JP2022534051A - Ｋｒａｓ抗原を標的とする免疫療法コンストラクト - Google Patents
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Abstract
抗原ターゲティング剤が提供される。抗原ターゲティング剤は、ミスセンス変異を組み込んだペプチドがＨＬＡ－Ａ＊０２分子によって提示された場合に、１２位に同ミスセンス変異を有する変異したカーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）タンパク質に結合する。ＫＲＡＳタンパク質の１２位のミスセンス変異は、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶまたはＧ１２Ｃである。抗原ターゲティング剤は、診断的または免疫療法に使用することができる。
Description
本発明のいくつかの実施形態は、癌免疫療法に使用するためのペプチド、タンパク質、核酸、および細胞に関する。本発明のいくつかの実施形態は、抗腫瘍免疫応答を刺激するための変異ＫＲＡＳ抗原を標的とする癌免疫療法剤に関する。本発明のいくつかの実施形態は、腫瘍関連ＫＲＡＳ変異体抗原を標的とするＴ細胞受容体に関する。本発明のいくつかの実施形態は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子を含むＨＬＡ－Ａ＊０２分子によって提示されるＫＲＡＳ抗原を発現する腫瘍を認識するように設計された抗原ターゲティング剤を利用する、免疫療法に基づく癌の治療のための組成物および方法に関する。本発明のいくつかの実施形態は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子を含むＨＬＡ－Ａ＊０２分子によって提示されるＫＲＡＳ抗原を発現する腫瘍を認識するように設計された抗原ターゲティング剤を利用する、免疫療法に基づく癌の治療のための組成物および方法に関する。
有効かつ安全な新しいがん治療法が求められている。また、患者の腫瘍を特徴づけ、腫瘍の発生に病原的な役割を果たしている独特の変異スペクトルに特化したがん治療法も一般的に望まれている。それぞれの患者の腫瘍に特異的な変異の存在は、患者の腫瘍遺伝子型の遺伝子構成に合わせて調整できる個別化された治療アプローチの機会を提供する。
主要組織適合性複合体（「ＭＨＣ」）は、適応免疫系に不可欠な細胞表面タンパク質をコードする一連の遺伝子である。ＭＨＣ分子には、クラスＩとクラスＩＩの２つのクラスがある。ＭＨＣクラスＩ分子は、赤血球を除くすべての有核細胞に発現している。ＭＨＣクラスＩ分子は、細胞性免疫を仲介する機能を有しており、例えば、腫瘍細胞、感染した細胞、または損傷した細胞を破壊するためにフラグを立てる。ＭＨＣクラスＩ分子は、短いペプチド（通常、長さが７～１２アミノ酸）を免疫系に提示するプロセスの一部である。このペプチドは、主に内因性の細胞質または核タンパク質、欠陥のあるリボソーム生成物、および細胞が発現した大きなペプチドがタンパク質分解により切断されたものであることが多い。正常な状態では、細胞傷害性Ｔ細胞は、ＭＨＣ分子が表示するペプチドが細胞内の非自己由来のもの、例えば感染した細胞や癌細胞など、と考えられる場合、ＭＨＣ／ペプチド複合体に結合する。そのような結合が起こった場合、その結合は、アポトーシスによる細胞死に至る細胞傷害性応答を誘発する。
ヒトのＭＨＣ分子は、ヒト白血球抗原（「ＨＬＡ」）として指定されており、これはさらにサブグループ、例えばＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、およびＨＬＡ－Ｃに分けることができる。サブグループＨＬＡ－Ａは、ヒトＭＨＣクラスＩ細胞表面受容体の３つの主要なタイプの１つである。
ＨＬＡ対立遺伝子は、その一次構造が可変である。各ＨＬＡ対立遺伝子は、様々なレベルの解像度でのタイピングによって定義することができる。低解像度のタイピングは、分類の第１フィールド（以前では、歴史的な４桁の分類システムの最初の２桁）のレベルでのＤＮＡベースのタイピング結果である。高解像度タイピングとは、ＨＬＡ分子のペプチド結合領域に対して同じタンパク質配列をコードする一連の対立遺伝子を特定するもので、第２フィールド（歴史的な４桁の分類システムの２番目の２桁）の解像度でＨＬＡ対立遺伝子を特定するものである。アレリック・レゾリューション（ａｌｌｅｌｉｃ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）とは、単一の対立遺伝子に一致するＤＮＡベースのタイピングのことである。分類の構造は、異なるタイピング解像度を反映するために、第１および第２の数字の組（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２）を利用し、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０４はＡ２血清型のメンバーである。この低解像度タイピングはＨＬＡ適合性を決定する主要因子である。
ＨＬＡ－Ａタンパク質は、数百種類のものが知られており、各血清型内の対立遺伝子の頻度は、人種によって異なるとされている。例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１は広く行きわたった対立遺伝子であり、米国白人集団の約５０％、米国アフリカ系アメリカ人集団の１７％に存在することが報告されている：Ａｌｌｅｌｅ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｎｅｔ Ｄａｔａｂａｓｅがオンラインで報告しているＡｌｌｅｌｅ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ｉｎ Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ（世界の人口における対立遺伝子の頻度）。全世界の集団におけるＨＬＡ対立遺伝子の多様性にもかかわらず、抗原を保持するＨＬＡ結合溝ポケットにはいくつかの一貫性がある：非特許文献１。
ＫＲＡＳ遺伝子（カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（Ｋｉｒｓｔｅｎ ｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ））は、Ｋ－Ｒａｓタンパク質をコードしている。Ｋ－Ｒａｓタンパク質は、ＲＡＳ／ＭＡＰＫ経路として知られるシグナル伝達経路の一部であり、細胞外からのシグナルを細胞の核に中継する。これらのシグナルは、細胞が成長・分裂すること、あるいは成熟・分化することを指示する。ＫＲＡＳが変異すると、正常な細胞ががん化する可能性がある。変異したＫＲＡＳは、限定されるものではないが、膵臓癌、大腸癌、肺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、前立腺癌ならびに白血病を含む、ヒトのさまざまな癌に存在し、発現している可能性がある。
変異したＫＲＡＳタンパク質は、癌でしばしば観察される。ＫＲＡＳのアミノ酸配列の１２位は、癌の変異ホットスポットとなっている。例えば、ＫＲＡＳＧ１２Ｄは多くの種類の癌細胞に存在し、膵臓腺癌、大腸腺癌、肺腺癌、結腸直腸腺癌、直腸腺癌で最も多いことが報告されている（非特許文献２）。同様に、ＫＲＡＳＧ１２Ｖは、米国癌研究協会のＧＥＮＩＥ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｅｘｃｈａｎｇｅ）症例の約３％に存在すると報告されており、膵臓腺癌、肺腺癌、大腸腺癌、結腸直腸腺癌、直腸腺癌の有病率が最も高いとされている（非特許文献２）。別の例としては、ＫＲＡＳＧ１２Ｃ変異がＧＥＮＩＥ症例の約２％に存在することが報告されており、肺腺癌、結腸腺癌、非小細胞肺癌、結腸直腸腺癌、原発不明腺癌の有病率が最も高いことがわかっている（非特許文献２）。
北米の癌関連死の第４位の原因である膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を例に注目すると、ＰＤＡＣの腫瘍の多くはＫＲＡＳＧ１２ＤとＫＲＡＳＧ１２Ｖの変異を抱えている。特に、ＰＤＡＣ患者の約５０％にＫＲＡＳＧ１２Ｄ、約３０％にＫＲＡＳＧ１２Ｖの変異が認められる（非特許文献３）。このような変異は、Ｋ－Ｒａｓタンパク質を活性化した状態に固定してしまうため、ほとんど治療できないことがわかっている（すなわち、このような変異バージョンのＫ－Ｒａｓの活性を阻害する小分子は達成しがたいことが分かっている）。
さらに、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ、ＫＲＡＳＧ１２Ｃなど、ＫＲＡＳのアミノ酸の１２位の変異を含むＫＲＡＳ変異は、発癌の初期に発生するドライバー変異であり、癌遺伝子の中毒性により腫瘍細胞に保持される：非特許文献４。このように、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ、ＫＲＡＳＧ１２ＶおよびＫＲＡＳＧ１２Ｃを含むＫＲＡＳＧ１２変異抗原は、癌のスクリーニングおよび／または治療のための魅力的なターゲットである。
いくつかのＫＲＡＳ抗原／ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子に結合して、それによってＭＨＣ／ペプチド複合体を形成することができる。このＭＨＣ／ペプチド複合体は、細胞傷害性細胞の適切な抗原標的部位、例えば細胞傷害性Ｔ細胞のＴ細胞受容体によって認識され、抗腫瘍免疫応答を刺激することができる。
細胞傷害性Ｔ細胞を用いたＴ細胞療法（例えばＴＣＲ療法）を実施するために使用できるＴ細胞受容体に加えて、キメラ抗原受容体（例えばＣＡＲ－Ｔ療法を介して）などの他のタイプの抗原ターゲティング受容体を、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの細胞傷害性細胞腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用いる細胞性免疫療法を用いて、癌の診断、予防、および／または治療に用いることができる。このような細胞および抗原ターゲティング受容体は、養子細胞療法を介して、同種異系細胞などとして患者に投与することができる。
変異したＫ－Ｒａｓタンパク質を発現する細胞を標的とし、そのような細胞を選択的に死滅させることを支援することができる免疫原性薬剤は、癌の診断、治療および／または予防に有効である可能性がある。
上述した関連技術の例およびそれに関連する制限は、例示を意図したものであり、排他的なものではない。関連技術の他の制限は、本明細書を読み、図面を検討することにより、当業者に明らかになるであろう。
セッテ（Ｓｅｔｔｅ）Ａ、シドニー（Ｓｉｄｎｅｙ）Ｊ．、「Ｎｉｎｅ ｍａｊｏｒ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ｓｕｐｅｒｔｙｐｅｓ ａｃｃｏｕｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｖａｓｔ ｐｒｅｐｏｎｄｅｒａｎｃｅ ｏｆ ＨＬＡ－Ａ ａｎｄ －Ｂ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（９つの主要なＨＬＡクラスＩスーパータイプが、ＨＬＡ－Ａおよび－Ｂの多型の大部分を占めている）」、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．、１９９９；５０：２０１－２１２．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００２５１００５０５９４
Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．、２０１７；７（８）：８１８－８３１、データセットバージョン６
ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ），Ｓ．他、「Ｃｏｒｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃａｒｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｇｌｏｂａｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ．（グローバルなゲノム解析によって明らかにされたヒト膵臓癌のコアシグナル伝達経路。）」Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２１、１８０１－６（２００８）
ワインシュタイン（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ），Ｉ．Ｂ．、「Ｃａｎｃｅｒ． Ａｄｄｉｃｔｉｏｎ ｔｏ ｏｎｃｏｇｅｎｅ－ｔｈｅ Ａｃｈｉｌｌｅｓ ｈｅａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ（癌。癌遺伝子への依存－癌のアキレス腱）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７、６３－４（２００２）
以下の実施形態およびその態様は、範囲を限定するものではなく、例示的であることを意図したシステム、ツール、および方法と併せて説明および図示されている。様々な実施形態において、上記の問題のうちの１つ以上が低減または排除されているが、他の実施形態は、他の改善に向けられている。
本発明の一態様は、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ／Ｖ／Ｃペプチド－ＭＨＣクラスＩ分子複合体に特異的に結合するように構成された抗原結合部位を有する抗原結合受容体を提供する。いくつかの実施形態において、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ／Ｖ／Ｃペプチドは、配列番号２、配列番号３または配列番号４のいずれか１つのアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩ分子はＨＬＡ－Ａ＊０２である。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩ分子はＨＬＡ－Ａ＊０２：０１である。
本発明の一態様は、ミスセンス変異を組み込んだペプチドがＨＬＡ－Ａ＊０２分子によって提示された場合に１２位に同ミスセンス変異を有する変異したカーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（Ｋｉｒｓｔｅｎ ｒａｔ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒａｌ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｈｏｍｏｌｏｇ）（ＫＲＡＳ）タンパク質に結合する抗原ターゲティング剤を提供する。
いくつかの実施形態において、ＫＲＡＳタンパク質の１２位のミスセンス変異は、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶまたはＧ１２Ｃである。
いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２分子はＨＬＡ－Ａ＊０２：０１である。
いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２分子はＨＬＡ－Ａ＊０２：０１である。
いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング剤は、第１の鎖および第２の鎖を有し、第１の鎖および第２の鎖のそれぞれ１つは、第１、第２および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。第１の鎖の第３のＣＤＲは、配列番号３０または配列番号３４のアミノ酸配列を有しており、第２の鎖の第３のＣＤＲは、配列番号３２または配列番号３６のアミノ酸配列を有している。
いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング剤は、ＴＲＡＶ２７＊０１（配列番号：６）のアミノ酸配列またはＴＲＡＶ１３－２＊０１（配列番号：１０）のアミノ酸配列を有する第１の鎖を有する。
いくつかの実施形態において、抗原ターゲィング剤は、ＴＲＢＶ １９＊０１（配列番号８）のアミノ酸配列またはＴＲＢＶ ０４－１＊０１（配列番号１２）のアミノ酸配列を有する第２の鎖を有する。
いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング剤は、配列番号１４または配列番号１８のアミノ酸配列を有する第１のＣＤＲを有する第１の鎖を有する。
いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング剤は、配列番号１６または配列番号２０のアミノ酸配列を有する第２のＣＤＲを有する第１の鎖を有する。
いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング剤は、配列番号１６または配列番号２０のアミノ酸配列を有する第２のＣＤＲを有する第１の鎖を有する。
いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング剤は、配列番号２２または配列番号２６のアミノ酸配列を有する第１のＣＤＲを有する第２の鎖を有する。
いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング剤は、配列番号２４または配列番号２８のアミノ酸配列を有する第２のＣＤＲを有する第２の鎖を有する。
いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング剤は、配列番号２４または配列番号２８のアミノ酸配列を有する第２のＣＤＲを有する第２の鎖を有する。
いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング剤は、（ｉ）それぞれ、その第１、第２および第３のＣＤＲとしてそれぞれ配列番号１４、配列番号１６および配列番号３０を有する第１の鎖と、それぞれ、その第１、第２および第３のＣＤＲとして配列番号２２、配列番号２６および配列番号３２を有する第２の鎖と、（ｉｉ）それぞれ、その第１、第２および第３のＣＤＲとして配列番号１８、配列番号２０および配列番号３４を有する第１の鎖と、それぞれ、第１、第２および第３のＣＤＲとして配列番号２２、配列番号２４および配列番号３２を有する第２の鎖と、（ｉｉｉ）それぞれ、その第１、第２および第３のＣＤＲとして配列番号１４、１６および３０に有する第１の鎖と、それぞれ、その第１、第２および第３のＣＤＲとして配列番号２６、２８及び３６を有する第２の鎖と；または（ｉｖ）それぞれ、その第１、第２および第３のＣＤＲとして配列番号１８、配列番号２０および配列番号３４を有する第１の鎖と、それぞれ、その第１、第２および第３のＣＤＲとして配列番号２６、配列番号２８および配列番号３６として有する第２の鎖と、を有する。
いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング剤は、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ変異を標的とし、第１の鎖のＣＤＲ３は、配列番号３０のアミノ酸配列を有し、第２の鎖のＣＤＲ３は、配列番号３２のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング剤はＫＲＡＳＧ１２Ｄ変異を標的とし、第１の鎖のＣＤＲ３は配列番号３４のアミノ酸配列を有し、第２の鎖のＣＤＲ３は配列番号３２のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング剤はＫＲＡＳＧ１２Ｄ変異を標的とし、第１の鎖のＣＤＲ３は配列番号３０のアミノ酸配列を有し、第２の鎖のＣＤＲ３は配列番号３６のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング剤の第１および第２の鎖は、一本鎖ポリペプチドを形成するか、または抗原ターゲティング剤の第１および第２の鎖は、２つの別々のポリペプチドを形成する。
いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング剤の第１および第２の鎖は、第１および第２の鎖がインビボで２つの別々のポリペプチドに切断されるか、または発現されるように、第１および第２の鎖を介在させる適切な配列を有する一本鎖ポリペプチドとして発現されるように構成される。適切な配列は、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２ＡまたはＩＲＥＳ配列であり得る。
いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング剤は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。いくつかのそのような実施形態において、第１の鎖はＴＣＲのα鎖であり、第２の鎖はＴＣＲのβ鎖である。他のそのような実施形態において、第１の鎖はＴＣＲのγ鎖であり、第２の鎖はＴＣＲのδ鎖である。
いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング剤はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり、第１の鎖および第２の鎖のそれぞれの３つの相補性決定領域は、共刺激性ドメインとともに一本鎖ポリペプチドとして発現されるように構成される。
いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング剤は二重特異性抗体であり、二重特異性抗体は、ミスセンス変異を組み込んだペプチドがＨＬＡ－Ａ＊０２分子によって提示された場合に、１２位に同ミスセンス変異を有するＫＲＡＳタンパク質に結合する抗原結合部位を有する第１のドメインと、細胞傷害性細胞に結合するように構成された抗原結合部位を有する第２のドメインとを有する。いくつかのそのような実施形態において、二重特異性抗体の第２のドメインは、ＣＤ３に結合する。
本発明の別の態様は、配列番号３８、４０、４２または４４のいずれか１つのアミノ酸配列を有するＴ細胞受容体を提供する。
本発明の別の態様は、本明細書に記載の抗原ターゲティング剤またはＴ細胞受容体をコードするＤＮＡ配列を有する単離された核酸分子を提供する。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号３７、３９、４１、４３、４５、４６、４７または４８のいずれか１つのヌクレオチド配列を有する。
本発明の別の態様は、本明細書に記載の抗原ターゲティング剤またはＴ細胞受容体をコードするＤＮＡ配列を有する単離された核酸分子を提供する。いくつかの実施形態において、単離された核酸分子は、配列番号３７、３９、４１、４３、４５、４６、４７または４８のいずれか１つのヌクレオチド配列を有する。
本発明の別の態様は、本明細書に記載の抗原結合剤または設計された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）Ｔ細胞受容体を発現することができる細胞傷害性細胞を提供する。
本発明の別の態様は、ＨＬＡ－Ａ＊０２分子によって提示される１２位にミスセンス変異を有するＫＲＡＳペプチドを標的とする抗原ターゲティング受容体を発現することができる細胞傷害性細胞を製造する方法を提供する。この方法は、供給源（ｓｏｕｒｃｅ）から細胞傷害性細胞を単離し、本明細書に記載のヌクレオチドベクターを用いて免疫細胞を遺伝子工学的に操作すること（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を含む。この細胞を使用して、自己または同種の（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）養子細胞療法を行うことができる。
本発明の別の態様は、ＨＬＡ－Ａ＊０２分子によって提示される１２位にミスセンス変異を有するＫＲＡＳペプチドを標的とする抗原ターゲティング受容体を発現することができる細胞傷害性細胞を製造する方法を提供する。この方法は、供給源（ｓｏｕｒｃｅ）から細胞傷害性細胞を単離し、本明細書に記載のヌクレオチドベクターを用いて免疫細胞を遺伝子工学的に操作すること（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を含む。この細胞を使用して、自己または同種の（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）養子細胞療法を行うことができる。
いくつかの実施形態において、方法は、対象からのサンプルの配列を決定して、１２位にミスセンス変異を有するＫＲＡＳの存在を確認すること、および／またはＨＬＡタイピングを行って、対象者がＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子を有することを確認することを含む。ＨＬＡタイピングは、対象がＨＬＡ－Ａ＊０２：０１対立遺伝子を有することを確認するために使用されてもよい。
別の態様は、哺乳動物における癌の検出方法を提供する。同方法は、細胞を含むサンプルを本明細書に記載の抗原ターゲティング剤と接触させることを含み、細胞がＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原を発現している場合、抗原ターゲティング剤はＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原に結合し、それによって複合体を形成し；そして複合体の存在が検出され、同複合体の存在は哺乳動物における癌を示す。
別の態様は、哺乳動物における癌の検出方法を提供する。同方法は、対象からサンプルを得ること；サンプルからの細胞を、ＨＬＡ－Ａ＊０２分子によって表示されるＫＲＡＳＧ１２Ｘペプチドに結合することができる細胞傷害性細胞と共培養すること；および細胞毒性活性の指標を評価することを含む。細胞毒性活性の指標の存在または細胞毒性活性の指標のレベルの上昇は、ＫＲＡＳタンパク質の１２位での突然変異が関与する癌を示す。
本発明の別の態様は、ＫＲＡＳエピトープを認識する設計されたＴＣＲを用いて癌患者を治療する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、設計されたＴＣＲは、配列番号３８、４０、４２および４４のアミノ酸配列を有する可変領域および／またはＣＤＲの任意の対の組み合わせを有するα鎖およびβ鎖を有する。
いくつかの実施形態において、設計されたＴＣＲは、配列番号３８、４０、４２および４４のアミノ酸配列を有する可変領域および／またはＣＤＲの任意の対の組み合わせを有するα鎖およびβ鎖を有する。
いくつかの実施形態において、設計されたＴＣＲαおよびβ鎖とＴ細胞の内因性ＴＣＲαおよびβ鎖との誤対合を制限するために、ヒト定常遺伝子セグメントの代わりに、ネズミ定常遺伝子セグメントが本発明のＴＣＲαおよびβ鎖に組み込まれる。
本発明の別の態様は、本発明のＴＣＲ、ポリペプチドおよびタンパク質に関連する、関連した核酸、組換えベクター、宿主細胞、細胞の集団および医薬組成物を提供する。
腫瘍ＫＲＡＳ変異スクリーニング、ＨＬＡタイピングまたは患者スクリーニングの他の方法に基づいて、本発明による治療に反応する患者を同定する方法も本発明によって提供される。
腫瘍ＫＲＡＳ変異スクリーニング、ＨＬＡタイピングまたは患者スクリーニングの他の方法に基づいて、本発明による治療に反応する患者を同定する方法も本発明によって提供される。
哺乳動物における癌の存在を検出する方法、および哺乳動物における癌を治療または予防する方法は、さらに本発明によって提供される。
上記の例示的な態様および実施形態に加えて、さらなる態様および実施形態は、図面を参照し、以下の詳細な説明を検討することによって明らかになるであろう。
上記の例示的な態様および実施形態に加えて、さらなる態様および実施形態は、図面を参照し、以下の詳細な説明を検討することによって明らかになるであろう。
例示的な実施形態は、図面の参照図に示されている。本明細書に開示される実施形態および図は、限定的ではなく例示的であると見なされるべきであることが意図されている。
以下の説明では、当業者がより深く理解できるように、具体的な内容が示されている。しかしながら、よく知られている要素は、本開示を不必要に不明瞭にすることを避けるために、詳細に示されたり説明されたりしていない場合がある。したがって、本明細書および図面は、制限的な意味ではなく、例示的な意味でみなされるべきである。
以下の説明では、当業者がより深く理解できるように、具体的な内容が示されている。しかしながら、よく知られている要素は、本開示を不必要に不明瞭にすることを避けるために、詳細に示されたり説明されたりしていない場合がある。したがって、本明細書および図面は、制限的な意味ではなく、例示的な意味でみなされるべきである。
本明細書で使用されるように、「ＣＤ８＋Ｔ－細胞」および「ＴＣＤ８＋」という用語は、ＣＤ８陽性Ｔ－細胞を指す。ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子によってフラグが立てられた細胞を認識して破壊することができ、この能力はＭＨＣクラスＩ－拘束性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）として知られている。ＣＤ８陽性Ｔ細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌｓ（ＣＴＬ））も含まれる。同様に、「ＣＤ４＋Ｔ細胞」は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞を指す。
本明細書で使用する場合、「抗原」という用語は、免疫応答を誘発することができる分子を指す。例えば、抗原は、抗腫瘍免疫応答を刺激するために細胞傷害性Ｔ細胞によって認識可能なものであってもよい。
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、免疫応答を刺激することができる抗原の部分を指す。例えば、エピトープは、ＭＨＣクラスＩ分子に結合してそれによりＭＨＣ／ペプチド複合体を形成するペプチドである可能性がある。このＭＨＣ／ペプチド複合体は、細胞傷害性Ｔ細胞の適切なＴ細胞受容体によって選択的に認識され、抗腫瘍免疫応答を刺激することができる。
本明細書で使用する場合、用語「ＤＮＡ」はデオキシリボ核酸を指す。ＤＮＡに保存されている情報は、一般的に４つの化学的塩基（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ））からなる配列としてコード化されている。他の塩基や化学的に修飾された塩基も同様に存在し、特定の実施形態に包含される。本明細書で使用される場合、ＤＮＡ配列への言及は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡの両方を含む。特定の配列とは、（ｉ）そのような配列の一本鎖ＤＮＡ、（ｉｉ）そのような配列の一本鎖ＤＮＡとその相補体からなる二本鎖ＤＮＡ、および（ｉｉｉ）そのような配列の相補体を指す。
本明細書で使用する場合、「フラグメント」という用語は、より大きな全体の一部分を意味する。ＤＮＡコーディング配列の文脈では、フラグメントとは、完全なコーディング領域よりも少ないＤＮＡ配列の一部分を意味する。しかしながら、フラグメントの発現産物は、完全なコーディング配列の発現産物と実質的に同じ生物学的機能を保持していてもよい。
本明細書で使用する場合、「ペプチド」という用語は、隣接するアミノ酸のアルファ－アミノ基とカルボニル基の間のペプチド結合によって互いに連結された一連のアミノ酸残基を意味する。ペプチドは、免疫原性を有していてもよく、これは、ペプチドが免疫応答、例えばＴ細胞応答を誘発することができることを意味する。
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、材料がその元の環境から分離／除去されることを意味する。たとえば、自然環境、例えば血液から取り出されたＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：ＫＲＡＳＧ１２Ｄ＆Ｖ反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞が単離される。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：ＫＲＡＳＧ１２Ｄ＆Ｖ－反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、膵臓癌患者内のその自然環境を提示するが、単離されない。
本明細書で使用する場合、「精製された」という用語は、絶対的な純度を意味しない。その代わりに、精製工程を経た製剤、例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の純度を有する高度に精製された製剤および部分的に精製された製剤を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞応答」という用語は、エフェクターＴ細胞の増殖および活性化を意味する。例えば、ＭＨＣクラスＩ拘束性細胞傷害性Ｔ細胞のＴ細胞応答は、標的細胞の溶解、サイトカインの分泌、およびエフェクター分子（例えば、パーフォリンおよびグランザイム）の分泌を含み得る。
本明細書で使用される場合、「バリアント（ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、タンパク質の文脈において、１つ、２つ、またはそれ以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基と置換されているが、バリアントは変更されていないタンパク質と実質的に同じ生物学的機能を保持していることを意味する。
「治療する」、「治療すること」および「治療」という用語は、所望の臨床結果を得るためのアプローチを意味する。望ましい臨床結果には、疾患の少なくとも１つの症状の軽減または緩和が含まれ得るが、これらに限定されない。例えば、治療は、疾患の少なくとも１つの症状の減少、疾患の程度の減少、疾患状態の安定化、疾患の拡散の防止、疾患の進行の遅延または減速、疾患の緩和、疾患の再発の減少、疾患の寛解、疾患での生存期間の延長、または疾患の完全な根絶であり得る。
「癌細胞」および「腫瘍細胞」という用語は、その成長および分裂が典型的には制御されていないものとして特徴づけられる細胞を指す。癌細胞は、良性および悪性の癌、転移性および非転移性の癌、ならびに原発性および続発性の癌を含む、任意の起源のものでありうる。
本明細書で使用する場合、「ＫＲＡＳＧ１２Ｘ」という用語は、ＫＲＡＳコドン位置１２におけるＫＲＡＳミスセンス変異体（ｍｕｔａｎｔ）を指す。本明細書で使用される場合、「ＫＲＡＳＧ１２Ｄ＆Ｖ」という用語は、ＫＲＡＳＧ１２ＤおよびＫＲＡＳＧ１２Ｖ変異ＫＲＡＳ、すなわち、野生型のグリシン残基がそれぞれアスパラギン酸残基またはバリンに変異している１２位にミスセンス変異を有するＫＲＡＳを指す。「ＫＲＡＳＧ１２Ｃ」は、１２位の野生型グリシン残基がシステイン残基に変異しているＫＲＡＳを指す。
一実施形態において、本発明者らは、抗腫瘍免疫応答を刺激するために使用することができる、ＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原／変異体を標的とする抗原ターゲティング受容体を発見した。いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング受容体は、Ｔ細胞受容体である。Ｔ細胞受容体は、ＭＨＣクラスＩ分子のサブクラスＨＬＡ－Ａ＊０２：０１によって提示されるＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原／変異体ペプチドを認識して結合するように操作されている（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）。多くのがん細胞がＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原／変異体を発現しており、またＨＬＡ－Ａ＊０２：０１は非常に普及しているＨＬＡ－Ａサブタイプであるため、いくつかの実施形態の新規な抗原ターゲティング受容体は、患者集団の大きなセグメントにおける癌のスクリーニング、治療および予防に使用することができる。例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞などの細胞傷害性細胞を、例えばＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）として、新規な抗原ターゲティング受容体を発現するように操作してもよい。ＴＣＲまたはＣＡＲが、腫瘍細胞上に発現し、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１によって提示されるＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原を認識して結合すると、ＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化され、例えば、腫瘍細胞の溶解、サイトカインの分泌、および／またはエフェクター分子（例えば、パーフォリンおよびグランザイム）の分泌によって、腫瘍細胞を死滅させることができる。
抗原ターゲティング剤
本発明のいくつかの実施形態は、抗原ターゲティング受容体を含む、抗原ターゲティング剤に関するものである。これらの抗原ターゲティング剤は、ＨＬＡ－Ａ＊０２分子によって提示されるＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原を標的にして、例えば、Ｔ細胞などの細胞傷害性細胞を腫瘍細胞に隣接して配置して、細胞傷害性細胞による腫瘍細胞の殺傷を促進するなど、抗腫瘍免疫応答を刺激するように構成される。いくつかの実施形態において、これらの抗原ターゲティング剤は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子によって提示されるＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原を標的とするように構成される。
本発明のいくつかの実施形態は、抗原ターゲティング受容体を含む、抗原ターゲティング剤に関するものである。これらの抗原ターゲティング剤は、ＨＬＡ－Ａ＊０２分子によって提示されるＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原を標的にして、例えば、Ｔ細胞などの細胞傷害性細胞を腫瘍細胞に隣接して配置して、細胞傷害性細胞による腫瘍細胞の殺傷を促進するなど、抗腫瘍免疫応答を刺激するように構成される。いくつかの実施形態において、これらの抗原ターゲティング剤は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子によって提示されるＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原を標的とするように構成される。
いくつかの実施形態において、これらの抗原ターゲティング剤は、ＨＬＡ－Ａ＊０２分子によって示されるＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原に特異的であり、これは、この抗原ターゲティング剤が高いアビディティ（ａｖｉｄｉｔｙ）でＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原に特異的に結合し、免疫学的に認識できることを意味する。例えば、抗原ターゲティング剤を組み込んだＴＣＲを発現するＴ細胞が、ＫＲＡＳの１２位に関連する標的突然変異を有するＫＲＡＳＧ１２Ｘペプチドを用いてパルスしたＨＬＡ－Ａ＊０２：０１陽性抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１を発現するように改変されたＫ５６２ｂ細胞）との共培養において、陰性対照によって発現されたＩＦＮγの量と比較して、少なくとも２倍以上のＩＦＮγを分泌する場合、抗原ターゲティング剤は、ＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原に対して抗原特異性を有すると考えられ得る。ＩＦＮγの分泌量は、例えば、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）などの当技術分野で知られている方法で測定することができる。
