KR20230154234A - 폴리펩티드의 제조 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
일련의 폴리펩티드의 제조 및 이의 용도에 있어서, 구체적으로 식(II)로 표시되는 서열의 폴리펩티드를 개시한다.
YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS0
(II)
YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS0
(II)
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출원에 대한 교차 참조
본 발명은 출원일이 2021/5/28인 중국특허출원 2021105946626, 출원일이 2021/07/19인 중국특허출원 CN2021108141169, 출원일이 2022/02/15인 중국특허출원 CN2022101388358, 출원일이 2022/05/18인 중국특허출원 CN2022105520774의 우선권을 주장한다. 본 출원은 상기 중국특허출원의 전문을 인용한다.
본 발명은 일련의 폴리펩티드의 제조 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 식(II)로 표시되는 서열의 폴리펩티드에 관한 것이다.
비알코올성 지방간질환(NAFLD)의 세계적 발병률은 25%에 도달하고, 여기서 비알코올성 지방간염(NASH)의 세계적 발병률은 약 3%-8%이다. 일부 NASH 환자는 간경화 및 간암으로 더욱 발전할 것이고, 현재 말기 간질환 및 간이식의 주요 원인 중 하나이다. NASH의 발병기전은 복잡하고, 현재 상기 질환의 치료를 위한 FDA 승인 약물이 없다. 다수의 전임상 연구에 따르면, 포도당 의존성 인슐린 분비 촉진 펩티드(GIP)/글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1) 이중 작용제는 NASH 치료에 사용될 수 있다. 엘리릴리앤드컴퍼니의 연구중인 약물 GLP-1/GIP는 이중 작용제 Tirzepatide의 임상 연구 결과는 NASH 관련 트랜스아미나제 등 관련 마커를 개선할 수 있음을 보여, NASH의 치료 가능성을 보여준다.
GLP-1 작용제는 다중 채널 시너지 효과를 통해 NASH를 치료할 수 있다. 예를 들어, GLP-1 작용제는 순환하는 종양 괴사 인자(TNF)-α, 인터루킨IL-1β, IL-6, CD163 및 hsCRP 수준을 저하시켜, 염증 억제 효과를 달성할 수 있다. GIP는 소장의 신경내분비 K세포에서 분비되는 폴리펩티드로서, GLP-1 작용제 치료를 기반으로 간의 지방 합성을 보다 완화시킬 수 있으므로, GLP-1/GIP 이중 작용제는 NASH 치료에 시너지 효과를 갖는다.
본 발명은 식(II)로 표시되는 서열의 폴리펩티드를 제공하는데,
YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS0
(II)
1) i 및 i+3 위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기 또는 j 및 j+4 위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기는 에 연결되고, 여기서 i는 17(즉, i가 17인 경우, 17위치의 이소류신은 먼저 라이신으로 치환된 후, 그 측쇄 상의 아미노기는 다시 20위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기와 함께 에 연결)이거나, 여기서 j는 20인 변형;
2) 식(II)로 표시되는 일련의 폴리펩티드의 별도의 0 내지 2개의 아미노산이 치환되는 변형을 갖되,
여기서,
Aib의 구조는 이고;
S0은 및 로부터 선택되며;
X는 , 및 로부터 선택되고, 여기서, "*"는 X1에 연결된 위치를 표시하며;
X1은 단일 결합, -C(=O)-, -O-C(=O)- 및 -N(R1)-C(=O)-로부터 선택되고;
R1은 H 및 C1- 3알킬기로부터 선택되며;
X2는 및
로부터 선택되고;
m은 2, 3 및 4로부터 선택되며;
n은 15, 16, 17, 18 및 19로부터 선택되고;
p는 1 및 2로부터 선택된다.
본 발명은 식(P)로 표시되는 서열의 폴리펩티드를 제공하는데,
YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS0
(P)
1) 17 및 20위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기가 에 연결되는 변형; 및
2) 식(P)로 표시되는 서열의 폴리펩티드의 0 내지 2개의 아미노산이 치환되는 변형을 갖되,
여기서,
Aib의 구조는 이고;
S0은 및 로부터 선택되며;
X는 , 및 로부터 선택되고, 여기서, "*"는 X1에 연결된 위치를 표시하며;
X1은 단일 결합, -C(=O)-, -O-C(=O)- 및 -N(R1)-C(=O)-로부터 선택되고;
R1은 H 및 C1- 3알킬기로부터 선택되며;
X2는 및
로부터 선택되고;
m은 2, 3 및 4로부터 선택되며;
n은 15, 16, 17, 18 및 19로부터 선택되고;
p는 1 및 2로부터 선택된다.
본 발명은 식(II)로 표시되는 서열의 폴리펩티드를 제공하는데,
YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS0
(II)
1) i 및 i+3 위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기 또는 j 및 j+4 위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기는 에 연결되고, 여기서 i는 17이며, 여기서 j는 20(17위치의 이소류신은 먼저 라이신으로 치환된 후, 그 측쇄 상의 아미노기는 다시 20위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기에 연결)인 변형; 및
2) 식(II)로 표시되는 일련의 폴리펩티드의 별도의 0 내지 2개의 아미노산이 치환되는 변형을 갖되,
여기서,
Aib의 구조는 이고;
S0은 및 로부터 선택되며;
X는 , 및 로부터 선택되고, 여기서, "*"는 X1에 연결된 위치를 표시하며;
X1은 단일 결합, -C(=O)-, -O-C(=O)- 및 -N(R1)-C(=O)-로부터 선택되고;
R1은 H 및 C1- 3알킬기로부터 선택되며;
X2는 및
로부터 선택되고;
m은 2, 3 및 4로부터 선택되며;
n은 15, 16, 17, 18 및 19로부터 선택되고;
p는 1 및 2로부터 선택된다.
본 발명의 일부 방안에서, 상기 폴리펩티드의 21번째, 23번째 또는 24번째 위치 중 0 내지 2개의 아미노산이 치환되고, 나머지 변수는 본 발명에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 일부 방안에서, 상기 폴리펩티드는, 식(II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-6), (IV-7), (IV-8), (IV-9) 및 (IV-10)으로 표시되는 서열을 갖되,
YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS-NH2
(II-1)
YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK EFVKW LIAGG PSSGA PPPS-NH2
(II-2)
YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFIKW LIAGG PSSGA PPPS-NH2
(II-3)
YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LLAGG PSSGA PPPS-NH2
(II-4)
YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVEW LIAGG PSSGA PPPS-NH2
(III-6)
YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVQW LIAGG PSSGA PPPS-NH2
(IV-7)
YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVAW LIAGG PSSGA PPPS-NH2
(IV-8)
YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVIW LIAGG PSSGA PPPS-NH2
(IV-9)
YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK EFVEW LIAGG PSSGA PPPS-NH2
(IV-10)
17 및 20위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기 또는 20 및 24 위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기는 에 연결되고,
여기서,
Aib, X, X1 및 X2는 본 발명에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 일부 방안에서, 상기 R1은 H로부터 선택되고, 다른 변수는 본 발명에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 일부 방안에서, 상기 X1은 단일 결합, -C(=O)-, -O-C(=O)- 및 -NH-C(=O)-로부터 선택되고, 다른 변수는 본 발명에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 일부 방안에서, 상기 m은 2로부터 선택되고, 다른 변수는 본 발명에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 일부 방안에서, 상기 n은 15 및 17로부터 선택되고, 다른 변수는 본 발명에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 일부 방안에서, 상기 X2는 , , 및 로부터 선택되고, 다른 변수는 본 발명에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 일부 방안에서, 상기 X2는 , , 및 로부터 선택되고, 다른 변수는 본 발명에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 일부 방안에서, 상기 i 및 i+3 위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기 또는 j 및 j+4 위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기는 에 연결되어 , , 또는 을 형성하고, 다른 변수는 본 발명에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 일부 방안에서, 상기 i 및 i+3 위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기 또는 j 및 j+4 위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기는 에 연결되어 , , 또는 을 형성하고, 다른 변수는 본 발명에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 일부 방안에서, 상기 는
,
,
,
,
및
로부터 선택되고, 다른 변수는 본 발명에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 일부 방안에서, 상기 는
,
,
,
및
로부터 선택되고, 다른 변수는 본 발명에서 정의된 바와 같다.
본 발명은 식(II)로 표시되는 서열의 폴리펩티드를 제공하는데,
YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS0
(II)
1) i 및 i+3 위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기 또는 j 및 j+4 위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기는 에 연결되고, 여기서 i는 17이며, 여기서 j는 20인 변형;
2) 식(II)로 표시되는 폴리펩티드의 0 내지 2개의 아미노산이 치환되는 변형을 갖되,
여기서,
Aib의 구조는 이고;
S0은 및 로부터 선택되며;
X는 , 및 로부터 선택되고, 여기서, "*"는 X1에 연결된 위치를 표시하며;
X1은 -C(=O)-, -O-C(=O)- 및 -N(R1)-C(=O)-로부터 선택되고;
R1은 H 및 C1- 3알킬기로부터 선택되며;
X2는 로부터 선택되고;
m은 2, 3 및 4로부터 선택되며;
n은 15, 16, 17, 18 및 19로부터 선택된다.
