配到肽庫中，用新抗原決定位庫重新刺激，針對活化標記上調進行分選，並進行 TCRβ 定序。該方法用於跨越一系列 HLA 基因型的供體，使 TCR 能夠與各種肽-HLA 對相關聯。然而，由於供體細胞的多等位基因性質，經鑑別之新抗原決定位的 HLA 限制最初並未在 3 至 6 個供體 HLA 等位基因之間消除歧義。

對於引發 T 細胞反應的新抗原決定位，相關的 TCRβ 及TCRα 序列使用平行多工檢定 (Howie 等人，2015 Sci Transl Med.7(301):301ra131) 來確定，該測定能夠構建配對 TCR 表現載體並選擇候選新抗原決定位特異性 TCR。然後透過細胞檢定來評估各 TCR 的特異性及潛在功效。經由電穿孔將編碼 TCR 的經活體外轉錄之 RNA (ivtRNA) 引入原代人類 T 細胞內，然後在表現經預測之 HLA 等位基因的標靶細胞或表現經預測之 HLA 等位基因及所關注之新抗原兩者的單等位基因 K562 細胞存在下，將該等原代人類 T 細胞與遞增濃度之候選新抗原決定位一起孵育。此等兩種方法能夠透過經外源性加載之標靶細胞的活性來表征 TCR 效力，以及新抗原決定位當在細胞環境中經表現、加工及呈現時引發 T 細胞反應的潛力。

因應於與所指示濃度之經外源性遞送的 YIMSDSNYV (SEQ ID NO: 116) 肽一起孵育的 T2 細胞 (其表現低含量之 HLA-A*02:01)，在將以經預測之 Flt3-p.D835Y/HLA-A*02:01 特異性 TCR 轉染的原代人類 CD8+ T 細胞共培養 12 小時後，發現了 CD137 之劑量依賴性上調 ( 圖 21A)。此外，此等 T 細胞由表現突變型 FLT3-p.D835Y 轉殖基因的單等位基因 A*02:01 K562 細胞活化並特異性地毒殺該 K562 細胞，但未由表現野生型 FLT3 轉殖基因的單等位基因 A*02:01 K562 細胞活化也未毒殺該 K562 細胞 ( 圖 21B 至 21F)。有趣的是，此等 TCR 似乎對突變型新抗原決定位具有敏銳的特異性，這是一個重要特徵，因為藉由非靶向分析在 HLA-A*02:01 單等位基因細胞中鑑別出類似的非突變型表位 IMSDSNYVV。此等資料表明此等 TCR 作為一種解決表現 Flt3-p.D835Y 之惡性腫瘤的方式的潛在效用。

作為概念的第二證明，用預測的 PIK3CA-p.E545K/HLA-A*11:01 TCR 轉染 T 細胞並與表現單等位基因 HLA-A*11:01 的 K562 細胞混合，並與遞增濃度之預測的新抗原決定位 STRDPLSEITK (SEQ ID NO: 169) 一起孵育 ( 圖 21G)。在此處，經 TCR 轉染之 T 細胞表明了劑量依賴性活化，如藉由 CD137 表現所測量。此外，相較於表現野生型 PIK3CA 轉殖基因的細胞，此等 T 細胞當與表現 PIK3CA-p.E545K 轉殖基因的單等位基因 A*11:01 K562 細胞混合時表明更高程度之活化及細胞毒殺 ( 圖 21H 至 21M)。引入錨定殘基的突變據信具有高免疫原性潛力，因為免疫系統尚未建立對類似 WT 表位的耐受性。對於 PIK3CA-p.E545K/HLA-A*11:01，E→K 突變在 HLA-A*11:01 的環境中引入錨定殘基，並且在 A*11:01 單等位基因細胞的非靶向 MS 分析中未偵測到野生型 STRDPLSEITE 表位。雖然缺乏在 MS 分析中之偵測不證明不存在，但 WT 表位也未經 NetMHC 預測為結合 HLA-A*11:01。總之，此等資料為 PIK3CA-p.E545K TCR 相較於野生型在辨識突變型 PIK3CA 方面的特異性提供了明確的機制，並支持此等 TCR 作為潛在的治療劑候選物。

討論

迄今為止，大多數新抗原決定位發現工作皆聚焦於有限數量的新抗原、HLA 等位基因或兩者上，以尋找免疫原性腫瘤相關肽。雖然最近的一份報告擴大了同時研究的新抗原及 HLA 等位基因的數量，但此等新抗原決定位係源自同一基因 - KRAS 的突變 (Choi 等人， Cell Rep Methods.2021; 1(5):100084)。在此處，研發了一種多工平台以整合高通量結合檢定、計算新抗原決定位結合預測、單等位基因細胞株的複雜細胞工程改造、及靶向質譜，從而鑑定可以在特定 HLA-I 等位基因環境中呈現並且作為基於新抗原的癌症免疫療法之潛在靶標而發揮作用的獨特腫瘤相關新抗原決定位。如所示，該工作流程利用了高通量生化新抗原決定位-HLA 結合檢定連同計算新抗原決定位-HLA 結合演算法的組合，並能夠全面篩選 47 個共有的癌症新抗原及 15 個常見 HLA 等位基因的全部潛在新抗原決定位。綜合分析得到了 783 個新抗原決定位-HLA 組合的簡短列表 (在調查的總計 24,149 個組合中)，此等組合經鑑別為穩定的粘合物及用於細胞表面 HLA-I 呈現的潛在候選物。獨立地，產生了包含編碼全部 47 個新抗原的多抗原卡匣的經定制工程改造之單等位基因細胞株組，以增加細胞表面所呈現的推定新抗原決定位-HLA 組合之廣度。使用非靶向與靶向質譜分析之組合，鑑別了 84 個獨特的新抗原決定位-HLA 對，它們源自跨 15 個所調查的 HLA 等位基因中之 12 者的 37 個共有的癌症新抗原。為了驗證此等獨特的新抗原決定位-HLA 對之免疫原性及其作為治療標靶的潛力，選擇兩個示例性組合 (Flt3-p.D835Y/HLA-A*02:01 及 PIK3CA-p.E545K/HLA-A*11:01) 並使用基於細胞的檢定來評定在單獨的 MIRA 工作流程中鑑別的一組新抗原特異性 TCR。不僅 T 細胞在對應 TCR 抗原/HLAI 組合存在下經活化，而且數種 TCR 展現出突變型肽選擇性。

超出此處提供的分析之外，TR-FRET 及 MS 資料代表新抗原決定位呈現之未來研究的寶貴資源。例如，TR-FRET 資料可能潛在地用作預測新抗原決定位-HLA 複合物形成的更高級計算演算法之訓練或基準資料。此外，為非靶向及靶向 MS 分析提供原始資料 - 使未來能夠使用以下項進行重新分析：更高級之搜尋演算法 (Vizcaíno 等人，The Human Immunopeptidome Project: A Roadmap to Predict and Treat Immune Diseases. Mol Cell Proteomics.2020; 19(1):31-49)、肽錯誤發現率測定 (Wilhelm 等人，Deep learning boosts sensitivity of mass spectrometry-based immunopeptidomics. Nat Commun. 2021; 12(1):3346) 或偵測抗原呈現途徑中罕見事件的特定工作流程 (例如，經剪接之肽 (Faridi 等人，Spliced HLA-bound peptides: a Black Swan event in immunology. Clin Exp Immunol.2021; 204(2):179-188))。除了本研究中生成的資料外，表現多抗原卡匣的單等位基因細胞株亦代表用於表征臨床上可操作的共有的癌症新抗原之加工及呈現的未來研究的理想系統。總而言之，本文描述的工作流程提供迄今為止對新抗原決定位景觀進行的最全面分析，並提供對於靶向共有的新抗原的基於新抗原決定位之癌症免疫療法的治療標靶的重要洞見。該分析的一個驚人發現是，相對少 (最初篩選的 24,149 個新抗原決定位-HLA 組合中的總計 84 個，或 0.35%) 的共有的新抗原決定位-HLA 對經呈現並因此可用於治療劑研發。共有的癌症新抗原決定位的有限呈現可能是由 HLA-I 肽結合的多樣性所驅動，因為在僅一個 HLA-I 等位基因的環境中偵測到 37 個癌症新抗原中之 18 者的新抗原決定位。對於跨多個 HLA-I 等位基因呈現表位的 19 個癌症新抗原，7 個為 KRAS G12X 或 G13X 突變。由於跨多個盛行 HLA 等位基因的呈現之低發生率，故將會需要擴展該平台的用途及額外的新抗原決定位 HLA 發現工作，以鑑定最有可能受益於共有的新抗原特異性免疫療法的患者群體。例如，據報告，KRAS G12D 突變在 CRC 中最常見，發生率為 14.9% (Araujo 等人，Molecular profile of KRAS G12C-mutant colorectal and non-small-cell lung cancer. BMC Cancer.2021; 21(1):193)。基於即時分析，呈現 KRAS G12D 新抗原決定位的最盛行之 HLA 等位基因為 A*03:01，其在高加索及歐洲血統的患者中平均構成約 14% 的等位基因頻率。因此，對於該適應症中此等高度常見的共有的新抗原，歐洲及高加索人群的最大患者覆蓋率為僅越 2% (突變頻率 X 等位基因頻率)。當慮及 HLA-A*03:01 之盛行率甚至更低的其他人群 (非洲裔美國人 (1.1%)、華裔 (0.2%)、西班牙裔 (1.0%)、東南亞裔 (0.75%))，該數字進一步減少。儘管愈來愈多之證據表明基於新抗原的治療劑對於癌症之治療非常有效，但此等總合研究結果表明，靶向共有的新抗原仍然具有挑戰性。

