TW202233695A

TW202233695A - ＦｏｋＩ核酸酶結構域之突變體

Info

Publication number: TW202233695A
Application number: TW110141338A
Authority: TW
Inventors: 八木祐介; 太田賢; 中村崇裕
Original assignee: 日商基因編輯力股份有限公司; 國立大學法人九州大學
Priority date: 2020-11-06
Filing date: 2021-11-05
Publication date: 2022-09-01
Also published as: CN116406383A; EP4242237A1; JPWO2022097663A1; WO2022097663A1; US20230416709A1

Abstract

本發明發現4種核酸酶結構域突變體相較於野生型核酸酶結構域而言具有優異的核酸酶活性，在與各式各樣的核酸結合結構域之組合中，能夠提高基因體編輯效率。

Description

ＦｏｋＩ核酸酶結構域之突變體

本發明係關於FokI核酸酶結構域之突變體、包含該突變體之人工核酸切割酶及該等的利用。

在基因體編輯中，係要求以較高的機率對所改變之基因中之標的部位導入DNA的缺失、插入、鹼基取代等。用於基因體編輯之分子(基因體編輯工具)係由結合至基因體上之標的序列之核酸結合結構域及切割標的序列附近的雙股DNA之觸媒結構域所構成。在利用鋅指蛋白質(ZFN)、Transcription activator-like effector(TALE)蛋白質、pentatricopeptide repeat(PPR)蛋白質等DNA結合蛋白質來構築基因體編輯工具之情況，通常，係使用屬於Type IIS型限制酶之FokI的持有切割雙股DNA之活性之觸媒結構域(FokI-CD)。在FokI切割雙股DNA時，必須在2個分子的FokI-CD間形成二聚體(非專利文獻1)。因此，在融合FokI-CD所構築而得之基因體編輯工具中，亦使用以所改變之標的部位周邊的有義鏈及反義鏈作為標的序列之2個分子。

在鋅指核酸酶等融合FokI-CD所構築而得之基因體編輯工具中，已施行藉由改變FokI-CD而提升經由基因體編輯工具之編輯效率。例如，已在ZFN中導入隨機突變並使用大腸菌的人工進化系統而單離出基因體編輯效率提升之改良型FokI-CD(Sharky突變)(非專利文獻2)。然而，在融合帶有Sharky突變之FokI-CD而得之TALEN中，與野生型之間並未看出編輯效率的差異(非專利文獻3)。 [先前技術文獻] [非專利文獻]

[非專利文獻1]Bitinaite J, et al., (1998) Proc Natl Acad Sci U S A. 95:10570-10575. [非專利文獻2]Guo J, et al., (2010) J Mol Biol. 400:96-107.

[發明所欲解決之課題]

本發明者等人針對具有上述非專利文獻2所記載之Sharky突變之FokI-CD施行進一步的性能評估，結果判明即便在融合PPR蛋白質作為核酸結合結構域之情況，該FokI-CD相較於野生型而言亦未看出基因體編輯效率的提升。從而，在具有Sharky突變之FokI-CD中，存在有在基因體編輯系統中無法與廣泛的核酸結合結構域組合使用之問題。

本發明係有鑑於此種狀況而完成，其目的在於提供在基因體編輯中可與各式各樣的核酸結合結構域組合使用，且能夠提升基因體編輯效率之核酸酶結構域突變體。 [解決課題之手段]

本發明者等人為了解決上述課題，施行利用大腸菌的人工進化系統之高活性核酸酶結構域突變體的篩選之結果，已判明與TALE進行結合而得之4種核酸酶結構域突變體相較於野生型核酸酶結構域而言具有優異的核酸酶活性，基因體編輯效率係因利用該核酸酶結構域突變體而提升。此等核酸酶結構域突變體之中，2種核酸酶結構域突變體共通地保持之在470位之突變對核酸酶活性的提升有較大的貢獻。此外，該核酸酶結構域突變體在與PPR進行融合之情況，亦可看出基因體編輯效率的提升。由以上，本發明者等人發現所製作而得之核酸酶結構域突變體具有優異的核酸酶活性，可與各式各樣的核酸結合結構域進行組合而利用於基因體編輯，遂完成本發明。

本發明係關於高活性核酸酶結構域突變體、包含該核酸酶結構域突變體之人工核酸切割酶及該等的利用，更詳細而言，係提供以下者。

[1]一種突變體，其係FokI蛋白質或其同源蛋白質的核酸酶結構域之突變體，且具有下述(a)~(d)中任一項所記載之突變，核酸酶活性係因該突變而提升。

(a)選自由下列者所組成之群組之至少1種突變：FokI蛋白質的386位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Met之取代、FokI蛋白質的399位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Arg之取代、FokI蛋白質的421位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Tyr之取代、FokI蛋白質的424位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Phe之取代、FokI蛋白質的432位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Leu之取代、FokI蛋白質的433位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Val之取代、FokI蛋白質的448位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Asn之取代、FokI蛋白質的466位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Ile之取代、FokI蛋白質的484位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Ala之取代及FokI蛋白質的486位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Leu之取代 (b)選自由下列者所組成之群組之至少1種突變：野生型蛋白質中之418位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Pro之取代、FokI蛋白質的420位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Leu之取代、FokI蛋白質的452位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Val之取代、FokI蛋白質的473位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Arg之取代、FokI蛋白質的486位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為His之取代、FokI蛋白質的490位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Val之取代、FokI蛋白質的498位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Leu之取代、FokI蛋白質的542位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Lys之取代、FokI蛋白質的559位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Arg之取代、FokI蛋白質的570位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Ser之取代 (c)選自由下列者所組成之群組之至少1種突變：野生型蛋白質中之386位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Met之取代、FokI蛋白質的395位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Phe之取代、FokI蛋白質的399位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Arg之取代、FokI蛋白質的421位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Tyr之取代、FokI蛋白質的424位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Phe之取代、FokI蛋白質的432位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Leu之取代、FokI蛋白質的433位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Val之取代、FokI蛋白質的448位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Asn之取代、FokI蛋白質的484位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Ala之取代、FokI蛋白質的486位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Leu之取代 (d)選自由下列者所組成之群組之至少1種突變：野生型蛋白質中之385位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Pro之取代、FokI蛋白質的395位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Ala之取代、FokI蛋白質的427位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Met之取代、FokI蛋白質的452位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Val之取代、FokI蛋白質的460位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Phe之取代、FokI蛋白質的473位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Arg之取代、FokI蛋白質的481位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為His之取代、FokI蛋白質的490位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Gln之取代、FokI蛋白質的542位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Thr之取代、FokI蛋白質的559位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Arg之取代、FokI蛋白質的570位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Ser之取代 [2]如[1]所記載之突變體，其係FokI蛋白質或其同源蛋白質的核酸酶結構域之突變體，且具有FokI蛋白質的473位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Arg之取代性突變，核酸酶活性係因該突變而提升。

[3]一種人工核酸切割酶，其包含核酸結合結構域及如[1]或[2]所記載之核酸酶結構域之突變體。

[4]如[3]所記載之人工核酸切割酶，其中，前述核酸結合結構域為TALE、鋅指(zinc finger)、PPR或CRISPR-Cas。

[5]一種多核苷酸，其係編碼出如[1]或[2]所記載之核酸酶結構域之突變體或者如[3]或[4]所記載之人工核酸切割酶。

[6]一種載體，其包含如[5]所記載之多核苷酸。

[7]一種細胞，其係導入如[5]所記載之多核苷酸或如[6]所記載之載體而得。

[8]一種基因體受到編輯之細胞或非人類生物的製造方法，其包含將如[3]所記載之人工核酸切割酶、編碼出該人工核酸切割酶之多核苷酸或包含該多核苷酸之載體導入細胞或非人類生物中。

[9]一種用於編輯細胞或生物的基因體之套組，其包含如[3]所記載之人工核酸切割酶、編碼出該人工核酸切割酶之多核苷酸或包含該多核苷酸之載體。 [發明效果]

依據本發明之核酸酶結構域突變體相較於野生型核酸酶結構域而言，可顯示出優異的核酸酶活性。依據將本發明之核酸酶結構域與TALE或PPR等核酸結合結構域進行融合所製作之人工核酸切割酶，能夠進行有效率的基因體編輯。