본 발명은 식(II)로 표시되는 서열의 폴리펩티드를 제공하는데,
YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS0
(II)
1) i 및 i+3 위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기 또는 j 및 j+4 위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기는 에 연결되고, 여기서 i는 17이며, 여기서 j는 20인 변형;
2) 식(II)로 표시되는 폴리펩티드의 0-1개의 아미노산이 치환되는 변형을 갖되,
여기서,
Aib의 구조는 이고;
S0은 및 로부터 선택되며;
X는 , 및 로부터 선택되고, 여기서, "*"는 X1에 연결된 위치를 표시하며;
X1은 -C(=O)-, -O-C(=O)- 및 -N(R1)-C(=O)-로부터 선택되고;
R1은 H 및 C1- 3알킬기로부터 선택되며;
X2는 로부터 선택되고;
m은 2, 3 및 4로부터 선택되며;
n은 15, 16, 17, 18 및 19로부터 선택된다.
본 발명의 일부 방안에서, 상기 폴리펩티드는, 식(II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (II-5) 및 (III-6)로 표시되는 서열을 갖되,
YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS-NH2
(II-1)
YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK EFVKW LIAGG PSSGA PPPS-NH2
(II-2)
YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFIKW LIAGG PSSGA PPPS-NH2
(II-3)
YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LLAGG PSSGA PPPS-NH2
(II-4)
YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS-NH2
(II-5)
YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVEW LIAGG PSSGA PPPS-NH2
(III-6)
17 및 20위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기 또는 20 및 24 위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기는 에 연결되고,
여기서, Aib, X, X1 및 X2는 본 발명에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 일부 방안에서, 상기 R1은 H로부터 선택되고, 다른 변수는 본 발명에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 일부 방안에서, 상기 X1은 -C(=O)-, -O-C(=O)- 및 -NH-C(=O)-로부터 선택되고, 다른 변수는 본 발명에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 일부 방안에서, 상기 m은 2로부터 선택되고, 다른 변수는 본 발명에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 일부 방안에서, 상기 n은 17로부터 선택되고, 다른 변수는 본 발명에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 일부 방안에서, 상기 X2는 로부터 선택되고, 다른 변수는 본 발명에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 일부 방안에서, 상기 i 및 i+3 위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기 또는 j 및 j+4 위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기는 에 연결되어 또는 을 형성하고, 여기서 Z2FZ3은 AFV, EFV 또는 AFI이며, 다른 변수는 본 발명에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 일부 방안에서, 상기 i 및 i+3 위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기 또는 j 및 j+4 위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기는 에 연결되어 , , 또는 을 형성하고, 다른 변수는 본 발명에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 일부 방안에서, 상기 는
,
및
로부터 선택되고, 다른 변수는 본 발명에서 정의된 바와 같다.
본 발명의 다른 일부 방안에서 상기 변수의 임의의 조합에 의해 형성된다.
본 발명은 하기 식으로 표시되는 폴리펩티드를 더 제공한다.
본 발명은 치료 유효량의 상기 폴리펩티드 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 활성 성분으로 포함하는 상기 약물 조성물을 더 제공한다.
본 발명의 일부 방안에서, 상기 폴리펩티드 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염 또는 상기 조성물은 NAFLD 및 NASH 치료용 약물의 제조에 적용된다.
본 발명의 일부 방안에서, 상기 폴리펩티드 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염 또는 상기 조성물의 투여 빈도는 3일 1회, 4일 1회, 1주 1회 또는 2주 1회이다.
기술적 효과
본 발명의 폴리펩티드는 GLP-1R/GIPR에 대해 강한 작용 활성을 갖고; 본 발명의 화합물은 우수한 약동학적 성질, 혈장 안정성 및 높은 혈장 단백질 결합도를 가지며; 본 발명의 화합물은 STZ-NASH 마우스 모델에서 NAS 점수를 유의하게 개선할 수 있다.
정의 및 설명
달리 명시되지 않는 한, 본문에서 사용되는 이하 용어 및 문구는 다음과 같은 의미를 갖는 것으로 의도된다. 하나의 특정된 문구 또는 용어는 특별한 정의가 없는 경우에 불확실하거나 불명확한 것으로 간주되어서는 아니되고, 일반적인 의미로 이해되어야 한다. 본문에서 상품명이 나타날 경우, 이의 대응되는 상품 또는 이의 활성 성분을 지칭하려는 것으로 의도된다.
여기서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 이러한 화합물, 재료, 조성물 및/또는 제형에 대한 것이고, 이들은 신뢰할 수 있는 의학적 판단 범위 내에서, 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하는데 적용되나, 과도한 독성, 자극성, 알레르기 반응 또는 기타 문제점 또는 합병증이 없으며, 합리적인 이익/위험 비율에 상응하다.
용어 "약학적으로 허용 가능한 염"은 본 발명의 화합물의 염을 지칭하고, 본 발명에서 발견된 특정 치환기를 갖는 화합물과 상대적 무독성 산 또는 염기로부터 제조된다. 본 발명의 화합물에 상대적으로 산성의 작용기가 함유될 경우, 순수한 용액 또는 적합한 불활성 용매에서 충분한 양의 염기가 이러한 화합물과 접촉하는 방식으로 염기 부가염을 수득할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염기 부가염은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 암모늄, 유기 아민 또는 마그네슘염 또는 유사한 염을 포함한다. 본 발명의 화합물에 상대적으로 염기성의 작용기가 함유될 경우, 순수한 용액 또는 적합한 불활성 용매에서 충분한 양의 산이 이러한 화합물과 접촉하는 방식으로 산 부가염을 수득할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 산 부가염의 구현예는 무기산염 및 유기산염을 포함하고, 상기 무기산은 예컨대 염산, 브롬화수소산, 질산, 탄산, 탄산수소기, 인산, 인산일수소기, 인산이수소기, 황산, 황산수소기, 요오드화수소산, 아인산을 포함하며; 또한 상기 유기산은 예컨대 아세트산, 프로피온산, 이소부티르산, 말레산, 말론산, 벤조산, 숙신산, 수베르산, 푸마르산, 젖산, 만델산, 프탈산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 구연산, 타르타르산 및 메탄설폰산 등 유사한 산을 포함하고; 또한 아미노산(아르기닌 등)의 염, 및 글루쿠론산과 같은 유기산의 염을 더 포함한다. 본 발명의 일부 특정된 화합물은 염기성 및 산성의 작용기를 포함으로써, 임의의 염기 또는 산 부가염으로 전환될 수 있다.
본 발명의 약학적으로 허용 가능한 염은 산기 또는 염기를 함유하는 모체 화합물이 통상적인 화학적 방법을 통해 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 염의 제조 방법은 다음과 같다. 물 또는 유기 용매 또는 양자의 혼합물에서, 유리산 또는 염기 형태의 이러한 화합물을 화학 양론적 양의 적절한 염기 또는 산과 반응시켜 제조한다.
"아미노산"은 천연 존재하는 및 합성된 아미노산, 및 천연 존재하는 아미노산과 유사하게 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 의미한다. 천연 존재하는 아미노산은 유전자 코드에 의해 코딩되는 아미노산, 및 나중에 변형되는 아미노산, 예를 들어, 히드록시프롤린, γ-카르복시글루탐산 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 천연 존재하는 아미노산과 동일한 기본 화학 구조(예를 들어 수소, 카르복시기, 아미노기 및 R 기에 결합된 α 탄소)를 갖는 화합물을 의미하고, 예를 들어, 호모세린, 노르류신, 메티오닌설폭사이드, 메티오닌메틸설포늄이다. 이러한 유사체는 변형된 R 기(예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 백본을 가질 수 있지만, 천연 존재하는 아미노산과 동일한 기본 화확 구조를 보류한다. 아미노산 모방체는 구조가 일반적인 아미노산의 화학 구조와 상이하지만, 천연 존재하는 아미노산과 유사한 작용을 하는 화학 화합물을 의미한다.
본원에 설명된 A 또는 Ala는 알라닌을 나타내고, 구조는 이며; R 또는 Arg는 아르기닌을 나타내고, 구조는 이며; N 또는 Asn은 아스파라긴을 나타내고, 구조는 이며; D 또는 Asp는 아스파르트산을 나타내고, 구조는 이며; C또는 Cys는 시스테인을 나타내고, 구조는 이며; Q 또는 Gln은 글루타민을 나타내고, 구조는 이며; E 또는 Glu는 글루탐산을 나타내고, 구조는 이며; G 또는 Gly는 글리신을 나타내고, 구조는 이며; H 또는 His는 히스티딘을 나타내고, 구조는 이며; I 또는 Ile는 이소류신을 나타내고, 구조는 이며; L 또는 Leu는 류신을 나타내고, 구조는 이며; K 또는 Lys는 라이신을 나타내고, 구조는 이며; M 또는 Met는 메티오닌을 나타내고, 구조는 이며; F 또는 Phe는 페닐알라닌을 나타내고, 구조는 이며; P 또는 Pro는 프롤린을 나타내고, 구조는 이며; S 또는 Ser은 세린을 나타내고, 구조는 이며; T 또는 Thr은 트레오닌을 나타내고, 구조는 이며; W 또는 Trp는 트립토판을 나타내고, 구조는 이며; Y 또는 Tyr은 티로신을 나타내고, 구조는 이며; V 또는 Val은 발린을 나타내고, 구조는 이며; Fmoc-AEEA-OH는 를 나타낸다.
