TW202309273A - 活化t細胞之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供新穎人工抗原呈現細胞(aAPCs)。本文所揭示的aAPC包含微脂體，其包含磷脂及展現於該微脂體的外表面上之刺激配體。本發明之aAPCs可用作活化及擴增所關注T細胞之「現成(off the shelf)」工具。此外，本發明提供使用本文所揭示的aAPCs活化T細胞及製備T細胞療法產品之方法。

Description

活化T細胞之方法
在過去十年中，細胞療法已成為用於治療疾病之新穎治療劑。具體而言，使用製造的T細胞(例如TILs、CAR-T及NeoTCR工程化細胞)已成為更受關注的領域。雖然許多療法能夠產生小規模，但研究等級結果顯示此類細胞療法治療癌症之有效性，讓患者獲得此等療法之主要限制係製造能力。
製作細胞療法之一個關鍵步驟係細胞之體外活化。當在體外培養時，天然T細胞在T細胞受體(TCR)刺激之後逐漸獲得記憶T細胞之表面標誌表型，從幹細胞類記憶(Tmsc)轉變成中央記憶(Tcm)且最終轉變成效應記憶(Tem) T細胞。年輕T細胞，特別是Tmsc細胞，在多種癌症免疫療法模型中證實優異抗腫瘤效應且在體內輸注時顯示更長長期存活。因此，需要最佳化抗腫瘤T細胞之體外擴增以獲得有效擴增同時維持Tmsc表型。
使用高免疫原性專業APCs (諸如樹突細胞)之重複或過度刺激不可避免地使T細胞成熟且導致T細胞活化誘導之細胞死亡(AICD)，尤其是對於具有高抗原特異性結合性之T細胞。由於其高效免疫原性，因此專業APCs不是產生用於細胞療法產品中之體外T細胞之最佳選擇。因此，已開發各種人工抗原呈現細胞或APC類似物(aAPCs)。例如，已使用某些細胞系，諸如K562。K562係一種人類紅血球性白血病細胞系，其衍生自處於母細胞危象之患有慢性骨髓性白血病的患者。K562細胞不表現內源性HLA I類、II類或CD1d分子，但確實表現ICAM-1(CD54)及LFA-3 (CD58)，其為形成有效免疫突觸所需的黏附分子。然而，培養及維持K562細胞群體係昂貴且耗時的。因此，已開發多種非細胞aAPCs且可商業購得。例如，通常使用經CD3 (αCD3)及CD28 (αCD28)之活化抗體功能化之微珠或奈米粒子。然而，由於此等商業產品將活化抗體共價地結合至固相擔體，因此活化分子係靜態的，不同於天然抗原呈現細胞，其中刺激配體在細胞膜內移動以實現TCR簇聚，T細胞活化之關鍵步驟。
目前技術之限制包括：1) T細胞與活化粒子之間的相互作用為靜態及非天然的，2)珠粒或其他惰性粒子可導致慢性活化，此導致經過度刺激之細胞，3) CD8+及CD4+ T細胞之擴增之差異，4)長時間體外培養後，CD8 T細胞之存活率與CD4細胞相比更差，及5)缺乏對細胞介素釋放之控制。
本文所述的方法及組合物旨在解決問題且滿足體外活化T細胞以製造用於治療患者的細胞療法之未滿足的需求。
本發明提供可用作活化及擴增所關注T細胞之「現成(off the shelf)」工具之新穎人工抗原呈現細胞(aAPCs)。
在某些實施例中，本發明提供一種包含微脂體之人工抗原呈現細胞(aAPC)，該微脂體包含磷脂及展現於該微脂體的外表面上之刺激配體。
在某些實施例中，該刺激配體係選自由CD3促效劑、CD28促效劑、主要組織相容性複合物(MHC)、肽-MHC複合物、多聚化新抗原決定基-HLA複合物、CD58、CD86、CD83、4-1BBL、OX40L、ICOSL (B7H2、B7RP1)、CD40L及LFA-1組成之群。在某些實施例中，該微脂體包含磷脂及功能化脂質之混合物。
在某些實施例中，該混合物中磷脂與功能化脂質之比率係介於10,000:1與25:1之間。在某些實施例中，該比率係介於1000:1與50:1之間。在某些實施例中，該比率係介於100:1與50:1之間。
在某些實施例中，該磷脂係選自由以下組成之群：磷脂酸(磷脂酸酯) (PA)、磷脂醯乙醇胺(腦磷脂) (PE)、磷脂醯膽鹼(卵磷脂) (PC)、磷脂醯絲胺酸(PS)、磷酸肌醇、磷脂醯肌醇(PI)、磷脂醯肌醇磷酸酯(PIP)、磷脂醯肌醇二磷酸酯(PIP2)、磷脂醯肌醇三磷酸酯(PIP3)、神經醯胺磷酸膽鹼(鞘磷脂) (SPH)、神經醯胺磷醯乙醇胺(鞘磷脂) (Cer-PE)及其組合。在某些實施例中，該微脂體包含18:1棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)及/或1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)。在某些實施例中，該功能化脂質包含生物素部分、N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分、磺基-NHS部分、氮基三乙酸(NTA)-鎳、馬來醯亞胺部分或N-苄基鳥嘌呤。在某些實施例中，該功能化脂質為1-油醯基-2-(12-生物素基-(胺基十二醯基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:1至12:0生物素-PE)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(生物素基) (16:0生物素-PE)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(生物素基) (18:1生物素-PE)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(cap生物素基) (18:1生物素-Cap-PE)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(cap生物素基) (16:0生物素-Cap-PE)、生物素-磷脂醯乙醇胺(生物素-PE)、或生物素-1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(生物素-POPE)。在某些實施例中，該功能化脂質為18:1生物素-Cap-PE、16:0生物素-Cap-PE或生物素-POPE。在某些實施例中，該功能化脂質為生物素-POPE。
在某些實施例中，該刺激配體係經由功能化脂質連接至微脂體。在某些實施例中，該刺激配體為CD3促效劑、CD28促效劑或其組合。在某些實施例中，該CD3促效劑為抗CD3抗體。在某些實施例中，該CD28促效劑為抗CD28抗體。在某些實施例中，該抗CD3抗體及/或抗CD28抗體為低內毒素無疊氮化物(LEAF)抗體。
在某些實施例中，該微脂體具有介於30 nm與2 μm之間的直徑。在某些實施例中，該微脂體具有介於50 nm與600 nm之間的直徑。在某些實施例中，該微脂體具有介於100 nm與400 nm之間的直徑。
在某些實施例中，本發明提供本文所揭示的aAPCs群體。在某些實施例中，該群體之微脂體具有介於30 nm與2 μm之間的平均直徑及5%至50%之大小分佈。在某些實施例中，該平均直徑係介於50 nm與600 nm之間。在某些實施例中，該平均直徑係介於100 nm與400 nm之間。
在某些實施例中，本發明提供包含T細胞群體及人工抗原呈現細胞(aAPCs)群體之組合物，其中各aAPC包含微脂體，其包含磷脂及展現於該微脂體的外表面上之刺激配體。在某些實施例中，該微脂體包含磷脂及功能化脂質之混合物。
在某些實施例中，該混合物中磷脂與功能化脂質之比率係介於10,000:1與25:1之間。在某些實施例中，該比率係介於1000:1與50:1之間。在某些實施例中，該比率係介於100:1與50:1之間。
在某些實施例中，該磷脂係選自由以下組成之群：磷脂酸(磷脂酸酯) (PA)、磷脂醯乙醇胺(腦磷脂) (PE)、磷脂醯膽鹼(卵磷脂) (PC)、磷脂醯絲胺酸(PS)、磷酸肌醇、磷脂醯肌醇(PI)、磷脂醯肌醇磷酸酯(PIP)、磷脂醯肌醇二磷酸酯(PIP2)、磷脂醯肌醇三磷酸酯(PIP3)、神經醯胺磷酸膽鹼(鞘磷脂) (SPH)、神經醯胺磷醯乙醇胺(鞘磷脂) (Cer-PE)及其組合。在某些實施例中，該微脂體包含18:1棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)及/或1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)。在某些實施例中，該功能化脂質包含生物素部分、N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分、磺基-NHS部分、氮基三乙酸(NTA)-鎳、馬來醯亞胺部分或N-苄基鳥嘌呤。在某些實施例中，該功能化脂質為1-油醯基-2-(12-生物素基-(胺基十二醯基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:1至12:0生物素-PE)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(生物素基) (16:0生物素-PE)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(生物素基) (18:1生物素-PE)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(cap生物素基) (18:1生物素-Cap-PE)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(cap生物素基) (16:0生物素-Cap-PE)、生物素-磷脂醯乙醇胺(生物素-PE)、或生物素-1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(生物素-POPE)。在某些實施例中，該功能化脂質為18:1生物素-Cap-PE、16:0生物素-Cap-PE或生物素-POPE。在某些實施例中，該功能化脂質為生物素-POPE。
在某些實施例中，該刺激配體係經由功能化脂質連接至微脂體。在某些實施例中，該刺激配體係選自由CD3促效劑、CD28促效劑、主要組織相容性複合物(MHC)、肽-MHC複合物、多聚化新抗原決定基-HLA複合物、CD58、CD86、CD83、4-1BBL、OX40L、ICOSL (B7H2、B7RP1)、CD40L及LFA-1組成之群。在某些實施例中，該刺激配體為CD3促效劑、CD28促效劑或其組合。在某些實施例中，該CD3促效劑為抗CD3抗體。在某些實施例中，該CD28促效劑為抗CD28抗體。在某些實施例中，該抗CD3抗體及/或抗CD28抗體為低內毒素無疊氮化物(LEAF)抗體。
在某些實施例中，該微脂體具有介於30 nm與2 μm之間的直徑。在某些實施例中，該微脂體具有介於50 nm與600 nm之間的直徑。在某些實施例中，該微脂體具有介於100 nm與400 nm之間的直徑。
在某些實施例中，該組合物進一步包含細胞生長介質。在某些實施例中，進一步包含介白素7 (IL-7)及介白素15 (IL-15)。在某些實施例中，其中該T細胞群體包含至少一個NeoTCR細胞。
在某些實施例中，本發明提供一種包含本文所揭示的T細胞群體及人工抗原呈現細胞(aAPCs)群體之組合物。
在某些實施例中，本發明提供一種活化T細胞之方法，其包括使T細胞暴露於一或多個人工抗原呈現細胞(aAPCs)，其中各aAPC包含微脂體，其包含磷脂及展現於微脂體的外表面上之刺激配體。
在某些實施例中，該磷脂係選自由以下組成之群：磷脂酸(磷脂酸酯) (PA)、磷脂醯乙醇胺(腦磷脂) (PE)、磷脂醯膽鹼(卵磷脂) (PC)、磷脂醯絲胺酸(PS)、磷酸肌醇、磷脂醯肌醇(PI)、磷脂醯肌醇磷酸酯(PIP)、磷脂醯肌醇二磷酸酯(PIP2)、磷脂醯肌醇三磷酸酯(PIP3)、神經醯胺磷酸膽鹼(鞘磷脂) (SPH)、神經醯胺磷醯乙醇胺(鞘磷脂) (Cer-PE)及其組合。在某些實施例中，該微脂體包含18:1棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)及/或1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)。
