TWI834999B - 處理來自使用多工式螢光切換的螢光原位雜化的影像 - Google Patents

Abstract

一種電腦程式產品包括指令，該等指令用來使得一個或多個電腦進行以下操作：從螢光原位雜化成像系統獲得相同的雜化步驟中的相同的色彩通道中的第一影像及第二影像，及配準該第一影像及該第二影像。識別在該第一影像中具有超過第一閾值的第一強度且在該第二影像中具有超過第二閾值的第二強度的一個或多個像素，並在第一讀出呼叫中將該一個或多個像素分類為是活化的，且識別在該第一影像中具有超過該第一閾值的該第一強度且在該第二影像中具有小於該第二閾值的該第二強度的一個或多個像素，並在第二讀出呼叫中將該一個或多個像素分類為是活化的。

Description

處理來自使用多工式螢光切換的螢光原位雜化的影像

此說明書與多工式螢光原位雜化成像中的增大的讀出探針組合相關。

生物技術界及製藥工業對開發視覺化及量化生物樣本內的多種生物分析物（例如 DNA、RNA及蛋白質）的方法非常感興趣，例如組織切除、活組織檢查、培養中生長的細胞。科學家使用此類方法來診斷/監測疾病、驗證生物標記及研究治療方法。迄今為止，示例性方法包括用功能域標記的抗體或寡核苷酸（例如RNA或DNA）對生物樣本進行多工成像。

多工式螢光原位雜化（mFISH）成像是一種決定空間轉錄組學中的基因表達的強大技術。簡而言之，將樣本暴露於靶向（target）感興趣的RNA的多個寡核苷酸探針。這些探針具有不同的標記方案，在互補的、螢光標記的探針被引入到樣本時，該等不同的標記方案將允許人們區分不同的RNA種類。然後，藉由暴露於不同波長的激發光來獲得順序輪次的螢光影像。對於每個給定的像素，該像素的來自不同影像的不同激發光波長的螢光強度形成訊號序列。然後，將此序列與來自將每個密碼與基因相關聯的碼本的參考密碼庫進行比較。最佳匹配參考密碼用來識別在影像中的該像素處表達的相關聯基因。

在一個態樣中，一種螢光原位雜化成像的方法包括以下步驟：將樣本暴露於複數個編碼探針；將該樣本暴露於第一複數個第一讀出探針及第二複數個第二讀出探針；在該等第一讀出探針及該等第二讀出探針分別與該等第一編碼探針及該等第二編碼探針結合以便以該第一波長範圍發射光的情況下，獲得該樣本的第一影像；處理該樣本，以便修改該第二複數個第二編碼探針上的該等第二讀出探針；及在該等第一讀出探針與該等第一編碼探針結合以便以該第一波長範圍發射光且該等第二編碼探針實質上不以該第一波長範圍發射光的情況下，獲得該樣本的第二影像。該複數個編碼探針中的每個編碼探針具有編碼部分及雜化部分，該編碼部分靶向該樣本中的核苷酸序列。該第一複數個第一讀出探針中的每個第一讀出探針具有螢光團及第一靶向部分，該螢光團用來以第一波長範圍發射光，該第一靶向部分與該複數個編碼探針中的第一編碼探針中的第一雜化序列結合，且該第二複數個第二讀出探針中的每個第二讀出探針具有螢光團及第二靶向部分，該螢光團用來以該第一波長範圍發射光，該第二靶向部分與該複數個編碼探針中的第二編碼探針中的第二雜化序列結合。

在另一個態樣中，一種電腦程式產品包括指令，該等指令用來使得一個或多個電腦進行以下操作：從螢光原位雜化成像系統獲得樣本的第一色彩通道中的第一影像，在該樣本中，第一讀出探針及第二讀出探針分別與第一編碼探針及第二編碼探針結合，以便都在該第一色彩通道中發射光；從該螢光原位雜化成像系統獲得樣本的該第一色彩通道中的第二影像，在該樣本中，第一讀出探針與該等第一編碼探針結合以便在該第一色彩通道中發射光，且該等第二編碼探針實質上不在該第一色彩通道中發射光；配準該第一影像及該第二影像以形成複數個配準的影像；識別該第一影像中具有超過第一閾值的第一強度且在該第二影像中具有超過第二閾值的第二強度的一個或多個像素，且在第一讀出呼叫中將此類像素分類為是活化的；及識別該第一影像中具有超過該第一閾值的該第一強度且在該第二影像中具有小於該第二閾值的該第二強度的一個或多個像素，且在第二讀出呼叫中將此類像素分類為是活化的。

在另一個態樣中，一種電腦程式產品包括指令，該等指令用來使得一個或多個電腦進行以下操作：儲存碼本，該碼本包括複數個碼字；及從螢光原位雜化成像系統獲得複數個影像切片。每個碼字包括複數個位元及對分析物的相關聯的指示，每個碼字包括與來自相同的雜化步驟內的相同的第一色彩通道對應的多個位元，且該多個位元的不同值組合與不同的分析物對應。來自該複數個影像切片的多個影像切片與來自該相同的雜化步驟內的該相同的色彩通道對應。配準該複數個影像以形成配準影像堆疊。決定包括複數個值的像素字，其中每個強度值與該配準影像堆疊的影像中的配準的像素對應。將該像素字與該複數個碼字中的每個碼字進行比較以尋找最佳匹配的碼字，及決定與該最佳匹配的碼字對應的該分析物。

實施方式的優點可以包括但不限於下列的一者或多者。

在多工式螢光原位雜化（mFISH）成像及處理中，可以實質上增大每輪雜化的資訊容量。特別是，在這些切換模態能夠將讀出探針從開位元切換到關位元（反之亦然）的情況下，可以在每輪雜化獲取附加的影像層而無需螢光漂白或引入及雜化附加的編碼探針。這增大了讀出呼叫位元深度及成像吞吐量。

例如，可以以兩個獨特的讀出探針靶向不同的核苷酸序列，該等讀出探針共用相同的螢光團及色彩通道但具有不同的切換模態。這實現了在切換步驟之後不同的讀出呼叫，這可以增大在每個雜化和螢光漂白步驟之間獲得的資訊量。這可以藉由增大每個耗材試劑的影像獲取來導致更快速的資料獲取並節省成本。

在每個核苷酸序列可以被可切換的讀出探針靶向時，用來以一連串的讀出呼叫識別目標基因的基因碼本也可以獲得更多的容量。例如，16位元碼本基因長度的最大目標數量隨著每個可切換讀出探針被添加到集合而增大。以這種方式，在碼本長度相同且碼字之間的漢明距離（Hamming distance）相同的情況下，每次試驗可以實現更多的目標。

此方法也與具有任何數量的色彩通道的現有mFISH成像系統相容。無論通道的總數如何，該方法都增大了系統中每個通道的位元讀出呼叫潛力。

一或更多個實施例的細節被闡述在附圖及以下的說明中。藉由說明書、附圖及請求項，將理解其他的特徵、態樣及優點。

多工式螢光原位雜化（mFISH）成像是一種強大的技術，其使用僅與編碼探針的共享高度序列互補性的那些部分結合的螢光讀出探針。這允許在單細胞中在它們原生的環境中靶向、成像及量化許多核酸種類及特定基因。

編碼探針可以靶向許多核酸種類中的核苷酸序列，包括組織及細胞中的DNA、mRNA、IncRNA及miRNA。核苷酸序列可以是基因內的序列或跨越多個基因的序列。藉由創建具有與目標基因內的序列互補的核苷酸編碼序列的編碼探針，mFISH允許精確定位的靶向。編碼探針的3'區域及5'區域並不與潛在的目標核苷酸序列共享序列特異性，而是與讀出探針的核苷酸序列互補的工程雜化序列。

mFISH讀出探針包括與螢光團結合的建構的核苷酸序列。每個讀出探針的核苷酸序列（例如靶向序列）靶向及結合到編碼探針的一個工程雜化區域。然後，光源激發螢光團，且以顯微鏡將生成的發射螢光成像。具有不同激發波長及/或具有不同發射波長的多個螢光團容許在讀出探針的單輪雜化之後獲取不同色彩通道中的多個影像。

為了在不增大色彩通道的數量的情況下進一步增大讀出探針的數量，可以將來自上一輪雜化的讀出探針螢光漂白，可以將新的讀出探針集合引入到樣本並與編碼探針雜化，並且可以獲得新一輪的影像。可以重複螢光漂白、雜化及成像步驟多次。

