TW202317164A

TW202317164A - 接骨木莓磁場發酵物之製備方法及其用於製備促進硬骨生成、增強免疫力或抗氧化的組合物之用途

Info

Publication number: TW202317164A
Application number: TW110138451A
Authority: TW
Inventors: 林詠翔; 吳佩宜
Original assignee: 大江生醫股份有限公司
Priority date: 2021-10-15
Filing date: 2021-10-15
Publication date: 2023-05-01
Also published as: TWI797780B; US20230118626A1; EP4166154A1

Abstract

本發明提供一種接骨木莓磁場發酵物之製備方法及其用於製備促進硬骨分化、增強免疫力或抗氧化的組合物之用途，其中該製備方法為提供一培養液，該培養液包括由該接骨木莓與水的重量比為1~3:5~29所形成的一接骨木莓溶液及該接骨木莓溶液總重的10重量%之葡萄糖；將該培養液及複數菌種在一磁場內進行發酵4~15.5日以得到一發酵原液，其中該複數菌種包括0.01~0.5重量%的酵母菌、0.01~0.25重量%的乳酸菌及3~10重量%的醋酸菌；以及調整該發酵原液的糖度以形成該接骨木莓磁場發酵物。

Description

接骨木莓磁場發酵物之製備方法及其用於製備促進硬骨分化、增強免疫力或抗氧化的組合物之用途

本案係關於一種接骨木莓（ Sambucus nigra）發酵物的用途，特別是關於接骨木莓發酵物用於製備促進硬骨分化、增強免疫力或抗氧化的組合物之用途。

現代人們因為各種因素而經常熬夜，或是睡眠不足，導致身體無法及時休息調養，降低免疫系統的效率，使免疫力下降，身體無法對抗外來的病菌，容易感冒、過敏、感染等。此外，體內自由基無法及時消除，因而累積過量自由基，容易造成身體發炎及提早老化。

隨著年紀增長，造骨細胞功能衰退，使得骨質流失的速度大於再生，導致骨頭脆弱而容易發生骨折。另外，女性停經後體內雌性激素大幅減少，加速骨質疏鬆及骨密度下降，增加骨折的風險。長期市售鈣片為碳酸鈣與檸檬酸鈣，雖然鈣含量高，人體吸收率卻只有25%~35%。進入血液後，部分鈣質又與蛋白質螯合而無法進入骨頭，失去應有的護骨功效。

為了解決上述問題，本領域的技術人員亟需研發出解決上述問題的機能性食品，以造福有此需求的廣大族群。

有鑑於此，本發明提供一種接骨木莓（Sambucus nigra）發酵物的製備方法及此製備方法所製得的接骨木莓發酵物，並提供該接骨木莓發酵物用於製備促進硬骨分化、增強免疫力或抗氧化的組合物之用途。

在一實施例中，一種接骨木莓發酵物的製備方法，包括：

提供一培養液，該培養液包括由該接骨木莓與水的重量比為1~3:5~29所形成的一接骨木莓溶液及該接骨木莓溶液總重的10重量%之葡萄糖；

在一實施例中，將該培養液及複數菌種在一磁場內進行發酵4~15.5日以得到一發酵原液，其中該複數菌種包括0.01~0.5重量%的酵母菌、0.01~0.25重量%的乳酸菌及3~10重量%的醋酸菌；以及

調整該發酵原液的糖度以形成該接骨木莓發酵物。

在一實施例中，該將該培養液及該些菌種在該磁場內進行發酵的步驟包括：

將該酵母菌在該磁場內進行發酵1~2.5日後形成一第一初發酵液；

添加該乳酸菌於該第一初發酵液內並於該磁場內發酵1~3日後形成一第二初發酵液；

添加該醋酸菌於該第二初發酵液內並於該磁場內發酵3~10日後形成該初發酵液；以及

過濾該初發酵液以得到該發酵原液。

在一實施例中，該磁場的磁通量密度為120~300毫特斯拉。

在一實施例中，該接骨木莓發酵液中的總多酚含量為1134.6 μg/ml。

在一實施例中，該酵母菌為Saccharomyces cerevisiae，其寄存編號為BCRC20271，該乳酸菌為Lactobacillus plantarum，其寄存編號為BCRC910805，該醋酸菌為Acetobacter aceti，其寄存編號為BCRC11688。

本發明還提供了一種接骨木莓發酵液用於製備促進硬骨分化、增強免疫力或抗氧化的組合物的用途。

在一實施例中，該接骨木莓發酵液增加血液中的骨鈣素(Osteocalcin)及/或第一型前膠原蛋白氮端前胜鏈(P1NP)的濃度。

在一實施例中，該接骨木莓發酵液增加白细胞介素18及/或白血球吞噬能力。

在一實施例中，該接骨木莓發酵液增加血液中的紅血球中的榖胱甘肽S轉移酶(GST-RBC)、含硫化合物(f-Thiols)、丙二醛(MDA)或其組合的濃度。

在一實施例中，該接骨木莓發酵液中的接骨木莓與水的重量比為1~3:5~29，並且通過複數菌種在一磁場內進行發酵4~15.5日，該複數菌種包括0.01~0.5重量%的酵母菌、0.01~0.25重量%的乳酸菌及3~10重量%的醋酸菌。

