TW202216772A

TW202216772A - 抗ｃｄ３／抗ｃｄ２８雙特異性抗原結合分子

Info

Publication number: TW202216772A
Application number: TW110123144A
Authority: TW
Inventors: 彼得布朗克; 瑪蒂娜蓋格爾; 湯瑪士哈福; 克里斯俊克萊; 帕洛尤瑪那
Original assignee: 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司
Priority date: 2020-06-25
Filing date: 2021-06-24
Publication date: 2022-05-01
Also published as: JP2023531067A; CN115916830A; US20230416366A1; EP4172203A1; AR122761A1; WO2021260064A1

Abstract

本發明涉及抗 CD3/抗 CD28 雙特異性抗原結合分子及其掩蔽蛋白酶活化的形式、生產該等物之方法、含有該等分子之醫藥組成物，以及該等物在疾病治療中作為免疫調節劑及/或共刺激劑之用途，該疾病特定而言為癌症。

Description

抗　CD3/抗　CD28　雙特異性抗原結合分子

本發明涉及抗 CD3/抗 CD28 雙特異性抗原結合分子及其經蛋白酶活化的形式、其產生方法、含有這些分子的醫藥組成物及它們在疾病 (特別是癌症) 治療中作爲免疫調解劑及/或共刺激劑之用途。

癌症免疫療法正在成為一種越來越有效的治療選擇，可使黑色素瘤、非小細胞肺癌和腎細胞癌等癌症類型產生顯著且持久之反應。這主要得益於幾種免疫檢查點阻斷劑的推動，其中包括抗 PD-1 (例如 Keytruda，Merck；Opdivo，BMS)、抗 CTLA-4 (例如 Yervoy，BMS) 及抗 PD-L1 (例如 Tecentriq，Roche)。這些藥劑可能用作多種癌症類型的護理標準，或用作聯合療法之主幹，但是，僅有一小部分患者 (＜25%) 受益於該等療法。此外，各種癌症 (前列腺癌、結腸直腸癌、胰腺癌、肉瘤、非三陰性乳腺癌等) 皆對這些免疫調解劑存在原發耐藥性。許多報道指出，預先存在的抗腫瘤 T 細胞之缺失導致一些患者缺乏反應或反應不佳。總之，儘管現有免疫療法具有令人印象深刻的抗癌效果，但仍然存在對於治療大量癌症患者群體及開發旨在誘導並增強新型腫瘤特異性 T 細胞反應的療法的明確的醫學需求。

CD28 為共刺激分子亞家族之奠基成員，其特徵在於連接至單個跨膜域及含有關鍵信號傳導基序的細胞質域的成對之 V 組免疫球蛋白超家族 (IgSF) 域 (Carreno 及 Collins，2002)。該亞家族之其他成員包括 ICOS、CTLA-4、PD1、PD1H、TIGIT 及 BTLA (Chen 及 Flies，2013)。CD28 表現僅限於 T 細胞，且普遍存在於所有天然亞群及大多數經歷抗原之亞群 (包括那些表現 PD-1 或 CTLA-4 的亞群) 中。CD28 及 CTLA-4 高度同源，且競爭結合相同之 B7 分子 CD80 及 CD86，它們在樹突狀細胞、B 細胞、巨噬細胞及腫瘤細胞上表現 (Linsley 等人，1990)。CTLA-4 與 B7 配體家族之較高親和力使 CTLA-4 在與 CD28 競爭配體結合方面勝出並抑制效應子T 細胞反應 (Engelhardt 等人，2006)。相比之下，研究表明 PD-1 藉由部分地使 CD28 之細胞質域去磷酸化而抑制 CD28 信號傳導 (Hui 等人，2017)。CD28 與專職抗原呈現細胞表面上之 CD80 或 CD86 之連接為天然 T 細胞功能性從頭引發、隨後之選殖擴增、細胞介素產生、標靶細胞裂解及長期記憶形成所必需。CD28 配體之結合亦促進了誘導型共刺激受體 (例如 OX-40、ICOS 及 4-1BB) 之表現 (綜述於以下文獻中：Acuto 及 Michel，2003)。在 CD28 連接後，二硫鍵所連接之同源二聚體、膜近端 YMNM 基序及遠端 PYAP 基序已被證明與幾種激酶及轉接蛋白複合 (Boomer 及 Green，2010)。這些基序對於誘導 IL2 轉錄很重要，後者由 NFAT、AP-1 及 NFκB 家族轉錄因子之 CD28 依賴性活化所媒介 (Fraser 等人，1991) (June 等人，1987) (Thompson 等人，1989)。但是，在 CD28 之細胞質域內發現額外之磷酸化及泛蛋白化位點。如 Esensten 等人所綜述 (Esensten 等人，2016)，CD28 所啟動之途徑在促進習知的 T 細胞增殖及效應子功能方面具有關鍵作用。CD28 連接亦促進調節性 T 細胞的抗炎功能。CD28 藉由部分增強來自 T 細胞受體之信號來共刺激 T 細胞，但亦表明其媒介獨特之信號傳導事件 (Acuto 及 Michel，2003；Boomer 及 Green，2010；June 等人，1987)。由 CD28 特異性觸發的信號控制 T 細胞功能之許多重要的態樣，包括下游蛋白質之磷酸化及其他轉譯後修飾 (例如 PI3K 所媒介之磷酸化)、轉錄變化 (例如 Bcl-xL 表現)、表觀遺傳變化 (例如 IL-2 啟動子)、細胞骨架重塑 (例如微管組織中心之取向) 及醣解速率的變化 (例如醣解通量)。CD28 缺陷型小鼠對傳染性病原體、同種異體移植抗原、移植物抗宿主病、接觸性過敏症及哮喘的反應降低 (Acuto 及 Michel，2003)。缺乏 CD28 所媒介之共刺激導致活體外和活體內 T 細胞增殖減少，嚴重抑制生長中心形成及免疫球蛋白同型類別轉換，減少 T 輔助 (Th) 細胞分化及 Th2 型細胞介素之表現。CD4 依賴性細胞毒性 CD8+ T 細胞反應亦受到影響。重要的是，CD28 缺陷型天然 T 細胞在較低的抗原濃度下表現出下降的增殖反應。越來越多的文獻支持在 T 細胞上接合 CD28 具有抗腫瘤潛力的觀點。最近的證據表明，PD-L1/PD-1 及 CTLA-4 檢查點抑制劑的抗癌作用取決於 CD28 (Kamphorst 等人，2017；Tai 等人，2007)。考察 CTLA-4 及 PD-1 阻斷劑之治療效果的臨床研究在晚期黑色素瘤及其他癌症患者中表現出非常有前景的結果。此外，已表明，輸注表現人工嵌合 T 細胞受體 (包含與細胞內 TCR 信號傳導域 (CD3z) 及細胞內共刺激域 (CD28 及/或 4-1BB 域) 融合的細胞外抗原識別域) 之經基因工程改造的 T 細胞在 B 細胞癌及其他癌症中表現出高反應率和持久性。

CD28 促效性抗體可分爲兩類：(i) CD28 超促效性抗體及 (ii) CD28 習知促效性抗體。通常，為活化天然 T 細胞，需要 T 細胞抗原受體 (TCR，信號 1) 的參與及 CD28 的共刺激信號傳導 (信號 2)。CD28 超促效劑 (CD28SA) 為 CD28 特異性單株抗體，能夠自主活化 T 細胞而無需明顯的 T 細胞受體參與 (Hünig, 2012)。在囓齒動物中，CD28SA 活化習知的調節性 T 細胞。CD28SA 抗體在多種自身免疫、發炎及移植模型中具有治療效果。但是，有關人類 CD28SA 抗 TGN1412 的一項 I 期研究於 2006 年引發一場危及生命的細胞介素風暴。後續研究表明，由於人類 T 細胞與臨床前動物模型 T 細胞之 CD28 反應性存在差異，導致劑量錯誤引起毒性。目前正在一項針對 RA 患者及轉移性或不可切除的晚期實體惡性腫瘤患者的開放標籤、多中心劑量遞增研究中重新評價 TGN1412。CD28 習知的促效性抗體 (例如選殖株 9.3) 模擬 CD28 天然配體，僅能在存在 T 細胞受體信號 (信號 1) 的情況下增強 T 細胞活化。已發表的見解表明，抗體之結合表位對促效性抗體是超促效劑還是習知的促效劑有重大影響 (Beyersdorf 等人，2005)。超促效性 TGN1412 與 CD28 之橫向基序結合，而習知的促效性分子 9.3 結合至配體結合表位附近。由於結合表位不同，超促效性抗體與習知的促效性抗體在 T 細胞表面形成線性 CD28 分子複合物的能力有所不同。確切而言，TGN1412 能夠高效形成 CD28 之線性陣列，這可能導致聚集的信號傳導成分足以超過 T 細胞活化之閾值。另一方面，習知的促效劑 9.3 導致在結構上並非線性的複合物。先前已發表嘗試基於 9.3 選殖株轉化習知的促效性結合物的嘗試 (Otz 等人，2009)，其中使用針對黑色素瘤相關蛋白多醣及 CD28 的重組雙特異性單鏈抗體。據報道，儘管使用習知的 CD28 促效性結合物 9.3，但基於雙特異性單鏈抗體形成多聚體構建體之內在趨勢，所報告之雙特異性單鏈抗體仍能發揮「超促效性」活性。

CD3 (分化簇3) 是由四個次單元、CD3γ 鏈、CD3δ 鏈及兩條 CD3ɛ 鏈組成之蛋白質複合物。CD3 與 T 細胞受體及 ζ 鏈締合，於 T 淋巴細胞中產生活化信號。CD3 作為藥物標靶已得到探索。靶向 CD3 之單株抗體已被用作自體免疫疾病 (如 I 型糖尿病) 的免疫抑制劑療法，或用於治療移植排斥反應。1985 年，CD3 抗體莫羅單抗-CD3 (OKT3) 成爲第一種獲批用於人體臨床的單株抗體。

CD3 抗體之最新應用以雙特異性抗體的形式出現，其一方面結合 CD3，另一方面結合腫瘤細胞抗原。該等抗體與其兩個標靶的同時結合將迫使標靶細胞與 T 細胞之間暫時相互作用，從而導致任何細胞毒性 T 細胞之活化及隨後標靶細胞之裂解。出於治療目的，抗體必須滿足的一個重要要求係在 活體外(用於藥物儲存) 及 活體內(投予患者後) 具有足夠高之穩定性。修飾 (如天冬醯胺脫醯胺) 為重組抗體之典型降解途徑，可能影響 活體外穩定性及 活體內生物學功能。鑒於抗體 (特定而言，活化 T 細胞之雙特異性抗體) 之巨大治療潛力，需要具有優化特性的增强型 CD3 抗體。

本發明描述了抗 CD3/抗 CD28 雙特異性抗原結合分子及其掩蔽的經蛋白酶活化之形式，其無需形成多聚體即可實現腫瘤依賴性 T 細胞活化及腫瘤細胞殺傷。本發明之雙特異性 CD28 抗原結合分子之特徵在於與 CD28 單價結合且它們包含可經掩蔽之能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域。具體而言，本發明涉及具有抗個體遺傳型結合部分的抗 CD3/抗 CD28 雙特異性抗原結合分子，該抗個體遺傳型結合部分掩蔽 CD3 抗原結合域直至經蛋白酶切割。這使得 CD3 抗原結合域無法接近或「經掩蔽」，直至其接近標靶組織 (例如腫瘤，例如腫瘤浸潤性 T 細胞)。此外，抗 CD3/抗 CD28 雙特異性抗原結合分子具有由能夠穩定締合的第一次單元及第二次單元構成之 Fc 域，該 Fc 域包含降低抗原結合分子與 Fc 受體之結合親和力及/或效應子功能之一個或多個胺基酸取代。從而取消 Fc 受體所媒介之交聯，藉由能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域之結合所引起之交聯實現腫瘤特異性活化。

因此，本發明提供一種特徵為與 CD28 單價結合之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，該分子包含 (a) 能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域， (b) 能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域，及 (c) 由能夠穩定締合的第一次單元及第二次單元構成之 Fc 域，其包含降低該抗原結合分子與 Fc 受體的結合親和力及/或效應子功能之一個或多個胺基酸取代，其中該能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域包含 (i) 重鏈可變區 (V _HCD3)，其包含 SEQ ID NO: 2 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 3 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 4 之 CDR-H3；以及輕鏈可變區 (V _LCD3)，其包含 SEQ ID NO: 5 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 6 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 7 之 CDR-L3；或 (ii) 重鏈可變區 (V _HCD3)，其包含 SEQ ID NO: 10 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 11 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 12 之 CDR-H3；以及輕鏈可變區 (V _LCD3)，其包含 SEQ ID NO: 13 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 14 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 15 之 CDR-L3。

在一個態樣中，提供如下文所定義之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中 Fc 域為 IgG，特定而言，Fc 域為 IgG1 Fc 域或 IgG4 Fc 域。在一個特定態樣中，由能夠穩定締合的第一次單元及第二次單元所構成之 Fc 域為 IgG1 Fc 域。在一個態樣中，Fc 域包含胺基酸取代 L234A 及 L235A (根據 Kabat EU 索引編號)。在一個態樣中，Fc 域為人類 IgG1 亞類且包含胺基酸突變 L234A、L235A 及 P329G (根據 Kabat EU 索引編號)。

在一個態樣中，提供一種如上文所定義之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域包含 (i) 重鏈可變區 (V _HCD28)，其包含 SEQ ID NO: 26 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 27 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 28 之 CDR-H3；以及輕鏈可變區 (V _LCD28)，其包含 SEQ ID NO: 29 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 30 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 31 之 CDR-L3；或 (ii) 重鏈可變區 (V _HCD28)，其包含 SEQ ID NO: 18 之 CDR-H1、SEQ ID NO: 19 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 20 之 CDR-H3；以及輕鏈可變區 (V _LCD28)，其包含 SEQ ID NO: 21 之 CDR-L1、SEQ ID NO: 22 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 23 之 CDR-L3。

在一個態樣中，雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子的能夠與 CD28 特異性結合的抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD28)，其包含 SEQ ID NO: 26 之 CDR-H1、SEQ ID NO: 27 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 28 之 CDR-H3；及輕鏈可變區 (V _LCD28)，其包含 SEQ ID NO: 29 之 CDR-L1、SEQ ID NO: 30 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 31 之 CDR-L3。

在另一態樣中，雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子的能夠與 CD28 特異性結合的抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD28)，其包含 SEQ ID NO: 18 之 CDR-H1、SEQ ID NO: 19 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 20 之 CDR-H3；及輕鏈可變區 (V _LCD28)，其包含 SEQ ID NO: 21 之 CDR-L1、SEQ ID NO: 22 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 23 之 CDR-L3。

此外，提供一種如上文所定義之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD28)，其包含與 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _LCD28)，其包含與 SEQ ID NO:25 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列。

在又一態樣中，提供一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD28)，其包含選自由下列各項所組成之群組之胺基酸序列：SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40 及 SEQ ID NO:41；及輕鏈可變區 (V _LCD28)，其包含選自由下列各項所組成之群組之胺基酸序列：SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50 及 SEQ ID NO:51。

在另一態樣中，提供一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域包含 (a) 包含 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V _HCD28) 以及包含 SEQ ID NO:44 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V _LCD28)，或 (b) 包含 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V _HCD28) 以及包含 SEQ ID NO:25 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V _LCD28)，或 (c) 包含 SEQ ID NO:41 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V _HCD28) 以及包含 SEQ ID NO:51 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V _LCD28)，或 (d) 包含 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V _HCD28) 以及包含 SEQ ID NO:43 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V _LCD28)，或 (e) 包含 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V _HCD28) 以及包含 SEQ ID NO:44 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V _LCD28)，或 (f) 包含 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V _HCD28) 以及包含 SEQ ID NO:49 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V _LCD28)，或 (g) 包含 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V _HCD28) 以及包含 SEQ ID NO:25 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V _LCD28)，或 (h) 包含 SEQ ID NO:33 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V _HCD28) 以及包含 SEQ ID NO:25 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V _LCD28)，或 (i) 包含 SEQ ID NO:32 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V _HCD28) 以及包含 SEQ ID NO:43 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V _LCD28)，或 (j) 包含 SEQ ID NO:32 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V _HCD28) 以及包含 SEQ ID NO:49 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V _LCD28)，或 (k) 包含 SEQ ID NO:32 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V _HCD28) 以及包含 SEQ ID NO:25 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V _LCD28)。

在一個特定態樣中，提供一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域包含 (i) 重鏈可變區 (V _HCD28)，其包含 SEQ ID NO: 52 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 53 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 54 之 CDR-H3；以及輕鏈可變區 (V _LCD28)，其包含 SEQ ID NO: 55 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 56 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 57 之 CDR-L3。在一個態樣中，能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD28) 之 CDR，其包含 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _LCD28) 之 CDR，其包含 SEQ ID NO:44 之胺基酸序列。

在另一特定態樣中，提供一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD28 特異性結合之抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD28)，其包含 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _LCD28)，其包含 SEQ ID NO: 43 之胺基酸序列。在又一特定態樣中，提供一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD28 特異性結合之抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD28)，其包含 SEQ ID NO: 32 之胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _LCD28)，其包含 SEQ ID NO:25 之胺基酸序列。

在一個態樣中，提供一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD3 特異性結合的抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD3)，其包含 SEQ ID NO: 2 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 3 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 4 之 CDR-H3；以及輕鏈可變區 (V _LCD3)，其包含 SEQ ID NO: 5 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 6 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 7 之 CDR-L3。在一個態樣中，能夠與 CD3 特異性結合的抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD3) 之 CDR，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _LCD3) 之 CDR，其包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列。在一個特定態樣中，能夠與 CD3 特異性結合的抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD3)，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _LCD3)，其包含SEQ ID NO:9 之胺基酸序列。

在另一態樣中，提供一種如本文所述之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD3 特異性結合的抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD3)，其包含 SEQ ID NO: 10 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 11 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 12 之 CDR-H3；及輕鏈可變區 (V _LCD3)，其包含 SEQ ID NO: 13 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 14 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 15 之 CDR-L3。在一個態樣中，能夠與 CD3 特異性結合的抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD3) 之 CDR，其包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _LCD3) 之 CDR，其包含 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列。在一個特定態樣中，能夠與 CD3 特異性結合的抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD3)，其包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _LCD3)，其包含 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列。

在又一態樣中，提供一種如前文所定義之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域及/或能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域為 Fab 片段或 crossFab 片段。在一個態樣中，提供一種如本文所述之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其包含：(a) 能夠與 CD28 特異性結合的Fab 片段，(b) 能夠與 CD3 特異性結合的 crossFab 片段，及 (c) 由能夠穩定締合的第一次單元及第二次單元構成之 Fc 域，其包含降低抗原結合分子與 Fc 受體之結合親和力及/或效應子功能之一個或多個胺基酸取代。在另一態樣中，提供一種如本文所述之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其包含：(a) 能夠與 CD28 特異性結合的 crossFab 片段，(b) 能夠與 CD3 特異性結合的 Fab 片段，及 (c) 由能夠穩定締合的第一次單元及第二次單元構成之 Fc 域，其包含降低抗原結合分子與 Fc 受體之結合親和力及/或效應子功能之一個或多個胺基酸取代。

在一個態樣中，能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域為 Fab 片段，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 或恆定域 CL 及 CH1 (特定而言，可變域 VL 及 VH) 係彼此替換。在一個態樣中，能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域為習知的 Fab 片段。在一個態樣中，能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域為 Fab 分子，其中在恆定域 CL 中，位置 123 處之胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 經選自離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 之胺基酸取代，且位置 124 處之胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 取代；且其中在恆定域 CH1 中，位置 147 處之胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) 取代，且位置 213 處之胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代。

在又一態樣中，提供一種如本文所述之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域為 Fab 分子，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 或恆定域 CL 及 CH1 (特定而言，恆定域 CL 及 CH1) 係彼此替換。在一個態樣中，能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域為習知的 Fab 分子。在一個態樣中，能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域為 Fab 分子，其中在恆定域 CL 中，位置 123 處之胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 經選自離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 之胺基酸取代，且位置 124 處之胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 取代；且其中在恆定域 CH1 中，位置 147 處之胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) 取代，且位置 213 處之胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代。

在另一態樣中，提供與本文所揭示之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中第一抗原結合域及第二抗原結合域各自為 Fab 分子，且 Fc 域由能夠穩定締合的第一次單元及第二次單元構成；且其中 (i) 第一抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域之第一次單元之 N 端融合，且第二抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域之第二次單元之 N 端融合，或 (ii) 第二抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域之第一次單元之 N 端融合，且第一抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端與 Fc 域之第二次單元之 N 端融合。在一個態樣中，Fc 域包含促進 Fc 域之第一次單元與第二次單元之締合之修飾。在一個態樣中，Fc 域之第一次單元包含胺基酸取代 S354C 及 T366W (EU 編號)，且 Fc 域之第二次單元包含胺基酸取代 Y349C、T366S 及 Y407V (根據 Kabat EU 索引編號)。

在又一態樣中，提供一種特徵為與 CD28 單價結合之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，該分子包含 (a) 能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域， (b) 能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域， (c) 由能夠穩定締合的第一次單元及第二次單元構成之 Fc 域，其包含降低該抗原結合分子與 Fc 受體的結合親和力及/或效應子功能之一個或多個胺基酸取代，其中該能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域包含 (i) 重鏈可變區 (V _HCD3)，其包含 SEQ ID NO: 2 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 3 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 4 之 CDR-H3；以及輕鏈可變區 (V _LCD3)，其包含 SEQ ID NO: 5 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 6 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 7 之 CDR-L3；或 (ii) 重鏈可變區 (V _HCD3)，其包含 SEQ ID NO: 10 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 11 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 12 之 CDR-H3；及輕鏈可變區 (V _LCD3)，其包含 SEQ ID NO: 13 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 14 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 15 之 CDR-L3；且進一步包含 (d) 通過蛋白酶可切割連接子共價連接至雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子的掩蔽部分，其中遮蔽部分能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域之個體遺傳型結合，從而可逆地隱蔽能夠與 CD3 特異性結合之抗原結合域。

在一個態樣中，掩蔽部分共價連接至能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域之重鏈可變區 (V _HCD3)，特定而言經由肽連接子共價連接，更特定而言經由蛋白酶可切割連接子共價連接。在一個態樣中，掩蔽部分為 scFv。

在又一態樣中，掩蔽部分包含 (i) 重鏈可變區 (V _H)，其包含 DYSMN (SEQ ID NO:123) 之 CDR-H1 胺基酸序列、選自由 WINTETGEPRYTDDFKG (SEQ ID NO:124)、WINTETGEPRYTDDFTG (SEQ ID NO:130) 及 WINTETGEPRYTQGFKG (SEQ ID NO:131) 所組成之群組之 CDR H2 胺基酸序列及 EGDYDVFDY (SEQ ID NO:125) 之 CDR H3 胺基酸序列；以及輕鏈可變區 (V _L)，其包含選自由 RASKSVSTSSYSYMH (SEQ ID NO:126) 及 KSSKSVSTSSYSYMH (SEQ ID NO:129) 所組成之群組之輕鏈互補決定區 CDR-L1 胺基酸序列、YVSYLES (SEQ ID NO:127) 之 CDR-L2 胺基酸序列及選自由 QHSREFPYT (SEQ ID NO:128) 及 QQSREFPYT (SEQ ID NO:132) 所組成之群組之 CDR-L3 胺基酸序列；或 (ii) 重鏈可變區 (V _H)，其包含 DYSMN (SEQ ID NO:123) 之 CDR-H1 胺基酸序列、WINTETGEPRYTDDFKG (SEQ ID NO:124) 之 CDR-H2 胺基酸序列及 EGDYDVFDY (SEQ ID NO:125) 之 CDR-H3 胺基酸序列；以及輕鏈可變區 (V _L)，其包含 RASKSVSTSSYSYMH (SEQ ID NO:126) 之 CDR-L1 胺基酸序列、YVSYLES (SEQ ID NO:127) 之 CDR-L2 胺基酸序列及 QHSREFPYT (SEQ ID NO:128) 之 CDR-L3 胺基酸序列；或 (iii) 重鏈可變區 (V _H)，其包含 SYGVS (SEQ ID NO:123) 之 CDR-H1 胺基酸序列、IIWGDGSTNYHSALIS (SEQ ID NO:124) 之 CDR-H2 胺基酸序列及 GITTVVDDYYAMDY (SEQ ID NO:125) 之 CDR-H3 胺基酸序列；以及輕鏈可變區 (V _L)，其包含 KSSKSVSTSSYSYMH (SEQ ID NO:129) 之 CDR-L1 胺基酸序列、AATFLAD (SEQ ID NO:127) 之 CDR-L2 胺基酸序列及 QHYYSTPYT (SEQ ID NO:128) 之 CDR-L3 胺基酸序列；或 (iv) 重鏈可變區 (V _H)，其包含 SYGVS (SEQ ID NO:123) 之 CDR-H1 胺基酸序列、WINTETGEPRYTDDFTG (SEQ ID NO:130) 之 CDR-H2 胺基酸序列及 GITTVVDDYYAMDY (SEQ ID NO:125) 之 CDR-H3 胺基酸序列；以及輕鏈可變區 (V _L)，其包含 KSSKSVSTSSYSYMH (SEQ ID NO:129) 之 CDR-L1 胺基酸序列、AATFLAD (SEQ ID NO:127) 之 CDR-L2 胺基酸序列及 QHYYSTPYT (SEQ ID NO:128) 之 CDR-L3 胺基酸序列；或 (v) 重鏈可變區 (V _H)，其包含 SYGVS (SEQ ID NO:123) 之 CDR-H1 胺基酸序列、WINTETGEPRYTQGFKG (SEQ ID NO:131) 之 CDR-H2 胺基酸序列及 GITTVVDDYYAMDY (SEQ ID NO:125) 之 CDR-H3 胺基酸序列；以及輕鏈可變區 (V _L)，其包含 KSSKSVSTSSYSYMH (SEQ ID NO:129) 之 CDR-L1 胺基酸序列、AATFLAD (SEQ ID NO:127) 之 CDR-L2 胺基酸序列及 QHYYSTPYT (SEQ ID NO:128) 之 CDR-L3 胺基酸序列。

在一個特定態樣中，掩蔽部分包含重鏈可變區 (V _H)，其包含 SYGVS (SEQ ID NO:115) 之 CDR-H1 胺基酸序列，IIWGDGSTNYHSALIS (SEQ ID NO:116) 之 CDR-H2 胺基酸序列，及 GITTVVDDYYAMDY (SEQ ID NO:117) 之 CDR-H3 胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _L)，其包含 RASENIDSYLA (SEQ ID NO:118) 之 CDR-L1 胺基酸序列，AATFLAD (SEQ ID NO:119) 之 CDR-L2 胺基酸序列，及 QHYYSTPYT (SEQ ID NO:120) 之 CDR-L3 胺基酸序列。

在另一態樣中，提供一種如上文所述之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中蛋白酶可切割連接子包含至少一個蛋白酶識別序列。在一個態樣中，蛋白酶識別序列選自下列所組成之群組： (a) RQARVVNG (SEQ ID NO:148)； (b) VHMPLGFLGPGRSRGSFP (SEQ ID NO:149)； (c) RQARVVNGXXXXXVPLSLYSG (SEQ ID NO:150)，其中 X 為任意胺基酸； (d) RQARVVNGVPLSLYSG (SEQ ID NO:151)； (e) PLGLWSQ (SEQ ID NO:152)； (f) VHMPLGFLGPRQARVVNG (SEQ ID NO:153)； (g) FVGGTG (SEQ ID NO:154)； (h) KKAAPVNG (SEQ ID NO:155)； (i) PMAKKVNG (SEQ ID NO:156)； (j) QARAKVNG (SEQ ID NO:157)； (k) VHMPLGFLGP (SEQ ID NO:158)； (l) QARAK (SEQ ID NO:159)； (m) VHMPLGFLGPPMAKK (SEQ ID NO:160)； (n) KKAAP (SEQ ID NO:161)；及 (o) PMAKK (SEQ ID NO:162)。

在一個態樣中，蛋白酶可切割連接子包含蛋白酶識別序列 RQARVVNG (SEQ ID NO:148)。在另一態樣中，蛋白酶可切割連接子包含蛋白酶識別序列 PMAKK (SEQ ID NO:162)。

根據本發明之另一態樣，提供編碼本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子的一種或多種經分離之多核苷酸。本發明進一步提供一種或多種載體，特定而言，提供一種或多種表現載體，其包含本發明之一種或多種經分離之多核苷酸，及包含本發明之一種或多種經分離之多核苷酸或一種或多種表現載體的宿主細胞。在一些態樣中，宿主細胞為真核細胞，特定而言為哺乳動物細胞。在另一態樣中，提供一種產生如本文所述之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子的方法，該方法包含在適合表現該雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子的條件下培養本發明之宿主細胞。視情況，該方法亦包含回收雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子。本發明亦涵蓋一種藉由本發明之方法產生的雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子。

本發明進一步提供一種醫藥組成物，該醫藥組成物包含本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子及至少一種醫藥上可接受之賦形劑。在一個態樣中，醫藥組成物用於治療疾病，特定而言，用於治療癌症。

本發明亦涵蓋使用本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子或醫藥組成物的方法。在一個態樣中，本發明提供一種根據本發明用爲藥劑之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子或醫藥組成物。在一個態樣中，提供一種如本文所述之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其用於 (a) 增强細胞活化或 (b) 增强 T 細胞效應子功能。在一個態樣中，提供一種根據本發明用於治療疾病之雙異性促效性 CD28 抗原結合分子或醫藥組成物。在一具體態樣中，疾病為癌症。在另一態樣中，提供一種根據本發明用於治療癌症之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子或醫藥組成物，其中雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子與化療劑、放射療法及/或用於癌症免疫療法中之其他藥劑聯合投予。

亦提供根據本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子或醫藥組成物在製造用於治療疾病之藥劑中的用途；以及治療個體之疾病的方法，該方法包含向該個體投予治療有效量之根據本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子或包含根據本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子且呈醫藥上可接受之形式的組成物。在一具體態樣中，疾病為癌症。在一個態樣中，提供一種 (a) 增强個體中之細胞活化或 (b) 增强個體中之 T 細胞效應子功能的方法，該方法包含向該個體投予根據本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子或包含根據本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子且呈醫藥上可接受之形式的組成物。在另一態樣中，根據本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子在製造用於治療疾病之藥劑中的用途，其中治療包含與化療劑、放射療法及/或用於癌症免疫療法中之其他藥劑共同投予。在又一態樣中，提供一種治療個體之疾病的方法，該方法包含向該個體投予治療有效量之根據本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子或包含根據本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子且呈醫藥上可接受之形式的組成物，其中該包含與化療劑、放射療法及/或用於癌症免疫療法中之其他藥劑共同投予。亦提供一種抑制個體中之腫瘤細胞生長的方法，該方法包含向個體投予有效量之根據本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子或包含根據本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子且呈醫藥上可接受之形式的組成物，以抑制腫瘤細胞生長。在上述態樣中任一項中，較佳的是，個體為哺乳動物，特定而言為人類。

定義

除非另有定義，否則本文所使用之技術及科學術語具有與本發明所屬技術領域通常使用的相同意義。出於解釋本説明書之目的，將適用以下定義，且在任何適當的情況下，以單數使用的術語還將包括複數，反之亦然。

如本文所用，術語「 抗原結合分子」在其最寬廣意義上是指特異性結合抗原決定位之分子。抗原結合分子之實例為抗體、多特異性抗體 (例如，雙特異性抗體)、抗體片段及支架抗原結合蛋白質。

如本文所用，術語「與 T 細胞上所表現之抗原結合的抗原結合域」或「能夠與 T 細胞上所表現之抗原特異性結合的部分」是指與抗原 CD3 特異性結合的多肽分子。在一個態樣中，抗原結合域能夠通過 CD3 活化信號傳導。在一個特定態樣中，抗原結合域能夠將其所連接的實體(例如 CD28 抗體) 導向表現 CD3 的細胞，例如導向特定類型之 T 細胞。能夠與 CD3 特異性結合的抗原結合域包括如本文所進一步定義之抗體及其片段。此外，能夠與抗原特異性結合的抗原結合域包括如本文所進一步定義之支架抗原結合蛋白質，例如基於經設計之重複蛋白質或經設計之重複域的結合域 (參見例如 WO 2002/020565)。

關於抗原結合分子，即抗體或其片段，術語「抗原結合域」是指分子之部分，其包含特異性結合抗原之部分或全部且與其互補之區域。可例如藉由一個或多個抗體可變域 (亦稱為抗體可變區) 提供能夠特異性結合抗原的抗原結合域。特定而言，能夠特異性結合抗原的抗原結合域包含抗體輕鏈可變區 (VL) 及抗體重鏈可變區 (VH)。在另一態樣中，「能夠與腫瘤相關抗原特異性結合之抗原結合域」亦可為 Fab 片段或 crossFab 片段。如本文中所使用的關於抗原結合域等的術語「第一」、「第二」或「第三」，係用於方便區分每一類型之部分何時存在多於一個。除非明確說明，否則使用此等術語並非旨在賦予部分特定之順序或方向。

本文中的術語「抗體」以最廣義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、單特異性抗體及多特異性抗體 (例如，雙特異性抗體) 及抗體片段，只要其等展示出預期抗原結合活性即可。

如本文所用的術語「 單株抗體」是指獲自實質上同源抗體群體之抗體，即群體中包含的受試者抗體係相同的及/或結合相同表位，但不包含，例如，含有天然生成之突變或產生於單株抗體製劑生產過程中的可能的變異體抗體，此等變異體通常係以少量存在。與典型地包括針對不同決定子 (表位) 之不同抗體的多株抗體製劑形成對比，單株抗體製劑中之各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。

如本文所使用之術語「 單特異性」抗體表示具有一個或多個結合位點之抗體，這些結合位點各自與相同抗原之相同表位結合。術語「 雙特異性」意指抗原結合分子能夠特異性結合至少二個不同的抗原決定位。通常，雙特異性抗原結合分子包含二個抗原結合位點，各該抗原結合位點對不同抗原決定位具有特異性。但是，雙特異性抗原結合分子亦可包含額外的抗原結合位點，這些抗原結合位點與其他抗原決定位結合。在某些態樣中，雙特異性抗原結合分子能夠同時結合兩個抗原決定位，特別是在兩種不同細胞或相同細胞上表現之兩個抗原決定位。因此，根據本發明之術語「 雙特異性」亦可包括三特異性分子，例如包含 CD28 抗體及靶向兩個不同標靶細胞抗原的雙特異性分子。

如本申請内所使用之術語「價」表示對一個不同的抗原決定位具有特異性的抗原結合分子中存在指定數量的對一個不同的抗原決定位具有特異性的結合位點。因此，術語「二價」、「四價」及「六價」分別表示抗原結合分子中存在對某個抗原決定位具有特異性的兩個結合位點、四個結合位點及六個結合位點。在本發明之特定樣態中，根據本發明之雙特異性抗原結合分子對某個抗原決定位可爲單價，意指它們針對該抗原決定位僅有一個結合位點，或者它們對某個抗原決定位可爲二價或四價，意指它們針對該抗原決定位分別具有兩個結合位點或四個結合位點。

術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，是指具有與天然抗體結構實質上類似的結構之抗體。「 天然抗體」是指具有不同結構的天然生成之免疫球蛋白分子。例如，天然 IgG 類抗體為約 150,000 個道耳頓的異四聚體糖蛋白，其由二條之輕鏈及二條之重鏈經二硫鍵鍵合所構成。從 N 端至 C 端，每條重鏈具有可變區 (VH)，亦稱為可變重鏈域或重鏈可變區，接著為三個恆定域 (CH1、CH2 及 CH3)，亦稱為重鏈恆定區。類似地，從 N 端至 C 端，每條輕鏈具有可變區 (VL)，亦稱為可變輕鏈域或輕鏈可變域，接著為輕鏈恆定域 (CL)，亦稱為輕鏈恆定區。抗體之重鏈可分配為五種類型之一，稱為 α (IgA)、δ (IgD)、ε (IgE)、γ (IgG) 或 μ (IgM)，其中一些可以進一步分為以下亞型，例如 γ1 (IgG1)、γ2 (IgG2)、γ3 (IgG3)、γ4 (IgG4)、α1 (IgA1) 及 α2 (IgA2)。基於其恆定域之胺基酸序列，抗體之輕鏈可被歸類為兩種類型中的一種，稱為卡帕 (κ) 及蘭姆達 (λ)。

「 抗體片段」是指除完整抗體以外的分子，其包含完整抗體的一部分，該完整抗體結合完整抗體所結合的抗原。抗體片段之實例包括但不限於 Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F (ab') ₂；雙抗體、三抗體、四抗體、crossFab 片段；線性抗體；單鏈抗體分子 (例如 scFv)；及單域抗體。關於某些抗體片段的綜述，參見 Hudson 等人，Nat Med 9，129-134 (2003)。關於 scFv 片段的綜述，請參見 Pluckthün，The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第 113 卷，Rosenburg 及 Moore 編，Springer-Verlag，New York，第 269-315 頁 (1994)；亦可參見 WO 93/16185；及美國專利第 5,571,894 號及第 5,587,458 號。關於包含補救受體結合表位殘基且具有增加的體內半衰期之 Fab 及 F(ab')2 片段的論述，參見美國第 5,869,046 號專利。雙抗體為具有兩個可爲二價或雙特異性的抗原結合位點的抗體片段，參見例如：EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson 等人，Nat Med 9，129-134 (2003)；及 Hollinger 等人，Proc Natl Acad Sci USA 90，6444-6448 (1993)。Hudson 等人，Nat Med 9，129-134 (2003) 中亦描述三功能抗體及四功能抗體。單域抗體為包含抗體之全部或部分重鏈可變域或抗體之全部或部分輕鏈可變域的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體 (Domantis, Inc.，Waltham, MA；參見例如美國第 6,248,516 B1 號專利)。抗體片段可透過各種技術製造，包括但不限於如本文所述之完整抗體的蛋白水解消化以及重組宿主細胞 (例如大腸桿菌或噬菌體) 的產生。

木瓜酶對完整抗體之消化產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，其各自包含重鏈和輕鏈變異域及輕鏈之恆定域和重鏈之第一恆定域 (CH1)。因此，如本文所用，術語「 Fab 片段」或「 Fab 分子」是指以下抗體片段，其包含：輕鏈片段，該輕鏈片段包含可變輕鏈 (VL) 域及輕鏈 (CL) 之恆定域，及可變重鏈 (VH) 域及重鏈之第一恆定域 (CH1)。Fab' 片段與 Fab 片段不同之處在於，在重鏈 CH1 域之羧基端添加幾個殘基，包括來自抗體樞紐區之一個或多個半胱胺酸。Fab’-SH 是 Fab’ 片段，其中恆定域的半胱胺酸殘基帶有一個游離硫醇基團。胃蛋白酶處理產生一個 F(ab') ₂片段，該片段具有兩個抗原結合位點 (兩個 Fab 片段) 及一部分 Fc 區域。「 習知的 Fab 片段」由 VL-CL 輕鏈及 VH-CH1 重鏈構成。

術語「 crossFab 片段」或「xFab 片段」或「交叉 Fab 片段」是指其中重鏈和輕鏈之可變區或恆定區發生交換的 Fab 片段。交叉 Fab 分子之兩個不同的鏈組成物是可能的，且包含於本發明之雙特異性抗體中：一方面，Fab 重鏈及輕鏈之可變區交換，即交叉 Fab 分子包含由輕鏈可變(VL) 域及重鏈恆定域 (CH1) 所構成之肽鏈，及由重鏈可變域 (VH) 及輕鏈恆定域 (CL) 所構成之肽鏈。該交叉 Fab 分子亦稱爲 CrossFab _(VLVH)。另一方面，當 Fab 重鏈及輕鏈之恒定區交換時，交叉 Fab 分子包含由重鏈可變域 (VH) 及輕鏈恆定域 (CL) 所構成之肽鏈，及由輕鏈可變域 (VL) 及重鏈恆定域 (CH1) 所構成之肽鏈。該交叉 Fab 分子亦稱爲 CrossFab _(CLCH1)。

「單鏈 Fab 片段」或「 scFab」為由抗體重鏈可變域 (VH)、抗體恆定域 1 (CH1)、抗體輕鏈可變域 (VL)、抗體輕鏈恆定域 (CL) 及連接子組成的多肽，其中該抗體域及該連接子在 N 端至 C 端方向具有以下序列之一：a) VH-CH1-連接子-VL-CL、b) VL-CL-連接子-VH-CH1、c) VH-CL-連接子-VL-CH1 或 d) VL-CH1-連接子-VH-CL；且其中該連接子為具有至少 30 個胺基酸 (較佳的是介於 32 個胺基酸和 50 個胺基酸之間) 的多肽。該單鏈 Fab 片段通過 CL 域與 CH1 域之間的天然二硫鍵達到穩定。此外，這些單鏈 Fab 分子可通過插入半胱胺酸殘基產生鏈間二硫鍵而得到進一步穩定 (例如根據 Kabat 編號，在可變重鏈之位置 44 及可變輕鏈之位置 100 處插入)。

「交叉單鏈 Fab 片段」或「 x-scFab」為由抗體重鏈可變域 (VH)、抗體恆定域 1 (CH1)、抗體輕鏈可變域 (VL)、抗體輕鏈恆定域 (CL) 及連接子組成的多肽，其中該抗體域及該連接子在 N 端至 C 端方向具有以下序列之一：a) VH-CL-連接子-VL-CH1 及 b) VL-CH1-連接子-VH-CL；其中 VH 及 VL 一起形成與抗原特異性結合的抗原結合位點，且其中該連接子為具有至少 30 個胺基酸的多肽。此外，這些 x-scFab 分子可通過插入半胱胺酸殘基產生鏈間二硫鍵而得到進一步穩定 (例如根據 Kabat 編號，在可變重鏈之位置 44 及可變輕鏈之位置 100 處插入)。

「 單鏈可變片段( scFv)」抗體之重鏈 (V _H) 及輕鏈 (V _L) 之可變區之融合蛋白，其通過具有 10 個至約 25 個胺基酸的短連接子肽連接。連接子富含甘胺酸以提高柔韌性，並含有絲胺酸或蘇胺酸以提高溶解性，並且可將 V _H之V _L端與 L 之 C 端連接，或反之亦然。儘管去除了恆定區並引入了連接子，但該蛋白質仍保留了原始抗病毒的特異性。scFv 抗體描述於例如以下文獻中：Houston, J.S.，Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96。此外，抗體片段包含具有 VH 域之特徵的單鏈多肽，即能夠與 VL 域組合在一起，或具有 VL 域之特徵，即能夠與 VH 域組合形成功能性抗原結合位點，從而提供全長抗體之抗原結合特性。

