TW202304959A - 多肽的製備及其應用 - Google Patents

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Abstract

一系列多肽的製備及其應用，具體公開了式（II）所示序列的多肽。 YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS 0（II）

Description

多肽的製備及其應用
本發明涉及一系列多肽的製備及其應用，具體涉及式（II）所示序列的多肽。
本申請要求申請日為2021/5/28的中國專利申請2021105946626，申請日為2021/07/19的中國專利申請CN2021108141169，申請日為2022/02/15的中國專利申請CN2022101388358，申請日為2022/05/18的中國專利申請CN2022105520774的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。
非酒精性脂肪肝(NAFLD)的全球發病率高達25%，其中非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的全球發病率約為3%-8%。部分NASH病人將進一步進展為肝硬化及肝癌，是目前終末期肝病和肝移植的主要原因之一。NASH發病機制複雜，目前並沒有FDA批准的藥物用於治療該疾病。多項臨床前研究發現，葡萄糖依賴性促胰島素樣肽（GIP）/胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)雙重激動劑可用於NASH治療。禮來在研藥物GLP-1/GIP雙重激動劑Tirzepatide臨床研究結果顯示其可改善NASH相關的轉氨酶等相關標記物，展現了治療NASH的潛力。
GLP-1激動劑可以通過多途徑協同作用治療NASH。如：GLP-1激動劑可降低循環中的腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素IL -1β，IL-6，CD163及hsCRP水平，達到抑制炎症的藥效。GIP是由小腸的神經內分泌K細胞分泌的多肽，可在GLP-1激動劑治療基礎上進一步緩解肝臟脂肪合成，因此GLP-1/GIP雙重激動劑對NASH治療具有協同效應。
本發明提供了式（II）所示序列的多肽， YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS 0（II） 其具有以下修飾： 1）i和i+3位置的賴胺酸側鏈上的氨基或j和j+4位置的賴胺酸側鏈上的氨基與
Figure 02_image001
相連，其中i為17（即：當i為17時，17位的異亮胺酸先替換為賴胺酸，然後其側鏈上的氨基再與20位的賴胺酸側鏈上的氨基與
Figure 02_image001
相連），或其中j為20；且 2）式（II）所示系列的多肽另外的0-2個胺基酸被替換； 其中， Aib的結構為
Figure 02_image003
； S 0選自
Figure 02_image005
和
Figure 02_image007
； X選自
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
和
Figure 02_image013
，其中，“*”表示與X 1相連的位置； X 1選自單鍵、-C(=O)-、-O-C(=O)-和-N(R 1)-C(=O)-； R 1選自H和C 1-3烷基； X 2選自
Figure 02_image015
和
Figure 02_image017
； m選自2、3和4； n選自15、16、17、18和19； p選自1和2。
本發明提供了式（P）所示序列的多肽， YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS 0（P） 其具有以下修飾： 1）17和20位置的賴胺酸側鏈上的氨基與
Figure 02_image001
相連；且 2）式（P）所示序列的多肽的0-2個胺基酸被替換； 其中， Aib的結構為
Figure 02_image003
； S 0選自
Figure 02_image005
和
Figure 02_image007
； X選自
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
和
Figure 02_image013
，其中，“*”表示與X 1相連的位置； X 1選自單鍵、-C(=O)-、-O-C(=O)-和-N(R 1)-C(=O)-； R 1選自H和C 1-3烷基； X 2選自
Figure 02_image015
和
Figure 02_image017
； m選自2、3和4； n選自15、16、17、18和19； p選自1和2。
本發明提供了式（II）所示序列的多肽， YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS 0（II） 其具有以下修飾： 1）i和i+3位置的賴胺酸側鏈上的氨基或j和j+4位置的賴胺酸側鏈上的氨基與
Figure 02_image001
相連，其中i為17，其中j為20（17位的異亮胺酸先替換為賴胺酸，然後其側鏈上的氨基再與20位的賴胺酸側鏈上的氨基相連）；且 2）式（II）所示系列的多肽另外的0-2個胺基酸被替換； 其中， Aib的結構為
Figure 02_image003
； S 0選自
Figure 02_image005
和
Figure 02_image007
； X選自
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
和
Figure 02_image019
，其中，“*”表示與X 1相連的位置； X 1選自單鍵、-C(=O)-、-O-C(=O)-和-N(R 1)-C(=O)-； R 1選自H和C 1-3烷基； X 2選自
Figure 02_image015
和
Figure 02_image017
； m選自2、3和4； n選自15、16、17、18和19； p選自1和2。
在本發明的一些方案中，所述多肽中第21、23或24位中0-2個胺基酸被替換，其餘變量如本發明所定義。
在本發明的一些方案中，上述的多肽，其具有式（II-1）、（II-2）、（II-3）、（II-4）、（III-6）、（IV-7）、（IV-8）、（IV-9）和（IV-10）所示序列， YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS-NH 2（II-1） YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK EFVKW LIAGG PSSGA PPPS-NH 2（II-2） YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFIKW LIAGG PSSGA PPPS-NH 2（II-3） YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LLAGG PSSGA PPPS-NH 2（II-4） YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVEW LIAGG PSSGA PPPS-NH 2（III-6） YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVQW LIAGG PSSGA PPPS-NH 2（IV-7） YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVAW LIAGG PSSGA PPPS-NH 2（IV-8） YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVIW LIAGG PSSGA PPPS-NH 2（IV-9） YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK EFVEW LIAGG PSSGA PPPS-NH 2（IV-10） 其具有以下修飾： 17和20位置的賴胺酸側鏈上的氨基或20和24位置的賴胺酸側鏈上的氨基與
Figure 02_image001
相連， 其中， Aib、X、X 1和X 2如本發明所定義。
在本發明的一些方案中，上述R 1選自H，其他變量如本發明所定義。
在本發明的一些方案中，上述X 1選自單鍵、-C(=O)-、-O-C(=O)-和-NH-C(=O)-，其他變量如本發明所定義。
在本發明的一些方案中，上述m選自2，其他變量如本發明所定義。
在本發明的一些方案中，上述n選自15和17，其他變量如本發明所定義。
在本發明的一些方案中，上述X 2選自
Figure 02_image021
、
Figure 02_image023
、
Figure 02_image025
和
Figure 02_image027
，其他變量如本發明所定義。
在本發明的一些方案中，上述X 2選自
Figure 02_image029
、
Figure 02_image031
、
Figure 02_image033
和
Figure 02_image035
，其他變量如本發明所定義。
在本發明的一些方案中，上述i和i+3位置的賴胺酸側鏈上的氨基或j和j+4位置的賴胺酸側鏈上的氨基與
Figure 02_image001
相連形成
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
或
Figure 02_image043
，其他變量如本發明所定義。
在本發明的一些方案中，上述i和i+3位置的賴胺酸側鏈上的氨基或j和j+4位置的賴胺酸側鏈上的氨基與
Figure 02_image001
相連形成
Figure 02_image045
、
Figure 02_image047
、
Figure 02_image049
或
Figure 02_image051
，其他變量如本發明所定義。
在本發明的一些方案中，上述
Figure 02_image001
選自
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
、
Figure 02_image057
、
Figure 02_image059
、
Figure 02_image061
和
Figure 02_image063
，其他變量如本發明所定義。
在本發明的一些方案中，上述
Figure 02_image001
選自
Figure 02_image065
、
Figure 02_image067
、
Figure 02_image069
、
Figure 02_image071
和
Figure 02_image073
，其他變量如本發明所定義。
本發明提供了式（II）所示序列的多肽， YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS 0（II） 其具有以下修飾： 1）i和i+3位置的賴胺酸側鏈上的氨基或j和j+4位置的賴胺酸側鏈上的氨基與
Figure 02_image001
相連，其中i為17，其中j為20； 2）式（II）所示多肽的0-2個胺基酸被替換； 其中， Aib的結構為
Figure 02_image003
； S 0選自
Figure 02_image077
和
Figure 02_image079
； X選自
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
和
Figure 02_image019
，其中，“*”表示與X 1相連的位置； X 1選自-C(=O)-、-O-C(=O)-和-N(R 1)-C(=O)-； R 1選自H和C 1-3烷基； X 2選自
Figure 02_image015
； m選自2、3和4； n選自15、16、17、18和19。
本發明提供了式（II）所示序列的多肽， YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS 0（II） 其具有以下修飾： 1）i和i+3位置的賴胺酸側鏈上的氨基或j和j+4位置的賴胺酸側鏈上的氨基與
Figure 02_image001
相連，其中i為17，其中j為20； 2）式（II）所示多肽的0-1個胺基酸被替換； 其中， Aib的結構為
Figure 02_image003
； S 0選自
Figure 02_image085
和
Figure 02_image087
； X選自
Figure 02_image009
、
Figure 02_image011
和
Figure 02_image019
，其中，“*”表示與X 1相連的位置； X 1選自-C(=O)-、-O-C(=O)-和-N(R 1)-C(=O)-； R 1選自H和C 1-3烷基； X 2選自
Figure 02_image015
； m選自2、3和4； n選自15、16、17、18和19。
在本發明的一些方案中，上述多肽，其具有式（II-1）、（II-2）、（II-3）、（II-4）、（II-5）和（III-6）所示序列， YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS-NH 2（II-1） YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK EFVKW LIAGG PSSGA PPPS-NH 2（II-2） YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFIKW LIAGG PSSGA PPPS-NH 2（II-3） YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LLAGG PSSGA PPPS-NH 2（II-4） YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS-NH 2（II-5） YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVEW LIAGG PSSGA PPPS-NH 2（III-6） 其具有以下修飾： 17和20位置的賴胺酸側鏈上的氨基或20和24位置的賴胺酸側鏈上的氨基與
Figure 02_image001
相連， 其中， Aib、X、X 1和X 2如本發明所定義。
在本發明的一些方案中，上述R 1選自H，其他變量如本發明所定義。
