TW202320827A - 用於治療癌症之檢查點抑制劑和溶瘤病毒的組合 - Google Patents

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馬庫斯 莫爾斯
加文 瑟斯頓
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Abstract

本發明是有關溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑和CTLA4抑制劑的新穎三重療法，其用於治療或抑制癌症患者的腫瘤生長。

Description

用於治療癌症之檢查點抑制劑和溶瘤病毒的組合
本發明大體上是有關於利用溶瘤病毒和檢查點抑制劑(諸如計畫性死亡1 (PD-1)路徑抑制劑及細胞毒性T淋巴細胞抗原-4 (CTLA4)抑制劑)進行癌症治療的組合療法。
直到最近，癌症免疫療法大致上已專注於藉由經活化效應子細胞的過繼轉移、針對相關抗原的免疫接種或提供非特異性免疫刺激劑(諸如細胞激素)來提高抗腫瘤免疫反應的方法上。但是，在過去十年內，開發特異性免疫檢查點路徑抑制劑的深入努力已經開始為治療癌症提供新的免疫治療方法，包括開發抗PD-1抗體和抗CTLA4抗體。
PD-1 (也稱為CD279)在自體免疫、抗感染免疫和抗腫瘤免疫中扮演重要作用。已經在癌症和慢性病毒感染的治療中研究了用拮抗劑(包括單株抗體)阻斷PD-1。阻斷PD-1也是一種有效且耐受性良好的刺激免疫反應的方法，並且在針對各種人類癌症(包括黑色素瘤、腎細胞癌(RCC)和非小細胞肺癌(NSCLC))方面達到治療優勢。(Sheridan 2012, Nat. Biotechnol., 30:729-730；Postow et al., 2015, J Clin Oncol, 33:1974-1982)。
CTLA4 (也稱為CD152)是一種第I型跨膜T細胞抑制性檢查點受體，表現在常規和調節性T細胞上。CTLA4藉由競爭贏過與其共有的天然配體B7-1 (CD80)和B7-2 (CD86)的刺激性受體CD28來負向調節T細胞活化。
最初的T細胞活化是藉由刺激T細胞受體(TCR)來實現的，該受體辨識抗原呈現細胞(APC)上的第I類或第II類主要組織相容性複合體(MHCI或MHCII)蛋白所呈現的特定肽(Goldrath et al. 1999, Nature402: 255-262)。經活化的TCR複合體復而啟動由啟動子驅動的級聯訊息傳遞事件，這些啟動子調節各種轉錄因子(轉錄因子為諸如活化因子蛋白1 (AP-1)、經活化T細胞的核因子(NFAT)或經活化B細胞的核因子κ輕鏈增強子(NF-κ-B))的表現。然後經由接合T細胞上組成型或誘導型表現的共刺激性或共抑制性受體(諸如CD28、CTLA4、PD-1、淋巴細胞活化基因3 (LAG-3)或其他分子)，進一步調控T細胞反應(Sharpe et al. 2002, Nat. Rev. Immunol. 2: 116-126)。
溶瘤病毒也有望用於治療癌症。這些病毒感染、特異性複製並殺死惡性細胞，使正常組織不受影響。幾種溶瘤病毒已達到治療多種腫瘤的臨床評估後期。然而，腫瘤的免疫抑制和病毒的過早清除通常只會導致較弱的腫瘤特異性免疫反應，從而限制了這些病毒作為癌症治療劑的潛力。
因此，強烈需要更為有效用於癌症治療的療法，包括如本文所揭示之包含溶瘤病毒和檢查點抑制劑(諸如PD-1路徑抑制劑和CTLA4抑制劑)的組合療法。
在一個態樣中，所揭示的技術是有關一種治療或抑制腫瘤生長的方法，包括：(a)挑選患有癌症的患者；以及(b)向有需要的患者投予：(i)治療有效量的溶瘤病毒組合以(ii)治療有效量的計畫性死亡1(PD-1)路徑抑制劑，和(iii)治療有效量的細胞毒性T淋巴細胞抗原4(CTLA4)抑制劑。在一些實施例中，溶瘤病毒包括溶瘤水泡病毒(vesiculovirus)。在一些實施例中，溶瘤水泡病毒包括溶瘤水泡性口炎病毒(VSV)。在一些實施例中，VSV包括重組VSV。在一些實施例中，重組VSV包括一或多個突變，諸如M51R取代。在一些實施例中，重組VSV表現細胞激素。在一些實施例中，重組VSV含有編碼免疫刺激性分子(諸如細胞激素)的核酸序列。
在一些實施例中，細胞激素包括干擾素-β(IFNb)，諸如人類或小鼠IFNb或其變體。在一些實施例中，編碼IFNb的核酸序列位於M和G病毒基因之間。
在一些實施例中，重組VSV進一步表現鈉/碘同向運輸蛋白(NIS)。在一些實施例中，重組VSV進一步含有編碼鈉/碘同向運輸蛋白(NIS)或其變體的核酸序列。在一些實施例中，編碼NIS的核酸序列位於G和L病毒基因之間。在一些實施例中，溶瘤病毒是Voyager V1。在一些實施例中，溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑和CTLA4抑制劑同時被投予給患者。在一些實施例中，一或多劑溶瘤病毒組合以一或多劑PD-1路徑抑制劑和一或多劑CTLA4抑制劑被依序投予。
在一些實施例中，溶瘤病毒在PD-1路徑抑制劑及/或CTLA4抑制劑之前或之後被投予給患者。在一些實施例中，PD-1路徑抑制劑在溶瘤病毒及/或CTLA4抑制劑之前或之後被投予給患者。在一些實施例中，CTLA4抑制劑在溶瘤病毒和/或PD-1路徑抑制劑之前或之後被投予給患者。在一些實施例中，溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑或CTLA4抑制劑中的至少一者一天一次、每兩天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每週一次、每兩週一次或每三週一次被投予給患者。在一些實施例中，一劑溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑或CTLA4抑制劑在前一劑溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑或CTLA4抑制劑之後1天至12週分別被投予給患者。
在一些實施例中，一或多劑CTLA4抑制劑包括單劑CTLA4抑制劑，且其中投予單劑CTLA4抑制劑導致抗腫瘤功效與包括兩劑或更多劑CTLA4抑制劑的組合療法不相上下。
在一些實施例中，抗腫瘤功效的特徵在於每個治療組的平均(mean)或平均(average)腫瘤體積、存活百分率、無腫瘤患者數量或其組合的減少。在一些實施例中，溶瘤病毒以一或多劑的10 4-10 14TCID 50(50%組織培養感染劑量)、10 4-10 12TCID 50、10 6-10 12TCID 50、10 8-10 14TCID 50、10 8-10 12TCID 50或10 10-10 12TCID 50被投予給患者。在一些實施例中，PD-1路徑抑制劑以一或多劑的約0.1 mg/kg至約20 mg/kg患者體重被投予給患者。在一些實施例中，PD-1路徑抑制劑以一或多劑的約1 mg至約1000 mg被投予給患者。在一些實施例中，CTLA4抑制劑以一或多劑的約0.1 mg/kg至約15 mg/kg患者體重被投予給患者。在一些實施例中，CTLA4抑制劑以單劑約0.1 mg/kg至約15 mg/kg患者體重被投予給患者。在一些實施例中，CTLA4抑制劑以一或多劑的約1 mg至約600 mg被投予給患者。在一些實施例中，將溶瘤病毒透過瘤內或靜脈內投予給患者。在一些實施例中，將PD-1路徑抑制劑和CTLA4抑制劑透過靜脈內、皮下或腹膜內投予給患者。
在一些實施例中，癌症是選自腎上腺腫瘤、膽管癌、膀胱癌、腦癌、乳癌、癌(carcinoma)、中樞或周邊神經系統組織癌、子宮頸癌、結腸癌、內分泌或神經內分泌癌或造血癌、食道癌、纖維瘤、胃腸癌、神經膠質瘤、頭頸癌、李-佛美尼腫瘤(Li-Fraumeni tumor)、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、腦膜瘤、第I型與第II型多發性神經內分泌腫瘤、鼻咽癌、口腔癌、口咽癌、骨原性肉瘤腫瘤、卵巢癌、胰臟癌、胰島細胞癌、副甲狀腺癌、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤、前列腺癌、直腸癌、腎癌、呼吸道癌、肉瘤、皮膚癌、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌、氣管癌、泌尿生殖器癌和子宮癌。在一些實施例中，癌症對用至少一種抗PD-1藥劑或療法的治療具有抗性。
在一些實施例中，PD-1路徑抑制劑包括抗PD-1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，或抗PD-L2抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，抗PD-1抗體是選自西米普利單抗(cemiplimab)、納武單抗(nivolumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、匹地利珠單抗(pidilizumab)、MEDI0608、BI 754091、PF-06801591、斯巴達珠單抗(spartalizumab)、卡瑞利珠單抗(camrelizumab)、JNJ-63723283和MCLA-134。
在一些實施例中，抗PD-1抗體或其抗原結合片段包括有包括胺基酸序列SEQ ID NO：1之重鏈可變區(HCVR)的重鏈互補決定區(HCDR)，以及包括胺基酸序列SEQ ID NO：2之輕鏈可變區(LCVR)的輕鏈互補決定區(LCDR)。在一些實施例中，抗PD-1抗體或其抗原結合片段包括有包括對應胺基酸序列SEQ ID NO：3、4和5的三個重鏈互補決定區(HCDR) (HCDR1、HCDR2和HCDR3)；以及包括對應胺基酸序列SEQ ID NO：6、7和8的三個輕鏈CDR (LCDR1、LCDR2和LCDR3)。
在一些實施例中，抗PD-1抗體或其抗原結合片段包括有包括胺基酸序列SEQ ID NO：1的重鏈可變區(HCVR)；以及包括胺基酸序列SEQ ID NO：2的輕鏈可變區(LCVR)。在一些實施例中，抗PD-1抗體或其抗原結合片段包括SEQ ID NO：9和10的重鏈和輕鏈序列對。
在一些實施例中，抗PD-L1抗體是選自REGN3504、阿維魯單抗(avelumab)、阿特利珠單抗(atezolizumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)、MDX-1105、LY3300054、FAZ053、STI-1014、CX-072、KN035和CK-301。在一些實施例中，抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包括有包括胺基酸序列SEQ ID NO：11的重鏈可變區(HCVR)；以及包括胺基酸序列SEQ ID NO：12的輕鏈可變區(LCVR)。在一些實施例中，抗PD-L1抗體包括REGN3504。
在一些實施例中，CTLA4抑制劑包括抗CTLA4抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，抗-CTLA4抗體是選自伊匹單抗(ipilimumab)、曲美木單抗(tremelimumab)和REGN4659。在一些實施例中，抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包括有包括胺基酸序列SEQ ID NO：13之重鏈可變區(HCVR)的重鏈互補決定區(HCDR)；以及包括胺基酸序列SEQ ID NO：14之輕鏈可變區(LCVR)的輕鏈互補決定區(LCDR)。
在一些實施例中，抗-CTLA4抗體或其抗原結合片段包括有包括對應胺基酸序列SEQ ID NO：15、16和17的三個重鏈互補決定區(HCDR) (HCDR1、HCDR2和HCDR3)；以及包括對應胺基酸序列SEQ ID NO：18、19和20的三個輕鏈CDR (LCDR1、LCDR2和LCDR3)。在一些實施例中，抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包括有包括胺基酸序列SEQ ID NO：13的重鏈可變區(HCVR)；以及包括胺基酸序列SEQ ID NO：14的輕鏈可變區(LCVR)。在一些實施例中，抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包括SEQ ID NO：21和22的重鏈和輕鏈序列對。
在一些實施例中，治療產生選自以下一或多項的治療效果：延遲腫瘤生長、減少腫瘤細胞數量、腫瘤消退、增加存活、部分反應以及完全反應。在一些實施例中，與未受治療的患者相比，腫瘤生長被抑制至少50%。在一些實施例中，與被投予溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑或CTLA4抑制劑作為單一療法的患者相比，腫瘤生長被抑制至少50%。在一些實施例中，與被投予溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑和CTLA4抑制劑中任兩者的患者相比，腫瘤生長被抑制至少50%。
在一些實施例中，該方法進一步包括向患者投予額外治療劑或療法。在一些實施例中，額外治療劑或療法是選自：放射線、手術、化療劑、癌症疫苗、B7-H3抑制劑、B7-H4抑制劑、淋巴細胞活化基因3(LAG3)抑制劑、T細胞免疫球蛋白與黏蛋白結構域3(TIM3)抑制劑、半乳糖凝集素9(GAL9)抑制劑、T細胞活化的V結構域免疫球蛋白(Ig)抑制因子(VISTA)抑制劑、殺手細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)抑制劑、B-淋巴細胞和T-淋巴細胞弱化子(BTLA)抑制劑、具有Ig和ITIM結構域的T細胞免疫受體(TIGIT)抑制劑、CD47抑制劑、吲哚胺-2,3-雙加氧酶(IDO)抑制劑、血管內皮生長因子(VEGF)拮抗劑、血管生成素-2(Ang2)抑制劑、轉形生長因子β(TGFβ)抑制劑、表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑，針對腫瘤特異性抗原的抗體、卡介苗、顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、細胞毒素、介白素6受體(IL-6R)抑制劑、介白素4受體(IL-4R)抑制劑、IL-10抑制劑、IL-2、IL-7、IL-12，IL-21、IL-15、抗體藥物結合物、消炎藥，及其組合。
在另一個態樣中，所揭示的技術是有關溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑和CTLA4抑制劑的組合用於治療或抑制腫瘤生長的方法，該方法包括：(a)挑選患有癌症的患者；以及(b)向有需要的患者投予：(i)治療有效量的溶瘤病毒組合以(ii)治療有效量的PD-1路徑抑制劑，和(iii)治療有效量的CTLA抑制劑。
在另一個態樣中，所揭示的技術是有關一種套組，其包括溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑和CTLA4抑制劑，組合以使用治療有效量的溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑以及CTLA4抑制劑之組合用於治療或抑制患者腫瘤生長的書面說明書。
前述概述並非希望限定本發明的每個態樣，並且在其他部分中描述了額外態樣，諸如以下詳細說明。整份文件旨在作為統一的揭示內容相關，並且應該理解，本文描述的特徵的所有組合都被考慮在內，即使特徵的組合沒有一起出現在此份文件的同一句子，或段落或部分中。本發明的其他特徵和優點將從以下詳細說明中變得顯而易見。然而，應該理解的是，詳細說明和特定實例雖然指示了本發明的特定實施例，但僅以說明的方式提供，因為在本發明的精神和範圍內的各種變化和修改對於本技術領域具有通常者來說，將因為此詳細說明變得顯而易見。
本發明至少部分是基於意外發現到，溶瘤病毒、計畫性死亡1(PD-1)路徑抑制劑和細胞毒性T淋巴細胞抗原-4(CTLA4)抑制劑的新穎三重組合療法相比溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑和CTLA4抑制劑的任何單一療法或雙重組合療法，在抑制腫瘤生長方面展現出協同活性。如本文證實的，所揭示的三重組合療法包含投予一劑CTLA4抑制劑，實現了與包含2、3、4或更多劑CTLA4抑制劑的組合療法不相上下的抗腫瘤功效。此外，溶瘤病毒的靜脈內投藥至少與病毒的瘤內投藥一樣有效。因此，如本文揭示的三重組合療法代表一種令人驚訝的有效癌症治療療法，同時降低了治療相關毒性的風險。
因此，在一個態樣中，本發明提供一種治療或抑制腫瘤生長的方法，包括：(a)挑選患有癌症的患者；以及(b)向有需要的患者投予：(i)治療有效量的溶瘤病毒組合以(ii)治療有效量的PD-1路徑抑制劑(例如抗PD-1，抗PD-L1或抗PD-L2抗體或其抗原結合片段)和(iii)治療有效量的CTLA4抑制劑(例如，抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)。
如本文所用，術語「患者」可以與術語「個體」交替使用。用語「有需要的個體」是指展現出一或多種癌症症狀或適應症及/或已被診斷患有癌症的人類或非人類哺乳動物。在一些實施例中，人類個體可能被診斷為患有原發性或轉移性腫瘤及/或具有一或多種症狀或適應症，包括但不限於淋巴結腫大、腹部腫脹、胸痛/胸悶、無法解釋的體重減輕、發燒、盜汗、持續疲勞、食慾不振、脾臟腫大、搔癢。該用語包括已接受一或多個週期的具有毒性副作用的化療的患者。在一些實施例中，用語「有需要的個體」包括患有已接受治療但隨後復發或轉移的癌症的患者。例如，用本發明方法治療可能已經接受了用一或多種抗癌劑治療導致腫瘤消退；然而，隨後復發的癌症對一或多種抗癌劑具有抗性(例如，化療抗性癌症)的患者。
如本文所用，術語「治療(treating, treat)」或類似用語是指減輕或降低至少一種症狀或適應症的嚴重程度、在暫時或永久的基礎上消除症狀的原因、延遲或抑制腫瘤生長、減少腫瘤細胞負荷或腫瘤負荷、促進腫瘤消退、引起腫瘤縮小、壞死及/或消失、防止腫瘤復發、預防或抑制轉移、抑制轉移性腫瘤生長、消除對放射線或手術的需要，及/或增加個體的存活時間。
在許多實施例中，術語「腫瘤」、「病變」、「腫瘤病變」、「癌症」和「惡性腫瘤」可交替使用並且指一或多種癌性生長。在一些實施例中，癌症是選自腎上腺腫瘤、膽管癌、膀胱癌、腦癌、乳癌、癌、中樞或周邊神經系統組織癌、子宮頸癌、結腸癌、內分泌或神經內分泌癌或造血癌、食道癌、纖維瘤、胃腸癌、神經膠質瘤、頭頸癌、李-佛美尼腫瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、腦膜瘤、第I型與第II型多發性神經內分泌腫瘤、鼻咽癌、口腔癌、口咽癌、骨原性肉瘤腫瘤、卵巢癌、胰臟癌、胰島細胞癌、副甲狀腺癌、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤、前列腺癌、直腸癌、腎癌、呼吸道癌、肉瘤、皮膚癌、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌、氣管癌、泌尿生殖器癌，和子宮癌。
根據一些實施例，本發明包括用於治療、延遲或抑制腫瘤生長的方法。在一些實施例中，本發明包括促進腫瘤消退的方法。在一些實施例中，本發明包括降低腫瘤細胞負荷或降低腫瘤負荷的方法。在一些實施例中，本發明包括預防腫瘤復發的方法。