용어 "치료"는 기존 증상 또는 환자 상태의 진행 또는 중증도를 억제, 완화, 정지 또는 역전시키는 것을 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 용어 "이성질체"는 기하학적 이성질체, 시스-트랜스 이성질체, 입체 이성질체, 거울상 이성질체, 광학 이성질체, 부분 입체 이성질체 및 호변 이성질체를 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 화합물은 특정된 기하학적 또는 입체 이성질체 형태로 존재할 수 있다. 본 발명은 모든 이러한 화합물을 고려하고, 시스 및 트랜스 이성질체, (-)- 및 (+)-거울상 이성질체, (R)- 및 (S)-거울상 이성질체, 부분 입체 이성질체, (D)-이성질체, (L)-이성질체, 및 이의 라세미 혼합물 및 거울상 이성질체 또는 부분 입체 이성질체가 풍부한 혼합물과 같은 다른 혼합물을 포함하며, 모든 이러한 혼합물은 모두 본 발명의 범위 내에 속한다. 알킬기와 같은 치환기에는 별도의 비대칭 탄소 원자가 존재할 수 있다. 모든 이러한 이성질체 및 이들의 혼합물은 모두 본 발명의 범위 내에 포함된다.
달리 명시되지 않는 한, 용어 "거울상 이성질체" 또는 "광학 이성질체"는 서로 거울상 관계인 입체 이성질체를 지칭한다.
달리 명시되지 않는 한, 용어 "시스-트랜스 이성질체" 또는 "기하학적 이성질체"는 이중 결합 또는 고리를 형성하는 탄소 원자의 단일 결합이 자유롭게 회전할 수 없기 때문에 발생된다.
달리 명시되지 않는 한, 용어 "부분 입체 이성질체" 는 분자가 두 개 또는 복수개의 키랄 중심을 갖고, 분자 사이가 비거울상 관계인 입체 이성질체를 지칭한다.
달리 명시되지 않는 한, "(+)"는 우회전을 나타내고, "(-)"는 좌회전을 나타내며, "(±)"는 라세미를 나타낸다.
달리 명시되지 않는 한, 쐐기형 실선 결합() 및 쐐기형 점선 결합()으로 하나의 입체 중심의 절대 구성을 나타내고, 직선형 실선 결합() 및 직선형 점선 결합()으로 입체 중심의 상대적 구성을 나타내며, 물결선()으로 쐐기형 실선 결합() 또는 쐐기형 점선 결합()을 나타내거나, 물결선()으로 직선형 실선 결합() 및 직선형 점선 결합()을 나타낸다.
달리 명시되지 않는 한, 용어 "하나의 이성질체가 풍부한", "이성질체가 풍부한", "하나의 거울상 이성질체가 풍부한" 또는 "거울상 이성질체가 풍부한"은 하나의 이성질체 또는 거울상 이성질체의 함량이 100%보다 작고, 또한, 상기 이성질체 또는 거울상 이성질체의 함량이 60%, 또는 70%, 또는 80%, 또는 90%, 또는 95%, 또는 96%, 또는 97%, 또는 98%, 또는 99%, 또는 99.5%, 또는 99.6%, 또는 99.7%, 또는 99.8%, 또는 99.9%보다 크거나 같은 것을 지칭한다.
달리 명시되지 않는 한, 용어 "이성질체 과량" 또는 "거울상 이성질체 과량"은 두 가지 이성질체 또는 두 가지 거울상 이성질체의 상대적 백분율 사이의 차이값을 지칭한다. 예를 들어, 하나의 이성질체 또는 거울상 이성질체의 함량이 90%이고, 다른 하나의 이성질체 또는 거울상 이성질체의 함량이 10%이면, 이성질체 또는 거울상 이성질체 과량(ee값)은 80%이다.
키랄 합성 또는 키랄 시약 또는 기타 통상적인 기술을 통해 광학 활성의 (R)- 및 (S)-이성질체 및 D 및 L이성질체를 제조할 수 있다. 만약 본 발명의 화합물의 거울상 이성질체를 얻고자 하면, 비대칭 합성 또는 키랄 보조제를 갖는 유도체 작용을 통해 제조할 수 있고, 여기서 얻은 부분 입체 이성질체의 혼합물을 분리시키며, 보조기가 절단되어 순수한 필요한 거울상 이성질체를 제공한다. 또는, 분자에 염기성 작용기(예: 아미노기) 또는 산성 작용기(예: 카르복실기)가 존재할 경우, 적절한 광학 활성의 산 또는 염기와 부분 입체 이성질체의 염을 형성한 후, 본 분야에 공지된 통상적인 방법을 통해 부분 입체 이성질체를 분해한 후, 회수하여 순수한 거울상 이성질체를 얻는다. 이 밖에, 거울상 이성질체 및 부분 입체 이성질체의 분리는 일반적으로 크로마토그래피로 완성되고, 상기 크로마토그래피는 키랄 고정상을 사용하며, 선택적으로 화학적 유도체에 결합시킨다(예를 들어 아민으로 카바메이트를 생성함).
본 발명의 화합물은 상기 화합물을 구성하는 하나 또는 복수개의 원자에 비천연 비율의 원자 동위원소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 삼중수소(3H), 요오드-125(125I) 또는 C-14(14C)와 같은 방사성 동위원소로 화합물을 표지할 수 있다. 또 예를 들어, 중수소로 수소를 대체하여 중수소화 약물을 형성할 수 있고, 중수소와 탄소가 구성하는 결합은 일반 수소와 탄소가 구성하는 결합보다 견고하며, 비중수소화 약물에 비해, 중수소화 약물은 독성 및 부작용 감소, 약물 안정성 증가, 치료 효과 향상, 약물의 생물학적 반감기 연장 등 장점을 갖는다. 본 발명의 화합물의 동위원소 조성의 모든 변환은 방사성 여부에 관계없이 모두 본 발명의 범위에 포함된다.
열거된 연결기가 연결 방향을 나타내지 않는 경우, 이의 연결 방향은 임의적인 것이고, 예를 들어, 에서 연결기 L은 -M-W-이며, 이때 -M-W-는 왼쪽에서 오른쪽으로 향하는 판독 순서와 동일한 방향으로 고리A 및 고리B를 연결시켜 를 구성할 수 있거나, 왼쪽에서 오른쪽으로 향하는 판독 순서와 상반되는 방향으로 고리A 및 고리B를 연결시켜 를 구성할 수 있다. 상기 연결기, 치환기 및/또는 이의 변이체의 조합은 이러한 조합이 안정적인 화합물을 생성하는 경우에만 허용된다.
달리 명시되지 않는 한, 어느 하나의 기에 하나 또는 복수개의 연결 가능한 사이트가 있을 경우, 상기 기의 임의의 하나 또는 복수개의 사이트는 화학 결합을 통해 다른 기에 연결될 수 있다. 상기 화학 결합의 연결 방식이 위치 결정된 것이 아니고, 연결 가능한 사이트에 H원자가 존재하면, 화학 결합이 연결될 경우, 상기 사이트의 H원자의 개수는 연결되는 화학 결합의 개수에 따라 대응되게 감소되어 상응한 원자가의 기로 변경된다. 상기 기와 다른 기 사이의 화학 결합은 직선 실선 결합(), 직선 점선 결합(), 또는 물결선()으로 나타낼 수 있다. 예를 들어, -OCH3의 직선 실선 결합은 상기 기의 산소 원자를 통해 다른 기에 연결되는 것을 나타내고; 의 직선 점선 결합은 상기 기의 질소 원자의 양단을 통해 다른 기에 연결되는 것을 나타내며; 의 물결선은 상기 페닐기의 1개 사이트 및 2개 사이트의 탄소 원자를 통해 다른 그룹에 연결되는 것을 나타낸다.
달리 명시되지 않는 한, 용어 "C1- 3알킬기"는 1개 내지 3개의 탄소 원자로 구성된 직쇄 또는 분지쇄의 포화 탄화수소 기를 나타낸다. 상기 C1- 3알킬기는 C1- 2알킬기 및 C2- 3알킬기 등을 포함하고; 이는 1가(예: 메틸기), 2가(예: 메틸렌기)또는 다가(예: 메틴기)를 포함한다. C1- 3알킬기의 구현예는 메틸기(Me), 에틸기(Et), 프로필기(n-프로필기 및 이소프로필기를 포함) 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 화합물의 구조는 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 통상적인 방법으로 확인할 수 있고, 만약 본 발명이 화합물의 절대 배열을 포함하면, 절대 배열은 본 분야의 통상적인 기술수단으로 확인할 수 있다. 예를 들어 단결정 X-선 회절(SXRD), 배양된 단결정을 Bruker D8 venture 회절계로 회절 강도 데이터를 수집하고, 광원은 CuKα 방사선이며, 스캐닝 방식: φ/ω 스캐닝으로, 관련 데이터를 수집한 후, 직접법(Shelxs97)으로 결정 구조를 추가로 해석하여, 절대 구성을 확인할 수 있다.