在某些實施例中，該刺激配體係選自由CD3促效劑、CD28促效劑、主要組織相容性複合物(MHC)、肽-MHC複合物、多聚化新抗原決定基-HLA複合物、CD58、CD86、CD83、4-1BBL、OX40L、ICOSL (B7H2、B7RP1)及CD40L組成之群。在某些實施例中，該刺激配體為CD3促效劑、CD28促效劑或其組合。在某些實施例中，該CD3促效劑為抗CD3抗體。在某些實施例中，該CD28促效劑為抗CD28抗體。在某些實施例中，該抗CD3抗體及/或抗CD28抗體為低內毒素無疊氮化物(LEAF)抗體。
在某些實施例中，該方法進一步包括混合T細胞群體與aAPCs群體。在某些實施例中，其中該aAPCs群體之微脂體具有介於30 nm與2 μm之間的平均直徑及5%至50%之大小分佈。在某些實施例中，該平均直徑係介於30 nm與400 nm之間。在某些實施例中，該平均直徑為約200 nm。在某些實施例中，該混合物包含介於5:1 (aAPCs:T細胞)與5000:1之間的比率的aAPCs及T細胞。在某些實施例中，該T細胞為NeoTCR細胞。
在某些實施例中，本發明提供一種製造T細胞療法產品之方法，其包括使T細胞群體暴露於人工抗原呈現細胞(aAPCs)群體，其中各aAPC包含微脂體，其包含磷脂及展現於微脂體的外表面上之刺激配體。
在某些實施例中，該方法進一步包括T細胞群體之至少一個T細胞之基因編輯。在某些實施例中，該基因編輯包括利用結合至導引RNA序列之CRISPR-Cas9核酸酶之雙重核糖核蛋白物種電穿孔該T細胞群，其中各物種靶向內源TCRα基因座及/或內源TCRβ基因座。在某些實施例中，該暴露在基因編輯之前發生。在某些實施例中，該基因編輯係非病毒性的。在某些實施例中，該T細胞群體包含一或多個NeoTCR細胞。
在某些實施例中，本發明提供一種利用T細胞療法治療有需要患者之方法，其中該T細胞療法係藉由本文所揭示的製造之方法來獲得。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2021年6月11日申請之美國臨時申請案第63/209,784號之優先權，該案之全部內容係以引用之方式併入本文中。
本發明提供包括可用於製備及製作過繼性細胞療法之人工抗原呈現細胞(aAPCs)之組合物及方法。本發明部分地基於發明人建立包含含有磷脂及刺激配體之微脂體之aAPCs之能力。此等aAPCs可用作活化及擴增所關注T細胞之「現成」工具。最後，本發明亦提供使用本文所揭示的組合物及方法產生過繼性細胞療法(例如T細胞療法產品)之方法。本發明之非限制性實施例藉由本描述及實例進行描述。出於本揭示內容之清晰性之目的而非藉由限制，將實施方式分為以下子部分： 1. 定義； 2. 人工抗原呈現細胞； 3. T細胞活化； 4. NeoTCR產品；及 5. 示例性實施例。
1. 定義除非另有定義，否則本文所使用的所有技術及科學術語具有熟習此項技術者通常所理解的含義。以下參考文獻為技術者提供用於目前所揭示的標的中之許多術語之一般定義： Concise Medical Dictionary，Law及Martin編，Oxford University Press，2020； A Dictionary of Biology，Hine編，Oxford University Press，2019； A Dictionary of Chemistry，Law及Rennie編，Oxford University Press，2020； Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology，Cammack、Atwood、Campbell、Parish、Smith、Vella及Stirling編，Oxford University Press，2006；及Paul、William，2013。 Fundamental Immunology。Philadelphia，PA: Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins。如本文所用，除非另作指明，否則以下術語具有以下歸屬於其等之含義。
應理解，本文所述的本發明之態樣及實施例包括「包含(comprising)」態樣及實施例、「由」態樣及實施例「組成」及「基本上由」態樣及實施例「組成」。術語「包含(comprises)」及「包含(comprising)」意欲具有美國專利法中歸屬於其等之廣泛含義且可意指「包括(includes)」、「包括(including)」及類似者。
如本文所用，術語「約」或「近似」意指在如由一般技術者確定的特定值之可接受誤差範圍內，該誤差範圍將部分地取決於該值之測量或確定方式，亦即測量系統之限制。例如，「約」可意指按照此項技術中的操作在3個或多於3個標準偏差以內。或者，「約」可意指高達給定值的20%，例如高達10%、高達5%或高達1%之範圍。或者，特別是關於生物系統或過程，該術語可意指在一值的一個數量級以內，例如在5倍或2倍以內。
術語「抗體」如本文所用係在最廣義上使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性及三特異性抗體)及抗體片段(例如雙-Fabs)，只要其展現所需抗原結合活性即可。「抗體片段」如本文所用係指除完整抗體以外的分子，其包含結合完整抗體所結合的抗原的完整抗體之一部分。抗體片段之實例包括(但不限於)雙-Fabs；Fv；Fab；Fab、Fab'-SH；F(ab')2；雙功能抗體(diabodies)；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
術語「癌症」及「腫瘤」在本文中可互換使用。如本文所用，術語「癌症」或「腫瘤」係指所有腫瘤性細胞生長及增殖(無論是惡性還是良性)、及所有癌前及癌性細胞及組織。該等術語進一步用於係指或描述哺乳動物中通常以不受調節之細胞生長/增殖為特徵之生理病狀。癌症可影響多種細胞類型、組織或器官，包括(但不限於)選自由膀胱、骨骼、腦、乳房、軟骨、神經膠質、食道、輸卵管、膽囊、心臟、腸、腎臟、肝臟、肺、淋巴結、神經組織、卵巢、胰臟、前列腺、骨骼肌、皮膚、脊髓、脾臟、胃、睾丸、胸腺、甲狀腺、氣管、泌尿生殖道、輸尿管、尿道、子宮及陰道或其組織或細胞類型組成之群之器官。癌症包括癌症，諸如肉瘤、癌或漿細胞瘤(漿細胞之惡性腫瘤)。癌症之實例包括(但不限於)彼等本文所述者。如本文所使用，術語「癌症」或「腫瘤」及「增生性病症」並非相互排斥。
「治療(Treat)」、「治療(treatment)」及「治療(treating)」可互換使用且如本文所用意指獲得有益或所需結果，包括臨床結果。治療之期望效應包括(但不限於)預防疾病之發生或復發、緩解症狀、減少疾病之任何直接或間接病理結果、預防轉移、減小疾病進展率、改善或減輕疾病狀態、及緩解或改良預後。在一些實施例中，本發明之NeoTCR產品用於延遲增生性病症(例如癌症)之發展或減慢此種疾病之進展。
「Dextramer」如本文所用意指特異性結合至其同源NeoTCR之多聚化新抗原決定基-HLA複合物。
如本文所用，術語「新抗原」、「新抗原決定基」或「neoE」係指新形成之抗原決定子，其例如來自於體細胞突變且經識別為「非自身」。產生「新抗原」、「新抗原決定基」或「neoE」之突變可包括框架移位或非框架移位插入或缺失(indel)、誤義或無意義取代、剪接位點變動(例如可變剪接轉錄本)、基因組重排或基因融合、任何基因組或表現變動或任何轉譯後修飾。
「NeoTCR」及「NeoE TCR」如本文所用意指例如藉由基因編輯方法引入至T細胞中之新抗原決定基特異性T細胞受體。
「NeoTCR細胞」如本文所用意指經精密工程化以表現一或多個NeoTCRs之一或多個細胞。在某些實施例中，該等細胞為T細胞。在某些實施例中，該等T細胞為CD8+及或CD4+ T細胞。在某些實施例中，該CD8+及/或CD4+ T細胞為來自將投與NeoTCR產品的患者之自體細胞。術語「NeoTCR細胞」、「NeoTCR-P1 T細胞」及「NeoTCR-P1細胞」在本文中可互換使用。
「NeoTCR產品」如本文所用意指包含一或多個NeoTCR細胞之醫藥調配物。NeoTCR產品由自體精密基因組工程化CD8+及/或CD4+ T細胞組成。使用靶向DNA介導之非病毒精密基因組工程化方法，消除內源TCR之表現且藉由從靶向腫瘤排斥新抗原決定基之周邊CD8+ T細胞分離的患者特異性NeoTCR置換。在某些實施例中，所得工程化CD8+或CD4+ T細胞於其天然序列、天然表現量及天然TCR功能之表面上表現NeoTCRs。NeoTCR外部結合域及細胞質訊號傳導域之序列從從天然CD8+ T細胞分離的TCR未修飾。NeoTCR基因表現調節由定位在NeoTCR基因盒整合至基因組中的上游的天然內源TCR啟動子驅動。透過此方法，在未刺激及抗原活化T細胞狀態中觀察到天然量的NeoTCR表現。
針對於各患者製造的NeoTCR產品代表限定劑量之自體CD8+及/或CD4+ T細胞，其為精密基因組，該精密基因組經工程化以表現從該相同患者之周邊血液個別地分離的neoE-特異性CD8+ T細胞選殖之單一neoE-特異性TCR。
「NeoTCR病毒產品」如本文所用具有NeoTCR產品之相同定義，除了基因組工程化使用病毒介導之方法進行。
「醫藥調配物」係指一種製劑，其呈此種使得允許其中所含活性成分之生物活性有效之形式，且其不含對將投與該調配物的個體具有不可接受之毒性之另外組分。為清楚起見，在用於NeoTCR產品中之量下之DMSO並不被認為具有不可接受之毒性。
出於治療之目的，「個體(subject)」、「患者(patient)」或「個體(individual)」係指歸類為哺乳動物之任何動物，包括人類、家畜及農場動物、及動物園、競技類或寵物動物，諸如狗、馬、貓、牛等。較佳地，該哺乳動物為人類。
「TCR」如本文所用意指T細胞受體。
術語「內源性」如本文所用係指通常在細胞或組織中表現的核酸分子或多肽。
術語「外源」如本文所用係指非內源性存在於細胞中之核酸分子或多肽。因此，術語「外源」將涵蓋表現於細胞中之任何重組核酸分子或多肽，諸如外來、異源及過度表現之核酸分子及多肽。「外源」核酸意指不存在於天然野生型細胞中之核酸；例如，外源核酸可因序列、位置(position/location)或二者而與內源對應物不同。為了清楚起見，外源核酸可具有相對於其天然內源對應物相同或不同之序列；其可藉由基因工程化引入至細胞本身或其原細胞(progenitor)中，且可視需要連接至替代控制序列，諸如非天然啟動子或分泌序列。
「年輕」或「較年輕」或「年輕T細胞」在其提及T細胞時意指記憶幹細胞(Tmsc)及中央記憶細胞(Tcm)。此等細胞於特異性活化後具有T細胞增殖且具有多次細胞分裂潛能。其亦能夠在再輸注之後植入、在暴露於其同源抗原後迅速分化成效應T細胞且靶向及殺死腫瘤細胞、以及持續進行癌症監視及控制。
後來在T細胞分化及成熟之連續體中的是兩種抗原經歷之子型：效應記憶T細胞(Tem)及最終分化效應T細胞(Teff)。
2. 人工抗原呈現細胞本發明提供用於製備及製作過繼性細胞療法之人工抗原呈現細胞。本發明之人工抗原呈現細胞(aAPCs)設計為能夠展現可用於活化CD4及CD8 T細胞之不同試劑之脂質囊泡或脂質奈米粒子。用於設計aAPCs之關鍵參數及考量提供於表1中。 表1 用於aAPCs之設計之考量
關鍵參數 經活化生物 APC 微脂體 aAPC
訊號1：識別 pMHC comPACT、四聚物、抗CD3 mAb、其他刺激配體
訊號2：共刺激 B7.1及B7.2 可溶性及不溶性提示抗CD28 mAb、41BBL、OX40L、ICAM之呈現
訊號3：可分泌之訊號 IL-2、趨化介素CCL3、CCL4 持續且局部化之釋放
免疫突觸 膜-膜 膜-膜
大小 直徑10至20 μm 直徑30 nm至10 μM
形狀 長薄片樣突部 球形、管狀、保形
使用aAPCs之一個關鍵目標係用移動配體建立活化劑。固定配體(例如珠粒結合或板塗佈試劑)對於T細胞活化平臺而言並不理想。相反地，長程膜擴散性允許配體之天然運動，此對於模擬天然T細胞活化及與T細胞更天然相互作用係理想的。鑑於此，有必要用各種不同脂質組合物(亦即不同脂質組合及組合之不同配比率)實驗以便尋找具有適當程度之流動性(擴散性)以允許製作細胞療法之最佳T細胞活化之組合物。
aAPCs之設計之一個關鍵考量係T細胞簇聚影響訊號轉導及活化之已知事實。該目標係設計可提供膜流動性以可在表面上實現蛋白質重排之aAPCs。
αCD3/αCD28 aAPC之aAPC合成工作流程之一個實例提供於 圖 1中。如圖所示，用於該aAPC中之兩種脂質為POPC及POPE，其中該POPE係經生物素化以用於連接抗CD3及抗CD28抗體或其他刺激配體。