＜核酸酶結構域突變體＞

本發明係提供FokI蛋白質或其同源蛋白質的核酸酶結構域之突變體。

本發明中之「FokI蛋白質」為在自然界中在海床黃桿菌(Flavobacterium okeanokoites)中所發現之IIS型限制酶。FokI蛋白質係在雙股DNA中，在與一條鏈上之識別部位相距9個核苷酸之位置，在與另一條鏈上之識別部位相距13個核苷酸之位置，具有催化切割之作用。FokI蛋白質係在N末端側存在有核酸結合結構域，在C末端側存在有核酸酶結構域(DNA切割結構域)。

將典型的野生型FokI蛋白質的胺基酸序列示於SEQ ID NO：1，將其核酸酶結構域的胺基酸序列示於SEQ ID NO：2。在SEQ ID NO：1中，384~579位係相當於核酸酶結構域。本發明之核酸酶結構域突變體係在FokI蛋白質的核酸酶結構域導入特定的突變而得者，相較於野生型核酸酶結構域而言，核酸酶活性係提升。

本發明之FokI核酸酶結構域突變體的一態樣為具有後述實施例的M47中所導入之突變者，具體而言，其係具有選自由下列者所組成之群組之至少1種突變之核酸酶結構域突變體：FokI蛋白質的386位的胺基酸成為Met之取代、FokI蛋白質的399位的胺基酸成為Arg之取代、FokI蛋白質的421位的胺基酸成為Tyr之取代、FokI蛋白質的424位的胺基酸成為Phe之取代、FokI蛋白質的432位的胺基酸成為Leu之取代、FokI蛋白質的433位的胺基酸成為Val之取代、FokI蛋白質的448位的胺基酸成為Asn之取代、FokI蛋白質的466位的胺基酸成為Ile之取代、FokI蛋白質的484位的胺基酸成為Ala之取代及FokI蛋白質的486位的胺基酸成為Leu之取代。

本發明之FokI核酸酶結構域突變體的另一態樣為具有後述實施例的M48中所導入之突變者，具體而言，其係具有選自由下列者所組成之群組之至少1種突變之核酸酶結構域突變體：野生型蛋白質中之418位的胺基酸成為Pro之取代、FokI蛋白質的420位的胺基酸成為Leu之取代、FokI蛋白質的452位的胺基酸成為Val之取代、FokI蛋白質的473位的胺基酸成為Arg之取代、FokI蛋白質的486位的胺基酸成為His之取代、FokI蛋白質的490位的胺基酸成為Val之取代、FokI蛋白質的498位的胺基酸成為Leu之取代、FokI蛋白質的542位的胺基酸成為Lys之取代、FokI蛋白質的559位的胺基酸成為Arg之取代、FokI蛋白質的570位的胺基酸成為Ser之取代。

本發明之FokI核酸酶結構域突變體的另一態樣為具有後述實施例的M49中所導入之突變者，具體而言，其係具有選自由下列者所組成之群組之至少1種突變之核酸酶結構域突變體：野生型蛋白質中之386位的胺基酸成為Met之取代、FokI蛋白質的395位的胺基酸成為Phe之取代、FokI蛋白質的399位的胺基酸成為Arg之取代、FokI蛋白質的421位的胺基酸成為Tyr之取代、FokI蛋白質的424位的胺基酸成為Phe之取代、FokI蛋白質的432位的胺基酸成為Leu之取代、FokI蛋白質的433位的胺基酸成為Val之取代、FokI蛋白質的448位的胺基酸成為Asn之取代、FokI蛋白質的484位的胺基酸成為Ala之取代、FokI蛋白質的486位的胺基酸成為Leu之取代。

本發明之FokI核酸酶結構域突變體的另一態樣為具有後述實施例的M50中所導入之突變者，具體而言，其係具有選自由下列者所組成之群組之至少1種突變之核酸酶結構域突變體：野生型蛋白質中之385位的胺基酸成為Pro之取代、FokI蛋白質的395位的胺基酸成為Ala之取代、FokI蛋白質的427位的胺基酸成為Met之取代、FokI蛋白質的452位的胺基酸成為Val之取代、FokI蛋白質的460位的胺基酸成為Phe之取代、FokI蛋白質的473位的胺基酸成為Arg之取代、FokI蛋白質的481位的胺基酸成為His之取代、FokI蛋白質的490位的胺基酸成為Gln之取代、FokI蛋白質的542位的胺基酸成為Thr之取代、FokI蛋白質的559位的胺基酸成為Arg之取代、FokI蛋白質的570位的胺基酸成為Ser之取代。

作為本發明之FokI核酸酶結構域突變體中之較佳突變之例，可列舉FokI蛋白質的473位的胺基酸成為Arg之取代。

在各突變體中，可具有2種以上突變的組合，亦可具有3種以上突變的組合，亦可具有4種以上突變的組合，亦可具有5種以上(例如6種以上、7種以上、8種以上、9種以上、10種以上)突變的組合。

此外，本發明之核酸酶結構域突變體亦可為天然的FokI蛋白質的同源蛋白質的核酸酶結構域之突變體(以下，稱為「同源蛋白質核酸酶結構域突變體」)。在此處，所謂「同源蛋白質」，係意味在將其核酸酶結構域與天然的FokI蛋白質的核酸酶結構域進行比較之情況，具有至少70%以上，較佳為80%以上，更佳為90%以上(例如95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上)的胺基酸序列的同源性之蛋白質。在同源蛋白質核酸酶結構域突變體中，與上述FokI核酸酶結構域突變體中之突變部位相對應之部位的胺基酸被取代成與FokI核酸酶結構域突變體中之突變部位相同的胺基酸。同源蛋白質亦可源自於海床黃桿菌(Flavobacterium okeanokoites)以外之生物。

「胺基酸序列的同源性」可利用序列解析軟體(例如BLAST；http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)加以特定。此外，與FokI蛋白質的特定的胺基酸「相對應之部位」的胺基酸可特定為利用上述胺基酸序列解析軟體(例如BLAST；http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)與FokI蛋白質的胺基酸序列進行對齊時，與其突變部位的胺基酸處於同等地位之胺基酸。在經由軟體之胺基酸序列的解析中，可利用例如預設的參數設定。

本發明之核酸酶結構域突變體的一較佳態樣為具有FokI蛋白質的473位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Arg之取代之突變體。

此外，本發明之核酸酶結構域突變體(FokI核酸酶結構域突變體、同源蛋白質核酸酶結構域突變體)係除了上述突變部位以外，亦可進一步導入1或複數個胺基酸的突變(取代、缺失、附加及/或插入)。在此處，所謂「複數」，並無特別限制，通常為2~50個，較佳為2~30個，更佳為2~20個，再佳為2~10個(例如2~8個、2~4個、2個)。作為有用的突變之例，可列舉例如異質二聚體形成型突變(Doyon Y, et al. (2011) Nat Methods 8:74-79)。

作為部位特異性地導入突變之方法，可利用例如Kunkel法(Kunkel, T. A. Proc Natl Acad Sci USA (1985), 82(2):488-492)、ODA法(Hashimoto-Gotoh et al., (1995) Gene 152:271-276)、SOE(splicing-by-overlap-extention)-PCR法(Ho, S. N. et al., (1989) Gene 77:51-59)等公知的方法。亦可利用市售的部位特異性突變導入套組。

本發明之核酸酶結構域突變體(FokI核酸酶結構域突變體、同源蛋白質核酸酶結構域突變體)係因突變的導入，相較於野生型蛋白質而言，核酸酶活性提升。核酸酶活性的提升較佳為10%以上，更佳為30%以上，更佳為50%以上(例如70%以上、100%以上、150%以上、200%以上)。核酸酶活性的提升可藉由例如實施例5(圖4、5)所記載之報導子試驗予以評估。具體而言，可藉由下列方式進行評估：將表現出TALEN或PPR等核酸結合結構域與本發明之核酸酶結構域突變體的融合蛋白質之效應子質體，以及包含該核酸結合結構域的識別序列且若融合蛋白質識別出該識別序列並發生DNA切割時便會表現出報導子之報導子質體導入培養細胞中，測定該培養細胞中之報導子活性，與表現出包含野生型核酸酶結構域之融合蛋白質之情況進行比較。在此報導子試驗系統中，可使用例如HEK293-T細胞作為培養細胞，在各質體中，作為用於表現出融合蛋白質或報導子之啟動子，可使用例如CMV啟動子，作為核酸結合結構域的識別序列，可使用例如人類B2M基因或GFP基因上之識別序列。

