TW202225411A - 使用對準珠的多工螢光原位雜合方法 - Google Patents

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Abstract

本揭示案係關於用於在用於偵測及定量樣品中的分析物的螢光測定中使用官能化的對準珠作為基準標記進行影像配準以改進影像配準的方法。

Description

使用對準珠的多工螢光原位雜合方法
本揭示係關於用於在用於偵測及定量樣品中的分析物的螢光測定中使用官能化的對準珠作為基準標記進行影像配準以改進影像配準的方法。
螢光原位雜交(fluorescence in situ hybridization; FISH)測定係用於偵測及定量樣品中的特定核酸（DNA或RNA）序列的存在或不存在的分子細胞遺傳學方法，通常用作醫學及研究中的診斷工具。例如，FISH用於偵測染色體畸變（基因突變）的存在、與不同疾病狀態（例如，癌症、自體免疫性疾病、精神異常等）相關聯的基因的表現譜及位置的改變、及物種鑑定。
FISH涉及使用螢光顯微術，其中所關注的樣品用具有高互補性的核酸探針標記以與所關注的遺傳序列結合。此等探針或與核酸探針結合的分離的讀出探針用螢光團標記，螢光團當由激發源（諸如來自螢光顯微設備）激發時發射螢光信號。隨後偵測並且處理信號以將信號轉換為光學影像，該光學影像通常描繪了樣品中的分析物的空間位置及/或豐度。
特定而言，作為FISH成像的部分，將樣品暴露於多種寡核苷酸探針。在一輪雜交期間，不同的寡核苷酸探針靶向不同的核苷酸序列。隨後，一輪螢光影像可以藉由將樣品相繼暴露於不同波長的激發光以激發不同探針來獲取。此外，在獲得一輪影像之後，探針可以經光漂白，並且另一輪雜交可以使用更多仍靶向不同核苷酸序列的寡核苷酸探針來執行，接著進行另一輪成像。
對於每個給定像素，其來自不同影像的螢光強度形成信號序列。隨後，將此序列與來自將每個代碼與基因相關聯的代碼簿的參考代碼庫進行比較。最佳匹配參考代碼可以用於識別在影像中的該像素處表示的相關聯的基因。
在一些實施方式中，在此檔案中描述的方法、系統、及基準標記可以實現mFISH效能的即時監測、mFISH效能的最佳化、或兩者。例如，mFISH效能可以取決於各種實驗設置，包括但不限於適當緩衝液交換的流體控制、階段上流動單元雜交、螢光強度、光穩定性、焦平面、及/或影像獲取配置。與先前系統、標記或方法相比，使用在本檔案中描述的基準標記可以實現此等配置的一或多個的監測、最佳化或兩者。在一些實例中，在此等基準標記上的信號可以指示儀器或測定正在適當地執行。
一般而言，在一個態樣中，一種用於對樣品執行原位螢光雜交測定的方法包括：使樣品與結合到樣品中的分析物的一或多個靶向探針（若存在）接觸；使樣品與包括複數個結合位點的複數個基準標記接觸；使樣品與一或多個讀出探針接觸，其中每個讀出探針獨立地包括螢光部分，每個讀出探針與一或多個靶向探針（若存在）及複數個結合位點結合，藉此呈現一或多個螢光信號；成像藉由每個讀出探針產生的一或多個螢光信號；以及配準影像。
一般而言，在本說明書中描述的標的的另一態樣可以在包括以下動作的方法中體現：在支撐件上接收生物樣品，該樣品具有第一核苷酸序列及第二核苷酸序列或具有結合到樣品上的靶向的核苷酸序列的第一及第二複數個靶向探針，其中第一複數個靶向探針具有第一核苷酸序列並且第二複數個靶向探針具有第二核苷酸序列；在支撐件上接收複數個珠，每個珠具有複數個結合位點，複數個結合位點的第一子集包括第一核苷酸序列並且複數個結合位點的第二子集包括第二核苷酸序列；將樣品及複數個珠暴露於第一複數個第一探針，每個第一探針具有螢光團及互補的第一核苷酸序列，使得互補的第一核苷酸序列結合到珠上的第一核苷酸序列及樣品中或第一複數個靶向探針中的第一核苷酸序列；獲得樣品及複數個珠的第一影像；使第一複數個第一探針停用；使樣品及複數個珠與第二複數個第二探針接觸，每個第二探針具有螢光團及互補的第二核苷酸序列，使得互補的第二核苷酸序列結合到珠上的第二核苷酸序列及樣品中或第二複數個靶向探針中的第二核苷酸序列；獲得樣品及複數個珠的第二影像；偵測第一影像及第二影像中的複數個珠的位置；以及基於所偵測的位置執行第一影像及第二影像的配準。
此態樣的其他實施例包括對應電腦系統、設備、電腦程式產品、及在一或多個電腦儲存裝置上記錄的電腦程式，各自經配置為執行方法的動作。一或多個電腦的系統可以經配置為藉助於具有在操作中導致系統執行動作的系統上安裝的其等的軟體、韌體、硬體、或其組合來執行特定操作或動作。一或多個電腦程式可以經配置為藉助於包括當由資料處理設備執行時導致該設備執行動作的指令來執行特定操作或動作。
上述及其他實施例可以各自視情況包括單獨或組合的一或多個以下特徵。
方法可以包括重複接觸直至成像的步驟0至10次。方法可以包括對樣品進行光漂白，並且獨立地重複接觸直至光漂白的步驟0至10次，例如，重複1至9次，從而提供總共2至10輪成像，例如，重複1至3次，藉此提供總共2至4輪成像。樣品可在使樣品與一或多個靶向探針接觸與使樣品與複數個基準標記接觸之間，或在使樣品與複數個基準標記接觸與使樣品與一或多個讀出探針接觸之間，或在使樣品與一或多個讀出探針接觸與成像之間洗滌。
樣品中的分析物（若存在）可包括寡核苷酸。一或多個靶向探針可包括寡核苷酸。每個讀出探針可進一步包括寡核苷酸。每個讀出探針可基本上由螢光部分及寡核苷酸組成。
每個螢光部分可獨立地係螢光染料或螢光多肽。每個螢光部分可獨立地係螢光染料。每個螢光部分可獨立地選自由下列組成的群組：太平洋藍(PacB)、Horizon V450、太平洋橙(PacO)、胺基甲基香豆素乙酸鹽(AMCA)、異硫氰酸螢光素(FITC)、Alexa488、藻紅蛋白(PE)、多甲藻素葉綠素蛋白/花青5.5(PerCP-Cy5.5)、PerCP、PE-TexasRed、藻紅蛋白/花青7(PE-Cy7)、別藻胺酸(APC)、Alexa594、花青5.5(Cy5.5)、IR800、Alexa647、別藻胺酸/H7(APC-H7)、APC-Cy7、Alexa680、及Alexa700。
複數個基準標記可係珠，並且珠可包括珠芯及珠表面，其中表面包含複數個結合位點。珠芯可包括無孔二氧化矽或有機聚合物。珠芯可包括選自聚苯乙烯、聚異戊二烯、及膠乳的有機聚合物。珠的直徑可係約0.05 μm至約1 μm。複數個結合位點的每一者可包括寡核苷酸。每個寡核苷酸可獨立地係DNA或RNA。每個寡核苷酸可獨立地係DNA。每個寡核苷酸可獨立地係RNA。每個寡核苷酸可獨立地包含15至30個殘基。
樣品可來自人類受試者。樣品可來自人類受試者的固體或液體活檢。人類受試者可能已經先前被診斷患有癌症。
對於配準的影像中的複數個像素的每一者，方法可以包括基於第一影像及第二影像中的樣品的螢光強度來確定樣品中的基因的表現。使第一複數個第一探針停用可以包括對第一複數個第一探針進行光漂白。使第一複數個第一探針停用可以包括沖洗第一複數個第一探針。
在一些實施方式中，第一影像及第二影像可以具有相同的橫向位置。第一影像及第二影像可以具有相同的顏色通道。獲得第一影像及獲得第二影像可以包括以相同的激發波長激發第一複數個第一探針及第二複數個第二探針中的螢光團。第一複數個第一探針中的螢光團及第二複數個第二探針的螢光團可以具有相同的材料組成。樣品可以具有第三核苷酸序列及第四核苷酸序列或者可以具有結合到樣品上的靶向的核苷酸序列的第三及第四複數個靶向探針，其中第三複數個靶向探針具有第三核苷酸序列並且第四複數個靶向探針具有第四核苷酸序列。
在一些實施方式中，方法可以包括在使第一複數個第一探針停用之前：將樣品及複數個珠暴露於第三複數個第三探針，每個第三探針具有螢光團及互補的第三核苷酸序列，使得互補的第三核苷酸序列結合到珠上的第三核苷酸序列及樣品中或第三複數個靶向探針中的第三核苷酸序列，並且獲得樣品及複數個珠的第三影像。第一影像及第三影像可以使用不同的顏色通道。第一複數個第一探針的螢光團及第三複數個第三探針的螢光團可以以不同波長發射。第一複數個第一探針的螢光團及第三複數個第三探針的螢光團可以藉由不同激發波長來激發。方法可以包括偵測複數個珠在第三影像中的位置，及基於偵測的位置執行第一影像及第三影像的配準。
在一些實施方式中，方法可以包括：使第三複數個第三探針停用；在使第一複數個第一探針及第三複數個第三探針停用之後：使樣品及複數個珠與第四複數個第四探針接觸，每個第四探針具有螢光團及互補的第四核苷酸序列，使得互補的第四核苷酸序列結合到珠上的第四核苷酸序列及樣品中或第四複數個靶向探針中的第四核苷酸序列；以及獲得樣品及複數個珠的第四影像。第二影像及第四影像可以使用不同的顏色通道。第三影像及第四影像可以使用相同的顏色通道。
在一些實施方式中，第二複數個第二探針的螢光團及第四複數個第四探針的螢光團可以以不同波長發射。第三複數個第三探針的螢光團及第四複數個第四探針的螢光團可以以相同波長發射。第三複數個第三探針中的螢光團及第四複數個第四探針的螢光團可以具有相同的材料組成。第二複數個第一探針的螢光團及第四複數個第四探針的螢光團可以藉由不同激發波長來激發。第三複數個第三探針的螢光團及第四複數個第四探針的螢光團可以藉由相同激發波長來激發。方法可以包括偵測複數個珠在第四影像中的位置，及基於偵測的位置執行第一影像及第四影像的配準。
在本說明書中描述的標的的另一態樣可以在包括複數個對準珠的製造物品中體現，每個對準珠具有複數個結合位點，複數個結合位點包括第一子集結合位點，該等結合位點包括第一核苷酸序列，其中第一核苷酸序列經選擇以結合到具有螢光團並且靶向樣品中或靶向樣品的第一靶向探針中的第一核苷酸序列的第一探針的互補第一核苷酸序列；複數個結合位點的第二子集，包括第二核苷酸序列，其中第二核苷酸序列經選擇以結合到具有螢光團並且靶向樣品中或靶向樣品的第二靶向探針中的第二核苷酸序列的第二探針的互補第二核苷酸序列，其中第一探針的螢光團具有與第二探針的螢光團相同的發射波長及/或相同的激發波長。
在一些實施例中，複數個結合位點包括第三子集結合位點，該等結合位點包括第三核苷酸序列，其中第三核苷酸序列經選擇以結合到具有螢光團並且靶向樣品中或靶向樣品的第三靶向探針中的第三核苷酸序列的第三探針的互補第三核苷酸序列，其中第三探針的螢光團具有與第一探針的螢光團不同的發射波長及/或不同的激發波長。
在一些實施例中，複數個結合位點包括第四子集結合位點，該等結合位點包括第四核苷酸序列，其中第四核苷酸序列經選擇以結合到具有螢光團並且靶向樣品中或靶向樣品的第四靶向探針中的第四核苷酸序列的第四探針的互補第四核苷酸序列，其中第四探針的螢光團具有與第三探針的螢光團相同的發射波長及/或相同的激發波長。
所描述的標的可導致但不限於一或多個以下優點。
藉由配準影像，不同顏色通道可以具有較高準確度的配準。較高準確度可以由描繪樣品及基準標記兩者的資料的單個影像的捕獲來獲得，此舉可以補償在樣品及基準標記的分離樣品的捕獲之間的時間期間可以發生的液體中的樣品、基準標記、或兩者的移動。
