TW202214858A

TW202214858A - 脫靶活性降低的修飾siRNA

Info

Publication number: TW202214858A
Application number: TW110128792A
Authority: TW
Inventors: 黃金宇; 羅敏; 尹科
Original assignee: 大陸商上海拓界生物醫藥科技有限公司
Priority date: 2020-08-04
Filing date: 2021-08-04
Publication date: 2022-04-16
Also published as: CA3190097A1; WO2022028462A1; US20230287418A1; CN115955973A; BR112023002080A2; KR20230043195A; EP4194553A1; JP2023536320A

Abstract

本公開涉及脫靶活性降低的修飾siRNA。具體而言，本公開涉及一種siRNA，其包含有義鏈和反義鏈，其中反義鏈在其5’區域的第2位至第8位中的至少一個核苷酸位置處包含式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾。本公開還涉及包含該siRNA的綴合物、醫藥組成物、細胞或試劑盒，以及該siRNA、其綴合物和/或醫藥組成物的醫藥用途。本公開還提供了式(II)和式(III)所示的化合物或其互變異構體及其製備方法。

Description

脫靶活性降低的修飾siRNA

本申請要求申請日為2020年08月04日的中國專利申請CN202010772542.6、申請日為2021年03月05日的中國專利申請CN202110244977.8和申請日為2021年04月02日的中國專利申請CN202110361502.7的優先權，本申請引用上述中國專利申請的原文。

本公開涉及具有抑制靶基因表達的siRNA，具體涉及脫靶活性降低的修飾siRNA。

RNA干擾(RNAi)是一種有效的沉默基因表達的方式。據統計，在人體內的疾病相關蛋白中，大約超過80%的蛋白質不能被目前常規的小分子藥物以及生物大分子製劑所靶向，屬於不可成藥蛋白。利用RNA干擾技術，可以根據編碼這些蛋白的mRNA，設計合適的siRNA，特異性靶向目標mRNA並降解目標mRNA，從而達到抑制相關的蛋白生成。因此siRNA具有非常重要的藥物開發前景。

然而siRNA常常具有不同程度的脫靶作用(Off-target effect)。一種脫靶作用是miRNA-like的脫靶作用，即siRNA反義鏈 (Antisense Strand，又稱AS鏈)的種子區(5’端第2-8位)與目標mRNA形成的完全或不完全配對所產生的對mRNA的抑制活性。一個siRNA分子的脫靶作用可能影響多個mRNA。因此可能產生不可預測的毒副作用，這是siRNA藥物產生毒副作用的主要原因(Janas,M.M.,Schlegel,M.K.,Harbison,C.E.et al.Selection of GalNAc-conjugated siRNAs with limited off-target-driven rat hepatotoxicity.Nat Commun 9,723(2018))。

siRNA

本公開提供一種siRNA，在其種子區引入了化學修飾，從而在保持(甚至提高)siRNA在靶(on-target)活性的同時，還抑制或減少siRNA脫靶活性。

本公開提供了一種siRNA，其包含有義鏈和反義鏈，每條鏈具有15至35個核苷酸，該反義鏈在其5’區域的第2位至第8位(如第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位)中的至少一個核苷酸位置處包含式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾：

其中，Y選自O、NH和S；

每個X獨立地選自CR₄(R₄’)、S、NR₅和NH-CO，其中R₄、R₄’、R₅分別獨立地為H或C₁-C₆烷基；

J₂為H或C₁-C₆烷基；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

R₃選自H、OH、鹵素、NH₂、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-烷基胺基和(CH₂)_pR₆；其中R₆選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，p=1、2或3；

Q₁為

，Q₂為R₂；或者Q₁為R₂，Q₂為

；

其中，

R₁選自H、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基和(CH₂)_qR₇；其中R₇選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，q=1、2或3；

J₁為H或C₁-C₆烷基；

R₂選自H、OH、鹵素、NH₂、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-烷基胺基和(CH₂)_rR₈；其中R₈選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，r=1、2或3；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

B是鹼基或鹼基類似物；

其中，該式(I)所示的化學修飾不是

。

在一些實施方案中，反義鏈在其5’區域的第2位至第8位(如第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位)中的至少一個核苷酸位置處包含式(I-1)所示的化學修飾或其互變異構體修飾：

其中，Y選自O、NH和S；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或C₁-C₆烷基；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

任選地，R₁和R₂直接相連成環。

在一些實施方案中，反義鏈在其5’區域的第2位至第8位(如第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位)中的至少一個核苷酸位置處包含式(I-2)所示的化學修飾或其互變異構體修飾：

其中Y選自O、NH和S；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或C₁-C₆烷基；

R₂選自H、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-烷基胺基和(CH₂)_rR₈；其中R₈選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基；r=1、2或3；

任選地，R₁和R₂直接相連成環。

一些實施方案中，包含式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾的核苷酸為包含式(I’)所示的化學修飾或其互變異構體修飾的核苷酸，

其中，Y選自O、NH和S；

J₂為H或C₁-C₆烷基；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

Q_1’為

，Q_2’為R₂；或者Q_1’為R₂，Q_2’為

；

其中，R₁選自H、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基和(CH₂)_qR₇；其中R₇選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，q=1、2或3；

J₁為H或C₁-C₆烷基；

M為O或S；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

B是鹼基或鹼基類似物；

其中，該式(I’)所示的化學修飾不是

。

在一些實施方案中，反義鏈在其5’區域的第2位至第8位(如第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位)中的至少一個核苷酸位置處包含式(I-3)所示的化學修飾或其互變異構體修飾：

其中，Y選自O、NH和S；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或C₁-C₆烷基；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

M為O或S；

任選地，R₁和R₂直接相連成環。

在一些實施方案中，反義鏈在其5’區域的第2位至第8位(如第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位)中的至少一個核苷酸位置處包含式(I-4)所示的化學修飾或其互變異構體修飾：

其中Y選自O、NH和S；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或C₁-C₆烷基；

M為O或S；

任選地，R₁和R₂直接相連成環。

在一些實施方案中，上述化學修飾不是

。

在一些實施方案中，當X為NH-CO時，R₁不是H。

在一些實施方案中，每個X獨立地選自CR₄(R₄’)、S、NR₅和NH-CO，其中R₄、R₄’、R₅分別獨立地為H或C₁-C₃烷基；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或C₁-C₃烷基；

R₃選自H、OH、鹵素、NH₂、C₁-C₃烷基、C₁-C₃烷氧基、C₂-C₄烯基、C₂-C₄炔基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-烷基胺基和(CH₂)_pR₆；其中R₆選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，p=1、2或3；

R₁選自H、C₁-C₃烷基、C₁-C₃烷氧基、C₂-C₄烯基、C₂-C₄炔基和(CH₂)_qR₇；其中R₇選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₄烯基和C₂-C₄炔基，q=1、2或3；

R₂選自H、OH、鹵素、NH₂、C₁-C₃烷基、C₁-C₃烷氧基、C₂-C₄烯基、C₂-C₄炔基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-烷基胺基和(CH₂)_rR₈；其中R₈選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₄烯基和C₂-C₄炔基，r=1、2或3；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

B選自嘌呤鹼基、嘧啶鹼基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。

在一些實施方案中，每個X獨立地選自CR₄(R₄’)、S、NR₅和NH-CO，其中R₄、R₄’、R₅分別獨立地為H、甲基、乙基、正丙基或異丙基；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或甲基；

R₃選自H、OH、F、Cl、NH₂、甲基、乙基、正丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、乙烯基、烯丙基、乙炔基、炔丙基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-甲基胺基、-O-乙基胺基和(CH₂)_pR₆；其中R₆選自OH、F、Cl、甲氧基、乙氧基、N₃、乙烯基、烯丙基、乙炔基和炔丙基，p=1或2；

R₁選自H、甲基、乙基、正丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、乙烯基、烯丙基、乙炔基、炔丙基和(CH₂)_qR₇；其中R₇選自OH、F、Cl、甲氧基、乙氧基、N₃、乙烯基、烯丙基、乙炔基和炔丙基，q=1或2；

R₂選自H、OH、F、Cl、NH₂、甲基、乙基、正丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、乙烯基、烯丙基、乙炔基、炔丙基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-甲基胺基、-O-乙基胺基和(CH₂)_rR₈；其中R₈選自OH、F、Cl、甲氧基、乙氧基、N₃、乙烯基、烯丙基、乙炔基和炔丙基，r=1或2；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

B選自嘌呤、腺嘌呤、鳥嘌呤、異鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、C2修飾的嘌呤、N8修飾的嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、6-二甲基胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、N6-烷基腺嘌呤、O6-烷基鳥嘌呤、7-脫氮嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、異胞嘧啶、假胞嘧啶、尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、C5修飾的嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或甲基；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

B選自嘌呤、腺嘌呤、鳥嘌呤、異鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、6-二甲基胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、7-脫氮嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、異胞嘧啶、假胞嘧啶、尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。

在一些實施方案中，Y為O或NH；每個X獨立地選自NH-CO、CH₂和NH；

n=0或1；m=0或1；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H；

R₁選自H、甲基和CH₂OH；

R₂選自H、OH、NH₂、甲基和CH₂OH；

R₃選自H、OH、NH₂、甲基和CH₂OH；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

B選自嘌呤、腺嘌呤、鳥嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、6-二甲基胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。

n=0或1；m=0或1；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H；

R₁選自H、甲基和CH₂OH；

R₂選自H、甲基和CH₂OH；

R₃選自H、OH、NH₂、甲基和CH₂OH；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

在一些實施方案中，該式(I)所示的化學修飾選自：

其中，B是鹼基或鹼基類似物，例如選自嘌呤鹼基、嘧啶鹼基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。

在一些實施方案中，B選自嘌呤、腺嘌呤、鳥嘌呤、異鳥嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤、C2修飾的嘌呤、N8修飾的嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、6-二甲基胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、N6-烷基腺嘌呤、O6-烷基鳥嘌呤、7-脫氮嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、異胞嘧啶、假胞嘧啶、尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、C5修飾的嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。

在另一些實施方案中，B選自嘌呤、腺嘌呤、鳥嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、6-二甲基胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。

一些實施方案中，B是該反義鏈在其5’區域的第2位至第8位(如第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位)中對應位置的鹼基。

一些具體的實施方案中，B是該反義鏈在其5’區域的第2位至第8位(如第2位、第3位、第4位、第5位、第6位、第7位、第8位)中對應位置的天然鹼基。

在一些實施方案中，該式(I)所示的化學修飾選自：

在一些實施方案中，該式(I)所示的化學修飾選自：

在另一些實施方案中，B選自腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶。

在一些實施方案中，該式(I)所示的化學修飾選自：

其中，M為O或S；

在一些實施方案中，該式(I)所示的化學修飾選自：

其中，M為O或S；

B是鹼基或鹼基類似物，例如選自嘌呤鹼基、嘧啶鹼基、吲哚、5-硝基吲哚和3-硝基吡咯。

在一些實施方案中，該式(I)所示的化學修飾選自：

其中，M為O或S；

在一些實施方案中，該式(I)所示的化學修飾包括但不限於：

以及它們結構中的腺嘌呤被置換為鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶的那些。

在一些實施方案中，反義鏈在其5’區域的第2位至第8位、第3位至第8位、第4位至第8位、第5位至第8位、第5位至第7位中的至少一個核苷酸位置處包含上述式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾。

在一些實施方案中，反義鏈在其5’區域的第5位、第6位或第7位的核苷酸位置處包含上述式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾。

在一些實施方案中，反義鏈在其5’區域的第7位的核苷酸位置處包含上述式(I)的化學修飾或其互變異構體修飾。

在一些實施方案中，有義鏈和反義鏈各自獨立地具有16至35個、16至34個、17至34個、17至33個、18至33個、18至32個、18至31個、18至30個、18至29個、18至28個、18至27個、18至26個、18至25個、18至24個、18至23個、19至25個、19至24個、或19至23個核苷酸。

在一些實施方案中，有義鏈和反義鏈長度相同或不同，該有義鏈的長度為19-23個核苷酸，反義鏈的長度為19-26個核苷酸。本公開提供的siRNA的有義鏈和反義鏈的長度比可以是19/20、19/21、19/22、19/23、19/24、19/25、19/26、20/20、20/21、20/22、20/23、20/24、20/25、20/26、21/20、21/21、21/22、21/23、21/24、21/25、21/26、22/20、22/21、22/22、22/23、22/24、22/25、22/26、23/20、23/21、23/22、23/23、23/24、23/25或23/26。在一些實施方式中，該siRNA的有義鏈和反義鏈的長度比為19/21、21/23或23/25。在一些實施方式中，該siRNA的有義鏈和反義鏈的長度比為19/21。

在一些實施方案中，反義鏈與靶序列至少部分地反向互補以介導RNA干擾；在一些實施方案中，反義鏈與靶序列之間存在不多於5個、不多於4個、不多於3個、不多於2個、不多於1個錯配；在一些實施方案中，反義鏈與靶序列完全反向互補。

在一些實施方案中，有義鏈與反義鏈至少部分地反向互補以形成雙鏈區；在一些實施方案中，有義鏈與反義鏈之間存在不多於5個、不多於4個、不多於3個、不多於2個、不多於1個錯配；在一些實施方案中，有義鏈與反義鏈完全反向互補。

本公開還提供了一種siRNA，其為經修飾的上述siRNA,除包含被上述式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾的核苷酸外，該有義鏈和/或反義鏈中的至少一條還包含至少一個其他的修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，除包含被上述式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾的核苷酸外，該有義鏈和/或反義鏈中其餘核苷酸為其他修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，該其他修飾的核苷酸相互獨立地選自脫氧-核苷酸、3’-末端脫氧-胸腺嘧啶核苷酸、2’-O-甲基修飾的核苷酸、2’-氟修飾的核苷酸、2’-脫氧-修飾的核苷酸、鎖核苷酸、非鎖核苷酸、構象限制性核苷酸、限制性乙基核苷酸、無鹼基核苷酸、2’-胺基-修飾的核苷酸、2’-O-烯丙基-修飾的核苷酸、2’-C-烷基-修飾的核苷酸、2’-羥基-修飾的核苷酸、2’-甲氧基乙基修飾的核苷酸、2’-O-烷基-修飾的核苷酸、嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯、包含非天然鹼基的核苷酸、四氫吡喃修飾的核苷酸、1,5-脫水己糖醇修飾的核苷酸、環己烯基修飾的核苷酸、包含硫代磷酸酯基的核苷酸、包含甲基膦酸酯基的核苷酸、包含5’-磷酸酯的核苷酸及包含5’-磷酸酯模擬物的核苷酸。

在一些實施方案中，該其他修飾的核苷酸相互獨立地選自：2'-烷氧基修飾的核苷酸、2'-經取代的烷氧基修飾的核苷酸、2'-烷基修飾的核苷酸、2'-經取代的烷基修飾的核苷酸、2'-胺基修飾的核苷酸、2'-經取代的胺基修飾的核苷酸、2'-氟修飾的核苷酸、2'-脫氧核苷酸、2'-脫氧-2'-氟修飾的核苷酸、3'-脫氧-胸腺嘧啶核苷酸、異核苷酸、LNA、ENA、cET、UNA和GNA。

在一些實施方案中，該其他修飾的核苷酸相互獨立地選自：2'-甲氧基修飾的核苷酸、2'-氟修飾的核苷酸和2'-脫氧-修飾的核苷酸。

在本公開的上下文中，氟修飾的核苷酸指核苷酸的核糖基2'位的羥基被氟取形成的核苷酸。在一些實施方式中，2'-烷氧基修飾的核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸(2'-OMe)。在一些實施方式中，2'-經取代的烷氧基修飾的核苷酸，例如可以是2'-O-甲氧基乙基修飾的核苷酸(2'-MOE)或2'-胺基修飾的核苷酸(2'-NH₂)。

在一些實施方案中，按照5'末端到3'末端的方向，反義鏈的第2、6、14和16位的核苷酸各自獨立地為2'-脫氧核苷酸或2'-氟修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，按照5'末端到3'末端的方向，反義鏈的第2、6、9、12和14位的核苷酸各自獨立地為2'-脫氧核苷酸或2'-氟修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，按照5'末端到3'末端的方向，反義鏈的第2、4、6、9、12、14和18位的核苷酸各自獨立地為2'-脫氧核苷酸或2'-氟修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，按照5'末端到3'末端的方向，反義鏈的第2、4、6、9、12、14、16和18位的核苷酸各自獨立地為2'-脫氧核苷酸或2'-氟修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，有義鏈和/或反義鏈中至少一個磷酸酯基為具有修飾基團的磷酸酯基。該修飾基團使得該SiRNA在生物樣品或環境中具有增加的穩定性。

在一些實施方案中，該具有修飾基團的磷酸酯基為硫代磷酸酯基。具體地，硫代磷酸酯基是指一個非橋接氧原子被硫原子替代而修飾的磷酸二酯基。

在一些實施方案中，硫代磷酸酯基存在於選自以下的位置中的至少一處：

該有義鏈的5'末端的第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；

該有義鏈的5'末端的第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；

該有義鏈的3'末端的第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；

該有義鏈的3'末端的第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；

該反義鏈的5'末端的第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；

該反義鏈的5'末端的第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；

該反義鏈的3'末端的第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；以及

該反義鏈的3'末端的第2個核苷酸和第3個核苷酸之間。

在一些實施方案中，有義鏈具有如下式所示的核苷酸序列：

5’-N_aN_aN_aN_aN_bN_aN_bN_bN_bN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_a-3’

其中，每個N_a和N_b各自獨立地表示修飾的核苷酸或者未修飾的核苷酸，且N_a和N_b上的修飾不同；和/或

反義鏈具有如下式所示的核苷酸序列：

5’-N_a’N_b’N_a’X’N_a’N_b’W’N_a’N_b’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’Y’N_a’X’N_a’N_a’N_a’-3’

其中，每個N_a’和N_b’獨立地表示修飾的核苷酸或者未修飾的核苷酸，其中N_a’和N_b’上的修飾不同；每個X’獨立地為N_a’或N_b’；Y’為N_a’或N_b’；W’表示包含上述式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，有義鏈具有如下式所示的核苷酸序列：

5’-N_aN_aN_aN_aN_bN_aN_bN_bN_bN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_a-3’

反義鏈具有如下式所示的核苷酸序列：

5’-N_a’N_b’N_a’X’N_a’W’N_a’N_a’N_b’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’Y’N_a’X’N_a’N_a’N_a’-3’

在一些實施方案中，有義鏈具有如下式所示的核苷酸序列：

5’-N_aN_aN_aN_aN_bN_aN_bN_bN_bN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_a-3’

反義鏈具有如下式所示的核苷酸序列：

5’-N_a’N_b’N_a’X’W’N_b’N_a’N_a’N_b’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’Y’N_a’X’N_a’N_a’N_a’-3’

在一些實施方案中，N_a為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b為2'-氟修飾的核苷酸或2'-脫氧-修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，N_a’為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b’為2'-氟修飾的核苷酸或2'-脫氧-修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，有義鏈和/或反義鏈中至少一個磷酸酯基為具有修飾基團的磷酸酯基，該修飾基團使得該siRNA在生物樣品或環境中具有增加的穩定性。

該有義鏈的5'末端的第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；

該有義鏈的5'末端的第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；

該有義鏈的3'末端的第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；

該有義鏈的3'末端的第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；

該反義鏈的5'末端的第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；

該反義鏈的5'末端的第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；

該反義鏈的3'末端的第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；以及

該反義鏈的3'末端的第2個核苷酸和第3個核苷酸之間。

在一些實施方案中，有義鏈具有如下式所示的核苷酸序列：

5’-NmsNmsNmNmNfNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmNm-3’

