TW202305137A - 靶向白蛋白的嵌合抗原受體及其使用方法 - Google Patents

靶向白蛋白的嵌合抗原受體及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本揭露內容提供了一種對白蛋白具有特異性的嵌合抗原受體（CAR）。本揭露內容還提供了包含CAR的組合物、編碼CAR的多核苷酸、包含編碼CAR的多核苷酸的載體、包含CAR的工程細胞及其使用方法。

Description

靶向白蛋白的嵌合抗原受體及其使用方法
本揭露內容大體上關於細胞療法領域。特別地，本揭露內容關於用於在白蛋白存在下擴增免疫細胞並刺激免疫反應的組合物和方法。
哺乳動物的免疫系統能夠識別和消除已被感染或受損的細胞以及那些已癌變的細胞。在癌症的情況下，免疫細胞如細胞毒性T細胞可以與癌細胞表面上的特定抗原（癌症抗原）結合並殺死癌細胞。利用免疫系統的這種天然能力，已開發出過繼性細胞療法，也稱為細胞免疫療法，以對抗癌症。根據細胞的來源和基因工程的方法，細胞免疫療法可分為腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）療法、工程T細胞受體（TCR）療法、嵌合抗原受體（CAR）T細胞療法和自然殺手（NK）細胞療法。
癌症患者體內天然存在的T細胞通常能夠靶向癌細胞。然而，僅這些T細胞的存在並不總是足以保證它們能夠消除腫瘤。一個潛在的障礙是這些T細胞必須首先被活化，然後將活性保持足夠長的時間以維持有效的抗腫瘤反應。為了解決這些問題，TIL療法收穫了已經浸潤患者腫瘤的天然存在的T細胞，然後將其活化並擴增。然後將大量這些活化的T細胞重新注入患者體內，以摧毀腫瘤。
TIL療法的一個問題是，並非所有患者都具有已經識別其腫瘤的T細胞。為了解決這個問題，TCR療法從患者獲取T細胞，並為T細胞配備新的T細胞受體，其使T細胞能夠靶向特定的癌症抗原。
TIL和TCR療法都只能靶向和消除通過主要組織相容性複合體（MHC）呈現其抗原的癌細胞。為了克服這一限制，科學家們已經工程改造T細胞或NK細胞來表達與癌細胞表面上表達的抗原特異性結合的CAR，即使這些抗原沒有通過MHC呈現在表面上。
當前細胞免疫療法關於活化和/或擴增從人類受試者分離的免疫細胞的步驟，這些步驟是昂貴且耗時的。因此，免疫細胞的離體活化和/或擴增已成為阻礙細胞免疫療法廣泛實施的主要障礙之一。因此，需要開發用於活化和/或擴增用於細胞免疫療法的免疫細胞的新方法。
在一個方面，本揭露內容提供了一種編碼嵌合抗原受體（CAR）蛋白的多核苷酸。在一些實施例中，CAR包含(1)包含第一抗原結合域的胞外域，(2)跨膜域和(3)胞內訊息傳遞域，其中第一抗原結合域與白蛋白特異性結合。
在一些實施例中，第一抗原結合域是單鏈可變片段（scFv）。在一些實施例中，scFv包含重鏈可變（VH）區和輕鏈可變（VL）區。在一些實施例中，VH區包含HCDR1，其具有如 表 1所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；HCDR2，其具有如 表 2所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；以及HCDR3，其具有如 表 3所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列。在一些實施例中，VL區包含LCDR1，其具有如 表 4所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；LCDR2，其具有如 表 5所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；以及LCDR3，其具有如 表 6所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列。
在一些實施例中，抗原結合域是單域抗體（SDAB）。在一些實施例中，SDAB包含CDR1，其具有如 表 1所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；CDR2，其具有如 表 2所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；以及CDR3，其具有如 表 3所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列。
在一些實施例中，抗原結合域是奈米抗體。在一些實施例中，奈米抗體包含CDR1，其具有如 表 3所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；CDR2，其具有如 表 3所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；以及CDR3，其具有如 表 3所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列。
在一些實施例中，CAR蛋白還包含訊號肽。在一些實施例中，訊號肽包含CD8α的訊號肽。在一些實施例中，CD8α的訊號肽包含SEQ ID NO: 130的序列或與其具有至少90%同一性的序列；或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列。
在一些實施例中，跨膜域包含CD8α的跨膜域。在一些實施例中，CD8α的跨膜域包含SEQ ID NO: 132的序列或與其具有至少90%同一性的序列；或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列。
在一些實施例中，胞外域通過鉸鏈區連接至跨膜域。在一些實施例中，鉸鏈區包含CD8α的鉸鏈區。在一些實施例中，CD8α的鉸鏈區包含SEQ ID NO: 133的序列或與其具有至少90%同一性的序列；或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列。
在一些實施例中，胞內域包含共刺激域和訊息傳遞域。在一些實施例中，共刺激域包含CD137的胞內域。在一些實施例中，CD137的胞內域包含SEQ ID NO: 134的序列或與其具有至少90%同一性的序列；或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列。
在一些實施例中，胞內域包含CD3ζ的訊息傳遞域。在一些實施例中，CD3ζ的訊息傳遞域包含SEQ ID NO: 135的序列或與其具有至少90%同一性的序列。
在一些實施例中，CAR蛋白具有以下結構（從左至右為N末端到C末端）：S-AB-H-TM-IC，其中S是訊號肽，AB是抗原結合域，H是鉸鏈區，TM是跨膜域並且IC是胞內訊息傳遞域。在一些實施例中，CAR具有以下結構：S-VH-L-VL-H-TM-IC，其中VH是重鏈可變區，L是連接子，VL是輕鏈可變區。在一些實施例中，CAR具有以下結構：S-VL-L-VH-H-TM-IC，其中VH是重鏈可變區，L是連接子，VL是輕鏈可變區。
在一些實施例中，CAR蛋白具有以下結構：S-SDAB-TM-IC，其中SDAB是單域抗體。
在一些實施例中，CAR蛋白具有以下結構：S-N-TM-IC，其中N是奈米抗體。
在一些實施例中，胞外域還包含第二抗原結合域，其與第一抗原結合域特異性結合白蛋白的不同表位。
在一些實施例中，胞外域還包含與細胞表面抗原特異性結合的第二抗原結合域。在一些實施例中，細胞表面抗原是癌症抗原。在一些實施例中，癌症抗原選自由以下組成的組：CD19、CD20、CAIX、CD33、CD44v7/8、CEA、EGP-2、EGP-40、erb-B2、erb-B3、erb-B4、FBP、胎兒乙醯膽鹼受體、GD2、GD3、Her2/neu、IL-13R-a2、KDR、k輕鏈、LeY、LI細胞黏附分子、MAGE-Al、間皮素、MUCl、KG2D配體、癌胚抗原（h5T4）、PSCA、PSMA、TAA、TAG-72和VEGF-R。
在一些實施例中，胞外域還包含與白蛋白特異性結合的第二抗原結合域，其中第一抗原結合域和第二抗原結合域結合白蛋白的不同表位。在一些實施例中，胞外域還包含與癌症抗原特異性結合的第三抗原結合域。
在一些實施例中，本文提供的多核苷酸是DNA。在一些實施例中，本文提供的多核苷酸是RNA。
在另一個方面，本揭露內容提供了由本文提供的多核苷酸編碼的多肽。
在另一個方面，本揭露內容提供了一種包含本文提供的多核苷酸的載體，其中編碼CAR的多核苷酸可操作地連接於至少一個調節性多核苷酸元件以用於表達CAR。
在一些實施例中，載體是質體載體、病毒載體、轉座子、定點插入載體或自殺式表達載體。在一些實施例中，載體是慢病毒載體、逆轉錄病毒載體或AAV載體。
在另一個方面，本揭露內容提供了一種包含本文提供的多核苷酸的工程細胞。在一些實施例中，工程細胞是T細胞或NK細胞。
在一些實施例中，本文提供的工程細胞還包含第二CAR蛋白，其中第二CAR包含與癌症抗原特異性結合的第二抗原結合域。在一些實施例中，癌症抗原選自由以下組成的組：CD19、CD20、CAIX、CD33、CD44v7/8、CEA、EGP-2、EGP-40、erb-B2、erb-B3、erb-B4、FBP、胎兒乙醯膽鹼受體、GD2、GD3、Her2/neu、IL-13R-a2、KDR、k輕鏈、LeY、LI細胞黏附分子、MAGE-Al、間皮素、MUCl、KG2D配體、癌胚抗原（h5T4）、PSCA、PSMA、TAA、TAG-72和VEGF-R。
在一些實施例中，本文提供的工程細胞還包含第二CAR蛋白，其中第二CAR包含與白蛋白特異性結合的第二抗原結合域，其中第一抗原結合域和第二抗原結合域結合白蛋白的不同表位。在一些實施例中，本文提供的工程細胞還包含第三CAR蛋白，其中第三CAR包含與癌症抗原特異性結合的第三抗原結合域。
在另一個方面，本揭露內容提供了一種用於刺激免疫反應的方法，其包括使本文提供的工程細胞與白蛋白接觸。在一些實施例中，工程細胞與白蛋白離體接觸。在一些實施例中，通過向需要免疫刺激的受試者施用工程細胞而使工程細胞與白蛋白在體內接觸。
在一些實施例中，受試者患有癌症。在一些實施例中，癌症是選自由以下組成的組的實體癌：腎上腺癌、骨癌、腦癌、乳腺癌、結腸直腸癌、食道癌、眼癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、細支氣管肺泡細胞肺癌、間皮瘤、頭頸癌、鱗狀細胞癌、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、子宮頸癌、陰莖癌、前列腺癌、胰腺癌、皮膚癌、肉瘤、睾丸癌、甲狀腺癌、子宮癌、陰道癌。在一些實施例中，癌症是選自由以下組成的組的血液惡性腫瘤：急性淋巴細胞性白血病（ALL）、急性骨髓性白血病（AML）、B細胞白血病、慢性淋巴母細胞性白血病（CLL）、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞瘤（BPDCN）、慢性骨髓單核細胞性白血病（CMML）、慢性粒細胞性白血病（CML）、前B急性淋巴細胞性白血病（Pre-B ALL）、彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、結外NK/T細胞淋巴瘤、毛細胞白血病、重鏈疾病、HHV8相關原發性滲出性淋巴瘤、漿母細胞性淋巴瘤、原發性CNS淋巴瘤、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤、富含T細胞/組織細胞的B細胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤（Hodgkin's lymphoma）、非霍奇金氏淋巴瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症（Waldenstrom's macroglobulinemia）、多發性骨髓瘤（MM）、骨髓增生異常症候群（MDS）、骨髓增生性贅瘤和真性紅細胞增多症。
在一些實施例中，刺激免疫反應包括增加免疫刺激細胞因子和/或分子的表達和/或分泌。在一些實施例中，免疫刺激細胞因子和/或分子是TNF-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-18和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子中的一種或多種。
在一些實施例中，刺激免疫反應包括增加免疫細胞的增殖。在一些實施例中，免疫細胞是T細胞。
在另一個方面，本揭露內容提供了一種體外擴增細胞的方法，所述方法包括使本文提供的工程細胞在體外與包含白蛋白的組合物接觸。在一些實施例中，組合物還包含IL-2。在一些實施例中，所述方法還包括使工程細胞與飼養細胞接觸。在一些實施例中，飼養細胞被輻照。
在另一個方面，本揭露內容提供了一種用於治療患者的疾病或病理狀況的方法，其包括向患者施用治療有效量的本文提供的工程細胞。在一些實施例中，所述疾病是癌症。
在一些實施例中，用於治療疾病或病理狀況的方法還包括通過包括使本文提供的工程細胞與包含白蛋白的組合物在體外接觸的方法在體外擴增工程細胞。
在更詳細地描述本揭露內容之前，應理解，本揭露內容不限於所描述的特定實施例，因此當然可能會有變化。還應理解，本文中使用的術語僅出於描述特定實施例的目的，而無意於為限制性的，因為本揭露內容的範圍將僅由所附申請專利範圍限制。
除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語具有與本揭露內容所屬技術領域中具有通常知識者通常所理解的相同含義。儘管類似於或等同於本文描述的那些方法和材料的任何方法和材料也可以用於本揭露內容的實踐或測試中，但是現在描述優選的方法和材料。