在一實施例中，該接骨木莓發酵液是進一步製備成保養品組合物、保健食品組合物、化妝品組合物或皮膚外用劑。

綜上所述，任一實施例的製造方法使得該接骨木莓發酵物的總多酚含量比傳統製程高出一倍，大量提升該接骨木莓發酵物的多個功效。此外，任一實施例的接骨木莓發酵物可用於製備促進硬骨分化、增強免疫力或抗氧化的組合物之用途，其中該組合物用於透過增加血液中的骨鈣素(Osteocalcin)及/或第一型前膠原蛋白氮端前胜鏈(P1NP)的濃度達到促進硬骨分化、提升骨細胞中的鈣離子含量、預防骨質疏鬆症、減緩骨質流失、加強骨密度及/或強化骨骼，透過增加白细胞介素18及/或白血球吞噬能力達到增強免疫力，達到身體保健的功效，以及透過增加血液中的紅血球中的榖胱甘肽S轉移酶(GST-RBC)、含硫化合物(f-Thiols)、丙二醛(MDA)而達成抗氧化作用，增加血液中的還原物質，消除身體內的氧化物質而減少氧化壓力，避免破壞蛋白質分子、氧化體內酵素而干擾其作用，也避免不飽和脂肪酸發生過氧化作用，本發明之接骨木莓發酵物實現促進硬骨分化、增強免疫力或抗氧化的功效。

以下將描述本案的部分具體實施態樣。在不背離本案精神下，本案尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將保護範圍限於說明書所具體陳述的條件。

本案使用Excel軟體進行統計分析。數據以平均值±標準差（SD）表示，各組之間的差異以學生t檢驗（student's t-test）進行分析。

本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在正負10%的範圍內，最佳為在正負5%的範圍內。

如本文中所使用，術語“萃取物”係指藉由萃取作用所製備之產物。該萃取物可以溶於溶劑中之溶液形式呈現，或萃取物可為不含或大體上不含溶劑之濃縮物或精華呈現。

依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道地(parenterally)、口服地(orally)或局部地(topically)投藥的劑型，這包括，但不限於：注射品(injection)[例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、無菌的粉末(sterile powder)、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pill)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)、外部製劑(external preparation)以及類似之物。

依據本發明，醫藥品可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，該醫藥上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersingagent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，該醫藥上可接受的載劑包含有一選自於由下列所構成之群組中的溶劑：水、生理鹽水(normal saline)、磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它們的組合。

依據本發明，該醫藥品可以一選自於由下列所構成之群組中的非經腸道途徑(parenteral routes)來投藥：腹膜內注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、皮內注射(intradermal injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)、靜脈內注射(intravenous injection)以及病灶內注射(intralesional injection)。

依據本發明，醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於局部地施用於皮膚上的外部製劑(external preparation)，這包括，但不限於：乳劑(emulsion)、凝膠(gel)、軟膏(ointment)、乳霜(cream)、貼片(patch)、擦劑(liniment)、粉末(powder)、氣溶膠(aerosol)、噴霧(spray)、乳液(lotion)、乳漿(serum)、糊劑(paste)、泡沫(foam)、滴劑(drop)、懸浮液(suspension)、油膏(salve)以及繃帶(bandage)。

依據本發明，該外部製劑是藉由將本發明的醫藥品與一為熟習此項技藝者所詳知的基底(base)相混合而被製備。

依據本發明，該基底可包含有一或多種選自於下列的添加劑(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氫化合物(hydrocarbons)[諸如石油膠(petroleum, jelly)以及白凡士林(white petrolatum)]、蠟(wax)[諸如石蠟(paraffin)以及黃蠟(yellow wax)]、保存劑(preserving agents)、抗氧化劑(antioxidants)、界面活性劑(surfactants)、吸收增強劑(absorption enhancers)、安定劑(stabilizing agents)、膠凝劑(gelling agents)[諸如卡波普®974P (carbopol®974P)、微結晶纖維素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纖維素(carboxymethylcellulose)]、活性劑(active agents)、保濕劑(humectants)、氣味吸收劑(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH調整劑(pH adjusting agents)、螯合劑(chelating agents)、乳化劑(emulsifiers)、閉塞劑(occlusive agents)、軟化劑(emollients)、增稠劑(thickeners)、助溶劑(solubilizing agents)、滲透增強劑(penetration enhancers)、抗刺激劑(anti-irritants)、著色劑(colorants)以及推進劑(propellants)等。有關這些添加劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，保養品可進一步包含有一被廣泛地使用於保養品製造技術之可接受的佐劑(acceptable adjuvant)。例如，該可接受的佐劑可包含有一或多種選自於下列的試劑：溶劑、膠凝劑、活性劑、防腐劑、抗氧化劑、遮蔽劑(screening agent)、螯合劑、界面活性劑、染色試劑(coloring agent)、增稠劑(thickening agent)、填料(filler)、香料以及氣味吸收劑。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，保養品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於護膚(skincare)或化妝(makeup)的形式，這包括，但不限於：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或複合型之乳劑、凝膠、軟膏、乳霜、面膜(mask)、貼片、貼布(pack)、擦劑、粉末、氣溶膠、噴霧、乳液、乳漿、糊劑、泡沫、分散液、滴劑、慕斯(mousse)、防曬油(sunblock)、化妝水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妝產品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身體清潔產品(body cleansing products)等。