其中，Nm表示甲氧基修飾的任意核苷酸，例如甲氧基修飾的C、G、U、A、T；Nf表示氟修飾的任意核苷酸，例如氟修飾的C、G、U、A、T；小寫字母s表示與該字母s左右相鄰的兩個核苷酸之間為硫代磷酸酯基連接；和/或

反義鏈具有如下式所示的核苷酸序列：

5’-Nms’Nfs’Nm’Nm’Nm’Nf’W’Nm’Nm’Nm’Nm’Nm’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nm’Nms’Nms’Nm’-3’

其中，Nm’表示甲氧基修飾的任意核苷酸，例如甲氧基修飾的C、G、U、A、T；Nf’表示氟修飾的任意核苷酸，例如氟修飾的C、G、U、A、T；小寫字母S表示與該字母s左右相鄰的兩個核苷酸之間為硫代磷酸酯基連接；W’表示包含上述式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，按照5'末端到3'末端的方向，反義鏈的第2、6、14位的核苷酸各自獨立地為2'-脫氧核苷酸或2'-氟修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，按照5'末端到3'末端的方向，反義鏈的第2、6、10、12和14位的核苷酸各自獨立地為2'-脫氧核苷酸或2'-氟修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，按照5'末端到3'末端的方向，反義鏈的第2、4、6、10、12、14和18位的核苷酸各自獨立地為2'-脫氧核苷酸或2'-氟修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，按照5'末端到3'末端的方向，反義鏈的第2、4、6、10、12、14、16和18位的核苷酸各自獨立地為2'-脫氧核苷酸或2'-氟修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，按照5'末端到3'末端的方向，反義鏈的第2、4、6、9、10、12、14、16和18位的核苷酸各自獨立地為2'-脫氧核苷酸或2'-氟修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，5'末端到3'末端的方向，反義鏈的第2、6和14的核苷酸各自獨立地為2'-氟修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，按照5'末端到3'末端的方向，反義鏈的第2、6、14和16位的核苷酸各自獨立地為2'-氟修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，按照5'末端到3'末端的方向，反義鏈的第2、6、12和14位的核苷酸各自獨立地為2'-氟修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，按照5'末端到3'末端的方向，反義鏈的第2、4、6、12、14、16和18位的核苷酸各自獨立地為2'-氟修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，按照5'末端到3'末端的方向，反義鏈的第2、4、6、9、12、14、16和18位的核苷酸各自獨立地為2'-氟修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，按照5'末端到3'末端的方向，反義鏈的第2、4、6、10、12、14、16和18位的核苷酸各自獨立地為2'-氟修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，本公開所述的siRNA有義鏈具有如下式所示的核苷酸序列：

5’-N_aN_aN_aN_aXN_aN_bN_bN_bN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_a-3’

其中，每個N_a和N_b各自獨立地表示修飾的核苷酸或者未修飾的核苷酸，且N_a和N_b上的修飾不同；每個X獨立地為N_a或N_b。

在一些實施方案中，本公開所述的siRNA反義鏈具有如下式所示的核苷酸序列：

5’-N_a’N_b’N_a’X’N_a’N_b’W’N_a’X’Y’N_a’X’N_a’N_b’N_a’X’N_a’X’N_a’N_a’N_a’-3’；

其中，每個N_a’和N_b’獨立地表示修飾的核苷酸或者未修飾的核苷酸，其中N_a’和N_b’上的修飾不同；每個X’獨立地為N_a’或N_b’，Y’為N_a’或N_b’，W’表示含有本公開任一式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾的核苷酸。

在一些實施方案中，X’和Y’上的修飾不同。

在一些具體的實施方案中，N_a為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b為2'-氟修飾的核苷酸。

在一些具體的實施方案中，N_a’為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b’為2'-氟修飾的核苷酸。

5’-N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’W’N_a’X’Y’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’-3’；

其中，每個X’獨立地為N_a’或N_b’，Y’為N_a’或N_b’，且X’和Y’上的修飾不同；N_a’為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b’為2'-氟修飾的核苷酸；W’表示含有本公開任一式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾的核苷酸。

5’-N_aN_aN_aN_aN_aN_aN_bN_bN_bN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_a-3’；或，

5’-N_aN_aN_aN_aN_bN_aN_bN_bN_bN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_a-3’；

其中，N_a為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b為2'-氟修飾的核苷酸。

5’-N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’W’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’-3’；或，

5’-N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’W’N_a’N_b’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’-3’；

其中，N_a為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b為2'-氟修飾的核苷酸；和/或N_a’為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b’為2'-氟修飾的核苷酸。

W’表示含有本公開任一式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾的核苷酸。

在一些具體的實施方案中，W’表示含有化學修飾或其互變異構體修飾的核苷酸；該化學修飾選自：

、

或

；其中，B選自鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶；在一些具體的實施方案中，B選自反義鏈在其5’區域的第7位中對應位置的鹼基。

、

，和

；其中，M為O或S；其中，B選自鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶；在一些具體的實施方案中，B選自反義鏈在其5’區域的第7位中對應位置的鹼基。

一些具體的實施方案中，M為S。一些具體的實施方案中，M為O。

在一些實施方案中，有義鏈和/或反義鏈中至少一個磷酸酯基為具有修飾基團的磷酸酯基，該修飾基團使得該siRNA在生物樣品或環境中具有增加的穩定性；在一些實施方案中，該具有修飾基團的磷酸酯基為硫代磷酸酯基。具體地，硫代磷酸酯基是指一個非橋接氧原子被硫原子替代而修飾的磷酸二酯基。

該有義鏈的5'末端的第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；

該有義鏈的5'末端的第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；

該有義鏈的3'末端的第1個核苷酸末端；

該有義鏈的3'末端的第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；

該有義鏈的3'末端的第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；

該反義鏈的5'末端的第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；

該反義鏈的5'末端的第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；

該反義鏈的3'末端的第1個核苷酸末端；

該反義鏈的3'末端的第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；以及

該反義鏈的3'末端的第2個核苷酸和第3個核苷酸之間。

在一些實施方案中，有義鏈和/或反義鏈中包括多個硫代磷酸酯基，該硫代磷酸酯基存在於：

該有義鏈的5'末端的第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；

該有義鏈的5'末端的第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；

該反義鏈的5'末端的第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；

該反義鏈的5'末端的第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；

該反義鏈的3'末端的第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；

該反義鏈的3'末端的第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；

任選地，該有義鏈的3'末端的第1個核苷酸末端，和/或，

任選地，該有義鏈的3'末端的第1個核苷酸和第2個核苷酸之間。

在一些實施方案中，有義鏈選自如下式所示的核苷酸序列：

5’-NmsNmsNmNmNfNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmNm-3’，或，

5’-NmsNmsNmNmNmNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmNm-3’，或，

5’-NmsNmsNmNmNfNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmNms-3’，或，

5’-NmsNmsNmNmNmNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmNms-3’，或，

5’-NmsNmsNmNmNfNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmsNm-3’，或，

5’-NmsNmsNmNmNmNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmsNm-3’，或，

5’-NmsNmsNmNmNfNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmsNms-3’，或，

5’-NmsNmsNmNmNmNmNfNfNfNmNmNmNmNmNmNmNmNmsNms-3’，

其中，Nm表示2'-甲氧基修飾的任意核苷酸，例如2'-甲氧基修飾的C、G、U、A、T；Nf表示2'-氟修飾的任意核苷酸，例如2'-氟修飾的C、G、U、A、T；

小寫字母s在大寫字母中間時表示與該字母s左右相鄰的兩個核苷酸之間為硫代磷酸酯基連接；小寫字母s在3’端第一個時表示與該字母s左側相鄰的一個核苷酸末端為硫代磷酸酯基。

在一些實施方案中，反義鏈具有如下式所示的核苷酸序列：

5’-Nms’Nfs’Nm’Nf’Nm’Nf’W’Nm’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nf’Nms’Nms’Nm’-3’或，

5’-Nms’Nfs’Nm’Nf’Nm’Nf’W’Nm’Nf’Nm’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nf’Nm’Nf’Nms’Nms’Nm’-3’

其中，Nm’表示2'-甲氧基修飾的任意核苷酸，例如2'-甲氧基修飾的C、G、U、A、T；Nf’表示2'-氟修飾的任意核苷酸，例如2'-氟修飾的C、G、U、A、T；

小寫字母s在大寫字母中間時表示與該字母s左右相鄰的兩個核苷酸之間為硫代磷酸酯基連接，小寫字母s在3’端第一個時表示與該字母s左側相鄰的一個核苷酸末端為硫代磷酸酯基；

W’表示含有化學修飾或其互變異構體修飾的核苷酸；該化學修飾選自：

、

或

；其中，B選自鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶，在一些實施方案中選自反義鏈在其5’區域的第7位中對應位置的鹼基。

、

，和

在一些實施方案中，siRNA包含選自表5中的有義鏈。

在一些實施方案中，siRNA包含選自表5中的任一反義鏈。

在一些實施方案中，siRNA包含選自表8中的任一有義鏈。

在一些實施方案中，siRNA包含選自表8中的任一反義鏈。

在一些實施方案中，siRNA包含選自表9中的任一反義鏈。

在一些實施方案中，siRNA包含選自表13中的任一有義鏈。

在一些實施方案中，siRNA包含選自表13中的任一反義鏈。

在一些實施方案中，siRNA包含選自表15中的任一有義鏈。

在一些實施方案中，siRNA包含選自表15中的任一反義鏈。

在一些實施方案中，siRNA包含選自表24中的任一有義鏈。

在一些實施方案中，siRNA包含選自表24中的任一反義鏈。

在一些實施方案中，siRNA包含選自表25中的任一有義鏈。

在一些實施方案中，siRNA包含選自表25中的任一反義鏈。

在一些實施方案中，siRNA包含選自表26中的任一有義鏈。

在一些實施方案中，siRNA包含選自表26中的任一反義鏈。

在一些實施方案中，siRNA包含選自表66中的任一有義鏈。

在一些實施方案中，siRNA包含選自表66中的任一反義鏈。

在一些實施方案中，上述siRNA當接觸到表達靶基因的細胞時，由例如：psiCHECK活性篩選和螢光素酶報告基因檢測法，其他如PCR或基於分支DNA(bDNA)的方法、或基於蛋白質的方法，如免疫螢光分析法，例如Western Blot或流式細胞術測定的，上述siRNA會抑制靶基因的表達至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%。

在一些實施方案中，上述siRNA當接觸到表達靶基因的細胞時，由例如：psiCHECK活性篩選和螢光素酶報告基因檢測法，其他如PCR或基於分支DNA(bDNA)的方法、或基於蛋白質的方法，如免疫螢光分析法，例如Western Blot或流式細胞術測定的，上述siRNA引起的靶基因mRNA剩餘表達百分比為不高於99%、不高於95%、不高於90%、不高於85%、不高於80%、不高於75%、不高於70%、不高於65%、不高於60%、不高於55%、不高於50%、不高於45%、不高於40%、不高於35%、不高於30%、不高於25%、不高於20%、不高於15%、或不高於10%。

在一些實施方案中，包含本公開化學修飾的siRNA當接觸到表達靶基因的細胞時，由例如：psiCHECK活性篩選和螢光素酶報告基因檢測法，其他如PCR或基於分支DNA(bDNA)的方法、或基於蛋白質的方法，如免疫螢光分析法，例如Western Blot、或流式細胞術測定的，包含本公開化學修飾，例如式(I)或式(II)所示化學修飾的siRNA在保持在靶活性的同時，將脫靶活性減少了至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%或至少75%。

在一些實施方案中，包含本公開化學修飾的siRNA當接觸到表達靶基因的細胞時，由例如：psiCHECK活性篩選和螢光素酶報告基因檢測法，其他如PCR或基於分支DNA(bDNA)的方法、或基於蛋白質的方法，如免疫螢光分析法，例如Western Blot、或流式細胞術測定的，包含本公開化學修飾，例如式(I)或式(II)所示化學修飾的siRNA使在靶活性降低至多20%、至多19%、至多15%、至多10%、至多5%或超過1%的同時，將脫靶活性減少了至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%或至少75%。

在一些實施方案中，包含本公開化學修飾的siRNA當接觸到表達靶基因的細胞時，由例如：psiCHECK活性篩選和螢光素酶報告基因檢測法，其他如PCR或基於分支DNA(bDNA)的方法、或基於蛋白質的方法，如免疫螢光分析法，例如Western Blot、或流式細胞術測定的，包含本公開化學修飾，例如式(I)或式(II)所示化學修飾的siRNA使在靶活性提高至少1%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%或至少80%的同時，將脫靶活性減少了至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%或至少75%。

綴合物

本公開還提供了一種siRNA綴合物，其包含上述siRNA中的任意一種和連接至該siRNA的綴合基團。

在一些實施方案中，該綴合基團包含藥學上可接受的靶向配體和任選的接頭，並且，該siRNA、該接頭和該靶向配體依次共價或非共價連接。

在一些實施方案中，該接頭連接至該siRNA的有義鏈3’末端。

本公開還提供了一種siRNA綴合物，其包含上述siRNA中的任意一種和連接至該siRNA的靶向配體。

在一些實施方案中，該siRNA和該靶向配體共價或非共價連接。

在一些實施方案中，該靶向配體連接至該siRNA的有義鏈3’末端。

在一些實施方案中，該靶向配體靶向肝臟。

在一些實施方案中，該靶向配體結合脫唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)。

在一些實施方案中，該靶向配體選自：半乳糖簇或半乳糖衍生物簇，該半乳糖衍生物選自N-乙醯基-半乳糖胺、N-三氟乙醯基半乳糖胺、N-丙醯基半乳糖胺、N-正丁醯基半乳糖胺或N-異丁醯基半乳糖胺。

在一些實施方案中，為了促進siRNA進入細胞，可以在siRNA有義鏈的末端引入膽固醇等親脂性的基團，親脂性的基團以共價鍵與小干擾核酸結合，如末端引入膽固醇、脂蛋白、維生素E等，以利於藉由由脂質雙分子層構成的細胞膜與細胞內的mRNA發生作用。同時，siRNA也可以進行非共價鍵修飾，如藉由疏水鍵或離子鍵結合磷脂分子、多肽、陽離子聚合物等增加穩定性和生物學活性。

在一些實施方案中，該靶向配體藉由磷酸酯基團、硫代磷酸酯基團或膦酸基團與siRNA末端連接。

在一些實施方案中，該靶向配體藉由磷酸酯基團、硫代磷酸酯基團或膦酸基團與siRNA末端間接連接。

在一些實施方案中，該靶向配體藉由磷酸酯基團、硫代磷酸酯基團或膦酸基團與siRNA末端直接連接。

在一些實施方案中，該靶向配體藉由磷酸酯基團或硫代磷酸酯基團與siRNA末端直接連接。

在一些實施方案中，該靶向配體藉由磷酸酯基團或硫代磷酸酯基團與siRNA有義鏈3’末端直接連接。

在一些實施方案中，該靶向配體結構如下式(IV)所示，

其中T為靶向部分，E為分支基團，L₁為接頭部分，L₂為靶向部分與分支基團間的栓系部分，其中i選自1到10的整數，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。

在一些實施方案中，i選自2到8的整數。

在一些實施方案中，i選自3到5的整數。

在一些實施方案中，L₁為

R⁹及R¹⁰各自獨立的選自為-S-，-NH-，-O-，-C(O)-，-OC(O)-，-C(O)O-，-NHC(O)-，-C(O)NH-，-CH₂-，-CH₂NH-，-CH₂O-，-NH-C(O)-CH₂-，-C(O)-CH₂-NH-，-NH(CO)NH-，3-12員雜環基，該-CH₂-任選被選自鹵素，烷基，烷氧基，烷胺基的取代基取代，該烷基任選進一步被選自羥基、胺基、鹵素的取代基取代；

R¹¹選自氘，鹵素，烷基，胺基，氰基，硝基，烯基，炔基，羧基，羥基，巰基，烷巰基，烷氧基，烷胺基，-C(O)-烷基，-C(O)-O-烷基，-CONH₂，-CONH-烷基，-OC(O)-烷基，-NH-C(O)-烷基，-S(O)O-烷基，-S(O)ONH₂，-S(O)ONH-烷基，該烷基，烯基、炔基、烷基巰基，烷基氧基，-C(O)-烷基，-C(O)-O-烷基，-CONH-烷基，-OC(O)-烷基，-NH-C(O)-烷基，-S(O)O-烷基，-S(O)ONH-烷基，任選進一步被選自鹵素，羥基，胺基，巰基的取代基取代；

該k選自0，1，2，3，4；

該j選自1到20的整數(例如0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20)。

在一些實施方案中，L₁為

或

，其中R¹¹選自氘，鹵素，烷基，胺基，氰基，硝基，烯基，炔基，羧基，羥基，巰基，烷巰基，烷氧基，烷胺基，-C(O)-烷基，-C(O)-O-烷基，-CONH₂，-CONH-烷基，-OC(O)-烷基，-NH-C(O)-烷基，-S(O)O-烷基，-S(O)ONH₂，-S(O)ONH-烷基，該烷基，烯基、炔基、羧基、烷基巰基，烷基氧基，-C(O)-烷基，-C(O)-O-烷基，-CONH-烷基，-OC(O)-烷基，-NH-C(O)-烷基，-S(O)O-烷基，-S(O)ONH-烷基，選進一步被選自鹵素，羥基，胺基，巰基的取代基取代；

該k選自0，1，2，3，4。

在一些實施方案中，L₁為

在一些實施方案中，L₁為

在一些實施方案中，L₁為

在一些實施方案中，該靶向配體中E為

該R¹²、R¹³、R¹⁴及R¹⁵各自獨立的選自-C(O)NH-，-C(O)-，該羰基任選進一步被烷基取代，該烷基任選進一步被選自烷基，羥基，-C(O)O-，-C(O)O-烷基-，-C(O)NH-取代；

該X²、X³、X⁴及X⁵各自獨立的選自0到10的整數(例如0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10)。

在一些實施方案中，該靶向配體中E為

該R¹²、R¹³、R¹⁴及R¹⁵各自獨立的選自-C(O)NH-，-C(O)-，該-C(O)NH-，-C(O)-任選進一步被烷基取代，該烷基任選進一步被選自烷基，羥基，-C(O)O-，-C(O)O-烷基-，-C(O)NH-取代；

在一些實施方案中，該靶向配體中E為

該R¹²、R¹³、R¹⁴及R¹⁵各自獨立的選自-C(O)NH-、-C(O)-、

、

、

、

、

、

、

、

，該X²、 X³、X⁴及X⁵各自獨立的選自0到10的整數(例如0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10)。

在一些實施方案中，該靶向配體中E為

在一些實施方案中，該靶向配體中E選自

在一些實施方案中，該靶向配體中E選自

或

在一些實施方案中，該靶向配體中E選自

。

在一些實施方案中，該靶向配體中E為

，L₁選自如下結構：

R⁹及R¹⁰各自獨立的選自為-S-，-NH-，-O-，-S-，-C(O)-，-OC(O)-，-C(O)O-，-NHC(O)-，-C(O)NH-，-CH₂-，-CH₂NH-，-CH₂O-，-NH-C(O)-CH₂-，-C(O)-CH₂-NH-，-NH(CO)NH-，3-12員雜環基，該-CH₂-任選被選自鹵素，烷基，烷氧基，烷胺基的取代基取代，該烷基任選進一步被選自羥基、胺基、鹵素的取代基取代；