본 발명의 화합물은 본 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 숙지된 다양한 합성 방법으로 제조될 수 있고, 이하 열거된 구체적인 실시형태, 이와 다른 화학적 합성 방법이 결합하여 형성된 실시형태 및 본 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 숙지된 동등한 대체 방식을 포함하며, 바람직한 실시형태는 본 발명의 실시예를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용매는 시판되는 것이다.
본 발명은 하기 약어를 사용한다. aq는 물을 대표하고; eq는 당량, 등량을 대표하며; DCM은 디클로로메탄을 대표하고; PE는 석유 에테르를 대표하며; DMSO는 디메틸설폭사이드를 대표하고; MeOH는 메탄올을 대표하며; BOC는 아민 보호기인 tert-부톡시카르보닐기를 대표하고; r.t.는 실온을 대표하며; O/N은 하룻밤 경과를 대표하고; THF는 테트라히드로푸란을 대표하며; Boc2O는 디tert-부틸디카보네이트를 대표하고; TFA는 트리플루오로아세트산을 대표하며; DIEA는 디이소프로필에틸아민을 대표하고; DMF는 N,N-디메틸포름아미드를 대표하며; HBTU는 벤조트리아졸-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로포스페이트를 대표하고; HOBT는 1-히드록시벤조트리아졸을 대표하며; HOAT는 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸을 대표하고; DIC는 N, N'-디이소프로필카르보디이미드를 대표하며; DBU는 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데카-7-엔을 대표하고; PhSiH3는 페닐실란을 대표하며; Pd(PPh3)4는 팔라듐 테트라키스트리페닐포스핀을 대표한다.
하기 실시예를 통해 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본원에서 본 발명을 상세하게 설명하는 바 그 구체적인 실시형태도 개시하며, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 한 본 발명의 구체적인 실시형태에 대한 다양한 변형 및 개선이 이루어질 수 있다는 것은 해당 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것이다.
중간체 A-1
단계 1: 수지 고정화
1.1 4g의 클로로(o-클로로페닐)디페닐메탄 수지(치환도 S=1.00mmol/g) 및 1.54g의 A-1_1을 칭량하여, 반응 컬럼에 첨가하고, DCM(25 mL)을 더 첨가한 후, 3 mL의 N,N-디이소프로필에틸아민을 반응 컬럼에 첨가하며, 그 후 질소 가스를 2시간 동안 불어넣은 후, 4 mL의 MeOH를 반응 컬럼에 첨가하고 계속하여 질소 가스를 30분간 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거하고, DMF(50 mL)를 첨가하여 1분씩 5회 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
1.2 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20분간 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)을 첨가하여 1분씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
단계 2: 아미노산의 커플링
2.1 A-1_1의 커플링
1. A-1_1(3.0 eq)을 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 20 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
2. 25℃의 환경에서 20분간 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
3. 반응액을 제거하고, DMF로 1분씩 5회 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
2.2 A-1_a의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20분간 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. A-1_a(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(3.00 eq)를 첨가하며 20 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5시간 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF(50 mL)으로 1분씩 5회 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
2.3 A-1_b의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20분간 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거하고, DMF(50 mL)를 첨가하여 1분씩 5회 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. A-1_b(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00eq)를 첨가하며 20 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5시간 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1분씩 5회 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
단계 3: 절삭 및 조펩티드 건조
3.1 이하의 부피로 절삭유를 조제한다.
3.2 조제된 60 mL의 절삭유를 건조된 펩타이드 수지가 첨가된 반응기에 부어 첨가하고, 반응기에 20분간 통기하며, 여과하고, 여과액을 플라스크에 첨가하며, 이 조작을 2회 반복하고, 2회에 거쳐 수집한 절삭유를 스핀건조시킨 후 A-1을 얻는다.
중간체 A-2
중간체 A-1의 합성을 참조하여, 중간체A -2를 얻는다.
중간체 A-3
중간체 A-1의 합성을 참조하여, 중간체 A-3을 얻는다.
중간체 A-4
중간체 A-1의 합성을 참조하여, 중간체 A-4를 얻는다.
실시예
1
단계 1: 1.34 g의 4-(2',4'-디메톡시페닐-플루오레닐메톡시카르보닐-아미노메틸)-페녹시아세트아미도-메틸벤즈하이드릴아민 수지(치환도 Sub=0.3 mmol/g)를 칭량하여, 반응 컬럼에 첨가하고, DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 더 첨가하여 질소 가스를 2시간 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거하고, DMF(50 mL)를 첨가하여 1분씩 5회 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
단계 2: 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20분간 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)을 첨가하여 1분씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
단계 3: 아미노산의 커플링
3.1
Fmoc
-
Ser
(
tBu
)-OH의 커플링
1. Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
2. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
3. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.2
Fmoc
-Pro-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Pro-OH(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.3
Fmoc
-Pro-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 클로로벤조퀴논으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Pro-OH(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 클로로벤조퀴논으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.4
Fmoc
-Pro-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 클로로벤조퀴논으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Pro-OH(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 클로로벤조퀴논으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.5
Fmoc
-Ala-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 클로로벤조퀴논으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Ala-OH(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 클로로벤조퀴논으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.6
Fmoc
-
Gly
-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Gly-OH(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.7
Fmoc
-
Ser
(
tBu
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.8
Fmoc
-
Ser
(
tBu
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.9
Fmoc
-Pro-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Pro-OH(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.10
Fmoc
-
Gly
-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 클로로벤조퀴논으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Gly-OH(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 클로로벤조퀴논으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.11
Fmoc
-
Gly
-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Gly-OH(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.12
Fmoc
-Ala-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Ala-OH(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.13
Fmoc
-
Ile
-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Ile-OH(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.14
Fmoc
-Leu-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Leu-OH(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.15
Fmoc
-
Trp
(
Boc
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Trp(Boc)-OH(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.16
Fmoc
-
Lys
(
Dde
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Lys(Dde)-OH(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.17
Fmoc
-Val-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Val-OH(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.18
Fmoc
-
Phe
-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Phe-OH(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.19
Fmoc
-Ala-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Ala-OH(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.20
Fmoc
-
Lys
(
Alloc
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Lys(Alloc)-OH(2.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 HOBT(2.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산 및 HOBT가 용해된 후 DIC(2.00 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.21
Fmoc
-
Gln
(
Trt
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Gln(Trt)-OH(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.22
Fmoc
-Ala-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Ala-OH(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.23
Fmoc
-
Ile
-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Ile-OH(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.24
Fmoc
-
Lys
(
Boc
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Lys(Boc-OH(2.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.25
Fmoc
-Asp(
OtBu
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Asp(OtBu)-OH(6.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(12.0 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(5.70 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.26
Fmoc
-Leu-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Leu-OH(6.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, DIEA(12.0 eq)를 반응 컬럼에 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(5.70 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.27
Fmoc
-
Aib
-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Aib-OH(6.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(12.0 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(5.70 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 2h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.28
Fmoc
-
Ile
-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Ile-OH(6.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 HOAT(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산 및 HOAT가 용해된 후 DIC(6.00 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 1h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.29
Fmoc
-
Ser
(
tBu
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Ser(tBu)-OH(6.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(12.0 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(5.70 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.30
Fmoc
-
Tyr
(
tBu
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Tyr(tBu)-OH(6.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(12.0 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(5.70 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.31
Fmoc
-Asp(
OtBu
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Asp(OtBu)-OH(6.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(12.0 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(5.70 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.32
Fmoc
-
Ser
(
tBu
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Ser(tBu)-OH(6.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(12.0 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(5.70 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.33
Fmoc
-
Thr
(
tBu
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Thr(tBu)-OH(6.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(12.0 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(5.70 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.34
Fmoc
-
Phe
-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Phe-OH(6.0q)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(12.0 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(5.70 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.35
Fmoc
-
Thr
(
tBu
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Thr(tBu)-OH(6.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(12.0 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(5.70 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.36
Fmoc
-
Gly
-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Gly-OH(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.37
Fmoc
-
Glu
(
OtBu
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Glu(OtBu)-OH(6.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 HOBT(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산 및 HOBT가 용해된 후 DIC(6.00 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.38
Fmoc
-
Aib
-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Aib-OH(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 하룻밤 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.39
Boc
-
Tyr
(
tBu
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 클로로벤조퀴논으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Boc-Tyr(tBu)-OH(6.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(12.0 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(5.70 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 클로로벤조퀴논으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.40
탈Alloc
1. PhSiH3(10.0 eq) 및 DCM(10 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 불어넣은 후 Pd(PPh3)4(0.1 eq)를 첨가하며, 질소 가스를 20min 동안 불어첨가하고, 2회 반응시키며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
2. DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.41
Fmoc
-Ida-OH의 커플링
1. Fmoc-Ida-OH(4..0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(8.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(3.80 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
2. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
3. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.42 중간체 A-1의 커플링
1. 10%의 DBU/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 클로로벤조퀴논으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. 중간체 A-1(1.50 eq)을 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(3.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(1.45 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.43
탈Dde
1. 3%의 히드라진/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 15min 동안 불어넣으며, 폐액을 제거하고, DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
3.44 아미드 고리 닫기
1. DIEA(3.0 eq)를 상기 수지의 DMF 용액에 첨가한 후, DMF에 용해된 HATU(1.5 eq)를 반응 컬럼에 천천히 적가하고, 질소 가스를 불어넣는다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
2. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
3. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
4. MeOH(50 mL)로 수지를 수축하고, 1회 3min이며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거하고, 수지를 부어 건조시켜, 나중에 사용한다.
4. 절삭 및
조펩티드
건조
4.1 이하의 부피로 절삭유를 조제한다.