在本說明書中引用的所有出版物和專利均通過引用併入本文，就如同每個單獨的出版物或專利均被具體和單獨指示為通過引用併入一般，並且通過引用併入本文以揭露和描述與所引用的出版物相關的方法和/或材料。對任何出版物的引用是針對其在申請日之前的揭露內容，不應解釋為承認本揭露內容無權憑藉在先公開而早於此類出版物。此外，提供的出版日期可能與可能需要獨立確認的實際出版日期不同。
如對本技術領域中具有通常知識者而言，在閱讀本揭露內容後將顯而易見的是，本文描述和說明的個別實施例中的每一個具有離散的組件和特徵，其可以在不脫離本揭露內容的範圍或精神的情況下，容易地與其他若干實施例中的任何一個的特徵分離或組合。任何敘述的方法可以按照敘述的事件的順序或邏輯上可能的任何其他順序進行。
定義
提供以下定義以幫助讀者。除非另有定義，否則本文使用的所有技術術語、符號和其他科學或醫學術語或用語旨在具有本技術領域中具有通常知識者通常理解的含義。在某些情況下，為了清楚和/或易於參考，本文定義了具有通常理解的含義的術語，並且在本文中包括此類定義不一定應被解釋為表示與本領域通常理解的術語的定義相比具有實質性差異。
如本文所用，除非上下文另外明確規定，否則單數形式「一（a/an）」和「所述」包括複數個指代物。
「抗原」是指引起免疫反應的分子。這種免疫反應可以是體液反應，或細胞介導的反應，或兩者兼有。本技術領域中具有通常知識者應理解，任何大分子，包括幾乎所有的蛋白質或肽，都可以用作抗原。顯而易見，本揭露內容的抗原包括能夠引發免疫反應的治療性抗體。
「抗體」是指與抗原結合的免疫球蛋白（Ig）家族的多肽。例如，天然存在的IgG類型的「抗體」是包含通過二硫鍵相互連接的至少兩條重（H）鏈和兩條輕（L）鏈的四聚體。每條重鏈由重鏈可變區（本文縮寫為VH）和重鏈恒定區構成。重鏈恒定區由三個域CH1、CH2和CH3構成。每條輕鏈由輕鏈可變區（本文縮寫為VL）和輕鏈恒定區構成。輕鏈恒定區由一個域（本文縮寫為CL）構成。VH和VL區可以進一步細分為高變區，稱為互補決定區（CDR）（輕鏈CDR包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，重鏈CDR包括HCDR1、HCDR2、HCDR3），其間散佈著更保守的區，稱為框架區（FR）。本文揭露的抗體的CDR邊界可以根據Kabat、IMGT、Chothia或Al-Lazikani的慣例定義或鑒定（Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, A. M., 《分子生物學雜誌》（J. Mol. Biol.）, 273(4), 927(1997)；Chothia, C.等人, 《分子生物學雜誌》, 12月5日;186(3):651-63(1985)；Chothia, C.和Lesk, A.M., 《分子生物學雜誌》, 196,901 (1987)；Chothia, C.等人, 《自然》（Nature）,  12月21-28日;342(6252):877-83 (1989)；Kabat E.A.等人, 美國國家衛生研究院（National Institutes of Health）, Bethesda, Md. (1991)；Marie-Paule Lefranc等人, 《發育與比較免疫學》（Developmental and Comparative Immunology）, 27: 55-77 (2003)；Marie-Paule Lefranc等人, 《免疫組研究》（Immunome Research）, 1(3), (2005)；Marie-Paule Lefranc, 《B細胞分子生物學》（Molecular Biology of B cells） (第二版), 第26章, 481-514, (2015)）。每個VH和VL由三個CDR和四個FR構成，從胺基端到羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合域。
如本文所用，「抗原結合片段」是指由完整抗體的一部分形成的包含一個或多個CDR的抗體片段，或可以與抗原結合但不包含完整原生抗體結構的任何其他抗體片段。抗原結合片段的實例包括但不限於雙功能抗體、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫鍵穩定的Fv片段（dsFv）、(dsFv)2、雙特異性dsFv（dsFv-dsFv'）、二硫鍵穩定的雙功能抗體（ds雙功能抗體）、單鏈抗體分子（scFv）、單鏈Fv-Fc抗體（scFv-Fc）、scFv二聚體（二價雙功能抗體）、雙特異性抗體、多特異性抗體、駱駝單域抗體、奈米抗體、域抗體和二價域抗體。抗原結合片段能夠與親本抗體所結合的相同抗原結合。
「自體細胞」是指來源於同一受試者的任何細胞，所述細胞隨後將被重新引入。
「同種異體細胞」是指來源於相同物種的不同受試者的任何細胞。
「共刺激配體」是指抗原呈現細胞（例如APC、樹突狀細胞、B細胞等）上的分子，其與T細胞上的同源共刺激分子特異性結合，從而提供訊號，除了由例如TCR/CD3複合物與裝載有肽的主要組織相容性複合物（MHC）分子結合而提供的初級訊號外，還介導T細胞反應，包括但不限於增殖、活化、分化等。
「共刺激分子」是指T細胞上的同源結合伴侶，其與共刺激配體特異性結合，從而介導T細胞的共刺激反應，例如但不限於增殖。共刺激分子包括但不限於MHC I類分子、BTLA和Toll配體受體。
在免疫細胞的上下文中使用的「效應細胞」是指可被活化以響應刺激而執行效應功能的細胞。效應細胞可包括但不限於NK細胞、細胞毒性T細胞和輔助T細胞。
「有效量」或「治療有效量」是指有效實現所需生物學結果的在此描述的細胞、組合物、製劑或任何材料的量。此類結果可包括但不限於消除表達特定B細胞受體（BCR）的B細胞和由此產生的抗體。
「表位」是指抗體或其抗原結合片段所識別的抗原的一部分。表位可以是線性的或構象的。
多肽或多核苷酸上下文中的「同一性」或「序列同一性」的百分比是通過在比較窗口中比較兩個最佳比對的序列來確定的，其中多核苷酸或多肽序列在比較窗口中的部分可能包括與參考序列（其不包括添加或缺失）相比的添加或缺失（即間隙），以便對兩個序列進行最佳比對。如下計算百分比：確定兩個序列中出現相同的核酸鹼基或胺基酸殘基的位置數，得出匹配的位置數，用匹配的位置數除以比較窗口中的總位置數，並且將結果乘以100，得出序列同一性的百分比。
「可操作地連接」是指兩個或更多個多核苷酸序列之間的功能關係。在編碼融合蛋白（如本揭露內容的CAR的多肽鏈）的多核苷酸的上下文中，該術語是指兩個或更多個多核苷酸序列接合，使得這些片段編碼的胺基酸序列保持在框內。在轉錄或轉譯調節的上下文中，該術語是指調節序列與編碼序列的功能關係，例如，啟動子在編碼序列的正確位置和方向上，以便調節轉錄。
「多核苷酸」或「核酸」是指核苷酸鏈。如本文所用，多核苷酸包括通過本領域可用的任何手段獲得的所有多核苷酸序列，所述手段包括但不限於重組手段和合成手段。
「多肽」和「蛋白質」可互換使用，是指通過肽鍵共價連接的胺基酸殘基鏈。多肽包括天然肽、重組肽、合成肽或其組合。
「單鏈可變片段」或「單鏈Fv抗體」或「scFv」是指包含輕鏈可變區直接或通過肽連接子序列與重鏈可變區融合的工程抗體。
「T細胞受體」或「TCR」是指T細胞表面上的蛋白質複合物，其負責識別作為與MHC分子結合的肽的抗原片段。
「載體」是指可操作地插入多核苷酸，以便遞送、複製或表達多核苷酸的載體。載體可以含有多種調節元件，包括但不限於複製起點、啟動子、轉錄起始序列、增強子、可選標記基因和報告基因。載體還可以包括幫助其進入宿主細胞的材料，包括但不限於病毒顆粒、脂質體或離子或兩親化合物。
注意，在本揭露內容中，如「包含（comprises/comprised/comprising）」、「含有（contains/containing）」等的術語具有美國專利法中賦予的含義；它們是包容性的或開放式的，並且不排除額外未引用的要素或方法步驟。如「基本上由……組成（consisting essentially of/consists essentially of）」的術語具有美國專利法賦予的含義；它們允許包括不會實質上影響要求保護的發明的基本和新穎特徵的額外成分或步驟。術語「由……組成（consists of/consisting of）」具有美國專利法賦予它們的含義；即這些術語是封閉式的。
嵌合抗原受體
當前細胞免疫療法關於活化和/或擴增從人類受試者分離的免疫細胞的步驟，這些步驟是昂貴且耗時的。免疫細胞的離體活化和/或擴增是阻礙細胞免疫療法廣泛實施的主要障礙之一。在一個方面，本揭露內容關於一種特異性識別白蛋白的嵌合抗原受體（CAR）。可溶性形式的抗原通常缺乏觸發CAR訊息傳遞的能力，因為CAR活化需要抗原誘導的CAR二聚化。白蛋白是相當可溶的，但白蛋白分子之間的頻繁接觸提供了形成明確定義的聚集體（如二聚體、三聚體，甚至更大的結構）的機會。在不希望受到任何理論束縛的情況下，本文揭露的CAR能夠對白蛋白聚集體作出反應，從而活化攜帶CAR的免疫細胞（ 圖 1A）。本文揭露的CAR在離體、體外或體內響應於白蛋白增強免疫細胞（如T細胞）的活化和擴增方面是有用的。無論基於腫瘤浸潤淋巴細胞、T細胞受體（TCR）工程或其他CAR，CAR也可用作輔助受體，以增強所有過繼性T細胞療法中T細胞介導的反應。
在一個方面，本揭露內容提供了一種CAR蛋白，其包含與白蛋白特異性結合的胞外域、跨膜域和胞內訊息傳遞域。在另一個方面，本揭露內容提供了編碼本文所述的CAR蛋白的多核苷酸。
術語「 白蛋白」或「血清白蛋白」是指在脊椎動物血液中發現的白蛋白（一種球狀蛋白）。血清白蛋白由肝臟產生，溶解在血漿中，是哺乳動物中最豐富的血液蛋白。在一些實施例中，血清白蛋白選自人血清白蛋白（HSA）、食蟹獼猴血清白蛋白和小鼠血清白蛋白。在一些實施例中，本文提供的血清白蛋白是HSA。
血清白蛋白高度可溶，可以聚集成二聚體、三聚體或甚至更大的結構。在一些實施例中，白蛋白形成共價連接的二聚體，例如具有二硫鍵連接的Cys-34的二聚體。在一些實施例中，白蛋白形成具有明確定義的結構的非共價二聚體。非共價二聚體的形成可以在生理學上相關的濃度下或響應於例如pH、流體動力學或溫度的條件的變化而發生。非共價形成的二聚體可以容易地逆轉為單體。二聚化與HSA在運輸、結合和其他生理過程中的作用有關（Chubarov A.等人, 《分子》（Molecules） 2021, 26, 108）。
胞外域
在一些實施例中，CAR的胞外域包含特異性結合白蛋白的第一抗原結合域。第一抗原結合域可以是抗體或其抗原結合片段（例如Fv、Fab、(Fab)2、scFv、SDAB、奈米抗體），或本領域中已知的充當抗原結合域的任何替代性骨架。
在一些實施例中，第一抗原結合域來源於CAR最終將被用於的同一物種。例如，CAR的抗原結合域包含的抗體或抗體片段的抗原結合域具有人殘基或人源化殘基可能是有益的。在一些實施例中，抗原結合域包含人抗體或人源化抗體或其抗體片段。術語「人抗體」是指整個分子來源於人類或由與人類形式的抗體或免疫球蛋白相同的胺基酸序列組成的抗體。術語「人源化抗體」是指含有來源於非人免疫球蛋白的序列（例如CDR序列）的抗體。人抗體或人源化抗體或其片段可以通過各種方式製備，例如通過重組方法或通過用感興趣的抗原對小鼠進行免疫，該小鼠經基因修飾以表達衍生自人重鏈和/或輕鏈編碼基因的抗體。
在一些實施例中，第一抗原結合域是單鏈可變片段（scFv）。scFv可以在其VL和VH區之間包含至少1、2、3、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50或更多個胺基酸殘基的肽連接子。連接子序列可包含任何天然存在的胺基酸。在一些實施例中，連接子序列包含胺基酸甘胺酸和絲胺酸。連接子長度的變化可以保留或增強活性。
在一些實施例中，scFv包含重鏈可變（VH）區和輕鏈可變（VL）區。在一些實施例中，VH包含CDR1，其具有如 表 1所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；CDR2，其具有如 表 2所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；以及CDR3，其具有如 表 3所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列。在一些實施例中，VL區包含CDR1，其具有如 表 4所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；CDR2，其具有如 表 5所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；以及CDR3，其具有如 表 6所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列。
表 1
CDR1 殖株編號 序列 SEQ ID NO.
HCDR1 殖株1 NYAIN 1
HCDR1 殖株2 NYGIH 2
HCDR1 殖株3 GFSLSSNAMG 3
HCDR1 殖株4 GFSFSSSYWIC 4
表 2
CDR2 殖株編號 序列 SEQ ID NO.
HCDR2 殖株1 IIWASGTTFYATWAKG 5
HCDR2 殖株2 SISPSGGLTYYRDSVKG 6
HCDR2 殖株3 IISVGGFTYYASWAKG 7
HCDR2 殖株4 CVFTGDGTTYYASWAKG 8
表 3
CDR3 殖株編號 序列 SEQ ID NO.
HCDR3 殖株1 TVPGYSTAPYFDL 9
HCDR3 殖株2 GGEGIFDY 10
HCDR3 殖株3 RDRHGGDSSGAFLY 11
HCDR3 殖株4 RPVSVYYYGMDL 12
表 4
CDR1 殖株編號 序列 SEQ ID NO.
LCDR1 殖株1 QSSPSVWSNFLS 13
LCDR1 殖株2 CRATQSIYNALA 14
LCDR1 殖株3 QSSESVYSNNQLS 15
LCDR1 殖株4 QASQIISSRSA 16
表 5
CDR2 殖株編號 序列 SEQ ID NO.