該k選自0，1，2，3，4；

該j選自0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20。

在一些實施方案中，該靶向配體中E選自：

、

或

，L₁選自：

、

或

在一些實施方案中，該靶向配體中E選自：

，L₁選自：

，即E-L₁為

。

在一些實施方案中，該靶向配體中E選自：

，L₁選自：

或

，即E-L₁為

在一些實施方案中，該靶向配體中E選自

或

，L₁選自

，即E-L₁為

或

。

在一些實施方案中，該靶向配體中E選自

或

，L₁選自

或

，即E-L₁為

本公開中L₂為靶向部分與分支基團間的栓系部分，L₂在分支基團和各靶向部分之間發揮連接、間隔作用。

在一些實施方式中，L₂的一端直接連接至靶向配體，而另一端直接連接至分支基團E。

在一些實施方式中，L₂的一端直接連接至靶向配體，而另一端間接地連接至分支基團E。

在一些實施方式中，L₂的一端間接地連接至靶向配體，而另一端間接地連接至分支基團E。

在一些實施方式中，本文公開的靶向配體包括2個L₂和2個靶向部分。

在一些實施方式中，本文公開的靶向配體包括3個L₂和3個靶向部分。

在一些實施方式中，本文公開的靶向配體包括4個L₂和4個靶向部分。

在一些實施方式中，本文公開的靶向配體包括多個L₂和多個靶向部分。

在一些實施方式中，本公開中L₂選自以下基團中的1個或2-20個共價連接的組合(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)：

，取代的或未取代的環烷基 (例如環己基，環丙基，環丁基，環戊基，環庚基，環辛基等)，取代的或未取代的環烯基(例如環己烯基，環丁烯基，環戊烯基，環庚烯基，環辛烯基，環己二烯基，環戊二烯基，環庚二烯基，環辛二烯基等)，取代的或未取代的芳基(例如苯基，萘基，聯萘基，蒽基等)，取代的或未取代的雜芳基(例如吡啶基，嘧啶基，吡咯，咪唑，呋喃，苯并呋喃，吲哚等)和取代的或未取代的雜環基(例如四氫呋喃，四氫吡喃，哌啶，吡咯烷等)的基團的共價組合。

在一些實施方式中，該靶向配體包括具有如下所示結構的L₂，

，其中x⁶是從1至20的整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。

，其中，x⁷是從1至20的整數(例如，1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，並且Z是

在一些實施方式中，該靶向配體具有如下所示結構的L₂，

在一些實施方式中，該靶向配體具有如下所示結構的L₂，

其中，x⁸是從1至20的整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，並且Z是

。

在一些實施方式中，該靶向配體具有如下所示結構的L₂，

，其中x⁹和X¹⁰各自獨立選自從1至20的整數(例如， 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19或20)，並且Z是

。

在一些實施方式中，該靶向配體具有如下所示結構的L₂，

在一些實施方式中，該靶向配體具有如下所示結構的L₂，

其中，x⁷和X⁸各自獨立選自從1至20的整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)，並且Z

在一些具體的實施方式中，該靶向配體具有以下結構：

在一些具體的實施方式中，靶向配體具有以下結構：

在一些具體的實施方式中，靶向配體具有以下結構：

在一些具體的實施方式中，靶向配體具有以下結構：

一些實施方案中，該靶向配體的靶向部分是由一個或多個靶向基團組成，該靶向配體協助引導將與其連接的治療性試劑遞送至所需靶位置。在一些情況中，該靶向部分可以結合細胞或細胞受體，並且啟動內吞作用以促進治療性試劑進入細胞。該靶向部分可以包括對細胞受體或細胞表面分子或抗體具有親和性的化合物。含有靶向部分的各種靶向配體可以與治療性試劑和其它化合物連接以將試劑靶向細胞和特定細胞受體。

一些實施方案中，該靶向部分的類型包括碳水化合物、膽固醇和膽甾醇基團或類固醇。可以結合細胞受體的靶向部分包括糖類，諸如半乳糖、半乳糖衍生物(如N-乙醯基-半乳糖胺，N-三氟乙醯基半乳糖胺、N-丙醯基半乳糖胺、N-正丁醯基半乳糖胺、N-異丁醯基半乳糖胺)、甘露糖和甘露糖衍生物。

已知結合脫唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)的靶向部分可特別用於引導遞送寡聚化合物至肝臟。脫唾液酸糖蛋白受體在肝臟細胞(肝細胞)上大量表達。靶向ASCPR的細胞受體靶向部分包括半乳糖和半乳糖衍生物。具體而言，半乳糖衍生物的簇，包括由2、3、4或超過4個N-乙醯基-半乳糖胺(GalNAc或NAG)組成的簇可以促進肝細胞中某些化合物的攝取。偶聯寡聚化合物的GalNAc簇用於引導組成物至肝臟，在這裡N-乙醯基-半乳糖胺糖能夠結合肝臟細胞表面的脫唾液酸糖蛋白受體。脫唾液酸糖蛋白受體的結合被認為將啟動受體介導的內吞作用，從而促進化合物進入細胞內部。

一些實施方案中，該靶向配體可以包括2、3、4或超過4個靶向部分。

在一些實施方式中，本文所公開的靶向配體可以包括1、2、3、4或超過4個藉由L₂連接至分支基團的靶向部分。

在一些實施方式中，該靶向配體是半乳糖簇的形式。

在一些實施方式中，各靶向部分包括半乳糖胺衍生物，其為N-乙醯基-半乳糖胺。可用作靶向部分且對脫唾液酸糖蛋白受體具有親和性的其他糖可選自半乳糖、半乳糖胺、N-甲醯基-半乳糖胺、N-乙醯基-半乳糖胺、N-丙醯基-半乳糖胺、N-正丁醯基-半乳糖胺和N-異丁醯基-半乳糖胺等。

在一些實施方式中，本公開中的靶向配體包括N-乙醯半乳糖胺做為靶向部分，

在一些實施方式中，該靶向配體包括三個末端半乳糖胺或半乳糖胺衍生物(諸如N-乙醯基-半乳糖胺)，其各自對唾液酸糖蛋白受體均具有親和性。在一些實施方式中，靶向配體包括三個末端N-乙醯基-半乳糖胺(GalNAc或NAG)作為靶向部分。

在一些實施方式中，該靶向配體包括四個末端半乳糖胺或半乳糖胺衍生物(諸如N-乙醯基-半乳糖胺)，其各自對脫唾液酸糖蛋白受體均具有親和性。在一些實施方式中，靶向配體包括四個末端N-乙醯基-半乳糖胺(GalNAc或NAG)作為靶向部分。

當述及三個末端N-乙醯基-半乳糖胺時本領域常用的術語包括三觸角(tri-antennary)、三價物(tri-valent)和三聚體。

當述及四個末端N-乙醯基-半乳糖胺時本領域常用的術語包括四觸角(tetra-antennary)、四價物(tetra-valent)和四聚體。

一些具體實施方案中，本公開的靶向配體具有如下結構，

一些具體實施方案中，本公開提供的靶向配體具有如下結構，

在一些實施方式中，本公開siRNA連接至本公開靶向配體，形成具有如下所示的siRNA綴合物，

其中T為靶向部分，E為分支基團，L₁為接頭部分，L₂為靶向部分與分支基團間的栓系部分，其中x選自1到10的整數，D為上述任一方案的siRNA。

在一些實施方式中，D為靶向ApoC3的siRNA。

在一些實施方式中，D為靶向HBV-X的siRNA。

在一些實施方式中，D為靶向F11的siRNA。

在一些實施方式中，D為靶向HBV-S的siRNA。

在一些實施方式中，D為靶向血管生成素樣蛋白-3(ANGPTL3)的siRNA。

在一些實施方式中，D為靶向甲狀腺素轉運蛋白(TTR)基因的siRNA。

在一些實施方式中，D為本公開任一siRNA。

在一些實施方案中，該L₁連接至該siRNA的有義鏈3’末端。

在一些實施方案中，該靶向配體藉由磷酸酯基團、硫代磷酸酯基團與siRNA末端直接連接。

在一些實施方案中，該靶向配體藉由磷酸酯基團、硫代磷酸酯基團與siRNA有義鏈3’末端直接連接。

在一些具體的實施方案中，本公開所述的siRNA綴合物如下所示，

或

，其中，D為上述任一方案的siRNA。

在一些實施方式中，D為靶向ApoC3的siRNA。

在一些實施方式中，D為靶向HBV-X的siRNA。

在一些實施方式中，D為靶向F11的siRNA。

在一些實施方式中，D為靶向HBV-S的siRNA。

在一些具體的實施方案中，該靶向配體藉由磷酸酯基團或硫代磷酸酯基團與siRNA有義鏈3’末端直接連接。

或

，其中，D為上述任一方案的siRNA。

在一些實施方式中，D為靶向ApoC3的siRNA。

在一些實施方式中，D為靶向HBV-X的siRNA。

在一些實施方式中，D為靶向F11的siRNA。

在一些實施方式中，D為靶向HBV-S的siRNA。

或

，其中， D為上述任一方案的siRNA。

在一些實施方式中，D為靶向ApoC3的siRNA。

在一些實施方式中，D為靶向HBV-X的siRNA。

在一些實施方式中，D為靶向F11的siRNA。

在一些實施方式中，D為靶向HBV-S的siRNA。

，其中，D為上述任一方案的siRNA。

在一些實施方式中，D為靶向ApoC3的siRNA。

在一些實施方式中，D為靶向HBV-X的siRNA。

在一些實施方式中，D為靶向F11的siRNA。

在一些實施方式中，D為靶向HBV-S的siRNA。

在一些具體的實施方案中，L₁與D藉由磷酸酯基團、硫代磷酸酯基團或膦酸基團連接。

在一些具體的實施方案中，L₁與D有義鏈3’末端藉由磷酸酯基團、硫代磷酸酯基團或膦酸基團連接。

在一些具體的實施方案中，L₁與D有義鏈3’末端藉由磷酸酯基團或硫代磷酸酯基團直接連接。

在一些具體的實施方案中，L₁與D有義鏈3’末端藉由磷酸酯基團或硫代磷酸酯基團間接連接。在一些實施方案中，為了促進siRNA進入細胞，可以在siRNA有義鏈的末端引入膽固醇等親脂性的基團，親脂性的基團包括以共價鍵與小干擾核酸結合，如末端引入膽固醇、脂蛋白、維生素E等，以利於藉由由脂質雙分子層構成的細胞膜與細胞內的mRNA發生作用。同時，siRNA也可以進行非共價鍵修飾，如藉由疏水鍵或離子鍵結合磷脂分子、多肽、陽離子聚合物等增加穩定性和生物學活性。

組成物

本公開另一方面提供一種組成物，其包含上述綴合物，和一種或多種藥學上可接受的賦形劑，例如載劑、運載體、稀釋劑、和/或遞送聚合物。

本公開還提供了一種醫藥組成物，其包含本公開的siRNA或siRNA綴合物。

在一些實施方案中，該醫藥組成物中還可以包含藥學上可接受的輔料和/或佐劑，該輔料可以為一種或多種本領域常規採用的各種製劑或化合物。例如，該藥學上可接受的輔料可以包括pH緩衝劑、保護劑和滲透壓調節劑中的至少一種。

用途和方法

本公開另一方面提供一種上述綴合物或含有綴合物的組成物在製備治療受試者疾病的藥物中的用途，在一些實施方案中該疾病選自肝源性疾病。

本公開另一方面提供一種治療受試者疾病的法，包括向受試者給予上述綴合物，或組成物。

本公開另一方面提供一種抑制受試者體內mRNA表達的方法，該方法包括給予受試者上述綴合物，或組成物。

本公開另一方面提供一種體內遞送表達抑制性寡聚化合物至肝臟的方法，給與受試者上述綴合物，或組成物。

本文所公開的綴合物、組成物和方法可以在細胞、細胞群、細胞群、組織或受試者中降低靶mRNA的水平，包括：向受試者給予治療有效量的本文所述的表達抑制性寡聚合物，該表達抑制性寡聚合物與靶向配體連接，從而抑制靶mRNA在受試者中的表達。

在一些實施方式中，該受試者已在先前被鑑定為在靶向的細胞或組織中具有靶基因的病原性上調。

本公開中所述的受試者是指患有將會受益於靶mRNA表達之減少或抑制的疾病或病症的受試者。

遞送可以是藉由局部給藥(例如，直接注射、植入、或局部給予)，全身給藥，或皮下，靜脈內，腹膜內，或胃腸外途徑，包括顱內(例如，心室內，實質內和鞘內)，肌肉內，透皮，氣道(氣溶膠)，鼻，口服，直腸，或局部(包括口頰和舌下)給藥。

可選的實施方案中，本公開提供的醫藥組成物可以藉由注射給予，例如，靜脈內、肌內、皮內、皮下、十二指腸內或腹膜內注射。

可選的實施方案中，該綴合物可被包裝在試劑盒中。

在一些實施方案中，上述siRNA綴合物或醫藥組成物當接觸到表達靶基因的細胞時，由例如：psiCHECK活性篩選和螢光素酶報告基因檢測法，其他如PCR或基於分支DNA(bDNA)的方法、或基於蛋白質的方法，如免疫螢光分析法，例如Western Blot或流式細胞術測定的，上述siRNA綴合物或醫藥組成物會抑制靶基因的表達至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%。

在一些實施方案中，上述siRNA綴合物或醫藥組成物當接觸到表達靶基因的細胞時，由例如：psiCHECK活性篩選和螢光素酶報告基因檢測法，其他如PCR或基於分支DNA(bDNA)的方法、或基於蛋白質的方法，如免疫螢光分析法，例如Western Blot或流式細胞術測定的，上述siRNA綴合物或醫藥組成物引起的靶基因mRNA剩餘表達百分比為不高於99%、不高於95%、不高於90%、不高於85%、不高於80%、不高於75%、不高於70%、不高於65%、不高於60%、不高於55%、不高於50%、不高於45%、不高於40%、不高於35%、不高於30%、不高於25%、不高於20%、不高於15%、或不高於10%。

在一些實施方案中，siRNA綴合物或醫藥組成物當接觸到表達靶基因的細胞時，由例如：psiCHECK活性篩選和螢光素酶報告基因檢測法，其他如PCR或基於分支DNA(bDNA)的方法、或基於蛋白質的方法，如免疫螢光分析法，例如Western Blot、或流式細胞術測定的，siRNA綴合物在保持在靶活性的同時，將脫靶活性減少了至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%或至少75%。

在一些實施方案中，siRNA綴合物或醫藥組成物當接觸到表達靶基因的細胞時，由例如：psiCHECK活性篩選和螢光素酶報告基因檢測法，其他如PCR或基於分支DNA(bDNA)的方法、或基於蛋白質的方法，如免疫螢光分析法，例如Western Blot、或流式細胞術測定的，siRNA綴合物使在靶活性降低至多20%、至多19%、至多15%、至多10%、至多5%或超過1%的同時，將脫靶活性減少了至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%或至少75%。

在一些實施方案中，siRNA綴合物或醫藥組成物當接觸到表達靶基因的細胞時，由例如：psiCHECK活性篩選和螢光素酶報告基因檢測法，其他如PCR或基於分支DNA(bDNA)的方法、或基於蛋白質的方法，如免疫螢光分析法，例如Western Blot、或流式細胞術測定的，siRNA綴合物使在靶活性提高至少1%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%或至少80%的同時，將脫靶活性減少了至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%或至少75%。

本公開還提供了一種用於沉默細胞中靶基因或靶基因的mRNA的方法，該方法包括將本公開的siRNA、siRNA綴合物和/或醫藥組成物引入該細胞中的步驟。

本公開還提供了一種用於在體內或在體外沉默細胞中靶基因或靶基因的mRNA的方法，該方法包括將根據本公開的siRNA、siRNA綴合物和/或醫藥組成物引入該細胞中的步驟。

本公開還提供了一種用於抑制靶基因或靶基因的mRNA表達的方法，該方法包括向有其需要的受試者施用有效量或有效劑量的根據本公開的siRNA、siRNA綴合物和/或醫藥組成物。

在一些實施方案中，施用藉由包括肌肉內、支氣管內、胸膜內、腹膜內、動脈內、淋巴、靜脈內、皮下、腦脊髓、或其組合的給藥方式進行。

在一些實施方案中，siRNA、siRNA綴合物和/或醫藥組成物的有效量或有效劑量為約0.001mg/kg體重至約200mg/kg體重、約0.01mg/kg體重至約100mg/kg體重或約0.5mg/kg體重至約50mg/kg體重。

在一些實施方案中，靶基因是乙肝病毒(HBV)基因、血管生成素樣蛋白-3(ANGPTL3)基因或甲狀腺素轉運蛋白(TTR)基因。

本公開還提供了前述siRNA和/或醫藥組成物和/或siRNA綴合物在製備用於預防和/或治療由乙肝病毒所引起的病理學病症和疾病的藥物中的用途。

本公開還提供了前述siRNA和/或醫藥組成物和/或siRNA綴合物在製備用於預防和/或治療乙肝的藥物中的應用。

本公開還提供了一種治療乙肝的方法，該方法包括將前述siRNA和/或醫藥組成物和/或siRNA綴合物給予有需要的患者。

本公開還提供了一種抑制感染慢性HBV的肝炎細胞中HBV基因表達的方法，該方法包括將有效量或有效劑量的前述siRNA和/或醫藥組成物和/或siRNA綴合物導入該感染慢性HBV的肝炎細胞。

本公開還提供了前述siRNA和/或醫藥組成物和/或siRNA綴合物在製備用於預防和/或治療哺乳動物(例如人類)中由ANGPTL3基因或TTR基因表達異常所引起的病理學病症和疾病的藥物中的用途。

本公開還提供了一種治療由ANGPTL3基因或TTR基因表達異常所引起的病理學病症和疾病的方法，其包括施用有效量或有效劑量的前述siRNA和/或醫藥組成物和/或siRNA綴合物。

ANGPTL3基因表達異常所引起的病理學病症和疾病包括心血管疾病和/或代謝疾病，例如高脂血症、高甘油三酯血症、高膽固醇血症、肥胖症、糖尿病和/或缺血性心臟病。

TTR基因表達異常所引起的病理學病症和疾病包括感官神經病(例如遠肢感覺異常、感覺減退)、自主神經病(例如，胃腸功能失調，如胃潰瘍，或體位性低血壓)、運動神經病、癲癇發作、癡呆、脊髓病、多神經病、腕管綜合症、自主缺陷、心肌病、玻璃體混濁、腎功能不全、腎病、mBMI實質降低(體重指數改變)、腦神經機能障礙和格子狀角膜營養不良。

在一些實施方案中，前述siRNA和/或醫藥組成物和/或siRNA綴合物在調節肝臟中表達的基因，或者在治療肝細胞中基因異常表達而引起的病理狀況或疾病中，表現出優異的在靶活性和降低的脫靶活性。在肝臟中表達的基因包括但不限於ApoB、ApoC、ANGPTL3、PCSK9、SCD1、TIMP-1、Col1A1、FVII、STAT3、p53、HBV、HCV等基因。在一些實施方式中，該特定基因選自乙型肝炎病毒基因、血管生成素樣蛋白 3基因或者載脂蛋白C3基因。相應地，該疾病選自慢性肝病、肝炎、肝纖維化疾病、肝增生性疾病和血脂異常。在一些實施方案中，該血脂異常為高膽固醇血症、高甘油三酯血症或動脈粥樣硬化。

在一些實施方案中，前述siRNA、siRNA綴合物和/或醫藥組成物也可以用於治療其他肝臟疾病，包括以不需要的細胞增殖為特徵的疾病、血液疾病、代謝疾病和以炎症為特徵的疾病。肝臟的增殖疾病可以是良性或惡性疾病，例如癌症、肝細胞癌(HCC)、肝轉移或肝母細胞瘤。肝臟血液學或炎症疾病可以是涉及凝血因子、補體介導的炎症或纖維化的疾病。肝臟的代謝疾病包括血脂異常和葡萄糖調節的不規則性。

