TW202216775A - 位點特異性Notch活化分子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係有關於靶向Notch受體的多特異性抗原結合分子及其用途等。本發明提供了包含特異性結合至第一靶細胞上的Notch受體的第一抗原結合部分和特異性結合至第二靶細胞上的錨定抗原的第二抗原結合部分的多特異性抗原結合分子。再者，本發明人證明了本發明的多特異性抗原結合分子對錨定依賴性Notch訊息傳遞的活化。

Description

位點特異性Notch活化分子及其用途
本揭露有關於靶向Notch受體的多特異性抗原結合分子及其用途等。
Notch受體家族和Notch配體的介紹 Notch 訊息傳遞是一個高度保守的過程，其對多種細胞系統至關重要，且其失調(deregulation)與大量發育障礙和惡性腫瘤有牽連。跨膜受體的Notch家族由人類和小鼠中的四種蛋白質同種同源物(paralog) (Notch1-4) 構成，其在很大程度上具有非多餘功能。在細胞膜定位之前，Notch受體轉譯後在S1位點被切割。這種切割發生在由類弗林蛋白質酶 (furin-like protease，NPL 1) 介導的反式高基氏體網絡內。形成成熟膜結合Notch的兩個多肽被稱為胞外域(extracellular domain，ECD)，而跨膜片段由跨膜域和胞內域構成。 從 N 端開始，ECD由29-36個類表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)域所組成。 據報導，EGF重複序列12是涉及受體-配體交互作用的主要結合域。在類EGF重複域之後是負調節區 (negative regulatory region，NRR)，其含有三個富含半胱胺酸的Lin12/Notch重複序列 (Lin12/Notch repeat，LNR)及連接跨膜域和 ECD 多肽以形成 Notch 異源二聚體的HD域(NPL 1)。NRR在介導Notch受體的自動抑制(auto-inhibition)中至關重要且在沒有正確訊號的情況下防止活化(NPL 2)。 人類和小鼠中的Delta/Serrate/Lag-2 (DSL)家族的Notch配體分為2類，取決於它們是果蠅Notch配體Delta還是Serrate的同源物(homolog)。類Delta配體(Delta-like ligand，DLL) 包含DLL1、DLL3、DLL4，而Serrate同源物包含Jagged1 (也稱為 Jag1)和 Jagged2 (也稱為 Jag2)。儘管四種Notch受體之間有功能差異，但與DLL或Jagged配體的交互作用皆會導致相同的經典(canonical)訊息傳遞路徑的活化(NPL 3)。
Notch訊息傳遞的生理功能，特別是在幹細胞訊息傳遞和組織再生中的角色 Notch訊息傳遞路徑被認為是少數在胚胎和成人組織的多個發育過程中重複使用的訊息傳遞路徑之一。在發育過程中，Notch 訊息傳遞涉及嚴格控制各種組織幹細胞(stem cell，SC) 的自我更新和分化之間的平衡，且負責維持組織恆定和受損組織的再生(NPL 3)。Notch活化的環境特異性決定了所發生的特定過程或功能事件(例如分化、增殖或凋亡)及此類事件何時發生(即發育階段)(NPL 4)。因此，此依賴環境的Notch活性可驅動多細胞真核生物許多方面的發育，且最近與胚胎和成人組織中的幹細胞命運和維持有關，包含衛星細胞、神經幹細胞、腸幹細胞和造血幹細胞。
目前療法的限制 Notch訊息傳遞的組成是有吸引力的治療目標，因為Notch訊息傳遞的失調跟過多的發育異常(disorder)和惡性腫瘤有關。然而，迄今為止，有幾種小分子顯示出對Notch訊息傳遞的選擇性抑制(NPL 5 和 6)。gamma-分泌酶抑制劑 (gamma-secretase inhibitor，GSI) 已廣泛用於阻斷Notch的蛋白質裂解活化，但也已知它們的作用是非特異性的，因為它們亦阻斷超過90種其他基質的處理，包含類澱粉前驅蛋白質(amyloid precursor protein，APP)、E-鈣黏蛋白質(E-cadherin)和 ErbB4 (NPL 7 至 9)。然而，此外，此類化合物抑制多種跨膜蛋白質的蛋白質裂解，其包含全部四種Notch受體 (NPL 10)，且當長期投予時會引起顯著毒性，最顯著的是由結腸杯狀細胞轉變(colonic goblet cell metaplasia)引起的嚴重分泌性腹瀉 (NPL 11)。此胃腸道毒性被認為是因為抑制了會促進結腸隱窩中的前驅幹細胞分化為吸收性腸細胞的NOTCH1和/或 NOTCH2 (NPL 12)。
除了小分子外，幾個團體已報導了對特定Notch受體有選擇性的拮抗性抗體(NPL 13至17)。 然而，這些Notch拮抗性抗體大多專注於靶向腫瘤適應症，且其臨床應用受到類似於小分子抑制劑所面臨的考慮所限制。 [引用列表] [非專利文獻(Non patent Literature，NPL)]
[NPL 1] Proc Natl Acad Sci USA. 1998 Jul 7;95(14):8108 [NPL 2] Nature Structural & Molecular Biology, 14, 295-300(2007) [NPL 3] Development 2013 140: 689-704 [NPL 4] Cell Death & Disease 8, e2595 (2017) [NPL 5] Sci Rep. 2019; 9: 10811. [NPL 6] Methods Mol Biol. 2014;1187:311-22. [NPL 7] Nature. 1999 Apr 8;398(6727):518-22. [NPL 8] J Alzheimers Dis. 2011;25(1):3-28. [NPL 9] Breast Cancer (Dove Med Press). 2012 Jun 21;4:83-90. [NPL 10] Nature Reviews Molecular Cell Biology, 5, 499-504(2004) [NPL 11] The Journal of Biological Chemistry, 279,12876-12882. [NPL 12] Nature volume 435, pages964-968(2005) [NPL 13] Methods. 2012 Sep; 58(1): 69-78. [NPL 14] Methods Mol Biol. 2014;1187:335-42. [NPL 15] The Journal of Biological Chemistry, 283, 8046-8054. [NPL 16] Clin Cancer Res; 21(9) May 1, 2015 [NPL 17] Plos One, February 2010, Volume 5, Issue 2, e9094
[技術問題]
本發明人認為將Notch調節作用限制在病理位點，而不對正常組織有副作用是有挑戰性的。因此，提高Notch調節劑的位點特異性是避開Notch調節劑全身投予的導致副作用的潛在策略之一。本發明是基於這樣的想法做出來的。本揭露的一目的是提供能夠以細胞錨定(anchorage)依賴性方式在感興趣的細胞中活化Notch訊息傳遞路徑的多特異性抗原結合分子、產生多特異性抗原結合分子的方法、和包含此種多特異性抗原結合分子作為活化感興趣的細胞中的Notch訊息傳遞路徑的活性成分的醫藥組合物。
之前有一篇回顧描述了參與Notch訊息傳遞、配體/受體交互作用和蛋白質裂解活化的觸發的核心組成(Cell. 2009 Apr 17;137(2):216-33)。根據此報告，作者的理論如下：Notch訊息傳遞的活化涉及：(1)允許Notch受體與其配體(類Delta配體和Jagged配體)之間的交互作用的細胞間接觸；(2)在配體參與後，Notch受體發生構形變化，產生使Notch受體內稱為負調節區(negative regulatory region，NRR)的保護域暴露的機械力。這將導致S2位點的後續蛋白質裂解的切割，且其餘結構域被S3位點的持續性活性gamma分泌酶辨認和切割，而釋放Notch胞內域 (Notch intracellular domain，NICD)；且(3)NICD從膜上的核轉位導致其結合至保守性轉錄因子，CSL；CBF1/RBPJ，以上調(upregulate) Notch靶基因。 [解決問題之技術手段]
發明人發現當(或僅當)多特異性抗原結合分子結合至第二靶細胞上的錨定抗原時，包含特異性結合至第一靶細胞上的Notch受體的第一抗原結合部分(moiety)、和特異性結合至第二靶細胞上的錨定抗原的第二抗原結合部分的多特異性抗原結合分子可在第一靶細胞中引起Notch訊息傳遞活化(即錨定依賴性訊息傳遞活化)。Notch訊息傳遞路徑活化的組織或位點特異性是由位點特異性結合域與其表現是對感興趣的組織或細胞群具有特異性、排他性或限制性獨特的錨定抗原的選擇性結合所賦予的。可藉由採用此種多特異性抗體形式，來實現位點特異性 Notch「反式活化」的概念。
更具體地，本發明提供以下內容： [1] 一種多特異性抗原結合分子，包含： (i) 第一抗原結合部分，其特異性結合至第一靶細胞上的Notch受體，及 (ii) 第二抗原結合部分，其特異性結合至第二靶細胞上的錨定抗原， 其中第一靶細胞和第二靶細胞是不同細胞，且 其中當多特異性抗原結合分子結合至第二靶細胞上的錨定抗原，多特異性抗原結合分子活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑。 [2] 如[1]所述的多特異性抗原結合分子，其中第一靶細胞是組織幹細胞、活化的CD4 T淋巴細胞、細胞分泌促纖維化因子(cell secreting pro-fibrotic factor)或腫瘤微環境中的促致瘤細胞(pro-tumorigenic cell)。 [3] 如[2]所述的多特異性抗原結合分子，其中組織幹細胞是衛星細胞、成人腸幹細胞或隱窩基底柱狀細胞(crypt base columnar (CBC) cell)。 [4] 如[1]至[3]中任一者所述的多特異性抗原結合分子，其中第一結合部分包含Notch受體配體的Notch結合域。 [5] 如[4]所述的多特異性抗原結合分子，其中Notch受體配體是Notch1、Notch2、Notch3或Notch4受體的配體。 [6] 如[4]或[5]所述的多特異性抗原結合分子，其中Notch受體是Delta蛋白質或Jagged蛋白質。 [7] 如[6]所述的多特異性抗原結合分子，其中Delta蛋白質是類Delta配體1(Delta Like Ligand 1，DLL1)、DLL3或DLL4。 [8] 如[6]所述的多特異性抗原結合分子，其中Jagged蛋白質是Jagged 1或Jagged 2。 [9] 如[1]至[3]中任一者所述的多特異性抗原結合分子，其中第一抗原結合部分包含特異性結合至Notch受體的一Fab、scFv、VHH、VL、VH或單一域抗體。 [10] 如[1]至[9]中任一者所述的多特異性抗原結合分子，其中第二靶細胞係選自由不是衛星細胞的肌肉細胞、活化的纖維母細胞、表現FcgRIIB的免疫細胞、表現GPC3的癌細胞和在腸隱窩中的細胞所組成的群組。 [11] 如[10]所述的多特異性抗原結合分子，其中表現FcgRIIB的免疫細胞係選自由循環B淋巴細胞(circulating B lymphocyte)、單核細胞(monocyte)、嗜中性球(neutrophil)、淋巴樹突細胞(lymphoid-dendritic cell)和骨髓樹突細胞(myeloid-dendritic cell)所組成的群組。 [12] 如[10]所述的多特異性抗原結合分子，其中在第二靶細胞上的錨定抗原係選自由鈣電壓閘控通道次單元Alpha1 S (Calcium Voltage-Gated Channel Subunit Alpha1 S，CACNA1S)、纖維母細胞活化蛋白質(Fibroblast activation protein，FAP)、磷脂肌醇聚糖3 (Glypican-3，GPC3)和Fc gamma RIIB (CD32B)所組成的群組。 [13] 如[1]至[12]中任一者所述的多特異性抗原結合分子，其中第二抗原結合部分包含特異性結合至錨定抗原的Fab、scFv、VHH、VL、VH、單一域抗體、配體或工程化(engineered)Fc區。 [14] 如[1]至[13]中任一者所述的多特異性抗原結合分子，其中多特異性抗原結合分子更包含Fc區。 [15] 如[14]所述的多特異性抗原結合分子，其中相比於天然人類IgG1 Fc域，Fc區是對人類Fc gamma受體展現出降低的結合親和力的工程化Fc區。 [16] 如[13]至[15]中任一者所述的多特異性抗原結合分子，其中第二抗原結合部分包含特異性結合至FcgRIIB的工程化Fc區。 [17] 如[16]所述的多特異性抗原結合分子，其中多特異性抗原結合分子更包含多一個第一抗原結合部分。 [18] 如[16]所述的多特異性抗原結合分子，其中多特異性抗原結合分子更包含特異性結合至在第三靶細胞上的錨定抗原的第三抗原結合部分。 [19] 如[18]所述的多特異性抗原結合分子，其中第二靶細胞和第三靶細胞是不同細胞或相同細胞。 [20] 一種醫藥組合物，包含如[1]至[19]中任一者所述之多特異性抗原結合分子，及醫藥上可接受的載劑。 [21] 一種活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑的方法，包含使第一靶細胞接觸有效量之如[1]至[19]中任一者所述之多特異性抗原結合分子或如[20]所述的醫藥組合物。 [22] 如[21]所述之方法，其中第一靶細胞在生物體內時是在哺乳動物對象中。 [23] 如[22]所述之方法，其中對象為人類。 [24] 一種編碼如[1]至[19]中任一者所述之多特異性抗原結合分子的單離核酸。 [25] 一種包含如[24]所述之核酸的載體。 [26] 一種包含如[24]所述之核酸或如[25]所述之載體的宿主細胞。 [27] 一種產生如[1]至[19]中任一者所述之多特異性抗原結合分子的方法，包含培養如[26]所述之宿主細胞。
在此描述或引用的技術和流程通常為本發明所屬技術領域中具有通常知識者很好理解且使用常規方法來普遍採用，例如在Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003))；the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987))；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press；Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons；Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)；Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)；Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)；和Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)中所述之廣泛使用的方法學。
提供以下定義和詳細描述，以促進對本文所說明的本揭露的理解。
定義 胺基酸 在本文中，胺基酸由一或三字母代碼或兩者描述，例如Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/W、His/H、Tyr/Y、Ile/I、或Val/V。
胺基酸的改變
對於抗原結合分子的胺基酸序列中的胺基酸改變(在此說明中亦稱為「胺基酸置換」或「胺基酸突變」)，可適當地使用例如定點誘變法(Kunkel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492)) 和重疊延伸PCR的已知方法。再者，也可採用幾種已知的方法作為取代非天然胺基酸的胺基酸改變法(Annu Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2006) 35, 225-249；和 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.  (2003) 100 (11), 6353-6357)。例如，適合使用含有具有與終止密碼子之一的UAG密碼子的互補琥珀抑制tRNA結合的非天然胺基酸(琥珀密碼子)tRNA的無細胞轉譯系統(Clover Direct (Protein Express))。
在本說明書中，當描述胺基酸改變的位點時，術語「和/或」的含義包含其中「和」及「或」適當組合的每個組合。具體而言，例如，「第 33、55和/或96 位的胺基酸被取代」包含以下胺基酸改變的變異：(a)第 33 位、(b)第 55 位、(c)第96位、(d)第33和55位、(e)第33和96、(f)第55和96、及(g)第33、55和96的胺基酸。
再者，本文中，作為表示胺基酸的改變的表示法，可適當地使用在所指定的特定位置的數字之前和之後，分別顯示改變之前和之後的胺基酸的一個字母或三個字母的代碼的表示法。例如，當取代抗體可變區中所含有的胺基酸時所使用的改變N100bL或Asn100bLeu係表示第100b位 (根據Kabat編號)的Asn被Leu取代。也就是說，數字表示根據Kabat編號的胺基酸位置，數字之前寫的一個字母或三個字母的胺基酸代碼表示取代前的胺基酸，數字之後寫的一個字母或三個字母的胺基酸代碼表示取代後的胺基酸。類似地，當取代抗體可變區中所含有的胺基酸時所使用的改變P238D或Pro238Asp係表示第238位 (根據Kabat編號)的Pro被Asp取代。也就是說，數字表示根據Kabat編號的胺基酸位置，數字之前寫的一個字母或三個字母的胺基酸代碼表示取代前的胺基酸，數字之後寫的一個字母或三個字母的胺基酸代碼表示取代後的胺基酸。
多肽 如本文所使用，術語「多肽」是指由藉由醯胺鍵(也稱為胜肽鍵)線性連接的單體(胺基酸)所構成的分子。術語「多肽」是指二或更多個胺基酸的任何鏈，而不是指特定長度的產物。因此，單肽、雙肽(dipeptide)、三肽(tripeptide)、寡肽(oligopeptide)、「蛋白質」、「胺基酸鏈」或任何其它用於表示二或更多個胺基酸的鏈的術語都包含在「多肽」的定義內，且術語「多肽」可代替這些術語中的任一個或與這些術語中的任一個互換使用。術語「多肽」也意指多肽表現後修飾的產物，包含但不限於糖基化(glycosylation)、乙醯化(acetylation)、磷酸化(phosphorylation)、醯胺化(amidation)、已知保護/阻擋基團的衍生化、蛋白質裂解切割或經非天然胺基酸的修飾。多肽可衍生自天然生物來源或藉由重組技術產生，但不一定由指定的核酸序列轉譯而來。它可以任何方法產生，包含藉由化學合成。如本文所述的多肽的尺寸可為約3個或更多、5個或更多、10個或更多、20個或更多、25個或更多、50個或更多、75個或更多、100個或更多、200個或更多、500個或更多、1,000或更多、或 2,000或更多個胺基酸。多肽可具有確定的三維結構，儘管它們不一定具有這樣的結構。具有確定的三維結構的多肽稱為折疊的，而沒有確定的三維結構而是可採用大量不同構形的多肽稱為未折疊的。
胺基酸序列一致性百分比(%) 相對於參考多肽序列的「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對序列且若有必要的話，則將間隙導入以達到最大的序列一致性百分比，且不將任何保守取代視為序列一致性的一部分後，候選序列中與參考多肽序列的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分比。可用本發明所屬領域技術內的各種方式，來實現用於確定胺基酸序列一致性百分比的比對，例如，使用公開可用的電腦軟體例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign(DNASTAR)軟體或GENETYX(註冊商標)(Genetyx Co., Ltd.)。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可確定用於比對序列的合適參數，包含在所比較的序列的全長上實現最大比對所需的任何演算法。然而，出於本文的目的，使用序列比較電腦程序ALIGN-2，來產生胺基酸序列一致性%值。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech, Inc.編寫，且源代碼已與用戶文件一起歸檔(file)於U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559中，且註冊於美國版權註冊號TXU510087中。ALIGN-2程式可從Genentech, Inc., South San Francisco, California公開獲得，或也可從源代碼中進行編譯。ALIGN-2程式應編譯在UNIX操作系統上使用，包含數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設置，且沒有改變。在使用ALIGN-2進行胺基酸序列比較的情況下，給定的胺基酸序列A對、和或針對給定的胺基酸序列B (可替代地表示為對、和或針對給定的胺基酸序列B具有或包含某胺基酸序列相同度%的給定的胺基酸序列A)的胺基酸序列相同度%的計算如下： 100乘以分數X/Y 其中X是在此程式的A和B的比對中被序列比對程式ALIGN-2計為相同匹配的胺基酸殘基的數目，且其中Y是B中胺基酸殘基的總數目。應理解的是，若胺基酸序列A的長度不等於胺基酸序列B的長度，則A對B的胺基酸序列相同度%將不等於B對A的胺基酸序列相同度%。除非另有具體說明，否則如前一段落所述，使用ALIGN-2電腦程式，來獲得本文使用的所有胺基酸序列相同度%值。
重組方法及組合物 可使用重組方法和組合物來產生抗體，例如如美國專利號4,816,567中所述。在一實施例中，提供了編碼本文所述之抗體的單離核酸。這樣的核酸可編碼包含抗體的VL的胺基酸序列和/或包含抗體的VH的胺基酸序列(例如抗體的輕鏈和/或重鏈)。在又一實施例中，提供了包含此類核酸的一或多種載體(例如表現載體)。在又一實施例中，提供了包含此類核酸的宿主細胞。在一此類實施例中，宿主細胞包含(例如已經用以下所述轉形)：(1) 載體，其包含編碼包含抗體的VL的胺基酸序列和包含抗體的VH的胺基酸序列的核酸、或(2) 第一載體，其包含編碼包含抗體的VL的胺基酸序列的核酸及第二載體，其包含編碼包含抗體的VH的胺基酸序列的核酸。在一實施例中，宿主細胞是真核的，例如中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary，CHO)細胞或類淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp2/0細胞)。在一實施例中，提供了一種製造本揭露的多特異性抗原結合分子的方法，其中此方法包含在適合表現抗體的條件下，培養包含如上所提供之包含編碼抗體的核酸的宿主細胞，和視需要而定地從宿主細胞(或宿主細胞培養基)中回收抗體。
為了重組產生本文所述之抗體，將例如如上所述之編碼抗體的核酸單離，且將其插入至一或多種載體中，以在宿主細胞中進一步選殖和/或表現。可使用常規流程(例如藉由使用能夠特異性結合至編碼抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)輕易地將此類核酸單離和定序。
用於選殖或表現編碼抗體的載體的合適宿主細胞包含本文所述的原核或真核細胞。例如，可在細菌中產生抗體，特別是在不需要糖基化和Fc效應子功能時。對於在細菌中表現抗體片段和多肽，參閱例如，美國專利號5,648,237、5,789,199和5,840,523。 (亦參閱Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254，其描述了在大腸桿菌中表現抗體片段。)表現之後，可從細菌細胞糊的可溶級分(fraction)中單離出抗體，且可進一步純化。
除原核生物外，真核微生物例如絲狀真菌或酵母菌，也是編碼抗體的載體的合適選殖或表現宿主，包含其糖基化路徑已被「人源化」的真菌和酵母菌株，從而產生具有部分或完全人類糖基化模式的抗體。參閱Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)、和Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)。
用於表現糖基化抗體的合適宿主細胞也衍生自多細胞有機體(無脊椎動物和脊椎動物)。無脊椎動物細胞的範例包含植物和昆蟲細胞。已鑑定出許多桿狀病毒株(baculoviral strain)，其可與昆蟲細胞結合使用，特別是用於節食斜紋夜蛾細胞(Spodoptera frugiperda cell)的轉染。
植物細胞培養物也可作為宿主。參閱例如美國專利號5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429 (描述了在轉基因植物中產生抗體的PLANTIBODIES TM科技)。
脊椎動物細胞也可作為宿主。例如，適應在懸浮液中生長的哺乳動物細胞可能是有用的。有用的哺乳動物宿主細胞系的其他範例是由SV40 (COS-7)轉形的猴腎CV1系；人類胚胎腎細胞系(293或293細胞，如Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)中所述)；嬰兒倉鼠腎細胞(baby hamster kidney cell，BHK)；小鼠史托利細胞(mouse sertoli cell)(TM4細胞，例如Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)中描述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；水牛大鼠肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，例如Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)中所述；MRC 5細胞；和FS4細胞。其他有用的哺乳動物宿主細胞系包含中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細胞，其包含DHFR -CHO細胞(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；和骨髓瘤細胞系例如Y0、NS0和Sp2/0。適合產生抗體的某些哺乳動物宿主細胞系的回顧，參閱例如Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)。
本文所述的抗原結合分子的重組產生可用與上述那些類似的方法進行，藉由使用包括(例如已經用以下所述轉形)包含編碼包含整個抗原結合分子或部分抗原結合分子的胺基酸序列的核酸一或多種載體的宿主細胞。
抗原結合分子和多特異性抗原結合分子 如本文所使用，術語「抗原結合分子」是指包含抗原結合位點的任何分子或對抗原具有結合活性的任何分子，且更可指例如胜肽或蛋白質的分子長度約為五個或更多個胺基酸。胜肽和蛋白質不限於來衍生自活有機體的那些，且例如，它們可為由人工設計的序列產生的多肽。它們也可為任何天然多肽、合成多肽、重組多肽等。包含作為支架(scaffold)的已知穩定構形結構例如alpha/beta桶，且其中分子的一部分被製成抗原結合位點的支架分子，也是本文所述的抗原結合分子的一實施例。
「多特異性抗原結合分子」是指特異性結合至超過一種抗原的抗原結合分子。術語「雙特異性」是指抗原結合分子能夠特異性結合至至少兩種不同的抗原決定子。術語「三特異性」是指抗原結合分子能夠特異性結合至至少三種不同的抗原決定子。
在某些實施例中，本申請的多特異性抗原結合分子是雙特異性抗原結合分子，即特異性結合至第一靶細胞上的Notch受體，且特異性結合第二靶細胞上的錨定抗原。
在某些實施例中，表現Notch受體的第一靶細胞和表現錨定抗原的第二靶細胞是不同的細胞。