LCDR2 殖株1 EASKLTS 17
LCDR2 殖株2 NANTLHT 18
LCDR2 殖株3 DASDLAS 19
LCDR2 殖株4 QASKLAS 20
表 6
CDR3 殖株編號 序列 SEQ ID NO.
LCDR3 殖株1 GGGYSSISDTT 21
LCDR3 殖株2 QQYYDYPLT 22
LCDR3 殖株3 AGGFSSSSDTA 23
LCDR3 殖株4 QCTYIDSNFGA 24
在一些實施例中，VH包含CDR1、CDR2和CDR3，其具有選自由以下組成的組的序列：(1) SEQ ID NO: 1、5和9，(2) SEQ ID NO: 2、6和10，(3) SEQ ID NO: 3、7和11，以及(4) SEQ ID NO: 4、8和12，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列。在一些實施例中，VL包含一組CDR1、CDR2和CDR3，其具有選自由以下組的序列：(1) SEQ ID NO: 13、17和21，(2) SEQ ID NO: 14、18和22，(3) SEQ ID NO: 15、19和23，以及(4) SEQ ID NO: 16、19和24，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列。
在一些實施例中，scFv包含： 包含SEQ ID NO: 1、5和9的VH和包含SEQ ID NO: 13、17和21的VL； 包含SEQ ID NO: 2、6和10的VH和包含SEQ ID NO: 14、18和22的VL； 包含SEQ ID NO: 3、7和11的VH和包含SEQ ID NO: 15、19和23的VL；或 包含SEQ ID NO: 4、8和12的VH和包含SEQ ID NO: 16、20和24的VL。
在一些實施例中，scFv包含VH和VL，其包含表7中列出的序列，或與其具有至少80%（例如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%）同一性的序列，或與其具有1、2、3、6、7、8、9、10個胺基酸殘基差異的序列。在一些實施例中，差異發生在CDR以外的區（例如FR中）。
表 7
殖株 1 VH (SEQ ID NO:25)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNYAINWVRQAPGKCLEWIGIIWASGTTFYATWAKGRFTISRDSTTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSS
VL (SEQ ID NO:26)DIVMTQSPSSVSASVGDRVTITCQSSPSVWSNFLSWYQQKPGKAPKLLIYEASKLTSGVPSRFKGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGGGYSSISDTTFGCGTKVEIK
殖株 2 VH (SEQ ID NO:27)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSNAMGWVRQAPGKGLEYIGIISVGGFTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARDRHGGDSSGAFYLWGQGTLVTVSS
VL (SEQ ID NO:28)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSESVYSNNQLSWYQQKPGQPPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAGGFSSSSDTAFGGGTKLTVLG
在一些實施例中，scFv包含 表 8中列出的序列，或與其具有至少80%（例如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%）同一性的序列，或與其具有1、2、3、6、7、8、9、10個胺基酸殘基差異的序列。在一些實施例中，差異發生在CDR以外的區（例如FR中）。
表 8
scFv 1 scFv (SEQ ID NO:29)EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGIDLSNYAINWVRQAPGKCLEWIGIIWASGTTFYATWAKGRFTISRDSTTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARTVPGYSTAPYFDLWGQGTLVTVSSGGGGSDIVMTQSPSSVSASVGDRVTITCQSSPSVWSNFLSWYQQKPGKAPKLLIYEASKLTSGVPSRFKGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGGGYSSISDTTFGCGTKVEIK
scFv 2 scFv (SEQ ID NO:30)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSNAMGWVRQAPGKGLEYIGIISVGGFTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYFCARDRHGGDSSGAFYLWGQGTLVTVSSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQSSESVYSNNQLSWYQQKPGQPPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAGGFSSSSDTAFGGGTKLTVLG
在一些實施例中，第一抗原結合域是單域抗體（SDAB）。術語「單域抗體」是指含有重鏈的單個可變域或輕鏈的單個可變域的抗體片段。在一些實施例中，單域抗體含有1、2或3個互補決定區（CDR）。單域抗體的大小相當小，例如其分子量不超過25 kD、不超過20 kD、不超過15 kD或不超過10 kD。在一些實施例中，單域抗體是人抗體或人源化抗體。
在一些實施例中，單個可變域來源於常規抗體（例如來自人或小鼠）重鏈的可變域（VH域）或普通抗體輕鏈的可變域（VL域）。
在一些實施例中，SDAB包含CDR1，其具有如 表 9所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；CDR2，其具有如 表 10所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；以及CDR3，其具有如 表 11所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列。
表 9
CDR 殖株編號 序列 SEQ ID NO.
LCDR1 dAb7m12 RASQSIFRHLK 31
LCDR1 dAb7m16 RASQSIIKHLK 32
LCDR1 dAb7m26 RASQSIYYHLK 33
LCDR1 dAb7r1 RASQYIGRYLR 34
LCDR1 dAb7r3 RASQYIGRYLR 34
LCDR1 dAb7r4 RASQWIGRYLR 35
LCDR1 dAb7r7 RASQYIGRYLR 34
LCDR1 dAb7r5 RASQYISRQLR 36
LCDR1 dAb7r8 RASQWIHRQLK 37
LCDR1 dAb7r13 RASQHIHRELR 38
LCDR1 dAb7r14 RASQHIHRELR 38
LCDR1 dAb7r15 RASQSIGRRLK 39
LCDR1 dAb7r16 RASQKIYKNLR 40
LCDR1 dAb7r17 RASQKIYNNLR 41
LCDR1 dAb7r18 RASQWIYKSLG 42
LCDR1 dAb7r19 RASQWIYRHLR 43
LCDR1 dAb7h1 RASQSISSYLN 44
LCDR1 dAb7h6 RASQSISSYLN 44
LCDR1 dAb7h7 RASQSISSYLN 44
LCDR1 dAb7h8 RASQSISSYLN 44
LCDR1 dAb7h2 RASQKIATYLN 45
HCDR1 dAb7r20 PYTMS 46
HCDR1 dAb7r21 PYTMS 46
HCDR1 dAb7r22 PYTMS 46
HCDR1 dAb7r23 PYTMS 46
HCDR1 dAb7r24 PYTMS 46
HCDR1 dAb7r25 PYTMS 46
HCDR1 dAb7r26 PYTMS 46
HCDR1 dAb7r27 PYTMS 46
HCDR1 dAb7r28 AYQMA 47
HCDR1 dAb7r29 DYDMT 48
HCDR1 dAb7r30 DYVMG 49
HCDR1 dAb7r31 HYRMG 50
HCDR1 dAb7r32 WDKMG 51
HCDR1 dAb7r33 AYPMS 52
HCDR1 dAb7h30 TYTMA 53
HCDR1 dAb7h31 PTNMS 54
表 10
CDR 殖株編號 序列 SEQ ID NO.
LCDR2 dAb7m12 AASRLQS 55
LCDR2 dAb7m16 GASRLQS 56
LCDR2 dAb7m26 KASTLQS 57
LCDR2 dAb7r1 DSSVLQS 58
LCDR2 dAb7r3 DSSVLQS 58
LCDR2 dAb7r7 DSSVLQS 58
LCDR2 dAb7r4 NGSQLQS 59
LCDR2 dAb7r5 GAVSLQS 60
LCDR2 dAb7r8 YASILQS 61
LCDR2 dAb7r13 QASRLQS 62
LCDR2 dAb7r14 QASRLQS 62
LCDR2 dAb7r15 RTSWLQS 63
LCDR2 dAb7r16 NSSILQS 64
LCDR2 dAb7r17 NTSILQS 65
LCDR2 dAb7r18 QSSLLQS 66
LCDR2 dAb7r19 DASRLQS 67
LCDR2 dAb7h1 RNSFLQS 68
LCDR2 dAb7h2 RSSSLQS 69
LCDR2 dAb7h6 RLSVLQS 70
LCDR2 dAb7h7 RNSQLQS 71
LCDR2 dAb7h8 RNSPLQS 72
HCDR2 dAb7r20 TISPFGSTTYYADSVKG 73
HCDR2 dAb7r21 TISPFGSTTYYADSVKG 73
HCDR2 dAb7r22 TISPFGSTTYYADSVKG 73
HCDR2 dAb7r23 TISPFGSTTYYADSVKG 73
HCDR2 dAb7r24 TISPFGSTTYYADSVKG 73
HCDR2 dAb7r25 TISPFGSTTYYADSVKG 73
HCDR2 dAb7r26 TISPFGSTTYYADSVKG 73
HCDR2 dAb7r27 TISPFGSTTYYADSVKG 73
HCDR2 dAb7r28 TIHQTGFSTYYADSVKG 74
HCDR2 dAb7r29 MISSSGLWTYYADSVKG 75
HCDR2 dAb7r30 LIKPNGSPTYYADSVKG 76
HCDR2 dAb7r31 WIRPDGTFTYYADSVKG 77
HCDR2 dAb7r32 FIGREGYGTYYADSVKG 78
HCDR2 dAb7r33 SISSWGTGTYYADSVKG 79
HCDR2 dAb7h30 SITSSGSTYYADSVKG 80
HCDR2 dAb7h31 TITGTGAATYYADSVKG 81
表 11
CDR 殖株編號 序列 SEQ ID NO:
LCDR3 dAb7m12 QQVALYPKT 82
LCDR3 dAb7m16 QQGARWPQT 83
LCDR3 dAb7m26 QQVRKVPQT 84
LCDR3 dAb7r1 QQRYRMPYT 85
LCDR3 dAb7r3 QQRYMQPFT 86
LCDR3 dAb7r4 QQRYLQPYT 87
LCDR3 dAb7r5 QQRYITYNT 88
LCDR3 dAb7r7 QQRYSSPYT 89
LCDR3 dAb7r8 QQTFSKPST 90
LCDR3 dAb7r13 QQKYLPPYT 91
LCDR3 dAb7r14 QQRYRVPYT 92
LCDR3 dAb7r15 QQTSQWPHT 93
LCDR3 dAb7r16 QQRYLSPYT 94
LCDR3 dAb7r17 QQRWRAPYT 95
LCDR3 dAb7r18 QQYHQMPRT 96
LCDR3 dAb7r19 QQTHNPPKT 97
LCDR3 dAb7h1 QQTYTVPPT 98
LCDR3 dAb7h2 QQTYAVPPT 99
LCDR3 dAb7h6 QQTYNVPPT 100
LCDR3 dAb7h7 QQTFAVPPT 101
LCDR3 dAb7h8 QQTYRLPPT 102
HCDR3 dAb7r20 GGKDFDY 103
HCDR3 dAb7r21 GNLEPFDY 104
HCDR3 dAb7r22 KLSNGFDY 105
HCDR3 dAb7r23 VVKDNTFDY 106
HCDR3 dAb7r24 NTGGKQFDY 107
HCDR3 dAb7r25 KTGPSSFDY 108
HCDR3 dAb7r26 RTENRGVSFDY 109
HCDR3 dAb7r27 SDVLKTGLDGFDY 110
HCDR3 dAb7r28 VRSMRPYKFDY 111
HCDR3 dAb7r29 GFRLFPRTFDY 112
HCDR3 dAb7r30 GRGRFNVLQFDY 113
HCDR3 dAb7r31 SYMGDRFDY 114
HCDR3 dAb7r32 SVASFDY 115
HCDR3 dAb7r33 GGQGSFDY 116
HCDR3 dAb7h30 VNSLYKFDY 117
HCDR3 dAb7h31 QNSRYRFDY 118
在一些實施例中，SDAB包含LCDR1，其具有如 表 9所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；相應的LCDR2，其具有如 表 10所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；以及相應的LCDR3，其具有如 表 11所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列。
在一些實施例中，SDAB包含HCDR1，其具有如 表 9所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；相應的HCDR2，其具有如 表 10所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；以及相應的HCDR3，其具有如 表 11所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列。
在一些實施例中，SDAB包含VH，其包含 表 12中列出的序列，或與其具有至少80%（例如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%）同一性的序列，或與其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個胺基酸殘基差異的序列。在一些實施例中，SDAB包含VL，其包含 表 12中列出的序列，或與其具有至少80%（例如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%）同一性的序列，或與其具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個胺基酸殘基差異的序列。在一些實施例中，差異發生在CDR以外的區（例如FR中）。
表 12
VH1 SEQ ID NO：119 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRTYTMAWVRQAPGKGLEWVSSITSSGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVNSLYKFDYWGQGTLVTVSS
VH2 SEQ ID NO：120 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRPTNMSWVRQAPGKGLEWVSTITGTGAATYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKQNSRYRFDYWGQGTLVTVSS
VL1 SEQ ID NO：121 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIFRHLKWYQQKPGKAPKLLIYAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVALYPKTFGQGTKVEIKR
VL2                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                               SEQ ID NO：122 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYRNSPLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYRVPPTFGQGTKVEIKR
在一些實施例中，單域抗體是奈米抗體，其中單個可變域來源於駱駝科抗體的可變域（VHH域）或軟骨魚抗體的可變域（VNAR域）。駱駝科抗體和軟骨魚抗體都天然缺乏輕鏈而由一對重鏈組成。
在一些實施例中，奈米抗體包含CDR1，其具有如 表 13所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；CDR2，其具有如 表 14所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；以及CDR3，其具有如 表 15所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列。
表 13
CDR 殖株編號 序列 SEQ ID NO:
HCDR1 殖株1 TTCMA 123
HCDR1 殖株2 DYTTG 124
表 14
CDR 殖株編號 序列 SEQ ID NO:
HCDR2 殖株1 TITTGGTYPYYADSVLG 125
HCDR2 殖株2 CISRSDGNTYYAESVL 126
表 15
CDR 殖株編號 序列 SEQ ID NO:
HCDR3 殖株1 DASWGCRLSGSWSTVYNY 127
HCDR3 殖株2 ADRYRSGFLGNGYEYD 128
在一些實施例中，奈米抗體包含HCDR1，其具有如 表 13所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；相應的HCDR2，其具有如 表 14所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；以及相應的HCDR3，其具有如 表 15所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列。
在一些實施例中，奈米抗體包含VHH，其包含 表 16中列出的序列，或與其具有至少80%（例如至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%）同一性的序列，或與其具有1、2、3、6、7、8、9、10個胺基酸殘基差異的序列。在一些實施例中，差異發生在CDR以外的區（例如FR中）。
表 16
殖株編號 1 VHH (SEQ ID NO:129)
  QVQLQGSGGGSVQAGGSLRLSCAASAYTYSTTCMAWFRQAPGKEREKVATITTGGTYPYYADSVKGRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAADASWGCRLSGSWSTVYNYWGQGTQVTVSS
殖株編號 2 VHH (SEQ ID NO:130)
DVQLQASGGDLVQAGGSLRLSCHASGLDDYIIGWFRQAPGKEREGLSCISRSDGNTYYAESVKGRFTISSDNAKNTVYLQMDSLKPEDTAVYYCAADRYRSGFLGNGYEYDYWGQGTQVTVSS
在一些實施例中，胞外域還包含訊號肽。如本文所用，術語「訊號肽」是指存在於多肽的N端，通常具有5-30個胺基酸殘基的長度，是分泌途徑上跨膜轉位和控制多肽進入分泌途徑所必需的肽。
在一些實施例中，訊號肽包含CD8α的訊號肽：在一些實施例中，CD8α的訊號肽包含SEQ ID NO: 130的序列或與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的序列。在一些實施例中，訊號肽包含IgG的訊號肽。
還設想，胞外域可以通過使抗原結合域多聚化，結合相同抗原（多價）或不同抗原（多特異性）而成為多特異性或多價的。
在一些實施例中，CAR包含第二抗原結合域。第二抗原結合域可以是與抗原結合的任何域，包括但不限於抗體或其片段（例如Fv、Fab、(Fab)2、scFv、SDAB、奈米抗體），以及本領域中已知的充當抗原結合域的替代性骨架。
在一些實施例中，第二抗原結合域與第一抗原結合域特異性結合白蛋白的不同表位。包含識別不同表位的抗原結合域的CAR可以同時結合白蛋白，並促進配體誘導的CAR二聚化。
在一些實施例中，第二抗原結合域與癌症抗原特異性結合。術語「癌症抗原」是指在腫瘤中產生的抗原物質。正常細胞和癌細胞都表達的癌症抗原，與正常細胞相比，在癌細胞中過度表達，或僅在癌細胞的細胞表面表達。在一些實施例中，癌症抗原選自CD19、CD20、CAIX、CD33、CD44v7/8、CEA、EGP-2、EGP-40、erb-B2、erb-B3、erb-B4、FBP、胎兒乙醯膽鹼受體、GD2、GD3、Her2/neu、IL-13R-a2、KDR、k輕鏈、LeY、LI細胞黏附分子、MAGE-Al、間皮素、MUCl、KG2D配體、癌胚抗原（h5T4）、PSCA、PSMA、mAb IgE靶向的TAA、TAG-72和VEGF-R。
在一些實施例中，第一和第二抗原結合域串聯排列，任選地由多肽連接子分開（ 圖 1B）。多肽連接子可以具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50或更多個胺基酸殘基。連接子序列可包含任何天然存在的胺基酸。在一些實施例中，連接子序列包含胺基酸甘胺酸和絲胺酸。