宿主細胞

本公開還提供了一種細胞，其包含本公開的siRNA或siRNA綴合物。

試劑盒

本公開還提供了一種試劑盒，其包含本公開的siRNA或siRNA綴合物。

中間體

本公開還提供了一種式(II)所示的化合物或其互變異構體，

其中，Y選自O、NH和S；

J₂為H或C₁-C₆烷基；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

Q’₁為

，Q₂為R₂；或者Q₁為R₂，Q’₂為

；

J₁為H或C₁-C₆烷基；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

B是鹼基或鹼基類似物；和

W是離去基團，Z是含磷活性反應基團。

在一些實施方案中，W是MMTr或DMTr。

在一些實施方案中，Z是

。

在一些實施方案中，上述化合物不是

，其中W，B，Z如上所定義。

在一些實施方案中，當X為NH-CO時，R₁不是H。

在一些實施方案中，上述化合物不是：

在一些實施方案中，上述化合物不是：

和

，其中Z如上所定義。

在一些實施方案中，式(II)所示的化合物或其互變異構體具體為：式(II-1)所示的化合物或其互變異構體，

其中，Y選自O、NH和S；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或C₁-C₆烷基；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

B是鹼基或鹼基類似物；和

W是離去基團，Z是含磷活性反應基團。

在一些實施方案中，W是MMTr或DMTr。

在一些實施方案中，Z是

。

在一些實施方案中，上述化合物不是

，其中W，B，Z如上所定義。

在一些實施方案中，當X為NH-CO時，R₁不是H。

在一些實施方案中，上述化合物不是：

在一些實施方案中，上述化合物不是：

和

，其中Z如上所定義。

在一些實施方案中，式(II)所示的化合物或其互變異構體具體為：式(II-2)所示的化合物或其互變異構體，

其中，Y選自O、NH和S；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或C₁-C₆烷基；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

B是鹼基或鹼基類似物；和

W是離去基團，Z是含磷活性反應基團。

在一些實施方案中，W是MMTr或DMTr。

在一些實施方案中，Z是

。

在一些實施方案中，上述化合物不是

，其中W，B，Z如上所定義。

在一些實施方案中，當X為NH-CO時，R₁不是H。

在一些實施方案中，上述化合物不是：

在一些實施方案中，上述化合物不是：

和

，其中Z如上所定義。

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或C₁-C₃烷基；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或甲基；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或甲基；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

n=0或1；m=0或1；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H；

R₁選自H、甲基和CH₂OH；

R₂選自H、OH、NH₂、甲基和CH₂OH；

R₃選自H、OH、NH₂、甲基和CH₂OH；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

n=0或1；m=0或1；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H；

R₁選自H、甲基和CH₂OH；

R₂選自H、甲基和CH₂OH；

R₃選自H、OH、NH₂、甲基和CH₂OH；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

在一些實施方案中，上述化合物包括但不限於：

以及它們中的腺嘌呤被置換為鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶的那些化合物。

本公開還提供了一種式(III)所示的化合物或其互變異構體，

其中，Y選自O、NH和S；

J₂為H或C₁-C₆烷基；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

Q”₁為

，Q₂為R₂；或者Q₁為R₂，Q”₂為

；

J₁為H或C₁-C₆烷基；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

B是鹼基或鹼基類似物；和

W是離去基團。

在一些實施方案中，W是MMTr或DMTr。

在一些實施方案中，上述化合物不是

，其中W和B如上所定義。

在一些實施方案中，當X為NH-CO時，R₁不是H。

在一些實施方案中，上述化合物不是以下的化合物中的一種或多種：

在一些實施方案中，式(III)所示的化合物或其互變異構體具體為：式(III-1)所示的化合物或其互變異構體，

其中，Y選自O、NH和S；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或C₁-C₆烷基；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

B是鹼基或鹼基類似物；和

W是離去基團。

在一些實施方案中，W是MMTr或DMTr。

在一些實施方案中，上述化合物不是

，其中W和B如上所定義。

在一些實施方案中，當X為NH-CO時，R₁不是H。

在一些實施方案中，式(III)所示的化合物不是以下的化合物中的一種或多種：

在一些實施方案中，式(III)所示的化合物或其互變異構體具體為：式(III-2)所示的化合物或其互變異構體，

其中，Y選自O、NH和S；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或C₁-C₆烷基；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

B是鹼基或鹼基類似物；和

W是離去基團。

在一些實施方案中，W是MMTr或DMTr。

在一些實施方案中，上述化合物不是

，其中W和B如上所定義。

在一些實施方案中，當X為NH-CO時，R₁不是H。

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或C₁-C₃烷基；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或甲基；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

n=0、1或2；m=0、1或2；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或甲基；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

n=0或1；m=0或1；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H；

R₁選自H、甲基和CH₂OH；

R₂選自H、OH、NH₂、甲基和CH₂OH；

R₃選自H、OH、NH₂、甲基和CH₂OH；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

n=0或1；m=0或1；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H；

R₁選自H、甲基和CH₂OH；

R₂選自H、甲基和CH₂OH；

R₃選自H、OH、NH₂、甲基和CH₂OH；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

另一些實施方案中，B選自腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶。

在一些實施方案中，上述化合物包括但不限於：

以及它們中的腺嘌呤被置換為鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶的那些化合物，和

以及它們中的鹼基或鹼基類似物被置換為嘌呤、腺嘌呤、鳥嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、6-二甲基胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚或3-硝基吡咯的那些化合物。

本公開還提供了一種siRNA或siRNA綴合物，其特徵在於以2’-甲氧基修飾，替換本公開任一siRNA或siRNA綴合物的反義鏈式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾。

本公開還提供了一種siRNA或siRNA綴合物，其特徵在於本公開任一siRNA或siRNA綴合物中反義鏈所含式(I)所示的化學修飾為2’-甲氧基修飾。本公開還提供了一種siRNA或siRNA綴合物，該反義鏈在其5’區域的第2位至第8位中的至少一個核苷酸包含修飾，該修飾為式(I)所示的化學修飾或互變異構體修飾。

本公開還提供了一種siRNA或siRNA綴合物，其特徵在於以鹼基T，替換本公開任一siRNA或siRNA綴合物的一個或多個鹼基U，例如1個、2個、3個、3個、5個、6個、7個、8個、9個、10個。

本公開還提供了一種製備前述siRNA或siRNA綴合物的方法，其包括以下步驟：(1)合成式(II)所示的化合物或其互變異構體；(2)利用步驟(1)的化合物或其互變異構體合成前述siRNA或siRNA綴合物。

在一些實施方案中，利用式(III)所示的化合物或其互變異構體合成式(II)所示的化合物或其互變異構體。

本公開還提供了上述的式(II)所示的化合物或其互變異構體在抑制或減少siRNA脫靶活性中的用途。

本公開還提供了上述的式(II)所示的化合物或其互變異構體在製備siRNA中的用途。

術語

為了更容易理解本公開，以下具體定義了一些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本公開所屬技術領域具有通常知識者通常理解的含義。

在不指明構型的情況下，本公開化合物可以存在特定的幾何或立體異構體形式。本公開設想所有的這類化合物，包括順式和反式異構體、(-)-和(+)-對對映體、(R)-和(S)-對映體、非對映異構體、(D)-異構體、(L)-異構體，及其外消旋混合物和其他混合物，例如對映異構體或非對映體富集的混合物，所有這些混合物都屬於本公開的範圍之內。烷基等取代基中可存在另外的不對稱碳原子。所有這些異構體以及它們的混合物，均包括在本公開的範圍之內。

另外，本公開的化合物和中間體還可以以不同的互變異構體形式存在，並且所有這樣的形式包含於本公開的範圍內。

術語“互變異構體”或“互變異構體形式”是指可經由低能壘互變的不同能量的結構異構體。例如，質子互變異構體(也稱為質子轉移互變異構體)包括經由質子遷移的互變，如酮-烯醇及亞胺-烯胺、內醯胺-內醯亞胺異構化。內醯胺-內醯亞胺平衡實例是在如下所示的A和B之間。

本公開中的所有化合物可以被畫成A型或B型。所有的互變異構形式在本公開的範圍內。化合物的命名不排除任何互變異構體。

本公開化合物可以是不對稱的，例如，具有一個或多個立體異構體。在不指明構型的情況下，所有立體異構體都包括，如對映異構體和非對映異構體。本公開的含有不對稱碳原子的化合物可以以光學活性純的形式或外消旋形式被分離出來。光學活性純的形式可以從外消旋混合物拆分，或藉由使用手性原料或手性試劑合成。

可以藉由的手性合成或手性試劑或者其他常規技術製備光學活性的(R)-和(S)-異構體以及D和L異構體。如果想得到本公開某化合物的一種對映體，可以藉由不對稱合成或者具有手性助劑的衍生作用來製備，其中將所得非對映體混合物分離，並且輔助基團裂開以提供純的所需對映異構體。或者，當分子中含有鹼性官能團(如胺基)或酸性官能團(如羧基)時，與適當的光學活性的酸或鹼形成非對映異構體的鹽，然後藉由本領域所公知的常規方法進行非對映異構體拆分，然後回收得到純的對映體。此外，對映異構體和非對映異構體的分離通常是藉由使用色譜法完成的，該色譜法採用手性固定相，並任選地與化學衍生法相結合(例如由胺生成胺基甲酸鹽)。

本公開還包括一些與本文中記載的那些相同的，但一個或多個原子被原子量或質量數不同於自然中通常發現的原子量或質量數的原子置換的同位素標記的本公開化合物。可結合到本公開化合物的同位素的實例包括氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟、碘和氯的同位素，諸如分別為²H、³H、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹³N、¹⁵N、¹⁵O、¹⁷O、¹⁸O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F、¹²³I、¹²⁵I和³⁶Cl等。

除另有說明，當一個位置被特別地指定為氘(D)時，該位置應理解為具有大於氘的天然豐度(其為0.015%)至少1000倍的豐度的氘(即，至少10%的氘摻入)。示例中化合物的具有大於氘的天然豐度可以是至少1000倍的豐度的氘、至少2000倍的豐度的氘、至少3000倍的豐度的氘、至少4000倍的豐度的氘、至少5000倍的豐度的氘、至少6000倍的豐度的氘或更高豐度的氘。本公開還包括各種氘化形式的式I化合物。與碳原子連接的各個可用的氫原子可獨立地被氘原子替換。所屬技術領域具有通常知識者能夠參考相關文獻合成氘化形式的式I化合物。在製備氘代形式的式I化合物時可使用市售的氘代起始物質，或它們可使用常規技術採用氘代試劑合成，氘代試劑包括但不限於氘代硼烷、三氘代硼烷四氫呋喃溶液、氘代氫化鋰鋁、氘代碘乙烷和氘代碘甲烷等。

“任選地”或“任選”是指意味著隨後所描述的事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如“任選的被鹵素或者氰基取代的C_1-6烷基”是指鹵素或者氰基可以但不必須存在，該說明包括烷基被鹵素或者氰基取代的情形和烷基不被鹵素和氰基取代的情形。

本公開所述化合物的化學結構中，鍵“

”表示未指定構型，即如果化學結構中存在手性異構體，鍵“

”可以為“

”或“

”，或者同時包含“

”和“

”兩種構型。雖然為簡便起見將全部上述結構式畫成某些異構體形式，但是本公開可以包括所有的異構體，如互變異構體、旋轉異構體、幾何異構體、非對映異構體、外消旋體和對映異構體。本公開所述化合物的化學結構中，鍵“

”並未指定構型，即鍵“

”的構型可以為E型或Z型，或者同時包含E和Z兩種構型。

如無特殊說明，本公開的“化學修飾”、“化合物”、“配體”、“綴合物”、“核酸”均可獨立地以鹽、混合鹽或非鹽(例如游離酸或游離鹼)的形式存在。當以鹽或混合鹽的形式存在時，其可為藥學上可接受的鹽。

術語“藥學上可接受的鹽”包括藥學上可接受的酸加成鹽和藥學上可接受的鹼加成鹽。

“藥學上可接受的酸加成鹽”是指能夠保留游離鹼的生物有效性而無其它副作用的，與無機酸或有機酸所形成的鹽。無機酸鹽包括但不限於鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等；有機酸鹽包括但不限於甲酸鹽、乙酸鹽、2,2-二氯乙酸鹽、三氟乙酸鹽、丙酸鹽、己酸鹽、辛酸鹽、癸酸鹽、十一碳烯酸鹽、乙醇酸鹽、葡糖酸鹽、乳酸鹽、癸二酸鹽、己二酸鹽、戊二酸鹽、丙二酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、油酸鹽、肉桂酸鹽、月桂酸鹽、蘋果酸鹽、谷胺酸鹽、焦谷胺酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、海藻酸鹽、抗壞血酸鹽、水楊酸鹽、4-胺基水楊酸鹽、萘二磺酸鹽等。這些鹽可藉由本領域已知的方法製備。

“藥學上可接受的鹼加成鹽”是指能夠保持游離酸的生物有效性而無其它副作用的、與無機鹼或有機鹼所形成的鹽。衍生自無機鹼的鹽包括但不限於鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、錳鹽、鋁鹽等。較佳的無機鹽為銨鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽及鎂鹽，較佳鈉鹽。衍生自有機鹼的鹽包括但不限於以下的鹽：伯胺類、第二胺類及第三胺類，被取代的胺類，包括天然的被取代胺類、環狀胺類及鹼性離子交換樹脂，例如胺、異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二甲基乙醇胺、2-二甲胺基乙醇、2-二乙胺基乙醇、二環己胺、賴胺酸、精胺酸、組胺酸、咖啡因、普魯卡因、膽鹼、甜菜鹼、乙二胺、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可鹼、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺樹脂等。較佳的有機鹼包括異丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二環己基胺、膽鹼及咖啡因。這些鹽可藉由本領域已知的方法製備。

術語“連接”，當表示兩個分子之間的聯繫時，指兩個分子藉由共價鍵連接或者兩個分子經由非共價鍵(例如，氫鍵或離子鍵)關聯，包括直接連接、間接連接。

術語“直接連接”指第一化合物或基團與第二化合物或基團在沒有任何間插原子或原子基團的情況下連接。

術語“間接連接”指第一化合物或基團與第二化合物或基團藉由中間基團、化合物或分子(例如，連接基團)連接。

如本文所使用的，在RNA介導的基因沉默的情形中，siRNA的有義鏈(又稱正義鏈、SS或SS鏈)是指包含與靶mRNA序列相同或基本上相同的序列的鏈；siRNA的反義鏈(又稱AS或AS鏈)是指具有與靶mRNA序列互補的序列的鏈。

如本文所使用的，術語“互補”或“反向互補”一詞可互相替代使用，並具有所屬技術領域具有通常知識者周知的含義，即，在雙鏈核酸分子中，一條鏈的鹼基與另一條鏈上的鹼基以互補的方式相配對。在DNA中，嘌呤鹼基腺嘌呤(A)始終與嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)(或者在RNA中為尿嘧啶(U))相配對；嘌呤鹼基鳥嘌呤(C)始終與嘧啶鹼基胞嘧啶(G)相配對。每個鹼基對都包括一個嘌呤和一個嘧啶。當一條鏈上的腺嘌呤始終與另一條鏈上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配對，以及鳥嘌呤始終與胞嘧啶配對時，兩條鏈被認為是彼此相互補的，以及從其互補鏈的序列中可以推斷出該鏈的序列。與此相應地，“錯配”在本領域中意指在雙鏈核酸中，對應位置上的鹼基並未以互補的形式配對存在。

術語“鹼基”包含任何已知的DNA和RNA鹼基、鹼基類似物，例如嘌呤或嘧啶，其還包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、次黃苷和天然類似物。

在本公開中，鹼基類似物一般為嘌呤或嘧啶鹼基，不包括常見鹼基：鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)。鹼基的非限制性實例包括次黃嘌呤(I)、黃嘌呤(X)、3β-D-呋喃核糖基-(2,6-二胺基嘧啶)(K)、3-β-D-呋喃核糖基-(1-甲基-吡唑并[4,3-d]嘧啶-5,7(4H,6H)-二酮)(P)、異胞嘧啶(iso-C)、異鳥嘌呤(iso-G)、1-β-D-呋喃核糖基-(5-硝基吲哚)、1-β-D-呋喃核糖基-(3-硝基吡咯)、5-溴尿嘧啶、2-胺基嘌呤、4-硫代-dT、7-(2-噻吩基)-咪唑并[4，5-b]吡啶(Ds)和吡咯-2-甲醛(Pa)、2-胺基-6-(2-噻吩基)嘌呤(S)、2-側氧吡啶(Y)、二氟甲苯基、4-氟-6-甲基苯并咪唑、4-甲基苯并咪唑、3-甲基羥基異喹啉基、5-甲基羥基異喹啉基和3-甲基-7-丙炔基羥基異喹啉基、7-氮雜吲哚基、6-甲基-7-氮雜吲哚基、咪唑并吡啶基、9-甲基-咪唑并吡啶基、吡咯並吡嗪基、羥基異喹啉基、7-丙炔基羥基異喹啉基、丙炔基-7-氮雜吲哚基、2,4,5-三甲基苯基、4-甲基吲哚基、4,6-二甲基吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、茋基(stilbenzyl)、并四苯基、并五苯基和其結構衍生物。鹼基類似物還可以是通用鹼基。

如本文所使用的，術語“通用鹼基”是指位於經過修飾的核苷酸中核苷酸糖部分的1'位或核苷酸糖部分取代物中等效位置的雜環部分，該雜環部分當存在於核酸雙鏈體中時，可與一種以上鹼基相對定位，同時不改變雙螺旋結構(例如，磷酸骨架的結構)。此外，通用鹼基不會破壞其所駐留的單鏈核酸與靶核酸形成雙鏈體的能力。含有通用鹼基的單鏈核酸與靶核酸形成雙鏈體的能力可藉由所屬技術領域具有通常知識者顯而易見的方法測定(例如，UV吸光度、圓二色性、凝膠遷移法、單鏈核酸酶敏感性等)。另外，可以改變能觀察到雙鏈體形成的條件，以確定雙鏈體穩定性或形成，例如，溫度，如解鏈溫度(Tm)，與核酸雙鏈體穩定性相關。相較於與靶核酸精確互補的參考單鏈核酸，含有通用鹼基的單鏈核酸與靶核酸形成的雙鏈體的Tm低於與互補核酸形成的雙鏈體。然而，與其中通用鹼基被鹼基置換而產生單一錯配的參考單鏈核酸相比較，含有通用鹼基的單鏈核酸與靶核酸形成的雙鏈體的Tm高於用具有錯配鹼基的核酸形成的雙鏈體。

一些通用鹼基能夠藉由在通用鹼基與所有鹼基鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)在鹼基配對條件下形成氫鍵，來實現鹼基配對。通用鹼基不是只與單一互補鹼基形成鹼基對的鹼基。在雙鏈體中，通用鹼基可與雙鏈體相對鏈上與之相對的G、C、A、T和U中每一者不形成氫鍵、形成一個氫鍵或形成一個以上氫鍵。較佳地，通用鹼基不與雙鏈體相對鏈上與之相對的鹼基相互作用。在雙鏈體中，與通用鹼基之間發生的鹼基配對不會改變磷酸骨架的雙螺旋結構。通用鹼基也可以借助堆疊相互作用與相同核酸鏈上的相鄰核苷酸中的鹼基相互作用。這種堆疊相互作用可使雙鏈體穩定，尤其是在通用鹼基不與雙鏈體相對鏈上與之相對定位的鹼基形成任何氫鍵的情形中。通用結合核苷酸的非限制性實例包括肌苷、1-β-D-呋喃核糖基-5-硝基吲哚和/或1-β-D-呋喃核糖基-3-硝基吡咯。