在本發明之核酸酶結構域突變體中，亦可包含經修飾之胺基酸及/或非天然胺基酸。作為經修飾之胺基酸，並無限定，可列舉例如甲基化、酯化、醯胺化、乙醯基化、烷基化、鹵化等。經修飾之胺基酸及非天然胺基酸可藉由公知的方法予以導入。

＜人工核酸切割酶＞本發明係提供包含核酸結合結構域及上述核酸酶結構域突變體之人工核酸切割酶。本發明之人工核酸切割酶係經由核酸結合結構域結合至核酸上之標的序列(核酸結合結構域的識別序列)，藉由核酸酶結構域在該標的序列的附近(標的切割部位)切割核酸。從而，本發明之人工核酸切割酶可作為序列特異性核酸切割酶而發揮機能。

在本說明書中，在「核酸」中，含括DNA及RNA中之任何者。本發明之人工核酸切割酶所切割之核酸主要為DNA。在DNA中，包含雙股DNA及單股DNA兩者。作為DNA，並無特別限制，可列舉例如真核生物核基因體DNA、粒線體DNA、色素體DNA、原核生物基因體DNA、噬菌體DNA或質體DNA等。本發明之人工核酸切割酶較佳係切割基因體上之雙股DNA。

本發明之人工核酸切割酶的標的序列為核酸上之任意的序列。在以基因體DNA作為標的之情況，標的序列亦可設定成任意的基因區域或基因外區域。標的序列的長度並無特別限制，例如為10~30個鹼基。在使用包含CRISPR/Cas之核酸結合結構域之情況，Cas需要識別原間隔子相鄰基序(protospacer adjacent motif，PAM)序列，因而將位於PAM序列的附近之序列設定為標的序列。

在藉由本發明之人工核酸酶施行DNA的雙股切割之情況，較佳係設定夾著間隔子序列之2個標的序列。間隔子序列的長度並無特別限定，例如為1~20個鹼基。熟習該項技術者可適宜設定由所期望的長度及鹼基序列所構成之標的序列。2個標的序列相互可為回文序列，或者亦可為非回文序列。在2個標的序列為非回文序列之情況，係使用以各序列作為標的之2種人工核酸切割酶。

本發明之核酸切割酶中之核酸結合結構域只要是特異性地結合至任意的核酸序列(標的序列)之蛋白質結構域即可，可列舉例如鋅指、TALE、CRISPR/Cas(Cas蛋白質與嚮導RNA的複合體)、Pentatricopeptide repeat (PPR)等。在本發明之人工核酸切割酶中，核酸酶結構域突變體與核酸結合結構域可直接連結，或者亦可經由連結子進行連結。連結子的鏈長並無特別限制，例如為1~20個胺基酸。

包含鋅指之核酸結合結構域較佳係可包含2個以上鋅指，並無限定，亦可包含例如由3~9個鋅指所構成之鋅指陣列。已知1個鋅指係識別連續的3個鹼基，例如，由3~9個鋅指所構成之鋅指陣列可識別9~27個鹼基。針對ZFN之例，係參照文獻(國際公開2003/087341號)。

包含TALE之核酸結合結構域較佳係可包含6個以上重複模組，並無限定，亦可包含例如由9~27個重複模組所構成之TALE。已知重複模組持有以34個胺基酸為1單位之重複結構，1個模組係識別1個鹼基。針對TALEN之例，係參照文獻(國際公開2012/104729號、國際公開2011/072246號、國際公開2015/019672號)。

包含PPR之核酸結合結構域較佳係可包含6個以上重複模組，並無限定，亦可包含例如由9~27個重複模組所構成之PPR。已知重複模組持有以35個胺基酸為1單位之重複結構，1個模組係識別1個鹼基。針對PPR之例，係參照文獻(Nakamura et al., (2012) Plant Cell Physiol 53:1171-1179、國際公開2014/175284號)。

包含CRISPR-Cas之核酸結合結構域係藉由構成CRISPR-Cas之嚮導RNA中之標的化RNA(crRNA)識別標的序列。即，標的化RNA與標的序列具有相互互補的鹼基序列，可進行雜交。由於Cas係與嚮導RNA形成複合體，故藉由嚮導RNA的作用而被誘導至標的序列。在本發明中，可利用嚮導RNA與Cas的複合體作為核酸結合結構域，在此情況，本發明之核酸酶突變體通常係融合至Cas。在本發明中，係藉由核酸酶突變體施行核酸的切割，因而CRISPR/Cas中之Cas不一定需要保持核酸酶活性。Cas較佳為將核酸酶活性去活化而得之Cas(例如dCas)。亦能夠藉由改變Cas蛋白質(例如突變的導入)而改變PAM識別(Benjamin, P. et al., (2015) Nature 523:481-485、Hirano, S. et al., (2016) Molecular Cell 61:886-894、國際公開2018/221685號)，藉此，可擴大標的序列的候補。

作為用於本發明之CRISPR/Cas，可列舉例如CRISPR-Cas9等Class 2/II型CRISPR/Cas，CRISPR-Cpf1(Cas12a)、CRISPR-Cas12b、CRISPR-CasX(Cas12e)及CRISPR-Cas14等Class 2/V型CRISPR/Cas，CRISPR-Cas13a等Class 2/VI型CRISPR/Cas，CRISPR-Cas3等Class 1/I型CRISPR/Cas，但並不限於此等。針對CRISPR/Cas之例，係參照文獻(國際公開2014/093712號、國際公開2013/176772號、國際公開2013/142578號、國際公開2016/205711號、Strecker J, et al., Nature Communications 10:212(2019)、Liu JJ, et al., Nature 566:218-223(2019)、國際公開2018/225858號)。

＜基因體受到編輯之細胞或非人類生物的製造方法＞本發明係提供基因體受到編輯之細胞或非人類生物的製造方法，其包含將上述人工核酸切割酶、編碼出該人工核酸切割酶之多核苷酸、包含該多核苷酸之載體導入細胞或非人類生物中。

若將本發明之人工核酸切割酶導入細胞(亦包含非人類生物的體內之細胞)中，則核酸結合結構域結合至核酸上之標的序列，核酸酶結構域突變體在標的切割部位切割該核酸。緊接於此切割之後，施行經由非同源末端連結修復(NHEJ)或同源重組修復(HR)等之修復，基因體受到編輯。在成為主要修復途徑之經由NHEJ之修復中，係在該切割部位插入1個以上突變，該核酸受到改變。另一方面，藉由使用後述供體DNA，便可藉由在標的切割部位的周邊區域所發生之同源重組修復(HDR)而在標的DNA區域插入供體DNA內之所期望的DNA。

導入細胞中之本發明之人工核酸切割酶可為蛋白質的形態，亦可為多核苷酸的形態，亦可為包含該多核苷酸之載體的形態。在使用CRISPR-Cas作為人工核酸切割酶的核酸結合結構域之情況，可進一步採用RNA與蛋白質的複合體的形態。多核苷酸可為DNA，亦可為RNA，為了在細胞中高度表現，亦可施行密碼子最適化。

在採用表現載體的形態之情況，係包含可操作地結合至應進行表現之DNA之1個以上調節元件。在此處，所謂「可操作地結合」，係意味在上述DNA能夠進行表現之情形下結合至調節元件。作為「調節元件」，可列舉啟動子、增強子、內部核糖體進入部位(IRES)及其他表現控制元件(例如轉錄終結訊號(例如多聚腺苷酸化訊號、多聚U序列))。作為調節元件，因應目的，例如可指向在多樣的宿主細胞中之DNA的構成表現，亦可指向僅在特定的細胞、組織或器官中之DNA的表現。此外，亦可指向僅在特定的時期之DNA的表現，亦可指向能夠人為地誘導之DNA的表現。作為啟動子，可列舉例如polIII啟動子(例如U6及H1啟動子)、polII啟動子(例如反轉錄病毒的勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)LTR啟動子、巨細胞病毒(CMV)啟動子、SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子、β-肌動蛋白啟動子、磷酸甘油激酶(PGK)啟動子及EF1α啟動子)、polI啟動子或該等的組合。只要是熟習該項技術者，便可因應所導入之細胞的種類等，選擇適切的表現載體。