然而，在長的時間尺度（例如＞10分鐘）上發生的步驟可能會限制在雜化的讀出探針的雜化、成像及螢光漂白的連續輪次期間的成像吞吐量。mFISH測量所需的總時間由對全部樣本面積進行成像所需的時間及完成與影像無關的試驗步驟（例如成像之間的雜化步驟）所需的時間組成。例如，高照射強度用來在連續的mFISH輪次之間對螢光訊號進行螢光漂白。必須在可以將新的探針添加到樣本之前對每個雜化探針進行螢光漂白，並且每個讀出探針必須有一孵育（incubation）時間以完全與它們的目標雜化區域雜化。

本文中所揭露的是一種系統，在該系統中，來自雜化的讀出探針的螢光訊號被「切換」，並且樣本在螢光漂白之前被重新成像。讀出探針被設計為使得它們的螢光狀態可以在「切換」步驟內從「開」狀態切換到「關」狀態，反之亦然。藉由在一輪雜化內嵌套一個或多個切換步驟，可以減少成像步驟（例如資料收集）之間的平均時間，並且可以添加進一步的資料多工級別以用於識別碼本內的基因密碼。設計的讀出探針合併了要在不執行附加雜化的情況下在成像輪次之間修改的可切換模態，附加雜化通常是mFISH過程中最長的步驟。

參照圖1，多工式螢光原位雜化（mFISH）成像和影像處理裝置100包括：流動室110，用來保持樣本10；螢光顯微鏡120，用來獲得樣本10的影像；及控制系統140，用來控制mFISH成像和影像處理裝置100的各種部件的操作。控制系統140可以包括執行控制軟體的電腦142（其例如具有記憶體、處理器等等）。

螢光顯微鏡120包括可以產生多種不同波長的激發光130的激發光源122。詳細而言，激發光源122可以在不同的時間產生具有不同波長的窄帶寬光束。例如，激發光源122可以由多波長連續波雷射系統所提供，例如可以獨立啟動以產生不同波長的雷射束的多個雷射模組122a。可以將來自雷射模組122a的輸出多工到共同的光束路徑中。

螢光顯微鏡120包括顯微鏡主體124，顯微鏡主體124包括各種光學部件以將激發光從光源122引導到流動室110。例如，可以將來自光源122的激發光耦合到多模光纖中、由透鏡集合重新聚焦並放大、然後由核心成像部件（例如高數值孔徑（NA）物鏡136）引導到樣本中。在激發通道需要被切換時，可以停用多個雷射模組122a中的一者並且可以啟動另一個雷射模組122a，其中元件之間的同步由一個或多個微控制器144、146完成。

可以將物鏡136或整個顯微鏡主體124安裝在耦接到Z驅動致動器的垂直可動的支座上。例如由控制Z驅動致動器的微控制器146對Z位置進行的調整可以實現對焦點位置的微調。替代性或附加性地，流動室110（或在流動室110中支撐樣本的平台118）可以藉由Z驅動致動器118b（例如軸向壓電平台）垂直地可動。此類壓電平台可以容許進行精確及迅速的多平面影像獲取。

將要成像的樣本10定位在流動室110中。流動室110可以是具有面積為約2 cm乘2 cm的橫截區域（其與顯微鏡的物面或影像平面平行）的腔室。可以將樣本10支撐在流動室內的平台118上，且平台（或整個流動室）可以例如藉由一對線性致動器118a側向地可動以容許XY運動。這容許在不同的側向偏移視場（FOV）中獲取樣本10的影像。或者，可以將顯微鏡主體124承載在側向可動的平台上。

流動室110的入口連接到雜化試劑源112。多閥門定位器114可以由控制器140所控制以在來源之間切換以選擇向流動室110供應哪個試劑112a。每個試劑包括一個或多個寡核苷酸探針的不同集合。每個探針靶向不同編碼探針上的不同核苷酸序列（因此靶向不同的RNA序列），且具有被不同波長組合激發的一種或多種螢光材料（例如螢光體）的不同集合。除了試劑112a以外，還可以存在清洗流體112b（例如DI水）的來源。

流動室110的出口連接到泵116（例如蠕動泵），泵116也由控制器140所控制以控制液體（例如試劑或清洗流體）通過流動室110的流動。來自流動室110的使用過的溶液可以由泵116傳遞到化學廢棄物管理子系統119。

操作時，控制器140使得光源122發射激發光130，激發光130造成樣本10中的螢光材料的螢光（例如與樣本中的RNA結合且被激發光的波長激發的探針的螢光）。發射的螢光132以及反向傳播的激發光（例如從樣本、平台等等散射的激發光）由顯微鏡主體124的物鏡136所收集。

可以由顯微鏡主體124中的多波段二向色反射鏡138過濾收集的光以從反向傳播的照射光分離發射的螢光，並且發射的螢光被傳遞到攝影機134。多波段二向色反射鏡138可以包括針對在各種激發波長下從探針預期的每個發射波段的通帶。使用單個多波段二向色反射鏡（與多個二向色反射鏡或可動二向色反射鏡相比）可以提供改進的系統穩定性。

攝影機134可以是高解析度（例如2048x2048像素）CMOS（例如科學CMOS）攝影機，且可以安裝在物鏡的直接影像平面處。其他的攝影機類型（例如CCD）也是可能的。在由訊號（其例如來自微控制器）所觸發時，來自攝影機的影像資料可以被捕捉，例如發送到影像處理系統150。因此，攝影機134可以從樣本收集一系列影像。

為了進一步移除殘餘的激發光並最小化激發通道之間的串擾，可以將每個雷射發射波長與對應的帶通發射濾波器128a配對。每個濾波器128a可以具有10-50 nm（例如14-32 nm）的波長。在一些實施方式中，例如在探針的螢光材料具有長尾光譜分佈時，濾波器比由激發所造成的探針的螢光材料的帶寬還窄。

濾波器安裝在由致動器128b可旋轉的高速濾波器輪128上。可以將濾波器輪128安裝在光學無限遠處以最小化成像路徑中的光學像差。在通過濾波器輪128的發射濾波器之後，可以將清潔的螢光訊號由鏡筒透鏡重新聚焦並由攝影機134捕捉。二向色反射鏡138可以定位在物鏡136與濾波器輪128之間的光路中。

為了促進系統的高速、同步的操作，控制系統140可以包括用來以協調的方式向螢光顯微鏡120的部件發送觸發訊號（例如TTL訊號）的兩個微控制器144、146。第一微控制器144由電腦142直接運行，並觸發濾波器輪128的致動器128b以切換不同色彩通道處的發射濾波器128a。第一微控制器144也觸發第二微控制器146，第二微控制器146向光源122發送數位訊號，以控制向樣本10傳遞哪個波長的光。例如，第二微控制器146可以向光源122的個別雷射模組發送開/關訊號，以控制哪個雷射模組是活動的，並因此控制將哪個波長的光用於激發光。在完成切換到新的激發通道之後，第二微控制器146控制壓電平台118b的馬達以選擇成像高度。最後，第二微控制器146向攝影機134發送觸發訊號以供進行影像獲取。

電腦142與裝置100的元件部件之間的通訊由控制軟體所協調。此控制軟體可以將所有元件部件的驅動器整合成單個框架，因此可以允許使用者將成像系統作為單個儀器進行操作（而不必單獨控制許多元件）。

為了提供背景脈絡，mFISH成像及基因識別的常規mFISH傳統輪次依賴一系列嵌套步驟，包括雜化、成像及螢光漂白。圖2展示了常規mFISH輪次的工作流程，其中包括一些時間尺度以供參考。在mFISH成像之前，將編碼探針添加到含有要被靶向的序列的生物樣本。目標核苷酸序列與編碼探針庫結合，每個編碼探針含有與特定靶向序列結合的編碼序列及在編碼序列的每個端部處的雜化區域。雜化區域被設計為與存在於讀出探針集合中的靶向序列結合，但不與樣本的序列結合。