依據本發明，保養品亦可與一或多種選自於下列之已知活性的外用劑(external use agents)一起合併使用：美白劑(whitening agents)[諸如維生素A酸(tretinoin)、兒茶素(catechin)、麴酸、熊果苷以及維生素C]、保濕劑、抗發炎劑(anti-inflammatory agents)、殺菌劑(bactericides)、紫外線吸收劑(ultraviolet absorbers)、植物萃取物(plant extracts)[諸如蘆薈萃取物(aloe extract)]、皮膚營養劑(skin nutrients)、麻醉劑(anesthetics)、抗痘劑(anti-acne agents)、止癢劑(antipruritics)、止痛劑(analgesics)、抗皮膚炎劑(antidermatitis agents)、抗過角化劑(antihyperkeratolytic agents)、抗乾皮膚劑(anti-dry skin agents)、抗汗劑(antipsoriatic agents)、抗老化劑(antiaging agents)、抗皺劑(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出劑(antiseborrheic agents)、傷口治療劑(wound-healing agents)、皮質類固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有關這些外用劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

依據本發明，食品產品可被當作食品添加物(food additive)，藉由習知方法於原料製備時添加，或是於食品的製作過程中添加，而與任一種可食性材料配製成供人類與非人類動物攝食的食品產品。

依據本發明，食品產品的種類包括但不限於：飲料(beverages)、發酵食品(fermented foods)、烘培產品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食補充品(dietary supplements)。

於下列實施方式的說明中，除非另有相關說明，則「%」符號是指重量百分比。

接骨木莓（學名： Sambucus nigra，又稱西洋接骨木莓）是五福花科接骨木屬的一種灌木的果實，主要種植在歐洲，舉例而言，義大利的米蘭諾(Merano)，其果實的果熟期7-8月。果實亮黑色，直徑3～5毫米。在一實施例中，接骨木莓是在義大利的米蘭諾以阿爾卑斯山的融雪與遍布境內的溫泉灌溉生長，使接骨木莓具有豐富的礦物質等生物活性物質。

參考圖1。在一實施例中，接骨木莓發酵物的製備方法包括下列步驟：提供培養液(步驟S01)、將培養液及複數菌種在磁場內進行發酵7日以得到發酵原液(步驟S02)、以及調整發酵原液的糖度(Degrees Brix，°Bx）以完成接骨木莓發酵物(步驟S03)。

在步驟S01中，培養液包括由該接骨木莓與水的重量比為1~3:5~29所形成的一接骨木莓溶液及接骨木莓溶液總重的10%的葡萄糖。在一些實施例中，「接骨木莓」通常係指植物果實，其中果實可包含原始、經乾燥或以其他物理方式加工以利於處理之果實，其可進一步包含完整、剁碎、切丁、碾磨、研磨或以其他方式經加工以影響原物料之大小及實體完整性之果實。

在一些實施例中，「接骨木莓發酵物」中的接骨木莓可為接骨木莓的果實經榨取而得的汁液。舉例而言，在一些實施例中，係將接骨木莓的果實經碾碎、擠壓並去除果渣與較細小的懸浮物後，再將其濃縮至一定糖度而得。在另一些實施例中，接骨木莓發酵物於製備過程中亦可經過其他大致上不影響其產生本文所述功效的程序，例如發酵，以增添風味或其他用途。

在一些實施例中，「接骨木莓發酵物」中的接骨木莓亦可為使用合適的萃取溶劑萃取接骨木莓的果實而得到的萃取液。舉例而言，可將接骨木莓浸泡於水中於常溫下經適當時間進行萃取，再經過濾去除固態雜質後可得到接骨木莓果實萃取液。

在一實施例中，步驟S01可包括：依上述比例混合接骨木莓及葡萄糖形成混合液；以及將混合液於50-100℃下萃取0.5-1.5小時以得到培養液。於此，將葡萄糖與接骨木莓溶液一併進行萃取程序，藉以助於葡萄糖溶解並且還可以避免污染。

在另一個實施例中，步驟S01包括：將接骨木莓及水於50-100℃下萃取0.5-1.5小時形成水萃液；以及將葡萄糖加入水萃液以得到培養液。於此，將接骨木莓單獨進行萃取程序，以利於接骨木莓內有效成分的確實地釋出。