いくつかの実施形態において、標的となるＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原は、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ／Ｖ／Ｃ抗原である。野生型ＫＲＡＳ（ＫＲＡＳＷＴ）は、配列ＫＬＶＶＶＧＡＧＧＧＶ（配列番号１）を有する１０個のアミノ酸のフラグメントを含む。いくつかの実施形態において、標的ＫＲＡＳＧ１２Ｄ／Ｖ抗原は、配列番号２（ＫＬＶＶＧＡＶＧＶ、１２位にＧ１２Ｖのミスセンス変異を有するＫＲＡＳに対応するペプチド、本明細書においてＫＲＡＳＧ１２Ｖと称する）および配列番号３（ＫＬＶＶＧＡＤＧＶ、１２位にＧ１２Ｄのミスセンス変異を有するＫＲＡＳに対応するペプチド、本明細書においてＫＲＡＳＧ１２Ｄと称する）に記載されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、標的ＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原は、配列番号４（ＫＬＶＶＧＡＣＧＶ、１２位にＧ１２Ｃのミスセンス変異を有するＫＲＡＳに対応するペプチド）に記載されたアミノ酸配列を有するＫＲＡＳＧ１２Ｃ抗原である。
いくつかの実施形態において、標的ＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原は、配列番号２～４のバリアント、または長さが変化するＫＲＡＳの１２位にミスセンス突然変異を組み込んでいる他のペプチドであり、例えば、ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端においてＫＲＡＳタンパク質からの１、２、３、４または５個の付加的なアミノ酸を含有するもの、および／またはペプチドのＮ末端においてＫＲＡＳタンパク質からの１、２または３個のより少ないアミノ酸および／またはＣ末端において１または２個のより少ないアミノ酸を含有するものである。いくつかの実施形態において、標的抗原は、ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に追加のアミノ酸を有し、例えば、ペプチドのＮ末端に１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの追加のアミノ酸を有し、および／またはペプチドのＣ末端に１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの追加のアミノ酸を有する。いくつかの実施形態において、標的抗原は、ペプチドのＮ－末端および／またはＣ－末端により少ないアミノ酸を有し、例えば、ペプチドのＮ－末端でＫＲＡＳタンパク質から１、２または３個のアミノ酸が取り除かれ、および／またはペプチドのＣ－末端で１または２個のアミノ酸が取り除かれている。いくつかの実施形態において、標的となるＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原は、ＫＲＡＳの１２位にミスセンス変異を組み込んだ８－ｍｅｒ、９－ｍｅｒ、１０－ｍｅｒ、１１－ｍｅｒ、１２－ｍｅｒ、１３－ｍｅｒ、１４－ｍｅｒ、１５－ｍｅｒまたは１６－ｍｅｒのペプチドである。
いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング剤は、ＨＬＡ－Ａ＊０２分子によって細胞表面に提示されるＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原に特異的な抗原結合部位を有する。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２分子はＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子である。
いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング剤は、細胞傷害性細胞を腫瘍細胞に標的化する。例えば、いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング剤は、コンストラクトを組み込んだＴ細胞を、ＫＲＡＳの１２位での標的ミスセンス変異を発現する腫瘍細胞にターゲティングするＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である。いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング剤は、Ｔ細胞などの細胞傷害性細胞をＫＲＡＳの１２位の標的ミスセンス変異を発現する腫瘍細胞にターゲティングするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング剤は、ＨＬＡ－Ａ＊０２分子によって提示される標的ＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原に結合して同剤を腫瘍細胞に標的化する第１の抗原結合ドメインと、細胞傷害性細胞を標的化する第２の抗原結合ドメイン、例えばＣＤ３に結合してＴ細胞を腫瘍細胞に標的化する第２の抗原結合ドメインとを有する二重特異性抗体などの薬剤である。
細胞傷害性細胞を腫瘍細胞に標的化するために使用することができる任意のタイプの免疫療法剤を、様々な実施形態で使用することができる。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２分子によって細胞表面に提示されるＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原と、Ｔ細胞などの細胞傷害性細胞を二重特異性抗体によって結合された腫瘍細胞に標的化するために使用できるＣＤ３などの因子の両方に結合する二重特異性抗体を使用することができる。いくつかの実施形態において、細胞性免疫療法を行うために用いることができる抗原ターゲティング受容体を用いることができる。いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）である。いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング受容体は、ＴＣＲの一本鎖抗原結合ドメインをＣＡＲ分子のシグナル伝達ドメインに融合させたＴＣＲ－ＣＡＲコンストラクトの改変形態である。
いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング剤はＴＣＲである。ＴＣＲは、（ｉ）第１、第２および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を有する第１の鎖と、（ｉｉ）第１、第２および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を有する第２の鎖とを有する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲの第１の鎖および第２の鎖は、それぞれ、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲの第１の鎖および第２の鎖は、それぞれ、ＴＣＲのγ鎖およびδ鎖である。理論に拘束されることなく、第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）は、ＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原の結合および特異性において重要な役割を果たすと考えられており、一方、第１および第２の相補性決定領域（ＣＤＲ１およびＣＤＲ２）は、ＭＨＣクラスＩバックボーンへの結合（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２分子への結合）において役割を果たすと考えられている。ＴＣＲの配列は、抗体の配列と同様に、体細胞のＶＤＪ組み換えによって生成され、非常に確率の高いもの（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ）である。
合成ＴＣＲの設計および構造は、一般に当技術分野で知られている。いくつかの実施形態において、合成ＴＣＲの第１の鎖および第２の鎖のそれぞれは、以下のドメイン：ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインのうちの１つまたは複数を有する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲの細胞内ドメインは、直接シグナルを発しないが、むしろシグナル伝達を促進するＣＤ３サブユニットなどの他の分子と複合体を形成する。
抗原ターゲティング剤がＴ細胞受容体であるいくつかの実施形態において、抗原ターゲティング剤は、ＴＣＲの両鎖を一本鎖ポリペプチドとして発現することができるヌクレオチドコンストラクトから発現される。いくつかの実施形態において、一本鎖ポリペプチドは、Ｔ細胞受容体の第１の鎖および第２の鎖を連結するリンカーペプチドを有する。リンカーペプチドは、宿主細胞における組換えＴＣＲの発現を促進することができる。
いくつかの実施形態において、合成ＴＣＲの第１の鎖と第２の鎖の両方を組み込んだ一本鎖ポリペプチドは、ＴＣＲの第１の鎖と第２の鎖の間に介在する切断配列を含み、第１の鎖と第２の鎖が一本鎖ポリペプチドとして発現された後、インビボで２つの別々のポリペプチドに切断されるようにする。いくつかの実施形態において、ＴＣＲを形成するポリペプチドをコードする核酸は、ＴＣＲの第１の鎖と第２の鎖をコードする核酸の間に介在する、スキップ配列、またはｍＲＮＡ分子の５’末端以外の部位での翻訳の開始を可能にする配列、または２つの異なるポリペプチドが一本鎖ｍＲＮＡから翻訳されることを可能にする他の任意の配列を含む。この目的のために、ＴＣＲの第１の鎖と第２の鎖との間の任意の適切な配列、例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、またはＩＲＥＳ配列などを使用することができる。
ＴＣＲをコードするポリヌクレオチド配列および得られるポリペプチドにおける合成ＴＣＲの第１の鎖および第２の鎖の順序は交換可能である（すなわち、いくつかの実施形態では第１の鎖はポリヌクレオチド配列の５’末端／ポリペプチドのＮ末端方向に設けられ、一方、他の実施形態では第２の鎖がポリヌクレオチド配列の５’末端／ポリペプチドのＣ末端方向に設けられている）。いくつかの実施形態において、α鎖（Ｖα）およびβ鎖（Ｖβ）の可変ドメインは、配列番号３８、４０、４２および４４のアミノ酸配列を有する可変領域および／またはＣＤＲの任意の対の組み合わせからなる。
いくつかの実施形態において、第１の鎖および第２の鎖、例えばα鎖（Ｃα）およびβ鎖（Ｃβ）の定常ドメイン（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｏｍａｉｎｓ）は、ヒト定常遺伝子セグメントからなる。他の実施形態において、ヒト定常遺伝子セグメントは、異なる生物からの定常遺伝子セグメント、例えば、マウス定常遺伝子セグメントで置換される。このような置換の利点は、設計されたＴＣＲ鎖、例えばα鎖およびβ鎖と、Ｔ細胞の内因性Ｔ細胞受容体鎖、例えばα鎖およびβ鎖との誤対合を制限することである。
いくつかの実施形態において、第１の鎖および第２の鎖の定常ドメインは、その間の相互作用を強化および／または調節するために、任意の適切な方法でさらに修飾される。例えば、インビボで互いに隣接して配置されている第１の鎖および第２の鎖のそれぞれの膜貫通ドメインの残基をシステイン残基に変更して、設計された第１の鎖および第２の鎖の間で追加のジスルフィド結合の形成を促してもよい（一方、そのようなジスルフィド結合は内因性のＴ細胞受容体鎖において形成されない）。
いくつかの実施形態において、ＴＣＲの第１の鎖と第２の鎖の間でダイマーを形成するためにＴＣＲ定常ドメインを使用する代わりに、合成ＴＣＲは、２つの鎖の二量体化をサポートする任意の他の適切なタンパク質ドメイン、例えばロイシンジッパードメインを備える。
いくつかの実施形態において、α鎖のＣＤＲ３は、配列番号３０に記載されたアミノ酸配列または配列番号３４に記載されたアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、β鎖のＣＤＲ３は、配列番号３２に記載されたアミノ酸配列または配列番号３６に記載されたアミノ酸配列を有する。
第１および第２の相補性決定領域（ＣＤＲ１およびＣＤＲ２）は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子を含むＨＬＡ－Ａ＊０２分子が提示するＫＲＡＳＧ１２Ｘペプチドと係合するように構成されている限り、任意のアミノ酸配列を有することができる。例えば、いくつかの実施形態において、α鎖のＣＤＲ１は、配列番号１４に記載されたアミノ酸配列または配列番号１８に記載されたアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、α鎖のＣＤＲ２は、配列番号１６に記載されたアミノ酸配列または配列番号２０に記載されたアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、β鎖のＣＤＲ１は、配列番号２２に記載のアミノ酸配列または配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、β鎖のＣＤＲ２は、配列番号２４に記載されたアミノ酸配列または配列番号２８に記載されたアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、（ｉ）配列番号１４、配列番号１６および配列番号３０に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有する第１、第２および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を有するα鎖と、（ｉｉ）配列番号２２、配列番号２４および配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有する第１、第２および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を有するβ鎖と、を含む。
他の実施形態において、ＴＣＲは、（ｉ）配列番号１８、配列番号２０および配列番号３４に記載されたアミノ酸配列をそれぞれ有する第１、第２および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を有するα鎖と、（ｉｉ）配列番号２２、配列番号２４および配列番号３２に記載されたアミノ酸配列を有する第１、第２および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を有するβ鎖とを含む。
他の実施形態において、ＴＣＲは、（ｉ）配列番号１４、配列番号１６および配列番号３０に記載されたアミノ酸配列をそれぞれ有する第１、第２および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を有するα鎖と、（ｉｉ）配列番号２６、配列番号２８および配列番号３６に記載されたアミノ酸配列を有する第１、第２および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を有するβ鎖とを含む。
他の実施形態において、ＴＣＲは、（ｉ）配列番号１８、配列番号２０および配列番号３４に記載のアミノ酸配列をそれぞれ有する第１、第２および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を有するα鎖と、（ｉｉ）配列番号２６、配列番号２８および配列番号３６に記載のアミノ酸配列を有する第１、第２および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を有するβ鎖と、を含む。
いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング剤は、一本鎖ポリペプチドとして、または２つの別個のポリペプチドとして形成されてもよい第１および第２の鎖を有し、第１および第２の鎖のそれぞれはＣＤＲを有し、ＣＤＲは独立して、表４に記載されたＣＤＲの配列の任意の組み合わせを有している。
いくつかの実施形態において、設計された抗原ターゲティング受容体は、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２または配列番号４４に記載されているアミノ酸配列のいずれかを有する。
いくつかの実施形態において、設計された抗原ターゲティング受容体は、配列番号４５、４６、４７または４８のいずれか１つのプラスミドのヌクレオチド配列を有するウイルスベクターを用いてＴ細胞に形質導入される。
いくつかの実施形態において、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖は交換可能であり、すなわち、適切な発現ベクターから任意の所望の順序で発現させることができる。α鎖（Ｖα）およびβ鎖（Ｖβ）の可変ドメインは、配列番号３８、４０、４２および４４の配列の可変領域および／またはＣＤＲの任意の対の組み合わせからなる。
このようなコンストラクトの適切なバリエーションは、当業者によって作製することができ、例えば、Ｔ細胞受容体の抗原結合ドメインを、典型的なｓｃＦｖフラグメントの代わりにＣＡＲコンストラクトに一緒に挿入して、一本鎖の抗原結合ドメインがＣＡＲコンストラクトのシグナル伝達ドメインと相互作用して、癌細胞に対する所望の細胞毒性活性を引き起こすようにすることができる。
いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング剤は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。そのような実施形態において、ＣＡＲは、一本鎖ポリペプチドとして一緒に結合され、単一のヒンジ領域、膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメイン、ならびに適切な共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＭＹＤ８８、ＩＬ１Ｒ１、ＣＤ７０など）、ならびにＣＡＲコンストラクトの特徴を増強することを意図した任意の他のドメインに一緒に連結された、ＴＣＲ（各々は、ＴＣＲコンストラクトについて上述した相補性決定領域のいずれであってもよい３つの相補性決定領域を有する）の第１の鎖および第２の鎖（例えばα鎖およびβ鎖）を有する、上記のＴＣＲ結合ドメインと同等の一本鎖抗原結合ドメインを提供するように構造化される。
いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング剤は二重特異性抗体であり、二重特異性抗体は、Ｔ細胞を動員するために使用することができるＣＤ３などの因子に結合する第１の抗原結合ドメインと、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子を含むＨＬＡ－Ａ＊０２分子によって表示されるＫＲＡＳＧ１２Ｘ変異体ペプチドに結合する第２の抗原結合ドメインとを有している。一例の実施形態において、二重特異性抗体の第２のドメインは、本明細書に記載のＴＣＲの第１の鎖および第２の鎖（例えばα鎖およびβ鎖）（各々が３つの相補性決定領域を有し、それはＴＣＲコンストラクトについて本明細書に記載の相補性決定領域のいずれかであってもよい）を一本鎖ポリペプチドとして有し、第２の抗原結合ドメインを提供する。
本発明のいくつかの実施形態は、本明細書に記載されているＴＣＲ、ポリペプチドおよびタンパク質に関連する、それらを組み込む、あるいはそれらをコードする、核酸、組換えベクター、宿主細胞、細胞の集団および医薬組成物に関する。
抗原ターゲティング剤を用いた免疫療法の実施
いくつかの実施形態において、ＴＣＲまたはＣＡＲなどの上述の抗原ターゲティング剤を任意の適切な方法で細胞傷害性細胞に導入して、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子などのＨＬＡ－Ａ＊０２分子によって提示される１２位で変異しているＫＲＡＳの形態を発現する細胞を特異的に標的にして死滅させる細胞傷害性細胞を提供する。いくつかの実施形態において、変異したＫＲＡＳは、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ、ＫＲＡＳＧ１２ＶまたはＫＲＡＳＧ１２Ｃである。
いくつかの実施形態において、ＴＣＲまたはＣＡＲなどの上述の抗原ターゲティング剤を任意の適切な方法で細胞傷害性細胞に導入して、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子などのＨＬＡ－Ａ＊０２分子によって提示される１２位で変異しているＫＲＡＳの形態を発現する細胞を特異的に標的にして死滅させる細胞傷害性細胞を提供する。いくつかの実施形態において、変異したＫＲＡＳは、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ、ＫＲＡＳＧ１２ＶまたはＫＲＡＳＧ１２Ｃである。
