TW202304470A

TW202304470A - 肌肉合成促進劑及p70S6K蛋白質之磷酸化促進劑

Info

Publication number: TW202304470A
Application number: TW111112382A
Authority: TW
Inventors: 河田大輔; 浮辺健; 瀬戸泰幸
Original assignee: 日商雪印惠乳業股份有限公司
Priority date: 2021-04-08
Filing date: 2022-03-31
Publication date: 2023-02-01
Also published as: WO2022215568A1; JPWO2022215568A1

Abstract

本發明之目的係提供不須透過身體活動即能直接促進肌肉合成且預防肌肉萎縮之新穎的技術。本發明提供將革蘭氏陽性菌細胞壁或脂壁酸作為有效成分之肌肉合成促進劑或肌肉萎縮預防劑，或是提供藉由使革蘭氏陽性菌細胞壁或脂壁酸作用於肌肉細胞來促進肌肉合成之方法。

Description

肌肉合成促進劑及p70S6K蛋白質之磷酸化促進劑

本發明係關於肌肉之肌肉合成促進劑。此外，本發明係關於p70S6K蛋白質之磷酸化促進劑。

肌肉係對於人的身體運動為必要的器官。由於增加肌肉量、強化肌力與提升運動能力有關，故對於從事體育運動的人們而言，無論是專業或業餘人士，皆是一件令人感興趣的事情。此外，即使是對於平常不運動的人們而言，肌肉量之維持、提升，對於維持健康和過著順利的日常生活而言係重要的要素。

此外，在逐漸超高齡化的日本，平均壽命與健康壽命之差距正成為迫切的課題。尤其是伴隨著年齡增長的運動器官之功能下降，即運動器官症候群(locomotive syndrome)，係降低高齡者之生活品質(QOL，Quality of Life)的重大因素之一，就看護負擔、醫療費增加之觀點而言亦會成為很大的問題。運動器官之中，特別是肌肉，除了肌肉本身具有的運動功能之外，尚具有衝擊吸收作用、姿勢穩定化作用，就預防其他的運動器官之障礙之觀點而言亦係重要的運動器官。但是，肌肉量從約30歲會開始減少，進而導致全身的骨骼肌肉量降低之狀態即肌肉減少症(sarcopenia)之人的比率會隨著年齡增長而增加。亦有報告稱該比率在75歲~79歲之高齡者為約25%，在80歲以上為超過35%(非專利文獻1)。全身的肌肉量係藉由肌肉合成與肌肉分解之平衡來維持。因此，藉由促進肌肉合成來預防肌肉萎縮且維持肌肉量，對於延長健康壽命、改善高齡者之QOL而言係必要而不可缺少之要素。即使是年輕人，若由於例如外傷、疾病而成為暫時的臥床不起之狀態，給予肌肉之負荷減少，則肌肉萎縮容易發展，對於復健、預後會有不良影響。因此，藉由促進肌肉合成來預防肌肉萎縮或維持肌肉量，除了高齡者之外，亦可以改善年輕人的QOL。

如上述，藉由促進肌肉合成來增加、維持肌肉量或預防肌肉萎縮，對於層面廣泛的人們而言可能會是有用的技術。

並且，若能夠促進家畜之肌肉合成，則可改善家畜之增肉、或是可改善運動能力，故促進肌肉合成之技術對於畜產而言亦可能會成為有用的技術。

此處，針對增加肌肉量、或預防肌肉萎縮之方法，一般而言係推薦進行肌力訓練，並且攝取作為肌肉之原料的蛋白質、刺激肌肉之合成訊號的支鏈胺基酸。此外，還存在記載如下之技術。例如專利文獻1揭示藉由將加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)OLL2809株作為有效成分之身體活動促進劑，身體活動會被促進，肌肉量會增加。專利文獻2揭示促進肌母細胞之增殖且促進肌肉修復之乳桿菌屬(Lactobacillus)的乳酸菌株。專利文獻3揭示來自彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)CP2998株之脂壁酸會抑制肌肉分解。