「 支架抗原結合蛋白」為本領域所知，例如纖連蛋白及經設計之錨蛋白重複蛋白 (DARPins) 已被用爲抗原結合域之替代天然支架，參見例如以下文獻：Gebauer 及 Skerra，Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics.Curr Opin Chem Biol 13: 245-255 (2009)；及 Stumpp 等人，Darpins: A new generation of protein therapeutics.Drug Discovery Today 13: 695-701 (2008)。在本發明之一個態樣中，支架抗原結合蛋白選自由下列各項所組成之群組：CTLA-4 (Evibody)，脂質運載蛋白 (Anticalin)，蛋白 A 衍生分子 (例如蛋白 A 之 Z 域 (Affibody))，A 域 (Avimer/Maxibody)，血清轉鐵蛋白 (反式体)；經設計之錨蛋白重複蛋白 (DARPin)，抗體輕鏈或重鏈 (單域抗體，sdAb)，抗體重鏈之可變域 (奈米體，aVH)，V _NAR片段，纖連蛋白 (AdNectin)，C 型凝集素域 (Tetranectin)；新型抗原受體 β-內酰胺酶之可變域 (V _NAR)，人類 γ-晶狀體蛋白或泛素 (Affili n分子)；人類蛋白酶抑制劑之 kunitz 型域，微體 (例如來自 knottin 家族的蛋白質)，肽適體及纖連蛋白 (adnectin)。CTLA-4 (細胞毒性 T 淋巴細胞相關抗原 4) 是一種 CD28 家族受體，主要在 CD4 ⁺T 細胞上表現。其胞外域具有類似於可變域之 Ig 折疊。與抗體之 CDR 對應的環可經異源序列取代，以賦予其不同的結合特性。經工程改造成具有不同結合特異性的 CTLA-4 分子亦稱為 Evibody (例如 US7166697B1)。Evibody 之大小與抗體 (例如域抗體) 之經分離的可變區大致相同。更多詳情參見：Journal of Immunological Methods 248 (1-2)，31-45 (2001)。脂質運載蛋白是一個胞外蛋白家族，可運輸疏水性小分子，例如類固醇、膽鹼、類視黃醇及脂質。它們具有剛性 β-折疊二級結構，在錐形結構之開放端有許多環，可經工程改造成與不同的靶抗原結合。Anticalin 之大小為 160-180 個胺基酸，其衍生自脂質運載蛋白。更多詳情參見：Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)；US7250297B1；及 US20070224633。Affibody 為衍生自金黃色葡萄球菌蛋白 A 的支架，可經工程改造成與抗原結合。該域由大約 58 個胺基酸的三螺旋束組成。已藉由表面殘基之隨機化生成文庫。更多詳情參見：Protein Eng. Des. Sel.2004，17，455-462；及 EP 1641818A1。Avimers 為衍生自 A 域支架家族的多域蛋白。大約 35 個胺基酸的天然域採用確定的二硫鍵結構。藉由 A 域家族所表現出的自然變異之改組產生多樣性。更多詳情參見：Nature Biotechnology 23(12)，1556 - 1561 (2005)；及 Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6)，909-917 (2007 年 6 月)。轉鐵蛋白是一種單體血清轉運糖蛋白。轉鐵蛋白可經工程改造，藉由在允許的表面環中插入肽序列以結合不同的標靶抗原。經工程改造支架之轉鐵蛋白支架的實例包括反式体。更多詳情參見：J. Biol. Chem 274，24066-24073 (1999)。經設計之錨蛋白重複蛋白 (DARPin) 衍生自錨蛋白 (媒介完整膜蛋白與細胞骨架之連接的蛋白質家族)。單個錨蛋白重複序列為由兩個 α 螺旋及一個 β 轉折組成的 33 個殘基基序。它們可經工程改造，藉由每個重複的第一 α 螺旋及 β 轉折中之殘基之隨機化以結合不同的標靶抗原。它們的結合界面可藉由增加模塊數量 (一種親和力成熟方法) 來增加。更多詳情參見：J. Mol. Biol. 332，489-503 (2003)，PNAS 100(4)，1700-1705 (2003)；及 J. Mol. Biol. 369，1015-1028 (2007)；及 US20040132028A1.單域抗體為由單個單價可變抗體域組成的抗體片段。第一單域衍生自駱駝科動物之抗體重鏈之可變域 (奈米體或 V _HH 片段)。此外，術語單域抗體包括人類自體的重鏈可變域 (aVH) 或源自鯊魚的 V _NAR片段。纖連蛋白是一種可經工程改造成與抗原結合的支架。Adnectin 由人類纖連蛋白 III 型 (FN3) 之 15 個重複單元之第 10 域之天然胺基酸序列之骨架組成。β-夾層一端的三個環可經工程改造以使 Adnectin 能夠特異性識別所關注之治療標靶。更多詳情參見：Protein Eng. Des. Sel.18，435-444 (2005)；US20080139791；WO2005056764；及 US6818418B1。肽適體為組合識別分子，由恆定支架蛋白組成，其通常是包含插入在活性位點的受限可變肽環的硫氧還蛋白 (TrxA)。更多詳情參見：Expert Opin. Biol. Ther. 5，783-797 (2005)。微體來源於長度為 25-50 個胺基酸的天然微生物蛋白，其含有 3-4 個半胱胺酸橋，微生物蛋白的實例包括 KalataBI、芋螺毒素及 knottin。微生物蛋白具有環，該環可經工程改造成包含多達 25 個胺基酸，而不影響微生物蛋白的整體折疊。經工程改造之 knottin 域的更多詳情參見 WO2008098796。

與參考分子「 與相同表位結合至抗原結合分子」是指以下抗原結合分子，其在競爭性測定中阻斷參考分子與其抗原結合 50% 或更多，且反之，參考分子在競爭性測定中阻斷該抗原結合分子與其抗原結合 50% 或更多。

術語「 抗原結合域(antigen binding domain)」是指抗原結合分子之部分，其包含特異性結合抗原之部分或全部且與其互補之區。當抗原較大時，抗原結合分子只能與抗原之特定部分結合，該部分稱為表位。抗原結合域可由例如一個或多個可變域 (亦稱為可變區) 提供。較佳的是，抗原結合域包含抗體輕鏈可變域 (VL) 及抗體重鏈可變域 (VH)。

如本文中所使用的術語「 抗原決定位(antigenic determinant)」與「抗原」及「表位 (epitope)」同義，且係指抗原結合部分結合的多肽大分子上的形成抗原結合部分-抗原複合物之位點 (例如，胺基酸之連續延伸或由非連續胺基酸之不同區域構成的構象構型)。例如，可用之抗原決定位可存在於腫瘤細胞之表面上、受病毒感染之細胞之表面上、其他疾病細胞之表面上、免疫細胞的表面上，不存在於血清中，及/或存在於細胞外基質 (ECM) 中。除非另有說明，否則本文中有用的作為抗原的蛋白質可以是來自任何脊椎動物來源的任何天然形式的蛋白質，該脊椎動物包括哺乳動物，例如靈長類動物 (例如人) 及囓齒類動物 (例如小鼠和大鼠)。在特定實施例中，該抗原為人類蛋白質。在本文中提及特定蛋白質的情況下，該術語涵蓋「全長」、未處理之蛋白質及由在細胞中處理所產生之任何蛋白質形式。該術語亦涵蓋天然生成之蛋白質變異體例如剪接變異體或對偶基因變異體。

「 特異性結合」意指結合對抗原具有選擇性且可區分出非所欲或非特定之相互作用。抗原結合分子結合特異性抗原之能力可藉由酶聯免疫吸附檢定 (ELISA) 或本領域技術人員所熟悉的其他技術，例如表面電漿共振 (SPR) 技術 (於 BIAcore 儀器上分析) (Liljeblad 等人，Glyco J 17, 323-329 (2000)) 及傳統的結合檢定 (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)) 來量測。在一個實施例中，抗原結合分子與無關的蛋白質的結合程度低於該抗原結合分子與抗原的結合程度的約 10%，例如藉由 SPR 所量測。在某些實施例中，與抗原結合之分子之解離常數 (Kd) 為 ≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM 或 ≤ 0.001 nM (例如 10 ^-8M 或更小，例如 10 ^-8M 至 10 ^-13M，例如 10 ^-9M 至 10 ^-13M)。

「 親和力」或「結合親和力」是指分子 (例如抗體) 之單一結合位點與其結合搭配物 (例如抗原) 之間的非共價交互作用總和的強度。除非另有說明，否則如本文中所使用的「結合親和力」是指反映結合對成員 (例如抗體及抗原) 之間 1:1 交互作用之內在結合親和力。分子 X 對其搭配物 Y 之親和力通常可以解離常數 (Kd) 表示，其是解離速率常數與締合速率常數 (分別為 koff 及 kon) 之比。因此，等效親和力可包括不同速率常數，只要速率常數比保持相同即可。可以藉由本領域已知的常規方法測定親和力，包括彼等本文所述之方法。用於測定親和力之特定方法為表面電漿子共振 (SPR)。

如本文所使用之「 T 細胞抗原」是指 T 淋巴細胞 (特定而言，細胞毒性 T 淋巴細胞) 表面所呈現的抗原決定位。

如本文所使用之「 T 細胞活化治療劑」是指能夠在受試者中誘導 T 細胞活化的治療劑，特定而言，設計用於在受試者中誘導 T 細胞活化的治療劑。T 細胞活化治療劑的實例包括特異性結合活化 T 細胞抗原(例如 CD3) 及另一種抗原 (例如 CD28) 的雙特異性抗體。

如本文中所使用之「活化 T 細胞抗原(activating T cell antigen)」是指由 T 淋巴細胞 (特定而言，細胞毒性 T 淋巴細胞) 所表現之抗原決定位，其能夠在與抗原結合分子相互作用時誘導或增强 T 細胞活化。具體而言，抗原結合分子與活化 T 細胞抗原之相互作用可藉由觸發 T 細胞受體複合物之傳訊級聯來誘導 T 細胞活化。一種例示性活化 T 細胞抗原為 CD3。

除非另有說明，否則術語「 CD3」是指來自任何脊椎動物來源之任何天然 CD3，該脊椎動物包括哺乳動物，例如靈長類動物 (例如人類)、非人類靈長類動物 (例如食蟹獼猴) 及囓齒動物 (例如小鼠和大鼠)。該術語涵蓋「全長」、未處理之 CD3 以及在細胞處理中得到的任何形式的 CD3。該術語亦涵蓋天然生成之 CD3 變異體，例如，剪接變異體或對偶基因變異體。在一個實施例中，CD3 為人類CD3，特定而言，為人類CD3 之 ε 次單元 (CD3ε)。人類CD3ε 之胺基酸序列顯示於 UniProt (www.uniprot.org) 登錄編號 P07766 (版本 144) 或 NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_000724.1 中。另見 SEQ ID NO: 70。食蟹獼猴 [Macaca fascicularis] CD3ε 之胺基酸序列顯示於 NCBI GenBank 編號 BAB71849.1 中。另見 SEQ ID NO: 71。

除非另有說明，否則術語「 CD28」 (分化簇 28，Tp44) 是指來自任何脊椎動物來源之任何 CD28，該脊椎動物包括哺乳動物，例如靈長類動物 (例如人類)、非人類靈長類動物 (例如食蟹獼猴) 及囓齒動物 (例如小鼠和大鼠)。CD28 在 T 細胞上表現並提供 T 細胞活化及存活所需之共刺激信號。除 T 細胞受體 (TCR) 以外，通過 CD28 所實現之 T 細胞刺激可為各種介白素之產生提供有效的信號。CD28 為 CD80 (B7.1) 及 CD86 (B7.2) 蛋白質的受體，且為天然 T 細胞上所組成型表現之唯一 B7 受體。人類CD28 之胺基酸序列顯示於 UniProt (www.uniprot.org) 登錄編號 P10747 (SEQ ID NO:1) 中。

「 促效性抗體」是指包含針對給定受體之促效性功能的抗體。一般而言，當促效劑配體 (因子) 與受體結合時，受體蛋白之三級結構發生變化，且受體被活化 (當受體為膜蛋白時，通常轉導細胞生長信號等)。如果受體為形成二聚體的類型，則促效性抗體可在適當之距離及角度使受體二聚化，從而起到類似於配體的作用。適當之抗受體抗體可模擬藉由配體所執行之受體的二聚化，從而可成爲促效性抗體。

「 CD28 促效性抗原結合分子」或「CD28 習知的促效性抗原結合分子」為以下抗原結合分子，其模擬 CD28 天然配體 (CD80 或 CD86) 在 T 細胞受體信號 (「信號 2」) 存在下增強 T 細胞活化的作用。T 細胞需要兩種信號以完全活化。在生理條件下，「信號 1」由 T 細胞受體 (TCR) 分子與抗原呈現細胞 (APC) 上之肽/主要組織相容性複合物 (MHC) 之相互作用產生，且「信號 2」藉由共刺激受體 (例如 CD28) 之參與提供。CD28 促效性抗原結合分子能夠共刺激 T 細胞 (信號 2)。它亦可與對 TCR 複合物具有特異性之分子結合誘導 T 細胞增殖及細胞介素分泌，但 CD28 促效性抗原結合分子在不經 TCR 之額外刺激的情況下不能完全活化 T 細胞。但是存在一個 CD28 特異性抗原結合分子亞類，即所謂 CD28 超促效性抗原結合分子。「 CD28 超促效性抗原結合分子」是一種無需 TCR 之額外刺激即可完全活化 T 細胞的 CD28 抗原結合分子。CD28 超促效性抗原結合分子能夠在未經事先 T 細胞活化 (信號 1) 的情況下誘導 T 細胞增殖及細胞介素分泌。

如本文所使用之「 個體遺傳型特異性多肽」是指識別抗原結合域 (例如，對 CD3 具有特異性的抗原結合域) 之個體遺傳型的多肽。個體遺傳型特異性多肽能夠與抗原結合域之可變區特異性結合，從而減少或阻止抗原結合域與其同源抗原之特異性結合。當涉及包含抗原結合域的分子時，個體遺傳型特異性多肽可用作該分子的掩蔽部分。具體而言，本文揭示了一種對抗 CD3 結合分子之個體遺傳型具有特異性的抗個體遺傳型抗體或抗個體遺傳型結合抗體片段。

如本文所使用之「 蛋白酶」或「蛋白水解酶」是指在識別位點切割連接子並由標靶細胞表現的任何蛋白水解酶。該等蛋白酶可由標靶細胞分泌或與標靶細胞保持關聯，例如，在標靶細胞表面上。蛋白酶之實例包括但不限於金屬蛋白酶，例如基質金屬蛋白酶 1-28 及 A 分解素及金屬蛋白酶 (ADAM) 2、7-12、15、17-23、28-30 及 33、絲胺酸蛋白酶 (例如尿激酶型纖溶酶原活化劑及 Matriptase)、半胱胺酸蛋白酶、天冬胺酸蛋白酶及組織蛋白酶家族之成員。人類 Matriptase 之一個特定實例包含 SEQ ID NO:164 之胺基酸序列。

如本文所使用之關於雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子「 可蛋白酶活化」是指具有降低或消除活化 T 細胞之能力的雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，因爲其具有降低或消除雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子與 CD3 之結合的能力的掩蔽部分。藉由蛋白酶切割以解離掩蔽部分，例如藉由蛋白酶切割將掩蔽部分連接至雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子的連接子，恢復與 CD3 之結合，從而使 T 細胞活化雙特異性分子被活化。

如本文所使用之「 可逆地隱蔽」是指掩蔽部分或個體遺傳型特異性多肽與抗原結合域或分子之結合，例如以防止抗原結合域或分子與其抗原 (例如 CD3) 之結合。該隱蔽為可逆的，因為個體遺傳型特異性多肽可從抗原結合域或分子中釋放出來，例如藉由蛋白酶切割，從而釋放出與其抗原結合之抗原結合域或分子。

術語「 可變域」或「可變區」是指參與抗原結合分子與抗原之結合的抗體重鏈域或輕鏈域。天然抗體之重鏈及輕鏈 (分別為 VH 及 VL) 之可變域通常具有類似的結構，且每個域均包含四個保留性骨架區 (FR) 及三個高度可變區 (HVR)。參見例如：Kindt 等人，Kuby Immunology，第 6 版，W.H. Freeman and Co.，第 91 頁 (2007)。單個 VH 或 VL 域可能足以賦予抗原結合特異性。

如本文所用，術語「高度可變區」或「HVR」是指抗原結合可變域中序列高度可變並決定抗原結合特異性的各個區，例如「互補決定區」(「CDR」)。通常，抗原結合域包含六個 CDR：三個在 VH 中 (CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，三個在 VL 中 (CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。在本文中，例示性 CDR 包括： (a) 高度可變環存在於胺基酸殘基 26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、及 96-101 (H3) 處 (Chothia 及 Lesk， J. Mol. Biol.196:901-917 (1987))； (b) CDR 存在於胺基酸殘基 24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、及 95-102 (H3)處 (Kabat 等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda, MD (1991))；及 (c) 抗原接觸存在於胺基酸殘基 27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、及 93-101 (H3) 處 (MacCallum 等人 J. Mol. Biol.262: 732-745 (1996))。

除非另有說明，否則 CDR 根據 Kabat 等人在上述文獻中所述之方法來確定。本領域之技術人員將理解，也可以根據 Chothia 在上述文獻、McCallum 在上述文獻中所述之方法或任何其他科學上接受之命名法來確定 CDR 名稱。Kabat 等人亦定義了適用於任何抗體的可變區序列之編號系統。本領域之普通技術人員可明確地將該「Kabat 編號」系統分配給任何可變區序列，而不依賴序列本身以外的任何實驗數據。如本文所用，「Kabat 編號」是指 Kabat 等人 (U.S. Dept. of Health and Human Services, 「Sequence of Proteins of Immunological Interest」 (1983)) 所述之編號系統。除非另有說明，對抗體可變區中特定胺基酸殘基位置之編號的引用根據 Kabat 編號系統進行。

如本文所使用之，在抗原結合分子 (例如，抗體) 背景下的術語「 親和力成熟」是指來源於抗原結合分子 (例如，藉由突變) 的抗原結合分子與參考抗體結合至相同抗原，較佳的是結合至相同表位；且具有高於參考抗原結合分子的親和力。親和力成熟通常涉及抗原結合分子之一個或多個 CDR 中之一個或多個胺基酸殘基之修飾。通常，親和力成熟之抗原結合分子與初始參考抗原結合分子結合至相同的表位。

「骨架(framework)」或「FR」是指除高度可變區 (hypervariable region) (HVR) 殘基之外的可變域殘基。可變域之 FR 通常由四個 FR 域組成：FR1、FR2、FR3 及 FR4。因此，HVR 及 FR 序列通常以如下順序出現在 VH (或 VL) 中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

就本文目的而言，「 接受者人類骨架(acceptor human framework)」是包含衍生自人類免疫球蛋白骨架或人類共通骨架的輕鏈可變域 (VL) 骨架或重鏈可變域 (VH) 骨架的胺基酸序列的骨架，如下定義。「衍生自」人類免疫球蛋白骨架或人類共通骨架的接受者人類骨架可包含其相同的胺基酸序列，或者其可含有胺基酸序列變化。於一些實施例中，胺基酸變更數目為 10 或更少、9 或更少、8 或更少、7 或更少、6 或更少、5 或更少、4 或更少、3 或更少、或 2 或更少。於一些實施例中，VL 受體人類骨架與 VL 人類免疫球蛋白骨架序列或人類共通骨架序列的序列相同。

術語「嵌合」抗體指代其中重鏈及/或輕鏈的一部分源自特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈的其餘部分源自不同來源或物種的抗體。

抗體之「類別(class)」係指為其重鏈所具有的恆定域或恆定區之類型。有五大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG 及 IgM，且彼等中的幾種可進一步分為次類 (同型 (isotype))，例如 IgG ₁、IgG ₂、IgG ₃、IgG ₄、IgA ₁及 IgA ₂。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為 α、δ、ε、γ 及 μ。

「 人源化(humanized)」抗體是指包含來自非人類HVR 之胺基酸殘基及來自人類FR 之胺基酸殘基之嵌合抗體。在某些實施例中，人源化抗體將包括實質上所有至少一個 (且通常兩個) 可變域，其中所有或實質上所有 HVR (例如 CDR) 對應於非人類抗體之其等，及所有或實質上所有 FR 對應對於人類抗體之其等。人源化抗體視情況可包含衍生自人類抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體 (例如非人抗體) 之「 人源化形式(humanized form)」是指已經歷人源化之抗體。本發明所涵蓋的「人源化抗體 (humanized antibody)」之其他形式為其中恆定區已自原始抗體之形式另外修飾或改變者，以產生根據本發明之性質、尤其關於 C1q 結合及/或 Fc 受體 (FcR) 結合之性質。

「 人類抗體(human antibody)」為具有胺基酸序列之抗體，該胺基酸序列對應於由人類或人體細胞產生或自利用人類抗體譜系 (antibody repertoire) 或其他人類抗體編碼序列之非人類來源衍生之抗體之胺基酸序列。人類抗體的該定義特定地排除包含非人類抗原結合殘基之人源化抗體。

術語「 CH1 域」表示抗體重鏈多肽之部分，其約從 EU 位置 118 延伸至 EU 位置 215 (根據 Kabat 所述之 EU 編號系統)。在一個態樣中，CH1 域具有 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKV (SEQ ID NO: 165) 之胺基酸序列。通常，後接具有 EPKSC (SEQ ID NO:168) 之胺基酸序列的片段以將 CH1 域連接至樞紐區，

術語「 樞紐區」表示抗體重鏈多肽之部分，其加入野生型抗體重鏈 CH1 域及 CH2 域 (例如，根據 Kabat 之 EU 編號系統，從約位置 216 至約位置 230；或根據 Kabat 之 EU 編號系統，從約位置 226 至約位置 230)。其他 IgG 亞類之樞紐區可藉由與 IgG1 亞類序列之樞紐區半胱胺酸殘基比對來確定。樞紐區通常是由兩個完全相同的胺基酸序列的多肽所組成之二聚體分子。樞紐區通常包含多達 25 個胺基酸殘基並且是彈性的，允許相關標靶結合位點獨立移動。樞紐區可細分為三個域：上樞紐域、中樞紐域及下樞紐域 (參見例如 Roux 等人，J. Immunol. 161 (1998) 4083)。

在一個態樣中，樞紐區具有胺基酸序列 DKTHTCPXCP (SEQ ID NO: 169)，其中 X 為 S 或 P。在一個態樣中，樞紐區具有胺基酸序列 HTCPXCP (SEQ ID NO: 170)，其中 X 為 S 或 P。在一個態樣中，樞紐區具有胺基酸序列 CPXCP (SEQ ID NO:171)，其中 X 為 S 或 P。

本文中之術語「 Fc 域」或「Fc 區域」用於定義包含至少一部分恆定區的抗體重鏈之 C 端區域。該術語包括天然序列 Fc 區域和變異 Fc 區域。IgG Fc 區域包含 IgG CH2 及 IgG CH3 域。

人類IgG Fc 區域之「CH2 域」通常從約 EU 位置 231 處之胺基酸殘基延伸至約 EU 位置 340 處之胺基酸殘基 (根據 Kabat 所述之 EU 編號系統)。在一個態樣中，CH2 域具有 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQESTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAK (SEQ ID NO: 166) 之胺基酸序列。CH2 域的獨特之處在於其沒有與另一域緊密配對。而是，兩個 N 連接之分支碳水化合物鏈插入完整天然 Fc 區域之兩個 CH2 域之間。經推測，碳水化合物可提供該域-域配對的替代物，並有助於穩定 CH2 域。Burton, Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206。在一個實施例中，碳水化合物鏈連接至 CH2 域。本文中之 CH2 域可為天然序列 CH2 域或變異體 CH2 域。

「CH3 域」包含 Fc 區域中之 C 端至 CH2 域的一段殘基，表示抗體重鏈多肽之部分，該部分約從 EU 位置 341 延伸至 EU 位置 446 (根據 Kabat 所述之 EU 編號系統)。在一個態樣中，CH3 域具有 GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG (SEQ ID NO: 167) 之胺基酸序列。本文之 CH3 區可為天然序列 CH3 域或變異體 CH3 域 (例如一個 CH3 域，在其一條鏈中引入「突起」 (「杵」)，並在其另一條鏈中引入相應的「空腔」 (「臼」)；參見美國第 5,821,333 號專利，該專利明確地以引用方式併入本文)。該等變異體 CH3 域可用於促進如本文所述之兩個不同抗體重鏈之異源二聚化。於一個實施例中，人類IgG 重鏈 Fc 區域從 Cys226 或 Pro230 延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc 區域的 C 端離胺酸 (Lys447) 可以存在或可以不存在。除非本文另有說明，否則 Fc 區或恆定區中胺基酸殘基之編號根據 EU 編號系統 (亦稱為 EU 索引) 進行，如 Kabat 等人所述 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 5 版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)。

「杵臼」技術描述於例如：US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway 等人，Prot Eng 9，617-621 (1996)；及 Carter，J Immunol Meth 248，7-15 (2001)。通常，該方法包括在第一多肽之界面處引入一個突起 (「杵」)，並且在第二多肽之界面中引入一個對應的空腔 (「臼」)，以使該突起可定位於空腔中，從而促進異源二聚體形成並阻礙同源二聚體形成。透過用較大支鏈 (例如酪胺酸或色胺酸) 替換第一多肽界面上之較小的胺基酸支鏈來構建突起。透過將較大胺基酸支鏈替換為較小的胺基酸支鏈 (例如丙胺酸或蘇胺酸)，在第二多肽之界面中形成與突起具有相同或相近大小的互補空腔。可透過改變編碼多肽的核酸 (例如透過針對特定位點之突變或透過肽合成) 來製備突起和空腔。在一個具體實施例中，杵修飾包含 Fc 域之兩個次單元中之一的胺基酸基 T366W，及 Fc 域之兩個次單元中之另一個的胺基酸取代 T366S、L368A 及 Y407V。在另一具體實施例中，包含杵修飾之 Fc 域之次單元另外包含胺基酸取代 S354C，且包含臼修飾之 Fc 域之次單元另外包含胺基酸取代 Y349C。引入這兩個半胱胺酸殘基導致在 Fc 區域之兩個次單元之間形成二硫鍵，由此進一步穩定二聚體 (Carter，J Immunol Methods 248，7-15 (2001))。

「與免疫球蛋白之 Fc 區域等同之區域」旨在包括免疫球蛋白之 Fc 區域之天然對偶基因變異體，以及具有產生取代、添加或缺失但不顯著降低免疫球蛋白媒介效應子功能 (例如抗體依賴性細胞毒性) 之能力的修改的變異體。例如，一種或多種胺基酸可從免疫球蛋白之 Fc 區域之 N 端或 C 端缺失，而不產生實質性生物功能損失。該等變異體可根據本領域中所知之一般規則來選擇，以便最大程度減少對活性之影響 (參見例如： Bowie, J. U. 等人，Science 247:1306-10 (1990))。

術語「 野生型 Fc 域」包含與自然界中發現的 Fc 域之胺基酸序列相同的胺基酸序列。野生型人類Fc 域包括天然人類IgG1 Fc 區域 (非 A 異型及 A 異型)、天然人類IgG2 Fc 區域、天然人類IgG3 Fc 區域及天然人類IgG4 Fc 區域及其天然變異體。野生型 Fc 區以 SEQ ID NO: 172 (IgG1，高加索人異型)、SEQ ID NO: 173 (IgG1，非裔美國人異型)、SEQ ID NO: 174 (IgG2)、SEQ ID NO: 175 (IgG3) 及 SEQ ID NO:176 (IgG4) 表示。

術語「 變異體 ( 人類 ) Fc 域」表示由於至少一處「胺基酸突變」而不同於「野生型」 (人類) Fc 域的胺基酸序列。在一個態樣中，變異體Fc 區域相比於天然 Fc 區域具有至少一處胺基酸突變，例如具有約一處至約十處胺基酸突變，且在一個態樣中，相比於天然 Fc 區域具有約一處至約五處胺基酸突變。在一個態樣中，(變異體) Fc 區域與野生型 Fc 區域具有至少約 95% 的同源性。

術語「 效應子功能」是指歸因於抗體之 Fc 區域的那些生物活性，其隨抗體同型而變化。抗體效應子功能的實例包括：C1q 結合及補體依賴性細胞毒性 (CDC)、Fc 受體結合、抗體依賴型細胞媒介的細胞毒性 (ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用 (ADCP)、細胞介素分泌、抗原呈現細胞攝取之免疫複合物媒介抗原、細胞表面受體 (例如，B 細胞受體) 下調及 B 細胞活化。

Fc受體結合依賴性效應子功能可以藉由抗體的Fc區與Fc受體(FcR)的相互作用來進行媒介，Fc受體是造血細胞上的特化細胞表面受體。Fc 受體屬於免疫球蛋白超家族，並且已顯示其藉由免疫複合物的吞噬作用來中介抗體包覆之病原體的去除，以及其經由抗體依賴性的細胞媒介之細胞毒性 (ADCC)，中介包覆有相應抗體之紅血球及各種其他細胞標的 (例如腫瘤細胞) 的裂解 (參見，例如 Van de Winkel, J.G. 及 Anderson, C.L., J. Leukoc.Biol. 49 (1991) 511-524)。FcR由其對免疫球蛋白同型的特異性來定義：對於IgG抗體的Fc受體稱為FcγR。Fc受體結合被描述於例如Ravetch, J.V.和Kinet, J.P.，Immunol. 9 (1991) 457-492；Capel, P.J.等人，Immunomethods 4 (1994) 25-34；de Haas, M.等人，J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341；以及Gessner, J.E.等人Ann. Hematol.76 (1998) 231-248。

對於IgG抗體(FcγR)之Fc區域的受體交聯，可觸發廣泛多樣的效應子功能，包括吞噬作用、抗體依賴性細胞毒性、及發炎介質的釋放以及免疫複合物的清除和抗體產生的調節。在人類中，已特徵出三類FcγR，其為： - FcγRI (CD64) 以高親和力結合單體 IgG，並表現於巨噬細胞、單核球、嗜中性白血球及嗜酸性球上。在 Fc 區域的 IgG 中至少一個胺基酸殘基 E233-G236、P238、D265、N297、A327 及 P329 (根據 Kabat 的 EU 索引引編號) 的修飾，會降低與FcγRI的結合。IgG2 殘基在位置 233–236 處經 IgG1 及 IgG4 取代，與 FcγRI 的結合降低 10³ 倍，且消除了人類單核球對抗體致敏之紅血球細胞的反應 (Armour, K.L. 等人，Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613–2624)。 -FcγRII (CD32) 以中至低親和力結合複合 IgG，並廣泛地表現。此受體可分為兩種亞型，即 FcγRIIA 及 FcγRIIB。FcγRIIA 存在於參與殺傷的許多細胞 (例如巨噬細胞、單核球、嗜中性白血球)中，且似乎能夠活化殺傷過程。FcγRIIB 似乎在抑制過程中起作用，且存在於 B 細胞、巨噬細胞以及肥大細胞和嗜酸性球上。在 B 細胞上，它似乎具有抑制免疫球蛋白進一步產生及同型轉換為例如 IgE 類的功能。在巨噬細胞上，FcγRIIB可抑制透過FcγRIIA中介的吞噬作用。在嗜酸性球及肥大細胞上，B 型可能透過 IgE 與其獨立受體之結合而有助於抑制這些細胞之活化。例如，已發現包含 IgG Fc 區域的抗體與 FcγRIIA 的結合降低，該 Fc 區域具有至少一個胺基酸殘基 E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292 及 K414 (根據 Kabat EU 索引編號) 突變。 - FcγRIII (CD16) 以中至低親和力結合 IgG，並以兩種類型存在。FcγRIIIA 存在於 NK 細胞、巨噬細胞、嗜酸性球及一些單核細胞和 T 細胞上，並媒介 ADCC。FcγRIIIB 在嗜中性球上高度表現。例如，已發現包含存在突變的 IgG Fc 區域的抗體與 FcγRIIIA 之結合減少，該突變發生於至少一個胺基酸殘基 E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338 及 D376 處 (根據 Kabat EU 索引編號)。

對人類IgG1 上與 Fc 受體的結合位點進行定位，上述突變位點以及測定與 FcγRI 和 FcγRIIA 結合的方法，描述於 Shields, R.L. 等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604 中。

術語「 ADCC」或「抗體依賴性細胞毒性」為一種免疫機制，其導致免疫效應子細胞裂解經抗體塗布的標靶細胞。標靶細胞為抗體或其衍生物包含 Fc 區的細胞，其通常透過作爲 N 端的蛋白質部分與 Fc 區特異性結合。如本文中所使用之術語「減少 ADCC」是指藉由上文所定義之 ADCC 機制在給定時間內以標靶細胞周圍之培養基中給定濃度的抗體在給定時間內裂解的標靶細胞數量的減少，及/或藉由 ADCC 機制在給定時間內實現給定數量之標靶細胞之裂解所需的標靶細胞周圍之培養基中抗體濃度的增加。ADCC 的減少相對於使用相同標準生產、純化、配製和儲存方法 (本技術領域具有通常知識者已知的方法) 由相同類型的宿主細胞所生產的相同抗體 (但尚未工程化) 所媒介的 ADCC。例如，由 Fc 域中包含減少 ADCC 的胺基酸取代的抗體所媒介的 ADCC 的減少為相對於在 Fc 域中不含此胺基酸取代的相同抗體所媒介的 ADCC。用於測定 ADCC 的合適的測定法為本技術領域中熟知的 (參見例如 PCT 公開號 WO 2006/082515 或 PCT 公開號 WO 2012/130831)。例如，藉由測定抗體與 Fcγ 受體所表現之細胞 (例如重組表現 FcγRI 及/或 FcγRIIA 之細胞或 NK 細胞 (基本上表現 FcγRIIIA)) 之結合，來研究抗體誘導中介 ADCC 之初始步驟的能力。特定而言，測定與 NK 細胞上 FcγR 之結合。

「活化 Fc 受體」為在抗體之 Fc 區域參與之後引起刺激受體攜帶細胞執行效應子功能的信號轉導事件的 Fc 受體。活化 Fc 受體包括 FcγRIIIa (CD16a)、FcγRI (CD64)、FcγRIIa (CD32) 及 FcαRI (CD89)。一個特定活化 Fc 受體為人類 FcγRIIIa (SEQ ID NO:177，UniProt 登錄編號 P08637，版本 141)。

「 胞外域」為延伸至細胞外空間 (即標靶細胞之外的空間) 的膜蛋白的域。胞外域通常是蛋白質的一部分，其引發與表面之接觸，導致信號轉導。

術語「 肽連接子」是指包含一個或多個胺基酸 (通常為 2 個至 20 個胺基酸) 的肽。肽連接子為本領域所熟知或如本文所述。適合的非免疫原性連接子肽為例如 (G ₄S) _n、(SG ₄) _n或 G ₄(SG ₄) _n肽連接子，其中「n」通常爲介於 1 至 5 之間 (通常介於 2 至 4 之間，特別是 2) 的數字，即該等肽選自由下列各項所組成之群組：GGGGS (SEQ ID NO:178) GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:179)、SGGGGSGGGG (SEQ ID NO:180) 及 GGGGSGGGGSGGGG (SEQ ID NO:183)，但并不包括序列 GSPGSSSSGS (SEQ ID NO:182)、(G4S) ₃(SEQ ID NO:183)、(G4S) ₄(SEQ ID NO:184)、GSGSGSGS (SEQ ID NO:185)、GSGSGNGS (SEQ ID NO:186)、GGSGSGSG (SEQ ID NO:187)、GGSGSG (SEQ ID NO:188)、GGSG (SEQ ID NO:189)、GGSGNGSG (SEQ ID NO:190)、GGNGSGSG (SEQ ID NO:191) 及 GGNGSG (SEQ ID NO:192)。特別受關注之肽連接子為 (G4S) (SEQ ID NO:178)、(G ₄S) ₂或 GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:179)、(G4S) ₃(SEQ ID NO:183) 及 (G4S) ₄(SEQ ID NO:184)。一個特定之肽連接子組為本文所述之蛋白酶可切割連接子。

如本申請内所用之術語「 胺基酸」是指一組天然羧基 α-胺基酸，其包含丙胺酸 (三字母代碼：ala，單字母代碼：A)、精胺酸 (arg, R)、天冬醯胺酸 (asn, N)、天冬胺酸 (asp, D)、半胱胺酸 (cys, C)、麩醯胺酸 (gln, Q)、麩胺酸 (glu, E)、甘胺酸 (gly, G)、組胺酸 (his, H)、異白胺酸 (ile, I)、白胺酸 (leu, L)、離胺酸 (lys, K)、甲硫胺酸 (met, M)、苯丙胺酸 (phe, F)、脯胺酸 (pro, P)、絲胺酸 (ser, S)、蘇胺酸 (thr, T)、色胺酸 (trp, W)、酪胺酸 (tyr, Y) 及纈胺酸 (val, V)。

「融合」或「連接」意指組分 (例如多肽及該 TNF 配體家族成員之胞外域) 藉由肽鍵直接或經由一個或多個肽連接子連接。

相對於參考多肽序列所述之「 百分比 (%) 胺基酸序列同一性」，是指候選序列中胺基酸殘基與參考多肽 (蛋白質) 序列中之胺基酸殘基相同之百分比，在比對序列並引入差異後 (如有必要)，可實現最大的序列同一性百分比，並且不考慮將任何保守性替換作為序列同一性之一部分。為確定胺基酸百分比序列同一性之目的而進行之比對可藉由本領域技術範圍內之各種方式實現，例如，使用公眾可取得的電腦軟體例如 BLAST、BLAST-2、ALIGNSAWI 或 Megalign (DNASTAR) 軟體。本領域之技術人員可確定用於排列序列之合適參數，包括在所比較之序列全長上實現最大排列所需之任何演算法。然而，出於本文的目的，使用序列比較電腦程式 ALIGN-2 產生％胺基酸序列同一性值。ALIGN-2 序列比較電腦程式由建南德克公司編寫，原始程式碼已與用戶文檔一起存檔於美國版權局，華盛頓特區，20559，並以美國版權註冊號 TXU510087 進行註冊。ALIGN-2 程式可從加利福尼亞南三藩市的建南德克公司公眾可取得，亦可以從原始程式碼進行編譯。ALIGN-2 程式應編譯為在 UNIX 作業系統 (包括數位 UNIX V4.0D) 上使用。所有序列比較參數均由 ALIGN-2 程式設置，並且沒有變化。在使用 ALIGN-2 進行胺基酸序列比較的情況下，既定胺基酸序列 A 對、與、或相對於既定胺基酸序列 B 的 % 胺基酸序列同一性 (其視情況表述為既定胺基酸序列 A，其對、與、或相對於既定胺基酸序列 B 具有或包含一定 % 的胺基酸序列同一性) 計算如下：X/Y 分數的 100 倍，其中 X 為序列排列程式 ALIGN-2 在 A 與 B 程式排列中評分為同一匹配的胺基酸殘基數，Y 為 B 中胺基酸殘基的總數。應當理解的是，在胺基酸序列 A 的長度不等於胺基酸序列 B 的長度的情況下，A 與 B 的 % 胺基酸序列同一性將不等於 B 與 A 的 % 胺基酸序列同一性。除非另有特別說明，否則如前一段所述，使用 ALIGN-2 電腦程式獲得本文使用的所有 % 胺基酸序列同一性值。

在某些實施例中，考慮到本文所提供之 CD28 抗原結合分子的 胺基酸序列變異體。例如，可能希望改善 CD28 抗原結合分子之結合親和力及/或其他生物學特性。可藉由將適當的修飾引入編碼分子的核苷酸序列分子，或藉由肽合成來製備 CD28 抗原結合分子之胺基酸序列變異體。此等修飾包括例如，抗體之胺基酸序列中的殘基的缺失及/或插入及/或取代。可實施缺失、插入和取代之任意組合以得到最終構建體，前提條件是最終構建體具有所需之特徵，例如抗原結合特徵。取代誘變的目標位點包括 HVR 及骨架 (FR)。保守取代提供於表 B 中之「較佳之取代」標題下，並在下文參考胺基酸支鏈類別 (1) 至 (6) 進一步描述。胺基酸取代可引入至所關注之分子中，且針對如下所需活性篩選產物：例如保留/改善之抗原結合、降低之免疫原性或改善之ADCC或CDC。表 A

原始殘基	例示性取代	較佳的取代
Ala (A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg (R)	Lys；Gln；Asn	Lys
Asn (N)	Gln；His；Asp；Lys；Arg	Gln
Asp (D)	Glu；Asn	Glu
Cys (C)	Ser；Ala	Ser
Gln (Q)	Asn；Glu	Asn
Glu (E)	Asp；Gln	Asp
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile (I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸	Leu
Leu (L)	正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys (K)	Arg；Gln；Asn	Arg
Met (M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe (F)	Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Val；Ser	Ser
Trp (W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr (Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val (V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸	Leu

胺基酸可根據常見的支鏈特性進行分組： (1) 疏水性：正白胺酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile； (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3) 酸性：Asp，Glu； (4) 鹼性：His，Lys，Arg; (5) 影響鏈取向之殘基：Gly，Pro； (6) 芳香族：Trp，Tyr，Phe。

非保守性取代需要將這些類別中之一類的成員交換為另一類的成員。

術語「 胺基酸序列變異體」包括實質性變異體，其中在母代抗原結合分子 ( 例如人源化或人類抗體) 之一個或多個高度可變區中存在胺基酸取代。通常，選擇用於進一步研究之所得變體將相對於母代抗原結合分子在某些生物學特性 (例如提高親和性、降低免疫原性) 上具有修飾 (例如，改善) 及/或基本上保留母代抗原結合分子之某些生物學特性。例示性取代變異體是親和力成熟的抗體，其可以方便地產生，例如，使用基於噬菌體展示的親和力成熟技術，例如，本文所述的那些。簡言之，一個或多個 HVR 殘基發生突變，並且變異體抗原結合分子在噬菌體上展示並篩選出特定的生物學活性 (例如結合親和力)。在某些實施例中，在一個或多個 HVR 內可能發生取代、插入或缺失，只要此等修改不顯著降低抗原結合分子結合抗原之能力即可。例如，可在 HVR 中實施基本上不降低結合親和力的保守修改 (例如，本文所提供之保守性取代)。如 Cunningham 與 Wells (1989) Science, 244:1081-1085 所揭示，用於識別可能誘變的抗體殘基或區域的一種有用的方法稱為「丙胺酸掃描誘變」。在該方法中，識別殘基或目標殘基組 (例如，帶電荷的殘基，如 Arg、Asp、His、Lys 和 Glu)，並用中性或帶負電荷的胺基酸 (例如，丙胺酸或聚丙胺酸) 取代以確定抗體與抗原之交互作用是否受到影響。可在胺基酸位置引入更多取代，表明對初始取代具有良好的功能敏感性。可替代地或另外地，可使用抗原-抗原結合分子複合物之晶體結構來識別抗體與抗原之間的接觸點。此等接觸殘基和鄰近殘基可靶向或消除為取代的候選物。可篩選變異體以確定它們是否包含所需之特性。

胺基酸序列插入包括胺基及/或羧基末端融合體之長度，從一個殘基到包含一百個或更多殘基之序列，以及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。插入之實例包括 CD28 抗原結合分子融合至多肽之 N 端或 C 端，由此增加了 CD28 抗原結合分子之血清半衰期。

在某些實施例中，改變本文所提供之 CD28 抗原結合分子以增加或減少抗體發生糖基化之程度。分子之糖基化變異體可藉由改變胺基酸序列以便產生或去除一個或多個糖基化位點來方便地獲得。在促效性 ICOS 結合分子包含 Fc 域的情況下，其連接的碳水化合物可能發生改變。哺乳動物細胞產生的天然抗體通常包含分支的雙觸角寡糖，其通常藉由 N 鍵連接至 Fc 區域 CH2 域之 Asn297。參見例如，Wright 等人 TIBTECH15:26-32 (1997)。寡糖可包括各種碳水化合物，例如，甘露糖、N-乙醯基葡糖胺 (GlcNAc)、半乳糖和唾液酸以及在雙觸角寡糖結構之「莖」中連接至 GlcNAc 的岩藻糖。在一些實施例中，可對促效性 ICOS 結合分子中之寡糖進行修飾，以便產生具有改善特性的變異體。在一個態樣中，提供了具有缺少 (直接或間接地) 連接至 Fc 區域的岩藻糖的碳水化合物結構之促效性 ICOS-結合分子變異體。該等岩藻糖基化變異體可具有改善之 ADCC 功能，參見例如美國專利公開號 US 2003/0157108 (Presta, L.) 或 US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。CD28 抗原結合分子的其他變異體包括具有二等分之寡糖的那些，例如，其中連接至 Fc 區域的雙觸角寡糖被 GlcNAc 平分。該等變異體可具有減少之藻糖基化及/或改善之 ADCC 功能，參見例如 WO 2003/011878 (Jean-Mairet 等人)；美國專利第 6,602,684 號 (Umana 等人)；及 US 2005/0123546 (Umana 等人)。亦提供了在寡糖上具有至少一個連接至 Fc 區域之半乳糖殘基的變異體。該等抗體變異體可具有改善之 CDC 功能，且描述於例如 WO 1997/30087 (Patel 等人)；WO 1998/58964 (Raju, S.) 及 WO 1999/22764 (Raju, S.) 中。