在某些實施例中，本申請的多特異性抗原結合分子是三特異性抗原結合分子，即特異性結合至第一靶細胞上的Notch受體，特異性結合至第二靶細胞上的錨定抗原，且特異性結合至第三靶細胞上的錨定抗原。 在某些實施例中，表現Notch受體的第一靶細胞和表現錨定抗原的第二靶細胞是不同的細胞，且表現錨定抗原的第二靶細胞和表現錨定抗原的第三靶細胞是不同的細胞或相同細胞。在某些實施例中，表現Notch受體的第一靶細胞和表現錨定抗原的第三靶細胞是不同的細胞。
本揭露的多特異性抗原結合分子的組成可以多種配置彼此融合。 示例性配置如圖1所繪示。
在一些態樣中，本發明的多特異性抗原結合分子包含至少一第一抗原結合部分(例如，Notch促效域)，例如一或兩個第一抗原結合部分。在一些態樣中，本發明的多特異性抗原結合分子包含至少一第二抗原結合部分(例如位點特異性結合域)，例如一或兩個第二抗原結合部分。
在一態樣中，本揭露提供了一種多特異性抗原結合分子，其包含： (i) 第一抗原結合部分，其特異性結合至第一靶細胞上的Notch受體，及 (ii) 第二抗原結合部分，其特異性結合至第二靶細胞上的錨定抗原， 其中第一靶細胞和第二靶細胞是不同的細胞，且多特異性抗原結合分子反式活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑。 在一態樣中，特徵「多特異性抗原結合分子反式活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑」替代地如下所指：當(或僅當)多特異性抗原結合分子結合至第二靶細胞上的錨定抗原時，多特異性抗原結合分子活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑。較佳地，第二靶細胞上的錨定抗原在第一靶細胞中不表現(或不顯著/基本上不/不特異性表現)。
在一態樣中，本揭露提供了一種多特異性抗原結合分子，其包含： (i) 第一抗原結合部分，其特異性結合至第一靶細胞上的Notch受體，及 (ii) 第二抗原結合部分，其特異性結合至第二靶細胞上的錨定抗原， 其中第一靶細胞和第二靶細胞是不同的細胞。
在某些態樣中，本揭露提供了更包含Fc區的多特異性抗原結合分子。 在某些實施例中，與天然人類IgGl Fc域相比，Fc區可為對人類Fc gamma受體表現出降低的結合親和力的Fc區。在某些實施例中，與多特異性抗原結合分子相同的同種型的野生型IgG抗體的Fc區之結合至Fc gamma受體的能力相比，Fc區可為對Fc gamma受體表現出降低的結合能力。
在一態樣中，本揭露提供了一種多特異性抗原結合分子，其包含： (i) 第一抗原結合部分，其特異性結合至第一靶細胞上的Notch受體，及 (ii) 第二抗原結合部分，其特異性結合至第二靶細胞上的錨定抗原， 其中第一靶細胞和第二靶細胞是不同的細胞，且多特異性抗原結合分子反式活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑。
在一態樣中，特徵「多特異性抗原結合分子反式活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑」替代地如下所指：當(或僅當)多特異性抗原結合分子結合至第二靶細胞上的錨定抗原時，多特異性抗原結合分子活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑。較佳地，第二靶細胞上的錨定抗原在第一靶細胞中不表現(或不顯著/基本上不/不特異性表現)。
在一實施例中，第二抗原結合部分包含特異性結合至第二靶細胞上的錨定抗原的工程化Fc區。在一實施例中，第二抗原結合部分包含特異性結合至作為錨定抗原的FcgRIIB的工程化Fc區。在某些實施例中，多特異性抗原結合分子更包含多一個第一抗原結合部分。
在一態樣中，本揭露提供了一種多特異性抗原結合分子，其包含： (i) 第一抗原結合部分，其特異性結合至第一靶細胞上的Notch受體，及 (ii) 第二抗原結合部分，其特異性結合至第二靶細胞上的錨定抗原， 其中第一靶細胞和第二靶細胞是不同的細胞，且多特異性抗原結合分子反式活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑。 在一態樣中，特徵「多特異性抗原結合分子反式活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑」替代地如下所指：當(或僅當)多特異性抗原結合分子結合至第二靶細胞上的錨定抗原時，多特異性抗原結合分子活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑。較佳地，第二靶細胞上的錨定抗原在第一靶細胞中不表現(或不顯著/基本上不/不特異性表現)。
在一實施例中，第二抗原結合部分包含特異性結合至第二靶細胞上的錨定抗原的工程化Fc區。在一實施例中，第二抗原結合部分包含特異性結合至作為錨定抗原的FcgRIIB的工程化Fc區。在一實施例中，多特異性抗原結合分子更包含特異性結合至錨定抗原的第三抗原結合部分。
在某些實施例中，第二靶細胞和第三靶細胞可為不同的細胞或相同的細胞。在某些實施例中，表現Notch受體的第一靶細胞和表現錨定抗原的第三靶細胞是不同的細胞。
根據以上實施例中的任一個，多特異性抗原結合分子的組成(例如抗原結合部分、Fc區(「Fc域」))可直接融合或透過本文中描述或在本發明所屬技術領域中已知的各種連接子(linker)特別是包含一或多個胺基酸，通常約2-20個胺基酸的胜肽連接子來融合。合適的非免疫原性胜肽連接子包含例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n或G4(SG4)n胜肽連接子，其中n通常是1和10之間的數字，通常在2和4之間。
在一態樣中，本揭露提供了一種多特異性抗原結合分子，其包含： (i) 第一抗原結合部分，其特異性結合至第一靶細胞上的Notch受體，及 (ii) 第二抗原結合部分，其特異性結合至第二靶細胞上的錨定抗原， 其中第一抗原結合部分和第二抗原結合部分各自包含抗體可變區，其中第一抗原結合部分的第一抗體可變區與第一重鏈恆定區融合，第一抗原結合部分的第二抗體可變區與第一輕鏈恆定區融合，第二抗原結合部分的第三抗體可變區與第二重鏈恆定區融合，第二抗原結合部分的第四抗體可變區與第二輕鏈恆定區融合。
焦麩醯胺化(Pyroglutamylation) 眾所皆知的是，當抗體在細胞中表現時，抗體在轉譯後被修飾。轉譯後修飾的範例包含藉由羧肽酶(carboxypeptidase)切割重鏈C末端的離胺酸；藉由焦麩胺酸化；糖基化(glycosylation)；氧化；脫醯胺化(deamidation)；和糖基化(glycation)將重鏈和輕鏈N端的麩醯胺酸(glutamine)或麩胺酸(glutamic acid)修飾為焦麩胺酸(pyroglutamic acid)，且已知這種轉譯後修飾發生於各種抗體中(Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, Vol. 97, p. 2426-2447)。
本揭露的多特異性抗原結合分子亦包含經過轉譯後修飾的多特異性抗體。經過轉譯後修飾的本揭露的其多特異性抗原結合分子的範例包含在重鏈可變區的N端經過焦麩醯胺化和/或在重鏈的C端缺失離胺酸的多特異性抗體。本領域已知此種由於N端焦麩醯胺化和C端離胺酸缺失所引起的轉譯後修飾對抗體的活性沒有任何影響(Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p. 24-39)。
特異性結合至Notch受體的抗原結合部分 如本文所使用，術語「抗原結合部分」是指特異性結合至抗原的多肽分子。在一實施例中，抗原結合部分能夠將其附著的實體(entity)引導至靶位點，例如引導至表現Notch受體的特定類型的細胞。 在另一實施例中，特異性結合至Notch受體的抗原結合部分能夠活化透過Notch受體的訊息傳遞，例如以錨定抗原依賴性方式的Notch訊息傳遞路徑。抗原結合部分可包含本文進一步定義的抗體、其片段、配體。 在某些實施例中，抗原結合部分可包含抗原結合域或抗體的抗體可變區，包含抗體重鏈可變區和抗體輕鏈可變區。在某些實施例中，抗原結合部分可包含如本文進一步定義和本發明所屬技術領域中已知的抗體恆定區。有用的重鏈恆定區包含五種同種型中的任一種：alpha、delta、epsilon、gamma或 mu。有用的輕鏈恆定區包含兩種同種型中的任一種：kappa和lambda。
在一態樣中，本揭露提供了一種多特異性抗原結合分子，其包含： (i) 第一抗原結合部分，其特異性結合至第一靶細胞上的Notch受體，及 (ii) 第二抗原結合部分，其特異性結合至第二靶細胞上的錨定抗原， 其中第一靶細胞和第二靶細胞是不同的細胞，且多特異性抗原結合分子反式活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑。 在一態樣中，特徵「多特異性抗原結合分子反式活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑」替代地如下所指：當(或僅當)多特異性抗原結合分子結合至第二靶細胞上的錨定抗原時，多特異性抗原結合分子活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑。較佳地，第二靶細胞上的錨定抗原在第一靶細胞中不表現(或不顯著/基本上不/不特異性表現)。
如本文所使用，當每種類型的部分等超過一個時，關於抗原結合部分等的術語「第一」、「第二」和「第三」是用來方便區分。 除非明確說明，否則這些術語的使用無意圖賦予多特異性抗原結合分子的特定順序或方向。
在一態樣中，特異性結合至本揭露的Notch受體的第一抗原結合部分包含可結合且以錨定依賴性方式(anchorage dependent manner)(即位點特異性結合域到其錨定抗原的同時結合)活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞的任何多肽。
在某些實施例中，Notch受體抗原結合部分(「第一抗原結合部分」)通常是Fab分子，特別是常規的Fab分子。在某些實施例中，Notch受體抗原結合部分(「第一抗原結合部分」)是「單鏈Fv (scFv)」、「單鏈抗體」、「Fv」、「單鏈Fv 2 (scFv2)」、「Fab」、「F(ab’)2」、VHH、VL、VH、單域抗體或任何抗體片段。
在某些實施例中，Notch受體抗原結合部分(「第一抗原結合部分」)包含Notch受體配體的Notch結合域。 在某些實施例中，Notch受體配體是Notch1、Notch2、Notch3或Notch4受體的配體。 在下文中，Genbank或RefSeq註冊號顯示在括號內。在某些實施例中，人類Notch受體的RefSeq註冊號如下：Notch1 (NP_060087.3或P46531)、Notch2 (NP_077719.2 (同功型(isoform)1)或NP_001186930.1 (同功型2))、Notch3 (NP_000426.2)或Notch4 (NP_004548.3或Q99466)。在某些實施例中，Notch受體配體是Delta蛋白質或Jagged蛋白質。在某些實施例中，本文揭露的任何那些配體的胞外域(extra cellular domain，ECD)可作為Notch結合域。在某些實施例中，Delta蛋白質是類Delta配體1 (Delta Like Ligand 1，DLL1)(GenBank登錄號ABC26875或NP005609；RefSeq NP_005609.3)、DLL3 (GenBank登錄號/RefSeq NP_982353.1或37.048) (GenBank登錄號NP_982353.1；RefSeq NP_061947.1)、其同源物或功能(Notch 結合)變異體、片段或衍生物。在某些實施例中，Delta蛋白質是類Delta配體1 (DLL1)或DLL4。在某些實施例中，Jagged蛋白質是Jagged 1 (GenBank登錄號AAC51731；RefSeq NP_000205.1)或Jagged 2 (GenBank登錄號AAD15562；RefSeq NP_002217.3 (同功型A)或NP_660142.1 (同功型B))、其同源物或功能(Notch 結合)變異體、片段或衍生物。在某些實施例中，以序列辨識號：3或4的部分序列顯示的人類Jagged 1 ECD可作為Notch結合域。
在某些實施例中，Notch受體抗原結合部分(「第一抗原結合部分」)特異性結合至Notch受體的部分胜肽的全部或一部分。在一特定實施例中，Notch受體是人類Notch受體或食蟹猴Notch受體或小鼠Notch受體，最尤其是人類Notch受體。在一具體實施例中，Notch受體抗原結合部分(「第一抗原結合部分」)對人類和食蟹猴Notch受體有交叉反應(即特異性結合)。
本揭露的多特異性抗原結合分子亦包含經過轉譯後修飾的多特異性抗體。經過轉譯後修飾的本揭露的其多特異性抗原結合分子的範例包含在重鏈可變區的N端經過焦麩醯胺化和/或在重鏈的C端缺失離胺酸的多特異性抗體。本領域已知此種由於N端焦麩醯胺化和C端離胺酸缺失所引起的轉譯後修飾對抗體的活性沒有任何影響(Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p. 24-39)。
特異性結合至錨定抗原的抗原結合部分 在一態樣中，本文所述的多特異性抗原結合分子包含至少一能夠結合至錨定抗原的抗原結合部分(本文也稱為「錨定抗原結合部分」或「第二抗原結合部分」)。在某些實施例中，多特異性抗原結合分子包含一能夠結合至鈣電壓閘控通道次單元Alpha1 S (Calcium Voltage-Gated Channel Subunit Alpha1 S，CACNA1S)、纖維母細胞活化蛋白質(Fibroblast activation protein，FAP)、磷脂肌醇聚糖3 (Glypican-3，GPC3)或Fc gamma RIIB (CD32B)的抗原結合部分。
在一態樣中，本揭露之特異性結合至錨定抗原的第二抗原結合部分包含可結合錨定抗原的任何多肽，只要本揭露的多特異性抗原結合分子可反式活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑。
在某些實施例中，錨定抗原結合部分(「第二抗原結合部分」)通常是Fab分子，特別是常規的Fab分子。在某些實施例中，錨定抗原結合部分(「第二抗原結合部分」)是包含抗體輕鏈和重鏈可變區(VL和VH)的結構域。在某些實施例中，錨定抗原結合部分(「第二抗原結合部分」)是「單鏈 Fv (scFv)」、「單鏈抗體」、「Fv」、「單鏈 Fv 2 (scFv2)」、「 Fab」、「F(ab’)2」、VHH、VL、VH、單域抗體或任何抗體片段。
在某些實施例中，Notch受體抗原結合部分(「第二抗原結合部分」)特異性結合至錨定抗原的部分胜肽的全部或一部分。在一特定實施例中，錨定抗原是人類錨定抗原或食蟹猴錨定抗原或小鼠錨定抗原，最尤其是人類錨定抗原。在一具體實施例中，錨定抗原結合部分(「第二抗原結合部分」)對人類和食蟹猴錨定抗原有交叉反應(即特異性結合)。
在一態樣中，本揭露提供了一種多特異性抗原結合分子，其包含： (i) 第一抗原結合部分，其特異性結合至第一靶細胞上的Notch受體，及 (ii) 第二抗原結合部分，其特異性結合至第二靶細胞上的錨定抗原， 其中第一靶細胞和第二靶細胞是不同的細胞，且多特異性抗原結合分子反式活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑。 在一態樣中，特徵「多特異性抗原結合分子反式活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑」替代地如下所指：當(或僅當)多特異性抗原結合分子結合至第二靶細胞上的錨定抗原時，多特異性抗原結合分子活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑。較佳地，第二靶細胞上的錨定抗原在第一靶細胞中不表現(或不顯著/基本上不/不特異性表現)。
在一些具體實施例中，本揭露的第二抗原結合部分特異性結合至GPC3，且GPC3抗原結合部分(「第二抗原結合部分」)包含下述(b1)之H鏈CDR 1、CDR 2和CDR 3和L鏈CDR 1、CDR 2和CDR 3的組合： (b1) 包含序列辨識號：7中所包含的互補決定區(complementarity determining region，CDR)1、CDR 2和CDR 3的重鏈可變區、及包含在序列辨識號：8 中所包含的CDR 1、CDR 2和CDR 3。
在一些具體實施例中，GPC3抗原結合部分(「第二抗原結合部分」)包括包含人類抗體框架或人源化抗體框架的抗體可變區。
在一些具體實施例中，GPC3抗原結合部分(「第二抗原結合部分」)包含下述(d1)： (d1) 包含序列辨識號：7的胺基酸序列的重鏈可變區、及包含序列辨識號：8的胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一實施例中，GPC3抗原結合部分(「第二抗原結合部分」)包含與序列辨識號：7有至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的重鏈可變區序列及包含與序列辨識號：8有至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的輕鏈可變區序列。
在一些具體實施例中，本發明的抗原結合分子包含： 序列辨識號：5的序列(包含可變重鏈域(variable heavy chain domain，VH)和恆定重鏈域 1 (constant heavy chain domain 1，CH1)(位點特異性結合域)及Fc區的「鏈1」)； 序列辨識號：6的序列(包含可變輕鏈域(variable light chain domain，VL) (位點特異性結合域)和恆定輕鏈域 (constant light chain domain，CL)的「鏈2」)；及 序列辨識號：3的序列(包含Jag1 ECD 和Fc區的「鏈3」)。
在一些具體實施例中，本發明的抗原結合分子包含： 序列辨識號：5的序列(包含可變重鏈域(VH)和恆定重鏈域 1 (CH1)(位點特異性結合域)及Fc區的「鏈1」)； 序列辨識號：6的序列(包含可變輕鏈域(VL)(位點特異性結合域)和恆定輕鏈域(CL)的「鏈2」)；及 序列辨識號：25的序列(包含Jag2 ECD 和Fc區的「鏈3」)。
在一些具體實施例中，本發明的抗原結合分子包含： 序列辨識號：5的序列(包含可變重鏈域(VH)和恆定重鏈域 1 (CH1)(位點特異性結合域)及Fc區的「鏈1」)； 序列辨識號：6的序列(包含可變輕鏈域(VL)(位點特異性結合域)和恆定輕鏈域(CL)的「鏈2」)；及 序列辨識號：26的序列(包含DLL1 ECD和Fc區的「鏈3」)。
在一些具體實施例中，本發明的抗原結合分子包含： 序列辨識號：5的序列(包含可變重鏈域(VH)和恆定重鏈域 1 (CH1)(位點特異性結合域)及Fc區的「鏈1」)； 序列辨識號：6的序列(包含可變輕鏈域(VL)(位點特異性結合域)和恆定輕鏈域(CL)的「鏈2」)；及 序列辨識號：27的序列(包含DLL3 ECD和Fc區的「鏈3」)。
在一些具體實施例中，本發明的抗原結合分子包含： 序列辨識號：5的序列(包含可變重鏈域(VH)和恆定重鏈域 1 (CH1)(位點特異性結合域)及Fc區的「鏈1」)； 序列辨識號：6的序列(包含可變輕鏈域(VL)(位點特異性結合域)和恆定輕鏈域(CL)的「鏈2」)；及 序列辨識號：27的序列(包含DLL4 ECD和Fc區的「鏈3」)。
在一些具體實施例中，本揭露的第二抗原結合部分特異性結合至FAP，且FAP抗原結合部分(「第二抗原結合部分」)包含下述(b1)之H鏈CDR 1、CDR 2和CDR 3和L鏈CDR 1、CDR 2和CDR 3的組合： (b1) 包含序列辨識號：31中所包含的互補決定區(CDR)1、CDR 2和CDR 3的重鏈可變區、及包含在序列辨識號：32中所包含的CDR 1、CDR 2和CDR 3。
在一些具體實施例中，FAP抗原結合部分(「第二抗原結合部分」)包括包含人類抗體框架或人源化抗體框架的抗體可變區。
在一些具體實施例中，FAP抗原結合部分(「第二抗原結合部分」)包含下述(d1)： (d1) 包含序列辨識號：31的胺基酸序列的重鏈可變區、及包含序列辨識號：32的胺基酸序列的輕鏈可變區。
在一實施例中，FAP抗原結合部分(「第二抗原結合部分」)包含與序列辨識號：31有至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的重鏈可變區序列及包含與序列辨識號：32至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的輕鏈可變區序列。
在一些具體實施例中，本發明的抗原結合分子包含： 序列辨識號：22的序列(包含可變重鏈域(VH)和恆定重鏈域 1 (CH1)(位點特異性結合域)及Fc區的「鏈1」)； 序列辨識號：23的序列(包含可變輕鏈域(VL) (位點特異性結合域)和恆定輕鏈域 (CL)的「鏈2」)；及 序列辨識號：3的序列(包含Jag1 ECD 和Fc區的「鏈3」)。
在一些具體實施例中，本揭露的第二抗原結合部分特異性結合至Fc gamma RIIB，且包含下述(d1)： (d1) 與序列辨識號：30有至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的胺基酸序列；或 (d2) 序列辨識號：30的胺基酸序列。
本揭露的多特異性抗原結合分子亦包含經過轉譯後修飾的多特異性抗體。經過轉譯後修飾的本揭露的其多特異性抗原結合分子的範例包含在重鏈可變區的N端經過焦麩醯胺化和/或在重鏈的C端缺失離胺酸的多特異性抗體。本領域已知此種由於N端焦麩醯胺化和C端離胺酸缺失所引起的轉譯後修飾對抗體的活性沒有任何影響(Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p. 24-39)。
抗原 如本文所使用，術語「抗原」是指抗原結合部分所結合的多肽巨分子的全部或其上的位點(例如連續的胺基酸延伸或由非連續胺基酸的不同區所構成的構形配置)，前述結合形成抗原結合部分-抗原複合物。有用的抗原決定子可在例如腫瘤細胞的表面上、在病毒感染的細胞的表面上，在其他患病細胞的表面上、在免疫細胞的表面上、血清中游離/或胞外基質(extracellular matrix，ECM)中發現。除非另有說明，否則本文稱為抗原的蛋白質(例如Notch受體，例如Notch1、Notch 2、Notch3和Notch4，鈣電壓閘控通道次單元Alpha1 S (CACNA1S)、纖維母細胞活化蛋白質(FAP)、磷脂肌醇聚糖3 (GPC3)或Fc gamma RIIB (CD32B)等)可為來自任何脊椎動物源的蛋白質的原生形式，包含哺乳動物例如靈長類(例如人類)和囓齒類(例如小鼠和大鼠)。在一特定實施例中，抗原是人類Notch受體、人類CACNA1S、人類FAP、人類GPC3或人類CD32B。在本文提到的特定蛋白質的地方，此術語涵蓋「全長」、未處理的蛋白質以及在細胞中處理而產生的任何形式的蛋白質。此術語亦涵蓋蛋白質的天然變異體，例如剪接變異體或等位基因變異體。
Notch受體 如本文所使用，除非另有說明，術語「Notch受體」是指來自包含靈長類(例如人類)和囓齒類(例如小鼠和大鼠)的任何脊椎動物源之本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的任何原生Notch受體和同源物。在Genbank登錄號P46531中顯示了人類Notch受體1 (也稱為Notch1)的胺基酸序列，在Genbank登錄號AAH71562.2中顯示了人類Notch受體2 (也稱為Notch2)的胺基酸序列，在Genbank登錄號No.AAB91371.1中顯示了人類Notch受體3 (也稱為Notch3)的胺基酸序列，且在Genbank登錄號AAC63097.1中顯示了人類Notch受體4 (也稱為Notch4)的胺基酸序列。 如本文所使用，術語「Notch訊息傳遞路徑」是指由於Notch蛋白質與例如Jagged或Delta蛋白質的相關蛋白質之間的交互作用，導致細胞膜中所表現的成熟Notch受體的蛋白質裂解切割而發生的細胞訊息傳遞級聯。
在一實施例中，第二靶細胞上的錨定抗原可為任何相關抗原，只要多特異性抗原結合分子可反式活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑。
在一實施例中，第二靶細胞上的錨定抗原在第一靶細胞中不表現。在一些實施例中，第二靶細胞上的錨定抗原在第一靶細胞上不顯著/基本上不/不特異性表現。 如本文所使用，詞組「不顯著/基本上不/不特異性表現」是指以包含非顯著、基本上不、非特異性或背景表現但不包含顯著、基本上或特異性表現的表現程度的表現例如錨定抗原的蛋白質。可由本發明所屬技術領域中具有通常知識者來適當地測量表現是否顯著、基本上有、特異性或背景。非顯著、基本上不、非特異性或背景表現的程度可為零，或可能不是零但接近零，或可能非常低足夠讓本發明所屬技術領域中具有通常知識者技術性忽略。對於本發明所屬技術領域中具有通常知識者來說，詞組「不表現」可具有與詞組「不顯著/基本上不/不特異性表現」有相同的意思。
在一些實施例中，可根據本揭露提供的揭露內容以及本發明所屬技術領域中可用的知識，來確定第一抗原和能夠在本揭露的多特異性抗原結合分子上展現出促效活性的第一靶細胞上的錨定抗原的合適比值。因此，第一抗原與第一靶細胞上的錨定抗原之間的任何比值，雖然沒有明確指出，但仍應視為在本揭露的範圍內，與使用對第一和錨定抗原之一者有特異性的抗原結合部分相比，只要這樣的比值能夠提供改進(例如至少2.5-、5-、10-、20-、30-、40-、50-、60-、70-、80-、90-、100-、150-、200-、250-、300-、400-、500-、600-、700-、800-、900-、1,000-或更多倍)多特異性抗原結合分子在調節靶訊息傳遞路徑中的活性。
第一抗原與第一靶細胞上的錨定抗原的比值的一些範例的範圍為約1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、16：1、17：1、18：1、19：1、20：1、50：1、100：1、200：1、500：1或1000：1或更高。
在某些實施例中，本文所述的多特異性抗原結合分子結合至在來自不同物種的Notch 受體、CACNA1S、FAP、GPC3或CD32B蛋白質中保守的Notch受體、CACNA1S、FAP、GPC3或 CD32B的抗原決定基。
CACNA1S (Cav1.1、鈣通道、電壓依賴性、L型、alpha 1S次單元) CACNA1S 也稱為鈣通道、電壓依賴性、L 型、alpha 1S次單元、(Cav1.1)，是一種在人類中由 CACNA1S 基因編碼的蛋白質。它也被稱為CACNL1A3和二氫吡啶受體(dihydropyridine receptor，DHPR，由於DHP對其的阻斷作用而得名)。此基因編碼骨骼肌細胞中緩慢失活的L型電壓依賴性鈣通道的五個次單元之一。 此基因中的突變與低鉀血週期性麻痺(hypokalemic periodic paralysis)、甲狀腺毒性週期性麻痺(thyrotoxic periodic paralysis)和惡性高熱易感性(malignant hyperthermia susceptibility)有關。 Cav1.1是在肌肉的橫管(transverse tubule)中發現的電壓依賴性鈣通道。在骨骼肌中，經由機械性連接，其與肌漿網(sarcoplasmic reticulum)的雷阿諾定受體(ryanodine receptor)RyR1結合。它感知由神經刺激所引起的終板電位而導致的電壓變化，且藉由鈉通道作為動作電位傳播到 T小管。
FAP (纖維母細胞活化蛋白質alpha) 纖維母細胞活化蛋白質alpha (FAP-alpha) 也稱為脯胺醯內肽酶FAP，是一種在人類中由FAP基因編碼的酵素。脯胺醯內肽酶FAP是一種170 kDa的膜結合明膠酶。 FAP是一種 760個胺基酸長的第II型跨膜糖蛋白質。它含有一個非常短的細胞質 N端部分(6 個胺基酸)、一個跨膜區(第7-26個胺基酸)和一個有alpha/beta -水解酶域和一個八葉beta-螺旋槳域的大胞外部分。缺乏胞內和跨膜部分的 FAP 的可溶性形式存在於血漿中。FAP是一種非經典的絲胺酸蛋白酶，屬於S9B脯胺醯寡肽酶次家族。