但是，對於高齡者、臥床不起狀態之患者而言，持續地進行肌力訓練並不實際。此外，由於蛋白質在肌肉合成中主要係作為原料，故即使增加蛋白質之攝取量，若肌肉細胞中之肌肉合成促進途徑沒有活化的話，則其效果有限。尤其是據稱高齡者對於支鏈胺基酸之肌肉合成回應會減弱，為了預防肌肉萎縮需要另外使肌肉合成促進途徑活化。專利文獻1，作為伴隨著身體活動之促進的附加效果，係使肌肉量增加，但並不是直接促進肌肉合成。關於專利文獻2，也是促進損傷後的肌肉之肌肉修復，並不是促進未受損傷的正常狀態下之肌肉合成。專利文獻3與本發明同樣地係將脂壁酸作為有效成分，但僅揭示了其效果是抑制肌肉分解，不會促進分化成骨骼肌，而並沒有揭示關於肌肉合成之促進。此外，關於抑制肌肉分解，亦只揭示了來自限定的1個菌株之乳酸菌之脂壁酸之作用。並且，該技術被揭示為在誘導肌肉分解時抑制該肌肉分解之程度，係以已患有肌肉萎縮之病患作為對象。另一方面，本發明的不同之處在於：對於正常狀態下之肌肉細胞可觀察到效果，不僅是病患，對於健康人亦有效。 [先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本特開2016-84358 [專利文獻2]國際公開2019-230957 [專利文獻3]日本專利6762855號公報 [非專利文獻]

[非專利文獻1]JAMDA 2013, 14, 911-915

[發明所欲解決之課題]

本發明提供一種有助於促進肌肉合成及預防肌肉萎縮之新穎的技術，其特徵係不須透過身體活動而可直接促進肌肉合成。 [解決課題之手段]

肌肉合成係藉由在肌肉細胞內之Akt-mTOR(mechanistic target of rapamycin(雷帕黴素機能標靶))途徑之活化而被促進。p70S6K蛋白質係位於Akt-mTOR途徑之下游，藉由磷酸化而被活化。因此，磷酸化p70S6K量係用來作為肌肉合成活化之指標，磷酸化p70S6K量之增加意指肌肉合成之活化。發明人們經過潛心研究之結果，發現若將革蘭氏陽性菌之細胞壁添加至肌肉細胞，則肌肉細胞之磷酸化p70S6K量會增加且肌肉合成會被促進，及若將係革蘭氏陽性菌之細胞壁構成成分之一的脂壁酸添加至肌肉細胞，則肌肉細胞之磷酸化p70S6K量會增加且肌肉合成會被促進。並且，發現該效果係透過一般會識別脂壁酸之細胞表面上之受體蛋白質TLR2(Toll-like receptor 2(類鐸受體2))而引起，並非取決於脂壁酸之來源菌種，藉此完成了本發明。

本發明係關於以下[1]~[8]之發明。 [1]一種肌肉合成促進劑，係以脂壁酸或含有脂壁酸之革蘭氏陽性細菌作為有效成分。 [2]如[1]之肌肉合成促進劑，其中，該脂壁酸係來自乳酸菌或枯草菌，或該含有脂壁酸之革蘭氏陽性細菌係乳酸菌或枯草菌。 [3]如[1]之肌肉合成促進劑，其中，該脂壁酸係來自屬於乳桿菌屬或雙岐桿菌屬之乳酸菌，或該含有脂壁酸之革蘭氏陽性細菌係屬於乳桿菌屬或雙岐桿菌屬之乳酸菌。 [4]如[1]之肌肉合成促進劑，其中，該脂壁酸來源之乳酸菌係加氏乳桿菌或戴白氏乳桿菌，或含有該脂壁酸之乳酸菌係加氏乳桿菌或戴白氏乳桿菌。 [5]一種肌肉合成促進用或肌肉萎縮預防用醫藥品、飲食品及飼料，其特徵係含有脂壁酸或含有脂壁酸之革蘭氏陽性細菌，且會促進肌肉合成。 [6]一種促進肌肉合成之方法，係藉由使脂壁酸或含有脂壁酸之革蘭氏陽性細菌作用於肌肉細胞來促進肌肉合成，但排除醫療行為。 [7]一種p70S6K蛋白質之磷酸化促進劑，係將脂壁酸或含有脂壁酸之革蘭氏陽性細菌作為有效成分。 [8]如[7]之p70S6K蛋白質之磷酸化促進劑，其中，該脂壁酸係來自乳酸菌或枯草菌，或該含有脂壁酸之革蘭氏陽性細菌係乳酸菌或枯草菌。 [9]如[7]之p70S6K蛋白質之磷酸化促進劑，其中，該脂壁酸來源之乳酸菌係加氏乳桿菌或戴白氏乳桿菌，或該含有脂壁酸之乳酸菌係加氏乳桿菌或戴白氏乳桿菌。 [10]一種脂壁酸或含有脂壁酸之革蘭氏陽性細菌之用途，係用來製造肌肉合成促進劑。 [11]一種脂壁酸或含有脂壁酸之革蘭氏陽性細菌，係用來使用在促進肌肉合成。 [12]一種肌肉合成促進方法，包含：讓需要的對象攝取或投予給該對象有效量之脂壁酸或含有脂壁酸之革蘭氏陽性細菌。 [發明之效果]