aAPCs以小規模進行概念驗證(Proof of concept)實驗。此等概念驗證實驗：1)確認本發明之aAPCs對T細胞無毒，2)限定配體展現之可接受密度之範圍，3)限定劑量範圍(aAPC:細胞)，及4)確認刺激配體可經由生物素-鏈黴親和素-生物素鍵聯展現於APCs上。微脂體不會不利影響T細胞增殖及存活率。微脂體與T細胞之比率可從25:1至10,000:1變化。更佳地，該比率為100:1、250:1、500:1、1000:1、2000:1、3000:1、4000:1或5000:1。aAPC與T細胞之比率及aAPCs之平均直徑可成反比地變化以維持相同效應，亦即可以比較小微脂體低的劑量提供較大微脂體以提供相同量之T活化。
在某些實施案中，可能需要呈現多於一個刺激配體以誘導T細胞之活化。該複數個刺激配體可以偶聯於單一類型之aAPC (例如同時展現αCD3及αCD28之aAPC)上或非偶聯於不同類型之aAPC(例如一個aAPC僅展現αCD3及第二aAPC僅展現αCD28)上呈現。類似地，任何特定刺激配體可相對於同時展現的刺激配體以相等濃度或不同濃度展現。
抗原呈現細胞(APCs)在天然生物環境中提供活化T細胞之訊號。APCs使用三(3)個主要類型之訊號導引初始T細胞：1) pMHC:TCR、2)經由細胞表面蛋白質共刺激、及3)藉由細胞介素決定T細胞命運。
2.1. 微脂體。除了本文列舉的方法及程序之外，本發明中亦可採用熟練技術者例行用於製備微脂體之各種方法。例如，可使用描述於Chen等人，Blood 115:4778-86，2010；及Liposome Technology，第1卷，第2版(Gregory Gregoriadis (CRC Press，Boca Raton、Ann Arbor、London、Tokyo)，第4章，pp 67-80，第10章，第167至184頁，及第17章，第261至276頁(1993))中之方法。更特定地，適宜方法包括(但不限於)超音波處理法(sonication method)、乙醇注入法、法式壓力法(French press method)、醚注入法、膽酸法、鈣融合法、凍乾法及反相蒸發法。微脂體之結構並無特定限制，且可為任何微脂體，諸如單層及多層。
本文所揭示的所揭示微脂體通常包括可在生理pH下為中性、陰離子或陽離子的兩種或更多種脂質中之一者或其組合。該等囊泡包括任何適宜脂質或脂質之組合或以其他方式可由其形成。同樣地，結合物可包含任何適宜脂質或以其他方式由任何適宜脂質形成。在一些實施例中，兩種、三種、四種、五種或更多種不同脂質結合物之組合(例如不同脂質及相同靶向部分、不同脂質及不同靶向部分、或相同脂質及不同靶向部分)可插入或以其他方式添加至相同囊泡。
用於進行本發明之脂質或脂質形成材料包括用於微脂體或囊泡形成之所有已知材料。有用材料之實例包括磷脂分子及膽固醇之組合。實例磷脂分子包括磷脂酸(磷脂酸酯) (PA)、磷脂醯乙醇胺(腦磷脂) (PE)、磷脂醯膽鹼(卵磷脂) (PC)、磷脂醯絲胺酸(PS)、磷酸肌醇、磷脂醯肌醇(PI)、磷脂醯肌醇磷酸酯(PIP)、磷脂醯肌醇二磷酸酯(PIP2)、磷脂醯肌醇三磷酸酯(PIP3)、神經醯胺磷酸膽鹼(鞘磷脂) (SPH)、神經醯胺磷醯乙醇胺(鞘磷脂) (Cer-PE)。特佳為包含18:1棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)之組合。
微脂體組合物可使用所述方法來產生，具有30 nm至2000 nm (2 μm)，例如30 nm、40 nm、50 nm、60 nm、80 nm、100 nm、150 nm、200 nm、250 nm、300 nm、350 nm、400 nm、450 nm、500 nm、550 nm、600 nm、650 nm、700 nm、750 nm、800 nm、850 nm、900 nm、950 nm、1 μm、1.2 μm、1.5 μm及2 μm之平均直徑、及5至50%、10至30%或15至20%之大小分佈。較佳地，微脂體組合物具有介於50 nm與600 nm之間，更佳介於100 nm與400 nm之間的平均直徑。此處描述的方法可用於提供用於在製作細胞療法期間活化T細胞之囊泡。
2.2. 功能化脂質。根據本發明之一個實施例，形成aAPC之一部分脂質包含結合至或以其他方式直接或間接連接至脂質之功能元件。該功能元件可為反應性部分、小分子、蛋白質或多肽、碳水化合物、核酸或其組合。在較佳實施例中，該等功能元件中之至少一者為靶向部分，其相對於脂質囊泡增加功能化脂質囊泡連接、結合或締合至標靶細胞、組織及/或微環境。在某些實施案中，脂質形成之一部分係用反應性配體功能化之脂質。合適的反應性部分、反應配體及含有的功能化脂質之具體實例列於表2中。
表2：示例性功能化脂質
反應性部分 反應部分 實例功能化脂質
生物素 抗生物素蛋白、鏈黴親和素 1-油醯基-2-(12-生物素基-(胺基十二醯基))-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:1至12:0生物素PE)； 1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(生物素基)、16:0生物素基PE 1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(生物素基)、18: 1生物素基PE 1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(cap生物素基)、18:1生物素基Cap PE； 1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(cap生物素基)、16:0生物素基Cap PE
N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)、磺基-NHS 胺 NHS棕櫚酸N-羥基琥珀醯亞胺酯
氮基三乙酸(NTA)-鎳 組胺酸、His標籤 1,2-二油醯基-sn-甘油-3-[(N-(5-胺基-1-羧基苯基)亞胺基二乙酸)琥珀醯基]、18:1 DGS-NTA (Ni)
馬來醯亞胺，例如 硫醇，例如硫醇化抗體 1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[4-(對馬來醯亞胺基甲基) 環己烷-甲醯胺] (鈉鹽)、16:0 PE MCC； 1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[4-(對馬來醯亞胺基甲基) 環己烷-甲醯胺] (鈉鹽)、18: 1 PE MCC； 1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(N-胺基乙基)、18:1胺基乙基PC； 1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[4-(對馬來醯亞胺基苯基)丁醯胺] (鈉鹽)、18:1 MPB PE 1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[4-(對馬來醯亞胺基苯基) 丁醯胺] (鈉鹽)、16:0 MPB PE
N-苄基鳥嘌呤 SNAP-標籤 1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-苄基鳥嘌呤、18:1 PE-苄基鳥嘌呤 1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[苄基鳥嘌呤(聚乙二醇)-2000]、18: 1 PE-PEG2000-苄基鳥嘌呤
較佳地，該反應性配體係選自生物素、N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)酯、磺基-NHS酯、氮基三乙酸(NTA)-鎳、胺、馬來醯亞胺、二硫基吡啶、吡啶基二硫化物、吡啶基二硫基丙酸酯及N-苄基鳥嘌呤。硫氫基(亦稱為硫醇)在蛋白質中存在於半胱胺酸(Cys，C)胺基酸之側鏈中。硫氫基反應性化學基團包括鹵基乙醯基、馬來醯亞胺、氮丙啶、丙烯醯基、芳基化劑、乙烯基碸、吡啶基二硫化物、TNB-硫醇及二硫化物還原劑。
為硫醚結合所提供的不同脂質含有馬來醯亞胺、芳族馬來醯亞胺，諸如N-[4-(對馬來醯亞胺基苯基)-丁醯基] (MPB)或4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸酯(MCC)基。含有脂族環己烷環之MCC之馬來醯亞胺官能基針對於在水性反應環境中之水解更穩定，而不是MPB之芳族苯基。使蛋白質或多肽結合至功能化脂質可根據此項技術中熟知的方法來進行。參見，例如，Chemistry of protein conjugation and cross-linking，Shan Wong，CRC Press (Boca Raton, Fla.，1991)；及Bioconjugate techniques，第2版，Greg Τ.Flermanson，Academic Press (London，UK，2008)。或者，刺激配體(諸如抗CD3及/或抗CD28)可經由包括生物素-鏈黴親和素相互作用之非共價手段連接。
3. T 細胞活化在用於製造用於細胞療法產品之T細胞之體外場景中，需要刺激T細胞以便其擴增。細胞擴增對於細胞療法開發及製作而言至關重要，因為T細胞需要能夠在體外培養中增殖以便產生具有足夠數目之細胞以對患者治療上有益之細胞產品。更具體而言，T細胞活化決定體外細胞增殖之程度(亦即細胞產品之產量)及T細胞分化(亦即細胞產品之品質)。使用可絲裂原驅動的抗原獨立刺激體外刺激T細胞。此種刺激可包括兩個主要訊號：1)訊號1，抗CD3劑將結合至TCR複合物之CD3鏈，及2)訊號2，抗CD28劑將結合至T細胞上的CD28。
用於多株T細胞擴增之市售產品包括超順磁顆粒(例如TransAct、Dynabeads、ProMag Bind0IT、MagMax及Spherotech)、經包埋或呈現於表面上之聚合物複合物(例如Cloudz)及可溶性四聚物抗體複合物(例如ImmunoCult)。此等市售產品之兩大主要限制係：1) T細胞與活化產物之間的相互作用係非天然的，及2)活化產物之珠粒/惰性粒子可導致慢性活化，此導致T細胞之過度刺激。
市售產品之另外問題包括：1)其無法調節以驅動個別細胞療法之所需T細胞特性，2)其在組成及活性上常常因批次而異，3)其常常無法提供在治療相關細胞數量下製造細胞產品所需的活化，及4)其非常昂貴。
4. NeoTCR 產品在一些實施例中，使用描述於PCT/US2020/17887及PCT/US2019/ 025415 (其以全文併入本中)中之基因編輯技術及NeoTCR分離技術，在來自患有癌症的相同患者的自體CD8+及CD4+ T細胞中藉由經工程化以表現NeoTCR之精密基因組來選殖NeoTCRs。換言之，在癌症患者中識別為腫瘤特異性的NeoTCRs，然後選殖此類NeoTCRs，然後將經選殖之NeoTCRs插入至癌症患者的自身T細胞中。表現NeoTCR的T細胞然後以保留「年輕」T細胞表型之方式擴增，產生其中大多數T細胞展現T記憶幹細胞及T中心記憶表型之NeoTCR-P1產物(亦即NeoTCR產品)。
描述此等「年輕」或「較年輕」或較低分化之T細胞表型以賦予改良之植入潛力及輸注後長時間之持續性。因此，由「年輕」T細胞表型顯著組成之NeoTCR產品之投與具有透過改良之植入潛力、延長之輸入後持續性及快速分化成效應T細胞以根除整體身體中之腫瘤細胞使患有癌症的患者受益之潛力。
利用用來自患有癌症的患者之T細胞製造的NeoTCR產品進行離體作用機制研究。觀測到可相比擬基因編輯效率及功能活性(以T細胞殺死活性、增殖及細胞介素產生之抗原特異性測定)，證實本文所述的製程成功地產生具有來自患有癌症的患者之T細胞作為起始材料之產品。
在某些實施例中，NeoTCR產品製程涉及結合至導引RNA序列之CRISPR-Cas9核酸酶之雙重核糖核蛋白物種之電穿孔，其中各物種靶向基因組TCRα及基因組TCRβ基因座。靶向Cas9核酸酶至各基因組基因座之特異性先前已在文獻中描述為是高度特異性的。分別使用COSMID及GUIDE-seq，在體外及電腦模擬分析中進行NeoTCR產品之全面測試以調查可能的脫靶基因組切割位點。藉由深定序判定來自健康供體之多種NeoTCR產品或可相比擬細胞產品之候選脫靶位點之裂解，支持所選核酸酶為高度特異性之公開證據。