GPC3 在RefSeq登錄號NM_001164617.1中揭露GPC3基因的核苷酸序列，而在RefSeq登錄號NP_001158089.1中顯示GPC3蛋白質。 產生具有所需結合活性的抗體的方法是本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的。以下是描述產生結合至屬於GPI錨定受體家族(Int J Cancer. (2003) 103(4), 455-65)的磷脂肌醇聚糖3 (下文中，也稱為GPC3)結合的抗體(抗 GPC3 抗體)的方法的範例。具體而言，如下所述製備單株抗體。可使用已知方法來獲得作為多株或單株抗體的抗GPC3抗體。較佳產生的抗GPC3抗體是衍生自哺乳動物的單株抗體。這種衍生自哺乳動物的單株抗體包含由雜交瘤或由藉由基因工程技術用攜帶抗體基因的表現載體轉形的宿主細胞所產生的抗體。
可使用已知技術，來產生單株抗體產生雜交瘤，例如如下所述。 具體而言，使用GPC3蛋白質作為致敏抗原，藉由常規免疫方法對哺乳動物進行免疫。藉由常規細胞融合法，使所得免疫細胞與已知的親代細胞融合。然後，可藉由使用常規篩選方法來篩選單株抗體產生細胞，以選擇產生抗GPC3抗體的雜交瘤。
第三靶細胞上的錨定抗原 本發明的多特異性抗原結合分子可更包含結合至第三靶細胞上的錨定抗原的第三抗原結合部分。如本文所述，藉由特異性結合域之選擇性結合至在感興趣的組織或細胞群中具有特異性、排他性或有限表現的錨定抗原而實現Notch訊息傳遞路徑活化的組織/位點特異性。第三抗原結合部分的目的是以錨定依賴性方式進一步增加Notch訊息傳遞路徑活化的特異性。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可適當選擇第三靶細胞和第三靶細胞上的錨定抗原，以達到上述目的。在一些實施例中，第二靶細胞和第三靶細胞是不同的細胞，而第二靶細胞上的錨定抗原不同於第三靶細胞上的錨定抗原。在一些實施例中，第二靶細胞和第三靶細胞是相同的細胞，而第二靶細胞上的錨定抗原不同於第三靶細胞上的錨定抗原。在一些實施例中，表現Notch受體的第一靶細胞和表現錨定抗原的第三靶細胞是不同的細胞。
反式-活化 例如「反式活化(trans-activation)」、「反式活化(trans-activate(s))」和「反式活化(trans-activating)」(和其他文法變化)等的術語是指本發明的多特異性抗原結合分子的特徵，其中多特異性抗原可導致第一靶細胞上的Notch訊息傳遞路徑活化，當(或僅當)多特異性抗原結合分子結合至第二靶細胞上表現的錨定抗原時。這個概念是當兩種類型的細胞即第一和第二靶細胞，在空間上與多特異性抗原結合分子「鏈接(link)」或「連接(connect)」時，Notch訊息傳遞被活化(即「反式」一詞意味著這種空間「鏈接」或「連接」)。較佳地，在第二靶細胞上表現的錨定抗原在第一靶細胞上不表現(或不顯著/基本上不/不特異性表現)。在一些實施例中，當(或僅當)多特異性抗原結合分子結合至第二靶細胞上的錨定抗原時，多特異性抗原結合分子反式活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑，其中錨定抗原較佳地在第一靶細胞上不表現(或不顯著/基本上不/不特異性表現)。以上描述集中於Notch訊息傳遞路徑的活化，其依賴於第二靶細胞上的錨定抗原(即Notch訊息傳遞路徑的「錨定依賴性」反式活化)； 然而，這同樣適用於用於錨定的靶細胞上的其他錨定抗原，例如第三靶細胞上的錨定抗原。
在一些態樣中，本揭露的多特異性抗原結合分子作為促效劑，且活化感興趣的訊息傳遞路徑(或靶訊息傳遞路徑)。在某些實施例中，與使用對第一和第二抗原中的任一者具有特異性的抗原結合部分相比，作為靶訊息傳遞路徑的促效劑的多特異性抗原結合分子上調(例如刺激、增強、促進或增加)靶訊息傳遞路徑的活性至少2.5-、5-、10-、20-、30-、40-、50-、60-、70-、80-、90-、100-、150-、200-、250-、300-、400-、500-、600-、700-、800-、900-、1,000-或更多倍，或它們之間的任何倍數的值。在一些實施例中，可藉由響應訊息傳遞路徑活化的報導基因測定法，來測量靶訊息傳遞路徑的活性。
在一些實施例中，可根據本揭露提供的揭露內容以及本發明所屬技術領域中可用的知識，來確定第一抗原和能夠在本揭露的多特異性抗原結合分子上展現出促效活性之第二靶細胞的表面上的第二抗原(或第三抗原)表現的合適閾值。因此，在第二靶細胞(或第三靶細胞)上的第二抗原(或第三抗原)的任何表現程度，雖然在此未明確指出，但仍應視為在本揭露的範圍內，與對第一和第二抗原之一者(或第三抗原)有特異性的抗原結合部分相比，只要這樣的閾值能夠提供改進(例如至少2.5-或更多倍)多特異性抗原結合分子在調節靶訊息傳遞路徑中的活性。第二靶細胞(或第三靶細胞)的表面上的第二抗原(或第三抗原)的閾值表現程度的一些範例的範圍為每細胞約100、500、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、5,500、6,000、6,500、7,000、7,500、8,000、8,500、9,000、9,500、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、25,000、30,000、40,000、50,000、100,000、200,000、500,000或更多拷貝數或任何中間拷貝數。
靶細胞和錨定抗原 可藉由多特異性抗原結合分子與第一靶細胞上的感興趣的分子(例如 Notch 受體)(透過第一抗原結合部分)及第二靶細胞上的錨定抗原(透過第二抗原結合部分)、及視需要而定地，第三靶細胞上的錨定抗原(透過第三抗原結合部分)等等結合，來實現Notch訊息傳遞路徑活化的組織或位點特異性。較佳地，錨定抗原的表現是特異性、排他性或侷限於第二(或第三)靶細胞。如本文所述，可藉由適當地選擇靶細胞和錨定抗原的組合，來實現訊息傳遞路徑的組織/位點特異性反式活化。在一些實施例中，第一靶細胞或第二靶細胞都不在腫瘤微環境中，即第一靶細胞和第二靶細胞都在非腫瘤微環境中。在一些實施例中，第一靶細胞或第二靶細胞都不是腫瘤細胞，即第一靶細胞和第二靶細胞都是非腫瘤細胞。在一些實施例中，第一靶細胞或第二靶細胞都不是腫瘤微環境中的非腫瘤細胞，即第一靶細胞和第二靶細胞都是非腫瘤環境中的非腫瘤細胞。在一些實施例中，Notch訊息傳遞路徑不是抗癌的，即Notch訊息傳遞路徑是非抗癌的。在一些實施例中，Notch訊息傳遞路徑是抗發炎的，即Notch訊息傳遞路徑不是促發炎的，即Notch訊息傳遞路徑是非發炎的。術語「腫瘤微環境」是指包含在腫瘤細胞周圍的正常細胞、分子和血管的小環境，且可影響腫瘤細胞的生長、增殖和/或遷移。在一些實施例中，由本發明的第二抗原結合部分所結合的錨定抗原不是腫瘤細胞的特異性抗原，例如CD33、CD326、CD133或間皮素(mesothelin)。在一些實施例中，由本發明的第二抗原結合部分所結合的錨定抗原不是存在於腫瘤微環境中的胞外抗原或基質，例如膠原蛋白(collagen)。
在一態樣中，多特異性抗原結合分子包含： (i) 第一抗原結合部分，其特異性結合至第一靶細胞上的Notch受體，及 (ii) 第二抗原結合部分，其特異性結合至第二靶細胞上的錨定抗原， 其中第一靶細胞和第二靶細胞是不同的細胞，且多特異性抗原結合分子反式活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑。
在一態樣中，特徵「多特異性抗原結合分子反式活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑」替代地如下所指：當(或僅當)多特異性抗原結合分子結合至第二靶細胞上的錨定抗原時，多特異性抗原結合分子活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑。較佳地，第二靶細胞上的錨定抗原在第一靶細胞中不表現(或不顯著/基本上不/不特異性表現)。
在一實施例中，表現Notch受體的第一靶細胞可為任何相關細胞，只要多特異性抗原結合分子可反式活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑。
在一些實施例中，表現Notch受體的第一靶細胞是組織幹細胞(也稱為「組織特異性幹細胞」或「成人幹細胞」)、活化的CD4 T淋巴細胞、分泌促纖維化因子的細胞或腫瘤微環境中的促致瘤細胞。在一這樣的實施例中，組織幹細胞是衛星細胞、成人腸幹細胞或隱窩基底柱狀(crypt base columnar，CBC)細胞。
在一態樣中，第二抗原結合部分特異性結合至第二靶細胞上的錨定抗原。
在一實施例中，表現錨定抗原的第二靶細胞可為任何相關抗原，只要多特異性抗原結合分子可以錨定抗原依賴性方式來反式活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑。 在一實施例中，第二靶細胞係選自由不是衛星細胞的肌肉細胞、活化的纖維母細胞、表現FcgRIIB的免疫細胞、表現GPC3的癌細胞和腸隱窩中的細胞所組成的群組。 在一些實施例中，表現FcgRIIB的免疫細胞係選自由循環B淋巴細胞、單核細胞、嗜中性球、淋巴樹突細胞和骨髓樹突細胞。
本發明所屬技術領域中具有通常知識者可根據公知的一般技術知識輕易地選擇任何合適的錨定抗原和第二靶細胞，以用於第二抗原結合部分的設計和實施。 本發明所屬技術領域中具有通常知識者可根據公知的一般技術知識輕易地選擇任何合適的錨定抗原和第三(或另外的)靶細胞，以用於第三(或另外的)抗原結合部分的設計和實施。
在一些實施例中，第一靶細胞和多特異性抗原結合分子之用來反式活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑的第二靶細胞的組合的範例如下： (1) 衛星細胞(第一靶細胞，用於 Notch活化)和用於分化的肌原細胞和分化的肌管細胞(第二靶細胞，表現錨定抗原例如 CACNA1S)。 (2) 分泌促纖維化因子的細胞(第一靶細胞)和在活躍的組織重塑區(例如腫瘤基質或癒合傷口)中表現例如 FAP(成纖維細胞活化蛋白)的任何纖維母細胞(第二靶細胞)。 例如，類風濕性類肌纖維母細胞滑膜細胞(rheumatoid myofibroblast-like synoviocyte)和肌纖維母細胞。 (3) 活化的 CD4-T 細胞(第一靶細胞)和在發炎位點表現例如 FcgRIIB(第二靶細胞)的免疫細胞(例如 B 細胞、漿細胞、巨噬細胞、單核細胞、嗜酸性球、嗜中性球、樹突細胞、肥大細胞)。 (4) 腫瘤微環境中之Notch活化將誘導抗癌作用(例如生長抑制或誘導細胞凋亡)促致瘤細胞(第一靶細胞)和表現GPC3的癌細胞(第二靶細胞)。 (5) 成人腸幹細胞或隱窩基底柱狀 (CBC) 細胞(第一靶細胞)和腸隱窩中的鄰近細胞(第二靶細胞)(例如班尼斯細胞(Paneth cell)、+4 細胞、瞬時放大細胞)。 本發明所屬技術領域中具有通常知識者可適當地選擇與成人腸幹細胞或隱窩基底柱狀(CBC)細胞相關的潛在錨定抗原(第二靶細胞)，以實現上述目的。
在一這樣的實施例中，可根據選自(1)至(5)的至少一個標準，來選擇用於設計和實施第二(和另外的)抗原結合部分的任何合適的錨定抗原。 1) 錨定抗原的空間表現應僅限於或僅由感興趣的細胞類型或組織表現，以限制全身暴露且最小化Notch活化引起的毒性風險。 2) 應仔細考慮錨定抗原的短暫表現。例如，一些錨定抗原只在幹細胞中表現，分化後就會丟失。不同發育階段的Notch活化也會導致轉基因小鼠中不同的表現型。 早期Notch活化會導致胚胎致死和肌肉發育受損。相反地，出生後轉基因小鼠中的Notch活化有助於改善老化肌肉且促進肌肉再生。 3) 錨定抗原應在細胞上穩定表現或錨定在細胞表面，且緩慢內化。 4) 錨定抗原應在大多數感興趣的細胞或組織中以低異質性均勻表達，以最小化Notch訊息傳遞的不均勻活化。 5) 甚至在病理條件下，錨定抗原也應以足夠的程度表現，且確保雙特異性Notch促效抗體的充分保留。
在一些實施例中，本揭露提供篩選出用於本揭露的多特異性抗原結合分子的第二抗原結合部分的錨定抗原的方法，其中此方法包含： (i) 評價候選錨定抗原是否滿足選自上述1)至5)中的至少一項標準；及 (ii) 如果滿足至少一個標準，則選擇此錨定抗原用於第二抗原結合部分。
在一些實施例中，本揭露提供了一種產生包含第一抗原結合部分和第二抗原結合部分的多特異性抗原結合分子的方法，其中此方法包含： (i) 評價候選錨定抗原是否滿足選自上述1)至5)中的至少一項標準；及 (ii) 如果滿足至少一個標準，則選擇此錨定抗原用於第二抗原結合部分； (iii) 製備編碼包含特異性結合至第一靶細胞上的Notch受體的第一抗原結合部分和特異性結合至第二靶細胞上的錨定抗原的第二抗原結合部分的多特異性抗原結合分子的核酸；和 (iv) 表現核酸以產生多特異性抗原結合分子， 其中當多特異性抗原結合分子結合至第二靶細胞上的錨定抗原時，多特異性抗原結合分子活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑。
在一些實施例中，本揭露提供了一種產生包含第一抗原結合部分和第二抗原結合部分的多特異性抗原結合分子的方法，其中此方法包含： (i) 評價候選錨定抗原是否滿足選自上述1)至5)中的至少一項標準；及 (ii) 如果滿足至少一個標準，則選擇此錨定抗原用於第二抗原結合部分； (iii) 製備編碼包含特異性結合至第一靶細胞上的Notch受體的第一抗原結合部分和特異性結合至第二靶細胞上的錨定抗原的第二抗原結合部分的多特異性抗原結合分子的核酸；和 (iv) 表現核酸以產生多特異性抗原結合分子。
以下列表顯示了候選錨定抗原或優先結合至錨定抗原的工程化Fc (例如Fc gamma RIIB 選擇性結合技術和 Fc gamma RIIB)。
錨定抗原 次細胞定位 組織/細胞表現 相關病理
鈣電壓閘控通道次單元alpha 1S (CACNA1S) 膜 骨骼肌 肌肉萎縮症
纖維母細胞活化蛋白質 膜 活化的纖維母細胞 組織纖維化
FcγRIIB (CD32B) 膜 循環B淋巴細胞, 單核細胞, 嗜中性球, 骨髓樹突細胞(DC) 自體免疫免疫疾病(例如 SLE、RA 和 MS)
作為錨定抗原候選者的胞外蛋白質列表 組織
興奮性胺基酸轉運蛋白質1 腦
麩胺酸 [NMDA] 受體次單元 zeta 1 腦
免疫球蛋白超家族，成員 8 腦
神經細胞黏著分子 腦
10 天新生兒皮質 cDNA，RIKEN庫，選殖：A830029E02 產品：與BK134P22.1 些微相似 腦
神經細胞黏著分子1的N-CAM 180，180 kDa 同功型 腦
鈉/鉀轉運ATP酶beta-2鏈 腦
DSD-1-蛋白聚醣 腦
成年男性睾丸 cDNA，突觸囊泡醣蛋白質 2b 腦
肝細胞黏著分子 腦
溶質載體家族 12 成員 5 腦
類接觸相關蛋白質 2 腦
成年男性大腦未定義細胞系 cDNA，質子肌醇轉運蛋白同源物 腦
LOC237403 蛋白質 腦
神經成束蛋白質 腦
接觸相關蛋白 1 腦
硫酸軟骨素蛋白多醣 5 的剪接同功型 1 腦
視覺皮層 cDNA，RIKEN庫，選殖：K530020M04 產品：二肽基胜肽酶 6，完整插入序列 腦
鈉通道beta-1次單元前體 腦
類Niemann-Pick C1蛋白質1 腸
寡肽轉運蛋白，小腸同功型 腸
血管收縮素轉換酶 2 腸
成年男性結腸 cDNA、RIKEN 全長富集庫、膜結合胺基胜肽酶 P 腸
NOD 衍生的 CD11c +ve 樹突細胞 cDNA，假設蛋白質 腸
4 天新生兒男性脂肪 cDNA，N-醯基鞘胺醇醯胺水解酶 2 腸
寡肽轉運蛋白，小腸同功型 腸
鈣活化氯通道 腸
N-乙醯化-alpha-連接的酸性類二肽酶蛋白質 腸
腫瘤壞死因子受體超家族成員 13C 脾
大麻素受體2 脾
B 細胞受體 CD22 的剪接同功型 1 脾
Semaphorin-4D 脾
血小板反應蛋白質 1 脾
類蝕骨細胞cDNA，顆粒蛋白 脾
NOD 衍生的 CD11c +ve 樹突細胞 cDNA，假設的磷脂酶 D/轉磷脂酶 脾
L-選擇素 脾
骨髓巨噬細胞 cDNA，溶質載體家族 30 脾
B細胞分化抗原CD72 脾
跨膜醣蛋白質NMB 脾
第II類組織相容性抗原，M beta 1鏈 脾
唾液酸黏著素的剪接同功型2 脾
髓過氧化物酶 脾
淋巴細胞表面抗原 CD53 脾
CD180抗原 脾
受體型酪胺酸蛋白質磷酸酶eta 脾
類鐸受體9 脾
補體受體第2型前體 脾
beta-微精蛋白質 前列腺
成年男性膀胱 cDNA，含有假設的 Kazal 型絲胺酸蛋白酶抑制域的蛋白質 前列腺
推定的多肽 N-乙醯半乳糖胺轉移酶樣蛋白 4 前列腺
癌胚抗原相關細胞黏著分子10 前列腺
成年男性舌頭 cDNA，假設蛋白 前列腺
精囊抗原 前列腺
成年男性膀胱 cDNA，與溶菌酶 C、M 型些微相似 前列腺
beta-防禦素 50 前列腺
鈉/膽汁酸共轉運蛋白質 肝
去唾液酸糖蛋白受體主要次單元 肝
類似於褐家鼠推定的整體膜轉運蛋白質 肝
SLC10A5 肝
成年男性睾丸 cDNA，類似於推定的金屬肽酶 睾丸
透明帶精子結合蛋白質3受體 睾丸
睾丸特異性蛋白質 TES101RP 睾丸
類Dickkopf蛋白質 1 睾丸
輸卵管特異性醣蛋白質 卵巢
原膠原蛋白-離胺酸，2-酮戊二酸 5-雙氧酶 2 卵巢
組織蛋白酶L 卵巢
腎鈉依賴性磷酸鹽轉運蛋白2 腎
gamma-麩胺醯轉肽酶 1 腎
鈉和氯依賴性轉運蛋白質XTRP2 的剪接同功型 4 腎
預測：類似於低密度脂蛋白受體相關蛋白質2 腎
EP1 胃
鉀轉運ATP酶beta鏈 胃
分泌性凝膠形成黏蛋白質 胃
MUC6 胃
淋巴細胞抗原 6 複合位點 G6C 蛋白質 表皮
鈉依賴性副腎上腺素轉運蛋白質 表皮
溶質載體家族 2（促進葡萄糖轉運蛋白質），成員 4 心臟
富含組胺酸的鈣結合蛋白質 心臟
鈣黏蛋白質-13 心臟
在一態樣中，本揭露提供了一種多特異性抗原結合分子，包含： (i) 第一抗原結合部分，其特異性結合至組織幹細胞上的抗原，及 (ii) 第二抗原結合部分，其特異性結合至第二靶細胞上的錨定抗原， 其中組織幹細胞和第二靶細胞是不同的細胞，且多特異性抗原結合分子反式活化組織幹細胞中的Notch訊息傳遞路徑。 在一態樣中，特徵「多特異性抗原結合分子反式活化組織幹細胞中的Notch訊息傳遞路徑」替代地如下所指：當(或僅當)多特異性抗原結合分子結合至第二靶細胞上的錨定抗原時，多特異性抗原結合分子活化組織幹細胞中的Notch訊息傳遞路徑。較佳地，第二靶細胞上的錨定抗原在組織幹細胞中不表現(或不顯著/基本上不/不特異性表現)。
在一態樣中，本揭露提供了一種多特異性抗原結合分子，包含： (i) 第一抗原結合部分，其特異性結合至衛星細胞上的抗原，及 (ii) 第二抗原結合部分，其特異性結合至第二靶細胞上的錨定抗原， 其中衛星細胞和第二靶細胞是不同的細胞，且多特異性抗原結合分子反式活化衛星細胞中的Notch訊息傳遞路徑。 在一態樣中，特徵「多特異性抗原結合分子反式活化衛星細胞中的Notch訊息傳遞路徑」替代地如下所指：當(或僅當)多特異性抗原結合分子結合至第二靶細胞上的錨定抗原時，多特異性抗原結合分子活化衛星細胞中的Notch訊息傳遞路徑。較佳地，第二靶細胞上的錨定抗原在衛星細胞中不表現(或不顯著/基本上不/不特異性表現)。
抗原結合域 術語「抗原結合域」是指抗體之包含特異性結合至且與抗原的一部分或全部互補的區域的部分。可由例如一或多個抗體可變域(也稱為抗體可變區)，來提供抗原結合域。較佳地，抗原結合域包含抗體輕鏈可變區(antibody light chain variable region，VL)和抗體重鏈可變區(antibody heavy chain variable region，VH)。 這種較佳的抗原結合域包含例如「單鏈Fv (single-chain Fv，scFv)」、「單鏈抗體」、「Fv」、「單鏈Fv2 (single-chain Fv2，scFv2)」、「Fab」和「F (ab’)2」。 也可由單域抗體提供抗原結合域。
單域抗體 在本說明書中，術語「單域抗體」不受其結構限制，只要此結構域本身可發揮抗原結合活性。已知，例如IgG抗體的一般抗體在可變區藉由VH和VL的配對來形成的狀態下展現出抗原結合活性，而單域抗體本身的域結構即可發揮抗原結合活性，而不與另一結構域配對。通常，單域抗體的分子量相對較低，且以單體形式存在。
單域抗體的範例包含但不限於先天性缺乏輕鏈的抗原結合分子，如駱駝科動物的VHH和鯊魚VNAR，及含有抗體VH域的全部或部分及抗體VL域的全部或部分的抗體片段。作為含有抗體VH或VL域的全部或部分的抗體片段的單域抗體的範例包含但不限於人工製備之源自人類抗體VH或人類抗體VL的單域抗體，如美國專利號 6,248,516 B1 等中所述。在本發明的一些實施例中，一單域抗體具有三個CDR (CDR1、CDR2和CDR3)。
可從能夠產生單域抗體的動物中、或藉由免疫能夠產生單域抗體的動物中，來獲得單域抗體。能夠產生單域抗體的動物的範例包含但不限於駱駝科動物和攜帶能夠產生單域抗體的基因的轉基因動物。駱駝科的動物包含駱駝、喇嘛(lama)、羊駝(alpaca)、一駝峰駱駝和原駝(guanaco)等。攜帶能夠產生單域抗體的基因的轉基因動物的範例包含但不限於國際公開號WO2015/143414和美國專利公開號US2011/0123527 A1。可將從動物獲得的單域抗體的框架序列轉化為人類種系序列或與其相似的序列，以獲得人源化單域抗體。人源化單域抗體(例如人源化VHH)也是本發明單域抗體的一實施例。
或者，可藉由ELISA、淘選(panning)等從含有單域抗體的多肽庫中獲得單域抗體。含有單域抗體的多肽庫的範例包含但不限於從各種動物或人類獲得的初始抗體庫(例如Methods in Molecular Biology 2012 911 (65-78)；和 Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics 2006 1764: 8 (1307-1319))、藉由各種動物的免疫來獲得的抗體庫(例如Journal of Applied Microbiology 2014 117:2 (528-536))、和由各種動物或人類抗體基因製備的合成抗體庫(例如，Journal of Biomolecular Screening 2016 21: 1 (35-43)；Journal of Biological Chemistry 2016 291:24 (12641-12657)；和 AIDS 2016 30: 11 (1691-1701))。
可變區 術語「可變區(variable region)」或「可變域(variable domain)」是指涉及使抗體結合至抗原的抗體重鏈或輕鏈的結構域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變域(分別為VH和VL)通常具有相似的結構，每個結構域包含四個保守框架區(framework region，FR) 和三個高度可變區(hypervariable region，HVR)。(參閱例如Kindt et al. Kuby Immunology, 6 thed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)。)單一個VH或VL域可能足以賦予抗原結合特異性。再者，可使用來自結合抗原的抗體的VH或VL域來分別篩選互補VL或VH域的庫，從而分離出結合特定抗原的抗體。參閱例如 Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)；Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)。
HVR或CDR 如本文所使用，術語「高度可變區」或「HVR」是指抗體可變域的每個在序列上是高度可變的(「互補決定區」或“CDR”)和/或形成結構上確定的環(「高度可變環」)和/或含有抗原接觸殘基(「抗原接觸」)的區域。高度可變區(HVR)也稱為「互補決定區」(CDR)，且參考形成抗原結合區的可變區部分，這些術語在本文中可交互使用。通常，抗體包含六個HVR：三個在VH (H1、H2、H3)中，且三個在 VL (L1、L2、L3)中。 本文的示例性HVR包含： (a) 高度變可環出現在第26-32位(L1)、第50-52位(L2)、第91-96位(L3)、第26-32位(H1)、第53-55位(H2) 和第96-101位(H3)的胺基酸殘基 (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))； (b) CDR出現在第24-34位(L1)、第50-56位(L2)、第89-97位(L3)、第31-35b位(H1)、第50-65位(H2)和第95-102位(H3)的胺基酸殘基(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))； (c) 抗原接觸發生在第27c-36位(L1)、第46-55位(L2)、第89-96位(L3)、第30-35b位(H1)、第47-58位(H2)和第93-101位(H3)的胺基酸殘基(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；及 (d) (a)、(b)和/或(c)的組合，包含第46-56位(L2)、第47-56位(L2)、第48-56位(L2)、第49-56位(L2)、第26-35位(H1)、第26-35b位(H1)、第49-65位(H2)、第93-102位(H3)和第94-102位(H3)的HVR胺基酸殘基。
除非另有說明，在本文中同上根據Kabat et al.，編號可變域中的HVR殘基和其他殘基(例如，FR 殘基)。
HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3、HVR-L1、HVR-L2 和 HVR-L3亦分別稱為「H-CDR1」、「H-CDR2」、「H-CDR3」、「L-CDR1」、「L-CDR2」和「L-CDR3」。
Fab分子 「Fab分子」是指由免疫球蛋白的重鏈(「Fab重鏈」)的VH和CH1域及輕鏈(「Fab輕鏈」)的VL和CL域所組成的蛋白質。
融合 「融合」是指組成(例如Fab分子和Fc域次單元)藉由胜肽鍵直接或經由一或多個胜肽連接子鍵結。
「雜交(crossover)」Fab 「雜交」Fab分子(也稱為「雜fab」)意指其中Fab重鏈和輕鏈的可變區或恆定區交換的Fab分子，即雜交Fab分子包含由輕鏈可變區和重鏈恆定區所構成的胜肽鏈、及由重鏈可變區和輕鏈恆定區所構成的胜肽鏈。為清楚起見，在雜交Fab輕鏈和Fab重鏈的可變區交換的雜交Fab分子中，包含重鏈恆定區的胜肽鏈在本文中稱為雜交Fab分子的「重鏈」。相反地，在Fab輕鏈和Fab重鏈的恆定區的雜交Fab分子中，包含重鏈可變區的胜肽鏈在本文中稱為雜交Fab分子的「重鏈」。
「常規」Fab 與之相反，「常規」Fab分子意指天然形式的Fab分子，即包含由重鏈可變區和恆定區(VH-CH1)所構成的重鏈、和由輕鏈可變區和恆定區(VL-CL)所構成的輕鏈。術語「免疫球蛋白分子」是指具有天然抗體的結構的蛋白質。例如，IgG 類別的免疫球蛋白是約150,000 daltons的異質四聚體醣蛋白質，由雙硫鍵連接的兩條輕鏈和兩條重鏈所構成。從N到C端，每條重鏈都有一個可變區 (VH)，也稱為可變重鏈域或重鏈可變域，後面跟著三個恆定區(CH1、CH2和CH3)，也稱為重鏈恆定區。類似地，從N到C端，每條輕鏈都有一個可變區(VL)，也稱為可變輕域或輕鏈可變域，後面跟著一個恆定輕(CL)域，也稱為輕鏈恆定區。免疫球蛋白的重鏈可被指定為五種類型之一，稱為alpha (IgA)、delta (IgD)、epsilon (IgE)、gamma (IgG) 或 mu (IgM)，其中一些可進一步分為次類型，例如 gamma 1 (IgG1)、gamma 2 (IgG2)、gamma 3 (IgG3)、gamma 4 (IgG4)、alpha 1 (IgA1) 和alpha 2 (IgA2)。基於其恆定域的胺基酸序列，免疫球蛋白的輕鏈可被指定為兩種類型中的一種，稱為kappa和lambda。 免疫球蛋白基本上由兩個Fab分子和一個Fc域所組成，其藉由免疫球蛋白鉸鏈區鍵接。
親和力(Affinity)/結合性(avidity) 「親和力」是指分子(例如抗原結合分子或抗體)的單一結合位點與其結合配偶體(例如，抗原)之間的非共價交互作用總和的強度。除非另有說明，如本文所使用，「結合親和力」是指反映結合對(例如，抗原結合分子和抗原、或抗體和抗原)的成員之間的1：1交互作用的內在結合親和力。分子X對其配偶體Y的親和力通常可用解離常數(dissociation constant，KD) 表示，其為解離和結合速率常數(分別為 koff 和 kon)的比值。因此，等效親和力可包含不同的速率常數，只要速率常數的比值維持相同。可藉由本發明所屬技術領域中已知的方法，來測量親和力，包含本文所述的那些。測量親和力的一種特殊方法是表面電漿共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)。 結合至抗原決定基的抗體抗原結合域的結構稱為互補位(paratope)。互補位透過作用於表位和互補位之間的氫鍵、靜電力、凡得瓦力、疏水鍵等，來穩定結合至抗原決定基。抗原決定基和互補位之間的此結合力稱為「親和力」(亦見上文)。多個抗原結合域與多個抗原結合時的總結合力稱為「結合性」。 例如，當包含多個抗原結合域的抗體(即多價抗體)結合至多個抗原決定基時，親和力協同作用，且結合性可高於親和力。