根據一些實施例，本發明方法包含向有需要的個體投予溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑(例如，抗PD-1抗體或其抗原結合片段)或CTLA4抑制劑(例如，抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)。
在一些實施例中，該等方法包含在向個體投予一或多劑PD-1路徑抑制劑及/或一或多劑CTLA4抑制劑之前、之後或同時向個體投予一或多劑溶瘤病毒。在一些實施例中，一或多劑PD-1路徑抑制劑可組合以一或多劑CTLA4抑制劑投予。
如本文所用，術語「組合以」還包括溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑(例如，抗PD-1抗體或其抗原結合片段)和CTLA4抑制劑(例如，抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)的依序或同時投予。例如，當在CTLA4抑制劑「之前」投予時，可以在投予一或多劑CTLA抑制劑前超過約12週、約11週、約10週、約9週、約8週、約7週、約6週、約5週、約4週、約3週、約2週、約150小時、約150小時、約100小時、約72小時、約60小時、約48小時、約36小時、約24小時、約12小時、約10小時、約8小時、約6小時、約4小時、約2小時、約1小時、約30分鐘、約15分鐘或約10分鐘投予一或多劑PD-1路徑抑制劑(例如，抗PD-1抗體或其抗原結合片段)。
當在CTLA4抑制劑(例如，抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)「之後」投予時，可以在投予CTLA4抑制劑後約12週、約11週、約10週、約9週、約8週、約7週、約6週、約5週、約4週、約3週、約2週、約150小時、約150小時、約100小時、約72小時、約60小時、約48小時、約36小時、約24小時、約12小時、約10小時、約8小時、約6小時、約4小時、約2小時、約1小時、約30分鐘、約15分鐘或約10分鐘投予PD-1路徑抑制劑(例如，抗PD-1抗體或其抗原結合片段)。
與CTLA4抑制劑(例如，抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)「同時」投予表示，在投予CTLA4抑制劑或以單一組合劑量調配物(包含PD-1路徑抑制劑和CTLA4抑制劑)被投予給個體(之前、之後或同時)不到10分鐘內將PD-1路徑抑制劑(例如，抗PD-1抗體或其抗原結合片段)投予給個體。
在一些實施例中，所揭示的方法可進一步包括投予抗腫瘤療法。抗腫瘤療法包括但不限於常規抗腫瘤療法，諸如化療、放射線、手術或如本文他處所述者。
在一些實施例中，治療產生選自以下一或多項的治療效果：延遲腫瘤生長、減少腫瘤細胞數量、腫瘤消退、增加存活、部分反應，和完全反應。在一些實施例中，與未受治療患者的腫瘤生長相比，患者的腫瘤生長延遲至少10天。在一些實施例中，與未受治療的患者相比，腫瘤生長被抑制至少20%(例如，至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少200%、至少300%)。在一些實施例中，與被投予溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑或CTLA4抑制劑作為單一療法的患者相比，腫瘤生長被抑制至少20%(例如，至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少200%、至少300%)。在一些實施例中，與被投予溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑和CTLA4抑制劑中的兩者的患者相比，腫瘤生長被抑制至少20%(例如，至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至少200%、至少300%)。 溶瘤病毒
溶瘤病毒是癌症療法，它採用經工程改造或自然演化的癌症趨向性病毒，在受治療的患者體內引發腫瘤細胞死亡。一般來說，當投予複製性溶瘤病毒時，受感染的腫瘤細胞有可能產生後代病毒，從而使破壞性感染擴散到鄰近腫瘤細胞。病毒複製的潛力是由細胞感知和回應於病毒感染的能力所決定。此外，溶瘤病毒帶有病原體相關分子模式(PAMP)，其可作為佐劑刺激骨髓細胞(巨噬細胞和樹突狀細胞)以增強T細胞刺激。
在一些實施例中，溶瘤病毒是複製勝任的溶瘤棒狀病毒。此類溶瘤棒狀病毒包括但不限於野生型或經遺傳修飾的阿拉哈斯病毒(Arajas virus)、錢迪普病毒(Chandipura virus)、可卡病毒(Cocal virus)、伊斯法罕病毒(Isfahan virus)、馬拉巴病毒(Maraba virus)、皮里病毒(Piry virus)、水泡性口炎阿拉戈斯病毒(Vesicular stomatitis Alagoas virus)、水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)、BeAn 157575病毒、博泰克病毒(Boteke virus)、卡爾查基病毒(Calchaqui virus)、美洲鰻病毒(Eel virus American)、格雷洛奇病毒(Gray Lodge virus)、朱羅納病毒(Jurona virus)、克拉馬斯病毒(Klamath virus)、克瓦塔病毒(Kwatta virus)、拉霍亞病毒(La Joya virus)、馬爾佩斯溫泉病毒(Malpais Spring virus)、埃爾岡山蝙蝠病毒(Mount Elgon bat virus)、佩裏內特病毒(Perinet virus)、樹鼩病毒(Tupaia virus)、法明頓(Farmington)、大巴伊亞病毒(Bahia Grande virus)、繆耳溫泉病毒(Muir Springs virus)、李德牧場病毒(Reed Ranch virus)、哈特公園病毒(Hart Park virus)、佛蘭德斯病毒(Flanders virus)、卡梅塞病毒(Kamese virus)、莫斯奎羅病毒(Mosqueiro virus)、莫蘇里病毒(Mossuril virus)、巴魯病毒(Barur virus)、福岡病毒(Fukuoka virus)、克恩峽谷病毒(Kern Canyon virus)、恩科爾比遜病毒(Nkolbisson virus)、利丹特病毒(Le Dantec virus)、科拉利巴病毒(Keuraliba virus)、康乃狄克病毒(Connecticut virus)、新明託病毒(New Minto virus)、鋸齒草病毒(Sawgrass virus)、查科病毒(Chaco virus)、塞納馬杜雷拉病毒(Sena Madureira virus)、蒂姆博病毒(Timbo virus)、阿爾姆皮瓦病毒(Almpiwar virus)、阿魯卡病毒(Aruac virus)、邦戈蘭病毒(Bangoran virus)、卞博病毒(Bimbo virus)、畢文斯阿姆病毒(Bivens Arm virus)、藍蟹病毒(Blue crab virus)、查理弗病毒(Charleville virus)、沿海平原病毒(Coastal Plains virus)、DakArK 7292病毒、內阿米巴病毒(Entamoeba virus)、加爾巴病毒(Garba virus)、戈薩斯病毒(Gossas virus)、漢普蒂杜病毒(Humpty Doo virus)、約英傑卡卡病毒(Joinjakaka virus)、肯納曼格拉姆病毒(Kannamangalam virus)、科隆各病毒(Kolongo virus)、庫爾平耶病毒(Koolpinyah virus)、科通考訥病毒(Kotonkon virus)、蘭德幾亞病毒(Landjia virus)、緬尼托巴病毒(Manitoba virus)、馬可病毒(Marco virus)、納蘇萊病毒(Nasoule virus)、納瓦羅病毒(Navarro virus)、恩蓋恩加病毒(Ngaingan virus)、奧克韋爾病毒(Oak-Vale vims)、奧博第安病毒(Obodhiang vims)、奧伊塔病毒(Oita vims)、萬戈病毒(Ouango vims)、帕里灣病毒(Parry Creek vims)、里奧格蘭德鯛病毒(Rio Grande ci chlid vims)、聖德吉姆巴病毒(Sandjimba vims)、西格馬病毒(Sigma vims)、斯里布爾病毒(Sripur vims)、斯威特沃特科病毒(Sweetwater Branch vims)、蒂布魯加爾岡病毒(Tibrogargan vims)、西布爾瑪病毒(Xiburema vims)、葉他病毒(Yata vims)、羅德島病毒(Rhode Island)、阿德萊德河病毒(Adelaide River vims)、貝里馬病毒(Berrimah vims)、金百利病毒(Kimberley vims)，或牛短暫熱病毒。
如上所述，水泡性口炎病毒(VSV)是棒狀病毒科的一個成員。VSV基因體是一個單分子的負義RNA，編碼5個主要多肽：核鞘(N)多肽、磷蛋白(P)多肽、基質(M)多肽、醣蛋白(G)多肽和病毒聚合酶(L)多肽。
在一些實施例中，溶瘤病毒是野生型或重組VSV。在一些實施例中，重組VSV包含一或多個突變，諸如M51R取代(在本文中也稱為VSV-M51R)。
在一些實施例中，溶瘤病毒可被工程改造成表現一或多種細胞激素，諸如干擾素-β(IFNb)。在一些實施例中，IFNb(例如干擾素β-1a)可以是人類或小鼠IFNb或其變體。在一些實施例中，IFNb包含與SEQ ID NO：23或24的胺基酸序列具有至少90%(例如90%、95%、96%、97%、98%、99%)序列同一性的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：23或24的胺基酸序列。在一些實施例中，編碼IFNb的核酸序列位於M和G病毒基因之間。這樣一個位置允許病毒表現一定量的IFNb多肽，該多肽可有效活化非癌組織中的抗病毒免疫反應，從而減輕潛在的病毒毒性卻不阻礙癌細胞中的有效病毒複製。
在一些實施例中，重組VSV進一步表現鈉/碘同向運輸蛋白(NIS)或其變體。在一些實施例中，NIS包含與SEQ ID NO：25的胺基酸序列具有至少90%(例如90%、95%、96%、97%、98%、99%)序列同一性的胺基酸序列，或包含SEQ ID NO：25的胺基酸序列。在一些實施例中，編碼NIS的核酸序列位於允許NIS多肽的適當表現程度的G和L病毒基因之間。
在某些實施例中，溶瘤病毒是本領域中已知為Voyager V1的重組VSV，描述於例如US 9428736中，其以全文引用的方式併入。 PD-1 路徑抑制劑
本文揭示的方法包括投予治療有效量的PD-1路徑抑制劑。如本文所用，「PD-1路徑抑制劑」是指能夠抑制、阻斷、消除或干擾PD-1的活性或表現的任何分子。在一些實施例中，PD-1路徑抑制劑可以是抗體、小分子化合物、核酸、多肽或其功能片段或變體。合適的PD-1路徑抑制劑的非限制性實例包括抗PD-1抗體及其抗原結合片段、抗PD-L1抗體及其抗原結合片段，以及抗PD-L2抗體及其抗原結合片段。
合適的PD-1路徑抑制劑的其他非限制性實例包括RNAi分子(諸如抗PD-1 RNAi分子、抗PD-L1 RNAi和抗PD-L2 RNAi)、反義分子(諸如抗PD-1反義RNA、抗PD-L1反義RNA和抗PD-L2反義RNA)，以及顯性抑制蛋白(dominant negative proteins) (諸如顯性抑制PD-1蛋白、顯性抑制PD-L1蛋白和顯性抑制PD-L2蛋白)。前述PD-1路徑抑制劑的一些實例描述於例如US 9308236、US 10011656和US 20170290808中，其中鑑定PD-1路徑抑制劑的部分以引用的方式併入。
如本文所用，術語「抗體」意指由藉著雙硫鍵相互連接的四條多肽鏈(兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈)組成的免疫球蛋白分子(即「完全抗體分子」)，以及其多聚體(例如IgM)或其抗原結合片段。每條重鏈包含重鏈可變區(「HCVR」或「VH」)和重鏈恆定區(由結構域CH1、CH2和CH3組成)。每條輕鏈包含輕鏈可變區(「LCVR」或「VL」)和輕鏈恆定區(CL)。VH區和VL區可以進一步細分為高度變異區，稱為互補決定區(CDR)，散佈著更保守的區域(稱為框架區(FR))。每個VH和VL由三個CDR和四個FR組成，從胺基端到羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在一些實施例中，抗體(或其抗原結合片段)的FR可能與人類生殖系序列相同，或者可能經天然或人工修飾。胺基酸共有序列可基於兩個或更多個CDR的並排分析來加以定義。如本文所用，術語「抗體」還包括完全抗體分子的抗原結合片段。
如本文所用，術語抗體的「抗原結合片段」、抗體的「抗原結合部分」與類似用語包括任何天然存在的、可酶促獲得的，合成的或經遺傳工程改造的多肽或醣蛋白，其特異地結合抗原而形成複合體。抗體的抗原結合片段可使用任何合適的標準技術(諸如蛋白水解消化或涉及操作和表現編碼抗體可變結構域和視情況選用之恆定結構域的DNA的重組遺傳工程技術)從例如完全抗體分子衍生而來。這種DNA是已知的及/或容易從例如商業來源、DNA庫(包括例如噬菌體-抗體庫)獲得，或者可以被合成。DNA可以進行定序並按化學方式或藉由分子生物學技術進行操作，例如，將一或多個可變結構域及/或恆定結構域排列成合適的構形，或引入密碼子、產生半胱胺酸殘基、修飾、添加或刪除胺基酸等。
抗原結合片段的非限制性實例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)單鏈Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；及(vii)由模擬抗體高度變異區(例如經分離的互補決定區(CDR)，諸如CDR3肽)的胺基酸殘基組成的最小辨識單位或受限型FR3-CDR3-FR4肽。其他經工程改造的分子，諸如結構域特異性抗體、單域抗體、域缺失抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、微型抗體、奈米抗體(例如單價奈米抗體、二價奈米抗體等)、小模塊免疫藥物(SMIP)和鯊魚可變IgNAR結構域也含括在如本文使用的用語「抗原結合片段」內。
抗體的抗原結合片段通常包含至少一個可變結構域。可變結構域可能具有任何大小或胺基酸組成，且通常將包含至少一個與一或多個框架序列相鄰或同框的CDR。在具有與V L結構域締合之V H結構域的抗原結合片段中，V H和V L結構域可按任何合適的排列彼此相對定位。例如，可變區可以是二聚體並含有V H-V H、V H-V L或V L-V L二聚體。或者，抗體的抗原結合片段可能含有單體V H或V L結構域。
在一些實施例中，抗體的抗原結合片段可能含有至少一個共價連接到至少一個恆定結構域的可變結構域。可以在本發明抗體的抗原結合片段中發現到的可變結構域和恆定結構域的非限制性例示性構形包括：(i)V H-C H1；(ii)V H-C H2；(iii)V H-C H3；(iv)V H-C H1-C H2；(v)V H-C H1-C H2-C H3；(vi)V H-C H2-C H3；(vii)V H-C L；(viii)V L-C H1；(ix)V L-C H2；(x)V L-C H3；(xi)V L-C H1-C H2；(xii)V L-C H1-C H2-C H3；(xiii)V L-C H2-C H3；及(xiv)V L-C L。在可變結構域和恆定結構域的任何構形中，包括上面列出的任何例示性構形，可變結構域和恆定結構域可能彼此直接連接或可以藉由完整或部分鉸鏈或連接子區加以連接。鉸鏈區可能由至少2個(例如5、10、15、20、40、60個或更多個)胺基酸組成，其導致單一條多肽分子中相鄰可變結構域及/或恆定結構域之間的撓性或半撓性鍵聯。此外，本發明抗體的抗原結合片段可包含彼此非共價締合及/或具有一或多個單體V H或V L結構域(例如藉由雙硫鍵)的以上所列的任何可變結構域和恆定結構域構形的同二聚體或異二聚體(或其他多聚體)。
本文揭示之方法中所用的抗體可能是人類抗體。如本文所用，術語「人類抗體」是指具有源自人類生殖系免疫球蛋白序列的可變區與恆定區的抗體。不過，本發明人類抗體可包括不是由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機或位點特異性誘變或藉由活體內體細胞突變引入的突變)，例如在CDR中，特別是CDR3中。然而，如本文所用，術語「人類抗體」並非意欲包括其中源自另一哺乳動物物種(諸如小鼠)的生殖系的CDR序列已移植到人類框架序列上的抗體。
本文揭示之方法中所用的抗體可能是重組人類抗體。如本文所用，術語「重組人類抗體」包括藉由重組方式製備、表現、創造或分離的所有人類抗體，諸如使用被轉染到宿主細胞中的重組表現載體所表現的抗體(下文進一步說明)、分離自重組、組合人類抗體庫的抗體(下文進一步說明)、分離自動物(例如小鼠)的抗體(其對人類免疫球蛋白基因來說是轉基因(參見例如Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295))，或藉由任何其他方式(涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列)製備、表現、創造或分離的抗體。此類重組人類抗體具有源自人類生殖系免疫球蛋白序列的可變區和恆定區。然而，在一些實施例中，對此類重組人類抗體進行活體外誘變(或者，當使用人類Ig序列的轉基因動物時，進行活體內體細胞誘變)，因此重組抗體V H區和V L區的胺基酸序列雖然是衍生自人類生殖系V H和V L序列並與之相關，但在活體內可能並非天然存在於人類抗體生殖系譜系中的序列。 抗 PD-1 抗體及其抗原結合片段
在一些實施例中，本文揭示之方法中所用的PD-1路徑抑制劑是特異地結合PD-1的抗體或其抗原結合片段(例如，抗PD-1抗體)。術語「特異地結合」或類似用語表示抗體或其抗原結合片段與抗原形成在生理條件下相對穩定的複合體。確定抗體是否特異地結合至抗原的方法是本領域中熟知的，並包括例如平衡透析、表面電漿共振與類似方法。例如，如本發明上下文中使用，「特異地結合」PD-1的抗體包括以小於約500 nM、小於約300 nM、小於約200 nM、小於約100 nM、小於約90 nM、小於約80 nM、小於約70 nM、小於約60 nM、小於約50 nM、小於約40 nM、小於約30 nM、小於約20 nM、小於約10 nM、小於約5 nM、小於約4 nM、小於約3 nM、小於約2 nM、小於約1 nM或小於約0.5 nM的K D結合PD-1或其部分的抗體，如在表面電漿共振分析中所測量的。然而，特異地結合人類PD-1的經分離抗體可能與其他抗原(諸如來自其他(非人類)物種的PD-1分子)具有交叉反應性。
根據某些例示性實施例，抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區(HCVR)、輕鏈可變區(LCVR)及/或包含US 9987500中列出的任何抗PD-1抗體的胺基酸序列的互補決定區(CDR)，該件專利以全文引用的方式併入本文。
在某些例示性實施例中，可用於本發明上下文中的抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含有包含胺基酸序列SEQ ID NO：1之重鏈可變區(HCVR)的重鏈互補決定區(HCDR)，以及包含胺基酸序列SEQ ID NO：2之輕鏈可變區(LCVR)的輕鏈互補決定區(LCDR)。