在某些實施例中，可能希望形成本發明之 CD28 抗原結合分子之 經半胱胺酸工程改造之變異體，例如「thioMAb」，其中分子之一個或多個殘基被半胱胺酸殘基取代。在特定態樣中，取代殘基出現在分子之可進入的位點。藉由用半胱胺酸取代那些殘基，反應性硫醇基團從而被定位在抗體之可進入的位點，並可用於使抗體與其他部分 (例如，藥物部分或連接子-藥物部分) 結合，以形成免疫結合體。在某些態樣中，以下任何一個或多個殘基可被半胱胺酸取代：輕鏈的 V205 (Kabat 編號)；重鏈的 A118 (EU 編號)；及重鏈 Fc 區的 S400 (EU 編號)。經半胱胺酸工程改造之抗原結合分子可按照例如美國第 7,521,541 號專利所述之方法產生。

在某些態樣中，可進一步修飾本文所提供之CD28 抗原結合分子，以使其包含本技術領域中已知且容易獲得的附加的非蛋白質部分。適用於抗體之衍生化的部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇 (PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三㗁𠮿、乙烯/順丁烯二酐共聚物、聚胺基酸 (均聚物或隨機共聚物) 以及葡聚糖或聚(N-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇 (例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其水中之穩定性而可能在製造中具有優勢。該聚合物可具有任何分子量，並且可以為支鏈聚合物或非支鏈聚合物。連接至抗體的聚合物之數量可以變化，並且如果連接的聚合物超過一種，則它們可以為相同或不同之分子。通常，用於衍生化的聚合物之數量和/或類型可基於以下考慮因素來確定，這些考慮因素包括但不限於待改善之抗體的特定性質或功能、雙特異性抗體是否將用於指定條件下的治療中等。在另一態樣中，提供了可藉由曝露於輻射而選擇性加熱之抗體及非蛋白質部分的結合體。在一個實施例中，非蛋白部分為奈米碳管 (Kam, N.W. 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605)。輻射可具有任何波長，並且包括但不限於不損害普通細胞但是將非蛋白質部分加熱至接近抗體--非蛋白質部分的細胞被殺死之溫度的波長。在另一態樣中，可獲得本文所提供之 CD28 抗原結合分子之免疫結合體。「 免疫結合體」是與一個或多個異源分子複合之抗體，其包括但不限於細胞毒性劑。

術語「 多核苷酸」是指經分離之核酸分子或構建體，例如信使 RNA (mRNA)、病毒來源的 RNA 或質體 DNA (pDNA)。多核苷酸可包含習知的磷酸二酯鍵或非習知的鍵 (例如酰胺鍵，例如肽核酸 (PNA) 中所見)。術語「核酸分子」，是指任何存在於多核苷酸中之一個或多個核酸片段，例如 DNA 或 RNA 片段。每個核苷酸由鹼基具體而言嘌呤或嘧啶鹼基 (即，胞嘧啶 (C)、鳥嘌呤 (G)、腺嘌呤 (A)、胸腺嘧啶 (T) 或尿嘧啶 (U))、糖 (即，脫氧核糖或核糖) 及磷酸基團構成。通常，核酸分子通過鹼基序列進行描述，其中所述鹼基代表核酸分子的一級結構 (線性結構)。鹼基序列通常由 5' 至 3' 表示。在本文中，術語核酸分子包括：脫氧核糖核酸 (DNA)，其包括例如互補 DNA (cDNA) 和基因組 DNA；核糖核酸 (RNA)，特定而言信使 RNA (mRNA)；DNA 或 RNA 的合成形式；以及包含兩個或更多個這些分子的混合聚合物。核酸分子可以是線性或環狀的。另外，術語核酸分子包括有义股和反義股，以及單股和雙股形式。此外，本文所述之核酸分子可包含天然存在或非天然存在之核苷酸。非天然存在之核苷酸的例子包括帶有衍生糖、磷酸鹽連接或化學修飾殘基的經修飾之核苷酸鹼基。核酸分子還包括適於在體外及/或體內例如在宿主或患者體內直接表現本發明之抗體的載體的 DNA 和 RNA 分子。此等 DNA (例如，cDNA) 或 RNA (例如，mRNA) 載體可以是未修飾的或經過修飾的。例如，mRNA 可經過化學修飾以增強 RNA 載體之穩定性及/或編碼分子之表現，從而將 mRNA 注入受試者體內以產生抗體 (參見例如 Stadler 等人 (2017) Nature Medicine 23:815-817 或 EP 2 101 823 B1)。

「 經分離之」核酸分子或多核苷酸是指已從其天然環境中分離出之核酸分子 (DNA 或 RNA)。例如，就本發明而言，編碼載體中所含之多肽的重組多核苷酸被視爲是經分離。經分離之多核苷酸之更多實例包括在異源性宿主細胞中保持之重組多核苷酸或溶液中經純化之 (部分或基本上) 多核苷酸。經分離之多核苷酸包括通常包含多核苷酸分子之細胞中所含之多核苷酸分子，但是多核苷酸分子存在於染色體外或與自然染色體位置不同之染色體位置。經分離之 RNA 分子包括本發明之活體內或活體外 RNA 轉錄物，以及正鏈和負鏈形式及雙鏈形式。根據本發明之經分離之多核苷酸或核酸進一步包括合成產生之此等分子。此外，多核苷酸或核酸可以為或可包括調控元件，例如啟動子、核醣體結合位點或轉錄終止子。

藉由與本發明的參考核苷酸序列具有至少例如 95% 的「同一性」的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，意指該多核苷酸的核苷酸序列與參考序列具有同一性，除了參考核苷酸序列的每 100 個核苷酸，多核苷酸序列最多可包含五個點突變。換句話說，為了獲得與參考核苷酸序列具有至少 95% 的同一性的核苷酸序列的多核苷酸，可以刪除參考序列中最多 5% 的核苷酸或用另一個核苷酸取代，或者將參考序列中核苷酸總數最多 5% 的核苷酸數插入到參考序列中。參考序列的這些改變可能發生在參考核苷酸序列的 5’ 端或 3’ 端位置或這些末端位置之間的任何位置，既散佈在參考序列的殘基之間，也散佈在參考序列內的一個或多個連續基團中。實際上，任何特定的多核苷酸序列是否與本發明的核苷酸序列具有至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性可以使用已知的電腦程式常規地確定，例如如上討論用於多肽的程式 (例如，ALIGN-2)。

術語「 表現盒」是指重組或合成產生之多核苷酸，其具有一系列允許特定核酸在標靶細胞中轉錄之特定核酸元件。重組表現盒可被引入質體、染色體、粒線體 DNA、色素體 DNA、病毒或核酸片段中。通常，表現載體之重組表現盒部分除其他序列外還包括待轉錄之核酸序列和啟動子。在某些實施例中，本發明之表現盒包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段的多核苷酸序列。

術語「載體」或「表現載體」與「表現構建體」同義，且是指用於在標靶細胞中引入並指導與其可操縱地連接的特定基因之表現的 DNA 分子。該術語包括作為自我複制核酸結構之載體以及摻入已引入該宿主細胞的基因組中的載體。本發明之表現載體包含表現盒。表現載體轉錄大量穩定的 mRNA。一旦表現載體進入標靶細胞內部，由基因編碼的核糖核酸分子或蛋白質即透過細胞轉錄和/或翻譯機制而產生。在一個實施例中，本發明之表現載體包含表現盒，該表現盒包含多核苷酸序列，該多核苷酸序列編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段。

術語「 宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已向其中引入外源性核酸的細胞，其包括此等細胞的子代細胞。宿主細胞包括「轉形體」和「轉形細胞」，其包括原代轉形細胞及由其衍生的子代細胞，與傳代次數無關。子代細胞之核酸含量可能與親代細胞不完全相同，但可能含有突變。本文中包括具有與原始轉形細胞中篩選或選擇的功能或生物學活性相同的功能或生物學活性的突變子代細胞。宿主細胞為可用於產生本發明之雙特異性抗原結合分子的任何類型的細胞系統。宿主細胞包括培養的細胞，例如培養的哺乳動物細胞，如 CHO 細胞、BHK 細胞、NS0 細胞、SP2/0 細胞、YO 骨髓瘤細胞、P3X63 小鼠骨髓瘤細胞、PER 細胞、PER.C6 細胞或雜交瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞和植物細胞等，亦包括基因轉殖動物、基因轉殖植物或培養的植物或動物組織內的細胞。

藥劑之「 有效量」是指在其所投予的細胞或組織中引起生理變化所需的量。

藥劑例如醫藥組成物的「 治療有效量」指在所需之給藥劑量和時間段內有效實現所需的治療或預防效果的量。治療有效量的藥劑例如消除、減少、延遲、最小化或防止疾病的不利影響。

「個體」或「受試者」為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養的動物 (例如牛、綿羊、貓、狗和馬)、靈長類動物 (例如人及非人類靈長類動物，例如猴)、兔以及囓齒類動物 (例如小鼠及大鼠)。特別地，個體或受試者為人類。

術語「 醫藥組成物」是指以下製劑：其呈允許其中所含之活性成分之生物活性有效之形式，且不含對將投予該製劑之受試者具有不可接受毒性之額外組分。

「 醫藥上可接受之賦形劑」指醫藥組成物中除對受試者無毒之活性成分以外的成分。醫藥上可接受之賦形劑包括但不限於緩衝液、穩定劑或防腐劑。

術語「 包裝插頁」用於指涉通常包含在治療性產品的商業包裝中的說明，該說明包含有關使用此等治療性產品的適應症、用法、劑量、投予途徑、聯合治療、禁忌症及/或警告等資訊。

如本文中所使用的「治療(treatment)」(及其語法變體，例如「治療 (treat)」或「治療 (treating)」)，係指試圖改變受治療受試者之疾病自然病程的臨床干預，並且可進行預防或在臨床病理過程中執行。期望之治療效果包括但不限於預防疾病之發生或複發、減輕症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理後果、預防轉移、降低疾病進展之速度、改善或減輕疾病狀態、及緩解或改善預後。在一些實施例中，本發明之分子用於延遲疾病之發展或減慢疾病之進展。

如本文所述之術語「 聯合治療」或「 共同投予」涵蓋聯合投予 (其中兩種或更多種治療劑包括於相同或獨立調配物中) 及獨立投予，在該情況下，可在投予額外之一種或多種治療劑 (較佳的是一種或多種抗體) 之前、同時及/或之後投予本文所報告之抗體。

術語「癌症」是指或描述哺乳動物中通常以不受調控的細胞生長為特徵的生理狀況。因此，如本文所使用之術語「癌症」是指增殖性疾病，例如癌、淋巴瘤 (例如，何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤)、胚細胞瘤、肉瘤及白血病。特定而言，術語「癌症」包括淋巴細胞白血病、肺癌、非小細胞肺癌 (NSCL)、細支氣管肺泡細胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門癌、胃癌 (stomach cancer/gastric cancer)、結腸癌、乳腺癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、宮頸癌、陰道癌、外陰癌、何杰金氏病、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽道癌、中樞神經系統 (CNS) 腫瘤、脊髓軸腫瘤、腦乾膠質瘤、多形性神經膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、腦膜瘤、鱗狀細胞癌、垂體腺瘤及 Ewing 氏肉瘤，包括上述癌症中任一種之難治型或上述癌症中一種或多種之組合。在一個態樣中，癌症為實性瘤。在另一態樣中，癌症為血癌，特定而言為白血病，最特定而言為急性淋巴細胞白血病 (ALL) 或急性髓細胞性白血病 (AML)。

本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子

本發明提供新型雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其具有特別有利之特性，例如可生產性、穩定性、結合親和力、生物活性、靶向效率、降低之毒性、可給予患者之更寬之劑量範圍及由此可能得到之增强之療效。該新型雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子包含由能夠穩定締合的第一次單元及第二次單元構成之 Fc 域，該 Fc 域包含降低抗原結合分子與 Fc 受體之結合親和力及/或效應子功能 (不活動 Fc) 之一個或多個胺基酸取代，並由此避免經由 Fc 受體之非特異性交聯。相反，它們包含至少一個能夠與 CD3 特異性結合的抗原結合域，該抗原結合域引起腫瘤部位之交聯。由此實現腫瘤特異性 T 細胞活化。在一個特定態樣中，提供具有經掩蔽之 CD3 抗原結合域的雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子。藉由含蛋白酶位點之連接子而於 N 端連接至 CD3 結合物之 HC 的抗個體遺傳型 CD3 scFv 掩蔽 CD3 結合物，旨在降低潛在毒性。蛋白酶在腫瘤微環境中活躍，導致連接子中蛋白酶位點之切割，從而恢復 CD3 結合。因此，CD3 結合在腫瘤細胞存在下是可能的，但在健康組織中則不然。

本文提供一種與 CD28 單價結合的雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其包含 (a) 能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域， (b) 能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域，及 (c) 由能夠穩定締合的第一次單元及第二次單元構成之 Fc 域，其包含降低該抗原結合分子與 Fc 受體的結合親和力及/或效應子功能之一個或多個胺基酸取代，其中該能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域包含 (i) 重鏈可變區 (V _HCD3)，其包含 SEQ ID NO: 2 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 3 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 4 之 CDR-H3；以及輕鏈可變區 (V _LCD3)，其包含 SEQ ID NO: 5 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 6 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 7 之 CDR-L3；或 (ii) 重鏈可變區 (V _HCD3)，其包含 SEQ ID NO: 10 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 11 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 12 之 CDR-H3；以及輕鏈可變區 (V _LCD3)，其包含 SEQ ID NO: 13 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 14 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 15 之 CDR-L3。

在一個態樣中，提供如上文所定義之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中 Fc 域為 IgG，特定而言，Fc 域為 IgG1 Fc 域或 IgG4 Fc 域。在一個特定態樣中，由能夠穩定締合的第一次單元及第二次單元所構成之 Fc 域為 IgG1 Fc 域。Fc 域包含降低抗原結合分子與 Fc 受體之結合親和力及/或降低或消除效應子功能的一種或多種胺基酸取代。在一個態樣中，Fc 域包含胺基酸取代 L234A 及 L235A (根據 Kabat EU 索引編號)。在一個態樣中，Fc 域為人類 IgG1 亞類且包含胺基酸突變 L234A、L235A 及 P329G (根據 Kabat EU 索引編號)。在一個態樣中，提供一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中抗原結合分子包含由能夠穩定締合的第一次單元及第二次單元所構成之 Fc 域，其中第一次單元包含 SEQ ID NO:96 之胺基酸序列 (Fc 臼 PGLALA)，且第二次單元包含 SEQ ID NO:95 之胺基酸序列 (Fc 杵 PGLALA)。

在另一態樣中，雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子的能夠與 CD28 特異性結合之抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD28)，其包含 SEQ ID NO: 18 之 CDR-H1、SEQ ID NO: 19 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 20 之 CDR-H3；及輕鏈可變區 (V _LCD28)，其包含 SEQ ID NO: 21 之 CDR-L1、SEQ ID NO: 22 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 23 之 CDR-L3。

此外，提供一種如上文所定義之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD28 特異性結合之抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD28)，其包含與 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _LCD28)，其包含與 SEQ ID NO:25 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD28)，其包含選自由下列各項所組成之群組之胺基酸序列：SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40 及 SEQ ID NO:41；及輕鏈可變區 (V _LCD28)，其包含選自由下列各項所組成之群組之胺基酸序列：SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50 及 SEQ ID NO:51。

在一個態樣中，提供一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD28) 之 CDR，其包含 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _LCD28) 之 CDR，其包含 SEQ ID NO:44 之胺基酸序列。在另一態樣中，雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子的能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD28)，其包含 SEQ ID NO: 52 之 CDR-H1、SEQ ID NO: 53 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 54 之 CDR-H3；及輕鏈可變區 (V _LCD28)，其包含 SEQ ID NO: 55 之 CDR-L1、SEQ ID NO: 56 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 57 之 CDR-L3。

在另一態樣中，提供一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD28 特異性結合之抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD28) 之 CDR，其包含 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _LCD28) 之 CDR，其包含 SEQ ID NO:43 之胺基酸序列。在另一態樣中，雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子的能夠與 CD28 特異性結合之抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD28)，其包含 SEQ ID NO: 58 之 CDR-H1、SEQ ID NO: 59 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 60 之 CDR-H3；及輕鏈可變區 (V _LCD28)，其包含 SEQ ID NO: 61 之 CDR-L1、SEQ ID NO: 62 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 63 之 CDR-L3。

在另一態樣中，提供一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD28 特異性結合之抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD28) 之 CDR，其包含 SEQ ID NO:32 之胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _LCD28) 之 CDR，其包含 SEQ ID NO:25 之胺基酸序列。在另一態樣中，雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子的能夠與 CD28 特異性結合之抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD28)，其包含 SEQ ID NO: 64 之 CDR-H1、SEQ ID NO: 65 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 66 之 CDR-H3；及輕鏈可變區 (V _LCD28)，其包含 SEQ ID NO: 67 之 CDR-L1、SEQ ID NO: 68 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 69 之 CDR-L3。

在一個態樣中，提供一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD28 特異性結合之抗原結合域相比於以下抗原結合域以降低之親和力與 CD28 結合，該抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD28)，其包含 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _LCD28)，其包含 SEQ ID NO:25 之胺基酸序列。藉由流式細胞術量測與表現 CD28 之 CHO 細胞結合的親和力。在一個態樣中，能夠與 CD28 特異性結合之抗原結合域相比於以下抗原結合域以降低之親和力與 CD28 結合，該抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD28)，其包含 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _LCD28)，其包含 SEQ ID NO:25 之胺基酸序列；且該能夠與 CD28 特異性結合之抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD28) 之 CDR-H1、CDR-H2 及 CDR-H3，其包含 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _LCD28) 之 CDR-L1、CDR-L2 及 CDR-L3，其包含 SEQ ID NO:44 之胺基酸序列。在一個態樣中，能夠與 CD28 特異性結合之抗原結合域相比於以下抗原結合域以降低之親和力與 CD28 結合，該抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD28)，其包含 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _LCD28)，其包含 SEQ ID NO:25 之胺基酸序列；且該能夠與 CD28 特異性結合之抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD28)，其包含與 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _LCD28)，其包含與 SEQ ID NO:44 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列。

在一個特定態樣中，提供一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD28 特異性結合之抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD28)，其包含 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _LCD28)，其包含 SEQ ID NO:44 之胺基酸序列。

在另一特定態樣中，提供一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD28 特異性結合之抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD28)，其包含 SEQ ID NO: 36 之胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _LCD28)，其包含 SEQ ID NO: 43 之胺基酸序列。

在又一特定態樣中，提供一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD28 特異性結合之抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD28)，其包含 SEQ ID NO: 32 之胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _LCD28)，其包含 SEQ ID NO:25 之胺基酸序列。

靶向 CD3 的雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子

本文提供一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與腫瘤相關抗原特異性結合的抗原結合域為能夠與 CD3 特異性結合的抗原結合域。

在一個態樣中，提供一種如本文所述之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD3 特異性結合的抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD3)，其包含 CDR-H1、CDR-H2 及 CDR-H3，該 CDR-H1 包含 SEQ ID NO:2 之胺基酸序列，該 CDR-H2 包含 SEQ ID NO:3 之胺基酸序列，該 CDR-H3 包含 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _LCD3)，其包含 CDR-L1、CDR-L2 及 CDR-L3，該 CDR-L1 包含 SEQ ID NO:5 之胺基酸序列，該 CDR-L2 包含 SEQ ID NO:6 之胺基酸序列，該 CDR-L3 包含 SEQ ID NO:7 之胺基酸序列。在一個態樣中，能夠與 CD3 特異性結合的抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD3) 之 CDR，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _LCD3) 之 CDR，其包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列。在一個態樣中，提供一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD3 特異性結合的抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD3)，其包含與 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _LCD3)，其包含與 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列。特定而言，能夠與 CD3 特異性結合的抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD3)，其包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _LCD3)，其包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列。

在另一態樣中，提供一種如本文所述之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD3 特異性結合的抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD3)，其包含 CDR-H1、CDR-H2 及 CDR-H3，該 CDR-H1 包含 SEQ ID NO:10 之胺基酸序列，該 CDR-H2 包含 SEQ ID NO:11 之胺基酸序列，該 CDR-H3 包含 SEQ ID NO:12 之胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _LCD3)，其包含 CDR-L1、CDR-L2 及 CDR-L3，該 CDR-L1 包含 SEQ ID NO:13 之胺基酸序列，該 CDR-L2 包含 SEQ ID NO:14 之胺基酸序列，該 CDR-L3 包含 SEQ ID NO:15 之胺基酸序列。在一個態樣中，能夠與 CD3 特異性結合的抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD3) 之 CDR，其包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _LCD3) 之 CDR，其包含 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列。在一個態樣中，提供一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD3 特異性結合的抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD3)，其包含與 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _LCD3)，其包含與 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列。特定而言，能夠與 CD3 特異性結合的抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD3)，其包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _LCD3)，其包含 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列。

與 CD28 單價結合且與 CD3 單價結合之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子 (1+1 形式 )

在一個態樣中，提供一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域及/或能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域為 Fab 片段。在一個特定態樣中，能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域及能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域皆爲 Fab 片段。

在一個態樣中，提供一種如本文所述之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其包含：(a) 能夠與 CD28 特異性結合的 crossFab 片段，(b) 能夠與 CD3 特異性結合的習知的 Fab 片段，及 (c) 由能夠穩定締合的第一次單元及第二次單元構成之 Fc 域，其包含降低抗原結合分子與 Fc 受體之結合親和力及/或效應子功能之一個或多個胺基酸取代。在另一態樣中，提供一種如本文所述之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其包含：(a) 能夠與 CD28 特異性結合的習知的 Fab 片段，(b) 能夠與 CD3 特異性結合的 crossFab 片段，及 (c) 由能夠穩定締合的第一次單元及第二次單元構成之 Fc 域，其包含降低抗原結合分子與 Fc 受體之結合親和力及/或效應子功能之一個或多個胺基酸取代。

在一個態樣中，提供一種如本文所述之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域為 Fab 片段，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 或恆定域 CL 及 CH1 (特定而言，可變域 VL 及 VH) 係彼此替換 (crossfab 片段)。在一個態樣中，能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域為 Fab 片段，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 或恆定域 CL 及 CH1 (特定而言，可變域 VL 及 VH) 係彼此替換，且能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域為習知的 Fab 片段。在一個態樣中，能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域為 Fab 片段，其中在恆定域 CL 中，位置 123 處之胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 經選自離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 之胺基酸取代，且位置 124 處之胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 取代；且其中在恆定域 CH1 中，位置 147 處之胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) 取代，且位置 213 處之胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代。

在一個特定態樣中，提供一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其包含：第一輕鏈，該第一輕鏈包含 SEQ ID NO: 102 之胺基酸序列；第一重鏈，該第一重鏈包含 SEQ ID NO:101 之胺基酸序列；第二重鏈，該第二重鏈包含 SEQ ID NO:103 之胺基酸序列；及第二輕鏈，該第二輕鏈包含 SEQ ID NO:104 之胺基酸序列 (分子 10)。

在一個態樣中，提供一種如本文所述之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域為 Fab 片段，且其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 或恆定域 CL 及 CH1 (特定而言，可變域 CL 及 CH1) 係彼此替換 (crossfab 片段)。在一個態樣中，能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域為 Fab 片段，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 或恆定域 CL 及 CH1 (特定而言，可變域 CL 及 CH1) 係彼此替換，且能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域為習知的 Fab 片段。在一個態樣中，能夠與 CD28 特異性結合之抗原結合域為 Fab 片段，其中在恆定域 CL 中，位置 123 處之胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 經選自離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 之胺基酸取代，且位置 124 處之胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 取代；且其中在恆定域 CH1 中，位置 147 處之胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) 取代，且位置 213 處之胺基酸 (根據 Kabat EU 索引編號) 獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) (根據 Kabat EU 索引編號) 取代。

在一個特定態樣中，提供一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其包含：第一輕鏈，該第一輕鏈包含 SEQ ID NO: 90 之胺基酸序列；第一重鏈，該第一重鏈包含 SEQ ID NO:89 之胺基酸序列；第二重鏈，該第二重鏈包含 SEQ ID NO:91 之胺基酸序列；及第二輕鏈，該第二輕鏈包含 SEQ ID NO:92 之胺基酸序列 (分子 1)。

在一個特定態樣中，提供一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其包含：第一輕鏈，該第一輕鏈包含 SEQ ID NO: 90 之胺基酸序列；第一重鏈，該第一重鏈包含 SEQ ID NO:89 之胺基酸序列；第二重鏈，該第二重鏈包含 SEQ ID NO:93 之胺基酸序列；及第二輕鏈，該第二輕鏈包含 SEQ ID NO:94 之胺基酸序列 (分子 2)。

在另一特定態樣中，提供一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其包含：第一輕鏈，該第一輕鏈包含 SEQ ID NO: 102 之胺基酸序列；第一重鏈，該第一重鏈包含 SEQ ID NO:101 之胺基酸序列；第二重鏈，該第二重鏈包含 SEQ ID NO:103 之胺基酸序列；及第二輕鏈，該第二輕鏈包含 SEQ ID NO:104 之胺基酸序列 (分子 10)。

減少 Fc 受體結合及 / 或效應子功能之 Fc 結構域修飾

本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子之 Fc 域由包含免疫球蛋白分子之重鏈域的一對多肽鏈組成。例如，免疫球蛋白 G (IgG) 分子之 Fc 結構域為二聚體，其每個次單元包含 CH2 及 CH3 IgG 重鏈恆定域。Fc 結構域之兩個次單元能夠彼此穩定締合。Fc 域賦予本發明之抗原結合分子有利的藥代動力學特性，包括較長之血清半衰期，其有助於在標靶組織中獲得良好的累積比和有利的組織-血液分配比。但是，另一方面，這可能導致不希望地將本發明之雙特異性抗體靶向表現 Fc 受體之細胞，而不是靶向較佳的攜帶抗原的細胞。

因此，與天然 IgG1 Fc 域相比，本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子之 Fc 域表現出降低的與 Fc 受體之結合親和力及/或降低的效應子功能。在一個態樣中，Fc 基本上不與 Fc 受體結合及/或不誘導效應子功能。在一個特定態樣中，Fc 受體為 Fcγ 受體。在一個態樣中，Fc 受體為人類 Fc 受體。在一個具體態樣中，Fc 受體為活化人類 Fcγ 受體，更具體而言人類 FcγRIIIa、FcγRI 或 FcγRIIa，最具體而言人類 FcγRIIIa。在一個態樣中，Fc 域不誘導效應子功能。降低的效應子功能可包括但不限於以下一種或多種：降低補體依賴性細胞毒性 (CDC)、降低抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性 (ADCC)、降低抗體依賴性細胞吞噬作用 (ADCP)、減少細胞介素分泌、減少抗原呈現細胞的免疫複合物媒介的抗原攝取、減少與 NK 細胞的結合、減少與巨噬細胞的結合、減少與單核細胞的結合、減少與多形核細胞的結合、減少直接信號傳導誘導的細胞凋亡、降低樹突狀細胞成熟度或減少 T 細胞引發。

在某些態樣中，可在本文所提供之抗體的 Fc 區域中引入一個或多個胺基酸修飾，從而產生 Fc 區域變體。Fc 區域變異體可包含人類 Fc 區域序列 (例如，人類 IgG1、IgG2、IgG3 或 IgG4 Fc 區域)，其在一個或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾 (例如，取代)。

在一個特定態樣中，本發明提供一種抗原結合分子，其中 Fc 區域包含減少與 Fc 受體 (特別與 Fcγ 受體) 之結合的一種或多種胺基酸取代。在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其中 Fc 區域包含一種或多種胺基酸取代，且其中由該抗體所誘導之 ADCC 誘導降至包含野生型人類 IgG1 Fc 區域的抗體所誘導之 ADCC 的 0-20%。

在一個態樣中，本發明之抗原結合分子之 Fc 域包含降低 Fc 域與 Fc 受體之結合親和力及/或效應子功能的一種或多種胺基酸突變。通常，在 Fc 結構域之兩個次單元中的每個中都存在相同的一個或多個胺基酸突變。特定而言，Fc 域包含位置 E233、L234、L235、N297、P331 及 P329 (EU 編號) 處之胺基酸取代。特定而言，Fc 域包含 IgG 重鏈之位置 234 及 235 (EU 編號) 及/或 329 (EU 編號) 處之胺基酸取代。更特定而言，提供一種根據本發明之抗原結合分子，其包含 Fc 域，該 Fc 域包含 IgG 重鏈中之胺基酸取代 L234A、L235A 及 P329G (「P329G LALA」，EU 編號)。胺基酸取代 L234A 及 L235A 是指所謂的 LALA 突變。胺基酸取代之「P329G LALA」組合幾乎完全消除了人類 IgG1 Fc 域之 Fcγ 受體結合，並且描述於國際專利申請公開號 WO 2012/130831 A1 中，其中亦描述了製備該等突變 Fc 域的方法及確定其特性 (例如 Fc 受體結合或效應子功能)。

Fc 受體結合及/或效應子功能下降的 Fc 域亦包括一個或多個 Fc 域殘基 238、265、269、270、297、327 和 329 被取代之抗體 (美國第 6,737,056 號專利)。此類 Fc 突變體包括在胺基酸位置 265、269、270、297 和 327 中的兩個或更多個取代的 Fc 突變體，包括所謂的「DANA」Fc 突變體，其中殘基 265 和 297 被丙胺酸所取代 (美國專利號 7,332,581)。

在另一態樣中，Fc 域為 IgG4 Fc 域。IgG4 抗體與 IgG1 抗體相比，表現出與 Fc 受體的降低的結合親和性和降低的效應子功能。在一個更具體之態樣中，Fc 域為 IgG4 Fc 域，其包含在位置 S228 (Kabat 編號) 的胺基酸取代，特別是胺基酸取代 S228P。在一個更具體之態樣中，Fc 域為 IgG4 Fc 域，其包含胺基酸取代 L235E 及 S228P 及 P329G (EU 編號)。該等 IgG4 Fc 域突變及其 Fcγ 受體結合特性亦描述於 WO 2012/130831 中。

可使用本領域中所熟知之遺傳或化學方法，透過胺基酸缺失、取代、插入或修飾來製備變異型 Fc 結構域。遺傳方法可包括編碼 DNA 序列的位點特異性突變、PCR、基因合成等。可透過例如定序來驗證核苷酸變化是否正確。

與 Fc 受體之結合可易於透過 ELISA 確定，或透過表面電漿子共振 (SPR) 使用標準儀器例如 BIAcore 儀器 (GE Healthcare) 進行確定，並且 Fc 受體可透過例如重組表現來獲得。可替代地，Fc 域或包含 Fc 域的細胞活化抗體對 Fc 受體之結合親和性可使用已知表現特定 Fc 受體的細胞系 (例如表現 FcγIIIa 受體的人類 NK 細胞) 進行評估。

Fc 域或包含 Fc 域的本發明之抗原結合分子的效應子功能可藉由本領域中所熟知的方法來量測。本文描述了用於量測 ADCC 的適合的測定法。用於評估所關注之分子之 ADCC 活性的活體外分析方法的其他實例描述於例如：美國第 5,500,362 號專利；Hellstrom 等人，Proc Natl Acad Sci USA 83，7059-7063 (1986)；及 Hellstrom 等人，Proc Natl Acad Sci USA 82，1499-1502 (1985)；美國第 5,821,337 號專利；Bruggemann 等人，J Exp Med 166，1351-1361 (1987)。可替代地，可採用非放射性分析方法 (參見例如：用於流式細胞術的 ACTI™ 非放射性細胞毒性測定 (CellTechnology，Inc. Mountain View，CA))；及 CytoTox 96® 非放射性細胞毒性測定 (Promega，Madison，WI))。用於此等分析的有用的效應子細胞包括外周血單核細胞 (PBMC) 及自然殺手 (NK) 細胞。可替代地或另外地，可在例如 Clynes 等人在 Proc Natl Acad Sci USA 95，652-656 (1998) 中揭示的動物模型中在活體內評估所關注之分子之 ADCC 活性。

在一些態樣中，減少 Fc 域與補體組分之結合，具體而言減少與 C1q 之結合。因此，在一些態樣中，其中，Fc 域工程改造為具有降低的效應子功能，所述降低的效應子功能包括降低的 CDC。可實施 C1q 結合測定以確定本發明之雙特異性抗體能否結合 C1q 並因此具有 CDC 活性。參見例如 WO 2006/029879 及 WO 2005/100402 中的 C1q 和 C3c 結合 ELISA。為評估補體活化，可實施 CDC 測定 (參見例如：Gazzano-Santoro 等人，J Immunol Methods 202，163 (1996)；Cragg 等人，Blood 101，1045-1052 (2003)；及 Cragg 和 Glennie，Blood 103，2738-2743 (2004))。

在一個特定態樣中，與天然 IgG1 Fc 域相比表現出降低的對 Fc 受體之結合親和力及/或降低的效應子功能的 Fc 域為包含胺基酸取代 L234A、L235A 及視情況存在的 P329G 的人類 IgG1 Fc 域或包含胺基酸取代 S228P、L235E 及視情況存在的 P329G (根據 Kabat EU 索引編號) 的人類 IgG4 Fc 域。更特定而言，Fc 域為包含胺基酸取代 L234A、L235A 及 P329G (根據 Kabat EU 索引編號) 的人類 IgG1 Fc 域。

促進異源二聚化的 Fc 結構域修飾

本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子包含不同的抗原結合位點，其與 Fc 域之兩個次要單元中的一個或另一個融合，因此 Fc 域之兩個次要單元可包含在兩個不同的多肽鏈中。這些多肽的重組共表現及隨後的二聚化導致兩種多肽具有若干可能的組合。為改善重組生產中本發明之雙特異性抗原結合分子之產率及純度，在本發明之雙特異性抗原結合分子之 Fc 域中引入促進所需之多肽締合之修飾將是有利的。

因此，在特定態樣中，本發明涉及與 CD28 單價結合之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，該分子包含：(a) 能夠與 CD28 特異性結合的一個抗原結合域；(b) 能夠與 CD3 特異性結合的至少一個抗原結合域；及 (c) 由能夠穩定締合的第一次單元及第二次單元構成之 Fc 域，其包含降低抗原結合分子與 Fc 受體之結合親和力及/或效應子功能之一個或多個胺基酸取代，其中 Fc 域包含促進 Fc 域之第一次單元與第二次單元之締合之修飾。人類 IgG Fc 結構域之兩個次單元之間最廣泛的蛋白質-蛋白質相互作用位點在 Fc 結構域之 CH3 結構域中。因此，在一個態樣中，所述修飾在 Fc 域之 CH3 域中進行。

在一個具體態樣中，該修飾為所謂的「杵臼 (knob-into-hole)」修飾，其包含在 Fc 域之兩個次單元中的一個的「杵」修飾及 Fc 域之兩個次單元中的另一個的「臼」修飾。因此，本發明涉及與 CD28 單價結合之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，該分子包含：(a) 能夠與 CD28 特異性結合的一個抗原結合域；(b) 能夠與腫瘤相關抗原特異性結合的至少一個抗原結合域；及 (c) 由能夠穩定締合的第一次單元及第二次單元構成之 Fc 域，其包含降低抗原結合分子與 Fc 受體之結合親和力及/或效應子功能之一個或多個胺基酸取代，其中根據杵臼法，Fc 域之第一次單元包含杵且 Fc 域之第二次單元包含。在一個特定態樣中，Fc 域之第一次單元包含胺基酸取代 S354C 及 T366W (EU 編號)，且 Fc 域之第二次單元包含胺基酸取代 Y349C、T366S 及 Y407V (根據 Kabat EU 索引編號)。

「杵臼」技術描述於例如：US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway 等人，Prot Eng 9，617-621 (1996)；及 Carter，J Immunol Meth 248，7-15 (2001)。通常，該方法包括在第一多肽之界面處引入一個突起 (「杵」)，並且在第二多肽之界面中引入一個對應的空腔 (「臼」)，以使該突起可定位於空腔中，從而促進異源二聚體形成並阻礙同源二聚體形成。透過用較大支鏈 (例如酪胺酸或色胺酸) 替換第一多肽界面上之較小的胺基酸支鏈來構建突起。透過將較大胺基酸支鏈替換為較小的胺基酸支鏈 (例如丙胺酸或蘇胺酸)，在第二多肽之界面中形成與突起具有相同或相近大小的互補空腔。

據此，在一個態樣中，在本發明之雙特異性抗原結合分子之 Fc 域的第一次單元的 CH3 域中，胺基酸殘基經具有較大支鏈體積的胺基酸殘基取代，從而在第一次單元之 CH3 域內產生突起，該突起可定位在第二次單元之 CH3 域内的空腔中，並且在 Fc 域的第二次單元的 CH3 域中，胺基酸殘基經具有較小支鏈體積的胺基酸殘基取代，從而在第二次單元之 CH3 域內產生空腔，第二次單元之 CH3 域内的突起為可定位在該空腔內。可透過改變編碼多肽的核酸 (例如透過針對特定位點之突變或透過肽合成) 來製備突起和空腔。在一個具體態樣中，在 Fc 域之第一次單元之 CH3 域中，位置 366 處之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基取代 (T366W)，且在 Fc 域之第二次單元之 CH3 域中，位置 407 處之酪胺酸殘基經纈胺酸殘基取代 (Y407V)。在一個態樣中，在 Fc 域之第二次單元中，位置 366 處之蘇胺酸殘基另外經絲胺酸殘基取代 (T366S)，且位置 368 處之白胺酸殘基經丙胺酸殘基取代 (L368A)。

在又一態樣中，在 Fc 域之第一次單元中，位置 354 處之絲胺酸另外經半胱胺酸殘基取代 (S354C)，且在 Fc 域之第第二次單元中，位置 349 處之酪胺酸另外經半胱胺酸殘基取代(Y349C)。引入這兩個胱胺酸殘基導致在 Fc 域之兩個次單元之間形成二硫鍵，從而進一步穩定二聚體 (Carter (2001), J Immunol Methods 248, 7-15)。在一個特定態樣中，Fc 域之第一次單元包含胺基酸取代 S354C 及 T366W (EU 編號)，且 Fc 域之第二次單元包含胺基酸取代 Y349C、T366S 及 Y407V (根據 Kabat EU 索引編號)。

在一替代態樣中，促進 Fc 域之第一次單元及第二次單元的締合的修飾包括媒介靜電轉向作用的修飾，例如 PCT 公開 WO 2009/089004 中所述。通常，此方法涉及用帶電荷的胺基酸殘基取代兩個 Fc 結構域次單元界面上的一個或多個胺基酸殘基，從而使同源二聚體形成在靜電上不利，但異源二聚化在靜電上有利。

如本文所報告之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子之重鏈之 C 端可為以胺基酸殘基 PGK 結尾的完整 C 端。重鏈的 C 端可以是縮短的 C 端，其中一個或兩個 C 端胺基酸殘基已被去除。在一個較佳之態樣中，重鏈之 C 端是縮短的 C 端結尾 P。在一個較佳之態樣中，重鏈之 C 端是縮短的結尾 PG。在本文所報告之所有態樣中的一個態樣中，CD28 抗原結合分子包含具有本文所指定之 C 端 CH3 域的重鏈，該抗原結合分子包含 C 端甘胺酸-離胺酸二肽 (G446 及 K447，根據 Kabat EU 索引編號)。在本文所報告之所有態樣中的一個態樣中，CD28 抗原結合分子包含具有本文所指定之 C 端 CH3 域的重鏈，該抗原結合分子包含 C 端甘胺酸殘基 (G446，根據 Kabat EU 索引編號)。

Fab 域中之修飾

在一個態樣中，本發明涉及一種特徵為與 CD28 單價結合之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，該抗原結合分子包含：(a) 能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域，(b) 能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域，及 (c) 由能夠穩定締合的第一次單元及第二次單元構成之 Fc 域，其包含降低抗原結合分子與 Fc 受體之結合親和力及/或效應子功能之一個或多個胺基酸取代，其中能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域為 Fab 片段，且在 Fab 片段中，可變域 VH 及 VL 或恆定域 CH1 及 CL 按照 Crossmab 技術交換。

在單個結合臂 (CrossMabVH-VL 或 CrossMabCH-CL) 中發生域替換/交換的多特異性抗體詳述於以下文獻中：WO2009/080252；及 Schaefer, W. 等人，PNAS，108 (2011) 11187-1191。它們明顯減少了由抗第一抗原之輕鏈與抗第二抗原之重鏈錯配所引起之副產物 (與不存在該等域交換的方法相比)。

在一個態樣中，本發明涉及一種特徵為與 CD28 單價結合之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，該抗原結合分子包含：(a) 能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域，(b) 能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域，及 (c) 由能夠穩定締合的第一次單元及第二次單元構成之 Fc 域，其包含降低抗原結合分子與 Fc 受體之結合親和力及/或效應子功能之一個或多個胺基酸取代，其中在能夠與 CD28 特異性結合之 Fab 片段中，可變域 VL 與 VH 係彼此替換，使得 VH 域為輕鏈之部分，且 VL 域為重鏈之部分。

在另一態樣中，且爲了進一步改善正確配對，特徵為與 CD28 單價結合之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子包含 (a) 能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域，(b) 能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域，及 (c) 由能夠穩定締合的第一次單元及第二次單元構成之 Fc 域，其包含降低抗原結合分子與 Fc 受體之結合親和力及/或效應子功能之一個或多個胺基酸取代，可包含帶不同電荷的胺基酸取代 (所謂「帶電荷的殘基」)。這些修飾被引入交叉或非交叉 CH1 域及 CL 域中。在一個特定態樣中，本發明涉及一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中在 CL 域中之一者中，位置 123 處之胺基酸 (EU 編號) 經精胺酸 (R) 取代，且位置 124 處之胺基酸 (EU 編號) 經離胺酸 (K) 取代，且其中在 CH1 域中之一者中，位置 147 處之胺基酸 (EU 編號) 及位置 213 之胺基酸 (EU 編號) 經麩胺酸 (E) 取代。在一個特定態樣中，在能夠與 CD28 特異性結合的 Fab 片段之 CL 域中，位置 123 處之胺基酸 (EU 編號) 經精胺酸 (R) 取代，且位置 124 處之胺基酸 (EU 編號) 經離胺酸 (K) 取代，且在能夠與 CD28 特異性結合的 Fab 片段之 CH1 域中，位置 147 處之胺基酸 (EU 編號) 及位置 213 處之胺基酸 (EU 編號) 經麩胺酸 (E) 取代。

可蛋白酶活化之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子

在另一態樣中，提供一種特徵為與 CD28 單價結合之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，該分子包含 (a) 能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域， (b) 能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域， (c) 由能夠穩定締合的第一次單元及第二次單元構成之 Fc 域，其包含降低該抗原結合分子與 Fc 受體的結合親和力及/或效應子功能之一個或多個胺基酸取代，其中該能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域包含 (i) 重鏈可變區 (V _HCD3)，其包含 SEQ ID NO: 2 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 3 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 4 之 CDR-H3；以及輕鏈可變區 (V _LCD3)，其包含 SEQ ID NO: 5 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 6 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 7 之 CDR-L3；或 (ii) 重鏈可變區 (V _HCD3)，其包含 SEQ ID NO: 10 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 11 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 12 之 CDR-H3；及輕鏈可變區 (V _LCD3)，其包含 SEQ ID NO: 13 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 14 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 15 之 CDR-L3，且進一步包含 (d) 通過蛋白酶可切割連接子共價連接至雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子的掩蔽部分，其中遮蔽部分能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域之個體遺傳型結合，從而可逆地隱蔽能夠與 CD3 特異性結合之抗原結合域。