如本文所使用，“化學修飾”或“修飾”包括核苷酸經化學手段的所有改變，例如化學部分的添加或去除、或以一個化學部分取代另一個化學部分。

在本公開的化學結構式中，波浪線“

”表示連接位點；星號“*”表示手性中心。

本公開上下文中，基團

中的

部分可以替換為能夠與相鄰核苷酸實現連接的任意基團。

術語“烷基”指飽和脂肪族烴基團，其為包含1至20個碳原子的直鏈或支鏈基團，例如含有1至12個碳原子的烷基、含有1至6個碳原子的烷基。烷基的非限制性實例包括但不限於：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、第二丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基或2,3-二甲基丁基。

術語“烷氧基”指-O-烷基，其中烷基的定義如上所述。烷氧基的非限制性實例包括但不限於：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、環丙氧基、環丁氧基、環戊氧基、環己氧基。C₁-C₆烷氧基可以是任選取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、羧基或羧酸酯基。

術語“烯基”是指含有至少一個雙鍵的烴基。烯基的非限制性實例包括但不限於：乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基或2-丁烯基及其各種支鏈異構體。

術語“炔基”指含有至少一個三鍵的烴基。炔基的非限制性實例包括但不限於：乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基或2-丁炔基及其各種支鏈異構體。

術語“鹵素”指氟、氯、溴或碘。

本公開中，“R₁和R₂直接相連成環”中的“環”可為“環烷基”或“雜環烷基”。

其中，術語“環烷基”可稱為“碳環”，指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，環烷基環包含3至20個碳原子，在一些實施方案中選自包含3至7個碳原子，在一些實施方案中為包含5至6個碳原子。單環環烷基的非限制性實例包括環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基、環己烯基、環己二烯基等；多環環烷基包括螺環、稠環和橋環的環烷基。環烷基可以是取代的或未取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，在一些實施方案中選自一個或多個以下基團，獨立地選自鹵素、氘、羥基、側氧、硝基、氰基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_2-6烯氧基、C_2-6炔氧基、C_3-6環烷氧基、3至6員雜環烷氧基、C_3-8環烯氧基、5至6員芳基或雜芳基，該C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_2-6烯氧基、C_2-6炔氧基、C_3-6環烷氧基、3至6員雜環烷氧基、C_3-8環烯氧基、5至6員芳基或雜芳基任選被一個或多個選自鹵素、氘、羥基、側氧、硝基、氰基所取代。

該環烷基環可以稠合於芳基或雜芳基環上，其中與母體結構連接在一起的環為環烷基，非限制性實例包括茚滿基、四氫萘基、苯并環庚烷基等。環烷基可以是任選取代的或非取代的，當被取代時，取代基在一些實施方案中選自一個或多個以下基團，其獨立地選自鹵素、氘、羥基、側氧、硝基、氰基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_2-6烯氧基、C_2-6炔氧基、C_3-6環烷氧基、3至6員雜環烷氧基、C_3-8環烯氧基、5至6員芳基或雜芳基，該C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_2-6烯氧基、C_2-6炔氧基、C_3-6環烷氧基、3至6員雜環烷氧基、C_3-8環烯氧基、5至6員芳基或雜芳基任選被一個或多個選自鹵素、氘、羥基、側氧、硝基、氰基所取代。

術語“雜環烷基”又稱為“雜環”或“雜環基”，指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，其包含3至20個環原子，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)_m(其中m是整數0至2)的雜原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的環部分，其餘環原子為碳。在一些實施方案中選自包含3至12個環原子，其中1~4個是雜原子；在一些實施方案中選自包含3至7個環原子。單環雜環烷基的非限制性實例包括吡咯烷基、咪唑烷基、四氫呋喃基、四氫噻吩基、二氫咪唑基、二氫呋喃基、二氫吡唑基、二氫吡咯基、哌啶基、哌嗪基、嗎啉基、硫代嗎啉基、高哌嗪基等。多環雜環烷基包括螺環、稠環和橋環的雜環烷基。“雜環烷基”非限制性實例包括：

，等等。

該雜環烷基環可以稠合於芳基或雜芳基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜環烷基，其非限制性實例包括：

和

等。

雜環烷基可以是任選取代的或非取代的，當被取代時，取代基在一些實施方案中選自一個或多個以下基團，其獨立地選自鹵素、氘、羥基、側氧、硝基、氰基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_2-6烯氧基、C_2-6炔氧基、C_3-6環烷氧基、3至6員雜環烷氧基、C_3-8環烯氧基、5至6員芳基或雜芳基，該C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_2-6烯氧基、C_2-6炔氧基、C_3-6環烷氧基、3至6員雜環烷氧基、C_3-8環烯氧基、5至6員芳基或雜芳基任選被一個或多個選自鹵素、氘、羥基、側氧、硝基、氰基所取代。

在本公開上下文中，Bz表示苯甲醯基保護基；MMTr表示甲氧基苯基二苯甲基；DMTr表示二甲氧三苯甲基保護基。

如無特別說明，在本公開上下文中，大寫字母C、G、U、A、T表示核苷酸的鹼基組成；小寫字母d表示該字母d右側相鄰的一個核苷酸為脫氧核糖核苷酸；小寫字母m表示該字母m左側相鄰的一個核苷酸為甲氧基修飾的核苷酸；小寫字母f表示該字母f左側相鄰的一個核苷酸為氟修飾的核苷酸；小寫字母s表示與該字母s左右相鄰的兩個核苷酸之間為硫代磷酸酯基連接。

如本文所使用的，術語“氟修飾的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羥基被氟取代形成的核苷酸，“非氟修飾的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羥基被非氟基團取代形成的核苷酸或核苷酸類似物。“核苷酸類似物”指能夠在核酸中代替核苷酸，但結構不同於腺嘌呤核糖核苷酸、鳥嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸的基團。如異核苷酸、橋聯的核苷酸(bridged nucleic acid，簡稱BNA)或無環核苷酸。該甲氧基修飾的核苷酸指核糖基的2'-羥基被甲氧基取代而形成的核苷酸。異核苷酸是指核苷酸中鹼基在核糖環上的位置發生改變而形成的化合物。在一些實施方式中，異核苷酸可以是鹼基從核糖環的1'-位移動至2'-位或3'-位而形成的化合物。BNA是指受約束的或不能接近的核苷酸。BNA可以含有五員環、六員環、或七員環的具有“固定的”C3'-內切糖縮攏的橋聯結構。通常將該橋摻入到該核糖的2'-、4'-位處以提供一個2',4'-BNA核苷酸。在一些實施方式中，BNA可以是LNA、ENA、cET BNA等。無環核苷酸是核苷酸的糖環被打開形成的一類核苷酸。在一些實施方式中，無環核苷酸可以是解鎖核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)。

如本文所使用的，術語“抑制”，可以與“減少”、“沉默”、“下調”、“阻抑”和其他類似術語交替使用，並且包括任何水平的抑制。抑制可藉由這些變量中的一個或多個與對照水平相比的絕對或相對水平的減少來評估。該對照水平可以是本領域中使用的任何類型的對照水平，例如給藥前基線水平或從類似的未經處理或經對照(例如僅緩衝液對照或惰性劑對照)處理的受試者、細胞、或樣品確定的水平。例如，可以採用mRNA剩餘表達量來表徵siRNA對靶基因表達的抑制程度，如mRNA剩餘表達量為不高於99%、不高於95%、不高於90%、不高於85%、不高於80%、不高於75%、不高於70%、不高於65%、不高於60%、不高於55%、不高於50%、不高於45%、不高於40%、不高於35%、不高於30%、不高於25%、不高於20%、不高於15%、或不高於10%。靶基因表達的抑制率可以採用Dual-Glo® Luciferase Assay System檢測，分別讀取螢火蟲(Firfly)化學發光值和海腎(Renilla)化學發光值，計算相對值Ratio=Ren/Fir，抑制率(%)=1-(Ratio+siRNA/Ratioreporter only)*100%；本公開中，剩餘mRNA表達量比例(或剩餘活性%)=100%-抑制率(%)。

“有效量”或“有效劑量”指指獲得任一種或多種有益的或所需的治療結果所必需的藥物、化合物或醫藥組成物的量。對於預防用途，有益的或所需的結果包括消除或降低風險、減輕嚴重性或延遲病症的發作，包括病症、其併發症和在病症的發展過程中呈現的中間病理表型的生物化學、組織學和/或行為症狀。對於治療應用，有益的或所需的結果包括臨床結果，諸如減少各種本公開靶基因、靶mRNA或靶蛋白相關病症的發病率或改善該病症的一個或更多個症狀，減少治療病症所需的其它藥劑的劑量，增強另一種藥劑的療效，和/或延緩患者的本公開靶基因、靶mRNA或靶蛋白相關病症的進展。

如本文所用，術語“血管生成素樣蛋白-3”(又名“ANGPTL3”或“ANGPTL3”)可以表示ANGPTL3的任何核酸或蛋白質。人ANGPTL3的序列登錄號為NP_055310。“ANGPTL3表達”是指從編碼ANGPTL3的基因轉錄的mRNA的水平或從mRNA翻譯的蛋白質的水平。

如本文所使用，術語“甲狀腺素轉運蛋白”(“TTR”)又名ATTR、HsT2651、PALB、前清蛋白、TBPA和運甲狀腺素蛋白(前清蛋白，澱粉樣變性類型I)可以表示TTR的任何核酸或蛋白質。人TTR mRNA轉錄物的序列登錄號為NM_000371。“TTR表達”是指從編碼TTR的基因轉錄的mRNA的水平或從mRNA翻譯的蛋白質的水平。

“醫藥組成物”包含本公開的siRNA或siRNA綴合物以及藥學上可接受的輔料和/或佐劑，該輔料可以為一種或多種本領域常規採用的各種製劑或化合物。例如，該藥學上可接受的輔料可以包括pH緩衝劑、保護劑和滲透壓調節劑中的至少一種。

如本文所使用的，“患者”、“受試者”或“個體”可互換使用，包括人類或者非人類動物，例如哺乳動物，例如人或猴。

各種遞藥系統是已知的並且可以用於本公開siRNA或siRNA綴合物，例如封裝在脂質體中、微粒、微囊、能夠表達該化合物的重組細胞、受體介導的細胞內吞作用、構建核酸作為逆轉錄病毒或其他載體的一部分。

本公開提供的siRNA可以藉由本領域常規的製備方法(例如固相合成和液相合成的方法)得到。其中，固相合成已經有商業化訂制服務。可以藉由使用具有相應修飾的核苷單體來將修飾的核苷酸基團引入本公開所述的siRNA中，製備具有相應修飾的核苷單體的方法及將修飾的核苷酸基團引入siRNA的方法也是所屬技術領域具有通常知識者所熟知的。

圖1A至圖IL為包含不同待測化合物的siRNA的脫靶活性實驗結果。

圖2A至圖2G為包含不同待測化合物的siRNA2的脫靶活性實驗結果。

圖3A至圖3G為包含待測化合物的siRNA3脫靶活性實驗結果。

圖4為胺基半乳糖分子簇綴合siRNA對於鼠原代肝細胞mTTR基因抑制活性。

圖5為胺基半乳糖分子簇綴合siRNA對於小鼠mTTR基因的體內抑制活性。

圖6為胺基半乳糖分子簇綴合的siRNA對於小鼠mTTR基因的體內長效抑制活性。

圖7為siRNA試劑於Apoc3轉基因小鼠總膽固醇水平影響。

圖8為siRNA試劑於Apoc3轉基因小鼠甘油三酯水平影響。

圖9為siRNA試劑於Apoc3轉基因小鼠Apoc3蛋白水平影響。

以下結合實施例進一步描述本公開，但這些實施例並非限制本公開的範圍。本公開實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，則該試劑可自任意分子生物學試劑的供應商以用於分子生物學應用的質量/純度而獲得。

一、化學修飾的製備和活性評價

實施例1化學修飾的製備

1.1 合成化合物1-1a和化合物1-1b

將化合物1(500mg,3.42mmol)和三乙胺(Et₃N，692mg,6.84mmol,0.95mL)溶於二氯甲烷(DCM，10mL)中，冰浴下滴加4-甲苯磺醯氯(TsCl,717mg,3.76mmol)的二氯甲烷(10mL)溶液，滴加完畢後反應在室溫下攪拌過夜，待反應完畢後，用水淬滅，水相用二氯甲烷(15mL)提取三次，合併的有機相先用飽和碳酸氫鈉水溶液(10mL)洗滌，再用飽和食鹽水(20mL)洗滌，隨後減壓蒸乾溶劑得到粗品2(820mg,80%)，直接用於下一步反應。MS m/z：C₁₄H₂₁O₅S，[M+H]⁺理論：301.10實測：301.2。

將化合物3(239mg,1.22mmol)溶解於二甲基甲醯胺(DMF，10mL)中，冰浴下加入NaH(60%溶解在礦物油中，93mg,2.33mmol)溶液，該反應下攪拌30分鐘，然後滴加化合物2(350mg,1.16mmol)，滴加完畢後反應在60℃下攪拌5小時，反應完畢後，加水淬滅，水相用乙酸乙酯(15mL)提取三次，合併的有機相先用水(10mL)洗滌三次，再用飽和食鹽水(10mL)洗滌，隨後減壓蒸乾溶劑，經反相製備HPLC(C¹⁸，條件：5-50%(A：H₂O,B：CH₃CN)，流速：70mL/min)，凍乾後得到220mg化合物4。MS m/z：C₁₉H₂₁N₅O₃Na，[M+Na]⁺理論：390.16，實測：390.3。

室溫下將化合物4(1.50g,4.08mmol)溶解於20mL的醋酸和水(4：1)的混合溶液中，60℃下攪拌30分鐘，待反應完畢後減壓蒸乾溶劑，經反相製備HPLC(C¹⁸，條件：5-25%(A：H₂O,B：CH₃CN)，流速：70mL/min)，凍乾後得到1.10g化合物5。MS m/z：C₁₆H₁₈N₅O₃，[M+H]⁺理論：328.13，實測：328.4。

將化合物5(1.00g,3.05mmol)溶於吡啶(Py，10mL)中，冰浴下滴4,4'-雙甲氧基三苯甲基氯(DMTrCl,1.50g,4.58mmol)的吡啶(5mL)溶液，滴加完畢後反應在室溫下攪拌過夜，待反應完畢後，用水淬滅，減壓蒸乾溶劑，經反相製備HPLC(C¹⁸，條件：5-80%(A：H₂O,B：CH₃CN)，流速：70mL/min)，凍乾後得到1.00g化合物6。MS m/z：C₃₇H₃₆N₅O₅，[M-H]⁺理論：630.26，實測：630.5。消旋體化合物6經手性管柱(Daicel CHIRALPAK® IE 250*4.6mm,5μm,A：正己烷，B：乙醇)拆分得410mg 6A(-)和435mg 6B(+)。

將化合物6A(-)(200mg,0.32mmol)、四唑(11mg,0.16mmol)、N-甲基咪唑(5mg,0.06mmol)、3A分子篩(500mg)溶於10mL的乙腈中，室溫下加入化合物7(144mg,0.48mmol)，在室溫下攪拌過夜。反應完畢後，將分子篩過濾掉，加入二氯甲烷(30mL)，飽和碳酸氫鈉水溶液(10mL)洗滌三次，再用飽和食鹽水(20mL)洗滌，濾液旋乾並經反相製備HPLC(C¹⁸，條件：5-100%(A：水，B：CH₃CN)，流速：70mL/min)，凍乾後得到200mg化合物1-1a。MS m/z：C₄₀H₃₉N₆O₇P，[M-二異丙基 +OH]⁺理論：747.26，實測：747.6。1H NMR(400MHz，乙腈-d ₃)δ 7.56,7.54(2s,1H),7.36-7.27(m,2H),7.24-7.21(m,7H),6.83-6.80(m,4H),4.12-4.10(m,2H),3.75-3.68(m,10H),3.20-2.80(m,2H),2.68-2.54(m,4H),1.22-1.04(m,18H)。

將化合物6B(+)(200mg,0.32mmol)、四唑(11mg,0.16mmol)、N-甲基咪唑(5mg,0.06mmol)、3A分子篩(500mg)溶於10mL的乙腈中，室溫下加入化合物7(144mg,0.48mmol)，在室溫下攪拌過夜。反應完畢後，將分子篩過濾掉，加入二氯甲烷(30mL)，飽和碳酸氫鈉水溶液(10mL)洗滌三次，再用飽和食鹽水(20mL)洗滌，濾液旋乾並經反相製備HPLC(C¹⁸，條件：5-100%(A：水，B：CH₃CN)，流速：70mL/min)，凍乾後得到200mg化合物1-1b。MS m/z：C₄₀H₃₉N6O₇P，[M-二異丙基+OH]⁺理論：747.26，實測：747.5。

1.2 合成化合物1-2

將化合物1(2g,8.36mmol)溶解在DMF(20mL)中，室溫條件下，氬氣保護下緩慢加入NaH(0.37g,9.2mmol,60%溶解在礦物油中)。室溫攪拌2個小時後，將化合物2(3.3g,16.72mmol)加入到反應液中。室溫攪拌12h後，將反應液濃縮後，殘留物用乙醇(EtOH，50mL) 再結晶得到目標產物3A(1.3g，收率44.0%)(二氯甲烷：乙酸乙酯=2：1,Rf=0.2)和目標產物3B(0.6g，化合物1的混合物)(二氯甲烷：乙酸乙酯=2：1,Rf=0.18)。

將化合物3A(1.3g,3.68mmol)溶解在混合液三氟乙酸(TFA，4mL)和DCM(20mL)後，室溫攪拌12h，將反應液濃縮，得到的殘留物用反向管柱純化(C¹⁸,H₂O+乙腈)得到目標產物4(1g，收率91.44%)。MS m/z：C₃₉H₃₈N₆O₆，[M+H]⁺：687.5。

將化合物(D-Threoninol 5，1.2g,11.4mmol)溶解在吡啶(10mL)然後緩慢加入DMTrCl(4.64g,13.70mmol)的吡啶(15mL)溶液。室溫下攪拌16h後，將反應液用H₂O(10mL)淬滅並濃縮。將反應液濃縮，得到的殘留物用反向管柱純化(C¹⁸,H₂O+乙腈)得到目標產物6(4.0g，收率86.0%)。MS m/z：C₂₅H₂₉NO₄，[M+Na]⁺：430.4。

將化合物6(600mg,2.02mmol)、化合物4(822.5mg,2.02mmol)和二氫喹啉(EEDQ，998.2mg,4.04mmol)溶解在DCM(10mL)和甲醇(MeOH，5mL)中。該混合液室溫攪拌16h後，將固體濾掉，濾液用DCM(100mL)稀釋。有機相用H₂O(30mL)洗滌三次，用無水Na₂SO₄乾燥，過濾再濃縮。得到的殘留物用反向管柱純化(C¹⁸,H₂O+乙腈)得到目標產物7(780mg，收率56.3%)。MS m/z：C₃₉H₃₈N₆O₆，[M+H]⁺：687.5。

將化合物7(780mg,1.13mmol)、四唑(39.8mg,0.57mmol)、N-甲基咪唑(18.7mg,0.23mmol)溶解在CH₃CN(10mL)中，加入3A分子篩(700mg)。氬氣保護下室溫攪拌5min後，加入化合物8(513.5mg,1.70mmol)。室溫攪拌1h後，將分子篩過濾掉，固體用DCM(30mL)淋洗三次。濾液分別用飽和的NaHCO₃水溶液(30mL×4)和H₂O(30mL×4)洗滌；有機相在30℃下濃縮。得到殘留物用反向管柱純化(C¹⁸,H₂O+乙腈，乙腈90%)，凍乾後得到目標化合物1-2(700mg，收率69.5%)。MS m/z：C₄₈H₅₅N₈O₇P，[M-氰乙基-二異丙基+OH]^-：749.3。