可以減少執行mFISH所需的計算資源。例如，與其他系統相比，mFISH設備可以使用較少電腦週期，例如，較快的電腦週期，因為其捕獲描繪樣品及基準標記兩者的資料的單一影像而非兩個影像，一個用於樣品且另一個用於基準標記。與其他系統相比，mFISH設備可以使用較少的電腦週期，因為其在配準製程、拼接製程、或兩者期間分析較少的影像。在一些實例中，與其他系統相比，mFISH設備可以使用較少的記憶體，因為其可以儲存描繪樣品及基準標記的資料的單個影像而非兩個影像。
本文描述了本揭示的特徵的各個實施例。然而，應當理解，此種實施例僅藉由實例的方式提供，並且在不脫離本揭示的範疇的情況下，熟習此項技術者可以想到許多變化、改變、及取代。亦應當理解，本文描述的具體實施例的各種替代方案亦在本揭示的範疇內。
在FISH成像製程期間，影像處理設備可以在多個不同時間捕獲樣品的某一部分的影像。例如，對於不同探針，例如，對於一輪雜交中的不同激發波長或對於不同輪次的雜交，樣品的一部分的影像可以在不同時間捕獲。
問題在於，在一些情況下，顯微鏡載玻片上的載體材料可以移動或期望成像的樣品可以在載體材料內移動。例如，在液體中懸浮的樣品可以移動。在此情況下，即使支撐載玻片的平台準確地移動到相同位置，樣品在稍後影像中可能不再處於相同位置，此可以使比較樣品的影像變得困難。用於補償此運動的技術係將基準標記（例如，螢光珠）放置在載玻片上的載體材料內。通常，樣品及基準標記珠將大致一致地移動。藉由比較基準標記的位置允許兩個影像的配準。
在習知系統中，樣品及用於執行配準的基準標記具有不同的螢光顏色。因此，捕獲兩個螢光顯微影像：一個僅描繪樣品（亦即，具有第一螢光顏色），並且一個僅描繪基準標記（亦即，具有第二螢光顏色）。問題在於，即使在此情況下，樣品的一些移動可以在獲取樣品的影像及基準標記的影像的時間之間發生。假設地，螢光團附接的基準珠發射與探針相同的顏色。但此僅為單個顏色通道提供配準，例如，不同雜交步驟，而不是在不同顏色通道之間。
相關的問題係FISH系統可對樣品的多個不同區域成像，例如，在載玻片上。FISH系統可以藉由沿著x軸、y軸、或兩者移動樣品來獲取此等影像。影像處理設備可以將樣品放置在顯微鏡（例如，螢光顯微鏡）下方的第一位置，並且捕獲在顯微鏡下方的第一視場（field of view; 「FOV」）的第一影像。隨後，影像處理設備可以調節樣品關於顯微鏡的x坐標、y坐標、或兩者以將樣品放置在顯微鏡下方的第二位置。影像處理設備可以捕獲在顯微鏡下方的第二FOV的第二影像。
系統可以組合樣品的多個影像（例如，多個FOV）的資料以產生樣品的單個影像。例如，系統可以對準基準標記，例如，影像的重疊部分中的螢光珠，以產生樣品的單個影像。如上文論述，當影像處理設備捕獲樣品及基準標記的分離影像時，在捕獲此等兩個影像之間可以存在漂移。
另一個問題係不同螢光團的不用性質可以導致此分析中的不平衡的信號強度，此提供了分析物的豐度及/或位置的不準確表示。在臨床設置中，此可能意味著在被診斷患有癌症或者被給予健康證明書的患者之間的差異。使用習知基準標記來解決此問題的嘗試通常係不成功的，至少因為此等標記僅使用單個螢光團，此在數輪成像期間損失強度。類似地，各自具有單個螢光團的不同組的標記仍以不同速率損失信號強度。
為了解決樣品跨影像的移動，影像處理設備（例如，mFISH設備）可以捕獲包括影像及基準標記兩者的資料的FOV的單個影像。為了能夠捕獲包括樣品及基準標記兩者的資料的單個影像，影像處理設備可以使用具有結合位點的基準標記，該等結合位點與結合到樣品中的分析物（例如，物質）的靶向探針上的結合位點相同。物質可以係所分析的任何適當的物質，諸如DNA或RNA。影像處理設備可以將讀出探針引入流體中，該等讀出探針由於共同的結合位點而結合到靶向探針及基準標記兩者。讀出探針可以用於特定的波長或波長範圍並且能夠捕獲分析物的影像資料。
此外，基準標記可以包括以不同波長照射的不同讀出探針的多個結合位點。此可以使影像處理設備能夠使用相同的基準標記而不是針對不同波長使用可能不在樣品中的相同位置處的不同基準標記來捕獲不同波長下的影像。 定義
如本文所使用，術語「約」用於意指近似地、在…的範圍中、大致、或左右。當術語「約」結合數值範圍使用時，其藉由將邊界延伸到低於及高於闡述的數值來修飾該範圍。通常，術語「約」在本文中用於以10%的變異修飾高於及低於所述值的數值。
當參考項目集合使用時，術語「每個」意欲標識集合中的獨立項目，但不一定代表集合中的每一個項目，除非另外明確說明，或除非使用的上下文另外清楚地指示。 概述
一些實施例提供了用於對樣品執行原位螢光雜交測定的方法，該方法包含： a)使樣品與一或多個靶向探針接觸，其中每個靶向探針結合到樣品中的分析物（若存在）； b)使樣品與複數個基準標記接觸，其中每個基準標記包含複數個結合位點； c)使樣品與一或多個讀出探針接觸，其中每個讀出探針獨立地包含螢光部分，並且其中每個讀出探針與一或多個靶向探針（若存在）及複數個結合位點結合，藉此呈現一或多個螢光信號； d)對藉由每個讀出探針產生的一或多個螢光信號成像； e)配準步驟d)中的影像； f)重複步驟(a)-(e) 0至10次； g)對樣品進行光漂白；以及 h)獨立地重複步驟(a)-(g) 0至10次。
在一些實施例中，方法進一步包含一或多個洗滌步驟。例如，在一些實施例中，樣品在步驟1(a)與1(b)之間、在步驟1(b)與1(c)之間、在步驟1(c)與1(d)之間洗滌、或前述的任一者的組合。
在一些實施例中，步驟(a)-(e)以其等所敘述的順序執行。在一些實施例中，步驟(a)-(e)的一或多個以與所敘述者不同的順序執行。
在一些實施例中，步驟(h)重複1至9次，藉此提供總共2至10輪成像。例如，步驟(h)可重複1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、或10次，藉此分別提供2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11輪成像。在一些實施例中，步驟(h)重複1至4次，藉此提供總共2至5輪成像。在一些實施例中，步驟(h)重複一次。在一些實施例中，步驟(h)重複兩次。片語「成像輪次」指執行步驟(h)的總次數（重複步驟(a)-(g)的次數），例如，當執行步驟一次時，執行一輪成像。
在一些實施例中，步驟(f)重複1至9次，其中靶向探針、基準標記、結合位點、讀出探針、及螢光部分的每一者可以各自獨立地在步驟(f)的每次重複中係相同或不同的。例如，不同螢光部分可用於通常不同的螢光信號。
在一些實施例中，基準標記包含寡核苷酸官能化的對準珠。在一些實施例中，單色探針用於在單輪雜交實驗中標記兩者，其中探針經設計為結合到分析物（諸如核酸分子）及對準珠的結合位點（諸如寡核苷酸結合位點）兩者。在一些實施例中，如本文描述，經設計為雜交至分析物及對準珠的結合位點的多色探針用於在單輪雜交實驗中標記兩者。在一些實施例中，基準識別系統可以用於識別顯微鏡載玻片的螢光顯微影像中的對準珠，該顯微鏡載玻片包含對準珠及樣品，各自具有共同的螢光波長。螢光顯微影像描繪了基準標記及樣品兩者。在一些實施例中，配準影像包含能夠配準在不同時間點捕獲的螢光影像的基準識別系統。
在一些實施例中，樣品中缺乏分析物。因此，靶向探針將僅僅結合到基準標記上的結合位點，並且從讀出探針獲得的螢光信號將僅指示基準標記的存在，從而闡明樣品中缺乏分析物。
將理解，螢光部分不基於結合相互作用呈現螢光信號，諸如結合到靶向探針或基準標記上的結合位點的讀出探針。而是，螢光部分在用適當波長（例如，來自螢光顯微設備）的光子激發之後呈現螢光信號。
在一些實施例中，「結合」包含雜交。例如，將靶向探針結合到分析物、將靶向探針結合到基準標記上的結合位點、及將讀出探針結合到靶向探針可以各自獨立地包含雜交。在一些實施例中，「結合」係寡核苷酸的雜交。
在一些實施例中，複數個結合位點係相同的。在一些實施例中，複數個結合位點彼此不同。在一些實施例中，每個珠可以具有30至100個不同的結合位點。在一些實施例中，每個珠可以具有1至30個不同的結合位點。在一些實施例中，複數個結合位點包含1至100個不同的結合位點，諸如，1至30個結合位點、1至10個結合位點、5至15個結合位點、或10至20個結合位點。在一些實施例中，複數個結合位點係1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20個不同的結合位點。在一些實施例中，複數個結合位點係4、5、6、7、8、9、或10個不同的結合位點。
在一些實施例中，對準珠上的結合位點的密度係每個珠約480至約2400。在一些實施例中，對準珠上的結合位點的密度係每個珠約480至約1200、每個珠約1200至約2400、每個珠約1200至約1800、每個珠約720至約1200、或每個珠約960至約1800。在一些實施例中，對準珠上的結合位點的密度係每個珠約1200。
在一些實施例中，樣品中的分析物（若存在）包含寡核苷酸。在一些實施例中，樣品中的分析物包含長於15 bp的寡核苷酸。在一些實施例中，樣品中的分析物包含係約15 bp至約1000 bp長的寡核苷酸。在一些實施例中，一或多個靶向探針的每一者包含寡核苷酸。在一些實施例中，每個讀出探針的每一者進一步包含寡核苷酸。在一些實施例中，每個讀出探針基本上由螢光部分及寡核苷酸組成。
「螢光部分」指回應於暴露於「激發」螢光材料的波長的光而發射特定波長（例如，具有特定顏色）的光的物質。螢光材料可以耦合到其他分子（例如，DNA分子、蛋白質、抗體、或珠）。例如，螢光材料可以使用NHS酯類型的反應耦合到DNA分子。螢光顯微鏡係藉由將螢光材料暴露於激發螢光材料的波長的光而產生影像的光學顯微鏡。示例性螢光材料包括太平洋藍(PacB)、Horizon V450、太平洋橙(PacO)、胺基甲基香豆素乙酸鹽(AMCA)、異硫氰酸螢光素(FITC)、Alexa488、藻紅蛋白(PE)、多甲藻素葉綠素蛋白/花青5.5(PerCP-Cy5.5)、PerCP、PE-TexasRed、藻紅蛋白/花青7(PE-Cy7)、別藻胺酸(APC)、Alexa594、花青5.5(Cy5.5)、IR800、Alexa647、別藻胺酸/H7(APC-H7)、APC-Cy7、Alexa680及Alexa700。
在一些實施例中，每個螢光部分獨立地係螢光染料或螢光多肽。在一些實施例中，每個螢光部分獨立地係螢光染料。在一些實施例中，每個螢光部分獨立地選自由下列組成的群組：太平洋藍(PacB)、Horizon V450、太平洋橙(PacO)、胺基甲基香豆素乙酸鹽(AMCA)、異硫氰酸螢光素(FITC)、Alexa488、藻紅蛋白(PE)、多甲藻素葉綠素蛋白/花青5.5(PerCP-Cy5.5)、PerCP、PE-TexasRed、藻紅蛋白/花青7(PE-Cy7)、別藻胺酸(APC)、Alexa594、花青5.5(Cy5.5)、IR800、Alexa647、別藻胺酸/H7(APC-H7)、APC-Cy7、Alexa680、及Alexa700。