跨膜域
本文所述的CAR的跨膜域可來源於任何膜結合蛋白或跨膜蛋白，包括但不限於BAFFR、BLAME（SLAMF8）、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD11a（CD18、ITGAL、LFA-l）、CD11b、CD11c、CD11d、CD16、CD19、CD22、CD27、CD28、CD29、CD33、CD37、CD40、CD45、CD49a、CD49d、CD49f、CD64、CD80、CD84、CD86、CD96（Tactile）、CD100（SEMA4D）、CD103、CD134、CD137（4-1BB）、CD150（IPO-3、SLAMF1、SLAM）、CD154、CD160（BY55）、CD162（SELPLG）、CD226（DNAM1）、CD229（Ly9）、CD244（2B4、SLAMF4）、CD278（ICOS）、CEACAM1、CRT AM、GITR、HYEM（LIGHTR）、IA4、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7R a、ITGA1、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIR、LTBR、OX40、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80（KLRF1）、PAG/Cbp、PSGL1、SLAMF6（NTB-A、Ly108）、SLAMF7、T細胞受體的α、β或ζ鏈、TNFR2、VLA1和VLA-6。
在一個實施例中，本文所述的CAR包含CD8α、CD28或ICOS的跨膜域。在某些實施例中，CD8α的跨膜域具有SEQ ID NO: 132的序列，或與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的序列。
在某些實施例中，本文所述的CAR的跨膜域是合成的，例如主要包含疏水性殘基，如白胺酸和纈胺酸。在某些實施例中，本文所述的CAR的跨膜域被修飾或設計為避免與相同或不同表面膜蛋白的跨膜域結合，以使與受體複合物的其他成員的相互作用最小化。
在一些實施例中，本文所述的CAR還包含鉸鏈區，其形成CAR的胞外域和跨膜域之間的連接。鉸鏈和/或跨膜域提供了CAR的胞外域的細胞表面呈現。
鉸鏈區可來源於任何膜結合蛋白或跨膜蛋白，包括但不限於BAFFR、BLAME（SLAMF8）、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD11a（CD18、ITGAL、LFA-l）、CD11b、CD11c、CD11d、CD16、CD19、CD22、CD27、CD28、CD29、CD33、CD37、CD40、CD45、CD49a、CD49d、CD49f、CD64、CD80、CD84、CD86、CD96（Tactile）、CD100（SEMA4D）、CD103、CD134、CD137（4-1BB）、CD150（IPO-3、SLAMF1、SLAM）、CD154、CD160（BY55）、CD162（SELPLG）、CD226（DNAM1）、CD229（Ly9）、CD244（2B4、SLAMF4）、CD278（ICOS）、CEACAM1、CRT AM、GITR、HYEM（LIGHTR）、IA4、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Ra、ITGA1、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIR、LTBR、OX40、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80（KLRF1）、PAG/Cbp、PSGL1、SLAMF6（NTB-A、Ly108）、SLAMF7、T細胞受體的α、β或ζ鏈、TNFR2、VLA1和VLA-6。
在一些實施例中，鉸鏈區包含CD8α的鉸鏈區、人類免疫球蛋白（Ig）的鉸鏈區或富含甘胺酸-絲胺酸的序列。
在一些實施例中，CAR包含CD8α、CD28、ICOS或IgG4m的鉸鏈區。在某些實施例中，鉸鏈區具有SEQ ID NO: 133的序列，或與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的序列。
胞內域
本文所述的CAR的胞內域負責活化CAR所處的免疫細胞的至少一種正常效應功能。在免疫細胞的上下文中使用的術語「效應功能」是指細胞的專門功能，例如T細胞的細胞溶解活性或輔助活性，包括細胞因子的分泌。
眾所周知，T細胞的完全活化需要通過T細胞受體（TCR）產生的訊號和次級或共刺激訊號。因此，T細胞的活化是由兩類不同的細胞質訊息傳遞序列介導的：那些通過TCR啟動抗原依賴性初級活化的訊息傳遞序列（初級細胞質訊息傳遞序列）和那些以抗原非依賴性方式提供次級或共刺激訊號的訊息傳遞序列（次級細胞質訊息傳遞序列）。
CAR的胞內域可以來源於轉導效應功能訊號並指導細胞執行效應功能的分子，或此類分子的截短部分，只要其轉導訊號即可。此類蛋白質分子包括但不限於B7-H3、BAFFR、BLAME（SLAMF8）、CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、CD4、CD5、CD7、CD8α、CD8β、CD11a（CD18、LFA-1、ITGAL）、CD11b、CD11c、CD11d、CD19、CD27、CD28、CD29、CD30、CD40、CD49a、CD49d、CD49f、CD69、CD79a、CD79b、CD83、CD84、CD86、CD96（Tactile）、CD100（SEMA4D）、CD103、CD127、CD137（4-1BB）、CD150（SLAM、SLAMF1、IPO-3）、CD160（BY55）、CD162（SELPLG）、CD226（DNAM1）、CD229（Ly9）、CD244（SLAMF4、2B4）、CEACAM1、CRTAM、DAP10、DAP12、常見FcRγ、FcRβ（Fcε Rib）、Fcγ RIIa、GADS、GITR、HVEM（LIGHTR）、IA4、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、ICAM-1、ICOS、LIGHT、LTBR、LAT、NKG2C、NKG2D,NKp44、NKp30、NKp46、NKp80（KLRF1）、OX40、PD-1、PAG/Cbp、PSGL1、SLP-76、SLAMF6（NTB-A、Ly108）、SLAMF7、T細胞受體（TCR）、TNFR2、TRANCE/RANKL、VLA1、VLA-6、其任何衍生物、變異體或片段、具有相同功能的分子的任何合成序列及其任何組合。
在一些實施例中，胞內域包含共刺激域和訊息傳遞域，其中當CAR與白蛋白結合時，共刺激域提供共刺激細胞內訊息傳遞而不需要其原始配體，並且訊息傳遞域提供初級活化訊息傳遞。CAR的共刺激域和訊息傳遞域可以隨機或指定的順序相互連接。
共刺激域
在一些實施例中，共刺激域來源於共刺激分子的胞內域。
共刺激分子的實例包括B7-H3、BAFFR、BLAME（SLAMF8）、CD2、CD4、CD8α、CD8β、CD7、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD 18、CD 19、CD27、CD28、CD29、CD30、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD83、CD84、CD96（Tactile）、CD100（SEMA4D）、CD103、CD127、CD137（4-1BB）、CD150（SLAM、SLAMF1、IPO-3）、CD160（BY55）、CD162（SELPLG）、CD226（DNAM1）、CD229（Ly9）、CD244（SLAMF4、2B4）、CEACAM1、CRTAM、CDS、OX40、PD-l、ICOS、GADS、GITR、HVEM（LIGHTR）、IA4、ICAM-l、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、LAT、LFA-l、LIGHT、LTBR、NKG2C、NKG2D、NKp44、NKp30、NKp46、NKp80（KLRF1）、PAG/Cbp、PSGL1、SLAMF6（NTB-A、Lyl08）、SLAMF7、SLP-76、TNFR2、TRANCE/RANKL、VLA1、VLA-6、其任何衍生物、變異體或片段、具有相同功能的共刺激分子的任何合成序列及其任何組合。
在一些實施例中，CAR的共刺激域包含共刺激分子CD137（4-1BB）、CD28、OX40或ICOS的胞內域。在一些實施例中，CAR的共刺激域具有SEQ ID NO: 134的序列，或與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的序列。
訊息傳遞域
TCR複合物的初級活化可以由初級細胞質訊息傳遞序列以刺激性方式或抑制性方式調節。以刺激性方式起作用的初級細胞質訊息傳遞序列可以含有稱為基於免疫受體酪胺酸的活化基序（ITAM）的訊息傳遞基序。在本揭露內容中特別使用的含有ITAM的初級訊息傳遞序列的實例包括那些來源於CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、FcRγ、FCRβ和TCRζ的初級訊息傳遞序列。
在一些實施例中，本揭露內容的CAR的訊息傳遞域包含ITAM，其在CAR與白蛋白結合後提供刺激性胞內訊息傳遞，而不受HLA限制。在一些實施例中，CAR的訊息傳遞域包含CD3ζ（CD247）的訊息傳遞域。在一些實施例中，CAR的訊息傳遞域包含SEQ ID NO: 135的序列，或與其具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的序列。
其他區
在一些實施例中，CAR還包含連接子。如本文所提供的術語「連接子」是連接CAR的各種組分的多肽。
在一些實施例中，連接子插入scFv的VH和VL之間。在一些實施例中，連接子插入跨膜域和胞內域之間。在一些實施例中，連接子在胞內域的訊息傳遞域和共刺激域之間。
在一些實施例中，連接子包含長度在2至20個胺基酸殘基之間的甘胺酸-絲胺酸（GS）雙聯體。示例性GS雙聯體包括(G4S)3：SEQ ID NO: 136。在一些實施例中，本文提供的多核苷酸包含編碼連接子的核苷酸序列。
在一些實施例中，本文提供的CAR從N端到C端包含：CD8α的訊號肽、與白蛋白特異性結合的抗原結合域、CD8α的鉸鏈區、CD8α的跨膜域、CD137的胞內域和CD3ζ的訊息傳遞域。
在一些實施例中，本文提供的多核苷酸編碼CAR，其從N端到C端包含：CD8α的信號肽、與白蛋白特異性結合的抗原結合域、CD8α的鉸鏈區、CD8α的跨膜域、CD137的胞內域和CD3ζ的訊息傳遞域。
在一些實施例中，CAR表現出對白蛋白的高親和力。如本文所用，術語「親和力」是指免疫球蛋白分子或其片段與抗原之間的非共價相互作用的強度。結合親和力可以用Kd值，即解離常數表示，其通過本領域已知的任何方法確定，包括但不限於酶聯免疫吸附測定（ELISA）、表面等離子體共振或流式細胞術（如FACS）。在某些實施例中，CAR對白蛋白的結合親和力小於50 nM、25 nM、10 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM或1 nM。
在一些實施例中，CAR具有以下結構：S-AB-H-TM-IC，其中S是信號肽，AB是抗原結合域，H是鉸鏈區，TM是跨膜域並且IC是胞內訊息傳遞域。在一些實施例中，CAR具有以下結構：S-VH-L-VL-H-TM-IC，其中VH是重鏈可變區，L是連接子，VL是輕鏈可變區。在一些實施例中，CAR具有以下結構：S-VL-L-VH-H-TM-IC，其中VH是重鏈可變區，L是連接子，VL是輕鏈可變區。
在一些實施例中，CAR具有以下結構：S-SDAB-TM-IC，其中SDAB是單域抗體。
在一些實施例中，CAR具有以下結構：S-N-TM-IC，其中N是奈米抗體。
在一些實施例中，CAR具有以下結構：S-AB1-L-AB2-H-TM-IC或S-AB2-L-AB1-H-TM-IC，其中AB1是與白蛋白特異性結合的第一抗原結合域，而AB2是與第一抗原結合域特異性結合白蛋白的不同表位或與癌症抗原特異性結合的第二抗原結合域。在一些實施例中，AB1和AB2可以獨立地是scFV、SDAB或奈米抗體。
載體
在另一個方面，本揭露內容提供了一種載體，其包含編碼本文所述的CAR的多核苷酸。編碼CAR的多核苷酸可以插入本領域已知的不同類型的載體中，例如質體、噬菌體、噬菌體衍生物、來源於動物病毒的病毒載體、黏接質體、轉座子、定點插入載體（例如CRISPR、鋅指核酸酶、TALEN）、體外轉錄的RNA或自殺式表達載體。在一些實施例中，載體是DNA或RNA。
在一些實施例中，多核苷酸可操作地連接於載體中的至少一個調節性多核苷酸元件以用於表達CAR。典型的載體含有各種調節性多核苷酸元件，例如調節插入的多核苷酸表達的元件（例如轉錄和轉譯終止子、起始序列和啟動子），調節載體在宿主細胞中複製的元件（例如複製起點），以及調節載體整合到宿主基因組中的元件（例如轉座子的末端重複序列）。CAR的表達可以通過將編碼CAR的多核苷酸可操作地連接於啟動子，並將該構建體插入載體中來實現。組成型啟動子（如CMV啟動子、SV40啟動子和MMTV啟動子）或誘導型啟動子（如金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子和孕酮啟動子）都可考慮用於本揭露內容。在一些實施例中，載體是表達載體，表達載體包含足夠的順式作用元件用於表達；其他表達元件可以由宿主細胞或在體外表達系統中提供。
為了評估CAR的表達，載體還可以包含可選標記基因或報告基因或兩者，以用於鑒定和選擇引入載體的細胞。有用的可選標記包括例如抗生素抗性基因，如neo等。有用的報告基因包括例如螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、分泌型鹼性磷酸酶或綠色螢光蛋白基因。
在一些實施例中，載體是病毒載體。病毒載體可以來源於例如逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒（AAV）、皰疹病毒和慢病毒。有用的病毒載體一般含有在至少一種生物體內起作用的複製起點、啟動子、限制性核酸內切酶位點和一個或多個可選標記。在一些實施例中，載體是逆轉錄病毒載體，如慢病毒載體。慢病毒載體對於將編碼CAR的多核苷酸長期、穩定地整合到非增殖細胞的基因組中特別有用，從而使CAR在宿主細胞，如宿主T細胞中穩定表達。
在一些實施例中，載體是RNA（例如mRNA）。由於RNA會隨著細胞分裂而被稀釋，所以RNA的表達不會是永久性的。在一個實施例中，體外轉錄的RNA CAR可以瞬時表達的形式引入到細胞中（ 圖 1D）。
具有促進穩定性和/或轉譯效率能力的化學結構也可以用於RNA中。生成用於轉染的RNA的方法可以關於用專門設計的引物對模板進行體外轉錄（IVT），然後添加聚A，以產生含有3'和5'非轉譯序列（「UTR」）、5'帽和/或內部核糖體進入位點（IRES）、待表達的核酸和通常長度為50-2000個鹼基的聚A尾的構建體。這樣產生的RNA可以有效地轉染不同種類的細胞。
RNA可以使用許多不同方法中的任一種引入目標細胞中，例如可用的方法包括但不限於電穿孔或Gene Pulser II（BioRad, Denver, Colo.）、Multiporator（Eppendort, Hamburg Germany）、使用脂質體轉染的陽離子脂質體介導的轉染、聚合物囊封、肽介導的轉染或生物彈粒子遞送系統（如「基因槍」）。
在一些實施例中，載體是表達DNA載體（例如質體、病毒）。當表達DNA載體瞬時引入細胞中時，CAR的mRNA將在宿主細胞中轉錄。由於DNA載體和mRNA會隨著細胞分裂而被稀釋，所以RNA的表達不會是永久性的。在一個實施例中，DNA載體可以CAR的瞬時表達形式引入細胞中。
在一些實施例中，載體是基於轉座子的表達載體。轉座子是可以改變其在基因組內位置的DNA序列。在轉座子系統中，編碼CAR的多核苷酸側面是由介導轉座子移動的轉座酶可識別的末端重複序列。轉座酶可以作為蛋白質共遞送、與CAR編碼在同一載體上或編碼在單獨的載體上。轉座子系統的非限制性實例包括Sleeping Beauty、Piggyback、Frog Prince和Prince Charming。
載體可以通過本領域已知的任何方法，例如通過物理、化學或生物手段引入宿主細胞，例如哺乳動物細胞中。將多核苷酸引入宿主細胞中的物理方法包括磷酸鈣沉澱、脂質轉染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔等。生物方法包括使用病毒載體，特別是逆轉錄病毒載體，將基因插入哺乳動物，例如人類細胞中。化學方法包括膠體分散系統，如大分子複合物、奈米膠囊、微球、珠粒，以及基於脂質的系統，包括水包油乳劑、膠束、混合膠束和脂質體。
細胞
在一個方面，本揭露內容提供了一種工程細胞，其包含或表達如本文所述的CAR。在一些實施例中，工程細胞包含編碼CAR的多核苷酸或包含CAR多核苷酸的載體。
在一些實施例中，工程細胞還包含或表達第二CAR（ 圖 1B）。在一些實施例中，第二CAR包含第二抗原結合域，其與第一抗原結合域特異性結合白蛋白的不同表位。在一些實施例中，第二CAR包含與癌症抗原特異性結合的第二抗原結合域。在一些實施例中，癌症抗原選自由以下組成的組：CD19、CD20、CAIX、CD33、CD44v7/8、CEA、EGP-2、EGP-40、erb-B2、erb-B3、erb-B4、FBP、胎兒乙醯膽鹼受體、GD2、GD3、Her2/neu、IL-13R-a2、KDR、k輕鏈、LeY、LI細胞黏附分子、MAGE-Al、間皮素、MUCl、KG2D配體、癌胚抗原（h5T4）、PSCA、PSMA、TAA、TAG-72和VEGF-R。
在一些實施例中，雙CAR-T細胞可以通過引入和表達包含編碼第一CAR和第二CAR的核苷酸的載體來生成。在一些實施例中，雙CAR-T細胞可以通過引入和表達包含編碼第一CAR的核苷酸的第一載體和包含編碼第二CAR的核苷酸的第二載體來生成。
在一些實施例中，第一載體和第二載體屬同一類型，例如質體、噬菌體、噬菌體衍生物、來源於動物病毒的病毒載體、黏接質體、轉座子、定點插入載體（例如CRISPR、鋅指核酸酶、TALEN）、體外轉錄的RNA或自殺式表達載體。在一些實施例中，第一載體和第二載體屬不同類型。在一些實施例中，第一載體和第二載體獨立地選自能夠永久或瞬時表達的載體。在一些實施例中，包含對白蛋白具有特異性的第一抗原結合域的CAR由RNA載體（例如，體外轉錄的RNA）表達，而包含對癌症抗原具有特異性的第二抗原結合域的CAR由非RNA載體表達。
如本文所述的工程細胞是經基因修飾的免疫細胞，可用於本揭露內容的免疫細胞包括T細胞、自然殺手（NK）細胞、不變NK細胞或NKT細胞，以及其他效應細胞。在一些實施例中，免疫細胞是原代細胞、來源於原代細胞的擴增細胞或來源於體外分化的幹細胞的細胞。「T細胞」包括表達CD3的所有類型的免疫細胞，包括例如T輔助細胞（CD4+細胞）、細胞毒性T細胞（CD8+細胞）、T調節細胞（Treg）和γ-δT細胞。
在另一個方面，本揭露內容提供了一種製造表達如本文所述的CAR的工程細胞的方法。在一些實施例中，所述方法包括選自以下的一個或多個步驟：從來源獲得細胞、培養細胞、活化細胞、擴增細胞和工程改造細胞。
在另一個方面，本揭露內容提供了一種使用工程細胞進行細胞療法的方法，其中工程細胞被引入受試者體內。在一些實施例中，受試者是獲得細胞的同一受試者。
細胞來源
工程細胞可以來源於從受試者，例如人類受試者分離的免疫細胞。在一些實施例中，免疫細胞是從感興趣的受試者獲得，例如疑似患有特定疾病或病況的受試者，疑似具有特定疾病或病況傾向的受試者，將接受、正在接受或已經接受特定疾病或病況治療的受試者，作為健康志願者或健康捐贈者的受試者，或來自血庫。因此，細胞對於感興趣的受試者可以是自體的或同種異體的。同種異體供體細胞可能與人類白細胞抗原（HLA）不相容，因此可以處理同種異體細胞以降低免疫原性。
免疫細胞可以從其在受試者體內駐留的任何位置收集，包括但不限於血液、臍帶血、脾臟、胸腺、淋巴結、胸腔積液、脾臟組織、腫瘤和骨髓。分離的免疫細胞可以直接使用，或其可以儲存一段時間，如通過冷凍。
在一些實施例中，工程細胞來源於T細胞。T細胞可以通過本技術領域中具有通常知識者已知的許多技術，如單採血液成分術從受試者採集的血液中獲得。
在一些實施例中，一個或多個T細胞群被富集或耗盡對特定標誌物，如表面標誌物呈陽性，或對特定標誌物呈陰性的細胞。此類標誌物是在某些T細胞群上不存在或以相對較低的水平表達，但在某些其他T細胞群上存在或以相對較高的水平表達的標誌物。在一些實施例中，分離出CD4+輔助性和CD8+細胞毒性T細胞。在一些實施例中，CD8+和CD4+ T細胞被進一步富集或耗盡初始幹細胞、中央記憶幹細胞、效應記憶和/或中央記憶幹細胞，例如通過基於與各自亞群相關的表面抗原的正向或負向選擇。
細胞的活化和擴增
免疫細胞的活化和/或擴增是免疫細胞功能的主要步驟之一。在一些實施例中，免疫細胞在基因修飾的同時、之前或/和之後被活化和擴增。在一些實施例中，免疫細胞在體外、離體或體內被活化和/或擴增。
活化和擴增免疫細胞的方法已經在本領域中描述，並且可以用於本文描述的方法中。例如，T細胞可以通過與附接有刺激CD3/TCR複合體相關訊號的藥劑和刺激T細胞表面上的共刺激分子的配體的表面接觸來活化和擴增。特別地，可以刺激T細胞群體，如通過與抗CD3抗體或其抗原結合片段或固定在表面上的抗CD2抗體接觸，或與蛋白激酶C活化劑（例如苔蘚蟲素）以及鈣離子載體接觸。為了共刺激T細胞表面的輔助分子，使用與輔助分子結合的配體。例如，在適合刺激T細胞增殖的條件下，T細胞群可以與抗CD3抗體和抗CD28抗體接觸。為了刺激CD4+ T細胞或CD8+ T細胞的增殖，可以使用抗CD3抗體和抗CD28抗體。在某些實施例中，T細胞的初級刺激訊號和共刺激訊號可以由不同的方案提供。
在一些方面，所述方法還包括通過使本揭露內容的工程細胞與包含白蛋白的組合物接觸，在體外或離體擴增和/或誘導T細胞的增殖。在一些實施例中，工程細胞是T細胞。使本揭露內容的工程細胞與包含白蛋白的組合物接觸可以改善當前的免疫細胞培養過程，並在培養過程中增加CAR陽性T細胞的百分比。
在一些實施例中，組合物包含0.1～10 mg/mL的白蛋白。在一些實施例中，組合物包含至少、至多或約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10 mg/mL的白蛋白（或其中任何可推導的範圍）。