根據一些實施例，抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含三個HCDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)以及三個LCDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中：HCDR1包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列；LCDR1包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列；而LCDR3包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列。
在又其他實施例中，抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：1的HCVR和包含SEQ ID NO：2的LCVR。在一些實施例中，抗體包含有包含胺基酸序列SEQ ID NO：9的重鏈。在一些實施例中，抗PD-1抗體包含有包含胺基酸序列SEQ ID NO：10的輕鏈。
包含有包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的重鏈可變區和包含胺基酸序列SEQ ID NO：2的輕鏈可變區的例示性抗體是完全人類抗PD-1抗體，稱為西米普利單抗(也稱為REGN2810；LIBTAYO®)。
根據某些例示性實施例，本發明方法包含使用西米普利單抗或其生物等效物。如本文所用，關於PD-1路徑抑制劑的術語「生物等效物」是指抗PD-1抗體或PD-1結合蛋白或其片段，它們是醫藥等效物或醫藥替代物，當在相似的實驗條件下(單劑量或多劑量)以相似的莫耳劑量投予時，其吸收比率及/或程度與參考抗體(例如，西米普利單抗)的吸收沒有顯示出顯著差異。在本發明上下文中，術語「生物等效物」包括結合PD-1並且在安全性、純度及/或效力方面與西米普利單抗沒有臨床有意義差異的抗原結合蛋白。
根據本發明的一些實施例，抗人類PD-1或其抗原結合片段包含與SEQ ID NO：1具有至少90%(例如，90%、95%、96%、97%、98%、99%)序列同一性的HCVR。
根據本發明的一些實施例，抗人類PD-1或其抗原結合片段包含與SEQ ID NO：2具有(例如，90%、95%、96%、97%、98%、99%)序列同一性的LCVR。序列同一性可以透過本領域中已知的方法(例如，GAP、BESTFIT和BLAST)測量。
根據本發明的一些實施例，抗人類PD-1或其抗原結合片段包含HCVR，該HCVR包含具有不超過10個胺基酸取代的SEQ ID NO：1的胺基酸序列。根據本發明的一些實施例，抗人類PD-1或其抗原結合片段包含LCVR，該LCVR包含具有不超過10個胺基酸取代的SEQ ID NO：2的胺基酸序列。
同樣在本發明範疇內的是本文揭示之具有一個或多個保守胺基酸取代的任何HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列的變體。例如，相對於本文揭示的任何HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列，本發明包括使用帶有例如10個或更少、8個或更少、6個或更少、4個或更少等保守胺基酸取代之HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列的抗PD-L1抗體。
可以在本發明方法的上下文中使用的其他抗PD-1抗體或其抗原結合片段包括，例如，在本領域中被提及和已知的抗體，如納武單抗、派姆單抗、MEDI0608、匹地利珠單抗、BI 754091、斯巴達珠單抗(也稱為PDR001)、卡瑞利珠單抗(也稱為SHR-1210)、JNJ-63723283、MCLA-134，或美國專利第6808710號、第7488802號、第8008449號、第8168757號、第8354509號、第8609089號、第8686119號、第8779105號、第8900587號和第9987500號，以及專利公開案WO 2006/121168、WO 2009/114335中列出的任何抗PD-1抗體。辨識抗PD-1抗體的所有上述出版物的部分以引用的方式併入本文。
在本發明方法的上下文中所用的抗PD-1抗體可能具有pH依賴性結合特徵。例如，與中性pH相比，用於本發明方法的抗PD-1抗體在酸性pH下可展現出與PD-1的結合降低。或者，與中性pH相比，本發明的抗PD-1抗體在酸性pH下可展現出與其抗原的結合增強。用語「酸性pH」包括小於約6.2的pH值，例如約6.0、5.95、5.9、5.85、5.8、5.75、5.7、5.65、5.6、5.55、5.5、5.45、5.4、5.35、5.3、5.25、5.2、5.15、5.1、5.05、5.0或更小。如本文所用，用語「中性pH」是指約7.0至約7.4的pH。用語「中性pH」包括約7.0、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35和7.4的pH值。
在某些情況下，「與中性pH相比，在酸性pH下與PD-1的結合降低」表示為抗體在酸性pH下和PD-1結合的K D值與抗體在中性pH下和PD-1結合的K D值之比(反之亦然)。例如，為了本發明的目的，如果抗體或其抗原結合片段展現出酸性/中性K D比為約3.0或更大，則抗體或其抗原結合片段可能被視為「與中性pH相比，在酸性pH下與PD-1的結合降低」。在某些例示性實施例中，本發明抗體或抗原結合片段的酸性/中性K D比可為約3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、20.0、25.0、30.0、40.0、50.0、60.0、70.0、100.0，或更大。
具有pH依賴性結合特徵的抗體可以例如藉由篩選與中性pH相比，在酸性pH下和特定抗原的結合減少(或增強)的抗體群來獲得。此外，在胺基酸層次上對抗原結合結構域進行修飾可能會產生具有pH依賴性特徵的抗體。例如，透過用組胺酸殘基取代抗原結合結構域(例如，在CDR內)的一或多個胺基酸，可以獲得相對於中性pH在酸性pH下抗原結合降低的抗體。如本文所用，用語「酸性pH」表示6.0或更低的pH。 抗 PD-L1 抗體及其抗原結合片段
在一些實施例中，本文揭示之方法中所用的PD-1路徑抑制劑是特異地結合PD-L1的抗體或其抗原結合片段(例如，抗PD-L1抗體)。例如，如在本發明上下文中使用的，「特異地結合」PD-L1的抗體包括以約1x10 -8M或更小的K D結合PD-L1或其部分的抗體(例如，較小的K D表示更為緊密的結合)。「高親和力」抗PD-L1抗體是指對PD-L1具有結合親和力的那些mAb，如藉由表面電漿共振測量(例如BIACORE TM或溶液親和力ELISA)表示K D為至少10 -8M，諸如10 -9M、10 -10M、10 - 11M，或10 -12M。然而，特異地結合人類PD-L1的經分離抗體可能與其他抗原(諸如來自其他(非人類)物種的PD-L1分子)具有交叉反應性。
根據某些例示性實施例，抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含有包含US 9938345中列出的任何抗PD-L1抗體之胺基酸序列的重鏈可變區(HCVR)、輕鏈可變區(LCVR)及/或互補決定區(CDR)，其以全文引用的方式併入本文。
在某些例示性實施例中，可用於本發明上下文的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含有包含SEQ ID NO：11之重鏈可變區(HCVR)的重鏈互補決定區(HCDR)，以及包含SEQ ID NO：12之輕鏈可變區(LCVR)的輕鏈互補決定區(LCDR)。包含SEQ ID NO：11的HCVR和SEQ ID NO：12的LCVR的例示性抗PD-L1抗體是REGN3504。
根據本發明的一些實施例，抗人類PD-L1抗體或其抗原結合片段包含與SEQ ID NO：11具有至少90%(例如，90%、95%、96%、97%、98%、99%)序列同一性的HCVR。根據本發明的一些實施例，抗人類PD-L1抗體或其抗原結合片段包含與SEQ ID NO：12具有至少90%(例如，90%、95%、96%、97%、98%、99%)序列同一性的LCVR。
根據本發明的一些實施例，抗人類PD-L1抗體或其抗原結合片段包含HCVR，該HCVR包含具有不超過10個胺基酸取代的SEQ ID NO：11的胺基酸序列。根據本發明的一些實施例，抗人類PD-L1抗體或其抗原結合片段包含LCVR，該LCVR包含具有不超過10個胺基酸取代的SEQ ID NO：12的胺基酸序列。
同樣在本發明範疇內的是本文揭示之具有一或多個保守胺基酸取代的任何HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列的變體。例如，本發明包括使用具有HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列的抗PD-L1抗體，該序列相對於本文揭示的任何HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列帶有例如10個或更少、8個或更少、6個或更少、4個或更少等保守胺基酸取代。
可以在本發明方法的上下文中使用的其他抗PD-L1抗體包括，例如，在本領域中被提及且已知的抗體，如MDX-1105、阿特利珠單抗(TECENTRIQ TM)、德瓦魯單抗(IMFINZI TM)、阿維魯單抗(BAVENCIO TM)、LY3300054、FAZ053、STI-1014、CX-072、KN035(Zhang et al., Cell Discovery, 3, 170004 (March 2017))、CK-301 (Gorelik et al., American Association for Cancer Research Annual Meeting (AACR), 2016-04-04 Abstract 4606)，或美國專利第7943743號、第8217149號、第9402899號、第9624298號和第9938345號以及專利公開案WO 2007/005874、WO 2010/077634、WO 2013/181452、WO 2013/181634、WO 2016/149201、WO 2017/034916或EP3177649中列出的任何其他抗PD-L1抗體。辨識抗PD-L1抗體的所有上述出版物的部分以引用的方式併入本文。 抗 PD-L2 抗體及其抗原結合片段
在一些實施例中，本文揭示之方法中所用的PD-1路徑抑制劑是特異地結合PD-L2的抗體或其抗原結合片段(例如，抗PD-L2抗體)。例如，如在本發明上下文中使用的，「特異地結合」PD-L2的抗體包括以約1x10 -8M或更小的K D結合PD-L1或其部分的抗體(例如，較小的K D表示更為緊密的結合)。「高親和力」抗PD-L2抗體是指對PD-L2具有結合親和力的那些mAb，如藉由表面電漿共振測量(例如BIACORETM或溶液親和力ELISA)表示KD為至少10 -8M，諸如10 -9M、10 -10M、10 - 11M，或10 -12M。然而，特異地結合人類PD-L2的經分離抗體可能與其他抗原(例如來自其他(非人類)物種的PD-L2分子)具有交叉反應性。
可以在本發明方法的上下文中使用的抗PD-L2抗體包括例如美國專利第8552154號和第10647771號中闡述的抗PD-L2抗體。辨識抗PD-L2抗體的所有上述出版物的部分以引用的方式併入本文。 CTLA4 抑制劑
本文揭示的方法包括投予治療有效量的CTLA4抑制劑。如本文所用，「CTLA4抑制劑」是指能夠抑制、阻斷、消除或干擾CTLA4的活性或表現的任何分子。在一些實施例中，CTLA4抑制劑可以是抗體、小分子化合物、核酸、多肽，或其功能片段或變體。合適的CTLA4抑制劑的非限制性實例包括抗CTLA4抗體及其抗原結合片段。合適的CTLA4抑制劑的其他非限制性實例包括RNAi分子(諸如抗CTLA4 RNAi分子)和顯性抑制蛋白(諸如顯性抑制CTLA4蛋白)。 抗 CTLA4 抗體及其抗原結合片段
在一些實施例中，本文揭示之方法中所用的CTLA4抑制劑是特異地結合CTLA4的抗體或其抗原結合片段(例如，抗CTLA4抗體)。術語「特異地結合」或類似用語表示抗體或其抗原結合片段在生理條件下與抗原形成相對穩定的複合體。用於測定抗體是否特異地結合至抗原的方法為本領域中周知的，並包括例如平衡透析、表面電漿共振以及類似技術。例如，如本發明上下文中所用之「特異地結合」CTLA4的抗體包括小於約500 nM、小於約300 nM、小於約200 nM、小於約100 nM，小於約90 nM、小於約80 nM、小於約70 nM、小於約60 nM、小於約50 nM、小於約40 nM、小於約30 nM、小於約20 nM、小於約10 nM、小於約5 nM、小於約4 nM、小於約3 nM、小於約2 nM、小於約1 nM或小於約0.5 nM的K D的結合CTLA4抗體或其部分的抗體，如在表面電漿共振分析中所測量的。然而，特異地結合人類CTLA4的經分離抗體可能與其他抗原(諸如來自其他(非人類)物種的CTLA4分子)具有交叉反應性。
在某些例示性實施例中，可用於本發明上下文中的抗-CTLA4抗體或其抗原結合片段包含有包含胺基酸SEQ ID NO：13之重鏈可變區(HCVR)的重鏈互補決定區(HCDR)，以及包含胺基酸序列SEQ ID NO：14之輕鏈可變區(LCVR)的輕鏈互補決定區(LCDR)。
根據一些實施例，抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含三個HCDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和三個LCDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，其中HCDR1包含SEQ ID NO：15的胺基酸序列；HCDR2包含SEQ ID NO：16的胺基酸序列；HCDR3包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列；LCDR1包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列；LCDR2包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列；而LCDR3包含SEQ ID NO：20的胺基酸序列。
在又其他實施例中，抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含有包含胺基酸序列SEQ ID NO：13的HCVR和包含胺基酸序列SEQ ID NO：14的LCVR。在一些實施例中，抗體包含有包含胺基酸序列SEQ ID NO：21的重鏈。在一些實施例中，抗CTLA4抗體包含有包含胺基酸序列SEQ ID NO：22的輕鏈。
包含有包含胺基酸序列SEQ ID NO：13的重鏈可變區和包含胺基酸序列SEQ ID NO：14的輕鏈可變區的例示性抗體是稱為REGN4659的完全人類抗CTLA4抗體。
根據某些例示性實施例，本發明的方法包含使用REGN4659或其生物等效物。如本文所用，關於CTLA4抑制劑的術語「生物等效物」是指抗CTLA4抗體或CTLA4結合蛋白或其片段，它們是醫藥等效物或醫藥替代物，當在相似的實驗條件下(單劑量或多劑量)以相似的莫耳劑量投予時，其吸收比率及/或程度與參考抗體(例如，REGN4659)的吸收沒有顯示出顯著差異。在本發明上下文中，術語「生物等效物」包括結合至CTLA4並且在安全性、純度及/或效力方面與REGN4659沒有臨床上有意義差異的抗原結合蛋白。
根據本發明的一些實施例，抗人類CTLA4或其抗原結合片段包含與胺基酸序列SEQ ID NO：13具有至少90%(例如，90%、95%、96%、97%、98%、99%)序列同一性的HCVR。
根據本發明的一些實施例，抗人類CTLA4或其抗原結合片段包含與胺基酸SEQ ID NO：14具有(例如，90%、95%、96%、97%、98%、99%)序列同一性的LCVR。
根據本發明的一些實施例，抗人類CTLA4或其抗原結合片段包含HCVR，該HCVR包含具有不超過10個胺基酸取代的SEQ ID NO：13的胺基酸序列。根據本發明的一些實施例，抗人類CTLA4或其抗原結合片段包含LCVR，該LCVR包含具有不超過10個胺基酸取代的SEQ ID NO：14的胺基酸序列。
同樣在本發明範疇內的是本文揭示之具有一或多個保守胺基酸取代的任何HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列的變體。例如，本發明包括使用具有HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列的抗PD-L1抗體，該序列相對於本文揭示的任何HCVR、LCVR及/或CDR胺基酸序列具有例如10個或更少、8個或更少、6個或更少、4個或更少等保守胺基酸取代。
可用於本發明方法的上下文中的其他抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包括，例如在本領域中被提及和已知的抗體，如伊匹單抗、曲美木單抗或美國專利第7527969號、第8779098號、第7666424號、第7737258號、第7740845號、第8148154號、第8414892號、第8501471號和第9062110號中；以及在專利公開案US2013/0078234、US2010/0143245、WO2017062615A2、WO 2004/001381和WO 2012/147713中所闡述的任何抗CTLA4的抗體。辨識抗CTLA4抗體的所有上述出版物的部分以引用的方式併入本文。 醫藥組成物及投藥
本發明包括包含向個體投予溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑及/或CTLA4抑制劑的方法，其中抗體包含在個別的或組合的(單一)醫藥組成物中。本發明的醫藥組成物可以與合適的載劑、賦形劑和提供合適的轉移、遞送、耐受性與類似者的其他藥劑一起調配。在所有醫藥化學家都熟知的處方集中可以找到多種合適的調配物：Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa。這些調配物包括，例如粉末、糊劑、軟膏、凝膠、蠟、油、脂質、含有脂質(陽離子或陰離子)的囊泡(諸如LIPOFECTIN)、DNA結合物、無水吸收糊劑、水包油和油包水乳液、乳液卡波蠟(carbowax) (各種分子量的聚乙二醇)、半固體凝膠，以及含有卡波蠟的半固體混合物。另見Powell et al.PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311。
各種遞送系統是已知的並且可以用於投予本發明的醫藥組成物，例如囊封在脂質體、微粒、微膠囊、能夠表現突變病毒的重組細胞、受體媒介的胞吞作用(參見例如Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432)。投藥方法包括但不限於皮內、肌肉內、瘤內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外和口服路徑。該組成物可以透過任何方便的路徑投予，例如，藉由輸注或快速注射、藉由透過上皮或黏膜皮膚內襯(例如，口腔黏膜、直腸和腸黏膜等)吸收並且可以與其他生物活性劑一起投藥。