在一些實施例中，複數個結合位點的每一者包含寡核苷酸。在一些實施例中，每個寡核苷酸獨立地係DNA或RNA。在一些實施例中，每個寡核苷酸獨立地係DNA。在一些實施例中，每個寡核苷酸獨立地係RNA。在一些實施例中，每個寡核苷酸獨立地包含15至30個殘基。
一些實施例提供了用於對樣品執行原位螢光雜交測定的方法，該方法包含： a)使樣品與一或多個探針接觸，其中每個探針包含靶向域及讀出域，其中每個讀出域呈現可藉由螢光成像系統偵測的信號； b)使樣品與複數個基準標記接觸，其中每個基準標記包含複數個結合位點；其中每個靶向域雜交到(i)樣品中的分析物（若存在），藉此呈現螢光信號，以及(ii)基準標記的結合位點，藉此呈現螢光信號； c)對藉由每個讀出域產生的螢光信號成像； d)配準步驟c)中的影像以及 e)對樣品進行光漂白。
在一些實施例中，步驟(a)-(e)以其等所敘述的順序執行。在一些實施例中，步驟(a)-(e)的一或多個以與所敘述者不同的順序執行。
在一些實施例中，步驟(a)-(e)重複1至9次，藉此提供總共2至10輪成像。例如，步驟(a)-(e)可重複1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、或10次，藉此分別提供2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11輪的成像。在一些實施例中，步驟(a)-(e)重複1至3次，藉此提供總共2至4輪成像。在一些實施例中，步驟(a)-(e)重複一次。在一些實施例中，步驟(a)-(e)重複兩次。片語「成像輪次」指執行步驟(a)-(e)的總次數，例如，當執行步驟一次時，執行一輪成像。
在一些實施例中，方法進一步包含在步驟(e)之前重複步驟(a)-(d)的子集，例如，步驟(a)、步驟(b)、步驟(c)、步驟(d)、或前述的任何組合可在步驟(e)之前重複1至4次。
在一些實施例中，複數個結合位點包含1至20個結合位點，例如，第一、第二、第三、第四等等結合位點。在一些實施例中，複數個結合位點包含第一結合位點及第二結合位點。
在一些實施例中，一或多個探針包含複數個第一、第二、第三、及/或第四探針。在一些實施例中，第一探針包含雜交到基準標記上的第一結合位點的第一靶向域；第二探針包含雜交到基準標記上的第二結合位點的第二靶向域；第三探針包含雜交到基準標記上的第三結合位點的第三靶向域；以及第四探針包含雜交到基準標記上的第四結合位點的第四靶向域。
在一些實施例中，一或多個探針包含複數個第一探針；其中第一探針包含雜交到基準標記上的第一結合位點的第一靶向域。在一些實施例中，一或多個探針包含複數個第二探針；其中第二探針包含雜交到基準標記上的第二結合位點的第二靶向域。
在一些實施例中，每個靶向域係不同的。在一些實施例中，每個靶向域係相同的。在一些實施例中，第一靶向域及第二靶向域係不同的。
在一些實施例中，樣品分別與複數個第一、第二、第三及/或第四探針接觸。在一些實施例中，在樣品與複數個第二探針接觸之前，樣品與複數個第一探針接觸。
在一些實施例中，樣品在相同輪次的成像中與複數個第一、第二、第三及/或第四探針接觸。在一些實施例中，樣品在兩個或多個不同輪次的成像中與複數個第一、第二、第三及/或第四探針接觸。在一些實施例中，樣品在相同輪次的成像中與複數個第一探針及複數個第二探針接觸。在一些實施例中，樣品在不同輪次的成像中與複數個第一探針及複數個第二探針接觸。
當螢光團歸因於光子誘導的化學改變而經歷對其化學結構的不可逆修飾時，發生螢光信號的光漂白（亦稱為褪色）。由於不同螢光團具有不同的化學結構及螢光性質，在多色（多工）FISH實驗中來自不同螢光團的每一者的螢光信號強度在使用一或多個激發波長的光暴露一段時間之後可能變得實質上不同，取決於每個螢光團對光漂白的固有敏感性。在多工FISH實驗中，對不同螢光團的光漂白的不同敏感性可能導致不平衡的信號強度，並且因此產生由所使用的不同螢光探針標記及偵測的不同分析物的相對豐度的不準確表示。習知的基準標記僅使用單個螢光團，此將隨時間（諸如隨著信號傳遞輪次）損失強度。即使使用各自具有單個螢光團的不同組的珠將以不同的速率損失信號強度。因此，習知的基準珠將不用作位置標記，至少因為在不同配準影像中的相同FOV內的相同珠。沒有簡單的機制來恢復標記上的螢光信號以防止影像中的不平衡的信號強度。此現象在多輪成像中特別成問題，其中來自用不同螢光團標記的基準標記的螢光信號強度可以在不同輪次的成像中實質上不同。
相反，如本文描述，基準標記可以在每輪雜交中用相同珠上的一或多個不同類型的螢光團標記，如本文描述。例如，每個靶向探針包含結合到樣品中的分析物（若存在）並且結合到基準標記上的結合位點的一個寡核苷酸區域，及結合到讀出探針的第二寡核苷酸區域。因此，在每輪成像中，可使用具有相同的第二寡核苷酸區域（其將全部結合到相同的讀出探針）或具有一或多個不同的第二寡核苷酸區域（其將各自結合到不同的讀出探針）的靶向探針。繼而，每個讀出探針可包含不同的螢光部分，因此促進在每個獨立輪次成像中及/或在多輪成像期間多個顏色通道的成像。
在一些實施例中，珠在相同輪次的雜交中用複數個第一探針標記。在一些實施例中，珠在相同輪次的雜交中用複數個第一及第二探針的混合物標記。在一些實施例中，珠在相同輪次的雜交中用複數個第一、第二及第三探針的混合物標記。在一些實施例中，基準標記珠在相同輪次的雜交中用複數個第一、第二、第三及第四探針的混合物標記。在一些實施例中，來自第一組探針的所有現有的螢光信號藉由光漂白有意地移除，並且在第一輪雜交及成像結束時將一組新的探針添加到樣品。在一些實施例中，雜交/成像/光漂白步驟執行一輪。在一些實施例中，雜交/成像/光漂白步驟重複2至3輪。在一些實施例中，雜交/成像/光漂白步驟重複4至7輪。在一些實施例中，雜交/成像/光漂白步驟重複8至10輪。
在一些實施例中，相同的視場(FOV)在不同輪次的成像中成像，其中來自樣品中的基準標記珠及分析物的螢光信號的任何偏移可以在整個輪次中追蹤。在一些實施例中，來自相同FOV內的3個基準標記珠的螢光信號足以實現在不同成像輪次之間的偏移的校正。在一些實施例中，來自相同FOV內的5個基準標記珠的螢光信號足以實現在不同成像輪次之間的偏移的校正。在一些實施例中，來自相同FOV內的10個基準標記珠的螢光信號足以實現在不同成像輪次之間的偏移的校正。在一些實施例中，來自相同FOV內的20個基準標記珠的螢光信號足以實現在不同成像輪次之間的偏移的校正。
在一些實施例中，複數個基準標記包含珠，其中珠包含珠芯及珠表面，其中表面包含複數個結合位點。在一些實施例中，珠芯包含無孔二氧化矽或有機聚合物。在一些實施例中，珠芯包含從聚苯乙烯或聚異戊二烯中選擇的有機聚合物。
在一些實施例中，珠的直徑係約0.050 μm至約1 μm。
在一些實施例中，每個探針的每個讀出域獨立地包含螢光染料。在一些實施例中，每個螢光染料獨立地選自：太平洋藍(PacB)、Horizon V450、太平洋橙(PacO)、胺基甲基香豆素乙酸鹽(AMCA)、異硫氰酸螢光素(FITC)、Alexa488、藻紅蛋白(PE)、多甲藻素葉綠素蛋白/花青5.5(PerCP-Cy5.5)、PerCP、PE-TexasRed、藻紅蛋白/花青7(PE-Cy7)、別藻胺酸(APC)、Alexa594、花青5.5(Cy5.5)、IR800、Alexa647、別藻胺酸/H7(APC-H7)、APC-Cy7、Alexa680、及Alexa700。在一些實施例中，探針的讀出域包含螢光肽或蛋白質，諸如GFP。在一些實施例中，探針的讀出域包含量子點。
在一些實施例中，對準珠不係自螢光的。在一些實施例中，對準珠在與任何讀出域大致相同的波長中不係自螢光的。在一些實施例中，對準珠包含無孔二氧化矽。在一些實施例中，對準珠包含一或多種有機聚合物。此種有機聚合物的實例包括但不限於聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、及聚(乙烯)醇。在一些實施例中，校準包含球形顆粒的分散膠態懸浮液，該等球形顆粒包含非晶聚異戊二烯（膠乳）。
在一些實施例中，對準珠的直徑係約0.05微米至約1微米（μm）。珠可以等於或大於影像的像素大小，例如，70至120 nm，但不需要大於像素大小的約10倍。在一些實施例中，珠的直徑係約0.2 μm。在一些實施例中，珠的直徑與靶點的直徑大致相同，藉此具有與靶點相當的信號強度。藉由調節對準珠上的結合位點的密度，對準珠的信號強度可以經調節以匹配平衡的信號位準的靶區域的信號強度。藉由調節用於標記珠的探針的密度（亦即，較少探針可以用於標記較大的珠），來自標記的珠的螢光強度可以經調節以匹配平衡的信號位準的靶區域的螢光強度。在一些實施例中，對準珠上的結合位點的密度係約480至約2400。在一些實施例中，對準珠上的結合位點的密度係約1200。
在一些實施例中，每個靶向域包含寡核苷酸。在一些實施例中，每個結合位點包含寡核苷酸。在一些實施例中，每種分析物包含寡核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸係DNA。在一些實施例中，寡核苷酸係RNA。在一些實施例中，每個寡核苷酸獨立地包含15至30個殘基。
寡核苷酸結合位點到對準珠的附接可以經由對熟習此項技術者熟知的適當化學偶聯反應來實現。在一些實施例中，用於共價偶聯反應的化學官能團（偶聯配偶體）係醯胺鍵形成反應中的胺/羧基基團。在一些實施例中，用於偶聯反應的偶聯配偶體係邁克爾(Michael)反應中的硫醇/馬來醯胺基團。在一些實施例中，用於偶聯反應的偶聯配偶體係二硫化物交換反應中的硫醇/二硫化物基團。在一些實施例中，用於偶聯反應的偶聯配偶體係環氧開環反應中的羥基/環氧基團。在一些實施例中，用於偶聯反應的偶聯配偶體係環氧開環反應中的胺基/環氧基團。
化學官能團鏈接到寡核苷酸的5’磷酸酯基團。在一些實施例中，化學官能團以約3至約16個碳原子的間隔基鏈接到寡核苷酸的5’磷酸酯基團，該間隔基例如3碳間隔基、4碳間隔基、5碳間隔基、6碳間隔基、7碳間隔基、8碳間隔基、9碳間隔基、10碳間隔基、11碳間隔基、12碳間隔基、13碳間隔基、14碳間隔基、15碳間隔基、或16碳間隔基。在一些實施例中，間隔基係6碳間隔基。在一些實施例中，間隔基係12碳間隔基。
在一些實施例中，對準珠上的表面電荷可以係正的或負的，取決於存在的官能團的標識。在一些實施例中，對準珠包含一個或帶正電荷的基團，賦予珠正表面電荷，例如，一或多個脒基團。在一些實施例中，對準珠包含一個或帶負電荷的基團，賦予珠負表面電荷，例如，一或多個羧基及/或硫酸根基團。在一些實施例中，對準珠不具有凈表面電荷，例如，不具有帶正電荷或帶負電荷的基團，或相等數量的帶正電荷及帶負電荷的基團，從而導致沒有凈表面電荷。
在一些實施例中，對準珠上的表面電荷密度係每電荷基團約70 Å至每電荷基團約1000 Å，例如，每電荷基團約70 Å至約300 Å、每電荷基團約200 Å至約400 Å、每電荷基團約300 Å至約500 Å、每電荷基團約400 Å至約600 Å、每電荷基團約600 Å至約800 Å、每電荷基團約800 Å至約1,000 Å、或其間的任何值。