讀出探針的第一雜化輪次（202）從以下操作開始：多閥門定位器114向容納樣本10的流動室110供應含有讀出探針的緩衝劑。如上所述，每個讀出探針包括與被設計為與編碼探針的雜化區域中的一者結合的寡核苷酸靶向序列耦合的螢光團。實際上，可以存在多個讀出探針群組，其中一群組內的讀出探針具有相同的寡核苷酸靶向序列及相同的螢光團，但不同群組的讀出探針具有寡核苷酸靶向序列及以不同波長發光的不同螢光團。讀出探針的群組總數可以等於或小於系統所能夠成像的色彩通道數量。例如，具有有著四個雷射模組的光源122的控制系統140可以以一系列的四個激發和成像輪次激發四個獨特螢光團的集合。

系統執行孵育步驟，其允許讀出探針的集合穿透樣本並與編碼探針雜化。孵育步驟的長度可以取決於樣本的類型、所使用的緩衝試劑、讀出探針長度及其他因素。例如，孵育步驟可以介於1000與1500秒之間。

然後，系統經由多閥門定位器114向流動室110供應一系列的緩衝劑以準備用於成像的樣本。緩衝劑系列可以包括洗滌緩衝劑，其可以包括用來取代可能干擾試驗的未結合及過量的成分的試劑，例如收斂試劑（例如甲醯胺）。緩衝劑系列可以進一步包括雜化緩衝劑以控制嚴格性並消除樣本殘餘的螢光材料或自發螢光。緩衝劑系列可以進一步包括成像緩衝劑以準備樣本及探針以供成像，例如執行驅氣（例如葡萄糖氧化酶）。組合的孵育和緩衝劑流動步驟可能需要1200到1500秒，然而取決於諸如流速之類的實驗條件，其他的持續時間也是可能的。

然後，系統執行成像步驟（204），其中對樣本的所有側向視場（FOV）進行成像，進一步描述在圖7中。簡而言之，成像包括跨系統可用的色彩通道數量對每個FOV進行成像的所有必要步驟。例如，系統可以包括用於每個FOV四個色彩通道（然而也可以考慮更多個）的光源122及發射濾波器輪128。光源122連續激發局限在選擇的FOV內的讀出探針集合的螢光團，同時濾波器輪128允許收集發射的螢光以形成螢光影像。在一些實施方式中，可以將成像系統配置為例如具有彩色攝影機以同時對不同發射波長的多個螢光團進行成像。這會捕捉前一步驟中雜化的讀出探針的側向位置及垂直位置。成像所需的時間可以基於樣本尺寸、照射強度及螢光強度而變化。一般而言，成像可能需要300到600秒。

然後，對雜化的讀出探針的螢光團進行螢光漂白（206）。這藉由以下操作開始：多閥門定位器114向流動室110供應一定體積的漂白緩衝劑以取代及清洗成像緩衝劑。螢光漂白包括以下操作：以高強度的光沐浴流動室110中的樣本10以光化學地使樣本螢光團內雜化的讀出探針永久不能發螢光。光源被選擇為對應於與讀出探針組合使用的螢光團。例如，可以使用具有400 nm與600 nm之間的波長的光源或過濾成該波長的寬光譜光源。使螢光團不能發螢光所需的功率可以介於100 mW與400 mW之間。螢光漂白步驟的時間可以取決於光源波長及所施加的功率而變化。一般而言，2秒到10秒是足夠的。然而，一些樣本需要更長的時間，及/或多輪螢光漂白。

雜化、緩衝劑洗滌、影像捕捉及螢光漂白的單個輪次可能需要50分鐘到70分鐘。然後，可以以雜化、緩衝劑洗滌、成像及螢光漂白的附加輪次重複過程（207）。例如，mFISH實驗可以包括4到20輪的雜化和mFISH成像，其中每個輪次中使用獨特的讀出探針。較高數量的輪次需要對應的大量時間投入。其結果是，增大讀出位元呼叫的數量以便增大給定影像像素中的資料深度可能不切實際或在商業上令人望而卻步。

本文中所揭露的是一種增大每輪雜化所執行的位元讀出呼叫（也簡稱為「讀出呼叫」或「位元呼叫」）的數量的方法。藉由引入原位可切換讀出探針，一輪雜化內及一色彩通道內的讀出呼叫的數量改進了。假設色彩通道的數量保持相同，則讀出呼叫的總數可以增大。或者，雖然可以從給定的色彩通道獲得更多讀出呼叫，也可以在維持讀出呼叫的總數的同時減少色彩通道的數量。這容許使用者選擇對於給定試驗而言給予最佳效能的特定通道，且避免了受到自發螢光影響的其他通道。

在光源122激發樣本10內的雜化的讀出探針的螢光團時，讀出呼叫發生在成像期間。激發的螢光團返回基態並發射給定波長的光，該光由顯微鏡120所接收。具有帶有發光螢光團的結合的讀出探針的編碼探針可以被認為是「開」位元。不具有發光螢光團的編碼探針可以被認為是「關」位元。出於諸如波長對於螢光團而言不正確的激發光、局部淬滅或者化學漂白或光漂白之類的理由，編碼探針可能無法發光。此外，可以在切換步驟期間切換編碼探針的位元狀態，從而將「開」位元轉成「關」，反之亦然。例如，可以從讀出探針裂解螢光團，或者可以洗去讀出探針，或者可以裂解淬滅劑使其不再對螢光團進行淬滅。

切換步驟可以包括用來從先前成像的狀態切換位元的二進制狀態的一種或多種手段。例如，若位元在第一影像中為「開」，則在不同的色彩通道中截取連續的影像之前，切換步驟可以將該位元切換成「關」。相反地，若位元在第一影像中為「關」，則在不同的色彩通道中截取連續的影像之前，切換步驟可以將該位元切換成「開」。切換技術取決於雜化的讀出探針的集合內所包含的讀出探針的構造，且可以在收集的影像之間執行一個或多個切換步驟。

讀出探針的螢光可以藉由來一個或多個切換模態來切換，該一個或多個切換模態可以包括對該一個或多個螢光團的修改或對靶向序列410的修改。螢光團修改的示例可以包括對螢光團進行淬滅或去淬滅。靶向序列410修改的示例可以包括解離、裂解或競爭性結合。

在螢光團在特定的波長下被激發並被提升到激發態時，會發生螢光。然後，激發的染料在返回基態時發射光。螢光團的示例可以包括7-AAD、吖啶橙、Alexa Fluor®染料、BFP（藍色螢光蛋白質）、GFP（綠色螢光蛋白質）、BODIPY®染料、CFP（青色螢光蛋白質）、基於花青的染料、DAPI、溴化乙錠、基於螢光素的染料、路西法（Lucifer）染料、俄勒岡（Oregon）染料、基於若丹明（Rhodamine）的染料、SYTO®染料、噻唑基染料、YFP（黃色螢光蛋白質）、YOYO®染料、ATTO染料或IRDye®染料。

螢光團淬滅指的是減小此過程的發射強度的任何過程。各種分子交互作用可以導致淬滅。這些包括激發態反應、分子重排、能量轉移、基態複合物形成及碰撞淬滅。淬滅劑可以是單個大型分子、離子、奈米顆粒或奈米結構。在淬滅劑存在時，激發的螢光團可以藉由將其能量轉移給淬滅劑來返回基態而不會發光，同時淬滅劑被提升到其激發態。然後，淬滅劑可以以未偵測到的波長發射能量，或者可以在非輻射路徑中釋放能量。淬滅劑可以藉由Förster共振能量轉移（FRET）路徑或Dexter電子轉移（DEX）路徑來操作，該等路徑都取決於緊鄰的螢光團及淬滅劑（例如＞10 nm）。不希望被理論束縛，淬滅劑的選擇取決於與螢光團的發射-吸收光譜重疊以及供體和受體躍遷偶極矩的相對取向。應瞭解，淬滅劑的選擇取決於讀出探針中所使用的螢光團。

使用淬滅機制的螢光修改可以包括添加或移除淬滅劑分子，藉此在切換步驟中打開或關閉螢光。在一些實施例中，存在於讀出探針中的每個螢光團的一個淬滅劑分子藉由裂解域附接到讀出探針。完整的裂解域將淬滅劑維持在保留淬滅（例如FRET或DEX）路徑的距離內（例如＞10 nm）。然後，切換步驟會包括裂解淬滅劑與螢光團之間的裂解域的手段。移除淬滅劑會將讀出探針從「關」位元變為「開」。