在本發明之基因體受到編輯之細胞或非人類生物的製造方法中，除了上述人工核酸切割酶以外，亦可將供體DNA導入細胞中。藉此，可利用在標的切割部位的周邊區域所發生之同源重組修復(HDR)，在標的DNA區域中插入所期望的DNA。在同源重組修復的過程中，需要標的DNA區域的鹼基序列與供體DNA的鹼基序列的同源性，將供體DNA用於包含標的切割部位之標的DNA區域的模板修復，導致遺傳信息從供體DNA移動至標的DNA區域。藉此，可使標的DNA區域的鹼基序列發生變化(例如插入、缺失、取代等)。從而，供體DNA包含與標的DNA區域內之鹼基序列具有較高的同一性之2個鹼基序列(同源性臂)及配置於該等之間之所期望的DNA(用於插入標的DNA區域中之DNA)。

同源性臂只要是足以施行同源重組之程度的大小即可，此外，可依供體DNA的形態或鏈長而有所變動，在雙股供體DNA之情況，例如為500~1000個鹼基對，在單股供體DNA之情況，例如為30~1000個鹼基。此外，同源性臂只要以足以施行同源重組之程度與標的DNA區域內之鹼基序列具有同一性，即便並非100%的同一性亦可。例如，各自具有95%以上，較佳為97%以上，更佳為99%以上，再佳為99.9%以上的同一性。

此外，存在於同源性臂之間之所期望的DNA的長度並無特別限定，可利用各式各樣的尺寸。在所期望的DNA中存在欲事後去除之鹼基序列之情況，亦可在該鹼基序列的兩端附加例如重組酶的識別序列(例如loxP序列或FRT序列)。被該識別序列所夾住之鹼基序列可藉由使重組酶(例如Cre重組酶或FLP重組酶)進行作用而予以去除。此外，在用於確認DNA敲入的成功等之目的下，亦可例如將選擇標記序列(例如螢光蛋白質或藥劑耐性基因等)併入所期望的DNA中。此外，亦可使用可操作地結合1個以上調節元件之基因作為所期望的DNA。

供體DNA可為直鏈狀DNA，亦可為環狀DNA。此外，可為單股DNA，亦可為雙股DNA。

本發明之人工核酸切割酶(上述各種形態)向細胞之導入可藉由例如電穿孔、顯微注射、DEAE-葡聚糖法、脂轉染法、奈米粒子介導性轉染法、病毒介導性核酸遞送法等公知的方法來施行。在施行向生物體內之直接投予之情況，可藉由注射等非經口投予及經口投予來施行。在此情況，較佳係視需要使其與對標的部位具有指向性之遞送系統進行組合。在使用供體DNA之情況，該供體DNA亦可以同樣的方法導入細胞或生物體內。

導入本發明之人工切割酶之細胞可為原核生物的細胞(原核細胞)或真核生物的細胞(真核細胞)中之任何種細胞，並無特別限定。作為原核細胞，可列舉例如大腸菌、放線菌、古細菌等。作為真核細胞，可列舉例如動物細胞、植物細胞、藻細胞、真菌細胞。作為動物細胞，可列舉例如哺乳動物細胞，除此以外，魚類、鳥類、爬蟲類、兩棲類、昆蟲類的細胞。

在動物細胞中，包含例如構成動物的個體之細胞、構成從動物摘出之器官/組織之細胞、源自於動物的組織之培養細胞等。具體而言，可列舉例如卵母細胞或精子等生殖細胞；各階段的胚胎的胚細胞(例如1細胞期胚、2細胞期胚、4細胞期胚、8細胞期胚、16細胞期胚、桑椹期胚等)；誘導多能性幹(iPS)細胞或胚性幹(ES)細胞等幹細胞；纖維母細胞、造血細胞、神經元、肌細胞、骨細胞、肝細胞、胰臟細胞、腦細胞、腎細胞等體細胞等。作為用於基因體編輯動物的製作之卵母細胞，可利用受精前及受精後之卵母細胞，較佳為受精後之卵母細胞，即受精卵。受精卵特佳為原核期胚。卵母細胞可將經凍結保存者加以解凍而使用。惟，在從倫理的觀點而言無法容許之情況，係排除對人類的生殖細胞或胚胎的細胞之應用。

哺乳動物為含括人類及非人類哺乳動物之概念。作為非人類哺乳動物之例，可列舉牛、野豬、家豬、羊、山羊等偶蹄類，馬等奇蹄類，小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、松鼠等齧齒類，兔等兔目，犬、貓、雪貂等食肉類等。非人類哺乳動物可為家畜或同伴動物(玩賞動物)，亦可為野生動物。

作為植物細胞，可列舉例如穀物類、油料作物、飼料作物、果物、蔬菜類的細胞。在植物細胞中，包含例如構成植物的個體之細胞、構成從植物分離出之器官或組織之細胞、源自於植物的組織之培養細胞等。作為植物的器官或組織，可列舉例如葉、莖、莖尖(生長點)、根、塊莖、癒傷組織等。作為植物之例，可列舉水稻、玉米、香蕉、花生、向日葵、番茄、油菜、菸草、小麥、大麥、馬鈴薯、大豆、棉花、康乃馨等，亦包含其繁殖材料(例如種子、塊根、塊莖等)。

在本發明之基因體受到編輯之細胞或非人類生物的製造方法中，亦可將核酸結合結構域不同的2種以上上述人工核酸切割酶導入細胞中。例如，在基因體上之欲編輯之區域中不存在回文序列之情況，亦可使用各自以不同的序列作為標的之2種人工核酸切割酶。在此情況，亦可進一步在2種人工核酸切割酶的核酸酶結構域突變體中導入促進該核酸酶結構域突變體的異質二聚體形成之進一步的突變。藉此，可增加人工核酸切割酶的識別序列，同時使脫靶的機率降低。

＜套組＞本發明係提供用於編輯細胞或生物的基因體之套組，其包含上述人工核酸切割酶、編碼出該人工核酸切割酶之多核苷酸、包含該多核苷酸之載體。該套組有時進一步包含一或複數種追加試劑，作為追加試劑，可列舉例如稀釋緩衝液、再構成溶液、洗淨緩衝液、核酸導入試劑、蛋白質導入試劑、對照試劑，但並不限於此等。通常，在套組中，係附有操作說明書。 [實施例]

(實施例1. B2P篩選的原理) 在B2P篩選系統中，係使用下列2種質體：持有致死基因ccdB基因之報導子質體，及表現出TALEN-A之效應子質體(Chen Z, Zhao H. (2005) Nucleic Acids Res. 33:e154)。在報導子質體的ccdB基因的下游，係將TALEN-A所識別之序列(表1)各自插入有義鏈側及反義側(若從有義鏈側來看，則成為「標的序列-間隔子序列-標的序列的互補序列」)(表2)。另外，表2中，大寫字母表示TALEN-A所識別之序列，小寫字母表示2個序列之間之間隔子序列。

ccdB基因可藉由阿拉伯糖誘導性啟動子加以表現控制，若在培養基中添加阿拉伯糖，則經報導子轉形之大腸菌無法生存(將此質體稱為「TALEN-A報導子質體」)。在效應子質體中，TALEN-A係在N-末端側與麥芽糖結合蛋白質進行融合，可藉由IPTG誘導MBP-TALEN-A融合蛋白質(將此質體稱為「TALEN-A效應子質體」)。若將此2種質體轉形至大腸菌(XL1-Blue)中，則轉形體在阿拉伯糖存在下無法生存，但在阿拉伯糖及IPTG存在下可生存。此乃由於MBP-TALEN-A在位於TALEN-A報導子質體之標的序列中導入雙股DNA切割，因而經切割之質體DNA無法進行DNA複製，報導子質體從轉形體中消失，失去ccdB基因的致死效果。若在持有TALEN-A報導子之大腸菌中導入TALEN-A效應子的突變體庫，並在阿拉伯糖及IPTG存在下施行篩選，則持有活性更高的TALEN-A效應子之大腸菌可生存，而持有活性較弱的TALEN-A效應子之大腸菌無法生存。若從已生存之大腸菌中萃取出TALEN-A效應子的質體DNA並再次轉形至持有TALEN-A報導子之大腸菌中，則持有活性最高的TALEN-A效應子之大腸菌進一步被濃縮。若重複此種循環，則可單離出包含活性最高的TALEN-A效應子之質體。