化學偶聯反應在有利於偶聯反應進行的適當反應條件（反應溶劑、添加劑、pH、溫度、反應時間）下執行。
在一些實施例中，偶聯反應在含水緩衝液中執行。在一些實施例中，含水緩衝液具有在約2與約10之間的pH，例如，約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、或其間的任何值。
在一些實施例中，含水緩衝液包含(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)、三(羥基甲基)胺基甲烷(Tris)、或三(羥基甲基)胺基甲烷-乙二胺四乙酸(TE)緩衝液。在一些實施例中，含水緩衝液係(N-嗎啉代)乙磺酸(MES)。在一些實施例中，緩衝液係三(羥基甲基)胺基甲烷(Tris)。在一些實施例中，緩衝液係三(羥基甲基)胺基甲烷-乙二胺四乙酸(TE)緩衝液。
在一些實施例中，一或多種添加劑用於促進偶聯反應。在一些實施例中，一或多種添加劑包含1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺(EDC)、N,N’-二異丙基碳二亞胺(DIC)、羥基苯并三唑(HOBt)、3-[雙(二甲基胺基)甲基]-3 H-苯并三唑-1-氧化物六氟磷酸鹽(HBTU)、(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷鏻六氟磷酸鹽(PyBOP)、溴三吡咯烷鏻六氟磷酸鹽(PyBrOP)、或前述任一者的組合。在一些實施例中，一或多種添加劑包含鹼，例如，有機鹼，諸如三甲胺(TEA)或二異丙基乙胺(DIPEA)。
在一些實施例中，偶聯反應在約0℃至約60℃下執行，例如，約0℃至約20°C、約10℃至約30℃、約20℃至約40℃、約30℃至約50℃、約40℃至約60℃、約0℃、約5℃、約10℃、約15℃、約20℃、約25℃（亦即，「室溫」）、約30℃、約35℃、約40℃、約45℃、約50℃、約55℃、約60℃、或其間的任何值。在一些實施例中，偶聯反應在室溫（約25℃）下執行。在一些實施例中，偶聯反應在約37℃下執行。
使用上文描述的化學偶聯反應及條件，每個對準珠可以利用一或多個不同的寡核苷酸結合位點來修飾。每個結合位點的寡核苷酸序列經設計為與生物分析物中的所關注的核酸（基因）序列相同，並且與探針的靶向域反向互補。寡核苷酸結合位點序列的設計可以使用公眾可獲得的在線序列計算器執行。在一個實例中，線上計算器可以經由網際網路網站存取：http://reverse-complement.com。對於最佳化雜交效率，寡核苷酸的長度係約15至35個殘基。在一些實施例中，結合位點的長度係33個寡核苷酸殘基。
在一些實施例中，樣品係來自人類受試者。在一些實施例中，樣品係來自實體或液體活檢，此活檢包含來自人類受試者的細胞。在一些實施例中，受試者先前已經診斷患有癌症，例如，經由使用管理機構批準的測定或診斷套組（諸如FDA批準的測定或診斷套組）。在一些實施例中，受試者被懷疑患有癌症。在一些實施例中，受試者目前患有癌症。在一些實施例中，受試者先前已患有癌症，但當前未被診斷患有癌症。在一些實施例中，細胞係癌症細胞。在一些實施例中，已知癌症由一或多種特定遺傳突變驅動，該等遺傳突變包括但不限於Brca1、Brca2、Ras、c-Myc、Bcr-Abl、Trk、ErbB、Egfr、Raf、Pdgfr、Mek、c-Jun、Bcl-2。 用於在單工或多工 FISH 測定中使用對準珠的方法
如上文描述，由於對準珠（基準標記）可以用多個不同的寡核苷酸結合位點來官能化，對準珠可以用具有單螢光團的不同讀出探針（單工）或具有多個不同螢光團的讀出探針（多工）標記，用於每輪雜交及成像。第1圖描繪了用九個不同結合位點102a-b官能化的對準珠100。對準珠上的結合位點編碼與探針的靶向域反向互補的寡核苷酸序列，該等探針與不同顏色染料綴合。三個不同探針用一種染料標記（例如，序列1、4及7用紅色染料標記，序列2、5及8用綠色染料標記，並且序列3、6及9用黃色染料標記），並且以一或多種顏色標記的探針可以在單輪雜交中使用。例如，在第1輪中，使用探針1-3；在第2輪中，使用探針4-6；在第3輪中，使用探針7-9。樣品在每輪雜交中成像及配準之後光漂白，從而在各輪期間產生一或多個漂白的讀出探針104a-f。
在單色FISH實驗的一個實例中，如第2圖所示，六個不同的單色探針可以用於標記每輪雜交中的對準珠。1 μm直徑及用與六個探針互補的寡核苷酸結合位點（各自具有單一顏色）官能化的對準珠可以用作基準標記。相同視場在整輪雜交中成像。執行六輪雜交，每輪包含(a)用含有對準珠及DAPI的緩衝水溶液染色樣品；(b)雜交一種類型的單色探針，每個探針包含與對準珠的一個寡核苷酸結合位點互補的寡核苷酸靶向域及螢光染料；以及(c)對樣品進行光漂白以在每輪結束時移除單色探針。1 μm對準珠在所有輪成像中顯示，每輪中具有不同顏色。各輪之間的對準珠的偏移用於校正影像配準。通常，每個FOV最少3個珠足以校正讀出輪之間的焦平面中的偏移。
mFISH設備可以藉由比較各自在不同輪期間捕獲的樣品的兩個影像來校正各輪之間的影像配準。當mFISH設備確定在兩個影像的每一者中描繪的對準珠在影像內處於近似相同位置時，例如，在彼此的閾值距離內，例如，小於100個像素，mFISH設備可以確定跳過配準。當mFISH設備確定在兩個影像的每一者中描繪的對準珠的位置隔開大於閾值距離時，mFISH設備可以確定影像的配準變換（例如，平移、旋轉、或其組合）當應用於影像時將在第一影像中描繪的每個珠的位置移動到在第二影像中描繪的珠的對應第二位置。隨後，mFISH設備可以使用將此變換應用於影像以執行影像配準。
mFISH設備可以藉由使用平移調節影像之一中描繪的樣品的位置來校正配準。此可以導致兩個影像中的樣品的描繪處於大致相同位置。
樣品亦可以在單輪雜交中用標記有多色探針的對準珠來成像。在此種多色FISH實驗的一個實例中，如第3圖所示，螢光顯微影像從1 μm直徑的對準珠相繼獲得，該1 μm直徑的對準珠具有附接到珠表面的十五個不同寡核苷酸結合位點的多個複本。對在玻璃上嵌入（附著）有1 μm直徑的對準珠的樣品執行五輪雜交，每輪包含(a)雜交三種類型的單色探針，每個探針包含與對準珠的一個寡核苷酸結合位點互補並且連接到螢光染料（諸如本文描述的彼等）的寡核苷酸靶向域；(b)在三個顏色通道中對樣品成像；以及(c)對樣品進行光漂白以移除在每輪結束時移除所有三個通道中的單色探針。在每輪雜交及成像期間，1 μm對準珠在所有三個螢光通道中同時顯示。每FOV追蹤三個珠實現校正在讀出輪之間導致的偏移。在另一實例中，如第4圖所示，螢光顯微影像從0.2 μm直徑的對準珠相繼獲得，該對準珠具有附接到珠表面的十八個不同寡核苷酸結合位點的多個複本。對在細胞系樣品上嵌入有對準珠的樣品執行六輪雜交，每輪包含(a)雜交三種類型的單色探針，每個探針包含與對準珠的一個寡核苷酸結合位點互補並且結合到螢光染料（諸如本文描述的彼等）的寡核苷酸靶向域；(b)在三個顏色通道中對樣品成像；以及(c)對樣品進行光漂白以在每輪結束時移除所有三個通道中的單色探針。在每輪雜交及成像期間，0.2 μm對準珠在所有三個螢光通道中同時顯示。每FOV追蹤三個珠實現校正在讀出輪之間導致的偏移。 用於使用寡核苷酸官能化的對準珠作為基準標記校正焦點漂移的方法
在一些實施例中能夠配準在不同時間點捕獲的螢光影像的基準識別系統係與如本說明書中描述的寡核苷酸官能化的對準珠結合使用。在一個實例中，基準識別系統可以用於識別顯微鏡載玻片的螢光顯微影像中的對準珠，該顯微鏡載玻片含有具有共同的螢光顏色的基準標記及樣品。螢光顯微影像描繪了基準標記及樣品兩者。在影像中識別的基準標記可以用於將影像與在不同時間點拍攝的顯微鏡載玻片的其他影像配準。為了配準在不同時間點捕獲的螢光影像，基準識別系統用於識別在影像中描繪的基準標記的位置，並且基準標記的位置用於確定適當的配準變換。
基準識別系統經配置為處理在第一時間點獲取的第一影像及在第二時間點獲取的第二影像以產生相應的基準標記位置。影像（例如，第一影像或第二影像）的基準標記位置定義了影像中描繪的基準標記的位置。特定基準標記的位置可以表示為一組坐標，例如，在第二影像的幀中的x-y坐標。
在一個實例中，顯微鏡載玻片的內容物包括核糖核酸(RNA)分子（樣品中關注的分析物）集合，並且用探針標記的基準標記對準珠懸浮在微流體腔室中。在捕獲第一影像與第二影像之間，RNA分子及基準標記珠可在微流體腔室中移動。在此實例中，RNA分子及基準標記珠大致一致地移動（亦即，因此RNA分子及基準標記珠的相對位置在時間點之間保持大致相同）。由於基準標記珠的位置可以在第一及第二影像之間定義，亦可以定義RNA分子位置的任何偏移。 實例
以下材料及方法用於本文闡述的實例中。 實例 1. 用 5’- 胺基 - 寡 核苷酸官能化 0.2 μm 羧基膠乳 珠
5’-胺基寡核苷酸（其中胺基與寡核苷酸的5’-磷酸酯基團用其間的12碳間隔基共價地鏈接）可以從商業供應商獲得。寡核苷酸經由習知的自動化固態寡核苷酸合成來合成地製備，並且所需的序列可以指定為寡核苷酸合成的一部分。寡核苷酸可以作為乾粉、或作為水或其他含水緩衝液中的水溶液供應。作為乾粉的寡核苷酸係較佳的，由於其等與作為水溶液儲存時相比更穩定。
作為乾粉的寡核苷酸再懸浮於超純水中至1 mM的最終濃度，等分至單次使用小瓶中並且在-20℃下儲存。冷凍的等分試樣在使用之前解凍，並且不重新冷凍以避免多次凍融循環。在解凍之後，將2.5 μL的1 mM（對應於2.5 nmol）的每種寡核苷酸溶液經由自動微量移液管轉移到1.8 mL的錐形管。對於對準珠官能化反應的每次運行，多個不同的寡核苷酸溶液可以組合在單個錐形管中。向組合的寡核苷酸溶液中添加1體積的MES緩衝液；例如，若組合16種寡核苷酸溶液，則將添加40 μL（15*2.5 μL）的MES緩衝液。將所得溶液輕輕渦旋以混合成分。
將1 pmol的0.2 μm直徑的羧基膠乳珠（目錄號C37486，分子探針）的4% (w/v)含水懸浮液經由微量移液管轉移到1.8 mL的錐形管，向其中添加3體積的MES緩衝液，產生1% (w/v)的珠懸浮液。將珠懸浮液以12,000 g離心15分鐘以完全沉澱珠。丟棄上清液，並且將沉澱重懸於400 μL的MES緩衝液中，輕輕渦旋。將所得珠懸浮液添加到如上文描述製備的寡核苷酸/MES溶液。
製備10 mg/mL EDC於超純水中的儲備溶液，並且將5 μL（對應於約250 nmol的EDC）儲備溶液添加到如上文描述的珠/寡核苷酸混合物以發起偶聯反應。所得混合物在室溫下以200-1000 rpm渦旋15分鐘，在4℃下溫育3小時，並且隨後藉由將50 μL的1M Tris緩衝液添加到反應混合物接著以200-1000 rpm渦旋15分鐘來終止。混合物隨後以12,000 g離心15分鐘，之後丟棄上清液並且將沉澱重懸於500 μL的TE緩衝液中。離心/重懸步驟重複一次，並且所得寡核苷酸官能化的珠在冷藏溫度（2-8℃）下儲存直到使用。 實例 2.FISH 成像實驗中的寡核苷酸對準珠