在本發明的一些方案中，上述X 1選自-C(=O)-、-O-C(=O)-和-NH-C(=O)-，其他變量如本發明所定義。
在本發明的一些方案中，上述m選自2，其他變量如本發明所定義。
在本發明的一些方案中，上述n選自17，其他變量如本發明所定義。
在本發明的一些方案中，上述X 2選自
Figure 02_image021
，其他變量如本發明所定義。
在本發明的一些方案中，上述i和i+3位置的賴胺酸側鏈上的氨基或j和j+4位置的賴胺酸側鏈上的氨基與
Figure 02_image001
相連形成
Figure 02_image037
或
Figure 02_image093
，其中Z 2FZ 3為AFV、EFV或AFI，其他變量如本發明所定義。
在本發明的一些方案中，上述i和i+3位置的賴胺酸側鏈上的氨基或j和j+4位置的賴胺酸側鏈上的氨基與
Figure 02_image001
相連形成
Figure 02_image037
、
Figure 02_image039
、
Figure 02_image041
或
Figure 02_image043
，其他變量如本發明所定義。
在本發明的一些方案中，上述
Figure 02_image001
選自
Figure 02_image053
、
Figure 02_image055
和
Figure 02_image057
，其他變量如本發明所定義。
本發明還有一些方案由上述變量任意組合而來。
本發明還提供了下式所示多肽，
Figure 02_image101
Figure 02_image103
Figure 02_image105
Figure 02_image107
Figure 02_image109
Figure 02_image111
Figure 02_image113
Figure 02_image115
Figure 02_image117
Figure 02_image119
Figure 02_image121
Figure 02_image123
Figure 02_image125
Figure 02_image127
Figure 02_image129
。
本發明還提供了上述藥物組合物，包括作為活性成分的治療有效量根據上述的多肽化合物或其藥學上可接受的鹽以及藥學上可接受的載體。
在本發明的一些方案中，上述多肽化合物或其藥學上可接受的鹽或者上述的組合物在製備治療NAFLD和NASH的藥物上的應用。
在本發明的一些方案中，上述的多肽化合物或其藥學上可接受的鹽或者上述的組合物在給藥頻次上為3天1次，4天1次，1周1次或2周1次。
技術效果
本發明的多肽對GLP-1R/GIPR具有很強的激動活性；本發明化合物具有優異的藥代動力學性質、血漿穩定性和極高的血漿蛋白結合度；本發明化合物在STZ-NASH小鼠模型中可顯著改善NAS評分。
定義和說明
除非另有說明，本文所用的下列術語和短語旨在具有下列含義。一個特定的術語或短語在沒有特別定義的情況下不應該被認為是不確定的或不清楚的，而應該按照普通的含義去理解。當本文中出現商品名時，意在指代其對應的商品或其活性成分。
這裡所採用的術語“藥學上可接受的”，是針對那些化合物、材料、組合物和/或劑型而言，它們在可靠的醫學判斷的範圍之內，適用於與人類和動物的組織接觸使用，而沒有過多的毒性、刺激性、過敏性反應或其它問題或併發症，與合理的利益/風險比相稱。
術語“藥學上可接受的鹽”是指本發明化合物的鹽，由本發明發現的具有特定取代基的化合物與相對無毒的酸或鹼製備。當本發明的化合物中含有相對酸性的功能團時，可以通過在純的溶液或合適的惰性溶劑中用足夠量的鹼與這類化合物接觸的方式獲得鹼加成鹽。藥學上可接受的鹼加成鹽包括鈉、鉀、鈣、銨、有機胺或鎂鹽或類似的鹽。當本發明的化合物中含有相對鹼性的官能團時，可以通過在純的溶液或合適的惰性溶劑中用足夠量的酸與這類化合物接觸的方式獲得酸加成鹽。藥學上可接受的酸加成鹽的實例包括無機酸鹽，所述無機酸包括例如鹽酸、氫溴酸、硝酸、碳酸，碳酸氫根，磷酸、磷酸一氫根、磷酸二氫根 、硫酸、硫酸氫根、氫碘酸、亞磷酸等；以及有機酸鹽，所述有機酸包括如乙酸、丙酸、異丁酸、馬來酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、鄰苯二甲酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸、酒石酸和甲磺酸等類似的酸；還包括胺基酸（如精胺酸等）的鹽，以及如葡糖醛酸等有機酸的鹽。本發明的某些特定的化合物含有鹼性和酸性的官能團，從而可以被轉換成任一鹼或酸加成鹽。
本發明的藥學上可接受的鹽可由含有酸根或鹼基的母體化合物通過常規化學方法合成。一般情況下，這樣的鹽的製備方法是：在水或有機溶劑或兩者的混合物中，經由游離酸或鹼形式的這些化合物與化學計量的適當的鹼或酸反應來製備。
“胺基酸”是指天然存在的和合成的胺基酸，以及起到與天然存在的胺基酸類似的作用的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸是由遺傳密碼編碼的那些胺基酸，以及後來修飾的那些胺基酸，例如，羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸和O-磷酸絲胺酸。胺基酸類似物是指具有與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構(例如與氫、羧基基團、氨基基團和R基團結合的α碳)的化合物，例如高絲胺酸、正亮胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。這樣的類似物可以具有修飾的R基團(例如，正亮胺酸)或修飾的肽骨架，但保留與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸模擬物是指其結構不同於一般的胺基酸化學結構，但起到與天然存在的胺基酸相似的作用的化學化合物。
本文所述的A或Ala表示丙胺酸，結構為
Figure 02_image131
；R或Arg表示精胺酸，結構為
Figure 02_image133
；N或Asn表示天冬醯胺，結構為
Figure 02_image135
；D或Asp表示天冬胺酸，結構為
Figure 02_image137
；C或Cys表示半胱胺酸，結構為
Figure 02_image139
；Q或Gln表示穀氨醯胺，結構為
Figure 02_image141
；E或Glu表示麩胺酸，結構為
Figure 02_image143
；G或Gly表示甘胺酸，結構為
Figure 02_image145
；H或His表示組胺酸，結構為
Figure 02_image147
；I或Ile表示異亮胺酸，結構為
Figure 02_image149
；L或Leu表示亮胺酸，結構為
Figure 02_image151
；K或Lys表示賴胺酸，結構為
Figure 02_image153
；M或Met表示甲硫胺酸，結構為
Figure 02_image155
；F或Phe表示苯丙胺酸，結構為
Figure 02_image157
；P或Pro表示脯胺酸，結構為
Figure 02_image159
；S或Ser表示絲胺酸，結構為
Figure 02_image161
；T或Thr表示蘇胺酸，結構為
Figure 02_image163
；W或Trp表示色胺酸，結構為
Figure 02_image165
；Y或Tyr表示酪胺酸，結構為
Figure 02_image167
；V或Val表示纈胺酸，結構為
Figure 02_image169
；Fmoc-AEEA-OH表示
Figure 02_image171
。
術語“治療”包括抑制、減緩、停止或逆轉現有症狀或病患的進展或嚴重程度。
除非另有說明，術語“異構體”意在包括幾何異構體、順反異構體、立體異構體、對映異構體、旋光異構體、非對映異構體和互變異構體。
本發明的化合物可以存在特定的幾何或立體異構體形式。本發明設想所有的這類化合物，包括順式和反式異構體、(-)- 和 (+)-對映體、( R)- 和 ( S)-對映體、非對映異構體、( D)-異構體、( L)-異構體，及其外消旋混合物和其他混合物，例如對映異構體或非對映體富集的混合物，所有這些混合物都屬本發明的範圍之內。烷基等取代基中可存在另外的不對稱碳原子。所有這些異構體以及它們的混合物，均包括在本發明的範圍之內。
除非另有說明，術語“對映異構體”或者“旋光異構體”是指互為鏡像關係的立體異構體。
除非另有說明，術語“順反異構體”或者“幾何異構體”系由因雙鍵或者成環碳原子單鍵不能自由旋轉而引起。
除非另有說明，術語“非對映異構體”是指分子具有兩個或多個手性中心，並且分子間為非鏡像的關係的立體異構體。
除非另有說明，“(+)”表示右旋，“(-)”表示左旋，“(±)”表示外消旋。
除非另有說明，用楔形實線鍵（
Figure 02_image173
）和楔形虛線鍵（
Figure 02_image175
）表示一個立體中心的絕對構型，用直形實線鍵（
Figure 02_image177
）和直形虛線鍵（
Figure 02_image179
）表示立體中心的相對構型，用波浪線（
Figure 02_image181
）表示楔形實線鍵（
Figure 02_image173
）或楔形虛線鍵（
Figure 02_image175
），或用波浪線（
Figure 02_image181
）表示直形實線鍵（
Figure 02_image177
）或直形虛線鍵（
Figure 02_image179
）。
除非另有說明，術語“富含一種異構體”、“異構體富集”、“富含一種對映體”或者“對映體富集”指其中一種異構體或對映體的含量小於100%，並且，該異構體或對映體的含量大於等於60%，或者大於等於70%，或者大於等於80%，或者大於等於90%，或者大於等於95%，或者大於等於96%，或者大於等於97%，或者大於等於98%，或者大於等於99%，或者大於等於99.5%，或者大於等於99.6%，或者大於等於99.7%，或者大於等於99.8%，或者大於等於99.9%。
除非另有說明，術語“異構體過量”或“對映體過量”指兩種異構體或兩種對映體相對百分數之間的差值。例如，其中一種異構體或對映體的含量為90%，另一種異構體或對映體的含量為10%，則異構體或對映體過量（ee值）為80%。
可以通過的手性合成或手性試劑或者其他常規技術製備光學活性的( R)-和( S)-異構體以及 D和 L異構體。如果想得到本發明某化合物的一種對映體，可以通過不對稱合成或者具有手性助劑的衍生作用來製備，其中將所得非對映體混合物分離，並且輔助基團裂開以提供純的所需對映異構體。或者，當分子中含有鹼性官能團（如氨基）或酸性官能團（如羧基）時，與適當的光學活性的酸或鹼形成非對映異構體的鹽，然後通過本領域所公知的常規方法進行非對映異構體拆分，然後回收得到純的對映體。此外，對映異構體和非對映異構體的分離通常是通過使用色譜法完成的，所述色譜法採用手性固定相，並任選地與化學衍生法相結合（例如由胺生成氨基甲酸鹽）。
本發明的化合物可以在一個或多個構成該化合物的原子上包含非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素標記化合物，比如氚（ 3H），碘-125（ 125I）或C-14（ 14C）。又例如，可用重氫取代氫形成氘代藥物，氘與碳構成的鍵比普通氫與碳構成的鍵更堅固，相比於未氘化藥物，氘代藥物有降低毒副作用、增加藥物穩定性、增強療效、延長藥物生物半衰期等優勢。本發明的化合物的所有同位素組成的變換，無論放射性與否，都包括在本發明的範圍之內。
當所列舉的連接基團沒有指明其連接方向，其連接方向是任意的，例如，
Figure 02_image183
中連接基團L為-M-W-，此時-M-W-既可以按與從左往右的讀取順序相同的方向連接環A和環B構成
Figure 02_image185
，也可以按照與從左往右的讀取順序相反的方向連接環A和環B構成
Figure 02_image187
。所述連接基團、取代基和/或其變體的組合只有在這樣的組合會產生穩定的化合物的情況下才是被允許的。
除非另有規定，當某一基團具有一個或多個可連接位點時，該基團的任意一個或多個位點可以通過化學鍵與其他基團相連。當該化學鍵的連接方式是不定位的，且可連接位點存在H原子時，則連接化學鍵時，該位點的H原子的個數會隨所連接化學鍵的個數而對應減少變成相應價數的基團。所述位點與其他基團連接的化學鍵可以用直形實線鍵（
Figure 02_image189
）、直形虛線鍵（
Figure 02_image191
）、或波浪線（
Figure 02_image193
）表示。例如-OCH 3中的直形實線鍵表示通過該基團中的氧原子與其他基團相連；
Figure 02_image195
中的直形虛線鍵表示通過該基團中的氮原子的兩端與其他基團相連；
Figure 02_image197
中的波浪線表示通過該苯基基團中的1和2位碳原子與其他基團相連。
除非另有規定，術語“C 1-3烷基”用於表示直鏈或支鏈的由1至3個碳原子組成的飽和碳氫基團。所述C 1-3烷基包括C 1-2和C 2-3烷基等；其可以是一價（如甲基）、二價（如亞甲基）或者多價（如次甲基）。C 1-3烷基的實例包括但不限於甲基 (Me)、乙基 (Et)、丙基 (包括 n-丙基和異丙基)等。
本發明的化合物可以通過本發明所屬技術領域具通常知識者所熟知的常規方法來確認結構，如果本發明涉及化合物的絕對構型，則該絕對構型可以通過本領域習知技術手段予以確證。例如單晶X射線衍射法（SXRD），把培養出的單晶用Bruker D8 venture衍射儀收集衍射強度數據，光源為CuKα輻射，掃描方式：φ/ω掃描，收集相關數據後，進一步採用直接法(Shelxs97)解析晶體結構，便可以確證絕對構型。
本發明的化合物可以通過本發明所屬技術領域具通常知識者所熟知的多種合成方法來製備，包括下面列舉的具體實施方式、其與其他化學合成方法的結合所形成的實施方式以及本發明所屬技術領域具通常知識者所熟知的等同替換方式，優選的實施方式包括但不限於本發明的實施例。
本發明所使用的溶劑可經市售獲得。
本發明採用下述縮略詞：aq代表水；eq代表當量、等量；DCM代表二氯甲烷；PE代表石油醚；DMSO代表二甲亞碸；MeOH代表甲醇；BOC代表第三丁氧羰基是一種胺保護基團；r.t.代表室溫；O/N代表過夜；THF代表四氫呋喃；Boc 2O代表二第三丁基二碳酸酯；TFA代表三氟乙酸；DIEA代表二異丙基乙基胺；DMF代表N,N-二甲基甲醯胺；HBTU代表苯並三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；HOBT代表1-羥基苯並三唑；HOAT代表1-羥基-7-氮雜苯並三唑；DIC代表N, N'-二異丙基碳二亞胺；DBU代表1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一碳-7-烯；PhSiH 3代表苯矽烷；Pd(PPh 3) 4代表四三苯基膦鈀。