藉由促進肌肉合成來預防肌肉萎縮且維持肌肉量，不限於高齡者，亦與改善年輕人之QOL有關。此外，藉由促進肌肉合成來增加肌肉量，對於一般的健康人、從事體育運動的人們而言亦有用。根據本發明，藉由攝取革蘭氏陽性菌細胞壁或脂壁酸來促進肌肉合成，或藉由對於生物體內之肌肉細胞進行肌肉注射等方法使脂壁酸直接產生作用，藉此可促進肌肉合成。此外，藉由將它們作為飼料讓家畜攝取，可實現家畜之肌肉量增加。

本發明提供將革蘭氏陽性菌細胞壁或脂壁酸作為有效成分之肌肉合成促進劑。此外，提供含有革蘭氏陽性菌細胞壁或脂壁酸之肌肉合成促進用或肌肉萎縮預防用之醫藥品、飲食品或飼料，以及提供藉由使脂壁酸作用於肌肉細胞來促進肌肉合成之方法。

脂壁酸係革蘭氏陽性菌之細胞壁構成成分之一，一般而言係包含在革蘭氏陽性菌中。此外，不僅是細胞壁，一部分亦包含在細胞膜中。脂壁酸係由甘油磷酸、核糖醇磷酸之長鏈構成。由於只要是革蘭氏陽性菌一般而言會具有脂壁酸，故藉由從適當的革蘭氏陽性菌進行萃取可得到脂壁酸，除此之外，來自枯草菌之脂壁酸亦作為市售試藥販售。此外，乳酸菌屬於革蘭氏陽性菌。因此，藉由從使用在優格、乳酸菌飲料等之具有食用經驗之乳酸菌等中進行萃取，可得到便宜且安全的脂壁酸。

以下表示從革蘭氏陽性菌中萃取、精製脂壁酸之方法。用於革蘭氏陽性菌之培養之培養基，只要該細菌能夠生長則並無特別限制，可藉由該細菌之培養法之常法來進行。

經培養之細菌可藉由離心分離等方法進行集菌。脂壁酸之萃取可直接使用得到之菌體，亦可使用經過濃縮、乾燥、冷凍乾燥、破碎處理之菌體。菌體可使用藉由加熱乾燥等製成死菌體之物。能夠在使用水、生理食鹽水或丁醇、乙酸乙酯、氯仿等有機溶劑或它們的混合液從這些菌體中萃取脂壁酸後，使用膠濾層析法、疏水層析法等手法來進行精製。

革蘭氏陽性菌，宜為屬於乳桿菌屬(Lactobacillus)或雙岐桿菌屬(Bifidobacterium)之乳酸菌、或枯草菌，較宜為屬於乳桿菌屬或雙岐桿菌屬之乳酸菌。屬於乳桿菌屬之乳酸菌，更宜為嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、澱粉乳桿菌(Lactobacillus amylovorus)、加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)、戴白氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、瑞士乳酸桿菌(Lactobacillus helveticus)、約氏乳酸桿菌(Lactobacillus johnsonii)、副乾酪乳酸桿菌(Lactobacillus paracasei)、胚芽乳酸桿菌(Lactobacillus plantarum)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、黏膜乳桿菌(Lactobacillus mucosae)、發酵乳酸桿菌(Lactobacillus fermentum)、彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)、唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius)或羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)，最宜為加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)或戴白氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)。屬於雙岐桿菌屬之乳酸菌，更宜為青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)、長雙岐桿菌(Bifidobacterium longum)、動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)、短雙岐桿菌(Bifidobacterium Breve)、鏈狀雙歧桿菌(Bifidobacterium catenulatum)、蒙古雙歧桿菌(Bifidobacterium mongoliense)、假長雙岐桿菌(Bifidobacteriumu pseudolongum)、假小鏈雙崎桿菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、糞雙歧桿菌(Bifidobacterium faecali)或嗜熱雙歧桿菌(Bifidobacterium thermophilum)。革蘭氏陽性菌，最宜為加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)SBT1848(NITE-BP03075)或戴白氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)SBT2002(NITE-BP03280)。脂壁酸，最宜為加氏乳桿菌SBT1848(NITE-BP03075)或戴白氏乳桿菌SBT2002(NITE-BP03280)中含有的脂壁酸。