包含溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑或CTLA4抑制劑的醫藥組成物可以用標準針頭和注射器在瘤內、皮下或靜脈內遞送。此外，關於皮下遞送，筆型遞送裝置很容易應用於遞送本發明的醫藥組成物。此種筆型遞送裝置可以是重複使用或拋棄式。可重複使用的筆型遞送裝置通常使用含有醫藥組成物的可換式藥匣。在藥匣內的所有醫藥組成物被投藥後且藥匣空了，空的藥匣可輕易丟棄並且置換成含有醫藥組成物的新藥匣。那麼就可以重複使用筆型遞送裝置。就拋棄式筆型遞送裝置來說，沒有可換式藥匣。更確切地來說，拋棄式筆型遞送裝置在裝置的貯器內預先填充醫藥組成物。在貯器沒有醫藥組成物後，整個裝置就被丟棄。
在某些情況下，醫藥組成物以控制釋放系統的方式被投遞。在一個實施例中，可使用泵。在另一個實施例中，可使用聚合材料；參見例如Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida。在又另一個實施例中，控制釋放系統被置放在組成物目標鄰近之處，因此僅需要全身性劑量的一部分(參見例如Goodson, 1984，於Medical Applications of Controlled Release,上文, vol. 2, pp. 115-138中)。其他控制釋放系統在Langer, 1990, Science 249:1527-1533的回顧中被討論。
可注射製品可包括用於靜脈內、皮下、皮內及肌肉內注射、點滴輸注等的劑型。此等可注射製品可依照已知方法來製備。例如，可注射製品可例如藉由將上述抗體或其鹽溶解、懸浮或乳化於習知用於注射的無菌水性介質或油性介質中來製備。有關用於注射的水性介質，例如有生理食鹽水、含有葡萄糖與其他助劑的等張溶液等，其可與適當助溶劑(諸如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子性介面活性劑[例如聚山梨醇酯80、HCO-50(氫化菎麻油的聚氧乙烯(50 mol)加合物)]等組合使用。有關油性介質，採用例如芝麻油、大豆油等，其可與助溶劑(諸如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等)組合使用。由此製備的注射劑較佳地被填充於適當安瓿中。
有利地，上述供口服或非經腸使用的醫藥組成物被製備為呈適於活性成分劑量之單位劑量的劑型。此等呈單位劑量之劑型包括，例如錠劑、丸劑、囊劑、注射劑(安瓿)、栓劑等。
本發明還提供了包含溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑和CTLA4抑制劑的套組，組合以使用治療有效量之溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑及CTLA4抑制劑用於治療或抑制患者腫瘤生長的書面說明書。 投藥方案
本發明的方法可包括向個體投予溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑(例如，抗PD-1、抗PD-L1或抗PD-L2抗體，或其抗原結合片段)，或CTLA4抑制劑(例如，抗-CTLA4抗體或其抗原結合片段)，給藥頻率約為一週四次、一週兩次、一週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每五週一次、每六週一次、每八週一次、每十二週一次，或不那麼頻繁，只要達到治療反應即可。本發明的方法還可以包括投予單一劑之溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑或CTLA4抑制劑中各者。
在一些實施例中，一天一次、每兩天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每週一次、每兩週一次或每三週一次向患者投予溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑或CTLA4抑制劑中的至少一者。
在一些實施例中，同時向患者投予溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑和CTLA4抑制劑。
在一些實施例中，該等方法可以包括向個體依序投予溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑和CTLA4抑制劑中的兩者或更多者。在一些實施例中，溶瘤病毒在PD-1路徑抑制劑和CTLA4抑制劑之前或之後被投予給患者。在一些實施例中，PD-1路徑抑制劑在溶瘤病毒和CTLA4抑制劑之前或之後被投予給患者。在一些實施例中，CTLA4抑制劑在溶瘤病毒和PD-1路徑抑制劑之前或之後被投予給患者。
如本文所用，「依序投予」表示各劑的溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑或CTLA4抑制劑在不同時間點被投予給個體，例如在由預定間隔(例如數小時、數天、數週或數月)所分隔開的不同天。本發明包括包含依序向患者投予單一初始劑量的溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑或CTLA4抑制劑，接而為一或多個第二劑量的溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑或CTLA4抑制劑，以及接著視情況一或多個第三劑量的溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑或CTLA4抑制劑的方法。在一些實施例中，該等方法進一步包含向患者依序投予單一初始劑量的溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑或CTLA4抑制劑，然後是一或多個第二劑量的溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑或CTLA4抑制劑，以及接著視情況一或多個第三劑量的溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑或CTLA4抑制劑。
術語「初始劑量」、「第二劑量」及「第三劑量」意指投藥的時間順序。因此，「初始劑量」是在治療方案開始時被投予的劑量(亦意指為「基線劑量」)；「第二劑量」為在初始劑量之後被投予的劑量；而「第三劑量」為在第二劑量之後被投予的劑量。初始劑量、第二劑量與第三劑量可全都含有等量的溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑或CTLA4抑制劑。但是，在一些實施例中，初始劑量、第二劑量及/或第三劑量中所含的數量將會在治療療程期間彼此改變(例如調高或調低，若需要的話)。在一些實施例中，一或多個(例如，2、3、4或5個)劑量在治療方案開始時作為「加載劑量」被投予，然後後續劑量以較不頻繁的方式被投予(例如「維持劑量」)。
在本發明的一個例示性實施例中，各第二劑量及/或第三劑量緊接在先前劑量之後½至14週(例如½、1、1½、2、2½、3、3½、4、4½、5、5½、6、6½、7、7½、8、8½、9、9½、10、10½、11、11½、12、12½、13、13½、14、14½週或更久)被投予。用語「緊接在先前劑量」，如本文所用，表示以多次投予的順序，溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑或CTLA4抑制劑的劑量就順序而言在下一個劑量投予之前沒有任何插入的劑量被投予給患者。
在一些實施例中，該等方法可包括向個體投予任一數目的第二劑量及/或第三劑量的溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑(例如，抗PD-1抗體或其抗原結合片段)，或CTLA4抑制劑(例如，抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)。例如，在一些實施例中，僅有單一第二劑量被投予給患者。在其他實施例中，兩個或更多個(例如，2、3、4、5、6、7、8個或更多個)第二劑量被投予給患者。同樣地，在一些實施例中，僅有單一第三劑量被投予給患者。在其他實施例中，兩個或更多個(例如，2、3、4、5、6、7、8個或更多個)第三劑量被投予給患者。
在涉及多個第二劑量的實施例中，各第二劑量可以按照與其他第二劑量相同的頻率被投予。例如，各第二劑量可緊接在先前劑量之後1至2週被投予給患者。同樣地，在涉及多個第三劑量的實施例中，各第三劑量可以按照與其他第三劑量相同的頻率被投予。例如，各第三劑量可緊接在先前劑量之後2至4週被投予給患者。或者，第二劑量及/或第三劑量被投予給患者的頻率可能隨著治療方案過程而改變。投予頻率也可在治療療程期間由臨床醫師依據個別患者的需要遵循臨床檢驗來進行調整。
在一些實施例中，在治療方案開始時更為頻繁地(一週兩次、一週一次或2週內一次)投予一或多劑溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑或CTLA4抑制劑(「作為誘導劑量」)，然後以較低頻率(例如，4至12週內一次)投予後續劑量(「鞏固劑量」或「維持劑量」)。 劑量
根據本文揭示的方法，被投予給個體的溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑(例如，抗PD-1抗體或其抗原結合片段)，或CTLA4抑制劑(例如，抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)的數量通常是治療有效量。如本文所用，術語「治療有效量」表示溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑及/或CTLA4抑制劑的數量，其導致以下一或多項：(a)癌症(例如腫瘤病變)的症狀或適應症的嚴重程度或持續時間減少；(b)抑制腫瘤生長，或增加腫瘤壞死、腫瘤縮小及/或腫瘤消失；(c)延緩腫瘤生長和發展；(d)抑制腫瘤轉移；(e)預防腫瘤生長的復發；(f)增加患有癌症的個體的存活率；及/或(g)與未經治療的個體、用單一療法治療的個體，或用本文揭示的三種治療劑(PD-1路徑抑制劑、CTLA4抑制劑和溶瘤病毒)中的任何兩者治療的個體相比，常規抗癌療法的使用或需要減少(例如，消除對手術的需要或減少或消除化療劑或細胞毒性劑的使用)。
在一些實施例中，組合的溶瘤病毒可以按一或多個單位劑量的10、100、10 3、10 4、10 5、10 6、10 7、10 8、10 9、10 10、10 11、10 12、10 13、10 14或更多病毒顆粒(vp)或空斑形成單位(pfu)被投予。在一些實施例中，溶瘤病毒是溶瘤棒狀病毒(例如，野生型或經遺傳修飾的VSV)並且按一或多個劑量的10 6- 10 14pfu、10 6-10 12pfu、10 8-10 14pfu、10 8-10 12或10 10-10 12pfu或其間任何範圍被投予給患有癌症的人類。
在一些實施例中，組合的溶瘤病毒可以按一或多個單位劑量的10、100、10 3、10 4、10 5、10 6、10 7、10 8、10 9、10 10、10 11、10 12、10 13、10 14或更多50%組織培養感染劑量(TCID 50)被投予。在一些實施例中，溶瘤病毒是溶瘤棒狀病毒(例如，野生型或經遺傳修飾的VSV)並且按一或多個劑量的10 4- 10 14TCID 50、10 4- 10 14TCID 50、10 4-10 12TCID 50 、10 8-10 14TCID 50 、10 8-10 12或10 10-10 12TCID 50或其間任何範圍被投予給患有癌症的人類。
在一些實施例中，PD-1路徑抑制劑(例如抗PD-1抗體或其抗原結合片段，諸如西米普利單抗或其生物等效物)的治療有效量可為約0.05 mg至約1500 mg、約1 mg至約800 mg、約5 mg至約600 mg、約10 mg至約550 mg、約50 mg至約400 mg、約75 mg至約350 mg，或約100 mg至約300 mg抗體。例如，在各種實施例中，PD-1路徑抑制劑的數量為約0.05 mg、約0.1 mg、約1.0 mg、約1.5 mg、約2.0 mg、約5 mg、約10 mg、約15 mg、約20 mg、約30 mg、約40 mg、約50 mg、約60 mg、約70 mg、約80 mg、約90 mg、約100 mg、約110 mg、約120 mg、約130 mg、約140 mg、約150 mg、約160 mg、約170 mg、約180 mg、約190 mg、約200 mg、約210 mg、約220 mg、約230 mg、約240 mg、約250 mg、約260 mg、約270 mg、約280 mg、約290 mg、約300 mg、約310 mg、約320 mg、約330 mg、約340 mg、約350 mg、約360 mg、約370 mg、約380 mg、約390 mg、約400 mg、約410 mg、約420 mg、約430 mg、約440 mg、約450 mg、約460 mg、約470 mg、約480 mg、約490 mg、約500 mg、約510 mg、約520 mg、約530 mg、約540 mg、約550 mg、約560 mg、約570 mg、約580 mg、約590 mg、約600 mg、約610 mg、約620 mg、約630 mg、約640 mg、約650 mg、約660 mg、約670 mg、約680 mg、約690 mg、約700 mg、約710 mg、約720 mg、約730 mg、約740 mg、約750 mg、約760 mg、約770 mg、約780 mg、約790 mg、約800 mg、約810 mg、約820 mg、約830 mg、約840 mg、約850 mg、約860 mg、約870 mg、約880 mg、約890 mg、約900 mg、約910 mg、約920 mg、約930 mg、約940 mg、約950 mg、約960 mg、約970 mg、約980 mg、約990 mg、約1000 mg、約1010 mg、約1020 mg、約1030 mg、約1040 mg、約1050 mg、約1060 mg、約1070 mg、約1080 mg、約1090 mg、約1200 mg、約1210 mg、約1220 mg、約1230 mg、約1240 mg、約1250 mg、約1260 mg、約1270 mg、約1280 mg、約1290 mg、約1300 mg、約1310 mg、約1320 mg、約1330 mg、約1340 mg、約1350 mg、約1360 mg、約1370 mg、約1380 mg、約1390 mg、約1400 mg、約1410 mg、約1420 mg、約1430 mg、約1440 mg、約1450 mg、約1460 mg、約1470 mg、約1480 mg，約1490 mg或約1500 mg。
個別劑量中所含PD-1路徑抑制劑(例如，抗PD-1抗體或其抗原結合片段)的數量可表示為每公斤個體體重的毫克抗體(即mg/kg)。在一些實施例中，本文揭示方法中所用的PD-1路徑抑制劑可以約0.0001至約100 mg/kg個體體重的劑量被投予給個體。在一些實施例中，可以約0.1 mg/kg至約20 mg/kg患者體重的劑量投予抗PD-1抗體。在一些實施例中，本發明方法包含以約1 mg/kg至3 mg/kg、1 mg/kg至5 mg/kg、1 mg/kg至10 mg/kg、1 mg/kg、3 mg/kg、5 mg/kg或10 mg/kg患者體重的劑量投予PD-1路徑抑制劑(例如，抗PD-1抗體或其抗原結合片段)。
在一些實施例中，每劑包含0.1-10 mg/kg個體體重(例如，0.3 mg/kg、1 mg/kg、3 mg/kg或10 mg/kg)。在某些其他實施例中，每劑包含5-1500 mg的PD-1路徑抑制劑(諸如抗PD-1抗體或其抗原結合片段)，例如5 mg、10 mg、15 mg、20 mg、25 mg、30 mg、40 mg、45 mg、50 mg、100 mg、150 mg、200 mg、250 mg、300 mg、350 mg、400 mg、450 mg、500 mg、550 mg、600 mg、650 mg、700 mg、750 mg、800 mg、850 mg、900 mg、950 mg、1000 mg、1050 mg、1100 mg、1150 mg、1200 mg、1550 mg、1300 mg、1350 mg、1400 mg、1450 mg，或1500 mgPD-1路徑抑制劑。
在一些實施例中，CTLA4抑制劑(例如抗CTLA4抗體或其抗原結合片段，或其生物等效物)的治療有效量可為約0.05 mg至約1000 mg、約1 mg至約800 mg、約5 mg至約600 mg、約10 mg至約550 mg、約50 mg至約400 mg、約75 mg至約350 mg，或約100 mg至約300 mg抗體。例如，在各種實施例中，CTLA4抑制劑的數量為約0.05 mg、約0.1 mg、約1.0 mg、約1.5 mg、約2.0 mg、約5 mg、約10 mg、約15 mg、約20 mg、約30 mg、約40 mg、約50 mg、約60 mg、約70 mg、約80 mg、約90 mg、約100 mg、約110 mg、約120 mg、約130 mg、約140 mg、約150 mg、約160 mg、約170 mg、約180 mg、約190 mg、約200 mg、約210 mg、約220 mg、約230 mg、約240 mg、約250 mg、約260 mg、約270 mg、約280 mg、約290 mg、約300 mg、約310 mg、約320 mg、約330 mg、約340 mg、約350 mg、約360 mg、約370 mg、約380 mg、約390 mg、約400 mg、約410 mg、約420 mg、約430 mg、約440 mg、約450 mg、約460 mg、約470 mg、約480 mg、約490 mg、約500 mg、約510 mg、約520 mg、約530 mg、約540 mg、約550 mg、約560 mg、約570 mg、約580 mg、約590 mg、約600 mg、約610 mg、約620 mg、約630 mg、約640 mg、約650 mg、約660 mg、約670 mg、約680 mg、約690 mg、約700 mg、約710 mg、約720 mg、約730 mg、約740 mg、約750 mg、約760 mg、約770 mg、約780 mg、約790 mg、約800 mg、約810 mg、約820 mg、約830 mg、約840 mg、約850 mg、約860 mg、約870 mg、約880 mg、約890 mg、約900 mg、約910 mg、約920 mg、約930 mg、約940 mg、約950 mg、約960 mg、約970 mg、約980 mg、約990 mg或約1000 mg。
個別劑量中所含CTLA4路徑抑制劑(例如，抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)的數量可表示為每公斤個體體重的毫克抗體(即mg/kg)。在一些實施例中，可以約0.1 mg/kg至約20 mg/kg患者體重的劑量投予抗CTLA4抗體。在一些實施例中，本發明方法包含以約1 mg/kg至3 mg/kg、1 mg/kg至5 mg/kg、1 mg/kg至10 mg/kg、1 mg/kg、3 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg，或15 mg/kg患者體重的劑量投予CTLA4路徑抑制劑(例如，抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)。