將如實例1中製備的寡核苷酸官能化的對準珠的5 μL等分試樣與1 mL的1-10 μg/mL的DAPI的PBS溶液的每一者（以1 μg/mL增量）混合，以靶向0.5-1% (v/v)珠/DAPI比率。將所得混合物超聲處理10分鐘，施加到顯微鏡載玻片。在15分鐘之後，樣品用2X SSC洗滌兩次，用PBS中的4% PFA後固定15分鐘，並且隨後用2X SSC洗滌3次。含有對準珠的樣品隨後用下文更詳細描述的mFISH設備及影像捕獲製程來成像。 FISH成像系統
參見第5圖，多工螢光原位雜交(mFISH)成像及影像處理設備500包括用於固定樣品502的流動單元510、用於獲得樣品502的影像的螢光顯微鏡520、及用於控制mFISH成像及影像處理設備500的各個部件的操作的控制系統540。控制系統540可以包括電腦542，例如，具有執行控制軟體的記憶體、處理器等。
螢光顯微鏡520包括可以產生多個不同波長的激發光530的激發光源522。特定而言，激發光源522可以在不同時間產生具有不同波長的窄帶寬光束。例如，激發光源522可以藉由多波長連續波雷射系統提供，例如，可以獨立激活以產生不同波長的雷射束的多個雷射模組522a。來自雷射模組522a的輸出可以多工到共同的光束路徑中。
螢光顯微鏡520包括顯微鏡主體524，該顯微鏡主體包括各種光學部件以將來自光源522的激發光引導至流動單元510。例如，來自光源522的激發光可以耦合到多模光纖中、藉由一組透鏡再聚焦及擴展、隨後藉由諸如高數值孔徑(numerical aperture; NA)物鏡536的核心成像部件來引導至樣品502中。當需要切換激發通道時，多個雷射模組522a之一可以停用，並且另一雷射模組522a可以激活，其中藉由一或多個微控制器544、546實現裝置之中的同步。
物鏡536或整個顯微鏡主體524可以在耦合到Z驅動致動器的可垂直移動的底座上安裝。例如，藉由控制Z驅動致動器的微控制器546，Z位置的調節可以實現焦點位置的微調。替代地或另外地，流動單元510（或支撐流動單元510中的樣品的平台518）可以藉由Z驅動致動器518b（例如，軸向壓電平台）可垂直地移動。此種壓電平台可以允許精確且快速的多平面影像獲取。
待成像的樣品502位於流動單元510中。流動單元510可以係其中橫截面積（平行於顯微鏡的物體或影像平面）之面積約2 cm乘2 cm的腔室。樣品502可以支撐在流動單元內的平台518上，並且平台（或整個流動單元）可以係可橫向移動的，例如，藉由一對線性致動器518a以允許XY運動。此允許在不同的橫向偏移視場(FOV)中獲取樣品502的影像。或者，顯微鏡主體524可以承載在可橫向移動的平台上。
到流動單元510的入口連接到一組雜交試劑源512。多閥定位器514可以藉由控制器540控制以在源之間切換，用於選擇將哪種試劑512a供應到流動單元510。每種試劑包括不同組的一或多個寡核苷酸探針，例如，讀出探針。每個探針靶向不同的所關注的RNA序列，並且具有不同組的一或多種螢光材料，例如，磷光體，該等螢光材料藉由波長的不同組合激發。除了試劑512a之外，可以存在沖洗流體源512b，例如，去離子（「DI」）水。
到流動單元510的出口連接到泵516，例如，蠕動泵，該泵亦藉由控制器540控制以控制液體（例如，試劑或沖洗流體）穿過流動單元510的流動。來自流動單元510的已使用的溶液可以藉由泵516傳遞到化學廢物管理子系統519。
在操作中，控制器540導致光源522發射激發光530，此導致樣品502中的螢光材料的螢光，例如，與樣品中的RNA結合並且藉由激發光的波長激發的探針的螢光。發射的螢光532以及反向傳播的激發光（例如，從樣品、平台等散射的激發光）由顯微鏡主體524的物鏡536收集。
收集的光可以藉由顯微鏡主體524中的多頻帶二向色鏡538過濾，以將發射的螢光與反向傳播的照明光分離，並且將發射的螢光傳遞到相機534。多頻帶二向色鏡538可以包括在各種激發波長下從探針（例如，讀出探針）預期的每個發射波長的通帶。使用單個多頻帶二向色鏡（與多個二向色鏡或可移動二向色鏡相比）可以提供改進的系統穩定性。
相機534可以係高解析度（例如，2048x2048像素）CMOS（例如，科學CMOS）相機，並且可以安裝在物體的中間影像平面處。其他相機類型（例如，CCD）係可能的。當由例如來自微控制器的信號觸發時，來自相機的影像資料可以捕獲，例如，發送到影像處理系統550。因此，相機534可以從樣品收集影像序列。
為了進一步移除殘留的激發光並且最小化激發通道之間的串擾，每個雷射發射波長可以與對應的帶通發射過濾器528a配對。每個過濾器528a可以具有10-50 nm（例如，14-32 nm）的波長。在一些實現方式中，例如，若探針的螢光材料具有長拖尾光譜輪廓，則過濾器與由激發產生的探針的螢光材料的頻寬相比較窄。
過濾器安裝在可藉由致動器旋轉的高速過濾器輪528上。過濾器輪528可以安裝在無限遠空間以最小化成像路徑中的光學像差。在經過過濾器輪528的發射過濾器之後，清潔的螢光信號可以藉由管透鏡再聚焦並且藉由相機534捕獲。二向色鏡538可以位於物鏡538與過濾器輪528之間的光路中。
為了促進系統的高速、同步操作，控制系統540可以包括兩個微控制器544、546，該等微控制器用於以協調方式將觸發信號（例如，TTL信號）發送到螢光顯微鏡520的部件。第一微控制器544直接由電腦542運行，並且觸發過濾器輪528的致動器528b切換不同顏色通道處的發射過濾器528a。第一微控制器544或電腦542可以觸發第二微控制器546，該微控制器將數位信號發送到光源522以便控制將哪個波長的光傳遞到樣品502。例如，第二微控制器546可以將開/關信號發送到光源522的獨立雷射模組，以控制哪個雷射模組係主動的，並且因此控制哪個波長的光用於激發光。在完成切換到新的激發通道之後，第二微控制器546控制壓電平台518b的馬達以選擇成像高度。最後，第二微控制器546將觸發信號發送到相機534用於影像獲取。
在電腦542與mFISH設備500的裝置部件之間的通信藉由控制軟體協調。此控制軟體可以將所有裝置部件的驅動器整合到單個框架中，並且因此可以允許使用者將成像影像作為單一儀器操作（而不是必須分別控制許多裝置）。
控制軟體支援顯微鏡的交互操作及成像結果的即時可視化。此外，控制軟體可以提供允許使用者設計及自動化其成像工作流的程式設計介面。一組預設工作流腳本可以用腳本語言指定。
在一些實現方式中，控制系統540經配置為（亦即，藉由控制軟體及/或工作流腳本）按以下順序（從最內迴路到最外迴路）獲取迴路中的螢光影像（亦簡稱為「收集的影像」或簡稱為「影像」）：z軸、顏色通道、橫向位置、及試劑。
此等迴路可藉由下文表1中的偽碼表示。
表 1 ：示例控制系統迴路偽碼
for h = 1:N_hybridization     % multiple hybridizations     for f = 1:N_FOVs         % multiple lateral field-of-views         for c = 1:N_channels             % multiple color channels             for z = 1:N_planes                 % multiple z planes                 Acquire image(h, f, c, z);             end % end for z         end % end for c     end  % end for f end % end for h
對於z軸迴路，控制系統540導致平台518步進穿過多個垂直位置。因為平台518的垂直位置藉由壓電致動器控制，調節位置所需的時間較少，並且此迴路中的每個步驟可以極快。
首先，樣品可以足夠厚，例如，幾微米，使得穿過樣品的多個影像平面可能係期望的。例如，可以存在多層單元，或甚至在單元內，可能存在基因表示的垂直變化。此外，對於薄樣品，焦平面的垂直位置可能例如歸因於熱漂移而事先未知。此外，樣品502可在流動單元510內垂直地漂移。在多個Z軸位置處的成像可以確保厚樣品中的大部分單元被覆蓋，並且可以幫助識別薄樣品中的最佳焦點位置。
對於顏色通道迴路，控制系統540導致光源522步進穿過不同波長的激發光。例如，激活雷射模組中的一個，使其他雷射模組停用，並且旋轉發射過濾器輪528以將適當的過濾器帶入樣品502與相機534之間的光的光學路徑中。
對於橫向位置，控制系統540導致光源522步進穿過不同橫向位置，以便獲得樣品的不同視場(FOV)。例如，在迴路的每個步驟處，可以驅動支撐平台518的線性致動器以橫向偏移平台。在一些實現方式中，選擇控制系統540的步數及橫向運動，使得累積的FOV覆蓋整個樣品502。在一些實現方式中，選擇橫向運動，使得FOV部分重疊。
對於試劑，控制系統540導致mFISH設備500步進穿過多個不同的可用試劑。例如，在迴路的每個步驟處，控制系統540可以控制閥514以將流動單元510連接到沖洗流體512b，導致泵516在第一時間段內將沖洗流體穿過單元抽吸以沖洗當前試劑，隨後控制閥514以將流動單元510連接到不同的新試劑，並且隨後在第二時間段內將新試劑穿過單元抽吸，該第二時間段足以將新試劑中的探針結合到適當的RNA序列。因為需要一些時間來沖洗流動單元及使新試劑中的探針結合，調節試劑所需的時間可以比製程中的其他步驟所需的時間長，例如，與調節橫向位置、顏色通道或z軸相比。
因此，對於z軸、顏色通道（激發波長）、橫向FOV、及試劑的可能值的每個組合，獲取螢光影像。因為最內部迴路具有最快的調節時間，並且連續環繞的迴路具有連續較慢的調節時間，此配置可以提供最時間有效的技術以獲取此等參數的值的組合的影像。
資料處理系統550用於處理影像並且確定基因表表示以產生空間轉錄組資料。至少，資料處理系統550包括資料處理裝置552（例如，由儲存在電腦可讀取媒體上的軟體控制的一或多個處理器）及接收由相機534獲取的影像的本端儲存裝置554（例如，非揮發性電腦可讀取媒體）。例如，資料處理裝置552可以係安裝有GPU處理器或FPGA板的工作站。資料處理系統550亦可以經由網路連接到遠端儲存器556，例如，經由網際網路連接到雲端儲存器。
資料處理系統550可以如下文更詳細描述地處理影像。例如，資料處理系統550可以執行一或多個步驟以將來自不同FOV的影像拼接在一起。
在一些實現方式中，隨著接收到影像，資料處理系統550執行即時影像處理。特定而言，儘管正在進行資料獲取，資料處理裝置552可以執行影像預處理步驟，諸如濾波及反摺積，該等步驟可以對儲存裝置554中的影像資料執行，但不需要整個資料集。因為濾波及反摺積可以係資料處理管線中的主要瓶頸，隨著發生影像獲取的預處理可以顯著縮短離線處理時間並且因此改進處理量。 影像捕獲製程
第6圖係用於配準第一影像及第二影像的製程600的流程圖。例如，製程600可以藉由參考第5圖描述的mFISH設備500（例如，mFISH系統）使用。