確定親和力的方法 在某些實施例中，本文提供的抗原結合分子或抗體的對其抗原的解離常數(KD)為1微莫耳(micro M) 或更小、120 nM 或更小、100 nM 或更小、80 nM 或更小、70 nM 或更小、 50 nM 或更小、40 nM 或更小、30 nM 或更小、20 nM 或更小、10 nM 或更小、2 nM 或更小、1 nM 或更小、0.1 nM 或更小、0.01 nM 或更小或0.001 nM 或更小 (例如，10 -8M或更少，10 -8M至10 -13M，10 -9M至10 -13M)。在某些實施例中，Notch受體或錨定抗原的抗體/抗原結合分子的KD值落在1-40、1-50、1-70、1-80、30-50、30-70、30-80、40-70、40-80或60-80 nM的範圍。
在一實施例中，藉由放射性標記的抗原結合測定法(radiolabeled antigen-binding assay，RIA)來測量KD。在一實施例中，用感興趣的抗體的Fab版本及其抗原進行RIA。例如，藉由在一滴定系列的未標記抗原存在下，用最小濃度的( 125I)標記的抗原平衡 Fab，然後用抗Fab抗體塗佈的盤來捕獲結合的抗原(參閱例如Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999))，以測量Fab對抗原的溶液結合親和力。為了建立測定法的條件，用配在50 mM 碳酸鈉(pH 9.6)中的 5 微克 (micro g)/ml捕獲抗Fab抗體(Cappel Labs)來塗佈MICROTITER (註冊商標)多孔盤(Thermo Scientific)隔夜，然後在室溫(約23度C)下用配在PBS中的2% (w/v)牛血清白蛋白阻斷二至五個小時。在非吸附盤(Nunc #269620) 中，100 pM或26 pM [ 125I]-抗原與感興趣的Fab的系列稀釋液混合(例如，與抗VEGF抗體Fab-12的評價一致，在Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)中)。然後將感興趣的 Fab 培養隔夜；然而，培養可持續更長的時間(例如約65小時)，以確保達到平衡。 此後，將混合物轉移至捕獲盤以在室溫下培養(例如，一小時)。然後除去溶液，且用配在PBS中的0.1% 聚山梨醇酯20 (TWEEN-20 (註冊商標))，將盤洗滌八次。當盤乾燥時，添加150微升(micro l)/孔的閃爍劑(MICROSCINT-20 TM；Packard)，且在TOPCOUNT TMgamma計數器(Packard)上將盤計數10分鐘。選擇給予小於或等於最大結合20%的每種Fab的濃度用於競爭性結合測定法。
根據另一實施例，使用BIACORE (註冊商標)表面電漿共振測定法來測量Kd。例如，在攝氏25度C下與約10個反應單位(response unit，RU)之固定的抗原CM5晶片一起進行使用BIACORE (註冊商標)-2000或BIACORE (註冊商標)-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)的測定法。在一實施例中，根據供應商的說明，用N-乙基-N’-(3-二甲基胺基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride，EDC)和N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)，來活化羧甲基化葡聚醣(carboxymethylated dextran)生物感測晶片(CM5, BIACORE, Inc.)。在以5微升/分鐘的流速注射前，用10 mM醋酸鈉、pH 4.8，將抗原稀釋至 5 微克/毫升(約 0.2 微 M)，以獲得約10個反應單位(RU)的偶聯蛋白質。注射抗原後，注射1 M乙醇胺(ethanolamine)，以阻斷未反應的基團。對動力學測量而言，以25度C，流速約為25 微升/分鐘，將Fab的兩倍系列稀釋液(0.78 nM至500 nM)注射到有0.05% 聚山梨醇酯 20 (TWEEN-20 TM) 表面活性劑 (PBST) 的PBS 中。使用簡單一對一朗繆爾結合模型(Langmuir binding model)(BIACORE (註冊商標)評估軟體3.2版)，藉由同時擬合結合和解離感測圖，來計算結合速率(kon)和解離速率(koff)。參閱例如，Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)。 如果藉由上述表面電漿共振測定法的接通速率(on-rate)超過10 6M -1s -1，則可藉由在分光計例如配備停止流動的分光光度計(Aviv Instruments)或具有攪拌比色皿的8000-series SLM-AMINCO TM分光光度計(ThermoSpectronic)中測量的抗原濃度增加時，使用以25度C之配在PBS中的20 nM 抗抗原抗體(Fab 形式)、pH 7.2，來測量螢光發射強度的增加或減少(激發 = 295 nm；發射 = 340 nm，16 nm 帶通(band-pass))的螢光猝滅技術，來確定接通率。
根據上述測量抗原結合分子或抗體的親和性方法，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，可對其他抗原結合分子或抗體對各種抗原進行親和性測量。
抗體 本文的術語「抗體」以最廣泛的含義使用且涵蓋各種抗體結構，包含但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們展現出所需的抗原結合活性。
抗體的類別 抗體的「類別」是指其重鏈所擁有的恆定域或恆定區的類型。有五個主要類別的抗體：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可進一步分為次類別(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應至不同類別的免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為alpha、delta、epsilon、gamma和mu。
除非另有說明，否則根據Kabat等人，在本文中編號輕鏈恆定區中的胺基酸殘基，且重鏈恆定區中胺基酸殘基的編號係根據EU編號系統，也稱為EU索引(EU index)，如Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991中所述。
框架 「框架」或「FR」是指高度可變區(hypervariable region，HVR)殘基以外的可變域殘基。可變域的FR通常由四個FR域所組成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常在VH(或VL)中以下列順序出現：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
人類共有框架 「人類共有框架」是代表人類免疫球蛋白VL或VH框架序列的選擇中最常見的胺基酸殘基的框架。通常，人類免疫球蛋白VL或VH序列的選擇係來自可變域序列的次群組。通常，序列的次群組如同Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3中的次群組。在一實施例中，對於VL，此次群組是如上述Kabat et al.中的次群組kappa I。在一實施例中，對於VH，此次群組是如上述Kabat et al.中的次群組III。
嵌合抗體 術語「嵌合」抗體是指重鏈和/或輕鏈的一部分衍生自特定來源或物種，而重鏈和/或輕鏈的其餘部分衍生自不同來源或物種的抗體。類似地，術語「嵌合抗體可變域」是指重鏈和/或輕鏈可變區的一部分衍生自特定來源或物種，而重鏈和/或輕鏈可變區的其餘部分衍生自不同的來源或物種的抗體可變區。
人源化抗體 「人源化」抗體是指包含來自非人類HVR的胺基酸殘基和來自人類FR的胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人源化抗體將包含基本上全部的至少一個、且通常為兩個可變域，其中全部或基本上全部的HVR (例如CDR)對應至非人類抗體的那些，且全部或基本上全部的FR對應至人類抗體。人源化抗體可視需要而定地包含衍生自人類抗體的抗體恆定區的至少一部分。抗體的「人源化形式」例如非人類抗體，是指經過人源化的抗體。「人源化抗體可變區」是指人源化抗體的可變區。
人類抗體 「人類抗體」是擁有對應至由人類或人類細胞所產生的或衍生自利用人類抗體庫或其他人類抗體編碼序列的非人類來源的抗體的胺基酸序列的抗體。人類抗體的此定義具體地排除包含非人類抗原結合殘基的人源化抗體。「人類抗體可變區」是指人類抗體的可變區。
多核苷酸(核酸) 如本文可交互使用的「多核苷酸」或「核酸」是指任何長度的核苷酸的聚合物，且包含DNA和RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修飾的核苷酸或鹼基和/或它們的類似物，或可藉由DNA或RNA聚合酶或藉由合成反應併入聚合物中的任何基質。多核苷酸可包含修飾的核苷酸，例如甲基化的核苷酸及其類似物。核苷酸的序列可能被非核苷酸成分中斷。多核苷酸可包含合成後進行的修飾，例如與標記偶聯。其他類型的修飾包含例如「帽(cap)」、用類似物取代一或多個天然核苷酸、核苷酸間修飾例如具有不帶電荷的鍵(例如，甲基膦酸酯(methyl phosphonate)、磷酸三酯(phosphotriester)、胺基磷酸酯(phosphoramidate)、胺基甲酸酯(carbamate)等)和帶電荷的鍵(例如硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)等)的那些、含有側基部分的那些例如蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、訊號肽、聚-L-離胺酸等)、帶有嵌入劑(例如吖啶(acridine)、補骨脂素(psoralen)等)的那些、含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等)的那些、含有烷基化劑的那些、帶有修飾的鍵(例如，alpha異頭核酸等)的那些、以及未修飾形式的多核苷酸。再者，糖中通常存在的任何羥基基團可被例如膦酸酯基團、磷酸酯基團替代、被標準保護基團保護、或被活化以製備額外核苷酸的額外鍵、或可偶聯至固體或半固體的支持。5’和3’端OH可被磷酸化或被胺或1至20個碳原子的有機帽基團部分取代。其他羥基也可衍生成標準保護基團。多核苷酸亦可包含本發明所屬技術領域中已知的核糖或去氧核糖的類似形式，包含例如2’-O-甲基-(2’-O-methyl-)、2’-O-烯丙基-(2’-O-allyl-)、2’-氟-(2’-fluoro-)或2’-疊氮基-核糖(2’-azido-ribose)、碳環醣類似物(carbocyclic sugar analog)、alpha-異頭糖(alpha-anomeric sugar)、差向異構糖(epimeric sugar)如阿拉伯糖(arabinose)、木糖(xylose)或來蘇糖(lyxose)、吡喃糖(pyranose sugar)、呋喃糖(furanose sugar)、景天庚酮糖(sedoheptulose)、無環類似物(acyclic analog)和鹼性核苷類似物(basic nucleoside analog)如甲基核苷(methyl riboside)。一或多個磷酸二酯鍵可被替代的連接基團替代。這些替代的連接基團包含但不限於其中磷酸酯被 P(O)S (「硫代酸酯(thioate)」)、P(S)S (「二硫代酸酯(dithioate)」)、(O)NR 2(「醯胺酸酯(amidate)」)、P(O)R、P(O)OR’、CO 或 CH2(「甲縮醛(formacetal)」)的實施例，其中每個R或 R’獨立地為 H 或視需要而定地含有醚(-O-) 鍵、芳基(aryl)、烯基(alkenyl)、環烷基(cycloalkyl)、環烯基(cycloalkenyl)或芳烷基(araldyl)的經取代或未經取代的烷基(1-20 C)。並非多核苷酸中的所有連接都需要相同。 前述描述適用於本文提及的所有多核苷酸，包含RNA和DNA。
單離(核酸) 「單離」核酸分子是已經與其自然環境的成分分離的核酸分子。單離核酸分子更包含在通常含有核酸分子的細胞中的核酸分子所含有的核酸分子，但核酸分子存在於染色體外或存在於與其天然染色體位置不同的染色體位置。
載體 如本文所使用，術語「載體」是指能夠繁殖與其連接的另一核酸的核酸分子。 術語包含作為自我複製核酸結構的載體，及併入其已被導入的宿主細胞基因組中的載體。某些載體能夠導引與它們可操作地連接的核酸的表現。此類載體在本文中稱為「表現載體」。可使用病毒或電穿孔將載體導入宿主細胞。然而，載體的導入不限於體外方法。 例如，也可直接使用體內方法將載體導入對象。
宿主細胞 術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」和「宿主細胞培養物」可交互使用，且是指已導入外源核酸的細胞，包含此類細胞的後代。宿主細胞包含「轉形株」和「轉形細胞」，其包含初代轉形細胞和由其衍生的後代，不考慮繼代次數。後代在核酸含量上可能與親本細胞不完全相同，但可能包含突變。具有與在最初轉形的細胞中篩選或選擇的功能或生物活性相同的功能或生物活性的突變後代包含在本文中。
特異性 「特異性」是指特異性結合至一或多個結合配偶體的分子對配偶體以外的分子不會顯示任何顯著結合。再者，當抗原結合位點對抗原中所含有的多個抗原決定基中的特定抗原決定基具有特異性時，也使用「特異性」。如果抗原結合分子特異性結合至抗原時，亦描述為「抗原結合分子對抗原具有/顯示出特異性」。當抗原結合位點所結合的抗原決定基含在多個不同的抗原中時，含有抗原結合位點的抗原結合分子可結合至具有此抗原決定基的各種抗原結合。
抗體片段 「抗體片段」是指除完整抗體之外，包含結合完整抗體所結合的抗原的完整抗體的一部分的分子。抗體片段的範例包含但不限於Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體分子(例如scFv)和單域抗體。對於某些抗體片段的回顧，參閱Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)。對於scFv片段的回顧，參閱例如Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)；亦參閱WO 93/16185；和美國專利號5,571,894和5,587,458。對於包含補救受體結合抗原結合基殘基且具有增加的體內半衰期的Fab和F(ab’)2片段的討論，參閱美國專利號5,869,046。雙抗體是具有兩個抗原結合位點的抗體片段，可為二價或雙特異性。參閱例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)； 和Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)。也在Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)中描述三抗體和四抗體。單域抗體是包含抗體的重鏈可變域的全部或部分或輕鏈可變域的全部或部分的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體是人類單域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA；參閱例如美國專利號6,248,516 B1)。可藉由各種技術製造抗體片段，包含但不限於完整抗體的蛋白質裂解消化以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)產生，如本文所述。
可變片段(Fv) 在本文中，術語「可變片段(variable fragment，Fv)」是指由一對抗體輕鏈可變區(VL)和抗體重鏈可變區(VH)所構成之抗體衍生抗原結合位點的最小單位。1988年，Skerra和Pluckthun發現藉由在細菌訊號序列下游插入抗體基因，且誘導此基因在大腸桿菌中的表現，可從大腸桿菌周質級分製備均質且活性抗體(Science (1988) 240(4855), 1038-1041)。在從周質級分製備的Fv中，VH以結合至抗原的方式與VL結合。
scFv、單鏈抗體和sc(Fv) 2在本文中，術語「scFv」、「單鏈抗體」和「sc(Fv) 2」均指含有衍生自重和輕鏈的可變區而非恆定區的單一多肽鏈的抗體片段。通常，單鏈抗體亦在VH和VL結構域之間含有多肽連接子，這使得能夠形成被認為允許抗原結合的所需結構。Pluckthun在「The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore, eds., Springer-Verlag, New York, 269-315 (1994)」中詳細討論了單鏈抗體。也參閱國際專利公開WO 1988/001649；美國專利號4,946,778和5,260,203。在一特定實施例中，單鏈抗體可為雙特異性和/或人源化的。
scFv是單鏈低分子量抗體，其中形成Fv的VH和VL藉由胜肽連接子連接在一起(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85(16), 5879-5883)。 VH 和VL 可藉由胜肽連接子保持緊密接近。 sc(Fv) 2是單鏈抗體，其中兩個VL和兩個VH的四個可變區藉由連接子例如胜肽連接子連接形成單鏈(J Immunol. Methods (1999) 231(1-2), 177 -189)。兩個VH和兩個VL可衍生自不同的單株抗體。這種sc(Fv) 2較佳包含例如辨識單一抗原中存在的兩個抗原決定基的雙特異性sc(Fv) 2，如Journal of Immunology (1994) 152(11), 5368-5374中所揭露。可藉由本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的方法，來產生sc(Fv) 2。 例如，可藉由用連接子如胜肽連接子來連接scFv，以產生sc(Fv) 2。
在本文中，從單鏈多肽的N端開始，sc(Fv) 2包含以VH、VL、VH和VL的順序([VH]-連接子-[VL]-連接子-[VH]-連接子- [VL])排列的兩個VH單元和兩個VL單元。兩個VH單元和兩個VL單元的順序不限於上述形式，且它們可以任何順序排列。 下面列出了形式的範例。 [VL]-連接子-[VH]-連接子-[VH]-連接子-[VL] [VH]-連接子-[VL]-連接子-[VL]-連接子-[VH] [VH]-連接子-[VH]-連接子-[VL]-連接子-[VL] [VL]-連接子-[VL]-連接子-[VH]-連接子-[VH] [VL]-連接子-[VH]-連接子-[VL]-連接子-[VH]
也在WO 2006/132352中詳細描述sc(Fv) 2的分子形式。 根據這些描述，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可適當地製備所需的sc(Fv) 2，以產生本文揭露的多肽複合物。 再者，本揭露的抗原結合分子或抗體可與載體聚合物(carrier polymer)偶聯，例如PEG或有機化合物例如抗癌劑。或者，較佳地將糖鏈添加序列插入至抗原結合分子或抗體中，使得糖鏈產生期望的效果。
用於鍵接抗體的可變區的連接子包含可藉由基因工程導入的任意胜肽連接子、合成連接子和例如Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996中揭露的連接子。 然而，在本揭露中較佳的是胜肽連接子。胜肽連接子的長度沒有特別限制，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可根據目的適當選擇。長度較佳為5個胺基酸或更多 (沒有特別限制，上限通常為30個胺基酸或更少、較佳為20個胺基酸或更少)、且特別佳為15個胺基酸。當sc(Fv) 2含有三個胜肽連接子時，它們的長度可以相同或不同。
例如，此類胜肽連接子包含： Ser、 Gly-Ser、 Gly-Gly-Ser、 Ser-Gly-Gly、 Gly-Gly-Gly-Ser (序列辨識號：9)、 Ser-Gly-Gly-Gly (序列辨識號：10)、 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (序列辨識號：11)、 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (序列辨識號：12)、 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (序列辨識號：13)、 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (序列辨識號：14)、 Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (序列辨識號：15)、 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (序列辨識號：16)、 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (序列辨識號：11))n、和 (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (序列辨識號：12))n， 其中n是1或更大的整數。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可根據目的相應地選擇胜肽連接子的長度或序列。
合成連接子(化學交聯劑)通常用於交聯胜肽，且範例包含： N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxy succinimide，NHS)、 二琥珀醯亞胺辛二酸酯(disuccinimidyl suberate，DSS)、 雙(磺基琥珀醯亞胺)辛二酸酯(bis(sulfosuccinimidyl) suberate，BS3)、 二硫代雙(琥珀醯亞胺丙酸酯)(dithiobis(succinimidyl propionate)，DSP)、 二硫代雙(磺基琥珀醯亞胺丙酸酯)(dithiobis(sulfosuccinimidyl propionate)，DTSSP)、 乙二醇雙(琥珀醯亞胺琥珀酸酯)(ethylene glycol bis(succinimidyl succinate)，EGS)、 乙二醇雙(磺基琥珀醯亞胺琥珀酸酯)(ethylene glycol bis(sulfosuccinimidyl succinate)，sulfo-EGS)、 酒石酸二琥珀醯亞胺酯disuccinimidyl tartrate (DST)、酒石酸二磺基琥珀醯亞胺酯(disulfosuccinimidyl tartrate，sulfo-DST))、 雙[2-(琥珀醯亞胺氧基羰基氧基)乙基]碸(bis[2-(succinimidoxycarbonyloxy)ethyl] sulfone，BSOCOES))和 雙[2-(磺基琥珀醯亞胺氧羰基氧基)乙基]碸(bis[2-(sulfosuccinimidoxycarbonyloxy)ethyl]sulfone，sulfo-BSOCOES)。這些交聯劑是市售的。
通常，需要三個連接子將四個抗體可變區鏈接在一起。要使用的連接子可以是相同類型或不同類型。
Fab、F(ab’) 2和Fab’ 「Fab」由單條輕鏈和來自單條重鏈的CH1域及可變區所組成。Fab分子的重鏈不能與另一個重鏈分子形成雙硫鍵。
「F(ab’) 2」或「Fab」是藉由用例如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的蛋白酶處理免疫球蛋白(單株抗體)來產生的，且是指藉由消化存在於兩條H鏈中每一條的鉸鏈區之間的雙硫鍵附近的免疫球蛋白(單株抗體)所產生的抗體片段。例如，木瓜蛋白酶在兩條H 鏈中每一條鉸鏈區之間存在的二硫鍵上游切割IgG，以產生兩個同源抗體片段，其中包含VL (L鏈可變區)和CL (L 鏈恆定區)的L鏈經由其C端區的雙硫鍵鍵接至包含VH (H鏈可變區)和CH gamma 1 (H 鏈恆定區中的gamma 1 區)的H鏈片段。這兩個同源抗體片段中的每一個都稱為 Fab’。
「F(ab’)2」由兩條輕鏈和兩條重鏈所組成，包含CH1域的恆定區和部分CH2域，從而在兩條重鏈之間形成二硫鍵。本文揭露的F(ab’) 2可較佳地如下產生。用蛋白酶例如胃蛋白酶部分消化完整單株抗體或包含所需抗原結合位點的這類；且藉由吸附至蛋白質A管柱上來除去Fc片段。蛋白酶沒有特別限制，只要它能在合適的酶反應條件例如pH下，以選擇性的方式切割整個抗體，以產生F(ab’)2即可。此類蛋白酶包含例如胃蛋白酶和無花果蛋白酶。
Fc區 術語「Fc區」或「Fc域」是指包含由抗體分子中的鉸鏈或其一部分和CH2和CH3域所組成的片段的區域。IgG類別的Fc區意指但不限於從例如第226位半胱胺酸 (EU編號(本文也稱為EU索引))至C端或第230位脯胺酸 (EU編號)至C端的區域。可藉由用蛋白質裂解酶例如胃蛋白酶部分消化例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4單株抗體，然後再洗提吸附在蛋白質A管柱或蛋白質G管柱上的級分，來獲得Fc區。這種蛋白質裂解酶沒有特別限制，只要此酵素能夠在適當設定的酵素反應條件(例如pH)下，消化完整抗體以限制性地形成Fab或F(ab’) 2即可。其範例可包含胃蛋白酶和木瓜蛋白酶。
衍生自例如天然IgG的Fc區可作為本揭露的「Fc區」。 在本文中，天然IgG是指含有與自然界中發現的IgG的胺基酸序列相同的胺基酸序列且屬於基本上由免疫球蛋白gamma基因所編碼的一抗體類別的多肽。天然人類IgG是指例如天然人類IgG1、天然人類IgG2、天然人類IgG3或天然人類IgG4。天然IgG亦包含變異體或自發性由其衍生的變異體。多個基於基因多態性的同種異型(allotype)序列被描述為在Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No. 91-3242中的人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3和人類IgG4抗體的恆定區，其中任何一個都可在本揭露中使用。特別地，人類IgGl的序列可具有DEL或EEM作為EU編號第356至358位的胺基酸序列。
在某些實施例中，可將一或多個胺基酸置換導入至本文提供的抗體的Fc區，從而產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含在一或多個胺基酸位置包含胺基酸取代的人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。 例如，分別在序列辨識號：18至21中顯示人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3和人類IgG4的重鏈恆定區。例如，人類IgG1、人類IgG2、人類IgG3 和人類IgG4 的 Fc 區顯示作為序列辨識號：18至21的部分序列。
在一些實施例中，多特異性抗原結合分子的Fc域由一對包含免疫球蛋白分子的重鏈域的多肽鏈所組成。例如，免疫球蛋白G (IgG)分子的Fc域是二聚體，其中每個次單元包含CH2和CH3 IgG重鏈恆定域。Fc域的兩個次單元能夠互相穩定結合。在一實施例中，本文所述的多特異性抗原結合分子包含不超過一個Fc域。
在本文所述的一實施例中，多特異性抗原結合分子的Fc域是IgG Fc域。在一特定實施例中，Fc域是IgG1 Fc域。在另一實施例中，Fc域是IgG1 Fc域。在另一特定實施中，Fc域是人類IgG1 Fc區。