下面通過實施例對本發明進行詳細描述，但並不意味著對本發明任何不利限制。本文已經詳細地描述了本發明，其中也公開了其具體實施例方式，對本發明所屬技術領域具通常知識者而言，在不脫離本發明精神和範圍的情況下針對本發明具體實施方式進行各種變化和改進將是顯而易見的。
中間體A-1
Figure 02_image199
步驟1：掛樹脂 1.1 秤取4g 氯代（鄰氯苯基）二苯基甲烷樹脂(替代度S=1.00mmol/g)和1.54g A-1_1，加入到反應柱中，再加入DCM (25 mL)，隨後加入3 mL N,N-二異丙基乙胺至反應柱氮氣鼓氣2小時，然後加入4 mL MeOH至反應柱氮氣繼續鼓氣30分鐘，排廢，直至沒有液體流出，加入DMF(50 mL) 洗滌5次每次1分鐘，排廢，直至沒有液體流出。 1.2 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20分鐘，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次每次1分鐘，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
步驟2：胺基酸的偶聯 2.1 A-1_1的偶聯 1. 秤取A-1_1 (3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加20 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入 HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 2. 在25℃的環境中反應20分鐘，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 3. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次，每次1分鐘，排廢，直至沒有液體流出。 2.2 A-1_a的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20分鐘，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取A-1_a(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(3.00 eq)補加20 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5小時，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF(50 mL)洗滌5次，每次1分鐘，排廢，直至沒有液體流出。 2.3 A-1_b的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50mL)至反應柱中，氮氣鼓起20分鐘，排廢，直至沒有液體流出，加入DMF(50mL)洗滌5次每次1分鐘，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取A-1_b（3.0 eq）加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00eq)補加20 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5小時，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次，每次1分鐘，排廢，直至沒有液體流出。
步驟3：切割及粗肽乾燥 3.1 按如下體積配置切割液
試劑 比例
六氟異丙醇(HFIP) 20
DCM 80
3.2 將配好的60 mL切割液倒入裝有乾燥後的肽樹脂的反應器中，在反應器中鼓氣20分鐘，過濾，濾液加入燒瓶中，重複此操作兩次，將兩次收集的切割液旋乾後得到A-1。
中間體A-2
Figure 02_image201
參考中間體A-1的合成，得到中間體A-2。
中間體A-3
Figure 02_image203
參考中間體A-1的合成，得到中間體A-3。
中間體A-4
Figure 02_image205
參考中間體A-1的合成，得到中間體A-4。
實施例1
Figure 02_image207
Figure 02_image209
步驟1：秤取1.34 g 4-(2’,4’-二甲氧基苯基-芴甲氧羰基-氨甲基)-苯氧基乙醯氨基-甲基二苯甲胺樹脂(替代度Sub=0.3 mmol/g)，加入到反應柱中，再加入DMF(50 mL)至反應柱氮氣鼓氣體2小時，排廢，直至沒有液體流出，加入DMF(50 mL) 洗滌5次每次1分鐘，排廢，直至沒有液體流出。
步驟2：加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20分鐘，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次每次1分鐘，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
步驟3：胺基酸的偶聯 3.1 Fmoc-Ser(tBu)-OH的偶聯 1. 秤取Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 2. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 3. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.2 Fmoc-Pro-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Pro-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.3 Fmoc-Pro-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。四氯苯醌檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Pro-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，四氯苯醌檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.4 Fmoc-Pro-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。四氯苯醌檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Pro-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，四氯苯醌檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.5 Fmoc-Ala-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。四氯苯醌檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Ala-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，四氯苯醌檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.6 Fmoc-Gly-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Gly-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.7 Fmoc-Ser(tBu)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.8 Fmoc-Ser(tBu)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.9 Fmoc-Pro-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Pro-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.10 Fmoc-Gly-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。四氯苯醌檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Gly-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，四氯苯醌檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.11 Fmoc-Gly-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Gly-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.12 Fmoc-Ala-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Ala-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.13 Fmoc-Ile-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Ile-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.14 Fmoc-Leu-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Leu-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.15 Fmoc-Trp(Boc)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Trp(Boc)-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.16 Fmoc-Lys(Dde)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Lys(Dde)-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.17 Fmoc-Val-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Val-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.18 Fmoc-Phe-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Phe-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.19 Fmoc-Ala-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Ala-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.20 Fmoc-Lys(Alloc)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Lys(Alloc)-OH (2.0 eq)加入到上述樹脂中，加入HOBT(2.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸和HOBT溶解後加入DIC(2.00 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.21 Fmoc-Gln(Trt)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Gln(Trt)-OH（3.0 eq）加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.22 Fmoc-Ala-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Ala-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.23 Fmoc-Ile-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Ile-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.24 Fmoc-Lys(Boc)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Lys(Boc-OH(2.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.25 Fmoc-Asp(OtBu)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Asp(OtBu)-OH(6.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(12.0 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(5.70 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.26 Fmoc-Leu-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Leu-OH(6.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(12.0 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(5.70 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.27 Fmoc-Aib-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Aib-OH(6.