様々な実施形態で使用することができる細胞傷害性細胞の例としては、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などを含む腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）が挙げられる。細胞免疫療法を実施するように操作することができる任意の細胞を、代替の実施形態で使用することができる。
抗原ターゲティングコンストラクトは、現在知られているまたは今後開発される任意の適切な技術を用いて、細胞傷害性細胞に導入することができる。いくつかの実施形態において、抗原ターゲティングコンストラクトは、プラスミドまたはＲＮＡトランスフェクション、ウイルスベクターによる導入、プログラム可能なヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲシステム（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）、ＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼなど、当業者に知られているもの、を介した直接編集を用いて、細胞傷害性細胞に導入される。いくつかの実施形態において、抗原ターゲティングコンストラクトは、適切なベクター、例えば、レンチウイルスまたはレトロウイルスベクター、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、トランスポゾンなどを用いた形質導入により、細胞傷害性細胞に導入される。いくつかの実施形態において、抗原ターゲティングコンストラクトは、トランスポゾンシステムまたはエレクトロポレーションを用いて細胞傷害性細胞に導入される。
いくつかの実施形態において、所望の抗原ターゲティング受容体を用いて、自家養子細胞療法を用いて設計された細胞傷害性細胞を生成する。すなわち、細胞傷害性細胞を哺乳動物対象から採取し、抗原ターゲティング受容体を発現するように遺伝子工学的に操作し、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖させ、その後、増殖した細胞を対象に再び導入して、１２位にミスセンス変異を有するＫＲＡＳの変異型、例えばＫＲＡＳＧ１２Ｄ、ＫＲＡＳＧ１２ＶまたはＫＲＡＳＧ１２Ｃを発現する細胞と関連する癌を治療する。いくつかの実施形態において、哺乳動物対象はヒトである。
いくつかの実施形態において、所望の抗原ターゲティング受容体を用いて、同種異系細胞（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ ｃｅｌｌｓ）を用いたユニバーサル養子細胞療法を用いて、設計された細胞傷害性細胞を生成する。ユニバーサル養子細胞療法において、同種異系ドナーからの一そろいの（ａ ｂａｎｋ ｏｆ）細胞が、本明細書に記載のＴＣＲまたはＣＡＲなどの所望の抗原ターゲティング受容体を発現するように遺伝的に改変される。その後、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ、ＫＲＡＳＧ１２ＣなどのＫＲＡＳの変異型を発現する細胞に関連する癌を治療するために、改変された同種異系細胞を患者に導入する。患者は、哺乳動物の対象、例えば、ヒト、であってもよい。
いくつかの実施形態において、所望の抗原ターゲティング受容体は、全身的な遺伝子治療を用いて、哺乳動物対象、例えばヒトに導入される。例えば、抗原ターゲティング受容体を発現させるためのヌクレオチド配列を含む複製不能ウイルスベクターを患者に直接注入して、ＫＲＡＳの変異型、例えばＫＲＡＳＧ１２Ｄ、ＫＲＡＳＧ１２ＶまたはＫＲＡＳＧ１２Ｃを発現する細胞に関連する癌を治療するために、Ｔ細胞をｉｎ ｓｉｔｕで直接形質導入する。
いくつかの実施形態において、細胞傷害性細胞を設計するよりはむしろ、所望の抗原ターゲティング受容体を適切な可溶性免疫療法剤、例えば、二重特異性Ｔ細胞誘導（ｂｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ（ＢｉＴＥ（登録商標）））などの二重特異性抗体に変換して、哺乳動物対象に直接投与することができる。このような実施形態において、抗原結合領域を形成する第１および第２の鎖の部分（それぞれ第１、第２および第３のＣＤＲを含む）が、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子を含むＨＬＡ－Ａ＊０２分子によって表示される変異型ＫＲＡＳを発現する腫瘍細胞を標的とする一本鎖ポリペプチドとして一緒に結合され、第２の抗原結合ドメイン、例えばＣＤ３受容体を介してＴ細胞に結合するｓｃＦｖなどと一緒に融合タンパク質として発現される。得られた融合タンパク質を精製し、任意の適切な方法で対象に投与して、細胞傷害性Ｔ細胞を腫瘍細胞に誘導する。
本明細書に記載されている細胞性免疫療法剤および免疫療法剤の投与方法は、当技術分野で知られており、例えば、静脈内注射または皮下注射を含むことができる。
いくつかの実施形態において、哺乳動物対象が本明細書に記載の抗原ターゲティング剤を用いた治療から利益を得る可能性を、そのような治療を開始する前に実施する。対象からのサンプルを評価して、対象がＫＲＡＳの１２位にミスセンス変異を有する潜在的な癌細胞を有する可能性があるかどうかを決定する。例えば、患者からの腫瘍のサンプルを、ＤＮＡ配列決定または適切な分析技術に供して、そのような変異の存在を決定してもよい。また、哺乳動物対象は、ＨＬＡタイピングを行い、対象がＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子を有するかどうか、および／または、対象がどのＨＬＡ－Ａ対立遺伝子を有するかを決定する。対象が、ＫＲＡＳの１２位でのミスセンス変異を有する潜在的な癌細胞と、いくつかの実施形態ではＨＬＡ－Ａ＊０２：０１対立遺伝子を含むＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子の両方を有する場合、同対象は、本明細書に記載の抗原ターゲティング剤を用いた免疫療法の潜在的な候補者である。
いくつかの実施形態において、哺乳動物対象が本明細書に記載の抗原ターゲティング剤を用いた治療から利益を得る可能性を、そのような治療を開始する前に実施する。対象からのサンプルを評価して、対象がＫＲＡＳの１２位にミスセンス変異を有する潜在的な癌細胞を有する可能性があるかどうかを決定する。例えば、患者からの腫瘍のサンプルを、ＤＮＡ配列決定または適切な分析技術に供して、そのような変異の存在を決定してもよい。また、哺乳動物対象は、ＨＬＡタイピングを行い、対象がＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子を有するかどうか、および／または、対象がどのＨＬＡ－Ａ対立遺伝子を有するかを決定する。対象が、ＫＲＡＳの１２位でのミスセンス変異を有する潜在的な癌細胞と、いくつかの実施形態ではＨＬＡ－Ａ＊０２：０１対立遺伝子を含むＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子の両方を有する場合、同対象は、本明細書に記載の抗原ターゲティング剤を用いた免疫療法の潜在的な候補者である。
１つの具体的な例示的実施形態において、本明細書に記載されるような設計されたＴＣＲがＣＤ８＋Ｔ細胞に組み込まれる。Ｔ細胞受容体が、腫瘍細胞上のＨＬＡ－Ａ＊０２分子（例えば、ＨＬＡ＊０２：０１分子）によって提示されるＫＲＡＳＧ１２Ｄ／Ｖ／Ｃ抗原を認識して結合すると、ＣＤ８＋Ｔ細胞は活性化され、腫瘍細胞に結合して、例えば、腫瘍細胞の溶解、サイトカインの分泌、および／またはエフェクター分子（例えば、パーフォリンおよびグランザイム）の分泌によって、腫瘍細胞を死滅させるための細胞傷害性応答を開始することができる。
１つの具体的な例示的実施形態において、Ｔ細胞受容体は、レンチウイルス形質導入を用いてＣＤ８＋Ｔ細胞において合成され、再構成される。レンチウイルス形質導入は、ＨＬＡ－Ａ＊０２分子（例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子）によって提示されるＫＲＡＳＧ１２Ｄ／Ｖ／Ｃ抗原に結合することができる抗原結合ドメインを含む受容体をコードするヌクレオチドベクターを使用する。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドベクターは、配列番号３７、３９、４１または４３のいずれか１つのＤＮＡ配列を有するヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ／Ｖ／Ｃ抗原に結合し、細胞傷害性応答を開始することができる免疫細胞が作られる。それらは、まず、免疫細胞を細胞源から単離し、ＨＬＡ－Ａ＊０２分子によって細胞表面に表示されるＫＲＡＳＧ１２Ｄ／Ｖ／Ｃ抗原に結合することができる抗原結合ドメインを含む受容体を発現するように、免疫細胞を遺伝子工学的に操作することによって作られる。いくつかの態様において、遺伝子操作は、レンチウイルスベクターを用いて実施することができる。設計された免疫細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２サブタイプを有し、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ／Ｖ／Ｃの発現を伴う癌または他の障害に罹患している患者の体内に導入して、その癌または障害を治療することができる。いくつかの実施形態において、患者はＨＬＡ－Ａ＊０２：０１サブタイプを有する。
設計されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、癌の患者を治療するため、および／または癌をスクリーニングするために使用されてもよい。治療の態様を例示する例に着目すると、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ／Ｖは、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）に罹患している患者において広くみられ、突然変異であるため、設計されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、そのような膵臓癌に対する免疫療法として特に有効であると考えられる。さらに、ＫＲＡＳＧ１２Ｘは最も一般的な癌のホットスポット変異であり、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１は広くみられるＨＬＡ対立遺伝子であるため、多くの患者集団が恩恵を受けることになり、そのような恩恵はＰＤＡＣのみならず、肺腺癌や大腸腺癌などのこれらの一般的な変異を有する他の癌種にまで及ぶ。
いくつかの実施形態において、ＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原を標的とする設計された免疫療法受容体は、癌を治療または予防するための方法において、ＨＬＡ－Ａ＊０２サブタイプを有する患者に使用される。例えば、その方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｔ細胞療法であってもよい。
いくつかの実施形態において、腫瘍ＫＲＡＳ突然変異スクリーニング、ＨＬＡタイピング、または患者スクリーニングの他の方法に基づいて、本発明による治療に応答する患者を同定する方法も提供される。
抗原ターゲティング剤を用いたスクリーニング
いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２分子によって細胞表面に表示されるＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原を標的とする抗原ターゲティング剤を使用して、患者の生検などのサンプル中の腫瘍細胞の存在を検出する。いくつかのそのような実施形態において、検出は、抗原ターゲティング受容体を発現する細胞傷害性細胞がサンプルに由来する腫瘍細胞培養物中の腫瘍細胞を死滅させる能力を評価するアッセイを行うことによって、または、インターフェロン－ガンマなどの細胞傷害性細胞の活性化を示す分子の発現を、そのような細胞を腫瘍細胞と共培養したときに評価する（例えば、ＥＬＩＳｐｏｔを使用する）ことによって行われる。
いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ａ＊０２分子によって細胞表面に表示されるＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原を標的とする抗原ターゲティング剤を使用して、患者の生検などのサンプル中の腫瘍細胞の存在を検出する。いくつかのそのような実施形態において、検出は、抗原ターゲティング受容体を発現する細胞傷害性細胞がサンプルに由来する腫瘍細胞培養物中の腫瘍細胞を死滅させる能力を評価するアッセイを行うことによって、または、インターフェロン－ガンマなどの細胞傷害性細胞の活性化を示す分子の発現を、そのような細胞を腫瘍細胞と共培養したときに評価する（例えば、ＥＬＩＳｐｏｔを使用する）ことによって行われる。
いくつかの実施形態において、ＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原を標的とする抗原ターゲティング剤は、例えば、エピソーム、すなわち、血液中に存在することが示されている膜フラグメント上に表示されたそのような抗原を検出することによって、血液などのサンプル中の腫瘍細胞の存在を検出するために使用される。いくつかの実施形態において、合成ＴＣＲを用いたインビトロアッセイ、例えば、ＴＣＲを標識された可溶性試薬として用いるか、または以下に記載されるようなレポーターシステムを有する細胞で発現させることにより、エピソーム上に表示されたそのような抗原の存在を検出することができる。
いくつかの実施形態において、設計された抗原ターゲティング受容体は、哺乳動物における癌の存在を検出するために使用される。例えば、設計された抗原ターゲティング受容体（その関連ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、または設計された細胞）を、１つ以上の細胞またはエピソームを有するサンプルと接触させてもよい。細胞がＨＬＡ－Ａ＊０２分子によって表示されるＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原を発現している場合、設計された抗原ターゲティング受容体はＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原に結合し、それによって複合体を形成する。この複合体の検出は、潜在的な癌細胞または前癌細胞の存在を示している。
複合体の検出は、当技術分野で知られている任意の数の方法によって行われてもよい。いくつかの実施形態において、設計された抗原ターゲティング剤（および／またはその関連ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、または設計された細胞）は、検出可能および／または視覚的な標識、例えば放射性同位元素または蛍光体で標識されてもよい。
いくつかの実施形態において、設計された抗原ターゲティング受容体は、例えば研究開発および／または創薬における使用のためのインビトロハイスループットスクリーニングアッセイをサポートするべく不死化Ｔ細胞株（例えばＪｕｒｋａｔ細胞）において再構成される。非限定的な例として、いくつかの実施形態において、抗原ターゲティング受容体は、αβＴＣＲの可溶性テトラマー、すなわちＴＣＲ多量体で再構成され、診断的に、例えば感染性物質または細胞の形質転換にさらされた細胞を可視化するために、および／または治療的に、例えば損なわれた細胞への薬物の送達のために、例えばロウ（Ｌｏｗ）他、ＰｌｏＳ Ｏｎｅ、７（１２）、ｅ５１３９７、２０１２に記載されているように使用される。いくつかの他の実施形態において、設計された抗原ターゲティング受容体は、リドゼック（Ｒｙｄｚｅｋ）他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、２７（２）、２８７－２９９、２０１９に報告されているように、Ｔ細胞リンパ腫株Ｊｕｒｋａｔに由来するレポーター細胞で再構成される。
特定の実施形態は以下の実施例を参照してさらに説明されるが、それらは例示的であり、本質的に限定されないことが意図されている。
実施例１：ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：ＫＲＡＳＧ１２Ｄ＆Ｖ反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の単離
ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：ＫＲＡＳＧ１２Ｄ＆Ｖ反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞のクローン的に純粋な集団を、膵臓癌患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離した。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子が提示するＫＲＡＳＧ１２Ｄ＆Ｖ抗原に対するそれらの標的特異性が検証された。
実施例１：ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：ＫＲＡＳＧ１２Ｄ＆Ｖ反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の単離
ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：ＫＲＡＳＧ１２Ｄ＆Ｖ反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞のクローン的に純粋な集団を、膵臓癌患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離した。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子が提示するＫＲＡＳＧ１２Ｄ＆Ｖ抗原に対するそれらの標的特異性が検証された。
ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：ＫＲＡＳＧ１２Ｄ＆Ｖ反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞クローンからのＴＣＲαおよびβ鎖は、配列決定され、再合成され、レンチウイルス形質導入を用いて健康なドナーのＣＤ８＋Ｔ細胞において組換えＴＣＲとして再構成された。
ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１：ＫＲＡＳＧ１２Ｄ＆Ｖ－反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞を同定するためのスクリーニングプロトコルは、修正された「ミニライン（ｍｉｎｉ－ｌｉｎｅ）」培養法であった。このプロトコルは、例えば、ウィック（Ｗｉｃｋ）他、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１４ Ｍａｒ １；２０（５）：１１２５－３４、ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－１３－２１４７．ＰＭＩＤ：２４３２３９０２；マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）他、「Ａ ｌｉｂｒａｒｙ－ｂａｓｅｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ－ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｐｒｉｏｒ ｔｏ ｒｅｌａｐｓｅ ｏｆ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ」、ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１７ Ｓｅｐ ２１；７（１）：ｅ１３７１８９５．ｄｏｉ：１０．１０８０／２１６２４０２Ｘ．２０１７．１３７１８９５．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１７．ＰＭＩＤ：２９２９６５２２に記載されている。前述の各刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