在一個態樣中，掩蔽部分能夠與能夠與 CD3 特異性結合的抗原結合域之個體遺傳型結合，從而可逆地隱蔽該抗原結合域。在一個態樣中，可蛋白酶活化之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子之掩蔽部分共價連接至第一抗原結合部分。在一個態樣中，掩蔽部分共價連接至第一抗原結合部分之重鏈可變區。在一個態樣中，掩蔽部分共價連接至第一抗原結合部分之輕鏈可變區。該共價鍵不同於掩蔽部分與個體遺傳型第一抗原結合位點之特異性結合，該特異性結合較佳的是非共價鍵。第一抗原結合部分之個體遺傳型包含其可變區。在一個態樣中，掩蔽部分與胺基酸殘基結合，該胺基酸殘基在第一抗原結合域與 CD3 結合時與 CD3 接觸。在一個較佳之態樣中，掩蔽部分并非第一抗原結合域之同源抗原或其片段，即掩蔽部分并非 CD3 或其片段。在一個態樣中，掩蔽部分為抗個體遺傳型抗體或其片段。在一個態樣中，掩蔽部分為抗個體遺傳型 scFv。作爲抗個體遺傳型 scFv 的例示性掩蔽部分且包含該等掩蔽部分的可蛋白酶活化之 CD28 抗原結合分子詳述於實例中。

可蛋白酶活化之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子之成分在各種構型中可彼此融合。在特定態樣中，活化雙特異性分子的可蛋白酶活化之 T 細胞包含由能夠穩定締合的第一次單元及第二次單元所構成之 Fc 域。在一些態樣中，第一抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端融合至 Fc 域之第一次單元或第二次單元之 N 端，且第二抗原結合域在 Fab 重鏈之 C 端融合至 Fc 域之另一此單元至 N 端。抗原結合部分可與 Fc 域直接融合或通過肽連接子與 Fc 融合，該肽連接子包含一個或多個胺基酸，通常約 2-20 個胺基酸。肽連接子為本領域中所熟知且如本文所述。合適的非免疫原性肽連接子包括例如 (G ₄S) _n、(SG ₄) _n、(G ₄S) _n或 G ₄(SG ₄) _n肽連接子。「n」通常爲介於 1 至 10 之間 (通常介於 2 至 4 之間) 的數字。一種適於連接第一抗原結合部分及第二抗原結合部分之 Fab 重鏈的例示性肽連接子為 EPKSC(D)-(G ₄S) ₂(SEQ ID NO: 193 及 SEQ ID NO: 194)。另外，連接子可包含免疫球蛋白鉸鏈區 (的一部分)。特定而言，在其中抗原結合部分與 Fc 域次單元之 N 端融合的情況下，可通過包含額外之肽連接子或不含額外之肽連接子的免疫球蛋白樞紐區或其一部分融合。

掩蔽部分

本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子可包含至少一個掩蔽部分。已經嘗試藉由用結合部分所識別之抗原之片段覆蓋結合部分來掩蔽抗體之結合 (例如，WO2013128194)。該方法存在幾個局限性。例如，使用抗原減少了降低結合部分之親和力的靈活性。這是因為親和力必須足夠高才能由抗原掩蔽物可靠地掩蔽。另外，經解離之抗原可能在 活體内與其一種或多種同源受體結合併相互作用，並向表現該等受體的細胞發出不良的信號。相比之下，本文所述之方法使用抗個體遺傳型抗體或其片段作為掩蔽物。設計有效掩蔽部分的兩個抵消因素是：1. 掩蔽之有效性，及 2. 掩蔽之可逆性。如果親和力過低，掩蔽效率將不足。但是，如果親和力過高，掩蔽過程可能不容易逆轉。無法預測高親和力抗個體遺傳型掩蔽物效果更好還是低親和力抗個體遺傳型掩蔽物效果更好。如本文所述，較高親和力之掩蔽部分在掩蔽抗原結合側面時整體表現更好，同時可有效去除以活化分子。在一個態樣中，抗個體遺傳型掩蔽物具有 1-8 nM 的 K _D。在一個態樣中，抗個體遺傳型掩蔽物於 37°C 下具有 2 nM 的 K _D。在一個具體實施例中，掩蔽部分識別能夠與 CD3 (例如人類CD3) 結合的第一抗原結合部分之個體遺傳型。在一個具體實施例中，掩蔽部分識別能夠與標靶細胞抗原結合的第二抗原結合部分之個體遺傳型。

在一個態樣中，掩蔽部分掩蔽 CD3 抗原結合域且包含 (i) 重鏈可變區 (V _H)，其包含 DYSMN (SEQ ID NO:123) 之 CDR-H1 胺基酸序列、選自由 WINTETGEPRYTDDFKG (SEQ ID NO:124)、WINTETGEPRYTDDFTG (SEQ ID NO:130) 及 WINTETGEPRYTQGFKG (SEQ ID NO:131) 所組成之群組之 CDR H2 胺基酸序列及 EGDYDVFDY (SEQ ID NO:125) 之 CDR H3 胺基酸序列；以及輕鏈可變區 (V _L)，其包含選自由 RASKSVSTSSYSYMH (SEQ ID NO:126) 及 KSSKSVSTSSYSYMH (SEQ ID NO:129) 所組成之群組之輕鏈互補決定區 CDR-L1 胺基酸序列、YVSYLES (SEQ ID NO:127) 之 CDR-L2 胺基酸序列及選自由 QHSREFPYT (SEQ ID NO:128) 及 QQSREFPYT (SEQ ID NO:132) 所組成之群組之 CDR-L3 胺基酸序列；或 (ii) 重鏈可變區 (V _H)，其包含 DYSMN (SEQ ID NO:123) 之 CDR-H1 胺基酸序列、WINTETGEPRYTDDFKG (SEQ ID NO:124) 之 CDR-H2 胺基酸序列及 EGDYDVFDY (SEQ ID NO:125) 之 CDR-H3 胺基酸序列；以及輕鏈可變區 (V _L)，其包含 RASKSVSTSSYSYMH (SEQ ID NO:126) 之 CDR-L1 胺基酸序列、YVSYLES (SEQ ID NO:127) 之 CDR-L2 胺基酸序列及 QHSREFPYT (SEQ ID NO:128) 之 CDR-L3 胺基酸序列；或 (iii) 重鏈可變區 (V _H)，其包含 SYGVS (SEQ ID NO:123) 之 CDR-H1 胺基酸序列、IIWGDGSTNYHSALIS (SEQ ID NO:124) 之 CDR-H2 胺基酸序列及 GITTVVDDYYAMDY (SEQ ID NO:125) 之 CDR-H3 胺基酸序列；以及輕鏈可變區 (V _L)，其包含 KSSKSVSTSSYSYMH (SEQ ID NO:129) 之 CDR-L1 胺基酸序列、AATFLAD (SEQ ID NO:127) 之 CDR-L2 胺基酸序列及 QHYYSTPYT (SEQ ID NO:128) 之 CDR-L3 胺基酸序列；或 (iv) 重鏈可變區 (V _H)，其包含 SYGVS (SEQ ID NO:123) 之 CDR-H1 胺基酸序列、WINTETGEPRYTDDFTG (SEQ ID NO:130) 之 CDR-H2 胺基酸序列及 GITTVVDDYYAMDY (SEQ ID NO:125) 之 CDR-H3 胺基酸序列；以及輕鏈可變區 (V _L)，其包含 KSSKSVSTSSYSYMH (SEQ ID NO:129) 之 CDR-L1 胺基酸序列、AATFLAD (SEQ ID NO:127) 之 CDR-L2 胺基酸序列及 QHYYSTPYT (SEQ ID NO:128) 之 CDR-L3 胺基酸序列；或 (v) 重鏈可變區 (V _H)，其包含 SYGVS (SEQ ID NO:123) 之 CDR-H1 胺基酸序列、WINTETGEPRYTQGFKG (SEQ ID NO:131) 之 CDR-H2 胺基酸序列及 GITTVVDDYYAMDY (SEQ ID NO:125) 之 CDR-H3 胺基酸序列；以及輕鏈可變區 (V _L)，其包含 KSSKSVSTSSYSYMH (SEQ ID NO:129) 之 CDR-L1 胺基酸序列、AATFLAD (SEQ ID NO:127) 之 CDR-L2 胺基酸序列及 QHYYSTPYT (SEQ ID NO:128) 之 CDR-L3 胺基酸序列。

在一個態樣中，掩蔽部分掩蔽 CD3 抗原結合域，且包含與 SEQ ID NO: 133 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的重鏈可變區序列及與 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的輕鏈可變區序列或其保留功能的變異體。在一個態樣中，掩蔽部分包含與 SEQ ID NO: 135 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的重鏈可變區序列及與 SEQ ID NO: 136 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的輕鏈可變區序列。在一個態樣中，掩蔽部分包含與 SEQ ID NO: 135 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的重鏈可變區序列及與 SEQ ID NO: 137 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的輕鏈可變區序列。在一個態樣中，掩蔽部分包含與 SEQ ID NO: 138 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的重鏈可變區序列及與 SEQ ID NO: 137 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的輕鏈可變區序列。在一個態樣中，掩蔽部分包含與 SEQ ID NO: 139 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的重鏈可變區序列及與 SEQ ID NO: 140 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的輕鏈可變區序列。在另一態樣中，掩蔽部分包含與 SEQ ID NO: 141 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的重鏈可變區序列及與 SEQ ID NO: 142 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的輕鏈可變區序列。

在一個態樣中，掩蔽部分掩蔽 CD3 結合域且包含 SEQ ID NO: 143 之胺基酸序列。在另一態樣中，掩蔽部分包含 SEQ ID NO: 144 之胺基酸序列。在又一態樣中，掩蔽部分包含 SEQ ID NO: 145 之胺基酸序列。在另一態樣中，掩蔽部分包含 SEQ ID NO: 146 之胺基酸序列。

在另一態樣中，掩蔽部分掩蔽 CD3 抗原結合域且包含：重鏈可變區 (V _H)，其包含 SYGVS (SEQ ID NO:115) 之 CDR-H1 胺基酸序列，IIWGDGSTNYHSALIS (SEQ ID NO:116) 之 CDR-H2 胺基酸序列，及 GITTVVDDYYAMDY (SEQ ID NO:117) 之 CDR-H3 胺基酸序列；及輕鏈可變區 (V _L)，其包含 RASENIDSYLA (SEQ ID NO:118) 之 CDR-L1 胺基酸序列，AATFLAD (SEQ ID NO:119) 之 CDR-L2 胺基酸序列，及 QHYYSTPYT (SEQ ID NO:120) 之 CDR-L3 胺基酸序列。

在一個態樣中，掩蔽部分掩蔽 CD3 抗原結合域，且包含與 SEQ ID NO: 121 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的重鏈可變區序列及與 SEQ ID NO: 122 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的輕鏈可變區序列或其保留功能的變異體。在一個態樣中，掩蔽部分掩蔽 CD3 抗原結合域且包含 SEQ ID NO: 121 之重鏈可變區序列及 SEQ ID NO: 122 之輕鏈可變區序列。在一個態樣中，掩蔽部分包含 SEQ ID NO: 147 之胺基酸序列。

在一個特定態樣中，掩蔽部分為人源化部分。在一個態樣中，用於可逆地隱蔽分子之抗 CD3 抗原結合域的個體遺傳型特異性多肽經人源化。使免疫球蛋白人源化之方法為本領域中所熟知，且如本文所述。

在一個態樣中，掩蔽部分掩蔽 CD3 抗原結合域，且包含與 SEQ ID NO: 133 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的重鏈可變區序列及與 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同的輕鏈可變區序列或其保留功能的變異體。在一個態樣中，掩蔽部分掩蔽 CD3 抗原結合域包含：重鏈可變區序列，其包含 SEQ ID NO: 133 之胺基酸序列；及輕鏈可變區序列，其包含 SEQ ID NO: 134 之胺基酸序列，或其保留功能的變異體。在一個態樣中，掩蔽部分包含 SEQ ID NO: 212 之胺基酸序列。

連接子

在一個態樣中，提供一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其包含通過蛋白酶可切割連接子共價連接至雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子的掩蔽部分，其中掩蔽部分能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域之個體遺傳型結合，從而可逆地隱蔽能夠與 CD3 特異性結合之抗原結合域。在一個態樣中，掩蔽部分共價連接至能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域之重鏈可變區 (V _HCD3)。在一個態樣中，掩蔽部分為抗個體遺傳型 scFv。

在一個特定態樣中，可蛋白酶活化之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子包含連接子，該連接子具有蛋白酶識別位點，該蛋白酶識別位點包含與 SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 196、SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 198、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 200、SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 202、SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 204、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 206、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 208、SEQ ID NO: 209、SEQ ID NO: 210 或 SEQ ID NO: 211 之胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列。在一個態樣中，蛋白酶識別位點包含 SEQ ID NO: 148、SEQ ID NO: 149、SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 161 或 SEQ ID NO: 162 之多肽序列。在一個較佳之實施例中，蛋白酶識別位點包含 SEQ ID NO: 162 之多肽序列。

在一個態樣中，能夠切割蛋白酶可切割連接子的蛋白酶選自由下列各項所組成之群組：金屬蛋白酶，例如基質金屬蛋白酶 (MMP) 1-28，A 分解素及金屬蛋白酶 (ADAM) 2、7-12、15、17-23、28-30 及 33；絲胺酸蛋白酶，例如尿激酶型纖溶酶原活化劑及 Matriptase；半胱胺酸蛋白酶；天冬胺酸蛋白酶；及組織蛋白酶。在一個具體態樣中，蛋白酶為 MMP9 或 MMP2。在又一具體態樣中，蛋白酶為人類 Matriptase。Matriptase，亦稱爲 MT-SP1、ST14 (抑制致瘤性蛋白 14) 或 TADG-15 (腫瘤相關差異表現之基因 15 蛋白) 為大多數人類上皮細胞中所表現之胰蛋白酶樣絲胺酸，且包含 SEQ ID NO:164 之胺基酸序列 (UniProt Q9Y5Y6)。在一個態樣中，蛋白酶可切割連接子包含蛋白酶識別序列 RQARVVNG (SEQ ID NO:148)。在另一態樣中，蛋白酶可切割連接子包含蛋白酶識別序列 PMAKK (SEQ ID NO:162)。

在一個特定態樣中，提供一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其包含：第一輕鏈，該第一輕鏈包含 SEQ ID NO: 102 之胺基酸序列；第一重鏈，該第一重鏈包含 SEQ ID NO:101 之胺基酸序列；第二重鏈，該第二重鏈包含 SEQ ID NO:106 之胺基酸序列；及第二輕鏈，該第二輕鏈包含 SEQ ID NO:104 之胺基酸序列 (分子 11)。

在另一特定態樣中，提供一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其包含：第一輕鏈，該第一輕鏈包含 SEQ ID NO: 90 之胺基酸序列；第一重鏈，該第一重鏈包含 SEQ ID NO:98 之胺基酸序列；第二重鏈，該第二重鏈包含 SEQ ID NO:97 之胺基酸序列；及第二輕鏈，該第二輕鏈包含 SEQ ID NO:92 之胺基酸序列 (分子 6)。

在另一特定態樣中，提供一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其包含：第一輕鏈，該第一輕鏈包含 SEQ ID NO: 90 之胺基酸序列；第一重鏈，該第一重鏈包含 SEQ ID NO:98 之胺基酸序列；第二重鏈，該第二重鏈包含 SEQ ID NO:99 之胺基酸序列；及第二輕鏈，該第二輕鏈包含 SEQ ID NO:94 之胺基酸序列 (分子 7)。

在另一態樣中，提供一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其包含通過不可切割連接子共價連接至雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子的掩蔽部分，其中掩蔽部分能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域之個體遺傳型結合，從而可逆地隱蔽能夠與 CD3 特異性結合之抗原結合域。在一個態樣中，掩蔽部分共價連接至能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域之重鏈可變區 (V _HCD3)。在一個態樣中，掩蔽部分為抗個體遺傳型 scFv。在一個態樣中，不可切割連接子具有 SEQ ID NO:163 之胺基酸序列。

多核苷酸

本發明進一步提供編碼如本文所述之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子或其片段的經分離之多核苷酸。本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子之一個或多種經分離之多核苷酸可表現爲編碼整個抗原結合分子的單個多核苷酸或為共表現的多個 (例如兩個或更多個) 多核苷酸。共表現之由多核苷酸編碼的多肽可通過例如二硫鍵或其他方式締合以形成功能性抗原結合分子。例如，免疫球蛋白之輕鏈部分與免疫球蛋白之重鏈部分可由單獨的多核苷酸編碼。當共表現時，重鏈多肽將與輕鏈多肽締合以形成免疫球蛋白。在一些態樣中，經分離之多核苷酸編碼根據如本文所述之本發明之整個雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子。在其他態樣中，經分離之多核苷酸編碼包含於根據如本文所述之本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子中的多肽。在某些態樣中，多核苷酸或核酸為 DNA。在其他態樣中，本發明之多核苷酸為 RNA，例如，呈信使 RNA (mRNA) 的形式。本發明之 RNA 可以為單鏈或雙鏈 RNA。

重組方法

可例如藉由固態肽合成 (例如 Merrifield 固相合成) 或重組生產獲得本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子。在重組生產時，將例如如上所述之編碼雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子或其多肽片段的一種或多種多核苷酸分離並插入一種或多種載體中，以在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此等多核苷酸可易於使用習知方法進行分離和定序。在本發明之一個態樣中，提供了包含本發明之多核苷酸中的一種或多種的載體，較佳的是包含表現載體。可使用本領域的技術人員所熟知方法來構建包含抗體 (片段) 之編碼序列以及適當的轉錄/轉譯控制信號的表現載體。這些方法包括體外重組 DNA 技術、合成技術及體內重組/基因重組。參見例如以下文獻中所述之技術：Maniatis 等人，MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1989)；及 Ausubel 等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.(1989)。表現載體可以為質體、病毒的一部分，也可以為核酸片段。表現載體包括表現盒，其中將編碼抗體或其多肽片段 (即編碼區) 的多核苷酸與啟動子及/或其他轉錄或轉譯控制元件可操縱地締合以進行選殖。如本文所用的「編碼區」，為由翻譯成胺基酸的密碼子組成的核酸的一部分。儘管「終止密碼子」 (TAG、TGA 或 TAA) 不翻譯成胺基酸，但可以將其視為編碼區的一部分 (如果存在)，但是任何側翼序列 (例如啟動子、核醣體結合位點、轉錄終止子、內含子、5’ 和 3’ 非翻譯區等) 不屬於編碼區的一部分。兩個或更多個編碼區可存在於單個多核苷酸構建體中，例如存在於單個載體上，或存在於單獨的多核苷酸構建體中，例如存在於單獨的 (不同的) 載體上。此外，任何載體可包含單個編碼區，或可包含兩個或更多個編碼區，例如，本發明之載體可編碼一種或多種多肽，該多肽經由蛋白水解後翻譯或共翻譯分離成最終蛋白。另外，本發明之載體、多核苷酸或核酸可編碼異源編碼區，其與編碼本發明之抗體或其多肽片段的多核苷酸或其變異體或衍生物融合或不融合。異源編碼區包括但不限於專門的元件或基序 (例如分泌信號肽) 或異源功能域。可操作的締合係指基因產物的編碼區 (例如，多肽) 與一個或多個調控序列締合，從而使基因產物的表現處於調控序列的影響或控制之下。如果啟動子功能的誘導導致編碼所需基因產物的 mRNA 轉錄，並且兩個 DNA 片段之間的連接子性質不干擾表現調控序列指導基因產物表現的能力，也不干擾 DNA 模培養皿被轉錄的能力，則兩個 DNA 片段 (例如多肽編碼區以及與之相締合的啟動子) 「可操縱地締合」。因此，如果啟動子能夠影響核酸的轉錄，則該啟動子區將與編碼多肽的核酸可操縱地締合。啟動子可以為細胞特異性啟動子，其僅指導預定細胞中 DNA 的大量轉錄。除啟動子外，其他轉錄控制元件，例如增強子、操縱子、抑制子和轉錄終止信號，可與多核苷酸可操縱地締合以指導細胞特異性轉錄。

本文公開了合適的啟動子及其他轉錄控制區。各種轉錄控制區為本領域的技術人員所熟知。其中包括但不限於在脊椎動物細胞中起作用的轉錄控制區，例如但不限於鉅細胞病毒 (例如直接早期啟動子，與內含子 A 結合)、猿猴病毒 40 (例如早期啟動子) 和逆轉錄病毒 (例如盧氏肉瘤病毒)。其他轉錄控制區包括來源於脊椎動物基因的那些，例如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素和兔 â-珠蛋白以及能夠控制真核細胞中基因表現的其他序列。其他適合的轉錄控制區包括組織特異性啟動子和增強子以及誘導型啟動子 (例如，啟動子誘導的四環素)。類似地，各種翻譯控制元件為本領域的普通技術人員所熟知。其中包括但不限於核醣體結合位點、翻譯起始和終止密碼子以及來源於病毒體系的元件 (特定而言內部核醣體進入位點或 IRES，也稱為 CITE 序列)。表現盒還可包含其他特徵，例如複製起點及/或染色體整合元件，例如逆轉錄病毒長末端重複序列 (LTR) 或腺相關病毒 (AAV) 反向末端重複序列 (ITR)。

本發明之多核苷酸及核酸編碼區可與編碼分泌或信號肽的其他編碼區締合，該分泌或信號肽指導由本發明之多核苷酸編碼的多肽的分泌。例如，如果需要分泌抗體或其多肽片段，則可將編碼信號序列的 DNA 置於編碼本發明之抗體或其多肽片段的核酸的上游。根據信號假說，哺乳動物細胞所分泌之蛋白質具有信號肽或分泌前導序列，其在增長的蛋白質鏈透過粗內質網輸出時從成熟蛋白質上裂解下來。本領域的普通技術人員將認識到，脊椎動物細胞所分泌之多肽通常具有與多肽之 N 端融合的信號肽，其從翻譯後的多肽上裂解下來以產生分泌或「成熟」形式的多肽。在某些實施例中，使用天然信號肽，例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽或該序列的功能性衍生物，該功能性衍生物保留指導與之可操縱地締合的分泌的能力。可替代地，可使用異源哺乳動物信號肽或其功能性衍生物。例如，野生型前導序列可被人類組織纖維蛋白溶酶原活化物 (TPA) 或小鼠 β-葡萄醣醛酸苷酶的前導序列取代。

編碼可用於促進以後的純化 (例如組胺酸標籤) 或輔助標記雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子的短蛋白質序列的 DNA 可包括在編碼本發明之抗體或其多肽片段的多核苷酸的內部或末端。

在本發明之又一態樣中，提供包含本發明之一種或多種多核苷酸的宿主細胞。在某些實施例中，提供了包含本發明之一種或多種載體的宿主細胞。多核苷酸和載體可分別單獨或組合結合本文中相對於多核苷酸和載體所述的任何特徵。在一個態樣中，宿主細胞包含載體 (例如已被其轉化或轉染)，該載體包含編碼本發明之抗體 (的一部分) 的多核苷酸。如本文所用，術語「宿主細胞」是指任何種類的細胞系統，其可以被設計成產生本發明的融合蛋白或其片段。適於複製並支持抗原結合分子的表現的宿主細胞為本技術領域中所熟知。可在適當情況下用特定的表現載體轉染或轉導此等細胞，並且可生長大量包含載體的細胞以接種大規模發酵劑，獲得足夠量的抗原結合分子以用於臨床應用。合適的宿主細胞包括原核微生物 (例如大腸桿菌) 或各種真核細胞 (例如中國倉鼠卵巢細胞 (CHO)、昆蟲細胞等)。例如，多肽可能在細菌中產生，特定而言在無需糖基化的情況下。在表現後，多肽可與細菌細胞糊中的可溶性部分分離，並可經過進一步純化。除原核生物以外，真核微生物 (如絲狀真菌或酵母菌) 也為合適的多肽編碼載體的選殖或表現宿主，包括其糖基化途徑已被「人源化」的真菌和酵母菌株，從而導致具有部分或完全人類糖基化模式的多肽的產生。參見：Gerngross，Nat Biotech 22，1409-1414 (2004)；及 Li 等人，Nat Biotech 24，210-215 (2006)。

用於表現 (糖基化) 多肽的合適的宿主細胞也來源於多細胞生物 (無脊椎動物和脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物和昆蟲細胞。已鑑定出許多桿狀病毒株，它們可以與昆蟲細胞結合使用，特別是用於轉染草地貪夜蛾 (Spodoptera frugiperda) 細胞。植物細胞培養物也可以用作宿主。參見例如，美國專利號 5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978 及 6,417,429 (描述在基因轉殖植物中生產抗體的 PLANTIBODIES ^TM技術)。脊椎動物細胞也可用作宿主。例如，可使用適於在懸浮液中生長的哺乳動物細胞系。可用的哺乳動物宿主細胞系的其他實例包括：由 SV40 (COS-7) 轉化的猴腎 CV1 系；人類胚胎腎系 (如 Graham 等人，J Gen Virol 36，59 (1977) 中所述之 293 或 293T 細胞)；幼地鼠腎細胞 (BHK)；小鼠睾丸支持細胞 (如 Mather，Biol Reprod 23，243-251 (1980) 中所述之 TM4 細胞)；猴腎細胞 (CV1)；非洲綠猴腎細胞 (VERO-76)；人類宮頸癌細胞 (HELA)；犬腎細胞 (MDCK)；Buffalo 大鼠肝細胞 (BRL 3A)；人類肺細胞 (W138)；人類肝細胞 (Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤細胞 (MMT 060562)；TRI 細胞 (如 Mather 等人，Annals N.Y.Acad Sci 383，44-68 (1982) 所述)；MRC 5 細胞；及 FS4 細胞。其他可用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞，包括 dhfr- CHO 細胞 (Urlaub 等人，Proc Natl Acad Sci USA 77，4216 (1980))；及骨髓瘤細胞系，例如 YO、NS0、P3X63 和 Sp2/0。有關某些適用於蛋白質生產的哺乳動物宿主細胞系的綜述，參見例如：Yazaki 和 Wu，Methods in Molecular Biology，Vol. 248 (B.K.C. Lo 主編，Humana Press，Totowa, NJ)，pp. 255-268 (2003)。宿主細胞包括培養的細胞，例如哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、細菌細胞和植物細胞等，還包括轉基因動物、基因轉殖植物或培養的植物或動物組織內的細胞。在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞，較佳的是哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢 (CHO) 細胞、人類胚腎 (HEK) 細胞或淋巴樣細胞 (例如，Y0、NS0、Sp20 細胞)。標準技術為本領域中所熟知，可在這些系統中表現外源基因。可對表現包含免疫球蛋白之重鏈或輕鏈的多肽的細胞進行工程改造，使其亦表現其他免疫球蛋白鏈，從而使表現的產物為兼有重鏈和輕鏈的免疫球蛋白。

在一個態樣中，提供一種產生本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子或其多肽片段的方法，其中該方法包含在適合表現本發明之抗體或其多肽片段的條件下培養包含編碼如本文所提供之本發明之抗體或其多肽片段的多核苷酸的宿主細胞，及從宿主細胞 (宿主細胞培養基) 中回收本發明之抗體或其多肽片段。

在某些態樣中，形成抗原結合分子之一部分你的能夠與 CD3 特異性結合的抗原結合域 (例如 Fab 片段) 包含能夠與抗原結合的至少一個免疫球蛋白可變區。可變區可形成並來源於天然或非天然存在的抗體及其片段的一部分。用於生產多選殖抗體和單選殖抗體的方法為本領域中所熟知 (參見例如 Harlow 和 Lane，「Antibodies, a laboratory manual」，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。非天然存在的抗體可使用固相肽合成來構建，可重組產生 (例如，如美國第 4,186,567 號專利中所述)，或者可例如透過篩選包含可變重鏈和可變輕鏈的組合文庫來獲得 (參見例如授予 McCafferty 的美國第 5,969,108 號專利)。

任何動物種類的免疫球蛋白均可用於本發明中。可用於本發明的免疫球蛋白可具有鼠類、靈長類或人類來源。如果融合蛋白旨在供人使用，則可以使用免疫球蛋白之嵌合形式，其中免疫球蛋白之恆定區來源於人類。免疫球蛋白之人源化或完全人源化形式也可根據本領域中所熟知的方法進行製備 (參見例如授予 Winter 的美國第 5,565,332 號專利)。人源化可以透過多種方法實現，這些方法包括但不限於：(a) 將非人類 (例如供體抗體) CDR 移植到人類 (例如受體抗體) 框架和恆定區上，其中保留或不保留關鍵框架殘基 (例如，對於保持良好的抗原結合親和性或抗體功能很重要的那些)，(b) 僅將非人類特異性決定區 (SDR 或 a-CDR；對抗體-抗原相互作用至關重要的殘基) 移植到人類框架和恆定區，或 (c) 移植整個非人類可變域，但透過替換表面殘基將其「隱藏」 (cloaking) 在仿人類區段中。人源化抗體及其製備方法綜述於例如以下文獻中：Almagro 及 Fransson，Front Biosci 13，1619-1633 (2008)，且進一步描述於例如以下文獻中：Riechmann 等人，Nature 332，323-329 (1988)；Queen 等人，Proc Natl Acad Sci USA 86，10029-10033 (1989)；美國第 5,821,337 號專利、第 7,527,791 號專利、第 6,982,321 號專利及第 7,087,409 號專利；Jones 等人，Nature 321，522-525 (1986)；Morrison 等人，Proc Natl Acad Sci 81，6851-6855 (1984)；Morrison 及 Oi，Adv Immunol 44，65-92 (1988)；Verhoeyen 等人，Science 239，1534-1536 (1988)；Padlan，Molec Immun 31(3)，169-217 (1994)；Kashmiri 等人，Methods 36，25-34 (2005) (描述了 SDR (a-CDR) 移植)；Padlan，Mol Immunol 28，489-498 (1991) (描述了「表面重修」)；Dall’Acqua 等人，Methods 36，43-60 (2005) (描述了「FR 改組」)；以及 Osbourn 等人，Methods 36，61-68 (2005) 及 Klimka 等人，Br J Cancer 83，252-260 (2000) (描述了 FR 改組之「導向選擇」方法)。根據本發明之特定免疫球蛋白為人類免疫球蛋白。可使用本領域中所熟知之各種技術生產人類抗體及人類可變區。人類抗體一般性描述於：van Dijk 和 van de Winkel，Curr Opin Pharmacol 5，368-74 (2001)；及 Lonberg，Curr Opin Immunol 20，450-459 (2008)。人類變區可形成人類單株抗體的一部分，且來源於人類單株抗體，單株抗體藉由雜交瘤方法製得 (參見例如：Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第 51-63 頁 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。人類抗體及人類可變區亦可藉由對基因轉殖動物投予免疫原來製備，該基因轉殖動物已被修飾以響應於抗原攻擊而產生完整的人類抗體或具有人類可變區的完整抗體 (參見例如：Lonberg，Nat Biotech 23，1117-1125 (2005))。人類抗體及人類可變區亦可藉由分離選自人源性噬菌體展示文庫的 Fv 選殖株可變區序列來製備 (參見例如：Hoogenboom 等人，Methods in Molecular Biology 178，1-37 (O’Brien 等人編，Human Press，Totowa，NJ，2001)；及 McCafferty 等人，Nature 348，552-554；Clackson 等人，Nature 352，624-628 (1991))。噬菌體通常以單鏈 Fv (scFv) 片段或 Fab 片段展示抗體片段。

在某些態樣中，根據例如 PCT 公開 WO 2012/020006 (參見有關親和力成熟的實例) 或美國專利申請公開號 2004/0132066 中所揭示之方法，對雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子中包含的抗原結合域進行工程改造，以使其具有增强之結合親和力。本發明之抗原結合分子結合特異性抗原決定位之能力可通過酶聯免疫吸附檢定 (ELISA) 或本領域技術人員所熟悉的其他技術，例如表面電漿共振技術 (Liljeblad 等人，Glyco J 17, 323-329 (2000)) 及傳統的結合檢定 (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)) 來量測。競爭測定法可用於鑑定與結合特定抗原的參考抗體競爭的抗原結合分子。在某些實施例中，該等競爭性抗原結合分子與參考抗原結合分子結合至相同表位 (例如線性或構象表位)。用於將表位映射至與其結合之抗原結合分子的詳細例示性方法提供於 Morris (1996) 「Epitope Mapping Protocols」 (在 Methods in Molecular Biology 第 66 卷 (Humana Press, Totowa, NJ) 中)。在一種例示性競爭測定中，將固定化抗原置於包含與抗原結合之第一標記抗原結合分子及待測其與第一抗原結合分子競爭結合至抗原之能力的第二未標記之抗原結合分子的溶液中進行孵育。第二抗原結合分子可存在於雜交瘤上清液中。作為對照，將固定化抗原置於包含第一標記抗原結合分子但不包含第二未標記抗原結合分子的溶液中進行孵育。在允許第一抗體與抗原結合的條件下孵育後，去除多餘的未結合抗體，並測定與固定化抗原相關聯之標記物的量。如果測試樣品中與固定抗原相關的標記物的數量相對於對照樣品而言明顯減少，則表明第二抗原結合分子正在與第一抗原結合分子競爭與抗原之結合。參見 Harlow 和 Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)。

按照本文所述之方法製備的本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子可藉由本領域中已知的技術進行純化，例如高效能液相層析法、離子交換層析法、凝膠電泳、親和力層析法、粒徑篩析層析法等。用於純化特定蛋白質之實際條件將部分取決於淨電荷、疏水性、親水性等因素，並且對本領域的技術人員而言為顯而易見的。對於親和力層析純化，可使用抗體、配體、受體或抗原以結合抗原結合分子。例如，對於本發明之抗原結合分子的親和力層析純化，可使用具有蛋白 A 或蛋白 G 的基質。可使用順序蛋白 A 或蛋白 G 親和力層析法和粒徑篩析層析法分離基本上如實例中所述之抗原結合分子。CD28 抗原結合分子或其片段之純度可藉由多種熟知的分析方法 (包括凝膠電泳法、高壓液相層析法等) 中之任一種進行測定。例如，如藉由還原型及非還原型 SDS-PAGE 所證明的，如實例中所述之所表現的 CD28 抗原結合分子完整且組裝正確。

測定

可採用本領域中所熟知的各種分析法對本文所提供之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子的物理/化學性質和/或生物活性進行鑑別、篩選或表徵。

1. 親和力測定

本文所提供之抗原結合分子與相應標靶之親和力可根據實例中所述之方法藉由表面電漿共振 (SPR) 技術，使用標準儀器 (例如 Proteon 儀器 (Bio-rad)) 及受體或標靶蛋白 (例如可藉由重組表現所獲得的那些) 來測定。雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子與其抗原之親和力亦可藉由表面電漿共振 (SPR)，使用標準儀器 (例如 Proteon 儀器 (Bio-rad)) 及受體或標靶蛋白 (例如可藉由重組表現所獲得的那些) 來測定。根據一個態樣，藉由表面電漿共振技術，使用 Proteon ® 儀器 (Bio-Rad) 於 25°C 下量測 K _D。

在一個態樣中，與 CD3 之結合活性藉由 SPR 進行測定，如下所述：在 Biacore T200 儀器 (GE Healthcare) 上於 25℃ 以 HBS-P+ (10 mM HEPES，150 mM NaCl pH 7.4，0.05% 表面活性劑 P20) 作為運行及稀釋緩衝液執行 SPR。將生物素化人類 CD3ɛ/δ (與人類 Fc 域融合之 CD3 δ 及 CD3 ε 胞外域的異二聚體，包含杵-臼修飾及 C 端 Avi 標籤；參見 SEQ ID NO: 41 及 SEQ ID NO: 42) 以及生物素化抗 huIgG (Capture Select, Thermo Scientific, #7103262100) 固定於 S 系列感測芯片 SA (GE Healthcare, #29104992) 上，使表面密度達到至少 1000 共振單位 (RU)。以 5 μl/min 之流速在 30 s 内注入濃度為 2 μg/ml 的抗 CD3 抗體，並監測 120 s 内之解離。藉由在 60 s 内注入 pH 1.5 的 10 mM 甘胺酸，使表面再生。藉由扣除空白進樣並扣除由空白對照流通池獲得之響應來校正本體折射率差。在評估時，取注射結束後 5 秒之結合響應。為使結合信號標準化，將 CD3 結合除以抗 huIgG 反應 (捕獲固定化抗 huIgG 抗體上之抗 CD3 抗體後獲得的信號 (RU))。在特定處理後抗體對 CD3 之結合活性相對於經不同處理後該抗體對 CD3 之結合活性，藉由參考特定處理後之抗體樣品的結合活性與經過不同處理後之相應抗體樣品來計算。

2. 結合測定及其他測定

本文所提供之雙特異性抗原結合分子與相應的受體表現細胞之結合可藉由流式細胞術 (FACS) 使用表現特定受體或標靶抗原之細胞系來評估。在一個態樣中，在結合測定中使用表現人類 CD28 的 CHO 細胞 (母代細胞系 CHO-k1 ATCC #CCL-61，其經修飾以穩定過度表現人類 CD28)。

3. 活性測定

在一個態樣中，提供用於鑑定具有生物活性之 CD28 抗原結合分子的測定。生物活性可例如包括誘導 T 細胞的增殖、誘導 T 細胞中的信號傳導、誘導 T 細胞中活化標志物的表現、誘導 T 細胞分泌細胞介素、誘導標靶細胞 (如腫瘤細胞) 裂解以及誘導腫瘤消退及/或改善生存率。特定而言，用實例 2 至 4 中所述之方法或腫瘤細胞殺傷來量測 T 細胞活化及細胞介素分泌。例如，使用 Jurkat NFAT 報告細胞測定來量測 T 細胞活化。亦提供在 活體内及/或 活體外具有該等生物活性之抗原結合分子。

醫藥組成物、調配物及投予途徑

在又一態樣中，本發明提供包含本文所提供之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子中之任一種的醫藥組成物，例如用於以下任何治療方法。在一個實施例中，提供一種醫藥組成物，該醫藥組成物包含本文所提供之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子及至少一種醫藥上可接受之賦形劑。在另一態樣中，醫藥組成物包含本文所提供之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子及至少一種額外之治療劑，如下文所述。

本發明之醫藥組成物包含治療有效量之溶解或分散於醫藥上可接受之賦形劑中的一種或多種雙特異性抗原結合分子。短語「醫藥上或藥理學上可接受」是指在採用的劑量和濃度下通常對受體無毒的分子實體和組成物，即給予動物 (例如人類) 時不產生不利的、過敏或其他不良反應 (在適當情況下)。根據本揭露，本領域技術人員將認識到包含至少一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子及視情況存在的額外活性成分的醫藥組成物的製備方法，如 Remington's Pharmaceutical Sciences 第 18 版 (Mack Printing Company，1990) 所例示，該文獻以引用方式併入本文中。特定而言，組成物為凍乾調配物或水溶液。如本文所使用之，「醫藥上可接受之賦形劑」包括任何及所有溶劑、緩沖液、分散介質、包衣、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑 (例如抗菌劑、抗真菌劑) 、等滲劑、鹽、穩定劑及其組合，如本領域中普通技術人員所知。

腸胃外組成物包括那些設計用於注射投予的組成物，例如皮下、皮內、病灶內、靜脈內、動脈內、肌肉內、鞘內腔或腹腔內注射。對於注射，可在水溶液中 (較佳地在生理相容性緩衝液中，例如 Hanks 溶液、Ringer 溶液或生理鹽水緩衝液) 配製本發明之含有 TNF 家族配體三聚體的抗原結合分子。該溶液可包含配製劑，例如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。可替代地，雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子可以呈粉末形式，以便在使用前與合適的賦形劑 (例如無菌無熱原水) 一起配製。藉由將所需量的本發明之融合蛋白併入適當的溶劑以及所需的以下枚舉之多種其他成分中來製備無菌注射溶液。無菌性可易於例如透過無菌濾膜過濾來實現。通常，透過將各種滅菌后的活性成分摻入含有基本分散介質及/或其他成分的無菌載劑中來製備分散液。對於用於製備無菌注射液、混懸劑或乳劑的無菌粉末，較佳的製備方法是真空乾燥或冷凍乾燥技術，該技術可從先前過濾後的無菌液體介質中得到活性成分與任何其他所需成分的粉末。如有必要，應適當緩衝液體介質，並且在註射足夠的鹽水或葡萄糖之前先使液體稀釋劑等滲。組成物必須在製造和儲存條件下保持穩定，並且必須能夠抵抗例如細菌和真菌等微生物的污染作用。應當理解，內毒素污染應最小限度地保持在安全濃度，例如，小於 0.5 ng/mg 蛋白質。合適的醫藥上可接受之賦形劑包括但不限於：緩沖劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫胺酸；防腐劑 (例如十八烷基二甲基芐基氯化銨；六甲基氯化銨；苯扎氯銨；芐索銨氯；苯酚、丁醇或芐醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇和間甲酚)；低分子量 (小於約 10 個殘基) 多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑 (例如 EDTA)；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，例如鈉；金屬錯合物 (例如鋅蛋白錯合物)；及/或非離子表面活性劑，例如聚乙二醇 (PEG)。水性注射懸浮液可包含提高混懸劑黏度的化合物，例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、右旋葡萄聚糖等。視情況，懸浮液還可包含合適的穩定劑或提高化合物溶解度的試劑，以製備高濃度溶液。另外，可將活性化合物的懸浮液製備為合適的油性注射懸浮液。合適的親脂性溶劑或載劑包括脂肪油 (例如芝麻油) 或合成脂肪酸酯 (例如油酸乙酯或甘油三酯) 或脂質體。

活性成分可以包載在例如透過凝聚技術或透過介面聚合製備的微囊 (例如，分別為羥甲基纖維素微囊或明膠微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊) 中、膠體藥物遞送系統 (例如脂質體、白蛋白微球、微乳、奈米顆粒和奈米囊 (nanocapsule)) 中或粗滴乳狀液中。此等技術公開於 Remington’s Pharmaceutical Sciences (第 18 版，Mack Printing Company，1990) 中。可製備緩釋製劑。緩釋製劑的適宜的實例包括含有多肽的固體疏水聚合物的半透性基質，該基質是成形物品的形式，例如膜或微囊。在特定實施例中，可以透過在組成物中使用延遲吸收的物質 (例如單硬脂酸鋁、明膠或其組合) 來產生可注射組成物的延長吸收。本文中例示性醫藥上可接受之賦形劑進一步包括間質藥物分散劑，例如，可溶性中性活性透明質酸酶糖蛋白 (sHASEGP)，例如，人類可溶性 PH-20 透明質酸酶糖蛋白，例如 rHuPH20 (HYLENEX®，Baxter International, Inc.)。某些例示性 sHASEGP 及用法 (包括 rHuPH20) 描述於美國專利公開號 2005/0260186 和 2006/0104968 中。在一個態樣中，sHASEGP 與一種或多種額外的糖胺聚醣酶例如軟骨素酶結合在一起。例示性凍乾抗體調配物如美國第 6,267,958 號專利所述。水性抗體調配物包括美國專利第6,171,586號及WO2006/044908中所述之調配物，後者調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。除之前描述的組成物外，雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子亦可配製為儲存製劑。此等長效調配物可藉由植入 (例如皮下或肌肉內) 或透過肌肉內注射來投予。因此，例如，雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子可以用適合的聚合物質或疏水物質 (例如作為可用油中的乳狀液) 或離子交換樹脂配製，或配製為微溶的衍生物，例如配製為微溶的鹽類。