已評定精密基因組工程化製程之其他態樣之安全性。在藉由靶向基因座擴增(TLA)或標準FISH細胞遺傳學評定多種NeoTCR產品中未發現精密基因組工程化後基因組不穩定之證據。未偵測到NeoTCR序列之基因組中任何地方的脫靶整合。在細胞產品中未發現殘餘Cas9之證據。
NeoTCR產品及精密基因組工程化製程之全面評估指示NeoTCR產品將在輸注回至患者後具有良好耐受性。
本文所述的基因組工程化方法實現用於針對於患有實體及液體腫瘤的患者之個人化過繼性細胞療法之定製NeoTCR細胞(亦即NeoTCR產品)之高效產生。此外，該工程化方法並不限於在T細胞中之使用且亦已成功應用於其他初級細胞類型，包括自然殺手及造血幹細胞。
5. 示例性實施例在某些實施例中，本發明提供一種包含微脂體之人工抗原呈現細胞(aAPC)，該微脂體包含磷脂及展現於該微脂體的外表面上之刺激配體。
在本文所揭示的aAPCs之某些實施例中，該刺激配體係選自由CD3促效劑、CD28促效劑、主要組織相容性複合物(MHC)、肽-MHC複合物、多聚化新抗原決定基-HLA複合物、CD58、CD86、CD83、4-1BBL、OX40L、ICOSL (B7H2、B7RP1)、CD40L及LFA-1組成之群。在本文所揭示的aAPCs之某些實施例中，該微脂體包含磷脂及功能化脂質之混合物。在本文所揭示的aAPCs之某些實施例中，該混合物中磷脂與功能化脂質之比率係介於10,000:1與25:1之間。在本文所揭示的aAPCs之某些實施例中，該比率係介於1000:1與50:1之間。在本文所揭示的aAPCs之某些實施例中，該比率係介於100:1與50:1之間。
在本文所揭示的aAPCs之某些實施例中，該磷脂係選自由以下組成之群：磷脂酸(磷脂酸酯) (PA)、磷脂醯乙醇胺(腦磷脂) (PE)、磷脂醯膽鹼(卵磷脂) (PC)、磷脂醯絲胺酸(PS)、磷酸肌醇、磷脂醯肌醇(PI)、磷脂醯肌醇磷酸酯(PIP)、磷脂醯肌醇二磷酸酯(PIP2)、磷脂醯肌醇三磷酸酯(PIP3)、神經醯胺磷酸膽鹼(鞘磷脂) (SPH)、神經醯胺磷醯乙醇胺(鞘磷脂) (Cer-PE)及其組合。在本文所揭示的aAPCs之某些實施例中，該微脂體包含18:1棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)及/或1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)。在本文所揭示的aAPCs之某些實施例中，該功能化脂質包含生物素部分、N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分、磺基-NHS部分、氮基三乙酸(NTA)-鎳、馬來醯亞胺部分或N-苄基鳥嘌呤。在本文所揭示的aAPCs之某些實施例中，該功能化脂質為1-油醯基-2-(12-生物素基-(胺基十二醯基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:1至12:0生物素-PE)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(生物素基) (16:0生物素-PE)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(生物素基) (18:1生物素-PE)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(cap生物素基) (18:1生物素-Cap-PE)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(cap生物素基) (16:0生物素-Cap-PE)、生物素-磷脂醯乙醇胺(生物素-PE)、或生物素-1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(生物素-POPE)。
在本文所揭示的aAPCs之某些實施例中，該功能化脂質為18:1生物素-Cap-PE、16:0生物素-Cap-PE或生物素-POPE。在本文所揭示的aAPCs之某些實施例中，該功能化脂質為生物素-POPE。
在本文所揭示的aAPCs之某些實施例中，該刺激配體係經由功能化脂質連接至微脂體。在本文所揭示的aAPCs之某些實施例中，該刺激配體為CD3促效劑、CD28促效劑或其組合。在本文所揭示的aAPCs之某些實施例中，該CD3促效劑為抗CD3抗體。在本文所揭示的aAPCs之某些實施例中，該CD28促效劑為抗CD28抗體。在本文所揭示的aAPCs之某些實施例中，該抗CD3抗體及/或抗CD28抗體為低內毒素無疊氮化物(LEAF)抗體。
在本文所揭示的aAPCs之某些實施例中，該微脂體具有介於30 nm與2 μm之間的直徑。在本文所揭示的aAPCs之某些實施例中，該微脂體具有介於50 nm與600 nm之間的直徑。在本文所揭示的aAPCs之某些實施例中，該微脂體具有介於100 nm與400 nm之間的直徑。
在某些實施例中，本發明提供本文所揭示的aAPCs群體。在本文所揭示的aAPCs群體之某些實施例中，該群體之微脂體具有介於30 nm與2 μm之間的平均直徑及5%至50%之大小分佈。在本文所揭示的aAPCs群體之某些實施例中，該平均直徑介於50 nm與600 nm之間。在本文所揭示的aAPCs群體之某些實施例中，該平均直徑介於100 nm與400 nm之間。
在某些實施例中，本發明提供一種包含T細胞群體及人工抗原呈現細胞(aAPCs)群體之組合物，其中各aAPC包含微脂體，其包含磷脂及展現於微脂體的外表面上之刺激配體。在本文所揭示的組合物之某些實施例中，該微脂體包含磷脂及功能化脂質之混合物。
在本文所揭示的組合物之某些實施例中，該混合物中磷脂與功能化脂質之比率係介於10,000:1與25:1之間。在本文所揭示的組合物之某些實施例中，該比率係介於1000:1與50:1之間。在本文所揭示的組合物之某些實施例中，該比率係介於100:1與50:1之間。
在本文所揭示的組合物之某些實施例中，該磷脂係選自由以下組成之群：磷脂酸(磷脂酸酯) (PA)、磷脂醯乙醇胺(腦磷脂) (PE)、磷脂醯膽鹼(卵磷脂) (PC)、磷脂醯絲胺酸(PS)、磷酸肌醇、磷脂醯肌醇(PI)、磷脂醯肌醇磷酸酯(PIP)、磷脂醯肌醇二磷酸酯(PIP2)、磷脂醯肌醇三磷酸酯(PIP3)、神經醯胺磷酸膽鹼(鞘磷脂) (SPH)、神經醯胺磷醯乙醇胺(鞘磷脂) (Cer-PE)及其組合。在本文所揭示的組合物之某些實施例中，該微脂體包含18:1棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)及/或1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)。在本文所揭示的組合物之某些實施例中，該功能化脂質包含生物素部分、N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分、磺基-NHS部分、氮基三乙酸(NTA)-鎳、馬來醯亞胺部分或N-苄基鳥嘌呤。在本文所揭示的组合物之某些實施例中，該功能化脂質為1-油醯基-2-(12-生物素基-(胺基十二醯基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:1至12:0生物素-PE)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(生物素基) (16:0生物素-PE)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(生物素基) (18:1生物素-PE)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(cap生物素基) (18:1生物素-Cap-PE)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(cap生物素基) (16:0生物素-Cap-PE)、生物素-磷脂醯乙醇胺(生物素-PE)、或生物素-1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(生物素-POPE)。在本文所揭示的組合物之某些實施例中，該功能化脂質為18:1生物素-Cap-PE、16:0生物素-Cap-PE或生物素-POPE。在本文揭示的組合物之某些實施例中，該功能化脂質為生物素-POPE。
在本文所揭示的組合物之某些實施例中，該刺激配體係經由功能化脂質連接至微脂體。在本文所揭示的組合物之某些實施例中，該刺激配體係選自由CD3促效劑、CD28促效劑、主要組織相容性複合物(MHC)、肽-MHC複合物、多聚化新抗原決定基-HLA複合物、CD58、CD86、CD83、4-1BBL、OX40L、ICOSL (B7H2、B7RP1)、CD40L及LFA-1組成之群。在本文所揭示的組合物之某些實施例中，該刺激配體為CD3促效劑、CD28促效劑或其組合。在本文所揭示的組合物之某些實施例中，該CD3促效劑為抗CD3抗體。在本文所揭示的組合物之某些實施例中，該CD28促效劑為抗CD28抗體。在本文所揭示的組合物之某些實施例中，該抗CD3抗體及/或抗CD28抗體為低內毒素無疊氮化物(LEAF)抗體。
在本文所揭示的組合物之某些實施例中，該微脂體具有介於30 nm與2 μm之間的直徑。在本文所揭示的組合物之某些實施例中，該微脂體具有介於50 nm與600 nm之間的直徑。在本文所揭示的組合物之某些實施例中，該微脂體具有介於100 nm與400 nm之間的直徑。
在本文所揭示的組合物之某些實施例中，該組合物進一步包含細胞生長介質。在本文所揭示的組合物之某些實施例中，該組合物進一步包含介白素7 (IL-7)及介白素15 (IL-15)。在本文所揭示的組合物之某些實施例中，該T細胞群體包含至少一個NeoTCR細胞。
在某些實施例中，本發明提供一種包含本文所揭示的T細胞群體及人工抗原呈現細胞(aAPCs)群體之組合物。
在某些實施例中，本發明提供一種活化T細胞之方法，其包括使T細胞暴露於一或多個人工抗原呈現細胞(aAPCs)，其中各aAPC包含微脂體，其包含有磷脂及展現於該微脂體的外表面上之刺激配體。
在本文所揭示的方法之某些實施例中，該磷脂係選自由以下組成之群：磷脂酸(磷脂酸酯) (PA)、磷脂醯乙醇胺(腦磷脂) (PE)、磷脂醯膽鹼(卵磷脂) (PC)、磷脂醯絲胺酸(PS)、磷酸肌醇、磷脂醯肌醇(PI)、磷脂醯肌醇磷酸酯(PIP)、磷脂醯肌醇二磷酸酯(PIP2)、磷脂醯肌醇三磷酸酯(PIP3)、神經醯胺磷酸膽鹼(鞘磷脂) (SPH)、神經醯胺磷醯乙醇胺(鞘磷脂) (Cer-PE)及其組合。在本文所揭示的方法之某些實施例中，該微脂體包含18:1棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)及/或1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)。
在本文所揭示的方法之某些實施例中，該刺激配體係選自由CD3促效劑、CD28促效劑、主要組織相容性複合物(MHC)、肽-MHC複合物、多聚化新抗原決定基-HLA複合物、CD58、CD86、CD83、4-1BBL、OX40L、ICOSL (B7H2、B7RP1)及CD40L組成之群。在本文所揭示的方法之某些實施例中，該刺激配體為CD3促效劑、CD28促效劑或其組合。在本文所揭示的方法之某些實施例中，該CD3促效劑為抗CD3抗體。在本文所揭示的方法之某些實施例中，該CD28促效劑為抗CD28抗體。在本文所揭示的方法之某些實施例中，該抗CD3抗體及/或抗CD28抗體為低內毒素無疊氮化物(LEAF)抗體。
在本文所揭示的方法之某些實施例中，該方法進一步包括混合T細胞群體與aAPCs群體。在本文所揭示的方法之某些實施例中，該aAPCs群體之微脂體具有介於30 nm與2 μm之間的平均直徑及5至50%之大小分佈。在本文所揭示的方法之某些實施例中，該平均直徑介於30 nm與400 nm之間。在本文所揭示的方法之某些實施例中，該平均直徑為約200 nm。在本文所揭示的方法之某些實施例中，該混合物包含介於5:1 (aAPCs:T細胞)與5000:1之間的比率的aAPCs及T細胞。在本文所揭示的方法之某些實施例中，該T細胞為NeoTCR細胞。