在一些實施例中，組合物還包含IL-2。在一些實施例中，組合物包含20～400 U/mL的IL-2。在一些實施例中，組合物包含至少、至多或約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、505、510、515、520、525、530、535、540、545、550、555、560、565、570、575、580、585、590、595、600 U/mL的IL-2（或其中任何可推導的範圍）。
在一些實施例中，所述方法還包括使細胞與飼養細胞接觸。在一些實施例中，飼養細胞被輻照。飼養細胞或支持細胞可以包括例如成纖維細胞、小鼠胚胎成纖維細胞、JK1細胞、SNL 76/7細胞、人胎兒皮膚細胞、人成纖維細胞、人PBMC和人包皮成纖維細胞。
在一些實施例中，所述方法不包括使T細胞與飼養細胞接觸。在一些情況下，排除的飼養細胞來自與T細胞不同的動物物種。
在一些方面，所述方法包括通過使本揭露內容的工程細胞與血液中的白蛋白接觸而在體內擴增和/或誘導T細胞的增殖。在一些實施例中，工程細胞是T細胞。
刺激免疫反應的方法
在另一個方面，本揭露內容關於刺激免疫反應的方法。免疫反應刺激可以在體外、離體或體內進行。在一些實施例中，所述方法關於如本文所述的能夠在白蛋白存在下刺激免疫反應的細胞。
在一些實施例中，刺激免疫反應包括增加免疫刺激細胞因子和/或分子的表達和/或分泌。在一些實施例中，免疫刺激細胞因子和/或分子是TNF-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-18和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子中的一種或多種。
在一些實施例中，刺激免疫反應包括增加免疫細胞的增殖。在一些實施例中，免疫細胞是T細胞。
如本文所述的表達或增殖的增加可以是比基準線表達量如對照（非疾病、非白蛋白或非抗原結合多肽對照）至少、至多或正好增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、200、300、500或1000倍。
在一些實施例中，刺激是在體外或離體進行的，其中如本文所述的工程細胞與包含白蛋白的組合物接觸。
在一些實施例中，刺激是在體內進行的，其中如本文所述的工程細胞與需要免疫刺激的人類受試者體內產生的內源性白蛋白接觸。在一些實施例中，所述方法包括將如本文所述的包含本揭露內容的CAR或核酸的細胞施用於人類受試者（例如，從其獲得細胞的個體），並且所述經基因修飾的細胞在體內被活化（即，通過內源性產生的白蛋白）。
體內刺激免疫反應可以增加體內免疫細胞的增殖，使體內細胞擴增更加有效，縮短體外細胞培養的時間，降低商品成本。在一些實施例中，如本文所述的工程細胞的體內擴增可以比對照（例如，非工程免疫細胞或表達非白蛋白結合的CAR的工程細胞）至少有效2、5、10、20、30、40、50、100倍。
在一些實施例中，人類受試者患有癌症。在一些實施例中，癌症是選自由以下組成的組的實體癌：腎上腺癌、骨癌、腦癌、乳腺癌、結腸直腸癌、食道癌、眼癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、細支氣管肺泡細胞肺癌、間皮瘤、頭頸癌、鱗狀細胞癌、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、子宮頸癌、陰莖癌、前列腺癌、胰腺癌、皮膚癌、肉瘤、睾丸癌、甲狀腺癌、子宮癌、陰道癌。在一些實施例中，癌症是選自由以下組成的組的血液惡性腫瘤：急性淋巴細胞性白血病（ALL）、急性骨髓性白血病（AML）、B細胞白血病、慢性淋巴母細胞性白血病（CLL）、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞瘤（BPDCN）、慢性骨髓單核細胞性白血病（CMML）、慢性粒細胞性白血病（CML）、前B急性淋巴細胞性白血病（Pre-B ALL）、彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、結外NK/T細胞淋巴瘤、毛細胞白血病、重鏈疾病、HHV8相關原發性滲出性淋巴瘤、漿母細胞性淋巴瘤、原發性CNS淋巴瘤、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤、富含T細胞/組織細胞的B細胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症、多發性骨髓瘤（MM）、骨髓增生異常症候群（MDS）、骨髓增生性贅瘤和真性紅細胞增多症。
治療方法
在另一個方面，本揭露內容提供了一種用於治療患者的疾病或病理狀況的方法，其包括向患者施用治療有效量的本文提供的工程細胞。在一些實施例中，所述疾病是癌症。在一些實施例中，癌症是如本文所述的實體腫瘤或血液惡性腫瘤。
在一些實施例中，治療疾病或病理狀況的方法包括提供從受試者分離的T細胞，工程改造T細胞以表達如本文提供的CAR，並將工程T細胞輸回受試者體內。在一些實施例中，所述方法還包括如本文所述體外或離體活化和/或擴增工程細胞，例如通過包括使工程細胞與包含白蛋白的組合物接觸的方法。在一些實施例中，組合物還包含IL-2。在一些實施例中，體外或離體活化和/或擴增工程細胞還包括使工程細胞與飼養細胞接觸。在一些實施例中，飼養細胞被輻照。
在某些實施例中，治療方法還包括施用增加工程細胞功效的藥劑。例如，將促進本揭露內容的工程細胞的生長和活化的生長因子與細胞同時或隨後施用細胞於受試者。生長因子可以是促進免疫細胞生長和活化的任何合適的生長因子。合適的免疫細胞生長因子的實例包括白細胞介素（IL）-2、IL-7、IL-15和IL-12，它們可以單獨使用或以各種組合使用，如IL-2和IL-7，IL-2和IL-15，IL-7和IL-15，IL-2、IL-7和IL-15，IL-12和IL-7、IL-12和IL-15，或IL-12和IL2。
在一些實施例中，治療方法還包括施用減少或改善與施用工程細胞相關的副作用的藥劑。示例性副作用包括細胞因子釋放症候群（CRS）和嗜血細胞淋巴組織細胞增生症（HLH，也稱為巨噬細胞活化症候群（MAS））。經施用以治療副作用的藥劑可以是中和可溶性因子如IFN-γ、IFN-α、IL-2和IL-6的藥劑。此類藥劑包括但不限於TNF-α的抑制劑（例如依那西普（entanercept））和IL-6的抑制劑（例如托珠單抗（tocilizumab））。
治療有效量的工程細胞可以通過多種途徑施用，包括腸胃外施用，例如靜脈內、腹膜內、肌肉內、胸骨內或關節內注射或輸注。
工程細胞可以各種治療方案施用，例如在一天至數天內單次或數次給藥，或在較長時間內定期給藥。所採用的精確劑量也將取決於施用途徑以及患者疾病或病理狀況的嚴重程度，並應根據從業者的判斷和每個病人的情況來決定。工程細胞的治療有效量將取決於所治療的受試者、病痛的嚴重程度和類型以及施用方式。在一些實施例中，可用於治療人類受試者的劑量範圍為至少3.8×10 4、至少3.8×10 5、至少3.8×10 6、至少3.8×10 7、至少3.8×10 8、至少3.8×10 9或至少3.8×10 10個細胞/m 2。在某個實施例中，用於治療人類受試者的劑量範圍為約3.8×10 9至約3.8×10 10個細胞/m 2。在另外的實施例中，工程細胞的治療有效量可以在每公斤體重約5×10 6個細胞至每公斤體重約7.5×10 8個細胞之間，如每公斤體重約2×10 7個細胞至約5×10 8個細胞，或每公斤體重約5×10 7個細胞至約2×10 8個細胞。本技術領域中具有通常知識者可以根據受試者的年齡、體重、性別和生理狀況容易地確定工程細胞的精確量。有效劑量可以從體外或動物模型測試系統得出的劑量反應曲線中推算出來。
在另一個方面，本揭露內容還提供了一種藥物組合物，其包含工程細胞和藥學上可接受的稀釋劑和/或載體。示例性的稀釋劑和/或載體包括緩衝劑，如中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白質；多肽或胺基酸，如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑，如EDTA或穀胱甘肽；佐劑（例如氫氧化鋁）；和防腐劑。在一個方面，本發明的組合物被配製用於靜脈內施用。
表 17. CAR中包含的域的示例性序列
SEQ ID NO. 序列 域
131 MALPVTALLLPLALLLHAARP CD8α訊號肽
132 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIFRHLKWYQQKPGKAPKLLIYAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVALYPKTFGQGTKVEIKR 白蛋白結合域
133 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT CD8α跨膜域
134 TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD CD8α鉸鏈區
135 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL CD137胞內域
136 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR CD3ζ（CD247）訊息傳遞域
137 GGGGSGGGGSGGGGS (G 4S) 3
實例
雖然已經參照具體實施例（其中一些是優選實施例）特別顯示和描述了本揭露內容，但本技術領域的中具有通常知識者應理解，在不脫離本文所揭露的本揭露內容的精神和範圍的情況下，可以在其中進行形式上和細節上的各種改變。
實例1
實例1說明表達針對白蛋白的CAR會增強T細胞的離體擴增。如 圖 2所述，設計並生成了Alb CAR構建體。從TPCS獲得健康供體全血中的人T細胞。用CD3/CD28 Dynabeads（Thermo Fisher Scientific）以1:1的細胞:珠粒比例刺激T細胞24小時，然後用含有CAR構建體的慢病毒進行轉導。T細胞在XF T細胞擴增培養基（STEMCELL Technologies）中培養，並且每2至3天加入50 U/ml IL-2（Thermo Fisher Scientific）。在培養9天後去除Dynabeads。將T細胞以5×10 5個細胞/1 mL/孔接種於24孔板中。培養物每2天補充一次50 U/mL IL-2。每2或3天對細胞進行計數，並在24孔板中以5×10 5個細胞/1 mL/孔進行次培養。與擴增200多倍的對照細胞相比，CAR陽性細胞擴增了60,000多倍（ 圖 3）。
無
併入本文的附圖構成本說明書的一部分。與此書面描述一起，附圖進一步用於解釋本揭露內容的原理，並使相關技術領域中具有通常知識者能夠製造和使用本揭露內容。
圖 1A示出了白蛋白通過CAR對免疫細胞的活化。將白蛋白CAR引入免疫細胞中。白蛋白二聚體誘導CAR二聚化並活化工程免疫細胞（陰影）。
圖 1B示出了白蛋白通過兩種CAR對免疫細胞的活化。第一CAR包含第一抗原結合域，並且第二CAR包含針對白蛋白的第二抗原結合域。兩種CAR在相同的工程免疫細胞中表達，並與同一白蛋白分子的不同表位結合。當兩種CAR通過同一白蛋白分子二聚化時，工程免疫細胞被活化。
圖 1C示出了包含兩個白蛋白結合域的CAR對免疫細胞的活化。當CAR在工程免疫細胞中表達時，一個白蛋白分子與兩個CAR分子結合，為CAR的二聚化和細胞的活化搭建橋樑。
圖 1D示出了靶向白蛋白的CAR的瞬時表達。CAR通過DNA或mRNA轉染表達，細胞被白蛋白活化。活化的細胞增殖，而最終細胞沒有靶向白蛋白的CAR。
圖 2示出了示例性CAR構建體的示意圖。
圖 3示出了表達靶向白蛋白的CAR會增強T細胞的離體擴增。通過慢病毒載體將靶向白蛋白的CAR遞送至T細胞中。通過細胞計數監測細胞生長。與在約30天內擴增了200多倍的對照細胞相比，CAR陽性細胞擴增了60,000多倍。
無
 
                         序列表
          <![CDATA[<110>  大陸商蘇州博騰生物製藥有限公司]]>
          <![CDATA[<120>  靶向白蛋白的嵌合抗原受體及其使用方法]]>
          <![CDATA[<140>  TW111110618]]>
          <![CDATA[<141>  2022-03-22]]>
          <![CDATA[<150>  PCT/CN2021/085179]]>
          <![CDATA[<151>  2021-04-02]]>
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          Gln Cys Thr Tyr Ile Asp Ser Asn Phe Gly Ala 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  119]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 
              50                  55                  60                  
          Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Thr Thr Val Tyr Leu Gln Met 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr 
                          85                  90                  95      
          Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  110]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn 
                      20                  25                  30          
          Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 
                  35                  40                  45              
          Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys 
              50                  55                  60                  
          Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile 
                          85                  90                  95      
          Ser Asp Thr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110 
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  121]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Ile Ile Ser Val Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 
              50                  55                  60                  
          Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Asp Arg His Gly Gly Asp Ser Ser Gly Ala Phe Tyr Leu Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210>  28]]>
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          <![CDATA[<400>  28]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Ser Asn 
                      20                  25                  30          
          Asn Gln Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu 
                  35                  40                  45              
          Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Phe Ser Ser 
                          85                  90                  95      
          Ser Ser Asp Thr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 
                      100                 105                 110         
          <![CDATA[<210>  29]]>
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          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Asn Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp Ala Lys 
              50                  55                  60                  
          Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Thr Thr Val Tyr Leu Gln Met 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr 
                          85                  90                  95      
          Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met 
                  115                 120                 125             
          Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 
              130                 135                 140                 
          Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Ala 
                          165                 170                 175     
          Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser 
                      180                 185                 190         
          Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe 
                  195                 200                 205             
          Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr Thr 
              210                 215                 220                 
          Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
          225                 230                 
          <![CDATA[<210>  30]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  30]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Asn 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Ile Ile Ser Val Gly Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 
              50                  55                  60                  
          Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Asp Arg His Gly Gly Asp Ser Ser Gly Ala Phe Tyr Leu Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile 
                  115                 120                 125             
          Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg 