在一態樣中，本揭露提供了一種多特異性抗原結合分子，其更包含 (i) Fc域，其與天然人類IgG1 Fc域相比，對人類Fc gamma 受體的展現出降低的結合親和力， 其中Fc域由能夠穩定結合的第一Fc區次單元和第二Fc區次單元所構成。
在一態樣中，本揭露提供了一種多特異性抗原結合分子，其更包含 (i) Fc域，其與天然人類IgG1 Fc域相比，對人類Fc gamma 受體的展現出降低的結合親和力， 其中Fc域包含以下(e1)或(e2)： (e1) 第一Fc區次單元，其包含第349位Cys、第366位Ser、第368位Ala和第407位Val、及第二Fc區次單元，其包含第354位Cys和第366位Trp； (e2) 第一Fc區次單元，其包含第439位Glu、及第二Fc區次單元，其包含第356位Lys； 其中胺基酸位置係根據EU索引編號。
在一態樣中，本揭露提供了一種多特異性抗原結合分子，其更包含 (i) Fc域，其與天然人類IgG1 Fc域相比，對人類Fc gamma 受體的展現出降低的結合親和力， 其中包含在Fc域中的第一和/或第二Fc區次單元包含以下(f1)或(f2)： (f1) 第234位Ala和第235位Ala； (f2) 第234位Ala、第235位Ala和第297位Ala； 其中胺基酸位置係根據EU索引編號。
在一態樣中，本揭露提供了一種多特異性抗原結合分子，其更包含 (i) Fc域，其與天然人類IgG1 Fc域相比，對人類Fc gamma 受體的展現出降低的結合親和力， 其中與天然人類IgG1 Fc域相比，Fc域更對人類FcRn展現出更強的FcRn結合親和力。
在一態樣中，本揭露提供了一種多特異性抗原結合分子，其更包含 (i) Fc域，其與天然人類IgG1 Fc域相比，對人類Fc gamma 受體的展現出降低的結合親和力， 其中包含在 Fc 域中的第一和/或Fc區次單元包含第428位Leu、第434位Ala、第438位Arg和第440位Glu， 其中胺基酸位置係根據EU索引編號。
具有降低的Fc受體(Fc gamma 受體)結合活性的Fc區 在某些實施例中，與天然IgG1 Fc域相比，本文所述的多特異性抗原結合分子的Fc域對Fc受體的結合親和力降低。在一這樣的實施例中，與天然IgG1 Fc域(或包含天然IgG1 Fc域的多特異性抗原結合分子)相比，Fc域(或包含所述Fc域的多特異性抗原結合分子)對Fc受體展現出小於50%、較佳小於20%、更佳小於10%、最佳小於5%的結合活性。在一實施例中，Fc域(或包含所述Fc域的多特異性抗原結合分子)基本上不結合至Fc受體。在一特定實施例中，Fc受體是Fc gamma受體。在一實施例中，Fc受體是人類Fc受體。在一實施例中，Fc受體是活化性Fc受體。在一具體實施例中，Fc受體是活化性人類Fc gamma受體、更具體地是人類Fc gamma RIIIa、Fc gamma RI或Fc gamma RIIa、最具體地是人類Fc gamma RIIIa。
在某些實施例中，多特異性抗原結合分子的Fc域包含一或多個降低Fc域對Fc受體的結合親和力的胺基酸突變。通常，相同的一或多個胺基酸突變存在於Fc域的兩個次單元中的每一個中。在一實施例中，胺基酸突變降低了Fc域對Fc受體的結合親和力。在一實施例中，胺基酸突變使Fc域對Fc受體的結合親和力降低至少2倍、至少5倍或至少10倍。在有超過一個之降低Fc域對Fc受體的結合親和力的胺基酸突變的實施例中，這些胺基酸突變的組合可使Fc域對Fc受體的結合親和力降低至少10倍、至少20倍、或甚至至少50倍。在一實施例中，與包含非工程化Fc域的多特異性抗原結合分子相比，包含工程化Fc域的多特異性抗原結合分子對Fc受體展現出小於20%、特別是小於10%、更特別是小於5%的結合親和力。在一特定實施例中，Fc受體是Fc gamma受體。在一些實施例中，Fc受體是人類Fc受體。在一些實施例中，Fc受體是活化性Fc受體。在一具體實施例中，Fc受體是活化性人類Fc gamma受體、更具體地人類Fc gamma RIIIa、Fc gamma RI或Fc gamma RIIa、最具體地人類Fc gamma RIIIa。較佳地，降低與這些受體中的每一個的結合。
在一實施例中，降低Fc域對Fc受體的結合親和力的胺基酸突變是胺基酸取代。在一實施例中，Fc域在選自E233、L234、L235、N297、P331和P329的群組的位置包含胺基酸取代。在一更具體的實施方例中，Fc域在選自L234、L235和P329的群組的位置包含胺基酸取代。在一些實施例中，Fc域包含胺基酸取代L234A和L235A。在一這樣的實施例中，Fc域是IgG1 Fc域，特別是人類IgG1 Fc域。在一實施例中，Fc域包含在第P329位的胺基酸取代。在一更具體的實施例中，胺基酸取代是P329A或P329G，特別是P329G。在一實施例中，Fc域包含在第P329位的胺基酸取代和在選自E233、L234、L235、N297和P331的位置的其它胺基酸取代。在一更具體的實施例中，其它胺基酸取代是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在一些特定實施例中，Fc域包含在第P329、L234和L235位的胺基酸取代。在一些更特定的實施例中，Fc域包含胺基酸突變L234A、L235A和P329G (「P329G LALA」)。在一這樣的實施例中，Fc域是IgG1 Fc域，特別是人類IgG1 Fc域。胺基酸取代的「P329G LALA」組合幾乎完全消除了人類IgG1 Fc域的 Fc gamma受體(以及補體)結合，如PCT公開號WO 2012/130831中所述。WO 2012/130831亦描述了製備此類突變Fc域的方法和確定其特性例如Fc受體結合或效應子功能的方法。
與 IgG1抗體相比，IgG4抗體對Fc受體展現出降低的結合親和力和降低的效應子功能。因此，在一些實施例中，本文所述的T細胞活化性雙特異性抗原結合分子的Fc域是IgG4 Fc域，特別是人類IgG4 Fc域。在一實施例中，IgG4 Fc域包含在第S228位的胺基酸取代，特別是胺基酸取代S228P。為了進一步降低其對Fc受體的結合親和力和/或其效應子功能，在一實施例中，IgG4 Fc域包含在第L235位的胺基酸取代，特別是胺基酸取代L235E。在另一實施例中，IgG4 Fc域包含在第L329位的胺基酸取代，特別是胺基酸取代P329G。在一特定實施例中，IgG4 Fc域包含在第S228、L235和P329位包含胺基酸取代，具體是胺基酸取代S228P、L235E和P329G。在PCT公開號WO 2012/130831中描述了此類IgG4 Fc域突變體及其 Fc gamma 受體結合特性。
在某些實施例中，Fc域的N-糖基化已被消除。在一這樣的實施例中，Fc域包含在第N297位的胺基酸突變，特別是用丙胺酸(N297A)或天冬胺酸(N297D)替代天冬醯胺的胺基酸取代。
在一特別佳的實施例中，與天然IgG1 Fc域相比，對Fc受體展現出降低的結合親和力的Fc域是包含胺基酸取代L234A、L235A和N297A的人類IgG1 Fc域。
可使用本發明所屬技術領域中熟知的遺傳或化學方法，藉由胺基酸缺失、取代、插入或修飾，來製備突變Fc域。遺傳方法可包含編碼DNA序列、PCR、基因合成等的位點特異性誘變。例如可藉定序，來驗證正確的核苷酸變化。
可例如藉由ELISA、或藉由使用標準儀器例如BIAcore儀器(GE Healthcare)的表面電漿共振(SPR)，輕易地確定與Fc受體的結合，且例如可藉由重組表現，來獲得Fc受體。本文描述了合適的此類結合測定法。或者，可使用已知表現特定Fc受體的細胞系例如表現Fc gamma IIIa受體的人類NK細胞，來評估Fc域或包含Fc域的細胞活化雙特異性抗原結合分子對Fc受體的結合親和力。
Fc受體 術語「Fc受體」或「FcR」是指結合至抗體的Fc區的受體。在一些實施例中，FcR是天然人類FcR。在一些實施例中，FcR是結合IgG抗體(gamma受體)且包含Fc gamma RI、Fc gamma RII和Fc gamma RIII次類別的受體，包含那些受體的等位基因變異體和剪接形式的受體。Fc gamma RII受體包含Fc gamma RIIA (「活化性受體」)和Fc gamma RIIB(「抑制性受體」)，它們具有類似的胺基酸序列，主要區別在於其細胞質域。活化性受體 Fc gamma RIIA在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸的活化基序 (immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)。 抑制性受體Fc gamma RIIB在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸的抑制基序 (immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif，ITIM)。(參閱例如Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997))。 例如，在 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)； Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)； 和 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)中回顧FcR。其他FcR，包含未來被鑑定出的那些被本文中的術語「FcR」所涵蓋。
術語「Fc受體」或「FcR」還包含新生兒受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) 和免疫球蛋白恆定的調節。測量與 FcRn 結合的方法是已知的(參閱例如，Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997)；Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)；WO 2004/92219 (Hinton et al))。
可例如在表現人類FcRn的轉基因小鼠或轉染人類細胞系中，或在投予具有變異Fc區的多肽的靈長類動物中，測定人類FcRn高親和力結合多肽之體內與人類FcRn結合和血漿半衰期。WO 2000/42072 (Presta) 描述了與 FcR 結合增加或減少的抗體變異體。也參閱例如，Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)。
Fc gamma受體 Fc gamma受體是指能夠結合至單株IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體的Fc域的受體，包含屬於基本上由Fc gamma受體基因編碼的蛋白質家族的所有成員。在人類中，此家族包含Fc gamma RI (CD64)，其包含同功型Fc gamma RIa、Fc gamma RIb 和Fc gamma RIc；Fc gamma RII (CD32)，其包含同功型Fc gamma RIIa (包含同種異型(allotype)H131和 R131)、Fc gamma RIIb(包含Fc gamma RIIb-1 和Fc gamma RIIb-2)和Fc gamma RIIc； 和Fc gamma RIII (CD16)，其包含同功型Fc gamma RIIIa (包含同種異型V158和 F158)和 Fc gamma RIIIb (包含同種異型Fc gamma RIIIb-NA1和Fc gamma RIIIb-NA2)；以及所有未鑑定的人類Fc gamma 受體、Fc gamma 受體同功型及其同種異型。然而，Fc gamma受體不限於這些範例。不限於前述，Fc gamma受體包含衍生自人類、小鼠、大鼠、兔和猴的那些。Fc gamma受體可衍生自任何生物體。小鼠Fc gamma受體包含但不限於Fc gamma RI (CD64)、Fc gamma RII (CD32)、Fc gamma RIII (CD16) 和 Fc gamma RIII-2 (CD16-2)、以及所有未鑑定的小鼠 Fc gamma受體、Fc gamma受體同功型及其同種異型。此種較佳的Fc gamma受體包含例如人類Fc gamma RI (CD64)、Fc gamma RIIA (CD32)、Fc gamma RIIB (CD32)、Fc gamma RIIIA (CD16)和/或Fc gamma RIIIB (CD16)。分別在RefSeq登錄號NM_000566.3和RefSeq登錄號NP_000557.1中顯示Fc gamma RI的多核苷酸序列和胺基酸序列；分別在RefSeq登錄號BC020823.1和RefSeq登錄號AAH20823.1中顯示Fc gamma RIIA的多核苷酸序列和胺基酸序列；分別在RefSeq登錄號BC146678.1和RefSeq登錄號AAI46679.1中顯示Fc gamma RIIB的多核苷酸序列和胺基酸序列；分別在RefSeq登錄號BC033678.1和RefSeq登錄號AAH33678.1中顯示Fc gamma RIIIA的多核苷酸序列和胺基酸序列；而分別在RefSeq登錄號BC128562.1和RefSeq登錄號AAI28563.1中顯示FcγRIIIB的多核苷酸序列和胺基酸序列。除了上述 FACS和ELISA格式之外，還可藉由ALPHA篩選(放大發光鄰近均相測定法(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay))、基於表面電漿共振 (SPR)的BIACORE方法及還有其他 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010)，來評價Fc gamma受體對單株IgG1、IgG2、IgG3 或 IgG4抗體的Fc域是否具有結合活性。
同時，「Fc配體」或「效應子配體」是指結合至抗體Fc域，而形成Fc/Fc配體複合物的分子且較佳為多肽。此分子可衍生自任何生物體。Fc配體與Fc的結合較佳地誘導一或多種效應子功能。此類Fc配體包含但不限於Fc受體、Fc gamma受體、Fc alpha受體、Fc beta受體、FcRn、C1q和C3、甘露聚醣結合凝集素、甘露糖受體、葡萄球菌蛋白質A(Staphylococcus Protein A)、葡萄球菌蛋白G和病毒Fc gamma受體。Fc配體亦包含Fc受體同源物(FcRH)(Davis et al., (2002) Immunological Reviews 190, 123-136)，它們是與Fc gamma受體同源的Fc受體家族。Fc配體亦包含結合至Fc的未鑑定分子。
Fc gamma受體結合活性 可藉由使用上述FACS和ELISA格式以及ALPHA篩選和基於表面電漿共振(SPR)的BIACORE方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010)，來評價Fc域與任一Fc gamma受體，Fc gamma RI、Fc gamma RIIA、Fc gamma RIIB、Fc gamma RIIIA和/或Fc gamma RIIIB的受損結合活性。
藉由ALPHA技術基於以下描述的原理使用兩種類型的珠子(bead)：供體珠(donor bead)和受體珠(acceptor bead)，來進行ALPHA篩選。只有當鏈接至供體珠的分子與鏈接至受體珠的分子發生生物學上的交互作用且當兩顆珠子非常靠近時，才會檢測到發光訊號。在雷射光束的激發下，供體珠中的光敏劑將珠子周圍的氧轉化為激發態的單線態氧。當單線態氧在供體珠周圍擴散且到達非常靠近的受體珠時，會在受體珠內誘導化學發光反應。此反應最終導致光放射。若鏈接至供體珠的分子不與鏈接至受體珠的分子交互作用，則供體珠產生的單線態氧不會到達受體珠且不會發生化學發光反應。
例如，生物素標記的抗原結合分子或抗體固定在供體珠上，而穀胱甘肽S-轉移酶 (glutathione S-transferase，GST) 標記的 Fc gamma受體固定在受體珠上。於包含競爭性突變Fc域的抗原結合分子或抗體不存在的情況下，Fc gamma受體與包含野生型Fc域的抗原結合分子或抗體交互作用，誘導520至620 nm的訊號作為結果。具有未標記的突變Fc域的抗原結合分子或抗體與包含野生型Fc域的抗原結合分子或抗體競爭與Fc gamma受體的交互作用。可藉由量化競爭導致的螢光減少，來確定相對結合親和力。使用磺基-NHS-生物素等將抗原結合分子或例如抗體的抗體生物素化的方法是已知的。將GST標記添加至Fc gamma受體的合適方法包含涉及將編碼Fc gamma受體的多肽與GST框內融合，使用導入了攜帶基因的載體的細胞表現融合基因，然後使用穀胱甘肽管柱純化的方法。可較佳地例如藉由使用例如GRAPHPAD PRISM (GraphPad; San Diego)的軟體，基於非線性回歸分析擬合單點競爭模型，來分析誘導訊號。
用於觀察它們交互作用的物質之一作為配體固定在感測晶片的金薄層上。當光線照射到感測晶片的背面，從而在金薄層和玻璃之間的界面發生全反射時，反射光的強度在某個位點會部分減弱(SPR訊號)。用於觀察它們交互作用的另一物質作為分析物注入至感測晶片的表面。當分析物結合至配體時，固定的配體分子的質量增加。這會改變感測晶片表面上的溶劑的折射率。 折射率的變化導致SPR訊號的位置偏移(相反地，解離將訊號移回原始位置)。在 Biacore系統中，上述偏移量(即感測晶片表面上的質量變化)繪製在緃軸上，因此質量隨時間的變化顯示為測量數據(感測圖)。由感測圖曲線，來確定動力學參數(結合速率常數(ka)和解離速率常數(kd))，且由這兩個常數之間的比率確定親和力(KD)。在BIACORE方法中較佳地使用抑制測定法。在Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005-4010中此種抑制測定法的範例。
特異性結合至Fc gamma RIIb的工程化Fc區(「Fc區變異體」) 在一態樣中，本揭露的多特異性抗原結合分子包含第二抗原結合部分，其包含特異性結合至第二靶細胞上的錨定抗原的工程化Fc區(「Fc區變異體」)。 在一態樣中，本揭露的多特異性抗原結合分子包含第二抗原結合部分，其包含特異性結合至FcgRIIB的工程化Fc區(「Fc區變異體」)。 在一實施例中，當與含有天然IgG抗體Fc區的多肽相比，特異性結合至FcgRIIB的工程化Fc區可降低與所有活化性Fc gamma R，特別是 Fc gamma RIIa (R型) 的結合活性，同時保持Fc gamma RIIb結合活性。 更具體地，本發明提供包含胺基酸序列的Fc區變異體，其中根據EU編號在第238位的胺基酸改變與其他特定胺基酸改變組合。 再者，與含有天然IgG抗體Fc區的多肽的那些相比，本發明提供了將胺基酸改變導入Fc區，以降低其與所有活化性Fc gamma R，特別是Fc gamma RIIa (R型)的結合活性，同時保持其Fc gamma RIIb結合活性。
在一些實施例中，特異性結合至本揭露的Fc gamma RIIb的工程化Fc區(「Fc區變異體」)包括包含組合根據EU編號的第238位胺基酸改變為另一胺基酸，其中以下(a)至(k)的任一胺基酸改變為人類IgG (IgG1、IgG2、IgG3和IgG4) 的Fc區中的另一胺基酸的Fc區變異體。與包含天然IgG Fc區的多肽的那些相比，將改變導入Fc區可提供包含對所有活化性Fc gamma R，特別是Fc gamma RIIa (R型)的結合活性降低，同時保持Fc gamma RIIb結合活性的Fc區變異體的多肽： (a) 根據EU編號在Fc區的第235位的胺基酸； (b) 根據EU編號在Fc區的第237位的胺基酸； (c) 根據EU編號在Fc區的第241位的胺基酸； (d) 根據EU編號在Fc區的第268位的胺基酸； (e) 根據EU編號在Fc區的第295位的胺基酸； (f) 根據EU編號在Fc區的第296位的胺基酸； (g) 根據EU編號在Fc區的第298位的胺基酸； (h) 根據EU編號在Fc區的第323位的胺基酸； (i) 根據EU編號在Fc區的第324位的胺基酸； (j) 根據EU編號在Fc區的第330位的胺基酸；及 (k) 至少兩個胺基酸選自(a)至(j)。
產生具有所需結合活性的抗體的方法 產生具有所需結合活性的抗體的方法是本發明所屬技術領域中具有通常知識者已知的。以下是描述結合至Notch受體的抗體(抗Notch受體抗體)的產生方法的範例。 也可根據下述範例產生，結合至第二靶細胞或第三靶細胞上的錨定抗原的抗體。
可使用已知方法，來獲得作為多株或單株抗體的抗Notch蛋白質受體抗體。較佳產生的抗Notch受體抗體是衍生自哺乳動物的單株抗體。此種哺乳動物衍生的單株抗體包含由雜交瘤或藉由基因工程技術用攜帶抗體基因的表現載體轉形的宿主細胞所產生的抗體。
可使用已知技術，來產生產生單株抗體的雜交瘤，例如如下所述。 具體地，藉由使用Notch受體蛋白質作為致敏抗原的常規免疫方法，對哺乳動物進行免疫。藉由常規細胞融合方法，使所得免疫細胞與已知的親代細胞融合。然後，可藉由使用常規篩選方法，來篩選單株抗體產生細胞以選擇產生抗Notch受體抗體的雜交瘤。
具體地，如下所述製備單株抗體。首先，核苷酸序列在RefSeq登錄號中揭露的Notch受體基因之Notch1 (NP_060087.3或P46531)、Notch2 (NP_077719.2(同功型1)或NP_001186930.1 (同功型2))、Notch3 (NP_000426.2))或 Notch4 (NP_004548.3或Q99466) 可被表現，以產生如下所示的Notch受體蛋白質 。 (人類Notch受體1的胺基酸序列：Genbank登錄號P46531、人類Notch受體2：Genbank登錄號AAH71562.2、人類Notch受體3：Genbank登錄號AAB91371.1、人類Notch受體4：Genbank登錄號AAC63097.1。) 這些蛋白質將作為抗體製備的致敏抗原。或者，編碼Notch受體的胞外域(ECD)的核苷酸可被表現，以產生含有Notch受體ECD的蛋白質。即，將編碼全長Notch受體或Notch受體ECD的基因序列插入至已知的表現載體中，且用此載體轉形合適的宿主細胞。可使用Notch受體的胞外域。藉由已知方法從宿主細胞或其培養物上清液中，純化所需的人類全長Notch受體或Notch受體ECD蛋白質。或者，可能使用純化的天然Notch受體蛋白質作為致敏抗原。
純化的全長Notch受體或Notch受體ECD蛋白質可作為用於哺乳動物免疫的致敏抗原。全長Notch受體或Notch受體ECD的部分胜肽也可作為致敏抗原。在此情況下，也可從人類Notch受體胺基酸序列藉由化學合成，來獲得部分胜肽。再者，它們也可藉由將Notch受體基因的一部分合併至表現載體中並表現來獲得。再者，它們也可使用蛋白酶藉由降解Notch受體蛋白質而獲得，但作為部分胜肽的Notch受體胜肽的區域和大小不特別限於特別實施例。
對於致敏抗原，或者可能使用藉由將全長Notch受體或Notch受體ECD蛋白質的所需部分多肽或胜肽與不同多肽融合而製備的融合蛋白質。例如，抗體Fc片段和胜肽標記較佳用來產生作為致敏抗原的融合蛋白質。可藉由將編碼二或更多個所需多肽片段的框內基因融合且將融合基因插入至如上所述的表現載體中，來構建用於表現此種融合蛋白質的載體。Molecular Cloning 2nd ed中描述了產生融合蛋白質的方法。(Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58 (1989) Cold Spring Harbor Lab. Press)。作為致敏抗原的Notch受體的製備方法和使用Notch受體的免疫方法也是眾所皆知的。
對用致敏抗原免疫的哺乳動物沒有特別限制。然而，較佳的是藉由考慮它們與用於細胞融合的親代細胞的相容性來選擇哺乳動物。通常，較佳地使用囓齒類例如小鼠、大鼠和倉鼠、兔和猴。
藉由已知方法用致敏抗原免疫上述動物。 通常進行的免疫方法包含例如，將致敏抗原腹膜內或皮下注射到哺乳動物。具體地，用PBS (磷酸鹽緩衝食鹽水)、生理食鹽水等適當地稀釋致敏抗原。若有需要，將常規佐劑如弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant)與抗原混合，且將混合物乳化。然後，將致敏抗原以4至21天的間隔多次投予至哺乳動物。合適的載體可用於用致敏抗原的免疫中。特別地，當低分子量部分胜肽作為致敏抗原時，有時需要將致敏抗原胜肽與用於免疫的載體蛋白質例如白蛋白質或匙孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)偶聯。
或者，可使用如下所述的DNA免疫，來製備產生所需抗體的雜交瘤。DNA免疫是一種藉由在投予構建為允許抗原蛋白質編碼基因在動物體內表現的載體DNA而免疫的動物中表現致敏抗原，來賦予免疫刺激作用的免疫方法。與將蛋白質抗原投予至待免疫動物的常規免疫方法相比， DNA免疫的預期優勢在於： - 可提供免疫刺激，同時保留膜蛋白質例如Notch受體的結構；和 - 無需純化用來免疫的抗原。
為了製備使用DNA免疫之本發明的單克隆抗體，首先，將表現Notch受體蛋白質的DNA投予至要免疫的動物。可藉由例如PCR的已知方法，來合成Notch受體編碼DNA。將獲得的DNA插入至合適的表現載體，然後將其投予至要免疫的動物。較佳使用的表現載體包含例如市售的表現載體，例如pcDNA3.1。可使用常規方法將載體投予至生物體。例如，藉由使用基因槍將表現載體塗佈的金顆粒導入至待免疫動物體內的細胞中，來進行DNA免疫。也可藉由WO 2003/104453中描述的方法，來產生辨識Notch受體的抗體。
如上所述對哺乳動物進行免疫後，證實了血清中Notch受體結合抗體的效價增加。然後，從哺乳動物中收集免疫細胞，然後進行細胞融合。特別地，脾細胞較佳地作為免疫細胞。
哺乳動物骨髓瘤細胞作為與上述免疫細胞融合的細胞。骨髓瘤細胞較佳地包含用於篩選的合適的選擇標記。選擇標記賦予細胞在特定培養條件下存活(或死亡)的特性(characteristic)。次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶缺乏(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase deficiency)(以下簡稱為HGPRT缺乏症)和胸苷激酶缺乏(thymidine kinase deficiency)(以下簡稱為TK缺乏症)被稱為選擇標記。HGPRT或TK缺乏的細胞具有次黃嘌呤-胺基蝶呤-胸苷敏感性(hypoxanthine-aminopterin-thymidine sensitivity)(以下簡稱HAT敏感性)。HAT敏感細胞無法在HAT選擇培養基中合成DNA，因此會被殺死。然而，當細胞與正常細胞融合時，它們可使用正常細胞的補救路徑繼續DNA合成，因此它們甚至可在HAT選擇培養基中生長。
可分別在含有6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine)、8-氮鳥嘌呤(8-azaguanine)(以下簡稱8AG)或5’-溴脫氧尿苷(5’-bromodeoxyuridine)的培養基中選擇HGPRT缺乏和TK缺乏細胞。 正常細胞被殺死是因為它們將這些嘧啶類似物合併至DNA中。同時，缺乏這些酵素的細胞可在選擇培養基中存活，因為它們不能合併這些嘧啶類似物。此外，由新黴素抗性基因提供之稱為G418抗性的選擇標記賦予對2-去氧鏈胺類抗生素(2-deoxystreptamine antibiotic)(慶大霉素類似物(gentamycin analog))的抗性。適用於細胞融合的各種類型的骨髓瘤細胞是已知的。
例如，可較佳地使用包含以下細胞的骨髓瘤細胞： P3(P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123 (4), 1548-1550)； P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978)81, 1-7)； NS-1 (C. Eur. J. Immunol. (1976)6 (7), 511-519)； MPC-11 (Cell (1976) 8 (3), 405-415)； SP2/0 (Nature (1978) 276 (5685), 269-270)； FO (J. Immunol. Methods (1980) 35 (1-2), 1-21)； S194/5.XX0.BU.1 (J. Exp. Med. (1978) 148 (1), 313-323)； R210 (Nature (1979) 277 (5692), 131-133)等等。