在一些實施例中，每劑包含0.1-10 mg/kg個體體重(例如，0.3 mg/kg、1 mg/kg、3 mg/kg或10 mg/kg)。在某些其他實施例中，每劑包含5-1000 mg CTLA4抑制劑(諸如抗CTLA4抗體或其抗原結合片段)，例如5 mg、10 mg、15 mg、20 mg、25 mg、30 mg、40 mg、45 mg、50 mg、100 mg、150 mg、200 mg、250 mg、300 mg、350 mg、400 mg、450 mg、500 mg、550 mg、600 mg、650 mg、700 mg、750 mg、800 mg、850 mg、900 mg、950 mg，或1000 mg CTLA4抑制劑。
在一些實施例中，本發明方法進一步包括向個體投予額外治療劑或療法。可以投予額外治療劑或療法以增加抗腫瘤功效、降低一或多種療法的毒性作用及/或減少一或多種療法的劑量。在各種實施例中，額外治療劑或療法可包括以下一或多者：放射線、手術、癌症疫苗、咪喹莫特、抗病毒劑(例如西多福韋)、光動力療法、淋巴細胞活化基因3(LAG3)抑制劑(例如，抗LAG3抗體、糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體(GITR)促效劑(例如，抗GITR抗體)、含有T細胞免疫球蛋白和黏蛋白-3(TIM3)抑制劑、B-淋巴細胞和T-淋巴細胞弱化子(BTLA)抑制劑、具有Ig和ITIM結構域的T細胞免疫受體(TIGIT)抑制劑、CD38抑制劑、CD47抑制劑、吲哚胺-2,3-雙加氧酶(IDO)抑制劑、CD28活化因子、血管內皮生長因子(VEGF)拮抗劑(例如，「VEGF-Trap」，例如阿柏西普(aflibercept)，或抗VEGF抗體或其抗原結合片段(例如，貝伐單抗(bevacizumab)或蘭尼單抗(ranibizumab))或VEGF受體的小分子激酶抑制劑(例如，舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)或帕唑帕尼(pazopanib))、血管生成素-2(Ang2)抑制劑、轉形生長因子β(TGFβ)抑制劑、表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑、針對腫瘤特異性抗原(例如CA9、CA125、黑色素瘤相關抗原3(MAGE3)、癌胚抗原(CEA)、波形蛋白、腫瘤-M2-PK、前列腺特異性抗原(PSA)、黏蛋白-1、MART-1和CA19-9)的抗體、疫苗(例如卡介苗)、顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、第二種溶瘤病毒、細胞毒素、化療劑(例如，培美曲塞(pemetrexed)、達卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、多西他賽(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、柔紅黴素(daunorubicin)、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、吉西他濱(gemcitabine)、甲胺蝶呤(methotrexate)、米托蒽醌(mitoxantrone)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、紫杉醇、托泊替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)、長春瑞濱(vinorelbine)和長春新鹼(vincristine))、IL-6R抑制劑、IL-4R抑制劑、IL-10抑制劑、細胞激素(諸如IL-2、IL-7、IL-12、IL-21和IL-15)、抗體藥物結合物、消炎藥(諸如皮質類固醇、非類固醇消炎藥(NSAID))、冷凍療法、抗HPV療法、雷射療法、具有HPV的細胞的電外科切除術，及其組合。
在一些實施例中，該等方法進一步包含投予額外治療劑，諸如抗癌藥。如本文所用，「抗癌藥」表示可用於治療癌症的任何藥劑，包括但不限於細胞毒素和藥劑，例如抗代謝物、烷化劑、蒽環類、抗生素、抗有絲分裂劑、丙卡巴肼、羥基脲、天冬醯胺酸酶、皮質類固醇、米托坦(O, P'-(DDD))、生物製劑(例如抗體和干擾素)以及放射性藥劑。如本文所用，「細胞毒素或細胞毒性劑」還指化療劑並且表示對細胞有害的任何藥劑。實例包括TAXOL(紫杉醇)、替莫唑胺、細胞鬆弛素B (cytochalasin B)、短桿菌肽D (gramicidin D)、溴化乙錠、依米汀(emetine)、順鉑、絲裂黴素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、長春新鹼、長春鹼(vinblastine)、秋水仙鹼(colchicine)、多柔比星、柔紅黴素、二羥基蒽二酮、米托蒽醌、光神黴素(mithramycin)、放線菌素D、1-二氫睪固酮、糖皮質激素、普魯卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛爾(propranolol)和嘌呤黴素，及其類似物或同系物。 額外定義
為了有助於理解根據本發明組成物和方法的詳細說明，提供了一些明確的定義以增進對本發明的各個態樣的明確揭示。除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬技藝中具有通常技術者一般理解的相同含義。
如本文所用，術語「藥劑」表示化學化合物、化學化合物的混合物、生物大分子(例如核酸、抗體、蛋白質或其部分，例如肽)或由生物材料製成的萃取物，生物材料為諸如細菌、植物、真菌或動物(尤其是哺乳動物)細胞或組織。此類藥劑的活性可以使其適宜作為「治療劑」，其是在個體體內局部或全身性發揮作用的生物學、生理學或藥理學活性物質(等)。在本發明的上下文中，術語「治療劑」是指本文揭示的任何PD-1路徑抑制劑、CTLA4抑制劑或溶瘤病毒。
如本文所用，術語「治療劑(therapeutic agent)」、「可用於治療的藥劑(therapeutic capable agent)」或「治療劑(treatment agent)」可交替使用，並指在投予於個體時賦予某些有益效果的分子或化合物。有益效果包括能夠進行診斷確定；改善疾病、症狀、病症或病理狀況；減少或預防疾病、症狀、病症或病況的發作；並且通常對抗疾病、症狀、病症或病理狀況。
如本文所用，術語「醫藥上可接受的」是指諸如載劑或稀釋劑之類的材料，其不會消除組成物的生物活性或性質並且相對無毒，即該材料可以被投予給個體而不會引起不樂見的生物學效用或以有害方式與包含它的組成物的任何組分交互作用。
如本文所用，術語「醫藥上可接受的載劑」包括醫藥上可接受的鹽、醫藥上可接受的材料、組成物或載劑(諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或囊封材料)，其涉及將本發明化合物(等)於個體體內攜帶或運輸或攜帶或運輸至個體以便其可以執行其預期功能。通常，此類化合物從一個器官或身體一部分被攜帶或運輸至另一個器官或身體一部分。就與調配物的其他成分相容的意義來說，每種鹽或載劑必須是「可接受的」，並且對個體無害。可用作醫藥上可接受的載劑的材料的一些實例包括：糖，諸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；澱粉，諸如玉米澱粉和馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素、和乙酸纖維素；粉狀黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，諸如可可脂和栓劑蠟；油，諸如花生油、棉籽油、紅花籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；二醇類，諸如丙二醇；多元醇，諸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯類，諸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩衝劑，諸如氫氧化鎂和氫氧化鋁；海藻酸；無熱原水；等滲食鹽水；林格氏溶液；乙醇；磷酸鹽緩衝溶液；稀釋劑；造粒劑；潤滑劑；黏合劑；崩解劑；潤濕劑；乳化劑；著色劑；脫模劑；包衣劑；甜味劑；調味劑；香味劑；防腐劑；抗氧化劑；塑化劑；凝膠劑；增稠劑；硬化劑；定型劑；懸浮劑；表面活性劑；保濕劑；載劑；穩定劑；和其他在醫藥調配物中採用的無毒相容物質，或其任何組合。如本文所用，「醫藥上可接受的載劑」還包括與本發明的一或多種組分的活性相容並且對個體來說生理學上可接受的任何和所有包衣、抗菌劑和抗真菌劑以及吸收延遲劑與類似者。補充性活性化合物也可以摻入組成物中。
劑量通常是根據體重來表示。因此，表示為[g、mg或其他單位]/kg (或g、mg等)的劑量通常是指[g、mg或其他單位]「每公斤(或g、mg等)體重」，即使沒有明確提及「體重」一詞。治療可能包括各種「單位劑量」。單位劑量定義為含有預定量的治療組成物。單位劑量不需要以單次注射投藥，而是可能包含在一段設定的時間內連續輸注。關於溶瘤病毒，單位劑量可以用空斑形成單位(pfu)或病毒組成的病毒顆粒來記述。單位劑量範圍為10 3、10 4、10 5、10 6、10 7、10 8、10 9、10 10、10 11、10 12、10 13pfu或vp或更高。或者，根據病毒的種類和可達到的效價，將向患者或患者的細胞提供1至100、10至50、100-1000或至多約1 x 10 4、1 x 10 5、1 x 10 6、1 x 10 7、1 x 10 8、1 x 10 9、1 x 10 10、1 x 10 11、1 x 10 12、1 x 10 13、1 x 10 14，或 1 x 10 15或更高的傳染性病毒顆粒(vp)。或者，溶瘤病毒的單位劑量是由TCID 50表示。「TCID 50」是指「組織培養感染劑量」，並定義為給定批次接種細胞培養物中的50%感染所需的病毒稀釋度。本技術領域具有通常知識者熟知的各種方法可用於計算TCID 50，包括通篇說明書內使用的Spearman-Karber方法。有關Spearman-Karber方法的說明，參見B. W. Mahy & H. 0. Kangro, Virology Methods Manual 25-46 (1996)。在一些實施例中，單位劑量範圍為10 3、10 4、10 5、10 6、10 7、10 8、10 9、10 10、10 11、10 12、10 13TCID 50和更高或其間任何範圍。
如本文所用，術語「疾病」通常希望是同義詞，並且可與術語「病症」和「病況」 (如在醫學病況中)交替使用，因為它們都反映了人體或動物體或其一部分的異常病況(例如，癌症)，其會損害正常功能，通常表現為明顯的徵象和症狀，並導致人類或動物的壽命或生活品質降低。
如本文所用，術語「活體外」是指在人工環境中發生的事件，例如在試管或反應容器中、在細胞培養物中等，而不是在多細胞生物體中。
如本文所用，術語「活體內」是指在多細胞生物體(諸如非人類動物體內)發生的事件。
如本文所用，單數形式「一(a、an)」或「該(the)」包括複數個指代對象，除非上下文另有明確說明。
如本文所用，除非另有註明，否則術語「包括」、「包含」、「含有」或「具有」及其變體意在含括其後列出的項目及其等效物以及額外請求標的。
如本文所用，重複使用片語「在一個實施例中」、「在各種實施例中」、「在一些實施例中」與類似者。這樣的片語不一定指相同的實施例，但除非上下文另有說明，否則它們可能指相同的實施例。
如本文所用，術語「及/或」或「/」表示與該術語相關聯的項目中的任何一者、項目的任何組合或所有項目。
如本文所用，單詞「基本上」不排除「完全」，例如「基本上不含」Y的組成物可能完全不含Y。必要時，可以從本發明的定義中省略單詞「基本上」。
如本文所用，術語「各」在用於指代項目集合時，意欲在識別集合中的單獨項目，但不一定指集合中的每個項目。如果明確揭示或上下文清楚地另有規定，則可能會出現例外情況。
如本文所用，當應用於一或多個感興趣之值時，術語「大約」或「約」是指與規定的參考值相似的值。在一些實施例中，術語「大約」或「約」是指範圍落在規定參考值的25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更少(大於或小於)之值(不論是哪個方向)，除非另有規定或從上下文中可以明顯看出(除非該數字超過可行值的100%)。除非本文另有說明，否則術語「約」意欲包括與所引用範圍相近的值(例如重量百分率)，其在單獨成分、組成物或實施例的功能性方面相當。
如本文所揭示，提供了多個值範圍。應當理解，除非上下文另有明確規定，否則每個介於該範圍的上限和下限之間的中間值到下限的十分之一單位也被具體揭示出來。本發明含括在規定範圍內的任何規定值或中間值和規定範圍內的任何其他規定值或中間值之間的每個較小範圍。這些較小範圍的上限和下限可以獨立地納入或排除在該範圍內，且限制的其中一者、無一者或兩者都被納入較小範圍內的每個範圍也含括在本發明內，但在規定的範圍內受任何明確排除條件所限制。在估定範圍包括一或兩個限制的情況下，排除那些被納入的一或兩個限制的範圍也含括在本發明中。
本文提供的任何和所有實例或例示性語言(例如「諸如」)的使用僅是希望在更為充分地闡明本發明並且不對本發明的範疇構成限制，除非另有聲明。說明書中的任何語言都不應被解釋為指示任何未請求保護的元件對於實施本發明來說必不可少。
除非本文另有說明或與上下文明顯矛盾，否則本文所述的所有方法均按任何合適的順序執行。關於所提供的任何方法，方法的步驟可以同時或依序發生。當方法的步驟依序發生時，這些步驟可以按任何順序發生，除非另有註明。在方法包括步驟組合的情況下，除非本文另有註明，否則步驟的各個與每個組合或子組合都含括在本發明的範疇內。
在此引用的每份出版物、專利申請案、專利和其他參考文獻按照與本發明不等的程度以全文引用的方式併入。本文所揭示的出版物僅提供它們在本發明的申請日期之前揭示。本文中的任何內容均不應被解釋為承認本發明無權因先前揭示內容而早於此出版物。此外，提供的公開日期可能與實際公開日期不同，這可能需要獨立確認。
應當理解，本文描述的實例和實施例僅用為說明目的，並且將據其向本技術領域具有通常知識者提出各種修改或變化，並且將被納入在本件申請案的精神和範圍以及隨附申請專利範圍的範疇內。 實例
提出以下實例是為了向那些本技術領域具有通常知識者提供如何製作和使用本發明方法與組成物的完整揭示和說明，並不是想要限制發明人視為的發明範疇。同樣地，本發明不限於本文所述的任何特定較佳實施例。實際上，在閱讀過這份說明書後，那些本技術領域具有通常知識者可以清楚地了解實施例的修改和變化，並且可以在不脫離其精神和範疇的情況下做出修改和變化。已盡力確保所用數字(例如數量、溫度等)的準確性，但應考量到仍會有一些實驗誤差和偏差。除非另有說明，否則份是重量份、分子量是平均分子量、溫度是呈攝氏度、室溫是約25℃，而壓力為大氣壓或接近大氣壓。 實例 1 ：在帶有 150 mm 3 平均 MC38 腫瘤的小鼠體內，利用抗 PD-1 、抗 CTLA4 和瘤內遞送溶瘤病毒 VSV-M51R-Fluc 的組合治療的抗腫瘤功效
本實例說明了在移植有MC38腫瘤的野生型小鼠體內，使用溶瘤病毒水泡性口炎病毒(VSV)與抗PD-1和抗CTLA4的三重組合的抗腫瘤功效。本實例(以及後續實例2-3)中使用的VSV是一種在遺傳上減毒的病毒，命名為VSV-M51R-Fluc，因為它在M蛋白中編碼一個突變(M51R) (M蛋白抑制宿主細胞蛋白的產生，但M51R突變保留了宿主細胞蛋白質的產生)，並編碼被插入到G和L病毒基因之間的螢火蟲螢光素酶。本實例(以及後續實例2-4)中使用的抗PD-1抗體是抗小鼠PD-1大鼠IgG2a抗體(純系29F1.A12，來自Bioxcell)，而本實例(以及後續實例2-4)中使用的抗CTLA4抗體是抗小鼠CTLA4-mIgG2a抗體(純系9D9)。
在第0天，將來自Jackson Laboratories的C57BL/6品系背景小鼠皮下植入MC38細胞(3x10 5個細胞懸浮在100 µl DMEM/小鼠中)。使用卡尺測量腫瘤，並用公式(L 2xW)/2計算腫瘤體積，其中L是最小尺寸。當平均腫瘤大小在第15天達到150 mm 3時，小鼠被平均隨機分成7個治療組。在15、19、22和26天，小鼠被瘤內注射50 µl的VSV-M51R-Fluc病毒(按照5x10 5TCID 50的劑量，重新懸浮於50 µl PBS)或PBS(作為對照)，及/或腹膜內注射250 µg同型對照抗體(mIgG2a及/或大鼠IgG2a)及/或250 µg抗CTLA4抗體及/或抗PD-1抗體。不同組別的實驗給藥和治療方案顯示於表1中。 表 1 ：小鼠組別的實驗給藥和治療方案
組別 病毒或PBS 路徑 在D15 時給予的病毒或PBS TCID 50 Ab 1 (IP 途徑) Ab 2 (IP 途徑) 給藥間隔抗體 n #
1 瘤內 PBS - 同型大鼠IgG2a 250 µg 同型小鼠IgG2a 250 µg D15、19、22與26 5
2 瘤內 PBS - a-PD-1 250 µg 同型小鼠IgG2a 250 µg D15、19、22與26 5
3 瘤內 PBS - a-PD-1 250 µg a-CTLA4 250 µg D15、19、22與26 6
4 瘤內 VSV-M51R-Fluc 5x10 5TCID 50 同型大鼠IgG2a 250 µg 同型小鼠IgG2a 250 µg D15、19、22與26 5
5 瘤內 VSV-M51R-Fluc 5x10 5TCID 50 a-PD-1 250 µg 同型小鼠IgG2a 250 µg D15、19、22與26 6
6 瘤內 VSV-M51R-Fluc 5x10 5TCID 50 同型大鼠IgG2a 250 µg a-CTLA4 250 µg D15、19、22與26 6
7 瘤內 VSV-M51R-Fluc 5x10 5TCID 50 a-PD-1 250 µg a-CTLA4 250 µg D15、19、2與26 6
每週兩次藉由卡尺測量監測腫瘤體積，直到第60天研究結束。
每組隨時間的平均腫瘤體積證明，與利用PBS治療和同型對照治療組相比，利用VSV或抗PD-1抗體的單一療法顯示出部分腫瘤生長抑制作用( 圖 1)。治療開始後第26天的個別腫瘤體積( 圖 2)用於統計分析，因為這是研究中所有組別中全部動物都存活的最後時間點。統計顯著性是藉由單因數ANOVA加上Dunnett多重比較後測(** p＜ 0.01，**** p＜ 0.0001)來確定。抗PD-1抗體或VSV的單一療法療效並未達到統計顯著性。與利用抗PD-1抗體的單一療法或對照相比，VSV加上抗CTLA4抗體或加上抗PD-1抗體治療的組合導致更有效的腫瘤生長抑制作用，其中在第26天，組合治療組的腫瘤在統計學上比抗PD-1抗體治療組的腫瘤明顯更小( 圖 3)。截至第26天，與沒有任何無腫瘤小鼠的所有其他單一和雙重組合相比，抗CTLA4和抗PD-1抗體治療的組合導致腫瘤生長在統計上有顯著降低。值得注意的是，與所有其他組別相比，VSV加上抗CTLA4和抗PD-1抗體治療的三重組合更為有效，其中所有小鼠在第29天前清除腫瘤，且這種腫瘤清除持續到第60天研究結束( 圖 1 、 2 、 3)。表2歸納了每個治療組的平均腫瘤體積、存活百分率和無腫瘤小鼠的數量。 表 2 ：每個治療組的平均腫瘤體積、存活百分率和無腫瘤小鼠的數量