在某些實施例中，本發明提供一種製造T細胞療法產品之方法，其包括使T細胞群體暴露於人工抗原呈現細胞(aAPCs)群體，其中各aAPC包含微脂體，其包含有磷脂及展現於該微脂體的外表面上之刺激配體。
在本文所揭示方法之某些實施例中，該方法進一步包括基因編輯T細胞群體之至少一個T細胞。在本文所揭示方法之某些實施例中，該基因編輯包括該T細胞群體利用結合至導引RNA序列之CRISPR-Cas9核酸酶之雙重核糖核蛋白物種電穿孔，其中各物種靶向內源TCRα基因座及/或內源TCRβ基因座。在本文所揭示方法之某些實施例中，該暴露發生於基因編輯之前。在本文所揭示方法之某些實施例中，該基因編輯係非病毒的。在本文所揭示方法之某些實施例中，該T細胞群體包含一或多個NeoTCR細胞。
在某些實施例中，本發明提供一種利用T細胞療法治療有需要患者之方法。在本文所揭示方法之某些實施例中，該T細胞療法係藉由本文所揭示的製造方法獲得。
實例以下是本發明之方法及組合物之實例。應理解，由以上所提供的一般描述，可實踐各種其他實施例。
實例 1. 可用活化劑之評估。比較六種活化劑用於製造NeoTCR產品之適合性。該等活化劑包括四種市售產品：(a) TRANSACT.TM (膠態聚合物奈米基質結合至人類化CD3及CD28促效劑，Miltenyi Biotec)、(b) CLOUDZ.TM (由基於藻酸鹽之水凝膠組成、用完全人類化抗CD3及抗CD28抗體衍化之12至100 μm直徑微球體，R&D Systems)、(c) IMMUNOCULT.TM (抗人類CD3單特異性抗體複合物及抗人類CD28單特異性抗體複合物，Stemcell Technologies)及(d) ImmunoCult+CD2。此外，將T細胞暴露於comPACT四聚物(鏈黴親和素核心結合至四種生物素化comPACT蛋白質)及comPACT-聚葡萄糖結合物(鏈黴親和素塗覆聚葡萄糖結合至生物素化comPACT蛋白質)，更詳細地描述於美國專利第10,875,905號中，其全文以引用之方式併入本文中)。TransAct及Cloudz亦在IL2存在及不存在下進行測試以確定IL2是否改良T細胞活化且導致改良之細胞增殖及生理學。
經編輯之T細胞如先前在美國專利第10,584,357號中所述製備。簡言之，CD8及CD4陽性T細胞富集自周邊血液單核細胞(PBMCs)，其藉由血球分離術從血液分離，藉由使用磁珠(Miltenyi)遵循製造商方案陽性選擇。富集的T細胞用測試試劑刺激且用培養基(TexMACS，含有各12.5 ng/mL IL-7及IL-15之3%人類血清)培養13天。如製造商所指示使用TransAct、Cloudz及ImmunoCult。在第2天，細胞利用Neo-TCR同源重組模板進行電穿孔以進行CRISPR/Cas9介導插入編碼NeoTCR之基因於TRAC基因座中。將T細胞培養於培養基中直至第13天，在該時間測定基因編輯效率(表3)。
表3：可用活化劑之編輯效率
aAPC 活細胞%
NeoTCR+ TCR基因剔除 野生型
TransAct 14.7 23.7 61.6
Cloudz 13.9 54.1 30.9
聚葡萄糖 7.99 7.12 84.7
四聚物 4.14 4.61 91.2
ImmunoCult 15.7 28.4 56.0
ImmunoCult + IL2 7.69 26.1 66.3
雖然Cloudz及ImmunoCult活化確實促進基因編輯，但基因編輯效率係特異於且偏斜於CD8 T細胞(表4)。
表4：CD4+及CD8+ T細胞之活化
aAPC 總的經編輯細胞 活細胞%
CD4 CD8 CD4 CD8
TransAct 1.90 x 10 7 2.86 x 10 7 52.4 47.6
TransAct + IL-2 n.d. n.d. 44.4 55.6
Cloudz 3.05 x 10 6 6.93 x 10 7 6.54 93.5
Cloudz + IL-2 n.d. n.d. 5.59 94.4
聚葡萄糖 1.09 x 10 7 1.32 x 10 6 85.0 15.0
四聚物 5.74 x 10 6 1.26 x 10 6 80.7 19.3
ImmunoCult 4.05 x 10 6 3.20 x 10 7 29.5 70.5
ImmunoCult + CD2 2.94 x 10 5 1.69 x 10 6 35.8 64.2
因此，Cloudz及ImmunoCult對於希望CD4及CD8 T細胞之有效基因編輯之細胞療法而言不是良好選項。此外，Cloudz係直徑約12至100 μm之聚合物且在電穿孔之前移除此種聚合物(以便促進有效基因編輯)及/或從最終產物(設計成輸注至患者中之最終細胞療法產品較佳已移除此種聚合物)移除係時間及資源密集型的非瑣事任務。
實例 2. POPC 微脂體之 T 細胞耐受性微脂體設計成模擬抗原呈現細胞(APC)。微脂體用作類似於活膜之曲率及剛度之曲率及剛度之流體膜平臺及微脂體上抗CD3及抗CD28抗體之表面展現提供包含T-細胞受體CD3複合物之受體及初始細胞上的共刺激受體CD28之訊號。
描述於此實例中之實驗進一步檢查富集的初級CD4/CD8細胞對各種濃度之18:1棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)微脂體(以10:1、100:1或1000:1微脂體:細胞之比率)之耐受性十三天。在氯仿中溶解儲備脂質。在硼矽酸鹽小瓶中，脂質以體積混合於過量氯仿中以達成所需脂質組合物。使用惰性氣體，蒸發掉散裝氯仿溶劑以產生薄脂質膜。脂質膜中之任何殘餘氯仿在真空下在乾燥器中進一步驅除過夜。將經乾燥脂質在無添加劑的室溫培養基中水合至少20分鐘。微脂體形成係藉由(1)透過已知孔徑之軌跡蝕刻膜擠出或(2)超音波處理來達成。
用培養基培養從血液分離的周邊血液單核細胞(PBMCs)。第二天，藉由使用磁珠(Miltenyi)遵循製造商方案積極選擇富集CD8及CD4陽性T細胞及24孔G-Rex® (透氣快速擴增)板的十六個孔經接種7.15 x 106個CD4及CD8細胞且在第0天及第8天提供新鮮培養基(TexMACS培養基、3% hABs、IL-7、IL-15)及TransAct。在第2天及第8天提供微脂體。在第0天、第2天、第8天及第13天經由吖啶橙及DAPI染色利用商業細胞計數器來評估T細胞之存活率及計數。
表5：對微脂體濃度之耐受性[Exp20-146]
微脂體： 細胞 存活率% 總的活細胞
第2天 第8天 第13天 第2天 第8天 第13天
10:1 94.7 96.3 96.7 4.92 x 10 6 5.14 x 10 7 7.47 x 10 7
100:1 94.4 95.7 96.1 4.90 x10 6 4.25 x 10 7 7.10 x 10 7
1000:1 94.7 96.1 96.4 4.60 x10 6 4.76 x 10 7 7.61 x 10 7
對照 95.1 96.3 96.5 5.13 x10 6 4.11 x 10 7 7.63 x 10 7
如表5中所顯示，在高達1000個aAPCs/細胞之劑量下，富集的經TransAct活化的CD4s/CD8s之存活率及增殖能力均不受空白aAPCs的存在影響。
實例 3. CD3 及 CD28 促效劑之滴定。為了檢查訊號傳導分子抗CD3及抗CD28之表面密度之影響，如以上所述使用具有0%、0.1%、1%、2%及4%生物素CAP-PE之POPC來製備800 nm直徑微脂體，以及包括空白對照(根據製造商說明書之TransAct)。αCD3及αCD28抗體如圖1中所繪示結合至微脂體之表面。簡言之，將對CD3或CD28具有特異性之生物素結合抗體(均從Miltenyi獲得)與鏈黴親和素以3:3:2 αCD3:αCD28:鏈黴親和素(有效的是每分子鏈黴親和素3:1抗體分子)之比率混合以形成抗體-鏈黴親和素三聚物。然後以過量將此等三聚物添加至含有生物素-CAP-PE之微脂體以產生展現刺激配體、αCD3及αCD28之aAPCs。所有條件均一式二份運行。
在第2天aAPC條件之存活率隨著配體展現增加而傾向於從97%略微下降至94%，但全部均等於或高於TA對照細胞之存活率且與從TA對照預期之存活率一致。從第0天至第2天，所有aAPC條件均具有細胞生長；TA對照在細胞數上略有減少。增加刺激配體呈現增加CD69之表現且減少Ki67之表現(表6)。TA對照具有與0.1% PE條件相似的CD69及Ki67量。所有條件及TA對照具有實質上相同的CD25表現量。
表6：對αCD3/αCD28濃度產生反應之活化及增殖
   表現CD25之細胞% 表現CD69之細胞% 表現 Ki67之細胞%
0.1%生物素CAP PE 93.8 32.4 21.7
1.0%生物素CAP PE 89.7 46.8 9.96
2.0%生物素CAP PE 92.7 65.8 5.06
4.0%生物素CAP PE 89.4 67.1 2.02
陽性對照(TA) 90.6 22.5 14.3
在第8天，所有條件(包括TA對照)均具有不良存活率及不良細胞生長。存活率隨著刺激配體呈現增加而傾向於下降。與Cloudz及Immunocult不同，當用本發明之微脂體活化時，CD4+與CD8+細胞之間在編輯效率上無甚差異(資料未顯示)。FSC與SSC中之淋巴細胞群體流量非常小，且於此等細胞上沒有TCR訊號，因此此很可能係假象(artifact)。在第8天，存活率及細胞計數與Ki67表現正相關且與CD69表現負相關。
重複該實驗且於擴增至第13天的細胞進行更廣泛aAPC給藥策略之評估。所有aAPCs之活化與利用陽性對照TransAct所達成大致相似。(表7)
表7：在不同配體密度下之存活率及生長
PE生物素% 存活率% 總的活細胞 擴增倍率
第2天 第8天 第13天 第2天 第8天 第13天
4% 94.4 95.5 94.8 6.55 x 10 6 1.53 x 10 7 7.57 x 10 7 15.13
2% 94.1 96.7 95.1 6.92 x 10 6 3.21 x 10 7 9.59 x 10 7 19.17
1% 94.4 97.1 94.8 7.17 x 10 6 3.15 x 10 7 8.56 x 10 7 17.12
0.1% 96.1 96.4 96.2 6.61 x 10 6 2.26 x 10 7 7.14 x 10 7 14.28
對照 97.1 95.8 95.6 4.61 x 10 6 1.79 x 10 7 7.36 x 10 7 14.72
測定在2% POPE aAPC條件下擴增倍率最大。進行2% POPE aAPC條件之另外訊問以測定對基因編輯之效應。2% PE aAPC條件顯示在第13天之50%編輯及最大經編輯細胞數。
亦檢查配體密度對細胞表型之影響。如圖4中所顯示，0.1至2% POPE顯示增加之Tmsc%及4% POPE係與TransAct可相比率擬的Tmsc%。此外，與TransAct活化的細胞相比，1至4% POPE顯示較低效應細胞，亦即「更老」T細胞。此外，遞增之配體密度與T細胞群體之增加之CD4分數相關且因此CD4/CD8 T細胞之分佈可藉由調整抗CD3:抗CD28比率來調節。
結論。細胞擴增隨著aAPC表面上之配體密度及每一細胞aAPCs之給藥增加而顯著改良。與TransAct活化的細胞群體相比，1至4% PE條件改良NeoTCR+ % ＞ 160%。可進行於不同電穿孔系統上之另外測試以進一步最佳化aAPC活化的細胞之基因編輯速率。此外，可調整抗CD3:抗CD28莫耳比率以最佳化CD4:CD8 T細胞群體。
實例 4. 用於 T 細胞活化之 aAPC 直徑CD8及CD4陽性T細胞富集自周邊血液單核細胞(PBMCs)，其藉由血球分離術從血液分離，藉由使用磁珠(Miltenyi)遵循製造商方案陽性選擇，及24孔G-Rex板的十六個孔經接種7.15 x 106個CD4及CD8細胞且在第0天提供新鮮培養基(TexMACS培養基、3% hABs、IL-7、IL-15)及aAPC。一式兩份以100個微脂體/細胞(30、100、200、400 nm之直徑)給予aAPCs至活化富集的CD4及CD8 T細胞。此等aAPCs以1:1 αCD3/αCD28及1%之生物素-PE濃度存在。在第2天，評估CD4/CD8 T細胞在用PACT35-TCR89 (一種用於CRISPR/Cas9介導插入編碼NeoTCR之基因於TRAC基因座中之Neo-TCR同源重組模板)電穿孔之前的活化標誌。培養基在第8天進行補充。在第8天及第13天評估經擴增細胞之基因編輯及表型狀態結果。在第0天、第2天、第8天及第13天經由吖啶橙及DAPI染色利用商業細胞計數器來評估T細胞之存活率及計數。