儘管該分析是全面的，但新抗原決定位-HLA 組合可能從生化分析及/或預測演算法中錯過，並且未包括在靶向質譜分析中。又，在過表現多抗原卡匣 (其編碼跨越經突變之胺基酸的約 25 聚體胺基酸片段) 的經工程改造之細胞株中測量呈現，這種格式中之加工及呈現可能會相較於腫瘤細胞中的全長抗原而經改變，導致錯過新抗原決定位。鑒於該潛在限制，評定了來自用 KRAS G12C、G12D 及 G12V 的全長新抗原進行工程改造之細胞株的新抗原決定位呈現，並觀察到相同的新抗原決定位呈現 ( 圖 12A及 12B)。可以對本文所述的全部 47 種新抗原執行類似的驗證。儘管有此等警告，但這是對跨最相關的共有的新抗原的新抗原決定位情形的最全面分析之一，並且總合研究結果得到了對於癌症免疫療法的可用藥之新抗原決定位標靶的有價值之洞見。

儘管已經揭露了本揭露之特定替代方案，但應理解，各種修改及組合是可能的並且在所附申請專利範圍的真實精神及範圍內考慮之。因此，無意限制本文所呈現之確切摘要及揭露。 序列表

下表列出了各種分子的示例性序列。

SEQ ID NO	同一性	序列	SEQ ID NO	同一性	序列
1	新抗原 KRAS G12R	RGVGKSAL	2	新抗原 KRAS G12R	RGVGKSALT
3	新抗原 KRAS G12R	RGVGKSALTI	4	新抗原 KRAS G12R	RGVGKSALTIQ
5	新抗原 KRAS G12R	ARGVGKSA	6	新抗原 KRAS G12R	ARGVGKSAL
7	新抗原 KRAS G12R	ARGVGKSALT	8	新抗原 KRAS G12R	ARGVGKSALTI
9	新抗原 KRAS G12R	GARGVGKS	10	新抗原 KRAS G12R	GARGVGKSA
11	新抗原 KRAS G12R	GARGVGKSAL	12	新抗原 KRAS G12R	GARGVGKSALT
13	新抗原 KRAS G12R	VGARGVGK	14	新抗原 KRAS G12R	VGARGVGKS
15	新抗原 KRAS G12R	VGARGVGKSA	16	新抗原 KRAS G12R	VGARGVGKSAL
17	新抗原 KRAS G12R	VVGARGVG	18	新抗原 KRAS G12R	VVGARGVGK
19	新抗原 KRAS G12R	VVGARGVGKS	20	新抗原 KRAS G12R	VVGARGVGKSA
21	新抗原 KRAS G12R	VVVGARGV	22	新抗原 KRAS G12R	VVVGARGVG
23	新抗原 KRAS G12R	VVVGARGVGK	24	新抗原 KRAS G12R	VVVGARGVGKS
25	新抗原 KRAS G12R	LVVVGARGV	26	新抗原 KRAS G12R	LVVVGARGVG
27	新抗原 KRAS G12R	LVVVGARGVGK	28	新抗原 KRAS G12R	KLVVVGAR
29	新抗原 KRAS G12R	KLVVVGARG	30	新抗原 KRAS G12R	KLVVVGARGV
31	新抗原 KRAS G12R	KLVVVGARGVG	32	新抗原 KRAS G12R	YKLVVVGAR
33	新抗原 KRAS G12R	YKLVVVGARG	34	新抗原 KRAS G12R	YKLVVVGARGV
35	新抗原 KRAS G12R	EYKLVVVGAR	36	新抗原 KRAS G12R	EYKLVVVGARG
37	新抗原 KRAS G12R	TEYKLVVVGAR	38	新抗原 ESR1 K303R	RNSLALSL
39	新抗原 ESR1 K303R	RNSLALSLT	40	新抗原 ESR1 K303R	RNSLALSLTA
41	新抗原 ESR1 K303R	RNSLALSLTAD	42	新抗原 ESR1 K303R	KRNSLALS
43	新抗原 ESR1 K303R	KRNSLALSL	44	新抗原 ESR1 K303R	KRNSLALSLT
45	新抗原 ESR1 K303R	KRNSLALSLTA	46	新抗原 ESR1 K303R	SKRNSLAL
47	新抗原 ESR1 K303R	SKRNSLALS	48	新抗原 ESR1 K303R	SKRNSLALSL
49	新抗原 ESR1 K303R	SKRNSLALSLT	50	新抗原 ESR1 K303R	RSKRNSLAL
51	新抗原 ESR1 K303R	RSKRNSLALS	52	新抗原 ESR1 K303R	RSKRNSLALSL
53	新抗原 ESR1 K303R	KRSKRNSLA	54	新抗原 ESR1 K303R	KRSKRNSLAL
55	新抗原 ESR1 K303R	KRSKRNSLALS	56	新抗原 ESR1 K303R	IKRSKRNS
57	新抗原 ESR1 K303R	IKRSKRNSLA	58	新抗原 ESR1 K303R	IKRSKRNSLAL
59	新抗原 ESR1 K303R	MIKRSKRN	60	新抗原 ESR1 K303R	MIKRSKRNS
61	新抗原 ESR1 K303R	MIKRSKRNSL	62	新抗原 ESR1 K303R	MIKRSKRNSLA
63	新抗原 ESR1 K303R	LMIKRSKR	64	新抗原 ESR1 K303R	LMIKRSKRN
65	新抗原 ESR1 K303R	LMIKRSKRNS	66	新抗原 ESR1 K303R	LMIKRSKRNSL
67	新抗原 ESR1 K303R	PLMIKRSKR	68	新抗原 ESR1 K303R	PLMIKRSKRN
69	新抗原 ESR1 K303R	PLMIKRSKRNS	70	新抗原 ESR1 K303R	SPLMIKRSKR
71	新抗原 ESR1 K303R	SPLMIKRSKRN	72	新抗原 ESR1 K303R	PSPLMIKRSKR
73	HLA-C*04:01 特異性 sgRNA (長)	TGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCAGTGGGCTACGTGGACGA	74	HLA-C*04:01 特異性 sgRNA 標靶序列	TTCATCGCAGTGGGCTACG
75	共有的新抗原 1 號	ELAGIGILTV	76	共有的新抗原 2 號	NLVPMVATV
77	共有的新抗原 3 號	ATVQGQNLK	78	共有的新抗原 4 號	ELAGIGILT
79	共有的新抗原 5 號	VLEETSVML	80	共有的新抗原 6 號	FLYGSKTFI
81	共有的新抗原 7 號	GTVDNHHFK	82	共有的新抗原 8 號	TSNGPVMQK
83	共有的新抗原 9 號	IYNVKIRGVNF	84	共有的新抗原 10 號	VKIRGVNF
85	共有的新抗原 11 號	KPYEGTQTM	86	共有的新抗原 12 號	GPVMQKKTL
87	共有的新抗原 13 號	YRLERIKEA	88	共有的新抗原 14 號	ATSFLYGSK
89	共有的新抗原 15 號	GSHLIANAK	90	共有的新抗原 16 號	KPYEGTQT
91	共有的新抗原 17 號	GTVDNHHF	92	共有的新抗原 18 號	MEGTVDNHHF
93	共有的新抗原 19 號	KMDWIFHTA	94	共有的新抗原 20 號	ATDFVKLKK
95	共有的新抗原 21 號	RATDFVKLK	96	共有的新抗原 22 號	SYVKVLHSI
97	共有的新抗原 23 號	SPARPGKVV	98	共有的新抗原 24 號	DQYMRTIL
99	共有的新抗原 25 號	VTDLTVKI	100	共有的新抗原 26 號	RATDFVRLV
101	共有的新抗原 27 號	LTIQLIQEQLK	102	共有的新抗原 28 號	LTIQLIQNK
103	共有的新抗原 29 號	AMTEYKLVVV	104	共有的新抗原 30 號	LLHRGNYMC
105	共有的新抗原 31 號	PARPGKVV	106	共有的新抗原 32 號	YLLHRGNYM
107	共有的新抗原 33 號	YVKVLHSI	108	共有的新抗原 34 號	YVVRGNAL
109	共有的新抗原 35 號	SGSGSLSHK	110	共有的新抗原 36 號	GSGGEALEY
111	共有的新抗原 37 號	FPNHVAAIH	112	新抗原 BRAF V600M	KIGDFGLATM
113	新抗原 EGFR G719A	ASGAFGTVYK	114	新抗原 FGFR3 S249C	ERCPHRPIL
115	新抗原 FGFR3 S249C	YTLDVLERC	116	新抗原 FLT3 D835Y	YIMSDSNYV
117	新抗原 FLT3 D835Y	YIMSDSNYVV	118	新抗原 KRAS G12A	VVVGAAGVGK
119	新抗原 KRAS G12C	VVVGACGVGK	120	新抗原 KRAS G12D	VVVGADGVGK