本實施形態之肌肉合成促進劑只要含有脂壁酸即可，可以係藉由上述方法萃取之脂壁酸，亦可以係使用市售之脂壁酸之方法。此外，亦可以係不針對脂壁酸進行萃取、精製而直接利用革蘭氏陽性菌之方法。直接利用革蘭氏陽性菌時，該革蘭氏陽性菌可以係經過濃縮、乾燥、冷凍乾燥、破碎處理之菌體，亦可使用藉由加熱乾燥等製成死菌體之物。因此，可廣泛地用來作為醫藥品、醫藥部外品、飲食品、飼料等中含有之組成物。進行製劑化時，亦可適當混合賦形劑、黏合劑、崩散劑、矯味劑等一般使用之添加物。意即，本實施形態之肌肉合成促進劑，只要可以得到本發明之效果，則可以係任意的形態。意即，可以係發酵乳之形態，亦可以係其他的劑形。劑形，可舉例粉劑、細粒劑、顆粒劑、錠劑、膠囊劑、及丸劑等固體狀或粉末狀製劑，以及懸浮液、乳劑、糖漿劑、及浸膏劑等液狀製劑。

關於本實施形態之肌肉萎縮預防劑之投予對象、每一日之攝取量，並無特別限制，例如投予對象係人時，可投予給未滿20歲之未成年人、成人、65歲以上之高齡者、未滿65歲者等。此外，可以投予給運動器官症候群、肌肉減少症已經發作之對象，用以治療或緩和症狀，亦可以投予給尚未有如此之症狀之健康對象，用以預防症狀。關於一日之攝取量，取決於年齡、症狀、體重、目的而有所不同，故並無特別限制，若欲舉例的話，例如，可舉例按菌體或菌體處理物之重量計為0.001~10g，宜為0.01~5g。

在本說明書中，「運動器官症候群」意指在骨、關節、軟骨、椎間盤、肌肉之運動器官中之任一者或多數發生由年齡增長所致之功能障礙，「站立」、「步行」之功能降低之狀態。在本說明書中，「肌肉減少症」意指特徵為伴隨著年齡增長而骨骼肌萎縮，且伴隨著骨骼肌肉量及骨骼肌力之降低或身體功能之降低之症候群。

(肌肉合成促進劑) 在本說明書中，「肌肉合成促進」或「促進肌肉之合成」，意指相較於對象沒有攝取本發明之肌肉合成促進劑之情形，在對象攝取了本發明之肌肉合成促進劑之情形下可觀察到較多的骨骼肌之合成。「肌肉合成促進」或「促進肌肉之合成」是否發生，可藉由評價相較於沒有投予有效成分之對象，在向對象投予了有效成分之情形下p70S6K蛋白質之磷酸化是否會被促進來決定。本發明之肌肉合成促進劑，例如可標示為：「維持肌肉」、「抑制肌肉萎縮」、「防止肌肉衰退」、「抑制肌肉衰退」、「增長肌肉」、「增加肌肉」、「構建肌肉」、「促進肌肉合成」、「支持構建肌肉的力量」、「有助於抑制肌肉量及肌力降低」、「有助於維持因年齡增長而衰退的肌肉」、或是能夠與它們等同之功能。上述「標示」，包含告知消費者上述功能之所有內容，所標示的對象不限其媒介，可以係肌肉合成促進劑本身、包裝、容器、目錄、小冊、及網站首頁等。

(p70S6K蛋白質之磷酸化促進劑) 在本說明書中，「p70S6K蛋白質」，意指p70核糖體S6激酶蛋白質。p70S6K(p70 ribosomal protein S6 kinase(p70核醣體蛋白S6激酶))係調控蛋白質之合成之細胞內訊息傳遞物質，為肌肉肥大之重要的調節因子。p70S6K蛋白質位於Akt-mTOR途徑之下游，會因磷酸化而被活化。本發明之p70S6K蛋白質之磷酸化促進劑，可標示有藉由促進p70S6K蛋白質之磷酸化而發揮之功能。藉由促進p70S6K蛋白質之磷酸化而發揮之功能之標示之內容，除了上述「肌肉合成促進劑」之情形之外，亦包含以下標示：「促進p70S6K蛋白質之磷酸化來幫助肌肉之合成」、「促進p70S6K蛋白質之磷酸化來維持肌肉」、「促進p70S6K蛋白質之磷酸化來抑制肌肉萎縮」、或能夠與它們等同之功能。 p70S6K蛋白質之磷酸化是否會被促進，例如，可按後述試驗例1中記載之手法進行評價。

本發明之肌肉合成促進用或肌肉萎縮預防用之飲食品，只要是含有脂壁酸或含有含脂壁酸之革蘭氏陽性菌之飲食品即可，除了一般的飲食品之外，可舉例特定保健用食品、功能性標示食品、營養輔助食品、營養補充品等。含有含脂壁酸之革蘭氏陽性菌之飲食品，舉例為乳酸菌飲料、起司、優格等。