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(12.0  eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(5.70 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應2h，茚三酮檢測，樹脂藍色。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.28 Fmoc-Ile-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Ile-OH(6.0 eq)加入到上述樹脂中，加入HOAT(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸和HOAT溶解後加入DIC(6.00 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應1h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.29 Fmoc-Ser(tBu)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Ser(tBu)-OH(6.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(12.0 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(5.70 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.30 Fmoc-Tyr(tBu)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Tyr(tBu)-OH(6.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(12.0 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(5.70 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.31 Fmoc-Asp(OtBu)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Asp(OtBu)-OH(6.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(12.0 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(5.70 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.32 Fmoc-Ser(tBu)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Ser(tBu)-OH(6.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(12.0 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(5.70 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.33 Fmoc-Thr(tBu)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Thr(tBu)-OH(6.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(12.0 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(5.70 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.34 Fmoc-Phe-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Phe-OH(6.0q)加入到上述樹脂中，加入DIEA(12.0 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(5.70 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.35 Fmoc-Thr(tBu)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Thr(tBu)-OH(6.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(12.0 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(5.70 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.36 Fmoc-Gly-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Gly-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.37 Fmoc-Glu(OtBu)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Glu(OtBu)-OH(6.0 eq)加入到上述樹脂中，加入HOBT(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸和HOBT溶解後加入DIC(6.00 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.38 Fmoc-Aib-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Aib-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應過夜，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.39 Boc-Tyr(tBu)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1min，排廢，直至沒有液體流出。四氯苯醌檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Boc-Tyr(tBu)-OH (6.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(12.0 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(5.70 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，四氯苯醌檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.40 脫Alloc 1. 加入PhSiH 3(10.0 eq) 和DCM(10 mL) 至反應柱中，氮氣鼓起後加入Pd(PPh 3) 4(0.1 eq)，氮氣鼓起20min，反應2次，排廢，直至沒有液體流出。 2. 用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.41 Fmoc-Ida-OH的偶聯 1. 秤取Fmoc-Ida-OH(4..0 eq）加入到上述樹脂中，加入DIEA (8.00 eq）補加10 mLDMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(3.80 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 2. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 3. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.42 中間體A-1的偶聯 1. 加入10%的DBU/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1min，排廢，直至沒有液體流出。四氯苯醌檢測，樹脂藍色。 2. 秤取中間體A-1(1.50 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(3.00 eq)補加10 mLDMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(1.45 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.43脫Dde 1. 加入3%的肼/DMF(50 mL）至反應柱中，氮氣鼓起15min，排廢，加入DMF(50 mL)洗滌5次每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 3.44 關醯胺環 1. 將DIEA(3.0 eq)加入到上述樹脂的DMF溶液中，後把用DMF溶解好的HATU(1.5 eq)緩慢滴加至反應柱中，鼓氮氣。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 2. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 3. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 4. 用MeOH(50 mL)收縮樹脂，每次3min，排廢，直至沒有液體流出，將樹脂倒出乾燥，備用。 4.切割及粗肽乾燥 4.1按如下體積配置切割液
試劑 比例
三氟乙酸 92.5
三異丙基矽烷 2.5
H 2O 2.5
3-巰基丙酸 2.5
4.2將乾燥後的肽樹脂加入到配好的切割液中，在搖床震盪2.5小時，過濾，濾液加入到10倍體積冰異丙醚中，離心，再用異丙醚洗滌5次。在真空乾燥2小時得到粗肽，純化得到多肽化合物WX-001，多肽分子量經ESI-MS進行確認，計算值為[M+4H]/4為1228.6，檢測值為1228.7。
實施例2
Figure 02_image211
參考WX-001的合成，得到多肽WX-002。多肽分子量經ESI-MS進行確認，計算值[M+4H]/4為1243.1，檢測值為1242.8。
實施例3
Figure 02_image213
參考WX-001的合成，得到多肽WX-003。多肽分子量經ESI-MS進行確認，計算值[M+4H]/4為1232.1，檢測值為1232.2。
實施例4
Figure 02_image215
參考WX-001的合成，得到多肽WX-004。多肽分子量經ESI-MS進行確認，計算值[M+4H]/4為1228.6，檢測值為1228.2。
實施例5
Figure 02_image217
步驟1：秤取1.34 g 4-(2’,4’-二甲氧基苯基-芴甲氧羰基-氨甲基)-苯氧基乙醯氨基-甲基二苯甲胺樹脂(替代度Sub=0.3 mmol/g)，加入到反應柱中，再加入DMF(50 mL)至反應柱氮氣鼓氣體2小時，排廢，直至沒有液體流出，加入DMF(50 mL) 洗滌5次每次1分鐘，排廢，直至沒有液體流出。
步驟2：加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20分鐘，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次每次1分鐘，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
步驟3：胺基酸的偶聯 3.1 Fmoc-Ser(tBu)-OH的偶聯 1. 秤取Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 2. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 3. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.2 Fmoc-Pro-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Pro-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 5. 重複3.2步驟，完成以下胺基酸的偶聯
序號 原料 偶聯試劑
3.3 Fmoc-Pro-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.4 Fmoc-Pro-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.5 Fmoc-Ala-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.6 Fmoc-Gly-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.7 Fmoc-Ser(tBu)-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.8 Fmoc-Ser(tBu)-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.9 Fmoc-Pro-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.10 Fmoc-Gly-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.11 Fmoc-Gly-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.12 Fmoc-Ala-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.13 Fmoc-Ile-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.14 Fmoc-Leu-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.15 Fmoc-Trp(Boc)-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.16 Fmoc-Glu(tBu)-OH (2.00 eq) HBTU (1.90 eq) and DIEA (4.00 eq)