(實施例2. 突變體庫的構築) TALEN-A效應子的突變體庫係構築如下。以TALEN-A效應子質體DNA當作模板，使用PrimeSTAR(註冊商標)HS DNA Polymerase(TaKaRa)進行PCR增幅，藉由去除FokI-CD部分並導入Esp3I部位而構築目標載體。將MBP-TALEN-A基因的FokI-CD部分的鹼基序列使用GeneMorph II Random Mutagenesis kit(Agilent Technologies公司)進行增幅，調製在FokI-CD的鹼基序列中導入隨機突變而得之嵌入物。使經Esp3I切割而得之目標載體與嵌入物進行接合而構築TALEN-A效應子的突變體庫。評估隨機突變的導入率，結果在FokI-CD部分的鹼基序列(595bp)中平均導入4處鹼基取代。

(實施例3. 突變體庫的篩選) 在階段1的第1次篩選中，將所構築而得之突變體庫的質體DNA 1μg以電穿孔法(Bio-Rad)轉形至持有TALEN-A報導子之大腸菌中。電穿孔後，將大腸菌移至30mL的SOB中並於37℃回復培養1小時。以最終濃度成為1mM之方式加入IPTG並於30℃保溫培養4小時之後，接種至包含100mg/L的氯黴素(Cm)及0.2%阿拉伯糖之LB瓊脂盤中。此時，藉由將菌液的一部分各自接種至添加及未添加阿拉伯糖之LB+Cm瓊脂盤中並對菌落數進行比較而求出生存率。第1次篩選的總菌落數為2×10 ⁷個，在有阿拉伯糖之培養基中所獲得之菌落為6×10 ⁶個。從而，生存率為30%。使有阿拉伯糖之培養基上之菌落懸浮於SOB培養基中，使用NucleoSpin(註冊商標)Plasmid(TaKaRa)從菌液中萃取出質體DNA。

第2次篩選亦使用所萃取出之質體DNA，與第1次同樣地施行。此時之總菌落數為6.8×10 ⁸個，生存率為58%。在第3次篩選中，生存率成為100%。在此條件下，無法選拔出更好的TALEN-A效應子，因而在第4次篩選中，將IPTG的誘導時間從4小時縮短成2小時，使選拔條件更加嚴格。第4次的生存率為20%，在相同條件下施行第5次篩選，結果生存率達到90%。第6~8次係將IPTG誘導時間設成1小時，結果生存率分別為1.3%、10%、6.5%。即便重複次數，生存率亦未提升，從第1次的獨立選殖株數6×10 ⁶個及8次篩選的生存率所算出之獨立選殖株數為55個以下，因而階段1係在第8次篩選結束。

將以階段1的第8次篩選中所獲得之質體DNA當作模板並進一步導入隨機突變而得之FokI-CD嵌入物插入目標載體中，而構築突變再導入庫。將此庫轉形至持有TALEN-A報導子之大腸菌中，並開始進行階段2的篩選。第1次係以1mM IPTG 1小時，第2~3次係30分鐘，第4次係15分鐘，第5~6次係以0.1mM IPTG 15分鐘，分別進行誘導並施行篩選。篩選的初次誘導係於30℃施行，第2次以後之誘導皆於37℃施行。從第1次的獨立選殖株數2.8×10 ⁵個及6次篩選的生存率所算出之獨立選殖株數成為1個。

將以階段2的第6次篩選中所獲得之質體DNA當作模板並進一步導入隨機突變而得之FokI-CD嵌入物插入目標載體中，而構築突變再導入庫。將此庫轉形至持有TALEN-A報導子之大腸菌中，並開始進行階段3的篩選。第1次係20μM IPTG，第2~3次係10μM IPTG，第4次係1μM IPTG，第5~6次係無IPTG 15分鐘，分別進行誘導並施行篩選。篩選的初次誘導係於30℃施行，第2次以後之誘導皆於37℃施行。從第1次的獨立選殖株數1.5×10 ⁵個及6次篩選的生存率所算出之獨立選殖株數成為1個，故結束階段3的篩選。

將以階段3的第6次篩選中所獲得之質體DNA當作模板並進一步導入隨機突變而得之FokI-CD嵌入物插入目標載體中，而構築突變再導入庫。將此庫轉形至持有TALEN-A報導子之大腸菌中，並開始進行階段4的篩選。全部在相同條件(在0.5μM IPTG存在下，於37℃誘導5分鐘)下施行5次篩選。從第1次的獨立選殖株數8.0×10 ⁴個及6次篩選的生存率所算出之獨立選殖株數成為6個，故結束階段4的篩選。

將在階段4中，第5次中所獲得之質體DNA轉形至大腸菌XL1 Blue株中，從所獲得之菌落中萃取出質體DNA，並確認FokI-CD部分的鹼基序列。其結果，獲得4種突變型FokI(M47、M48、M49、M50)。在M47、M48、M49中各自包含10處胺基酸取代，在M50中包含11處胺基酸取代(圖1)。

將所單離出之4種突變型FokI中所發現之胺基酸取代與既存的突變型FokI中所包含之胺基酸取代進行比較。就鋅指核酸酶而言顯示出高活性之Sharkey突變係由S418P取代及K441E取代所構成(上述非專利文獻2)。S418P取代亦存在於M48中，但K441E取代不存在。在非專利文獻2中亦已驗證Q481H及N527D突變的效果，但相比於Sharkey突變而言，其效果較小。Q481H取代亦存在於M50中。此外，已報導FokI僅在不同分子間形成二聚體之異質二聚體形成型突變，Q486E/I499L/N496D及E490K/I538K/ H537R(Doyon Y, et al., (2011) Nat Methods. 8: 74-79)。在M47、M48、M49中，係在Q486導入取代，在M47及M49中為Q486L取代，在M48中為Q486H取代。在M50中存在E490Q取代，與Doyon等人的文獻的E490K取代不同。同樣的異質二聚體形成型突變亦已在文獻(Ramalingam S, et al., (2011) J Mol Biol. 405: 630-641、Szczepek M, et al., (2007) Nat Biotechnol. 25: 786-793)中報導，但除了Doyon等人的文獻與本實施例中所單離出之4種突變體所共通之殘基以外，並不存在共通的胺基酸取代。Q481A取代已被報導為使脫靶突變減少之突變(Miller JC, et al., (2019) Nat Biotechnol. 37: 945-952)，但在M47及M49中為Q486L取代，在M48中為Q486H取代，因而並不一致。

(實施例4. 經由大腸菌B2P之突變型FokI的評估) (1)首先，藉由大腸菌的B2P確認4種突變型FokI(M47、M48、M49、M50)相比於野生型FokI而言，生存率提升何種程度。將持有野生型及4種突變型FokI(M47、M48、M49、M50)之TALEN-A效應子質體DNA 10ng藉由電穿孔法(Bio-Rad)轉形至持有TALEN-A報導子之大腸菌中。加入1mL SOB並於37℃回復培養1小時後，加入包含0.1mM IPTG之6mL SOB並於37℃保溫培養15分鐘而誘導TALEN-A。將轉形體接種至添加及未添加阿拉伯糖之盤中並於37℃培養1晩之後，對菌落數進行計測。生存率係定為將經添加阿拉伯糖之盤的菌落數除以未添加阿拉伯糖之盤的菌落數而得之值。

其結果，表現出持有野生型FokI之TALEN-A效應子之大腸菌的生存率為0.0001%，相對於此，在使用M47、M48、M49或M50作為FokI之大腸菌中，生存率分別為29%、37%、45%、28%(圖2)。突變型FokI-TALEN-A效應子相比於野生型而言，活性係上升21萬倍(M47、M50)~33萬倍(M49)。