添加淬滅劑的示例包括將淬滅劑探針添加到流動室。淬滅劑探針包括附接到核苷酸靶向序列的淬滅劑，該序列特異性地結合與讀出探針相鄰的雜化區域的一部分。可以將淬滅劑探針靶向序列設計為使得在與雜化區域結合時，淬滅劑分子在其中發生淬滅（例如FRET或DEX）的讀出探針的螢光團附近隔開一定距離。然後，切換步驟會包括添加淬滅劑探針及雜化輪次之間足夠的孵育時間。添加淬滅劑探針會將讀出探針「開」位元切換到「關」。淬滅劑的示例可以包括TAMRA、Black Berry Quencher-650、ECLIPSETM、DyQ®淬滅劑、Black Hole Quenchers®、QSY®淬滅劑、IRDye®淬滅劑、Iowa black ® FQ、Iowa black ® RQ、丙烯醯胺、Dabcyl基團及上述項目的任何衍生物。

在一些實施例中，螢光修改可以包括使用螢光團的FRET或DEX對來切換讀出呼叫。在FRET或DEX對中，螢光團中的一者是供體且第二螢光團是受體。在靠近時，激發的供體螢光團非輻射性地將激發能量轉移到鄰近的受體螢光團。然後，受體螢光團藉由以成像系統可以偵測的波長發射光來返回基態。以這種方式，添加或移除FRET或DEX對螢光團會切換第一螢光團的位元狀態。例如，讀出探針集合可以包括不發射由系統可偵測的波長的第一供體讀出探針。可以將具有受體螢光團的第二讀出探針添加到樣本以將螢光團讀出呼叫從「關」改變為「開」。

使用核苷酸修改的螢光修改可以包括從讀出探針移除螢光團。移除螢光團的示例包括藉由可裂解鍵或短的可裂解核苷酸序列（例如＞30 bp）來將螢光團附接到讀出探針的核苷酸序列，藉此將「開」位元切換到「關」。在一些實施方式中，可裂解鍵或短的可裂解核苷酸序列可以位在讀出探針核苷酸序列內。然後，切換步驟會包括中斷淬滅劑與螢光團之間的鍵的手段，例如光裂解、酶促裂解或化學裂解。移除淬滅劑會將讀出探針從「關」位元變為「開」。

螢光修改可以進一步包括從編碼探針有差異地移除雜化的讀出探針的集合中的一個或多個讀出探針。例如，讀出探針集合可以包括具有短的靶向序列（例如＜20 bp）的第一讀出探針及具有較長的靶向序列（例如＞40 bp）的第二讀出探針。在雜化讀出探針集合之後向流動室供應的緩衝劑可以包括用來從編碼探針的讀出區域釋放雜化的讀出探針的化學試劑。可以將緩衝劑與樣本10一起孵育達足以分離具有短的靶向序列的讀出探針的時間，並在長的靶向序列解離時的讀出探針之前清洗。在此示例中，移除具有短的靶向序列的讀出探針將那些位元轉變為「關」，同時具有長的靶向序列的讀出探針保持「開」。

在另一個示例中，可以將讀出探針的靶向序列設計為與編碼探針的雜化區域部分互補（例如非特異性的30-70%基對互補）。在雜化讀出探針集合之後向流動室供應的緩衝劑可以使用非特異性結合劑以競爭性地將雜化的讀出探針與部分互補的靶向序列結合。在此示例中，競爭性地將讀出探針與非特異性靶向序列結合會將那些位元轉變為「關」，同時具有特異性靶向序列的讀出探針保持「開」。

圖3A到圖3I描繪用於螢光切換步驟中的讀出探針構造的幾個示例。如圖3A中所示且如上所述，讀出探針300包括至少一個螢光團320及與編碼探針的一個雜化區域互補的核苷酸靶向序列310。螢光團320被第一波長的光刺激並發射第二波長的光。

靶向序列310可以包括8到100 bp的核苷酸，例如15到45 bp的核苷酸。例如，圖3A的靶向序列310描繪第一靶向序列310，且圖3B描繪具有第二靶向序列311同時共用相同的螢光團320的讀出探針301，第二靶向序列311比第一靶向序列310還長。

在一些實施例中，讀出探針302可以包括具有如圖3C中所描繪的一個或多個裂解域314的靶向序列312。例如，裂解域314可以包括容易受到光裂解、酶促裂解或化學裂解的影響的域。可光裂解的基團可以包括基於硝基芐基、基於羰基或基於芐基的基團。酶促可裂解位點包括被諸如如S1或P1核酸內切酶之類的單鏈核酸酶特異性靶向切割的核苷酸序列。化學可裂解位點包括不穩定位點，例如二硫鍵（其例如可被溫和還原劑裂解）、酯鍵（其例如可被酸、鹼或羥胺裂解）、肽鍵（其例如可被蛋白酶裂解）或磷酸二酯鍵（其例如可經由核酸酶裂解）。靶向序列312內的裂解域可以位於靶向序列312中相對於螢光團320的遠端到近端之間的任何點處。靶向核苷酸序列312的長度可以與核苷酸序列310類似（例如介於15與45 bp之間），或可以更長（例如長度與核苷酸序列311類似）。

相比之下，如圖3A及圖3B中所示的「基本」讀出探針可以僅包括單個螢光團320，且不需包括容許從靶向序列310、311裂解螢光團320的任何專門化學結構。

如圖3D、圖3E及圖3F中所示，在一些實施例中，讀出探針包括兩個或更多個螢光團，每個螢光團對不同的激發波長有反應。例如，如圖3D中所示，讀出探針303依序包括靶向核苷酸序列312、第一螢光團320、連接區域313及第二螢光團321。舉個例子，連接區域可以包括短的（例如＞15 bp）非特異性核苷酸序列。在另外的示例中，連接區域可以是化學連接，例如二甘醇連接。讀出探針可以包括更大數量的螢光團，只要每個螢光團具有不同的修改技術。

如圖3E中所示，連接區域313可以進一步包括如本文中所述的裂解位點314。舉另外一個例子，圖3F描繪讀出探針303，讀出探針303依序包括具有第一裂解域314a的第一靶向核苷酸序列312、第一螢光團320、具有第二裂解域314b的第二非特異性核苷酸序列313及第二螢光團321。

圖3G到圖3I示出使用淬滅劑作為螢光修改切換模態的讀出探針的示例。圖3G描繪與淬滅劑探針330相鄰的圖3B的讀出探針301。淬滅劑探針330包括靶向序列310及淬滅劑322。上面描述了淬滅劑的示例。圖3H示出讀出探針302與淬滅劑探針330的組合。圖3F及圖3G中所描繪的組合可以藉由添加或移除淬滅劑探針330來切換。

圖3I描繪讀出探針305，讀出探針305依序包括第一靶向序列312、螢光團320、具有裂解域314的第二非特異性核苷酸序列313及淬滅劑322。讀出探針305被建構為具有第二非特異性核苷酸序列313及淬滅劑322，且可以藉由裂解第二非特異性核苷酸序列313中的裂解位點314來從「關」切換到「開」。

使用可切換的讀出探針設計，可以從單個雜化步驟內獲得進一步的多工資訊。圖4A描繪傳統mFISH系統中所使用的示例性編碼探針400及結合的讀出探針300。編碼探針400包括編碼區域402、定位在編碼區域402的一端處的第一雜化序列404a及定位在編碼探針400的相對端處的可選的第二雜化序列404b。編碼區域402是與樣本10內的目標序列410互補且將特異性地與目標序列410結合的序列。

第一雜化序列404a及可選的第二雜化序列404b是與描繪的讀出探針300的靶向序列310互補的序列。以此方式與編碼探針400結合的讀出探針300將在成像期間用作「開」位元，指示目標序列410已被結合。然而，在傳統的mFISH中，此位元狀態是靜態的，直到樣本10被螢光漂白，從而熄滅所有螢光為止。

包括切換模態的讀出探針可以在切換步驟期間修改編碼探針的位元狀態。圖4B描繪與目標序列410結合的編碼探針400及包括靶向序列312的讀出探針302，靶向序列312包括裂解域314。在此配置中，靶向序列312與雜化序列404a結合，且螢光團是未修改的。讀出探針300在成像期間將用作「開」位元。然後，可以在切換步驟中破壞示例性裂解域314（被示出）。