121	新抗原 KRAS G12S	VVVGASGVGK	122	新抗原 KRAS G12V	VVGAVGVGK
123	新抗原 KRAS G12V	VVVGAVGVGK	124	新抗原 KRAS G13C	VVVGAGCVGK
125	新抗原 NRAS Q61K	ILDTAGKEEY	126	新抗原 NRAS Q61R/HRAS Q61R	ILDTAGREEY
127	新抗原 PIK3CA H1047L	FMKQMNDAL	128	新抗原 TP53 R175H	HMTEVVRHC
129	新抗原 TP53 R248Q	SCMGGMNQR	130	新抗原 BRAF V600E	EKSRWSGSHQF
131	新抗原 BRAF V600E	KIGDFGLATEK	132	新抗原 BRAF V600M	IGDFGLATM
133	新抗原 BRAF V600M	KIGDFGLATMK	134	新抗原 CALR fs	KMRRKMSP
135	新抗原 DNMT3A R882H	YTDVSNMSH	136	新抗原 DNMT3A R882H	YTDVSNMSHLA
137	新抗原 EGFR C797S	MPFGSLLDY	138	新抗原 EGFR G719A	ASGAFGTVY
139	新抗原 EGFR G719A	FKKIKVLAS	140	新抗原 EGFR G719A	LASGAFGTVYK
141	新抗原 EGFR L858R	FGRAKLLGA	142	新抗原 EGFR T790M	LTSTVQLIM
143	新抗原 ERBB2 S310F	STDVGFCTL	144	新抗原 FGFR3 S249C	CPHRPILQA
145	新抗原 FLT3 D835Y	FGLARYIM	146	新抗原 GNAQ Q209L	FRMVDVGGL
147	新抗原 GNAQ Q209L	VDVGGLRSER	148	新抗原 IDH1 R132C	KPIIIGCH
149	新抗原 IDH1 R132C	WVKPIIIGC	150	新抗原 IDH1 R132G	IIIGGHAY
151	新抗原 IDH1 R132H	IIIGHHAY	152	新抗原 IDH1 R132H	PIIIGGHAY
153	新抗原 IDH1 R132H	VKPIIIGHHAY	154	新抗原 IDH2 R140Q	SPNGTIQNIL
155	新抗原 KRAS G12A	VVGAAGVGK	156	新抗原 KRAS G12C	GACGVGKSAL
157	新抗原 KRAS G12C	VVGACGVGK	158	新抗原 KRAS G12D	DGVGKSAL
159	新抗原 KRAS G12D	GADGVGKSAL	160	新抗原 KRAS G12D	VVGADGVGK
161	新抗原 KRAS G12S	VVGASGVGK	162	新抗原 KRAS G12V	GAVGVGKSAL
163	新抗原 KRAS G13C	VVGAGCVGK	164	新抗原 KRAS G13D	VVGAGDVGK
165	新抗原 MYD88 L265P	RPIPIKYKAM	166	新抗原 NRAS Q61K	LDTAGKEEY
167	新抗原 NRAS Q61R/HRAS Q61R	AGREEYSAM	168	新抗原 NRAS Q61R/HRAS Q61R	DTAGREEY
169	新抗原 PIK3CA E545K	STRDPLSEITK	170	新抗原 PIK3CA H1047L	ALHGGWTTK
171	新抗原 SF3B1 R625C	CNTTARAFAVV	172	新抗原 TP53 R273C	GRNSFEVCV
173	新抗原 TP53 R273H	GRNSFEVHV	174	新抗原 IDH1 R132H	PIIIGHHAY
175	總 KRAS	SFEDIHHYR	176	新抗原 KRAS G12C	LVVVGACGVGK
177	新抗原 KRAS G12D	LVVVGADGVGK	178	新抗原 KRAS G12V	LVVVGAVGVGK
179	KRAS G12 野生型	VVGAGGVGK	180	KRAS G12 野生型	VVVGAGGVGK
181		DARHGGWTT	182		MKQMNDAR
183		KICDFGLARY	184		VGGLRSERRKW
185		DILDTAGKEEY	186		SKITEQEK
187		ATMKSRWSG	188		LSEITKQEK
189		MNDARHGGWT	190		KQMNDARH
191	新抗原 KRAS G12V	KLVVVGAVGV	192	擴增子引子：Fwd-	CTCCCAGAGCCACCGTTACAC
193	擴增子引子：Rev-	GACTTAACGCGTCCTGGTTGC	194	定序引子	CTGGTTGCAGGCGTTTAGCGT
195	新抗原 IDH1 R132G- IDH2 R140Q	RATDFVR	196	新抗原 PIK3CA H1047R - BRAF V600E	KMDWIFHDL
197	新抗原 JAK V617F - KRAS G13D	FVKMTEY	198	新抗原 JAK V617F - KRAS G13D	QEFVKM
199	新抗原 JAK V617F - KRAS G13D	QEFVKMT	200	新抗原 M 型流感 - IE1	GLQEFC
201	新抗原 Mart1 - MAGE A3	VKVLHSI	202	EGFR L858R - EGFR C797S	HASTVQLIT
203	EGFR T79M - 連接子	YVRGSGSGSGSGSL	204	IFWLQW - 連接子	IFWLQEGS
205	連接子 - JAK2 V617F	SGSGSLSHK	206	連接子 - PIK3CA H1047R	GSGGEALEY
207	連接子 - KRAS G12C	GSSGGGSSGMTEY	208	BFP 表位	YVEQHEVAVARY
209	BFP 表位	QHEVAVARY	210	MAGE A3 表位	ALVETSYVK
211	NYESO1 表位	FLPVFLAQP	212	M 型流感表位	ILSPLTK
213	NYESO1 表位	LMWITQV	214	病毒表位	SLLMWITQV
215	IE-1 表位	SVMLAKRPLITK	216	MAGE A3 表位	TSYVKVL
217	BFP 表位	FLYGSKT	218	BFP 表位	SFLYGSK
219	BFP 表位	LYGSKTF	220	BFP 表位	KPYEGTQ
221	BFP 表位	YGSKTFI	222	EGFR L858R	KITDFGRAK

[ 圖 1A 至 1D]示出新抗原決定位發現流程的實例。圖 1A顯示全部已知新抗原的臨床基因體學分析，包括共有的新抗原決定位發現流程之總結 (下圖)。在高通量結合檢定中測試新抗原決定位-HLA 對。藉由非靶向及靶向之免疫肽組學在表現 47 聚體新抗原匣的經工程改造之細胞株中進一步詢問結合物，以確認新抗原決定位-HLA 對的呈現。然後透過發現能夠進行 T 活化及標靶細胞毒殺的特定 TCR，驗證選定的新抗原決定位之免疫原性潛力。圖 1B為測量新抗原決定位-HLA 結合及穩定性的 TR-FRET 檢定示意圖。圖 1C為攜帶經工程改造之單等位基因及新抗原的細胞之示意圖。圖 1D為測量新抗原決定位呈現的靶向質譜之示意圖。 [ 圖 2A 至 2F]為一組示出藉由 TR-FRET 及 NetMHC 鑑別的新抗原決定位結合物之圖。圖 2A顯示對 B*07:02 等位基因的 KRAS G12R 新抗原決定位結合物之 TR-FRET (點/左軸) 及 NetMHC (正方形/右軸) 分析。列出的 KRAS G12R 新抗原決定位，從左到右，定義為 SEQ ID NO: 1 至 37。圖 2B顯示對 B*07:02 等位基因的 ESR K303R 新抗原決定位結合物之 TR-FRET (點/左軸) 及 NetMHC (正方形/右軸) 分析。列出的 ESR K303R 新抗原決定位，從左到右，定義為 SEQ ID NO: 38 至 72。圖 2C顯示在 TR-FRET 及 NetMHC 4.0 分析中鑑別的結合物百分比。圖 2D將新抗原決定位-HLA 組合的百分比進行比較，該等組合藉由跨 HLA A、HLA B 及 HLA C 等位基因的 TR-FRET (各屏右側之條形) 及 NetMHC (個屏左側之條形) 分析確定為穩定結合物。圖 2E為進一步示出圖 2A中之結果的圖，其顯示 B*07:02 等位基因與 KRAS G12R 新抗原的全部新抗原決定位-HLA 組合之 TR-FRET RZ 評分 (下屏) 及 1/NetMHC 百分等級 (上屏)。上屏及下屏中的虛線分別代表 NetMHC 及 TR-FRET 分析的穩定結合物之截止值。