本發明之肌肉合成促進用或肌肉萎縮預防用飲食品，具體而言，可舉例碳酸飲料、各種果汁、果汁飲料、含果汁之清涼飲料、果肉飲料、含果粒之果實飲料、含有各種蔬菜之蔬菜系飲料、豆乳、豆乳飲料、咖啡飲料、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、運動飲料、營養飲料等一般飲料或酒精飲料；焦糖、糖果、口香糖、巧克力、小甜餅、餅乾、蛋糕、派、點心、脆餅乾、日式點心、米點心、豆點心、甜點點心等點心類；奶油、人造奶油類、蛋黃醬類、植物油等油脂類；牛奶、加工乳、乳飲料、優格類、乳酸菌飲料、起司、冰淇淋類、製備粉乳類、乳油等牛乳、乳產品、穀物片(穀物加工品)等農產加工品、嬰兒食品、流質食物等其他的市售食品等。

本發明之肌肉合成促進用或肌肉萎縮預防用飲食品中，視需要可摻合抗氧化劑、香料、酸味劑、色素、乳化劑、防腐劑、調味料、甜味劑、香辛料、pH調整劑、穩定劑、植物油、動物油、糖及糖醇類、維生素、有機酸、果汁萃取物類、蔬菜萃取物類、穀類、豆類、蔬菜類、肉類、海鮮類等添加物及材料，此等可單獨使用或組合2種以上。此等材料及添加物之摻合量可適當決定。本發明之肌肉合成促進用或肌肉萎縮預防用飲食品之形態並無特別限制，例如可以係如飲料、流質食物之液狀、流動性之形態，亦可以係果凍狀、糊狀、半液體、凝膠狀之形態，亦可以係固體、條狀、粉末之形態。

肌肉合成促進用或肌肉萎縮預防用之脂壁酸對於這些飲食品之摻合量，由於取決於形態、劑型、投予對象之症狀、體重、用途等而有所不同，故並無特別限制，若欲舉例的話，按飲食品基準，例如可以摻合0.001~100(w/w)%、0.01~10(w/w)、或0.1~1(w/w)%。上述摻合量，係按脂壁酸計之摻合量。就肌肉合成促進用或萎縮預防用之飼料而言，在通常的飼料中混合上述有效成分即可，此外，亦可利用投予脂壁酸或含有脂壁酸之革蘭氏陽性菌之方法。

以上，根據本實施形態可提供新穎的肌肉合成促進劑。本肌肉合成促進劑係將一般在革蘭氏陽性菌中含有的脂壁酸作為有效成分，能夠藉由將革蘭氏陽性菌作為原料，低廉且大量地進行製造，若利用乳酸菌等具有食用經驗之革蘭氏陽性菌則可提供安全性高之產品。 [實施例]

以下，作為本發明之實施例，具體地說明係革蘭氏陽性菌之乳酸菌的細胞壁具有的肌肉合成促進效果、從乳酸菌中萃取之脂壁酸及來自係革蘭氏陽性菌之枯草菌之市售之脂壁酸具有的肌肉合成促進效果。但是，本發明之實施形態並不受限於此。

[乳酸菌破碎物之製備] 於此記載使用加氏乳桿菌SBT1848(NITE-BP03075)及戴白氏乳桿菌SBT2002(NITE-BP03280)之例。但是如上述般，亦可使用除了它們之外的革蘭氏陽性菌。將各菌株之甘油儲備液(Glycerol stock)畫線於MRS平板培養基，於37℃培養3晩(64小時)。然後將於平板培養基得到之1個菌落植菌於10mL之MRS培養基，於37℃培養1晩(16小時)。將300μL之該菌體培養液繼代培養於10mL之新的MRS培養基，再次於37℃培養1晩(16小時)。然後，將3mL之菌體培養液植菌於100mL之MRS培養基，於37℃培養1晩(16小時)。將得到之菌體培養液予以離心分離，以PBS、超純水清洗沉澱後之菌體。將菌體再懸浮於4mL之超純水中並於-80℃冷凍。藉由使用冷凍乾燥機(東京理化器械)將其冷凍乾燥，得到冷凍乾燥菌體。藉由將得到之冷凍乾燥菌體懸浮於PBS或DMEM培養基(gibco)中，使用Multi Beads Shocker(安井機械)進行破碎來製備乳酸菌破碎物。