1.3 合成化合物1-3

將化合物1(2g,8.36mmol)溶解在DMF(20mL)中，室溫條件下，氬氣保護下緩慢加入NaH(0.37g,9.2mmol,60%溶解在礦物油中)。室溫攪拌2個小時後，將化合物2(3.3g,16.72mmol)加入到反應液中。室溫攪拌12h後，將反應也濃縮後，殘留物用EtOH(50mL)再結晶得到目標產物3A(1.3g，收率44.0%)(二氯甲烷：乙酸乙酯=2：1,Rf=0.2)和目標產物3B(0.6g，化合物1的混合物)(二氯甲烷：乙酸乙酯=2：1,Rf=0.18)。

將化合物3A(1.3g,3.68mmol)溶解在混合液TFA(4mL)和DCM(20mL)後，室溫攪拌12h，將反應液濃縮，得到的殘留物用反向管柱純化(C¹⁸,H₂O+乙腈)得到目標產物4(1g，收率91.44%)。MS m/z：C₃₉H₃₈N₆O₆，[M+H]⁺：687.5。

將化合物L-蘇胺醇(L-Threoninol 5，1.2g,11.4mmol)溶解在吡啶(10mL)，然後緩慢加入DMTrCl(4.64g,13.70mmol)的吡啶(15mL)溶液。室溫下攪拌16h後，將反應液用H₂O(10mL)淬滅並濃縮。將反應液濃縮，得到的殘留物用反向管柱純化(C¹⁸,H₂O+乙腈)得到目標產物6(4.0g，收率86.0%)。MS m/z：C₂₅H₂₉NO₄，[M+Na]⁺：430.4。

將化合物6(600mg,2.02mmol)、化合物4(822.5mg,2.02mmol)、四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，1.15g,3.03mmol)和二異丙基乙胺 (DIEA，1mL,6.05mmol)溶解在DMF(10mL)中。室溫攪拌16h後，反應液過濾，濾液用DCM(100mL)稀釋。有機相用H₂O(30mL)洗三次，用無水Na₂SO₄乾燥，過濾，濃縮。得到的殘留物用反向管柱純化(C¹⁸,H₂O+乙腈，乙腈60%)，凍乾後得到目標化合物7(1.0g，收率72.1%)。MS m/z：C₃₉H₃₈N₆O₆，[M+H]⁺：687.5。

將化合物7(1.2g,1.75mmol)、四唑(61.2mg,0.87mmol)、N-甲基咪唑(28.7mg,0.35mmol)溶解在CH₃CN(10mL)中，加入3A分子篩(700mg)。氬氣保護下室溫攪拌5min後，加入化合物8(0.79g,2.62mmol)。室溫攪拌1h後，將分子篩過濾掉，固體用DCM(30mL)淋洗三次。濾液分別用飽和的NaHCO₃水溶液(30mL×4)和H₂O(30mL×4)洗。有機相在30℃下濃縮。得到殘留物用反向管柱純化(C¹⁸,H₂O+乙腈，乙腈90%)，凍乾後得到目標化合物1-3(1.2g，收率77.4%)。MS m/z：C₄₈H₅₅N₈O₇P，[M-氰乙基-二異丙基+OH]^-：749.3。

1.4 合成化合物1-4a和化合物1-4b

將化合物1A(6.73g,28.14mmol)溶解在乾燥的DMF(80mL)中，氬氣保護下緩慢加入NaH(60%,1.24g,30.95mmol)。該混合液室溫攪拌30min後，將該反應液加到溶有四(三苯基膦)鈀(Pd(PPh₃)₄，1.95 g,1.69mmol)、三苯基膦(PPh₃，0.74g,2.81mmol)和化合物1(4.0g,28.14mmol)的四氫呋喃(THF，60mL)溶液中。該反應液在55℃攪拌16h後，將固體濾掉並用DCM(60mL)洗滌三次。將濾液濃縮，得到的殘留物用正向管柱純化(先用乙酸乙酯，再用乙酸乙酯：甲醇(12：1沖洗管柱子)得目標產物2(7g，粗品)。

將化合物2(8g，粗品)和DMTrCl(12.65g,37.34mmol)溶解在吡啶(10mL)。該混合物室溫攪拌16h後，用水(80mL)淬滅並濃縮。得到的殘留物用反向管柱純化(C¹⁸，水+乙腈)凍乾後，得到目標化合物3(13g，收率83.7%)。

將化合物3(5g,8.02mmol)溶解在甲醇(MeOH，20mL)和氨水(6mL)中，該混合液室溫攪拌16h後，將反應液濃縮。得到的殘留物用正向管柱(DCM：MeOH=20：1)純化得到目標化合物4(4g，收率96.0%)。

氬氣保護下，0℃下將硼烷(BH₃)四氫呋喃溶液(1.0M溶解於THF中，38.54mL,38.54mmol)逐滴滴加到溶有化合物4(4.00g,7.71 mmol)的THF(12mL)溶液中。該化合物在氬氣保護下0℃攪拌6h後，逐滴滴加H₂O(27mL)。然後，將3M的NaOH水溶液(52mL,156mmol)0℃下逐滴加入反應液中後，再將30%的H₂O₂(106mL)的水溶液逐滴滴加反應液中，再加入EtOH(10mL)。該反應液室溫攪拌48h後，0℃下用飽和的Na₂S₂O₃緩慢加入，直到無氣泡產生。將H₂O(300mL)加到反應液中，用DCM(4×200mL)萃取。有機相用無水Na₂SO₄乾燥，過濾並濃縮。得到的殘留物用反向管柱純化(C¹⁸，乙腈+H2O,50%)，凍乾後得到目標產物5a(730mg，收率17.6%)和目標產物5b(1.1g,26.6%)。

將化合物5a(730mg,1.36mmol)溶解在吡啶(8mL)中，氬氣保護和室溫下加入TMSCl(0.67g,6.14mmol)。室溫攪拌1h後，BzCl(0.29mL,2.46mmol)加到反應液中。室溫攪拌16h後，反應液用H₂O(10mL)淬滅並濃縮。得到的殘留物溶解在THF(30mL)中，加入四丁基氟化銨(TBAF，1mL)。室溫攪拌1h後，將氨水(0.5mL)加入，室溫攪拌5h後。反應液用乙醇(EA，100mL)稀釋並用飽和食鹽水(30mL)洗五次。將有機相濃縮，得到殘留物用反相管柱純化(C18,H₂O+乙腈，乙腈60%)凍乾得到目標產物6a(480mg，收率74.8%)。MS m/z：C₃₈H₃₅N₅O₅，[M+H]⁺：642.6。

將化合物5b(1.1g,2.05mmol)溶解在吡啶(20mL)中，氬氣保護和室溫下加入TMSCl(1.34g,1.28mmol)。室溫攪拌1h後，苯甲醯氯(BzCl，0.59mL,5.92mmol)加到反應液中。室溫攪拌16h後，反應液用H₂O(10mL)淬滅並濃縮。得到的殘留物溶解在THF(30mL)中，加入TBAF(2mL)。室溫攪拌1h後，將氨水(0.5mL)加入，室溫攪拌5h後。反應液用EA(100mL)稀釋並用飽和食鹽水(30mL)洗五次。將有機相濃縮，得到殘留物用反相管柱純化(C18,H₂O+乙腈，乙腈60%)凍乾得到目標產物6b(1.4g，收率82.1%)。MS m/z：C₃₈H₃₅N₅O₅，[M+H]⁺：642.5。

將化合物6a(700mg,1.04mmol)、四唑(26.2mg,0.37mmol)、N-甲基咪唑溶解在CH₃CN(10mL)中，加入3A分子篩(500mg)。氬氣保護，室溫攪拌5min後，加入化合物7(470.4mg,1.56mmol)。室溫攪拌1h後，將分子篩過濾掉，固體用DCM(50mL)淋洗三次。濾液分別用飽和的NaHCO₃水溶液(50mL×4)和H₂O(50mL×4)洗。有機相在30℃下濃縮。得到殘留物用反向管柱純化(C¹⁸,H₂O+乙腈，乙腈90%)，凍乾後得到目標化合物1-4A(600mg，收率66.1%)。MS m/z：C₄₇H₅₂N₇O₆P，[M-氰乙基-二異丙基+OH]^-：704.3。

將化合物6b(1.3g,2.03mmol)、四唑(71.0mg,1.01mmol)、N-甲基咪唑(33.3mg,0.41mmol)溶解在CH₃CN(20mL)中，加入3A分子篩(700mg)。氬氣保護，室溫攪拌5min後，加入化合物7(0.92g,3.04mmol)。室溫攪拌1h後，將分子篩過濾掉，固體用DCM(50mL)淋洗三次。濾液分別用飽和的NaHCO₃水溶液(50mL×4)和H₂O(50mL×4)洗。有機相在30℃下濃縮。得到殘留物用反向管柱純化(C¹⁸,H₂O+乙腈，乙腈90%)，凍乾後得到目標化合物1-4b(1.4g，收率82.1%)。MS m/z：C₄₇H₅₂N₇O₆P，[M-氰乙基-二異丙基]^-：704.3。

1.5 合成化合物1-5

將化合物1A(6.73g,28.14mmol)溶解在乾燥的DMF(80mL)中，氬氣保護下緩慢加入NaH(60%,1.24g,30.95mmol)。該混合液室溫攪拌30min後，將該反應液加到溶有Pd(PPh₃)₄(1.95g,1.69mmol)、PPh₃(0.74g,2.81mmol)和化合物1(4.0g,28.14mmol)的THF(60mL)溶液中。該反應液在55℃攪拌16h後，將固體濾掉並用DCM(60mL)洗滌三次。將濾液濃縮，得到的殘留物用正向管柱純化(先用乙酸乙酯，再用乙酸乙酯：甲醇(12：1沖洗管柱子)得目標固體2(7g，粗品)。

將化合物3(1g,1.60mmol),KHCO₃(0.48g,4.81mmol)和乙二醇(0.40g,6.41mmol)溶解在丙酮(50mL)中，-30℃下緩慢加入KMnO₄(40%溶解於水中，0.67g,1.68mmol)。-30℃下攪1h後，用飽和的硫代硫酸鈉水溶液(30mL)將反應淬滅。該混合液用DCM(30mL)萃取四次。有機相用無水Na₂SO₄乾燥，過濾並濃縮。殘留物用反向管柱純化(C18,H₂O+乙腈，乙腈60%)凍乾得到目標產物4(600mg，收率56.9%)。MS m/z：C₃₈H₃₅N₅O₆，[M+H]⁺：658.5。

在250mL圓底瓶中加入反應物4(5.0g,7.601mmol)、NaIO₄和1,4-二噁烷/水(50mL/5mL)，室溫反應2小時後，減壓除去溶劑，得到白色固體(6.0g)，然後溶於甲醇(50mL)，加入硼氫化鈉(1.62 g,38mmol)，室溫攪拌2小時後，加入10%氯化銨溶液(10mL)，減壓除去溶劑後，C18管柱層析(水/乙腈：5%-95%)得到產品P1，無色油狀物5(2.0g,3.0315mmol,39%),LCMS,MS+,[M+H]⁺：660。

將化合物5(1.7g,2.58mmol)和DBU(0.77mL,5.15mmol)溶解在DCM(20mL)，氬氣保護-70℃下將BzCl(0.5M in DCM,0.8mL)逐滴滴加到反應中。該反應液置於-70℃下1h，該反應液用乙醇(5mL)淬滅。淬滅的反應液用DCM(100mL)稀釋並用水(30mL)洗滌三次，有機相用無水Na₂SO₄乾燥，過濾並濃縮。得到的殘留物用正向管柱純化(DCM：EA=1：1)得到白色固體6(80mg，收率4.14%)。MS m/z：C₄₅H₄₁N₅O₇，[M+H]⁺：764.5。

將化合物4(380mg,0.50mmol)、四唑(17.43mg,0.25mmol)、N-甲基咪唑(8.17mg,0.10mmol)溶解在CH₃CN(10mL)中，加入3A分子篩(500mg)。氬氣保護，室溫攪拌5min後，加入化合物7(224.95mg,0.75mmol)。室溫攪拌1h後，將分子篩過濾掉，固體用DCM(50mL)淋洗三次。濾液分別用飽和的NaHCO₃水溶液(50mL×4)和H₂O(50mL×4)洗。有機相在30℃下濃縮。得到殘留物用反向管柱純化(C¹⁸,H₂O +乙腈，乙腈90%)，凍乾後得到目標產物1-5(330mg，收率68.8%)。MS m/z：C₅₄H₅₈N₇O₈P，[M-氰乙基-二異丙基]^-：826.3。

1.6 合成化合物1-6a

將化合物1(10g,68.404mmol)，化合物2(15g,62.186mmol)和三苯基膦(32.62g,124.371mmol)溶於無水THF(30mL)，於0℃下緩慢滴加DIAD(24.656mL，124.371mmol)。該反應液在25度下反應12h.LCMS顯示反應完成。將該反應液用乙酸乙酯(200mL)和水(200mL)萃取，有機相乾燥將濾液濃縮，得到的殘留物用正向管柱純化(DCM/MeOH=10/1)得目標產物3(20g)。

將化合物3(20g,28.585mmol)溶於醋酸(24mL,426.016mmol)和H₂O(12mL)中，60℃攪拌1小時。之後將反應液旋乾加入THF(12mL)和H₂O(12mL)，80℃攪拌7小時。LCMS顯示反應完成。將反應液加入乙酸乙酯(200mL)和水(100mL)萃取，水相加入碳酸鈉固體直到水相有大量固體析出。將固體過濾，用水洗滌，將濾餅用油泵拉乾，得到目標化合物5(9g)。

在氮氣保護下，將化合物5(6.8g,18.581mmol)溶於吡啶(80mL)中，於0度下緩慢加入TMSCl(14.250mL,111.489mmol)，攪拌2h。之後在0度下加入Isobutyryl chloride(2.044mL,19.511mmol)，於25度下攪拌1h。LCMS顯示反應完成。用二氯甲烷(200mL)和水(200mL)萃取，有機相乾燥旋乾後拌樣，用正向管柱純化(DCM：MeOH=10：1)過管柱，在4.8%處出峰)，得到黃色油狀化合物6(12g)。

在氮氣保護下，將化合物6(5.5g,12.392mmol)溶於吡啶(30mL)，加入MOLECULAR SIEVE 4A 1/16(7g,12.392mmol)，然後在0℃下分批加入DMTrCl(5.04g,14.870mmol)固體，25℃反應2h.TLC(PE：EtOAc=1：1,Rf=0.69)顯示反應已經完成。該反應液和TJN200879-040-P1合併一起處理。將反應液用乙酸乙酯(200mL)和水(200mL)萃取，有機相乾燥旋乾後拌樣用正向管柱純化(PE：EtOAc過管柱，在84%處出峰)，得到黃色油狀化合物7(12g)。

將化合物7(12g,15.389mmol)溶於EtOAc(140mL)，加入濕鈀碳Pd/C(7g,15.389mmol)該反應液在25度，氫氣(15Psi)下反應2小時。TLC(PE：EtOAc=0：1,Rf=0.09)顯示反應已經完成。將反應液過濾，濾餅用乙酸乙酯(30mL)沖洗三遍後，收集濾液。濾液旋乾後加入50mL二氯甲烷和2mL三乙胺拌樣用正向管柱純化(DCM：MeOH=10：1過管柱，在0.5%處出峰)，得到9g(黃色泡沫狀固體)。將所得消旋化合物SFC拆分，得到產品目標化合物7A(-)(3.9g)和目標化合物7B(+)(3.8g)。

將化合物7A(-)(3.30g,5.40mmol)、四唑(190mg,2.70mmol)、1-甲基咪唑(90mg,1.10mmol)、3A分子篩(500mg)溶於30mL的乙腈中，室溫下加入化合物8(2.50g,8.10mmol)，在室溫下攪拌2h。反應完畢後，將分子篩過濾掉，加入DCM(150mL)，飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌(30mL*3)，再用飽和食鹽水(30mL)洗滌，濾液旋乾並經反相製備HPLC(C18，條件：5-100%(A：水，B：CH3CN)，流速：70mL/min)，凍乾後得到1-6a(2.9g,66%)。MS m/z：C43H55N7O7P[M+H]+，理論： 812.38，實測：812.5。1H NMR(400MHz，乙腈-d3)δ 7.56,7.54(2s,1H),7.36-7.27(m,2H),7.24-7.21(m,7H),6.83-6.80(m,4H),4.12-4.10(m,2H),3.75-3.68(m,10H),3.20-2.80(m,2H),2.68-2.54(m,4H),1.22-1.04(m,18H)。

1.7 合成化合物1-7a

在氮氣保護下，將化合物1(5g,23.1272mmol)、化合物2(6.76g,46.254mmol)和三苯基磷(7.28g,27.753mmol)溶於30mL二噁烷中，於0℃緩慢滴加入DEAD(5.502mL,27.753mmol)。滴加完成後，反應緩慢升溫至25℃繼續反應1h。在反應液裡加入100mL H2O和100mL EtOAc萃取，有機相合併乾燥過濾濃縮後拌樣過管柱，用正向管柱純化(PE：EtOAc=1：1過管柱得目標產物(4g)。

將化合物3(3.3g)溶於HOAc(16mL)和H2O(4mL)，油浴60℃加熱0.5h。將反應液旋乾得到的殘留物用正向管柱純化(PE：EtOAc=0：1過管柱)，得到目標產物4(3g)。

將化合物4(3g,8.873mmol)溶於5mL吡啶中，在氮氣保護下於0℃緩慢滴加DMTrCl(3.91g,11.535mmol)的10mL吡啶的溶液。滴加完畢後反應升溫至25℃並繼續反應1h。在反應液中加入50mL水和100mL乙酸乙酯萃取。水相再用100mL乙酸乙酯萃取三次，有機相合併乾燥過濾濃縮用正向管柱純化(用PE：EtOAc=2：1)。得到目標產物5(4g)。

將化合物5(4g,5.769mmol)溶於甲醇(10mL)，加入飽和的NH3甲醇溶液(40mL)，0℃反應6h。將反應液旋乾用正向管柱純化(用PE：EtOAc=0：1)得消旋化合物2.4g SFC拆分，得到目標產物6A(750mg,100%純度)和目標產物6B(400mg,99.16%純度)。

將化合物6A(-)(700mg,1.40mmol)、四唑(50mg,0.70mmol)、1-甲基咪唑(23mg,0.28mmol)，3A分子篩(500mg)溶於10mL的乙腈中，室溫下加入化合物7(630mg,2.10mmol)，在室溫下攪拌2h。反應完畢後，將分子篩過濾掉，加入DCM(50mL)，飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌(10mL*3)，再用飽和食鹽水(20mL)洗滌，濾液旋乾並經反相製備HPLC(C18，條件：5-100%(A：水，B：CH3CN)，流速：70mL/min)，凍乾後得到1-7a(700mg,72%)。MS m/z：C38H47N4O7PNa[M+Na]+，理論：725.32，實測：725.5。

1.8 合成化合物1-8a

將化合物1(8.5g,76.508mmol)、化合物2(30.64g,91.809mmol)溶於DMF(150mL)，加入CS2CO3(29.91g,91.809mmol)，反應於氮氣保護下，90℃反應12h。LCMS檢測反應完成。將反應液過濾，油泵旋乾，正向管柱分離純化(80g,DCM/MeOH=10/1~5/1)得到目標產物3(13.5g,80%純度)。

將化合物3(10.5g,35.105mmol)溶於吡啶(65mL)和CH₃CN(65mL)，向溶液中滴加BzCl(4.894mL,42.126mmol)，於25℃反應2h。LCMS檢測大部分原料反應完成，加H2O(100mL)淬滅，EtOAc(100mL×3)萃取，乾燥旋乾，管柱分離(合併TJN200872-101)純化(80g,PE/EtOAc=10/1~0/1,DCM/MeOH=10/1)得到目標產物4(14g,90%純度)。