KRAS G12R 新抗原，在圖 2E中從左到右，為 ARGVGKSA (SEQ ID NO: 5)、ARGVGKSAL (SEQ ID NO: 6)、ARGVGKSALT (SEQ ID NO: 7)、ARGVGKSALTI (SEQ ID NO: 8)、EYKLVVVGAR (SEQ ID NO: 35)、EYKLVVVGARG (SEQ ID NO: 36)、GARGVGKS (SEQ ID NO: 9)、GARGVGKSA (SEQ ID NO: 10)、GARGVGKSAL (SEQ ID NO: 11)、GARGVGKSALT (SEQ ID NO: 12)、KLVVVGAR (SEQ ID NO: 28)、KLVVVGARG (SEQ ID NO: 29)、KLVVVGARGV (SEQ ID NO: 30)、KLVVVGARGVG (SEQ ID NO: 31)、LVVVGARGV (SEQ ID NO: 25)、LVVVGARGVG (SEQ ID NO: 26)、LVVVGARGVGK (SEQ ID NO: 27)、RGVGKSAL (SEQ ID NO: 1)、RGVGKSALT (SEQ ID NO: 2)、RGVGKSALTI (SEQ ID NO: 3)、RGVGKSALTIQ (SEQ ID NO: 4)、TEYKLVVVGAR (SEQ ID NO: 37)、VGARGVGK (SEQ ID NO: 13)、VGARGVGKS (SEQ ID NO: 14)、VGARGVGKSA (SEQ ID NO: 15)、VGARGVGKSAL (SEQ ID NO: 16)、VVGARGVG (SEQ ID NO: 17)、VVGARGVGK (SEQ ID NO: 18)、VVGARGVGKS (SEQ ID NO: 19)、VVGARGVGKSA (SEQ ID NO: 20)、VVVGARGV (SEQ ID NO: 21)、VVVGARGVG (SEQ ID NO: 22)、VVVGARGVGK (SEQ ID NO: 23)、VVVGARGVGKS (SEQ ID NO: 24)、YKLVVVGAR (SEQ ID NO: 32)、YKLVVVGARG (SEQ ID NO: 33) 及 YKLVVVGARGV (SEQ ID NO: 34)。圖 2F為進一步示出圖 2B中之結果的圖，其顯示 B*07:02 等位基因與 ESR1 K303R 新抗原的全部新抗原決定位-HLA 組合之 TR-FRET 穩健 Z 評分 (下屏中之方塊) 及 1/百分等級 (上屏中之點)。上屏及下屏中的虛線分別代表 NetMHC 及 TR-FRET 分析的穩定結合物之截止值。ESR1 K303R 新抗原，在圖 2F中從左到右，為 IKRSKRNS (SEQ ID NO: 56)、IKRSKRNSLA (SEQ ID NO: 57)、IKRSKRNSLAL (SEQ ID NO: 58)、KRNSLALS (SEQ ID NO: 42)、KRNSLALSL (SEQ ID NO: 43)、KRNSLALSLT (SEQ ID NO: 44)、KRNSLALSLTA (SEQ ID NO: 45)、KRSKRNSLA (SEQ ID NO: 53)、KRSKRNSLAL (SEQ ID NO: 54)、KRSKRNSLALS (SEQ ID NO: 55)、LMIKRSKR (SEQ ID NO: 63)、LMIKRSKRN (SEQ ID NO: 64)、LMIKRSKRNS (SEQ ID NO: 65)、LMIKRSKRNSL (SEQ ID NO: 66)、MIKRSKRN (SEQ ID NO: 59)、MIKRSKRNS (SEQ ID NO: 60)、MIKRSKRNSL (SEQ ID NO: 61)、MIKRSKRNSLA (SEQ ID NO: 62)、PLMIKRSKR (SEQ ID NO: 67)、PLMIKRSKRN (SEQ ID NO: 68)、PLMIKRSKRNS (SEQ ID NO: 69)、PSPLMIKRSKR (SEQ ID NO: 72)、RNSLALSL (SEQ ID NO: 38)、RNSLALSLT (SEQ ID NO: 39)、RNSLALSLTA (SEQ ID NO: 40)、RNSLALSLTAD (SEQ ID NO: 41)、RSKRNSLAL (SEQ ID NO: 50)、RSKRNSLALS (SEQ ID NO: 51)、RSKRNSLALSL (SEQ ID NO: 52)、SKRNSLAL (SEQ ID NO: 46)、SKRNSLALS (SEQ ID NO: 47)、SKRNSLALSL (SEQ ID NO: 48)、SKRNSLALSLT (SEQ ID NO: 49)、SPLMIKRSKR (SEQ ID NO: 70) 及 SPLMIKRSKRN (SEQ ID NO: 71)。 [ 圖 3A 至 3E]為一組將 TR-FRET 與 NetMHC 分析結果進行比較的圖。圖 3A顯示 TR-FRET 與 NetMHC 分析之間在鑑定結合物及非結合物方面的百分比一致性的比較。圖 3B顯示 TR-FRET 與 NetMHC 分析之間在鑑定結合物方面的百分比一致性的比較。圖 3C顯示 TR-FRET 與 NetMHC 分析之間在鑑定非結合物方面的百分比一致性的比較。圖 3D顯示 TR-FRET 與 NetMHC 分析之間在 HLA-A、HLA-B 及 HLA-C 等位基因方面的百分比一致性的比較。圖 3E顯示藉由跨該等個別等位基因之 NetMHCpan 4.0 及 TR-FRET 兩者發現的新抗原決定位-HLA 對百分比，代表修正後的圖 3B之結果。 [ 圖 4A 至 4D]為一組將全部經鑑別之結合物在 TR-FRET 與 NetMHC 分析之間進行比較的圖。圖 4A顯示熱圖，其展示針對跨經篩選以進行 TR-FRET 分析的全部 HLA 之各新抗原的新抗原決定位結合物之數量。圖 4B顯示熱圖，其針對展示跨經篩選以進行 NetMHC 分析的全部 HLA 之各新抗原的新抗原決定位結合物之數量。圖 4C及 4D顯示熱圖，其展示來自類似實驗的針對跨經篩選以進行 NetMHC 分析 ( 圖 4C) 或 TR-FRET 分析 ( 圖 4D) 的全部 15 個 HLA ( x軸) 之各新抗原 ( y軸) 的新抗原決定位結合物之數量。 [ 圖 5A 至 5C]為一組示出細胞工程改造過程之示例的圖。圖 5A顯示 piggybac 新抗原匣之示例的結構，該匣含有串接新抗原表現陣列，在表現陣列中的新抗原中之各者之間有或沒有連接子，其中對照構建體含有已知由 A*02:01 呈現在 C 末端的數種病毒肽。圖 5B顯示將具有或不具有連接子的 piggybac 新抗原表現構建體、或對照引入穩定地表現 A*02:01 等位基因的 K562 細胞株中之過程。HLA IP + LC-MS 可用於偵測從新抗原切割並結合至經表現的 A*02:01 等位基因的任何新抗原決定位。圖 5C為示出對照構建體上的一些經鑑別之病毒對照肽的圖，如所預期。所示之肽包括 ELAGIGILTV (SEQ ID NO: 75)、NLVPMVATV (SEQ ID NO: 76) 及 SLLMWITQV (SEQ ID NO: 214)。彼等藉由對照組 1 構建體鑑別者經框在矩形中，而彼等藉由「全部對照」構建體鑑別者由箭頭指示。 [ 圖 6A 至 6H]為一組示出細胞工程改造過程之示例的圖。圖 6A顯示 CRISPR/Cas9 剔除策略之示例，該策略從 HMy2.C1R 細胞去除剩餘 HLA-C 等位基因 (HLA-C*04:01)，生成有用於產生表現外源性 A*02:01 的單等位基因細胞株的 HLA-I 類剔除 (I 類 KO) HMy2.C1R 群體。HLA-C*04:01 特異性 sgRNA (長) 含有 TGGCCCGGCCGCGGGGAGCCCCGCTTCATCGCAGTGGGCTACGTGGACGA (SEQ ID NO: 73) 之序列，且 HLA-C*04:01 特異性 sgRNA 標靶序列含有 TTCATCGCAGTGGGCTACG (SEQ ID NO: 74) 之序列。圖 6B顯示使用泛 HLA-I 偵測抗體 W6/32 或同型 (ISO) 對照對野生型 (WT) 或 HMy2.C1R HLA I-剔除 (KO) 細胞中泛 HLA-I 表現的流式細胞分析術偵測，對此類 I 類 KO 細胞與親本野生型 HMy2.C1R 之間在 HLA 表現方面的差異進行比較。藉由 FACS 偵測外源性 A*02:01 及 piggybac 新抗原表現構建體在 I 類 KO 細胞中的表現，如圖 6C中所示。圖 6D示出將 I 類 KO 細胞轉導以產生表現所關注之 HLA 變異體的細胞以供進一步分析之示例。圖 6E顯示本研究中使用的 piggyBac 多新抗原表現構建體之向量圖。含有 47 個串接新抗原 (各新抗原約 25 個胺基酸長度) 後隨 7 個對照肽及一 IRES 連接的 BFP 報告基因的單個轉錄本由 pol II Ef1 α 啟動子驅動。新抗原或者直接串接 (無連接子)，或者藉由短柔性連接子序列 (連接子) 散佈。圖 6F顯示對所選細胞株或 I 類剔除親本株的 HLA-I 表現 (使用 W6/32 抗體) 及多抗原卡匣表現 (BFP，又名藍色螢光蛋白) 的流式細胞分析術偵測。圖 6G顯示對所指示多新抗原表現單等位基因細胞株 HMy2.CIR ^MHCInull中之泛 HLA 表現 (藉由 W6/32抗體；上屏) 或經轉錄連接之 TagBFP2 報導基因 (藉由 BFP，下屏) 的流式細胞分析術偵測。