[細胞壁之製備] 將乳酸菌破碎物予以離心分離並去除上清液。以滅菌水清洗得到之沉澱物，藉由再次離心分離來去除上清液，重複此操作數次以得到細胞壁。 [從乳酸菌精製脂壁酸] 使用上述方法從80mg之冷凍乾燥菌體製備乳酸菌破碎物。將其予以離心分離，使用0.22μm過濾器(Merck)過濾上清液。以滅菌水將該過濾液定容至6mL，添加6mL之1-丁醇並進行萃取操作。藉由此操作，混合液會分離成水層、中間層、丁醇層。收集水層，進行冷凍乾燥藉此去除溶劑。將得到之萃取物溶解於5mL之15%丙醇/0.1M乙酸鈉水溶液中，並將其作為脂壁酸粗精製級份。然後將脂壁酸粗精製級份予以離心分離，以0.22μm過濾器過濾上清液。以15%丙醇/乙酸鈉水溶液將容量1mL之Hitrap Octyl FF管柱(GE Healthcare)平衡化，將1mL之粗精製級份上清液供給至管柱。然後，使各2.5mL之丙醇濃度逐漸地增加至15%、25%、35%、45%之溶出液通過管柱，得到各2.5mL之添加樣本時之流通物(Flow-through)及各丙醇濃度之級份。然後將流通物、15%級份合計5mL供給至管柱，回收5mL之溶出後之液體作為流通物(第2次)。接著使各2.5mL之丙醇濃度逐漸地增加至15%、25%、35%、45%之溶出液通過管柱，得到各2.5mL之各丙醇濃度之級份。再次將5mL之流通物(第2次)供給至管柱，回收5mL之溶出後之液體作為流通物(第3次)。與目前為止同樣地，使各2.5mL之丙醇濃度逐漸地增加至15%、25%、35%、45%之溶出液通過管柱，得到各2.5mL之各丙醇濃度之級份。再一次重複此操作。藉由以上操作，得到流通物(第4次)合計5mL、15%級份(第2~4次)合計7.5mL及25%級份、35%級份、45%級份(第1~4次)合計10mL。藉由使用離心蒸發器將回收後之各級份予以濃縮，並以滅菌水進行定容來製成2mL之濃縮溶液。將它們以Microsep Advance with 1K Omega(Pall Corporation)及Vivaspin 500, 3 kDa MWCO(Cytiva)進行濃縮、脫鹽，於DMEM培養基進行定容藉此得到各200μL之級份。

[藉由西方墨點法之脂壁酸之檢出] 藉由西方墨點法確認在精製時得到之級份中是否含有脂壁酸。將各級份與Laemmli樣本緩衝液(sample buffer)混合，於90℃進行10分鐘加熱、改性。將加熱後之樣本注入4-20% Mini Protean TGX凝膠中並於150V定壓下進行40分鐘電泳。電泳後，使用Criterion平板濕式轉漬槽(Plate transblot cell)(Bio-Rad)，於50V定壓下歷時60分轉印至PVDF轉漬膜。轉印後，藉由以TBST清洗轉漬膜，並在5% BSA(岩井化學藥品)/TBST之封閉緩衝液(Blocking Buffer)中震盪1小時來進行封閉。將其浸漬在經過封閉緩衝液稀釋的抗LTA一次抗體(脂壁酸殖株55(Lipoteichoic acid clone 55)；Hycult Biotech稀釋2000倍)中，於10°C震盪1晩。一次抗體反應後，將轉漬膜以TBST清洗後，浸漬在經過封閉緩衝液稀釋2000倍之HRP標識二次抗體(抗小鼠IgG HRP連接抗體(Anti-mouse IgG HRP-linked Antibody)；Cell Signaling Technology)中，震盪1小時。二次抗體反應後，以TBST清洗轉漬膜，使用ECL Prime西方墨點法檢測試劑(Western Blotting Detection Reagent)(GE healthcare)使其反應5分鐘。反應結束後，使用Chemi Doc MP(Bio-Rad)進行訊號之檢出。其結果確認了脂壁酸，在由加氏乳桿菌之萃取中，係被精製到經25%及35%之丙醇/乙酸鈉水溶液溶出之級份中，在由戴白氏乳桿菌之萃取中，係被精製到25%之級份中(圖1)。