切換步驟的結果示於圖4C中。編碼探針400保持與目標序列410結合，且靶向序列312保持與雜化序列404a結合，但是螢光團320已經從讀出探針302移除。可以從流動室110清洗螢光團320。以這種方式，編碼探針400上沒有螢光團，且位元狀態已經被切換到「關」。

圖5示出使用包括切換模態的讀出探針的示例性工作流程。讀出探針的第一雜化輪次（502）從以下操作開始：多閥門定位器114向容納樣本10的流動室110供應含有一個或多個可切換讀出探針的第一集合的緩衝劑。如上所述，在系統能夠在單個影像中成像時，向流動室110供應的可切換讀出探針的每個集合可以包括一定數量的獨特螢光團作為色彩通道。如上所述，將讀出探針與樣本一起孵育達足夠的時間以允許與編碼探針雜化。連續地供應洗滌、漂白及成像緩衝劑，從而如302中地從流動室110清洗先前體積。

然後，進行成像步驟（504），其中對樣本的所有側向FOV及其中的垂直位置進行成像，如上面針對圖1及圖3所述。大體上，光源122連續激發局限在選擇的垂直位置及FOV內的可切換讀出探針集合的螢光團，同時濾波器輪128允許收集發射的螢光以形成螢光影像。這會捕捉前一步驟中雜化的可切換讀出探針的側向位置及垂直位置。

在第一次收集樣本的所有成像之後，會進行至少一個切換輪次。切換步驟修改第一可切換讀出探針群組的螢光（506）。切換可以藉由裂解、淬滅、FRET/DEX或洗滌來執行。在此步驟期間，可以取決於存在於讀出探針集合中的切換模態及切換過程的類型來切換讀出探針的一部分的位元狀態。例如，光裂解步驟可以切換包括光裂解位點的讀出探針的位元狀態，但是不會切換包括淬滅探針的讀出探針的位元狀態。一般而言，切換步驟至少使第二讀出探針群組的螢光保持不變。此第二讀出探針群組可以是「基本」讀出探針，或者是不受用來切換第一讀出探針群組的切換過程的類型影響的可切換讀出探針。

作為切換的結果，第一位元狀態集合被切換（506），且附加成像輪次（504）可以被執行（505）。切換和附加成像的輪次可以對包括在讀出探針集合中的一樣多的切換模態執行。以這種方式，讀出探針的位元狀態是單個雜化輪次（502）內可用的附加資料多工級別。

一旦切換步驟完成（例如所有可用的切換模態已被使用），過程就可以繼續螢光漂白（508）並重複（509）雜化（502）輪次，如圖3中所描述。

使用可切換讀出探針可以允許從單個可切換讀出探針收集多工資訊。每個讀出探針靶向編碼探針內的特定雜化區域，且每個編碼探針靶向樣本內的特定核苷酸序列。因此，可切換探針實現了雜化區域的多工讀出呼叫，並擴展了基因密碼字位的位元深度。

圖6A描繪三個讀出探針的示例性集合，每個讀出探針共用共同的螢光團且具有設計為靶向三個獨特雜化區域的獨特靶向序列。在以光源122激發且收集發射的螢光以形成螢光影像時，激發的螢光團在與讀出探針300、301及302對應的位置中產生「開」位元，如圖6A的表格的第一列中所示。

執行第一切換步驟506，其包括緩衝劑洗滌步驟以解開包括短的靶向序列的讀出探針300。讀出探針302及301具有長的靶向序列，且保持與它們相應的雜化區域的雜化。第二影像示出「開」位元及影像中原本與第一「開」位元相關且被切換到「關」的位置。

執行第二切換步驟506，其包括裂解步驟以裂解讀出探針302的靶向序列中的位點。讀出探針301不具有裂解位點且將在讀出探針302的螢光團被清洗的同時保持與相應的雜化區域雜化。第三影像將示出一個「開」位元，且影像中原本與第一「開」位元及第二「開」位元相關的位置現在將被切換到「關」。

三個影像中的位置及位元狀態資訊可以使用本文中所述的影像堆疊方法來相關，且與至少一個「開」位元相關的每個位置像素被稱為「讀出呼叫」，且由圖6A的行所表示。三個影像中的三個讀出探針位置的讀出呼叫（例如行）將各自具有獨特的特徵，對應於僅使用單個色彩通道（例如螢光團）及單個雜化步驟的三個相應的雜化區域。

圖6B中所描繪的讀出探針集合包括圖6A的讀出探針以及兩個獨特的讀出探針組合，302及301在淬滅劑探針330附近雜化，且讀出探針305具有附接的可劈裂淬滅劑分子。第一影像將示出三個「開」位元，與圖6A的第一列類似。如圖6A中地執行洗滌步驟（506），其清洗讀出探針300及淬滅劑探針330。兩個新的「開」位元將出現在所收集的第二影像中，且與讀出探針300對應的位置將被切換到「關」。執行第二切換步驟（圖6A的示例性裂解步驟），且所收集的第三影像將示出第二讀出探針位置及第四讀出探針位置被切換到「關」，且第六讀出探針位置被切換到「開」，因為淬滅劑分子從讀出探針305裂解。圖6B的讀出探針集合在單個雜化步驟及單個色彩通道內造成六個獨特的讀出呼叫。

圖6C中所描繪的讀出探針集合包括八個示例性讀出探針。圖6C的讀出探針是包括使用單獨的色彩通道來成像的兩個螢光團、靶向序列及裂解區域的成分組合。圖6C的表格示出來自使用這些組合的兩個影像的八個可能的讀出呼叫。從左邊開始，讀出探針600包括第一螢光團及具有裂解域的靶向序列；讀出探針300包括第一螢光團及不具有裂解域的靶向序列；讀出探針601包括第二螢光團及包括裂解域的靶向序列；讀出探針602包括第二螢光團及不具有裂解域的靶向序列；讀出探針603包括連接到不具有裂解域的靶向序列第一螢光團及第二螢光團兩者；讀出探針604包括第一螢光團及第二螢光團兩者，其中第二螢光團經由裂解域連接到靶向序列；讀出探針605包括第一螢光團及第二螢光團兩者，其中第一螢光團經由裂解域連接到靶向序列；讀出探針606包括第一螢光團及第二螢光團兩者，其中第一螢光團及第二螢光團兩者經由裂解域連接到靶向序列。

第一影像將示出跨兩個色彩通道的八個「開」位元，四個單個「開」位元及四個成雙的「開」位元。執行切換步驟506，其包括裂解步驟以裂解讀出探針600、601、603、604、605及606的位點。然後，第二影像將示出圖6C的表格的列二的讀出呼叫狀態，其中讀出探針300、602及603的讀出呼叫保持「開」，讀出探針600、601及606被切換成「關」，且讀出探針604及605被切換成可區分的「開」狀態。此讀出探針集合可以在單個雜化輪次及兩個影像中實現位元深度為二的8個相異的讀出呼叫。

回到圖1，控制系統140被配置（即被控制軟體及/或工作流程腳本配置）為按以下順序以迴圈方式（從最內迴圈到最外迴圈）獲取螢光影像（也簡稱為「收集的影像」或簡稱為「影像」）：z軸線、色彩通道、側向位置、切換及試劑。

這些迴圈可以由以下偽代碼所表示： for g = 1:N_hybridization % multiple hybridizations for h= 1:N_switch % multiple switches for f = 1:N_FOVs % multiple lateral field-of-views for c = 1:N_channels % multiple color channels for z = 1:N_planes % multiple z planes Acquire image(g, h, f, c, z); end % end for z end % end for c end  % end for f end % end for h end % end for g

對於z軸線迴圈而言，控制系統140使得平台118步進通過多個垂直位置。因為平台118的垂直位置由壓電致動器所控制，所以調整位置所需的時間很小，且此迴圈中的每個步驟都非常快。

首先，樣本可以是足夠厚的（例如幾微米），從而可能需要通過樣本的多個影像平面。例如，可能存在多個細胞層，或者甚至在一細胞內，基因表達也可能存在垂直變化。並且，對於薄的樣本而言，例如由於熱漂移，可能無法事先知道焦平面的垂直位置。此外，樣本10可能在流動室110內垂直漂移。在多個Z軸線位置處成像可以確保厚樣本中的大部分細胞被覆蓋，且可以有助於識別薄樣本中的最佳焦點位置。