mFISH系統接收支撐件上的生物樣品(602)。操作人員可以將樣品放置在mFISH系統中的支撐件上。例如，如上文描述，mFISH系統接收流動單元510上的樣品502。樣品，例如，作為RNA或DNA的部分（或第一靶向探針，例如，作為結合到樣品的靶向探針的讀出部分的部分），具有第一核苷酸序列。樣品，例如，作為RNA或DNA的部分（或第二靶向探針，例如，作為結合到樣品的第二靶向探針的讀出部分的部分），具有第二核苷酸序列。
mFISH系統接收支撐件上的複數個珠(604)。每個珠具有複數個結合位點。複數個結合位點的第一子集包括第一核苷酸序列。複數個結合位點的第二子集包括第二核苷酸序列。珠可以係如上文更詳細描述的基準標記。例如，複數個珠中的每個珠可以係對準珠，諸如參考第1圖描述的對準珠100。
mFISH系統將樣品及複數個珠暴露於第一複數個第一探針(606)。每個第一探針具有螢光材料及互補的第一核苷酸序列，使得互補的第一核苷酸序列結合到珠上的第一核苷酸序列及樣品中或靶向探針中的第一核苷酸序列。例如，mFISH系統可以將樣品及複數個珠暴露於第一複數個第一讀出探針。探針可以係讀出探針，諸如上文更詳細描述的彼等。
在一些實例中，第一探針的每一者結合到珠或樣品的任一者。在一些實現方式中，僅第一探針的子集結合到珠或樣品中的一者。在此等實現方式中，一些第一探針可能不結合到珠或樣品。
mFISH系統獲得樣品及複數個珠的第一影像(608)。例如，mFISH系統將樣品及支撐件定位在第一位置，並且使用如上文更詳細描述的相機獲得第一影像。隨後，mFISH系統獲得描繪樣品及複數個珠兩者的第一影像。第一影像可以具有第一z軸位置、第一顏色通道、及第一橫向位置。第一橫向位置可以包括第一x軸位置、及第一y軸位置。
如上文更詳細描述，mFISH系統可以使用不同顏色通道來獲得不同影像。例如，mFISH系統可以從多個顏色通道中的第一顏色通道處獲得第一影像，並且在第二不同的顏色通道處獲得第二影像。
作為獲得影像的製程的部分，mFISH系統可以激發探針中的螢光團。mFISH系統可以藉由將由激發源（諸如螢光顯微鏡設備）產生的信號發送到螢光團中來激發螢光團，該信號激發螢光團並且導致螢光團發射螢光信號。mFISH系統可以使用相機來獲得描繪藉由第一探針中的螢光團發射的螢光信號的影像。
第一影像可以描繪複數個珠的全部或子集、樣品的全部或一部分、或兩者的資料。例如，第一影像可以描繪珠的兩個或三個及樣品的一部分的資料。
mFISH系統沖洗複數個探針(610)。例如，如上文描述，mFISH系統可以使用沖洗流體來沖洗複數個探針。沖洗製程可以從支撐件沖洗複數個探針中的所有探針。在一些實例中，沖洗製程從支撐件移除複數個探針中的一些探針，但並不移除複數個探針中的所有探針。此可以在沖洗製程從尚未結合到珠之一或樣品的支撐件移除探針時發生。
在一些實現方式中，替代沖洗製程或作為沖洗製程的部分，mFISH系統可以對樣品、珠、探針、或此等的兩個或多個的組合進行光漂白。例如，如上文更詳細描述，mFISH系統可以對樣品進行光漂白。對樣品進行光漂白亦可以導致支撐件上的珠、探針、或兩者的光漂白。
mFISH系統使樣品及複數個珠與第二複數個第二探針接觸。每個第二探針具有螢光材料及互補的第二核苷酸序列，使得互補的第二核苷酸序列結合到珠上的第二核苷酸序列及樣品中或第二靶向探針中的第二核苷酸序列(612)。第二探針係與第一探針不同的探針。第一及第二複數個可以係相同的數量或不同的數量。第二探針可以係讀出探針，諸如上文更詳細描述的讀出探針。
在一些實例中，第二探針的每一者結合到珠或樣品的任一者。在一些實現方式中，僅第二探針的子集結合到珠或樣品中的一者。在此等實現方式中，一些第二探針可能不結合到珠或樣品。
mFISH系統獲得樣品及複數個珠的第二影像(614)。例如，mFISH系統使用相機來獲得第二影像。mFISH系統獲得描繪樣品及複數個珠兩者的第二影像。第二影像可以描繪複數個珠的全部或子集、樣品的全部或一部分、或兩者的資料。例如，第二影像可以描繪珠的兩個或三個及樣品的一部分的資料。
mFISH系統使用第二顏色通道來獲得第二影像。第二顏色通道可以係與第一顏色通道相同的顏色通道。第二顏色通道可以係與第一顏色通道不同的顏色通道。
第二影像具有第二z軸位置、及第二橫向位置。第二橫向位置具有第二x軸位置及第二y軸位置。第二z軸位置可以係與第一z軸位置相同的z軸位置。
在一些實例中，當橫向位置係二維的時，第一橫向位置及第二橫向位置可以部分重疊，例如，用於拼接製程，或完全重疊，例如，用於配準製程。在此等實例中，第一影像及第二影像皆可以描繪複數個珠的至少一個的資料。例如，第一影像及第二影像皆可以描繪第一珠的資料。第一影像可以描繪未在第二影像中描繪的兩個其他珠的資料。第二影像可以描繪未在第一影像中描繪的三個其他珠的資料。
第一影像及第二影像可以各自描繪樣品的不同部分。樣品的不同部分可以重疊，同時不係樣品的完全相同部分。
mFISH系統偵測珠在第一影像及第二影像中的位置(616)。例如，mFISH系統可以偵測如上文更詳細描述並且參考第7圖中的步驟708的珠的位置。
儘管在不同的橫向位置處捕獲第一影像及第二影像，並且不同探針結合到第一珠，mFISH系統可以使用表示附接到第一珠的探針的來自第一影像及第二影像的資料來偵測第一珠的位置。mFISH系統可以確定第一珠使用任何適當製程在第一影像及第二影像兩者中描繪。例如，mFISH系統可以確定在兩個影像的每一者中描繪的特徵。mFISH系統可以使用所描述的第一珠的性質、及在第一影像及第二影像兩者中描繪的第一珠附近的特徵，以確定兩個影像皆描繪相同珠。
mFISH系統基於所偵測的位置執行第一影像及第二影像的配準(618)。例如，mFISH系統可以配準第一影像及第二影像，如下文更詳細描述，例如，參考下文第7圖中的步驟708。
上文描述的製程600中的步驟順序僅係說明性的，並且配準第一影像及第二圖係可以不同順序執行。例如，mFISH系統可以提供支撐件上的複數個珠，並且隨後提供支撐件上的生物樣品。
在一些實現方式中，製程600可以包括額外步驟、較少步驟、或可以分為多個步驟的一些步驟。例如，mFISH系統可以執行來自參考下文第7圖描述的製程700的一或多個步驟。 影像拼接製程
第7圖示出了資料處理製程700的流程圖，其中處理在已經獲取所有影像之後執行。儘管將製程700描述為在已經獲取所有影像之後執行，製程700中的一或多個步驟可以在已經獲取所有影像之前執行。例如，可以執行步驟703、步驟704、步驟706、或此等步驟的組合用於一或多個第一影像，而資料處理系統（例如，影像處理設備）繼續獲取一或多個第二影像。
製程700開始於資料處理系統接收原始影像檔案及支援檔案（步驟702）。特定而言，資料處理系統可以從相機接收完整的原始影像集合，例如，用於z軸、顏色通道（激發波長）、橫向FOV、及試劑的可能值的每個組合的影像。
收集的影像可以在更密集處理之前經歷一或多個品質度量（步驟703），以便篩除品質不足的影像。取決於資料處理系統的參數，僅滿足品質度量的影像可以被傳遞用於進一步的處理。此可以顯著減少資料處理系統上的處理負載。例如，銳度品質值可以針對每個收集的影像確定以偵測聚焦失敗。作為另一實例，為了偵測所關注的區域，亮度品質值可以針對每個收集的影像確定。
接下來，可以處理一些影像以移除實驗偽像（步驟704）。由於每個RNA分子將在不同的激發通道處與探針雜交多次，跨多通道、多輪影像堆疊的嚴格校準可以有益於揭示整個FOV上方的RNA身份。移除實驗偽像可以包括場平坦化及/或色差校正。在一些實現方式中，場平坦化在色差校正之前執行。
可以處理一或多個影像以提供RNA影像斑點銳化（步驟706）。RNA影像斑點銳化可以包括應用過濾器以移除細胞背景及/或用點擴散函數反摺績以銳化RNA斑點。
配準具有相同FOV的影像以校準其中的特徵，例如，細胞或細胞器（步驟708）。為了準確地識別影像序列中的RNA種類，例如，將不同輪的影像中的特徵校準到子像素精度。來自不同輪影像的影像可以各自具有不同的顏色通道。例如，對於在第一輪成像期間使用的第一探針，一個影像可以在第一螢光材料的第一顏色通道處捕獲，而對於在第二輪成像期間使用的第二探針，另一影像可以在第二不同的螢光材料的第二不同的顏色通道處捕獲。
然而，由於mFISH樣品在水相中成像並且藉由機動平台來回移動，在數小時長的成像製程中的樣品漂移及平台漂移可以轉變成影像特徵漂移，若不加以處理，此可以破壞轉錄組分析。換言之，即時假設螢光顯微鏡與流動單元或支撐件的精確可重複對準，樣片可能不再處於稍後影像中的相同位置，此可以將錯誤引入解碼中或簡單地使解碼不可能。
資料處理設備可以藉由將基準標記（例如，螢光珠）放置在載玻片上的載體材料內來配準影像。通常，樣品及基準標記珠將大致一致地移動。資料處理設備可以基於其大小及形狀來識別影像中的此等珠。珠位置的比較可以使資料處理設備能夠配準兩個影像，例如，計算兩個影像之間的仿射轉換。
作為此製程的部分，資料處理設備可以使用珠的特徵、珠周圍的樣品的部分的特徵、或兩者，以偵測多個影像中描繪的珠。多個影像可以係在不同處理輪次期間捕獲的影像。資料處理設備可以隨後使用此等特徵來確定描繪相同珠的影像。資料處理設備可以隨後配準描繪相同珠的影像，例如，如上文更詳細描述。
視情況，在配準之後，遮罩可以針對每個收集的影像計算。簡而言之，每個像素的強度值與閾值進行比較。若強度值高於閾值，則將遮罩中的對應像素設置為1，並且若強度值低於閾值，則設置為0。閾值可以係根據經驗確定的值，例如，預定值，或可以根據影像中的強度值計算。通常，遮罩可以對應於樣品內的單元位置；單元之間的空間不應當發螢光並且應當具有低強度。
在配準FOV中的影像之後，可以執行空間轉錄組分析（步驟710）。
FOV標準化可以在空間轉錄組分析之前執行，以便使直方圖更一致。在一些實現方式中，FOV標準化在配準之後發生。或者，FOV標準化可以在配準之前發生。FOV標準化應當被認為係濾波的部分。
在標準化之後，影像堆疊可以評估為像素字的二維矩陣，作為解碼每個像素的製程的一部分。矩陣可以具有P列（其中P=X*Y）、及B行，其中B係針對給定FOV（例如，N_雜化*N_通道）的堆疊中的影像的數量。每列對應於像素（跨堆疊中的多個影像的相同像素）之一，來自該列的值提供像素字。每行提供字中的值之一，亦即，來自該像素的影像層的強度值。值可以標準化，例如，在0與I MAX之間變化。I MAX可以具有值1。
若將所有像素傳遞到解碼步驟，則所有P個字將如下文描述般處理。然而，單元邊界外側的像素可以藉由二維遮罩屏蔽掉並且不被處理。結果，計算負載可以在以下分析中顯著降低。
資料處理系統550可以儲存用於解碼影像資料以識別特定像素處表示的基因的代碼簿。代碼簿可以包括多個參考代碼字，每個參考代碼字與特定基因相關聯。代碼簿可以表示為具有G列及B行的二維矩陣，其中G係代碼字的數目，例如，基因的數目（儘管相同的基因可以藉由多個代碼字表示）。每列可以對應於參考代碼字之一，並且每行可以提供參考代碼字中的值之一，如藉由已知基因的預先校準及測試所建立。對於每行，參考代碼中的值可以係二進制的，亦即，「開」或「關」。例如，每個值可以係0或I MAX，例如，1。