[試驗例1]乳酸菌細胞壁、從乳酸菌中精製之脂壁酸之肌肉合成促進效果之評價將係小鼠肌母細胞之C2C12細胞，播種至添加了10% FBS、含有1%青黴素-鏈黴素之DMEM培養基之48孔培養盤(IWAKI)，以成為1.8×10 ⁴細胞/孔。將其在37℃、5%CO ₂之條件下培養2天，直至達到80%~90%匯合(Confluent)。然後將培養基交換成不含有FBS之含有1%青黴素-鏈黴素之DMEM培養基，並培養4小時。培養後，添加在乳酸菌細胞壁或從菌株精製脂壁酸之過程中得到之各級份。將該C2C12細胞進一步培養2小時後，以PBS進行清洗，使用Alpha SureFire Ultra裂解緩衝液(Lysis Buffer)(PerkinElmer)溶解細胞。回收細胞溶解液，進行離心分離得到上清液，藉此得到接下來的西方墨點法中使用之樣本。將各樣本與Laemmli樣本緩衝液(sample buffer)混合，於90℃進行10分鐘加熱、改性。將加熱後之樣本注入4-20% Criterion TGX凝膠(Bio-Rad)中並於200V定壓下進行40分鐘電泳。電泳後，使用Criterion平板濕式轉漬槽(Plate transblot cell)(Bio-Rad)，於50V定壓下歷時60分轉印至PVDF轉漬膜。轉印後，藉由以TBST清洗轉漬膜，並在5% BSA(岩井化學藥品)/TBST之封閉緩衝液中震盪1小時來進行封閉。將轉漬膜浸漬在經過封閉緩衝液稀釋的一次抗體(磷酸-p70 S6激酶(Phospho-p70 S6 Kinase)(Thr389)(108D2)兔子mAb；Cell Signaling Technology稀釋1000倍、p70 S6激酶(p70 S6 Kinase)(49D7)兔子mAb；Cell Signaling Technology稀釋2000倍)中，於10℃震盪1晩。一次抗體反應後，將轉漬膜以TBST清洗後，浸漬在經過封閉緩衝液稀釋10000倍之HRP標識二次抗體(抗兔子IgG HRP連接抗體(Anti-rabbit IgG HRP-linked Antibody)；Cell Signaling Technology)中，震盪1小時。二次抗體反應後，以TBST清洗轉漬膜，使用ECL Prime西方墨點法檢測試劑(Western Blotting Detection Reagent)或Clarity Max Western ECL受質(Substrate)(Bio-Rad)使其反應5分鐘。反應結束後，使用Chemi Doc MP(Bio-Rad)進行訊號之檢出。定量訊號強度後，藉由將磷酸化p70S6K之值除以總p70S6K之值來評價肌肉合成促進效果。其結果，在係乳酸菌細胞壁及脂壁酸之精製級份之丙醇25%及35%級份中觀察到了肌肉合成促進活性(圖2、圖3、圖4)。另外，由於脂壁酸係細胞壁構成成分之一，故將菌體破碎物予以離心處理後之沉澱物(細胞壁級份)、上清液(可溶級份)皆亦包含在內。

[試驗例2]來自枯草菌之脂壁酸之肌肉合成促進效果之評價探討了發現到的脂壁酸之肌肉合成促進效果是否不限於乳酸菌而一般在革蘭氏陽性菌中亦能觀察到。使用市售的來自枯草菌之脂壁酸，進行確認是否能與試驗例1同樣地觀察到肌肉合成促進效果。與試驗例1同樣地培養C2C12細胞，以成為各最終濃度之方式添加來自枯草菌之脂壁酸(InvivoGen)。對照組中係添加了認為有肌肉合成促進活性之菌體破碎物上清液。回收細胞後，藉由西方墨點法評價肌肉合成促進效果。其結果，來自枯草菌之脂壁酸係在100ng/mL以上之濃度觀察到肌肉合成促進效果(圖5)。

[試驗例3]對於TLR2涉及肌肉合成促進效果之評價一般而言，革蘭氏陽性菌之脂壁酸係藉由TLR2(類鐸受體2(Toll-like receptor 2))而被辨識，訊號會傳遞到下游。因此，探討了本發明中之肌肉合成促進效果是否係透過該TLR2。與試驗例1同樣地培養C2C12細胞，添加含有脂壁酸之菌體破碎物上清液與阻礙TLR2之訊號傳遞之胜肽(TIRAP抑制胜肽(TIRAP Inhibitor Peptide))；NOVUS BIOLOGICALS)，以使最終濃度成為50μM。對照群中係添加了不具有抑制序列之胜肽(對照胜肽)。回收細胞後，藉由西方墨點法來評價肌肉合成促進效果。其結果，明白了若阻礙TLR2之訊號傳遞則肌肉合成促進效果會消失，意即肌肉合成促進效果係透過TLR2而引起的(圖6)。據稱TLR2會辨識革蘭氏陽性細菌一般的脂壁酸。因此，由此可證實本發明之肌肉合成促進效果係脂壁酸一般的效果，而不是取決於脂壁酸來源之菌種、菌株。 [產業上利用性]

根據本發明，可藉由革蘭氏陽性菌細胞壁或脂壁酸來促進肌肉合成或預防肌肉萎縮。特別是藉由利用已經使用在乳產品等之具有食用經驗之乳酸菌，能夠安全且低廉地提供本發明之肌肉合成促進劑或肌肉萎縮預防劑。綜上所述，藉由本發明來增加人們的肌肉量、或預防肌肉萎縮，藉此可改善維持肌力、延長健康壽命，達成QOL之提升。並且藉由作為飼料讓家畜攝取，亦能夠實現家畜之肌肉量增加。