修正されたミニラインＴ細胞増殖プロトコルを図１に模式的に示す。膵管腺癌（ＰＤＡＣ）患者の末梢血サンプルは、ＢＣ Ｐａｎｃｒｅａｓ Ｃｅｎｔｒｅから入手した。全血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を精製し、製造業者（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ．、独国）によって概説された推奨するプロトコルに従ってＣＤ８＋Ｔ細胞単離キットを用いてＰＢＭＣからＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、Ｕ字型ウェルを有する９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カリフォルニア州、米国）に１ウェルあたり２０００個の細胞の密度で分注した。その後、細胞を、ＲＰＭＩ－１６４０補充培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カリフォルニア州、米国）に、さらにｒＩＬ－２（３００Ｕ／ｍＬ）（ＰｒｅｐｒｏＴｅｃｈ、ニュージャージー州、米国）、抗ＣＤ３抗体（Ｃｌｏｎｅ ＯＫＴ３，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州、米国）および抗ＣＤ２８抗体（Ｃｌｏｎｅ ＣＤ２８．２，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州、米国）を最終濃度１μｇ／ｍＬで、対照ＰＢＭＣ源からの照射したフィーダー細胞を１：１０００（Ｔ細胞：フィーダー）の比率で添加した。５日目およびその後２日目ごとに培養物を分割し、１４日目の増殖終了まで、追加のｒＩＬ－２（最終濃度３００Ｕ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ－１６４０補充培地を加えた。１４日目、細胞をマスタープレートに再プールし、洗浄後、少量のｒＩＬ－２（１０Ｕ／ｍＬ）のみを添加したＲＰＭＩ－１６４０補充培地に再懸濁し、４日間インキュベートした後、ＥＬＩＳｐｏｔおよびシングルセルソーティングアッセイを行った。
実施例２：ＫＲＡＳＧ１２Ｄ／Ｖペプチドに対する反応性のスクリーニング
次に、ポリクローナルＴ細胞プールのパネルを、ＩＦＮ－γ（インターフェロンガンマ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（ＭａｂＴｅｃｈ社）を用いて、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１の文脈におけるＫＲＡＳＧ１２Ｄ／Ｖペプチドに対する反応性についてスクリーニングした。
次に、ポリクローナルＴ細胞プールのパネルを、ＩＦＮ－γ（インターフェロンガンマ）ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（ＭａｂＴｅｃｈ社）を用いて、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１の文脈におけるＫＲＡＳＧ１２Ｄ／Ｖペプチドに対する反応性についてスクリーニングした。
図２に示すように、いくつかのポリクローナルＴ細胞プールは、ＥＬＩＳＰＯＴにより抗原特異的ＩＦＮ－γ応答を示し、これらは続いて、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するＫＲＡＳＧ１２Ｄペプチドおよび配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＫＲＡＳＧ１２ＶペプチドでパルスしたＨＬＡ－Ａ＊０２：０１陽性抗原提示細胞（ＡＰＣ）（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１を発現するように改変したＫ５６２ｂ細胞）で再刺激した。増殖後のプールを、インビトロで２４～２８時間、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ／Ｇ１２Ｖ予測ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－拘束性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）エピトープ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、ニュージャージー州、米国）でパルスした抗原提示細胞（ＡＰＣ）に暴露した（ＡＰＣ／Ｔ細胞比１：５）。ＥＬＩＳｐｏｔプレートのデベロップメントは、ＥＬＩＳｐｏｔ検出抗体および材料の製造者および供給者（ＭＡＢＴＥＣＨ、ストックホルム、スウェーデン）が概説した標準的なＥＬＩＳｐｏｔプロトコルに従って行った。
図３に示すように、反応性Ｔ細胞は、一過性の活性化マーカーである４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）のｄｅ ｎｏｖｏ発現の検出に基づいて、蛍光活性化セルソーティング（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ））によりシングルセルにソーティングした。患者１由来のＥＬＩＳｐｏｔ陽性生ポリクローナルＴ細胞を、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ／Ｇ１２Ｖ予測ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－拘束性エピトープでパルスしたＡＰＣとの共培養２４時間後に、ヨウ化プロピウム（ＰＩ）生／死染色（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州、米国）および蛍光色素標識抗体ＣＤ８－ＡＰＣおよびＣＤ１３７－ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カリフォルニア州、米国）（Ｑ２、Ｑｕａｄｒａｎｔ ２）を用いてＣＤ８、一過性抗原誘導活性化マーカー、ＣＤ１３７の発現に基づいてシングルセルにソーティングした。
シングルセルソーティングした（ｓｉｎｇｌｅ ｓｏｒｔｅｄ）Ｔ細胞を、ＩＬ－２（２００Ｕ／ｍＬ）および過剰の照射した同種ＰＢＭＣフィーダーを補充したｃＲＰＭＩ培地中で増殖した。抗ＫＲＡＳＧ１２ＸモノクローナルＴ細胞集団の機能および特異性を探索するために、候補Ｔ細胞クローンのいくつかを、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－ＫＲＡＳＧ１２Ｘテトラマー染色により（図４Ａ～４Ｊに示すように）、および／またはＨＬＡ－Ａ＊０２：０１対立遺伝子および関連するＫＲＡＳＧ１２Ｘ突然変異の両方を有する細胞株に対する反応性についてＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴにより（図５および表１に示すように）、評価した。
図４Ａ～４Ｊを参照して、ＫＲＡＳｗｉｌｄ ｔｙｐｅ、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ、およびＫＲＡＳＧ１２Ｄの予測エピトープのＨＬＡ－Ａ＊０２：０１提示に基づいてテトラマーを設計し、ＰＥフルオロクローム（ＮＩＨ Ｔｅｔｒａｍｅｒ ｆａｃｉｌｉｔｙ、ジョージア州、米国）で標識した。単一細胞（ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ）の単離を図４Ａ、４Ｂおよび４Ｃに示す。図４Ｄ～４Ｊを参照すると、ＣＤ３－ｅＦｌｕｏｒ ４５０がＸ軸に沿って示されている。ＫＣＴＬ－１ ＫＲＡＳＧ１２Ｖ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－拘束性ペプチド特異的Ｔ細胞クローンは、ＣＤ３およびＣＤ８（図４Ｄ）、ならびにＡ＊０２：０１－ＫＲＡＳＧ１２Ｖテトラマー（図４Ｆ）に対して陽性に染色されたが、Ａ＊０２：０１－ＫＲＡＳＧ１２Ｄ（図４Ｇ）およびＡ＊０２：０１－ＫＲＡＳｗｉｌｄ ｔｙｐｅ（図４Ｅ）の両方に対して陰性であった。ＫＣＴＬ－２ ＫＲＡＳＧ１２Ｄ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－拘束性ペプチド特異的Ｔ細胞クローンは、ＣＤ３およびＣＤ８（図４Ｄ）、ならびにＡ＊０２：０１－ＫＲＡＳＧ１２Ｄ（図４Ｊ）に対して陽性に染色されたが、Ａ＊０２：０１－ＫＲＡＳＧ１２Ｖ（図４Ｉ）およびＡ＊０２：０１－ＫＲＡＳｗｉｌｄ ｔｙｐｅ（図４Ｈ）の両方に対して陰性であった。蛍光色素標識した抗体抗ＣＤ３－ｅＦｌｕｏｒ ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カリフォルニア州、米国）およびＣＤ８－ＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カリフォルニア州、米国）。
図５を参照すると、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－拘束性ペプチド特異的Ｔ細胞クローン（「ＫＣＴＬ－２」）は、ＲＰＭＩ－１６４０補充培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カリフォルニア州、米国）中でＰＡＮＣ－１細胞およびＨｅＬａ細胞と共培養すると活性化された。また、この培地には、１０Ｕ／ｍＬのｒＩＬ－２（ＰｒｅｐｒｏＴｅｃｈ、ニュージャージー州、米国）が含まれていた。２５，０００個のＰＡＮＣ－１細胞と２５，０００個のＫＣＴＬ－２を共培養したところ、ＰＡＮＣ－１とＫＣＴＬ－２の両方を単独で培養した場合に比べて、ガンマ・インターフェロン（ＩＦＮγ）のスポット形成単位（ＳＦＵ）が増加した。さらに、このＫＣＴＬ－２を非ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１／非ＫＲＡＳＧ１２ＤのＨｅＬａ細胞株と同じ条件で共培養したところ、ＳＦＵに顕著な変化は見られなかった。ＫＣＴＬ－２のための生ＥＬＩＳｐｏｔウェル画像の例を提示し、全てのウェルからの表にされた結果を表１に列挙し、ＥＬＩＳｐｏｔプレートデベロップメント（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）は、ＰＡＮＣ－１およびＨｅＬａ細胞の付着性を考慮した追加の洗浄ステップを除いて、ＥＬＩＳｐｏｔ抗体および材料の製造業者および供給業者（ＭＡＢＴＥＣＨ、ストックホルム、スウェーデン）が概説した標準的なＥＬＩＳｐｏｔプロトコルに従って行った。
以下の表１は、生データから解釈されたＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔデータをまとめたものであり、その結果のサンプルは図５に示されている。表１は、非特異的／バックグラウンドスポットを考慮して対照に対して正規化した、２．５×１０４ ＫＣＴＬ－２細胞あたりのＩＦＮγのＳＦＵを含む。また、表１には、平均値、標準偏差（ＳＤ）、および複製数（Ｎ）も含まれている。ＫＣＴＬ－２とＰＡＮＣ－１の共培養物におけるＩＦＮγのＳＦＵの、ＫＣＴＬ－２とＨｅＬａの共培養物と比較した場合の有意差は、両側Ｔ検定を用いて判定し、ｐ値を以下に示した。
上記のデータは、候補ＴＣＲの細胞溶解活性が標的特異的であることを示している。すなわち、各ＴＣＲを単離するために使用された同族の新抗原（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ）（Ｇ１２ＤまたはＧ１２Ｖ）に対する選択性があり、ＫＲＡＳ５－１４ａａエピトープの野生型バージョンに対する特異的な認識はないことである。
実施例３：ＫＲＡＳＧ１２Ｄ／Ｖ／Ｃペプチドへの異なるＨＬＡ－Ａ＊０２サブタイプの結合の予測
ＫＲＡＳＧ１２Ｄ／Ｖ／Ｃペプチドに対する様々なＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子の結合予測は、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ ｖ３．０（ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ），Ｍ．およびアンドレッタ（Ａｎｄｒｅａｔｔａ），Ｍ．、（２０１６）、Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、８（１）、３３）を用いて実施した。結合ペプチド（ＩＣ５０＜５００ｎＭ）と非結合ペプチド（ＩＣ５０＞５００ｎＭ）を区別するために、ＩＣ５０の閾値を５００ｎＭとした。ＫＲＡＳＧ１２Ｄ／Ｖ／Ｃペプチドに結合することが予測されるＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子を表２に示す。
ＫＲＡＳＧ１２Ｄ／Ｖ／Ｃペプチドに対する様々なＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子の結合予測は、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ ｖ３．０（ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ），Ｍ．およびアンドレッタ（Ａｎｄｒｅａｔｔａ），Ｍ．、（２０１６）、Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、８（１）、３３）を用いて実施した。結合ペプチド（ＩＣ５０＜５００ｎＭ）と非結合ペプチド（ＩＣ５０＞５００ｎＭ）を区別するために、ＩＣ５０の閾値を５００ｎＭとした。ＫＲＡＳＧ１２Ｄ／Ｖ／Ｃペプチドに結合することが予測されるＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子を表２に示す。
約１５４の異なるＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子が、ＫＲＡＳＧ１２Ｄに結合することができると予測された。約１８４の異なるＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子が、ＫＲＡＳＧ１２Ｖに結合することができると予測された。約１８０の異なるＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子が、ＫＲＡＳＧ１２Ｃに結合することができると予測された。
実施例４：組換えＴ細胞受容体
次に、候補Ｔ細胞クローンをα－βＴＣＲの増幅と配列決定に供した。その結果、ＫＴＣＲ－１は、ＴＣＲのα鎖の可変領域の配列としてＴＲＡＶ２７＊０１対立遺伝子（配列番号５のＤＮＡおよび配列番号６のアミノ酸）を、ＴＣＲのβ鎖の配列としてＴＲＢＶ１９＊０１対立遺伝子（配列番号７のＤＮＡおよび配列番号８のアミノ酸）を有していること；ＫＴＣＲ－２がＴＣＲのα鎖の可変領域の配列としてＴＲＡＶ１３－２＊０１対立遺伝子（配列番号９のＤＮＡと配列番号１０のアミノ酸）を、ＴＣＲのβ鎖の可変領域の配列としてＴＲＢＶ１９＊０１対立遺伝子（配列番号７のＤＮＡと配列番号８のアミノ酸）を有していること；ＫＴＣＲ－３はＴＣＲのα鎖の可変領域の配列としてＴＲＡＶ２７＊０１の対立遺伝子（配列番号５のＤＮＡと配列番号６のアミノ酸）を、ＴＣＲのβ鎖の可変領域の配列としてＴＲＢＶ４－１＊０１の対立遺伝子（配列番号１１のＤＮＡと配列番号１２のアミノ酸）を有していること、が明らかとなった。
次に、候補Ｔ細胞クローンをα－βＴＣＲの増幅と配列決定に供した。その結果、ＫＴＣＲ－１は、ＴＣＲのα鎖の可変領域の配列としてＴＲＡＶ２７＊０１対立遺伝子（配列番号５のＤＮＡおよび配列番号６のアミノ酸）を、ＴＣＲのβ鎖の配列としてＴＲＢＶ１９＊０１対立遺伝子（配列番号７のＤＮＡおよび配列番号８のアミノ酸）を有していること；ＫＴＣＲ－２がＴＣＲのα鎖の可変領域の配列としてＴＲＡＶ１３－２＊０１対立遺伝子（配列番号９のＤＮＡと配列番号１０のアミノ酸）を、ＴＣＲのβ鎖の可変領域の配列としてＴＲＢＶ１９＊０１対立遺伝子（配列番号７のＤＮＡと配列番号８のアミノ酸）を有していること；ＫＴＣＲ－３はＴＣＲのα鎖の可変領域の配列としてＴＲＡＶ２７＊０１の対立遺伝子（配列番号５のＤＮＡと配列番号６のアミノ酸）を、ＴＣＲのβ鎖の可変領域の配列としてＴＲＢＶ４－１＊０１の対立遺伝子（配列番号１１のＤＮＡと配列番号１２のアミノ酸）を有していること、が明らかとなった。
ＫＴＣＲ－１、ＫＴＣＲ－２およびＫＴＣＲ－３から同定されたＴＣＲのα鎖およびβ鎖に同定された対立遺伝子を、それぞれ（すなわち、ＫＲＡＳＧ１２ＤまたはＫＲＡＳＧ１２Ｖ）の結合特異性とともに、以下の表３に示す。これらの結果に基づいて、ＴＣＲのα鎖にＴＲＡＶ１３－２＊０１、β鎖にＴＲＢＶ０４－１＊０１の可変鎖領域を有するＴＣＲは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１によって提示されるＫＲＡＳＧ１２Ｘ変異ペプチドに結合するのにも有効であると予測される。このようなコンストラクトは、本明細書において、予測されるコンストラクトとしてＰＴＣＲ－４と呼ばれる。理論に拘束されるものではないが、ＰＴＣＲ－４コンストラクトは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１拘束性ＫＲＡＳＧ１２ＤおよびＫＲＡＳＧ１２Ｖを認識するが、ＫＲＡＳＷｉｌｄ Ｔｙｐｅは認識しないことが予測される。
前述の対立遺伝子を含むＴＣＲのα鎖およびβ鎖のそれぞれの可変領域には、各鎖の第１および第２の相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＣＤＲ１およびＣＤＲ２）が含まれている。ＫＴＣＲ－１、ＫＴＣＲ－２およびＫＴＣＲ－３のそれぞれについて、第３のＣＤＲの配列を決定して、相補性決定領域のそれぞれの配列を、表４の以下のようにおよび図２２の下線部のように特定した。
再構成用の組換えＴＣＲは、上記３つの異なるＴ細胞クローン、ＫＴＣＲ－１、ＫＴＣＲ－２、ＫＴＣＲ－３からそれぞれ新規なα－βＴＣＲ配列を組み込んで設計した。これらの設計に従って物理的ＤＮＡをｄｅ ｎｏｖｏ合成し、図６～８に模式的に示すレンチウイルス転送プラスミドにライゲーションした（配列番号４５、４６および４７に対応し、ＰＴＣＲ－４を生成するための予測されるプラスミド配列は配列番号４８として示されている）。
実施例５：設計されたＣＤ８＋Ｔ細胞
次に、複製不能なレンチウイルス粒子をＴＣＲ遺伝子転送ベクターとして生成し、健康なドナーのＣＤ８＋Ｔ細胞を形質導入するために使用した。
次に、複製不能なレンチウイルス粒子をＴＣＲ遺伝子転送ベクターとして生成し、健康なドナーのＣＤ８＋Ｔ細胞を形質導入するために使用した。
図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃは、ＨｅＬａ細胞に対するＫＴＣＲ－１、ＫＴＣＲ－２、およびＫＴＣＲ－３レンチウイルスの滴定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）の結果を示す。様々な量の各レンチウイルスを、５×１０４個のＨｅＬａ細胞に４８時間かけて添加した。ＨｅＬａ細胞をフローサイトメトリーを用いて赤色蛍光タンパク質（レポーター遺伝子、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ）発現について解析し（図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃおよび１０Ｄに示す例、図１０Ｃに示されるｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ陽性細胞）、将来のトランスフェクションに必要なレンチウイルスの最適量を決定した。