3.17 Fmoc-Val-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.18 Fmoc-Phe-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.19 Fmoc-Ala-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.20 Fmoc-Lys(Dde)-OH(3.00 eq) HOBT (2.00 eq) and DIC (2.00 eq)
3.21 Fmoc-Gln(Trt)-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.22 Fmoc-Ala-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.23 Fmoc-Lys(Alloc)-OH (2.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.24 Fmoc-Lys(Boc)-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.25 Fmoc-Asp(tBu)-OH (6.00 eq) HATU (5.70 eq) and DIEA (12.0 eq)
3.26 Fmoc-Leu-OH (6.00 eq) HATU (5.70 eq) and DIEA (12.0 eq)
3.27 Fmoc-Aib-OH (6.00 eq) HATU (5.70 eq) and DIEA (12.0 eq)
3.28 Fmoc-Ile-OH (6.00 eq) HOAT (6.00 eq) and DIC (6.00 eq)
3.29 Fmoc-Ser(tBu)-OH (6.00 eq) HATU (5.70 eq) and DIEA (12.0 eq)
3.30 Fmoc-Tyr(tBu)-OH (6.00 eq) HATU (5.70 eq) and DIEA (12.0 eq)
3.31 Fmoc-Asp(tBu)-OH (6.00 eq) HATU (5.70 eq) and DIEA (12.0 eq)
3.32 Fmoc-Ser(tBu)-OH (6.00 eq) HATU (5.70 eq) and DIEA (12.0 eq)
3.33 Fmoc-Thr(tBu)-OH (6.00 eq) HATU (5.70 eq) and DIEA (12.0 eq)
3.34 Fmoc-Phe-OH (6.00 eq) HATU (5.70 eq) and DIEA (12.0 eq)
3.35 Fmoc-Thr(tBu)-OH (6.00 eq) HATU (5.70 eq) and DIEA (12.0 eq)
3.36 Fmoc-Gly-OH (6.00 eq) HATU (5.70 eq) and DIEA (12.0 eq)
3.37 Fmoc-Glu(tBu)-OH (6.00 eq) HOBT (6.00 eq) and DIC (6.00 eq)
3.38 Fmoc-Aib-OH (3.00 eq) HATU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.39 Boc-Tyr(tBu)-OH (3.00 eq) HATU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.40 脫Alloc 1. 加入PhSiH 3(10.0 eq) 和DCM(10 mL) 至反應柱中，氮氣鼓起後加入Pd(PPh 3) 4(0.1 eq)，氮氣鼓起20min，反應2次，排廢，直至沒有液體流出。 2. 用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.41 Fmoc-Ida-OH的偶聯 1. 秤取Fmoc-Ida-OH(4..0 eq）加入到上述樹脂中，加入DIEA (8.00 eq）補加10 mLDMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(3.80 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 2. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 3. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.42 中間體A-1的偶聯 1. 加入10%的DBU/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1min，排廢，直至沒有液體流出。四氯苯醌檢測，樹脂藍色。 2. 秤取中間體A-1(1.50 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(3.00 eq)補加10 mLDMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(1.45 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.43脫Dde 1. 加入3%的肼/DMF(50 mL）至反應柱中，氮氣鼓起15min，排廢，加入DMF(50 mL)洗滌5次每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 3.44 關醯胺環 1. 將DIEA(3.0 eq)加入到上述樹脂的DMF溶液中，後把用DMF溶解好的HATU(1.5 eq)緩慢滴加至反應柱中，鼓氮氣。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 2. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 3. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 4. 用MeOH(50 mL)收縮樹脂，每次3min，排廢，直至沒有液體流出，將樹脂倒出乾燥，備用。 4.切割及粗肽乾燥 4.1按如下體積配置切割液
試劑 比例
三氟乙酸 92.5
三異丙基矽烷 2.5
H 2O 2.5
3-巰基丙酸 2.5
4.2將乾燥後的肽樹脂加入到配好的切割液中，在搖床震盪2.5小時，過濾，濾液加入到10倍體積冰異丙醚中，離心，再用異丙醚洗滌5次。在真空乾燥2小時得到粗肽，純化得到多肽WX-005。多肽分子量經ESI-MS進行確認，計算值[M+4H]/4為1232.6，檢測值為1232.5。
實施例6
Figure 02_image219
參考WX-001的合成，得到多肽WX-006。多肽分子量經ESI-MS進行確認，計算值[M+4H]/4為1232.4，檢測值為1232.4。
實施例7
Figure 02_image221
參考WX-001的合成，得到多肽WX-007。多肽分子量經ESI-MS進行確認，計算值[M+4H]/4為1218.1，檢測值為1218.3。
實施例8
Figure 02_image223
參考WX-001的合成，得到多肽WX-008。多肽分子量經ESI-MS進行確認，計算值[M+4H]/4為1228.6，檢測值為1228.6。
實施例9
Figure 02_image225
步驟1：秤取1.34 g 4-(2’,4’-二甲氧基苯基-芴甲氧羰基-氨甲基)-苯氧基乙醯氨基-甲基二苯甲胺樹脂(替代度Sub=0.3 mmol/g)，加入到反應柱中，再加入DMF(50 mL)至反應柱氮氣鼓氣體2小時，排廢，直至沒有液體流出，加入DMF(50 mL) 洗滌5次每次1分鐘，排廢，直至沒有液體流出。
步驟2：加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20分鐘，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次每次1分鐘，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
步驟3：胺基酸的偶聯 3.1 Fmoc-Ser(tBu)-OH的偶聯 1. 秤取Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 2. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 3. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.2 Fmoc-Pro-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Pro-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 5. 重複3.2步驟，完成以下胺基酸的偶聯
序號 原料 偶聯試劑
3.3 Fmoc-Pro-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.4 Fmoc-Pro-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.5 Fmoc-Ala-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.6 Fmoc-Gly-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.7 Fmoc-Ser(tBu)-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.8 Fmoc-Ser(tBu)-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.9 Fmoc-Pro-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.10 Fmoc-Gly-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.11 Fmoc-Gly-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.12 Fmoc-Ala-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.13 Fmoc-Ile-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.14 Fmoc-Leu-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.15 Fmoc-Trp(Boc)-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.16 Fmoc-Glu(tBu)-OH (2.00 eq) HBTU (1.90 eq) and DIEA (4.00 eq)
3.17 Fmoc-Val-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.18 Fmoc-Phe-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.19 Fmoc-Glu(tBu)-OH (6.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.20 Fmoc-Lys(Dde)-OH(3.00 eq) HOBT (2.00 eq) and DIC (2.00 eq)
3.21 Fmoc-Gln(Trt)-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.22 Fmoc-Ala-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.23 Fmoc-Lys(Alloc)-OH (2.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.24 Fmoc-Lys(Boc)-OH (3.00 eq) HBTU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.25 Fmoc-Asp(tBu)-OH (6.00 eq) HATU (5.70 eq) and DIEA (12.0 eq)
3.26 Fmoc-Leu-OH (6.00 eq) HATU (5.70 eq) and DIEA (12.0 eq)
3.27 Fmoc-Aib-OH (6.00 eq) HATU (5.70 eq) and DIEA (12.0 eq)
3.28 Fmoc-Ile-OH (6.00 eq) HOAT (6.00 eq) and DIC (6.00 eq)
3.29 Fmoc-Ser(tBu)-OH (6.00 eq) HATU (5.70 eq) and DIEA (12.0 eq)
3.30 Fmoc-Tyr(tBu)-OH (6.00 eq) HATU (5.70 eq) and DIEA (12.0 eq)
3.31 Fmoc-Asp(tBu)-OH (6.00 eq) HATU (5.70 eq) and DIEA (12.0 eq)
3.32 Fmoc-Ser(tBu)-OH (6.00 eq) HATU (5.70 eq) and DIEA (12.0 eq)
3.33 Fmoc-Thr(tBu)-OH (6.00 eq) HATU (5.70 eq) and DIEA (12.0 eq)
3.34 Fmoc-Phe-OH (6.00 eq) HATU (5.70 eq) and DIEA (12.0 eq)