              130                 135                 140                 
          Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Glu Ser Val Tyr Ser Asn Asn Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 
                          165                 170                 175     
          Tyr Asp Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
                      180                 185                 190         
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
                  195                 200                 205             
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Phe Ser Ser Ser Ser 
              210                 215                 220                 
          Asp Thr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 
          225                 230                 235             
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          Arg Ala Ser Gln Ser Ile Phe Arg His Leu Lys 
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          Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ile Lys His Leu Lys 
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          Arg Ala Ser Gln Ser Ile Tyr Tyr His Leu Lys 
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          Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Arg Tyr Leu Arg 
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          Arg Ala Ser Gln Tyr Ile Ser Arg Gln Leu Arg 
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
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          Arg Ala Ser Gln Trp Ile His Arg Gln Leu Lys 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  38]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          Arg Ala Ser Gln His Ile His Arg Glu Leu Arg 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  39]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  39]]>
          Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Arg Arg Leu Lys 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  40]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  40]]>
          Arg Ala Ser Gln Lys Ile Tyr Lys Asn Leu Arg 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  41]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  41]]>
          Arg Ala Ser Gln Lys Ile Tyr Asn Asn Leu Arg 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  42]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  42]]>
          Arg Ala Ser Gln Trp Ile Tyr Lys Ser Leu Gly 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  43]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  43]]>
          Arg Ala Ser Gln Trp Ile Tyr Arg His Leu Arg 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  44]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  44]]>
          Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  45]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  45]]>
          Arg Ala Ser Gln Lys Ile Ala Thr Tyr Leu Asn 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  46]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  46]]>
          Pro Tyr Thr Met Ser 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  47]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  47]]>
          Ala Tyr Gln Met Ala 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  48]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  48]]>
          Asp Tyr Asp Met Thr 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  49]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  49]]>
          Asp Tyr Val Met Gly 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  50]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  50]]>
          His Tyr Arg Met Gly 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  51]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  51]]>
          Trp Asp Lys Met Gly 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  52]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  52]]>
          Ala Tyr Pro Met Ser 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  53]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  53]]>
          Thr Tyr Thr Met Ala 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  54]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  54]]>
          Pro Thr Asn Met Ser 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  55]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  ]]>合成
          <![CDATA[<400>  55]]>
          Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  56]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  56]]>
          Gly Ala Ser Arg Leu Gln Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  57]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  57]]>
          Lys Ala Ser Thr Leu Gln Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  58]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  58]]>
          Asp Ser Ser Val Leu Gln Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  59]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  59]]>
          Asn Gly Ser Gln Leu Gln Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  60]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  60]]>
          Gly Ala Val Ser Leu Gln Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  61]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  61]]>
          Tyr Ala Ser Ile Leu Gln Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  62]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  62]]>
          Gln Ala Ser Arg Leu Gln Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  63]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  63]]>
          Arg Thr Ser Trp Leu Gln Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  64]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  64]]>
          Asn Ser Ser Ile Leu Gln Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  65]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  65]]>
          Asn Thr Ser Ile Leu Gln Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  66]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  66]]>
          Gln Ser Ser Leu Leu Gln Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  67]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  67]]>
          Asp Ala Ser Arg Leu Gln Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  68]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  68]]>
          Arg Asn Ser Phe Leu Gln Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  69]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  69]]>
          Arg Ser Ser Ser Leu Gln Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  70]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  70]]>
          Arg Leu Ser Val Leu Gln Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  71]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  71]]>
          Arg Asn Ser Gln Leu Gln Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  72]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  72]]>
          Arg Asn Ser Pro Leu Gln Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  73]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  73]]>
          Thr Ile Ser Pro Phe Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  74]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  74]]>
          Thr Ile His Gln Thr Gly Phe Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  75]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  75]]>
          Met Ile Ser Ser Ser Gly Leu Trp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  76]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  76]]>
          Leu Ile Lys Pro Asn Gly Ser Pro Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  77]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  77]]>
          Trp Ile Arg Pro Asp Gly Thr Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  78]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  78]]>
          Phe Ile Gly Arg Glu Gly Tyr Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  79]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  79]]>
          Ser Ile Ser Ser Trp Gly Thr Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  80]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  80]]>
          Ser Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  81]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  81]]>
          Thr Ile Thr Gly Thr Gly Ala Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  82]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  82]]>
          Gln Gln Val Ala Leu Tyr Pro Lys Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  83]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  83]]>
          Gln Gln Gly Ala Arg Trp Pro Gln Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  84]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  84]]>
          Gln Gln Val Arg Lys Val Pro Gln Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  85]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  85]]>
          Gln Gln Arg Tyr Arg Met Pro Tyr Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  86]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  86]]>
          Gln Gln Arg Tyr Met Gln Pro Phe Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  87]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  87]]>
          Gln Gln Arg Tyr Leu Gln Pro Tyr Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  88]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  88]]>
          Gln Gln Arg Tyr Ile Thr Tyr Asn Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  89]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  89]]>
          Gln Gln Arg Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  90]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  90]]>
          Gln Gln Thr Phe Ser Lys Pro Ser Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  91]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  91]]>