圖 6H顯示對於對照抗原肽表現 (左側深色列：NLVPMVATV (SEQ ID NO: 76)，其起源於 pp65；右側灰色列：VLEETSVML (SEQ ID NO: 79)，其起源於 IE-1) 的靶向免疫肽組偵測，該偵測在經有連接子及無連接子 HLA-A*02:01 工程改造之細胞兩者中進行。 [ 圖 7]為顯示 17 個所關注之 HLA 變異體的每個等位基因之 8 至 11 聚體獨特肽計數之圖。 [ 圖 8A 至 8B]為一組示出經鑑別的新抗原決定位-HLA 結合對之圖。圖 8A顯示來自跨 4 個 HLA 等位基因的 15 個共有的新抗原的 18 個新抗原決定位-HLA 結合對之示例，藉由本文所述的非靶向分析鑑別。經鑑別的新抗原，藉由從上到下的塊表示，為：用於 A*01:01 的 NRAS Q61K (ILDTAGKEEY，SEQ ID NO: 125) 及 NRAS Q61R/HRAS Q61R (ILDTAGREEY, SEQ ID NO: 126)；用於 A*02:01 的 BRAF V600M (KIGDFGLATM，SEQ ID NO: 112)、FGFR3 S249C (YTLDVLERC，SEQ ID NO: 115)、FLT3 D835Y (YIMSDSNYV，SEQ ID NO: 116)、FLT3 D835Y (YIMSDSNYVV，SEQ ID NO: 117) 及 TP53 R175H (HMTEVVRHC，SEQ ID NO: 128)；用於 A*11:01 的 EGFR G719A (ASGAFGTVYK，SEQ ID NO: 113)、KRAS G12A (VVVGAAGVGK，SEQ ID NO: 118)、KRAS G12C (VVVGACGVGK，SEQ ID NO: 119)、KRAS G12D (VVVGADGVGK，SEQ ID NO: 120)、KRAS G12S (VVVGASGVGK，SEQ ID NO: 121)、KRAS G12V (VVGAVGVGK，SEQ ID NO: 122)、KRAS G12V (VVVGAVGVGK，SEQ ID NO: 123)、KRAS G13C (VVVGAGCVGK，SEQ ID NO: 124) 及 TP53 R248Q (SCMGGMNQR，SEQ ID NO: 129)；用於 B*08:01 的 GFGR3 S249C (ERCPHRPIL，SEQ ID NO: 114) 及 PIK3CA H1047L (FMKQMNDAL，SEQ ID NO: 127)。圖 8B將此等 18 對的 NetMHC 呈現預測評分 (「EL-mut」) 及測量的穩健 Z 評分 (「RobustzScore」；用箭頭表示或用橢圓框起來) 進行比較。 [ 圖 9]為一組示出藉由非靶向 + 靶向分析或僅靶向分析鑑別的新抗原決定位-HLA 結合對之圖。將此等經鑑別之對的 NetMHC 呈現預測分數 (「EL-mut」，上屏) 及測量的穩健 Z 評分 (「RobustzScore」，下屏) 進行比較。 [ 圖 10]為顯示 TR-FRET RZ 評分及 Log2 NetMHC 百分等級的散點圖之圖。水平虛線表示如藉由 TR-FRET 測量的穩定結合物之截止值，其中高於水平虛線的值被認為是穩定結合物。垂直虛線表示基於 NetMHC 分析的結合物之截止值，其中低於垂直虛線 (左側) 的值被認為是結合物。 [ 圖 11]為一組示出類似於圖 10中之散點圖的圖，每張圖用於一個特定等位基因。 [ 圖 12A 至 12B]為一組示出將 C1R A*11:01 KRAS 全長樣品與 SharedNeo 非連接子樣品進行比較的蛋白質轉換率差異之圖。對於此等分析，A*11:01 單等位基因細胞經工程改造以表現強力黴素 (dox) 誘導型全長 KRAS 野生型 (WT) 或突變型蛋白 (G12C、G12D、G12V)。將此等與含有無連接子多抗原卡匣的 A*11:01 單等位基因細胞株進行比較。各屏中之條形，從左到右，代表用不由 dox 誘導的 WT、由 dox 誘導的 WT、不由 dox 誘導的 G12C、由 dox 誘導的 G12C、不由 dox 誘導的 G12D、由 dox 誘導的 G12D、不由 dox 誘導的 G12V、由 dox 誘導的 G12V 或 SharedNeo 無連接子對照進行的實驗。圖 12A顯示 KRAS WT的絕對量皆藉由靶向質譜測得的細胞溶胞產物物中所指示之突變蛋白的表現。經鑑別之肽包括 SFEDIHHYR (SEQ ID NO: 175)、LVVVGACGVGK (SEQ ID NO: 176)、LVVVGADGVGK (SEQ ID NO: 177) 及 LVVVGAVGVGK (SEQ ID NO: 178)。圖 12B顯示每個細胞的所呈現之 KRAS 來源肽之複本數，如藉由在親和純化及靶向質譜之前加標 (spike) 的含有重合成新抗原決定位相關肽的同位素 A*11:01 單體所測量。NL 指代無連接子。n=1 (NL 樣品僅針對重同位素編碼肽 MHC (hipMHC) 實驗進行加工)。經鑑別之肽包括 VVGAGGVGK (SEQ ID NO: 179)、VVVGAGGVGK (SEQ ID NO: 180)、VVGACGVGK (SEQ ID NO: 157)、VVVGACGVGK (SEQ ID NO: 119)、VVGADGVGK (SEQ ID NO: 160)、VVVGADGVGK (SEQ ID NO: 120)、VVGAVGVGK (SEQ ID NO: 122) 及 VVVGAVGVGK (SEQ ID NO: 123)。 [ 圖 13A 至 13D]為一組示出對表現多抗原卡匣的單等位基因細胞株的示例性非靶向免疫肽組分析之圖。圖 13A顯示非靶向免疫肽組分析之工作流程。所示肽序列包括 DARHGGWTT (SEQ ID NO: 181)、MKQMNDAR (SEQ ID NO: 182)、KICDFGLARY (SEQ ID NO: 183)、PIIIGHHAY (SEQ ID NO: 174)、VGGLRSERRKW (SEQ ID NO: 184)、DILDTAGKEEY (SEQ ID NO: 185)、SKITEQEK (SEQ ID NO: 186)、ATMKSRWSG (SEQ ID NO: 187)、LSEITKQEK (SEQ ID NO: 188)、MNDARHGGWT (SEQ ID NO: 189)、KQMNDARH (SEQ ID NO: 190) 等。圖 13B顯示在非靶向免疫肽組分析中鑑別的各等位基因的獨特 8 至 11 聚體肽之數量。圖 13C顯示經鑑別的共有的癌症新抗原表位。顏色代表跨多個分析的 log10 最大面積 (箭頭顯示具有最大值的兩個塊)。經鑑別的新抗原表位包括，從左到右，KIGDFGLATMK (SEQ ID NO: 133)、ASGAFGTVYK (SEQ ID NO: 113)、ERCPHRPIL (SEQ ID NO: 114)、YIMSDSNYV (SEQ ID NO: 116)、YIMSDSNYVV (SEQ ID NO: 117)、VVVGAAGVGK (SEQ ID NO: 118)、VVVGACGVGK (SEQ ID NO: 119)、VVVGADGVGK (SEQ ID NO: 120)、VVVGASGVGK (SEQ ID NO: 121)、VVGAVGVGK (SEQ ID NO: 122)、VVVGAVGVGK (SEQ ID NO: 123)、VVVGAGCVGK (SEQ ID NO: 124)、ILDTAGKEEY (SEQ ID NO: 125)、ILDTAGREEY (SEQ ID NO: 126)、ALHGGWTTK (SEQ ID NO: 170)、FMKQMNDAL (SEQ ID NO: 127)、HMTEVVRHC (SEQ ID NO: 128) 及 SCMGGMNQR (SEQ ID NO: 129)。圖 13D將透過非靶向免疫肽組分析鑑別的每個表位之 TR-FRET 穩健 Z 評分 (RZ 評分) 及 NetMHC 百分等級 (%Rank) 評分進行比較。 [ 圖 14]為顯示在按等位基因及新抗原構建體之連接子狀態分層的非靶向蛋白質組學分析中鑑別的獨特肽 (8 至 11 聚體) 的示例性數量之圖。各點代表細胞沉澱物的測量值。方框代表四分位數間距，且線代表中位數。 [ 圖 15A 及 15B]為一組示出在所呈現的肽之結合模體序列 ( 圖 15B，對於實驗模體) 與對應的預期模體 ( 圖 15A，對於已知模體) 之間的一致性之圖。藉由非靶向質譜確定結合模體。使用帶有兩個箱 (bin) 的 GibbsCluster 2.0 生成模體，允許一個主要模體之箱及用於非特異性肽之第二箱。 [ 圖 16A 至 16F]為一組示出對表現多抗原卡匣的單等位基因細胞株的示例性靶向免疫肽組分析之圖。圖 16A顯示靶向免疫肽組工作流程。圖 16B顯示各等位基因的靶向 (對於各等位基因，在左側之條形) 及偵測 (對於各等位基因，在右側之條形) 的共有的癌症新抗原表位之數量。