治療組(n=5-6) 腫瘤體積，mm 3 平均值(±SD) 無腫瘤小鼠 存活率，%
第26 天 第29 天 第26 天 第29 天 第60 天
1 PBS 1821 (±168) 0/5 100% 0% 0%
2 a-PD-1 1326 (±164) 0/5 100% 0% 0%
3 a-PD-1 + a-CTLA4 223 (±59) 1/5 100% 100% 20%
4 VSV 1364 (126) 0/6 100% 0% 0%
5 VSV + a-PD-1 1220 (±115) 0/6 100% 16.6% 0%
6 VSV + a-CTLA4 932 (±148) 0/6 100% 50% 0%
7 VSV + a-PD-1 + a-CTLA4 70 (±26) 6/6 100% 100% 100%
如表2中所示，在研究過程期間，利用VSV加上抗PD-1和抗CTLA4抗體的三重組合治療的小鼠在控制和清除大腫瘤方面相當有效，其中六隻小鼠中有六隻在第29天是無腫瘤的。在研究的第26天，與對照組相比，在有或沒有組合以VSV的情況下利用抗PD-1或抗CTLA4抗體治療的小鼠展現出適量減少的腫瘤體積。相比之下，與對照組相比，在本研究中，利用抗PD1和抗CTLA4抗體雙重組合治療在減少腫瘤體積方面證實有顯著功效，其中五隻小鼠中有一隻小鼠實現了腫瘤清除；但不如將VSV組合以抗PD1和抗CTLA4抗體遞送時那樣有效。截至研究的第29天，對照PBS組、抗PD-1組、經VSV治療組中的所有小鼠都沒活下來，雙重組合VSV加上抗PD-1治療組中有六分之五、雙重組合VSV加上抗CTLA4組中有六分之三，以及抗PD1和抗CTLA4抗體雙重組合和三重組合VSV加上抗PD-1和抗CTLA4抗體組中的所有小鼠存活了下來。在研究結束時，只有三重組合組保持無腫瘤並活了下來，抗PD1和抗CTLA4抗體雙重組合組中的五隻小鼠中只有一隻活下來。由於三重組合療法，觀察到沒有體重減輕的證據。
總歸來說，與利用抗體及/或VSV的單一療法或雙重療法相比，VSV加上抗mCTLA4和抗PD-1抗體的組合治療會導致腫瘤生長減少且存活期更長。 實例 2 ：三重組合抗 PD-1 、抗 CTLA4 和瘤內遞送溶瘤病毒 VSV-M51R-GFP 的抗腫瘤功效可在僅只一劑抗 CTLA4 mIgG2a 抗體 的情況下達到
本實例說明了在移植有MC38腫瘤的野生型小鼠體內，使用溶瘤病毒水泡性口炎病毒(VSV)加上抗PD-1和抗CTLA4的三重組合要達到的抗腫瘤功效所必需的抗CTLA4抗體的劑量數。本研究中使用的VSV是一種在遺傳上減毒的病毒，命名為VSV-M51R-GFP，因為它在M蛋白中編碼一個突變(M51R) (M蛋白抑制宿主細胞蛋白的產生，但M51R突變保留了宿主細胞蛋白質的產生)，並編碼被插入到G和L病毒基因之間的GFP。在第0天，將來自Jackson Laboratories的C57BL/6品系背景小鼠皮下植入MC38細胞(3x10 5個細胞/小鼠)。使用卡尺測量腫瘤，並利用公式(L 2xW)/2計算腫瘤體積，其中L是最小尺寸。當平均腫瘤大小在第15天達到150 mm 3時，小鼠被平均隨機分成5個治療組。在第15、18、22和25天，小鼠被瘤內注射50 μl VSV-M51R-GFP病毒(按照5x10 8TCID 50的劑量，重新懸浮於PBS中)或PBS(作為對照)，及/或加上腹膜內注射250 µg同型對照抗體及/或抗PD-1抗體，及/或4劑(在第15、18、22和25天)或一劑(在第15天)或兩劑(在第15和18天)250 µg抗CTLA4抗體(劑量數各異) (表3)。 表 3 ：小鼠組別的實驗給藥和治療方案
組別 病毒或PBS 途徑 在D15 時給予的病毒或PBS TCID 50 Ab 1 (IP 途徑) Ab 2 (IP 途徑) # 劑量 給藥間隔抗體 n #
1 瘤內 PBS - 同型大鼠IgG2a 250 µg 同型mIgG2a 250 µg D15、18、22與25 7
2 瘤內 PBS - a-PD-1 250 µg a-CTLA4 mIgG2a 250 µg 4劑 D15、18、22與25 7
3 瘤內 VSV-M51R-GFP 5x10 8TCID 50 a-PD-1 250 µg a-CTLA4 mIgG2a 250 µg 4劑 D15、18、22與25 7
4 瘤內 VSV-M51R-GFP 5x10 8  TCID 50 a-PD-1 250 µg a-CTLA4 mIgG2a 250 µg 1劑 D15、18、22與25 8
5 瘤內 VSV-M51R-GFP 5x10 8  TCID 50 a-PD-1 250 µg a-CTLA4 mIgG2a 250 µg 2劑 D15、18、22與25 8
每週兩次藉由卡尺測量監測腫瘤體積，直到第60天研究結束。
表4歸納了每個治療組的平均腫瘤體積、存活百分率和無腫瘤小鼠的數量。在接受一劑或兩劑或四劑抗CTLA4抗體的組別中，三重組合VSV加上抗PD-1抗體和mIgG2a形式之抗CTLA4抗體的抗腫瘤功效非常相似( 圖 4A 、 4B 、 4C 、 4D 、 4E)，其中截至第45天，一劑組和兩劑組的八隻小鼠中有六隻(75%)沒有腫瘤，而相較之下在4劑組中，七隻小鼠中有五隻(71%)沒有腫瘤。截至第60天，一劑組和兩劑組有62.5%的小鼠存活下來且無腫瘤，而相較之下四劑組為71.4%( 圖 5)。這些結果表明，三重組合VSV加上抗PD-1和抗CTLA4抗體的有效抗腫瘤功效可用連同病毒和第一劑抗PD-1抗體同時給予的僅只一劑抗CTLA4來概括。 表 4 ：每個治療組的平均腫瘤體積、存活百分率和無腫瘤小鼠的數量
治療組(n=5-6) 腫瘤體積，mm 3 平均值(±SD) 無腫瘤小鼠 存活率，%
第29 天 第29 天 第45 天 第29 天 第32 天 第60 天
1 PBS 2404 (±294) 0/7 0/7 100% 0% 0%
2 a-PD-1 + a-CTLA4 mIgG2a (4劑) 580 (±129) 0/7 0/7 100% 100% 0%
3 VSV I.T. + a-PD-1 + a-CTLA4 mIgG2a (4劑) 70 (±45) 3/7 5/7 100% 100% 71.4%
4 VSV I.T. + a-PD-1 + a-CTLA4 mIgG2a (1劑) 207 (±128) 0/8 6/8 100% 100% 62.5%
5 VSV I.T. + a-PD-1 + a-CTLA4 mIgG2a (2劑) 140 (±82) 3/7 6/8 100% 100% 62.5%
實例 3 ：三重組合抗 PD-1 、抗 CTLA4 和溶瘤病毒 VSV-M51R-GFP 的抗腫瘤功效可以利用瘤內或靜脈內遞送病毒來實現
本實例說明了在移植有MC38腫瘤的野生型小鼠體內，要遞送病毒以便達到使用溶瘤病毒水泡性口炎病毒(VSV)加上抗PD-1和抗CTLA4的三重組合的抗腫瘤功效的遞送途徑。本實例中使用的VSV是一種在遺傳上減毒的病毒，命名為VSV-M51R-GFP，因為它在M蛋白中編碼一個突變(M51R) (M蛋白抑制宿主細胞蛋白的產生，但M51R突變保留了宿主細胞蛋白質的產生)，並編碼被插入到G和L病毒基因之間的GFP。在第0天，將來自Jackson Laboratories的C57BL/6品系背景小鼠皮下植入MC38細胞(3x10 5個細胞/小鼠)。使用卡尺測量腫瘤，並利用公式(L 2xW)/2計算腫瘤體積，其中L是最小尺寸。當平均腫瘤大小在第15天達到150 mm 3時，小鼠被平均隨機分成4個治療組。在第15、18、22和25天，小鼠被瘤內注射50 µl VSV-M51R-GFP病毒(按照5x10 8TCID 50的劑量，重新懸浮於PBS中)或靜脈內注射200 µl VSV-M51R-GFP病毒(按照1x10 9TCID 50的劑量，重新懸浮於PBS中)或PBS(作為對照)，及/或加上腹膜內注射250 µg同型對照抗體及/或抗PD-1抗體及/或250 µg抗CTLA4抗體(表5)。監測腫瘤體積直至第60天研究結束。 表 5 ：小鼠組別的實驗給藥和治療方案
組別 病毒或PBS 途 徑 在D15 時給予的病毒或PBS TCID 50 Ab 1 (IP 途徑) Ab 2 (IP 途徑) # 劑量 給藥間隔抗體 n #
1 瘤內 PBS - 同型大鼠IgG2a 250 µg 同型mIgG2a 250 µg D15、18、22 與25 7
2 瘤內 PBS - a-PD-1 250 µg a-CTLA4 mIgG2a 250 µg 4劑 D15、18、22與25 7
3 瘤內 VSV-M51R-GFP 1x10 9TCID 50 a-PD-1 250 µg a-CTLA4 mIgG2a 250 µg 4劑 D15、18、22與25 7
4 靜脈內 VSV-M51R-GFP 1x10 9TCID 50 a-PD-1 250 µg a-CTLA4 mIgG2a 250 µg 4劑 D15、18、22與25 8
表6歸納了本實驗中每個治療組的平均腫瘤體積、存活百分比和無腫瘤小鼠的數量。
三重組合VSV加上抗PD-1和抗CTLA4抗體的抗腫瘤功效在接受VSV的組別中非常強大，無論是瘤內單劑還是靜脈內單劑，靜脈內遞送傾向於比瘤內遞送更為有效( 圖 6)，其中靜脈內給藥組的八隻小鼠中有八隻(100%)截至第45天沒有腫瘤，相較之下瘤內給藥組的七隻小鼠中為五隻(71%)。截至第60天，100%的靜脈內給藥組活了下來並且無腫瘤，而相較之下瘤內給藥組為71.4% ( 圖 7)。VSV的靜脈內遞送大大增強了抗PD-1和抗CTLA4組合檢查點療法，並表明利用瘤內或靜脈內遞送病毒可以實現三重組合功效。 表 6 ：每個治療組的平均腫瘤體積、存活百分率和無腫瘤小鼠的數量
治療組(n=5-6) 腫瘤體積，mm 3 平均值(±SD) 無腫瘤小鼠 存活率，%
第29 天 第29 天 第45 天 第29 天 第32 天 第60 天
1 PBS 2404 (±294) 0/7 0/7 100% 0% 0%
2 a-PD-1 + a-CTLA4 mIgG2a (4劑) 580 (±129) 0/7 0/7 100% 100% 0%
3 VSV I.T. + a-PD-1 + a-CTLA4 mIgG2a (4劑) 70 (±45) 3/7 5/7 100% 100% 71.4%
4 VSV I.V. + a-PD-1 + a-CTLA4 mIgG2a (4劑) 40 (±12)  2/8 8/8 100% 100% 100%
實例 4 ：在帶有 150mm 3 平均 MC38 腫瘤的小鼠體內，利用抗 PD-1 、抗 CTLA4 和靜脈內遞送溶瘤病毒 VSV-mIFNb-NIS 的組合治療的抗腫瘤功效
本實例說明了在移植有MC38腫瘤的野生型小鼠體內，使用靜脈內遞送之溶瘤病毒水泡性口炎病毒(VSV)加上抗PD-1和抗CTLA4抗體的三重組合的抗腫瘤功效。本研究中使用的VSV是一種在遺傳上減毒的病毒VSV-mIFNb-NIS (或mVV1)，它編碼被插入到M和G病毒基因之間的小鼠干擾素-β(IFNb)以及被插入到G和L病毒基因之間的鈉/碘同向運輸蛋白(NIS)。
在第0天，將來自Jackson Laboratories的C57BL/6品系背景小鼠皮下植入MC38細胞(3x10 5個細胞/小鼠)。使用卡尺測量腫瘤，並利用公式(L 2xW)/2計算腫瘤體積，其中L是最小尺寸。當平均腫瘤大小在第15天達到150 mm 3時，小鼠被平均隨機分成八個治療組。在第15、18、21和24天，小鼠接受靜脈內注射200 µl的mVV1(按照1x10 9TCID 50的劑量，重新懸浮於PBS中)或PBS(作為對照)，及/或加上腹膜內注射250 µg同型對照抗體(mIgG2a及/或大鼠IgG2a)及/或250 µg抗CTLA4抗體及/或抗PD-1抗體(表7)。每週兩次藉由卡尺測量監測腫瘤體積，直到第60天研究結束。 表 7 ：小鼠組別的實驗給藥和治療方案
組別 病毒或PBS 途徑 病毒或PBS TCID 50 Ab 1 (IP 途徑) Ab 1 給藥間隔 Ab 2 (IP 途徑) Ab 2 給藥間隔 n #
1 靜脈內 PBS - 同型大鼠IgG2a 250 µg D15、18、21、24 同型小鼠IgG2a 250 µg D15、18、21、24 7
2 靜脈內 PBS - a-PD-1 250 µg D15、18、21、24 同型小鼠IgG2a 250 µg D15、18、21、24 7
3 靜脈內 PBS - 同型大鼠IgG2a 250 µg D15、18、21、24 a-CTLA4 mIgG2a 250 µg D15、18、21、24 7
4 靜脈內 PBS - a-PD-1 250 µg D15、18、21、24 a-CTLA4 mIgG2a 250 µg D15、18、21、24 7
5 靜脈內 VSV-mIFNb-NIS 1x10 9TCID 50 同型大鼠IgG2a 250 µg D15、18、21、24 同型小鼠IgG2a 250 µg D15、18、21、24 7
6 靜脈內 VSV-mIFNb-NIS 1x10 9TCID 50 a-PD-1 250 µg D15、18、21、24 同型小鼠IgG2a 250 µg D15、18、21、24 7
7 靜脈內 VSV-mIFNb-NIS 1x10 9TCID 50 同型大鼠IgG2a 250 µg D15、18、21、24 a-CTLA4 mIgG2a 250 µg D15、18、21、24 7
8 靜脈內 VSV-mIFNb-NIS 1x10 9TCID 50 a-PD-1 250 µg D15、18、21、24 a-CTLA4 mIgG2a 250 µg D15、18、21、24 7
表8歸納了每個治療組的平均腫瘤體積、存活百分比和無腫瘤小鼠的數量。隨著時間推移，每組的腫瘤體積平均值證實，與利用PBS治療和同型對照治療組相比，利用mVV1或抗PD-1或抗CTLA4抗體的單一療法顯示出輕微的腫瘤生長抑制作用( 圖 8)。治療開始後第24天的個別腫瘤體積( 圖 9)用於統計分析，因為這是研究中所有組別中全部動物都存活的最後時間點。統計顯著性是藉由單因數ANOVA加上Dunnett多重比較後測(** p＜ 0.01，**** p＜ 0.0001)來確定。抗PD-1或抗CTLA4抗體或mVV1的單一療法並未達到統計顯著性，mVV1加上抗PD-1抗體的組合也沒有。與利用抗PD-1或抗CTLA4抗體或mVV1或對照的單一療法相比，mVV1組合抗CTLA4抗體治療導致更為有效的腫瘤生長抑制作用( 圖 10)。抗CTLA4和抗PD-1抗體的組合導致腫瘤生長減少，但與所有其他單一和雙重組合相比，在第24天並沒有導致統計學上顯著的減少。值得注意的是，與所有其他組別相比，靜脈內遞送mVV1加上抗CTLA4和抗PD-1抗體治療的三重組合非常有效，其中七隻小鼠中有兩隻小鼠維持無腫瘤狀態截至第60天研究結束( 圖 8 、 9 、 10)。由於三重組合療法，沒有觀察到體重減輕的證據。總之，與利用抗體及/或mVV1的單一療法或雙重療法相比，利用靜脈內遞送mVV1加上抗mCTLA4和抗PD-1抗體的組合治療可減少腫瘤生長並增進存活率。 表 8 ：每個治療組的平均腫瘤體積、存活百分率和無腫瘤小鼠的數量
治療組(n=5-6) 腫瘤體積，mm 3 平均值(±SD) 無腫瘤小鼠 存活率，%
第24 天 第24 天 第42 天 第29 天 第42 天 第60 天
1 PBS 1468 (±189) 0/7 0/7 100% 0% 0%
2 a-PD-1 1257 (±148) 0/7 0/7 100% 0% 0%
3 a-CTLA4 1164 (±69) 0/7 0/7 100% 0% 0%
4 a-PD-1 + a-CTLA4 875 (±148) 0/7 0/7 100% 0% 0%
5 mVV1 I.V. 1146 (±237) 0/7 0/7 100% 0% 0%
6 mVV1 I.V. + a-PD-1 1324 (±152) 0/7 0/7 100% 0% 0%
7 mVV1 I.V. + a-CTLA4 773 (±120) 0/7 0/7 100% 0% 0%
8 mVV1 I.V. + a-PD-1 + a-CTLA4 361 (±123) 0/7 2/7 100% 42.9% 28.6%
實例 5 ：抗 -PD-1 、抗 -CTLA4 和瘤內遞送溶瘤病毒 VSV-M51R-GFP 的三重組合的抗腫瘤功效可以利用較低劑量的抗 -CTLA4 mIgG2a 抗體來實現
本實例說明了低劑量的抗CTLA4抗體，其在移植有MC38腫瘤的野生型小鼠體內，使用溶瘤病毒水泡性口炎病毒(VSV)加上抗PD-1和抗CTLA4抗體的三重組合仍達到抗腫瘤功效。本研究中使用的VSV是一種在遺傳上減毒的病毒，命名為VSV-M51R-GFP，因為它在M蛋白中編碼一個突變(M51R) (M蛋白抑制宿主細胞蛋白的產生，但M51R突變保留了蛋白質產生)，並編碼被插入到G和L病毒基因之間的GFP。本研究中使用的抗PD-1抗體是Bioxcell的純系29F1.A12大鼠IgG2a，使用的抗CTLA4抗體是購自Invivogen的mIgG2a形式的純系9D9。在第0天，將來自Jackson Laboratories的C57BL/6品系背景小鼠皮下植入MC38細胞(3x10 5個細胞/小鼠)。使用卡尺測量腫瘤，並利用公式(L 2xW)/2計算腫瘤體積，其中L是最小尺寸。當平均腫瘤大小在第15天達到150 mm 3時，小鼠被平均隨機分成四個治療組。在第15、18、22和25天，小鼠被瘤內注射50 µl的VSV-M51R-GFP病毒(按照5x10 8TCID50的劑量，重新懸浮於PBS中)或PBS(作為對照)，及/或加上腹膜內注射250 µg同型對照抗體及/或抗小鼠PD-1大鼠IgG2a抗體(29F1.A12)，及/或4劑(第15、18、22和25天) 250 µg或50 µg抗小鼠CTLA4-mIgG2a(純系9D9)。每週兩次藉由卡尺測量監測腫瘤體積，直到第60天研究結束。
在接受較低劑量的抗CTLA4抗體的組別中，觀察到VSV加上抗PD-1抗體和抗CTLA4抗體的三重組合的抗腫瘤功效( 圖 11 、 12)，其中八隻小鼠中有四隻(50%)沒有腫瘤截至第45天，相較高劑量組中七隻小鼠中有五隻(71%)沒有腫瘤。截至第60天，低劑量組有50%的小鼠活了下來且無腫瘤，相較之下4劑組為71.4%( 圖 13)。這些結果表明，在VSV加上抗PD-1和抗CTLA4抗體的三重組合中投予的抗CTLA4的數量可以減少而仍然達到抗腫瘤功效。 表 9 ：每個活體內腫瘤治療組的平均腫瘤體積、存活百分率和無腫瘤小鼠的數量
治療組(n=5-6) 腫瘤體積，mm 3 平均值(±SD) 無腫瘤小鼠 存活率，%
第29 天 第29 天 第45 天 第29 天 第32 天 第60 天
1 PBS 2404 (±294) 0/7 0/7 100% 0% 0%
2 a-PD-1 + a-CTLA4 mIgG2a (高劑量) 580 (±129) 0/7 0/7 100% 100% 0%
3 VSV I.T. + a-PD-1 + a-CTLA4 mIgG2a (高劑量) 70 (±45) 3/7 5/7 100% 100% 71.4%
4 VSV I.T. + a-PD-1 + a-CTLA4 mIgG2a (低劑量) 240 (±117) 0/8 4/8 100% 100% 50%
如表9中所示，利用三重組合VSV I.Y. (瘤內)加上抗PD-1和抗CTLA4抗體治療的小鼠在控制腫瘤生長方面非常有效，其中截至第45天，七隻小鼠中有五隻小鼠沒有腫瘤。當與VSV加上抗PD-1抗體組合時，抗CTLA4劑量降低五倍(從250 µg到50 µg)顯示出令人驚訝的顯著抗腫瘤功效。 實例 6 ：在帶有 150 mm 3 平均 MC38 腫瘤的小鼠體內，利用抗 PD-1 、一劑抗 CTLA4 加上靜脈內遞送溶瘤病毒 VSV-mIFNb-NIS 的組合治療的抗腫瘤功效