3.35 Fmoc-Thr(tBu)-OH (6.00 eq) HATU (5.70 eq) and DIEA (12.0 eq)
3.36 Fmoc-Gly-OH (6.00 eq) HATU (5.70 eq) and DIEA (12.0 eq)
3.37 Fmoc-Glu(tBu)-OH (6.00 eq) HOBT (6.00 eq) and DIC (6.00 eq)
3.38 Fmoc-Aib-OH (3.00 eq) HATU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.39 Boc-Tyr(tBu)-OH (3.00 eq) HATU (2.85 eq) and DIEA (6.00 eq)
3.40 脫Alloc 1. 加入PhSiH 3(10.0 eq) 和DCM(10 mL) 至反應柱中，氮氣鼓起後加入Pd(PPh 3) 4(0.1 eq)，氮氣鼓起20min，反應2次，排廢，直至沒有液體流出。 2. 用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.41 Fmoc-Ida-OH的偶聯 1. 秤取Fmoc-Ida-OH(4..0 eq）加入到上述樹脂中，加入DIEA (8.00 eq）補加10 mLDMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(3.80 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 2. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 3. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.42 中間體A-1的偶聯 1. 加入10%的DBU/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1min，排廢，直至沒有液體流出。四氯苯醌檢測，樹脂藍色。 2. 秤取中間體A-1(1.50 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(3.00 eq)補加10 mLDMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(1.45 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 3.43脫Dde 1. 加入3%的肼/DMF(50 mL）至反應柱中，氮氣鼓起15min，排廢，加入DMF(50 mL)洗滌5次每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 3.44 關醯胺環 1. 將DIEA(3.0 eq)加入到上述樹脂的DMF溶液中，後把用DMF溶解好的HATU(1.5 eq)緩慢滴加至反應柱中，鼓氮氣。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 2. 在25℃的環境中反應0.5h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 3. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。 4. 用MeOH(50 mL)收縮樹脂，每次3min，排廢，直至沒有液體流出，將樹脂倒出乾燥，備用。 4.切割及粗肽乾燥 4.1按如下體積配置切割液
試劑 比例
三氟乙酸 92.5
三異丙基矽烷 2.5
H 2O 2.5
3-巰基丙酸 2.5
4.2將乾燥後的肽樹脂加入到配好的切割液中，在搖床震盪2.5小時，過濾，濾液加入到10倍體積冰異丙醚中，離心，再用異丙醚洗滌5次。在真空乾燥2小時得到粗肽，純化得到多肽WX-009。多肽分子量經ESI-MS進行確認，計算值[M+4H]/4為1247.1，檢測值為1247.2。
實施例10
Figure 02_image227
步驟1：秤取1.08 g 4-(2’,4’-二甲氧基苯基-芴甲氧羰基-氨甲基)-苯氧基乙醯氨基-甲基二苯甲胺樹脂(替代度Sub=0.37 mmol/g)，加入到反應柱中，再加入DMF(50 mL)至反應柱氮氣鼓氣體2 h，排廢，直至沒有液體流出，加入DMF(50 mL) 洗滌5次每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
步驟2：加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
步驟3：胺基酸的偶聯 3.1 Fmoc-Ser(tBu)-OH的偶聯 1. 秤取Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 2. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 3. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.2 Fmoc-Pro-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Pro-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.3 Fmoc-Pro-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。四氯苯醌檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Pro-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，四氯苯醌檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.4 Fmoc-Pro-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。四氯苯醌檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Pro-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5h，四氯苯醌檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.5 Fmoc-Ala-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。四氯苯醌檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Ala-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，四氯苯醌檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.6 Fmoc-Gly-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Gly-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.7 Fmoc-Ser(tBu)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.8 Fmoc-Ser(tBu)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.9 Fmoc-Pro-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Pro-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.10 Fmoc-Gly-Gly-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。四氯苯醌檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Gly-Gly-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，四氯苯醌檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.11 Fmoc-Ala-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Ala-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.12 Fmoc-Ile-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Ile-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.13 Fmoc-Leu-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Leu-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.14 Fmoc-Trp(Boc)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Trp(Boc)-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.15 Fmoc-Glu(OtBu)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Glu(OtBu)-OH (3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.16 Fmoc-Val-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Val-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.17 Fmoc-Phe-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Phe-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.18 Fmoc-Ala-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Ala-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.19 Fmoc-Lys(Alloc)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Lys(Alloc)-OH (3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(5 0mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.20 Fmoc-Gln(Trt)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Gln(Trt)-OH(3.00 eq）加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.21 Fmoc-Ala-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Ala-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.22 Fmoc-Lys(Dde)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Lys(Dde)-OH (3.00eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.23 Fmoc-Lys(Boc)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Lys(Boc-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.24 Fmoc-Asp(OtBu)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Asp(OtBu)-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.25 Fmoc-Leu-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Leu-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.26 Fmoc-Aib-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Aib-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應2h，茚三酮檢測，樹脂藍色。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.27 Fmoc-Ile-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Ile-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應1 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.28 Fmoc-Ser(tBu)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.29 Fmoc-Tyr(tBu)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Tyr(tBu)-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.30 Fmoc-Asp(OtBu)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Asp(OtBu)-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.31 Fmoc-Thr(tBu)-SerPsi(Me,Me)Pro-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Thr(tBu)-SerPsi(Me,Me)Pro-OH (2.