在第2天aAPC條件之存活率隨著aAPC大小增加而傾向於從97%略微下降至94%，但全部均等於或高於TA對照細胞之存活率(表8)。從第0天至第2天，所有aAPC條件均具有細胞生長；TA對照在細胞數上略有減少。
表8：隨微脂體大小而變化之細胞存活率
微脂體 直徑 存活率% 總的活細胞
第2天 第8天 第0天 第2天 第8天
30 nm 97.5 73.9 7.15 x 10 6 1.01 x 10 7 3.58 x 10 5
100 nm 96.8 82.2 7.15 x 10 6 8.98 x 10 6 6.81 x 10 5
200 nm 95.6 86.4 7.15 x 10 6 1.32 x 10 7 9.41 x 10 5
400 nm 93.9 92.5 7.15 x 10 6 8.72 x 10 6 1.83 X 10 6
對照(TA) 94.5 84.6 7.15 x 10 6 6.65 X 10 6 1.08 X 10 6
30 nm aAPC條件具有與未染色對照(相同供體)相似的CD25、CD69及Ki67表現量，極有可能指刺激配體不足以活化細胞(表9)。具有大於30 nm之aAPCs之aAPC條件顯示與TA活化的對照可相比率擬之CD25量。增加aAPC大小增加T細胞上CD69之表現。在具有大於30之aAPCs之aAPC條件下，具有與TA對照可相比率擬或更高的CD69表現。除30 nm外，所有aAPC條件具有比TA對照更高的Ki67表現。CD25、CD69及Ki67之表現在CD4+及CD8+細胞之間並無實質性差異(資料未顯示)。類似地，基因編輯效率並未顯示相對於微脂體大小之任何傾向(資料未顯示)。
表9：對aAPC大小產生反應之活化及增殖
微脂體直徑 表現以下的細胞%
CD25 CD69 Ki67
30 nm 39.6 9.09 3.37
100 nm 86.1 21.1 15.3
200 nm 94.2 27.8 23.0
400 nm 94.3 38.0 22.2
陽性對照(TA) 90.6 22.5 14.3
陰性對照 34.1 8.58 3.48
基於以上考量，確定200 nm直徑係實現從aAPCs分離及純化T細胞最佳的及2%或4%配體表面覆蓋對於活化而言係最佳的。
實例 5. 用於 T 細胞活化之 aAPCs 之促效劑負載為了評估將αCD3/αCD28抗體分離至不同微脂體(200 nm)上，產生各別αCD3及αCD28三聚物且結合至aAPCs以達成總共100個微脂體/細胞(50個微脂體/每個物種的細胞)。從第0天至第2天，偶聯及未偶聯配體呈現條件均具有比TA對照更佳之細胞生長；在偶聯條件下比在未偶聯條件下活細胞多20%(資料未顯示)。在兩種條件之間，任何活化標誌均無顯著差異。在第8天，偶聯條件下之細胞擴增及經編輯細胞總數略高，但兩種條件之間對NeoTCR+%或KO%沒有顯著影響。
以上呈現的結果表明T細胞活化依賴於aAPC大小及配體呈現形式及密度。彼等結果亦指妨礙富集的CD4及CD8 T細胞之有效活化狀態之過度刺激，在處理第2天所測定。在本研究中，經由兩種渠道研究較低刺激配體劑量之效應：(1)降低表面密度及(2)降低每個T細胞的aAPC劑量。對此，進行200 nm之aAPC大小中0.01至1% PE之大規模(6孔)反覆。滴定在10 aAPCs/細胞至100 aAPCs/細胞之範圍內的aAPC劑量。
CD8及CD4陽性T細胞富集自周邊血液單核細胞(PBMCs)，其藉由血球分離術從血液分離，藉由使用磁珠(Miltenyi)遵循製造商方案陽性選擇，及24孔G-Rex板的十六個孔經接種7.15 x 10 7個CD4及CD8細胞且在第0天提供新鮮培養基(TexMACS培養基、3% hABs、IL-7、IL-15)及aAPC。在第2天，評估CD4/CD8 T細胞在用PACT35-TCR89 (一種用於CRISPR/Cas9介導插入編碼NeoTCR之基因於TRAC基因座中之Neo-TCR同源重組模板)電穿孔之前的活化標誌。培養基在第8天進行補充。在第8天及第13天評估經擴增細胞之基因編輯及表型狀態結果。在第0天、第2天、第8天及第13天經由吖啶橙及DAPI染色利用商業細胞計數器來評估T細胞之存活率及計數。在第2天評估活化。在第8天及第13天評估T細胞表型及耗竭。
在除最低量之刺激配體外的全部刺激配體中，本發明之aAPCs誘導活化標誌CD25及CD69之表現至類似於陽性對照之量之量。如所見，先前暴露於aAPCs誘導增殖標誌Ki67之表現，但在量上低於陽性對照。如同活化標誌，除最低量之刺激配體外的全部刺激配體顯示相似的Ki67表現量。
表10：活化及增殖
生物素PE% APC:細胞 表現以下的細胞%
CD25 CD69 Ki67
0.01 10 71.9 12.9 7.0
0.01 100 91.6 17.1 22.1
0.1 10 90.8 14.7 21.7
0.1 100 94.3 17.7 23.4
1.0 10 94.2 16.7 23.2
1.0 100 94.8 16.5 24.7
陽性對照(TA) 96.4 16.1 33.3
與彼等經aAPCs活化者相比，對於TA條件，Ki67表現在CD4 T細胞中較高及在CD8 T細胞中較低( 表 11)。具有最低刺激配體之aAPC條件(在10 aAPCs/細胞下之0.01% PE)具有比其他條件相更低的CD25、CD69及Ki67表現。
表11：CD4+及CD8+ T細胞之活化及增殖
生物素PE% APC:細胞 表現以下的CD4+細胞% 表現以下的CD8+細胞%
CD25 CD69 Ki67 CD25 CD69 Ki67
0.01 10 76.7 11.0 4.65 56.1 23.3 16.5
0.01 100 94.1 15.9 19.3 86.9 26.7 35.2
0.1 10 93.4 14.0 18.7 84.5 24.0 35.1
0.1 100 94.7 18.3 20.0 95.5 23.5 38.9
1.0 10 94.6 17.3 19.7 95.2 22.8 38.9
1.0 100 95.9 17.6 22.3 94.9 21.9 36.9
陽性對照(TA) 98.5 18.2 35.0 94.7 19.5 32.1
檢查基因編輯與抗CD3及抗CD28表面展現之滴定及aAPC大小對T細胞活化及接合之相關性。與彼等具有最低刺激配體者相比，具有更高莫耳之刺激配體之條件具有更高NeoTCR表現，但基因敲除具有相似量(資料未顯示)。到第8天，aAPCs對CD4:CD8比率沒有效應，對於所測試的所有條件(包括TA對照)，該CD4:CD8比率為約3:1。
分析活化標誌以確定若刺激配體之量保持恆定，aAPC大小是否對T細胞活化及接合有效應。CD69及CD25用作活化標誌且Ki67用作增殖標誌。在200至800 nm之範圍之間選擇6至100個aAPCs/細胞之不同劑量之aAPCs (0.1% PE)。在所有條件下，刺激配體之莫耳數保持恆定(每一檢定3.02皮莫耳的各αCD3抗體及αCD28抗體或每一T細胞約25,000個刺激配體)。類似地，囊泡之大小及劑量(APCs)成反比率地變化使得總微脂體表面積恆定(1.26 x 10 7nm 2)。CD25、CD69及Ki67之表現量獨立於在等莫耳促效劑水準下之大小及aAPC/細胞給藥( 表 12)。在刺激配體之莫耳數保持恆定下，aAPC大小/劑量不影響neoTCR表現(表R)。
表12：利用等莫耳配體之活化及增殖
   表現以下的CD4+細胞% 表現以下的CD8+細胞%
直徑 (APC:細胞) CD25 CD69 Ki67 CD25 CD69 Ki67
200 nm 100 94.7 18.3 20.0 95.5 23.5 38.9
400 nm 25 95.1 17.4 20.7 95.9 22.7 40.1
800 nm 6.25 95.3 17.5 21.1 96 22.4 40.5
陽性對照(TA) 98.5 18.2 35.0 94.7 19.5 32.1
此等實驗顯示，影響富集的CD4/CD8 T細胞之活化及編輯的是刺激配體的總量，而不是大小或aAPC給藥。
實例 6. 與 T 細胞融合之微脂體抗性本發明之aAPCs為由脂質(諸如具有不同活化訊號傳遞分子之經結合之鏈黴親和素三聚物之POPC及生物素-POPE脂質)組成之微脂體構築體。此等aAPCs可用於CD4/CD8 T細胞之活化。然而，微脂體在配體相互作用期間具有與患者細胞融合之潛力。為了確立微脂體是否將與患者細胞融合或融合發生的程度如何，使用Texas Red DHPE (一種結合至Texas Red之脂質)作為脂質與淋巴細胞融合之標誌。產生抗CD3/抗CD28三聚物且結合至微脂體上的生物素化脂質(1% Texas Red、1%生物素-POPE 含在POPC中)。
使用流動式細胞測量術評定融合。將第-1天(減一)解凍的富集的CD4/CD8 T細胞接種於完全培養基中且靜置24小時。第0天，在800 nm之直徑下製造Texas Red微脂體(具有αCD3/αCD28 (1% PE)之TR-微脂體)且以10個微脂體/細胞之劑量添加至培養物。待評定的時間點為第0天、離心前第2天、離心後第2天及靜置後電穿孔後第2天。在第0天，5個孔經接種10M細胞且以10 aAPCs/細胞添加aAPCs。在第0天兩小時之後，收集一個孔且稀釋於1% BSA/PBS中，然後流動運行以檢查紅色訊號及aAPCs之存在。為了在微脂體上具有基線讀數，亦測定Tx-Red微脂體之平均螢光強度(MFI)。
在第2天，評定樣品以測試電穿孔對APC融合之效應。將細胞再懸浮至培養基中且將可分量離心前樣品在再懸浮之前從培養物與上清液一起取出，且然後取出再懸浮後樣品。將剩餘培養物中的兩份再懸浮且以100 g離心10分鐘。對於D2離心後，收集上清液且將集結粒再懸浮於1% BSA/PBS中。對於電穿孔後樣品，移除上清液，且將集結粒再懸浮於100 μL P3初級細胞核染溶液(Nucleofector Solution) (Lonza)緩衝液中及在X比色管中進行電穿孔。10分鐘後，將細胞返送至培養基且在37℃下培養2小時，此後收集細胞以進行流動分析。
為了確定從D0至D2 aAPCs是否與富集的T細胞相互作用，歷時2天時間監測T細胞及aAPCs。在D0，將25000個T細胞以10個aAPCs/細胞接種四個孔中。兩個孔接收完全aAPCs，而其他兩個孔接收空白aAPCs (具有Texas Red，不含生物素PE)作為刺激配體之陰性對照。每2小時拍攝影像持續兩天以評定T細胞:aAPC相互作用。
處理細胞之時間線如下：1)第-1天：乾燥aAPCs [1% TR、1%生物素-PE]之脂質，在10M/孔下解凍且靜置細胞；2)第0天：以10個aAPCs/細胞添加至經靜置之細胞，直徑為800 nm，具有αCD3/αCD28；評定D0融合；及3)第2天：在X比色管條件4、5下電穿孔且在電穿孔後2小時評定融合；評定D0融合。
TransAct活化的細胞簇聚在一起，此在48小時時最可見(資料未顯示)。在aAPC活化的條件下，此現象未被相同程度地看到。此可歸因於(1)缺乏自簇聚所需的LFA-1 ICAM-1上調所需的刺激配體或(2)藉由aAPCs空間阻斷LFA-1 ICAM-1相互作用。
在第0天，僅添加aAPCs後四小時的細胞具有任何TxRed訊號。此表明到沉降前在培養物中四小時，T細胞與aAPCs接合。
在第2天，僅培養物上清液樣品具有TxRed訊號。此證實初始大小為800 nm之aAPCs並未沉降在培養物中。離心前細胞沒有TxRed訊號，表明到第2天沒有與沉降後aAPCs融合或接合。離心後及電穿孔後細胞亦沒有TxRed訊號。此表明離心不促進aAPCs與T細胞之融合且足以清除電穿孔前的aAPCs。
實例 7. aAPC 劑量及配體密度驅動之 T 細胞簇聚總結。Zumwalde等人，J. Immunol. 2013 191:3681-3693已顯示LFA-1/ICAM-1相互作用介導經活化T細胞之間的同型黏附，因為T細胞表現LFA-1及ICAM-1。此類同型聚集物係體外有效T細胞活化之標誌且亦已在體內抗原特異性T細胞活化之後觀測到T細胞簇。ICAM-1係早期T細胞活化標誌，其藉由IL-12調節及T細胞簇之破壞藉由同時調節抗原接近經活化CD8 T細胞、以及CTLA-4及脱中胚蛋白(eomesodermin)之表現量增強CD8 T細胞效應功能之開發。