在一些實施例中，萃取係指將混合液維持在50-100℃並靜置0.5-1.5小時。在一實施例中，萃取係指將混合液維持在95℃並靜置1小時。

在一實施例中，培養液的糖度為9°Bx~10°Bx。於此，足夠的糖度可以確保後續發酵的順利進行，菌種可以有足夠的養份。

後續，將培養液及複數菌種在磁場內進行發酵4~15.5日以得到發酵原液(步驟S02)。其中，複數菌種包括相對於培養液為0.01%~0.5%的酵母菌、相對於培養液為0.01%~0.25%的乳酸菌及相對於培養液為3~10%的醋酸菌(Acetobacter aceti)。在一實施例中，培養液不另濾除其內部的固形物(萃取後的接骨木莓)直接加入菌種進行發酵，藉以利用菌種進一步提取固形物中的活性成分。

在一實施例中，酵母菌可以是市售的啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。舉例而言，向財團法人食品工作發展研究所採購寄存編號BCRC20271(國際寄存ATCC26602)菌株的啤酒酵母。

在一實施例中，乳酸菌可以是為市售的胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)、市售的嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophiles)或植物乳桿菌。舉例而言，採用胚芽乳酸桿菌(購自財團法人食品工作發展研究所，寄存編號 BCRC910760)。再舉例而言，採用寄存編號BCRC910636(國際寄存DSM28121)菌株的嗜熱鏈球菌TCI633。

在一實施例中，向美國菌種中心(American Type Culture Collection)採購寄存編號BCRC11688(國際寄存ATCC15973)菌株的醋酸菌。

在一實施例中，「啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)」、「胚芽乳酸菌(Lactobacillus plantarum)」以及「醋酸菌(Acetobacter aceti)」分別意欲涵蓋那些為熟習此項技術人士可易於獲得的啤酒酵母菌、胚芽乳酸菌以及醋酸菌(例如，可購自於國內或國外寄存機構者)，或者利用本技藝中所慣用的微生物分離方法而從天然來源中所分離純化出的啤酒酵母菌、胚芽乳酸菌以及醋酸菌菌株。

參考圖2。在一實施例中，步驟S02可包括：將酵母菌在磁場內進行發酵1~2.5日後形成第一初發酵液(步驟S21)；添加乳酸菌於第一初發酵液內並在磁場內發酵1~3日後形成第二初發酵液(步驟S22)；添加醋酸菌於第二初發酵液內並於磁場內發酵3~10日後形成初發酵液(步驟S23)；以及過濾初發酵液以得到發酵原液(步驟S24)。

在步驟S21中，透過先添加酵母菌可以使培養液發酵以產生酒精；於此，酒精有利提取出人參與枸杞內不同的有效成份。在一些實施例中，第一初發酵液的PH值小於4，且其糖度為約9°Bx。

在步驟S22中，透過添加乳酸菌可以使得第一初發酵液內的葡萄糖被進一步消耗而降低糖度並且產生乳酸，以降低第一初發酵液的PH值；於此，降低第一初發酵液的PH值有利於進一步提取人參與枸杞內其他不同有效成分。在一些實施例中，第二初發酵液的PH值小於3.5，且其糖度為約6°Bx。

在步驟S23中，透過添加醋酸菌可以使得第二初發酵液內的酒精被消耗，而進一步再降低葡萄糖的含量。在一些實施例中，初發酵液的PH值小於3.5，且其糖度為為約3°Bx。

在步驟S24的一實施例中，可以是過濾並濃縮初發酵液以得到發酵原液。在一示範例中，濃縮方式可以採取在60℃下的減壓濃縮，以及過濾方式可以是以200mesh過濾。在一些實施例中，發酵原液的糖度為約2°Bx。在一些實施例中，發酵原液的PH值小於3.5。

在步驟S03的一實施例中，可以是添加寡糖至發酵原液以使發酵原液的糖度達到40°Bx以形成接骨木莓發酵物。於此，寡糖係指由3~10個單醣分子聚合而成的低聚糖。其中，寡糖可為果寡糖、半乳寡糖、木寡糖、異麥芽寡糖等等。在一實施例中，所添加的寡糖可為含40%~70%異麥芽寡糖的寡糖溶液。