4.2 건조된 펩티드 수지를 조제된 절삭유에 첨가하고, 진탕기에서 2.5시간 동안 진탕한 후, 여과하며, 여과액을 10배 부피의 아이스 이소프로필에테르에 첨가하고, 원심분리하며, 이소프로필에테르로 5회 세척한다. 2시간 동안 진공 건조시켜 조펩티드를 얻고, 정제하여 폴리펩티드 화합물WX -001을 얻으며, 폴리펩티드의 분자량은 ESI-MS로 확인하고, 계산값 [M+4H]/4는 1228.6이며, 검출값은 1228.7이다.
실시예
2
WX -001의 합성을 참조하여, 폴리펩티드 WX -002를 얻는다. 폴리펩티드의 분자량은 ESI-MS로 확인하고, 계산값 [M+4H]/4는 1243.1이며, 검출값은 1242.8이다.
실시예
3
WX -001의 합성을 참조하여, 폴리펩티드 WX -003을 얻는다. 폴리펩티드의 분자량은 ESI-MS로 확인하고, 계산값 [M+4H]/4는 1232.1이며, 검출값은 1232.2이다.
실시예
4
WX -001의 합성을 참조하여, 폴리펩티드 WX -004를 얻는다. 폴리펩티드의 분자량은 ESI-MS로 확인하고, 계산값 [M+4H]/4는 1228.6이며, 검출값은 1228.2이다.
실시예
5
단계 1: 1.34 g의 4-(2',4'-디메톡시페닐-플루오레닐메톡시카르보닐-아미노메틸)-페녹시아세트아미도-메틸벤즈하이드릴아민 수지(치환도 Sub=0.3 mmol/g)를 칭량하여, 반응 컬럼에 첨가하고, DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 더 첨가하여 질소 가스를 2시간 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거하고, DMF(50 mL)를 첨가하여 1분씩 5회 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
단계 2: 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20분간 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)을 첨가하여 1분씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
단계 3:
아미노산의 커플링
3.1
Fmoc
-
Ser
(
tBu
)-OH의 커플링
1. Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
2. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
3. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.2
Fmoc
-Pro-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Pro-OH(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
5. 3.2 단계를 반복하여, 이하의 아미노산의 커플링을 완성
3.40
탈Alloc
1. PhSiH3(10.0 eq) 및 DCM(10 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 불어넣은 후 Pd(PPh3)4(0.1 eq)를 첨가하며, 질소 가스를 20min 동안 불어첨가하고, 2회 반응시키며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
2. DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.41
Fmoc
-Ida-OH의 커플링
1. Fmoc-Ida-OH(4..0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(8.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(3.80 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
2. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
3. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.42 중간체 A-1의 커플링
1. 10%의 DBU/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 클로로벤조퀴논으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. 중간체 A-1(1.50 eq)을 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(3.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(1.45 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.43
탈Dde
1. 3%의 히드라진/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 15min 동안 불어넣으며, 폐액을 제거하고, DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
3.44
아미드 고리 닫기
1. DIEA(3.0 eq)를 상기 수지의 DMF 용액에 첨가한 후, DMF에 용해된 HATU(1.5 eq)를 반응 컬럼에 천천히 적가하고, 질소 가스를 불어넣는다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
2. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
3. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
4. MeOH(50 mL)로 수지를 수축하고, 1회 3min이며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거하고, 수지를 부어 건조시켜, 나중에 사용한다.
4. 절삭 및
조펩티드
건조
4.1 이하의 부피로 절삭유를 조제한다.
4.2 건조된 펩티드 수지를 조제된 절삭유에 첨가하고, 진탕기에서 2.5시간 동안 진탕한 후, 여과하며, 여과액을 10배 부피의 아이스 이소프로필에테르에 첨가하고, 원심분리하며, 이소프로필에테르로 5회 세척한다. 2시간 동안 진공 건조시켜 조펩티드를 얻고, 정제하여 폴리펩티드 WX -005를 얻는다. 폴리펩티드의 분자량은 ESI-MS로 확인하고, 계산값 [M+4H]/4는 1232.6이며, 검출값은 1232.5이다.
실시예
6
WX -001의 합성을 참조하여, 폴리펩티드 WX -006을 얻는다. 폴리펩티드의 분자량은 ESI-MS로 확인하고, 계산값 [M+4H]/4는 1232.4이며, 검출값은 1232.4이다.
실시예
7
WX -001의 합성을 참조하여, 폴리펩티드 WX -007을 얻는다. 폴리펩티드의 분자량은 ESI-MS로 확인하고, 계산값 [M+4H]/4는 1218.1이며, 검출값은 1218.3이다.
실시예
8
WX -001의 합성을 참조하여, 폴리펩티드 WX -008을 얻는다. 폴리펩티드의 분자량은 ESI-MS로 확인하고, 계산값 [M+4H]/4는 1228.6이며, 검출값은 1228.6이다.
실시예
9
단계 1: 1.34 g의 4-(2’,4’-디메톡시페닐-플루오레닐메톡시카르보닐-아미노메틸)-페녹시아세트아미도-메틸벤즈하이드릴아민 수지(치환도 Sub=0.3 mmol/g)를 칭량하여, 반응 컬럼에 첨가하고, DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 더 첨가하여 질소 가스를 2시간 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거하고, DMF(50 mL)를 첨가하여 1분씩 5회 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
단계 2: 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20분간 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)을 첨가하여 1분씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
단계 3: 아미노산의 커플링
3.1
Fmoc
-
Ser
(
tBu
)-OH의 커플링
1. Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
2. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
3. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.2
Fmoc
-Pro-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Pro-OH(3.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
5. 3.2 단계를 반복하여, 이하의 아미노산의 커플링을 완성
3.40 탈Alloc1. PhSiH3(10.0 eq) 및 DCM(10 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 불어넣은 후 Pd(PPh3)4(0.1 eq)를 첨가하며, 질소 가스를 20min 동안 불어첨가하고, 2회 반응시키며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
2. DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.41
Fmoc
-Ida-OH의 커플링
1. Fmoc-Ida-OH(4.0 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(8.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(3.80 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
2. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
3. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.42 중간체 A-1의 커플링
1. 10%의 DBU/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 클로로벤조퀴논으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. 중간체 A-1(1.50 eq)을 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(3.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(1.45 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.43
탈Dde
1. 3%의 히드라진/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 15min 동안 불어넣으며, 폐액을 제거하고, DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
3.44
아미드 고리 닫기
1. DIEA(3.0 eq)를 상기 수지의 DMF 용액에 첨가한 후, DMF에 용해된 HATU(1.5 eq)를 반응 컬럼에 천천히 적가하고, 질소 가스를 불어넣는다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
2. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
3. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
4. MeOH(50 mL)로 수지를 수축하고, 1회 3min이며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거하고, 수지를 부어 건조시켜, 나중에 사용한다.
4. 절삭 및
조펩티드
건조
4.1 이하의 부피로 절삭유를 조제한다.
4.2 건조된 펩티드 수지를 조제된 절삭유에 첨가하고, 진탕기에서 2.5시간 동안 진탕한 후, 여과하며, 여과액을 10배 부피의 아이스 이소프로필에테르에 첨가하고, 원심분리하며, 이소프로필에테르로 5회 세척한다. 2시간 동안 진공 건조시켜 조펩티드를 얻고, 정제하여 폴리펩티드 WX -009를 얻는다. 폴리펩티드의 분자량은 ESI-MS로 확인하고, 계산값 [M+4H]/4는 1247.1이며, 검출값은 1247.2이다.