將化合物4(14g,36.694mmol)溶於HOAc(56mL,314.796mmol)和H₂O(14mL)，於60℃反應2h，LCMS顯示反應完成。油泵濃縮，正向管柱分離(40g,DCM/MeOH=1/0~5/1)得到目標產物5(8.4g,90%純度& 2.4g,80%純度)。

將化合物5(7.4g,21.957mmol)、DMAP(0.54g,4.391mmol)、MOLECULAR SIEVE 4A(11.1g,2.967mmol)溶於吡啶(60mL)，冰浴下攪拌10min，然後加入DMTrCl(8.93g,26.348mmol)，反應攪拌1.8h.LCMS檢測約19%原料剩餘，約60%目標MS。合併(TJN200872-105&106)一起純化。向反應液中加入H2O(50mL)，經DCM(50mL×3)萃取，乾燥，旋乾，管柱分離(120g,PE/(EA：DCM：TEA=1：1：0.05)=1/0~0/1至DCM/MeOH=10/1)得到黃色固體化合物6(11g,89%純度，TJN200872-105&106&107)，回收原料(3.0g,70%純度)。

化合物6(15g,22.041mmol)經SFC(DAICEL CHIRALPAK AD(250mm*50mm,10um)；0.1% NH₃H₂O EtOH，B：45%-45%；200ml/min)分離得到目標產物6A(5.33g,94.29%純度)，目標產物6B(6.14g,97.91%純度)，，化合物6回收1.0g。

將化合物6B(-)(5.4g,8.92mmol)、四唑(312mg,4.46mmol)、1-甲基咪唑(146mg,1.78mmol)、3A分子篩(500mg)溶於40mL的乙腈中，室溫下加入化合物7(4g,13.4mmol)，在室溫下攪拌2h。反應完畢後，將分子篩過濾掉，加入DCM(200mL)，飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌(30mL*3)，再用飽和食鹽水(50mL)洗滌，濾液旋乾並經反相製備HPLC(C18，條件：5-100%(A：水，B：CH3CN)，流速：70mL/min)，凍乾後得到1-8a(5.8g,80%)。MS m/z：C45H51N5O7P，[M+H]+，理論：804.36，實測：804.4。

實施例2 siRNA的合成

siRNA的合成與通常的亞磷醯胺固相合成法無異，在合成AS鏈5’第7位修飾的核苷酸時，使用上述合成的亞磷醯胺單體替換母序列原核苷酸。

合成過程簡要描述如下：於Dr.Oligo48合成器(Biolytic)上，以Universal CPG載體為起始，根據合成程序逐個連接核苷亞磷醯胺單體。除上述描述的AS鏈5’第7位的核苷亞磷醯胺單體外，其餘核苷單體原料2’-F RNA、2’-O-甲基RNA等核苷亞磷醯胺單體購自上海兆維或蘇州吉瑪。採用5-乙基硫-1H-四唑(ETT)作為活化劑(0.6M乙腈溶液)，使用0.22M的PADS溶於1：1體積比的乙腈和三甲基吡啶(蘇州柯樂瑪)溶液作為硫化試劑，使用碘吡啶/水溶液(柯樂瑪)作為氧化劑。

固相合成完成後，寡核糖核苷酸自該固體支撐物裂解，採用3：1的28%氨水和乙醇溶液在50℃條件下浸泡16小時。然後離心，將上清液轉移到另一個離心管中，濃縮蒸發乾後，使用C18反向色譜純化，流動相為0.1MTEAA和乙腈，並使用3%三氟乙酸溶液脫除DMTr。目標寡核苷酸收集後凍乾，並經LC-MS鑑定為目標產物，再經過UV(260nm)定量。

所得到的單鏈寡核苷酸，根據等莫耳比，按照互補配對，退火，最後所得到的雙鏈siRNA溶於1×PBS中，並調整至實驗所需濃度備用。

實施例3 psiCHECK活性篩選實驗

3.1 實驗材料和儀器

siRNA樣本合成見前述，質粒來源於生工生物工程(上海)股份有限公司。psiCHECK實驗耗材、試劑和儀器如表1和表2所示。

表1. psiCHECK實驗耗材和試劑

表2. psiCHECK實驗儀器

3.2 psiCHECK活性篩選實驗步驟

細胞鋪板、細胞轉染，其中，轉染複合物具體配製量如表3所示；

表3. 96孔板每孔所需轉染複合物用量

依照表4對不同的實驗需求稀釋至不同濃度作為工作液備用。

表4. 多濃度點siRNA稀釋方案

轉染24h後，按照Dual-Glo® Luciferase Assay System檢測試劑盒的實驗操作方案進行檢測。Dual-Glo® Luoiferase Assay System檢測，採用Dual luciferase reporter gene assay kit(Promega,cat.E2940)，讀取Firfly化學發光值和Renilla化學發光值；計算相對值=Ren/Fir；計算抑制率=1-(Ratio+siRNA/Ratioreporter only)*100%=抑制率(%)。

本公開中，剩餘mRNA表達量比例=100%-抑制率(%)。

實施例4包含不同化學修飾的siRNA的在靶活性和脫靶活性實驗

利用實施例1的化合物、採用實施例2的方法合成下述siRNA，並藉由實施例3的方法驗證各siRNA的在靶活性和脫靶活性，其中各siRNA採用相同的有義鏈，且反義鏈5’端第7位分別為以下修飾核苷酸/化學修飾：

其中，我們將由2-羥甲基-1,3-丙二醇為起始原料合成的核苷酸定義hmpNA；

TJ-NA019(A)為實施例1.1節中核苷亞磷醯胺單體1-2藉由固相合成獲得；

TJ-NA020(A)為實施例1.1節中核苷亞磷醯胺單體1-3藉由固相合成獲得；

TJ-NA026(A)為實施例1.1節中核苷亞磷醯胺單體1-4a藉由固相合成獲得；

TJ-NA027(A)為實施例1.1節中核苷亞磷醯胺單體1-4b藉由固相合成獲得；

TJ-NA038(A)為實施例1.1節中核苷亞磷醯胺單體1-5藉由固相合成獲得；

(+)hmpNA(A)為實施例1.1節中核苷亞磷醯胺單體1-1b藉由固相合成獲得，絕對構型為(S)-hmpNA(A)；

(-)hmpNA(A)為實施例1.1節中核苷亞磷醯胺單體1-1a藉由固相合成獲得，絕對構型為(R)-hmpNA(A)；

類似地，替換hmpNA的鹼基種類，藉由固相合成獲得以下結構並確認絕對構型：

(+)hmpNA(G)，絕對構型為(S)-hmpNA(G)；

(-)hmpNA(G)為實施例1.6節中核苷亞磷醯胺單體1-6a藉由固相合成獲得，絕對構型為(R)-hmpNA(G)；

(+)hmpNA(C)，絕對構型為(S)-hmpNA(C)；

(-)hmpNA(C)為實施例1.8節中核苷亞磷醯胺單體1-8a藉由固相合成獲得，絕對構型為(R)-hmpNA(C)；

(+)hmpNA(U)，絕對構型為(R)-hmpNA(U)；

(-)hmpNA(U)為實施例1.7節中核苷亞磷醯胺單體1-7a藉由固相合成獲得，絕對構型為(S)-hmpNA(U)。

(S)-hmpNA(G)，(R)-hmpNA(G)，(S)-hmpNA(C)，(R)-hmpNA(C)，(S)-hmpNA(U)和(R)-hmpNA(U)的絕對構型由其中間體或衍生物經X-Ray衍射而確認。

中間體或衍生物的結構為：

TJ-NA067：檢測晶體為無色塊狀(0.30×0.10×0.04mm3)，屬於單斜晶系P21空間群。晶胞參數a=16.0496(5)Å,b=4.86260(10)Å,c=16.4686(5)Å,α=90°,β=118.015(4)°,γ=90°,V=1134.65(7)Å3,Z=4。計算密度Dc=1.389g/cm3，單胞中電子數F(000)=504.0，單胞的線性吸收係數μ(Cu Kα)=0.840mm-1，衍射實驗溫度T=150.00(11)K。

6A(+)：檢測晶體為無色塊狀(0.30×0.20×0.10mm3)，屬於單斜晶系P21空間群。晶胞參數a=22.6688(7)Å,b=8.5595(2)Å,c=23.3578(5)Å,α=90°,β=113.876(3)°,γ=90°,V=4144.3(2)Å3,Z=2。計算密度Dc=0.999g/cm3，單胞中電子數F(000)=1318.0，單胞的線性吸收係數μ(Cu Kα)=0.570mm-1，衍射實驗溫度T=100.01(18)K。

TJ-NA048：檢測晶體為無色針狀(0.30×0.04×0.04mm3)，屬於單斜晶系P1空間群。晶胞參數a=7.6165(4)Å,b=11.3423(5)Å,c=17.3991(8)Å,α=85.007(4)°,β=88.052(4)°,γ=70.532(4)°,V=1411.75(12)Å3,Z=2。計算密度Dc=1.366g/cm3，單胞中電子數F(000)=620.0，單胞的線性吸收係數μ(Cu Kα)=0.856mm-1，衍射實驗溫度T=150.00(13)K。

TJ-NA092：檢測晶體為無色棱管柱狀(0.30×0.10×0.10mm3)，屬於三斜晶系P1空間群。晶胞參數a=5.17960(10)Å,b=8.0667(2)Å,c=12.4077(2)Å,α=93.146(2)°,β=101.266(2)°,γ=96.134(2)°,V=503.993(18)Å3,Z=2。計算密度Dc=1.412g/cm3，單胞中電子數F(000)=228.0，單胞的線性吸收係數μ(Cu Kα)=0.945mm-1，衍射實驗溫度T=100.00(10)K。

表5. 靶向HBV-S的siRNA序列和修飾信息

在靶活性實驗結果參見表6，脫靶活性實驗結果參見表7和圖1A至圖1L，目前實驗的化合物，在測試序列上均顯示了與母序列相當或略優的活性，說明修飾沒有影響在靶活性，其中活性最優的是分別包含GNA/Abasic/Id、TJ-NA019 (A) 、TJ-NA020 (A) 、TJ-NA026 (A) 、(+)hmpNA(A)和(-)hmpNA(A)的siRNA。另外，母序列具有明顯的脫靶活性，所有修飾均顯示了明顯的抑制脫靶活性的效果，特別是對於分別包含TJ-NA027 (A) 、(+)hmpNA(A)和(-)hmpNA(A)的siRNA，並未觀察到脫靶活性。

表6. 靶向HBV-S的siRNA的在靶活性結果

表7. 靶向HBV-S的siRNA的脫靶活性結果

實施例5包含不同化學修飾的siRNA的序列依賴性實驗

已知Abasic修飾具有siRNA序列依賴性，因此發明人在多條不同序列上測試了本公開的待測化合物。使用了靶向四個不同基因(ANGPTL3、HBV-S、HBV-X、TTR)mRNA的siRNA(序列如表8所示)，使用實施例1的化合物TJ-NA020(A)、TJ-NA027 (A) 、(+)hmpNA(A)、(-)hmpNA(A)和作為對照的GNA (A) 、Id化合物修飾AS鏈5’端第7位(序列如表9所示)，再與母序列比較在靶活性和脫靶活性。

表8. 靶向不同基因的siRNA序列

表9.靶向不同基因的包含化學修飾修飾的siRNA序列

在靶活性實驗結果參見表10，GNA (A) 顯現出明顯的序列依賴性，不同序列的在靶活性差異明顯。本公開的待測化合物沒有顯示出明顯的序列依賴性，普遍適用性更強。此外，僅改變AS鏈5’端9位為2’-F修飾、10位為2’-OMe修飾，獲得了相似的活性效果，即本公開的待測化合物沒有顯示出明顯的序列依賴性。

表10. 針對不同靶序列的siRNA的在靶活性結果

siRNA2和siRNA3的脫靶活性實驗結果參見表11、圖2A至圖2G(靶向HBV-S)和圖3A至圖3G(靶向HBV-X)，可以看出，相對於母序列，本公開的待測化合物明顯降低了siRNA的脫靶活性。此外，僅改變AS鏈5’端9位為2’-F修飾、10位為2’-OMe修飾，獲得了相似的脫靶活性效果，即同樣能夠明顯降低了siRNA的脫靶活性。

表11. 針對不同靶序列的siRNA的脫靶活性結果

二、靶向配體的製備和活性評價

表12. 製備靶向配體的主要的儀器設備型號及原料來源

實施例6連接到固相載體上的胺基半乳糖化合物1-t

合成路線如下：

1)化合物1-g的合成路線

2)化合物1-h的合成路線

3)化合物1-l的合成路線

4)化合物1-q的合成

5)連接到固相載體上的胺基半乳糖化合物1-t的合成

步驟一

將原料1-a(297g,763mmol,)和原料1-b(160g,636mmol)溶解於960mlDCE，在15℃條件下，加入Sc(OTf)₃(15.6g,31.8mmol,)，然後升高反應溫度到85℃，攪拌反應2h，反應結束後加入1.5L飽和NaHCO₃中止反應，分出有機相，並再用1.5升飽和食鹽水洗滌，有機相無水Na₂SO₄乾燥，過濾後的溶液減壓蒸餾後矽膠管柱層析純化(石油醚：乙酸乙酯5：1-0：1)，的到淡黃色油狀產物1-c(328g，544mmol，收率為85.5%，純度為96.4%)。

¹HNMR：(400MHz,CDCl₃)δ 7.44-7.29(m,5H),5.83(d,J=8.8Hz,1H),5.40-5.23(m,2H),5.18-5.06(m,2H),4.86(s,1H),4.66(d,J=8.4 Hz,1H),4.21-4.07(m,2H),4.04-3.77(m,3H),3.51-3.45(m,1H),3.31-3.11(m,2H),2.18(d,J=2.0Hz,1H),2.14(s,3H),2.06(s,3H),2.03-1.99(m,3H),1.95(s,3H),1.64-1.46(m,4H),1.43-1.29(m,4H)。

MS，C₂₈H₄₀N₂O¹¹，實測M⁺ 581.3。

步驟二

將步驟一所得化合物平行分成兩份進行：每個反應包含化合物1-c(72.0g,124mmol)加入432mL THF中，在氬氣保護下加入Pd/C(20.0g,10%純度)，再加入TFA(14.1g,124mmol,9.18mL)，在反應溶液中通入氫氣，保持氣體壓力在30Psi，加熱至30℃並攪拌反應16h。反應完成後，合併兩個平行進行的反應，過濾，並減壓濃縮濾液。殘餘物使用二氯甲烷稀釋並重複減壓濃縮，重複三次。減壓抽乾後得到目標化合物1-d(139g)。

¹HNMR(400MHz,DMSO-d ₆)δ 7.85(d,J=9.2Hz,1H),7.74(s,3H),5.21(d,J=3.6Hz,1H),4.97(dd,J=2.8,10.8Hz,1H),4.48(d,J=8.8Hz,1H),4.06-3.98(m,3H),3.93-3.82(m,1H),3.73-3.68(m,1H),3.63-3.56(m,1H),3.43-3.38(m,1H),2.82-2.71(m,2H),2.13-2.09(m,3H),2.01-1.97(m,3H),1.91-1.87(m,3H),1.77(s,3H),1.76-1.73(m,1H),1.52-1.44(m,4H),1.28(s,4H)。

步驟三

將化合物1-d(139g,247mmol)和化合物1-e(75.3g,223mmol)加入DMF溶液(834mL)，在0℃下再加入DIPEA(41.6g,322mmol,56.1mL)、HOBt(36.8g,272mmol)和EDCI(52.2g,272mmol)，保持15℃攪拌反應16h，反應完成後將，反應液用二氯甲烷((400mL)稀釋，然後用飽和氯化銨溶液(1L)、飽和NaHCO₃(1.00L)、飽和食鹽水依次洗滌，分出有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾後減壓蒸餾除去溶劑，殘餘物矽膠管柱層析純化(石油醚：乙酸乙酯=5：1-0：1)，得到目標化合物1-f(108g，收率為56.8%)。

¹HNMR(40(400MHz,DMSO-d ₆)δ 7.89-7.78(m,2H),7.41-7.27(m,6H),5.21(d,J=3.2Hz,1H),5.08-4.92(m,3H),4.48(d,J=8.4Hz,1H),4.07-3.99(m,3H),3.97-3.81(m,2H),3.75-3.64(m,1H),3.42-3.37(m,1H),3.13-2.93(m,2H),2.20(t,J=8.0Hz,2H),2.10(s,3H),1.99(s,3H),1.89(s,3H),1.87-1.79(m,1H),1.76(s,3H),1.74-1.64(m,1H),1.48-1.41(m,2H),1.38(s,12H),1.29-1.20(m,4H),1.19-1.14(m,1H)。

MS，C₃₇H₅₅N₃O₁₄，實測值M⁺766.4。

步驟四

將上述所得化合物1-f平行分成兩份進行：每個反應包含化合物6(47.0g,61.3mmol)加入280mL THF中，在氬氣保護下加入Pd/C(15.0g,10%純度)，再加入TFA(7.00g,61.3mmol,4.54mL)，在反應溶液中通入氫氣，保持氣體壓力在30Psi，加熱至30℃並攪拌反應16h。反應完成後，合併兩個平行進行的反應，過濾，並減壓濃縮濾液。殘餘物使用二氯甲烷稀釋並重複減壓濃縮，重複三次。減壓抽乾後得到目標化合物1-g(94.0g,crude)。

¹HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ 8.38(s,1H),8.10(s,3H),7.83(d,J=9.2Hz,1H),5.21(d,J=3.2Hz,1H),4.96(dd,J=3.6,11.2Hz,1H),4.47(d,J=8.4Hz,1H),4.06-3.98(m,3H),3.92-3.82(m,1H),3.75-3.67 (m,2H),3.60(s,1H),3.43-3.37(m,1H),3.18-3.04(m,2H),2.30-2.24(m,2H),2.10(s,3H),2.00(s,3H),1.95-1.90(m,2H),1.89(s,3H),1.78-1.75(m,3H),1.49-1.41(m,3H),1.40(s,9H),1.26(s,4H)。

步驟五

將上述所得化合物1-f平行分成兩份進行：每個反應包含化合物1-f(46.0g,60mmol)加入HCl-EtOAc(2.00M,276mL)中，在15℃條件下攪拌反應16h。反應完成後合併兩個反應溶液，減壓蒸餾濃縮，殘餘物使用二氯甲烷稀釋並重複減壓濃縮，重複三次。減壓抽乾後得到淡紅色化合物1-h(91.0g，粗品)。

¹HNMR(400MHz,DMSO-d ₆)δ 7.91-7.80(m,2H),7.42-7.26(m,6H),5.21(d,J=3.2Hz,1H),5.07-4.92(m,4H),4.48(d,J=8.4Hz,1H),4.06-3.98(m,3H),3.98-3.82(m,3H),3.73-3.65(m,1H),3.44-3.35(m,1H),3.12-2.94(m,2H),2.22(t,J=8.0Hz,2H),2.10(s,3H),2.01-1.97(m,4H),1.94-1.90(m,1H),1.89(s,3H),1.87-1.79(m,2H),1.76(s,3H),1.74-1.67(m,1H),1.49-1.40(m,2H),1.40-1.32(m,2H),1.24(d,J=4.0Hz,4H),1.19-1.13(m,1H)。