図１１は、ＫＴＣＲ－１、ＫＴＣＲ－２およびＫＴＣＲ－３形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞をソーティングした結果を示す。最初の増殖後にレポーター遺伝子、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ポスト（ｐｏｓｔ）－ＫＴＣＲ－１、ＫＴＣＲ－２およびＫＴＣＲ－３レンチウイルストランスフェクションを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞を単離するために、フローゲーティング手順を行った。陰性対照と比較したｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ陽性を示すラベル付きヒストグラムが示されている。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、製造者のプロトコルに従って、磁気ビーズベースの細胞分離キットを用いて分離した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、独国）。その後、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州、米国）を最終濃度１μｇ／ｍＬで用いてＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化した。活性化から２４時間後、ＣＤ８＋Ｔ細胞をカウントし、１２ウェル培養プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カリフォルニア州、米国）に、それぞれ５０μＬおよび１００μＬのいずれかの各ウイルスを関連する細胞に添加することにより、感染の多重度（ＭＯＩ）が１および２になるように、所定の細胞濃度でプレーティングした。トランスフェクションから４８時間後、細胞を３００Ｕ／ｍＬのｒＩＬ－２（ＰｒｅｐｒｏＴｅｃｈ、ニュージャージー州、米国）および照射（５０Ｇｙ）したフィーダーＰＢＭＣ（１：１００（トランスフェクションしたＣＤ８＋Ｔ細胞：照射したフィーダー細胞）の割合）を添加したＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カリフォルニア州、米国）に再懸濁した。１週間の増殖後、フローゲーティングプロトコルに従って細胞をソーティングした。
次に、ＴＣＲ－形質導入されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴによる抗ＫＲＡＳＧ１２Ｘの機能および特異性（図１２および表５に示す）、およびＨＬＡ－Ａ＊０２：０１／ＫＲＡＳＧ１２Ｘ陽性標的細胞に対する細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）（図１３Ａ～１３Ｆ、１４および１５ならびに表６に示す）について評価した。上述した手順により、３つの異なる有効な抗ＫＲＡＳＧ１２ＸＴＣＲが得られた（ＫＴＣＲ－１、ＫＴＣＲ－２およびＫＴＣＲ－３）。
図１２は、Ｇｒａｐｈｐａｄ－Ｐｒｉｓｍ（商標）８（バージョン８．０．０）を用いて解析された生のＥＬＩＳｐｏｔデータを示す。示されるように、ＫＴＣＲ－１ ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１＋ＫＲＡＳＧ１２ＶＣＦＰＡＣ－１細胞と共培養した場合、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１＋ＫＲＡＳＧ１２ＤＰＡＮＣ－１細胞およびＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－ＫＲＡＳＷｉｌｄ ｔｙｐｅＨｅＬａ細胞と比較して、γインターフェロン（ＩＦＮγ）スポット形成単位（ＳＦＵ）の増加を示した。同様に、ＫＴＣＲ－２およびＫＴＣＲ－３ ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１＋ＫＲＡＳＧ１２ＤＰＡＮＣ－１と共培養した場合、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１＋ＫＲＡＳＧ１２ＶＣＦＰＡＣ－１およびＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－ＫＲＡＳＷｉｌｄ ｔｙｐｅＨｅＬａ細胞と比較して、ＩＦＮγＳＦＵの増加を示した。
表５は、ＫＴＣＲ－１、ＫＴＣＲ－２、およびＫＴＣＲ－３ ＣＤ８＋Ｔ細胞のＥＬＩＳｐｏｔ解析の結果を示す。結果は、ガンマ・インターフェロン（ＩＦＮγ）のスポット形成単位（ＳＦＵ）として報告された。ＡＮＯＶＡによる統計解析と追試の多重比較（テューキー（Ｔｕｋｅｙ）ＨＳＤ多重比較検定）を行った。ＫＴＣＲ－１ ＣＤ８＋Ｔ細胞をＨＬＡ－Ａ＊０２：０１＋ＫＲＡＳＧ１２ＶＣＦＰＡＣ－１細胞と共培養した場合、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－ＫＲＡＳＷｉｌｄ ｔｙｐｅＨｅＬａ細胞と比較して、有意な差（ｖａｒｉａｎｃｅ）が認められた。同様に、ＫＴＣＲ－２およびＫＴＣＲ－３ ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１＋ＫＲＡＳＧ１２ＤＰＡＮＣ－１と共培養した場合、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１＋ＫＲＡＳＧ１２ＶＣＦＰＡＣ－１およびＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－ＫＲＡＳＷｉｌｄ ｔｙｐｅＨｅＬａ細胞と比較して、ＩＦＮγＳＦＵの有意な増加を示した。データ解析はＧｒａｐｈｐａｄ－Ｐｒｉｓｍ（商標）８（ｖｅｒｓｉｏｎ ８．０．０）を用いて行った。
図１３Ａ～１３Ｄは、ＫＲＡＳＧ１２Ｄペプチドでパルスし、ＫＴＣＲ－２細胞および対照リンパ球と共培養したＫ５６２－Ａ＊０２：０１細胞の例示的なフローサイトメトリーデータ解析を示す。フローサイトメトリーゲーティングプロトコルに従った。ｅｆ４５０染色（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カリフォルニア州、米国）された増殖Ｋ５６２－Ａ＊０２：０１細胞を、ＦＩＴＣ－ＣＤ８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カリフォルニア州、米国）の二重陽性のものを含むようにゲートした。この選別では、二重陽性の染色は、分析時にエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞が標的のｅｆ４５０染色Ｋ５６２－Ａ＊０２：０１細胞に結合しているためであり、Ｋ５６２－Ａ＊０２：０１細胞もＣＤ８＋Ｔ細胞を発現していたことによるものではないと仮定した。これは、ＫＲＡＳＧ１２Ｄペプチドでパルスし、ＫＴＣＲ－２細胞（図１３Ｆ）および対照リンパ球（図１３Ｅ）と共培養したＫ５６２－Ａ＊０２：０１を比較して、パルスした細胞に対するＫＴＣＲ－２細胞の細胞毒性活性を評価したときに確認された。細胞は、ＲＰＭＩ－１６４０補充培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カリフォルニア州、米国）で培養した。
図１４は、図１３Ａ～１３Ｄを参照して概説したフローゲーティング手順を用いて、様々な条件下でＦＳＶ７８０（Ｆｉｘａｂｉｌｉｔｙ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｓｔａｉｎ ７８０）生／死染色した（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州、米国）Ｋ５６２－Ａ＊０２：０１細胞の生データのヒストグラムプロットを示す。
図１５は、図１４に示す生データの細胞溶解アッセイ解析を示す。ＫＴＣＲ１、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ－特異的、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－拘束性ＴＣＲ、およびＫＴＣＲ２およびＫＴＣＲ３、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ－特異的、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－拘束性ＴＣＲを、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ、ＫＲＡＳＷＴペプチド（１０μｇ／ｍＬ）のいずれかで５時間、エフェクター対標的細胞比５：１でペプチドパルスしたＫ５６２－Ａ＊０２：０１抗原提示細胞と共培養したものである。このデータは、非特異的な死を排除するために、ペプチドをパルスしたＫ５６２－Ａ＊０２：０１と、刺激なしの（ペプチドをパルスしていない）Ｋ５６２－Ａ＊０２：０１をＫＴＣＲ Ｔ細胞と共培養したときの死を比較して正規化した。ＫＲＡＳＧ１２Ｖペプチドをパルスした（ｐｕｌｓｅｄ）Ｋ５６２－Ａ＊０２：０１は、ＫＴＣＲ１ Ｔ細胞と共培養した場合、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｓｔａｉｎ ７８０で染色することによって測定したとき、死滅が有意に多かった（ＡＮＯＶＡ，ｐ＜０．００１、テューキー多重比較検定（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｅｓｔ）、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。ＫＲＡＳＧ１２ＤペプチドをパルスしたＫ５６２－Ａ＊０２：０１は、ＫＲＡＳＧ１２ＤおよびＫＲＡＳｗｔをパルスしたＫ５６２－Ａ＊０２：０１と比較して、ＫＴＣＲ２またはＫＴＣＲ３ Ｔ細胞と共培養した場合、死滅が有意に多かった（ＡＮＯＶＡ，それぞれ、ｐ＜０．００１、ｐ＝０．２７２。テューキー多重比較検定、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。フロー解析は、Ｇｒａｐｈｐａｄ－Ｐｒｉｓｍ（商標）８（ｖｅｒｓｉｏｎ ８．０．０）を用いて行ったデータ解析を用いて実施した。
表６は、図１５に示すデータをまとめたものである。ＡＮＯＶＡを用いた統計解析により、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ、またはＫＲＡＳｗｉｌｄ ｔｙｐｅエピトープのいずれかでパルス処理し、ＫＴＣＲ－Ｘ（すなわち、ＫＴＣＲ－１、ＫＴＣＲ－２、またはＫＴＣＲ－３）細胞と共培養した標的細胞Ｋ５６２－Ａ＊０２：０１の細胞毒性の平均パーセンテージ（％）の間に、有意な差があることが示されている。多重比較（テューキーＨＳＤ多重比較検定）も示し、ＫＲＡＳＧ１２Ｄエピトープを提示されたＨＬＡ－Ａ＊０２：０１を標的とするＫＴＣＲ－２またはＫＴＣＲ－３細胞と、ＫＲＡＳＧ１２Ｖエピトープを提示されたＨＬＡ－Ａ＊０２：０１を標的とするＫＴＣＲ－１細胞と、の特異性に起因する細胞毒性の平均パーセンテージ（％）の間の差（ｖａｒｉａｎｃｅ）を強調している。データ解析はＧｒａｐｈｐａｄ－Ｐｒｉｓｍ（商標）８（ｖｅｒｓｉｏｎ ８．０．０）を用いて行った。
図２３を参照すると、Ｋ５６２－Ａ＊０２：０１細胞にＫＲＡＳＧ１２Ｄ、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ、ＫＲＡＳＷＴペプチド（１０μｇ／ｍＬ）のいずれかをパルスした後、関連するＫＲＡＳＧ１２Ｘ特異的ｒＴＣＲを発現するように形質導入されたＴ細胞と共培養し、製造業者のプロトコル（Ｍａｂｔｅｃｈ社）に従ってＥＬＩＳｐｏｔを実施した。ＡＮＯＶＡ，ｐ＝０．０４４０，テューキー多重比較検定を用いて、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ特異的ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－拘束性ｒＴＣＲは、ＫＲＡＳＧ１２ＶペプチドをパルスしたＫ５６２－Ａ＊０２：０１細胞と共培養した場合、ＫＲＡＳＧ１２ＤおよびＫＲＡＳｗｔをパルスしたＫ５６２－Ａ＊０２：０１細胞と比較して、１００万個の４細胞あたり有意なＩＦＮ－γスポット形成単位（ＳＦＵ）を生成した（それぞれ、＊＊＊ｐ＝０．０００６および＊＊＊ｐ＝０．０００４）。ＫＲＡＳＧ１２Ｄ特異的ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－拘束性ｒＴＣＲは、ＫＲＡＳＧ１２ＤペプチドをパルスしたＫ５６２－Ａ＊０２：０１細胞と共培養した場合、ＫＲＡＳＧ１２ＶおよびＫＲＡＳｗｔをパルスしたＫ５６２－Ａ＊０２：０１細胞と比較して、有意性を示した（それぞれ、＊＊＊ｐ＝０．００１５および＊＊＊ｐ＝０．００２３）Ｋ５６２－Ａ＊０２：０１細胞。
図２４は、ＫＲＡＳＧ１２ＶおよびＫＲＡＳＧ１２Ｄ特異的ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－拘束性ＴＣＲのテトラマー染色を示す。下の３枚のパネルは、ＫＲＡＳＧ１２Ｄ特異的ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－拘束性ＴＣＲを示す。中段の３枚はＫＲＡＳＧ１２Ｖ特異的ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－拘束性ＴＣＲを横に並べたものである。上の３つのパネルは、形質導入前のＴ細胞である対照を示す。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－ＫＲＡＳＧ１２Ｘペプチド複合体に基づくテトラマーは、ＮＩＨのテトラマーコア施設（アトランタ、ジョージア州、米国）によって製造された。ＫＲＡＳＧ１２Ｖ特異的ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－拘束性ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞の９０％以上が、ＫＲＡＳＧ１２Ｖテトラマーに特異的に陽性であった。ＫＲＡＳＧ１２Ｄ特異的ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－拘束性ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞の９０％以上が、ＫＲＡＳＧ１２Ｄテトラマーに特異的に陽性であった。関連するＴＣＲの形質導入および発現が成功したことは、適切なテトラマーに対して特異的に示された陽性であるだけでなく、形質導入前のＴ細胞に見られた陰性のテトラマー応答でも明らかである（上段）。
図２５Ａは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－拘束性ＫＲＡＳＧ１２Ｖ特異的ＴＣＲ再構成Ｔ細胞のインビボでの試験結果を示す。ＫＴＣＲ１を発現するように形質導入されたＫＲＡＳＧ１２Ｖ特異的ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１－拘束性Ｔ細胞での処置は、対照Ｔ細胞で処置したマウスと比較して、ＫＲＡＳＧ１２Ｖ／ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１患者由来の腫瘍の成長を有意に減少させた。ＡＮＯＶＡｐ＝０．００１、多重比較については、テューキーＨＳＤ多重比較検定、＊ｐ≦０．０１８、＊＊ｐ＝０．００４。図２５Ｂは、処置されたマウスの対照マウスに対する生存率を示す。
前述の実施例は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１によって拘束され提示されるＫＲＡＳＧ１２Ｘ変異ペプチドを標的とする設計されたＴ細胞受容体を用いてＴ細胞を成功裏に形質導入することができ、そのようなＴ細胞を用いて、関連するＧ１２Ｘ変異を有するＫＲａｓを発現する細胞を死滅させることができることを示している。このような細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１対立遺伝子を有する対象において、１２位で変異したＫＲａｓが関与する癌の診断、予防および／または治療に有用である可能性がある。他のＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子によって提示されるＫＲＡＳＧ１２Ｘ変異ペプチドの予測される結合の計算解析に基づいて、そのような細胞は、１２位で変異したＫＲａｓが他のＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子を有する対象に関与している癌の診断、予防および／または治療において潜在的な有用性を有することが予測される。
多数の例示的な態様および実施形態を上述したが、当業者であれば、それらの特定の変更、順列、追加、およびサブコンビネーションを認識するであろう。したがって、以下の添付の特許請求の範囲および今後導入される特許請求の範囲は、本明細書全体の最も広い解釈と一致するすべてのそのような変更、順列、追加、およびサブコンビネーションを含むように解釈されることが意図される。
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載の主題に関して興味深いものである。以下の参考文献および本明細書に記載されている他のすべての参考文献は、その全体が参照により組み込まれている。
以下の参考文献は、本明細書に記載の主題に関して興味深いものである。以下の参考文献および本明細書に記載されている他のすべての参考文献は、その全体が参照により組み込まれている。
１．ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）Ｓ．他、「Ｃｏｒｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｇｌｏｂａｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ（グローバルゲノム解析によって明らかにされたヒト膵臓癌のコアシグナル伝達経路）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２１、１８０１－６（２００８）。
２．ワインスタイン（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ），Ｉ．Ｂ．、「Ｃａｎｃｅｒ．Ａｄｄｉｃｔｉｏｎ ｔｏ ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ－ｔｈｅ Ａｃｈｉｌｌｅｓ ｈｅａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ（癌：癌遺伝子への依存－癌のアキレス腱）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７、６３－４（２００２）。
３．フォンデルハイデ（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ），Ｒ．Ｈ．およびベイネ（Ｂａｙｎｅ），Ｌ．Ｊ．、「Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（炎症性ネットワークと膵臓癌の免疫監視）」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２５、２００－５（２０１３）。
４．マックアリスター（ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ），Ｆ．他、「Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ Ｋｒａｓ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ａ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ－ｔｏ－ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ＩＬ－１７ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｘｉｓ ｉｎ ｐｒｅｉｎｖａｓｉｖｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｎｅｏｐｌａｓｉａ（発癌性のＫｒａｓｓは、浸潤前の膵臓腫瘍において造血から上皮へのＩＬ－１７シグナル伝達軸を活性化する）」、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、２５、６２１－３７（２０１４）。
５．ウィノグラッド（Ｗｉｎｏｇｒａｄ），Ｒ．他、「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ Ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ＰＤ－１ ａｎｄ ＣＴＬＡ－４ Ｂｌｏｃｋａｄｅ ａｎｄ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ（Ｔ細胞免疫の誘導は、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４遮断に対する完全な耐性を克服し、膵臓癌の生存率を改善する）」、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．、３、３９９－４１１（２０１５）。