圖 16C將透過靶向 MS 鑑別的各表位的 TR-FRET RZ 評分及 NetMHC %Rank 評分進行比較。圖 16D顯示在非靶向和靶向分析兩者 (左) 或僅在靶向分析 (右) 中偵測到的新抗原決定位之 NetMHC %Rank 評分。圖 16E顯示在非靶向和靶向分析兩者 (左) 或僅在靶向分析 (右) 中偵測到的新抗原決定位之 TR-FRET RZ 評分。圖 16F顯示對從共有的癌症新抗原中偵測到的新抗原決定位-HLA 對之總結。顏色代表分析期間在列上偵測到的新抗原決定位之阿托莫耳 (attomole) (箭頭顯示具有比其他更高 Log2(阿托莫耳) 值的塊)。帶有中心點的粗體方塊代表在非靶向分析中亦偵測到的新抗原決定位。結果從跨 12 個等位基因的 37 種突變中鑑定出 84 個獨特的新抗原決定位-HLA 組合。熱圖上的「FRMVDVGGL」(SEQ ID NO: 146) 肽來自 GNA11 及 GNAQ 蛋白兩者，其中準確的 NetMHC EL_mut 評分為 0.0918。然而，該肽基於 8.32 的穩健 Z 評分而與 GNAQ 蛋白相關 (如圖上所反映)，與之相反，與 GNA11 相關時該評分為 4.42。類似地，熱圖上的「VDVGGLRSER」(SEQ ID NO: 147) 肽來自 GNA11 及 GNAQ 蛋白兩者，其中準確的 NetMHC EL_mut 評分為 58.4。然而，該肽基於 5.00 的穩健 Z 評分而與 GNA11 蛋白相關 (如圖上所反映)，與之相反，與 GNAQ 相關時該評分為 0.069。經鑑別的新抗原決定位包括，從上到下，EKSRWSGSHQF (SEQ ID NO: 130)、KIGDFGLATEK (SEQ ID NO: 131)、IGDFGLATM (SEQ ID NO: 132)、KIGDFGLATMK (SEQ ID NO: 133)、KMRRKMSP (SEQ ID NO: 134)、YTDVSNMSH (SEQ ID NO: 135)、YTDVSNMSHLA (SEQ ID NO: 136)、MPFGSLLDY (SEQ ID NO: 137)、ASGAFGTVY (SEQ ID NO: 138)、ASGAFGTVYK (SEQ ID NO: 113)、FKKIKVLAS (SEQ ID NO: 139)、LASGAFGTVYK (SEQ ID NO: 140)、FGRAKLLGA (SEQ ID NO: 141)、KITDFGRAK (SEQ ID NO: 222)、LTSTVQLIM (SEQ ID NO: 142)、STDVGFCTL (SEQ ID NO: 143)、KRNSLALSL (SEQ ID NO: 43)、MIKRSKRNSL (SEQ ID NO: 61)、RSKRNSLAL (SEQ ID NO: 50)、SKRNSLAL (SEQ ID NO: 46)、CPHRPILQA (SEQ ID NO: 144)、ERCPHRPIL (SEQ ID NO: 114)、YTLDVLERC (SEQ ID NO: 115)、FGLARYIM (SEQ ID NO: 145)、YIMSDSNYV (SEQ ID NO: 116)、YIMSDSNYVV (SEQ ID NO: 117)、FRMVDVGGL (SEQ ID NO: 146)、VDVGGLRSER (SEQ ID NO: 147)、KPIIIGCH (SEQ ID NO: 148)、WVKPIIIGC (SEQ ID NO: 149)、IIIGGHAY (SEQ ID NO: 150)、IIIGHHAY (SEQ ID NO: 151)、PIIIGGHAY (SEQ ID NO: 152)、VKPIIIGHHAY (SEQ ID NO: 153)、SPNGTIQNIL (SEQ ID NO: 154)、VVGAAGVGK (SEQ ID NO: 155)、VVVGAAGVGK (SEQ ID NO: 118)、GACGVGKSAL (SEQ ID NO: 156)、VVGACGVGK (SEQ ID NO: 157)、VVVGACGVGK (SEQ ID NO: 119)、DGVGKSAL (SEQ ID NO: 158)、GADGVGKSAL (SEQ ID NO: 159)、VVGADGVGK (SEQ ID NO: 160)、VVVGADGVGK (SEQ ID NO: 120)、GARGVGKSA (SEQ ID NO: 10)、GARGVGKSAL (SEQ ID NO: 11)、VVVGARGVGK (SEQ ID NO: 23)、VVGASGVGK (SEQ ID NO: 161)、VVVGASGVGK (SEQ ID NO: 121)、GAVGVGKSAL (SEQ ID NO: 162)、VVGAVGVGK (SEQ ID NO: 122)、VVVGAVGVGK (SEQ ID NO: 123)、VVGAGCVGK (SEQ ID NO: 163)、VVVGAGCVGK (SEQ ID NO: 124)、VVGAGDVGK (SEQ ID NO: 164)、RPIPIKYKAM (SEQ ID NO: 165)、ILDTAGKEEY (SEQ ID NO: 125)、LDTAGKEEY (SEQ ID NO: 166)、AGREEYSAM (SEQ ID NO: 167)、DTAGREEY (SEQ ID NO: 168)、ILDTAGREEY (SEQ ID NO: 126)、STRDPLSEITK (SEQ ID NO: 169)、ALHGGWTTK (SEQ ID NO: 170)、FMKQMNDAL (SEQ ID NO: 127)、CNTTARAFAVV (SEQ ID NO: 171)、HMTEVVRHC (SEQ ID NO: 128)、SCMGGMNQR (SEQ ID NO: 129)、GRNSFEVCV (SEQ ID NO: 172) 及 GRNSFEVHV (SEQ ID NO: 173)。 [ 圖 17]為一組將各等位基因的偵測到的新抗原決定位之絕對量與藉由穩健 Z 評分 (下屏) 或 NetMHCpan-4.0 (上屏) 方法預測的呈現評分進行比較之圖。各點代表在靶向蛋白質組分析中偵測到的新表位-HLA 對。如果偵測到多個新抗原決定位-HLA 對，則阿托莫耳值為跨全部分析的該肽-HLA 對之最大值。 [ 圖 18]為一組將含有連接子及無連接子構建體的細胞株之表位呈現進行比較之圖。各條線代表特定表位，且該線之斜率表明在含有連接子及無連接子多抗原卡匣的單等位基因細胞株之間的表現是否更低、更高或相似。 [ 圖 19]為一組顯示跨分析批次的表位呈現分析之圖，其中考慮了構建體中連接子的存在。各列代表對於表現具有或不具有連接子的多抗原卡匣的細胞株之特定批次分析。顏色代表藉由在列上針對各新抗原決定位偵測到的阿托莫耳量而測量的絕對豐度。按與圖 16F中相同的順序從上到下列出各 HLA 的新抗原決定位。 [ 圖 20]為將跨分析批次的表位呈現進行比較之圖。對於各等位基因，展示各批的表位偵測，包括對含有該特定等位基因的單等位基因細胞株的分析。顏色代表在列上針對各新抗原決定位偵測到的以阿托莫耳計之肽量。按與圖 16F中相同的順序從上到下列出新抗原決定位。 [ 圖 21A 至 21M]為一組示出對經鑑別的腫瘤相關新抗原決定位-HLA 對的功能驗證之圖。用 (A) FLT3-p.D835Y 特異性或 (B) PIK3CA-p.E545K 特異性 TCR RNA 轉染的人類 CD8+ T 細胞。將 Flt3-p.D835Y/HLA-A*02:01 特異性 TCR 轉染到原代人類 CD8+ T 細胞中。將經轉染的 T 細胞與 YIMSDSNYV (SEQ ID NO: 116) 肽脈衝的 HLA-A*02:01+ T2 細胞共培養越夜。圖 21A評估以不同 YIMSDSNYV (SEQ ID NO: 116) 肽濃度脈衝到 T2 細胞的經轉染的 T 細胞之 CD137 表現。從上到下的跡線表示表現各種 FLT3-p.D835Y 特異性 TCR (分別為 FLT3_TCR_1、FLT3_TCR_2 及 FLT3_TCR_3) 的 T 細胞及沒有 TCR 表現的模擬對照。然後將 T 細胞與表現野生型 FLT3 轉殖基因或突變型 FLT3-p.D835Y 轉殖基因的單等位基因 A*02:01 K562 細胞共培養。藉由經活化之 T 細胞的 CD137 ( 圖 21B)、TNF (pg/mL，圖 21C)、IFNγ (pg/mL，圖 21D) 及 GranzymeB (pg/mL，圖 21E) 之表現並且藉由圖 21F中之標靶 K562 細胞之毒殺/溶胞來評估所得 T 細胞活化。在圖 21B至 21F中，各轉殖基因條件上方的條形代表，從左到右，沒有 TCR 表現的模擬對照以及表現 FLT3_TCR_1、FLT3_TCR_2 或 FLT3_TCR_3 的 T 細胞 (如圖 21B中所指示)。