          Gln Gln Lys Tyr Leu Pro Pro Tyr Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  92]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  92]]>
          Gln Gln Arg Tyr Arg Val Pro Tyr Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  93]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  93]]>
          Gln Gln Thr Ser Gln Trp Pro His Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  94]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  94]]>
          Gln Gln Arg Tyr Leu Ser Pro Tyr Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  95]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  95]]>
          Gln Gln Arg Trp Arg Ala Pro Tyr Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  96]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  96]]>
          Gln Gln Tyr His Gln Met Pro Arg Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  97]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  97]]>
          Gln Gln Thr His Asn Pro Pro Lys Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  98]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  98]]>
          Gln Gln Thr Tyr Thr Val Pro Pro Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  99]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  99]]>
          Gln Gln Thr Tyr Ala Val Pro Pro Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  100]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  100]]>
          Gln Gln Thr Tyr Asn Val Pro Pro Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  101]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  101]]>
          Gln Gln Thr Phe Ala Val Pro Pro Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  102]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  102]]>
          Gln Gln Thr Tyr Arg Leu Pro Pro Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  103]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  103]]>
          Gly Gly Lys Asp Phe Asp Tyr 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  104]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  104]]>
          Gly Asn Leu Glu Pro Phe Asp Tyr 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  105]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  105]]>
          Lys Leu Ser Asn Gly Phe Asp Tyr 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  106]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  106]]>
          Val Val Lys Asp Asn Thr Phe Asp Tyr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  107]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  107]]>
          Asn Thr Gly Gly Lys Gln Phe Asp Tyr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  108]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  108]]>
          Lys Thr Gly Pro Ser Ser Phe Asp Tyr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  109]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  109]]>
          Arg Thr Glu Asn Arg Gly Val Ser Phe Asp Tyr 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  110]]>
          <![CDATA[<211>  13]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  110]]>
          Ser Asp Val Leu Lys Thr Gly Leu Asp Gly Phe Asp Tyr 
          1               5                   10              
          <![CDATA[<210>  111]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  111]]>
          Val Arg Ser Met Arg Pro Tyr Lys Phe Asp Tyr 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  112]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  112]]>
          Gly Phe Arg Leu Phe Pro Arg Thr Phe Asp Tyr 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  113]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  113]]>
          Gly Arg Gly Arg Phe Asn Val Leu Gln Phe Asp Tyr 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210>  114]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  114]]>
          Ser Tyr Met Gly Asp Arg Phe Asp Tyr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  115]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  115]]>
          Ser Val Ala Ser Phe Asp Tyr 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  116]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  116]]>
          Gly Gly Gln Gly Ser Phe Asp Tyr 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  117]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  117]]>
          Val Asn Ser Leu Tyr Lys Phe Asp Tyr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  118]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  118]]>
          Gln Asn Ser Arg Tyr Arg Phe Asp Tyr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  119]]>
          <![CDATA[<211>  117]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  119]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Thr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Ser Ile Thr Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 
              50                  55                  60                  
          Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Lys Val Asn Ser Leu Tyr Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 
                      100                 105                 110         
          Val Thr Val Ser Ser 
                  115         
          <![CDATA[<210>  120]]>
          <![CDATA[<211>  118]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  120]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Pro Thr 
                      20                  25                  30          
          Asn Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Thr Ile Thr Gly Thr Gly Ala Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Lys Gln Asn Ser Arg Tyr Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115             
          <![CDATA[<210>  121]]>
          <![CDATA[<211>  108]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  121]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Phe Arg His 
                      20                  25                  30          
          Leu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Ala Leu Tyr Pro Lys 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 
                      100                 105             
          <![CDATA[<210>  122]]>
          <![CDATA[<211>  108]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  122]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Arg Asn Ser Pro Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Arg Val Pro Pro 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 
                      100                 105             
          <![CDATA[<210>  123]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  123]]>
          Thr Thr Cys Met Ala 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  124]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  124]]>
          Asp Tyr Thr Thr Gly 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  125]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  125]]>
          Thr Ile Thr Thr Gly Gly Thr Tyr Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Leu 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  126]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  126]]>
          Cys Ile Ser Arg Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Leu 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  127]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  127]]>
          Asp Ala Ser Trp Gly Cys Arg Leu Ser Gly Ser Trp Ser Thr Val Tyr 
          1               5                   10                  15      
          Asn Tyr 
          <![CDATA[<210>  128]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  128]]>
          Ala Asp Arg Tyr Arg Ser Gly Phe Leu Gly Asn Gly Tyr Glu Tyr Asp 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  129]]>
          <![CDATA[<211>  127]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  129]]>
          Gln Val Gln Leu Gln Gly Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Tyr Thr Tyr Ser Thr Thr 
                      20                  25                  30          
          Cys Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Lys Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Thr Ile Thr Thr Gly Gly Thr Tyr Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Ala Asp Ala Ser Trp Gly Cys Arg Leu Ser Gly Ser Trp Ser Thr 
                      100                 105                 110         
          Val Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125         
          <![CDATA[<210> ]]> 130
          <![CDATA[<211>  123]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<21]]>3>  人工序列]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;220&gt;]]&gt;
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;223&gt;  合成]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;400&gt;  130]]&gt;
          <br/>
          <br/><![CDATA[Asp Val Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Ala Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys His Ala Ser Gly Leu Asp Asp Tyr Ile Ile 
                      20                  25                  30          
          Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Leu Ser Cys 
                  35                  40                  45              
          Ile Ser Arg Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala 
                          85                  90                  95      
          Asp Arg Tyr Arg Ser Gly Phe Leu Gly Asn Gly Tyr Glu Tyr Asp Tyr 
                      100                 105                 110         
          Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120             
          <![CDATA[<210>  131]]>
          <![CDATA[<211>  ]]>21
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>]]>  人工序列
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  131]]>
          Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 