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(4.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(1.90 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.32 Fmoc-Phe-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Phe-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.33 Fmoc-Thr(tBu)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Thr(tBu)-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.34 Fmoc-Gly-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Gly-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.35 Fmoc-Glu(OtBu)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Glu(OtBu)-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.36 Fmoc-Aib-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Fmoc-Aib-OH(3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應過夜，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.37 Boc-Tyr(tBu)-OH的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。四氯苯醌檢測，樹脂藍色。 2. 秤取Boc-Tyr(tBu)-OH (3.00 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，四氯苯醌檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.38 脫Alloc 1. 加入PhSiH 3(10.0 eq) 和DCM(20 mL) 至反應柱中，氮氣鼓起後加入Pd(PPh 3) 4(0.10 eq)，氮氣鼓起20min，反應2次，排廢，直至沒有液體流出。 2. 用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.39 Fmoc-Glu-OAll的偶聯 1. 秤取Fmoc-Glu-OAll (3.00 eq）加入到上述樹脂中，加入DIEA (6.00 eq）補加10 mLDMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 2. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 3. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.40 中間體A-1的偶聯 1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 2. 秤取中間體A-1(1.50 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(3.0 0eq)補加10 mLDMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(1.45 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.41 脫Alloc 1. 加入PhSiH 3(10.0 eq) 和DCM(20 mL) 至反應柱中，氮氣鼓起後加入Pd(PPh 3) 4(0.10 eq)，氮氣鼓起20 min，反應二次，排廢，直至沒有液體流出。 2. 用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 3.42脫Dde 1. 加入3%的hydrazine hydrate /DMF(50 mL）至反應柱中，氮氣鼓起15 mim，排廢，加入DMF(50 mL)洗滌5次每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。 3.42 關醯胺環 1. 將DIEA(3.00 eq)加入到上述樹脂的DMF溶液中，後把用DMF溶解好的HATU(1.50 eq)緩慢滴加至反應柱中，鼓氮氣。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。 2. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。 3. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。 4. 用MeOH(50 mL)收縮樹脂，每次3 min，排廢，直至沒有液體流出，將樹脂倒出乾燥，備用。 4.切割及粗肽乾燥 4.1按如下體積配置切割液
試劑 比例
三氟乙酸 92.5
三異丙基矽烷 2.5
H 2O 2.5
3-巰基丙酸 2.5
4.2將乾燥後的肽樹脂加入到配好的切割液中，在搖床震盪2.5 h，過濾，濾液加入到10倍體積冰異丙醚中，離心，再用異丙醚洗滌5次。在真空乾燥2 h得到粗肽，純化。多肽分子量經ESI-MS進行確認，計算值為1236.1，實測值為1236.0。
實施例11
Figure 02_image229
參考WX-010的合成，得到多肽WX-011。多肽分子量經ESI-MS進行確認，計算值[M+4H]/4為1236.1，檢測值為1236.0。
實施例12
Figure 02_image231
參考WX-001的合成，使用中間體A-2，得到多肽WX-012。多肽分子量經ESI-MS進行確認，計算值[M+4H]/4為1225.6，檢測值為1225.7。
實施例13
Figure 02_image233
參考WX-001的合成，使用中間體A-3，得到多肽WX-013。多肽分子量經ESI-MS進行確認，計算值[M+4H]/4為1264.9，檢測值為1264.6。
實施例14
Figure 02_image235
參考WX-001的合成，使用中間體A-4，得到多肽WX-014。多肽分子量經ESI-MS進行確認，計算值[M+4H]/4為1257.9，檢測值為1257.8。
生物測試數據
測試例1：體外GLP-1R/GIPR激動活性測試 A：主要材料： 1)細胞株 該細胞株由上海藥明康德構建。詳情見下表1。 表1 細胞株信息
靶點 宿主細胞 克隆
GLP-1R HEK293 N/A
GIPR CHO N/A
2) 試劑與耗材 表2 試劑及耗材信息
名稱 批次. 貨號 廠家
cAMP 檢測盒 29F 62AM4PEJ Cisbio
1M HEPES 2120919 15630-106 Invitrogen
Hanks平衡鹽溶液(HBSS) 2185775 14025 Invitrogen
人血清白蛋白(HSA) SLCF7301 A1653-10G 西格瑪
酪蛋白 SLCC9458 C4765-10 mL 西格瑪
3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX) STBF6061V I5879-5G 西格瑪
ECHO qualified 384 孔板 0006433672 PP-0200 Labcyte
OptiPlate-384 8210-19481 6007299 珀金埃爾默
3) 儀器 表3 儀器信息
名稱 型號 廠家
EnVision envision2014 珀金埃爾默
Vi-cell counter Vi-CELL™ XR Cell Viability Analyzer 貝克曼
Bravo Bravo V11 安捷倫
ECHO ECHO 555 Labcyte
Centrifuge Allegra™ 25R Centrifuge 貝克曼
B. 方法 1) 實驗材料 實驗緩衝液 表4 緩衝液信息
試劑 儲存濃度 體積 終濃度
Hanks平衡鹽溶液 1x 48.7  mL/ 44.7 mL ≈1x
HEPES緩衝液 1 mol/L 250 μL 5 mmol/L
5%酪蛋白溶液(HEPES)/ 10%人血清白蛋白溶液(HSA) 5%/ 10% 1000 μL/ 5000 μL 0.10%/ 1%
3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX) 500 mmol/L 50 μL 0.5 mmol/L
檢測試劑製備 表5 檢測試劑信息
試劑 儲存濃度 體積 終濃度
細胞裂解液 1x 9.5 mL ≈1x
D2-cAMP溶液 40x 250 μL 1x
cAMP-抗體溶液 40x 250 μL 1x
2) 實驗方法 a) 製備化合物板： 待測化合物做10個點4倍稀釋，起始濃度為30 μM，Bravo完成稀釋 b) 轉移化合物： 1) 使用Echo轉移100 nL化合物至OptiPlate-384 plate。 2) 將OptiPlate-384 plate在1000 rpm離心5秒。 c) 細胞懸液的製備 1) 將一支GLP-1R/GIPR細胞凍存管迅速置於37℃溫水中解凍。 2) 將細胞懸液轉移至Transfer15 mL離心管中，用10 mL HBSS輕柔沖洗。 3) 將離心管在1000 rpm室溫離心1分鐘。 4) 棄去上清。 5) 輕柔打散底部細胞並再用10 mL HBSS輕柔沖洗，離心沉降細胞，最後用實驗緩衝液重懸細胞。 6) 利用Vi-cell測量細胞密度與活度。 7) 用實驗緩衝液將GLP-1R/GIPR細胞濃度稀釋至2.0*10 5/ mL。 8) 在OptiPlate-384 plate中轉入100 nL稀釋好的細胞懸液。 9) 室溫孵育30分鐘。 d) 加入檢測試劑： 1) 在OptiPlate-384 plate空孔中加入10μL 800nM梯度稀釋好的cAMP標準品。 2) 加入10μL cAMP檢測試劑。 3) 用TopSeal-A film覆蓋OptiPlate-384 plate，室溫孵育60分鐘。 揭去TopSeal-A,在EnVision讀數。 C 實驗結果 實驗結果如表6所示。 表6 體外GLP-1R/GIPR激動活性測試結果
多肽藥物 GLP-1R 激動活性 GIPR 激動活性
EC 50(nM) 比值 EC 50(nM) 比值
(-) 1% HSA (+) 1% HSA (-) 1% HSA (+) 1% HSA
WX-001 0.05958 16.6 278.6 0.3239 15.97 49.3
WX-002 0.19 31.35 165 0.43 12.49 29
WX-003 0.54 13.97 26 1.07 43.95 41
WX-004 1.86 84.28 45 1.36 21.37 16
WX-005 0.036 7.63 212 0.16 19.29 121
WX-006 0.027 NA NA 0.26 NA NA
WX-007 0.026 NA NA 0.40 NA NA
WX-008 0.18 NA NA 2.74 NA NA
WX-009 0.014 NA NA 0.074 NA NA
WX-010 0.017 NA NA 0.14 NA NA
WX-011 0.018 NA NA 0.25 NA NA
WX-012 0.024 NA NA 0.17 NA NA
WX-013 0.057 NA NA 0.18 NA NA
WX-014 0.071 NA NA 0.24 NA NA
結論：本發明化合物對GLP-1R/GIPR具有很強的激動活性。
測試例2：化合物大鼠藥代動力學評價 A. 實驗目的 測試化合物在SD大鼠體內藥代動力學 B. 實驗操作 以標準方案測試化合物皮下注射後的齧齒類動物藥代特徵，實驗中候選化合物配成澄清溶液，給予大鼠單次皮下注射（SC, 0.048 mpk）。注射溶媒為檸檬酸鹽緩衝液（20 mM, pH=7）。收集全血，製備得到血漿，以LC-MS/MS方法分析藥物濃度，並用Phoenix WinNonlin軟件計算藥代參數。 C. 實驗結果 實驗結果如表7所示。 表7 大鼠藥代動力學測試結果
化合物編號 藥峰濃度(nM) 半衰期 T 1/2(h) 藥峰時間Tmax（h） SC濃度積分 AUC0-72 h (nM.hr)
WX005 28 21 16 1153
WX009 24 21 20 1092
結論：本發明化合物具有優異的大鼠藥代動力學性質。
測試例3：化合物小鼠藥代動力學評價 A. 實驗目的 測試化合物在C57BL/6小鼠體內藥代動力學 B. 實驗操作 以標準方案測試化合物皮下注射給藥後的齧齒類動物藥代特徵，實驗中候選化合物配成澄清溶液，皮下注射給藥(SC, 0.048 mpk)。皮下注射溶媒為檸檬酸鹽緩衝液（20 mM, pH=7）。收集全血，製備得到血漿，以LC-MS/MS方法分析藥物濃度，並用Phoenix WinNonlin軟件計算藥代參數。 C. 實驗結果 實驗結果如表8所示。 表8 小鼠藥代動力學測試結果
化合物編號 藥峰濃度(nM) 半衰期 T 1/2(h) 藥峰時間Tmax（h） SC濃度積分 AUC 0-72h(nM.hr)
WX005 79 16 12 2240
WX009 59 17 12 1986
結論：本發明化合物具有優異的小鼠藥代動力學性質。
測試例4：化合物食蟹猴藥代動力學評價 A. 實驗目的 測試化合物在食蟹猴體內藥代動力學 B. 實驗操作 以標準方案測試化合物靜脈注射及皮下注射給藥後的哺乳類動物藥代特徵，實驗中候選化合物配成澄清溶液，給予食蟹猴單次皮下注射給藥(SC, 0.02 mpk)。皮下注射溶媒為檸檬酸鹽緩衝液（20 mM, pH=7）。收集全血，製備得到血漿，以LC-MS/MS方法分析藥物濃度，並用Phoenix WinNonlin軟件計算藥代參數。 C. 實驗結果 實驗結果如表9所示。 表9 食蟹猴藥代動力學測試結果