在一實施例中，步驟S03所得的接骨木莓發酵物的總多酚含量為436.33µg/ml。在一實施例中，接骨木莓發酵物的黃酮含量為12703µg/ml。

[例1]: 接骨木莓發酵物的製備

將採購自義大利的米蘭諾的接骨木莓、水與葡萄糖混合成為混合液。在混合液中，該接骨木莓與水的重量比為1:5所形成的一接骨木莓溶液（即，接骨木莓為一倍重量，水為五倍重量），並且葡萄糖為接骨木莓與水所形成的接骨木莓溶液總重的10%。接著，將混合液於95℃下萃取1小時以得到培養液。發酵桶外圍設置的磁鐵能在發酵桶內形成磁場，待培養液冷卻之後置入其外圍設置有磁鐵的發酵桶內，使培養液在磁場內進行發酵。添加相對於培養液為0.01%的BCRC20271菌株之啤酒酵母菌於發酵桶中的培養液內，然後於30℃下進行發酵1天以形成第一初發酵液。再添加相對於培養液為0.05%的嗜熱鏈球菌(TCI633寄存編號BCRC910636，國際寄存DSM28121)於發酵桶中的第一初發酵液內，然後進行發酵1天以形成第二初發酵液。最後添加相對於培養液為5%的BCRC11688菌株之醋酸菌於發酵桶中的第二初發酵液內，然後進行發酵5天以得到發酵原液。於得到發酵原液後，在60℃下減壓濃縮及以200mesh過濾初發酵液以得到發酵原液。然後，以異麥芽寡糖60%及發酵原液40%之比例進行混合以使發酵原液的糖度達到40°Bx而形成接骨木莓磁場發酵物。

固態的接骨木莓磁場發酵物之製備：

為獲得固態的接骨木莓磁場發酵物，可將前述經減壓濃縮的接骨木莓磁場發酵物以噴霧乾燥方式去除溶劑，因此獲得接骨木莓磁場發酵物粉末。

[例2]: 接骨木莓發酵物（一般發酵）的製備

採用與例1的接骨木莓發酵物相同的原料比例與發酵程序，但其發酵桶外圍並未設置磁鐵，來製得接骨木莓發酵物。

[例3]: 接骨木莓水萃物（無發酵）的製備

將採購自義大利的米蘭諾的接骨木莓與水以1:5的比例混合均勻，再添加葡萄糖溶液將糖度調整為9，得到接骨木莓水萃液，其pH值為6.3。

[例4]: 總多酚含量測試

分別以例1所得的接骨木莓發酵物及例2所得的接骨木莓水萃物作為實驗組及對照組。將各樣本以水稀釋10倍後取100mL到離心管中。接著，加入500μL之Folin-Ciocalteu酚試劑至離心管中與稀釋後的樣本混合並靜置3分鐘後，再加入400μL之7.5%碳酸鈉混勻靜置30分鐘後以得到待測反應溶液。於二次靜置後，取200μL之待測反應溶液至96孔板中，並測量待測反應溶液於750nm下之吸光值。

並且，以沒食子酸(Gallic acid)作為標準品製作標準曲線。於此，配置0μL/mL、20μL/mL、40μL/mL、60μL/mL、80μL/mL、及100μL/mL之沒食子酸的標準溶液，並分別取100μL之各濃度的標準溶液至10mL離心管中。加入500μL之Folin-Ciocalteu酚試劑至離心管內與標準溶液混合並靜置3分鐘後，再加入400μL之7.5%碳酸鈉混勻靜置30分鐘後以得到標準反應溶液。取200μL之標準反應溶液96孔板中，並測量其在750nm下之吸光值，以獲得標準曲線。

接著，利用標準曲線將待測反應溶液的吸光值換算成總多酚含量。於此，可得到實驗組的接骨木莓磁場發酵物總多酚含量為1134.6µg/ml及對照組的接骨木莓發酵物中總多酚含量557.6µg/ml，如圖3所示。

由實驗結果可知，接骨木莓磁場發酵物總多酚含量相較於接骨木莓發酵物總多酚含量提升203.5%；基此可知在磁場內進行發酵更有利於有效成份的提取。

[例5]: 促進硬骨形成（Osteogenesis）試驗

為證實本發明之接骨木莓磁場發酵物具有促進硬骨形成之能力，本發明利用茜素紅(Alizarin Red S)(Sigma-Aldrich)染色進行確認。Alizarin Red S是橙黃色結晶物，可溶於水，會與鈣鹽結合而形成橘紅色的沉澱物，用於檢測細胞的鈣沉積或鈣化物質的檢測。

本發明利用該接骨木莓磁場發酵物處理OP9新生小鼠骨髓間質細胞株(係由ATCC編號為 CRL-2749取得)，以未經處理的OP9細胞株作為控制組，例3之接骨木莓水萃物作為對照組1，例2之接骨木莓發酵物作為對照組2，觀察例1之接骨木莓磁場發酵物對OP9細胞株分化成硬骨細胞的情形。結果顯示，經由茜素紅染色分析顯示該接骨木莓磁場發酵物處理的OP9細胞可分化成硬骨細胞，進而增加鈣離子的累積。且其經分析後的數據結果如圖4所示，相較於未以接骨木莓磁場發酵物處理控制組的分化成硬骨細胞的數量為100%，對照組1之接骨木莓水萃物處理的OP9細胞株分化成硬骨細胞的數量為72.05%，對照組2之接骨木莓發酵物處理的OP9細胞株分化成硬骨細胞的數量為74.38%，實驗組之接骨木莓磁場發酵物處理的OP9細胞株分化成硬骨細胞的數量為129.45%，故本發明經接骨木莓磁場發酵物處理的OP9細胞株可有效提升軟骨分化能力1.29倍，證實本發明之接骨木莓磁場發酵物具有效促進硬骨細胞生長及硬骨形成之能力。