실시예
10
단계 1: 1.08 g의 4-(2',4'-디메톡시페닐-플루오레닐메톡시카르보닐-아미노메틸)-페녹시아세트아미도-메틸벤즈하이드릴아민 수지(치환도 Sub=0.37 mmol/g)를 칭량하여, 반응 컬럼에 첨가하고, DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 더 첨가하여 질소 가스를 2h 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거하고, DMF(50 mL)를 첨가하여 1min씩 5회 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
단계 2: 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
단계 3: 아미노산의 커플링
3.1
Fmoc
-
Ser
(
tBu
)-OH의 커플링
1. Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
2. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
3. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.2
Fmoc
-Pro-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Pro-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.3
Fmoc
-Pro-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 클로로벤조퀴논으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Pro-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 클로로벤조퀴논으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.4
Fmoc
-Pro-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 클로로벤조퀴논으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Pro-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 클로로벤조퀴논으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.5
Fmoc
-Ala-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 클로로벤조퀴논으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Ala-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 클로로벤조퀴논으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.6
Fmoc
-
Gly
-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Gly-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.7
Fmoc
-
Ser
(
tBu
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.8
Fmoc
-
Ser
(
tBu
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.9
Fmoc
-Pro-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Pro-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.10
Fmoc
-
Gly
-
Gly
-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 클로로벤조퀴논으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Gly-Gly-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 클로로벤조퀴논으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.11
Fmoc
-Ala-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Ala-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.12
Fmoc
-
Ile
-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Ile-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.13
Fmoc
-Leu-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Leu-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.14
Fmoc
-
Trp
(
Boc
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Trp(Boc)-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.15
Fmoc
-
Glu
(
OtBu
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Glu(OtBu)-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.16
Fmoc
-Val-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Val-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.17
Fmoc
-
Phe
-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Phe-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.18
Fmoc
-Ala-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Ala-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.19
Fmoc
-
Lys
(
Alloc
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Lys(Alloc)-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.20
Fmoc
-
Gln
(
Trt
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Gln(Trt)-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.21
Fmoc
-Ala-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Ala-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HBTU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.22
Fmoc
-
Lys
(
Dde
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Lys(Dde)-OH(3.00eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.23
Fmoc
-
Lys
(
Boc
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Lys(Boc-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.24
Fmoc
-Asp(
OtBu
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1회 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Asp(OtBu)-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.25
Fmoc
-Leu-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Leu-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.26
Fmoc
-
Aib
-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Aib-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 2h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.27
Fmoc
-
Ile
-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Ile-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 1h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.28
Fmoc
-
Ser
(
tBu
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.29
Fmoc
-
Tyr
(
tBu
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Tyr(tBu)-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.30
Fmoc
-Asp(
OtBu
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Asp(OtBu)-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.31
Fmoc
-
Thr
(
tBu
)-
SerPsi(Me,Me)Pro
-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Thr(tBu)-SerPsi(Me,Me)Pro-OH(2.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(4.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(1.90 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.32
Fmoc
-
Phe
-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Phe-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.33
Fmoc
-
Thr
(
tBu
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Thr(tBu)-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.34
Fmoc
-
Gly
-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Gly-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.35
Fmoc
-
Glu
(
OtBu
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Glu(OtBu)-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.36
Fmoc
-
Aib
-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Fmoc-Aib-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 하룻밤 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.37
Boc
-
Tyr
(
tBu
)-OH의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 클로로벤조퀴논으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. Boc-Tyr(tBu)-OH(3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 클로로벤조퀴논으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.38
탈Alloc
1. PhSiH3(10.0 eq) 및 DCM(20 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 불어넣은 후 Pd(PPh3)4(0.10 eq)를 첨가하며, 질소 가스를 20min 동안 불어첨가하고, 2회 반응시키며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
2. DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.39
Fmoc
-
Glu
-
OAll의
커플링
1. Fmoc-Glu-OAll (3.00 eq)를 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(6.00 eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(2.85 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
2. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
3. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.40 중간체 A-1의 커플링
1. 20%의 피페리딘/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. DMF(50 mL)를 첨가하여 1min씩 5회 세척하고, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
2. 중간체 A-1(1.50 eq)을 칭량하여 상기 수지에 첨가하고, 반응 컬럼에 DIEA(3.00eq)를 첨가하며 10 mL의 DMF를 보충 첨가하고, 질소 가스를 불어넣으며, 아미노산이 용해된 후 HATU(1.45 eq)를 첨가한다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
3. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
4. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.41
탈Alloc
1. PhSiH3(10.0 eq) 및 DCM(20 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 불어넣은 후 Pd(PPh3)4(0.10 eq)를 첨가하며, 질소 가스를 20min 동안 불어넣으며, 2회 반응시키며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
2. DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
3.42
탈Dde
1. 3%의 하이드라진/DMF(50 mL)를 반응 컬럼에 첨가하고, 질소 가스를 15 mim 동안 불어넣으며, 폐액을 제거하고, DMF(50 mL)를 첨가하여 1min씩 5회 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다. 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 청색을 띤다.
3.42
아미드 고리 닫기
1. DIEA(3.00 eq)를 상기 수지의 DMF 용액에 첨가한 후, DMF에 용해된 HATU(1.50 eq)를 반응 컬럼에 천천히 적가하고, 질소 가스를 불어넣는다. 수지가 균일하게 팽창되도록 질소 가스를 조절한다.
2. 25℃의 환경에서 0.5h 동안 반응시키고, 닌히드린으로 검출할 때, 수지는 무색 투명하다.
3. 반응액을 제거하고, DMF로 1min씩 5회(1회 50 mL씩) 세척하며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거한다.
4. MeOH(50 mL)로 수지를 수축하고, 1회 3min이며, 액체가 흘러나오지 않을 때까지 폐액을 제거하고, 수지를 부어 건조시켜, 나중에 사용한다.
4. 절삭 및
조펩티드
건조
4.1 이하의 부피로 절삭유를 조제한다.
4.2 건조된 펩티드 수지를 조제된 절삭유에 첨가하고, 진탕기에서 2.5h 동안 진탕한 후, 여과하며, 여과액을 10배 부피의 아이스 이소프로필에테르에 첨가하고, 원심분리하며, 이소프로필에테르로 5회 세척한다. 2h 동안 진공 건조시켜 조펩티드를 얻고, 정제한다. 폴리펩티드의 분자량은 ESI-MS로 확인하고, 계산값은 1236.1이며, 실제 측정값은 1236.0이다.
실시예
11
WX -010의 합성을 참조하여, 폴리펩티드 WX -011을 얻는다. 폴리펩티드의 분자량은 ESI-MS로 확인하고, 계산값 [M+4H]/4는 1236.1이며, 검출값은 1236.0이다.
실시예
12
WX -001의 합성을 참조하고, 중간체 A-2를 사용하여, 폴리펩티드 WX -012를 얻는다. 폴리펩티드의 분자량은 ESI-MS로 확인하고, 계산값 [M+4H]/4는 1225.6이며, 검출값은 1225.7이다.
실시예
13
WX -001의 합성을 참조하고, 중간체 A-3을 사용하여, 폴리펩티드 WX -013을 얻는다. 폴리펩티드의 분자량은 ESI-MS로 확인하고, 계산값 [M+4H]/4는 1264.9이며, 검출값은 1264.6이다.
실시예
14
WX -001의 합성을 참조하고, 중간체 A-4를 사용하여, 폴리펩티드 WX -014를 얻는다. 폴리펩티드의 분자량은 ESI-MS로 확인하고, 계산값 [M+4H]/4는 1257.9이며, 검출값은 1257.8이다.
생물학적 테스트 데이터
시험예
1: 체외 GLP-1R/
GIPR
작용 활성 테스트
A: 주요 재료:
1) 세포주
상기 세포주는 Shanghai WuXi Pharma Tech에서 구축한다. 상세한 내용은 하기 표 1을 참조한다.
| 표적 | 숙주 세포 | 클로닝 |
| GLP-1R | HEK293 | N/A |
| GIPR | CHO | N/A |
2) 시약 및
소포품
| 명칭 | 배치 | 제품 번호 | 제조업체 |
| cAMP 검출 키트 | 29F | 62AM4PEJ | Cisbio |
| 1M HEPES | 2120919 | 15630-106 | Invitrogen |
| Hanks 균형 염 용액(HBSS) | 2185775 | 14025 | Invitrogen |
| 인간 혈청 알부민(HSA) | SLCF7301 | A1653-10G | Sigma |
| 카세인 | SLCC9458 | C4765-10 mL | Sigma |
| 3-이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX) | STBF6061V | I5879-5G | Sigma |
| ECHO qualified 384웰 플레이트 | 0006433672 | PP-0200 | Labcyte |
| OptiPlate-384 | 8210-19481 | 6007299 | PerkinElmer |
3) 기기
| 명칭 | 모델 | 제조업체 |
| EnVision | envision2014 | PerkinElmer |
| Vi-cell counter | Vi-CELL™ XR Cell Viability Analyzer | Beckman |
| Bravo | Bravo V11 | Agilent |
| ECHO | ECHO 555 | Labcyte |
| Centrifuge | Allegra™ 25R Centrifuge | Beckman |
B. 방법
1) 실험 재료
실험 버퍼
| 시약 | 저장 농도 | 부피 | 최종 농도 |
| Hanks 균형 염 용액 | 1x | 48.7 mL/44.7 mL |  |
| HEPES 버퍼 | 1 mol/L | 250 μL | 5 mmol/L |
| 5%의 카세인 용액(HEPES)/10%의 인간 혈청 알부민 용액(HSA) | 5%/ 10% |
1000 μL/ 5000 μL |
0.10%/ 1% |
| 3-이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX) | 500 mmol/L | 50 μL | 0.5 mmol/L |
검출 시약 준비
| 시약 | 저장 농도 | 부피 | 최종 농도 |
| 세포 용해액 | 1x | 9.5 mL |  |
| D2-cAMP용액 | 40x | 250 μL | 1x |
| cAMP-항체 용액 | 40x | 250 μL | 1x |
2) 실험 방법
a) 화합물 플레이트 제조:
테스트 화합물을 10개의 포인트로 4배 희석하고, 초기 농도는 30 μM이며, Bravo로 희석한다.
b) 화합물 이송:
1) Echo를 사용하여 100 nL의 화합물을 OptiPlate-384 플레이트에 옮긴다.
2) OptiPlate-384 플레이트를 1000 rpm으로 5초간 원심분리한다.
c) 세포 현탁액의 제조
1) 하나의 GLP-1R/GIPR 세포 동결보관 바이알을 37℃의 따뜻한 물에 넣어 신속하게 해동시킨다.