對於要解碼的每個像素，距離d(p,i)在像素字與每個參考代碼字之間計算。例如，在像素字與參考代碼字之間的距離可以計算為歐幾里得(Euclidean)距離，例如，在像素字中的每個值與參考代碼字中的對應值之間的平方差之和。此計算可以表示為：
Figure 02_image001
其中I p,x係來自像素字的矩陣的值，並且C i,x係來自參考代碼字的矩陣的值。可以使用其他度量（例如，差的絕對值之和、餘弦角、相關性等）替代歐幾里得距離。
一旦針對給定像素計算每個代碼字的距離值，確定最小距離值，提供最小距離值的代碼字經選擇為最佳匹配代碼字。換言之，資料處理設備確定min(d(p,1),d(p,2),…d(p,B))，並且將值b確定為針對提供最小值的i（在1與B之間）的值。例如，對應於該最佳匹配代碼字的基因從查詢表中確定，該查詢表將代碼字與基因相關聯，並且將像素標記為表示該基因。
資料處理設備可以過濾掉錯誤標註。過濾掉錯誤標註的一種技術係丟棄標籤，其中指示基因表示的距離值d(p,b)大於閾值，例如，若d(p,b)＞D1 MAX。
用於過濾錯誤標註的又一種技術係在計算的位元比率BR低於閾值的情況下拒絕代碼字。將位元比率計算為來自影像字（該影像字用於被認為係接通的層（如由代碼字確定））的強度值的平均值除以影像字（該影像字用於被認為係斷開的層（同樣由代碼字確定））的強度值的平均值。
將位元比率BR與閾值TH BR進行比較。在一些實現方式中，閾值TH BR係由先前量測經驗地確定的。然而，在一些實現方式中，閾值TH BR可以基於從樣品獲得的量測來針對特定代碼字自動地計算。
用於過濾錯誤標註的又一種技術係在計算的位元亮度BB低於閾值的情況下拒絕代碼字。將位元亮度計算為來自影像字的強度值的平均值，該影像字用於被認為係接通的層（由代碼字確定）。
將位元亮度BB與閾值TH BB進行比較。在一些實現方式，閾值TH BB係由先前量測經驗地確定的。然而，在一些實現方式中，閾值TH BB係基於從樣品獲得的量測來針對特定代碼字自動地計算。
資料處理設備可以執行最佳化及重解碼（步驟712）。最佳化可以包括解碼參數的基於機器學習的最佳化，接著使用更新的解碼參數來更新空間轉錄組分析。此循環可以重複直到解碼參數已經穩定。
解碼參數的最佳化可以使用優值函數，例如，FPKM/TPM相關性、空間相關性、或置信比率。可以作為變量包括在優值函數中的參數包括用於移除細胞背景的過濾器的形狀（例如，頻率範圍的開始及結束等）、用於銳化RNA斑點的點擴散函數的數值孔徑值、用於FOV的標準化的分位數邊界Q、位元比率閾值TH BR、位元亮度閾值TH BB（或用於確定位元比率閾值TH BR及位元亮度閾值TH BB的分位數）、及/或像素字可以被認為匹配代碼字的最大距離D1 MAX。
此優值函數可係有效的不連續函數，因此習知的梯度跟蹤演算法可能不足以識別最佳參數值。機器學習模型可以用於收斂參數值。
接下來，資料處理設備可以執行跨所有FOV的參數值的統一。因為獨立地處理每個FOV，每個場可以經歷不同的標準化、閾值處理、濾波設置、或此等的兩個或多個的組合。結果，高對比影像可以導致具有變化的直方圖，該變化導致安靜區域中的錯誤正標註。統一的結果係所有FOV使用相同的參數值。此可以從安靜區域中的背景雜訊中顯著移除標註，並且可以在大取樣區域中提供清晰且無偏差的空間圖案。
各種途徑可能選擇將跨所有FOV使用的參數值。一個選項係簡單地拾取預定的FOV，例如，第一量測的FOV或在樣品中心附近的FOV，並且使用該預定FOV的參數值。另一選項係跨多個FOV對參數的值進行平均，並且隨後使用平均值。另一選項係確定哪個FOV導致其像素字與標記的代碼字之間的最佳擬合。例如，可以確定並且隨後選擇在標記的代碼字與彼等代碼字的像素字之間具有最小平均距離d(p,b1)的FOV。
資料處理設備可以執行拼接及分割（步驟714）。拼接將多個FOV組合呈單個影像。拼接可以使用各種技術執行。一種途徑係，針對將一起形成樣品的組合影像的每一列FOV及該列內的每個FOV，確定每個FOV的水平偏移。一旦計算了水平偏移，就針對FOV的每列計算垂直偏移。水平及垂直偏移可以基於交叉相關性（例如，相位相關）來計算。利用每個FOV的水平及垂直偏移，單個組合的影像可以產生，並且基因坐標可以基於水平及垂直偏移來轉移到組合的影像。
可以添加基因在組合的螢光影像中的特定坐標處表示的指示（如由FOV中的坐標及該FOV的水平及垂直偏移確定），例如，作為元資料。此指示可以稱為「標註」。
染色影像（例如，DAPI影像）可以拼接在一起以產生組合的染色影像。在一些實現方式中，不必從收集的螢光影像建立組合的螢光影像；一旦確定每個FOV的水平及垂直偏移，就可以計算組合的染色影像內的基因坐標。染色影像可以配準到收集的螢光影像。可以添加基因在組合的染色影像中的特定坐標處表現的指示（如由FOV中的坐標及該FOV的水平及垂直偏移確定），例如，作為元資料，用於提供標註。
拼接的影像中仍存在潛在問題。特定而言，一些基因可在重疊區域中雙計數。為了移除雙計數，距離（例如，歐幾里得距離）可以在標記為表示基因的每個像素與標記為表示相同基因的其他附近像素之間計算。若距離低於閾值，則可以移除標註之一。若將像素群集標記為表示基因，則可以使用更複雜的技術。
將組合的影像（例如，染色細胞的影像）分割為對應於細胞的區域可以使用各種已知技術來執行。分割通常在拼接影像之後執行，但可以在將標註添加到組合的影像之前或之後發生。
具有指示基因表示位置的標註的分割影像現在可以儲存及呈現給使用者用於分析，例如，在視覺顯示器上。
儘管上文的論述假設對於每個FOV使用單個z軸影像，此不係必須的。來自不同z軸位置的影像可以分別處理；不同z軸位置有效地提供新的FOV集合。
本說明書使用術語「配置」與系統及電腦程式部件結合。對於一或多個電腦的系統經配置為執行特定操作或動作，意味著系統已經在其上安裝在操作中導致系統執行該等操作或動作的軟體、韌體、硬體、或其等的組合。對於一或多個電腦程式經配置為執行特定操作或動作，意味著一或多個程式包括當由資料處理設備執行時導致該設備執行該等操作或動作的指令。
本說明書中描述的標的及功能操作的實施例可以在數位電子電路系統中、在有形體現的電腦軟體或韌體中、在電腦硬體（包括在本說明書中揭示的結構及其結構均等物）中、或其等的一或多個的組合中實現。本說明書中描述的標的的實施例可以作為一或多個電腦程式實現，亦即，在有形的非暫時性儲存媒體上編碼的電腦程式指令的一或多個模組，用於由資料處理設備執行或控制資料處理設備的操作。電腦儲存媒體可以係機器可讀取儲存裝置、機械可讀取儲存基板、隨機或串列存取記憶體裝置、或其等的一或多個的組合。替代地或此外，程式指令可以在人工生成的傳播信號（例如，機器生成的電氣、光學、或電磁信號）上編碼，該信號經生成以編碼資訊，用於傳輸到適當的接收器設備用於由資料處理設備執行。
術語「資料處理設備」指資料處理硬體並且涵蓋用於處理資料的所有種類的設備、裝置及機器，藉由實例的方式包括可程式設計處理器、電腦、或多個處理器或電腦。設備亦可以係或進一步包括專用邏輯電路，例如，FPGA（現場可程式設計閘陣列）或ASIC（特殊應用積體電路）。除了硬體之外，設備可以視情況包括建立電腦程式的執行環境的代碼，例如，構成處理器韌體、協定堆疊、資料庫管理系統、作業系統、或其等的一或多個的組合的代碼。
電腦程式（亦可稱為或描述為程式、軟體、軟體應用、應用程式、模組、軟體模組、腳本、或代碼）可以任何形式的程式設計語言寫入，包括編譯或解釋語言、或者聲明性或程式性語言；並且其可以任何形式部署，包括作為獨立式程式或作為適用於在計算環境中使用的模組、部件、子常式、或其他單元。程式可能但不必對應於檔案系統中的檔案。程式可以儲存在保存其他程式或資料（例如，儲存在標記語言文檔中的一或多個腳本）的檔案的一部分中、專用於所論述的程式的單個檔案中、或多個協同檔案（例如，儲存一或多個模組、子程式、或代碼部分的檔案）中。電腦程式可以經部署為在一個電腦上或在多個電腦上執行並且藉由資料通信網路互連，該等電腦位於一個位點處或跨多個位點分佈。
本說明書中描述的製程及邏輯流程可以藉由一或多個可程式設計電腦執行，該等可程式設計電腦執行一或多個電腦程式以藉由對輸入資料進行操作並且生成輸出來執行功能。製程及邏輯流程亦可以藉由專用邏輯電路系統（例如，FPGA或ASIC）、或藉由專用邏輯電路系統及一或多個程式設計的電腦的組合來執行。
適用於執行電腦程式的電腦可以基於通用或專用微處理器或兩者、或任何其他種類的中央處理單元。通常，中央處理單元將從唯讀記憶體或隨機存取記憶體或兩者接收指令及資料。電腦的基本元件係用於進行或執行指令的中央處理單元及用於儲存指令及資料的一或多個記憶體裝置。中央處理單元及記憶體可以藉由專用邏輯電路系統補充或整合到專用邏輯電路系統中。通常，電腦亦將包括用於儲存資料的一或多個大容量儲存裝置（例如，磁碟、磁光碟、或光碟），或可操作地耦合以從該等大容量儲存裝置接收資料或將資料傳送到該等大容量儲存裝置，或兩者。然而，電腦不需要具有此種裝置。
適用於儲存電腦程式指令及資料的電腦可讀取媒體包括所有形式的非揮發性記憶體、媒體及記憶體裝置，藉由實例的方式包括半導體記憶體裝置，例如，EPROM、EEPROM、及快閃記憶體裝置；磁碟，例如，內部硬碟或可移除碟；磁光碟；以及CD-ROM及DVD-ROM碟。
為了提供與使用者的交互，本說明書中描述的標的的實施例可以在電腦上實現，該電腦具有用於向使用者顯示資訊的顯示裝置，例如，CRT（陰極射線管）或LCD（液晶顯示器），以及使用者可以藉其向電腦提供輸入的鍵盤及指向裝置，例如，滑鼠或軌跡球。其他種類的裝置亦可以用於提供與使用者的交互；例如，提供給使用者的反饋可以係任何形式的感覺反饋，例如，視覺反饋、聽覺反饋、或觸覺反饋；以及來自使用者的輸入可以任何形式接收，包括聲音、語音、或觸覺輸入。此外，電腦可以藉由向使用者使用的裝置發送文檔並且從該裝置接收文檔來與使用者交互；例如，藉由回應於從web瀏覽器接收的請求來向使用者的裝置上的web瀏覽器發送web頁面。此外，電腦可以藉由向個人裝置（例如，運行消息傳送應用的智慧電話）發送文本訊息或其他形式的訊息，以及繼而從使用者接收回應訊息來與使用者交互。
用於實現機器學習模型的資料處理設備亦可以包括例如專用硬體加速器單元，用於處理機械學習訓練或生產（亦即，推斷、工作負載）的通用及電腦密集部分。
機器學習模型可以使用機器學習框架（例如，TensorFlow框架、Microsoft Cognitive Toolkit框架、Apache Singa框架、或Apache MXNet框架）來實現及部署。