本實例說明了在移植有MC38腫瘤的野生型小鼠體內，使用編碼IFNb和NIS之溶瘤病毒水泡性口炎病毒(VSV)加上抗PD-1和一劑抗CTLA4的三重組合的抗腫瘤功效。本研究中使用的VSV是一種在遺傳上減毒的病毒，命名為VSV-mIFNb-NIS(或mVV1)，因為它編碼被插入到M和G病毒基因之間的小鼠干擾素-β(IFNb)以及被插入到G和L病毒基因之間的鈉/碘同向運輸蛋白(NIS)。本研究中使用的抗PD-1抗體是Bioxcell的純系29F1.A12大鼠IgG2a，使用的抗CTLA4抗體是Invivogen的mIgG2a形式的純系9D9。
在第0天，將來自Jackson Laboratories的C57BL/6品系背景小鼠皮下植入MC38細胞(3x10 5個細胞/小鼠)。使用卡尺測量腫瘤，並利用公式(L 2xW)/2計算腫瘤體積，其中L是最小尺寸。當平均腫瘤大小在第12天達到150 mm 3時，小鼠被平均隨機分成治療組。在第12、15、19和22天，小鼠接受靜脈內注射200 µl的mVV1(按照1x10 9TCID50的劑量，重新懸浮於PBS中)或PBS(作為對照)，及/或加上腹膜內注射250 µg同型對照抗體(mIgG2a及/或大鼠IgG2a)及/或抗小鼠PD-1大鼠IgG2a抗體(29F1.A12)，及/或在第12天或第15天250 µg抗小鼠CTLA4-mIgG2a抗體(純系9D9)作為單劑，或在第12、15、19和22天四劑。每週兩次藉由卡尺測量監測腫瘤體積，直到第60天研究結束。隨著時間的推移，每組的腫瘤體積平均值顯示，當組合以mVV1和抗PD-1投予時，與用四劑抗CTLA4治療相比，一劑抗CTLA4抗體顯示出相似的腫瘤生長抑制作用( 圖 14)。治療開始後第22天的個別腫瘤體積( 圖 15)用於統計分析，因為這是研究中所有組別中全部動物都存活的最後時間點。統計顯著性是藉由單因數ANOVA加上Dunnett多重比較後測試(** p＜ 0.01，**** p＜ 0.0001)來確定。與四劑抗CTLA4抗體相比，mVV1加上一劑抗CTLA4抗體治療的組合在腫瘤生長抑制方面產生了相同的功效( 圖 14 、 15)。值得注意的是，靜脈內遞送mVV1加上一劑抗CTLA4和抗PD-1抗體治療的三重組合也使得存活率增加，類似於接受四劑CTLA4的組別( 圖 16)。總歸來說，用靜脈內遞送mVV1加上抗PD-1和一劑抗mCTLA4抗體的組合治療與投予四劑抗mCTLA4抗體的功效相似。 表 10 ：小鼠組別的實驗給藥和治療方案
組別 病毒或PBS 途徑 病毒或PBS TCID 50 Ab 1 (IP 途徑) Ab 1 給藥間隔 Ab 2 (IP 途徑) Ab 2 給藥間隔 Ab 3 (IP 途徑) Ab 3 給藥間隔 n #
1 靜脈內 PBS - 同型大鼠IgG2a 250 µg D12、15、19、22 同型小鼠IgG2a 250 µg D12、15、19、22 7
2 靜脈內 PBS - a-PD-1 250 µg D12、15、19、22 a-CTLA4 mIgG2a 250 µg D12、15、19、22 7
3 靜脈內 PBS - a-PD-1 250 µg D12、15、19、22 a-CTLA4 mIgG2a 250 µg D12 同型小鼠IgG2a 250 µg D15、19、22 7
4 靜脈內 mVV1 1x10 9TCID 50 a-PD-1 250 µg D12、15、19、22 a-CTLA4 mIgG2a 250 µg D12、15、19、22 7
5 靜脈內 mVV1 1x10 9TCID 50 a-PD-1 250 µg D12、15、19、22 a-CTLA4 mIgG2a 250 µg D12 同型小鼠IgG2a 250 µg D15、19、22 8
6 靜脈內 mVV1 1x10 9TCID 50 a-PD-1 250 µg D12、15、19、22 a-CTLA4 mIgG2a 250 µg D15 同型小鼠IgG2a 250 µg D12、19、22 8
表 11 ：每個活體內腫瘤治療組的平均腫瘤體積、存活百分率和無腫瘤小鼠的數量
治療組(n=5-6) 腫瘤體積，mm 3 平均值(±SD) 無腫瘤小鼠 存活率，%
第22 天 第29 天 第22 天 第29 天 第48 天
1 PBS 2057 (±719) 0/7 100% 0% 0%
2 a-PD-1 + a-CTLA4 D12, 15, 19, 22 566 (±216) 0/7 100% 85% 0%
a-PD-1 + a-CTLA4 D12 980 (±492) 0/7 100% 71% 0%
3 mVV1 + a-PD-1 + a-CTLA4 D12, 15, 19, 22 303 (±158) 0/7 100% 100% 57%
4 mVV1 + a-PD-1 + a-CTLA4 D12 266 (155) 2/8 100% 100% 37.5%
5 mVV1 + a-PD-1 + a-CTLA4 D15 1130 (±565) 0/8 100% 37.5% 0%
如表11中所示，在研究過程期間，利用mVV1加上抗PD-1和四劑抗CTLA4抗體的三重組合治療的小鼠在控制和清除大腫瘤方面非常有效。與四劑相比，利用三重組合mVV1加上抗PD-1和一劑抗CTLA4抗體(與病毒同時給予)治療的小鼠展現出相似的腫瘤體積減少。相反的，如果在病毒後三天給予一劑抗CTLA4抗體與抗PD-1，則三重組合的功效被消除。這個數據表明，伴隨著mVV1給予的一劑抗CTLA4和抗PD-1的連續給藥可用於實現強烈的抗腫瘤功效。 實例 7 ：在帶有 150 mm 3 平均 MC38 腫瘤的小鼠體內，與靜脈內遞送溶瘤病毒 VSV-mIFNb-NIS 伴隨投予的抗 PD-1 、一劑抗 CTLA4 的組合治療的抗腫瘤功效
本實例說明了在移植有MC38腫瘤的野生型小鼠體內，使用編碼IFNb和NIS之溶瘤病毒水泡性口炎病毒(VSV)加上抗PD-1和一劑抗CTLA4抗體的三重組合的抗腫瘤功效。本研究中使用的VSV是一種在遺傳上減毒的病毒，命名為VSV-mIFNb-NIS(或mVV1)，因為它編碼被插入到M和G病毒基因之間的小鼠干擾素-β(IFNb)以及被插入到G和L病毒基因之間的鈉/碘同向運輸蛋白(NIS)。本研究中使用的抗PD-1抗體是Bioxcell的純系29F1.A12大鼠IgG2a，而使用的抗CTLA4抗體是來自Invivogen的mIgG2a形式的純系9D9。
在第0天，將來自Jackson Laboratories的C57BL/6品系背景小鼠皮下植入MC38細胞(3x10 5個細胞/小鼠)。使用卡尺測量腫瘤，並利用公式(L 2xW)/2計算腫瘤體積，其中L是最小尺寸。當平均腫瘤大小在第12天達到150 mm 3時，小鼠被平均隨機分成四個治療組。在第12、15、19和22天，小鼠接受靜脈內注射200 µl的mVV1(按照1x10 9TCID50的劑量，重新懸浮於PBS中)或PBS(作為對照)，及/或加上腹膜內注射250 µg同型對照抗體(mIgG2a及/或大鼠IgG2a)及/或抗小鼠PD-1大鼠IgG2a抗體(29F1.A12)，及/或在第12天或第15天250 µg抗小鼠CTLA4-mIgG2a抗體(純系9D9)作為單劑。每週兩次藉由卡尺測量監測腫瘤體積，直到第60天研究結束。隨著時間的推移，每組的腫瘤體積平均值證明，一劑抗CTLA4抗體需要與病毒伴隨投予，因為在第15天接受a-CTLA4的組別與在第12天接受的組別相比的抗腫瘤控制降低( 圖 17)。
總歸來說，用靜脈內遞送mVV1加上抗PD-1和一劑抗mCTLA4抗體(與病毒伴隨投予)的組合治療會導致強烈的抗腫瘤功效。 實例 8 ：在帶有 100 mm 3 平均 B16F10 腫瘤的小鼠體內，抗 PD-1 、一劑抗 CTLA4 加上靜脈內遞送溶瘤病毒 VSV-mIFNb-NIS 的組合治療的抗腫瘤功效
本實例說明了在移植有B16F10腫瘤的野生型小鼠體內，使用編碼IFNb和NIS之溶瘤病毒水泡性口炎病毒(VSV)加上抗PD-1和一劑抗CTLA4的三重組合的抗腫瘤功效。本研究中使用的VSV是一種在遺傳上減毒的病毒，命名為VSV-mIFNb-NIS(或mVV1)，因為它編碼被插入到M和G病毒基因之間的小鼠干擾素-β(IFNb)以及被插入到G和L病毒基因之間的鈉/碘同向運輸蛋白(NIS)。本研究中使用的抗PD-1抗體是Bioxcell的純系29F1.A12大鼠IgG2a，而使用的抗CTLA4抗體是Invivogen的mIgG2a形式的純系9D9。
在第0天，將來自Jackson Laboratories的C57BL/6品系背景小鼠皮下植入B16F10細胞(5x10 5個細胞/小鼠)。使用卡尺測量腫瘤，並利用公式(L 2xW)/2計算腫瘤體積，其中L是最小尺寸。當平均腫瘤大小在第10天達到100 mm 3時，小鼠被平均隨機分成七個治療組。在第12、15、19與22天，小鼠接受靜脈內注射200 µl的mVV1(按照1x10 9或5x10 7或1x10 7或1x10 6TCID50的劑量，重新懸浮於PBS中)或PBS(作為對照)，及/或加上腹膜內注射250 µg同型對照抗體(mIgG2a及/或大鼠IgG2a)及/或抗小鼠PD-1大鼠IgG2a抗體(29F1.A12)，及/或在第10天250 µg抗小鼠CTLA4-mIgG2a抗體(純系9D9)作為單劑。每週兩次藉由卡尺測量監測腫瘤體積，直到第60天研究結束。隨著時間的推移，每組的腫瘤體積平均值證明，與PBS或單一藥劑相比，一劑抗CTLA4抗體在B16F10模型中顯示出強烈的腫瘤生長抑制作用( 圖 18)。值得注意的是，當病毒劑量從1x10 9降至5x10 7或1x10 7或1x10 6TCID50時，靜脈內遞送mVV1加上一劑抗CTLA4和抗PD-1抗體治療的三重組合也導致存活率增加而功效相似( 圖 18)。
總歸來說，靜脈內遞送mVV1加上抗PD-1和一劑抗mCTLA4抗體的組合治療在B16F10抗PD-1抗性腫瘤模型中產生了強烈的抗腫瘤功效，並且大範圍的病毒效價仍能達到強烈組合功效。 表 12 ：小鼠組別的實驗給藥和治療方案
組別 病毒或PBS 途 徑 病毒或PBS TCID 50 Ab 1 (IP 途徑 ) Ab 1 給藥間隔 Ab 2 (IP 途徑 ) Ab 2 給藥間隔 n #
1 靜脈內 PBS - 同型大鼠IgG2a 250 µg D10、14、17、21 同型小鼠IgG2a 250 µg D10 5
2 靜脈內 PBS - a-PD-1 250 µg D10、14、17、21、24、28 a-CTLA4 mIgG2a 250 µg D10 6
3 靜脈內 mVV1 1x10 9TCID 50 同型大鼠IgG2a 250 µg D10、14、17、21 同型小鼠IgG2a 250 µg D10 6
4 靜脈內 mVV1 1x10 9TCID 50 a-PD-1 250 µg D10、14、17、21、24、28 a-CTLA4 mIgG2a 250 µg D10 7
5 靜脈內 mVV1 5x10 7TCID 50 a-PD-1 250 µg D10、14、17、21、24、28 a-CTLA4 mIgG2a 250 µg D10 7
6 靜脈內 mVV1 1x10 7TCID 50 a-PD-1 250 µg D10、14、17、21、24、28 a-CTLA4 mIgG2a 250 µg D10 6
7 靜脈內 mVV1 1x10 6TCID 50 a-PD-1 250 µg D10、14、17、21、24、28 a-CTLA4 mIgG2a 250 µg D10 7
表 13 ：使用 B16F10 黑色素瘤腫瘤模型，每個活體內腫瘤治療組的平均腫瘤體積、存活百分率和無腫瘤小鼠的數量
治療組(n=5-6) 腫瘤體積，mm 3 平均值(±SD) 存活率，%
第17 天 第17 天 第24 天 第28 天
1 PBS 774 (±143) 100% 80% 0%
2 mVV1 1e9 TCID50 758 (±259) 100% 66% 0%
3 a-PD-1 + a-CTLA4 592 (±249) 100% 66% 16.6%
4 mVV1 1e9 TCID50 + a-PD-1 + a-CTLA4 200 (±142) 100% 100% 71%
5 mVV1 5e7 TCID50 + a-PD-1 + a-CTLA4 203 (±65) 100% 100% 100%
6 mVV1 1e7 TCID50 + a-PD-1 + a-CTLA4 277 (±66) 100% 100% 100%
7 mVV1 1e6 TCID50 + a-PD-1 + a-CTLA4 356 (±138) 100% 100% 85%
如表13中所示，使用B16F10皮下腫瘤模型，用mVV1或抗PD-1組合以一劑抗CTLA4抗體治療的小鼠在這種高標準(high bar)免疫檢查點抗性腫瘤模型中對腫瘤生長具有非常溫和的效用。然而，與其他組別相比，三重組合mVV1加上抗PD-1組合以一劑抗CTLA4抗體顯著增加了抗腫瘤功效。數據表明，VSV可使檢查點抗性腫瘤對免疫療法敏感。 實例 9 ：在帶有 150mm 3 平均 CMT64 肺腫瘤的小鼠體內，利用抗 PD-1 、一劑抗 CTLA4 加上靜脈內遞送溶瘤病毒 VSV-mIFNb-NIS 的組合治療的抗腫瘤功效
本實例說明了在移植有CMT64腫瘤的野生型小鼠體內，使用編碼IFNb和NIS之溶瘤病毒水泡性口炎病毒(VSV)加上抗PD-1和一劑抗CTLA4的三重組合的抗腫瘤功效，CMT64腫瘤對抗PD-1治療有抗性。本研究中使用的VSV是一種在遺傳上減毒的病毒，命名為VSV-mIFNb-NIS(或mVV1)，因為它編碼被插入到M和G病毒基因之間的小鼠干擾素-β(IFNb)以及被插入到G和L病毒基因之間的鈉/碘同向運輸蛋白(NIS)。本研究中使用的抗PD-1抗體是Bioxcell的純系29F1.A12大鼠IgG2a，而使用的抗CTLA4抗體是Invivogen的mIgG2a形式的純系9D9。
在第0天，將來自Jackson Laboratories的C57BL/6品系背景小鼠皮下植入B16F10細胞(5x10 5個細胞/小鼠)。使用卡尺測量腫瘤，並利用公式(L 2xW)/2計算腫瘤體積，其中L是最小尺寸。當平均腫瘤大小在第10天達到100 mm 3時，小鼠被平均隨機分成四個治療組。在第12、15、19和22天，小鼠接受靜脈內注射200 µl的mVV1(按照1x10 9TCID50的劑量，重新懸浮於PBS中)或PBS(作為對照)，及/或加上腹膜內注射250 µg同型對照抗體(mIgG2a及/或大鼠IgG2a)及/或抗小鼠PD-1大鼠IgG2a抗體(29F1.A12)，及/或在第10天50 µg抗小鼠CTLA4-mIgG2a抗體(純系9D9)作為單劑。每週兩次藉由卡尺測量監測腫瘤體積，直到第60天研究結束。隨著時間的推移，每組的腫瘤體積平均值證實，與PBS或抗PD-1加上抗CTLA4相比，一劑抗CTLA4抗體在CMT64腫瘤模型中顯示出強烈的腫瘤生長抑制作用( 圖 19)。 圖 20顯示了在第12天接受VSV以及在第12天與第14天接受兩劑抗PD-1和a-CTLA4後，每個治療組在第17天從腫瘤收取的CD8 TIL釋放的IFNg，並在再次暴露於指定的腫瘤抗原或VSV-NP過夜的平均空斑形成單位(SFU)。DMSO和PMA/離子黴素分別用作為多個腫瘤植入後時間點的陰性和陽性對照，治療天數由箭頭表示。
總歸來說，利用靜脈內遞送mVV1加上抗PD-1和一劑抗mCTLA4抗體的組合治療在CMT64抗PD-1抗性腫瘤模型中產生了出乎意料的強烈抗腫瘤功效，表明這種三重組合功效可應用於各種腫瘤環境。 表 14 ：小鼠組別的實驗給藥和治療方案
組別 病毒或PBS 途徑 病毒或PBS TCID 50 Ab 1 (IP 途徑) Ab 1 給藥間隔 Ab 2 (IP 途徑) Ab 2 給藥間隔 n #
1 靜脈內 PBS - 同型大鼠IgG2a 250 µg D9、12、16、20、24、27、31 同型小鼠IgG2a 50 µg D9 8
2 靜脈內 VSV-mIFNb-NIS 1x10 9TCID 50 同型大鼠IgG2a 250 µg D10、14、17、21、24、28 同型小鼠IgG2a 50 µg D9 8
3 靜脈內 PBS - a-PD-1 250 µg D10、14、17、21、24、28 a-CTLA4 mIgG2a 50 µg D9 8
4 靜脈內 VSV-mIFNb-NIS 1x10 9TCID 50 a-PD-1 250 µg D10、14、17、21、24、28 a-CTLA4 mIgG2a 50 µg D9 8
表 15 ：每個活體內腫瘤治療組的平均腫瘤體積、存活百分比和無腫瘤小鼠的數量，著重在CMT64肺腺癌模型中測試靜脈mVV1加上抗CTLA4 + 抗PD-1抗體的三重組合。
治療組(n=8) 腫瘤體積，mm 3 平均值(±SD) 存活率，%
第31 天 第31 天 第41 天 第59 天
1 PBS 1516 (±280) 100% 0% 0%
2 mVV1 1514 (±193) 100% 0% 0%
5 a-PD-1 + a-CTLA4 1355 (±568) 100% 37.5% 12.5%
10 mVV1 + a-PD-1 + a-CTLA4 814 (±381) 100% 75% 12.5%
如表15中所示，利用三重組合靜脈內mVV1加上抗PD-1與一劑抗CTLA4抗體治療的小鼠在控制CMT64腫瘤生長方面非常有效。 實例 10 ：在帶有 150 mm 3 平均 CMT64 肺腫瘤的小鼠體內，抗 PD-1 、抗 CTLA4 加上靜脈內遞送溶瘤病毒 VSV-mIFNb-NIS 的組合治療引起廣泛的多株抗腫瘤 T 細胞反應
本實例說明了在移植有CMT64腫瘤的野生型小鼠體內，使用編碼IFNb和NIS之溶瘤病毒水泡性口炎病毒(VSV)加上抗PD-1和一劑抗CTLA4的三重組合的作用機制，CMT64腫瘤對抗PD-1治療有抗性。本研究中使用的VSV是一種在遺傳上減毒的病毒VSV-mIFNb-NIS(或mVV1)，因為它編碼被插入到M和G病毒基因之間的小鼠干擾素-β(IFNb)以及被插入到G和L病毒基因之間的鈉/碘同向運輸蛋白(NIS)。本研究中使用的抗PD-1抗體是Bioxcell的純系29F1.A12大鼠IgG2a，而使用的抗CTLA4抗體是Invivogen的mIgG2a形式的純系9D9。
在第0天，將來自Jackson Laboratories的C57BL/6品系背景小鼠皮下植入CMT64細胞(5x10 5個細胞/小鼠)。使用卡尺測量腫瘤，並利用公式(L 2xW)/2計算腫瘤體積，其中L是最小尺寸。當平均腫瘤大小在第10天達到100 mm 3時，小鼠被平均隨機分成七個治療組。在第10天和第14天，小鼠接受靜脈內注射200 µl的mVV1(按照1x10 9TCID50的劑量，重新懸浮於PBS中)或PBS(作為對照)，及/或加上腹膜內注射250 µg同型對照抗體(mIgG2a及/或大鼠IgG2a)及/或抗小鼠PD-1大鼠IgG2a抗體(29F1.A12)及/或10 µg抗小鼠CTLA4-mIgG2a抗體(純系9D9)。在第17天收取腫瘤。經純化的CD8 TIL和初始脾細胞以1：1比例藉由每孔鋪盤10,000個細胞進行共培育並與相應肽抗原培育過夜以用於IFNg ELISPOT分析。在接受VSV的組別中，偵測到CD8 TIL的大量反應性對VSV-NP抗原具有特異性。值得注意的是，許多腫瘤新抗原在從接受VSV的組別收集而來的再次暴露之CD8 TIL中誘導信號，且在經單獨抗PD-1和抗CTLA4治療的組別中偵測到非常有限的反應。與其他組別相比，三重組合VSV加上a-PD-1和a-CTLA4誘導了大規模多株抗腫瘤T細胞反應，其中一些新抗原反應性僅在三重組合中被偵測到，諸如NAIP2和ZHX2。