[例6]: 巨噬細胞吞噬活性相關基因檢測

準備一個6孔盤(購自GeneDireX公司)，在各孔中注入例6的控制組、對照組1、對照組2及實驗組之人類單核球細胞株THP-1 (包含RPMI培養液、以及10% FBS)，以5x10 ⁵個/每孔的數量將單核球細胞株THP-1培養在6孔盤中，接者在每個孔中加入500奈莫耳濃度的分化試劑(佛波醇12-肉荳蔻酸酯13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)，購自Sigma公司)，使單核球細胞株THP-1分化為巨噬細胞，培養24小時。而後，將各孔的培養基移除，再將細胞分為4組，分別為控制組、對照組1、對照組2以及實驗組。針對控制組的細胞，僅加入200μL不含FBS的培養基；針對對照組1的細胞，僅加入200μL的接骨木莓水萃物；針對對照組2的細胞，則是加入200μL的接骨木莓發酵物；針對實驗組的細胞，則是加入200μL的接骨木莓磁場發酵物。將各組細胞於5％CO ₂、37℃環境下，培養24小時。

以RNA萃取套組、反轉錄酶、KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組配合定量PCR儀，測定巨噬細胞經接骨木莓磁場發酵物處理後，細胞中白细胞介素18(IL-18，Gene ID:3606)的基因表現量的變化，白细胞介素18可刺激先天免疫力及促進巨噬細胞的聚集與吞噬作用。

表1:

引子名稱	序列編號	引子序列
IL-18-F	SEQ ID NO:1	TCTTCATTGACCAAGGAAATCGG
IL-18-R	SEQ ID NO:2	TCCGGGGTGCATTATCTCTAC
GAPDH-F	SEQ ID NO:3	CTGGGCTACACTGAGCACC
GAPDH-R	SEQ ID NO:4	AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG

*R為REVERSE反向，F為FORWARD順向。

請參閱圖5。將控制組的IL-18基因的表現量視為1（即100%），相對於控制組1的IL-18基因表現量上升至1.74，控制組2的IL-18基因表現量上升至2.04，實驗組的IL-18基因表現量上升至2.48，代表實驗組的IL-18基因的表現量為控制組的2.48倍。由此可知，當小鼠巨噬細胞以含有接骨木莓磁力酵素處理後，IL-18基因的表現量提高，表示接骨木莓磁力酵素具有刺激先天免疫力及提升巨噬細胞吞噬活性的功效。

[例7]: 巨噬細胞吞噬活性檢測

在例6的控制組、對照組1、對照組2及實驗組之巨噬細胞中加入0.5%的螢光微珠(大小為1.7微米至2.2微米，購自Spheroteth公司)，繼續培養4小時。接者，清除培養液，加入1X PBS清洗3次，再將每孔分為5區，每區隨機選取2個視野以螢光顯微鏡(購自ZEISS公司)進行拍照，進一步計算照片中巨噬細胞裡螢光微珠的數量，並將結果統計示於圖6。

如圖6所示，以控制組之巨噬細胞裡螢光微珠的數量作為100%，對照組1之巨噬細胞裡螢光微珠的數量為106.03%，對照組2之巨噬細胞裡螢光微珠的數量為113.79%，實驗組1之巨噬細胞裡螢光微珠的數量為145.69%。可見，相較於控制組，與接骨木莓磁力酵素共培養的巨噬細胞，皆可吞噬較多的螢光微珠，顯示接骨木莓磁力酵素可顯著提升巨噬細胞的吞噬能力。

而為證實本發明的接骨木莓磁力酵素對於人體的功效，亦進行相關人體實驗如下。

[例8]：人體實驗-抗氧化能力測定

本實驗針對6位45-65歲之已停經女性之受試者連續8週服用含有7.5ml的如例1所製的接骨木莓磁力酵素之飲品。在第0週及第8週進行抽血，以偵測在服用含有本發明的接骨木莓磁力酵素之飲品前後的其血液中的總和抗氧化能力(TAC)、榖胱甘肽S轉移酶(GST-RBC)、含硫化合物(f-Thiols)、丙二醛(MDA)的變化量。

本實施例受試者血液中的總和抗氧化能力(TAC)、榖胱甘肽S轉移酶(GST-RBC)、含硫化合物(f-Thiols)、丙二醛(MDA)是委由立人檢驗所（台灣）測定。

圖7示出了受試者在服用含有本發明的接骨木莓磁力酵素之飲品於第0週及第8週的總和抗氧化能力的變化量，第0週時的受試者之總和抗氧化能力(TAC)值為約0.56 mmol/L，受試者於第8週的總和抗氧化能力增加至約0.64 mmol/L，上升了14.3%，總和抗氧化能力(Total Antioxidant Capacity，TAC)檢測測量血漿中非酵素類抗氧化物總體的抗氧化能力，比單獨測量某一抗氧化物更能反應全身抗氧化的能力。所測得的TAC值越高表示體內抗氧化能力越高。本發明的接骨木莓磁力酵素可強化體內抗氧化力，幫助抵禦自由基誘發之傷害。