包含本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子的醫藥組成物可以利用習用的混合、溶解、乳化、包膜、誘捕或凍乾方法來製備。可使用一種或多種有助於將蛋白質加工成可藥用製劑的生理上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑以習用方式配製醫藥組成物。適宜的調配物視所選的投藥途徑而定。本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子可以以游離酸或鹼、中性或鹽形式配製成組成物。醫藥上可接受之鹽是基本上保留游離酸或鹼的生物活性的鹽。這些包括酸加成鹽，例如與蛋白質組成物的游離氨基形成的那些，或與無機酸 (例如，鹽酸或磷酸) 或有機酸 (例如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸) 形成的那些。與游離羧基形成的鹽類還可以衍生自：無機鹼，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；或有機鹼，例如異丙胺、三甲胺、組胺酸或普魯卡因。藥用鹽趨向於比對應的游離鹼形式更易溶於水性溶劑和其他質子性溶劑。本文之組成物亦可含有適合於所治療的特定適應症的多於一種活性成分，優先地，為那些相互無不利影響的具有互補活性成分。此等活性成分適宜地以對預期目的有效的量組合存在。用於體內投藥的調配物通常是無菌的。無菌性可易於例如透過無菌濾膜過濾來實現。

治療方法及組成物

本文所提供之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子中的任一種皆可用於治療方法中，其單獨或聯合使用。

在一個態樣中，提供用爲藥劑的雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子。在又一態樣中，提供了用於治療癌症之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子。在某些態樣中，提供用於治療方法中之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子。在某些態樣中，本文提供用於治療患有癌症之個體之方法中的雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，該方法包含向個體投予有效量之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子。在一個該等實施例中，該方法進一步包含將有效量之至少一種額外的治療劑投予個體。

在一個態樣中，雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子用於抑制癌細胞之生長。因此，在特定態樣中，雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子用於治療癌症。該等癌症包括例如：乳腺癌、肺癌、皮膚癌、血癌、鱗狀細胞癌、骨癌、腎癌、頭頸癌、胃癌 (stomach cancer)、前列腺癌、卵巢癌、結腸直腸癌、結腸癌、宮頸癌、食道癌、氣管癌、胃癌 (gastric cancer)、膀胱癌、子宮癌、直腸癌或小腸癌、胰腺癌或其他上皮癌或與其相關的轉移。

在某些態樣中，提供用於治療方法中之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子。在某些態樣中，本文提供用於治療患有癌症之個體之方法中的雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，該方法包含向個體投予有效量之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子。在另一態樣中，提供一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其用於治療患有表現 CD3 之癌症之個體的方法中，該癌症特別是上皮癌或鱗癌或選自乳腺癌、肺癌、胃癌 (stomach cancer)、前列腺癌、卵巢癌、大腸癌、結腸癌、食道癌、氣管癌、胃癌 (gastric cancer)、膀胱癌、子宮癌、直腸癌、胰腺癌或小腸癌的癌症，該方法包含向個體投予有效量之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子。在一個該等實施例中，該方法進一步包含將有效量之至少一種額外的治療劑投予個體。

在又一態樣中，本文提供如本文所述之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子在藥劑製造或配製中之用途。在一個實施例中，藥劑用於治療癌症。在又一態樣中，藥劑用於治療癌症的方法中，該方法包括向患有癌症的個體投予治療有效量之藥劑。在一個該等態樣中，該方法進一步包含將有效量之至少一種另外治療劑 (如下文所述) 投予個體。在另一態樣中，藥劑用於治療癌症。在又一態樣中，藥劑用於治療癌症的方法中，該方法包括向患有癌症的個體投予治療有效量之藥劑。在又一態樣中，本文提供一種治療癌症之方法。在一個態樣中，該方法包含向患有癌症之個體投予有效量之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子。在一個此等態樣中，該方法進一步包含將有效量之至少一種另外治療劑 (如下文所述) 投予個體。根據上述任一態樣的「個體」可以是人。

在又一態樣中，本發明提供包含如本文所報告之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子中之任一種的醫藥組成物，例如其用於上述任何治療方法中。在一個態樣中，醫藥組成物包含如本文所報告之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子中之任一種及醫藥上可接受之載劑。在另一態樣中，醫藥組成物包含如本文所報告之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子中之任一種及至少一種額外治療劑。

如本文所報告知雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子在治療中可單獨使用或與其他藥劑聯合使用。例如，如本文所報告知雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子可與至少一種額外之治療劑共同投予。因此，提供用於癌症免疫療法中的如本文所述之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子。在某些實施例中，提供用於癌症免疫療法中的雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子。根據上述任一態樣的「個體」較佳地為人。

上面提到的此等聯合療法涵蓋聯合投予 (其中兩種或多種治療劑包含在同一或單獨的醫藥組成物中)，以及單獨投予，在這種情況下，如本文所報告之抗體的投予可在投予額外之一種或多種治療劑之前、同時和/或之後發生。在一個態樣中，投予雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子與投予其他治療劑彼此發生在約一個月內，或發生在約一週、兩週或三週內，或發生在約一天、二天、三天、四天、五天或六天內。

本文所報告之抗原結合分子 (及任意其他治療劑) 可藉由任意合適手段投予，包括腸胃外、肺內及鼻內投予，並且如果需要局部治療，則可以採用病灶內投予。腸胃外輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投予。投予可透過任何合適的途徑進行，例如透過注射，例如靜脈內或皮下注射，部分取決於短暫投予還是長期投予。本文中考慮各種給藥方案，其包括但不限於在多種時間點單次或多次投予、快速注射投予及脈衝輸注。

如本文所述之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子將按照與良好醫學實踐一致的方式進行配製、給藥及投予。在這種情況下，考慮的因素包括待治療的具體障礙、待治療的具體哺乳動物、個體患者的臨床病症、障礙的原因、遞送藥物的部位、投予方法、投予日程及醫療從業者已知的其他因素。雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子並非必須、但可以任選與一種或多種目前用於預防或治療所述疾病之藥劑一起配製。此等其他治療劑的有效量取決於存在於調調配物中存在的抗體量、病症或治療的類型以及上文討論的其他因素。這些通常以與本文中所述相同的劑量及投予途徑，或本文中所述劑量的約 1% 至 99%，或以經驗上/臨床上確定為適當的任何劑量及藉由任何途徑使用。

為了預防或治療疾病，如本文所述之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子之適當劑量 (當單獨或與一種或多種其他額外治療劑組合使用時) 將視欲治療之疾病類型、抗體類型、疾病嚴重程度及病程、是出於預防目的或是治療目的投予抗體、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應及主治醫師之判斷而定。適合的是，在一次或一系列治療中向患者投予雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子。根據疾病之類型和嚴重程度不同，約 1 µg/kg 至 15 mg/kg (例如 0.5 mg/kg - 10 mg/kg) 的雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子可為例如藉由一次或多次分開投予或透過連續輸注以投予患者的初始候選劑量。根據上述因素，一種典型的日劑量可在約 1 µg/kg 至 100 mg/kg 或更多的範圍內。對於在幾天或更長時間內重複投予，視病症而定，治療通常將持續直至出現所需的疾病症狀抑制。抗體的一種例示性劑量將在從 0.05 mg/kg 至約 10 mg/kg 的範圍內。因此，可以對患者投予約 0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg 或 10 mg/kg 中的一種或多種劑量 (或其任意組合)。此等劑量可以間歇投予，例如每週或每三週投予 (例如，使得患者接受約 2 種至約 20 種或例如約 6 種劑量的抗體)。可以投予初始較高的負荷劑量，然後投予一種或多種較低的劑量。但是，可以使用其他劑量方案。透過習用技術和測定很容易監測此治療的進展。

其他藥劑及治療

如前文所述，本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子可在治療中與一種或多種其他藥劑聯合投予。例如，本發明之抗原結合分子可以與至少一種其他治療劑聯合投予。術語「治療劑」涵蓋為治療需要此等治療的個體中之症狀或疾病而可能投予的任何藥劑。此等另外的治療劑可包含適合於所治療的特定適應症的任何活性成分，較佳地，為那些相互無不利影響的具有互補活性成分。在某些實施例中，該另外的治療劑為其他抗癌劑，例如微管破壞劑、抗代謝藥、拓撲異構酶抑制劑、DNA 嵌入劑、烷化劑、激素療法、激酶抑制劑、受體拮抗劑、腫瘤細胞凋亡啟動劑或抗血管發生劑。在某些態樣中，該另外的治療劑為免疫調節劑、細胞生長抑制劑、細胞黏附抑制劑、細胞毒性或細胞生長抑制劑、細胞凋亡啟動劑或增加細胞對凋亡誘導劑敏感性的藥劑。

因此，提供用於治療癌症的本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子或包含該等分子的醫藥組成物，其中雙特異性抗原結合分子與化療劑、放射療法及/或用於癌症免疫療法中之其他藥劑聯合投予。

此等其他藥物適宜地以對預期目的有效的量組合存在。此類其他藥劑的有效量取決於所使用之融合蛋白數量、病症或治療的類型以及上文討論的其他因素。本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體通常以與本文中所述相同的劑量和投予途徑，或本文中所述劑量的約 1% 至 99%，或以經驗上/臨床上確定為適當的任意劑量和透過任意途徑使用。上面提到的此等聯合療法涵蓋聯合投予 (其中兩種或多種治療劑包含在同一或單獨的組合物中)，以及單獨投予，在這種情況下，本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體的投予可在投予其他治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後發生。

在又一態樣中，提供用於治療癌症的如前文所述之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中雙特異性抗原結合分子與另一種免疫調解劑聯合投予。術語「免疫調解劑」是指包括影響免疫系統的單株抗體的任何物質。本發明之分子可被視爲免疫調解劑。免疫調解劑可用爲抗腫瘤劑以治療癌症。在一個態樣中，免疫調解劑包括但不限於抗 CTLA4 抗體 (例如伊匹單抗)、抗 PD1 抗體(例如納武利尤單抗或帕博利珠單抗)、PD-L1抗體(例如阿替利珠單抗、阿維魯單抗或度伐魯單抗)、OX40 促效劑 (特別是 OX-40 抗體)、4-1BB 促效劑 (4-1BBL 或 4-1BB 抗效劑) 及 GITR 促效劑 (例如 GITR 抗體)。如上文所述之此類聯合療法包括聯合投予 (即兩種或多種治療劑包含在同一或單獨的組成物中)，以及單獨投予，在這種情況下，雙特異性抗原結合分子之投予可在投予額外的治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後發生。

上面提到的此等聯合療法涵蓋聯合投予 (其中兩種或多種治療劑包含在同一或單獨的醫藥組成物中)，以及單獨投予，在這種情況下，治療劑之投予可在投予額外之一種或多種治療劑之前、同時和/或之後發生。在一個實施例中，投予治療劑與投予另外治療劑彼此發生在約一個月內，或發生在約一週、兩週或三週內，或發生在約一天、二天、三天、四天、五天或六天內。

製品

本發明的另一態樣提供包含用於治療、預防和/或診斷上述疾病的製成品。該製品包括容器及容器上或與容器相關的標籤或藥品說明書。合適的容器包括例如，瓶、小瓶、注射器、IV 溶液袋等。該等容器可以由多種材料例如，玻璃或塑膠形成。該容器可容納組成物，該組成物本身或與有效治療、預防和/或診斷症狀的另一組成物結合使用，並可能具有無菌入口 (例如，容器可為具有可透過皮下注射針頭穿孔的塞子的靜脈內溶液袋或小管)。組成物中的至少一種活性劑為本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子。該標籤或藥品說明書指示該組成物用於治療所選擇的症狀。此外，該製品可以包括 (a) 其中包含有組成物的第一容器，其中，該組成物包含本發明之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子；及 (b) 其中包含有組成物的第二容器，其中，組成物包含其他細胞毒性或其他治療劑。本發明之此實施例中的製成品可以進一步包含指示組成物可以用於治療具體疾病的藥品說明書。可替代地或另外地，製成品可以進一步包含第二 (或第三) 容器，該容器包含醫藥上可接受之緩衝劑，例如抑菌注射用水 (BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、Ringer 溶液和葡萄糖溶液。從商業和使用者的角度來看，它可以進一步包含其他材料，其中包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭和注射器。表 B ( 序列 ) ：

SEQ ID NO:	名稱	序列
1	hu CD28 UniProt 編號 P10747，版本 1	MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE FRASLHKGLD SAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPP PYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG GVLACYSLLV TVAFIIFWVR SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS
2	CD3 (CH2527) CDR-H1	TYAMN
3	CD3 (CH2527) CDR-H2	RIRSKYNNYATYYADSVKG
4	CD3 (CH2527) CDR-H3	HGNFGNSYVSWFAY
5	CD3 (CH2527) CDR-L1	GSSTGAVTTSNYAN
6	CD3 (CH2527) CDR-L2	GTNKRAP
7	CD3 (CH2527) CDR-L3	ALWYSNLWV
8	重鏈可變域 VH，CD3 (CH2527)	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
9	輕鏈可變域 VL，CD3 (CH2527)	QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
10	CD3 (P035.093) CDR-H1	SYAMN
11	CD3 (P035.093) CDR-H2	RIRSKYNNYATYYADSVKG
12	CD3 (P035.093) CDR-H3,	ASNFPASYVSYFAY
13	CD3 (P035.093) CDR-L1	GSSTGAVTTSNYAN
14	CD3 (P035.093) CDR-L2	GTNKRAP
15	CD3 (P035.093) CDR-L3	ALWYSNLWV
16	重鏈可變域 VH，CD3 (P035.093)	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRASNFPASYVSYFAYWGQGTLVTVSS
17	輕鏈可變域 VL，CD3 (P035.093)	QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTC GSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIG GTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYC ALWYSNLWVFGGGTKLTVL
18	CD28(SA) CDR-H1	SYYIH
19	CD28(SA) CDR-H2	CIYPGNVNTNYNEKFKD
20	CD28(SA) CDR-H3	SHYGLDWNFDV
21	CD28(SA) CDR-L1	HASQNIYVWLN
22	CD28(SA) CDR-L2	KASNLHT
23	CD28(SA) CDR-L3	QQGQTYPYT
24	CD28(SA) VH	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS
25	CD28(SA) VL	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIK
26	CD28 CDR-H1 共通	SYYIH
27	CD28 CDR-H2 共通	SIYPX ₁X ₂X ₃X ₄TNYNEKFKD，其中 X ₁為 G 或 R X ₂為 N 或 D X ₃為 V 或 G X ₄為 N 或 Q 或 A
28	CD28 CDR-H3 共通	SHYGX ₅DX ₆NFDV，其中 X ₅為 L 或 A X ₆為 W 或 H 或 Y 或 F
29	CD28 CDR-L1 共通	X ₇ASQX ₈IX ₉X ₁₀X ₁₁LN，其中 X ₇為 H 或 R X ₈為 N 或 G X ₉為 Y 或 S X ₁₀為 V 或 N X ₁₁為 W 或 H 或 F 或 Y
30	CD28 CDR-L2 共通	X ₁₂X ₁₃SX ₁₄LX ₁₅X ₁₆，其中 X ₁₂為 K 或 Y X ₁₃為 A 或 T X ₁₄為 N 或 S X ₁₅為 H 或 Y X ₁₆為 T 或 S
31	CD28 CDR-L3 共通	QQX ₁₇QTYPYT，其中 X ₁₇為 G 或 A
32	CD28 VH 變異體 a	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS
33	CD28 VH 變異體 b	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDHNFDVWGQGTTVTVSS
34	CD28 VH 變異體 c	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGADHNFDVWGQGTTVTVSS
35	CD28 VH 變異體 d	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPRDGQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDYNFDVWGQGTTVTVSS
36	CD28 VH 變異體 e	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS
37	CD28 VH 變異體 f	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDFNFDVWGQGTTVTVSS
38	CD28 VH 變異體 g	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPRNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDHNFDVWGQGTTVTVSS
39	CD28 VH 變異體 h	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPRDVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDHNFDVWGQGTTVTVSS
40	CD28 VH 變異體 i	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYYIHWVRQAPGKGLEWVASIYPGNVNTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS
41	CD28 VH 變異體 j	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYYIHWVRQAPGKGLEWVASIYPGNVATRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS
42	CD28 VL 變異體 k	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVHLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAQTYPYTFGGGTKVEIK
43	CD28 VL 變異體 l	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVFLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIK
44	CD28 VL 變異體 m	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIK
45	CD28 VL 變異體 n	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIK
46	CD28 VL 變異體 o	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIK
47	CD28 VL 變異體 p	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIK
48	CD28 VL 變異體 q	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISNHLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIK
49	CD28 VL 變異體 r	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGIYVYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIK
50	CD28 VL 變異體 s	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISVYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIK
51	CD28 VL 變異體 t	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGQGTKLEIK
52	CD28 (變異體 8) CDR-H1	SYYIH
53	CD28 (變異體 8) CDR-H2	SIYPGNVQTNYNEKFKD
54	CD28 (變異體 8) CDR-H3	SHYGLDWNFDV
55	CD28 (變異體 8) CDR-L1	HASQNIYVYLN
56	CD28 (變異體 8) CDR-L2	KASNLHT
57	CD28 (變異體 8) CDR-L3	QQGQTYPYT
58	CD28 (變異體 15) CDR-H1	SYYIH
59	CD28 (變異體 15) CDR-H2	SIYPGNVQTNYNEKFKD
60	CD28 (變異體 15) CDR-H3	SHYGLDWNFDV
61	CD28 (變異體 15) CDR-L1	HASQNIYVFLN
62	CD28 (變異體 15) CDR-L2	KASNLHT
63	CD28 (變異體 15) CDR-L3	QQGQTYPYT
64	CD28 (變異體 29) CDR-H1	SYYIH
65	CD28 (變異體 29) CDR-H2	SIYPGNVNTNYNEKFKD
66	CD28 (變異體 29) CDR-H3	SHYGLDWNFDV
67	CD28 (變異體 29) CDR-L1	HASQNIYVWLN
68	CD28 (變異體 29) CDR-L2	KASNLHT
69	CD28 (變異體 29) CDR-L3	QQGQTYPYT
70	人類 CD3ε Uniprot 編號 P07766	MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI
71	食蟹獼猴 CD3ε Uniprot 編號 Q95LI5	MQSGTRWRVLGLCLLSIGVWGQDGNEEMGSITQTPYQVSISGTTVILTCSQHLGSEAQWQHNGKNKEDSGDRLFLPEFSEMEQSGYYVCYPRGSNPEDASHHLYLKARVCENCMEMDVMAVATIVIVDICITLGLLLLVYYWSKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQQDLYSGLNQRRI
72	VH (CD28 SA) CH1 (EE)- Fc 杵 PGLALA	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
73	VH (CD28 變異體 g) CH1 (EE) - Fc 杵 PGLALA	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPRNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDHNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
74	VH (CD28 變異體 f) CH1 (EE) - Fc 杵 PGLALA	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDFNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
75	VH (CD28 變異體 j) CH1 (EE) - Fc 杵 PGLALA	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYYIHWVRQAPGKGLEWVASIYPGNVATRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
76	VH (CD28 變異體 e) CH1 (EE)- Fc 杵 PGLALA	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
77	VH (CD28 變異體 b) CH1 (EE) - Fc 杵 PGLALA	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDHNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
78	VH (CD28 變異體 a) CH1 (EE) - Fc 杵 PGLALA	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
79	VH (CD28 變異體 i) CH1 (EE) - Fc 杵 PGLALA	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYYIHWVRQAPGKGLEWVASIYPGNVNTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
80	VL-CD28(SA)-CL「RK」	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
81	VL (CD28 變異體 k)-CL (RK)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVHLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAQTYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
82	VL (CD28 變異體 l)-CL (RK)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVFLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
83	VL (CD28 變異體 m)-CL (RK)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
84	VL (CD28 變異體 r)-CL (RK)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGIYVYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
85	VL (CD28 變異體 s)-CL (RK)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISVYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
86	VL (CD28 變異體 t)-CL (RK)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
87	Fc 臼 PGLALA，HYRF	DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSP
88	Avi 標籤	GLNDIFEAQKIEWHE
89	CD3(CH2527) VH-CL hu IgG1 Fc 杵 PGLALA	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
90	CD3(CH2527) VL-CH1	QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
91	CD28(9.3) VH-CH1 (EE) hu IgG1 Fc 臼 PGLALA	EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
92	CD28(9.3) VL-Cκ (RK)	DIELTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYVTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGVPARFSGSGSGTNFSLNIHPVDEDDVAMYFCQQSRKVPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADY EKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
93	CD28(SA) VH-CH1 (EE) hu IgG1 Fc 臼 PGLALA	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
94	CD28(SA) VL-Cκ (RK)	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
95	Fc 杵 PGLALA	DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
96	Fc 臼 PGLALA	DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
97	CD28(9.3) VH-CH1 (EE) hu IgG1 Fc 臼 PGLALA	EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSP
98	ScFv (4.24.72) VH-(G4S)4-VL-Matriptase 連接子- CD3 VH-CL hu IgG1 Fc 杵 PGLALA	QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVSWVRQPPGKCLEWLGIIWGDGSTNYHSALISRLSISKDNSKSQVFLKLNSLQTDDTATYYCAKGITTVVDDYYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIDSYLAWYQQKQGKSPQLLVYAATFLADDVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDVARYYCQHYYSTPYTFGCGTKLEIKGGGGSGGGGSRQARVVNGGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
99	CD28(SA) VH-CH1 (EE) hu IgG1 Fc 臼 PGLALA	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDI AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSP
100	ScFv (4.24.72) VH-(G4S)4-VL-不可切割連接子- CD3 VH-CL hu IgG1 Fc 杵 PGLALA	QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVSWVRQPPGKCLEWLGIIWGDGSTNYHSALISRLSISKDNSKSQVFLKLNSLQTDDTATYYCAKGITTVVDDYYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIDSYLAWYQQKQGKSPQLLVYAATFLADDVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDVARYYCQHYYSTPYTFGCGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
101	CD28(SA_變異體 8) VL-CH hu IgG1 Fc 臼 PGLALA	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY ICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
102	CD28(SA_變異體 8) VH-CL	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDFNFDVWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
103	CD3 (P035.093) VH-CH1 (EE) Fc 杵 PGLALA	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRASNFPASYVSYFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
104	CD3 (P035.093) VL-Cκ	QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSKKLQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
105	ScFv (4.24.72) VH-(G4S) ₄-VL-不可切割連接子- CD3 (P035.093) VH-CH1 hu IgG1 Fc 杵 PGLALA	QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTVTDYSMNWVKQAPGKCLKWMGWINTETGEPRYTDDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDSATYFCAREGDYDVFDYWGHGTTLKVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYVSYLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPYTFGCGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRASNFPASYVSYFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
106	ScFv (4.24.72) VH-(G4S)4-VL-PMAKK- CD3 (P035.093) VH-CH1 hu IgG1 Fc 杵 PGLALA	QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTVTDYSMNWVKQAPGKCLKWMGWINTETGEPRYTDDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDSATYFCAREGDYDVFDYWGHGTTLKVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYVSYLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPYTFGCGTKLEIKSGGGSGGGGSPMAKKGGGGSGGGGSGGGGSGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC VRASNFPASYVSYFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
107	CD28(mAb 9.3) CDR-H1	DYGVH
108	CD28(mAb 9.3) CDR-H2	VIWAGGGTNYNSALMS
109	CD28(mAb 9.3) CDR-H3	DKGYSYYYSMDY
110	CD28(mAb 9.3) CDR-L1	RASESVEYYVTSLMQ
111	CD28(mAb 9.3) CDR-L2	AASNVES
112	CD28(mAb 9.3) CDR-L3	QQSRKVPYT
113	CD28(mAb 9.3) VH	EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSS
114	CD28(mAb 9.3) VL	DIELTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYVTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGVPARFSGSGSGTNFSLNIHPVDEDDVAMYFCQQSRKVPYTFGGGTKLEIK
115	CDR-H1 (ID_4.32.63)	SYGVS
116	CDR-H2 (ID_4.32.63)	IIWGDGSTNYHSALIS
117	CDR-H3 (ID_4.32.63)	GITTVVDDYYAMDY
118	CDR-L1 (ID_4.32.63)	RASENIDSYLA
119	CDR-L2 (ID_4.32.63)	AATFLAD
120	CDR-L3 (ID_4.32.63)	QHYYSTPYT
121	VH (ID_4.32.63)	QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVSWVRQPPGKCLEWLGIIWGDGSTNYHSALISRLSISKDNSKSQVFLKLNSLQTDDTATYYCAKGITTVVDDYYAMDYWGQGTSVTVSS
122	VL (ID_4.32.63)	DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIDSYLAWYQQKQGKSPQLLVYAATFLADDVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDVARYYCQHYYSTPYTFGCGTKLEIK
123	CDR-H1 (ID_4.24.72, H1L1, H1L2, H2L2, H3L2, H3L3)	DYSMN
124	CDR-H2 (ID_4.24.72, H1L1, H1L2)	WINTETGEPRYTDDFKG
125	CDR-H3 (ID_4.24.72, H1L1, H1L2, H2L2, H3L2, H3L3)	EGDYDVFDY
126	CDR-L1 (ID_4.24.72, H1L1)	RASKSVSTSSYSYMH
127	CDR-L2 (ID_4.24.72, H1L1, H1L2, H2L2, H3L2, H3L3)	YVSYLES
128	CDR-L3 (ID_4.24.72, H1L1, H1L2, H2L2, H3L2)	QHSREFPYT
129	CDR-L1 (H1L2, H2L2, H3L3)	KSSKSVSTSSYSYMH
130	CDR-H2 (H2L2)	WINTETGEPRYTDDFTG
131	CDR-H2 (H3L2)	WINTETGEPRYTQGFKG
132	CDR-L3 (H3L3)	QQSREFPYT
133	ID_4.24.72 VH	QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTVTDYSMNWVKQAPGKCLKWMGWINTETGEPRYTDDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDSATYFCAREGDYDVFDYWGHGTTLKVSS
134	ID_4.24.72 VL	DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYVSYLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPYTFGCGTKLEIK
135	H1L1, H1L2 VH	QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTVTDYSMNWVRQAPGQGLEWMGWINTETGEPRYTDDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREGDYDVFDYWGQGTLVTVSS
136	H1L1 VL	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYVSYLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSREFPYTFGQGTKLEIK
137	H1L2, H2L2 VL	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYVSYLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSREFPYTFGQGTKLEIK
138	H2L2 VH	QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTVTDYSMNWVRQAPGQGLEWMGWINTETGEPRYTDDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREGDYDVFDYWGQGTLVTVSS
139	H3L3 VH	QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTVTDYSMNWVRQAPGQGLEWMGWINTETGEPRYTQGFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREGDYDVFDYWGQGTLVTVSS
140	H3L3 VL	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYVSYLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSREFPYTFGQGTKLEIK
141	H7L5 VH	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTVTDYSMNWVRQAPGQGLEWMGWINTETGEPRYTDDFKGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAREGDYDVFDYWGQGTLVTVSS
142	H7L5 VL	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYYVSYLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSREFPYTFGQGTKLEIK
143	H1L1 scFv	QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTVTDYSMNWVRQAPGQCLEWMGWINTETGEPRYTDDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREGDYDVFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYVSYLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSREFPYTFGCGTKLEIK
144	H1L2 scFv	QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTVTDYSMNWVRQAPGQCLEWMGWINTETGEPRYTDDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREGDYDVFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYVSYLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSREFPYTFGCGTKLEIK
145	H2L2 scFv	QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTVTDYSMNWVRQAPGQCLEWMGWINTETGEPRYTDDFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREGDYDVFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYVSYLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSREFPYTFGCGTKLEIK
146	H3L2 scFv	QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTVTDYSMNWVRQAPGQCLEWMGWINTETGEPRYTQGFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCAREGDYDVFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYVSYLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSREFPYTFGCGTKLEIK
147	4.32.63 scFv	QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTSYGVSWVRQPPGKCLEWLGIIWGDGSTNYHSALISRLSISKDNSKSQVFLKLNSLQTDDTATYYCAKGITTVVDDYYAMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIDSYLAWYQQKQGKSPQLLVYAATFLADDVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQSEDVARYYCQHYYSTPYTFGCGTKLEIK
148	蛋白酶識別位點 1	RQARVVNG
149	蛋白酶識別位點 2	VHMPLGFLGPGRSRGSFP
150	蛋白酶識別位點 3	RQARVVNGXXXXXVPLSLYSG
151	蛋白酶識別位點 4	RQARVVNGVPLSLYSG
152	蛋白酶識別位點 5	plglwsq
153	蛋白酶識別位點 6	VHMPLGFLGPRQARVVNG
154	蛋白酶識別位點 7	FVGGTG
155	蛋白酶識別位點 8	KKAAPVNG
156	蛋白酶識別位點 9	PMAKKVNG
157	蛋白酶識別位點 10	QARAKVNG
158	蛋白酶識別位點 11	VHMPLGFLGP
159	蛋白酶識別位點 12	QARAK
160	蛋白酶識別位點 13	VHMPLGFLGPPMAKK
161	蛋白酶識別位點 14	KKAAP
162	蛋白酶識別位點 15	PMAKK
163	不可切割連接子	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGGGGSGGGGSGGGGS
164	人類 Matriptase UniProt Q9Y5Y6	MGSDRARKGGGGPKDFGAGLKYNSRHEKVNGLEEGVEFLPVNNVKKVEKHGPGRWVVLAAVLIGLLLVLLGIGFLVWHLQYRDVRVQKVFNGYMRITNENFVDAYENSNSTEFVSLASKVKDALKLLYSGVPFLGPYHKESAVTAFSEGSVIAYYWSEFSIPQHLVEEAERVMAEERVVMLPPRARSLKSFVVTSVVAFPTDSKTVQRTQDNSCSFGLHARGVELMRFTTPGFPDSPYPAHARCQWALRGDADSVLSLTFRSFDLASCDERGSDLVTVYNTLSPMEPHALVQLCGTYPPSYNLTFHSSQNVLLITLITNTERRHPGFEATFFQLPRMSSCGGRLRKAQGTFNSPYYPGHYPPNIDCTWNIEVPNNQHVKVRFKFFYLLEPGVPAGTCPKDYVEINGEKYCGERSQFVVTSNSNKITVRFHSDQSYTDTGFLAEYLSYDSSDPCPGQFTCRTGRCIRKELRCDGWADCTDHSDELNCSCDAGHQFTCKNKFCKPLFWVCDSVNDCGDNSDEQGCSCPAQTFRCSNGKCLSKSQQCNGKDDCGDGSDEASCPKVNVVTCTKH TYRCLNGLCLSKGNPECDGKEDCSDGSDEKDCDCGLRSFTRQARVVGGTDADEGEWPWQVSLHALGQGHICGASLISPNWLVSAAHCYIDDRGFRYSDPTQWTAFLGLHDQSQRSAPGVQERRLKRIISHPFFNDFTFDYDIALLELEKPAEYSSMVRPICLPDASHVFPAGKAIWVTGWGHTQYGGTGALILQKGEIRVINQTTCENLLPQQITPRMMCVGFLSGGVDSCQGDSGGPLSSVEADGRIFQAGVVSWGDGCAQRNKPGVYTRLPLFRDWIKENTGV
165	IgG CH1 域	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV
166	IgG CH2 域	APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQESTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
167	IgG CH3 域	GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
168	CH1 接頭	EPKSC
169	完整樞紐	DKTHTCPXCP，其中 X 為 S 或 P
170	中部樞紐	HTCPXCP，其中 X 為 S 或 P
171	短樞紐	CPXCP，其中 X 為 S 或 P
172	IgG1，高加索人異型	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
173	IgG1，非裔美國人異型	ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
174	IgG2	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
175	IgG3	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
176	IgG4	ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
177	人類 FcγRIIIa UniProt 登錄編號 P08637	MWQLLLPTALLLLVSAGMRTEDLPKAVVFLEPQWYRVLEKDSVTLKCQGAYSPEDNSTQWFHNESLISSQASSYFIDAATVDDSGEYRCQTNLSTLSDPVQLEVHIGWLLLQAPRWVFKEEDPIHLRCHSWKNTALHKVTYLQNGKGRKYFHHNSDFYIPKATLKDSGSYFCRGLFGSKNVSSETVNITITQGLAVSTISSFFPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNIRSSTRDWKDHKFKWRKDPQDK
178	肽連接子 (G4S)	GGGGS
179	肽連接子 (G4S)2	GGGGSGGGGS
180	肽連接子 (SG4)2	SGGGGSGGGG
181	肽連接子 G4(SG4)2	GGGGSGGGGSGGGG
182	肽連接子	GSPGSSSSGS
183	(G4S)3 肽連接子	GGGGSGGGGSGGGGS
184	(G4S)4 肽連接子	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
185	肽連接子	GSGSGSGS
186	肽連接子	GSGSGNGS
187	肽連接子	GGSGSGSG
188	肽連接子	GGSGSG
189	肽連接子	GGSG
190	肽連接子	GGSGNGSG
191	肽連接子	GGNGSGSG
192	肽連接子	GGNGSG
193	肽連接子	EPKSCGGGGSGGGGS
194	肽連接子	EPKSCDGGGGSGGGGS
195	Matriptase 連接子	SGGGSGGGGSPMAKKGGGGSGGGGSGGGGSGGS
196	連接子 2	GGGGSVHMPLGFLGPRQARVVNGGGGGSGGGGS
197	連接子 3	GGGGSGGGGSRQARVVNGGGGGSGGGGSGGGGS
198	MMP 蛋白酶連接子	ggggsggggsgplglwsqggggsggggsggggsgg
199	組合 MMP9 MK062，CD3 之 33 個 AA	GGGGSVHMPLGFLGPRQARVVNGGGGGSGGGGS
200	組織蛋白酶 S/B	GGGGSGGGGSGGGGSFVGGTGGGGSGGGGSGGS
201	KKAAPVNG	GGGGSGGGGSKKAAPVNGGGGGSGGGGSGGGGS
202	PMAKKVNG	GGGGSGGGGSPMAKKVNGGGGGSGGGGSGGGGS
203	QARAKVNG	GGGGSGGGGSQARAKVNGGGGGSGGGGSGGGGS
204	MMP9	GGGGSGGGGSVHMPLGFLGPGGGGSGGGGSGGS
205	QARAK	GGGGSGGGGSQARAKGGGGSGGGGSGGGGSGGS
206	MMP9-PMAKK	GGGGSVHMPLGFLGPPMAKKGGGGSGGGGSGGS
207	KKAAP	GGGGSGGGGSKKAAPGGGGSGGGGSGGGGSGGS
208	PMAKK	GGGGSGGGGSPMAKKGGGGSGGGGSGGGGSGGS
209	組合 NF9/Mat5 連接子	GGGGSVHMPLGFLGPGRSRGSFPGGGGS
210	組合 MK062 MMP9	GGGGSGGGGSRQARVVNGGGGGSVPLSLYSGGGGGSGGGGS
211	組合 MK062-MMP9	GGGGSGGGGSRQARVVNGVPLSLYSGGGGGSGGGGS
212	4.24.72 scFv	QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTVTDYSMNWVKQAPGKCLKWMGWINTETGEPRYTDDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDSATYFCAREGDYDVFDYWGHGTTLKVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSSYSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYVSYLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPYTFGCGTKLEIK

有關人類免疫球蛋白輕鍊和重鏈核苷酸序列的一般資訊，請參見：Kabat, E.A. 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD (1991)。根據上文所定義之 Kabat 之編號系統對抗體鏈之氨基酸進行編號和引用 (Kabat, E.A. 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD (1991))。 *** 實例

以下為本發明之方法和組成物的實例。應當理解，鑒於上文給出的一般描述，可以實施各種其他實施例。

重組 DNA 技術

使用標準方法來操縱 DNA，如以下文獻中所述：Sambrook 等人，Molecular cloning: A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989。根據製造商的說明書使用分子生物試劑。有關人類免疫球蛋白輕鍊和重鏈核苷酸序列的一般資訊，請參見：Kabat, E.A. 等人 (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，NIH 公開號 91-3242。

DNA 定序

透過雙股定序測定 DNA 序列。

基因合成

需要時，所需的基因片段可通過使用適當模培養皿的 PCR 產生，或在 Geneart AG (德國雷根斯堡) 或 Genscript (美國新澤西州) 通過合成的寡核苷酸和 PCR 產物透過自動基因合成來合成。將位於單個限制內切酶切割位點側翼的基因片段選殖到標準選殖/定序載體中。從轉化的細菌中純化質體 DNA，並透過 UV 光譜確定濃度。透過 DNA 定序確認亞選殖基因片段的 DNA 序列。基因片段設計有合適的限制位點，以允許亞選殖到各自的表現載體中。所有構建體均設計有用於前導肽的 5’ 端 DNA 序列編碼，該前導肽靶向蛋白質以在真核細胞中分泌。

細胞培養技術

使用如以下文獻中所述之標準細胞培養技術：Current Protocols in Cell Biology (2000)，Bonifacino, J.S.，Dasso, M.,Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. 及 Yamada, K.M. (編)，John Wiley & Sons, Inc。

蛋白質純化

參照標準方案從過濾的細胞培養上清液中純化蛋白質。簡言之，將抗體施加於 Protein A Sepharose 柱 (GE Healthcare) 並用 PBS 洗滌。在 pH 2.8 下完成抗體之洗滌，然後立即中和樣品。藉由粒徑篩析層析法 (Superdex 200, GE Healthcare) 在 PBS 或 20 mM 組胺酸、150 mM NaCl (pH 6.0) 中將聚集之蛋白質與單體抗體分離。合併單體抗體部分，使用例如 MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO) 離心濃縮機濃縮 (如果需要)，冷凍並儲存於 -20°C 或 -80°C 下。提供部分樣品用於後續蛋白質分析及分析表徵，例如藉由 SDS-PAGE、粒徑篩析層析法 (SEC) 或質譜法來完成。

SDS-PAGE

根據製造商之說明使用 NuPAGE® 預製膠系統 (Invitrogen)。特定而言，使用 10% 或 4-12% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS 預製膠 (pH 6.4) 及 NuPAGE® MES (還原凝膠，包含 NuPAGE® Antioxid 運行緩衝液添加劑) 或 MOPS (非還原凝膠) 運行緩衝液。

分析型粒徑篩析層析法

用於測定抗體之聚集及寡聚狀態之粒徑篩析層析法 (SEC) 藉由 HPLC 層析法進行。簡言之，將蛋白 A 純化的抗體施加於 Agilent HPLC 1100 系統上之 Tosoh TSKgel G3000SW 層析柱 (使用 300 mM NaCl、50 mM KH ₂PO ₄/K ₂HPO ₄，pH 7.5) 或 Dionex HPLC 系統上之 Superdex 200 柱 (GE Healthcare) (使用 2 x PBS)。藉由紫外吸光度及峰面積積分對洗滌的蛋白質進行定量。使用 BioRad 凝膠過濾標準品 151–1901 作為標準品。

質譜法

本部分描述了包含 VH/VL 交換 (VH/VL CrossMab) 的多特異性抗體之表徵，重點表徵其是否正確組裝。藉由去糖基化完整 CrossMab 及去糖基化/纖維蛋白溶酶消化或者去糖基化/限制性 LysC 消化之 CrossMab 的電噴霧電離質譜法 (ESI-MS) 分析預期之一級結構。

VH/VL CrossMab 在磷酸鹽或 Tris 緩衝液中用 N-糖苷酶 F 於 37°C 下以 1 mg/ml 的蛋白質濃度去糖基化長達 17 h。纖維蛋白溶酶或限制性 LysC (Roche) 消化分別用 100 µg 去糖基化之 VH/VL CrossMab 在 pH 8 的 Tris 緩衝液中於室溫下實施 120 小時並於 37°C 下實施 40 min。在質譜分析之前，在 Sephadex G25 柱 (GE Healthcare) 上經由 HPLC 對樣品脫鹽。在配備 TriVersa NanoMate 離子源 (Advion) 的 maXis 4G UHR-QTOF MS 系統 (Bruker Daltonik) 上經由 ESI-MS 測定總質量。

使用表面電漿共振 (SPR) (BIACORE) 測定多特異性抗體與相應抗原之結合及結合親和力

藉由表面電漿共振，使用 BIACORE 儀器 (GE Healthcare Biosciences AB，瑞典烏普沙拉) 研究所生成之抗體與相應抗原之結合。簡言之，在親和力量測中，將山羊抗人類 IgG、JIR 109-005-098 抗體經由胺偶聯固定到 CM5 晶片上，用於呈遞抗相應抗原的抗體。在 HBS 緩衝液 (HBS-P (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005% 吐溫 20, pH 7.4) 中於 25°C (或者 37°C) 下量測結合。將各種濃度的抗原 (R&D Systems 或內部純化) 添加至溶液中。藉由注射抗原 80 秒至 3 分鐘來量測締合；藉由用 HBS 緩衝液洗滌晶片表面 3-10 分鐘來量測解離，並使用 1:1 Langmuir 結合模型來估計 KD 值。從樣品曲線中減去陰性對照數據 (例如緩衝曲線) 以校正系統固有之基線漂移並降低噪音信號。使用相應的 Biacore 評估軟件分析感應分析圖並計算親和力數據。實例 1 靶向 CD28 及 CD3 之雙特異性抗原結合分子的生成及產生

1.1 抗 CD28 抗體的生成

抗原之選殖：

將編碼人類 CD28 之胞外域 (成熟蛋白質之胺基酸 1 至 134) DNA 片段 (Uniprot: P10747) 在框內插入兩種不同的哺乳動物接受者載體中，該載體位於編碼人類 IgG1 Fc 片段 (用作溶解性和純化標籤) 的片段上游。表現載體中之一種在 Fc 區域中包含「臼」突變，另一種包含「杵」突變以及 C 端 Avi 標籤 (GLNDIFEAQKIEWHE, SEQ ID NO:88) 以允許與 Bir A 生物素連接酶共表現過程中實現特異性生物素化。此外，兩個 Fc 片段皆含有 PG-LALA突變。將兩種載體與編碼 BirA 生物素連接酶的質粒共轉染，以便得到在 Fc-杵鏈之 C 端帶有單價生物素化 avi 標籤的二聚體 CD28-Fc 構建體。

無熱點且親和力降低的 CD28 (SA) 變異體的生成及表徵

WO 2006/050949 中描述了包含 VH 及 VL 的 CD28 超促效性抗體(SA)，該 VH 包含 SEQ ID NO:24 之胺基酸序列，且 VL 包含 SEQ ID NO:25 之胺基酸序列。

去除未配對之半胱胺酸殘基、色胺酸殘基、脫醯胺位點並生成親和力降低的 CD28 (SA) 變異體

作為詳細的結合物表徵的一部分，對 CD28(SA) 可變域序列進行計算分析。該分析揭示了 VH 之 CDR2 區中未配對的半胱胺酸 (位置 50，Kabat 編號)、VH 之 CDR3 中之色胺酸殘基 (位置 100a，Kabat 編號) 及 VL 之 CDR1 (位置 32，Kabat 編號)，以及 VH 之 CDR2 中潛在的天冬醯胺脫醯胺位點 (位置 56，Kabat 編號)。雖然色胺酸之氧化是一個相當緩慢的過程並可藉由添加還原性化合物來避免，但抗體可變域中存在的未配對之半胱胺酸可能至關重要。游離半胱胺酸具有反應性，可與其他蛋白質之未配對之半胱胺酸或細胞或培養基成分形成穩定的鍵。因此，這可能導致包含未知修飾的異質性不穩定產物，這些修飾具有潛在的免疫原性，並因此可能對患者構成風險。此外，天冬醯胺之脫醯胺及所形成之異天冬胺酸及琥珀醯亞胺可能影響 活體外穩定性及 活體内生物學功能。母代鼠類結合物 5.11A 之晶體結構分析表明，C50 不參與與人類 CD28 之結合，因此可經類似的胺基酸 (例如絲胺酸) 替換而不影響與 CD28 之親和力。但是，位置 50 處之色胺酸殘基及天冬醯胺酸皆接近或參與結合界面，因此經類似的胺基酸替換可能導致結合親和力下降。在本實例中，降低 CD28(SA) 對人類 CD28 之親和力的原因如下：CD28(SA) 之的親和力在 1-2 nM 範圍內，且結合半衰期為約 32 分鐘。當靜脈注射到患者體內時，這一強親和力可能導致含有大量 CD28 表現細胞的組織 (例如血液和淋巴組織) 中產生匯效應子。因此，經由靶向成分以位點特異性靶向化合物可能減少，且構建體之功效可能下降。為盡量減少該等效應子，生成幾種 VH 和 VL 變異體，以便將親和力降至不同程度 ( 圖 2A 及 2C)。除前文提到的代表潛在穩定性熱點的位置以外，直接或間接參與與人類 CD28 之結合的其他殘基經原始鼠類生殖系胺基酸或類似的胺基酸替換。此外，亦分別將 CD28(SA) VL 及 VH 之 CDR 移植到曲妥珠單抗之相應的骨架序列中 ( 圖 2B 及 2D)。然後將 VH 及 VL 變異體的幾種組合表現為單價單臂抗 CD28 IgG 樣構建體，並藉由 SPR 表徵結合。