          1               5                   10                  15      
          His Ala Ala Arg Pro 
                      20      
          <![CDATA[<210>  132]]>
          <![CDATA[<211>  108]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  132]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Phe Arg His 
                      20                  25                  30          
          Leu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Ala Leu Tyr Pro Lys 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 
                      100                 105             
          <![CDATA[<210>  133]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  133]]>
          Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Val Ile Thr 
                      20      
          <![CDATA[<210>  134]]>
          <![CDATA[<211>  45]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  134]]>
          Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 
                      20                  25                  30          
          Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 
                  35                  40                  45  
          <![CDATA[<210>  135]]>
          <![CDATA[<211>  42]]>
          <![CDATA[<212>]]>  PRT
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  135]]>
          Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 
          1               5                   10                  15      
          Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 
                      20                  25                  30          
          Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 
                  35                  40          
          <![CDATA[<210>  136]]>
          <![CDATA[<211>  112]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  136]]>
          Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 
                  35                  40                  45              
          Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 
                          85                  90                  95      
          Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 
                      100                 105                 110         
          <![CDATA[<210>  137]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成]]>
          <![CDATA[<400>  137]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5                   10                  15
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004
Figure 12_A0101_SEQ_0005
Figure 12_A0101_SEQ_0006
Figure 12_A0101_SEQ_0007
Figure 12_A0101_SEQ_0008
Figure 12_A0101_SEQ_0009
Figure 12_A0101_SEQ_0010
Figure 12_A0101_SEQ_0011
Figure 12_A0101_SEQ_0012
Figure 12_A0101_SEQ_0013
Figure 12_A0101_SEQ_0014
Figure 12_A0101_SEQ_0015
Figure 12_A0101_SEQ_0016
Figure 12_A0101_SEQ_0017
Figure 12_A0101_SEQ_0018
Figure 12_A0101_SEQ_0019
Figure 12_A0101_SEQ_0020
Figure 12_A0101_SEQ_0021
Figure 12_A0101_SEQ_0022
Figure 12_A0101_SEQ_0023
Figure 12_A0101_SEQ_0024
Figure 12_A0101_SEQ_0025
Figure 12_A0101_SEQ_0026
Figure 12_A0101_SEQ_0027
Figure 12_A0101_SEQ_0028
Figure 12_A0101_SEQ_0029
Figure 12_A0101_SEQ_0030
Figure 12_A0101_SEQ_0031
Figure 12_A0101_SEQ_0032
Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
Figure 12_A0101_SEQ_0035
Figure 12_A0101_SEQ_0036
Figure 12_A0101_SEQ_0037
Figure 12_A0101_SEQ_0038
Figure 12_A0101_SEQ_0039
Figure 12_A0101_SEQ_0040
Figure 12_A0101_SEQ_0041
Figure 12_A0101_SEQ_0042
Figure 12_A0101_SEQ_0043
Figure 12_A0101_SEQ_0044
Figure 12_A0101_SEQ_0045
Figure 12_A0101_SEQ_0046
Figure 12_A0101_SEQ_0047
Figure 12_A0101_SEQ_0048
Figure 12_A0101_SEQ_0049

Claims (68)

  1. 一種編碼嵌合抗原受體（CAR）的多核苷酸，其中所述CAR包含(1)包含第一抗原結合域的胞外域，(2)跨膜域和(3)胞內訊息傳遞域，其中所述第一抗原結合域與白蛋白特異性結合。
  2. 根據請求項1所述的多核苷酸，其中所述第一抗原結合域是單鏈可變片段（scFv）。
  3. 根據請求項2所述的多核苷酸，其中所述scFv包含重鏈可變（VH）區和輕鏈可變（VL）區。
  4. 根據請求項3所述的多核苷酸，其中所述VH區包含HCDR1，其具有如表1所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；HCDR2，其具有如表2所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；以及HCDR3，其具有如表3所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列。
  5. 根據請求項3所述的多核苷酸，其中所述VL區包含LCDR1，其具有如表4所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；LCDR2，其具有如表5所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；以及LCDR3，其具有如表6所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列。
  6. 根據請求項1所述的多核苷酸，其中所述抗原結合域是單域抗體（SDAB）。
  7. 根據請求項6所述的多核苷酸，其中所述SDAB包含CDR1，其具有如表9所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；CDR2，其具有如表10所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；以及CDR3，其具有如表11所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列。
  8. 根據請求項1所述的多核苷酸，其中所述抗原結合域是奈米抗體。
  9. 根據請求項8所述的多核苷酸，其中所述奈米抗體包含CDR1，其具有如表13所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；CDR2，其具有如表14所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列；以及CDR3，其具有如表15所示的序列，或與其具有至少90%同一性的序列，或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列。
  10. 根據請求項1所述的多核苷酸，其中所述抗原結合域包含SEQ ID NO: 131的序列或與其具有至少90%同一性的序列。
  11. 根據請求項1所述的多核苷酸，其中所述CAR還包含訊號肽。
  12. 根據請求項11所述的多核苷酸，其中所述訊號肽包含CD8α的訊號肽。
  13. 根據請求項12所述的多核苷酸，其中所述CD8α的訊號肽包含SEQ ID NO: 130的序列或與其具有至少90%同一性的序列；或與其具有1、2、3個胺基酸殘基差異的序列。
  14. 根據請求項1所述的多核苷酸，其中所述跨膜域包含CD8α的跨膜域。
  15. 根據請求項14所述的多核苷酸，其中所述CD8α的跨膜域包含SEQ ID NO: 132的序列或與其具有至少90%同一性的序列；或與其具有1、2、3、4或5個胺基酸殘基差異的序列。
  16. 根據請求項1所述的多核苷酸，其中所述胞外域通過鉸鏈區連接至所述跨膜域。
  17. 根據請求項16所述的多核苷酸，其中所述鉸鏈區包含CD8α的鉸鏈區。
  18. 根據請求項17所述的多核苷酸，其中所述CD8α的鉸鏈區包含SEQ ID NO: 133的序列或與其具有至少90%同一性的序列；或與其具有1、2、3、4或5個胺基酸殘基差異的序列。
  19. 根據請求項1所述的多核苷酸，其中胞內域包含共刺激域和訊息傳遞域。
  20. 根據請求項19所述的多核苷酸，其中所述共刺激域包含CD137的胞內域。
  21. 根據請求項20所述的多核苷酸，其中所述CD137的胞內域包含SEQ ID NO: 134的序列或與其具有至少90%同一性的序列；或與其具有1、2、3、4或5個胺基酸殘基差異的序列。
  22. 根據請求項19所述的多核苷酸，其中所述胞內域包含CD3ζ的訊息傳遞域。
  23. 根據請求項22所述的多核苷酸，其中所述CD3ζ的訊息傳遞域包含SEQ ID NO: 135的序列或與其具有至少90%同一性的序列。
  24. 根據請求項1所述的多核苷酸，其中所述CAR具有以下結構：S-AB-H-TM-IC，其中S是訊號肽，AB是抗原結合域，H是鉸鏈區，TM是跨膜域並且IC是胞內訊息傳遞域。
  25. 根據請求項24所述的多核苷酸，其中所述CAR具有以下結構：S-VH-L-VL-H-TM-IC，其中VH是重鏈可變區，L是連接子，VL是輕鏈可變區。
  26. 根據請求項24所述的多核苷酸，其中所述CAR具有以下結構：S-VL-L-VH-H-TM-IC，其中VH是重鏈可變區，L是連接子，VL是輕鏈可變區。
  27. 根據請求項24所述的多核苷酸，其中所述CAR具有以下結構：S-SDAB-H-TM-IC，其中SDAB是單域抗體。
  28. 根據請求項24所述的多核苷酸，其中所述CAR具有以下結構：S-N-H-TM-IC，其中N是奈米抗體。
  29. 根據請求項1所述的多核苷酸，其中所述胞外域還包含與癌症抗原特異性結合的第二抗原結合域。
  30. 根據請求項29所述的多核苷酸，其中所述癌症抗原選自由以下組成的組：CD19、CD20、CAIX、CD33、CD44v7/8、CEA、EGP-2、EGP-40、erb-B2、erb-B3、erb-B4、FBP、胎兒乙醯膽鹼受體、GD2、GD3、Her2/neu、IL-13R-a2、KDR、k輕鏈、LeY、LI細胞黏附分子、MAGE-Al、間皮素、MUCl、KG2D配體、癌胚抗原（h5T4）、PSCA、PSMA、TAA、TAG-72和VEGF-R。
  31. 根據請求項1所述的多核苷酸，其中所述胞外域還包含與白蛋白特異性結合的第二抗原結合域，其中所述第一抗原結合域和第二抗原結合域結合白蛋白的不同表位。
  32. 根據請求項31所述的多核苷酸，其中所述胞外域還包含與癌症抗原特異性結合的第三抗原結合域。
  33. 根據請求項1至32中任一項所述的多核苷酸，其為DNA或RNA。
  34. 一種多肽，其由根據請求項1至33中任一項所述的多核苷酸編碼。
  35. 一種載體，其包含根據請求項1至33中任一項所述的多核苷酸，其中編碼所述CAR的所述多核苷酸可操作地連接於至少一個調節性多核苷酸元件以用於表達所述CAR。
  36. 根據請求項35所述的載體，其中所述載體是質體載體、病毒載體、轉座子、定點插入載體或自殺式表達載體。
  37. 根據請求項36所述的載體，其中所述病毒載體是慢病毒載體、逆轉錄病毒載體或AAV載體。
  38. 一種工程細胞，其包含根據請求項34所述的多肽。
  39. 根據請求項38所述的工程細胞，其中所述工程細胞是T細胞或NK細胞。
  40. 根據請求項38所述的工程細胞，其還包含第二CAR，其中所述第二CAR包含與癌症抗原特異性結合的第二抗原結合域。
  41. 根據請求項40所述的工程細胞，其中所述癌症抗原選自由以下組成的組：CD19、CD20、CAIX、CD33、CD44v7/8、CEA、EGP-2、EGP-40、erb-B2、erb-B3、erb-B4、FBP、胎兒乙醯膽鹼受體、GD2、GD3、Her2/neu、IL-13R-a2、KDR、k輕鏈、LeY、LI細胞黏附分子、MAGE-Al、間皮素、MUCl、KG2D配體、癌胚抗原（h5T4）、PSCA、PSMA、TAA、TAG-72和VEGF-R。
  42. 根據請求項38所述的工程細胞，其還包含第二CAR，其中所述第二CAR包含與白蛋白特異性結合的第二抗原結合域，其中所述第一抗原結合域和第二抗原結合域結合白蛋白的不同表位。
  43. 根據請求項42所述的工程細胞，其還包含第三CAR，其中所述第三CAR包含與癌症抗原特異性結合的第三抗原結合域。
  44. 一種用於刺激免疫反應的方法，其包括使根據請求項38至43中任一項所述的工程細胞與白蛋白接觸。
  45. 根據請求項44所述的方法，其中所述工程細胞與白蛋白離體接觸。
  46. 根據請求項44所述的方法，其中通過向需要免疫刺激的受試者施用所述工程細胞而使所述工程細胞與白蛋白在體內接觸。
  47. 根據請求項46所述的方法，其中所述受試者患有癌症。
  48. 根據請求項47所述的方法，其中所述癌症是選自由以下組成的組的實體癌：腎上腺癌、骨癌、腦癌、乳腺癌、結腸直腸癌、食道癌、眼癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、細支氣管肺泡細胞肺癌、間皮瘤、頭頸癌、鱗狀細胞癌、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、子宮頸癌、陰莖癌、前列腺癌、胰腺癌、皮膚癌、肉瘤、睾丸癌、甲狀腺癌、子宮癌、陰道癌。
  49. 根據請求項47所述的方法，其中所述癌症是選自由以下組成的組的血液惡性腫瘤：急性淋巴細胞性白血病（ALL）、急性骨髓性白血病（AML）、B細胞白血病、慢性淋巴母細胞性白血病（CLL）、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞瘤（BPDCN）、慢性骨髓單核細胞性白血病（CMML）、慢性粒細胞性白血病（CML）、前B急性淋巴細胞性白血病（Pre-B ALL）、彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、結外NK/T細胞淋巴瘤、毛細胞白血病、重鏈疾病、HHV8相關原發性滲出性淋巴瘤、漿母細胞性淋巴瘤、原發性CNS淋巴瘤、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤、富含T細胞/組織細胞的B細胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症、多發性骨髓瘤（MM）、骨髓增生異常症候群（MDS）、骨髓增生性贅瘤和真性紅細胞增多症。
  50. 根據請求項44至49中任一項所述的方法，其中刺激免疫反應包括增加免疫刺激細胞因子和/或分子的表達和/或分泌。
  51. 根據請求項50所述的方法，其中所述免疫刺激細胞因子和/或分子是TNF-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-18和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子中的一種或多種。
  52. 根據請求項45至50中任一項所述的方法，其中刺激免疫反應包括增加免疫細胞的增殖。
  53. 根據請求項52所述的方法，其中所述免疫細胞是T細胞。
  54. 一種體外擴增細胞的方法，所述方法包括在包含白蛋白的培養基中體外培養根據請求項38至43中任一項所述的工程細胞。
  55. 根據請求項54所述的方法，其中所述培養基還包含IL-2。
  56. 根據請求項54或55所述的方法，其中所述方法還包括使所述工程細胞與飼養細胞接觸。
  57. 根據請求項56所述的方法，其中所述飼養細胞被輻照。
  58. 一種體外擴增細胞的方法，所述方法包括將根據請求項1至33中任一項所述的多核苷酸引入體外細胞，從而表達CAR；以及在包含白蛋白的培養基中培養所述細胞。
  59. 根據請求項58所述的方法，其中所述細胞是T細胞或NK細胞。
  60. 根據請求項58所述的方法，其中所述CAR是瞬時表達的。
  61. 一種用於治療患者的疾病或病理狀況的方法，其包括向所述患者施用治療有效量的根據請求項38至43中任一項所述的工程細胞。
  62. 根據請求項61所述的方法，其中所述疾病是癌症。
  63. 根據請求項62所述的方法，其中所述癌症是選自由以下組成的組的實體癌：腎上腺癌、骨癌、腦癌、乳腺癌、結腸直腸癌、食道癌、眼癌、胃癌、頭頸癌、腎癌、肝癌、肺癌、非小細胞肺癌、細支氣管肺泡細胞肺癌、間皮瘤、頭頸癌、鱗狀細胞癌、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、子宮頸癌、陰莖癌、前列腺癌、胰腺癌、皮膚癌、肉瘤、睾丸癌、甲狀腺癌、子宮癌、陰道癌。
  64. 根據請求項62所述的方法，其中所述癌症是選自由以下組成的組的血液惡性腫瘤：急性淋巴細胞性白血病（ALL）、急性骨髓性白血病（AML）、B細胞白血病、慢性淋巴母細胞性白血病（CLL）、母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞瘤（BPDCN）、慢性骨髓單核細胞性白血病（CMML）、慢性粒細胞性白血病（CML）、前B急性淋巴細胞性白血病（Pre-B ALL）、彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、結外NK/T細胞淋巴瘤、毛細胞白血病、重鏈疾病、HHV8相關原發性滲出性淋巴瘤、漿母細胞性淋巴瘤、原發性CNS淋巴瘤、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤、富含T細胞/組織細胞的B細胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症、多發性骨髓瘤（MM）、骨髓增生異常症候群（MDS）、骨髓增生性贅瘤和真性紅細胞增多症。
  65. 根據請求項61至64中任一項所述的方法，其中所述工程細胞已通過包括在包含白蛋白的培養基中體外培養所述工程細胞的方法在體外擴增。
  66. 根據請求項65所述的方法，其中所述培養基還包含IL-2。
  67. 根據請求項65或66所述的方法，其中所述方法還包括使所述工程細胞與飼養細胞接觸。
  68. 根據請求項67所述的方法，其中所述飼養細胞被輻照。
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