T細胞簇聚可用拍攝細胞培養物之週期性影像的Sartorius IncuCyte儀器監測。在各種aAPC:T細胞比率下給予aAPCs及每2小時獲取影像以監測簇聚事件。該實驗包括TransAct刺激及未刺激之T細胞，分別作為陽性及陰性對照，以用於比較分析。aAPC刺激確實啟動T細胞簇聚事件，然而，與TransAct珠粒活化之細胞培養物相比，簇聚程度低得多。
不同於如上所述進行廣泛13個處理日研究，將T細胞簇聚用作評定且潛在地縮小大規模測試所需的aAPC劑量及配體密度構築體之最佳範圍之代表。此外，此等測量顯示簇聚過程是否係第2天電穿孔前足夠T細胞活化之必要前驅物。
描述於該實例中之實驗描述αCD3/αCD28配體密度為0.1至4%之aAPC表面之篩選亦及100至5000個aAPCs/細胞之劑量範圍。
CD8及CD4陽性T細胞富集自周邊血液單核細胞(PBMCs)，其藉由血球分離術從血液分離，藉由使用磁珠(Miltenyi)遵循製造商方案陽性選擇。條件以一式三份接種於96孔板格式中。每個孔經接種100,000個T細胞及aAPCs (以10 μL之總體積計)且歷時48小時以每2小時捕捉的影像監測。TransAct係根據製造商說明書使用。所有微脂體製備為直徑約200 nm。在第0天(CD4/CD8 T細胞之富集、細胞計數及存活率、接種以用於IncuCyte分析)及第2天(影像分析)取得讀數。所有細胞均在TexMACs 3% HS + IL7及IL15 (均在12.5 ng/mL下)中培養。
為了確認aAPCs在該實驗模型中之非毒性，細胞在POPC微脂體(0% PE)存在下以0、10、100及1000個微脂體/細胞之濃度生長於培養物中且用TransAct活化。在所有濃度之微脂體/細胞之間，生長速率沒有差異，包括沒有微脂體。此確認aAPCs為非毒性。
在活化期期間監測T細胞簇聚(圖2A及2B)。對於此等實驗，將25,000個T細胞接種於96孔板中，其中aAPCs包含介於0.1%與4%之間的PE且在介於100:1與5000:1 aAPC:細胞之間的劑量下(每種條件以一式三份接種)。在活化期期間每6小時獲取影像。監測活化期間T細胞之ICAM-1依賴性同型簇聚。
進行實驗以確定T細胞簇聚是否會隨著aAPC劑量增加而改良。於IncuCyte上評估所有條件之活化誘導之簇聚。圖3A說明隨CD3及CD28促效劑而變化之簇聚，其中在1000:1 aAPC:細胞下劑量保持在恆定。簇聚量隨著配體密度從0.1% PE增加至2% PE而增加但在4% PE下實質上下降。圖3B說明劑量對簇聚之影響，其中所有微脂體均含有含1% PE於POPC中。簇聚隨著劑量從100 aAPC:細胞至1000 aAPC:細胞而增加，此時提供另外微脂體沒有多大影響。圖3C證實與在1000:1之劑量下具有2% PE之aAPCs比在2000:1之劑量下具有1% PE之aAPCs誘導稍微更多之簇聚。活化的細胞之影像提供於圖3D中。
實例 8. 大規模 aAPCs – 配體密度與最佳化基於大規模比色管之電穿孔總結。評估aAPCs活化富集的CD4/CD8 T細胞於使用最佳化基於大規模比色管之電穿孔系統(1 mL比色管)之電穿孔之用途。如上述，證實與TransAct對照相比，在小規模上使用aAPCs作為CD4s及CD8s之活化子具有可相比擬基因敲入(knock-in)及改良之基因敲除。亦證實使用大規模1 mL比色管最佳化電穿孔系統來改良電穿孔效率。與大規模1 mL比色管最佳化電穿孔系統中之TransAct活化相比，描述於該實例中之實驗測試三種不同aAPC配體表面密度。
CD8及CD4陽性T細胞富集自周邊血液單核細胞(PBMCs)，其藉由血球分離術從血液分離，藉由使用磁珠(Miltenyi)遵循製造商方案陽性選擇。在6孔G-Rex板中按每種條件活化71.5M個細胞。配體密度在1至4% PE之範圍內及給藥在1000至4000 aAPC:細胞之範圍內同時維持約200 nm之恆定平均直徑。在第2天，用PACT035 TCR089在P3緩衝液中電穿孔每種條件之50M個細胞。在補充IL-7及IL-15之TexMACS中運行該研究十三天。培養基在第8天進行補充。在第8天及第13天評估經擴增細胞之基因編輯及表型狀態結果。在第2天、第8天及第13天經由吖啶橙及DAPI染色利用商業細胞計數器來評估T細胞之存活率及計數。
表13：利用aAPCs之大規模活化之結果
條件 細胞計數 擴增倍率 基因編輯
PE% aAPCs/細胞 第2天 第8天 第13天 NeoTCR% 經編輯細胞
4% 1000 5.0 x 10 7 1.19 x 10 8 5.74 x 10 8 11.5 73.2 4.20 x 10 8
2% 1000 5.0 x 10 7 1.35 x 10 8 6.26 x 10 8 12.5 68.9 4.32 x 10 8
1% 1000 5.0 x 10 7 1.59 x 10 8 6.35 x 10 8 12.7 59.0 3.75 x 10 8
1% 4000 5.0 x 10 7 1.27 x 10 8 5.84 x 10 8 11.7 68.5 4.00 x 10 8
1% 2000 5.0 x 10 7 1.47 x 10 8 6.39 x 10 8 12.8 67.4 4.31 x 10 8
TransAct 5.0 x 10 7 2.02 x 10 8 5.26 x 10 8 10.5 53.2 2.80 x 10 8
在第13天的aAPC評估顯示最高刺激配體劑量導致最高編輯但比低刺激配體略低之擴增(表13)。TransAct具有最低擴增及編輯。在第13天，aAPC活化條件具有至多3.6% WT，而TransAct條件具有14.3% (資料未顯示)。亦顯示，所有條件均具有13至20%之CD4+細胞及增加之刺激配體劑量增加Ttm/Tem群體及減少Tmsc+ Tcm群體(圖6)。
在第13天，可成功地活化富集的CD4/CD8 T細胞，其中aAPCs在中等規模上具有高NeoTCR+表現及低%的野生型細胞。隨著刺激配體劑量增加，觀測到增加之Ttm/Tem群體。就最低配體劑量而言，觀測到與TransAct相比CD8 T細胞中改良之Tmsc/Tcm群體。
實例 9. aAPC 表面上抗 CD3: 抗 CD28 抗體比率之動態範圍總結。在該實例中進行的實驗設計成確定抗CD3:抗CD28比率對aAPCs之表面之效應。
結果。為了確認可在aAPCs上滴定配體展現，如上所述製備微脂體，但改用生物素化螢光團(AlexaFluor 488-生物素化、AlexaFluor 594-生物素化)代替生物素化刺激配體。不同構築體之個別MFIs之幾何平均顯示可解析且建立不同aAPC物種( 表 14)。
表14：展現螢光團之微脂體
生物素-AF488 生物素-AF594 比率(預期) MFI AF488 MFI AF594 Norm AF488 Norm AF594 比率(觀測)
1 1 1 8021 2036 1 1 1.00
1 2 0.5 6028 3175 0.8 1.6 0.48
1 5 0.2 3142 4524 0.4 2.2 0.18
1 10 0.1 1477 4162 0.2 2.0 0.09
2 1 2 12619 1460 1.6 0.7 2.19
5 1 5 18213 757 2.3 0.4 6.11
10 1 10 18964 178 2.4 0.1 27.04
CD8及CD4陽性T細胞富集自周邊血液單核細胞(PBMCs)，其藉由血球分離術從血液分離，藉由使用磁珠(Miltenyi)遵循製造商方案陽性選擇。
接下來的問題是，是否可識別用於活化及電穿孔啟動之最佳配體比率。CD8及CD4陽性T細胞富集自周邊血液單核細胞(PBMCs)，其藉由血球分離術從血液分離，藉由使用磁珠(Miltenyi)遵循製造商方案陽性選擇，及24孔G-Rex板的十六個孔經接種7.15 x 10 6個CD4及CD8細胞且在第0天提供新鮮培養基(TexMACS培養基、3% hABs、IL-7、IL-15)及aAPC。在第8天更換細胞培養基。確定αCD28展現範圍似乎不影響細胞擴增及存活率。相反地，αCD3展現範圍確實具有一定效應。具體而言，5:1顯示顯示增加之細胞擴增且在將αCD3:αCD28比率增加上升10:1下細胞健康改良( 表 15)。
表15：刺激配體比率
配體比率 活細胞 基因編輯
αCD3 αCD28 第2天 第8天 第13天 NeoTCR%
1 1 6.19 x 10 7 1.72 x 10 8 7.96 x 10 8 35.7
1 2 6.28 x 10 7 1.40 x 10 8 7.32 x 10 8 37.4
1 5 6.81 x 10 7 1.51 x 10 8 7.42 x 10 8 42.7
2 1 4.86 x 10 7 2.00 x 10 8 7.76 x 10 8 33.4
5 1 6.38 x 10 7 2.00 x 10 8 1.14 x 10 8 32.1
10 1 6.06 x 10 7 1.41 x 10 8 7.54 x 10 8 30.4
1 LEAF 1 LEAF 5.63 x 10 7 1.56 x 10 8 1.11 x 10 8 48.8
TransAct 6.26 x 10 7 1.77 x 10 8 6.42 x 10 8 36.5
為了評估配體比率對基因編輯之影響，在第2天電穿孔之前，將細胞與aAPC (1%PE，200 nm直徑，在1000 aAPC:細胞下，其中配體比率不同)培養44至48小時。在第2天，在各條件下培養的5,000萬個細胞經核染且然後在補充aAPC之新鮮培養基中培養。在第8天更換培養基。增加抗CD28表面展現改良編輯效率使得αCD28中的5x增加導致NeoTCR+細胞增加23%。相反地，增加抗CD3表面展現降低編輯效率使得NeoTCR+減少17%且αCD3刺激增加10倍( 表 15；測定活化標誌但資料未顯示)。
亦進行實驗以確定配體(Miltenyi RUO抗體(純系OKT3、15E8)及生物素化LEAF抗體(純系OKT3、28.2))之低內毒素、無疊氮化物(LEAF)調配物是否影響細胞擴增及/或基因編輯效率。資料顯示，具有LEAF活化子之aAPCs改良細胞擴增但亦由於積聚多2x的乳酸酯、由於多2x的細胞擴增而增加aAPC活化的T細胞中之培養基消耗速率。進一步顯示，甚至在1%表面配體密度(aAPC活化的T細胞導致多25%的NeoTCR +%)下及aAPC活化的T細胞產生多2倍的總經標記細胞。總而言之，顯示Biolegend LEAF抗體處於共刺激配體之1%表面積覆蓋下，aAPCs驅動更高電穿孔效率且導致更大數目之經編輯細胞。
儘管本發明已相對於幾個所描述的實施例以某種長度及某種特定性進行描述，但本發明不意圖其應受限於任何此類特定或實施例或任何特定實施例，但本發明應參考隨附申請專利範圍加以解釋以便有鑑於先前技術提供此申請專利範圍之最寬廣的可能解釋且因此有效涵蓋本發明之所欲範疇。
本文提及的所有公開案、專利申請案、專利及其他參考文獻以其全文引用之方式併入。若發生衝突，則以本說明書(包括定義)為準。另外，部分標題、材料、方法及實例僅係例示性而無意為限制性。
圖 1顯示具有表面呈現抗CD3及抗CD28之aAPC之工作流程。
圖 2A 及 2B顯示活化階段期間T細胞簇聚之監測。
圖 3A 至 3D顯示活化階段期間對各種aAPCs之暴露產生反應之T細胞簇聚之監測。
圖 4顯示，0.1至2% POPE顯示增加之Tmsc%及4% POPE係與TransAct可相比擬的Tmsc%。
圖 5顯示刺激配體之增加之劑量增加Ttm/Tem群體且減少Tmsc+Tcm群體。

Claims (69)

  1. 一種人工抗原呈現細胞(aAPC)，其包含微脂體，該微脂體包含磷脂及展現於該微脂體的外表面上之刺激配體。
  2. 如請求項1之aAPC，其中該刺激配體係選自由CD3促效劑、CD28促效劑、主要組織相容性複合物(MHC)、肽-MHC複合物、多聚化新抗原決定基-HLA複合物、CD58、CD86、CD83、4-1BBL、OX40L、ICOSL (B7H2、B7RP1)、CD40L及LFA-1組成之群。
  3. 如請求項1或2之aAPC，其中該微脂體包含磷脂及功能化脂質之混合物。
  4. 如請求項3之aAPC，其中該混合物中磷脂與功能化脂質之比率係介於10,000:1與25:1之間。
  5. 如請求項4之aAPC，其中該比率係介於1000:1與50:1之間。
  6. 如請求項4或5之aAPC，其中該比率係介於100:1與50:1之間。