對於色彩通道迴圈而言，控制系統140使得光源122步進通過不同波長的激發光。例如，雷射模組中的一者被啟動，其他雷射模組被停用，且發射濾波器輪128被旋轉以使適當的濾波器進入樣本10與攝影機134之間的光的光路徑。

對於側向位置而言，控制系統140使得光源122步進通過不同的側向位置以獲得樣本的不同的視場(FOV)。例如，在迴圈的每個步驟，可以驅動支撐平台118的驅動器以側向移動平台。在一些實施方式中，控制系統140的步數及側向運動被選擇為使得累積的FOV覆蓋整個樣本10。在一些實施方式中，側向運動被選擇為使得FOV部分重疊。

對於切換而言，控制系統140使得裝置100步進通過可用的切換過程。例如，若讀出探針群組包括光不穩定裂解基團414，則控制系統140可以使得光源122以與裂解基團對應的波長的光照射流動室110並破壞化學鍵。在另一個示例中，若讀出探針群組包括化學敏感的裂解基團414，則控制系統140可以使得多閥門定位器114選擇靶向化學敏感的裂解基團414的試劑112a並向流動室110供應試劑112a。在另外的示例中，若樣本含有具有短的靶向序列310的讀出探針300或淬滅劑探針330的群組，則控制系統140可以使得多閥門定位器114選擇試劑112a以洗去讀出探針300或淬滅劑探針330。

對於雜化，控制系統140使得裝置100步進通過多個不同的可用試劑，該等試劑包括要與樣本10內的編碼探針雜化的一個或多個讀出探針的集合。例如，在迴圈的每個步驟，控制系統140可以控制閥門114以將流動室110連接到清洗流體112b，使得泵116藉由室抽吸清洗流體達第一時間段以清洗當前的試劑，然後控制閥門114將流動室110連接到不同的新試劑，然後藉由室抽吸新的試劑達足以使得新試劑中的探針與適當的RNA序列結合的第二時間段。因為清洗流動室及使新試劑中的探針結合需要一些時間，所以與調整側向位置、色彩通道或z軸線相比，調整試劑所需的時間是最長的。

其結果是，針對z軸線、色彩通道（激發波長）、側向FOV、切換及試劑的可能值的每個組合獲取了螢光影像。因為最內迴圈具有最快的調整時間，且相繼環繞的迴圈的調整時間逐漸變慢，所以此配置提供了時間效率最高的針對這些參數的值組合獲取影像的技術。

資料處理系統150用來處理影像及決定基因表達以產生空間轉錄組資料。至少，資料處理系統150包括資料處理元件152（例如由儲存在電腦可讀取媒體上的軟體所控制的一個或多個處理器）及本端儲存元件154（例如非依電性電腦可讀取媒體），本端儲存元件154接收由攝影機134所獲取的影像。例如，資料處理元件152可以是安裝有GPU處理器或FPGA板的工作站。資料處理系統150也可以藉由網路連接到遠端儲存器156，例如藉由網際網路連接到雲端儲存器。

在一些實施方式中，資料處理系統150在影像被接收時執行真時影像處理。詳細而言，在資料獲取正在進行時，資料處理元件152可以執行影像預處理步驟（例如過濾及去卷積），該等影像預處理步驟可以對儲存元件154中的影像資料執行但不需要整個資料集。因為過濾及去卷積是資料處理管線中的主要瓶頸，所以在影像獲取進行時進行預處理可以顯著縮短離線處理時間，因此改進吞吐量。

圖7示出資料處理方法的流程圖，其中處理是在獲取了所有影像之後執行的。過程開始於系統接收原始影像檔案及支援檔案（步驟702）。詳細而言，資料處理系統可以從攝影機接收完整的原始影像集合，例如針對z軸線、色彩通道（激發波長）、側向FOV及試劑的可能值的每個組合的影像。

此外，資料處理系統可以接收參考表達檔案，例如FPKM（每百萬映射讀取量千鹼基序列的碎片（fragments per kilobase of sequence per million mapped reads））檔案、資料模式及一個或多個染色影像（例如DAPI影像）。參考表達檔案可以用來在傳統序列結果與mFISH結果之間進行交叉檢查。

從攝影機所接收的影像檔案可以可選地包括元資料、用以截取影像的硬體參數值（例如平台位置、像素大小、激發通道等等）。資料模式提供了基於硬體參數來排序影像使得影像以適當的順序安置到一個或多個影像堆疊中的規則。若未包括元資料，則資料模式可以將影像的順序與用來產生該影像的z軸線、色彩通道、側向FOV及試劑的值相關聯。

染色影像將與覆加的轉錄組資訊一起呈現給使用者。

在更密集的處理之前，可以使收集的影像經受一個或多個品質度量（步驟703），以篩選出品質不足的影像。只有滿足品質度量的影像才會被傳遞以進行進一步的處理。這可以顯著減少資料處理系統的處理負載。品質度量的示例包括影像銳度、影像亮度及雜化間偏移，例如如由相位相關所偵測的。

接下來，處理每個影像以移除實驗偽影（步驟704）。因為每個RNA分子將在不同的激發通道與探針雜化多次，所以跨多通道、多輪次的影像堆疊進行嚴格的對準有益於揭露整個FOV中RNA的特性。移除實驗偽影可以包括場平坦化及/或色像差校正。在一些實施方式中，在色像差校正之前執行場平坦化。

處理每個影像以提供RNA影像斑點銳化（步驟706）。RNA影像斑點銳化可以包括施加濾波器以移除細胞背景及/或用點擴散函數去卷積以銳化RNA斑點。

具有相同FOV的影像被配準以對準其中的特徵（例如細胞或細胞器）（步驟708）。為了準確識別影像序列中的RNA種類，不同輪次的影像中的特徵被對準例如達到亞像素精度。然而，因為mFISH樣本在水相中成像且藉由電動平台移動，所以在長達數小時的成像過程中，樣本漂移及平台漂移可能會轉換成影像特徵偏移，如果不加以解決，這會破壞轉錄組分析。換言之，即使假設螢光顯微鏡與流動室或支撐件精確地可重複對準，樣本也可能在後來的影像中不再處於相同的位置，這可能會將誤差引入到解碼中或者干脆使解碼無法進行。

配準影像的一個常規技術是在載玻片上的載體材料內安置基準點標記（例如螢光珠）。一般而言，樣本及基準點標記珠將大致一齊移動。基於這些珠子的尺寸及形狀，可以在影像中識別這些珠子。珠子的位置的比較容許配準兩個影像，例如計算仿射變換。

可以在配準之後執行配準品質檢查。若正確配準，則每個影像中的亮點應重疊，使得總亮度增大。

可選地，在配準之後，可以針對每個收集的影像計算掩碼。簡而言之，將每個像素的強度值與閾值進行比較。如果強度值大於閾值，則將掩碼中的對應像素設定為1，如果強度值小於閾值，則設定為0。閾值可以是根據經驗決定的預定值，或者可以根據影像中的強度值計算出來。一般而言，掩碼可以與樣本內的細胞的位置對應；細胞之間的空間不應發螢光且應具有低的強度。

資料處理裝置現在可以執行最佳化及再解碼（步驟712）。最佳化可以包括解碼參數的基於機器學習的最佳化，隨後以更新的解碼參數返回步驟710以更新空間轉錄組分析。可以重複此循環，直到解碼參數穩定為止。

解碼參數的最佳化將使用評價函數（merit function），例如FPKM/TPM相關、空間相關或置信比。可以包括作為評價函數中的變數的參數包括用來移除細胞背景的濾波器的形狀（例如頻率範圍的開始及結束等等）、用來銳化RNA斑點的點擴散函數的數值孔徑值、FOV的正規化中所使用的分位數邊界Q、位元比閾值THBR、位元亮度閾值THBB（或用來決定位元比閾值THBR及位元亮度閾值THBB的分位數）及/或可以將像素字認為是與碼字匹配的最大距離D1max。

此評價函數可以是實際上不連續的函數，因此常規的梯度跟蹤演算法可能不足以識別最佳參數值。可以使用機器學習模型來收歛參數值。

接下來，資料處理裝置可以跨所有FOV執行參數值的統一處理。因為每個FOV均被個別處理，所以每個場可能經歷不同的正規化、定限及過濾設定。其結果是，高對比度的影像可能導致直方圖的變化，從而導致安靜區域中的偽陽性呼出。統一的結果是所有FOV都使用相同的參數值。這可以顯著移除來自安靜區域中的背景雜訊的呼出，且可以在大的樣本區域中提供清晰且無偏的空間模式。