本說明書中描述的標的的實施例可以在計算系統中實現，該計算系統包括後端部件（例如，作為資料伺服器），或包括中間軟體部件（例如，應用伺服器），或包括前端部件（例如，具有圖形使用者介面、web瀏覽器、或使用者可以經由其與本說明書中描述的標的的實現方式交互的應用程式的用戶端電腦）、或一或多個此種後端、中間軟體、或前端部件的任何組合。系統部件可以藉由數位資料通訊的任何形式或媒體（例如，通信網路）來互連。通信網路的實例包括區域網路(local area network; LAN)及廣域網路(wide area network; WAN)，例如，網際網路。
儘管本說明書含有許多具體實現方式細節，此等不應當被解釋為限制任何發明的範圍或可能要求保護的範圍，而應解釋為可特定於特定發明的特定實施例的特徵的描述。在分離的實施例的上下文中在本說明書中描述的某些特徵亦可以在單個實施例中組合實現。相反地，在單個實施例的上下文中描述的各個特徵亦可以在多個實施例中分別實現或以任何適宜的子組合來實現。此外，儘管特徵可在上文描述為在某些組合中起作用，並且甚至最初被如此要求保護，來自要求包含的組合的一或多個特徵可以在一些情況下從組合中刪除，並且要求保護的組合可涉及子組合或子組合的變化。
類似地，儘管操作在附圖中描繪並且在申請專利範圍中以特定順序記載，此不應當被理解為要求以所示的特定順序或以相繼順序執行此種操作，或要求執行所有示出的操作以實現期望的結果。在某些情況下，多任務及並行處理可能係有利的。此外，上文描述的實施例中的各種系統模組及部件的分離不應理解為在所有實施例中要求此種分離，並且應當理解，所描述的程式部件及系統可以通常在單個軟體產品中整合在一起或封裝到多個軟體產品中。
已經描述了標的的特定實施例。其他實施例係在以下申請專利範圍的範疇內。例如，在申請專利範圍中記載的動作可以不同順序執行並且仍實現期望的結果。作為一個實例，在附圖中描繪的製程不必要求所示的特定順序、或相繼順序以實現期望的結果。在一些情況下，多任務及並行處理可能係有利的。
100:對準珠 102a:結合位點 102b:結合位點 104a:讀出探針 104b:讀出探針 104c:讀出探針 104d:讀出探針 104e:讀出探針 104f:讀出探針 500:多工螢光原位雜交(mFISH)成像及影像處理設備 502:樣品 510:流動單元 512:雜交試劑源 512a:試劑 512b:沖洗流體源 514:閥 516:泵 518:平台 518a:線性致動器 518b:Z驅動致動器 519:化學廢物管理子系統 520:螢光顯微鏡 522:激發光源 524:顯微鏡主體 528:過濾器輪 522a:雷射模組 528a:過濾器 528b:致動器 530:激發光 532:螢光 534:相機 536:高數值孔徑(NA)物鏡 538:多頻帶二向色鏡 540:控制系統 542:電腦 544:微控制器 546:微控制器 550:影像處理系統 552:資料處理裝置 554:本端儲存裝置 556:遠端儲存器 600:製程 602:步驟 604:步驟 606:步驟 608:步驟 610:步驟 612:步驟 614:步驟 616:步驟 618:步驟 700:製程 702:步驟 703:步驟 704:步驟 706:步驟 708:步驟 710:步驟 712:步驟 714:步驟
第1圖係描繪了用九個不同結合位點官能化並且用不同顏色染料的三個探針標記的對準珠。
第2圖係相繼用六個不同探針標記的樣品的代表性螢光顯微影像，單個顏色的每一者使用1 μm直徑的對準珠作為基準標記。
第3圖係針對五輪雜交用三個探針標記的1 μm直徑的對準珠相繼獲取的代表性螢光顯微影像。
第4圖係針對六輪雜交用三個探針標記的200 nm直徑的對準珠相繼獲取的代表性螢光顯微影像。
第5圖描繪了多工螢光原位雜交(mFISH)成像及影像處理設備。
第6圖係用於配準第一影像及第二影像的製程的流程圖。
第7圖示出了資料處理製程的流程圖，其中處理在已經獲取影像之後執行。
國內寄存資訊(請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無 國外寄存資訊(請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無
500:多工螢光原位雜交(mFISH)成像及影像處理設備
502:樣品
510:流動單元
512:雜交試劑源
512a:試劑
512b:沖洗流體源
514:閥
516:泵
518:平台
518a:線性致動器
518b:Z驅動致動器
519:化學廢物管理子系統
520:螢光顯微鏡
522:激發光源
524:顯微鏡主體
528:過濾器輪
522a:雷射模組
528a:過濾器
528b:致動器
530:激發光
532:螢光
534:相機
536:高數值孔徑(NA)物鏡
538:多頻帶二向色鏡
540:控制系統
542:電腦
544:微控制器
546:微控制器
550:影像處理系統
552:資料處理裝置
554:本端儲存裝置
556:遠端儲存器

Claims (25)

  1. 一種用於確定一生物樣品內的一生物分析物的相對位置的方法，該方法包含以下步驟： 在一支撐件上接收一生物樣品，該樣品具有一第一核苷酸序列及一第二核苷酸序列或具有結合到該樣品上的靶向的核苷酸序列的第一及第二複數個靶向探針，其中該第一複數個靶向探針具有該第一核苷酸序列並且該第二複數個靶向探針具有該第二核苷酸序列； 在該支撐件上接收複數個珠，每個珠具有複數個結合位點，該複數個結合位點的一第一子集包括該第一核苷酸序列並且該複數個結合位點的一第二子集包括該第二核苷酸序列； 將該樣品及該複數個珠暴露於第一複數個第一探針，每個第一探針具有一螢光團及一互補的第一核苷酸序列，使得該互補的第一核苷酸序列結合到該等珠上的該等第一核苷酸序列及該樣品中或該第一複數個靶向探針中的該等第一核苷酸序列； 獲得該樣品及該複數個珠的一第一影像； 使該第一複數個第一探針停用； 使該樣品及該複數個珠與第二複數個第二探針接觸，每個第二探針具有一螢光團及一互補的第二核苷酸序列，使得該互補的第二核苷酸序列結合到該等珠上的該第二核苷酸序列及該樣品中或該第二複數個靶向探針中的該第二核苷酸序列； 獲得該樣品及該複數個珠的一第二影像； 偵測該複數個珠在該第一影像及該第二影像中的位置；以及 基於所偵測的該等位置執行該第一影像及該第二影像的一配準。
  2. 如請求項1所述之方法，對於配準的該等影像中的複數個像素的每一者，包含以下步驟：基於該第一影像及該第二影像中的該樣品的螢光強度來確定該樣品中的基因的表現。
  3. 如請求項1所述之方法，其中使該第一複數個第一探針停用之步驟包含以下步驟：對該第一複數個第一探針進行光漂白。
  4. 如請求項3所述之方法，其中使該第一複數個第一探針停用之步驟包含以下步驟：沖洗該第一複數個第一探針。
  5. 如請求項1所述之方法，其中該第一影像及該第二影像具有相同的橫向位置。
  6. 如請求項1所述之方法，其中該第一影像及該第二影像具有相同的顏色通道。
  7. 如請求項6所述之方法，其中獲得該第一影像及獲得該第二影像之步驟包括以下步驟：以相同的激發波長激發該第一複數個第一探針及該第二複數個第二探針中的該等螢光團。
  8. 如請求項7所述之方法，其中該第一複數個第一探針中的該等螢光團及第二複數個第二探針的該等螢光團具有相同的材料組成。
  9. 如請求項1所述之方法，其中該樣品具有一第三核苷酸序列及一第四核苷酸序列或者具有結合到該樣品上的靶向核苷酸序列的第三及第四複數個靶向探針，其中該第三複數個靶向探針具有該第三核苷酸序列並且該第四複數個靶向探針具有該第四核苷酸序列。
  10. 如請求項9所述之方法，包含以下步驟： 在使該第一複數個第一探針停用之前， 將該樣品及該複數個珠暴露於第三複數個第三探針，每個第三探針具有一螢光團及一互補的第三核苷酸序列，使得該互補的第三核苷酸序列結合到該等珠上的該等第三核苷酸序列及該樣品中或該第三複數個靶向探針中的該等第三核苷酸序列，並且 獲得該樣品及該複數個珠的一第三影像。
  11. 如請求項10所述之方法，其中該第一影像及該第三影像使用不同的顏色通道。
  12. 如請求項11所述之方法，其中該第一複數個第一探針的螢光團及該第三複數個第三探針的螢光團在不同波長下發射。
  13. 如請求項12所述之方法，其中該第一複數個第一探針的螢光團及該第三複數個第三探針的螢光團可以藉由不同激發波長來激發。
  14. 如請求項10所述之方法，包含偵測該複數個珠在該第三影像中的位置，及基於偵測到的該等位置執行該第一影像及該第三影像的一配準。
  15. 如請求項10所述之方法，進一步包含以下步驟 使該第三複數個第三探針停用； 在使該第一複數個第一探針及該第三複數個第三探針停用之後， 使該樣品及該複數個珠與第四複數個第四探針接觸，每個第四探針具有一螢光團及一互補的第四核苷酸序列，使得該互補的第四核苷酸序列結合到該等珠上的該第四核苷酸序列及該樣品中或該第四複數個靶向探針中的該第四核苷酸序列；以及 獲得該樣品及該複數個珠的一第四影像。
  16. 如請求項15所述之方法，其中該第二影像及該第四影像使用不同的顏色通道。
  17. 如請求項16所述之方法，其中該第三影像及該第四影像使用相同的顏色通道。
  18. 如請求項15所述之方法，其中該第二複數個第二探針的螢光團及該第四複數個第四探針的螢光團以不同波長發射及/或藉由不同激發波長來激發。
  19. 如請求項18所述之方法，其中該第三複數個第三探針的螢光團及該第四複數個第四探針的螢光團在相同的波長下發射及/或具有相同的材料組成及/或藉由相同的激發波長激發。
  20. 如請求項15所述之方法，包含以下步驟：偵測該複數個珠在該第四影像中的位置，及基於偵測到的該等位置執行該第一影像及該第四影像的一配準。
  21. 一種用於對一樣品執行一原位螢光雜交測定的方法，該方法包含以下步驟： a)使該樣品與一或多個靶向探針接觸，其中若該樣品中的一分析物存在，則每個靶向探針結合到該分析物； b)使該樣品與複數個基準標記接觸，其中每個基準標記包含複數個結合位點； c)使該樣品與一或多個讀出探針接觸，其中每個讀出探針獨立地包含一螢光部分，並且其中若存在該一或多個靶向探針，則每個讀出探針與該一或多個靶向探針及該複數個結合位點結合，藉此呈現一或多個螢光信號； d)對藉由每個讀出探針產生的該一或多個螢光信號進行成像； e)配準步驟d)中的該影像； f)重複步驟(a)-(e) 0至10次； g)對該樣品進行光漂白；以及 h)獨立地重複步驟(a)-(g) 0至10次。
  22. 如請求項21所述之方法，其中該樣品係來自一人類受試者。
  23. 如請求項22所述之方法，其中該受試者先前已經被診斷患有癌症。
  24. 如請求項21所述之方法，進一步包含以下步驟：在步驟1(a)與1(d)之間洗滌該樣品。
  25. 如請求項21所述之方法，其中針對步驟(f)，將步驟(a)-(e)重複1次至9次，藉此提供總共2輪至10輪的成像。
TW110132205A 2020-08-31 2021-08-31 使用對準珠的多工螢光原位雜合方法 TW202225411A (zh)

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