藉由 SPR 分析經還原之單臂抗 CD28 變異體解離速率常數 (k _off)

為表徵第一步中之抗 CD28 結合物變異體，將所有結合物皆表示為單價單臂 IgG 樣構建體 ( 圖 1A)。選擇該形式以在 1:1 模型中表徵與 CD28 之結合。轉染到 HEK 細胞中後 5 天，收集上清液並測定所表現之構建體之力價。

藉由表面電漿共振 (SPR)，使用 ProteOn XPR36 儀器 (Biorad) 於 25°C 下用藉由中性抗生物素蛋白捕獲固定於 NLC 晶片上之生物素化 huCD28-Fc 抗原測定抗 CD28 結合物變異體之解離速率。為固定重組抗原 (配體)，將 huCD28-Fc 用 PBST (含吐溫 20 的磷酸鹽緩衝鹽水，由 10 mM 磷酸鹽、150 mM 氯化鈉 pH 7.4、0.005% 吐溫 20 組成) 稀釋至濃度範圍為 100 之 500 nM，然後在不同接觸時間内以 25 μl/分鐘的速率注射。由此導致垂直取向之固定水平介於 1000 至 3000 響應單位 (RU) 之間。

在單次動力學測量中，將注射方向改為水平取向。根據所產生之上清液之力價，將單價單臂 IgG 用 PBST 稀釋，以得到 100 nM 至 6.25 nM 範圍内的兩倍稀釋系列。沿單獨通道 1-5 以 50 μl/min 同時進行注射，締合時間為 120 s，且解離時間為 300 s。沿第六通道注射緩衝液 (PBST)，以提供「行內」空白以供參考。由於結合相互作用用來自未經純化及生化表徵的上清液之單價單臂 IgG 來量測，因此僅使用蛋白質:蛋白質相互作用之解離速率得出進一步結論。在 ProteOn Manager v3.1 軟體中藉由擬合解離感應分析圖，使用簡單的一對一 Langmuir 結合模型計算解離速率。所有選殖株之解離速率常數 (k _off) 值彙總於表 1中。所產生之變異體之比較表明，與母代序列相比，k _off值下降多達 30 倍。表 1 ：表現的所有單價抗 CD28 變異體與解離速率常數 (k _off) 值之彙總

結合物變異體	ID	SEQ ID NO:	SEQ ID NO:	SEQ ID NO:	k _off(10 ^-4/M)
CD28(SA)_變異體_1 (母代 CD28)	P1AE4441	72	80	87	3.0
CD28(SA)_變異體_2	P1AE3058	73	81	87	N/A
CD28(SA)_變異體_3	P1AE3059	73	82	87	N/A
CD28(SA)_變異體_4	P1AE3060	73	83	87	N/A
CD28(SA)_變異體_5	P1AE3061	73	80	87	N/A
CD28(SA)_變異體_6	P1AE3062	74	81	87	N/A
CD28(SA)_變異體_7	P1AE3063	74	82	87	100
CD28(SA)_變異體_8	P1AE3064	74	83	87	68
CD28(SA)_變異體_9	P1AE3065	74	84	87	78
CD28(SA)_變異體_10	P1AE3066	74	85	87	N/A
CD28(SA)_變異體_11	P1AE3067	74	80	87	37
CD28(SA)_變異體_12	P1AE3068	75	86	87	2.4
CD28(SA)_變異體_13	P1AE3069	75	80	87	1.9
CD28(SA)_變異體_14	P1AE3070	76	81	87	100
CD28(SA)_變異體_15	P1AE3071	76	82	87	24
CD28(SA)_變異體_16	P1AE3072	76	83	87	10
CD28(SA)_變異體_17	P1AE3073	76	84	87	14
CD28(SA)_變異體_18	P1AE3074	76	85	87	82
CD28(SA)_變異體_19	P1AE3075	76	80	87	2.9
CD28(SA)_變異體_20	P1AE3076	77	81	87	N/A
CD28(SA)_變異體_21	P1AE3077	77	82	87	N/A
CD28(SA)_變異體_22	P1AE3078	77	83	87	61
CD28(SA)_變異體_23	P1AE3079	77	80	87	43
CD28(SA)_變異體_24	P1AE3080	78	81	87	80
CD28(SA)_變異體_25	P1AE3081	78	82	87	3.51
CD28(SA)_變異體_26	P1AE3082	78	83	87	9.7
CD28(SA)_變異體_27	P1AE3083	78	84	87	14
CD28(SA)_變異體_28	P1AE3084	78	85	87	69
CD28(SA)_變異體_29	P1AE3085	78	80	87	2.5
CD28(SA)_變異體_30	P1AE3086	79	86	87	3.22
CD28(SA)_變異體_31	P1AE3087	79	80	87	2.5

使用表現人類 CD28 的 CHO 細胞 (母代細胞系 CHO-k1 ATCC #CCL-61，經修飾以穩定過度表現人類 CD28) 測試與人類 CD28 之結合。為評估結合，收穫細胞、計數、檢查活力並以2.5x10 ⁵/ml 重新懸浮於 FACS 緩衝液 (eBioscience，目錄號 00-4222-26) 中。將 5 × 10 ⁴個細胞在圓底 96 孔培養皿中於 4°C 下孵育 2 h，其中 CD28 結合物之濃度逐漸增加 (1 pM – 100 nM)。然後，將細胞用冷 FACS 緩衝液洗滌 3 次，於 4°C 下與 PE 結合的山羊抗人類 PE (Jackson ImmunoReserach，目錄號 109-116-098) 進一步孵育 60 min，用冷 FACS 緩衝液洗滌一次，離心並重新懸浮於 100 μl FACS 緩衝液中。為監測構建體與細胞之間的非特異性結合相互作用，包括抗 DP47 IgG 作為陰性對照。藉由流式細胞術與 FACS Fortessa (BD，軟體 FACS Diva) 評估結合。使用 GraphPadPrism6 獲得結合曲線。從圖 3A 至圖 3C中可以看出，單價單臂 IgG 樣 CD28 變異體構建體表現出結合之差異。

1.2 靶向 CD3 及 CD28 之雙特異性抗原結合分子的生成

靶向 CD3 及 CD28 之雙特異性抗原結合分子的選殖

為生成表現質粒，使用相應可變域之序列，與預先插入相應接受者哺乳動物表現載體中之恆定區在框内亞選殖。在 Fc 域中，已根據國際專利申請號 WO 2012/130831 中所述之方法，將 Pro329Gly、Leu234Ala 及 Leu235Ala (PG-LALA) 被引入人類 IgG1 重鏈之恆定區中以消除與 Fc γ 受體之結合。為生成雙特異性抗體，Fc 片段含有「杵」 (S354C/T366W 突變，根據 Kabat EU 索引編號)或「臼」突變 (Y349C/T366S/L368A/Y407V 突變，根據 Kabat EU 索引編號) 以避免重鏈錯配。為避免雙特異性抗原結合分子中輕鏈錯配，在一個結合部分中引入 VH/VL 或 CH1/Cκ 域之交換 (CrossFab 技術)。在另一個結合部分，按照國際專利申請公開號 WO 2015/150447 中所述，將電荷引入 CH1 及 Cκ 域中。

選殖以下分子，其示意圖如圖 1B至圖 1I所示：分子 1：在 CD3 (CH2527) Fab 片段 (杵) 中包含 VH/VL 交換且 CD28 (9.3) Fab 片段 (臼) 中包含帶電荷之修飾的 CD28 (9.3)-CD3 (CH2527) 1+1 形式的雙特異性 huIgG1 PG-LALA CrossFab 分子 ( 圖 1B)，其包含 SEQ ID NO: 89 及 SEQ ID NO: 91 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 90 及 SEQ ID NO: 92 之輕鏈胺基酸序列 (P1AD8935)。分子 2：在 CD3 (CH2527) Fab 片段 (杵) 中包含 VH/VL 交換且 CD28 (SA) Fab 片段 (臼) 中包含帶電荷之修飾的 CD28 (SA)-CD3 (CH2527) 1+1 形式的雙特異性 huIgG1 PG-LALA CrossFab 分子 ( 圖 1B)，其包含 SEQ ID NO: 89 及 SEQ ID NO: 93 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 90 及 SEQ ID NO: 94 之輕鏈胺基酸序列 (P1AD8942)。分子 3：CD28 (9.3) 單特異性 huIgG1 PG-LALA、單價抗 CD28 (9.3) huIgG1 PG-LALA 構建體，其中 CD28 重鏈表現爲「臼」 Fc 鏈與 Fc (杵) 片段之組合 ( 圖 1C) 。該分子包含 SEQ ID NOs: 91、SEQ ID NOs: 92 及 SEQ ID NOs: 95 之胺基酸序列 (P1AD8938)。分子 4：CD28 (SA) 單特異性 huIgG1 PG-LALA、單價抗 CD28 (SA) huIgG1 PG-LALA 構建體，其中 CD28 重鏈表現爲「臼」 Fc 鏈與 Fc (杵) 片段之組合 ( 圖 1C) 。該分子包含 SEQ ID NOs: 93、SEQ ID NOs: 94 及 SEQ ID NOs: 95 之胺基酸序列 (P1AD8944)。分子 5：CD3 (CH2527) 單特異性 huIgG1 PG-LALA、單價抗 CD3 (CH2527) huIgG1 PG-LALA 構建體，其中 CD3 重鏈表現爲「杵」 Fc 鏈與 Fc (臼) 片段之組合 ( 圖 1D) 。該分子包含 SEQ ID NOs: 89、SEQ ID NOs: 90 及 SEQ ID NOs: 96 之胺基酸序列 (P1AD8939)。分子 6 ：在 CD3 (CH2527) Fab 片段 (杵) 中包含 VH/VL 交換且 CD28 (9.3) Fab 片段 (臼) 中包含帶電荷之修飾的經掩蔽之 CD28 (9.3)-CD3 (CH2527) 1+1 形式的雙特異性 huIgG1 PG-LALA CrossFab 分子，其中 CD3 由抗個體遺傳型 CD3 scFv 4.24.72 及可切割連接子掩蔽 (經掩蔽之 4.24.72_RQARVVNG 位點，MK062 Matriptase 位點) ( 圖 1E)。該分子包含 SEQ ID NO: 98及 SEQ ID NO: 97 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 90 及 SEQ ID NO: 92 之輕鏈胺基酸序列 (P1AD8987)。分子 7 ：在 CD3 (CH2527) Fab 片段 (杵) 中包含 VH/VL 交換且 CD28 (SA) Fab 片段 (臼) 中包含帶電荷之修飾的經掩蔽之 CD28 (SA)-CD3 (CH2527) 1+1 形式的雙特異性 huIgG1 PG-LALA CrossFab 分子，其中 CD3 由抗個體遺傳型 CD3 scFv 4.24.72 及可切割連接子掩蔽 (經掩蔽之 4.24.72_RQARVVNG 位點，MK062 Matriptase 位點) ( 圖 1E)。該分子包含 SEQ ID NO: 98及 SEQ ID NO: 99 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 90 及 SEQ ID NO: 94 之輕鏈胺基酸序列 (P1AD8990)。分子 8 ：在 CD3 (CH2527) Fab 片段 (杵) 中包含 VH/VL 交換且 CD28 (9.3) Fab 片段 (臼) 中包含帶電荷之修飾的經掩蔽之 CD28 (9.3)-CD3 (CH2527) 1+1 形式的雙特異性 huIgG1 PG-LALA CrossFab 分子，其中 CD3 由抗個體遺傳型 CD3 scFv 4.32.63 及不可切割連接子掩蔽 (經掩蔽之不可切割 4.24.72) ( 圖 1F)。該分子包含 SEQ ID NO: 100及 SEQ ID NO: 97 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 90 及 SEQ ID NO: 92 之輕鏈胺基酸序列 (P1AD8988)。分子 9 ：在 CD3 (CH2527) Fab 片段 (杵) 中包含 VH/VL 交換且 CD28 (SA) Fab 片段 (臼) 中包含帶電荷之修飾的經掩蔽之 CD28 (SA)-CD3 (CH2527) 1+1 形式的雙特異性 huIgG1 PG-LALA CrossFab 分子，其中 CD3 由抗個體遺傳型 CD3 scFv 4.32.72 及不可切割連接子掩蔽 (經掩蔽之不可切割 4.24.72) ( 圖 1F)。該分子包含 SEQ ID NO: 100及 SEQ ID NO: 99 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 90 及 SEQ ID NO: 94 之輕鏈胺基酸序列 (P1AD8989)。分子 10：在 CD28 (SA_變異體 8) Fab 片段 (臼) 中包含 VH/VL 交換且 CD3 (P035.093) Fab 片段 (杵) 中包含帶電荷之修飾的 CD28 (SA_變異體 8)-CD3 (P035.093) 1+1、雙特異性 huIgG1 PG-LALA CrossFab 分子 ( 圖 1G)，其包含 SEQ ID NO: 101 及 SEQ ID NO: 103 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 102 及 SEQ ID NO: 104 之輕鏈胺基酸序列 (P1AF7289)。分子 11 ：在 CD28 (SA_變異體 8) Fab 片段 (臼) 中包含 VH/VL 交換且 CD3 (P035.093) Fab 片段 (杵) 中包含帶電荷之修飾的經掩蔽之 CD28 (SA_變異體8)-CD3 (P035.093) 1+1、雙特異性 huIgG1 PG-LALA CrossFab 分子，其中 CD3 經抗個體遺傳型 CD3 scFv 4.24.72 及可切割連接子 (PMAKK 位點) 掩蔽 ( 圖 1H)。該分子包含 SEQ ID NO: 101及 SEQ ID NO: 106 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 102 及 SEQ ID NO: 104 之輕鏈胺基酸序列 (P1AF7291)。分子 12 ：在 CD28 (SA_變異體 8) Fab 片段 (臼) 中包含 VH/VL 交換且 CD3 (P035.093) Fab 片段 (杵) 中包含帶電荷之修飾的經掩蔽之 CD28 (SA_變異體8)-CD3 (P035.093) 1+1、雙特異性 huIgG1 PG-LALA CrossFab 分子，其中 CD3 經抗個體遺傳型 CD3 scFv 4.32.72 及不可切割連接子掩蔽 ( 圖 1I)。該分子包含 SEQ ID NO: 101及 SEQ ID NO: 105 之重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 102 及 SEQ ID NO: 104 之輕鏈胺基酸序列 (P1AF7290)。

1.2 靶向 CD28 及 CD3 之雙特異性抗原結合分子的產生

藉由 RACE-PCR (快速擴增 cDNA 末端) 從雜交瘤細胞之 RNA 中獲得抗個體遺傳型 (ID) 結合物序列。藉由免疫小鼠獲得雜交瘤細胞。在 Invitrogen 訂購單鏈 Fv (ScFv) 序列合成，其包括選殖所需之限制性位點。抗 ID 單鏈 Fv DNA序列與預插入相應之接受者哺乳動物表現載體的 CD3 VH 鏈在框内亞選殖。蛋白質表現由 MPSV 啟動子驅動，且合成 polyA 信號序列存在於 CDS 之 3' 端。此外，每個載體皆含有 EBV OriP 序列。

該分子藉由使用 Expifectamine 試劑與哺乳動物表現載體共轉染在懸浮液中生長的 HEK293 Expi293TMF (Thermo Fisher) 細胞來產生。將細胞用相應之表現載體以 1:1:1:1 的比例 (重鏈臼、重鏈杵、帶電荷之輕鏈、交叉輕鏈) 轉染。

在轉染過程中，將 HEK293 Expi293TMF 細胞在轉染前於 Expi293 表現培養基 (Thermo Fisher) 中培養。轉染當天，將質粒 DNA (總轉染體積 1 µg/mL，4 種個質粒之比例為 1:1:1:1) 與 Opti-MEM (總轉染體積之 5%) 混合。將 Expifectamine 試劑 (Ratio Reagent-OptiMEM 8:150) 與 Opti-MEM (總轉染體積之 5%) 混合，於室溫下孵育 5 min。將 DNA 與試劑以 1:1 的比例混合，並於室溫下孵育 30 min。將細胞 (當總轉染體積為 5 ml 時，需要 2.5 × 10 ⁶個細胞) 用 Expi 培養基稀釋並加入 DNA-試劑複合物中。将细胞用複合物於 37°C 及 5% CO ₂下孵育 16-18 小時。然後用轉染增強子 1 (總轉染體積的 0.5%) 和轉染增強子 2 (總轉染體積的 5%) 飼養細胞。

6-7 天后，收集培養上清液，藉由在 210 x g (Sigma 8K 離心機) 下離心 20-30 分鐘以進行純化。對溶液進行無菌過濾 (0.22 µm 過濾器)，並加入最終濃度為 0.01% w/v 的疊氮化鈉。將溶液保持於 4°C 下直至純化。

1.3 靶向 CD28 及 CD3 之雙特異性抗原結合分子的純化

藉由使用蛋白 A 親和力層析的親和力層析法及隨後的一至兩個粒徑篩析層析步驟，從細胞培養上清液中純化所分泌之蛋白質。

在親和力層析法中，將上清液加載到用 25 ml 20 mM 磷酸鈉、20 mM 檸檬酸鈉、0.5M 氯化鈉 pH 7.5 平衡的 HiTrap Protein A FF 柱 (CV = 5 mL，GE Healthcare) 上。藉由用至少 10 倍柱體積的 20 mM 磷酸鈉、20 mM 檸檬酸鈉 (pH 7.5) 洗滌以去除未結合之蛋白質，然後以 20 倍柱體積 (梯度從 0% - 100%) 之 20 mM 檸檬酸鈉、100 mM 氯化鈉、100 mM 甘胺酸 (pH 3) 中洗滌標靶蛋白質。藉由添加 1/10 的 2 M Tris (pH 10.5)，中和蛋白質溶液。在上樣至經 20 mM 組胺酸、140 mM 氯化鈉 (pH 6.0) 平衡的 HiLoad Superdex 200 柱 (GE Healthcare) 之前，用 Amicon® Ultra-15 Ultracel 30K (Merck Millipore Ltd.) 將標靶蛋白濃縮至最大體積 4 ml。

對於粒徑篩析層析法之後的分析，在不存在還原劑的情況下藉由 SDS-PAGE 及 Coomassie (InstantBlue™, Expedeon) 染色來分析單一餾分中分子之純度及分子量。根據製造商之說明使用 NuPAGE® 預製膠系統 (4-12% Bis-Tris，Invitrogen；或 3-8% Tris 乙酸鹽，Invitrogen)。藉由量測 280 nm 下之光密度 (OD) 並除以基於胺基酸序列計算出的摩爾消光係數來確定純化蛋白質樣品的蛋白質濃度。

在還原劑存在及不存在下，藉由 CE-SDS 分析最終純化步驟後分子之純度及分子量。根據製造商之說明使用 Caliper LabChip GXII 系統 (Caliper Lifescience)。使用 TSKgel G3000 SW XL 分析型粒徑篩析柱 (Tosoh) 在 25 mM K ₂HPO ₄、125 mM NaCl、200 mM L-精胺酸單鹽酸鹽、0.02% (w/v) NaN ₃(pH 6.7) 運行緩衝液中於 25°C 下分析分子之聚集體含量。

所有分子之最終質量良好，單體含量 ≥95% (分子 9 除外，其單體含量為 84%)。特定分子之純化參數彙總見表 2 。表 2 ：雙特異性 CD28 抗原結合分子的產生和純化彙總

分子	產率 [mg/l]	分析型 SEC (HMW/單體/LMW) [%]	藉由 CE-SDS 所測得之純度 [%]
1	36.3	0/73.96/24.4	75.55
2	29.93	1.44/97.5/1.05	78.1
3	10.15	1.4/98.6/0	97.7
4	38.5	0.2/99.3/0.5	99.6
5	103.2	0/99.11/0.89	94.36
6	0.65	2/98/0	100
7	4.94	5/95/0	100
8	1.296	3.4/96.6/0	100
9	3	14.5/83.5/1.7	71.2
10	39.15	0/91.9/8.1	98.04
11	2.55	0/92.7/7.3	95.73
12	1.54	0.9/90.1/9	100

實例 2 使用 Jurkat NFAT 報告細胞進行 T 細胞活化測定

Jurkat-NFAT 報告細胞測定用於定量由雙特異性 CD28-CD3 IgG 所媒介之 T 細胞活化。

Jurkat-NFAT 報告細胞系 (Promega) 是一種人類急性淋巴白血病報告細胞系，其包含 NFAT 啟動子，表現人類 CD3ε。如果 T 細胞雙分子酶分子與 CD28 及 CD3ε (交聯) 結合，則可以量測螢光素酶表現。在添加 One-Glo 受質 (Promega) 後量測發光。

收穫 Jurkat-NFAT 報告細胞，並使用 ViCell 評估活力。將細胞於 350 x g 下離心 5 min，然後將其重新懸浮於 Jurkat 培養基 (Jurkat 培養基：RPMI1640，2g/l 葡萄糖，2 g/l NaHCO ₃，10 % FCS，25 mM HEPES，2 mM L-麩醯胺酸，1 x NEAA，1 x 丙酮酸鈉) 中。以每孔 50 µl 的體積 (25,000 個細胞/孔) 添加至 96 孔白色平底培養皿 (Greiner，未經塗布) 中。將抗體用 Jurkat 培養基稀釋，並以每孔 50 µl 的體積添加至 Jurkat 細胞中。將培養皿在加濕培養箱中於 37°C 下孵育 5 小時，然後取出以獲得發光讀數。

在進行測定前大約 5 小時，於室溫下解凍適量製備的 ONE-Glo 溶液之冷凍等分試樣。添加 ONE-Glo 前 15 min，將測定培養皿從培養箱中取出，以使它們亦達到室溫。每孔添加 30 µl ONE-Glo 溶液，並藉由上下移液數次以使孔中内容物重新懸浮。將培養皿於室溫下避光孵育大約 10 min，並量測發光 (5s)。

如圖 4A及圖 4B所示，對於包含 CD3 及 CD28 兩者的雙特異性抗原結合分子，可偵測到劑量依賴性 Jurkat NFAT 活化，而對於單價對照，則未偵測到 Jurkat NFAT 活化，即 T 細胞活化需要交聯。實例 3 使用 Jurkat NFAT 報告細胞及抗人類 Fc 塗布的培養皿進行 T 細胞活化測定

將 96 孔白色平底培養皿 (Greiner) 用 0.025 μl/孔 PBS 中之 8 μg/ml 抗人類 Fc Ab (BioLegends) 於 4°C 下塗布 20 h。藉由抽吸去除 DPBS。

所有抗體皆用 Jurkat 培養基進行稀釋。對於未經塗布的培養皿，添加 50 µl/孔；對於經塗布的培養皿，添加 25 μl/孔。於 4°C 下孵育 30 min。藉由抽吸去除 DPBS。

收穫 Jurkat-NFAT 報告細胞，並使用 ViCell 評估活力。將細胞於 350 x g 下離心 5 min，然後將其重新懸浮於 Jurkat 培養基中。以每孔 50 µl 的體積 (25,000 個細胞/孔) 添加至 96 孔白色平底培養皿 (Greiner) 中。將培養皿在加濕培養箱中於 37°C 下孵育 5 小時，然後取出以獲得發光讀數。

結果分別如圖 4C及圖 4D(經抗人類 Fc 塗布的培養皿) 及圖 4E 及圖 4F (未經塗布的培養皿) 所示。對於包含 CD3 及 CD28 兩者的雙特異性抗原結合分子，可偵測到劑量依賴性 Jurkat NFAT 活化；而對於單價對照，則未偵測到 Jurkat NFAT 活化 (T 細胞活化需要交聯)。使用經抗人類 Fc 塗布的培養皿，IgG (雙特異性 CD28-CD3 抗體及二價 CD3 IgG) 所實現之 Jurkat NFAT 活化程度更高 (＜ 10 倍)。實例 4 使用人類 PBMC 進行 T 細胞活化測定

將 96 孔平底培養皿 (TPP) 用 0.025 μl/孔 PBS 中之 8 μg/ml 抗人類 Fc Ab (BioLegends) 於 4°C 下塗布 20 h。藉由抽吸去除 DPBS。所有抗體皆用測定培養基 (先進 RPMI 1640 培養基 (12633012, FisherScientific)，補充有 2% FCS 及 1X GlutaMAX)。對於未經塗布的培養皿，添加 50 µl/孔；對於經塗布的培養皿，添加 25 μl/孔。於 4°C 下孵育 30 min。藉由抽吸去除 DPBS。

將人類 PBMC 用作效應子細胞，並在用分子孵育 48 h 時偵測到細胞殺傷作用。人類周邊血單核細胞 (PBMC) 係從健康人類供體之膚色血球層中分離出來。對於經富集之淋巴細胞製劑 (膚色血球層)，使用 Histopaque-1077 密度製劑。將血液/膚色血球層用無菌 PBS 按 1:1 的比例稀釋並以 Histopaque 梯度 (Sigma, #H8889) 分層。離心 (450 x g，30 分鐘，無中斷，室溫) 後，丟棄含有 PBMC 的中間相上方的血漿，並將 PBMC 轉移到新的離心管中，隨後用 50 ml PBS 填充。將混合物離心 (400 x g，10 分鐘，室溫)，棄去上清液，將 PBMC 沉澱重新懸浮於 2 ml ACK 緩衝液中用於紅血球裂解。於 37°C 下孵育約 2-3 分鐘後，向管中裝入 50 ml 無菌 PBS，並在 350 x g 下離心 10 分鐘。在將 PBMC 重新懸浮於含有 2% FCS 及 1X GlutaMaxx 的 RPMI1640 培養基中之前，重複一次該洗滌步驟。在轉移到液氮中之前，PBMC 在 Cool Cell 箱中於 -80°C 下冷凍過夜。在測定開始前 24 h，將 PBMC 解凍並置於測定培養基 (密度 2 mio/ml) 中並放入 37°C、5% CO ₂的加濕培養箱中。

藉由定量 CD4 陽性及 CD8 陽性 T 細胞上之 CD25 及 CD69 並藉由定量干擾素 γ 釋放 (ELISA)，在 37°C、5% CO ₂下孵育 48 h 後評估 T 細胞活化。

用於 T 細胞活化的材料： CD4 陽性及 CD8 陽性 T 細胞上 CD25 及 CD69 之定量FACS 緩衝液 (1x PBS 0.1% BSA) 4% PFA 福馬林溶液 (Sigma) HT501320-9 51 Brilliant Violet 421TM 抗人類 CD4 (BioLegend, 317434) Brilliant Violet 421TM 抗人類 CD25 (BioLegend, 356114) APC 抗人類 CD8 (BioLegend, 344722) PE 抗人類 CD8 (BioLegend, 344706) FITC 抗人類 CD4 (BioLegend, 357406) PE 抗人類 CD69 (BioLegend, 310906)

所用之補償對照：僅 PBMC 未染色 Bv421 CD4 APC CD8 FITC CD4 PE CD8

染色： APC CD8 R1 FITC CD4 B1 PE CD69 B2 BV421 CD25 V1

FACS 染色及固定：

將培養皿置於 350 x g 下離心 5 min，藉由翻轉培養皿以去除上清液。添加 150 μl 冷 FACS 緩衝液，在 350 xg 下再次將培養皿離心 4 min。在添加 25 μl/孔 (FACS 緩衝液，每個發光團對應 0.8 μl/孔 Ab) 之前，藉由渦旋以使細胞重新懸浮，並將培養皿於 4°C 下孵育 60 min。將細胞洗滌兩次 (150 μl 冷 FACS 緩衝液)，然後將細胞重新懸浮於每孔 100 μl 2% PFA (福馬林溶液) 中以固定細胞。

干擾素 γ 釋放 (ELISA)

所用之材料：人類 IFN-γ DuoSet ELISA，15 個培養皿 (R&D Systems) 免疫培養皿 Maxisorp F Boden 400 ml MaxiSorp (10547781, Fisher Scientific) TMB 高靈敏度受質溶液 (BioLegend) Pierce™ TMB 受質套組 (34021, Thermo Fisher) 終止溶液：硫酸溶液，1 M (35276, Fluka) 試劑稀釋劑：0.01%，0.05% 吐溫 20 於 PBS 中洗滌緩衝液：0.05% 吐溫 20 於 PBS 中封閉緩衝液：1% BSA 於 PBS 中吐溫 20，10% 溶液 (Roche)

將捕獲抗體復溶於 500 μl PBS 中。240 μg/管，因此為 480 μg/ml。最終濃度應為 4 μg/ml，因此以 1:120 的比例在 PBS 中稀釋 (300 μl，於 30 ml PBS 中)

用捕獲抗體進行塗布：

以 100 μl/孔的密度鋪到 MicrotestTM 96 孔 ELISA 透明培養皿 (BD Falcon) 上，密封，並於室溫下孵育過夜。將培養皿翻轉並用洗滌緩衝液洗滌，重複該過程兩次，總共洗滌三次。藉由用洗滌緩衝液 (0.05% 吐溫 20 於 PBS 中) (400 μL) 填充各個孔以進行洗滌。在每一步完全去除液體對於獲得良好的性能至關重要。最後一次洗滌後，藉由抽吸或倒置培養皿並將其用乾淨紙巾吸乾，以除去任何剩餘的洗滌緩衝液。向每孔中加入 300 μL 封閉緩衝液 (1% BSA，於 PBS 中) 進行封閉。於室溫下孵育至少 1 小時。將洗滌步驟重複 3 次。

標準品：將 32.5 ng 復溶於 0.5 ml 試劑稀釋劑 (0.01%，0.05% 吐溫 20 於 PBS 中) 中。稀釋至 65 ng/ml，並製備標準稀釋液。向每個孔中添加 100 μL 標準品。將培養皿用膠條覆蓋並於室溫下孵育 2 小時。將洗滌步驟重複 3 次。向每個孔中添加 100 μL 偵測抗體 (12 μg/ml à 200 ng/ml，按 1:60 稀釋)。用膠條覆蓋，於室溫下孵育 2 小時。將洗滌步驟重複 3 次。向每個孔中添加 100 μL 鏈黴親和素-HRP 之工作稀釋液 (1:40)。覆蓋培養皿，並在暗處於室溫下孵育 20 分鐘。將洗滌步驟重複 3 次。每個孔中添加 100 μL 受質溶液 (TMB 高靈敏度受質溶液，BioLegend)。在暗處於室溫下孵育。待溶液變成深藍色後，添加 50 μl/孔的終止溶液 (變成黃色)。立即使用設定爲 450 nm 的酶標儀測定各孔的光密度。如果波長校正可用，則將其設定爲 540 nm 或 570 nm。如果波長校正不可用，則從 450 nm 下的讀數中扣除 540 nm 或 570 nm 下的讀數。此扣除將校正培養皿中的光學缺陷。未經校正而直接獲得的 450 nm 下的讀數可能更高且準確度較低。

使用 huFc 塗層進行交聯：對於雙特異性 CD3-CD28 (9.3) IgG 以及 CD3 IgG (二價) 及單價 CD3 IgG，可偵測到劑量依賴性 T 細胞活化 (藉由干擾素 γ 釋放量測)，而對於單價 CD28 mAb9.3 IgG，未偵測到 T 細胞活化 (圖 5A)。未經塗布 (交聯) 時，CD3 IgG (二價) 誘導的劑量依賴性 T 細胞活化 (藉由干擾素 γ 釋放量測) 的 EC ₅₀為約 0.13 nM，而 CD3 IgG 誘導的 T 細胞活化則下降 (EC ₅₀為約 12 nM)。未經塗布時，對於單價 CD3 或單價 CD28 (9.3) IgG，均未偵測到 T 細胞活化 ( 圖 5B)。

使用 huFc 塗層進行交聯：對於雙特異性 CD3-CD28 (SA) IgG 以及 CD3 IgG (二價) 及單價 CD3 IgG，可偵測到劑量依賴性 T 細胞活化 (藉由干擾素 γ 釋放量測)，而對於單價 CD28 (SA) IgG，未偵測到 T 細胞活化 (圖 5C)。未經塗布 (交聯) 時，CD3 IgG (二價) 誘導非常弱的劑量依賴性 T 細胞活化 (藉由干擾素 γ 釋放量測)，EC ₅₀為約 9 nM。對於雙特異性 CD3-CD28 (SA)，僅可在 100 nM 下偵測到雙特異性 IgG IFNγ 釋放。未經塗布時，對於單價 CD3 或單價 CD28 (SA) IgG，均未偵測到 T 細胞活化 ( 圖 5D)。

使用 huFc 塗層進行交聯：對於雙特異性 CD3-CD28 (9.3) IgG 以及 CD3 IgG (二價)，可偵測到劑量依賴性 T 細胞活化 (藉由干擾素 γ 釋放量測)。單價 CD3 IgG 以及經切割之雙特異性 CD28 mAb9.3-CD3 IgG 誘導劑量依賴性 T 細胞活化，而對於經掩蔽之 CD3-CD28 (9.3) IgG (不可切割)，可偵測到降低的 T 細胞活化，對於單價 CD28 (9.3) IgG，則未偵測到 T 細胞活化 ( 圖 6A)。

使用 huFc 塗層進行交聯：對於雙特異性 CD3-CD28 (9.3) IgG 以及 CD3 IgG (二價)，可偵測到劑量依賴性 T 細胞活化 (藉由定量 CD8 陽性 T 細胞上之 CD69 來量測)。單價 CD3 IgG 以及經切割之雙特異性 CD3-CD28 (9.3) IgG 亦誘導劑量依賴性 T 細胞活化，而對於經掩蔽之 CD3-CD28 (9.3) IgG (不可切割)，可偵測到降低的 T 細胞活化，對於單價 CD28 (9.3) IgG，則未偵測到 T 細胞活化 ( 圖 6B)。

未經塗布：對於雙特異性 CD3-CD28 (9.3) IgG 以及 CD3 IgG (二價)，可偵測到劑量依賴性 T 細胞活化 (藉由干擾素 γ 釋放量測) (EC50 比雙特異性抗體低約 5 倍)。經掩蔽之 CD3-CD28 (9.3) (不可切割) IgG、單價 CD3 IgG 以及單價 CD28 (9.3) IgG 不誘導 T 細胞活化，但本文所用之最高濃度的單價 CD3 IgG 除外。經切割之 CD3-CD28 (9.3) IgG 誘導 T-細胞活化，其 EC50 高於不帶掩蔽物的明顯鐘形雙特異性 CD3-CD28 (9.3) IgG ( 圖 6C)。

未經塗布：對於雙特異性 CD3-CD28 (9.3) IgG 以及 CD3 IgG (二價)，可偵測到劑量依賴性 T 細胞活化 (藉由定量 CD8 陽性 T 細胞上之 CD69 來量測)。經切割之 CD3-CD28 (9.3) IgG 與不帶掩蔽物的雙特異性抗體相當，而對於單價 CD3 IgG、單價 CD28 (9.3) IgG 及經掩蔽之 CD3-CD28 (9.3) IgG (不可切割連接子)，未觀察到 T 細胞活化 ( 圖 6D)。

使用 huFc 塗層進行交聯：對於雙特異性 CD3-CD28 (SA) IgG 以及 CD3 IgG (二價)，可偵測到劑量依賴性 T 細胞活化 (藉由干擾素 γ 釋放量測)。單價 CD3 IgG 以及經切割之雙特異性 CD3-CD28 (SA) IgG 誘導劑量依賴性 T 細胞活化，而對於經掩蔽之 CD3-CD28 (SA) IgG (不可切割)，可偵測到降低的 T 細胞活化，對於單價 CD28 (SA)，則未偵測到 T 細胞活化 ( 圖 7A)。

使用 huFc 塗層進行交聯：對於雙特異性 CD3-CD28 (SA) IgG 以及 CD3 IgG (二價)，可偵測到劑量依賴性 T 細胞活化 (藉由定量 CD8 陽性 T 細胞上之 CD69 來量測)。單價 CD3 IgG 以及經切割之雙特異性 CD3-CD28 (SA) IgG 亦誘導劑量依賴性 T 細胞活化，而對於經掩蔽之 CD3-CD28 (SA) IgG (不可切割)，可偵測到降低的 T 細胞活化 (EC50 比無掩蔽物的雙特異性 CD3-CD28 (SA) IgG 高出約 240 倍)，對於單價 CD28 (SA) IgG，則未偵測到 T 細胞活化 ( 圖 7B)。

未經塗布：對於雙特異性CD3-CD28 (SA) IgG 以及 CD3 IgG (二價)，可偵測到劑量依賴性 T 細胞活化 (藉由干擾素 γ 釋放量測) (EC50 比雙特異性抗體低約 30 倍)。經掩蔽之 CD3-CD28 (SA) (不可切割)、單價 CD3 IgG 以及單價 CD28 (SA) IgG 不誘導 T 細胞活化，但本文所用之最高濃度的單價 CD3 IgG 除外。經切割之 CD3-CD28 (SA) IgG 不誘導 T 細胞活化 ( 圖 7C)。

未經塗布：對於雙特異性 CD3-CD28 (SA) IgG 以及 CD3 IgG (二價)，可偵測到劑量依賴性 T 細胞活化 (藉由定量 CD8 陽性 T 細胞上之 CD69 來量測)。經切割之 CD3-CD28 (SA) IgG 亦誘導劑量依賴性 T 細胞活化，而功效低於無掩蔽物的雙特異性 CD3-CD28 (SA)。對於經掩蔽之 CD3-CD28 (SA) (不可切割)，未觀察到 T 細胞活化。單價 CD3 IgG 及單價 CD28 (SA) 在本文所用之最高濃度下誘導 T 細胞活化 ( 圖 7D)。實例 5 如 Jurkat IL2 報告細胞測定中所量測的 T 細胞活化

亦使用 Jurkat IL2 報告細胞測定量測經掩蔽之 CD3-CD28 雙特異性抗體所媒介的 T 細胞活化。CD3 (信號 1) 及 CD28 (信號 2) 在 Jurkat IL2 報告細胞上的同時結合導致 Jurkat IL2 報告細胞之下游活化。IL2-Jurkat 報告細胞之活化導致 IL2 的產生，其觸發 Jurkat IL2 報告細胞中由 IL2 調節的螢光素酶的表現。添加 One-Glo 受質 (Promega)，對後者進行定量。測定的發光量為 CD3 及 CD28 所媒介的 Jurkat 活化的直接量度。

將 Jurkat IL-2 報告細胞 (Promega, Ca No J1651) 用作效應子細胞。Jurkat T 細胞係是一種人類急性淋巴白血病報告細胞系，其帶有 IL2 啟動子，在僅由人類 CD3 活化 (甚至更多地，額外活化人類 CD28) 時導致螢光素酶表現。細胞於 RPMI1640 (包括2g/l 葡萄糖、2g/l NaHCO ₃) 與 10 % FCS、25 mM HEPES、1x GlutaMAX、1 x NEAA MEM、1 x 丙酮酸鈉 0.1 – 0.5 Mio 細胞/ml 中之懸浮液中生長。每當細胞傳代時，添加最終濃度為 200 µg/ml 的潮黴素 B。

在測定時，對懸浮液中的 Jurkat IL2 報告細胞計數，並使用 ViCell 評估活力。離心 (310xg, 3 min) 後，抽吸培養基，并將細胞重新懸浮於新鮮 Jurkat 培養基中 (Jurkat 培養基：RPMI1640，2g/l 葡萄糖，2 g/l NaHCO ₃，10 % FCS，25 mM HEPES，2 mM L-麩醯胺酸，1 x NEAA，1 x 丙酮酸鈉) 中。

收穫 Jurkat-NFAT 報告細胞，並使用 ViCell 評估活力。將細胞於 350 x g 下離心 5 min，然後將其重新懸浮於 Jurkat 培養基 (Jurkat 培養基：RPMI1640，2g/l 葡萄糖，2 g/l NaHCO ₃，10 % FCS，25 mM HEPES，2 mM L-麩醯胺酸，1 x NEAA，1 x 丙酮酸鈉) 中。向 384 孔白色透明底培養皿 (Corning) 中添加 30 µl/孔 (30,000 個細胞/孔)，並添加 Glosensor cAMP 試劑 (Promega)。將抗體用 Jurkat 培養基稀釋 (製備 1:5 之稀釋行)，並將所需的量 (每種抗體 200 nM) 添加至安全鎖 eppis 中，並於 37°C 下在存在或不存在 1 μl Rh-Matriptase (來源於大腸桿菌，帶有 His 標籤，Enzo) 的情況下孵育 2 h。然後將各稀釋液濃縮 4 倍，並將每種濃縮的抗體稀釋液以每孔 10 µl 的體積添加至測定培養皿中。將測定培養皿離心幾秒鐘以確保所有液體都處於培養皿底部，然後用培養基液體覆蓋並於 37°C 下在加濕 CO ₂環境中孵育一定時間 (例如 4 h 及 6 h)，然後取出以獲得發光讀數。使用 Tecan Spark 10M 直接量測發光 (每孔 0.5 秒)。

如圖 8所示，對於經掩蔽之 CD28 (SA_變異體8)-CD3 (P035.093) 1+1 抗原結合分子，當添加 Rh-Matriptase 時，在孵育 2 小時至 6 小時後可偵測到 Jurkat NFAT IL2 活化，而在 Matriptase 不存在時則未偵測到 Jurkat IL2 活化。在圖 9A至圖 9C中，示出各種 CD28-CD3 雙特異性抗體在不同時間點 (即 2 h 時 (圖 9A)、3 h 40 min 時 (圖 9B) 及 6 h (圖 9C) 時) 所誘導之 Jurkat NFAT IL2 活化。

雙特異性 CD28-CD3 IgG 誘導劑量依賴性 Jurkat NFAT IL2 活化。用重組人類 Matriptase 於 37°C 下孵育 2 h，未誘導 CD28-CD3 IgG 之功效。用 Matriptase 孵育或不用 Matriptase 孵育時，CD28-CD3 IgG 誘導 Jurkat NFAT IL2 活化的作用相當。含有不可切割連接子的經掩蔽之 CD28-Pro-CD3 IgG 不誘導 Jurkat NFAT IL2 活化，但最高濃度 200 nM 下除外。活化作用明顯低於未經掩蔽之分子。用 Matriptase 孵育或不用 Matriptase 孵育時，CD28-pro-CD3 IgG 誘導 Jurkat NFAT IL2 活化的作用相同。含有 Matriptase 可切割連接子 (PMAKK) 的經掩蔽之 CD28-Pro-CD3 IgG 誘導劑量依賴性 Jurkat NFAT IL2 活化。與 CD28-CD3 IgG 相比，在 EC ₅₀方面的功效略低。當不存在 Matriptase 時，含有 Matriptase 可切割連接子 (PMAKK) 的經掩蔽之 CD28-Pro-CD3 IgG 與含有不可切割連接子的經掩蔽之 CD28-Pro-CD3 IgG 相當。 ***