藉由用預測的 PIK3CA-p.E545K/HLA-A*11:01 TCR 轉染人類 CD8+ T 細胞並與表現單等位基因 HLA-A*11:01 的 K562 細胞混合，並與遞增濃度之預測的新抗原決定位 STRDPLSEITK (SEQ ID NO: 169) (僅由靶向 MS 發現) 一起孵育，執行了類似的實驗。圖 21G評估以不同 STRDPLSEITK (SEQ ID NO: 169) 肽濃度脈衝到 K562 細胞的經轉染的 T 細胞之 CD137 表現。從上到下的跡線表示表現各種 PIK3CA-p.E545K 特異性 TCR (分別為 PIK3CA_TCR_3、PIK3CA_TCR_1、PIK3CA_TCR_2 及 PIK3CA_TCR_4) 的 T 細胞及沒有 TCR 表現的模擬對照。然後將 T 細胞與表現野生型 PIK3CA 轉殖基因或突變型 PIK3CA-p.E545K 轉殖基因的單等位基因 HLA-A*11:01 K562 細胞共培養。藉由經活化之 T 細胞的 CD137 ( 圖 21H)、TNF (pg/mL，圖 21J)、IFNγ (pg/mL，圖 21K) 及 GranzymeB (pg/mL，圖 21L) 之表現並且藉由圖 21M中之標靶 K562 細胞之毒殺/溶胞來評估所得 T 細胞活化。在圖 21H至 21M中，各轉殖基因條件上方的條形代表，從左到右，沒有 TCR 表現的模擬對照以及表現 PIK3CA_TCR_1、PIK3CA_TCR_2、PIK3CA_TCR_3 或 PIK3CA_TCR_4 的 T 細胞 (如圖 21H中所指示)。

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Claims

一種產生單等位基因 MHC 表現細胞株之方法，其包含： i) 獲得不表現內源性 MHC 等位基因 (allele) 的細胞； ii) 將編碼外源性 MHC 等位基因多肽的多核苷酸引入該細胞中，使得該外源性 MHC 等位基因多肽由該細胞表現，以製造單等位基因 MHC 表現細胞；以及 iii) 在用以獲得單等位基因 MHC 表現細胞株的條件下擴增該單等位基因 MHC 表現細胞。
如請求項 1 之方法，其中步驟 i) 中的該細胞係經過基因修飾，以使內源性 MHC 等位基因突變或缺失 (delete)。
如請求項 1 之方法，其中步驟 i) 包含對細胞進行基因修飾，以使內源性 MHC 等位基因突變或缺失。
如請求項 1 至 3 中任一項之方法，其中該 MHC 等位基因為 MHCI 等位基因。
如請求項 1 至 4 中任一項之方法，其中該單等位基因 MHC 表現細胞株表現 β2-微球蛋白 (B2M)。
如請求項 4 之方法，其中該 MHCI 等位基因係由以下基因座中之任一者編碼：HLA-A、HLA-B 及 HLA-C。
如請求項 4 至 6 中任一項之方法，其中該 MHCI 等位基因係選自：A*01.01、A*02.01、A*03.01、A*11.01、A*24.02、B*07.02、B*08.01、B*35.01、B*44.02、B*51.01、C*03.04、C*04.01、C*05.01、C*06.02、C*07.01、C*07.02 及 C*08.02。
如請求項 1 至 7 中任一項之方法，其進一步包含將編碼複數個新抗原相關聯肽的多核苷酸卡匣 (cassette) 引入該單等位基因 MHC 表現細胞株中。
如請求項 8 之方法，其中該複數個新抗原相關聯肽係在該單等位基因 MHC 表現細胞株中表現，並且裂解為複數個新抗原決定位，其中至少一個新抗原決定位與該外源性 MHC 多肽特異性結合。
如請求項 9 之方法，其中該至少一個新抗原決定位的長度為 8、9、10、11、12 或 13 個胺基酸。
如請求項 8 至 10 中任一項之方法，其中該等新抗原相關聯肽係藉由腫瘤突變的生物資訊學及/或臨床分析來鑑別。
如請求項 8 至 11 中任一項之方法，其中該等新抗原相關聯肽中之至少一者與 SEQ ID NO: 1 至 72、75 至 191 及 195 至 222 中之至少一者具有至少 70％序列同一性。
如請求項 8 至 12 中任一項之方法，其中該複數個新抗原相關聯肽中之各者的長度為在約 20 與約 50 個之間的胺基酸。
如請求項 8 至 13 中任一項之方法，其中該等新抗原相關聯肽中之至少一者係選自圖式中列出的新抗原。
如請求項 1 至 14 中任一項之方法，其中該細胞為抗原呈現細胞 (APC)。
如請求項 1 至 14 中任一項之方法，其中該細胞為 HMy2.C1R 細胞或 K562 細胞。
一種單等位基因 MHC 表現細胞株，其藉由如請求項 1 至 16 中任一項之方法而產生。
一種系統，其包含複數個單等位基因 MHC 表現細胞株，其中各細胞株不表現內源性 MHC 等位基因，並且其中各細胞株表現外源性 MHC 等位基因，使得各細胞株表現不同的外源性 MHC 等位基因。
如請求項 18 之系統，其中該等單等位基因 MHC 表現細胞株中之各者係經過基因修飾，以使內源性 MHC 等位基因突變或缺失。
如請求項 18 或 19 之系統，其中所表現之 MHC 等位基因中之各者為 MHCI 等位基因。
如請求項 18 至 20 中任一項之系統，其中該單等位基因 MHC 表現細胞株表現 β2-微球蛋白 (B2M)。
如請求項 20 之系統，其中該 MHCI 等位基因係由以下基因座中之任一者編碼：HLA-A、HLA-B 及 HLA-C。
如請求項 20 至 22 中任一項之系統，其中該 MHC 等位基因係選自：A*01.01、A*02.01、A*03.01、A*11.01、A*24.02、B*07.02、B*08.01、B*35.01、B*44.02、B*51.01、C*03.04、C*04.01、C*05.01、C*06.02、C*07.01、C*07.02 及 C*08.02。
如請求項 18 至 23 中任一項之系統，其中各細胞株包含編碼複數個新抗原相關聯肽的多核苷酸卡匣。
如請求項 24 之系統，其中該複數個新抗原相關聯肽在該複數個單等位基因 MHC 表現細胞株中表現，並且裂解為複數個新抗原決定位，其中至少一個新抗原決定位與該外源性 MHC 多肽特異性結合。
如請求項 25 之系統，其中該至少一個新抗原決定位的長度為 8、9、10、11、12 或 13 個胺基酸。
如請求項 24 至 26 中任一項之系統，其中該複數個新抗原相關聯肽係藉由腫瘤突變的生物資訊學及/或臨床分析來鑑別。
如請求項 24 至 26 中任一項之系統，其中該複數個新抗原相關聯肽中之至少一者與 SEQ ID NO: 1 至 72、75 至 191 及 195 至 222 中之至少一者具有至少 70％序列同一性。
如請求項 24 至 28 中任一項之系統，其中該複數個新抗原相關聯肽中之各者的長度為在約 20 與約 50 個之間的胺基酸。
如請求項 24 至 29 中任一項之系統，其中該複數個新抗原相關聯肽中之至少一者係選自圖式中列出的新抗原。
如請求項 18 至 30 中任一項之系統，其中該等單等位基因 MHC 表現細胞株中之各者為抗原呈現細胞 (APC)。
如請求項 18 至 30 中任一項之系統，其中該細胞為 HMy2.C1R 細胞或 K562 細胞。
一種分離之多核苷酸卡匣，其編碼複數個新抗原相關聯肽。
如請求項 33 之分離之多核苷酸卡匣，其中該複數個新抗原相關聯肽中之各者的長度為在約 20 與約 50 個之間的胺基酸。
如請求項 33 或 34 之分離之多核苷酸卡匣，其中該複數個新抗原相關聯肽係藉由腫瘤突變的生物資訊學及/或臨床分析來鑑別。
如請求項 33 至 35 中任一項之分離之多核苷酸卡匣，其進一步至少包含在兩個新抗原相關聯肽之間的連接子。
如請求項 36 之分離之多核苷酸卡匣，其中該連接子包含肽連接子。
如請求項 33 至 37 中任一項之分離之多核苷酸卡匣，其進一步包含啟動子，該啟動子能夠在細胞中啟動該複數個新抗原相關聯肽轉譯成單一多肽。
如請求項 38 之分離之多核苷酸卡匣，其中該單一多肽在該細胞中裂解為複數個新抗原決定位。
如請求項 39 之分離之多核苷酸卡匣，其中該複數個新抗原決定位係呈現在該細胞的表面上。
如請求項 33 至 40 中任一項之分離之多核苷酸卡匣，其中該複數個新抗原相關聯肽中之至少一者與 SEQ ID NO: 1 至 72、75 至 191 及 195 至 222 中之至少一者具有至少 70％序列同一性。
一種鑑別新抗原決定位-MHC 結合對之方法，其包含： i) 提供包含細胞的單等位基因 MHC 表現細胞株，其中各細胞表現第一外源性 MHC 且包含編碼複數個新抗原相關聯肽的多核苷酸卡匣； ii) 在各細胞中表現該複數個新抗原相關聯肽，其中藉由在各細胞內使該複數個新抗原相關聯肽裂解來產生複數個新抗原決定位，使得一個或多個新抗原決定位與在該細胞表面處的該第一外源性 MHC 結合； iii) 從該新抗原決定位的在該細胞表面處的所結合的第一外源性 MHC 中溶析該新抗原決定位；以及 iv) 鑑別來自步驟 iii) 溶析的新抗原決定位，從而鑑別新抗原決定位-MHC 結合對。