2) 세포 현탁액을 Transfer 15 mL의 원심분리 튜브에 옮기고, 10 mL의 HBSS로 부드럽게 세척한다.
3) 원심분리 튜브를 1000 rpm으로 실온에서 1분간 원심분리한다.
4) 상등액을 제거한다.
5) 하부 세포를 부드럽게 분산시키고 다시 10 mL의 HBSS로 부드럽게 세척하며, 원심분리하여 세포를 침전시키고, 마지막으로 실험 버퍼로 세포를 재현탁시킨다.
6) Vi-cell을 이용하여 세포의 밀도와 생존율을 측정한다.
7) 실험 버퍼로 GLP-1R/GIPR 세포 농도를 2.0*105/mL로 희석한다.
8) OptiPlate-384 플레이트에 100 nL의 희석된 세포 현탁액을 옮긴다.
9) 실온에서 30분간 인큐베이션한다.
d) 검출 시약 첨가:
1) OptiPlate-384 플레이트의 빈 웰에 10 μL의 800nM 구배 희석된 cAMP 표준액을 첨가한다.
2) 10 μL의 cAMP 검출 시약을 첨가한다.
3) TopSeal-A 필름으로 OptiPlate-384 플레이트를 커버하고, 실온에서 60분간 인큐베이션한다.
TopSeal-A를 제거하고, EnVision에서 판독한다.
C. 실험 결과
실험 결과는 표 6에 나타낸 바와 같다.
| 폴리펩티드 약물 | GLP-1R 작용 활성 | GIPR 작용 활성 | ||||
| EC50 (nM) | 비율 | EC50 (nM) | 비율 | |||
| (-) 1% HSA | (+) 1% HSA | (-) 1% HSA | (+) 1% HSA | |||
| WX -001 | 0.05958 | 16.6 | 278.6 | 0.3239 | 15.97 | 49.3 |
| WX -002 | 0.19 | 31.35 | 165 | 0.43 | 12.49 | 29 |
| WX -003 | 0.54 | 13.97 | 26 | 1.07 | 43.95 | 41 |
| WX -004 | 1.86 | 84.28 | 45 | 1.36 | 21.37 | 16 |
| WX -005 | 0.036 | 7.63 | 212 | 0.16 | 19.29 | 121 |
| WX -006 | 0.027 | NA | NA | 0.26 | NA | NA |
| WX -007 | 0.026 | NA | NA | 0.40 | NA | NA |
| WX -008 | 0.18 | NA | NA | 2.74 | NA | NA |
| WX -009 | 0.014 | NA | NA | 0.074 | NA | NA |
| WX -010 | 0.017 | NA | NA | 0.14 | NA | NA |
| WX -011 | 0.018 | NA | NA | 0.25 | NA | NA |
| WX -012 | 0.024 | NA | NA | 0.17 | NA | NA |
| WX -013 | 0.057 | NA | NA | 0.18 | NA | NA |
| WX -014 | 0.071 | NA | NA | 0.24 | NA | NA |
결론: 본 발명의 화합물은 GLP-1R/GIPR에 대한 강한 작용 활성을 갖는다.
시험예
2:
래트에
대한 화합물의 약동학적 평가
A. 실험 목적
SD 래트 체내에서의 화합물의 약동학에 대해 테스트한다.
B. 실험 조작
표준 방안으로 화합물을 피하 주사한 설치류 동물의 약동학적 특징을 테스트하고, 실험에서 후보 화합물은 투명한 용액으로 조제되어, 래트에게 단일 피하 주사(SC, 0.048 mpk)로 투여한다. 주사 비히클은 구연산염 버퍼(20 mM, pH=7)이다. 전혈을 수집하여, 혈장을 제조하여 얻고, LC-MS/MS 방법으로 약물 농도를 분석하며, Phoenix WinNonlin 소프트웨어로 약동학 파라미터를 계산한다.
C. 실험 결과
실험 결과는 표 7에 나타낸 바와 같다.
| 화합물 번호 |
약물 피크 농도
(nM) |
반감기 T
1/2
(h) |
약물 피크 시간
T
max
(h) |
SC 농도 적분
AUC0 -72h (nM.hr) |
| WX005 | 28 | 21 | 16 | 1153 |
| WX009 | 24 | 21 | 20 | 1092 |
결론: 본 발명의 화합물은 우수한 래트 약동학적 성질을 갖는다.
시험예
3: 마우스에 대한 화합물의 약동학적 평가
A. 실험 목적
C57BL/6 마우스 체내에서의 화합물의 약동학에 대해 테스트한다.
B. 실험 조작
표준 방안으로 화합물을 피하 주사 투여한 설치류 동물의 약동학적 특징을 테스트하고, 실험에서 후보 화합물은 투명한 용액으로 조제되어, 피하 주사(SC, 0.048 mpk)로 투여한다. 피하 주사용 비히클은 구연산염 버퍼(20 mM, pH=7)이다. 전혈을 수집하여, 혈장을 제조하여 얻고, LC-MS/MS 방법으로 약물 농도를 분석하며, Phoenix WinNonlin 소프트웨어로 약동학 파라미터를 계산한다.
C. 실험 결과
실험 결과는 표 8에 나타낸 바와 같다.
| 화합물 번호 | 약물 피크 농도(nM) |
반감기 T
1/2
(h) |
약물 피크 시간
T
max
(h) |
SC 농도
적분AUC
0
-72h
(nM.hr) |
| WX005 | 79 | 16 | 12 | 2240 |
| WX009 | 59 | 17 | 12 | 1986 |
결론: 본 발명의 화합물은 우수한 마우스 약동학적 성질을 갖는다.
시험예
4:
사이노몰구스
원숭이에 대한 화합물의 약동학적 평가
A. 실험 목적
사이노몰구스 원숭이 체내에서의 화합물의 약동학적 평가
B. 실험 조작
표준 방안으로 화합물을 정맥 주사 및 피하 주사 투여한 포유류 동물의 약동학적 특징을 테스트하고, 실험에서 후보 화합물은 투명한 용액으로 조제되어, 사이노몰구스 원숭이에게 단일 피하 주사(SC, 0.02 mpk)로 투여한다. 피하 주사용 비히클은 구연산염 버퍼(20 mM, pH=7)이다. 전혈을 수집하여, 혈장을 제조하여 얻고, LC-MS/MS 방법으로 약물 농도를 분석하며, Phoenix WinNonlin 소프트웨어로 약동학 파라미터를 계산한다.
C. 실험 결과
실험 결과는 표 9에 나타낸 바와 같다.
| 화합물 번호 |
약물 피크 농도
(nM) |
반감기 T
1/2
(h) |
약물 피크 시간 T
max
(h) |
SC 농도
적분AUC
0
-72h
(nM.hr) |
| WX005 | 36 | 100 | 24 | 4467 |
| WX009 | 37 | 105 | 24 | 4737 |
결론: 본 발명의 화합물은 우수한 원숭이 약동학적 성질을 갖는다.
시험예
5: 혈장 안정성 테스트(
PLS
)
A. 실험 목적
정상 마우스 혈장 중 시험 화합물의 안정성을 연구한다.
B. 실험 조작
1. 실험 전, 응고된 동결 혈장을 37℃의 수욕에서 해동한다. 혈장을 4000 rpm으로 5 분간 원심분리하고, 혈전이 있으면, 혈전을 제거하고, pH값을 7.4±0.1로 조절한다.
2. 테스트 화합물 용액의 제조: DMSO로 희석하여 100 μM의 용액을 제조한다.
3. 98 μL의 블랭크 대조 혈장에 2 μL의 테스트 화합물 용액(100 μM)을 첨가하여, 양자의 혼합 용액의 최종 농도가 2 μM에 도달하도록 하고, 37℃의 수욕 조건 하에서 배양한다.
4. 각 시점(0, 10, 30, 60 및 120min)에서 100 μL의 H3PO4 용액 및 800 μL의 정지 용액(200 ng/mL의 톨부타마이드 및 200 ng/mL의 라베탈롤의 100%의 메탄올 용액)을 각각 첨가하여 단백질을 침전시키고 충분히 혼합한다.
5. 샘플을 4000 rpm의 회전속도로 20 분간 원심분리하고, 각 웰에서 100 μL의 상등액을 취하여 LC-MS/MS 분석을 진행한다.
C. 실험 결과
실험 결과는 표 10에 나타낸 바와 같다.
| 화합물 번호 | WX005 | WX009 |
| PLS (H/M) T1/2 (min) | >289.1/>289.1 | >289.1/>238.9 |
결론: 본 발명의 화합물은 우수한 혈장 안정성을 갖는다.
시험예
6: 혈장 단백질 결합도 테스트(
PPB
)
A. 실험 목적
인간/마우스 혈장 알부민에 대한 시험 화합물의 결합도를 연구한다.
B. 실험 조작
1. 매트릭스 준비: 실험 당일, 혈장을 냉수에서 해동하고, 3220 rpm의 회전속도로 5 분간 원심분리하여, 모든 혈전을 제거한다. 얻은 혈장의 pH값을 측정하고, 필요에 따라 1%의 인산 또는 1N의 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.4±0.1로 조절한다.