(2)4種突變型FokI(M47、M48、M49、M50)之中，在M48及M50中係共通地包含G473R突變。G473R突變為在篩選的最初階段(階段1)已鑑定出之突變，其係鄰接於屬於FokI核酸酶的活性中心之K469殘基。於是，藉由大腸菌的B2P檢討G473R突變在M50的核酸酶的活性中之重要性。首先，構築以PCR法導入將M50的R473殘基恢復成野生型G473殘基之回復突變(M50(G473))而得之TALEN-A效應子質體。將分別持有野生型FokI、M50及M50(G473)之TALEN-A效應子質體DNA 10ng藉由電穿孔法(Bio-Rad)轉形至持有TALEN-A報導子之大腸菌。加入1mL SOB並於37℃回復培養1小時後，加入包含0.1mM IPTG之6mL SOB並於37℃保溫培養15分鐘而誘導TALEN-A。將轉形體接種至添加及未添加阿拉伯糖之盤中並於37℃培養1晩之後，對菌落進行計數。生存率係定為將經添加阿拉伯糖之盤的菌落數除以未添加阿拉伯糖之盤的菌落數而得之值。

其結果，表現出持有M50之TALEN-A效應子之大腸菌的生存率為24%，而表現出持有M50(G473)之TALEN-A效應子之大腸菌的生存率為0.05%以下(圖3)。藉此，得知G473R突變在M50的核酸酶活性中之重要性。

(實施例5. 突變型FokI在動物培養細胞中之經由報導子試驗之評估) (1)其次，為了調查突變型FokI是否使基因體編輯效率提升，係使用被用作評估基因體編輯效率之常法之SSA(Single Strand Annealing)報導子來評估使突變型FokI連結至TALE而得之效應子的性能。

為了使4種突變型FokI(M47、M48、M49、M50)可在動物細胞中效率良好地表現，係合成經最適化成人類的密碼子之基因。使4種經最適化成人類的密碼子之突變型FokI-CD融合至以GFP基因作為標的之TALEN(GFP_TALEN)或以人類B2M基因作為標的之TALEN(B2M_TALEN)的C-末端側，並使用Golden-Gate法插入持有CMV啟動子之表現載體中，而構築動物細胞用效應子質體。另外，所使用之TALEN所識別之序列係示於上述表1。

持有上述TALEN所識別之標的序列之SSA報導子為以下構成。在CMV啟動子的下游依序連結螢火蟲螢光素酶(fLUC)的5’側1131bp的序列、標的序列、fLUC的3’側1317bp的序列。在fLUC的5’側及3’側有795bp重複的序列，在於此等重複序列之間發生同源重組之情況，會生成正常的fLUC並進行表現。標的序列係示於上述表2。

SSA報導子試驗係施行如下。將1500個人類培養細胞HEK293-T細胞預培養1日，使用FuGENE(註冊商標)Transfection Reagent(Promega)轉染2.0ng的報導子質體DNA、10ng的效應子質體DNA、0.5ng的參考質體DNA。在5%CO ₂存在下於37℃培養2日後，使用Dual-Glo(註冊商標)Luciferase Assay System(Promega)測定fLUC及rLUC的活性。對各樣品按4個系列施行試驗3次。其結果，4種突變型FokI中之任何者相較於野生型而言皆顯示出較高的活性(圖4)。

(2)使用可以高感度檢測出基因體編輯之Fn(Firefly luciferase & NanoLUC)報導子檢討對PPR使用突變型FokI是否亦提升基因體編輯效率。

使已最適化成人類的密碼子之野生型FokI或M50融合至以人類B2M基因或GFP基因作為標的之1對PPR(B2M_PPR、GFP_PPR)的C-末端側，插入持有CMV啟動子之表現載體中而構築動物細胞用效應子質體。另外，所使用之PPR所識別之序列係示於表3。

持有上述PPR所識別之標的序列之Fn報導子為以下構成。在CMV啟動子的下游依序連結螢火蟲螢光素酶(fLUC)、標的序列、NanoLuc(nLUC)而構築Fn報導子質體。在Fn報導子系統中，fLUC與標的序列係在框內連接，通常，直至fLUC為止會被轉譯，而nLUC係由於在上游有終止密碼子而不會被轉譯。從而，通常僅檢測出fLUC的活性。另一方面，若標的序列受到編輯而產生Indel，則會在標的序列產生框移，fLUC與nLUC進行融合而得之報導子基因會進行表現，可檢測出fLUC及nLUC兩者的活性。另外，將插入Fn報導子系統中之人類B2M基因及GFP基因的標的序列示於表4。

Fn報導子試驗係施行如下。將1500個人類培養細胞HEK293-T細胞預培養1日。將2.5ng的Fn報導子質體DNA以及針對於PPR(L)及PPR(R)各者之50ng的效應子質體DNA使用FuGENE(註冊商標)Transfection Reagent (Promega)轉染至經預培養之HEK293-T細胞。在5%CO ₂存在下於37℃培養1晩後，使用Nano-Glo(註冊商標) Luciferase Assay System(Promega)測定fLUC及nLUC的活性。對各樣品按4個系列施行試驗，以將nLUC除以fLUC而得之值評估活性。

其結果，在以B2M基因作為標的之情況，M50顯示出野生型FokI的2.2倍的活性，在以GFP基因作為標的之情況，M50顯示出野生型FokI的1.5倍的活性(圖5)。由以上結果，已判明M50即便連結至PPR，相較於野生型FokI而言亦顯示出較高的性能。 [產業上之可利用性]

如以上所說明，本發明之新穎核酸酶結構域突變體在與各式各樣的核酸結合結構域之組合中，相較於野生型FokI核酸酶結構域而言具有優異的活性。本發明之人工核酸切割酶作為基因體編輯工具不僅在基礎研究中有用，在包含醫療、農業、工業在內之各式各樣的產業應用中亦有用。 [序列表非關鍵詞文字]

SEQ ID NO：3 ＜223＞TALEN-A的標的序列 SEQ ID NO：4 ＜223＞GFP_TALEN(L)的標的序列 SEQ ID NO：5 ＜223＞GFP_TALEN(R)的標的序列 SEQ ID NO：6 ＜223＞B2M_TALEN(L)的標的序列 SEQ ID NO：7 ＜223＞B2M_TALEN(R)的標的序列 SEQ ID NO：8 ＜223＞TALEN-A的標的部位 SEQ ID NO：9 ＜223＞GFP_TALEN的標的部位 SEQ ID NO：10 ＜223＞B2M_TALEN的標的部位 SEQ ID NO：11 ＜223＞M47突變體 SEQ ID NO：12 ＜223＞M48突變體 SEQ ID NO：13 ＜223＞M49突變體 SEQ ID NO：14 ＜223＞M50突變體 SEQ ID NO：15 ＜223＞B2M_PPR(L)的標的序列 SEQ ID NO：16 ＜223＞B2M_PPR(R)的標的序列 SEQ ID NO：17 ＜223＞GFP_PPR(L)的標的序列 SEQ ID NO：18 ＜223＞GFP_PPR(R)的標的序列 SEQ ID NO：19 ＜223＞B2M_PPR的標的部位 SEQ ID NO：20 ＜223＞GFP_PPR的標的部位

[圖1]示出4種FokI核酸酶結構域突變體的胺基酸序列之圖。示出相當於FokI核酸酶結構域之第384個至第579個胺基酸序列。底線部分表示與野生型FokI不同的突變處。 [圖2]示出以大腸菌的人工進化系統(B2P)中之生存率為指標，評估FokI核酸酶結構域突變型的核酸酶活性之結果之圖。生存率表示將經添加阿拉伯糖之盤的菌落數除以未添加阿拉伯糖之盤中所生長之菌落數而得之值。WT為將野生型FokI核酸酶結構域融合至TALEN-A效應子所得者，圖中之數值表示利用野生型FokI核酸酶之情況之生存率。 [圖3]示出以大腸菌的人工進化系統(B2P)中之生存率為指標，評估FokI核酸酶結構域中之G473R突變對核酸酶活性所帶來之影響之結果之圖。生存率表示將經添加阿拉伯糖之盤的菌落數除以未添加阿拉伯糖之盤中所生長之菌落數而得之值。WT為將野生型FokI核酸酶結構域融合至TALEN-A效應子所得者，圖中之數值表示利用野生型FokI核酸酶之情況及利用已導入G473回復突變之M50(M50(G473))之情況之生存率。 [圖4]示出使用以B2M基因或GFP基因作為標的序列之TALEN之標靶/報導子試驗的結果之圖。圖表示出FokI核酸酶結構域突變體相對於野生型FokI核酸酶結構域之活性的增加率(倍)。值為3次獨立實驗的結果。 [圖5]示出使用以B2M基因或GFP基因作為標的序列之PPR之標靶/報導子試驗的結果之圖。圖表示出相對於野生型FokI核酸酶結構域之M50的活性(nLUC/fLUC)的增加率(倍)。值表示3次獨立實驗的平均值及標準誤差。＊係以P＜0.1，＊＊係以P＜0.05，對野生型FokI效應子的報導子活性顯示出顯著差異。