６．フェイク（Ｆｅｉｇ），Ｃ．他、「Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＸＣＬ１２ ｆｒｏｍ ＦＡＰ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｓｙｎｅｒｇｉｚｅｓ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ（ＦＡＰを発現する癌関連線維芽細胞からＣＸＣＬ１２を標的とすることは、膵臓癌における抗ＰＤ－Ｌ１免疫療法と相乗効果を発揮する）」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１１０、２０２１２－７（２０１３）。
７．ユング（Ｊｕｎｇ），Ｓ．およびシュルセナー（Ｓｃｈｌｕｅｓｅｎｅｒ），Ｈ．Ｊ．、「Ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｐｏｉｎｔ－ｍｕｔａｔｅｄ， ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｒａｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ヒトＴリンパ球は、単一の点突然変異した発癌性ｒａｓタンパク質のペプチドを認識する）」、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７３、２７３－６（１９９１）。
８．ベルクマン－ライトナー（Ｂｅｒｇｍａｎｎ－Ｌｅｉｔｎｅｒ），Ｅ．Ｓ．，カントール（Ｋａｎｔｏｒ），Ｊ．Ａ．，シュペルト（Ｓｈｕｐｅｒｔ），Ｗ．Ｌ．，シュロム（Ｓｃｈｌｏｍ），Ｊ．およびアブラムズ（Ａｂｒａｍｓ），Ｓ．Ｉ．、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ＣＤ８＋ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｎｅｏ－ｅｐｉｔｏｐｅ ｃｒｅａｔｅｄ ｂｙ ａ ｒａｓ ｃｏｄｏｎ １２ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＨＬＡ－Ａ２ ａｌｌｅｌｅ（ＨＬＡ－Ａ２対立遺伝子によって拘束されるｒａｓコドン１２変異によって作製されたヒトＣＤ８＋Ｔリンパ球ネオエピトープの同定）」、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８７、１０３－１６（１９９８）。
９．クブショク（Ｋｕｂｕｓｃｈｏｋ），Ｂ．他、「Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ Ｔ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ ｍｕｔａｔｅｄ ｐ２１ ｒａｓ ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ（膵臓癌における変異ｐ２１ｒａｓ腫瘍性タンパク質に対する自然発生のＴ細胞応答）」、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１２、１３６５－７２（２００６）。
１０．ギェルツェン（Ｇｊｅｒｔｓｅｎ），Ｍ．Ｋ．，ビヨルハイム（Ｂｊｏｒｈｅｉｍ），Ｊ．，サーテルダル（Ｓａｅｔｅｒｄａｌ），Ｉ．，ミクレブスト（Ｍｙｋｌｅｂｕｓｔ），Ｊ．およびガウデルナック（Ｇａｕｄｅｒｎａｃｋ），Ｇ．、「Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ＣＤ４＋ ａｎｄ ＣＤ８＋ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ， ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｍｕｔａｎｔ ｐ２１－ｒａｓ（１２Ｖａｌ） ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐａｔｉｅｎｔ，ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ １２Ｖａｌ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｎｅｓｔｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｋｉｌｌ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｔｕｍｏｕｒ ｃｅｌｌｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｔｈｉｓ ｍｕｔａｔｉｏｎ（患者の変異したｐ２１－ｒａｓ（１２Ｖａｌ）ペプチドワクチン接種により生成された細胞傷害性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ワクチンペプチド内に存在する１２Ｖａｌ依存性のネステッドエピトープを認識し、この変異を有する自己の腫瘍細胞を死滅させる）」、Ｉｎｔ．Ｊ．ｃａｎｃｅｒ、７２、７８４－９０（１９９７）。
１１．トラン（Ｔｒａｎ），Ｅ．他、「Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｃａｎｃｅｒｓ（ヒト消化器癌における体細胞変異の免疫原性）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３５０、１３８７－９０（２０１５）。
１２．トラン（Ｔｒａｎ），Ｅ．他、「Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｍｕｔａｎｔ ＫＲＡＳ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ（癌の変異ＫＲＡＳを標的とするＴ細胞移植療法）」、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３７５、２２５５－２２６２（２０１６）。
１３．ワン（Ｗａｎｇ），Ｑ．Ｊ．他、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＫＲＡＳ－Ｍｕｔａｔｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｔｕｍｏｒｓ（ＫＲＡＳ変異ヒト腫瘍を標的とするＴ細胞受容体の同定）」、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．、４、２０４－１４（２０１６）。
１４．シャルマ（Ｓｈａｒｍａ），Ｇ．，ライブ（Ｒｉｖｅ），Ｃ．Ｍ．およびホルト（Ｈｏｌｔ），Ｒ．Ａ．、「Ｒａｐｉｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｆｒｏｍ ｌａｒｇｅ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｃｏｄｉｎｇ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（大規模なペプチドコーディングライブラリーからの機能的なＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープの迅速な選択と同定）」、Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１０、４５５３（２０１９）。
１５．ビイェン（Ｂｉｊｅｎ），Ｈ．Ｍ．他、「Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｔｏ Ｉｄｅｎｔｉｆｙ Ｏｆｆ－Ｔａｒｇｅｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｈｉｇｈ－Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＴＣＲｓ（高親和性ＴＣＲのオフターゲット毒性を特定するための前臨床戦略）」、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２６、１２０６－１２１４（２０１８）。
１６．ツェルキンスキー（Ｃｚｅｒｋｉｎｓｋｙ），Ｃ．Ｃ．，ニルソン（Ｎｉｌｓｓｏｎ），Ｌ．Ａ．，ニーグレン（Ｎｙｇｒｅｎ），Ｈ．，オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ），Ｏ．及びタルコウスキー（Ｔａｒｋｏｗｓｋｉ），Ａ．、「Ａ ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ （ＥＬＩＳＰＯＴ） ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ（特定の抗体分泌細胞を数えるための固相酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ）」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、６５、１０９－２１（１９８３）。
１７．ジャネツキー（Ｊａｎｅｔｚｋｉ），Ｓ．他、「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｌｉｓｐｏｔ ａｓｓａｙｓ（Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイの自動評価のガイドライン）」、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．、１０、１０９８－１１５（２０１５）。
１８．ドレオリニ（Ｄｒｅｏｌｉｎｉ），Ｌ．他、「Ａ Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（細胞治療製品のマイコプラズマスクリーニングのための迅速で高感度な核酸増幅技術）」、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．－Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．（２０２０）、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｏｍｔｍ．２０２０．０１．００９
１９．ロウ（Ｌｏｗ），Ｊ．Ｌ．，ナイドー（Ｎａｉｄｏｏ），Ａ．，エオ（Ｙｅｏ），Ｇ．，ゲーリング（Ｇｅｈｒｉｎｇ），Ａ．Ｊ．，ホウ（Ｈｏ），Ｚ．Ｚ．，ヤオ（Ｙａｕ），Ｙ．Ｈ．，グローテンブレク（Ｇｒｏｔｅｎｂｒｅｇ），Ｇ．Ｍ．（２０１２）、「Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ＴＣＲ ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ ａｎｄ ａ ＴＣＲ－ｌｉｋｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｉｎｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｉｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ＨＬＡ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ（ＴＣＲマルチマーと明確な微細特異性を持つＴＣＲ様抗体の結合は、ＨＬＡ複合体の表面密度に依存する）」、ＰｌｏＳ Ｏｎｅ、７（１２）、ｅ５１３９７、ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５１３９７。
１９．ロウ（Ｌｏｗ），Ｊ．Ｌ．，ナイドー（Ｎａｉｄｏｏ），Ａ．，エオ（Ｙｅｏ），Ｇ．，ゲーリング（Ｇｅｈｒｉｎｇ），Ａ．Ｊ．，ホウ（Ｈｏ），Ｚ．Ｚ．，ヤオ（Ｙａｕ），Ｙ．Ｈ．，グローテンブレク（Ｇｒｏｔｅｎｂｒｅｇ），Ｇ．Ｍ．（２０１２）、「Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ＴＣＲ ｍｕｌｔｉｍｅｒｓ ａｎｄ ａ ＴＣＲ－ｌｉｋｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｗｉｔｈ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｉｎｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｉｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ＨＬＡ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ（ＴＣＲマルチマーと明確な微細特異性を持つＴＣＲ様抗体の結合は、ＨＬＡ複合体の表面密度に依存する）」、ＰｌｏＳ Ｏｎｅ、７（１２）、ｅ５１３９７、ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５１３９７。
２０．リドゼック（Ｒｙｄｚｅｋ），Ｊ．，ネルレーター（Ｎｅｒｒｅｔｅｒ），Ｔ．，ペング（Ｐｅｎｇ），Ｈ．，ジュッツ（Ｊｕｔｚ），Ｓ．，ライトナー（Ｌｅｉｔｎｅｒ），Ｊ．，シュタインベルガー（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ），Ｐ．，フデセック（Ｈｕｄｅｃｅｋ），Ｍ．（２０１９）、「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｂｒａｒｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ａ ｎｏｖｅｌ ＮＦ－κＢ／ＮＦＡＴ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｃｅｌｌ ｐｌａｔｆｏｒｍ（新規ＮＦ－κＢ／ＮＦＡＴレポーター細胞プラットフォームを使用したキメラ抗原受容体ライブラリースクリーニング）」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、２７（２）、２８７－２９９、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｙｍｔｈｅ．２０１８．１１．０１５。
Claims (49)
- 抗原ターゲティング剤であって、ミスセンス変異を組み込んだペプチドがＨＬＡ－Ａ＊０２分子によって提示された場合に、１２位に同ミスセンス変異を有する変異したカーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）タンパク質に結合する抗原結合部位を含む、抗原ターゲティング剤。
- 前記ＫＲＡＳタンパク質の１２位の前記ミスセンス変異は、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２ＶまたはＧ１２Ｃである、請求項１に記載の抗原ターゲティング剤。
- 前記ＨＬＡ－Ａ＊０２分子がＨＬＡ－Ａ＊０２：０１である、請求項１または請求項２に記載の抗原ターゲティング剤。
- 前記ＫＲＡＳタンパク質の１２位の前記ミスセンス変異がＧ１２Ｖであり、前記ＨＬＡ－Ａ＊０２分子がＨＬＡ－Ａ０２：２５３、ＨＬＡ－Ａ０２：０３、ＨＬＡ－Ａ０２：２６４、ＨＬＡ－Ａ０２：２５８、ＨＬＡ－Ａ０２：２３０、ＨＬＡ－Ａ０２：６９、ＨＬＡ－Ａ０２：１１、ＨＬＡ－Ａ０２：１２８、ＨＬＡ－Ａ０２：１０４、ＨＬＡ－Ａ０２：２２、ＨＬＡ－Ａ０２：５０、ＨＬＡ－Ａ０２：２６、ＨＬＡ－Ａ０２：１７１、ＨＬＡ－Ａ０２：１４１、ＨＬＡ－Ａ０２：９９、ＨＬＡ－Ａ０２：１３、ＨＬＡ－Ａ０２：９０、ＨＬＡ－Ａ０２：１５８、ＨＬＡ－Ａ０２：１３１、ＨＬＡ－Ａ０２：１６、ＨＬＡ－Ａ０２：１０２、ＨＬＡ－Ａ０２：１５５、ＨＬＡ－Ａ０２：６３、ＨＬＡ－Ａ０２：０２、ＨＬＡ－Ａ０２：１８６、ＨＬＡ－Ａ０２：１１５、ＨＬＡ－Ａ０２：２０９、ＨＬＡ－Ａ０２：４７、ＨＬＡ－Ａ０２：２９、ＨＬＡ－Ａ０２：２６３、ＨＬＡ－Ａ０２：１１６、ＨＬＡ－Ａ０２：２４１、ＨＬＡ－Ａ０２：７１、ＨＬＡ－Ａ０２：５９、ＨＬＡ－Ａ０２：４０、ＨＬＡ－Ａ０２：１６６、ＨＬＡ－Ａ０２：２３８、ＨＬＡ－Ａ０２：１７６、ＨＬＡ－Ａ０２：７５、ＨＬＡ－Ａ０２：３０、ＨＬＡ－Ａ０２：１７４、ＨＬＡ－Ａ０２：２６６、ＨＬＡ－Ａ０２：１８７、ＨＬＡ－Ａ０２：８５、ＨＬＡ－Ａ０２：１６５、ＨＬＡ－Ａ０２：１６０、ＨＬＡ－Ａ０２：１８３、ＨＬＡ－Ａ０２：１８９、ＨＬＡ－Ａ０２：１３８、ＨＬＡ－Ａ０２：２２８、ＨＬＡ－Ａ０２：２６０、ＨＬＡ－Ａ０２：１０７、ＨＬＡ－Ａ０２：２１５、ＨＬＡ－Ａ０２：１８２、ＨＬＡ－Ａ０２：０９、ＨＬＡ－Ａ０２：１９２、ＨＬＡ－Ａ０２：１６３、ＨＬＡ－Ａ０２：２２１、ＨＬＡ－Ａ０２：１５９、ＨＬＡ－Ａ０２：１９４、ＨＬＡ－Ａ０２：１４０、ＨＬＡ－Ａ０２：２０６、ＨＬＡ－Ａ０２：７４、ＨＬＡ－Ａ０２：１９８、ＨＬＡ－Ａ０２：１２３、ＨＬＡ－Ａ０２：９５、ＨＬＡ－Ａ０２：１６８、ＨＬＡ－Ａ０２：１５０、ＨＬＡ－Ａ０２：２１０、ＨＬＡ－Ａ０２：８６、ＨＬＡ－Ａ０２：２３５、ＨＬＡ－Ａ０２：２３７、ＨＬＡ－Ａ０２：２０８、ＨＬＡ－Ａ０２：２１２、ＨＬＡ－Ａ０２：２０１、ＨＬＡ－Ａ０２：１２０、ＨＬＡ－Ａ０２：２４０、ＨＬＡ－Ａ０２：２１１、ＨＬＡ－Ａ０２：１７５、ＨＬＡ－Ａ０２：１６２、ＨＬＡ－Ａ０２：１２１、ＨＬＡ－Ａ０２：８９、ＨＬＡ－Ａ０２：２２０、ＨＬＡ－Ａ０２：１６４、ＨＬＡ－Ａ０２：１９０、ＨＬＡ－Ａ０２：１５７、ＨＬＡ－Ａ０２：９６、ＨＬＡ－Ａ０２：２５６、ＨＬＡ－Ａ０２：２３４、ＨＬＡ－Ａ０２：９７、ＨＬＡ－Ａ０２：２０４、ＨＬＡ－Ａ０２：７０、ＨＬＡ－Ａ０２：７７、ＨＬＡ－Ａ０２：９３、ＨＬＡ－Ａ０２：１８１、ＨＬＡ－Ａ０２：１１１、ＨＬＡ－Ａ０２：１１８、ＨＬＡ－Ａ０２：１９６、ＨＬＡ－Ａ０２：１８５、ＨＬＡ－Ａ０２：２１４、ＨＬＡ－Ａ０２：１９３、ＨＬＡ－Ａ０２：２００、ＨＬＡ－Ａ０２：２５、ＨＬＡ－Ａ０２：１７３、ＨＬＡ－Ａ０２：１７７、ＨＬＡ－Ａ０２：２０７、ＨＬＡ－Ａ０２：２５７、ＨＬＡ－Ａ０２：２０３、ＨＬＡ－Ａ０２：１９９、ＨＬＡ－Ａ０２：６６、ＨＬＡ－Ａ０２：０１、ＨＬＡ－Ａ０２：２１６、ＨＬＡ－Ａ０２：１３３、ＨＬＡ－Ａ０２：１１９、ＨＬＡ－Ａ０２：１５３、ＨＬＡ－Ａ０２：２５１、ＨＬＡ－Ａ０２：１４５、ＨＬＡ－Ａ０２：２４、ＨＬＡ－Ａ０２：１９７、ＨＬＡ－Ａ０２：２３６、ＨＬＡ－Ａ０２：１４９、ＨＬＡ－Ａ０２：６８、ＨＬＡ－Ａ０２：２１８、ＨＬＡ－Ａ０２：２０５、ＨＬＡ－Ａ０２：３１、ＨＬＡ－Ａ０２：２３９、ＨＬＡ－Ａ０２：１０９、ＨＬＡ－Ａ０２：６７、ＨＬＡ－Ａ０２：１３２、ＨＬＡ－Ａ０２：１３４、ＨＬＡ－Ａ０２：２５２、ＨＬＡ－Ａ０２：２０２、ＨＬＡ－Ａ０２：２１３、ＨＬＡ－Ａ０２：３５、ＨＬＡ－Ａ０２：１６１、ＨＬＡ－Ａ０２：２４５、ＨＬＡ－Ａ０２：７３、ＨＬＡ－Ａ０２：１０５、ＨＬＡ－Ａ０２：１２、ＨＬＡ－Ａ０２：２７、ＨＬＡ－Ａ０２：１４８、ＨＬＡ－Ａ０２：１３９、ＨＬＡ－Ａ０２：７８、ＨＬＡ－Ａ０２：２６２、ＨＬＡ－Ａ０２：３８、ＨＬＡ－Ａ０２：４１、ＨＬＡ－Ａ０２：１６７、ＨＬＡ－Ａ０２：５８、ＨＬＡ－Ａ０２：３４、ＨＬＡ－Ａ０２：２０、ＨＬＡ－Ａ０２：２３３、ＨＬＡ－Ａ０２：１４７、ＨＬＡ－Ａ０２：１５１、ＨＬＡ－Ａ０２：４２、ＨＬＡ－Ａ０２：６０、ＨＬＡ－Ａ０２：６２、ＨＬＡ－Ａ０２：１２６、ＨＬＡ－Ａ０２：５１、ＨＬＡ－Ａ０２：６１、ＨＬＡ－Ａ０２：７９、ＨＬＡ－Ａ０２：１３７、ＨＬＡ－Ａ０２：１７０、ＨＬＡ－Ａ０２：０６、ＨＬＡ－Ａ０２：２８、ＨＬＡ－Ａ０２：７２、ＨＬＡ－Ａ０２：２５９、ＨＬＡ－Ａ０２：１８０、ＨＬＡ－Ａ０２：９１、ＨＬＡ－Ａ０２：２４８、ＨＬＡ－Ａ０２：１０６、ＨＬＡ－Ａ０２：１４４、ＨＬＡ－Ａ０２：２１、ＨＬＡ－Ａ０２：４４、ＨＬＡ－Ａ０２：１４２、ＨＬＡ－Ａ０２：１２２、ＨＬＡ－Ａ０２：４８、ＨＬＡ－Ａ０２：１２７、ＨＬＡ－Ａ０２：５２、ＨＬＡ－Ａ０２：２５４、ＨＬＡ－Ａ０２：２４３、ＨＬＡ－Ａ０２：２２４、ＨＬＡ－Ａ０２：３６、ＨＬＡ－Ａ０２：１６９、またはＨＬＡ－Ａ０２：１０１分子である、請求項１または請求項２に記載の抗原ターゲティング剤。