化合物編號 藥峰濃度(nM) 半衰期 T 1/2(h) 藥峰時間Tmax（h） SC濃度積分 AUC 0-72h(nM.hr)
WX005 36 100 24 4467
WX009 37 105 24 4737
結論：本發明化合物具有優異的猴藥代動力學性質。
測試例5：血漿穩定性測試（PLS） A. 實驗目的 研究受試化合物在正常小鼠血漿中的穩定性。 B. 實驗操作 1. 實驗前，將凝結的冷凍血漿置於37℃的水浴鍋中解凍。血漿4000 rpm離心5 min，如有血塊，清除血塊，將pH值調到7.4±0.1。 2. 測試化合物溶液的製備：用DMSO稀釋制得100 µM的溶液。 3. 98 μL的空白對照血漿加入2 μL的測試化合物溶液(100 μM)，使得兩者混合溶液的最終濃度達到2 μM, 將其置於37℃水浴條件下培養。 4. 在每個時間點(0、10、30、60和120 min)分別加入100 μL H 3PO 4溶液和800 μL終止溶液（200 ng/mL 甲糖寧和200 ng/mL 拉貝洛爾100% 的甲醇溶液）來沉澱蛋白並充分混合。 5. 樣品在轉速4000 rpm下離心20 min，從每孔取100 μL上清液進行LC-MS/MS分析。 C. 實驗結果 實驗結果如表10所示。 表10 PLS測試結果
化合物編號 WX005 WX009
PLS (H/M) T 1/2(min) ＞289.1/＞289.1 ＞289.1/＞238.9
結論：本發明化合物具有優異的血漿穩定性。
測試例6：血漿蛋白結合度測試（PPB） A. 實驗目的 研究受試化合物與人/小鼠血漿白蛋白的結合度。 B. 實驗操作 1. 基質準備：實驗當天，將血漿在冷水中解凍，並以3220 rpm的速度離心5 min，以去除所有血塊。測量得到的血漿的pH值，並根據需要使用1%的磷酸或1N的氫氧化鈉將其pH調整到7.4±0.1。 2. 測試化合物的稀釋步驟：測試化合物溶解在二甲基亞碸（DMSO）中，以製備濃度分別為10 mM和2 mM的原液。用98 μL DMSO稀釋2 μL原液（2 mM），制得40 μM的工作溶液。用240 μL DMSO稀釋10 μL原液，制得400 μM對照化合物的工作溶液。將化合物的工作溶液（5 μL）與空白基質（995 μL）按1:200的比例混合均勻以製備負載基質。 3. 分析步驟 3.1將等量的30 μL負載基質（n=2）轉移至樣品採集板，製備待測時間0 (T0)樣品用於殘留測定。樣品立即與相應的空白緩衝液進行匹配，最終體積為60 μL，每孔中血漿與緩衝液的體積比為1:1。然後，測試化合物的T0樣品分別加入60µL的4%H 3PO 4的H 2O和480 µL含有內標物的終止液。然後將它們與其他樣品一起儲存在2-8°C下等待進一步處理。 3.2 將剩餘的血漿樣品放在37±1°C的二氧化碳培養箱預培養30 min。準備無蛋白樣品（F樣品），負載基質的樣品（230μL）都被轉移到聚碳酸酯管（n = 2）中，並在37°C和155000×g (35000 rpm) 條件下超速離心4 h。 3.3為了製備T樣品（測試樣品），額外一份含基質樣品轉移到單獨的96孔板(樣品培育板)上，並在37℃下培育4 h。 3.4離心結束後，從上清液第二層（上層以下）取30 μL的無蛋白樣品和30 μL的T樣品轉移到新的樣品收集板中。每個樣品與相應的空白緩衝液或基質混合，最終體積為60 μL，基質:緩衝液體積比1:1。在所有樣品加入60µL 4%的H 3PO 4水溶液和480 µL的終止溶液（含內標）。混合物在轉速4000 rpm下離心20 min，取各樣品上清液100µL進行LC-MS/MS分析。 C. 實驗結果 實驗結果如表11所示。 表11 PPB測試結果
化合物編號 WX005 WX009
PPB% unbound (H/M） NA/NA NA/NA
注：NA表示血漿蛋白結合度過高，在正常血漿蛋白濃度下未檢出游離藥物。 結論：本發明化合物具有極高的血漿蛋白結合度。
測試例7：STZ-NASH小鼠模型體內藥效驗證 A. 實驗目的 驗證受試物在C57BL/6小鼠經STZ-HFD飼料誘導的NASH模型中的藥效。 B. 實驗操作 建模方法：新生鼠在出生48小時內皮下注射STZ（200 ug/只），母乳餵養4周後挑選空腹血糖值＞12 mmol/L的動物連續6周HFD餵養，最終建立NASH模型。另挑選8只動物不進行STZ注射和HFD餵養（正常對照組）。 給藥方案：HFD餵養一周後開始給藥，設定首次給藥當天為Day1，之後每隔兩天進行皮下注射，連續給藥5周。 實驗終點檢測：病理HE和SR染色。 C. 實驗結果 實驗結果如表12所示。 表12 STZ-NASH模型終點動物病理指標
模型溶媒對照組 WX005 WX009
脂肪變性評分 2 1.5 1.0
炎症評分 1.2 1.0 1.4
氣球樣變評分 0.7 0.1 0
NAS評分 3.9 2.6 2.4
纖維化(%) 1.0 0.8 1.1
結論：本發明化合物在STZ-NASH小鼠模型中可顯著改善NAS評分。
雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
無
無

Claims (19)

  1. 一種式（II）所示序列的多肽， YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS 0（II） 其具有以下修飾： 1）i位置替換為賴胺酸後和i+3位置的賴胺酸側鏈上的氨基或j和j+4位置的賴胺酸側鏈上的氨基與
    Figure 03_image001
    相連，其中i為17，其中j為20；且 2）式（II）所示系列的多肽另外的0-2個胺基酸被替換； 其中， Aib的結構為
    Figure 03_image003
    ； S 0選自
    Figure 03_image005
    和
    Figure 03_image007
    ； X選自
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    和
    Figure 03_image013
    ，其中，“*”表示與X 1相連的位置； X 1選自單鍵、-C(=O)-、-O-C(=O)-和-N(R 1)-C(=O)-； R 1選自H和C 1-3烷基； X 2選自
    Figure 03_image015
    和
    Figure 03_image017
    ； m選自2、3和4； n選自15、16、17、18和19； p選自1和2。
  2. 根據請求項1所述的多肽，其多肽序列如式（P）所示， YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS 0（P） 其具有以下修飾： 1）17和20位置的賴胺酸側鏈上的氨基與
    Figure 03_image001
    相連；且 2）多肽的0-2個胺基酸被替換； 其中， Aib的結構為
    Figure 03_image003
    ； S 0選自
    Figure 03_image005
    和
    Figure 03_image007
    ； X選自
    Figure 03_image009
    、
    Figure 03_image011
    和
    Figure 03_image013
    ，其中，“*”表示與X 1相連的位置； X 1選自單鍵、-C(=O)-、-O-C(=O)-和-N(R 1)-C(=O)-； R 1選自H和C 1-3烷基； X 2選自
    Figure 03_image015
    和
    Figure 03_image017
    ； m選自2、3和4； n選自15、16、17、18和19； p選自1和2。
  3. 根據請求項1或2所述的多肽，其中，所述多肽的第21、23或24位中0-2個胺基酸被替換。
  4. 根據請求項1所述的多肽，其具有式（II-1）、（II-2）、（II-3）、（II-4）、（III-6）、（IV-7）、（IV-8）、（IV-9）和（IV-10）所示序列， YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS-NH 2（II-1） YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK EFVKW LIAGG PSSGA PPPS-NH 2（II-2） YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFIKW LIAGG PSSGA PPPS-NH 2（II-3） YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LLAGG PSSGA PPPS-NH 2（II-4） YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVEW LIAGG PSSGA PPPS-NH 2（III-6） YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVQW LIAGG PSSGA PPPS-NH 2（IV-7） YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVAW LIAGG PSSGA PPPS-NH 2（IV-8） YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVIW LIAGG PSSGA PPPS-NH 2（IV-9） YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK EFVEW LIAGG PSSGA PPPS-NH 2（IV-10） 其具有以下修飾： 17和20位置的賴胺酸側鏈上的氨基或20和24位置的賴胺酸側鏈上的氨基與
    Figure 03_image001
    相連， 其中， Aib、X、X 1和X 2如請求項1所定義。
  5. 根據請求項1-4任意一項所述的多肽，其中，R 1選自H。
  6. 根據請求項1-4任意一項所述的多肽，其中，X 1選自單鍵、-C(=O)-、-O-C(=O)-和-NH-C(=O)-。
  7. 根據請求項1-4任意一項所述的多肽，其中，m選自2。
  8. 根據請求項1-4任意一項所述的多肽，其中，n選自15和17。
  9. 根據請求項1-4任意一項所述的多肽，其中，p選自2。
  10. 根據請求項1-4任意一項所述的多肽，其中，X 2選自
    Figure 03_image021
    、
    Figure 03_image023
    、
    Figure 03_image025
    和
    Figure 03_image027
    。
  11. 根據請求項10所述的多肽，其中，X 2選自
    Figure 03_image029
    、
    Figure 03_image031
    、
    Figure 03_image033
    和
    Figure 03_image035
    。
  12. 根據請求項1-4任意一項所述的多肽，其中i和i+3位置的賴胺酸側鏈上的氨基或j和j+4位置的賴胺酸側鏈上的氨基與
    Figure 03_image001
    相連形成
    Figure 03_image250
    、
    Figure 03_image039
    、
    Figure 03_image041
    或
    Figure 03_image043
    。
  13. 根據請求項1-4任意一項所述的多肽，其中i和i+3位置的賴胺酸側鏈上的氨基或j和j+4位置的賴胺酸側鏈上的氨基與
    Figure 03_image001
    相連形成
    Figure 03_image045
    、
    Figure 03_image047
    、
    Figure 03_image049
    或
    Figure 03_image051
    。
  14. 根據請求項1-4任意一項所述的多肽，其中，結構單元
    Figure 03_image001
    選自
    Figure 03_image053
    、
    Figure 03_image055
    、
    Figure 03_image057
    、
    Figure 03_image059
    、
    Figure 03_image061
    和
    Figure 03_image063
    。
  15. 根據請求項14所述的多肽，其中，結構單元
    Figure 03_image001
    選自
    Figure 03_image253
    、
    Figure 03_image067
    、
    Figure 03_image069
    、
    Figure 03_image255
    和
    Figure 03_image073
    。
  16. 一種下式所示多肽，
    Figure 03_image257
    Figure 03_image103
    Figure 03_image105
    Figure 03_image107
    Figure 03_image111
    Figure 03_image113
    Figure 03_image115
    Figure 03_image117
    Figure 03_image119
    Figure 03_image121
    Figure 03_image123
    Figure 03_image125
    Figure 03_image127
    Figure 03_image129
    。
  17. 一種藥物組合物，包括作為活性成分的治療有效量的根據請求項1-16 任意一項所述的多肽化合物或其藥學上可接受的鹽以及藥學上可接受的載體。
  18. 根據請求項1-16 任意一項所述的多肽化合物或其藥學上可接受的鹽或者根據請求項17所述的組合物在製備治療NAFLD和NASH的藥物上的應用。
  19. 根據請求項1-16 任意一項所述的多肽化合物或其藥學上可接受的鹽或者根據請求項17所述的組合物在給藥頻次上為3天1次，4天1次，1周1次或2周1次。
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