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在圖 1A 至 1I中，示出如本文所述之例示性分子之示意圖。圖 1A示出呈單價 hu IgG1 PGLALA 同型 (「不活動 Fc」) 的 CD28 促效性抗體變異體之示意圖。圖 1B示出呈 1+1 形式的雙特異性 CD3-CD28 抗原結合分子，其中在包含 CD3 抗原結合域的 Fab 分子中，CH1 與 CL 域彼此交換 (CH1/CL crossfab)，且其中在包含 CD28 抗原結合域的 Fab 分子中，CH1 與 CL 域中之某些胺基酸交換 (帶電荷的變異體)，以實現與輕鏈更好配對。圖 1C示出呈單價 hu IgG1 PGLALA 同型 (「不活動 Fc」) 的 CD28 促效性抗體變異體之示意圖，且圖 1D示出呈單價 hu IgG1 PGLALA 同型 (「不活動 Fc」) 的 CD3 抗體之示意圖。圖 1E示出呈 1+1 形式的雙特異性 CD3-CD28 抗原結合分子，其為 huIgG1 PG-LALA CrossFab 分子，其中在 CD3 (CH2527) Fab 片段 (杵) 中，CH1 與 CK 域交換，且其中 CD3 由抗個體遺傳型 CD3 scFv 4.24.72 及可切割連接子 (MK062 Matriptase 位點) 掩蔽。圖 1F示出呈 1+1 形式的雙特異性 CD3-CD28 抗原結合分子，其為 huIgG1 PG-LALA CrossFab 分子，其中在 CD3 (CH2527) Fab 片段 (杵) 中，CH1 與 CL 域彼此交換 (CL/CH1 crossfab)，且其中 CD3 由抗個體遺傳型 CD3 scFv 4.24.72 及不可切割連接子掩蔽。圖 1G示出呈 1+1 形式的雙特異性 CD3-CD28 抗原結合分子，其中在包含 CD28 抗原結合域的分子中，VH 與 VL 域彼此交換 (VH/VL crossfab)，且其中在包含 CD3 抗原結合域的 Fab 分子中，CH1 與 CL 域中之某些胺基酸交換 (帶電荷的變異體)，以實現與輕鏈更好配對。圖 1H示出呈 1+1 形式的雙特異性 CD3-CD28 抗原結合分子，其為 huIgG1 PG-LALA CrossFab 分子，其中在 CD28 Fab 片段 (臼) 中，VH 與 CL 域交換，且其中 CD3 由抗個體遺傳型 CD3 scFv 4.72.24 及可切割連接子 (MK062 Matriptase 位點) 掩蔽。圖 1I示出呈 1+1 形式的雙特異性 CD3-CD28 抗原結合分子，其為 huIgG1 PG-LALA CrossFab 分子，其中在 CD28 Fab 片段 (臼) 中，VH 與 CL 域交換，且其中 CD3 由抗個體遺傳型 CD3 scFv 4.72.24 及不可切割連接子掩蔽。 CD28(SA) 之可變域及其變異體之比對如圖 2A至圖 2D所示。CD28(SA) VH 域及其變異體 (以便去除半胱胺酸 50 並使所得抗 CD28 結合物之親和力降至不同程度) 之比對如圖 2A所示。需要注意的是，在 VH 變異體 i 及 j 中，CD28(SA) 之 CDR 從 IGHV1-2 骨架移植到 IGHV3-23 骨架中 ( 圖 2B)。在圖 2C中，示出 CD28(SA) VL 域及其變異體 (以便使所得抗 CD28 結合物之親和力降至不同程度) 之比對。在變異體 t 中，將 CDR 移植到曲妥珠單抗 (賀癌平) VL 序列之骨架序列 ( 圖 2D)。在圖 3A至圖 3C中，示出來自上清液之單特異性、單價 IgG 形式的親和力降低之 CD28 促效性抗體變異體與人類 CD28 之結合。與陰性對照 (抗 DP47) 及原始 CD28 抗體 CD28(SA) 相比，與表現人類 CD28 之 CHO 細胞 (親本細胞系 CHO-k1 ATCC #CCL-61，其經修飾以穩定過度表現人類 CD28) 結合的中間值螢光強度藉由流式細胞術來評估。變異體 1-10 之結合曲線如圖 3A所示，變異體 11 至 22 之結合曲線如圖 3B所示，且變異體 23 至 31 之結合曲線如圖 3C所示。所繪示的為技術重複樣品結果與 SD。圖 4A 及圖 4B涉及如實例 2 中所述之 Jurkat NFAT 活化測定。圖 4A示出由雙特異性 CD28 mAb9.3-CD3 IgG 所媒介之 Jurkat NFAT 活化。將 Jurkat NFAT 效應子細胞用雙特異性 CD28 (9.3)-CD3 IgG 或單價對照 IgG 進行孵育。添加 One Glo 受質後，在孵育 5 h 後量測螢光。每個數據點代表三個重複樣品之平均值 (n=2)。在圖 4B中，示出由雙特異性 CD28 (SA)-CD3 IgG 所媒介之 Jurkat NFAT 活化。將 Jurkat NFAT 效應子細胞用雙特異性 CD28 (SA)-CD3 IgG 或單價對照 IgG 進行孵育。添加 One Glo 受質後，在孵育 5 h 後量測螢光。每個數據點代表三個重複樣品之平均值 (n=2)。圖 4C示出抗人類 Fc 抗體塗布的培養皿上由雙特異性 CD28 (9.3)-CD3 IgG 所媒介之 Jurkat NFAT 活化。將 Jurkat NFAT 效應子細胞用雙特異性 CD28 (9.3)-CD3 IgG 或單價對照 IgG 進行孵育。添加 One Glo 受質後，在孵育 5 h 後量測螢光。每個數據點代表三個重複樣品之平均值 (n=2)。圖 4D示出抗人類 Fc 抗體塗布的培養皿上由雙特異性 CD28 (SA)-CD3 IgG 所媒介之 Jurkat NFAT 活化。將 Jurkat NFAT 效應子細胞用雙特異性 CD28(SA)-CD3 IgG 或單價對照 IgG 進行孵育。添加 One Glo 受質後，在孵育 5 h 後量測螢光。每個數據點代表三個重複樣品之平均值 (n=2)。圖 4E示出未經塗布的培養皿上由雙特異性 CD28 (9.3)-CD3 IgG 所媒介之 Jurkat NFAT 活化。將 Jurkat NFAT 效應子細胞用雙特異性 CD28 (9.3)-CD3 IgG 或單價對照 IgG 進行孵育。添加 One Glo 受質後，在孵育 5 h 後量測螢光。每個數據點代表三個重複樣品之平均值 (n=2)。圖 4F 示出未經塗布的培養皿上由雙特異性 CD28 (SA)-CD3 IgG 所媒介之 Jurkat NFAT 活化。將 Jurkat NFAT 效應子細胞用雙特異性 CD28(SA)-CD3 IgG 或單價對照 IgG 進行孵育。添加 One Glo 受質後，在孵育 5 h 後量測螢光。每個數據點代表三個重複樣品之平均值 (n=2)。圖 5A至圖 5D示出孵育 48 h 後，由濃度為 10 nM 的雙特異性 CD3-CD28 IgG、單價對照 IgG 在人類 PBMC 中所媒介之 T 細胞活化 (見實例 4)。在圖 5A中，示出使用 huFc 塗層進行交聯時，雙特異性 CD3-CD28 (9.3) IgG 之劑量依賴性 T 細胞活化 (藉由 IFN γ 釋放來量測)，而在圖 5B中，示出不使用 huFc 塗層時的劑量依賴性 T 細胞活化 (藉由 IFN γ 釋放來量測)。在圖 5C中，示出使用 huFc 塗層進行交聯時，雙特異性 CD3-CD28 (SA) IgG 之劑量依賴性 T 細胞活化 (藉由 IFN γ 釋放來量測)，而在圖 5D中，示出不使用 huFc 塗層時的劑量依賴性 T 細胞活化 (藉由 IFN γ 釋放來量測)。圖 6A至圖 6D示出在一項實驗中所量測之 T 細胞活化，其中亦測試了可蛋白酶活化之經掩蔽的 CD3-CD28 IgG (經抗個體遺傳型 CD3 scFv 掩蔽之 Pro-CD3，其通過可切割連接子或不可切割連接子融合至 CD3)。於 37°C 下用 rhMatriptase/ST14 (R&D Systems) 在 24 小時内完成預處理。在圖 6A中，示出使用 huFc 塗層進行交聯時，雙特異性 CD3-CD28 (9.3) IgG 構建體之劑量依賴性 T 細胞活化 (藉由 IFN γ 釋放來量測)，其中在圖 6B中，示出使用 huFc 塗層時的劑量依賴性 T 細胞活化 (藉由定量 CD8 陽性 T 細胞上之 CD69 來量測)。圖 6C示出不使用 huFc 塗層進時，雙特異性 CD3-CD28 (SA) IgG 之劑量依賴性 T 細胞活化 (藉由 IFN γ 釋放來量測)，而在圖 6D中，示出不使用 huFc 塗層時的劑量依賴性 T 細胞活化 (藉由定量 CD8 陽性 T 細胞上之 CD69 來量測)。圖 7A至 7D示出在另一項實驗中所量測之 T 細胞活化，其中亦包括可蛋白酶活化之經掩蔽的 CD3-CD28 (SA) IgG (經抗個體遺傳型 CD3 scFv 掩蔽之 Pro-CD3，其通過可切割連接子或不可切割連接子融合至 CD3)，並進一步研究了 huFc 塗層 vs. 無 huFc 塗層的影響。在圖 7A中，示出使用 huFc 塗層進行交聯時，雙特異性 CD3-CD28 (SA) IgG 構建體之劑量依賴性 T 細胞活化 (藉由 IFN γ 釋放來量測)。圖 7B示出使用 huFc 塗層進行交聯時的劑量依賴性 T 細胞活化 (藉由定量 CD8 陽性 T 細胞上之 CD69 來量測)。圖 7C示出不使用 huFc 塗層時，雙特異性 CD3-CD28 (SA) IgG 構建體之劑量依賴性 T 細胞活化 (藉由 IFN γ 釋放來量測)。In 圖 7D示出不使用 huFc 塗層時的劑量依賴性 T 細胞活化 (藉由定量 CD8 陽性 T 細胞上之 CD69 來量測)。圖 8示出不經重組 Matriptase 孵育且存在 1 μl 重組 Matriptase (rhMat) 的情況下，可蛋白酶活化之經掩蔽的 CD3-CD28 (Var. 8) IgG (經抗個體遺傳型 CD3 scFv 掩蔽的 Pro-CD3，通過 Matriptase 可切割連接子融合至 CD3) 的動力學。圖 9A至 9C示出藉由於不同時間點量測 Jurkat NFAT IL2 活化 (發光讀數) 所獲得之 T 細胞活化，其中對可蛋白酶活化之經掩蔽的 CD3-CD28 (Var. 8) IgG (經抗個體遺傳型 CD3 scFv 掩蔽的 Pro-CD3，通過可切割連接子或不可切割連接子融合至 CD3) 與未經掩蔽之 CD3-CD28 (Var. 8) 進行比較。所示為不存在 Matriptase 或用 1 μl 重組 Matriptase (rhMat) 孵育 2 h ( 圖 9A)、3.40 h ( 圖 9B) 及 6h ( 圖 9C) 後的 NFAT IL2 活化。

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          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  220]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val 
          1               5                   10                  15      
          Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr 
                      20                  25                  30          
          Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser 
                  35                  40                  45              
          Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu 
              50                  55                  60                  
          Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr 
                          85                  90                  95      
          Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys 
                      100                 105                 110         
          Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser 
                  115                 120                 125             
          Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro 
              130                 135                 140                 
          Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile 
                          165                 170                 175     
          Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met 
                      180                 185                 190         
          Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro 
                  195                 200                 205             
          Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 
              210                 215                 220 
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          Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 
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          Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3 (CH2527) CDR-L3]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  125]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈可變域 VH，CD3 (CH2527)]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 
              50                  55                  60                  
          Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 
                          85                  90                  95      
          Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 
                      100                 105                 110         
          Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125 
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  109]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈可變域 VL，CD3 (CH2527)]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly 
                  35                  40                  45              
          Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 
                          85                  90                  95      
          Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
                      100                 105                 
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3 (P035.093) CDR-H1]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Ser Tyr Ala Met Asn 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3 (P035.093) CDR-H2]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 
          1               5                   10                  15      
          Val Lys Gly 
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3 (P035.093) CDR-H3]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Ala Ser Asn Phe Pro Ala Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3 (P035.093) CDR-L1]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3 (P035.093) CDR-L2]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3 (P035.093) CDR-L3]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  125]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈可變域 VH，CD3 (P035.093)]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 
              50                  55                  60                  
          Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 
                          85                  90                  95      
          Tyr Cys Val Arg Ala Ser Asn Phe Pro Ala Ser Tyr Val Ser Tyr Phe 
                      100                 105                 110         
          Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120                 125 
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  109]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈可變域 VL，CD3 (P035.093)]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly 
                  35                  40                  45              
          Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 
                          85                  90                  95      
          Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 
                      100                 105                 
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(SA) CDR-H1]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          Ser Tyr Tyr Ile His 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(SA) CDR-H2]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          Cys Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 
          1               5                   10                  15      
          Asp 
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(SA) CDR-H3]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(SA) CDR-L1]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Trp Leu Asn 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(SA) CDR-L2]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          Lys Ala Ser Asn Leu His Thr 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(SA) CDR-L3]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  120]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(SA) VH]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Cys Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120 
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(SA) VL]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Trp 
                      20                  25                  30          
          Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28 CDR-H1 共通]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          Ser Tyr Tyr Ile His 
          1               5   
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          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28 CDR-H2 共通]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  變異體]]>
          <![CDATA[<222>  (5)..(5)]]>
          <![CDATA[<223>  Gly 或 Arg]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  變異體]]>
          <![CDATA[<222>  (6)..(6)]]>
          <![CDATA[<223>  Asn 或 Asp]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  變異體]]>
          <![CDATA[<222>  (7)..(7)]]>
          <![CDATA[<223>  Val 或 Gly]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  變異體]]>
          <![CDATA[<222>  (8)..(8)]]>
          <![CDATA[<223>  Asn, Gln 或 Ala]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          Ser Ile Tyr Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 
          1               5                   10                  15      
          Asp 
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28 CDR-H3 共通]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  變異體]]>
          <![CDATA[<222>  (5)..(5)]]>
          <![CDATA[<223>  Leu 或 Ala]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  變異體]]>
          <![CDATA[<222>  (7)..(7)]]>
          <![CDATA[<223>  Trp, His, Tyr 或 Phe]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          Ser His Tyr Gly Xaa Asp Xaa Asn Phe Asp Val 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28 CDR-L1 共通]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  變異體]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(1)]]>
          <![CDATA[<223>  His 或 Arg]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  變異體]]>
          <![CDATA[<222>  (5)..(5)]]>
          <![CDATA[<223>  Asn 或 Gly]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  變異體]]>
          <![CDATA[<222>  (7)..(7)]]>
          <![CDATA[<223>  Tyr 或 Ser]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<223>  Val 或 Asn]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  變異體]]>
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          <![CDATA[<400>  29]]>
          Xaa Ala Ser Gln Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Leu Asn 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28 CDR-L2 共通]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  變異體]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(1)]]>
          <![CDATA[<223>  Lys 或 Tyr]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  變異體]]>
          <![CDATA[<222>  (2)..(2)]]>
          <![CDATA[<223>  Ala 或 Gly]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  變異體]]>
          <![CDATA[<222>  (4)..(4)]]>
          <![CDATA[<223>  Asn 或 Ser]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  變異體]]>
          <![CDATA[<222>  (6)..(6)]]>
          <![CDATA[<223>  His 或 Tyr]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  變異體]]>
          <![CDATA[<222>  (7)..(7)]]>
          <![CDATA[<223>  Thr 或 Ser]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          Xaa Xaa Ser Xaa Leu Xaa Xaa 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28 CDR-L3 共通]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  變異體]]>
          <![CDATA[<222>  (3)..(3)]]>
          <![CDATA[<223>  Gly 或 Ala]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          Gln Gln Xaa Gln Thr Tyr Pro Tyr Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  32]]>
          <![CDATA[<211>  120]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28 VH 變異體 a]]>
          <![CDATA[<400>  32]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120 
          <![CDATA[<210>  33]]>
          <![CDATA[<211>  120]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28 VH 變異體 b]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Gln Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp His Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120 
          <![CDATA[<210>  34]]>
          <![CDATA[<211>  120]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28 VH 變異體 c]]>
          <![CDATA[<400>  34]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Gln Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Arg Ser His Tyr Gly Ala Asp His Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120 
          <![CDATA[<210>  35]]>
          <![CDATA[<211>  120]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28 VH 變異體 d]]>
          <![CDATA[<400>  35]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Ser Ile Tyr Pro Arg Asp Gly Gln Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Tyr Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120 
          <![CDATA[<210>  36]]>
          <![CDATA[<211>  120]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28 VH 變異體 e]]>
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          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
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          Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Gln Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
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          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Gln Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Phe Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
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          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 
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          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
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          Gly Ser Ile Tyr Pro Arg Asn Val Gln Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
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          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
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          Gly Ser Ile Tyr Pro Arg Asp Val Gln Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 
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          Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
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          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
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          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr 
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          Ala Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
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          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr 
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          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
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          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
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          Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
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          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
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          <![CDATA[<400>  59]]>
          Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Gln Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 
          1               5                   10                  15      
          Asp 
          <![CDATA[<210>  60]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(變異體 15) CDR-H3]]>
          <![CDATA[<400>  60]]>
          Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  61]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(變異體 15) CDR-L1]]>
          <![CDATA[<400>  61]]>
          His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Phe Leu Asn 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  62]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(變異體 15) CDR-L2]]>
          <![CDATA[<400>  62]]>
          Lys Ala Ser Asn Leu His Thr 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  63]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(變異體 15) CDR-L3]]>
          <![CDATA[<400>  63]]>
          Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  64]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(變異體 29) CDR-H1]]>
          <![CDATA[<400>  64]]>
          Ser Tyr Tyr Ile His 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  65]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(變異體 29) CDR-H2]]>
          <![CDATA[<400>  65]]>
          Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 
          1               5                   10                  15      
          Asp 
          <![CDATA[<210>  66]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(變異體 29) CDR-H3]]>
          <![CDATA[<400>  66]]>
          Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  67]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
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          <![CDATA[<400>  67]]>
          His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Trp Leu Asn 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  68]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
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          <![CDATA[<400>  68]]>
          Lys Ala Ser Asn Leu His Thr 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  69]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(變異體 29) CDR-L3]]>
          <![CDATA[<400>  69]]>
          Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  70]]>
          <![CDATA[<211>  207]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  70]]>
          Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser 
          1               5                   10                  15      
          Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr 
                      20                  25                  30          
          Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr 
                  35                  40                  45              
          Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys 
              50                  55                  60                  
          Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp 
          65                  70                  75                  80  
          His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr 
                          85                  90                  95      
          Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu 
                      100                 105                 110         
          Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu 
              130                 135                 140                 
          Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn 
                          165                 170                 175     
          Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg 
                      180                 185                 190         
          Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile 
                  195                 200                 205         
          <![CDATA[<210>  71]]>
          <![CDATA[<211>  198]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  食蟹獼猴]]>
          <![CDATA[<400>  71]]>
          Met Gln Ser Gly Thr Arg Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser 
          1               5                   10                  15      
          Ile Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr 
                      20                  25                  30          
          Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr 
                  35                  40                  45              
          Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys 
              50                  55                  60                  
          Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro 
                          85                  90                  95      
          Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn 
                      100                 105                 110         
          Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp 
                  115                 120                 125             
          Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys 
              130                 135                 140                 
          Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn 
                          165                 170                 175     
          Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly 
                      180                 185                 190         
          Leu Asn Gln Arg Arg Ile 
                  195             
          <![CDATA[<210>  72]]>
          <![CDATA[<211>  448]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  VH (CD28 SA) CH1 (EE)- Fc 杵 PGLALA]]>
          <![CDATA[<400>  72]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Cys Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 
                  115                 120                 125             
          Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 
              130                 135                 140                 
          Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 
                          165                 170                 175     
          Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 
                  195                 200                 205             
          Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 
              210                 215                 220                 
          Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 
                          245                 250                 255     
          Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 
                      260                 265                 270         
          Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 
                  275                 280                 285             
          Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 
              290                 295                 300                 
          Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu 
                          325                 330                 335     
          Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 
                      340                 345                 350         
          Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 
                  355                 360                 365             
          Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 
              370                 375                 380                 
          Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 
                          405                 410                 415     
          Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 
                      420                 425                 430         
          Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                  435                 440                 445             
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          <![CDATA[<211>  448]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<400>  73]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Ser Ile Tyr Pro Arg Asn Val Gln Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp His Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 
                  115                 120                 125             
          Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 
              130                 135                 140                 
          Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 
                          165                 170                 175     
          Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 
                  195                 200                 205             
          Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 
              210                 215                 220                 
          Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 
                          245                 250                 255     
          Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 
                      260                 265                 270         
          Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 
                  275                 280                 285             
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              290                 295                 300                 
          Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu 
                          325                 330                 335     
          Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 
                      340                 345                 350         
          Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 
                  355                 360                 365             
          Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 
              370                 375                 380                 
          Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 
                          405                 410                 415     
          Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 
                      420                 425                 430         
          Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                  435                 440                 445             
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          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Gln Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Phe Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 
                  115                 120                 125             
          Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 
              130                 135                 140                 
          Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 
                          165                 170                 175     
          Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 
                  195                 200                 205             
          Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 
              210                 215                 220                 
          Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 
                          245                 250                 255     
          Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 
                      260                 265                 270         
          Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 
                  275                 280                 285             
          Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 
              290                 295                 300                 
          Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu 
                          325                 330                 335     
          Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 
                      340                 345                 350         
          Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 
                  355                 360                 365             
          Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 
              370                 375                 380                 
          Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 
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                          405                 410                 415     
          Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 
                      420                 425                 430         
          Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                  435                 440                 445             
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          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Ala Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
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                          85                  90                  95      
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                      100                 105                 110         
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          Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 
              130                 135                 140                 
          Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 
                          165                 170                 175     
          Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 
                  195                 200                 205             
          Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 
              210                 215                 220                 
          Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 
                          245                 250                 255     
          Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 
                      260                 265                 270         
          Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 
                  275                 280                 285             
          Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 
              290                 295                 300                 
          Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu 
                          325                 330                 335     
          Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 
                      340                 345                 350         
          Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 
                  355                 360                 365             
          Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 
              370                 375                 380                 
          Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 
                          405                 410                 415     
          Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 
                      420                 425                 430         
          Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                  435                 440                 445             
          <![CDATA[<210>  76]]>
          <![CDATA[<211>  448]]>
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          <![CDATA[<400>  76]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Gln Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 
                  115                 120                 125             
          Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 
              130                 135                 140                 
          Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 
                          165                 170                 175     
          Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 
                  195                 200                 205             
          Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 
              210                 215                 220                 
          Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 
                          245                 250                 255     
          Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 
                      260                 265                 270         
          Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 
                  275                 280                 285             
          Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 
              290                 295                 300                 
          Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu 
                          325                 330                 335     
          Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 
                      340                 345                 350         
          Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 
                  355                 360                 365             
          Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 
              370                 375                 380                 
          Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 
                          405                 410                 415     
          Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 
                      420                 425                 430         
          Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                  435                 440                 445             
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          <![CDATA[<400>  77]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Gln Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp His Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 
                  115                 120                 125             
          Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 
              130                 135                 140                 
          Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 
                          165                 170                 175     
          Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 
                  195                 200                 205             
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              210                 215                 220                 
          Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 
                          245                 250                 255     
          Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 
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          Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu 
                          325                 330                 335     
          Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 
                      340                 345                 350         
          Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 
                  355                 360                 365             
          Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 
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          Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 
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          Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 
                          405                 410                 415     
          Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 
                      420                 425                 430         
          Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                  435                 440                 445             
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          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 
                  115                 120                 125             
          Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 
              130                 135                 140                 
          Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 
                          165                 170                 175     
          Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 
                  195                 200                 205             
          Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 
              210                 215                 220                 
          Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 
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          Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 
                          245                 250                 255     
          Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 
                      260                 265                 270         
          Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 
                  275                 280                 285             
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          Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu 
                          325                 330                 335     
          Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 
                      340                 345                 350         
          Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 
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          Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 
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          Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 
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          Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 
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          Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 
                      420                 425                 430         
          Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                  435                 440                 445             
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          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 
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              130                 135                 140                 
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          Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 
                          165                 170                 175     
          Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 
                  195                 200                 205             
          Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 
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                          245                 250                 255     
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                      260                 265                 270         
          Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 
                  275                 280                 285             
          Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 
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                      340                 345                 350         
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              370                 375                 380                 
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                      420                 425                 430         
          Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                  435                 440                 445             
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          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
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                  35                  40                  45              
          Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr 
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          1               5                   10                  15      
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          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Trp 
                      20                  25                  30          
          Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Lys Ala Ser Asn Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 
                  195                 200                 205             
          Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 
          <![CDATA[<210>  87]]>
          <![CDATA[<211>  225]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Fc 臼 PGLALA, HYRF]]>
          <![CDATA[<400>  87]]>
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
                      20                  25                  30          
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 
                  35                  40                  45              
          Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
              50                  55                  60                  
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
                          85                  90                  95      
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile 
                      100                 105                 110         
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                  115                 120                 125             
          Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 
              130                 135                 140                 
          Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
                          165                 170                 175     
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 
                      180                 185                 190         
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                  195                 200                 205             
          His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
              210                 215                 220                 
          Pro 
          225 
          <![CDATA[<210>  88]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Avi 標籤]]>
          <![CDATA[<400>  88]]>
          Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  89]]>
          <![CDATA[<211>  457]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3(CH2527) VH-CL hu IgG1 Fc 杵 PGLALA]]>
          <![CDATA[<400>  89]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 
              50                  55                  60                  
          Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 
                          85                  90                  95      
          Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 
                      100                 105                 110         
          Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val 
                  115                 120                 125             
          Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 
              130                 135                 140                 
          Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 
                          165                 170                 175     
          Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 
                      180                 185                 190         
          Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 
                  195                 200                 205             
          Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 
              210                 215                 220                 
          Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 
                          245                 250                 255     
          Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 
                      260                 265                 270         
          Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 
                  275                 280                 285             
          Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 
              290                 295                 300                 
          Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 
          305                 310                 315                 320 
          Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 
                          325                 330                 335     
          Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 
                      340                 345                 350         
          Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp 
                  355                 360                 365             
          Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe 
              370                 375                 380                 
          Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 
          385                 390                 395                 400 
          Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 
                          405                 410                 415     
          Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 
                      420                 425                 430         
          Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 
                  435                 440                 445             
          Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
              450                 455         
          <![CDATA[<210>  90]]>
          <![CDATA[<211>  214]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3(CH2527) VL-CH1]]>
          <![CDATA[<400>  90]]>
          Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly 
                  35                  40                  45              
          Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 
                          85                  90                  95      
          Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala 
                      100                 105                 110         
          Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 
                  115                 120                 125             
          Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 
              130                 135                 140                 
          Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 
                          165                 170                 175     
          Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 
                  195                 200                 205             
          Val Glu Pro Lys Ser Cys 
              210                 
          <![CDATA[<210>  91]]>
          <![CDATA[<211>  448]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(9.3) VH-CH1 (EE) hu IgG1 Fc 臼 PGLALA]]>
          <![CDATA[<400>  91]]>
          Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Thr Pro Ser Gln 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu 
                  35                  40                  45              
          Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Lys Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 
                  115                 120                 125             
          Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 
              130                 135                 140                 
          Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 
                          165                 170                 175     
          Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 
                  195                 200                 205             
          Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 
              210                 215                 220                 
          Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 
                          245                 250                 255     
          Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 
                      260                 265                 270         
          Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 
                  275                 280                 285             
          Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 
              290                 295                 300                 
          Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu 
                          325                 330                 335     
          Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 
                  355                 360                 365             
          Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 
              370                 375                 380                 
          Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp 
                          405                 410                 415     
          Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 
                      420                 425                 430         
          Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                  435                 440                 445             
          <![CDATA[<210>  92]]>
          <![CDATA[<211>  218]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(9.3) VL-Cκ (RK)]]>
          <![CDATA[<400>  92]]>
          Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 
                  35                  40                  45              
          Lys Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asn Phe Ser Leu Asn Ile His 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Val Asp Glu Asp Asp Val Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg 
                          85                  90                  95      
          Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 
                      100                 105                 110         
          Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys 
                  115                 120                 125             
          Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 
              130                 135                 140                 
          Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 
                          165                 170                 175     
          Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 
                      180                 185                 190         
          His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 
                  195                 200                 205             
          Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 215             
          <![CDATA[<210>  93]]>
          <![CDATA[<211>  448]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(SA) VH-CH1 (EE) hu IgG1 Fc 臼 PGLALA]]>
          <![CDATA[<400>  93]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Cys Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 
                  115                 120                 125             
          Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 
              130                 135                 140                 
          Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 
                          165                 170                 175     
          Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 
                  195                 200                 205             
          Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 
              210                 215                 220                 
          Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 
                          245                 250                 255     
          Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 
                      260                 265                 270         
          Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 
                  275                 280                 285             
          Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 
              290                 295                 300                 
          Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu 
                          325                 330                 335     
          Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 
                  355                 360                 365             
          Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 
              370                 375                 380                 
          Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp 
                          405                 410                 415     
          Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 
                      420                 425                 430         
          Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                  435                 440                 445             
          <![CDATA[<210>  94]]>
          <![CDATA[<211>  214]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(SA) VL-Cκ (RK)]]>
          <![CDATA[<400>  94]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Trp 
                      20                  25                  30          
          Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 
                  195                 200                 205             
          Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 
          <![CDATA[<210>  95]]>
          <![CDATA[<211>  225]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Fc 杵 PGLALA]]>
          <![CDATA[<400>  95]]>
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
                      20                  25                  30          
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 
                  35                  40                  45              
          Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
              50                  55                  60                  
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
                          85                  90                  95      
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile 
                      100                 105                 110         
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                  115                 120                 125             
          Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 
              130                 135                 140                 
          Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
                          165                 170                 175     
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 
                      180                 185                 190         
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                  195                 200                 205             
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
              210                 215                 220                 
          Pro 
          225 
          <![CDATA[<210>  96]]>
          <![CDATA[<211>  225]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Fc 臼 PGLALA]]>
          <![CDATA[<400>  96]]>
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
                      20                  25                  30          
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 
                  35                  40                  45              
          Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
              50                  55                  60                  
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
                          85                  90                  95      
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile 
                      100                 105                 110         
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                  115                 120                 125             
          Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 
              130                 135                 140                 
          Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
                          165                 170                 175     
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 
                      180                 185                 190         
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                  195                 200                 205             
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
              210                 215                 220                 
          Pro 
          225 
          <![CDATA[<210>  97]]>
          <![CDATA[<211>  448]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(9.3) VH-CH1 (EE) hu IgG1 Fc 臼 PGLALA]]>
          <![CDATA[<400>  97]]>
          Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Thr Pro Ser Gln 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu 
                  35                  40                  45              
          Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Lys Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 
                  115                 120                 125             
          Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 
              130                 135                 140                 
          Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 
                          165                 170                 175     
          Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 
                  195                 200                 205             
          Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 
              210                 215                 220                 
          Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 
                          245                 250                 255     
          Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 
                      260                 265                 270         
          Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 
                  275                 280                 285             
          Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 
              290                 295                 300                 
          Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu 
                          325                 330                 335     
          Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 
                  355                 360                 365             
          Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 
              370                 375                 380                 
          Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp 
                          405                 410                 415     
          Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 
                      420                 425                 430         
          Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                  435                 440                 445             
          <![CDATA[<210>  98]]>
          <![CDATA[<211>  739]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  ScFv (4.24.72) VH-(G4S)4-VL-Matriptase 連接子- CD3 VH-CL hu IgG1 ]]>
                 Fc 杵 PGLALA
          <![CDATA[<400>  98]]>
          Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Leu 
                  35                  40                  45              
          Gly Ile Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Lys Gly Ile Thr Thr Val Val Asp Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile 
              130                 135                 140                 
          Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Asp Ser Tyr Leu Ala 
                          165                 170                 175     
          Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Ala 
                      180                 185                 190         
          Ala Thr Phe Leu Ala Asp Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 
                  195                 200                 205             
          Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser Glu Asp 
              210                 215                 220                 
          Val Ala Arg Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
                          245                 250                 255     
          Gly Gly Ser Arg Gln Ala Arg Val Val Asn Gly Gly Gly Gly Gly Ser 
                      260                 265                 270         
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu 
                  275                 280                 285             
          Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 
              290                 295                 300                 
          Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys 
                          325                 330                 335     
          Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 
                      340                 345                 350         
          Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn 
                  355                 360                 365             
          Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly 
              370                 375                 380                 
          Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 
                          405                 410                 415     
          Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val 
                      420                 425                 430         
          Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp 
                  435                 440                 445             
          Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr 
              450                 455                 460                 
          Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 
          465                 470                 475                 480 
          Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val 
                          485                 490                 495     
          Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly 
                      500                 505                 510         
          Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 
                  515                 520                 525             
          Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 
              530                 535                 540                 
          Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 
          545                 550                 555                 560 
          Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 
                          565                 570                 575     
          Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 
                      580                 585                 590         
          Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 
                  595                 600                 605             
          Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala 
              610                 615                 620                 
          Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 
          625                 630                 635                 640 
          Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 
                          645                 650                 655     
          Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 
                      660                 665                 670         
          Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 
                  675                 680                 685             
          Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 
              690                 695                 700                 
          Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 
          705                 710                 715                 720 
          Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 
                          725                 730                 735     
          Leu Ser Pro 
          <![CDATA[<210>  99]]>
          <![CDATA[<211>  448]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(SA) VH-CH1 (EE) hu IgG1 Fc 臼 PGLALA]]>
          <![CDATA[<400>  99]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Cys Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 
                  115                 120                 125             
          Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 
              130                 135                 140                 
          Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 
                          165                 170                 175     
          Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 
                  195                 200                 205             
          Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 
              210                 215                 220                 
          Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 
                          245                 250                 255     
          Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 
                      260                 265                 270         
          Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 
                  275                 280                 285             
          Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 
              290                 295                 300                 
          Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu 
                          325                 330                 335     
          Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys 
                      340                 345                 350         
          Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 
                  355                 360                 365             
          Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 
              370                 375                 380                 
          Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp 
                          405                 410                 415     
          Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 
                      420                 425                 430         
          Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                  435                 440                 445             
          <![CDATA[<210>  100]]>
          <![CDATA[<211>  739]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  ScFv (4.24.72) VH-(G4S)4-VL-不可切割連接子- CD3 VH-CL hu IgG1]]>
                 Fc 杵 PGLALA
          <![CDATA[<400>  100]]>
          Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Leu 
                  35                  40                  45              
          Gly Ile Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Lys Gly Ile Thr Thr Val Val Asp Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile 
              130                 135                 140                 
          Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Asp Ser Tyr Leu Ala 
                          165                 170                 175     
          Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Ala 
                      180                 185                 190         
          Ala Thr Phe Leu Ala Asp Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 
                  195                 200                 205             
          Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser Glu Asp 
              210                 215                 220                 
          Val Ala Arg Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
                          245                 250                 255     
          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser 
                      260                 265                 270         
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu 
                  275                 280                 285             
          Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 
              290                 295                 300                 
          Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys 
                          325                 330                 335     
          Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 
                      340                 345                 350         
          Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn 
                  355                 360                 365             
          Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly 
              370                 375                 380                 
          Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 
                          405                 410                 415     
          Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val 
                      420                 425                 430         
          Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp 
                  435                 440                 445             
          Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr 
              450                 455                 460                 
          Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 
          465                 470                 475                 480 
          Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val 
                          485                 490                 495     
          Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly 
                      500                 505                 510         
          Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 
                  515                 520                 525             
          Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 
              530                 535                 540                 
          Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 
          545                 550                 555                 560 
          Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 
                          565                 570                 575     
          Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 
                      580                 585                 590         
          Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 
                  595                 600                 605             
          Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala 
              610                 615                 620                 
          Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 
          625                 630                 635                 640 
          Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 
                          645                 650                 655     
          Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 
                      660                 665                 670         
          Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 
                  675                 680                 685             
          Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 
              690                 695                 700                 
          Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 
          705                 710                 715                 720 
          Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 
                          725                 730                 735     
          Leu Ser Pro 
          <![CDATA[<210>  101]]>
          <![CDATA[<211>  437]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(SA_變異體 8) VL-CH hu IgG1 Fc 臼 PGLALA]]>
          <![CDATA[<400>  101]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr 
                      100                 105                 110         
          Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 
                  115                 120                 125             
          Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 
              130                 135                 140                 
          Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 
          145                 150                 155                 160 
          Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 
                          165                 170                 175     
          Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 
                      180                 185                 190         
          Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 
                  195                 200                 205             
          Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 
              210                 215                 220                 
          Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 
                          245                 250                 255     
          Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 
                      260                 265                 270         
          Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 
                  275                 280                 285             
          Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 
              290                 295                 300                 
          Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 
                          325                 330                 335     
          Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 
                      340                 345                 350         
          Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 
                  355                 360                 365             
          Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 
              370                 375                 380                 
          Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser 
          385                 390                 395                 400 
          Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 
                          405                 410                 415     
          Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 
                      420                 425                 430         
          Leu Ser Leu Ser Pro 
                  435         
          <![CDATA[<210>  102]]>
          <![CDATA[<211>  227]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(SA_變異體 8) VH-CL]]>
          <![CDATA[<400>  102]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Gln Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Phe Asn Phe Asp Val Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val 
                  115                 120                 125             
          Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 
              130                 135                 140                 
          Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val 
                          165                 170                 175     
          Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu 
                      180                 185                 190         
          Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu 
                  195                 200                 205             
          Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg 
              210                 215                 220                 
          Gly Glu Cys 
          225         
          <![CDATA[<210>  103]]>
          <![CDATA[<211>  453]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3 (P035.093) VH-CH1 (EE) Fc 杵 PGLALA]]>
          <![CDATA[<400>  103]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 
              50                  55                  60                  
          Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 
                          85                  90                  95      
          Tyr Cys Val Arg Ala Ser Asn Phe Pro Ala Ser Tyr Val Ser Tyr Phe 
                      100                 105                 110         
          Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 
                  115                 120                 125             
          Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 
              130                 135                 140                 
          Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 
                          165                 170                 175     
          Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 
                      180                 185                 190         
          Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys 
                  195                 200                 205             
          Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu 
              210                 215                 220                 
          Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 
                          245                 250                 255     
          Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 
                      260                 265                 270         
          Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 
                  275                 280                 285             
          Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 
              290                 295                 300                 
          Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 
                          325                 330                 335     
          Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 
                      340                 345                 350         
          Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys 
                  355                 360                 365             
          Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 
              370                 375                 380                 
          Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 
                          405                 410                 415     
          Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 
                      420                 425                 430         
          Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 
                  435                 440                 445             
          Leu Ser Leu Ser Pro 
              450             
          <![CDATA[<210>  104]]>
          <![CDATA[<211>  215]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD3 (P035.093) VL-Cκ]]>
          <![CDATA[<400>  104]]>
          Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly 
                  35                  40                  45              
          Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 
                          85                  90                  95      
          Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 
                      100                 105                 110         
          Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Lys Lys Leu 
                  115                 120                 125             
          Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro 
              130                 135                 140                 
          Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala 
                          165                 170                 175     
          Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg 
                      180                 185                 190         
          Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr 
                  195                 200                 205             
          Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 
              210                 215 
          <![CDATA[<210>  105]]>
          <![CDATA[<211>  735]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  ScFv (4.24.72) VH-(G4S)4-VL-不可切割連接子- CD3 (P035.093) ]]>
                 VH-CH1 hu IgG1 Fc 杵 PGLALA
          <![CDATA[<400>  105]]>
          Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 
          1               5                   10                  15      
          Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Val Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Lys Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Thr Asp Asp Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Asp Val Phe Asp Tyr Trp Gly His Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Lys Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
                  115                 120                 125             
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln 
              130                 135                 140                 
          Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His 
                          165                 170                 175     
          Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr 
                      180                 185                 190         
          Val Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly 
                  195                 200                 205             
          Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp 
              210                 215                 220                 
          Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Phe Pro Tyr Thr Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
                          245                 250                 255     
          Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser 
                      260                 265                 270         
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu 
                  275                 280                 285             
          Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 
              290                 295                 300                 
          Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys 
                          325                 330                 335     
          Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 
                      340                 345                 350         
          Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn 
                  355                 360                 365             
          Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Ala Ser 
              370                 375                 380                 
          Asn Phe Pro Ala Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 
                          405                 410                 415     
          Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 
                      420                 425                 430         
          Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 
                  435                 440                 445             
          Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 
              450                 455                 460                 
          Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 
          465                 470                 475                 480 
          Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 
                          485                 490                 495     
          Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 
                      500                 505                 510         
          Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro 
                  515                 520                 525             
          Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 
              530                 535                 540                 
          Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 
          545                 550                 555                 560 
          Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 
                          565                 570                 575     
          Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 
                      580                 585                 590         
          Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 
                  595                 600                 605             
          Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys 
              610                 615                 620                 
          Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 
          625                 630                 635                 640 
          Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp 
                          645                 650                 655     
          Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 
                      660                 665                 670         
          Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 
                  675                 680                 685             
          Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 
              690                 695                 700                 
          Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 
          705                 710                 715                 720 
          Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                          725                 730                 735 
          <![CDATA[<210>  106]]>
          <![CDATA[<211>  735]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  ScFv (4.24.72) VH-(G4S)4-VL-PMAKK- CD3 (P035.093) VH-CH1 hu IgG1 ]]>
                 Fc 杵 PGLALA
          <![CDATA[<400>  106]]>
          Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 
          1               5                   10                  15      
          Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Val Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Lys Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Thr Asp Asp Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Asp Val Phe Asp Tyr Trp Gly His Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Lys Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
                  115                 120                 125             
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln 
              130                 135                 140                 
          Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His 
                          165                 170                 175     
          Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr 
                      180                 185                 190         
          Val Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly 
                  195                 200                 205             
          Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp 
              210                 215                 220                 
          Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Phe Pro Tyr Thr Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
                          245                 250                 255     
          Gly Gly Ser Pro Met Ala Lys Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 
                      260                 265                 270         
          Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu 
                  275                 280                 285             
          Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 
              290                 295                 300                 
          Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser Lys 
                          325                 330                 335     
          Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 
                      340                 345                 350         
          Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn 
                  355                 360                 365             
          Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Ala Ser 
              370                 375                 380                 
          Asn Phe Pro Ala Ser Tyr Val Ser Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 
                          405                 410                 415     
          Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 
                      420                 425                 430         
          Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 
                  435                 440                 445             
          Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 
              450                 455                 460                 
          Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 
          465                 470                 475                 480 
          Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 
                          485                 490                 495     
          Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 
                      500                 505                 510         
          Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro 
                  515                 520                 525             
          Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 
              530                 535                 540                 
          Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 
          545                 550                 555                 560 
          Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 
                          565                 570                 575     
          Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 
                      580                 585                 590         
          Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 
                  595                 600                 605             
          Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys 
              610                 615                 620                 
          Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 
          625                 630                 635                 640 
          Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp 
                          645                 650                 655     
          Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 
                      660                 665                 670         
          Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 
                  675                 680                 685             
          Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 
              690                 695                 700                 
          Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 
          705                 710                 715                 720 
          Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                          725                 730                 735 
          <![CDATA[<210>  107]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(mAb 9.3) CDR-H1]]>
          <![CDATA[<400>  107]]>
          Asp Tyr Gly Val His 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  108]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(mAb 9.3) CDR-H2]]>
          <![CDATA[<400>  108]]>
          Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met Ser 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  109]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(mAb 9.3) CDR-H3]]>
          <![CDATA[<400>  109]]>
          Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210>  110]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(mAb 9.3) CDR-L1]]>
          <![CDATA[<400>  110]]>
          Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr Val Thr Ser Leu Met Gln 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  111]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(mAb 9.3) CDR-L2]]>
          <![CDATA[<400>  111]]>
          Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  112]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(mAb 9.3) CDR-L3]]>
          <![CDATA[<400>  112]]>
          Gln Gln Ser Arg Lys Val Pro Tyr Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  113]]>
          <![CDATA[<211>  120]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(mAb 9.3) VH]]>
          <![CDATA[<400>  113]]>
          Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Thr Pro Ser Gln 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Leu 
                  35                  40                  45              
          Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Ala Leu Met 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Lys Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120 
          <![CDATA[<210>  114]]>
          <![CDATA[<211>  111]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CD28(mAb 9.3) VL]]>
          <![CDATA[<400>  114]]>
          Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 
                  35                  40                  45              
          Lys Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asn Phe Ser Leu Asn Ile His 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Val Asp Glu Asp Asp Val Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Arg 
                          85                  90                  95      
          Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110     
          <![CDATA[<210>  115]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CDR-H1 (ID_4.32.63)]]>
          <![CDATA[<400>  115]]>
          Ser Tyr Gly Val Ser 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  116]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CDR-H2 (ID_4.32.63)]]>
          <![CDATA[<400>  116]]>
          Ile Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile Ser 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  117]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CDR-H3 (ID_4.32.63)]]>
          <![CDATA[<400>  117]]>
          Gly Ile Thr Thr Val Val Asp Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210>  118]]>
          <![CDATA[<211>  11]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CDR-L1 (ID_4.32.63)]]>
          <![CDATA[<400>  118]]>
          Arg Ala Ser Glu Asn Ile Asp Ser Tyr Leu Ala 
          1               5                   10      
          <![CDATA[<210>  119]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CDR-L2 (ID_4.32.63)]]>
          <![CDATA[<400>  119]]>
          Ala Ala Thr Phe Leu Ala Asp 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  120]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CDR-L3 (ID_4.32.63)]]>
          <![CDATA[<400>  120]]>
          Gln His Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  121]]>
          <![CDATA[<211>  122]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  VH (ID_4.32.63)]]>
          <![CDATA[<400>  121]]>
          Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Leu 
                  35                  40                  45              
          Gly Ile Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Lys Gly Ile Thr Thr Val Val Asp Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 
                  115                 120         
          <![CDATA[<210>  122]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  VL (ID_4.32.63)]]>
          <![CDATA[<400>  122]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Asp Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 
                  35                  40                  45              
          Tyr Ala Ala Thr Phe Leu Ala Asp Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Val Ala Arg Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  123]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CDR-H1 (ID_4.24.72, H1L1, H1L2, H2L2, H3L2, H3L3)]]>
          <![CDATA[<400>  123]]>
          Asp Tyr Ser Met Asn 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  124]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CDR-H2 (ID_4.24.72, H1L1, H1L2)]]>
          <![CDATA[<400>  124]]>
          Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Thr Asp Asp Phe Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  125]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CDR-H3 (ID_4.24.72, H1L1, H1L2, H2L2, H3L2, H3L3)]]>
          <![CDATA[<400>  125]]>
          Glu Gly Asp Tyr Asp Val Phe Asp Tyr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  126]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CDR-L1 (ID_4.24.72, H1L1)]]>
          <![CDATA[<400>  126]]>
          Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  127]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CDR-L2 (ID_4.24.72, H1L1, H1L2, H2L2, H3L2, H3L3)]]>
          <![CDATA[<400>  127]]>
          Tyr Val Ser Tyr Leu Glu Ser 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  128]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CDR-L3 (ID_4.24.72, H1L1, H1L2, H2L2, H3L2)]]>
          <![CDATA[<400>  128]]>
          Gln His Ser Arg Glu Phe Pro Tyr Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  129]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CDR-L1 (H1L2, H2L2, H3L3)]]>
          <![CDATA[<400>  129]]>
          Lys Ser Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  130]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CDR-H2 (H2L2)]]>
          <![CDATA[<400>  130]]>
          Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Thr Asp Asp Phe Thr 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  131]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CDR-H2 (H3L2)]]>
          <![CDATA[<400>  131]]>
          Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Thr Gln Gly Phe Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  132]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  CDR-L3 (H3L3)]]>
          <![CDATA[<400>  132]]>
          Gln Gln Ser Arg Glu Phe Pro Tyr Thr 
          1               5                   
          <![CDATA[<210>  133]]>
          <![CDATA[<211>  118]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  ID_4.24.72 VH]]>
          <![CDATA[<400>  133]]>
          Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 
          1               5                   10                  15      
          Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Val Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Lys Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Thr Asp Asp Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Asp Val Phe Asp Tyr Trp Gly His Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Lys Val Ser Ser 
                  115             
          <![CDATA[<210>  134]]>
          <![CDATA[<211>  111]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  ID_4.24.72 VL]]>
          <![CDATA[<400>  134]]>
          Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 
                  35                  40                  45              
          Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Val Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 
          65                  70                  75                  80  
          Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 
                          85                  90                  95      
          Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110     
          <![CDATA[<210>  135]]>
          <![CDATA[<211>  118]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  H1L1, H1L2 VH]]>
          <![CDATA[<400>  135]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Val Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Thr Asp Asp Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Asp Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115             
          <![CDATA[<210>  136]]>
          <![CDATA[<211>  111]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  H1L1 VL]]>
          <![CDATA[<400>  136]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 
                  35                  40                  45              
          Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Val Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 
                          85                  90                  95      
          Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110     
          <![CDATA[<210>  137]]>
          <![CDATA[<211>  111]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  H1L2, H2L2 VL]]>
          <![CDATA[<400>  137]]>
          Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 
                  35                  40                  45              
          Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Val Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 
                          85                  90                  95      
          Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                      100                 105                 110     
          <![CDATA[<210>  138]]>
          <![CDATA[<211>  118]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  H2L2 VH]]>
          <![CDATA[<400>  138]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Val Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Thr Asp Asp Phe 
              50                  55                  60                  
          Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Asp Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115             
          <![CDATA[<210>  139]]>
          <![CDATA[<211>  118]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  H3L3 VH]]>
          <![CDATA[<400>  139]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Val Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Thr Gln Gly Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Asp Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Leu Val Thr Val Ser Ser 
                  115             
          <![CDATA[<210>  140]]>
          <![CDATA[<211>  111]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 
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          Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Val Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp 
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          Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 
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          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Val Thr Asp Tyr 
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          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 
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          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 
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          Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 
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          Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
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              130                 135                 140                 
          Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn 
          145                 150                 155                 160 
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          Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr 
                      180                 185                 190         
          Val Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 
                  195                 200                 205             
          Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp 
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          <![CDATA[<400>  146]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Val Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Thr Gln Gly Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Asp Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
                  115                 120                 125             
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln 
              130                 135                 140                 
          Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Lys Ser Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His 
                          165                 170                 175     
          Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr 
                      180                 185                 190         
          Val Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 
                  195                 200                 205             
          Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp 
              210                 215                 220                 
          Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Phe Pro Tyr Thr Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                          245                 
          <![CDATA[<210>  147]]>
          <![CDATA[<211>  249]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4.32.63 scFv]]>
          <![CDATA[<400>  147]]>
          Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Leu 
                  35                  40                  45              
          Gly Ile Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Lys Gly Ile Thr Thr Val Val Asp Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile 
              130                 135                 140                 
          Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Asp Ser Tyr Leu Ala 
                          165                 170                 175     
          Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Ala 
                      180                 185                 190         
          Ala Thr Phe Leu Ala Asp Asp Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 
                  195                 200                 205             
          Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser Glu Asp 
              210                 215                 220                 
          Val Ala Arg Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                          245                 
          <![CDATA[<210>  148]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  蛋白酶識別位點 1]]>
          <![CDATA[<400>  148]]>
          Arg Gln Ala Arg Val Val Asn Gly 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  149]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  蛋白酶識別位點 2]]>
          <![CDATA[<400>  149]]>
          Val His Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro Gly Arg Ser Arg Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Phe Pro 
          <![CDATA[<210>  150]]>
          <![CDATA[<211>  21]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  蛋白酶識別位點 3]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  misc_feature]]>
          <![CDATA[<222>  (9)..(13)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa 可以為任何天然出現之胺基酸]]>
          <![CDATA[<400>  150]]>
          Arg Gln Ala Arg Val Val Asn Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Val Pro Leu 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Tyr Ser Gly 
                      20      
          <![CDATA[<210>  151]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  蛋白酶識別位點 4]]>
          <![CDATA[<400>  151]]>
          Arg Gln Ala Arg Val Val Asn Gly Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  152]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  蛋白酶識別位點 5]]>
          <![CDATA[<400>  152]]>
          Pro Leu Gly Leu Trp Ser Gln 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  153]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  蛋白酶識別位點 6]]>
          <![CDATA[<400>  153]]>
          Val His Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro Arg Gln Ala Arg Val Val 
          1               5                   10                  15      
          Asn Gly 
          <![CDATA[<210>  154]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  蛋白酶識別位點 7]]>
          <![CDATA[<400>  154]]>
          Phe Val Gly Gly Thr Gly 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  155]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  蛋白酶識別位點 8]]>
          <![CDATA[<400>  155]]>
          Lys Lys Ala Ala Pro Val Asn Gly 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  156]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  蛋白酶識別位點 9]]>
          <![CDATA[<400>  156]]>
          Pro Met Ala Lys Lys Val Asn Gly 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  157]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  蛋白酶識別位點 10]]>
          <![CDATA[<400>  157]]>
          Gln Ala Arg Ala Lys Val Asn Gly 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  158]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  蛋白酶識別位點 11]]>
          <![CDATA[<400>  158]]>
          Val His Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  159]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  蛋白酶識別位點 12]]>
          <![CDATA[<400>  159]]>
          Gln Ala Arg Ala Lys 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  160]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  蛋白酶識別位點 13]]>
          <![CDATA[<400>  160]]>
          Val His Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro Pro Met Ala Lys Lys 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  161]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  蛋白酶識別位點 14]]>
          <![CDATA[<400>  161]]>
          Lys Lys Ala Ala Pro 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  162]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  蛋白酶識別位點 15]]>
          <![CDATA[<400>  162]]>
          Pro Met Ala Lys Lys 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  163]]>
          <![CDATA[<211>  33]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  不可切割連接子]]>
          <![CDATA[<400>  163]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Ser 
          <![CDATA[<210>  164]]>
          <![CDATA[<211>  855]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  164]]>
          Met Gly Ser Asp Arg Ala Arg Lys Gly Gly Gly Gly Pro Lys Asp Phe 
          1               5                   10                  15      
          Gly Ala Gly Leu Lys Tyr Asn Ser Arg His Glu Lys Val Asn Gly Leu 
                      20                  25                  30          
          Glu Glu Gly Val Glu Phe Leu Pro Val Asn Asn Val Lys Lys Val Glu 
                  35                  40                  45              
          Lys His Gly Pro Gly Arg Trp Val Val Leu Ala Ala Val Leu Ile Gly 
              50                  55                  60                  
          Leu Leu Leu Val Leu Leu Gly Ile Gly Phe Leu Val Trp His Leu Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Arg Asp Val Arg Val Gln Lys Val Phe Asn Gly Tyr Met Arg Ile 
                          85                  90                  95      
          Thr Asn Glu Asn Phe Val Asp Ala Tyr Glu Asn Ser Asn Ser Thr Glu 
                      100                 105                 110         
          Phe Val Ser Leu Ala Ser Lys Val Lys Asp Ala Leu Lys Leu Leu Tyr 
                  115                 120                 125             
          Ser Gly Val Pro Phe Leu Gly Pro Tyr His Lys Glu Ser Ala Val Thr 
              130                 135                 140                 
          Ala Phe Ser Glu Gly Ser Val Ile Ala Tyr Tyr Trp Ser Glu Phe Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Ile Pro Gln His Leu Val Glu Glu Ala Glu Arg Val Met Ala Glu Glu 
                          165                 170                 175     
          Arg Val Val Met Leu Pro Pro Arg Ala Arg Ser Leu Lys Ser Phe Val 
                      180                 185                 190         
          Val Thr Ser Val Val Ala Phe Pro Thr Asp Ser Lys Thr Val Gln Arg 
                  195                 200                 205             
          Thr Gln Asp Asn Ser Cys Ser Phe Gly Leu His Ala Arg Gly Val Glu 
              210                 215                 220                 
          Leu Met Arg Phe Thr Thr Pro Gly Phe Pro Asp Ser Pro Tyr Pro Ala 
          225                 230                 235                 240 
          His Ala Arg Cys Gln Trp Ala Leu Arg Gly Asp Ala Asp Ser Val Leu 
                          245                 250                 255     
          Ser Leu Thr Phe Arg Ser Phe Asp Leu Ala Ser Cys Asp Glu Arg Gly 
                      260                 265                 270         
          Ser Asp Leu Val Thr Val Tyr Asn Thr Leu Ser Pro Met Glu Pro His 
                  275                 280                 285             
          Ala Leu Val Gln Leu Cys Gly Thr Tyr Pro Pro Ser Tyr Asn Leu Thr 
              290                 295                 300                 
          Phe His Ser Ser Gln Asn Val Leu Leu Ile Thr Leu Ile Thr Asn Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Arg Arg His Pro Gly Phe Glu Ala Thr Phe Phe Gln Leu Pro Arg 
                          325                 330                 335     
          Met Ser Ser Cys Gly Gly Arg Leu Arg Lys Ala Gln Gly Thr Phe Asn 
                      340                 345                 350         
          Ser Pro Tyr Tyr Pro Gly His Tyr Pro Pro Asn Ile Asp Cys Thr Trp 
                  355                 360                 365             
          Asn Ile Glu Val Pro Asn Asn Gln His Val Lys Val Arg Phe Lys Phe 
              370                 375                 380                 
          Phe Tyr Leu Leu Glu Pro Gly Val Pro Ala Gly Thr Cys Pro Lys Asp 
          385                 390                 395                 400 
          Tyr Val Glu Ile Asn Gly Glu Lys Tyr Cys Gly Glu Arg Ser Gln Phe 
                          405                 410                 415     
          Val Val Thr Ser Asn Ser Asn Lys Ile Thr Val Arg Phe His Ser Asp 
                      420                 425                 430         
          Gln Ser Tyr Thr Asp Thr Gly Phe Leu Ala Glu Tyr Leu Ser Tyr Asp 
                  435                 440                 445             
          Ser Ser Asp Pro Cys Pro Gly Gln Phe Thr Cys Arg Thr Gly Arg Cys 
              450                 455                 460                 
          Ile Arg Lys Glu Leu Arg Cys Asp Gly Trp Ala Asp Cys Thr Asp His 
          465                 470                 475                 480 
          Ser Asp Glu Leu Asn Cys Ser Cys Asp Ala Gly His Gln Phe Thr Cys 
                          485                 490                 495     
          Lys Asn Lys Phe Cys Lys Pro Leu Phe Trp Val Cys Asp Ser Val Asn 
                      500                 505                 510         
          Asp Cys Gly Asp Asn Ser Asp Glu Gln Gly Cys Ser Cys Pro Ala Gln 
                  515                 520                 525             
          Thr Phe Arg Cys Ser Asn Gly Lys Cys Leu Ser Lys Ser Gln Gln Cys 
              530                 535                 540                 
          Asn Gly Lys Asp Asp Cys Gly Asp Gly Ser Asp Glu Ala Ser Cys Pro 
          545                 550                 555                 560 
          Lys Val Asn Val Val Thr Cys Thr Lys His Thr Tyr Arg Cys Leu Asn 
                          565                 570                 575     
          Gly Leu Cys Leu Ser Lys Gly Asn Pro Glu Cys Asp Gly Lys Glu Asp 
                      580                 585                 590         
          Cys Ser Asp Gly Ser Asp Glu Lys Asp Cys Asp Cys Gly Leu Arg Ser 
                  595                 600                 605             
          Phe Thr Arg Gln Ala Arg Val Val Gly Gly Thr Asp Ala Asp Glu Gly 
              610                 615                 620                 
          Glu Trp Pro Trp Gln Val Ser Leu His Ala Leu Gly Gln Gly His Ile 
          625                 630                 635                 640 
          Cys Gly Ala Ser Leu Ile Ser Pro Asn Trp Leu Val Ser Ala Ala His 
                          645                 650                 655     
          Cys Tyr Ile Asp Asp Arg Gly Phe Arg Tyr Ser Asp Pro Thr Gln Trp 
                      660                 665                 670         
          Thr Ala Phe Leu Gly Leu His Asp Gln Ser Gln Arg Ser Ala Pro Gly 
                  675                 680                 685             
          Val Gln Glu Arg Arg Leu Lys Arg Ile Ile Ser His Pro Phe Phe Asn 
              690                 695                 700                 
          Asp Phe Thr Phe Asp Tyr Asp Ile Ala Leu Leu Glu Leu Glu Lys Pro 
          705                 710                 715                 720 
          Ala Glu Tyr Ser Ser Met Val Arg Pro Ile Cys Leu Pro Asp Ala Ser 
                          725                 730                 735     
          His Val Phe Pro Ala Gly Lys Ala Ile Trp Val Thr Gly Trp Gly His 
                      740                 745                 750         
          Thr Gln Tyr Gly Gly Thr Gly Ala Leu Ile Leu Gln Lys Gly Glu Ile 
                  755                 760                 765             
          Arg Val Ile Asn Gln Thr Thr Cys Glu Asn Leu Leu Pro Gln Gln Ile 
              770                 775                 780                 
          Thr Pro Arg Met Met Cys Val Gly Phe Leu Ser Gly Gly Val Asp Ser 
          785                 790                 795                 800 
          Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ser Ser Val Glu Ala Asp Gly 
                          805                 810                 815     
          Arg Ile Phe Gln Ala Gly Val Val Ser Trp Gly Asp Gly Cys Ala Gln 
                      820                 825                 830         
          Arg Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Leu Pro Leu Phe Arg Asp Trp 
                  835                 840                 845             
          Ile Lys Glu Asn Thr Gly Val 
              850                 855 
          <![CDATA[<210>  165]]>
          <![CDATA[<211>  98]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  165]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Lys Val 
          <![CDATA[<210>  166]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  166]]>
          Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 
          1               5                   10                  15      
          Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 
                      20                  25                  30          
          Trp Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 
                  35                  40                  45              
          Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 
              50                  55                  60                  
          Glu Ser Thr Tyr Arg Trp Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 
                          85                  90                  95      
          Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 
                      100                 105         
          <![CDATA[<210>  167]]>
          <![CDATA[<211>  106]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  167]]>
          Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 
          1               5                   10                  15      
          Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 
                      20                  25                  30          
          Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 
                  35                  40                  45              
          Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 
              50                  55                  60                  
          Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 
                          85                  90                  95      
          Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
                      100                 105     
          <![CDATA[<210>  168]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  168]]>
          Glu Pro Lys Ser Cys 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  169]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<223>  X 為 S 或 P]]>
          <![CDATA[<400>  169]]>
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Xaa Cys Pro 
          1               5                   10  
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<222>  (5)..(5)]]>
          <![CDATA[<223>  X 為 S 或 P]]>
          <![CDATA[<400>  170]]>
          His Thr Cys Pro Xaa Cys Pro 
          1               5           
          <![CDATA[<210>  171]]>
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          <![CDATA[<222>  (3)..(3)]]>
          <![CDATA[<223>  X 為 S 或 P]]>
          <![CDATA[<400>  171]]>
          Cys Pro Xaa Cys Pro 
          1               5   
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          <![CDATA[<211>  330]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  172]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 
                      100                 105                 110         
          Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 
                  115                 120                 125             
          Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 
              130                 135                 140                 
          Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 
                          165                 170                 175     
          Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 
                      180                 185                 190         
          His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 
                  195                 200                 205             
          Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 
              210                 215                 220                 
          Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 
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          Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 
                          245                 250                 255     
          Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 
                      260                 265                 270         
          Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 
                  275                 280                 285             
          Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 
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          Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 
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          Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                          325                 330 
          <![CDATA[<210>  173]]>
          <![CDATA[<211>  330]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  173]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 
                      100                 105                 110         
          Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 
                  115                 120                 125             
          Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 
              130                 135                 140                 
          Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 
          145                 150                 155                 160 
          Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 
                          165                 170                 175     
          Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 
                      180                 185                 190         
          His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 
                  195                 200                 205             
          Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 
              210                 215                 220                 
          Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 
          225                 230                 235                 240 
          Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 
                          245                 250                 255     
          Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 
                      260                 265                 270         
          Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 
                  275                 280                 285             
          Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 
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          Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                          325                 330 
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  174]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 
                      100                 105                 110         
          Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 
                  115                 120                 125             
          Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 
              130                 135                 140                 
          Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 
                      180                 185                 190         
          Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 
                  195                 200                 205             
          Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 
              210                 215                 220                 
          Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 
                          245                 250                 255     
          Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 
                      260                 265                 270         
          Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 
                  275                 280                 285             
          Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 
              290                 295                 300                 
          Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                          325     
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          <![CDATA[<400>  175]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 
                      100                 105                 110         
          Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 
                  115                 120                 125             
          Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys 
              130                 135                 140                 
          Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 
                          165                 170                 175     
          Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 
                      180                 185                 190         
          Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr 
                  195                 200                 205             
          Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 
              210                 215                 220                 
          Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 
                          245                 250                 255     
          Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 
                      260                 265                 270         
          Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 
                  275                 280                 285             
          Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 
              290                 295                 300                 
          Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 
                          325                 330                 335     
          Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile 
                      340                 345                 350         
          Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln 
                  355                 360                 365             
          Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
              370                 375         
          <![CDATA[<210>  176]]>
          <![CDATA[<211>  327]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  176]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 
                      100                 105                 110         
          Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 
                  115                 120                 125             
          Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 
              130                 135                 140                 
          Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 
                          165                 170                 175     
          Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 
                      180                 185                 190         
          Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 
                  195                 200                 205             
          Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 
              210                 215                 220                 
          Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 
                          245                 250                 255     
          Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 
                      260                 265                 270         
          Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 
                  275                 280                 285             
          Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 
              290                 295                 300                 
          Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 
          305                 310                 315                 320 
          Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 
                          325         
          <![CDATA[<210>  177]]>
          <![CDATA[<211>  254]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  智人]]>
          <![CDATA[<400>  177]]>
          Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 
          1               5                   10                  15      
          Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 
                      20                  25                  30          
          Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 
                  35                  40                  45              
          Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 
              50                  55                  60                  
          Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 
                          85                  90                  95      
          Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 
                      100                 105                 110         
          Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 
                  115                 120                 125             
          His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 
              130                 135                 140                 
          Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe 
                          165                 170                 175     
          Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 
                      180                 185                 190         
          Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 
                  195                 200                 205             
          Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 
              210                 215                 220                 
          Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp 
          225                 230                 235                 240 
          Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys 
                          245                 250                 
          <![CDATA[<210>  178]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子 G4S]]>
          <![CDATA[<400>  178]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  179]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子 (G4S)2]]>
          <![CDATA[<400>  179]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  180]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子 (SG4)2]]>
          <![CDATA[<400>  180]]>
          Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  181]]>
          <![CDATA[<211>  14]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子 G4(SG4)2]]>
          <![CDATA[<400>  181]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 
          1               5                   10                  
          <![CDATA[<210>  182]]>
          <![CDATA[<211>  10]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  182]]>
          Gly Ser Pro Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser 
          1               5                   10  
          <![CDATA[<210>  183]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子 (G4S)3]]>
          <![CDATA[<400>  183]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  184]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子 (G4S)4]]>
          <![CDATA[<400>  184]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Gly Ser 
                      20  
          <![CDATA[<210>  185]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  185]]>
          Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  186]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  186]]>
          Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  187]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  187]]>
          Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  188]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  188]]>
          Gly Gly Ser Gly Ser Gly 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  189]]>
          <![CDATA[<211>  4]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  189]]>
          Gly Gly Ser Gly 
          1               
          <![CDATA[<210>  190]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  190]]>
          Gly Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  191]]>
          <![CDATA[<211>  8]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  191]]>
          Gly Gly Asn Gly Ser Gly Ser Gly 
          1               5               
          <![CDATA[<210>  192]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子]]>
          <![CDATA[<400>  192]]>
          Gly Gly Asn Gly Ser Gly 
          1               5       
          <![CDATA[<210>  193]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子 EPKSCGGGGSGGGGS]]>
          <![CDATA[<400>  193]]>
          Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5                   10                  15  
          <![CDATA[<210>  194]]>
          <![CDATA[<211>  16]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  肽連接子 EPKSCDGGGGSGGGGS]]>
          <![CDATA[<400>  194]]>
          Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          <![CDATA[<210>  195]]>
          <![CDATA[<211>  33]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Matriptase 連接子]]>
          <![CDATA[<400>  195]]>
          Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Met Ala Lys Lys Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Ser 
          <![CDATA[<210>  196]]>
          <![CDATA[<211>  33]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子 2]]>
          <![CDATA[<400>  196]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Val His Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro Arg 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ala Arg Val Val Asn Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Ser 
          <![CDATA[<210>  197]]>
          <![CDATA[<211>  33]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  連接子 3]]>
          <![CDATA[<400>  197]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Gln Ala Arg Val Val 
          1               5                   10                  15      
          Asn Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Ser 
          <![CDATA[<210>  198]]>
          <![CDATA[<211>  35]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MMP 蛋白酶連接子]]>
          <![CDATA[<400>  198]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Leu Gly Leu Trp 
          1               5                   10                  15      
          Ser Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Ser Gly Gly 
                  35  
          <![CDATA[<210>  199]]>
          <![CDATA[<211>  33]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  組合 MMP9 MK062，CD3 之 33 個 AA]]>
          <![CDATA[<400>  199]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Val His Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro Arg 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ala Arg Val Val Asn Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Ser 
          <![CDATA[<210>  200]]>
          <![CDATA[<211>  33]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  組織蛋白酶 S/B]]>
          <![CDATA[<400>  200]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Phe 
          1               5                   10                  15      
          Val Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Ser 
          <![CDATA[<210>  201]]>
          <![CDATA[<211>  33]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  KKAAPVNG]]>
          <![CDATA[<400>  201]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala Ala Pro Val 
          1               5                   10                  15      
          Asn Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Ser 
          <![CDATA[<210>  202]]>
          <![CDATA[<211>  33]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PMAKKVNG]]>
          <![CDATA[<400>  202]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Met Ala Lys Lys Val 
          1               5                   10                  15      
          Asn Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Ser 
          <![CDATA[<210>  203]]>
          <![CDATA[<211>  33]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  QARAKVNG]]>
          <![CDATA[<400>  203]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Lys Val 
          1               5                   10                  15      
          Asn Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Ser 
          <![CDATA[<210>  204]]>
          <![CDATA[<211>  33]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MMP9]]>
          <![CDATA[<400>  204]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val His Met Pro Leu Gly 
          1               5                   10                  15      
          Phe Leu Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Ser 
          <![CDATA[<210>  205]]>
          <![CDATA[<211>  33]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  QARAK]]>
          <![CDATA[<400>  205]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Arg Ala Lys Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Ser 
          <![CDATA[<210>  206]]>
          <![CDATA[<211>  33]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MMP9-PMAKK]]>
          <![CDATA[<400>  206]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Val His Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro Pro 
          1               5                   10                  15      
          Met Ala Lys Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Ser 
          <![CDATA[<210>  207]]>
          <![CDATA[<211>  33]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  KKAAP]]>
          <![CDATA[<400>  207]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Lys Ala Ala Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Ser 
          <![CDATA[<210>  208]]>
          <![CDATA[<211>  33]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PMAKK]]>
          <![CDATA[<400>  208]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Met Ala Lys Lys Gly 
          1               5                   10                  15      
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Ser 
          <![CDATA[<210>  209]]>
          <![CDATA[<211>  28]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  組合 NF9/Mat5 連接子]]>
          <![CDATA[<400>  209]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Val His Met Pro Leu Gly Phe Leu Gly Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Arg Ser Arg Gly Ser Phe Pro Gly Gly Gly Gly Ser 
                      20                  25              
          <![CDATA[<210>  210]]>
          <![CDATA[<211>  41]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  組合 MK062 MMP9]]>
          <![CDATA[<400>  210]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Gln Ala Arg Val Val 
          1               5                   10                  15      
          Asn Gly Gly Gly Gly Gly Ser Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly Gly 
                      20                  25                  30          
          Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
                  35                  40      
          <![CDATA[<210>  211]]>
          <![CDATA[<211>  36]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  組合 MK062-MMP9]]>
          <![CDATA[<400>  211]]>
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Gln Ala Arg Val Val 
          1               5                   10                  15      
          Asn Gly Val Pro Leu Ser Leu Tyr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly 
                      20                  25                  30          
          Gly Gly Gly Ser 
                  35      
          <![CDATA[<210>  212]]>
          <![CDATA[<211>  249]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  4.24.72 scFv]]>
          <![CDATA[<400>  212]]>
          Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 
          1               5                   10                  15      
          Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Val Thr Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ser Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Lys Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Arg Tyr Thr Asp Asp Phe 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Glu Gly Asp Tyr Asp Val Phe Asp Tyr Trp Gly His Gly Thr 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Lys Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 
                  115                 120                 125             
          Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln 
              130                 135                 140                 
          Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His 
                          165                 170                 175     
          Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr 
                      180                 185                 190         
          Val Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly 
                  195                 200                 205             
          Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp 
              210                 215                 220                 
          Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu Phe Pro Tyr Thr Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 
                          245