有各種方法可以選擇將跨所有FOV使用的參數值。一個選項是單純選擇預定的FOV（例如第一個測得的FOV或樣本中心附近的FOV），並將參數值用於該預定的FOV。另一個選項是跨多個FOV對參數的值求平均，然後使用平均值。另一個選項是決定哪個FOV導致其像素字與標記的碼字之間最佳的擬合。例如，標記的碼字與針對那些碼字的像素字之間具有最小平均距離d(p,b1)的FOV可以被決定然後選擇。

資料處理裝置現在可以執行縫合及分段（步驟714）。縫合將多個FOV組合成單個影像。縫合可以使用各種技術來執行。

參照圖8來解釋解碼。可以將特定FOV的對準的影像認為是包括多個影像層的堆疊，其中每個影像層為X乘Y個像素，例如2048x2048個像素。影像層數量（B）取決於色彩通道數量（例如激發波長的數量）、切換狀態數量及雜化數量（例如試劑的數量）的組合，例如B = N_hybridization * N_switch * N_channels。簡而言之，來自每個影像的每個色彩通道可以提供一影像切片。

在正規化之後，可以將此影像堆疊作為像素字的2D矩陣802來評估。矩陣802可以具有P個列804（其中P = X * Y）及B個行806，其中B是給定FOV的堆疊中的影像的數量，例如N_hybridization * N_switch * N_channels。每個列804與像素中的一者（跨堆疊中的多個影像的相同像素）對應，且來自列804的值提供像素字810。每個行806提供字810中的值中的一者，即來自該像素的影像層的強度值。如上所述，值可以被正規化，例如在0與IMAX之間變化。不同的強度值在圖8中被表示為相應細胞的不同程度的陰影。

若所有像素都被傳遞到解碼步驟，則所有P字都將如下面所述地被處理。然而，細胞邊界外的像素可以由2D掩碼（參照上面的圖4B）篩選掉且不被處理。因此，在以下分析中可以顯著減少計算負載。

資料處理系統150儲存用來對影像資料進行解碼以識別在特定像素處表達的基因的碼本822。碼本822包括多個參考碼字，每個參考碼字與特定的分析物（例如基因）相關聯。如圖8中所示，可以將碼本822表示為具有G個列824及B個行826的2D矩陣，其中G是碼字的數量，例如基因的數量（然而相同的基因可以由多個碼字所表示）。每個列824與參考碼字830中的一者對應，且每個行806提供參考碼字830中的值中的一者，如藉由已知基因的先前校準及測試所建立的。對於每個行，參考碼字830中的值可以是二進制的，即「開」或「關」。例如，每個值可以是0或IMAX中的任一者，例如1。開值及關值在圖8中由相應細胞的亮及暗的陰影所表示。因此，參考碼字中的每個位元可以與影像切片中的一者對應。

取決於過程中所使用的探針的組合，可以預期位元值的一些組合永遠不會發生；參考碼字將不會使用此類位元值組合。這個的示例在下面關於圖9進一步論述。

繼續圖8，針對要解碼的每個像素，計算像素字810與每個參考碼字830之間的距離d(p,i)。例如，可以將像素字810與參考碼字830之間的距離計算為歐幾里得距離，例如像素字中的每個值與參考碼字中的對應值之間的平方差的總和。可以將此計算表示為： 其中Ip,x是來自像素字的矩陣802的值，且Ci,x是來自參考碼字的矩陣822的值。可以使用其他的度量（例如差的絕對值的總和、餘弦角、相關性等等）而不是歐幾里得距離。

一旦針對給定的像素計算了每個碼字的距離值，就決定最小距離值，且將提供該最小距離值的碼字選作最佳的匹配碼字。換言之，資料處理裝置決定min (d(p,1), d(p,2), … d(p,B))，並將值b決定為提供最小值的i（介於1與B之間）的值。例如根據將碼字與分析物相關聯的查找表來決定與該最佳匹配碼字對應的分析物（例如基因），且將像素標記為表示分析物（例如基因）。

可以添加基因被表示在組合的螢光影像中的某個坐標（如根據FOV中的坐標及該FOV的水平偏移及垂直偏移所決定的）處的指示，例如作為元資料。此指示可以稱為「呼出（callout）」。回到圖7，資料處理裝置可以過濾掉假呼出。過濾掉假呼出的一個技術是丟棄指示基因的表達的距離值d(p,b)大於閾值處（例如在d(p,b) ＞ D1MAX時）的標籤。

現在參照圖9，示出了使用兩個讀出探針的解碼方法的示例。示出了兩個探針（讀出探針901及讀出探針902），每個探針具有螢光團920。讀出探針901包括第一靶向序列911，且讀出探針902包括第二靶向序列912及裂解位點914。例如，讀出探針901可以是來自圖3B的探針，且讀出探針902可以是來自圖3C的探針。

圖9示出來自一系列示例影像切片的像素字910（例如像素字810）及從示例碼本抽出的碼字930（例如來自矩陣822的參考碼字830）。

在包括單個裂解步驟的單個雜化輪次內，在裂解之前截取影像，對裂解位點914進行裂解，然後在裂解之後截取另一個影像。對於影像堆疊中的特定像素而言，這會提供與兩個影像切片對應的像素字910的值R1及R2。因此，對應螢光團920的色彩通道可以提供像素的兩個值，R1及R2。碼字930包括與在裂解之前的R1的影像切片對應的第一位元及與在裂解之後的R2的影像切片對應的第二位元，兩者都在相同的雜化輪次內。

取決於雜化輪次中所使用的探針的組成物，碼字中將不容許一些位元組合。例如，對於讀出探針901及讀出探針902的組合而言，示出了所有二進制組合的矩陣940。最上側的組合00、11及10容許來自預裂解成像及後裂解成像。然而，因為在此特定探針組合中，不存在具有僅在處理步驟之後活化的螢光團的探針，所以不容許組合01。

如本文中所述，用於計算像素字910與碼字930之間的距離然後對像素字910進行解碼的步驟是相同的。

可以將此說明書中所述的標的的實施例實施於計算系統中，該計算系統包括後端部件（例如資料伺服器），或包括中間軟體部件（例如應用伺服器），或包括前端部件（例如具有圖形使用者介面、網頁瀏覽器或應用程式的客戶端電腦，使用者可以藉由該圖形使用者介面、網頁瀏覽器或應用程式與此說明書中所述的的標的的實施方式互動），或包括一個或多個此類後端部件、中間軟體部件或前端部件的任何組合。可以由任何形式的數位資料通訊媒體（例如通訊網路）互連系統的部件。通訊網路的示例包括區域網路（LAN）及廣域網路（WAN）（例如網際網路）。

雖然此說明書包含許多特定實施方式細節，但這些不應被解釋為對任何發明的範圍或所可以請求保護的範圍的限制，而應被解釋為可以專用於特定發明的特定實施例的特徵的說明。也可以將在單獨實施例的背景脈絡下在此說明書中描述的某些特徵結合實施在單個實施例中。相反地，也可以單獨地或用任何合適的子組合將在單個實施例的背景脈絡下描述的各種特徵實施在多個實施例中。並且，雖然可能在上面將特徵描述為用某些組合作用且甚至起初如此主張，但在一些情況下也可以將來自所主張的組合的一或更多個特徵從該組合刪去，且所主張的組合也可以涉及子組合或子組合的變型。

類似地，雖然以特定順序在附圖中描繪及在請求項中記載操作，這不應被瞭解為需要以所示的特定順序或依序執行這樣的操作才能達成所需的結果，或不應被瞭解為需要執行所有示出的操作才能達成所需的結果。在某些情況下，多工作業及並行處理可以是有利的。而且，上述實施例中的各種系統模組及部分的分離不應被瞭解為在所有實施例中都需要此類分離，且應瞭解，所述的程式部件及系統一般可以在單個軟體產品中整合在一起或封裝到多個軟體產品中。

已經描述了標的的特定實施例。其他的實施例都在以下請求項的範圍之內。例如，可以以不同的順序執行請求項中所載的動作且仍然實現合乎需要的結果。舉一個例子，隨附的圖式中所描繪的過程不一定需要所示出的特定順序或次序順序才能實現合乎需要的結果。在一些情況下，多工作業及並行處理可以是有利的。