[圖1]係對於由乳酸菌精製脂壁酸之過程中得到之級份使用抗脂壁酸抗體，並實施了西方墨點法(Western Blotting)之照片。由加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)之萃取中，係於丙醇濃度25%、35%之級份觀察到較濃的條帶(band)，由戴白氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)之萃取中，係於濃度25%之級份觀察到較濃的條帶，顯示脂壁酸係被精製到該級份中。 [圖2]係關於試驗例1，為顯示了革蘭氏陽性菌細胞壁具有肌肉合成促進效果之西方墨點法照片及定量圖表。 [圖3]係關於試驗例1，為顯示了加氏乳桿菌之脂壁酸精製級份具有肌肉合成促進效果之西方墨點法照片及定量圖表。 [圖4]係關於試驗例1，為顯示了戴白氏乳桿菌之脂壁酸精製級份具有肌肉合成促進效果之西方墨點法照片及定量圖表。 [圖5]係關於試驗例2，為顯示了來自枯草菌之脂壁酸具有肌肉合成促進效果之西方墨點法照片及定量圖表。 [圖6]係關於試驗例3，為顯示了肌肉合成促進效果係透過TLR2之西方墨點法照片及定量圖表。

[受託編號]

[關於寄存生物材料] (1)SBT1848株甲寄存該生物材料之寄存機關之名稱及地址獨立行政法人製品評價技術基礎機構專利微生物寄存中心(千葉縣木更津市Kazusa鎌足2-5-8(郵政編號292-0818)) 乙將生物材料寄存在甲之寄存機關之日期令和1年11月25日(原寄存日) 令和3年9月10日(從原寄存處移交至基於布達佩斯條約之寄存處之移交日) 丙甲之寄存機關針對寄存所給予之受託編號 NITE BP-03075 (2)SBT2002株甲寄存該生物材料之寄存機關之名稱及地址與上述(1)相同乙將生物材料寄存在甲之寄存機關之日期令和2年9月15日(原寄存日) 令和3年9月10日(從原寄存處移交至基於布達佩斯條約之寄存處之移交日) 丙甲之寄存機關針對寄存所給予之受託編號 NITE BP-03280

Claims

一種肌肉合成促進劑，係以脂壁酸或含有脂壁酸之革蘭氏陽性細菌作為有效成分。
如請求項1之肌肉合成促進劑，其中，該脂壁酸係來自乳酸菌或枯草菌，或該含有脂壁酸之革蘭氏陽性細菌係乳酸菌或枯草菌。
如請求項1之肌肉合成促進劑，其中，該脂壁酸係來自屬於乳桿菌屬或雙岐桿菌屬之乳酸菌，或該含有脂壁酸之革蘭氏陽性細菌係屬於乳桿菌屬或雙岐桿菌屬之乳酸菌。
如請求項1之肌肉合成促進劑，其中，該脂壁酸之來源乳酸菌係加氏乳桿菌或戴白氏乳桿菌，或含有該脂壁酸之乳酸菌係加氏乳桿菌或戴白氏乳桿菌。
一種肌肉合成促進用或肌肉萎縮預防用醫藥品、飲食品及飼料，其特徵係含有脂壁酸或含有脂壁酸之革蘭氏陽性細菌，且會促進肌肉合成。
一種促進肌肉合成之方法，係藉由使脂壁酸或含有脂壁酸之革蘭氏陽性細菌作用於肌肉細胞來促進肌肉合成，但排除醫療行為。
一種p70S6K蛋白質之磷酸化促進劑，係將脂壁酸或含有脂壁酸之革蘭氏陽性細菌作為有效成分。
如請求項7之p70S6K蛋白質之磷酸化促進劑，其中，該脂壁酸係來自乳酸菌或枯草菌，或該含有脂壁酸之革蘭氏陽性細菌係乳酸菌或枯草菌。
如請求項7之p70S6K蛋白質之磷酸化促進劑，其中，該脂壁酸之來源乳酸菌係加氏乳桿菌或戴白氏乳桿菌，或該含有脂壁酸之乳酸菌係加氏乳桿菌或戴白氏乳桿菌。
一種脂壁酸或含有脂壁酸之革蘭氏陽性細菌之用途，係用來製造肌肉合成促進劑。
一種脂壁酸或含有脂壁酸之革蘭氏陽性細菌，係用來使用在促進肌肉合成。
一種促進肌肉合成之方法，包含：讓需要的對象攝取或投予給該對象有效量之脂壁酸或含有脂壁酸之革蘭氏陽性細菌。