Claims

一種特徵為與 CD28 單價結合之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其包含 (a) 能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域， (b) 能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域，及 (c) 由能夠穩定締合的第一次單元及第二次單元構成之 Fc 域，其包含降低該抗原結合分子與 Fc 受體的結合親和力及/或效應子功能之一個或多個胺基酸取代，其中該能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域包含 (i) 重鏈可變區 (V _HCD3)，其包含 SEQ ID NO: 2 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 3 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 4 之 CDR-H3；以及輕鏈可變區 (V _LCD3)，其包含 SEQ ID NO: 5 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 6 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 7 之 CDR-L3；或 (ii) 重鏈可變區 (V _HCD3)，其包含 SEQ ID NO: 10 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 11 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 12 之 CDR-H3；以及輕鏈可變區 (V _LCD3)，其包含 SEQ ID NO: 13 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 14 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 15 之 CDR-L3。
如請求項 1 之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中該 Fc 域為人類 IgG1 亞類且包含胺基酸突變 L234A、L235A 及 P329G（根據 Kabat EU 索引編號）。
如請求項 1 或 2 之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中該能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域包含 (i) 重鏈可變區 (V _HCD28)，其包含 SEQ ID NO: 26 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 27 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 28 之 CDR-H3；以及輕鏈可變區 (V _LCD28)，其包含 SEQ ID NO: 29 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 30 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 31 之 CDR-L3；或 (ii) 重鏈可變區 (V _HCD28)，其包含 SEQ ID NO: 18 之 CDR-H1、SEQ ID NO: 19 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 20 之 CDR-H3；以及輕鏈可變區 (V _LCD28)，其包含 SEQ ID NO: 21 之 CDR-L1、SEQ ID NO: 22 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 23 之 CDR-L3。
如請求項 1 至 3 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中該能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD28)，其包含與 SEQ ID NO:24 的胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列；以及輕鏈可變區 (V _LCD28)，其包含與 SEQ ID NO:25 的胺基酸序列至少約 95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 相同之胺基酸序列。
如請求項 1 至 4 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中該能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域包含：重鏈可變區 (V _HCD28)，其包含選自由 SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40 及 SEQ ID NO:41 所組成之群組之胺基酸序列；以及輕鏈可變區 (V _LCD28)，其包含選自由 SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50 及 SEQ ID NO:51 所組成之群組之胺基酸序列。
如請求項 1 至 3 或 5 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中該能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域包含 (a) 包含 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V _HCD28) 以及包含 SEQ ID NO:44 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V _LCD28)，或 (b) 包含 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V _HCD28) 以及包含 SEQ ID NO:25 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V _LCD28)，或 (c) 包含 SEQ ID NO:41 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V _HCD28) 以及包含 SEQ ID NO:51 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V _LCD28)，或 (d) 包含 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V _HCD28) 以及包含 SEQ ID NO:43 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V _LCD28)，或 (e) 包含 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V _HCD28) 以及包含 SEQ ID NO:44 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V _LCD28)，或 (f) 包含 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V _HCD28) 以及包含 SEQ ID NO:49 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V _LCD28)，或 (g) 包含 SEQ ID NO:36 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V _HCD28) 以及包含 SEQ ID NO:25 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V _LCD28)，或 (h) 包含 SEQ ID NO:33 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V _HCD28) 以及包含 SEQ ID NO:25 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V _LCD28)，或 (i) 包含 SEQ ID NO:32 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V _HCD28) 以及包含 SEQ ID NO:43 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V _LCD28)，或 (j) 包含 SEQ ID NO:32 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V _HCD28) 以及包含 SEQ ID NO:49 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V _LCD28)，或 (k) 包含 SEQ ID NO:32 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V _HCD28) 以及包含 SEQ ID NO:25 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V _LCD28)。
如請求項 1 至 6 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中該能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域包含 (i) 重鏈可變區 (V _HCD28)，其包含 SEQ ID NO: 52 之重鏈互補決定區 CDR-H1、SEQ ID NO: 53 之 CDR-H2 及 SEQ ID NO: 54 之 CDR-H3；以及輕鏈可變區 (V _LCD28)，其包含 SEQ ID NO: 55 之輕鏈互補決定區 CDR-L1、SEQ ID NO: 56 之 CDR-L2 及 SEQ ID NO: 57 之 CDR-L3。
如請求項 1 至 6 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中該能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域包含：包含 SEQ ID NO:37 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V _HCD28) 的 CDR 以及包含 SEQ ID NO:44 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V _LCD28) 的 CDR。
如請求項 1 至 8 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD3 特異性結合之該抗原結合域包含：包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V _HCD3) 的 CDR 以及包含 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V _LCD3) 的 CDR。
如請求項 1 至 9 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD3 特異性結合之該抗原結合域包含：包含 SEQ ID NO:16 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V _HCD3) 以及包含 SEQ ID NO:17 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V _LCD3)。
如請求項 1 至 8 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD3 特異性結合之該抗原結合域包含：包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V _HCD3) 的 CDR 以及包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V _LCD3) 的 CDR。
如請求項 1 至 8 或 11 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD3 特異性結合之該抗原結合域包含：包含 SEQ ID NO:8 之胺基酸序列的重鏈可變區 (V _HCD3) 以及包含 SEQ ID NO:9 之胺基酸序列的輕鏈可變區 (V _LCD3)。
如請求項 1 至 12 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中該能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域及/或該能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域為 Fab 分子。
如請求項 1 至 13 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中該能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域為 Fab 分子，其中 Fab 輕鏈及 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 或恆定域 CL 及 CH1、特定而言該可變域 VL 及 VH 係彼此替換。
如請求項 1 至 14 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中該能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域為習用 Fab 分子。
如請求項 1 至 13 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中能夠與 CD3 特異性結合之該抗原結合域為 Fab 分子，其中該 Fab 輕鏈及該 Fab 重鏈之可變域 VL 及 VH 或恆定域 CL 及 CH1、特定而言該恆定域 CL 及 CH1 係彼此替換。
如請求項 1 至 13 或 16 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中該能夠與 CD28 特異性結合之第一抗原結合域為習用 Fab 分子。
如請求項 15 或 17 之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中該習用 Fab 分子為以下的 Fab 分子：其中在該恆定域 CL 中，在 123 位置的胺基酸（根據 Kabat EU 索引編號）經選自離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 的胺基酸取代，且在 124 位置的胺基酸（根據 Kabat EU 索引編號）獨立地經離胺酸 (K)、精胺酸 (R) 或組胺酸 (H) 取代；以及其中在該恆定域 CH1 中，在 147 位置的胺基酸（根據 Kabat EU 索引編號）獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D) 取代，且在 213 位置的胺基酸（根據 Kabat EU 索引編號）獨立地經麩胺酸 (E) 或天冬胺酸 (D)（根據 Kabat EU 索引編號）取代。
如請求項 1 至 18 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中該 Fc 域包含促進該 Fc 域之該第一次單元與該第二次單元之締合之修飾。
如請求項 1 至 19 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中該 Fc 域的該第一次單元包含胺基酸取代 S354C 及 T366W（EU 編號），且該 Fc 域的該第二次單元包含胺基酸取代 Y349C、T366S 及 Y407V（根據 Kabat EU 索引編號）。
如請求項 1 至 20 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其進一步包含 (d) 掩蔽部分，其透過蛋白酶可切割連接子與該雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子共價連接，其中該掩蔽部分能夠結合該能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域之個體遺傳型，從而可逆地隱藏能夠與 CD3 特異性結合之該抗原結合域。
如請求項 22 之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中該掩蔽部分與該能夠與 CD3 特異性結合之第二抗原結合域的重鏈可變區 (V _HCD3) 共價連接。
如請求項 21 或 22 之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中該掩蔽部分為 scFv。
如請求項 21 至 23 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中該掩蔽部分包含 (i) 重鏈可變區 (V _H)，其包含 DYSMN (SEQ ID NO:123) 之 CDR-H1 胺基酸序列、選自由 WINTETGEPRYTDDFKG (SEQ ID NO:124)、WINTETGEPRYTDDFTG (SEQ ID NO:130) 及 WINTETGEPRYTQGFKG (SEQ ID NO:131) 所組成之群組之 CDR H2 胺基酸序列及 EGDYDVFDY (SEQ ID NO:125) 之 CDR H3 胺基酸序列；以及輕鏈可變區 (V _L)，其包含選自由 RASKSVSTSSYSYMH (SEQ ID NO:126) 及 KSSKSVSTSSYSYMH (SEQ ID NO:129) 所組成之群組之輕鏈互補決定區 CDR-L1 胺基酸序列、YVSYLES (SEQ ID NO:127) 之 CDR-L2 胺基酸序列及選自由 QHSREFPYT (SEQ ID NO:128) 及 QQSREFPYT (SEQ ID NO:132) 所組成之群組之 CDR-L3 胺基酸序列；或 (ii) 重鏈可變區 (V _H)，其包含 DYSMN (SEQ ID NO:123) 之 CDR-H1 胺基酸序列、WINTETGEPRYTDDFKG (SEQ ID NO:124) 之 CDR-H2 胺基酸序列及 EGDYDVFDY (SEQ ID NO:125) 之 CDR-H3 胺基酸序列；以及輕鏈可變區 (V _L)，其包含 RASKSVSTSSYSYMH (SEQ ID NO:126) 之 CDR-L1 胺基酸序列、YVSYLES (SEQ ID NO:127) 之 CDR-L2 胺基酸序列及 QHSREFPYT (SEQ ID NO:128) 之 CDR-L3 胺基酸序列；或 (iii) 重鏈可變區 (V _H)，其包含 SYGVS (SEQ ID NO:123) 之 CDR-H1 胺基酸序列、IIWGDGSTNYHSALIS (SEQ ID NO:124) 之 CDR-H2 胺基酸序列及 GITTVVDDYYAMDY (SEQ ID NO:125) 之 CDR-H3 胺基酸序列；以及輕鏈可變區 (V _L)，其包含 KSSKSVSTSSYSYMH (SEQ ID NO:129) 之 CDR-L1 胺基酸序列、AATFLAD (SEQ ID NO:127) 之 CDR-L2 胺基酸序列及 QHYYSTPYT (SEQ ID NO:128) 之 CDR-L3 胺基酸序列；或 (iv) 重鏈可變區 (V _H)，其包含 SYGVS (SEQ ID NO:123) 之 CDR-H1 胺基酸序列、WINTETGEPRYTDDFTG (SEQ ID NO:130) 之 CDR-H2 胺基酸序列及 GITTVVDDYYAMDY (SEQ ID NO:125) 之 CDR-H3 胺基酸序列；以及輕鏈可變區 (V _L)，其包含 KSSKSVSTSSYSYMH (SEQ ID NO:129) 之 CDR-L1 胺基酸序列、AATFLAD (SEQ ID NO:127) 之 CDR-L2 胺基酸序列及 QHYYSTPYT (SEQ ID NO:128) 之 CDR-L3 胺基酸序列；或 (v) 重鏈可變區 (V _H)，其包含 SYGVS (SEQ ID NO:123) 之 CDR-H1 胺基酸序列、WINTETGEPRYTQGFKG (SEQ ID NO:131) 之 CDR-H2 胺基酸序列及 GITTVVDDYYAMDY (SEQ ID NO:125) 之 CDR-H3 胺基酸序列；以及輕鏈可變區 (V _L)，其包含 KSSKSVSTSSYSYMH (SEQ ID NO:129) 之 CDR-L1 胺基酸序列、AATFLAD (SEQ ID NO:127) 之 CDR-L2 胺基酸序列及 QHYYSTPYT (SEQ ID NO:128) 之 CDR-L3 胺基酸序列。
如請求項 21 至 23 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中該掩蔽部分包含：重鏈可變區 (V _H)，其包含 SYGVS (SEQ ID NO:115) 之 CDR-H1 胺基酸序列、IIWGDGSTNYHSALIS (SEQ ID NO:116) 之 CDR-H2 胺基酸序列及 GITTVVDDYYAMDY (SEQ ID NO:117) 之 CDR-H3 胺基酸序列；以及輕鏈可變區 (V _L)，其包含 RASENIDSYLA (SEQ ID NO:118) 之 CDR-L1 胺基酸序列、AATFLAD (SEQ ID NO:119) 之 CDR-L2 胺基酸序列及 QHYYSTPYT (SEQ ID NO:120) 之 CDR-L3 胺基酸序列。
如請求項 21 至 25 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中該蛋白酶可切割連接子包含至少一個蛋白酶識別序列。
如請求項 21 至 26 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中該蛋白酶識別序列係選自由以下所組成之群組： (a) RQARVVNG (SEQ ID NO:148)； (b) VHMPLGFLGPGRSRGSFP (SEQ ID NO:149)； (c) RQARVVNGXXXXXVPLSLYSG (SEQ ID NO:150)，其中 X 為任意胺基酸； (d) RQARVVNGVPLSLYSG (SEQ ID NO:151)； (e) PLGLWSQ (SEQ ID NO:152)； (f) VHMPLGFLGPRQARVVNG (SEQ ID NO:153)； (g) FVGGTG (SEQ ID NO:154)； (h) KKAAPVNG (SEQ ID NO:155)； (i) PMAKKVNG (SEQ ID NO:156)； (j) QARAKVNG (SEQ ID NO:157)； (k) VHMPLGFLGP (SEQ ID NO:158)； (l) QARAK (SEQ ID NO:159)； (m) VHMPLGFLGPPMAKK (SEQ ID NO:160)； (n) KKAAP (SEQ ID NO:161)；及 (o) PMAKK (SEQ ID NO:162)。
如請求項 26 或 27 之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中該蛋白酶可切割連接子包含蛋白酶識別序列 RQARVVNG (SEQ ID NO:148)。
如請求項 26 或 27 之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其中該蛋白酶可切割連接子包含蛋白酶識別序列 PMAKK (SEQ ID NO:162)。
一種或多種經分離之多核苷酸，其編碼如請求項 1 至 29 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子。
一種或多種載體，特定而言表現載體，其包含如請求項 30 之一種或多種多核苷酸。
一種宿主細胞，其包含如請求項 30 之一種或多種多核苷酸或如請求項 31 之一種或多種載體。
一種用於生產雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子之方法，其包含下列步驟：a) 在適合表現該雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子之條件下培養如請求項 26 之宿主細胞，以及 b) 視情況回收該雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子。
一種雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子，其藉由如請求項 33 之方法生產。
一種醫藥組成物，其包含如請求項 1 至 29 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子以及至少一種醫藥上可接受之賦形劑。
如請求項 1 至 29 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子或如請求項 35 之醫藥組成物，其用為藥物。
如請求項 1 至 29 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子或如請求項 35 之醫藥組成物，其用於增強 (a) T 細胞活化或 (b) T 細胞效應子功能。
如請求項 1 至 29 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子或如請求項 35 之醫藥組成物，其用於治療疾病。
如請求項 38 所使用之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子或醫藥組成物，其中該疾病為癌症。
如請求項 1 至 29 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子或如請求項 35 之醫藥組成物，其在癌症治療中使用，其中該使用係用於與化學治療劑、放射治療及/或其他用於癌症免疫治療之藥劑組合投予。
一種如請求項 1 至 29 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子或如請求項 35 之醫藥組成物之用途，其用於製造供治療疾病之藥物，特定而言供治療癌症之藥物。
一種治療個體之疾病，特定而言癌症之方法，其包含將治療有效量之組成物投予該個體，該組成物包含如請求項 1 至 29 中任一項之雙特異性促效性 CD28 抗原結合分子。
如請求項 42 之方法，其進一步包含與化學治療劑、放射治療及/或其他用於癌症免疫治療之藥劑組合投予。