<![CDATA[<110>  日商基因編輯力股份有限公司（EditForce, Inc.）]]>
                 日本國立大學法人九州大學（KYUSHU UNIVERSITY, NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION）
          <![CDATA[<120>  FokI核酸�k結構域之突變體]]>
          <![CDATA[<130>  IBPF21-544WO]]>
          <![CDATA[<150>  JP 2020-185619]]>
          <![CDATA[<151>  2020-11-06]]>
          <![CDATA[<160>  20    ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn version 3.5]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  579]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  海床黃桿菌（Flavobacterium okeanokoites）]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Met Val Ser Lys Ile Arg Thr Phe Gly Trp Val Gln Asn Pro Gly Lys 
          1               5                   10                  15      
          Phe Glu Asn Leu Lys Arg Val Val Gln Val Phe Asp Arg Asn Ser Lys 
                      20                  25                  30          
          Val His Asn Glu Val Lys Asn Ile Lys Ile Pro Thr Leu Val Lys Glu 
                  35                  40                  45              
          Ser Lys Ile Gln Lys Glu Leu Val Ala Ile Met Asn Gln His Asp Leu 
              50                  55                  60                  
          Ile Tyr Thr Tyr Lys Glu Leu Val Gly Thr Gly Thr Ser Ile Arg Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Ala Pro Cys Asp Ala Ile Ile Gln Ala Thr Ile Ala Asp Gln Gly 
                          85                  90                  95      
          Asn Lys Lys Gly Tyr Ile Asp Asn Trp Ser Ser Asp Gly Phe Leu Arg 
                      100                 105                 110         
          Trp Ala His Ala Leu Gly Phe Ile Glu Tyr Ile Asn Lys Ser Asp Ser 
                  115                 120                 125             
          Phe Val Ile Thr Asp Val Gly Leu Ala Tyr Ser Lys Ser Ala Asp Gly 
              130                 135                 140                 
          Ser Ala Ile Glu Lys Glu Ile Leu Ile Glu Ala Ile Ser Ser Tyr Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Ala Ile Arg Ile Leu Thr Leu Leu Glu Asp Gly Gln His Leu Thr 
                          165                 170                 175     
          Lys Phe Asp Leu Gly Lys Asn Leu Gly Phe Ser Gly Glu Ser Gly Phe 
                      180                 185                 190         
          Thr Ser Leu Pro Glu Gly Ile Leu Leu Asp Thr Leu Ala Asn Ala Met 
                  195                 200                 205             
          Pro Lys Asp Lys Gly Glu Ile Arg Asn Asn Trp Glu Gly Ser Ser Asp 
              210                 215                 220                 
          Lys Tyr Ala Arg Met Ile Gly Gly Trp Leu Asp Lys Leu Gly Leu Val 
          225                 230                 235                 240 
          Lys Gln Gly Lys Lys Glu Phe Ile Ile Pro Thr Leu Gly Lys Pro Asp 
                          245                 250                 255     
          Asn Lys Glu Phe Ile Ser His Ala Phe Lys Ile Thr Gly Glu Gly Leu 
                      260                 265                 270         
          Lys Val Leu Arg Arg Ala Lys Gly Ser Thr Lys Phe Thr Arg Val Pro 
                  275                 280                 285             
          Lys Arg Val Tyr Trp Glu Met Leu Ala Thr Asn Leu Thr Asp Lys Glu 
              290                 295                 300                 
          Tyr Val Arg Thr Arg Arg Ala Leu Ile Leu Glu Ile Leu Ile Lys Ala 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Ser Leu Lys Ile Glu Gln Ile Gln Asp Asn Leu Lys Lys Leu Gly 
                          325                 330                 335     
          Phe Asp Glu Val Ile Glu Thr Ile Glu Asn Asp Ile Lys Gly Leu Ile 
                      340                 345                 350         
          Asn Thr Gly Ile Phe Ile Glu Ile Lys Gly Arg Phe Tyr Gln Leu Lys 
                  355                 360                 365             
          Asp His Ile Leu Gln Phe Val Ile Pro Asn Arg Gly Val Thr Lys Gln 
              370                 375                 380                 
          Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg His Lys 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala Arg 
                          405                 410                 415     
          Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met Lys Val Met Glu Phe Phe 
                      420                 425                 430         
          Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His Leu Gly Gly Ser Arg Lys 
                  435                 440                 445             
          Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile Asp Tyr Gly Val 
              450                 455                 460                 
          Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Pro Ile Gly 
          465                 470                 475                 480 
          Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val Glu Glu Asn Gln Thr Arg Asn 
                          485                 490                 495     
          Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser Val 
                      500                 505                 510         
          Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly His Phe Lys Gly Asn Tyr 
                  515                 520                 525             
          Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His Ile Thr Asn Cys Asn Gly Ala 
              530                 535                 540                 
          Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys Ala 
          545                 550                 555                 560 
          Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly Glu 
                          565                 570                 575     
          Ile Asn Phe 
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  196]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  海床黃桿菌（Flavobacterium okeanokoites）]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg His 
          1               5                   10                  15      
          Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala 
                      20                  25                  30          
          Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met Lys Val Met Glu Phe 
                  35                  40                  45              
          Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His Leu Gly Gly Ser Arg 
              50                  55                  60                  
          Lys Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile Asp Tyr Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Pro Ile 
                          85                  90                  95      
          Gly Gln Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val Glu Glu Asn Gln Thr Arg 
                      100                 105                 110         
          Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser 
                  115                 120                 125             
          Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly His Phe Lys Gly Asn 
              130                 135                 140                 
          Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His Ile Thr Asn Cys Asn Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys 
                          165                 170                 175     
          Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly 
                      180                 185                 190         
          Glu Ile Asn Phe 
                  195     
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  TALEN-A的標的序列]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          agccgaaatc atcgcag                                                      17
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  GFP_TALEN(L)的標的序列]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          cagcgtgtcc ggcga                                                        15
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  GFP_TALEN(R)的標的序列]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          ttgccgtagg tggca                                                        15
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  B2M_TALEN(L)的標的序列]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          ccaaagattc aggt                                                         14
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  B2M_TALEN(R)的標的序列]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          gactttccat tctc                                                         14
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  50]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  TALEN-A的標的部位]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          agccgaaatc atcgcagccg ctgccgcgag ctcctgcgat gatttcggct                  50
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  42]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  GFP_TALEN的標的部位]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc aa                          42
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  47]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  B2M_TALEN的標的部位]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          ccaaagattc aggtttactc acgtcatcca gcagagaatg gaaagtc                     47
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  196]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  M47突變體]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          Gln Leu Met Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg Arg 
          1               5                   10                  15      
          Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala 
                      20                  25                  30          
          Arg Asn Ser Thr Gln Tyr Arg Ile Phe Glu Met Lys Val Met Glu Phe 
                  35                  40                  45              
          Leu Val Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His Leu Gly Gly Ser Arg 
              50                  55                  60                  
          Asn Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile Asp Tyr Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Val Ile Ile Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Pro Ile 
                          85                  90                  95      
          Gly Gln Ala Asp Ala Met Leu Arg Tyr Val Glu Glu Asn Gln Thr Arg 
                      100                 105                 110         
          Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser 
                  115                 120                 125             
          Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly His Phe Lys Gly Asn 
              130                 135                 140                 
          Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His Ile Thr Asn Cys Asn Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys 
                          165                 170                 175     
          Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly 
                      180                 185                 190         
          Glu Ile Asn Phe 
                  195     
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  196]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  M48突變體]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Gln Leu Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ser Glu Leu Arg His 
          1               5                   10                  15      
          Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala 
                      20                  25                  30          
          Arg Asn Pro Thr Leu Asp Arg Ile Leu Glu Met Lys Val Met Glu Phe 
                  35                  40                  45              
          Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His Leu Gly Gly Ser Arg 
              50                  55                  60                  
          Lys Pro Asp Gly Val Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile Asp Tyr Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Arg Gly Tyr Asn Leu Pro Ile 
                          85                  90                  95      
          Gly Gln Ala Asp Glu Met His Arg Tyr Val Val Glu Asn Gln Thr Arg 
                      100                 105                 110         
          Asn Lys Leu Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser 
                  115                 120                 125             
          Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly His Phe Lys Gly Asn 
              130                 135                 140                 
          Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His Ile Thr Asn Cys Lys Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Arg 
                          165                 170                 175     
          Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Ser Lys Phe Asn Asn Gly 
                      180                 185                 190         
          Glu Ile Asn Phe 
                  195     
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  196]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  M49突變體]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          Gln Leu Met Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Phe Glu Leu Arg Arg 
          1               5                   10                  15      
          Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala 
                      20                  25                  30          
          Arg Asn Ser Thr Gln Tyr Arg Ile Phe Glu Met Lys Val Met Glu Phe 
                  35                  40                  45              
          Leu Val Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His Leu Gly Gly Ser Arg 
              50                  55                  60                  
          Asn Pro Asp Gly Ala Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ile Asp Tyr Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Gly Gly Tyr Asn Leu Pro Ile 
                          85                  90                  95      
          Gly Gln Ala Asp Ala Met Leu Arg Tyr Val Glu Glu Asn Gln Thr Arg 
                      100                 105                 110         
          Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser 
                  115                 120                 125             
          Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly His Phe Lys Gly Asn 
              130                 135                 140                 
          Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His Ile Thr Asn Cys Asn Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Lys 
                          165                 170                 175     
          Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Arg Lys Phe Asn Asn Gly 
                      180                 185                 190         
          Glu Ile Asn Phe 
                  195     
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  196]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  M50突變體]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          Gln Pro Val Lys Ser Glu Leu Glu Glu Lys Lys Ala Glu Leu Arg His 
          1               5                   10                  15      
          Lys Leu Lys Tyr Val Pro His Glu Tyr Ile Glu Leu Ile Glu Ile Ala 
                      20                  25                  30          
          Arg Asn Ser Thr Gln Asp Arg Ile Leu Glu Met Met Val Met Glu Phe 
                  35                  40                  45              
          Phe Met Lys Val Tyr Gly Tyr Arg Gly Lys His Leu Gly Gly Ser Arg 
              50                  55                  60                  
          Lys Pro Asp Gly Val Ile Tyr Thr Val Gly Ser Pro Phe Asp Tyr Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Val Ile Val Asp Thr Lys Ala Tyr Ser Arg Gly Tyr Asn Leu Pro Ile 
                          85                  90                  95      
          Gly His Ala Asp Glu Met Gln Arg Tyr Val Gln Glu Asn Gln Thr Arg 
                      100                 105                 110         
          Asn Lys His Ile Asn Pro Asn Glu Trp Trp Lys Val Tyr Pro Ser Ser 
                  115                 120                 125             
          Val Thr Glu Phe Lys Phe Leu Phe Val Ser Gly His Phe Lys Gly Asn 
              130                 135                 140                 
          Tyr Lys Ala Gln Leu Thr Arg Leu Asn His Ile Thr Asn Cys Thr Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Val Leu Ser Val Glu Glu Leu Leu Ile Gly Gly Glu Met Ile Arg 
                          165                 170                 175     
          Ala Gly Thr Leu Thr Leu Glu Glu Val Arg Ser Lys Phe Asn Asn Gly 
                      180                 185                 190         
          Glu Ile Asn Phe 
                  195     
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  B2M_PPR(L)的標的序列]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          aatggaaagt caaa                                                         14
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  B2M_PPR(R)的標的序列]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          agcaattcag gaaa                                                         14
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  GFP_PPR(L)的標的序列]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          acgacttctt caagt                                                        15
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  GFP_PPR(R)的標的序列]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          cctggacgta gcctt                                                        15
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  96]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  B2M_PPR的標的部位]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          tactccaaag attcaggttt actcacgtca tccagcagag aatggaaagt caaatttcct       60
          gaattgctat gtgtctgggt ttcatccatc cgacat                                 96
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  212]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  GFP_PPR的標的部位]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa       60
          gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac      120
          ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa      180
          gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gc                                    212