基本上使用已知方法例如Kohler 和 Milstein et al的方法，進行免疫細胞和骨髓瘤細胞之間的細胞融合。 更具體地，例如可在細胞融合促進劑的存在下於常規培養基中進行細胞融合。 融合促進劑包含例如聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)和仙台病毒(Sendai virus，HVJ)。若需要，亦可添加例如二甲基亞碸的輔助物質，以改善融合效率。
免疫細胞與骨髓瘤細胞的比值可自行決定，較佳地例如每一至十個免疫細胞對應一個骨髓瘤細胞。用於細胞融合的培養基包含例如適合骨髓瘤細胞系生長的培養基，例如RPMI1640培養基和MEM培養基，以及用於此類細胞培養的其他常規培養基。此外，可較佳地將血清補充物例如胎牛血清(fetal calf serum，FCS)添加至培養基。
對於細胞融合，將預定量的上述免疫細胞和骨髓瘤細胞在上述培養基中充分混合。然後，以通常30%至60% (w/v)的濃度，將預熱至約攝氏37度(C)的PEG溶液(例如，平均分子量為約1,000至6,000)添加至其中。將其輕輕混合以產生所需的融合細胞(雜交瘤)。然後，將上述適當的培養基逐漸添加至細胞，且將此反復離心以去除上清液。因此，可去除不利於雜交瘤生長的細胞融合劑等。
可藉由使用常規選擇培養基例如HAT培養基(含有次黃嘌呤、胺基蝶呤和胸苷的培養基)的培養，來選擇由此獲得的雜交瘤。藉由在上述HAT培養基中持續培養足夠長的時間，可殺死所需雜交瘤以外的細胞(非融合細胞)。通常，此時間是幾天至幾週。然後，藉由常規有限稀釋方法篩選和單獨選殖產生所需抗體的雜交瘤。
可使用基於用於細胞融合的骨髓瘤所擁有的選擇標記的選擇培養基，來選擇由此獲得的雜交瘤。例如，可藉由使用HAT培養基(含有次黃嘌呤、胺基蝶呤和胸苷的培養基)的培養，來選擇HGPRT或TK缺乏細胞。具體地，當HAT敏感骨髓瘤細胞用於細胞融合時，與正常細胞成功融合的細胞可在HAT培養基中選擇性增殖。藉由在上述HAT培養基中持續培養足夠長的時間，可殺死所需雜交瘤以外的細胞(非融合細胞)。具體地，通常可藉由培養數天至數週來選擇所需的雜交瘤。然後，藉由常規有限稀釋方法篩選和單獨選殖產生所需抗體的雜交瘤。
可藉由基於已知抗原/抗體反應的篩選方法，來較佳地選擇和單獨選殖所需的抗體。例如，Notch受體結合單株抗體可結合至在細胞表面上表現的Notch受體結合。可藉由螢光活化細胞分選(fluorescence activated cell sorting，FACS)，來篩選此種單株抗體。FACS是一種藉由使用雷射光束分析與螢光抗體接觸的細胞，且測量個別細胞發出的螢光，從而評價抗體與細胞或細胞表面的結合的系統。
為了藉由FACS來篩選出產生本發明的單株抗體的雜交瘤，先製備Notch受體表現細胞。較佳用於篩選的細胞是其中強制表現Notch受體的哺乳動物細胞。作為對照，未轉形的哺乳動物細胞可作為宿主細胞，選擇性地檢測抗體與細胞表面Notch受體結合的活性。具體地，可藉由選擇產生結合至被迫表現Notch受體的細胞而不結合至宿主細胞的抗體的雜交瘤，來單離產生抗Notch受體單株抗體的雜交瘤。
或者，可基於 ELISA 的原理，來評估抗體與固定的Notch受體表現細胞結合的活性。例如，Notch受體表現細胞被固定至ELISA盤的孔。雜交瘤的培養上清液與孔中的固定細胞接觸，且檢測結合至固定細胞的抗體。當單株抗體衍生自小鼠時，可使用抗小鼠免疫球蛋白抗體，來檢測與細胞結合的抗體。藉由上述篩選，來選擇產生具有抗原結合能力的所需抗體的雜交瘤，且可藉由有限稀釋法等來選殖。
可在常規培養基中繼代如此製備之單株抗體產生雜交瘤，且在液態氮中長期保存。
藉由常規方法來培養上述雜交瘤，且可從培養上清液製備所需的單株抗體。或者，將雜交瘤投予至相容的哺乳動物且在其中生長，並從腹水中製備單株抗體。前述方法適合製備高純度抗體。
也可較佳地使用由從抗體產生細胞如上述雜交瘤選殖的抗體基因所編碼的抗體。將選殖的抗體基因插入至合適的載體中，且將其導入至宿主中，以表現由此基因所編碼的抗體。例如，Vandamme et al. (Eur. J. Biochem. (1990) 192(3), 767-775)已經建立了單離抗體基因、將基因插入至載體中和轉形宿主細胞的方法。產生重組抗體的方法也是已知的，如下所述。
較佳地，本發明提供編碼本發明的多特異性抗原結合分子的核酸。本發明還提供導入了編碼多特異性抗原結合分子的核酸的載體，即包含此核酸的載體。再者，本發明提供包含核酸或載體的細胞。本發明亦提供藉由培養細胞來產生多特異性抗原結合分子的方法。本發明更提供了藉由此方法產生的多特異性抗原結合分子。
例如，從表現抗Notch受體抗體的雜交瘤細胞製備編碼抗Notch受體抗體的可變區(V區)的cDNA。為此，先從雜交瘤中萃取總RNA。用於從細胞中萃取mRNA的方法包含，例如： - 胍超速離心法(guanidine ultracentrifugation method)(Biochemistry (1979) 18(24), 5294-5299)、和 - AGPC法(Anal. Biochem. (1987) 162(1), 156-159)
可使用mRNA純化試劑組(GE Healthcare Bioscience) 等，來純化萃取的mRNA。或者，用於直接從細胞中萃取總mRNA的試劑組例如QuickPrep mRNA Purification Kit (GE Healthcare Bioscience)，也是市售的。可使用此類試劑組從雜交瘤製備 mRNA。可使用反轉錄酶從製備的mRNA合成編碼抗體V區的cDNA。可使用AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (Seikagaku Co.)等來合成cDNA。再者，SMART RACE cDNA amplification kit (Clontech) 和基於PCR的5’-RACE方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85(23), 8998-9002; Nucleic Acids Res. (1989) 17(8), 2919-2932)可適當用來合成和擴增 cDNA。 在這樣的cDNA合成過程中，可將下述適當的限制酶位點導入至cDNA的兩端。
從所得的PCR產物中純化感興趣的cDNA片段，然後將其連接至載體DNA。由此構建出重組載體，且導入至大腸桿菌等。菌落選擇後，可從形成菌落的大腸桿菌中製備所需的重組載體。然後，藉由已知方法例如雙去氧核苷酸鏈終止法，來測試重組載體是否具有感興趣的cDNA核苷酸序列。
使用引子來擴增可變區基因的5’-RACE方法方便地用來單離編碼可變區的基因。首先，從雜交瘤細胞中萃取的RNA作為模板，藉由cDNA合成來構建5’-RACE cDNA庫。
製備的5’-RACE cDNA庫作為模板，藉由PCR來擴增抗體基因。可根據已知的抗體基因序列設計用於擴增小鼠抗體基因的引子。引子的核苷酸序列因免疫球蛋白次類別而異。因此，較佳的是使用例如Iso Strip mouse monoclonal antibody isotyping kit (Roche Diagnostics)等市售試劑組，來預先決定次類別。
具體地，例如，允許編碼gamma1、gamma2a、gamma2b 和 gamma3 重鏈及kappa和lambda輕鏈的基因擴增的引子用來單離小鼠IgG編碼基因。通常，黏著至靠近可變區的恆定區位點的引子作為3’側引子，以擴增IgG可變區基因。 同時，將連接到5’ RACE cDNA庫構建試劑組的引子作為5’側引子。
如此擴增的PCR產物用來重塑由重鏈和輕鏈的組合所構成的免疫球蛋白。重塑的免疫球蛋白的Notch受體結合活性可作為指標，來選擇所需的抗體。例如，當目的是單離針對Notch受體的抗體時，更佳的是抗體與Notch受體的結合是特異性的。例如，可藉由以下步驟篩選Notch受體結合抗體： (1) 使Notch受體表現細胞與包含由從雜交瘤單離的cDNA所編碼的V區的抗體接觸； (2) 檢測抗體與Notch受體表現細胞的結合；及 (3) 選擇結合至Notch受體表現細胞的抗體。
檢測抗體與Notch受體表現細胞的結合的方法是已知的。具體地，可藉由例如FACS的上述技術，來檢測抗體與Notch受體表現細胞的結合。 Notch受體表現細胞的固定樣品適用於評價抗體的結合活性。
結合活性作為指標的較佳抗體篩選方法亦包含使用噬菌體載體的淘選方法。當從多株抗體表現細胞群的重鏈和輕鏈次類別庫中單離抗體基因時，使用噬菌體載體的篩選方法是有利的。編碼重鏈和輕鏈可變區的基因可藉由合適的連接子序列連接，以形成單鏈 Fv (scFv)。可藉由將編碼scFv的基因插入至噬菌體載體中，來產生在其表面呈現scFv的噬菌體。噬菌體與感興趣的抗原接觸。然後，可藉由收集與抗原結合的噬菌體，來單離編碼具有感興趣的結合活性的scFv的DNA。可根據需要重複此過程，以富集具有所需結合活性的scFv。
單離出編碼感興趣的抗Notch受體抗體的V區的cDNA後，用辨識導入至cDNA兩端的限制性位點的限制酶，來消化cDNA。較佳的限制酶辨識且切割抗體基因的核苷酸序列中出現頻率較低的核苷酸序列。再者，較佳地將產生黏性端的酵素的限制性位點導入至載體中，以在正確方向插入單一拷貝消化片段。編碼抗Notch受體抗體的V區的cDNA如上所述被消化，且將其插入至合適的表現載體中以構建抗體表現載體。在此情況下，如果編碼抗體恆定區(C區)的基因和編碼上述V區的基因框內融合，則獲得嵌合抗體。在此，「嵌合抗體」是指恆定區的來源與可變區的來源不同。因此，除了小鼠/人類異源嵌合抗體之外，人類/人類異源嵌合(allochimeric)抗體也包含在本發明的嵌合抗體中。可藉由將上述V區基因插入至已經具有恆定區的表現載體中，來構建嵌合抗體表現載體。具體地，例如，可在攜帶編碼所需抗體恆定區(C區)的DNA的表現載體的5’側適當地配置用於切除上述V區基因的限制酶的辨識序列。藉由框內融合用相同的限制酶組合所消化的兩個基因，來構建嵌合抗體表現載體。
為了製備抗Notch受體單株抗體，將抗體基因插入至表現載體中，使基因在表現調控區的控制下表現。抗體表現的表現調控區包含例如增強子和啟動子。再者，可將合適的訊號序列附加至胺基端，使表現的抗體分泌至細胞外。在下述實施例中，具有胺基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS (序列辨識號：17)的胜肽作為訊號序列。同時，可附加其他適當的訊號序列。表現的多肽在上述序列的羧基端被切割，且所得多肽作為成熟多肽分泌至細胞外。然後，用表現載體轉形合適的宿主細胞，且獲得表現抗Notch受體抗體編碼DNA的重組細胞。
編碼抗體重鏈(H鏈)和輕鏈(L鏈)的DNA分別插入至不同的表現載體中，以表現抗體基因。可藉由用分別插入H鏈和L鏈基因的載體共轉染同一宿主細胞，來表現具有H鏈和L鏈的抗體分子。或者，可用插入了編碼H和L鏈的DNA的單一個表現載體，來轉形宿主細胞(參閱WO 94/11523)。
有多種藉由將單離的抗體基因導入至合適的宿主中之用於抗體製備的已知宿主細胞/表現載體組合。所有這些表現系統都適用於單離包含本發明的抗體可變區的結構域。作為宿主細胞的合適真核細胞包含動物細胞、植物細胞和真菌細胞。具體地，動物細胞包含例如以下細胞。 (1) 哺乳動物細胞：CHO、COS、骨髓瘤、幼倉鼠腎 (baby hamster kidney，BHK)、HeLa、Vero等； (2) 兩棲動物細胞：非洲爪蟾卵母細胞(Xenopus oocytes)等；及 (3) 昆蟲細胞：sf9、sf21、Tn5等。
此外，作為植物細胞，使用衍生自例如煙草的煙草屬(Nicotiana genus)的細胞的抗體基因表現系統是已知的。癒傷組織培養細胞可適當地用來轉形植物細胞。
再者，以下細胞可作為真菌細胞： 酵母菌：例如釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)的酵母菌屬、例如畢赤酵母(Pichia pastoris)的畢赤酵母屬；及 絲狀真菌：例如黑曲霉(Aspergillus niger)的曲霉屬。
再者，利用原核細胞的抗體基因表現系統亦是已知的。例如，當使用細菌細胞時，大腸桿菌細胞、枯草芽孢桿菌細胞(Bacillus subtilis cell)等可適當地用於本發明中。藉由轉染將攜帶感興趣的抗體基因的表現載體導入至這些細胞中。體外培養轉染細胞，且可從轉形的細胞的培養物來製備所需抗體。
除了上述宿主細胞外，轉基因動物亦可用來產生重組抗體。即，可從導入了編碼感興趣的抗體的基因的動物中獲得抗體。例如，可藉由框內插入編碼在乳汁中特異性產生的蛋白質的基因，來將抗體基因構建為融合基因。例如，山羊beta-酪蛋白質等可作為乳汁中分泌的蛋白質。將含有插入抗體基因的融合基因的DNA片段注射至山羊胚胎中，然後將此胚胎導入至雌性山羊體內。可獲得作為與由來自胚胎受體山羊(或其後代)所生的轉基因山羊所產生的乳汁的乳蛋白質融合的蛋白質之所需的抗體。此外，為了增加含有由轉基因山羊產生之所需抗體的乳汁量，可根據需要對轉基因山羊投予荷爾蒙 (Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12 (7), 699-702)。
人源化抗體的產生方法 當將本文所述的抗原結合分子投予至人類時，衍生自經人工修飾以降低對人類的異源抗原性等的基因重組抗體的結構域可適當地作為包含抗體可變區抗原結合分子的結構域。此類基因重組抗體包含例如人源化抗體。藉由已知的方法適當地產生這些經修飾抗體。再者，通常可藉由CDR移植(CDR grafting)，將某種抗體的結合特異性導入至另一抗體中。
具體地，藉由將非人類動物抗體例如小鼠抗體的CDR移植至人類抗體等來製備的人源化抗體是已知的。用於獲得人源化抗體的常見基因工程技術也是已知的。具體地，例如，重疊延伸PCR (overlap extension PCR)亦稱為將小鼠抗體CDR移植到人類FR的方法。在重疊延伸PCR中，將編碼待移植的小鼠抗體CDR的核苷酸序列添加至用於合成人類抗體FR的引子中。為四個FR中的每一個都製備了引子。一般認為，將小鼠CDR移植到人類FR時，選擇與小鼠FR具有高度一致性的人類FR有利於維持CDR功能。即，通常較佳使用包含與待移植的小鼠CDR相鄰的FR的胺基酸序列具有高度一致性的胺基酸序列的人類FR。
要連接的核苷酸序列被設計為使它們在框架內彼此連接。使用各自的引子，來個別合成人類FR。因此，獲得了小鼠CDR編碼DNA附接至個別FR編碼DNA的產物。 編碼每個產物的小鼠CDR的核苷酸序列被設計為彼此重疊。然後，進行互補股合成反應，來黏著使用人類抗體基因作為模板合成的產物的重疊CDR區。藉由此反應，經由小鼠CDR序列來連接人類FR。
使用與其5’或 3’端黏著且添加了合適的限制酶辨識序列的引子，來擴增最終連接三個CDR和四個FR的全長V區基因。可藉由將如上所述獲得的DNA和編碼人類抗體C區的DNA插入至表現載體中，使得它們會框內連接，來生產人源化抗體的表現載體。重組載體轉染至宿主以建立重組細胞後，培養重組細胞，將編碼人源化抗體的DNA表現，以在細胞培養物中產生人源化抗體(參閱歐洲專利公開號EP 239400和國際專利公開號WO 1996/002576)。
藉由定性或定量地測量和評價如上所述產生的人源化抗體的抗原結合活性，可適當地選擇當透過CDR連接時允許CDR形成有利的抗原結合位點的人類抗體FR。可根據需要取代FR中的胺基酸殘基，使重塑人類抗體的CDR形成合適的抗原結合位點。例如，可藉由應用用來將小鼠CDR移植至人類FR中的PCR方法，將胺基酸序列突變導入至FR中。更具體地，可將部分核苷酸序列突變導入至黏著至FR的引子中。核苷酸序列突變被導入至藉由使用這樣的引子合成的FR中。可藉由上述方法測量和評價胺基酸取代的突變抗體之與抗原結合的活性，來選擇具有所需特性的突變FR序列(Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53: 851-856)。
產生人類抗體的方法 或者，可藉由DNA免疫來免疫具有完整人類抗體基因庫的轉基因動物，來獲得所需的人類抗體(參閱WO 1993/012227；WO 1992/003918；WO 1994/002602；WO 1994/025585；WO 1996/034096；WO 1996/033735)。
再者，使用人類抗體庫藉由淘選來製備人類抗體的技術也是已知的。例如，藉由噬菌體展示方法，在噬菌體表面上表現作為單鏈抗體(scFv)的人類抗體的V區。可選擇表現結合至抗原的scFv的噬菌體。可藉由分析所選噬菌體的基因，來確定編碼結合至抗原的人類抗體V區的DNA序列。確定結合至抗原的scFv的DNA序列。藉由將V區序列與所需人類抗體的C區序列框內融合，且將其插入至合適的表現載體中，來製備表現載體。將表現載體導入至適合表現的細胞，例如上述那些。可藉由在細胞中表現人類抗體編碼基因，來產生人類抗體。這些方法是已知的(參閱WO 1992/001047；WO 1992/020791；WO 1993/006213；WO 1993/011236；WO 1993/019172；WO 1995/001438；WO 1995/015388)。
抗原決定基 「抗原決定基(epitope)」是指抗原中的抗原決定簇(antigenic determinant)，且是指與本文所揭露的抗原結合分子或抗體的抗原結合域結合的抗原位點。因此，例如，可根據其結構定義抗原決定基。或者，也可根據辨識此抗原決定基的抗原結合分子或抗體的抗原結合活性來定義抗原決定基。當抗原是胜肽或多肽時，可由形成抗原決定基的胺基酸殘基來指定抗原決定基。或者，當抗原決定基是糖鏈時，可由其特定的糖鏈結構來指定抗原決定基。
線性抗原決定基是含有其一級胺基酸序列被辨識的抗原決定基的抗原決定基。此類線性抗原決定基在其特定序列中通常含有至少三個且最常見至少五個，例如約8至10或6至20個胺基酸。
與線性抗原決定基相反，「構形抗原決定基」是其中含有抗原決定基的一級胺基酸序列並不是所辨識的抗原決定基的唯一決定簇(例如，構形抗原決定基的一級胺基酸序列不一定被抗原決定基定義抗體所辨識)的抗原決定基。與線性抗原決定基相比，構形抗原決定基可含有更多的胺基酸。構形抗原決定基辨識抗原結合域辨識胜肽或蛋白質的三維結構。例如，當蛋白質分子折疊且形成三維結構時，形成構形抗原決定基的胺基酸和/或多肽主鏈排列，且抗原結合域使此抗原決定基可辨識。確定抗原決定基構型的方法包含，例如，X射線晶體學、二維核磁共振、位點特異性自旋標記和電子順磁共振，但不限於此。參閱，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996), Vol. 66, Morris (ed.)。
以下描述了藉由含有抗Notch受體抗原結合域的測試抗原結合分子或抗體，來評價抗原決定基結合的方法的範例。根據以下範例，也可適當地進行藉由含有對Notch受體以外之抗原的抗原結合域的測試抗原結合分子或抗體，來評價抗原決定基的方法。
例如，可如下所述，確認測試含有抗Notch受體抗原結合域的抗體或抗原結合分子是否辨識Notch受體分子中的線性抗原決定基。為了上述目的，合成了包含形成Notch受體的胞外域的胺基酸序列的線性胜肽。可化學合成胜肽，或使用編碼對應至Notch受體cDNA中的胞外域的胺基酸序列的區域，藉由基因工程技術來獲得。然後，評價含有抗Notch受體抗原結合域的測試抗原結合分子或抗體之對包含形成胞外域的胺基酸序列的線性胜肽的結合活性。例如，固定的線性胜肽可作為ELISA的抗原，以評估多肽複合物對胜肽的結合活性。或者，可基於線性胜肽抑制抗原結合分子或抗體與Notch受體表現細胞的結合的程度，來評價對線性胜肽的結合活性。這些測試可證明抗原結合分子或抗體對線性胜肽的結合活性。
可如下評價含有抗Notch受體抗原結合域的測試抗原結合分子或抗體是否辨識構型抗原決定基。為了上述目的，製備Notch受體表現細胞。當含有抗Notch受體抗原結合域的測試抗原結合分子或抗體在接觸時強烈結合至Notch受體表現細胞，但基本上不結合至包含形成Notch受體的胞外域的胺基酸序列之固定的線性胜肽時，可確定其辨識構型抗原決定基。在此，「基本上不結合」是指與對表現Notch受體的細胞的結合活性相比，結合活性為80%或更低、通常為50%或更低、較佳為30%或更低、特別佳為15%或更低。
測定含有抗Notch受體抗原結合域的測試抗原結合分子或抗體之對Notch受體表現細胞的結合活性的方法包含，例如，Antibodies: A Laboratory Manual (Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420)中所述之方法。具體地，可基於ELISA或螢光活化細胞分選(FACS)的原理，使用Notch受體表達細胞作為抗原進行評價。
在ELISA形式中，可藉由比較酵素反應所產生的訊號程度，來定量評價含有抗Notch受體抗原結合域的測試抗原結合分子或抗體對Notch受體表現細胞的結合活性。具體地，將測試多肽複合物添加至其上固定有Notch受體表現細胞的ELISA盤上。然後，使用辨識測試抗原結合分子或抗體的酵素標記抗體，來檢測與細胞結合的測試抗原結合分子或抗體。或者，當使用FACS時，製備測試抗原結合分子或抗體的稀釋系列，且可確定Notch受體表現細胞的抗體結合效價，以比較測試抗原結合分子或抗體之對Notch受體表現細胞的結合活性。
可使用流式細胞儀，來檢測測試抗原結合分子或抗體之對在懸浮於緩衝液等中的細胞或細胞的表面上表現的抗原的結合。已知的流式細胞儀包含例如以下裝置： FACSCantoTM II FACSAriaTM FACSArrayTM FACSVantageTM SE FACSCaliburTM (全都是BD Biosciences的商品名) EPICS ALTRA HyPerSort Cytomics FC 500 EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (全都是Beckman Coulter的商品名)
測定含有抗Notch受體抗原結合域的測試抗原結合分子或抗體之對抗原的結合活性的較佳方法包含例如以下方法。首先，Notch受體表現細胞與測試抗原結合分子或抗體反應，然後用辨識抗原結合分子或抗體的FITC標記二抗染色。用合適的緩衝液適當稀釋測試抗原結合分子或抗體，以製備所需濃度的抗原結合分子或抗體。例如，可在10微克/ml至10 ng/ml的濃度範圍內，使用抗原結合分子或抗體。然後，使用FACSCalibur (BD)來確定螢光強度和細胞計數。 藉由使用 CELL QUEST軟體 (BD) 分析所獲得的螢光強度，即幾何平均值，反映了與細胞結合的抗體量。即，可藉由測量幾何平均(Geo-mean)值，來決定測試抗原結合分子或抗體的結合活性，其以測試抗原結合分子或抗體的結合量來表示。
可基於兩個抗原結合分子或抗體之間的相同抗原決定基競爭，來評價含有抗Notch受體抗原結合域的測試抗原結合分子或抗體是否與另一抗原結合分子或抗體具有共同的抗原決定基。可藉由交叉阻斷測定法等，來檢測抗原結合分子或抗體之間的競爭。例如，競爭性ELISA測定法是較佳的交叉阻斷測定法。
具體地，在交叉阻斷測定法中，在存在或不存在候選競爭抗原結合分子或抗體的情況下，預培養固定至微量滴定盤的孔的Notch受體蛋白質，然後將測試抗原結合分子或抗體添加至其中。孔中與Notch受體蛋白質結合的測試抗原結合分子或抗體的量與競爭結合相同抗原決定基的候選競爭者抗原結合分子或抗體的結合能力間接相關。即，競爭者抗原結合分子或抗體對相同抗原決定基的親和力越大，則測試抗原結合分子或抗體對Notch受體蛋白塗佈的孔的結合活性越低。
藉由預先標記抗原結合分子或抗體，可輕易地確定透過Notch受體蛋白質與孔結合之測試抗原結合分子或抗體的量。例如，使用抗生物素蛋白質(avidin)/過氧化酶偶聯物和合適的基質，來測量生物素標記的抗原結合分子或抗體。特別地，使用酵素標記例如過氧化酶的交叉阻斷測定法被稱為「競爭性ELISA測定法」。也可用其他能夠檢測或測量的標記物質，來標記抗原結合分子或抗體。具體地，放射性標記、螢光標記等是已知的。
與競爭者抗原結合分子或抗體不存在的情況下進行的對照實驗中的結合活性相比，當候選競爭者抗原結合分子或抗體可阻斷經由含有抗Notch受體抗原結合域的測試抗原結合分子或抗體的結合至少20%、較佳至少20至50%、更佳至少50%，測試抗原結合分子或抗體被確定為基本上結合至與競爭者抗原結合分子所結合的相同抗原決定基或抗體，或競爭與相同抗原決定基的結合。
當含有抗Notch受體抗原結合域的測試抗原結合分子或抗體所結合的抗原決定基的結構已被鑑定出時，可藉由比較兩種抗原結合分子或抗體之對藉由將胺基酸突變導入至形成抗原決定基的胜肽所製備的胜肽的結合活性，來評價測試抗原結合分子或抗體是否具有共同的抗原決定基。
為了測量上述結合活性，例如，以上述ELISA形式比較測試和對照抗原結合分子或抗體之對導入了突變的線性胜肽的結合活性。除了ELISA方法之，可藉由在管柱中流動測試和對照抗原結合分子或抗體，然後對洗提液中洗提的抗原結合分子或抗體進行定量，來確定對結合至管柱上的突變胜肽的結合活性。例如以GST融合胜肽的形式，將突變胜肽吸附到管柱上的方法是已知的。
或者，當鑑定的抗原決定基是構型抗原決定基時，可藉由以下方法評價測試和對照抗原結合分子或抗體是否享有共同的抗原決定基。首先，製備Notch受體表現細胞和表現在抗原決定基中導入了突變的Notch受體的細胞。將測試和對照抗原結合分子或抗體添加至藉由將這些細胞懸浮液在適當的緩衝液例如PBS中所製備的細胞懸浮液中。然後，用緩衝液適當地洗滌細胞懸浮液，且將辨識測試和對照抗原結合分子或抗體的FITC標記抗體添加至其中。使用 FACSCalibur (BD) 來確定螢光強度和用標記抗體染色的細胞的量。使用合適的緩衝液，來適當地稀釋測試和對照抗原結合分子或抗體，並以所需濃度使用。例如，可以10微克/ml至10 ng/ml範圍內的濃度使用它們。 藉由使用CELL QUEST 軟體(BD)分析所確定的螢光強度，即幾何平均值，反映了與細胞結合的標記抗體的量。即，可藉由測量幾何平均值，來決定測試抗原結合分子或抗體的結合活性，其以結合的標記抗體的量來表示。
在上述方法中，例如可藉由以下方法評價，抗原結合分子或抗體是否「基本上不結合至表現突變Notch受體的細胞」。首先，用標記抗體染色與表現突變Notch受體的細胞結合的測試和對照抗原結合分子或抗體。然後，確定細胞的螢光強度。當FACSCalibur用於流式細胞術的螢光檢測時，可使用CELL QUEST軟體，來分析確定的螢光強度。根據抗原結合分子或抗體存在和不存在時的幾何平均值，可根據以下公式計算比較值(delta Geo-Mean)，以確定螢光強度增加的比值，作為抗原結合分子或抗體的結合的結果。 delta Geo-Mean = Geo-Mean (抗原結合分子或抗體存在的情況下)/Geo-Mean (抗原結合分子或抗體不存在的情況下)
藉由上述分析所確定之反映了與表現突變Notch受體的細胞結合的測試抗原結合分子或抗體的量幾何平均比較值(突變Notch受體分子的 delta Geo-Mean值)與反映了與Notch受體表現細胞結合的測試抗原結合分子或抗體的量的delta Geo-Mean比較值進行比較。在此情況下，將用來確定Notch表現受體的細胞和表現突變Notch受體的細胞的delta Geo-Mean比較值的測試抗原結合分子或抗體的濃度特佳地調整為相等或基本上相等。已確認辨識Notch受體中的抗原決定基的抗原結合分子或抗體作為對照抗原結合分子或抗體。
如果表現突變Notch受體的細胞的測試抗原結合分子或抗體的 delta Geo-Mean比較值比表現Notch受體的細胞的測試抗原結合分子或抗體的 delta Geo-Mean比較值小至少80%、較佳50%、更佳30%、特佳15%，則測試抗原結合分子或抗體「基本上不結合至表現突變Notch受體的細胞」。CELL QUEST軟體用戶指南(BD biosciences)中描述了用於確定 Geo-Mean (幾何平均值)值的公式。當比較顯示出比較值基本上相等時，可確定測試和對照抗原結合分子或抗體的抗原決定基相同。
多特異性抗原結合分子的產生和純化 在一些實施例中，本揭露的多特異性抗原結合分子是單離多特異性抗原結合分子。 在一實施例中，本文所述的多特異性抗原結合分子包含兩種不同的抗原結合部分(例如“第一抗原結合部分”和“第二抗原結合部分”) ，其與Fc域的兩個次單元中的一個或另一個融合，所以Fc域的兩個次單元通常包含在兩條不同的多肽鏈中。這些多肽的重組共表現和隨後的二聚化導致這兩個多肽的幾種可能組合。為了改善重組產生中多特異性抗原結合分子的產量和純度，因此在多特異性抗原結合分子的Fc域中導入促進所需多肽結合的修飾將是有利的。