圖8示出了受試者在服用含有本發明的接骨木莓磁力酵素之飲品於第0週及第8週的榖胱甘肽S轉移酶的變化量，第0週時的受試者之榖胱甘肽S轉移酶(GST-RBC)值為約5.17 U/g-Hb，受試者於第8週的榖胱甘肽S轉移酶增加至約6.19 U/g-Hb，上升了19.7%，榖胱甘肽S轉移酶的增加提升抗氧化及免疫力的功效，使體內的過氧化氫還原成水及氧氣，並且還原脂質過氧化物為無害的產物，降低體內的氧化壓力。

圖9示出了受試者在服用含有本發明的接骨木莓磁力酵素之飲品於第0週及第8週的含硫化合物的變化量，第0週時的受試者之含硫化合物的濃度為約311.00 μg/mL，受試者於第8週的含硫化合物的濃度上升至約348.50 μg/mL，上升了12%。本發明的接骨木莓磁力酵素可增加含硫化合物的含量，含硫化合物為一良好的抗氧化物質，對自由基相當敏感，能緩和活性氧自由基(ROS)的傷害，具有解毒與強化肝臟功能的作用。

圖10示出了受試者在服用含有本發明的接骨木莓磁力酵素之飲品於第0週及第8週的丙二醛的變化量，第0週時的受試者之丙二醛的濃度為約1.36nmol/mL，受試者於第8週的丙二醛的濃度下降至約1.30 nmol/mL，下降了4.4%，丙二醛(malondialdehyde, MDA)是由體內自由基與細胞膜上的磷脂質(phospholipids)發生脂質過氧化反應而形成，MDA形成越快表示身體抗氧化能力較差，MDA累積越多，表示受傷害機率高。本發明的接骨木莓磁力酵素可減少MDA的含量，避免MDA造成皮膚產生黑斑、雀斑，加速老化過程，同時會破壞膽固醇傷害動脈血管、冠狀動脈硬化等心血管疾病、DNA損傷導致癌症。降低細胞膜上的磷脂質(phospholipids)發生脂質過氧化。

[例9]: 人體實驗-促進骨質生成能力測定

本實驗針對例8之受試者在第0週及第8週進行抽血，以偵測在服用含有本發明的接骨木莓磁力酵素之飲品前後的骨鈣素及第一型前膠原蛋白氮端前胜鏈(P1NP)的濃度的變化。

本實施例受試者血液中的骨鈣素及第一型前膠原蛋白氮端前胜鏈的濃度是委由立人檢驗所（台灣）測定。

圖11示出了受試者在服用含有本發明的接骨木莓磁力酵素之飲品於第0週及第8週的骨鈣素的濃度的變化，結果示於第11圖，以第0週時的骨鈣素的濃度為約17.70 ng/mL，受試者於第8週的骨鈣素的濃度增加至約18.02 ng/mL，增加了1.8%，具有促進骨質生成速率、減緩骨質疏鬆的功效。

圖12示出了受試者在服用含有本發明的接骨木莓磁力酵素之飲品於第0週及第8週的第一型前膠原蛋白氮端前胜鏈的濃度的變化，結果示於第11圖，以第0週時的第一型前膠原蛋白氮端前胜鏈的濃度為約60.66 ng/mL，受試者於第8週的第一型前膠原蛋白氮端前胜鏈的濃度增加至約66.65 ng/mL，增加了9.9%，具有促進骨質生成速率、減緩骨質疏鬆的功效。

[例10]: 人體實驗-骨質密度測定

本實驗針對例8之受試者在第0週及第8週使用雙能譜X光骨質密度吸收測量儀(dual-energy x-ray absorptiometry)來量測T評分，以評估骨質密度。

圖13示出了受試者在服用含有本發明的接骨木莓磁力酵素之飲品於第0週及第8週的T評分的變化，結果示於第13圖，以第0週時的T評分為-0.92，受試者於第8週的T評分增加至-0.85，增加了7.6%，本發明的接骨木莓磁力酵素確實可以預防骨質疏鬆症、加強骨密度及強化骨骼的功效。

綜上所述，任一實施例的製造方法使得該接骨木莓發酵物的總多酚含量比傳統製程高出一倍，大量提升該接骨木莓發酵物的多個功效。此外，任一實施例的接骨木莓發酵物可用於製備促進硬骨分化、增強免疫力或抗氧化的組合物之用途，其中該組合物用於透過增加血液中的骨鈣素(Osteocalcin) 及/或第一型前膠原蛋白氮端前胜鏈(P1NP)的濃度達到促進硬骨分化、提升骨細胞中的鈣離子含量、預防骨質疏鬆症、加強骨密度及/或強化骨骼，透過增加白细胞介素18及/或白血球吞噬能力達到增強免疫力，達到身體保健的功效，以及透過增加血液中的紅血球中的榖胱甘肽S轉移酶(GST-RBC)、含硫化合物(f-Thiols)、丙二醛(MDA)而達成抗氧化作用，增加血液中的還原物質，消除身體內的氧化物質而減少氧化壓力，避免破壞蛋白質分子、氧化體內酵素而干擾其作用，也避免不飽和脂肪酸發生過氧化作用，本發明之接骨木莓發酵物實現促進硬骨分化、增強免疫力或抗氧化的功效。