這個數據表明，三重組合功效是受到多株抗腫瘤T細胞的生成所驅動，這些細胞在腫瘤內具有功能並誘導抗腫瘤T細胞反應。 表 16 ：小鼠組別的實驗給藥和治療方案
組別 病毒或PBS 途徑 病毒或PBS TCID 50 Ab 1 (IP 途徑) Ab 1 給藥間隔 Ab 2 (IP 途徑) Ab 2 給藥間隔 n#
1 靜脈內 PBS - 同型大鼠IgG2a 250 µg D10、14 同型小鼠IgG2a 10 µg D10、14 8
2 靜脈內 VSV-mIFNb-NIS 1x10 9TCID 50 同型大鼠IgG2a 250 µg D10、14 同型小鼠IgG2a 10 µg D10、14 8
3 靜脈內 PBS - a-PD-1 250 µg D10、14 a-CTLA4 mIgG2a 10 µg D10、14 8
4 靜脈內 VSV-mIFNb-NIS 1x10 9TCID 50 a-PD-1 250 µg D10、14 a-CTLA4 mIgG2a 10 µg D10、14 8
表 17 ：從治療後7天的小鼠所收取的CMT64腫瘤分離的TIL生成的IFNg Elispot數據(10,000個TIL：10,000個脾細胞)
同型 a-PD-1/a-CTLA4 mVV1 mVV1/a-PD-1/a-CTLA4
Elispot抗原 平均值 ±SD 平均值 ±SD 平均值 ±SD 平均值 ±SD
DMSO 0.0 0.0 0.0 0.0 4.0 1.7 0.0 0.0
AIM1 0.0 0.0 0.0 0.0 4.3 3.5 8.0 1.7
LYST 0.0 0.0 0.0 0.0 8.3 1.5 13.7 4.5
RPP40 0.0 0.0 0.0 0.0 8.0 6.1 19.3 4.6
NAIP2 0.0 0.0 0.0 0.0 0.7 1.2 22.3 4.9
ZHX2 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 21.3 3.2
CEP192 0.0 0.0 0.0 0.0 1.0 1.0 12.7 5.5
NDUFS1 0.7 0.6 3.7 1.5 6.7 2.5 30.0 3.5
ARHGEF11 0.0 0.0 0.0 0.0 0.7 1.2 0.7 0.6
NES 0.0 0.0 0.0 0.0 4.7 2.9 9.7 3.1
RAB13 0.0 0.0 0.0 0.0 11.3 2.1 18.7 9.6
AKAP9 0.0 0.0 0.0 0.0 9.3 4.9 14.0 2.0
ARHGEF10 0.0 0.0 0.0 0.0 10.0 5.2 14.7 3.2
ARHGEF10 (2) 0.0 0.0 0.0 0.0 10.3 5.1 12.3 1.5
VSV-NP 0.0 0.0 0.3 0.6 22.3 5.7 30.3 1.5
PMA/離子黴素 1.0 1.0 13.3 9.2 93.0 15.7 135.0 17.3
本發明的範疇不受本文所述特定實施例所囿限。實際上，根據前面的說明和附圖，除了本文描述的那些以外，本發明的各種修改對於本技術領域具有通常知識者來說將變得很清楚。此類修改意欲落入隨附申請專利範圍的範疇內。
無
圖 1是顯示如實例1中所述在帶有150mm 3平均MC38腫瘤的小鼠體內，利用抗PD-1、抗CTLA4和瘤內遞送溶瘤病毒VSV-M51R-Fluc的組合治療的抗腫瘤功效的圖。如實例1中所述，顯示了各治療組在多個腫瘤植入後時間點的平均腫瘤體積(mm 3+/- SEM)，治療天數由箭頭指示。
圖 2是顯示實例1中所述各治療組在治療開始後第11天(腫瘤植入後第26天)的個別腫瘤體積的圖。
圖 3是顯示實例1中所述各治療組的Kaplan-Meier存活曲線的圖。
圖 4A、 4B、 4C、 4D和 4E是一組圖，顯示了如實例2中所述，在僅只一劑抗CTLA4 mIgG2a抗體的情況下，就可達報三重組合抗PD-1、抗CTLA4和瘤內遞送溶瘤病毒VSV-M51R-GFP的抗腫瘤功效，。 圖 4A顯示了PBS治療組在多個腫瘤植入後時間點的平均腫瘤體積。 圖 4B顯示了PBS、抗PD-1抗體和抗CTLA4抗體(4劑)治療組在多個腫瘤植入後時間點的平均腫瘤體積。 圖 4C顯示了VSV、抗PD-1抗體和抗CTLA4抗體(1劑)治療組在多個腫瘤植入後時間點的平均腫瘤體積。 圖 4D顯示了VSV、抗PD-1抗體和抗CTLA4抗體(2劑)治療組在多個腫瘤植入後時間點的平均腫瘤體積。 圖 4E顯示了VSV IT、抗PD-1抗體和抗CTLA4抗體(4劑)治療組在多個腫瘤植入後時間點的平均腫瘤體積。治療天數用箭頭表示。TF：無腫瘤。
圖 5是顯示實例2中所述各治療組的Kaplan-Meier存活曲線的圖。
圖 6是顯示如實例3中所述三重組合抗PD-1、抗CTLA4和溶瘤病毒VSV-M51R-GFP的抗腫瘤功效可以利用瘤內或靜脈內遞送病毒來實現的圖。顯示了各治療組在多個腫瘤植入後時間點的平均腫瘤體積(mm 3+/- SEM)。如表5和實例3中所述投予治療。
圖 7是顯示實例3中所述各治療組的Kaplan-Meier存活曲線的圖。
圖 8是顯示如實例4中所述的在帶有150mm 3平均MC38腫瘤的小鼠體內，利用抗PD-1、抗CTLA4和靜脈內遞送溶瘤病毒VSV-mIFNb-NIS的組合治療的抗腫瘤功效。顯示了各治療組在多個腫瘤植入後時間點的平均腫瘤體積(mm 3+/- SEM)。如表7和實例4中所述投予治療。
圖 9是顯示實例4中所述各治療組在治療開始後第10天的個別腫瘤體積的圖。統計顯著性是藉由單因數ANOVA加上Dunnett多重比較後檢測來確定(** p＜0.01，**** p ＜ 0.0001)。
圖 10是顯示實例4中所述各治療組的Kaplan-Meier存活曲線的圖。
圖 11是顯示實例5中所述各治療組在多個腫瘤植入後時間點的平均腫瘤體積(mm 3+/- SEM)的圖，治療天數由箭頭指示。
圖 12是顯示實例5中所述各治療組在治療開始後第29天的個別腫瘤體積的圖。
圖 13是顯示實例5中所述各治療組的Kaplan-Meier存活曲線的圖。
圖 14是顯示實例6中所述各治療組在多個腫瘤植入後時間點的平均腫瘤體積(mm 3+/- SEM)的圖，治療天數由箭頭指示。
圖 15是顯示實例6中所述各治療組在腫瘤植入後第22天(治療開始後10天)的個別腫瘤體積的圖。
圖 16是顯示實例6中所述各治療組的Kaplan-Meier存活曲線的圖。
圖 17是顯示實例7中所述各治療組在多個腫瘤植入後時間點的平均腫瘤體積(mm 3+/- SEM)的圖，治療天數由箭頭示。
圖 18是顯示實例8中所述各治療組在多個腫瘤植入後時間點的平均腫瘤體積(mm 3+/- SEM)的圖，治療天數由箭頭指示。
圖 19是顯示實例9中所述各治療組在多個腫瘤植入後時間點的平均腫瘤體積(mm 3+/- SEM)的圖。
圖 20是顯示實例10中所述在第12天接受VSV以及在第12天與第14天接受兩劑抗PD-1和a-CTLA4後，各治療組在第17天從腫瘤收取的CD8 TIL釋放的IFNg，並在再次暴露於指定的腫瘤抗原或VSV-NP過夜的平均空斑形成單位(SFU)。DMSO和PMA/離子黴素分別用作為多個腫瘤植入後時間點的陰性和陽性對照，治療天數用箭頭表示。
無
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Claims (48)

  1. 一種治療或抑制腫瘤生長的方法，包含： (a)挑選患有癌症的患者；以及 (b)向有需要的患者投予：(i)治療有效量的溶瘤病毒組合以(ii)治療有效量的計畫性死亡1(PD-1)路徑抑制劑，和(iii)治療有效量的細胞毒性T淋巴細胞抗原4(CTLA4)抑制劑。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該溶瘤病毒包含溶瘤水泡病毒(vesiculovirus)。
  3. 如請求項1或2所述之方法，其中該溶瘤水泡病毒包含溶瘤水泡性口炎病毒(VSV)。
  4. 如請求項3所述之方法，其中該VSV包含重組VSV。
  5. 如請求項4所述之方法，其中該重組VSV包含M51R取代。
  6. 如請求項3至5中任一項所述之方法，其中該重組VSV表現細胞激素。
  7. 如請求項6所述之方法，其中該細胞激素包含干擾素-β(IFNb)。
  8. 如請求項7所述之方法，其中編碼IFNb的核酸序列位於M和G病毒基因之間。
  9. 如請求項4至8中任一項所述之方法，其中該重組VSV進一步表現鈉/碘同向運輸蛋白(NIS)。
  10. 如請求項9所述之方法，其中編碼NIS的核酸序列位於G和L病毒基因之間。
  11. 如請求項1至10中任一項所述之方法，其中該溶瘤病毒是Voyager V1。
  12. 如請求項1至11中任一項所述之方法，其中該溶瘤病毒、該PD-1路徑抑制劑和該CTLA4抑制劑係同時被投予給該患者。
  13. 如請求項1至11中任一項所述之方法，其中一或多劑溶瘤病毒組合以一或多劑PD-1路徑抑制劑和一或多劑CTLA4抑制劑被依序投予。
  14. 如請求項13所述之方法，其中一或多劑CTLA4抑制劑包含單劑CTLA4抑制劑，且其中投予單劑CTLA4抑制劑的抗腫瘤功效與包含兩劑或更多劑CTLA4抑制劑的組合療法相當。
  15. 如請求項14所述之方法，其中該抗腫瘤功效的特徵為每個治療組的平均(mean)或平均(average)腫瘤體積、存活百分率、無腫瘤患者數量或其組合的減少。
  16. 如請求項1至15中任一項所述之方法，其中該溶瘤病毒以一或多劑的10 4-10 14TCID 50、10 4-10 12TCID 50、10 6-10 12TCID 50、10 8-10 14TCID 50、10 8-10 12TCID 50或10 10-10 12TCID 50被投予給患者。
  17. 如請求項1至16中任一項所述之方法，其中該PD-1路徑抑制劑以一或多劑的約0.1 mg/kg至約20 mg/kg患者體重被投予給該患者。
  18. 如請求項1至17中任一項所述之方法，其中該PD-1路徑抑制劑以一或多劑的約1 mg至約1000 mg被投予給該患者。
  19. 如請求項1至18中任一項所述之方法，其中該CTLA4抑制劑以一或多劑的約0.1 mg/kg至約15 mg/kg患者體重被投予給該患者。
  20. 如請求項1至19中任一項所述之方法，其中該CTLA4抑制劑以單劑的約0.1 mg/kg至約15 mg/kg患者體重被投予給該患者。
  21. 如請求項1至20中任一項所述之方法，其中該CTLA4抑制劑以一或多劑的約1 mg至約600 mg被投予給該患者。
  22. 如請求項1至21中任一項所述之方法，其中將該溶瘤病毒透過瘤內或靜脈內投予給該患者。
  23. 如請求項1至22中任一項所述之方法，其中將該PD-1路徑抑制劑和CTLA4抑制劑透過靜脈內、皮下或腹膜內投予給該患者。
  24. 如請求項1至23中任一項所述之方法，其中該癌症是選自腎上腺腫瘤、膽管癌、膀胱癌、腦癌、乳癌、癌(carcinoma)、中樞或周邊神經系統組織癌、子宮頸癌、結腸癌、內分泌或神經內分泌癌或造血癌、食道癌、纖維瘤、胃腸癌、神經膠質瘤、頭頸癌、李-佛美尼腫瘤(Li-Fraumeni tumor)、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、腦膜瘤、第I型與第II型多發性神經內分泌腫瘤、鼻咽癌、口腔癌、口咽癌、骨原性肉瘤腫瘤、卵巢癌、胰臟癌、胰島細胞癌、副甲狀腺癌、嗜鉻細胞瘤、垂體瘤、前列腺癌、直腸癌、腎癌、呼吸道癌、肉瘤、皮膚癌、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌、氣管癌、泌尿生殖器癌和子宮癌。
  25. 如請求項1至24中任一項所述之方法，其中該癌症對用至少一種抗PD-1藥劑或療法的治療具有抗性。
  26. 如請求項1至25中任一項所述之方法，其中該PD-1路徑抑制劑包含抗PD-1抗體或其抗原結合片段、抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，或抗PD-L2抗體或其抗原結合片段。
  27. 如請求項26所述之方法，其中該抗PD-1抗體是選自西米普利單抗(cemiplimab)、納武單抗(nivolumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、匹地利珠單抗(pidilizumab)、MEDI0608、BI 754091、PF-06801591、斯巴達珠單抗(spartalizumab)、卡瑞利珠單抗(camrelizumab)、JNJ-63723283和MCLA-134。
  28. 如請求項26至27中任一項所述之方法，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含有包含胺基酸序列SEQ ID NO：1之重鏈可變區(HCVR)的重鏈互補決定區(HCDR)，以及包含胺基酸序列SEQ ID NO：2之輕鏈可變區(LCVR)的輕鏈互補決定區(LCDR)。
  29. 如請求項26至28中任一項所述之方法，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含有包含對應胺基酸序列SEQ ID NO：3、4和5的三個重鏈互補決定區(HCDR) (HCDR1、HCDR2和HCDR3)；以及包含對應胺基酸序列SEQ ID NO：6、7和8的三個輕鏈CDR (LCDR1、LCDR2和LCDR3)。
  30. 如請求項26至29中任一項所述之方法，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含有包含胺基酸序列SEQ ID NO：1的重鏈可變區(HCVR)；以及包含胺基酸序列SEQ ID NO：2的輕鏈可變區(LCVR)。
  31. 如請求項26至30中任一項所述之方法，其中該抗PD-1抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：9和10的重鏈和輕鏈序列對。
  32. 如請求項26所述之方法，其中該抗PD-L1抗體是選自REGN3504、阿維魯單抗(avelumab)、阿特利珠單抗(atezolizumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)、MDX-1105、LY3300054、FAZ053、STI-1014、CX-072、KN035和CK-301。
  33. 如請求項26所述之方法，其中該抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包含有包含胺基酸序列SEQ ID NO：11的重鏈可變區(HCVR)；以及包含胺基酸序列SEQ ID NO：12的輕鏈可變區(LCVR)。
  34. 如請求項26至33中任一項所述之方法，其中該抗PD-L1抗體包含REGN3504。
  35. 如請求項1至34中任一項所述之方法，其中該CTLA4抑制劑包含抗CTLA4抗體或其抗原結合片段。
  36. 如請求項35所述之方法，其中該抗-CTLA4抗體是選自伊匹單抗(ipilimumab)、曲美木單抗(tremelimumab)和REGN4659。
  37. 如請求項35或36所述之方法，其中該抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含有包含胺基酸序列SEQ ID NO：13之重鏈可變區(HCVR)的重鏈互補決定區(HCDR)；以及包含胺基酸序列SEQ ID NO：14之輕鏈可變區(LCVR)的輕鏈互補決定區(LCDR)。
  38. 如請求項35至37中任一項所述之方法，其中該抗-CTLA4抗體或其抗原結合片段包含有包含對應胺基酸序列SEQ ID NO：15、16和17的三個重鏈互補決定區(HCDR) (HCDR1、HCDR2和HCDR3)；以及包含對應胺基酸序列SEQ ID NO：18、19和20的三個輕鏈CDR (LCDR1、LCDR2和LCDR3)。
  39. 如請求項35至38中任一項所述之方法，其中該抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含有包含胺基酸序列SEQ ID NO：13的重鏈可變區(HCVR)；以及包含胺基酸序列SEQ ID NO：14的輕鏈可變區(LCVR)。
  40. 如請求項35至39中任一項所述之方法，其中該抗CTLA4抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：21和22的重鏈和輕鏈序列對。
  41. 如請求項1至40中任一項所述之方法，其中該治療產生選自以下一或多項的治療效果：延遲腫瘤生長、減少腫瘤細胞數量、腫瘤消退、增加存活、部分反應以及完全反應。
  42. 如請求項1至41中任一項所述之方法，其中與未受治療的患者相比，腫瘤生長被抑制至少50%。
  43. 如請求項1至42中任一項所述之方法，其中與被投予該溶瘤病毒、該PD-1路徑抑制劑或該CTLA4抑制劑作為單一療法的患者相比，腫瘤生長被抑制至少50%。
  44. 如請求項1至43中任一項所述之方法，其中與被投予該溶瘤病毒、該PD-1路徑抑制劑和該CTLA4抑制劑中任兩者的患者相比，腫瘤生長被抑制至少50%。
  45. 如請求項1至44中任一項所述之方法，其進一步包含向該患者投予額外治療劑或療法。
  46. 如請求項45所述之方法，其中該額外治療劑或療法是選自：放射線、手術、化療劑、癌症疫苗、B7-H3抑制劑、B7-H4抑制劑、淋巴細胞活化基因3(LAG3)抑制劑、T細胞免疫球蛋白與黏蛋白結構域-3(TIM3)抑制劑、半乳糖凝集素9(GAL9)抑制劑、T細胞活化的V結構域免疫球蛋白(Ig)抑制因子(VISTA)抑制劑、殺手細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)抑制劑、B-淋巴細胞和T-淋巴細胞弱化子(BTLA)抑制劑、具有Ig和ITIM結構域的T細胞免疫受體(TIGIT)抑制劑、CD47抑制劑、吲哚胺-2,3-雙加氧酶(IDO)抑制劑、血管內皮生長因子(VEGF)拮抗劑、血管生成素-2(Ang2)抑制劑、轉形生長因子β(TGFβ)抑制劑、表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑，針對腫瘤特異性抗原的抗體、卡介苗、顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、細胞毒素、介白素6受體(IL-6R)抑制劑、介白素4受體(IL-4R)抑制劑、IL-10抑制劑、IL-2、IL-7、IL-12，IL-21、IL-15、抗體藥物結合物、消炎藥，及其組合。
  47. 一種溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑和CTLA4抑制劑的組合，其用於治療或抑制腫瘤生長的方法，該方法包含： (a)挑選患有癌症的患者；以及 (b)向有需要的患者投予：(i)治療有效量的溶瘤病毒組合以(ii)治療有效量的PD-1路徑抑制劑，和(iii)治療有效量的CTLA抑制劑。
  48. 一種套組，其包括溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑和CTLA4抑制劑，組合以使用治療有效量的溶瘤病毒、PD-1路徑抑制劑以及CTLA4抑制劑之組合用於治療或抑制患者腫瘤生長的書面說明書。
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