因此，在一些特定實施例中，本文所述的多特異性抗原結合分子的Fc域包含促進Fc域的第一和第二次單元結合的修飾。人類IgG Fc域的兩個次單元之間最廣泛的蛋白質-蛋白質交互作用位點在Fc域的CH3域中。因此，在一實施例中，所述修飾在Fc域的CH3域中。
在一具體實施例中，所述修飾是所謂的「旋鈕進入孔」修飾，包含在Fc域的兩個次單元之一個中的「旋鈕」修飾和兩個次單元之另一個中的「孔」修飾。 例如在美國專利號 5,731,168 中； 美國專利號 7,695,936 ； Ridgway 等人，Prot Eng 9, 617-621 (1996) 和 Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)中描述旋鈕進入孔技術。通常，此方法包含在第一多肽的界面處導入突起(「旋鈕」)和在第二多肽的界面中的對應腔(「孔」)，使得突起可定位在腔中，以促進異源二聚體的形成且阻礙同源二聚體的形成。藉由用較大的側鏈(例如酪酸胺或色胺酸)取代來自第一多肽的界面的小胺基酸側鏈來構建突起。藉由用較小的胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)取代大胺基酸側鏈，在第二多肽的界面中產生與突起大小相同或類似的補償腔。
因此，在一特別實施例中，在多特異性抗原結合分子的Fc域的第一次單元的CH3域中，胺基酸殘基被具有較大側鏈體積的胺基酸殘基取代，從而在第一次單元的CH3域內產生突起，其可定位在第二次單元的CH3域內的空腔中，且在Fc域的第二次單元的CH3域中，胺基酸殘基被具有較小側鏈體積的殘基取代，從而在第二次單元的CH3域內產生空腔，第一次單元的CH3域內的突起可定位在此空腔內。
可藉由改變編碼多肽的核酸來製造突起和空腔，例如藉由位點特異性誘變或藉由胜肽合成。
在一具體實施例中，在Fc域的第一次單元的CH3域中，第366位的蘇胺酸殘基被色胺酸殘基(T366W)取代，且在Fc域的第二次單元的CH3域中，第407位的酪胺酸殘基被纈胺酸殘基(Y407V)取代。在一實施例中，在Fc域的第二次單元中，另外第366位的蘇胺酸殘基被絲胺酸殘基(T366S)取代且第368位的白胺酸殘基被丙胺酸殘基(L368A)取代。
在又一實施例中，在Fc域的第一次單元中，另外第354位的絲胺酸殘基被半胱胺酸殘基(S354C)取代，且在Fc域的第二次單元中，另外第349位的酪胺酸殘基被半胱胺酸殘基 (Y349C)取代。這兩個半胱胺酸殘基的導入導致在 Fc域的兩個次單元之間形成雙硫鍵，進一步穩定二聚體 (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001))。
在另一些實施例中，促進具有所需組合的H鏈之間及L和H鏈之間的結合的其他技術可應用於本揭露的多特異性抗原結合分子。
例如，藉由在抗體H鏈的第二恆定區或第三恆定區(CH2或CH3)的界面處導入靜電排斥，來抑制不需要的H鏈結合的技術可應用於多特異性抗體結合(WO2006/106905)。
在藉由在CH2或CH3的界面處導入靜電排斥來抑制意外H鏈結合的技術中，在H鏈的另一恆定區的界面處接觸的胺基酸殘基的範例包含對應至CH3區中EU編號第356、439、357、370、399和409位的殘基。
更具體地，範例包含包括兩種類型的H鏈CH3區的抗體，其中第一H鏈CH3區中的一至三對胺基酸殘基選自以下(1)至(3)中所示的胺基酸殘基對，且攜帶相同類型的電荷：(1) 包含在H鏈CH3區中EU編號第356和439位的胺基酸殘基；(2) 包含在H鏈CH3區中EU編號第357和370位的胺基酸殘基； (3) 包含在H鏈CH3區中EU編號第399和409位的胺基酸殘基。
再者，抗體可為如下所述的抗體，其中與上述第一H鏈CH3區不同的第二H鏈CH3區中的胺基酸殘基對選自上述(1)至(3)的胺基酸殘基對，其中對應至在上述第一H鏈CH3區中攜帶相同類型的電荷之上述(1)至(3)的胺基酸殘基對的一至三對胺基酸殘基攜帶與在上述第一H鏈CH3區中的對應胺基酸殘基相反的電荷。
上述(1)至(3)中所示的每個胺基酸殘基在結合過程中彼此接近。本發明所屬技術領域具有通常知識者可使用市售軟體藉由同源性建模等，來找出與所需H鏈CH3區或H鏈恆定區中上述(1)至(3)的胺基酸殘基對應的位置 ，且這些位置的胺基酸殘基可適當地進行修飾。
在上述抗體中，「帶電胺基酸殘基」較佳地選自，例如，包含在以下任一群組中的胺基酸殘基： (a) 麩胺酸(E)和天冬胺酸(D)；和 (b) 離胺酸(K)、精胺酸(R)和組胺酸(H)。
在上述抗體中，詞組「攜帶相同電荷」是指，例如，二或更多個胺基酸殘基的全部均選自上述群組(a)和(b)中任一者所包含的胺基酸殘基。詞組「攜帶相反電荷」是指，例如，當二或更多個胺基酸殘基中的至少一個胺基酸殘基選自上述群組(a)和(b)中任一者所包含的胺基酸殘基時，剩餘的胺基酸殘基選自在另一組中所包含的胺基酸殘基。
在一較佳實施例中，可藉由雙硫鍵來交聯上述抗體的第一H鏈CH3區和第二H鏈CH3區。
本揭露中，經修飾的胺基酸殘基不限於上述抗體可變區或抗體恆定區的胺基酸殘基。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可使用市售軟體藉由同源建模等，來鑑定在突變多肽或異源多聚體中形成界面的胺基酸殘基；然後可對這些位置的胺基酸殘基進行修飾，以調節結合。
此外，其他已知技術也可用於形成本揭露的多特異性抗原結合分子。可使用由將抗體的H鏈CH3中之一者的一部分改變成且將對應的IgA衍生序列導入至另一H鏈CH3的互補部分的股交換工程域CH3，藉由CH3的互補結合，來有效率地誘導具有不同序列的多肽的結合(Protein Engineering Design & Selection, 23; 195-202, 2010)。此已知技術亦可用於有效率地形成感興趣的多特異性抗原結合分子。
此外，WO 2011/028952、WO2014/018572和Nat Biotechnol. 2014 Feb; 32(2):191-8中描述的使用抗體CH1和CL的結合及VH和VL的結合的抗體產生技術。WO2008/119353和WO2011/131746中描述的使用單獨製備的單株抗體組合(Fab臂交換)的產生雙特異性抗體的技術；WO2012/058768和WO2013/063702中描述的調節抗體重鏈CH3之間結合的技術；WO2012/023053中描述的產生由兩種類型的輕鏈和一種類型的重鏈所構成的多特異性抗體的技術；如Christoph et al. (Nature Biotechnology Vol. 31, p 753-758 (2013))所述之使用兩種單獨表現包含單一條H鏈和單一條L鏈的抗體的鏈之一者的細菌細胞株，來產生多特異性抗體的技術等可用來形成多特異性抗原結合分子。
或者，即使當不能有效率地形成目標多特異性抗原結合分子時，也可藉由從產生的分子中分開且純化出感興趣的多特異性抗原結合分子，來獲得本揭露的多特異性抗原結合分子。例如，已報導了一種藉由離子交換層析法藉由將胺基酸取代導入至兩種類型的H鏈的可變區，來賦予等電點差異，從而能夠純化兩種類型的同質聚合形式和感興趣的異質聚合抗體的方法(WO2007114325)。目前為止，作為純化異質聚合抗體的方法，已報導了使用蛋白質A來純化包含結合至蛋白質A的小鼠IgG2a H鏈和不結合至蛋白質A的大鼠IgG2b H鏈的異質二聚抗體的方法(WO98050431和WO95033844)。再者，藉由使用包含EU編號第435和436位的胺基酸殘基，其為IgG-蛋白質A結合位點，之被產生不同蛋白質A親和力的Tyr、His等取代的H鏈，或使用具有不同蛋白質A親和力的H鏈，以改變每個H鏈與蛋白質A的交互作用，然後使用蛋白質A管柱，可有效率地獨自純化出異質二聚抗體。
再者，Fc區C端異質性得到改善的Fc區可適當地作為本揭露的Fc區。更具體地，本揭露提供了藉由從構成衍生自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc區的兩個多肽的胺基酸序列中剔除EU編號所指定的第446位甘胺酸和第447位離胺酸而產生的Fc區。
可藉由本發明所屬技術領域中已知的技術，來純化如本文所述製備的多特異性抗原結合分子，例如高效液相層析、離子交換層析、膠體電泳、親和層析、尺寸排阻層析等。用於純化特定蛋白質的實際條件將部分取決於例如淨電荷、疏水性、親水性等因素，且對本發明所屬技術領域中具有通常知識者而言是顯而易見的。對於親和層析純化，可使用多特異性抗原結合分子所結合的抗體、配體、受體或抗原。例如，對於本發明的多特異性抗原結合分子的親和層析純化，可使用具有蛋白質A或蛋白質G的基質。順序蛋白質A或G親和層析和尺寸排阻層析可用於單離多特異性抗原結合分子。可藉由包含膠體電泳、高壓液相層析等各種熟知的分析方法中的任一種，來確定多特異性抗原結合分子的純度。
醫藥組合物 在一態樣中，本揭露提供了包含本揭露的多特異性抗原結合分子的醫藥組合物。 在某些實施例中，本揭露的醫藥組合物在感興趣的靶細胞中誘導對Notch訊息傳遞路徑的反式活化，換句話說，本揭露的醫藥組合物是用於治療或預防經由(反式)活化Notch訊息傳遞路徑而導致之Notch受體介導的疾病或異常的治療劑。在某些實施例中，本揭露的醫藥組合物增強肌肉再生和/或維持肌肉功能。在某些實施例中，本揭露的醫藥組合物增強肌肉衛星細胞增殖和分化。 在某些實施例中，本揭露的醫藥組合物是用來治療和/或預防肌肉萎縮症、組織纖維化、自體免疫性疾病(例如SLE(全身性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus))、RA(類風濕性關節炎(Rheumatoid arthritis))、MS(多發性硬化症(Multiple sclerosis))等)的醫藥組合物。在某些實施例中，本揭露的醫藥組合物是細胞生長抑制劑。在某些實施例中，本揭露的醫藥組合物是用來治療和/或預防可受益於Notch促效劑的任何癌症和惡性腫瘤(即下調(downregulate)Notch訊息傳遞的癌症)的醫藥組合物。在某些實施例中，本揭露的醫藥組合物是用來治療和/或預防可受益於Notch促效劑的胃腸癌症和惡性腫瘤(即下調Notch訊息傳遞的癌症)的醫藥組合物。在某些實施例中，本揭露的醫藥組合物是用來治療和/或預防DMD(杜氏肌萎縮)的醫藥組合物。在某些實施例中，本揭露的醫藥組合物是用於預防DMD(杜氏肌營養萎縮)進展的醫藥組合物。 在某些實施例中，本揭露的醫藥組合物是用來促進lgr5+ CBC的自我更新和/或增殖的醫藥組合物。在某些實施例中，本揭露的醫藥組合物是用來治療和/或預防胃腸(GI)道疾病例如克羅恩病(Crohn's disease)和潰瘍性結腸炎(Ulcerative Colitis)、IBS或導致腸損傷的任何疾病的醫藥組合物。在某些實施例中，本揭露的醫藥組合物是用來促進腸道修復的醫藥組合物。
藉由混合具有所需純度的此類抗原結合分子或抗體與一或多個視需要而定的醫藥上可接受的載劑，以凍乾配方或水溶液的形式來製備包含如本文所述的抗原結合分子或抗體的醫藥組合物(Remington's Pharmaceutical Sciences 16 thedition, Osol, A. Ed. (1980))。醫藥上可接受的載體在採用的劑量和濃度下通常對接受者無毒，且包含但不限於：緩衝劑例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸；抗氧化劑包含抗壞血酸和甲硫胺酸(methionine)；防腐劑(例如十八烷基二甲基芐基氯化銨(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride)；氯化六甲銨(hexamethonium chloride)；苯扎氯銨(benzalkonium chloride)；芐索氯銨(benzethonium chloride)；酚(phenol)、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷酯(alkyl paraben)例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚(catechol)；間苯二酚(resorcinol)；環己醇(cyclohexanol)；3-戊醇(3-pentanol)；和間甲酚(m-cresol)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質例如血清白蛋白質、明膠或免疫球蛋白質；親水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣和其他碳水化合物包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑例如EDTA；糖例如蔗糖(sucrose)、甘露糖醇(mannitol)、海藻糖(trehalose)或山梨糖醇(sorbitol)；鹽形成反離子例如鈉；金屬複合物(例如鋅-蛋白質複合物)；和/或非離子表面活性劑，例如聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)。本文的示例性醫藥上可接受的載體更包含間質藥物分散劑，例如可溶性中性活性透明質酸酶糖蛋白(soluble neutral-active hyaluronidase glycoprotein，sHASEGP)例如人類可溶性PH-20透明質酸酶糖蛋白例如rHuPH20 (HYLENEX(註冊商標), Baxter International, Inc.)。在美國專利公開號2005/0260186和2006/0104968中描述了某些示例性的sHASEGP和使用方法包含rHuPH20。在一態樣中，sHASEGP與一或多種額外的糖胺聚醣酶如軟骨素酶組合。
在美國專利號6,267,958中描述示例性凍乾抗體配方。水性抗體配方包含美國專利號6,171,586和WO2006/044908中描述的那些，後者的配方包含組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
本文的配方亦可包含多於一種所治療的特定適應症所必需的活性成分，較佳地是具有互補活性且不會互相產生不利影響的活性成分。此類活性成分以對預期目的有效的量的組合適當地存在。
若有必要時，可將本發明的抗原結合分子或抗體封裝在微膠囊中(由羥甲基纖維素(hydroxymethylcellulose)、明膠(gelatin)、聚[甲基丙烯酸甲酯]( poly[methylmethacrylate])等製成的微膠囊)，且製成膠體給藥系統(colloidal drug delivery system)的組成(脂質體、白蛋白微球、微乳液、納米顆粒和納米膠囊)(例如參閱"Remington's Pharmaceutical Science 16 thedition", Oslo Ed. (1980))。再者，製備作為緩釋劑的藥劑的方法是已知的，且這些可應用於本揭露的抗原結合分子(J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15, 267-277; Chemtech. ( 1982) 12, 98-105；美國專利號3773719；歐洲專利申請 (EP)號EP58481和EP133988；Biopolymers (1983) 22, 547-556)。
若有必要，可將包含編碼本揭露的多特異性抗原結合分子的核酸分子的載體導入至對象，以直接在對象體內表現本揭露的抗原結合分子或抗體。可能使用的載體的範例是腺病毒，但不限於此。也可能將編碼本揭露的抗原結合分子或抗體的核酸分子直接投予至對象，或經由電穿孔將編碼本揭露的抗原結合分子或抗體的核酸分子轉移至對象，或投予包含編碼待表現且分泌至對象中的本揭露的抗原結合分子或抗體的核酸分子的細胞，以在對象中持續地表現和分泌本揭露的抗原結合分子或抗體。 本揭露的醫藥組合物可口服或腸胃外投予至病人。腸胃外投予是較佳的。具體地，這樣的投予方法包含注射、經鼻投予、經肺投予和經皮投予。注射包含例如靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射和皮下注射。例如，可藉由注射，來局部或全身性投予本揭露的醫藥組合物、用於誘導細胞毒性的治療劑、細胞生長抑制劑或抗癌劑。再者，可根據病人的年齡和症狀選擇合適的投予方法。對於每次投予，投予劑量可選自例如每kg體重0.0001 mg至1,000 mg的範圍。或者，劑量可選自例如每位病人0.001 mg/身體至100,000 mg/身體的範圍。然而，本揭露的醫藥組合物的劑量不限於這些劑量。
在本揭露中，可例如藉由將本揭露的抗原結合分子添加至體外培養的表現CLDN6的細胞的培養基中來進行「接觸」。 在這種情況下，要添加的抗原結合分子可以適當的形式使用，例如藉由冷凍乾燥等製備的溶液或固體。當本揭露的抗原結合分子以水溶液形式添加時，此溶液可為僅含有抗原結合分子的純水溶液或含有例如上述表面活性劑、賦形劑、著色劑、調味劑、防腐劑、穩定劑、緩衝劑、懸浮劑、等滲劑、黏合劑、崩解劑、潤滑劑、流動性促進劑和矯味劑(corrigent)的溶液。添加的濃度沒有特別限制；然而，培養基中的終濃度較佳地在1 pg/ml至1 g/ml的範圍內、更佳地在1 ng/ml至1 mg/ml的範圍內、且更佳地1微克/ml至1 mg/ml的範圍內。
在一態樣中，本揭露提供了一種在第一靶細胞中活化Notch訊息傳遞路徑的方法，包含使第一靶細胞與有效量的本揭露的任何態樣/實施例的多特異性抗原結合分子接觸。在一實施例中，第一靶細胞在哺乳動物對象體內。在另一實施例中，對象是人類。 在一些實施例中，對象是非人類哺乳動物。在一些實施例中，此方法是用於體內活化Notch訊息傳遞路徑的方法。在一些實施例中，此方法是一種體外活化Notch訊息傳遞路徑的方法。
在一態樣中，本揭露提供了一種用於活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑之本揭露的任何態樣/實施例的多特異性抗原結合分子。 在一態樣中，本揭露提供了一種用於活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑的方法中之本揭露的任何態樣/實施例的多特異性抗原結合分子，其中此方法包含使第一靶細胞與有效量的多特異性抗原結合分子接觸。 在一態樣中，本揭露提供了本揭露的任何態樣/實施例的多特異性抗原結合分子於活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑的試劑或組合物(包含治療劑或醫藥組合物)中的製備的用途。 在一態樣中，本揭露提供了本揭露的任何態樣/實施例的多特異性抗原結合分子於用於活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑的試劑或組合物(包含治療劑或醫藥組合物)的製備的用途，其中此方法包含使第一靶細胞與有效量的多特異性抗原結合分子接觸。 在一態樣中，本揭露提供了本揭露的任何態樣/實施例的多特異性抗原結合分子於活化第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑的用途，其中此方法包含使第一靶細胞與有效量的多特異性抗原結合分子接觸。
在本揭露的另一實施例中，亦可藉由投予至體內移植了Notch受體表現細胞的非人類動物、投予至具有內源性表現Notch受體的細胞的動物或體外條件下使用Notch受體表現細胞的動物，來進行「接觸」。投予方法可為口服或腸胃外。腸胃外投予是特別佳的。具體地，腸胃外投予包含注射、經鼻投予、經肺投予和經皮投予。注射包含例如靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射和皮下注射。例如，可藉由注射，來局部或全身性投予本揭露的醫藥組合物、用於誘導細胞毒性的治療劑、細胞生長抑制劑或抗癌劑。再者，可根據動物對象的年齡和症狀選擇合適的投予方法。當以水溶液形式投予本揭露的抗原結合分子時，此溶液可為僅含有抗原結合分子的純水溶液或含有例如上述表面活性劑、賦形劑、著色劑、調味劑、防腐劑、穩定劑、緩衝劑、懸浮劑、等滲劑、黏合劑、崩解劑、潤滑劑、流動性促進劑和矯味劑的溶液。每次投予，投予劑量可選自例如每kg體重0.0001 mg至1,000 mg的範圍。或者，劑量可選自例如每位病人0.001 mg/身體至100,000 mg/身體的範圍。然而，本揭露的抗原結合分子的劑量不限於這些範例。
本揭露亦提供了用於本揭露的方法的試劑組，其含有本揭露的抗原結合分子或藉由本揭露的方法所產生的抗原結合分子。試劑組可與額外的醫藥上可接受的載劑或介質、或描述如何使用試劑組的說明書等一起包裝。
在本發明的另一態樣中，提供了含有有用於活化Notch訊息傳遞路徑或治療、預防和/或診斷上述異常的材料的製品。製品包含容器和在容器上的標籤或與容器相關的仿單。合適的容器包含例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由各種材料形成，例如玻璃或塑膠。容器裝有組合物，其本身或與另一有效治療、預防和/或診斷病症的組合物組合，且可具有無菌進入口(例如容器可為靜脈內溶液袋或具有可被皮下注射針刺破的塞子的小瓶)。組合物中的至少一種活性成分是本發明的抗體。標籤或仿單指示此組合物用於治療所選病症。再者，製品可包含(a)其中含有組合物的第一容器，其中組合物包含本發明的抗體；及(b)其中含有組合物的第二容器，其中組合物包含另外的細胞毒性劑或其他治療劑。本發明的此實施例中的製品可更包含指示此組合物可用來治療特定病症的仿單。替代地或另外地，製品可更包含第二(或第三)容器，其包含醫藥上可接受的緩衝液，例如抑菌注射用水(bacteriostatic water for injection，BWFI)、磷酸鹽緩衝食鹽水、林格氏溶液和葡萄糖溶液。它可更包含其他從商業和用戶的角度來看所需的材料，包含其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針頭和注射器。
仿單(package insert) 術語「仿單」用於指習慣上包含在治療產品的商業包裝中的說明，其含有關於適應症、用法、劑量、投予、組合治療、禁忌症和/或關於使用此類治療產品的警告的資訊。
醫藥配方 術語「醫藥配方」或「醫藥組合物」是指處於使其中所含有的活性成分的生物活性有效的此類形式，且不含有對將投予此配方的對象有不可接受的毒性的額外組成的製劑。
醫藥上可接受的載劑 「醫藥上可接受的載劑」是指醫藥配方中除活性成分之外對對象無毒的成分。 醫藥上可接受的載劑包含但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
治療 如本文所使用地，「治療(treatment)」(及其語法變異，例如「治療(treat)」或「治療(treating)」)是指試圖改變被治療個體的自然病程的臨床干預，且可用於預防或在臨床病理的期間進行。治療的理想效果包含但不限於，預防疾病的發生或復發、減輕症狀、減輕疾病的任何直接或間接病理後果、預防轉移、降低疾病進展速度、改善或緩和疾病狀態、緩解或改善預後。在一些實施例中，本揭露的抗原結合分子或抗體用來延遲疾病的發展或減緩疾病的進展。
其他試劑和治療 本文所述的多特異性抗原結合分子可在治療中與一或多個其他試劑組合投予。 例如，本文所述的多特異性抗原結合分子可與至少一種額外治療劑共同投予。術語「治療劑」涵蓋為治療需要此類治療的個體的症狀或疾病而投予的任何試劑。此種額外治療劑可包含適合所治療的特定適應症的任何活性成分，較佳為具有互補活性且不會互相產生不利影響的活性成分。在某些實施例中，額外治療劑是免疫調節劑、細胞抑制劑、細胞黏附抑制劑、細胞毒劑、細胞凋亡活化劑或增加細胞對凋亡誘導劑的敏感性的試劑。在一特定實施例中，額外治療劑是抗癌劑，例如微管破壞劑(microtubule disruptor)、抗代謝物(antimetabolite)、拓撲異構酶抑制劑(topoisomerase inhibitor)、DNA嵌入劑(DNA intercalator)、烷化劑(alkylating agent)、荷爾蒙療法(hormonal therapy)、激酶抑制劑(kinase inhibitor)、受體拮抗劑(receptor antagonist)、 腫瘤細胞凋亡的活化劑，或抗血管生成劑(antiangiogenic agent)。
此類其他試劑適當地以對於預期目的有效的量的組合存在。 此類其他試劑的有效量取決於所使用的多特異性抗原結合分子的量、異常或治療的類型及上述其他因素。通常以與本文所述相同的劑量和投予路徑、或本文所述劑量的約1至99%、或以經驗/臨床確定為合適的任何劑量和任何路徑使用多特異性抗原結合分子。
上述此類組合療法涵蓋組合投予(其中二或更多種治療劑包含在相同或分開的組合物中)和分開投予，在這種情況下，本文所述的多特異性抗原結合分子的投予可在額外治療劑和/或佐劑的投予之前、同時和/或之後發生。如本文所述的多特異性抗原結合分子也可與放射療法組合使用。
本文引用的所有文件均藉由引用併入本文。
以下是本揭露的方法和組合物的實施例。應理解的是，鑑於以上所提供的一般性描述，可實踐各種其他實施例。
[實施例] 以下是本發明的方法和組合物的實施例。應理解的是，鑑於以上所提供的一般性描述，可實踐各種其他實施例。
實施例1. Notch促效域能夠在藉由位點特異性結合域同時結合至Notch報導基因和錨定抗原時，活化Notch訊號(圖1A-C)。Notch促效域包含能以錨定依賴性方式(即位點特異性結合域與其錨定抗原的同時結合)結合且活化Notch訊息傳遞的任何多肽。Notch促效域包含Notch配體的胞外域，例如Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL3和DLL4、或Notch促效劑抗體臂。與可在結合時活化受體的常規促效抗體或配體不同，本發明的抗原結合分子僅在其結合至於細胞或細胞表面上表現或固定至支架的錨定抗原結合時，才可導致Notch活化。 組織或位點特異性是由位點特異結合域之選擇性結合至表現是排他性(exclusive)或侷限於感興趣的組織或細胞群之獨特的錨定抗原賦予的。可藉由採用如圖1所示的各種多特異性抗體形式和錨定抗原的選擇，來實現位點特異性Notch反式活化的概念。實施例中描述的大多數Notch促效抗體都採用如圖1A所示的抗體形式，其抗體臂對錨定抗原(例如 GPC3、CACNA1S和FAP)具有結合特異性。 除了Fab臂賦予的位點特異性外，對錨定抗原具有增強的結合親和力的工程化Fc亦可提供Notch受體反式活化所需的錨定(圖1B)。例如，Fc gamma RIIB選擇性結合技術可應用於將Fc工程化，以增強對Fc gamma RIIB的選擇性結合，Fc gamma RIIB是一種由淋巴和髓系細胞表現的膜蛋白質(圖2；參閱例如WO2012/115241， WO2014/030728、WO2014/163101、WO2013/002362、WO2014/030750、WO2014/104165)。表現Fc gamma RIIB的免疫細胞，例如樹突狀細胞(dendritic cell，DC)、巨噬細胞、活化的嗜中性球、肥大細胞和嗜鹼性球，它們通常響應趨化因子(chemokine)而被募集到發炎位置。發炎微環境藉由正回饋迴路維持，因為這些免疫細胞繼續分泌促炎細胞因子。據報導，活化的 CD4 T淋巴細胞中的Notch活化可調節活化的CD4-T淋巴細胞成為能夠釋放抗發炎細胞因子的 Treg細胞(Brandstadter and Maillard (2019); Ferrandino et al (2018) Tindemans et al (2017))。透過將 Fc gamma RIIB選擇性結合技術應用於Notch促效抗體，活化的CD4 T淋巴細胞的Notch活化可局部化至富含表現FcgRIIB的細胞的發炎位置，這些細胞與活化的CD4 T淋巴細胞非常接近，以調節促發炎微環境(圖 2)。 再者，藉由具有結合至第二錨定抗原的第二抗體Fab臂，可實現額外的位點特異性(圖 1C)。 如果第二錨定抗原專門由感興趣的細胞群表現，這可進一步增強對微環境內特定細胞群的局部Notch反式活化。
[表1A] 定義組織或位點特異性的錨定抗原候選者列表
錨定抗原 次細胞定位 組織/細胞表現 相關病理
鈣電壓閘控通道次單元alpha 1S (CACNA1S) 膜 骨骼肌 肌肉萎縮症
纖維母細胞活化蛋白質 膜 活化的纖維母細胞 組織纖維化
FcγRIIB (CD32B) 膜 循環B淋巴細胞, 單核細胞, 嗜中性球, 骨髓樹突細胞(DC) 自體免疫免疫疾病(例如 SLE、RA 和 MS)