2. 테스트 화합물의 희석 단계: 테스트 화합물을 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해시켜, 각각 10 mM 및 2 mM 농도의 원액을 제조한다. 98 μL의 DMSO로 2 μL의 원액(2 mM)을 희석하여, 40 μM의 작동 용액을 제조한다. 240 μL의 DMSO로 10 μL의 원액을 희석하여, 400 μM의 대조 화합물의 작동 용액을 제조한다. 화합물의 작동 용액(5 μL)과 블랭크 매트릭스(995 μL)를 1: 200의 비율로 균일하게 혼합하여 로딩 매트릭스를 제조한다.
3. 분석 단계
3.1 등량의 30 μL의 로딩 매트릭스(n=2)를 샘플 수집 플레이트에 옮겨, 잔여물 측정을 위한 테스트 시간0(T0) 샘플을 제조한다. 샘플을 상응한 블랭크 버퍼와 즉시 매칭시키고, 최종 부피는 60 μL이며, 각 웰에서 혈장과 버퍼의 부피비는 1: 1이다. 다음, 테스트 화합물의 T0 샘플에 각각 60 μL의 4% H3PO4의 H2O 및 480 μL의 내부 표준 물질 함유 정지 용액을 첨가한다. 다음 추가 처리를 위해, 이들을 다른 샘플과 함께 2 - 8℃에서 대기시킨다.
3.2 나머지 혈장 샘플을 37±1℃의 이산화탄소 인큐베이션에서 30 분간 사전 배양한다. 무 단백질 샘플(F샘플)을 준비하고, 로딩 매트릭스의 샘플(230 μL)은 모두 폴리카보네이트 튜브(n = 2)에 옮기며, 37℃ 및 155000Хg(35000 rpm) 조건에서 4시간 동안 초원심분리한다.
3.3 T샘플(테스트 샘플)을 제조하기 위해, 별도의 매트릭스 함유 샘플을 단독 96웰 플레이트(샘플 배양 플레이트)에 옮기고, 37℃에서 4시간 동안 배양한다.
3.4 원심분리 종료 후, 상등액의 두번째층(상층 이하)에서 30 μL의 무 단백질 샘플 및 30 μL의 T샘플을 새로운 샘플 수집 플레이트에 옮긴다. 각 샘플을 상응한 블랭크 버퍼 또는 매트릭스와 혼합하고, 최종 부피는 60 μL이며, 매트릭스와 버퍼의 부피비는 1: 1이다. 모든 샘플에 60 μL의 4%의 H3PO4 수용액 및 480 μL의 정지 용액(내부 표준 물질 함유)을 첨가한다. 혼합물을 4000 rpm의 회전속도로 20 분간 원심분리하고, 각 샘플의 상등액 100 μL를 취하여 LC-MS/MS 분석을 진행한다.
C. 실험 결과
실험 결과는 표 11에 나타낸 바와 같다.
| 화합물 번호 | WX005 | WX009 |
| PPB% unbound (H/M) | NA/NA | NA/NA |
비고: NA는 혈장 단백질 결합도가 너무 높음을 나타내고, 정상 혈장 단백질 농도에서 유리 약물이 검출되지 않았다.결론: 본 발명의 화합물은 극히 높은 혈장 단백질 결합도를 갖는다.
시험예
7:
STZ
-NASH 마우스 모델의 체내 약효 검증
A. 실험 목적
C57BL/6 마우스의 STZ-HFD 사료로 유도된 NASH 모델에서의 시험 물질의 약효를 검증한다.
B. 실험 조작
모델링 방법: 생후 48시간 내에 신생 마우스에게 STZ(200 ug/마리)를 피하 주사하고, 모유 수유 4주 후, 공복 혈당 >12 mmol/L인 동물을 선택하여 연속 6주간 HFD를 먹여, 최종적으로 NASH 모델을 구축한다. 별도로 8마리의 동물을 선택하고 STZ 주사 및 HFD 공급을 진행하지 않는다(정상 대조군).
투여 방안: HFD를 1주간 공급한 후 투여를 시작하고, 처음 투여 당일을 Day 1로 설정하며, 그 후 연속 5주간 2일 마다 피하 주사한다.
실험 종점 검출: 병리학적 HE 및 SR 염색.
C. 실험 결과
실험 결과는 표 12에 나타낸 바와 같다.
| 모델 비히클 대조군 | WX005 | WX009 | |
| 지방 변성 점수 | 2 | 1.5 | 1.0 |
| 염증 점수 | 1.2 | 1.0 | 1.4 |
| 풍선 변성 점수 | 0.7 | 0.1 | 0 |
| NAS 점수 | 3.9 | 2.6 | 2.4 |
| 섬유화(%) | 1.0 | 0.8 | 1.1 |
결론: 본 발명의 화합물은 STZ-NASH 마우스 모델에서 NAS 점수를 유의하게 개선할 수 있다.
Claims (19)
- 하기 식(II)로 표시되는 서열의 폴리펩티드로서:
YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS0 (II),
1) i 위치의 아미노산은 라이신으로 치환된 후 i+3 위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기와 함께 에 연결되거나, j 및 j+4 위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기는 에 연결되고, i는 17이며, j는 20인 변형; 및
2) 식(II)로 표시되는 일련의 폴리펩티드의 별도의 0 내지 2개의 아미노산이 치환되는 변형
을 갖고,
Aib의 구조는 이고;
S0은 및 로부터 선택되며;
X는 , 및 로부터 선택되고, "*"는 X1에 연결된 위치를 표시하며;
X1은 단일 결합, -C(=O)-, -O-C(=O)- 및 -N(R1)-C(=O)-로부터 선택되고;
R1은 H 및 C1- 3알킬기로부터 선택되며;
X2는 및
로부터 선택되고;
m은 2, 3 및 4로부터 선택되며;
n은 15, 16, 17, 18 및 19로부터 선택되고;
p는 1 및 2로부터 선택되는 것을 특징으로 하는,
식(II)로 표시되는 서열의 폴리펩티드. - 제1항에 있어서, 하기 식(P)로 표시되는 폴리펩티드 서열로서:
YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS0 (P),
1) 17 및 20위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기가 에 연결되는 변형; 및
2) 폴리펩티드의 0 내지 2개의 아미노산이 치환되는 변형
을 갖고,
Aib의 구조는 이고;
S0은 및 로부터 선택되며;
X는 , 및 로부터 선택되고, "*"는 X1에 연결된 위치를 표시하며;
X1은 단일 결합, -C(=O)-, -O-C(=O)- 및 -N(R1)-C(=O)-로부터 선택되고;
R1은 H 및 C1- 3알킬기로부터 선택되며;
X2는 및
로부터 선택되고;
m은 2, 3 및 4로부터 선택되며;
n은 15, 16, 17, 18 및 19로부터 선택되고;
p는 1 및 2로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 21번째, 23번째 또는 24번째 위치 중 0 내지 2개의 아미노산이 치환되는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, 하기 식(II-1), (II-2), (II-3), (II-4), (III-6), (IV-7), (IV-8), (IV-9) 또는 (IV-10)으로 표시되는 서열을 갖고:
YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LIAGG PSSGA PPPS-NH2
(II-1)
YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK EFVKW LIAGG PSSGA PPPS-NH2
(II-2)
YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFIKW LIAGG PSSGA PPPS-NH2
(II-3)
YAibEGT FTSDY SIAibLD KIAQK AFVKW LLAGG PSSGA PPPS-NH2
(II-4)
YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVEW LIAGG PSSGA PPPS-NH2
(III-6)
YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVQW LIAGG PSSGA PPPS-NH2
(IV-7)
YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVAW LIAGG PSSGA PPPS-NH2
(IV-8)
YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVIW LIAGG PSSGA PPPS-NH2
(IV-9)
YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK EFVEW LIAGG PSSGA PPPS-NH2
(IV-10)
, 17 및 20위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기 또는 20 및 24 위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기는 에 연결되는 변형을 갖고, Aib, X, X1 및 X2는 제1항에서 정의된 바와 같은 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R1은 H인 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, X1은 단일 결합, -C(=O)-, -O-C(=O)- 및 -NH-C(=O)-로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, m은 2인 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, n은 15 및 17로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, p는 2인 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, X2는
, , 및 로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드. - 제10항에 있어서, X2는 ,
,
및
로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, i 및 i+3 위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기 또는 j 및 j+4 위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기는 에 연결되어 , , 또는 을 형성하는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, i 및 i+3 위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기 또는 j 및 j+4 위치의 라이신 측쇄 상의 아미노기는 에 연결되어 , , 또는 을 형성하는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 구조 단위 는 ,
,
,
,
및
로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드. - 제14항에 있어서, 구조 단위 는 , ,
,
및 로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 폴리펩티드. - 하기 식으로 표시되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드:
. - 치료 유효량의 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 활성 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 조성물.
- 비알코올성 지방간질환(NAFLD) 및 비알코올성 지방간염(NASH) 치료용 약물의 제조에서의 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 제17항에 따른 조성물의 용도.
- 3일당 1회, 4일당 1회, 주당 1회 또는 2주당 1회인 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 제17항에 따른 조성물의 투여 빈도.
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