  7. 如請求項1至6中任一項之aAPC，其中該磷脂係選自由以下組成之群：磷脂酸(磷脂酸酯) (PA)、磷脂醯乙醇胺(腦磷脂) (PE)、磷脂醯膽鹼(卵磷脂) (PC)、磷脂醯絲胺酸(PS)、磷酸肌醇、磷脂醯肌醇(PI)、磷脂醯肌醇磷酸酯(PIP)、磷脂醯肌醇二磷酸酯(PIP2)、磷脂醯肌醇三磷酸酯(PIP3)、神經醯胺磷酸膽鹼(鞘磷脂) (SPH)、神經醯胺磷醯乙醇胺(鞘磷脂) (Cer-PE)，及其組合。
  8. 如請求項1至6中任一項之aAPC，其中該微脂體包含18:1棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)及/或1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)。
  9. 如請求項3至8中任一項之aAPC，其中該功能化脂質包含生物素部分、N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分、磺基-NHS部分、氮基三乙酸(NTA)-鎳、馬來醯亞胺部分，或N-苄基鳥嘌呤。
  10. 如請求項3至9中任一項之aAPC，其中該功能化脂質為1-油醯基-2-(12-生物素基-(胺基十二醯基))-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:1至12:0生物素-PE)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(生物素基) (16:0生物素-PE)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(生物素基) (18:1生物素-PE)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(cap生物素基) (18:1生物素-Cap-PE)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(cap生物素基) (16:0生物素-Cap-PE)、生物素-磷脂醯乙醇胺(生物素-PE)、或生物素-1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(生物素-POPE)。
  11. 如請求項10之aAPC，其中該功能化脂質為18:1生物素-Cap-PE、16:0生物素-Cap-PE，或生物素-POPE。
  12. 如請求項10或11之aAPC，其中該功能化脂質為生物素-POPE。
  13. 如請求項1至12中任一項之aAPC，其中該刺激配體係經由該功能化脂質連接至該微脂體。
  14. 如請求項1至13中任一項之aAPC，其中該刺激配體為CD3促效劑、CD28促效劑，或其組合。
  15. 如請求項14之aAPC，其中該CD3促效劑為抗CD3抗體。
  16. 如請求項14之aAPC，其中該CD28促效劑為抗CD28抗體。
  17. 如請求項15或16之aAPC，其中該抗CD3抗體及/或抗CD28抗體為低內毒素無疊氮化物(LEAF)抗體。
  18. 如請求項1至17中任一項之aAPC，其中該微脂體具有介於30 nm至2 μm之間的直徑。
  19. 如請求項18之aAPC，其中該微脂體具有介於50 nm與600 nm之間的直徑。
  20. 如請求項18或19之aAPC，其中該微脂體具有介於100 nm 與400 nm之間的直徑。
  21. 一種如請求項1至20中任一項之aAPC之群體。
  22. 如請求項21之群體，其中該群體之微脂體具有介於30 nm與2 μm之間的平均直徑及5%至50%之大小分佈。
  23. 如請求項22之群體，其中該平均直徑係介於50 nm至600 nm之間。
  24. 如請求項22或23之群體，其中該平均直徑係介於100 nm至400 nm之間。
  25. 一種包含T細胞群體及人工抗原呈現細胞(aAPCs)群體之組合物，其中各aAPC包含微脂體，其包含磷脂及展現於該微脂體的外表面上之刺激配體。
  26. 如請求項25之組合物，其中該微脂體包含磷脂及功能化脂質之混合物。
  27. 如請求項26之組合物，其中該混合物中磷脂與功能化脂質之比率係介於10,000:1與25:1之間。
  28. 如請求項27之組合物，其中該比率係介於1000:1與50:1之間。
  29. 如請求項27或28之組合物，其中該比率係介於100:1與50:1之間。
  30. 如請求項25至29中任一項之組合物，其中該磷脂係選自由以下組成之群：磷脂酸(磷脂酸酯) (PA)、磷脂醯乙醇胺(腦磷脂) (PE)、磷脂醯膽鹼(卵磷脂) (PC)、磷脂醯絲胺酸(PS)、磷酸肌醇、磷脂醯肌醇(PI)、磷脂醯肌醇磷酸酯(PIP)、磷脂醯肌醇二磷酸酯(PIP2)、磷脂醯肌醇三磷酸酯(PIP3)、神經醯胺磷酸膽鹼(鞘磷脂) (SPH)、神經醯胺磷醯乙醇胺(鞘磷脂) (Cer-PE)，及其組合。
  31. 如請求項25至30中任一項之組合物，其中該微脂體包含18:1棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)及/或1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)。
  32. 如請求項26至31中任一項之組合物，其中該功能化脂質包含生物素部分、N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)部分、磺基-NHS部分、氮基三乙酸(NTA)-鎳、馬來醯亞胺部分，或N-苄基鳥嘌呤。
  33. 如請求項26至32中任一項之組合物，其中該功能化脂質為1-油醯基-2-(12-生物素基-(胺基十二醯基))-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:1至12:0生物素-PE)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(生物素基) (16:0生物素-PE)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(生物素基) (18:1生物素-PE)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(cap生物素基) (18:1生物素-Cap-PE)、1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-(cap生物素基) (16:0生物素-Cap-PE)、生物素-磷脂醯乙醇胺(生物素-PE)、或生物素-1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(生物素-POPE)。
  34. 如請求項33之組合物，其中該功能化脂質為18:1生物素-Cap-PE、16:0生物素-Cap-PE，或生物素-POPE。
  35. 如請求項33或34之組合物，其中該功能化脂質為生物素-POPE。
  36. 如請求項25至35中任一項之組合物，其中該刺激配體係經由該功能化脂質連接至該微脂體。
  37. 如請求項25至36中任一項之組合物，其中該刺激配體係選自由CD3促效劑、CD28促效劑、主要組織相容性複合物(MHC)、肽-MHC複合物、多聚化新抗原決定基-HLA複合物、CD58、CD86、CD83、4-1BBL、OX40L、ICOSL (B7H2、B7RP1)、CD40L及LFA-1組成之群。
  38. 如請求項25至37中任一項之組合物，其中該刺激配體為CD3促效劑、CD28促效劑，或其組合。
  39. 如請求項38之組合物，其中該CD3促效劑為抗CD3抗體。
  40. 如請求項38之組合物，其中該CD28促效劑為抗CD28抗體。
  41. 如請求項39或40之組合物，其中該抗CD3抗體及/或該抗CD28抗體為低內毒素無疊氮化物(LEAF)抗體。
  42. 如請求項25至41中任一項之組合物，其中該微脂體具有介於30 nm至2 μm之間的直徑。
  43. 如請求項42之組合物，其中該微脂體具有介於50 nm與600 nm之間的直徑。
  44. 如請求項42或43之組合物，其中該微脂體具有介於100 nm與400 nm之間的直徑。
  45. 如請求項25至44中任一項之組合物，其進一步包含細胞生長介質。
  46. 如請求項25至45中任一項之組合物，其進一步包含介白素7 (IL-7)及介白素15 (IL-15)。
  47. 如請求項25至46中任一項之組合物，其中該T細胞群體包含至少一個NeoTCR細胞。
  48. 一種組合物，其包含如請求項21至25中任一項之T細胞群體及人工抗原呈現細胞(aAPCs)群體。
  49. 一種活化T細胞之方法，其包括使T細胞暴露於一或多個人工抗原呈現細胞(aAPCs)，其中各aAPC包含微脂體，其包含磷脂及展現於該微脂體的外表面上之刺激配體。
  50. 如請求項50之方法，其中該磷脂係選自由以下組成之群：磷脂酸(磷脂酸酯) (PA)、磷脂醯乙醇胺(腦磷脂) (PE)、磷脂醯膽鹼(卵磷脂) (PC)、磷脂醯絲胺酸(PS)、磷酸肌醇、磷脂醯肌醇(PI)、磷脂醯肌醇磷酸酯(PIP)、磷脂醯肌醇二磷酸酯(PIP2)、磷脂醯肌醇三磷酸酯(PIP3)、神經醯胺磷酸膽鹼(鞘磷脂) (SPH)、神經醯胺磷醯乙醇胺(鞘磷脂) (Cer-PE)，及其組合。
  51. 如請求項49或50之方法，其中該微脂體包含18:1棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)及/或1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)。
  52. 如請求項49至51中任一項之方法，其中該刺激配體係選自由CD3促效劑、CD28促效劑、主要組織相容性複合物(MHC)、肽-MHC複合物、多聚化新抗原決定基-HLA複合物、CD58、CD86、CD83、4-1BBL、OX40L、ICOSL (B7H2、B7RP1)及CD40L組成之群。
  53. 如請求項49至52中任一項之方法，其中該刺激配體為CD3促效劑、CD28促效劑，或其組合。
  54. 如請求項53之方法，其中該CD3促效劑為抗CD3抗體。
  55. 如請求項53之方法，其中該CD28促效劑為抗CD28抗體。
  56. 如請求項54或55之方法，其中該抗CD3抗體及/或抗CD28抗體為低內毒素無疊氮化物(LEAF)抗體。
  57. 如請求項49至56中任一項之方法，其進一步包括將T細胞群體與aAPCs群體混合。
  58. 如請求項57之方法，其中該aAPCs群體之微脂體具有介於30 nm與2 μm之間的平均直徑及5%至50%之大小分佈。
  59. 如請求項58之方法，其中該平均直徑係介於30 nm至400 nm之間。
  60. 如請求項59之方法，其中該平均直徑為約200 nm。
  61. 如請求項57至60中任一項之方法，其中該混合物包含aAPCs及T細胞介於5:1 (aAPCs:T細胞)與5000:1之間的比率。
  62. 如請求項49至61中任一項之方法，其中該T細胞為NeoTCR細胞。
  63. 一種製造T細胞療法產品之方法，其包括使T細胞群體暴露於人工抗原呈現細胞(aAPCs)群體，其中各aAPC包含微脂體，其包含磷脂及展現於該微脂體的外表面上之刺激配體。
  64. 如請求項63之方法，其進一步包括該T細胞群體之至少一個T細胞之基因編輯。
  65. 如請求項64之方法，其中該基因編輯包括該T細胞群體利用結合至導引RNA序列之CRISPR-Cas9核酸酶之雙重核糖核蛋白物種電穿孔，其中各物種靶向內源TCRα基因座及/或內源TCRβ基因座。
  66. 如請求項63或64之方法，其中該暴露發生於該基因編輯之前。
  67. 如請求項63至66中任一項之方法，其中該基因編輯係非病毒的。
  68. 如請求項63至67中任一項之方法，其中該T細胞群體包含一或多個NeoTCR細胞。
  69. 一種利用T細胞療法治療有需要患者之方法，其中該T細胞療法係藉由如請求項63至69中任一項之方法獲得。
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