[表1B] 在特定組織中排他或侷限表現的胞外蛋白質列表
作為錨定抗原候選者的胞外蛋白質列表 組織
興奮性胺基酸轉運蛋白質1 腦
麩胺酸鹽 [NMDA] 受體次單元 zeta 1 腦
免疫球蛋白超家族，成員 8 腦
神經細胞黏著分子 腦
10 天新生兒皮質 cDNA，RIKEN庫，選殖株：A830029E02 產品：與BK134P22.1 些微相似 腦
神經細胞黏著分子1的N-CAM 180，180 kDa 同功型 腦
鈉/鉀轉運ATP酶beta-2鏈 腦
DSD-1-蛋白聚醣 腦
成年男性睾丸 cDNA，突觸囊泡醣蛋白質 2b 腦
肝細胞黏著分子 腦
溶質載體家族 12 成員 5 腦
類接觸相關蛋白質 2 腦
成年男性大腦未定義細胞系 cDNA，質子肌醇轉運蛋白同源物 腦
LOC237403 蛋白質 腦
神經束蛋白質 腦
接觸相關蛋白 1 腦
硫酸軟骨素蛋白多醣 5 的剪接同功型 1 腦
視覺皮層 cDNA，RIKEN庫，選殖株：K530020M04 產品：二肽基胜肽酶 6，完整插入序列 腦
鈉通道beta-1次單元前體 腦
類Niemann-Pick C1蛋白質1 腸
寡肽轉運蛋白，小腸同功型 腸
血管收縮素轉換酶 2 腸
成年男性結腸 cDNA、RIKEN 全長富集庫、膜結合胺基胜肽酶 P 腸
NOD 衍生的 CD11c +ve 樹突細胞 cDNA，假設蛋白質 腸
4 天新生兒男性脂肪 cDNA，N-醯基鞘胺醇醯胺水解酶 2 腸
寡肽轉運蛋白，小腸同功型 腸
鈣活化氯通道 腸
N-乙醯化-alpha-連接的酸性類二肽酶蛋白質 腸
腫瘤壞死因子受體超家族成員 13C 脾
大麻素受體2 脾
B 細胞受體 CD22 的剪接同功型 1 脾
Semaphorin-4D 脾
血小板反應蛋白質 1 脾
類蝕骨細胞cDNA，顆粒蛋白 脾
NOD 衍生的 CD11c +ve 樹突細胞 cDNA，假設的磷脂酶 D/轉磷脂酶 脾
L-選擇素 脾
骨髓巨噬細胞 cDNA，溶質載體家族 30 脾
B細胞分化抗原CD72 脾
跨膜醣蛋白質NMB 脾
第II類組織相容性抗原，M beta 1鏈 脾
唾液酸黏著素的剪接同功型2 脾
髓過氧化物酶 脾
淋巴細胞表面抗原 CD53 脾
CD180抗原 脾
受體型酪胺酸蛋白質磷酸酶eta 脾
類鐸受體9 脾
補體受體第2型前體 脾
beta-微精蛋白質 前列腺
成年男性膀胱 cDNA，含有假設的 Kazal 型絲胺酸蛋白酶抑制域的蛋白質 前列腺
推定的多肽 N-乙醯半乳糖胺轉移酶樣蛋白 4 前列腺
癌胚抗原相關細胞黏著分子10 前列腺
成年男性舌頭 cDNA，假設蛋白 前列腺
精囊抗原 前列腺
成年男性膀胱 cDNA，與溶菌酶 C、M 型些微相似 前列腺
beta-防禦素 50 前列腺
鈉/膽汁酸共轉運蛋白質 肝
去唾液酸糖蛋白受體主要次單元 肝
類似於褐家鼠推定的整體膜轉運蛋白質 肝
SLC10A5 肝
成年男性睾丸 cDNA，類似於推定的金屬肽酶 睾丸
透明帶精子結合蛋白質3受體 睾丸
睾丸特異性蛋白質 TES101RP 睾丸
類Dickkopf蛋白質 1 睾丸
輸卵管特異性醣蛋白質 卵巢
原膠原蛋白-離胺酸，2-酮戊二酸 5-雙氧酶 2 卵巢
組織蛋白酶L 卵巢
腎鈉依賴性磷酸鹽轉運蛋白2 腎
gamma-麩胺醯轉肽酶 1 腎
鈉和氯依賴性轉運蛋白質XTRP2 的剪接同功型 4 腎
預測：類似於低密度脂蛋白受體相關蛋白質2 腎
EP1 胃
鉀轉運ATP酶beta鏈 胃
分泌性凝膠形成黏蛋白質 胃
MUC6 胃
淋巴細胞抗原 6 複合位點 G6C 蛋白質 表皮
鈉依賴性副腎上腺素轉運蛋白質 表皮
溶質載體家族 2（促進葡萄糖轉運蛋白質），成員 4 心臟
富含組胺酸的鈣結合蛋白質 心臟
鈣黏蛋白質-13 心臟
選擇錨定抗原時應考慮幾個標準。參閱表1A (候選錨定抗原的列表)、表 1B (排他性表現或僅限於特定組織的胞外蛋白質的列表)或優先結合至錨定抗原的工程化Fc (例如 Fc gamma RIIB選擇性結合技術和 Fc gamma RIIB)。 1) 錨定抗原的空間表現應僅限於或由感興趣的細胞類型或組織排他性地表現，以限制全身性暴露，且最小化Notch活化所引起的毒性風險。 2) 應仔細考慮錨定抗原的短暫表現。例如，一些錨定抗原只在幹細胞中表現，且在分化後就會丟失。不同發育階段的Notch活化也會導致轉基因小鼠出現不同的表現型。早期Notch活化會導致胚胎致死和肌肉發育受損。相反地，出生後(post-natal)轉基因小鼠中的Notch活化有助於改善老化肌肉且促進肌肉再生。 3) 錨定抗原應在細胞上穩定表現或錨定在細胞表面緩慢內化。 4) 錨定抗原應在大多數感興趣的細胞或組織中以低異質性均勻表現，以最小化Notch訊息傳遞的不均勻活化。 5) 即使在病理條件下，錨定抗原也應以足夠的程度表現，且確保雙特異性Notch促效抗體的充分保留。
實施例2. 多特異性Notch促效抗體的製備。 圖3A顯示了雙特異性分子抗AA//Jag-Fc的範例，其中一臂靶向錨定抗原而另一臂靶向Notch受體，其由缺乏Fc gamma R結合的Fc、人類Jag1胞外域(ECD) 和結合至例如GPC3的錨定抗原的Fab所組成。藉由Fc中的旋鈕進入孔(kih)突變，來實現異質二聚體化和正確組裝。圖3A中顯示分子設計及命名規則，表2A中顯示序列ID (序列辨識號)。 圖3B顯示了另一範例，一個對Notch受體具有二價結合的分子Jag1//Jag1-Fc，由缺乏Fc gamma R結合的Fc、和兩個人類Jag1胞外域(ECD)所組成。在圖3B中顯示分子設計及命名規則，在表2B中顯示序列ID (序列辨識號)。如圖3A中所示，「鏈1」包含可變重鏈域(VH)和恆定重鏈域1(CH1)(位點特異性結合域)和Fc區；「鏈2」包含可變輕鏈域(VL)(位點特異性結合域)和恆定輕鏈域(CL)；且「鏈3」包含Notch促效域(此實施例中的Jag1 ECD)和Fc區。
[表2] 顯示圖4所示分子的序列辨識號的表 A
分子名稱 序列辨識號：
  鏈1 鏈2 鏈3
抗KLH//Jag1-Fc 1 2 3
抗GPC3//Jag1-Fc 5 6 3
B
樣品名 序列辨識號：
Jag1//Jag1-Fc 4
[表3] 顯示圖4和表2所示分子的胺基酸序列的表
Figure 02_image001
實施例3. 多特異性Notch促效抗體的純化。 使用HEK293細胞瞬時表現重組多特異性Notch促效抗體。將表現抗體的條件培養基施加至填充有蛋白質A(Protein A)樹脂的管柱，且用酸性溶液洗提。收集含有抗體的級分，隨後施用於用組胺酸緩衝液平衡的膠體過濾管柱。然後合併含有抗體的級分且儲存在攝氏-80度(C)。
實施例4. 為了證明Notch促效抗體需要錨定以活化Notch受體的假設，Notch促效抗體藉由吸附直接固定在培養盤上，或被抗人類kappa輕鏈抗體捕獲(圖 4A)。在錨定不存在的情況下，即使在處理48小時後，未固定的Notch促效抗體也未能活化C2C12報導細胞中的Notch訊息傳遞。相反地，當Notch促效抗體被固定至培養盤或被抗人類kappa輕鏈抗體捕獲時，在C2C12報導細胞中觀察到顯著的Notch活化。由於 Jag1//Jag1-Fc缺乏人類kappa輕鏈，固定的抗人類kappa輕鏈抗體未能捕獲 Jag1//Jag1-Fc，導致其無法活化C2C12報導細胞中的Notch訊息傳遞。此觀察表明由Notch促效抗體誘導的Notch訊息傳遞的活化依賴於錨定。 為了進一步闡明由Notch促效抗體誘導的Notch活化機制依賴於固定的抗IgG抗體對抗體的錨定而非聚集(clustering)，將抗人類IgG Fc特異性抗體經由吸附固定在培養盤上或和Notch促效抗體一起添加至培養基(圖 4B)。一致地，當除同種型對照外的所有Notch促效抗體被吸附至培養盤或被固定的抗人類IgG Fc抗體捕獲時，它們都成功地誘導了Notch活化。 有趣的是，添加具有Notch促效抗體的抗人類Fc抗體未能活化Notch訊息傳遞。此觀察表明，當Notch促效抗體被固定的抗人類IgG Fc抗體錨定時，抗人類IgG Fc抗體對 Notch抗體的聚集或寡聚化(oligomerization)可能有助於活化Notch促效抗體誘導的Notch訊息傳遞。類似地，Jag1//Jag1-Fc也不太可能能夠同時交聯在兩個不同細胞上表現的Notch受體，以誘導反式活化(圖 4B)。 結果證明了錨定對於Notch促效抗體誘導Notch訊息傳遞的反式活化的重要性。
抗體固定測定法 對於經由吸附直接固定的Notch促效抗體，首先用濃度為10 mcg/mL的抗體將96孔盤塗佈，置於攝氏4度(C)16小時。對於抗體捕獲的情況，首先在與上述相同的條件下塗佈抗人類kappa輕鏈抗體(在圖4A中；10 mcg/mL)或抗人 IgG Fc 特異性抗體(在圖4B中；10 mcg/mL) 。抗體塗佈後，用細胞培養基洗滌培養盤，然後在室溫下用5% FBS溶液阻斷2小時。對於抗體捕獲的情況，添加Notch促效抗體(10 mcg/mL)且在37度C下培養1小時。此後，將 C2C12 Notch報導細胞以每孔3x10 4個細胞接種，且在37度C下培養48小時，然後根據製造商的指南(Promega)進行雙螢光素酶測定法(dual-glo luciferase assay)。以螢火蟲(Firefly)除以海腎(renilla)訊號來表示螢光素酶訊號，且此比值進一步標準化至同種型對照的比值。
實施例5. 因為有充分特徵化的抗GPC3抗體和一組具有不同 GPC3表現程度的轉染細胞系，磷脂肌醇聚糖3 (GPC3) 被選為模型錨定抗原，以證明誘導 Notch訊息傳遞的反式活化對於錨定的依賴性。表現錨定抗原的細胞SK-PCa60首先以不同的細胞密度與用抗GPC3//Jag1-Fc或同種型對照抗體處理的C2C12 Notch報導細胞共培養(圖 5A)。結果顯示，由螢光素酶活性所示的Notch活化程度取決於GPC3表現細胞的數量。值得注意的是，當錨定抗原表現細胞不足時(即5E3/孔)，抗GPC3//Jag1 Fc未能在C2C12報導細胞中誘導Notch訊息傳遞的反式活化。 為了進一步驗證錨定抗原表現在Notch訊息傳遞的錨定依賴性反式活化中的重要性，將穩定轉染了不同程度的GPC3表現的SK-HEP1細胞與用抗GPC3//Jag1-Fc處理的C2C12報導細胞共培養。與圖5A中的觀察一致，只有SK-PCa60 細胞(具有高GPC3表現)在抗GPC3//Jag1-Fc處理後成功誘導C2C12報導細胞中的Notch活化(圖 5B)。
共培養Notch報導基因的測定法 錨定抗原表現細胞(即GPC3過度表現的細胞)以每孔1x10 5個細胞的密度接種，且在37度C下培養16小時。以每孔250 mcg/mL添加抗GPC3//Jag1-Fc雙特異性抗體或 IgG1同種型對照抗體且培養1小時，然後將3x10 4個C2C12 Notch報導細胞接種至孔中。在37度C下培養24小時後，根據製造商的指南(Promega)進行雙螢光素酶測定法。以螢火蟲除以海腎訊號來表示螢光素酶訊號，且此比值進一步標準化至同種型對照的比值。
實施例6. 為了驗證抗GPC//Jag1-Fc誘導的Notch訊息傳遞活化的特異性，在接種親本C2C12細胞之前，先經由吸附將抗體固定至培養盤(圖 6)。用作為對照的DMSO或DAPT處理細胞，DAPT是一種 gamma-分泌酶抑制劑(10 微莫耳)進而會抑制Notch訊息傳遞路徑。一致地，具有固定的抗GPC3//Jag1-Fc的C2C12細胞在處理24小時後顯示出Notch靶基因、HEY1和NRARP的強烈上調。因此，DAPT處理的C2C12細胞完全消除了由抗GPC3//Jag1-Fc誘導的Notch活化，指出此活化對Notch訊息傳遞具有特異性。
實施例7 在實施例4中，具有Jag1 ECD和抗GPC3結合臂的雙特異性抗體證明了Notch訊息傳遞的錨定依賴性反式活化。為了證明Notch訊息傳遞的錨定依賴性反式活化適用於其他錨定抗原，我們製備了結合Jag1 ECD和其他例如纖維母細胞相關蛋白質(Fibroblast associated protein，FAP)和Fc gamma受體 IIB (Fc gamma RIIB)的錨定抗原的雙特異性抗體。產生了具有Jag1 ECD和抗FAP抗體臂的雙特異性抗體(「抗 FAP//Jag1-Fc」)，且顯示其結合至過度表現FAP的NIH-3T3細胞(圖 7A)。與我們在實施例4中觀察到的Notch訊息傳遞是錨定依賴的一致，當NIH3T3-FAP細胞與Notch報導細胞共培養時，抗FAP//Jag1-Fc而不是不能結合在NIH3T3-FAP細胞上的KLH//Jag1-Fc和KLH//KLH-Fc，能夠誘導C2C12 Notch報導細胞中的Notch活化(圖 7B)。 此外，亦製備了如圖3B所示之由雙臂上皆為Jag1 ECD和優先結合至 Fc gamma 受體IIB的工程化Fc所組成的雙特異性抗體(「Jag1//Jag1-Fc*」)。使用過度表現Fc gamma受體IIB的穩定細胞系，Jag1//Jag1-Fc*處理能夠誘導Notch受體細胞的Notch活化(圖7C)。數據顯示，由Fc而不是抗體Fab臂所提供的錨定也能夠誘導Notch活化。綜合起來，我們的數據表明由雙特異性抗體誘導的錨定依賴性Notch活化的概念可跨錨定抗原和形式應用。
實施例8 哺乳動物Notch受體家族由四個異源二聚體同種同源物(Notch1-4)所組成，且它們與Jagged (Jag1和Jag2)和類Delta(DLL1、DLL3和DLL4)家族中的五個Notch配體交互作用。大多數Notch配體活化Notch訊號傳遞，除了被認為是用作訊息傳遞路徑的天然拮抗劑的DLL3之外(Kopan 和 Ilagan，2009)。由Notch配體ECD所組成的雙特異性抗體固定至培養盤，或直接添加至培養基(即非固定)，然後添加Notch報導細胞。一致地，僅當它們被固定時，才觀察到除了DLL3之外，所有Notch配體雙特異性抗體的Notch報導基因的錨定依賴性活化(圖8A)。 為了證明錨定對抗體誘導的Notch活化的重要性，使用了表現兩種不同程度的錨定抗原GPC3的SK-HEP1細胞(圖8B)。由抗GPC3結合臂所組成的雙特異性抗體而不是含有不結合至GPC3表現細胞的抗KLH雙特異性抗體，能夠活化Notch報導細胞。此外，僅在GPC3過度表現細胞(SK-PCA31和SK-PCA60)中觀察到由抗GPC3雙特異性抗體誘導的Notch活化。值得注意的是，SK-PCA31 (GPC3低)和SK-PCA60 (GPC高)之間的Notch活化程度仍然相當，這表明了就每個細胞的表面錨定抗原表現而言，錨定依賴性Notch活化所需的閾值為低的(SK-PAC31中每個細胞2,672個表面錨定抗原和SK-PCA60中每個細胞120,762個表面錨定抗原)(圖 6C)。這表明了只要在細胞上表現足夠數量的錨定抗原，就可實現藉由反式結合(trans-binding)的Notch活化(圖 8C)。
抗體固定的測定法 對於經由吸附直接固定Notch配體雙特異性抗體，先用10微克/mL濃度的抗體塗佈96孔盤，置於4℃16小時。抗體塗佈後，用細胞培養基洗滌培養盤，然後在室溫下用5% FBS溶液阻斷2小時。之後，以每孔3x10 4個細胞接種C2C12 Notch報導細胞，且在37℃下培養48小時，然後根據製造商的指南(Promega)進行雙螢光素酶測定法。對於非固定的條件，就在接種C2C12 Notch報導細胞之前添加抗體。以相對螢光素酶單位(Relative Luciferase Unit，RLU)表示螢光素酶訊號，且進一步標準化至抗KLH同種型對照的RLU。
共培養Notch報導基因的測定法 以每孔1x10 5個細胞的密度接種錨定抗原表現細胞(即GPC3/FAP/CD32過度表現細胞)，且在37℃下培養16小時。以每孔250 微克/mL添加抗GPC3//Notch配體-Fc雙特異性抗體或抗KLH IgG1同種型對照抗體且培養1小時，然後將3x10 4個C2C12 Notch報導細胞接種至孔。在37℃下培養24小時後，根據製造商的指南(Promega)進行雙螢光素酶測定法。以相對螢光素酶單位表示螢光素酶訊號，且進一步標準化至抗KLH同種型對照的RLU。
細胞表面GPC3的定量方法 根據製造商推薦的指南，使用Quantum Simply Cellular抗人類套組(Bangs Laboratories)，來量化GPC3的細胞表面表現。簡而言之，製備10,000個細胞且在冰上用抗GPC3抗體染色30分鐘。用HEPES-BSA緩衝液洗滌96孔盤兩次，然後添加山羊抗人類Kappa PE二級抗體(Southern Biotech)且在冰上培養30分鐘。洗滌盤兩次之後，用流式細胞儀(BD, Fortessa)分析樣品的PE訊號。用不同程度之與抗人類IgG偶聯的微球，來產生標準曲線。使用製造商提供的QuickCal v2.3工具，來計算細胞表面GPC3。
[表4] 顯示圖7和8所示分子的序列辨識號的表
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[表5] 顯示圖7和8和表4所示分子的胺基酸序列的表
Figure 02_image005
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無。
[圖1] 顯示了具有位點特異性結合域和能夠結合至導致其活化的Notch受體結合的多肽的位點特異性Notch活化的概念的說明性圖式。(A) 具有一個能夠特異性結合至錨定抗原，以藉由Notch促效域(Notch agonist domain)來誘導Notch受體的錨定依賴性反式活化的Fab臂的雙特異性抗體。(B) 具有能夠結合至錨定抗原的工程化Fc和兩個Notch促效域的多特異性抗體。(C) 具有能夠結合至錨定抗原的工程化Fc和具有能夠結合至一個錨定抗原(1)的工程化Fc、一個Notch促效域和結合至第二錨定抗原的額外結合域 (2)，以獲得額外的特異性的多特異性抗體。 [圖2] 描繪了具有Notch促效抗體的概念與Fc gamma RIIB選擇性結合技術的說明性圖式(藉由在Fc 區導入突變，此技術選擇性增加Fc區對抑制性Fc gamma RIIb 的結合親和力，而不是活化Fc gamma受體，其包含Fc gamma RIIa、Fc gamma RI 和Fc gamma RIIIa。)。 [圖3] 多特異性Notch促效抗體的製備。分子格式和命名規則的說明性圖式。(A) 抗AA//Jag-Fc，由不與Fc gamma R結合的 Fc (「Fc gamma R沉默」)、人類Jag1胞外域 (extra cellular domain，ECD) 和結合至靶抗原例如GPC3的Fab組成。異質二聚體化和正確組裝是藉由Fc中的旋鈕進入孔 (knob into hole，kih)突變來實現(B) Jag1//Jag1-Fc，由不與Fc gamma R結合的 Fc、和兩個人類Jag1胞外域(ECD)組成。 [圖4] 錨定依賴性Notch活化誘導Notch促效抗體。(A) RBP-Jk報導基因測定法顯示了穩定表現由Notch促效抗體誘導的螢光素酶報導基因(C2C12-Notch報導細胞)的C212細胞中錨定依賴性Notch活化的影響。包含人類IgG1抗體作為同種型(isotype)對照。Notch促效抗體 (10 微克 (microgram，mcg)/mL) 在接種C212-Notch報導細胞之前，藉由吸附直接固定在培養盤上，其藉由吸附在培養盤上的抗人類IgG kappa輕鏈(anti-IgG kappa-LC) 抗體(10 mcg/mL)固定，或與C2C12-Notch報導細胞一起添加(無固定)。數據以針對同種型對照抗體處理標準化的螢光素酶的倍數刺激來表示。(B) 包含人類IgG1抗體作為同種型對照。Notch促效抗體(10 mcg/mL) 藉由吸附直接固定在培養盤上，其藉由先吸附在培養盤上的抗人類IgG Fc特異性抗體(10 mcg/mL)固定，或不固定而與或不與抗抗人類IgG Fc抗體一起直接添加至培養基。 [圖5] Notch活化取決於錨定抗原的可用性和程度。(A) 穩定過度表現GPC3 (SK-PCa 60) 的SK-HEP1細胞與C2C12-Notch報導細胞以指定的細胞密度共培養，在進行雙螢光素酶測定法之前，用同種型對照抗體或抗GPC3//Jag1-Fc抗體(10 mcg/mL)處理24小時。數據以針對同種型對照抗體處理標準化的螢光素酶的倍數刺激來表示。(B) 以不同程度穩定過度表現GPC3 (高GPC3：SK-PCa 60、中GPC3：SK-PCA31和低SK-PCA 13)的SK-HEP1細胞與C2C12-Notch報導細胞共培養，在進行雙螢光素酶測定法之前，用同種型對照抗體或抗GPC3//Jag1-Fc抗體 (10 mcg/mL)處理24 小時。數據以針對同種型對照抗體處理標準化的螢光素酶的倍數刺激來表示。 [圖6] qPCR分析顯示了Notch靶基因的相對表現，(A) HEY1和(B) NRARP。在添加親本C2C12細胞之前，將同種型對照抗體或抗GPC3//Jag1-Fc抗體(0 或 25 mcg/mL)吸附至培養盤隔夜。在將細胞收集用於qPCR分析之前，將C2C12細胞進一步用 DMSO或gamma-分泌酶抑制劑DAPT (10 微莫耳)處理24小時。 [圖7] 藉由對位點特異性錨定抗原的雙特異性Notch促效抗體誘導的錨定依賴性Notch活化。 (A) Notch報導細胞與NIH3T3-FAP過度表現細胞共培養，且進行螢光素酶測定法之前，用抗KLH對照抗體或抗FAP//Jag1雙特異性抗體 (10 mcg/mL) 處理 24 小時。(B) FACS測定顯示了抗FAP//Jag1-Fc結合至在 NIH3T3細胞上過度表現的表面FAP的能力。(C) Notch報導細胞與MDCK-Fc gamma RIIB過度表現細胞共培養。 Jag1//Jag1-Fc*由優先結合至作為錨定抗原的Fc gamma RIIB的工程化Fc所組成。 [圖8] 由具有其他 Notch配體(即Jagged2、DLL1、DLL3、DLL4)而不是 Jagged1 的胞外域的雙特異性Notch促效抗體誘導的錨定依賴性Notch活化。(A) 在進行螢光素酶測定法之前，藉由塗佈在盤上的抗人類Fc 特異性抗體，來固定由Notch促效臂(即所示的Notch 配體)和抗錨定抗原臂(即抗KLH或抗GPC3)所組成的雙特異性抗體(10 mcg/mL)或將其直接添加至培養基中的Notch報導細胞中(非固定化條件)。數據以針對抗KLH對照抗體處理標準化後的相對螢光素酶單位 (relative luciferase unit，RLU) 的倍數變化來表示。(B) 穩定過度表現GPC3的SK-HEP1細胞(SK-PCA 60和 SK-PCA 31)與C2C12-Notch報導細胞共培養，進行螢光素酶測定法之前，用由用於抗錨定抗原結合臂的抗KLH 抗體或抗GPC3抗體、和指示的人類Notch配體的胞外域所組成的雙特異性抗體(10 mcg/mL)來處理24小時。數據以針對抗KLH對照抗體處理標準化後的相對螢光素酶單位(RLU) 的倍數變化來表示。(C) 使用來自 Bangs Laboratories 的 QuantumTM Simply Cellular (註冊商標)(QSC)微球試劑盒對在GPC3過度表現細胞(SK-PCA31和SK-PCA60)上表現的細胞表面 GPC3進行定量。數據以每個細胞表現的表面GPC3的數量來表示。
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Claims (27)

  1. 一種多特異性抗原結合分子，包括： (i) 一第一抗原結合部分，其特異性結合至一第一靶細胞上的一Notch受體，及 (ii) 一第二抗原結合部分，其特異性結合至一第二靶細胞上的一錨定抗原， 其中該第一靶細胞和該第二靶細胞是不同細胞，且 其中當該多特異性抗原結合分子結合至該第二靶細胞上的該錨定抗原，該多特異性抗原結合分子活化該第一靶細胞中的該Notch訊息傳遞路徑。
  2. 如請求項1所述之多特異性抗原結合分子，其中該第一靶細胞是一組織幹細胞、活化的CD4 T淋巴細胞、細胞分泌促纖維化因子(cell secreting pro-fibrotic factor)或腫瘤微環境中的促致瘤細胞(pro-tumorigenic cell)。
  3. 如請求項2所述之多特異性抗原結合分子，其中該組織幹細胞是一衛星細胞、成人腸幹細胞或隱窩基底柱狀細胞(crypt base columnar (CBC) cell)。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之多特異性抗原結合分子，其中該第一結合部分包括一Notch受體配體的一Notch結合域。
  5. 如請求項4所述之多特異性抗原結合分子，其中該Notch受體配體是一Notch1、Notch2、Notch3或Notch4受體的一配體。
  6. 如請求項4或5所述之多特異性抗原結合分子，其中該Notch受體是一Delta蛋白質或Jagged蛋白質。
  7. 如請求項6所述之多特異性抗原結合分子，其中該Delta蛋白質是一類Delta配體1(Delta Like Ligand 1，DLL1)、DLL3或DLL4。
  8. 如請求項6所述之多特異性抗原結合分子，其中該Jagged蛋白質是一Jagged 1或Jagged 2。
  9. 如請求項1至3中任一項所述之多特異性抗原結合分子，其中該第一抗原結合部分包括特異性結合至該Notch受體的一Fab、scFv、VHH、VL、VH或單一域抗體。
  10. 如請求項1至9中任一項所述之多特異性抗原結合分子，其中該第二靶細胞係選自由不是衛星細胞的肌肉細胞、活化的纖維母細胞、表現FcgRIIB的免疫細胞、表現GPC3的癌細胞和在腸隱窩中的細胞所組成的群組。
  11. 如請求項10所述之多特異性抗原結合分子，其中表現FcgRIIB的該免疫細胞係選自由一循環B淋巴細胞(circulating B lymphocyte)、單核細胞(monocyte)、嗜中性球(neutrophil)、淋巴樹突細胞(lymphoid-dendritic cell)和骨髓樹突細胞(myeloid-dendritic cell)所組成的群組。
  12. 如請求項10所述之多特異性抗原結合分子，其中在該第二靶細胞上的該錨定抗原係選自由鈣電壓閘控通道次單元Alpha1 S (Calcium Voltage-Gated Channel Subunit Alpha1 S，CACNA1S)、纖維母細胞活化蛋白質(Fibroblast activation protein，FAP)、磷脂肌醇聚糖3 (Glypican-3，GPC3)和Fc gamma RIIB (CD32B)所組成的群組。
  13. 如請求項1至12中任一項所述之多特異性抗原結合分子，其中該第二抗原結合部分包括特異性結合至該錨定抗原的一Fab、scFv、VHH、VL、VH、單一域抗體、配體或工程化Fc區。
  14. 如請求項1至13中任一項所述之多特異性抗原結合分子，其中該多特異性抗原結合分子更包括一Fc區。
  15. 如請求項14所述之多特異性抗原結合分子，其中相比於一天然人類IgG1 Fc域，該Fc區是對人類Fc gamma受體展現出降低的結合親和力的一工程化Fc區。
  16. 如請求項13至15中任一項所述之多特異性抗原結合分子，其中該第二抗原結合部分包括特異性結合至FcgRIIB的一工程化Fc區。
  17. 如請求項16所述之多特異性抗原結合分子，其中該多特異性抗原結合分子更包括多一個該第一抗原結合部分。
  18. 如請求項16所述之多特異性抗原結合分子，其中該多特異性抗原結合分子更包括特異性結合至在一第三靶細胞上的一錨定抗原的一第三抗原結合部分。
  19. 如請求項18所述之多特異性抗原結合分子，其中該第二靶細胞和該第三靶細胞是不同細胞或相同細胞。
  20. 一種醫藥組合物，包括如請求項1至19中任一項所述之多特異性抗原結合分子，及一醫藥上可接受的載劑。
  21. 一種活化一第一靶細胞中的Notch訊息傳遞路徑的方法，包括使該第一靶細胞接觸一有效量之如請求項1至19中任一項所述的多特異性抗原結合分子或如請求項20所述的醫藥組合物。
  22. 如請求項21所述之方法，其中該第一靶細胞在生物體內時是在一哺乳動物對象中。
  23. 如請求項22所述之方法，其中該對象為一人類。
  24. 一種編碼如請求項1至19中任一項所述之多特異性抗原結合分子的單離核酸。
  25. 一種包括如請求項24所述之核酸的載體。
  26. 一種包括如請求項24所述之核酸或如請求項25所述之載體的宿主細胞。
  27. 一種產生如請求項1至19中任一項所述之多特異性抗原結合分子的方法，包括培養如請求項26所述之宿主細胞。
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