10:樣本 100:多工式螢光原位雜化（mFISH）成像和影像處理裝置 110:流動室 112:雜化試劑源 114:多閥門定位器 116:泵 118:壓電平台 119:化學廢棄物管理子系統 120:螢光顯微鏡 122:光源 124:顯微鏡主體 128:濾波器輪 130:激發光 132:螢光 134:攝影機 136:物鏡 138:多波段二向色反射鏡 140:控制系統 142:電腦 144:第一微控制器 146:第二微控制器 150:影像處理系統 152:資料處理元件 154:本端儲存元件 156:遠端儲存器 202:步驟 204:步驟 206:步驟 207:步驟 300:讀出探針 301:讀出探針 302:讀出探針 303:讀出探針 305:讀出探針 310:靶向序列 311:第二靶向序列 312:靶向序列 313:連接區域 314:裂解位點 320:第一螢光團 321:第二螢光團 322:淬滅劑 330:淬滅劑探針 400:編碼探針 402:編碼區域 410:目標序列 502:步驟 504:步驟 505:步驟 506:步驟 508:步驟 509:步驟 600:讀出探針 601:讀出探針 602:讀出探針 603:讀出探針 604:讀出探針 605:讀出探針 606:讀出探針 703:步驟 704:步驟 706:步驟 707:步驟 708:步驟 710:步驟 712:步驟 714:步驟 802:矩陣 804:列 806:行 810:像素字 822:碼本 824:列 826:行 830:參考碼字 901:讀出探針 902:讀出探針 910:像素字 911:第一靶向序列 912:第二靶向序列 914:裂解位點 920:螢光團 930:碼字 940:矩陣 112a:試劑 112b:清洗流體 118a:線性致動器 118b:壓電平台 122a:雷射模組 128a:發射濾波器 128b:致動器 314a:第一裂解域 314b:第二裂解域 404a:第一雜化序列 404b:第二雜化序列

圖1是用於多工式螢光原位雜化成像的裝置的示意圖。

圖2是mFISH成像中所涉及的步驟的流程圖。

圖3A-3I是示例性讀出探針設計。

圖4A描繪與編碼探針的雜化區域結合的讀出探針。

圖4B描繪與編碼探針的雜化區域結合的包括可切換模態的讀出探針。

圖4C描繪在裂解位點已被裂解（cleave）之後的包括可切換模態的讀出探針。

圖5是包括一個或多個切換步驟的mFISH成像中所涉及的步驟的流程圖。

圖6A描繪使用三個示例讀出探針的讀出呼叫深度（readout call depth）的示例。

圖6B描繪使用三個示例讀出探針及兩個淬滅探針（quenching probe）的讀出呼叫深度的示例。

圖6C描繪使用八個讀出探針及兩個螢光團的讀出呼叫深度的示例。

圖7是資料處理的方法的流程圖。

圖8示出解碼方法。

圖9示出使用兩個讀出探針的解碼方法的示例。

各種附圖中的類似的附圖標記及符號指示類似的元件。

國內寄存資訊 (請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無

國外寄存資訊 (請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無

802:矩陣

804:列

806:行

810:像素字

822:碼本

824:列

826:行

830:參考碼字

Claims (11)

1. 一種用於螢光原位雜化成像的系統，該系統包括：一流動室，用來容納一樣本，該樣本要暴露於一試劑中的具有螢光團的探針；一閥門，用來控制從複數個試劑源中的一者到該流動室的流動；一泵，用來造成通過該流動室的流體流動；一顯微鏡，包括一變頻激發光源及一攝影機，該攝影機被定位為接收來自該樣本的發射的光；一馬達，用來造成該流動室與該顯微鏡之間的相對側向運動；及一控制系統，被配置為將以下操作作為嵌套的迴圈來進行：使得該閥門依序將該流動室耦接到複數個不同的試劑源，以將該樣本暴露於複數個不同的試劑，該複數個不同的試劑包括至少一個類型的可修改讀出探針，針對該複數個讀出探針中的每個類型的可修改讀出探針，切換相應類型的該複數個讀出探針，使得相應類型的該複數個讀出探針通過一狀態序列進行，及針對該狀態序列中的每個狀態，獲得一影像，以增大每輪雜化的資訊容量。
2. 一種用於螢光原位雜化成像的系統，該系統包括：一流動室，用來容納一樣本，該樣本要暴露於一試劑中的具有螢光團的探針；一閥門，用來控制從複數個試劑源中的一者到該流動室的流動；一泵，用來造成通過該流動室的流體流動；一顯微鏡，包括一變頻激發光源及一攝影機，該攝影機被定位為接收來自該樣本的發射的光；一馬達，用來造成該流動室與該顯微鏡之間的相對側向運動；及一控制系統，被配置為將以下操作作為嵌套的迴圈來進行：使得該閥門將該流動室耦接到試劑源，以將該樣本暴露於一試劑，該試劑包括至少一個類型的可修改讀出探針，針對該複數個讀出探針中的每個類型的可修改讀出探針，切換相應類型的該複數個讀出探針，使得相應類型的該複數個讀出探針通過一狀態序列進行，及針對該狀態序列中的每個狀態，在相同波長獲得一影像。
3. 如請求項1或2所述的系統，其中該控制系統被配置為將以下操作作為嵌套的迴圈來進行： 針對該狀態序列中的每個狀態，使得該馬達相對於該樣本以複數個不同的視場依序定位該顯微鏡，針對該複數個不同視場中的每個視場，使得該變頻激發光源依序發射複數個不同的激發波長，及針對該複數個不同激發波長中的每個波長，獲得覆蓋該樣本的相應視場的一影像，其中相應試劑的相應探針處於相應的狀態且該樣本由相應的激發波長所照射。
4. 如請求項1或2所述的系統，包括定位為照射該流動室的一光裂解光源，且其中該控制系統被配置為啟動該光裂解光源，使得該複數個讀出探針暴露於該光裂解光且該可修改讀出探針中的一裂解區域被裂解。
5. 如請求項1或2所述的系統，包括一裂解化學物質源，且其中該控制系統被配置為使得一致動器將裂解化學物質從該裂解化學物質源遞送到該流動室，使得該複數個讀出探針暴露於該裂解化學物質且該可修改讀出探針中的一裂解區域被裂解。
6. 如請求項1或2所述的系統，包括一洗滌液體源，且其中該控制系統被配置為使得一致動器將洗滌液體從該洗滌液體源遞送到該流動室，使得該複數個讀出探針暴露於該洗滌液體且將該可修改讀出探針從該樣本洗去。
7. 一種電腦程式產品，有形地實施在包括指令的一非暫時性電腦可讀取媒體中，該等指令用來使得一個或多個電腦進行以下操作：儲存包括複數個碼字的一碼本，每個碼字包括複數個位元及對一分析物的一相關聯的指示，其中每個碼字包括與來自一相同的雜化步驟內的一相同的第一色彩通道對應的多個位元，且其中該多個位元的不同值組合與不同的分析物對應；從請求項1至6中任一項所述的用於螢光原位雜化成像的系統獲得複數個影像切片，其中來自該複數個影像切片的多個影像切片與來自該相同的雜化步驟內的該相同的色彩通道對應；配準該複數個影像以形成一配準影像堆疊；決定包括複數個值的一像素字，其中每個強度值與該配準影像堆疊的一影像中的一配準的像素對應，將該像素字與該複數個碼字中的每個碼字進行比較，以尋找一最佳匹配的碼字；及決定與該最佳匹配的碼字對應的該分析物。
8. 如請求項7所述的電腦程式產品，其中每個碼字包括與來自該相同的雜化步驟內的一相同的第二色彩通道對應的多個第二位元，且其中來自該複數個影像切片的多個第二影像切片與來自該相同的雜化步驟內的該相同的第二色彩通道對應。
9. 如請求項8所述的電腦程式產品，其中該多個第二位元的不同的值組合與不同的分析物對應。
10. 如請求項7所述的電腦程式產品，其中每個碼字包括與來自該相同的雜化步驟內的該相同的色彩通道對應的三個位元，且其中來自該複數個影像切片的三影像切片與來自該相同的雜化步驟內的該相同的色彩通道對應。
11. 如請求項10所述的電腦程式產品，其中該三個位元的不同的值組合與不同的分析物對應。