S01,S02,S03,S21,S22,S23,S24:步驟

圖1係本發明一實施例之發酵液的製法的流程圖。圖2係圖1步驟S02的細部的流程圖。圖3係本發明的一實施例的製造方法所製得的接骨木莓發酵物的總多酚含量。圖4係控制組、對照組1、對照組2及實驗組分化成硬骨細胞的數量之結果比較圖。**p值＜0.01，相較於控制組。圖5係控制組、對照組1、對照組2及實驗組的白细胞介素18的表現量之結果比較圖。*p值＜0.05，相較於控制組。圖6係控制組、對照組1、對照組2及實驗組的白血球吞噬能力之結果比較圖。***p值＜0.001，相較於控制組。圖7係受試者連續攝取含有該實驗組的飲品在第0週及第8週的總和抗氧化能力的結果比較圖。圖8係受試者連續攝取含有該實驗組的飲品在第0週及第8週的紅血球中的榖胱甘肽S轉移酶的結果比較圖。圖9係受試者連續攝取含有該實驗組的飲品在第0週及第8週的含硫化合物的結果比較圖。圖10係受試者連續攝取含有該實驗組的飲品在第0週及第8週的丙二醛的結果比較圖。圖11係受試者連續攝取含有該實驗組的飲品在第0週及第8週的骨鈣素的結果比較圖。圖12係受試者連續攝取含有該實驗組的飲品在第0週及第8週的第一型前膠原蛋白氮端前胜鏈的結果比較圖。圖13係受試者連續攝取含有該實驗組的飲品在第0週及第8週的骨質密度的T評分(T-score)的結果比較圖。

財團法人食品工業發展研究所（台灣）；民國103年6月23日；寄存編號：BCRC 910636。

Claims

一種接骨木莓磁場發酵物的製備方法，包括：提供一培養液，該培養液包括由該接骨木莓與水的重量比為1~3:5~29所形成的一接骨木莓溶液及該接骨木莓溶液總重的10重量%之葡萄糖；將該培養液及複數菌種在一磁場內進行發酵4~15.5日以得到一發酵原液，其中該複數菌種包括0.01~0.5重量%的酵母菌、0.01~0.25重量%的乳酸菌及3~10重量%的醋酸菌；以及調整該發酵原液的糖度以形成該接骨木莓磁場發酵物。
如請求項1所述的製備方法，其中將該培養液及該些菌種在該磁場內進行發酵的步驟包括：將該酵母菌在該磁場內進行發酵1~2.5日後形成一第一初發酵液；添加該乳酸菌於該第一初發酵液內並於該磁場內發酵1~3日後形成一第二初發酵液；添加該醋酸菌於該第二初發酵液內並於該磁場內發酵3~10日後形成一初發酵液；以及過濾該初發酵液以得到該發酵原液。
如請求項1所述的製備方法，其中該磁場的一磁通量密度為120~300毫特斯拉。
如請求項1所述的製備方法，其中該接骨木莓發酵液中的總多酚含量為1134.6 μg/ml。
如請求項1所述的製備方法，其中該酵母菌為Saccharomyces cerevisiae，其寄存編號為BCRC20271，該乳酸菌為Lactobacillus plantarum，其寄存編號為BCRC910805，該醋酸菌為Acetobacter aceti，其寄存編號為BCRC11688。
一種接骨木莓磁場發酵物用於製備促進硬骨分化、增強免疫力或抗氧化的組合物的用途。
如請求項6所述的用途，其中該接骨木莓發酵液增加血液中的骨鈣素 (Osteocalcin) 及/或第一型前膠原蛋白氮端前胜鏈(P1NP)的濃度。
如請求項6所述的用途，其中該接骨木莓發酵液增加白细胞介素18及/或白血球吞噬能力。
如請求項6所述的用途，其中該接骨木莓發酵液增加血液中的紅血球中的榖胱甘肽S轉移酶(GST-RBC)、含硫化合物(f-Thiols)、丙二醛(MDA)或其組合的濃度。
如請求項6所述的用途，其中該接骨木莓發酵液中的接骨木莓與水的重量比為1~3:5~29，並且通過複數菌種在一磁場內進行發酵4~15.5日，該複數菌種包括0.01~0.5重量%的酵母菌、0.01~0.25重量%的乳酸菌及3~10重量%的醋酸菌。
如請求項6所述的用途，其中該接骨木莓發酵液是進一步製備成保養品組合物、保健食品組合物、化妝品組合物或皮膚外用劑。