- 前記ＫＲＡＳタンパク質の１２位の前記ミスセンス変異がＧ１２Ｄであり、ＨＬＡ－Ａ＊０２分子がＨＬＡ－Ａ０２：０３、ＨＬＡ－Ａ０２：２５３、ＨＬＡ－Ａ０２：２３０、ＨＬＡ－Ａ０２：２５８、ＨＬＡ－Ａ０２：２６４、ＨＬＡ－Ａ０２：１１、ＨＬＡ－Ａ０２：６９、ＨＬＡ－Ａ０２：１２８、ＨＬＡ－Ａ０２：２２、ＨＬＡ－Ａ０２：１０４、ＨＬＡ－Ａ０２：５０、ＨＬＡ－Ａ０２：２６、ＨＬＡ－Ａ０２：１７１、ＨＬＡ－Ａ０２：９９、ＨＬＡ－Ａ０２：１３、ＨＬＡ－Ａ０２：０２、ＨＬＡ－Ａ０２：６３、ＨＬＡ－Ａ０２：１０２、ＨＬＡ－Ａ０２：１１５、ＨＬＡ－Ａ０２：２０９、ＨＬＡ－Ａ０２：１５５、ＨＬＡ－Ａ０２：１８６、ＨＬＡ－Ａ０２：１４１、ＨＬＡ－Ａ０２：９０、ＨＬＡ－Ａ０２：４７、ＨＬＡ－Ａ０２：１５８、ＨＬＡ－Ａ０２：１６、ＨＬＡ－Ａ０２：１３１、ＨＬＡ－Ａ０２：１４８、ＨＬＡ－Ａ０２：２６３、ＨＬＡ－Ａ０２：２９、ＨＬＡ－Ａ０２：１２、ＨＬＡ－Ａ０２：１１６、ＨＬＡ－Ａ０２：２７、ＨＬＡ－Ａ０２：１０５、ＨＬＡ－Ａ０２：７３、ＨＬＡ－Ａ０２：２４５、ＨＬＡ－Ａ０２：０１、ＨＬＡ－Ａ０２：０９、ＨＬＡ－Ａ０２：３１、ＨＬＡ－Ａ０２：４０、ＨＬＡ－Ａ０２：２４、ＨＬＡ－Ａ０２：２５、ＨＬＡ－Ａ０２：３０、ＨＬＡ－Ａ０２：５９、ＨＬＡ－Ａ０２：６６、ＨＬＡ－Ａ０２：６７、ＨＬＡ－Ａ０２：６８、ＨＬＡ－Ａ０２：７０、ＨＬＡ－Ａ０２：７１、ＨＬＡ－Ａ０２：７４、ＨＬＡ－Ａ０２：７５、ＨＬＡ－Ａ０２：７７、ＨＬＡ－Ａ０２：８５、ＨＬＡ－Ａ０２：８６、ＨＬＡ－Ａ０２：８９、ＨＬＡ－Ａ０２：９３、ＨＬＡ－Ａ０２：９５、ＨＬＡ－Ａ０２：９６、ＨＬＡ－Ａ０２：９７、ＨＬＡ－Ａ０２：１０７、ＨＬＡ－Ａ０２：１０９、ＨＬＡ－Ａ０２：１１１、ＨＬＡ－Ａ０２：１１８、ＨＬＡ－Ａ０２：１１９、ＨＬＡ－Ａ０２：１２０、ＨＬＡ－Ａ０２：１７３、ＨＬＡ－Ａ０２：１７４、ＨＬＡ－Ａ０２：１７５、ＨＬＡ－Ａ０２：１７６、ＨＬＡ－Ａ０２：１７７、ＨＬＡ－Ａ０２：１８１、ＨＬＡ－Ａ０２：２１２、ＨＬＡ－Ａ０２：２１３、ＨＬＡ－Ａ０２：２１４、ＨＬＡ－Ａ０２：２１５、ＨＬＡ－Ａ０２：２１６、ＨＬＡ－Ａ０２：２１８、ＨＬＡ－Ａ０２：２２０、ＨＬＡ－Ａ０２：２２１、ＨＬＡ－Ａ０２：２０２、ＨＬＡ－Ａ０２：２０３、ＨＬＡ－Ａ０２：２０４、ＨＬＡ－Ａ０２：２０５、ＨＬＡ－Ａ０２：２０６、ＨＬＡ－Ａ０２：２０７、ＨＬＡ－Ａ０２：２０８、ＨＬＡ－Ａ０２：２１０、ＨＬＡ－Ａ０２：２１１、ＨＬＡ－Ａ０２：２３７、ＨＬＡ－Ａ０２：２３８、ＨＬＡ－Ａ０２：２３９、ＨＬＡ－Ａ０２：２４０、ＨＬＡ－Ａ０２：２４１、ＨＬＡ－Ａ０２：１３２、ＨＬＡ－Ａ０２：１３３、ＨＬＡ－Ａ０２：１３４、ＨＬＡ－Ａ０２：１３８、ＨＬＡ－Ａ０２：１４０、ＨＬＡ－Ａ０２：１５３、ＨＬＡ－Ａ０２：１５７、ＨＬＡ－Ａ０２：１５９、ＨＬＡ－Ａ０２：１６０、ＨＬＡ－Ａ０２：１６２、ＨＬＡ－Ａ０２：１６３、ＨＬＡ－Ａ０２：１６４、ＨＬＡ－Ａ０２：１６５、ＨＬＡ－Ａ０２：１６６、ＨＬＡ－Ａ０２：１６８、ＨＬＡ－Ａ０２：２５１、ＨＬＡ－Ａ０２：２５２、ＨＬＡ－Ａ０２：２５６、ＨＬＡ－Ａ０２：２５７、ＨＬＡ－Ａ０２：１４５、ＨＬＡ－Ａ０２：１４９、ＨＬＡ－Ａ０２：１５０、ＨＬＡ－Ａ０２：１９２、ＨＬＡ－Ａ０２：１９３、ＨＬＡ－Ａ０２：１９４、ＨＬＡ－Ａ０２：１９６、ＨＬＡ－Ａ０２：１９７、ＨＬＡ－Ａ０２：１９８、ＨＬＡ－Ａ０２：１９９、ＨＬＡ－Ａ０２：２００、ＨＬＡ－Ａ０２：２０１、ＨＬＡ－Ａ０２：２２８、ＨＬＡ－Ａ０２：２３４、ＨＬＡ－Ａ０２：２３５、ＨＬＡ－Ａ０２：２３６、ＨＬＡ－Ａ０２：２６０、ＨＬＡ－Ａ０２：２６６、ＨＬＡ－Ａ０２：１８２、ＨＬＡ－Ａ０２：１８３、ＨＬＡ－Ａ０２：１８５、ＨＬＡ－Ａ０２：１８７、ＨＬＡ－Ａ０２：１８９、ＨＬＡ－Ａ０２：１９０、ＨＬＡ－Ａ０２：１２１、ＨＬＡ－Ａ０２：１２３、ＨＬＡ－Ａ０２：１６１、ＨＬＡ－Ａ０２：３５、ＨＬＡ－Ａ０２：３８、ＨＬＡ－Ａ０２：１３９、ＨＬＡ－Ａ０２：２６２、ＨＬＡ－Ａ０２：４１、ＨＬＡ－Ａ０２：５８、ＨＬＡ－Ａ０２：２３３、ＨＬＡ－Ａ０２：１４７、ＨＬＡ－Ａ０２：１５１、ＨＬＡ－Ａ０２：１６７、ＨＬＡ－Ａ０２：２０、ＨＬＡ－Ａ０２：１２２、ＨＬＡ－Ａ０２：４４、ＨＬＡ－Ａ０２：１４２、ＨＬＡ－Ａ０２：３４、ＨＬＡ－Ａ０２：４２、ＨＬＡ－Ａ０２：７８、ＨＬＡ－Ａ０２：０６、ＨＬＡ－Ａ０２：２１、ＨＬＡ－Ａ０２：２８、ＨＬＡ－Ａ０２：５１、ＨＬＡ－Ａ０２：６１、ＨＬＡ－Ａ０２：７２、ＨＬＡ－Ａ０２：７９、ＨＬＡ－Ａ０２：９１、ＨＬＡ－Ａ０２：１０６、ＨＬＡ－Ａ０２：１８０、ＨＬＡ－Ａ０２：１３７、ＨＬＡ－Ａ０２：１７０、ＨＬＡ－Ａ０２：２４８、ＨＬＡ－Ａ０２：１４４、ＨＬＡ－Ａ０２：２５９、ＨＬＡ－Ａ０２：１２６、ＨＬＡ－Ａ０２：２４３、ＨＬＡ－Ａ０２：５２、ＨＬＡ－Ａ０２：４８、ＨＬＡ－Ａ０２：６０、ＨＬＡ－Ａ０２：６２、ＨＬＡ－Ａ０２：１２７、またはＨＬＡ－Ａ０２：２２９分子である、請求項１または請求項２に記載の抗原ターゲティング剤。
- 前記ＫＲＡＳタンパク質の１２位の前記ミスセンス変異がＧ１２Ｃであり、ＨＬＡ－Ａ＊０２分子がＨＬＡ－Ａ０２：２５３、ＨＬＡ－Ａ０２：０３、ＨＬＡ－Ａ０２：２６４、ＨＬＡ－Ａ０２：２５８、ＨＬＡ－Ａ０２：２３０、ＨＬＡ－Ａ０２：６９、ＨＬＡ－Ａ０２：１１、ＨＬＡ－Ａ０２：１０４、ＨＬＡ－Ａ０２：２２、ＨＬＡ－Ａ０２：５０、ＨＬＡ－Ａ０２：１２８、ＨＬＡ－Ａ０２：２６、ＨＬＡ－Ａ０２：１７１、ＨＬＡ－Ａ０２：９９、ＨＬＡ－Ａ０２：１０２、ＨＬＡ－Ａ０２：１５５、ＨＬＡ－Ａ０２：６３、ＨＬＡ－Ａ０２：０２、ＨＬＡ－Ａ０２：１８６、ＨＬＡ－Ａ０２：１１５、ＨＬＡ－Ａ０２：２０９、ＨＬＡ－Ａ０２：４７、ＨＬＡ－Ａ０２：１３、ＨＬＡ－Ａ０２：１４１、ＨＬＡ－Ａ０２：９０、ＨＬＡ－Ａ０２：１４８、ＨＬＡ－Ａ０２：１５８、ＨＬＡ－Ａ０２：１３１、ＨＬＡ－Ａ０２：１６、ＨＬＡ－Ａ０２：２６３、ＨＬＡ－Ａ０２：１１６、ＨＬＡ－Ａ０２：２９、ＨＬＡ－Ａ０２：３５、ＨＬＡ－Ａ０２：３８、ＨＬＡ－Ａ０２：１０５、ＨＬＡ－Ａ０２：１２、ＨＬＡ－Ａ０２：２４５、ＨＬＡ－Ａ０２：７３、ＨＬＡ－Ａ０２：２４１、ＨＬＡ－Ａ０２：７１、ＨＬＡ－Ａ０２：５９、ＨＬＡ－Ａ０２：４０、ＨＬＡ－Ａ０２：１６６、ＨＬＡ－Ａ０２：２３８、ＨＬＡ－Ａ０２：１７６、ＨＬＡ－Ａ０２：７５、ＨＬＡ－Ａ０２：３０、ＨＬＡ－Ａ０２：１７４、ＨＬＡ－Ａ０２：２６６、ＨＬＡ－Ａ０２：１８７、ＨＬＡ－Ａ０２：８５、ＨＬＡ－Ａ０２：１６５、ＨＬＡ－Ａ０２：１６０、ＨＬＡ－Ａ０２：１８３、ＨＬＡ－Ａ０２：１８９、ＨＬＡ－Ａ０２：１３８、ＨＬＡ－Ａ０２：２２８、ＨＬＡ－Ａ０２：２６０、ＨＬＡ－Ａ０２：１０７、ＨＬＡ－Ａ０２：２１５、ＨＬＡ－Ａ０２：１８２、ＨＬＡ－Ａ０２：０９、ＨＬＡ－Ａ０２：１９２、ＨＬＡ－Ａ０２：１６３、ＨＬＡ－Ａ０２：２２１、ＨＬＡ－Ａ０２：１５９、ＨＬＡ－Ａ０２：１９４、ＨＬＡ－Ａ０２：１４０、ＨＬＡ－Ａ０２：２０６、ＨＬＡ－Ａ０２：７４、ＨＬＡ－Ａ０２：１９８、ＨＬＡ－Ａ０２：１２３、ＨＬＡ－Ａ０２：９５、ＨＬＡ－Ａ０２：１６８、ＨＬＡ－Ａ０２：１５０、ＨＬＡ－Ａ０２：２１０、ＨＬＡ－Ａ０２：８６、ＨＬＡ－Ａ０２：２３５、ＨＬＡ－Ａ０２：２３７、ＨＬＡ－Ａ０２：２０８、ＨＬＡ－Ａ０２：２１２、ＨＬＡ－Ａ０２：２０１、ＨＬＡ－Ａ０２：１２０、ＨＬＡ－Ａ０２：２４０、ＨＬＡ－Ａ０２：２１１、ＨＬＡ－Ａ０２：１７５、ＨＬＡ－Ａ０２：１６２、ＨＬＡ－Ａ０２：１２１、ＨＬＡ－Ａ０２：８９、ＨＬＡ－Ａ０２：２２０、ＨＬＡ－Ａ０２：１６４、ＨＬＡ－Ａ０２：１９０、ＨＬＡ－Ａ０２：１５７、ＨＬＡ－Ａ０２：９６、ＨＬＡ－Ａ０２：２５６、ＨＬＡ－Ａ０２：２３４、ＨＬＡ－Ａ０２：９７、ＨＬＡ－Ａ０２：２０４、ＨＬＡ－Ａ０２：７０、ＨＬＡ－Ａ０２：７７、ＨＬＡ－Ａ０２：９３、ＨＬＡ－Ａ０２：１８１、ＨＬＡ－Ａ０２：１１１、ＨＬＡ－Ａ０２：１１８、ＨＬＡ－Ａ０２：１９６、ＨＬＡ－Ａ０２：１８５、ＨＬＡ－Ａ０２：２１４、ＨＬＡ－Ａ０２：１９３、ＨＬＡ－Ａ０２：２００、ＨＬＡ－Ａ０２：２５、ＨＬＡ－Ａ０２：１７３、ＨＬＡ－Ａ０２：１７７、ＨＬＡ－Ａ０２：２０７、ＨＬＡ－Ａ０２：２５７、ＨＬＡ－Ａ０２：２０３、ＨＬＡ－Ａ０２：１９９、ＨＬＡ－Ａ０２：６６、ＨＬＡ－Ａ０２：０１、ＨＬＡ－Ａ０２：２１６、ＨＬＡ－Ａ０２：１３３、ＨＬＡ－Ａ０２：１１９、ＨＬＡ－Ａ０２：１５３、ＨＬＡ－Ａ０２：２５１、ＨＬＡ－Ａ０２：１４５、ＨＬＡ－Ａ０２：２４、ＨＬＡ－Ａ０２：１９７、ＨＬＡ－Ａ０２：２３６、ＨＬＡ－Ａ０２：１４９、ＨＬＡ－Ａ０２：６８、ＨＬＡ－Ａ０２：２１８、ＨＬＡ－Ａ０２：２０５、ＨＬＡ－Ａ０２：３１、ＨＬＡ－Ａ０２：２３９、ＨＬＡ－Ａ０２：１０９、ＨＬＡ－Ａ０２：６７、ＨＬＡ－Ａ０２：１３２、ＨＬＡ－Ａ０２：１３４、ＨＬＡ－Ａ０２：２５２、ＨＬＡ－Ａ０２：２０２、ＨＬＡ－Ａ０２：２１３、ＨＬＡ－Ａ０２：１６１、ＨＬＡ－Ａ０２：１２２、ＨＬＡ－Ａ０２：２７、ＨＬＡ－Ａ０２：２６２、ＨＬＡ－Ａ０２：２３３、ＨＬＡ－Ａ０２：４１、ＨＬＡ－Ａ０２：１３９、ＨＬＡ－Ａ０２：４４、ＨＬＡ－Ａ０２：１４２、ＨＬＡ－Ａ０２：５８、ＨＬＡ－Ａ０２：２２９、ＨＬＡ－Ａ０２：１６７、ＨＬＡ－Ａ０２：１４７、またはＨＬＡ－Ａ０２：１５１分子である、請求項１または請求項２に記載の抗原ターゲティング剤。
- 請求項１～６のいずれか一項に記載の抗原ターゲティング剤であって、第１の鎖および第２の鎖を含み、前記第１の鎖および前記第２の鎖のそれぞれは、第１、第２および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有し、前記第１の鎖の第３のＣＤＲは、配列番号３０または配列番号３４のアミノ酸配列を含み、前記第２の鎖の第３のＣＤＲは、配列番号３２または配列番号３６のアミノ酸配列を含む、抗原ターゲティング剤。
- 前記第１の鎖は、ＴＲＡＶ２７＊０１（配列番号：６）のアミノ酸配列またはＴＲＡＶ１３－２＊０１（配列番号：１０）のアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗原ターゲティング剤。
- 前記第２の鎖は、ＴＲＢＶ１９＊０１（配列番号８）のアミノ酸配列またはＴＲＢＶ０４－１＊０１（配列番号１２）のアミノ酸配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗原ターゲティング剤。
- 前記第１の鎖の前記第１のＣＤＲが配列番号１４または配列番号１８を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗原ターゲティング剤。
- 前記第１の鎖の前記第２のＣＤＲが配列番号１６または配列番号２０を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗原ターゲティング剤。
- 前記第２の鎖の前記第１のＣＤＲが配列番号２２または配列番号２６を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗原ターゲティング剤。
- 前記第２の鎖の前記第２のＣＤＲが配列番号２４または配列番号２８を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗原ターゲティング剤。
- 請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗原ターゲティング剤であって、
前記第１の鎖は、その第１、第２および第３のＣＤＲとして、それぞれ、配列番号１４、配列番号１６および配列番号３０を含み、前記第２の鎖は、その第１、第２および第３のＣＤＲとして、それぞれ、配列番号２２、配列番号２６および配列番号３２を含むか、
前記第１の鎖は、その第１、第２および第３のＣＤＲとして、それぞれ、配列番号１８、配列番号２０および配列番号３４を含み、前記第２の鎖は、その第１、第２および第３のＣＤＲとして、それぞれ、配列番号２２、配列番号２４および配列番号３２を含むか、
前記第１の鎖は、その第１、第２および第３のＣＤＲとして、それぞれ、配列番号１４、配列番号１６および配列番号３０を含み、前記第２の鎖は、その第１、第２および第３のＣＤＲとして、それぞれ、配列番号２６、配列番号２８および配列番号３６を含むか；あるいは
前記第１の鎖が、その第１、第２および第３のＣＤＲとして、それぞれ、配列番号１８、配列番号２０および配列番号３４を含み、前記第２の鎖が、その第１、第２および第３のＣＤＲとして、それぞれ、配列番号２６、配列番号２８および配列番号３６を含む、抗原ターゲティング剤。 - 請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗原ターゲティング剤であって、
前記ＫＲＡＳの１２位のミスセンス変異がＧ１２Ｖであり、前記第１の鎖の前記第３のＣＤＲが配列番号３０のアミノ酸配列を有し、前記第２の鎖の前記第３のＣＤＲが配列番号３２のアミノ酸配列を有するか；
前記ＫＲＡＳの１２位のミスセンス変異がＧ１２Ｄであり、前記第１の鎖の前記第３のＣＤＲが配列番号３４のアミノ酸配列を有し、前記第２の鎖の前記第３のＣＤＲが配列番号３２のアミノ酸配列を有するか；あるいは
前記ＫＲＡＳの１２位のミスセンス変異がＧ１２Ｄであり、前記第１の鎖の前記第３のＣＤＲが配列番号３０のアミノ酸配列を有し、前記第２の鎖の前記第３のＣＤＲが配列番号３６のアミノ酸配列を有する、抗原ターゲティング剤。 - 前記抗原ターゲティング剤の前記第１の鎖および前記第２の鎖は、一本鎖ポリペプチドを含むか、あるいは前記抗原ターゲティング剤の前記第１の鎖および前記第２の鎖は、２つの別々のポリペプチドを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の抗原ターゲティング剤。
- 前記抗原ターゲティング剤の前記第１の鎖および前記第２の鎖は、前記第１の鎖および前記第２の鎖がインビボで２つの別々のポリペプチドに切断されるかまたは翻訳されるように、前記第１の鎖および前記第２の鎖を介在させる適切な配列を有する一本鎖ポリペプチドとして発現されるように構成されており、前記適切な配列は、任意にＴ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２ＡまたはＩＲＥＳ配列を含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の抗原ターゲティング剤。
- 前記抗原ターゲティング剤がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗原ターゲティング剤。
- 前記第１の鎖が前記ＴＣＲのα鎖を含み、前記第２の鎖が前記ＴＣＲのβ鎖を含む、請求項１８に記載の抗原ターゲティング剤。
- 前記第１の鎖が前記ＴＣＲのγ鎖を含み、前記第２の鎖が前記ＴＣＲのδ鎖を含む、請求項１８に記載の抗原ターゲティング剤。
- 前記ＴＣＲの定常領域がマウス定常領域を含む、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の抗原ターゲティング剤。
- 前記抗原ターゲティング剤がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み、前記第１の鎖および前記第２の鎖のそれぞれの３つの相補性決定領域が、共刺激性ドメインとともに一本鎖ポリペプチドとして発現するように構成されている、請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗原ターゲティング剤。
- 前記抗原ターゲティング剤は二重特異性抗体であり、前記二重特異性抗体は、ミスセンス変異を組み込んだペプチドがＨＬＡ－Ａ＊０２分子によって提示された場合に、１２位に同ミスセンス変異を有するＫＲＡＳタンパク質に結合する抗原結合部位を含む第１のドメインと、細胞傷害性細胞を動員するように構成された抗原結合部位を含む第２のドメインとを有する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗原ターゲティング剤。
- 前記二重特異性抗体の第２のドメインは、ＣＤ３に結合する、請求項２３に記載の抗原ターゲティング剤。
- 前記抗原ターゲティング剤は、前記ＫＲＡＳタンパク質の１２位に前記ミスセンス変異を組み込んだペプチドがＨＬＡ－Ａ＊０２分子によって提示された場合に、同ペプチドに特異的に結合する、請求項１～２４のいずれか一項に記載の抗原ターゲティング剤。
- 前記Ｔ細胞受容体が、配列番号３８、４０、４２または４４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の抗原ターゲティング剤。
- 前記抗原ターゲティング剤が同抗原ターゲティング剤を発現するように遺伝子操作された細胞によって発現される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の抗原ターゲティング剤。
- 請求項１～２７のいずれか一項に記載の、単離されたまたは精製された抗原ターゲティング剤。
- 請求項１～２８のいずれか一項に記載の抗原ターゲティング剤をコードするＤＮＡ配列を有する単離された核酸分子。
- 配列番号３７、３９、４１、４３、４５、４６、４７または４８のいずれか１つのヌクレオチド配列を有する、請求項２９に記載の単離された核酸分子。
- 請求項１～２８のいずれか一項に記載の抗原ターゲティング剤および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
- 請求項１～２８のいずれか一項に記載の抗原ターゲティング剤を発現するように遺伝子操作された細胞傷害性細胞。
- 請求項２９または請求項３０のいずれかに記載の核酸分子を含む細胞傷害性細胞。
- 前記細胞傷害性細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはナチュラルキラー細胞である、請求項３２または請求項３３のいずれかに記載の細胞傷害性細胞。
- ＨＬＡ－Ａ＊０２分子が提示する１２位にミスセンス変異を有するＫＲＡＳペプチドに結合する抗原ターゲティング剤を発現することができる細胞傷害性細胞を製造する方法であって、前記方法は、
供給源から前記細胞傷害性細胞を得ることと、
請求項２９または請求項３０のいずれかに記載の核酸分子を含むヌクレオチドベクターを用いて、前記細胞傷害性細胞を遺伝子工学的に操作することと、
を含む方法。 - 哺乳動物対象において養子細胞療法を実施する方法であって、請求項３５に記載の方法を実施することと、遺伝子操作された細胞傷害性細胞を増殖することと、増殖された細胞を前記対象に再導入することと、を含む、方法。
- 前記細胞傷害性細胞の前記供給源が前記対象である、請求項３６に記載の方法。
- 前記細胞傷害性細胞の前記供給源が同種発生源である、請求項３６に記載の方法。
- 請求項２３または請求項２４のいずれかに記載の抗原ターゲティング剤を哺乳動物対象に投与することを含む免疫療法を実施する方法。
- 前記対象からのサンプルの配列を決定して、１２位にミスセンス変異を有するＫＲＡＳの存在を確認することを含む、請求項３５～３９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象がＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子を有することを確認するためにＨＬＡタイピングを実施することを含む、請求項３５～４０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象がＨＬＡ－Ａ＊０２：０１対立遺伝子を有することを確認するためにＨＬＡタイピングを実施することを含む、請求項４１に記載の方法。
- 請求項３６～４２のいずれか一項に記載の養子細胞療法または免疫療法を実施する方法であって、前記方法は癌を治療するために使用される方法。
- 哺乳動物における癌の検出方法であって、前記方法は、
前記対象から得られた細胞を含むサンプルを、請求項１～２８または３２～３４のいずれか一項に記載の抗原ターゲティング剤または細胞傷害性細胞と接触させることと；
前記細胞がＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原を発現している場合、前記抗原ターゲティング剤または前記細胞傷害性細胞が前記ＫＲＡＳＧ１２Ｘ抗原と結合してそれにより複合体を形成することと；
前記複合体の存在を検出することと、
を含み、前記複合体の存在が前記哺乳動物における癌を示す方法。 - 哺乳動物対象における癌の検出方法であって、前記方法は、
前記対象からサンプルを得ることと、
前記サンプルからの細胞を、ＨＬＡ－Ａ＊０２分子が示すＫＲＡＳＧ１２Ｘペプチドに結合可能な細胞傷害性細胞と共培養することであって、同細胞傷害性細胞が、請求項１～２８のいずれか一項に記載の抗原ターゲティング剤を発現している前記共培養することと、
細胞毒性活性の指標を評価することであって、前記細胞毒性活性の指標の存在またはレベルの上昇が、ＫＲＡＳの１２位のミスセンス変異を伴う癌を示す前記評価することと、
を含む方法。 - 前記細胞毒性活性の指標が、前記細胞毒性活性および／または前記サンプルからの細胞の細胞死を示す分子の発現の増加を含む、請求項４５に記載の方法。
- 前記細胞毒性活性の指標が、インターフェロンガンマを含む、請求項４６に記載の方法。
- 前記癌が、膵臓癌、結腸直腸癌、直腸癌、肺癌、子宮内膜癌、卵巣癌、前立腺癌、または白血病を含む、請求項４３～４７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記哺乳動物対象がヒトである、請求項３６～４７のいずれか一項に記載の方法。
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