Claims

一種突變體，其係FokI蛋白質或其同源蛋白質的核酸酶結構域之突變體，且具有下述(a)~(d)中任一項所記載之突變，核酸酶活性係因該突變而提升； (a)選自由下列者所組成之群組之至少1種突變：FokI蛋白質的386位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Met之取代、FokI蛋白質的399位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Arg之取代、FokI蛋白質的421位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Tyr之取代、FokI蛋白質的424位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Phe之取代、FokI蛋白質的432位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Leu之取代、FokI蛋白質的433位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Val之取代、FokI蛋白質的448位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Asn之取代、FokI蛋白質的466位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Ile之取代、FokI蛋白質的484位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Ala之取代及FokI蛋白質的486位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Leu之取代； (b)選自由下列者所組成之群組之至少1種突變：野生型蛋白質中之418位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Pro之取代、FokI蛋白質的420位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Leu之取代、FokI蛋白質的452位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Val之取代、FokI蛋白質的473位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Arg之取代、FokI蛋白質的486位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為His之取代、FokI蛋白質的490位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Val之取代、FokI蛋白質的498位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Leu之取代、FokI蛋白質的542位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Lys之取代、FokI蛋白質的559位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Arg之取代、FokI蛋白質的570位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Ser之取代； (c)選自由下列者所組成之群組之至少1種突變：野生型蛋白質中之386位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Met之取代、FokI蛋白質的395位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Phe之取代、FokI蛋白質的399位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Arg之取代、FokI蛋白質的421位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Tyr之取代、FokI蛋白質的424位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Phe之取代、FokI蛋白質的432位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Leu之取代、FokI蛋白質的433位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Val之取代、FokI蛋白質的448位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Asn之取代、FokI蛋白質的484位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Ala之取代、FokI蛋白質的486位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Leu之取代； (d)選自由下列者所組成之群組之至少1種突變：野生型蛋白質中之385位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Pro之取代、FokI蛋白質的395位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Ala之取代、FokI蛋白質的427位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Met之取代、FokI蛋白質的452位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Val之取代、FokI蛋白質的460位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Phe之取代、FokI蛋白質的473位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Arg之取代、FokI蛋白質的481位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為His之取代、FokI蛋白質的490位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Gln之取代、FokI蛋白質的542位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Thr之取代、FokI蛋白質的559位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Arg之取代、FokI蛋白質的570位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Ser之取代。
如請求項1之突變體，其係FokI蛋白質或其同源蛋白質的核酸酶結構域之突變體，且具有FokI蛋白質的473位或同源蛋白質的對應部位的胺基酸成為Arg之取代性突變，核酸酶活性係因該突變而提升。
一種人工核酸切割酶，其包含核酸結合結構域及如請求項1或2之核酸酶結構域之突變體。
如請求項3之人工核酸切割酶，其中，前述核酸結合結構域為TALE、鋅指(zinc finger)、PPR或CRISPR-Cas。
一種多核苷酸，其係編碼出如請求項1或2之核酸酶結構域之突變體或者如請求項3或4之人工核酸切割酶。
一種載體，其包含如請求項5之多核苷酸。
一種細胞，其係導入如請求項5之多核苷酸或如請求項6之載體而得。
一種基因體受到編輯之細胞或非人類生物的製造方法，其包含將如請求項3之人工核酸切割酶、編碼出該人工核酸切割酶之多核苷酸或包含該多核苷酸之載體導入細胞或非人類生物中。
一種用於編輯細胞或生物的基因體之套組，其包含如請求項3之人工核酸切割酶、編碼出該人工核酸切割酶之多核苷酸或包含該多核苷酸之載體。