一種鑑別新抗原決定位-MHC 結合對之方法，其包含： i) 提供包含細胞的單等位基因 MHC 表現細胞株，其中各細胞表現第一外源性 MHC； ii) 使該細胞與合成的新抗原決定位接觸； iii) 溶析結合至在該細胞表面處的該第一外源性 MHC 的肽；以及 iv) 鑑別來自步驟 iii) 溶析的新抗原決定位，從而鑑別新抗原決定位-MHC 結合對。
如請求項 42 之方法，其中藉由肽交換測定來確定該複數個新抗原相關聯肽與一個或多個 MHC 結合。
如請求項 42 之方法，其中該複數個新抗原相關聯肽係藉由腫瘤突變的生物資訊學及/或臨床分析來鑑別。
如請求項 42 至 45 中任一項之方法，其中該複數個新抗原決定位中之至少一者的長度為 8、9、10、11、12 或 13 個胺基酸。
如請求項 42 至 46 中任一項之方法，其中該複數個新抗原相關聯肽中之至少一者與 SEQ ID NO: 1 至 72、75 至 191 及 195 至 222 中之至少一者具有至少 70％序列同一性。
如請求項 42 至 47 中任一項之方法，其中該複數個新抗原相關聯肽中之各者的長度為在約 20 與約 50 個之間的胺基酸。
如請求項 42 至 48 中任一項之方法，其中該複數個新抗原相關聯肽中之至少一者係選自圖式中列出的新抗原。
如請求項 42 至 49 中任一項之方法，其中該複數個新抗原相關聯肽係以單一多肽表現。
如請求項 50 之方法，其中該單一多肽包含至少一個在兩個新抗原相關聯肽之間的連接子。
如請求項 43 之方法，其中藉由肽交換測定來確定該合成的新抗原決定位與一個或多個 MHC 結合。
如請求項 42 至 52 中任一項之方法，其中在包含細胞的第二單等位基因 MHC 表現細胞株中重複步驟 i) 至 iv)，其中各細胞表現第二外源性 MHC 等位基因多肽。
如請求項 42 至 53 中任一項之方法，其中對步驟 i) 中該等單等位基因 MHC 表現細胞株中之各細胞進行基因修飾，以使內源性 MHC 等位基因突變或缺失。
如請求項 42 至 54 中任一項之方法，其中步驟 i) 包含對該單等位基因 MHC 表現細胞株中之一個或多個細胞進行基因修飾，以使內源性 MHC 等位基因突變或缺失。
如請求項 42 至 55 中任一項之方法，其中該 MHC 等位基因為 MHCI 等位基因。
如請求項 42 至 56 中任一項之方法，其中該單等位基因 MHC 表現細胞株表現 β2-微球蛋白 (B2M)。
如請求項 56 之方法，其中該 MHCI 等位基因係由以下基因座中之任一者編碼：HLA-A、HLA-B 及 HLA-C。
如請求項 42 至 58 中任一項之方法，其中該 MHC 等位基因係選自：A*01.01、A*02.01、A*03.01、A*11.01、A*24.02、B*07.02、B*08.01、B*35.01、B*44.02、B*51.01、C*03.04、C*04.01、C*05.01、C*06.02、C*07.01、C*07.02 及 C*08.02。
一種癌症疫苗，其包含分離之多肽或編碼該多肽的分離之多核苷酸，其中該多肽包含新抗原決定位，該新抗原決定位係在藉由如請求項 42 至 59 中任一項之方法鑑別的所鑑別的新抗原決定位-MHC 結合對中。
一種製備表現 T 細胞受體 (TCR) 及/或嵌合抗原受體 (CAR) 的 T 細胞之方法，其包含將 TCR 及/或 CAR 引入 T 細胞中，其中該 TCR 及/或該 CAR 與新抗原決定位-MHC 複合物特異性結合，該新抗原決定位-MHC 複合物係由藉由如請求項 42 至 59 中任一項之方法鑑別的新抗原決定位-MHC 結合對形成。
一種表現 T 細胞受體 (TCR) 及/或嵌合抗原受體 (CAR) 之重組 T 細胞，其中該 TCR 及/或該 CAR 與新抗原決定位-MHC 結合對特異性結合，該新抗原決定位-MHC 結合對包含：新抗原決定位，其藉由使腫瘤或癌症所表現的新抗原相關聯肽裂解而產生；以及 MHC，其由該腫瘤或癌症所表現。
如請求項 62 之重組 T 細胞，其中該 MHC 等位基因肽為 MHCI 等位基因多肽。
如請求項 63 之重組 T 細胞，其中該單等位基因 MHC 表現細胞株表現 β2-微球蛋白 (B2M)。
如請求項 63 之重組 T 細胞，其中該 MHCI 等位基因係由以下基因座中之任一者編碼：HLA-A、HLA-B 及 HLA-C。
如請求項 62 至 65 中任一項之重組 T 細胞，其中該 MHC 等位基因肽係由選自以下之 MHC 等位基因編碼：A*01.01、A*02.01、A*03.01、A*11.01、A*24.02、B*07.02、B*08.01、B*35.01、B*44.02、B*51.01、C*03.04、C*04.01、C*05.01、C*06.02、C*07.01、C*07.02 及 C*08.02。
如請求項 62 至 66 中任一項之重組 T 細胞，其中該新抗原相關聯肽係藉由腫瘤突變的生物資訊學及/或臨床分析來鑑別。
如請求項 62 至 67 中任一項之重組 T 細胞，其中該新抗原決定位的長度為 8、9、10、11、12 或 13 個胺基酸。
如請求項 62 至 68 中任一項之重組 T 細胞，其中該新抗原相關聯肽與 SEQ ID NO: 1 至 72、75 至 191 及 195 至 222 中之至少一者具有至少 70％序列同一性。
如請求項 62 至 69 中任一項之重組 T 細胞，其中該新抗原相關聯肽的長度為在約 20 與約 50 個之間的胺基酸。
一種選擇患有癌症或腫瘤的個體以藉由表現 T 細胞受體 (TCR) 及/或嵌合抗原受體 (CAR) 的 T 細胞進行治療之方法，其包含： (i) 對該個體進行基因分型，以鑑別由該個體所表現的 MHC 等位基因及由該癌症或腫瘤所表現的新抗原，其中該新抗原可由細胞裂解以產生複數個新抗原決定位；以及 (ii) 確定所表現的 MHC 是否能夠結合該等新抗原決定位中之一者或多者，其中如果所鑑別的 MHC 與該複數個新抗原決定位之新抗原決定位形成新抗原決定位-MHC 結合對，則該個體被確定為能夠藉由該 T 細胞治療，其中該 TCR 及/或該 CAR 與該新抗原決定位-MHC 結合對特異性結合。
一種選擇患有癌症或腫瘤的個體以藉由癌症疫苗進行治療之方法，其包含： (i) 對該個體進行基因分型，以鑑別由該個體所表現的 MHC 等位基因及由該癌症或腫瘤所表現的新抗原，其中該新抗原可由細胞裂解以產生複數個新抗原決定位；以及 (ii) 確定該 MHC 是否能夠結合該等新抗原決定位中之一者或多者，其中如果所鑑別的 MHC 與該複數個新抗原決定位之新抗原決定位形成新抗原決定位-MHC 結合對，則該個體被確定為能夠藉由癌症疫苗治療，該癌症疫苗包含該新抗原決定位或編碼該新抗原決定位的多核苷酸。
一種治療患有表現新抗原相關聯肽及 MHC 的癌症或腫瘤的個體之方法，其中該 MHC 係經確定與來自該新抗原的新抗原決定位結合，該方法包含向該個體投予治療有效量之表現 T 細胞受體 (TCR) 及/或嵌合抗原受體 (CAR) 的 T 細胞，其中該 TCR 及/或該 CAR 與包含該 MHC 及該新抗原決定位的新抗原決定位-MHC 結合對特異性結合。
一種治療患有癌症或腫瘤的個體之方法，其包含： (i) 選擇表現 MHC 且患有表現新抗原的癌症的個體，其中該 MHC 係經確定與來自該新抗原的新抗原決定位結合；以及 (ii) 向該個體投予治療有效量之表現 T 細胞受體 (TCR) 及/或嵌合抗原受體 (CAR) 的 T 細胞，其中該 TCR 及/或該 CAR 與包含該 MHC 及該新抗原決定位的新抗原決定位-MHC 結合對特異性結合。
一種治療患有表現新抗原及 MHC 的癌症或腫瘤的個體之方法，其中該 MHC 係經確定與來自該新抗原的新抗原決定位結合，該方法包含向該個體投予治療有效量之疫苗，該疫苗包含該新抗原決定位或編碼該新抗原決定位的多核苷酸。
如請求項 71 至 75 中任一項之方法，其中藉由肽交換測定來確定該新抗原決定位與一個或多個 MHC 結合。
如請求項 71 至 76 中任一項之方法，其中該新抗原係藉由腫瘤突變的生物資訊學及/或臨床分析來鑑別。
如請求項 71 至 77 中任一項之方法，其中該新抗原為圖式中之任一者中列出的新抗原。
如請求項 71 至 78 中任一項之方法，其中該新抗原決定位的長度為 8、9、10、11、12 或 13 個胺基酸。
如請求項 71 至 79 中任一項之方法，其中該新抗原決定位與 SEQ ID NO: 1 至 72、75 至 191 及 195 至 222 中之至少一者具有至少 70％序列同一性。
如請求項 71 至 80 中任一項之方法，其中該 MHC 等位基因為 MHCI 等位基因。
如請求項 81 之方法，其中該單等位基因 MHC 表現細胞株表現 β2-微球蛋白 (B2M)。
如請求項 81 之方法，其中該 MHCI 等位基因係由以下基因座中之任一者編碼：HLA-A、HLA-B 及 HLA-C。
如請求項 71 至 83 中任一項之方法，其中該 MHC 等位基因係選自：A*01.01、A*02.01、A*03.01、A*11.01、A*24.02、B*07.02、B*08.01、B*35.01、B*44.02、B*51.01、C*03.04、C*04.01、C*05.01、C*06.02、C*07.01、C*07.02 及 C*08.02。