MS，C₃₃H₄₇N₃O₁₄，實測M⁺710.3。

步驟六

平行進行兩個反應：每個反應包含化合物1-g(45.0g,60.3mmol)和化合物1-h(38.5g,54.3mmol)加入到270mL DMF，在0℃下再加入DIPEA(10.1g,78.4mmol,13.6mL)，再加入HOBt(8.97g,66.3mmol)和EDCI(12.7g,66.3mmol)。在15℃條件下攪拌反應16h。反應完成後合併兩個反應溶液，並加入300mL DCM稀釋，依次使用飽和氯化銨(800mL)、飽和NaHCO₃(800mL)和飽和食鹽水(800mL)洗滌，有機相用無水Na₂SO₄乾燥。過濾後，加壓蒸發濃縮，殘餘物使用矽膠管柱層析純化(石油醚：乙酸乙酯=5：1-0：1)，得到白色化合物1-i(66.0g,47.4mmol，收率為39.3%，純度為95.1%)。

¹HNMR(400MHz,DMSO-d ₆)δ 7.96-7.78(m,5H),7.41-7.25(m,6H),5.21(d,J=3.6Hz,2H),5.05-4.92(m,4H),4.48(d,J=8.8Hz,2H),4.22-4.12(m,1H),4.02(s,6H),3.94-3.80(m,3H),3.74-3.64(m,2H),3.45-3.35(m,2H),3.11-2.92(m,4H),2.20-2.12(m,4H),2.10(s,6H),1.99(s,6H),1.89(s,6H),1.82-1.79(m,2H),1.76(s,6H),1.74-1.63(m,2H),1.44(d,J=6.0Hz,4H),1.37(s,12H),1.24(s,9H)。

MS：C₆₂H₉₄N₆O₂₅，實測值m/z 1323.8。

步驟七

分成11個反應進行：在每個反應中加入化合物1-i(5.00g,3.78mmol)和甲苯(300mL)，加入矽膠(45.0g)。在100℃下攪拌反應40h，反應完成後合併11個反應混合物。減壓蒸餾除去溶劑後，殘餘物加入異丙醇和二氯甲烷，並攪拌20min。過濾除去不溶物，並使用異丙醇洗滌濾餅至無產物溶出，得到的溶液除去溶劑並抽乾後得到淡黃色化合物1-j(43.2g,34.0mmol，收率為82.0%)。

¹HNMR：(400MHz,DMSO-d6)δ 8.01(d,J=7.6Hz,1H),7.93-7.79(m,2H),7.39-7.27(m,3H),5.21(d,J=3.2Hz,1H),5.06-4.91(m,2H),4.48(d,J=8.0Hz,1H),4.07-3.97(m,3H),3.94-3.82(m,2H),3.73-3.65(m,1H),3.45-3.36(m,2H),3.10-2.94(m,2H),2.15(d,J=7.6Hz,2H), 2.10(s,3H),1.99(s,3H),1.89(s,3H),1.86-1.79(m,1H),1.77(s,3H),1.74-1.65(m,1H),1.44(s,2H),1.37(d,J=5.2Hz,2H),1.24(s,4H)。

MS：C₅₈H₈₆N₆O₂₅，實測m/z=1267.8。

步驟八

此步平行分成兩個反應進行：每個反應包含化合物1-d(11.8g,21.0mmol)和化合物1-j(21.3g,16.8mmol)加入到70mL DMF，在0℃下再加入DIPEA(3.54g,27.3mmol,4.77mL)，再加入HOBt(3.13g,23.1mmol)和EDCI(4.44g,23.1mmol)。在15℃條件下攪拌反應16h。反應完成後合併兩個反應溶液，並加入500mL DCM稀釋，依次使用飽和氯化銨(1.5L)、飽和NaHCO₃(1.5mL)和飽和食鹽水(1.5mL)洗滌，有機相用無水Na₂SO₄乾燥。過濾後，加壓蒸發濃縮，殘餘物使用矽膠管柱層析純化(二氯甲烷：甲醇=50：1-10：1)，得到淡黃色化合物1-k(54.0g,31.8mmol，收率為75.6%)。

¹HNMR(400MHz,DMSO-d ₆)δ 7.91(d,J=7.6Hz,1H),7.87-7.78(m,5H),7.73(t,J=5.2Hz,1H),7.42-7.24(m,6H),5.21(d,J=3.6Hz,3H),5.06-4.92(m,5H),4.48(d,J=8.4Hz,3H),4.19-4.09(m,2H),4.07-3.97(m,10H),3.94-3.80(m,4H),3.76-3.64(m,3H),3.42-3.37(m,4H),3.08-2.94(m,6H),2.20-2.12(m,2H),2.10(s,9H),2.08-2.01(m,2H),1.99(s,9H),1.89(s,9H),1.87-1.79(m,2H),1.77(s,9H),1.74-1.63(m,2H),1.44(d,J=5.6Hz,6H),1.40-1.31(m,6H),1.24(s,13H)。

MS：C₇₈H₁₁₈N₈O₃₃，實測值m/z=1696.1。

步驟九

此步平行分成3個反應進行：在每個反應中加入化合物1-k(17.0g,10.0mmol)和THF(100mL)，在氬氣保護下加入Pd/C(5.0g,10%純度)，再加入TFA(1.14g,10.0mmol,742uL)，在反應溶液中通入氫氣，保持氣體壓力在15Psi，加熱至30℃並攪拌反應4h。反應完成後，合併3個平行進行的反應，過濾，並減壓濃縮濾液。殘餘物使用二氯甲烷稀釋並重複減壓濃縮，重複三次。殘餘物使用製備液相色譜(C18，流動相A 0.1%TFA-水，流動相B：10-40% CAN，20min)純化得到白色化合物1-l(17.3g,10.2mmol，收率為34.0%)。

¹HNMR：(400MHz,DMSO-d ₆)δ 8.45(t,J=5.2Hz,1H),8.14(d,J=5.2Hz,3H),7.97(t,J=5.2Hz,1H),7.90-7.77(m,4H),5.21(d,J=2.8Hz,3H),4.96(dd,J=3.2,11.6Hz,3H),4.47(d,J=8.4Hz,3H),4.20-4.10(m,1H),4.02(s,8H),3.87(q,J=9.6Hz,3H),3.75-3.61(m,4H),3.46-3.34(m,3H),3.21-2.93(m,6H),2.21(s,2H),2.14-2.02(m,11H),1.99(s,9H),1.96-1.82(m,12H),1.80-1.65(m,10H),1.44(d,J=5.6Hz,8H),1.36(d,J=6.4Hz,4H),1.30-1.17(m,12H)

MS：C₇₀H₁₁₂N₈O₃₁，實測值m/2z=781.8。

步驟十

將化合物1-m(2g,12.64mmol)溶於吡啶(10mL)中，室溫下滴加DMTrCl(4.71g,13.90mmol)的吡啶(10mL)溶液，反應在室溫下攪拌5小時，待反應完畢後，用甲醇淬滅，減壓濃縮得到粗品，用矽膠純化(石油醚：乙酸乙酯=10：1沖提)，收集產物沖提液，減壓蒸乾溶劑得到4g的化合物1-n。

MS m/z：C₂₉H₃₂O₅，[M+H]⁺實測：461.3。

步驟十一

將化合物1-n(2g,4.34mmol)、N,N-二異丙基乙胺(DIEA，1.43mL,8.68mmol)和HATU(2.47g,6.51mmol)溶解於DMF(10mL)中，室溫下加入化合物1-o的DMF(5mL)溶液，該反應在室溫下攪拌8小時。反應完畢後，加水淬滅，水相用乙酸乙酯提取，合併的有機相先用水洗滌，再用飽和食鹽水(20mL)洗滌，隨後減壓蒸乾溶劑，經反相製備HPLC(Column：Boston Green ODS 150*30mm*5um，條件：25-80%(A：水0.075% NH₃．H₂O,B：CH₃CN)，流速：55mL/min)，凍乾後得到2.4g化合物1-p。

MS m/z：C₃₃H₃₉NO₇，[M+H]⁺實測：562.4。

步驟十二

將化合物1-p(2.4g,4.27mmol)溶解於15mL的甲醇和水(2：1)的混合溶液中，室溫下加入LiOH(0.36g,8.54mmol)並攪拌過夜。待反應完畢後減壓蒸乾溶劑，經反相製備HPLC(Column：Boston Green ODS 150*30mm*5um，條件：25-75%(A：水0.075% NH₃．H₂O,B：CH₃CN)，流速：55mL/min)，凍乾後得到2g化合物1-q。

MS m/z：C₃₂H₃₇NO₇，[M+H]⁺實測：548.6。

步驟十三

將化合物1-q(0.37g,0.69mmol)、DIEA(0.19mL,1.15mmol)和HATU(0.32g,0.86mmol)溶於2mL的DMF中，室溫下加入化合物1-l(0.9g,0.69mmol)的DMF(2mL)溶液，在室溫下攪拌過夜。反應完畢後，經二氯甲烷(10mL)稀釋反應液，並依次用飽和NaHCO₃(20mL)和飽和食鹽水(20mL)洗滌，有機相無水Na₂SO₄乾燥，過濾後減壓濃縮。經反相製備HPLC(Column：Boston Green ODS 150*30mm*5um，條件：25-65%(A：水0.075% NH₃．H₂O,B：CH₃CN)，流速：45mL/min)純化，凍乾後得到0.5g化合物1-r。

MS m/z：C₁₀₂H₁₄₇N₉O₃₇，[M-H]⁺實測：2088.5。

步驟十四

將化合物1-r(300mg,0.14mmol)和丁二酸酐(28.70mg,0.28mmol)溶解於四氫呋喃中，向反應液中加入DMAP(3.50mg,0.028mmol)並在40℃下攪拌過夜。待反應完畢後，待反應完畢後，加入甲醇(18.8mg)，並攪拌反應10min，然後將反應液用二氯甲烷(3mL)稀釋反應液，並用飽和NaHCO3(5mL)洗滌2次。將有機相減壓濃縮至乾，經反相製備HPLC(Column：Boston Green ODS 150*30mm*5um，條件：25-65%(A：水0.075% NH₃．H₂O,B：CH₃CN)，流速：35mL/min)純化，凍乾後得到140mg化合物1-s。

MS m/z：C₁₀₆H₁₅₁N₉O₄₀，[M-H]⁺實測：2189.4。

步驟十五

將上步得到的化合物1-r(140mg，64ummol)加入乙腈(5mL)，再加入HBTU(48.7mg，128umol)，加入表面胺基修飾的固相支撐物(CPG-NH2，2.3g)，加入DIEA(41.5mg,320umol,55uL)，保持30℃震盪反應16h。反應完成後，過濾，並依次用甲醇(8mL x 4)、二氯甲烷(8mL x 4)洗滌。固體繼續加入吡啶：乙酸酐(v：v=4：1,10.0 mL)中，繼續保持30℃震盪反應16h。反應完成後，過濾，並依次用甲醇(8mL x 4)、二氯甲烷(8mL x 4)洗滌。得到連接在固相載體上的化合物1-t 2.1g。

實施例7連接到固相載體上的胺基半乳糖化合物2-e

合成路線如下：

1)化合物2-b的合成

2)化合物2-e的合成

步驟一

將化合物2-a(1.00g,2.37mmol)加入THF(7.5mL)和H₂O(7.5mL)中，再加入LiOH.H₂O(109mg,2.60mmol)，保持16℃攪拌反應16h。反應完成後，減壓蒸發除去溶劑，殘餘物繼續冷凍乾燥，得到白色化合物2-b(960mg,2.32mmol，收率為97.8%)。

¹HNMR：(400MHz,DMSO-d6)δ 7.44(d,J=8.4Hz,2H),7.34-7.23(m,6H),7.22-7.15(m,1H),6.86(d,J=8.0Hz,4H),3.73(s,6H),3.66(d,J=6.4Hz,1H),3.32(d,J=12.0Hz,1H),3.11(dd,J=2.0,9.2Hz,1H),2.85(t,J=8.8Hz,1H)。

MS m/z：C₂₄H₂₄O₆，實測m/z：407.2。

步驟二

將化合物1-l(500mg,0.30mmol)加入二氯甲烷(3mL)中，15℃下，再將化合物2-b(0.14g,0.34mmol)加入反應中，在0℃下再加入HBTU(142mg,375umol)和DIEA((115mg,895umol)，保持15℃反應16h。反應完畢後，經二氯甲烷(10mL)稀釋反應液，並依次用飽和NaHCO₃(20mL)和飽和食鹽水(20mL)洗滌，有機相無水Na2SO4乾燥，過濾後減壓濃縮，殘餘物經過製備液相純化(column：Welch Xtimate C18 250*70mm#10um；mobile phase：[水-ACN]；B%：40%-66%,18min)，得到化合物2-c。

MS m/z：C₉₄H₁₃₄N₈O₃₆，[M-H]+實測：1952.1。

步驟三

將化合物2-c(230mg,0.12mmol)和丁二酸酐(23.5mg,0.26mmol)溶解於二氯甲烷溶液(2mL)中，向反應液中加入DMAP(43.1 mg,0.35mmol)，保持在15℃下攪拌16h。待反應完畢後，加入甲醇(18.8mg)，並攪拌反應10min，然後將反應液用二氯甲烷(3mL)稀釋反應液，並用飽和NaHCO₃洗滌2次。將反應液減壓濃縮抽乾得到化合物2-d(240mg，粗品)。

MS m/z：C106H151N9O40，[M-H]+實測：m/2z：2070.2

步驟四

將上步得到的化合物2-d(240mg，116ummol)加入乙腈(8mL)，再加入HBTU(88.7mg，233umol)，加入表面胺基修飾的固相支撐物(CPG-NH2，4g)，加入DIEA(75.5mg,584umol,101uL)，保持30℃震盪反應16h。反應完成後，過濾，並依次用甲醇(8mL x 4)、二氯甲烷(8mL x 4)洗滌。固體繼續加入吡啶：乙酸酐(v：v=4：1,10.0mL)中，繼續保持30℃震盪反應16h。反應完成後，過濾，並依次用甲醇(8mL x 4)、二氯甲烷(8mL x 4)洗滌。得到目標產物連接在固相載體上的化合物2-e 3.7g。

實施例8連接到固相載體上的胺基半乳糖化合物3-n

合成路線如下：

1)化合物3-d的合成

2)化合物3-g的合成

3)化合物3-n的合成

步驟一

將原料3-a(78.8g,202mmol)和原料3-b(40g,168mmol)溶解於DCE(250mL)，在15℃條件下，加入CF₃SO₃H(4.15g,8.43mmol)，然後升高反應溫度到75℃，攪拌反應2h，反應結束後加入1L飽和NaHCO₃中止反應，分出有機相，並再用1L飽和食鹽水洗滌，有機相無水Na₂SO₄乾燥，過濾後的溶液減壓蒸餾後矽膠管柱層析純化(石油醚：乙酸乙酯5：1-0：1)，的到目標產物3-c(63.2g,107mmol，收率為63.5%)。

¹HNMR：(400MHz,CDCl₃)δ 7.35-7.26(m,5H),5.88(s,1H),5.34-5.25(m,2H),4.65(d,J=8.4Hz,1H),4.16-4.13(m,2H),3.92-3.87(m,3H),3.18-3.17(m,1H),3.15-3.14(m,2H),2.16-1.91(m,15H),1.58-1.50(m,5H),1.49-1.36(m,2H)。

MS m/z：C₂₄H₄₀N₂O₁₁，實測m/z：567.4。

步驟二

將上述所得化合物3-c(60.0g,106mmol)加入360mL THF中，在氬氣保護下加入Pd/C(15.0g,10%純度)，再加入TFA(12.1g,106mmol,7.84mL)，在反應溶液中通入氫氣，保持氣體壓力在30Psi，加熱至30℃並攪拌反應16h。反應完成後，過濾，並減壓濃縮濾液。殘餘物使用二氯甲烷稀釋並重複減壓濃縮，重複三次(500mL x 3)。減壓抽乾後得到淡黃色化合物3-d(44g,102mmol，收率為96.1%)。

步驟三

將化合物3-e(60.0g，447mmol)溶解於DMF(300mL)，加入K₂CO₃(92.7g，671mmol)，在0℃條件下滴加入BnBr(115g，671mmol，79.7mL)。保持25℃攪拌反應6h。將反應液倒入碎冰中，然後使用乙酸乙酯(100mL*6)萃取，有機相再依次用水洗滌(100ml*2)，飽和食鹽水洗滌(100ml*3)。有機相無水硫酸鈉乾燥後減壓蒸餾除去溶劑，殘餘物使用矽膠管柱層析純化(石油醚：乙酸乙酯=2：1-0：1)，得到白色固體化合物3-f(60.3g，269mmol，收率60.1%)。

¹HNMR：(400MHz,CDCl₃)δ 7.37-7.26(m,5H),5.18(d,J=4.4Hz,2H),3.95-3.90(m,2H),3.75-3.71(m,2H),1.08(s,1H)。

MS m/z：C₁₂H₁₆O₄，實測m/z：223.5。

步驟四

將化合物3-f(50.0g，223mmol)溶解在二氯甲烷中(300mL)，加入吡啶(73.5g，929mmol，75mL)和溶解於二氯甲烷(50mL)的對硝基苯基氯甲酸酯(180g，892mmol)，氮氣保護下保持25℃攪拌反應24h。反應完成後，加入二氯甲烷(250mL)稀釋，然後依次使用NaHSO₄ 溶液(30mL*3)和飽和食鹽水(30mL*2)洗滌，有機相使用MgSO₄乾燥後，過濾，減壓蒸發掉溶劑。所得到的粗品使用矽膠管柱層析純化(石油醚：乙酸乙酯=3：1)，得到目標化合物3-g(37.0g，66.7mmol，收率為29.9%)

MS m/z：C₂₆H₂₂N₂O₁₂，實測m/z：553.4

步驟五

將化合物3-g(22.0g，39.7mmol)加入乙腈(120mL)中，在氮氣保護條件下，再加入三乙胺(24.1g，238mmol，33,1mL)，將反應液冷卻到0℃，滴加入溶解在乙腈(120mL)中的化合物3-d(42.1g，40mmol)，升高溫度到25℃，並攪拌反應1h。反應完成後，減壓濃縮除去溶劑，然後使用矽膠管柱層析純化(石油醚：乙酸乙酯=2：1)得到目標化合物3-h(37.0g，12.0mmol，收率為30.2%)。

MS m/z：C₅₂H₇₆N₄O₂₄，實測m/z：1141.8。

步驟六

將化合物3-h(11.0g，9.64mmol)溶解於乙酸乙酯(60mL)中，加入Pd/C(2.00g,10%純度)，反應溶液中通入氫氣，保持氣體壓力在40Psi，溫度25℃攪拌反應8h。反應完成後，過濾，並減壓蒸發至乾燥，得到目標化合物3-i(10.0g,9.42mmol，收率為97.7%)。

¹HNMR：(400MHz,DMSO-d ₆)δ 7.79(d,J=9.2Hz,2H),7.10(s,2H),5.74(t,J=1.6Hz,2H),5.21(d,J=3.6Hz,2H),4.98-4.95(m,2H),4.48(d,J=8.4Hz,2H),4.02(d,J=4.8Hz,11H),3.87-3.84(m,2H),3.69-3.67(m,2H),3.41-3.39(m,2H),2.94-2.90(m,4H),2.10(s,5H), 1.99(s,7H),1.89(s,6H),1.77(s,6H),1.47-1.35(m,8H),1.26-1.24(m,4H),1.23-1.08(m,3H)。

MS m/z：C₄₅H₇₀N₄O₂₄，實測m/z：1051.4

步驟七

將化合物3-i(5.00g,4.76mmol)加入到二氯甲烷(30mL)和DMF(30mL)的混合溶劑中，再加入化合物33(312mg,2.38mmol)，加入HBTU(1.80g,4.76mmol)和DIEA(615mg,4.76mmol)，保持25℃攪拌反應12h。反應完成後，將反應液倒入到乙酸乙酯(100mL)中，然後使用飽和食鹽水洗滌，無水Na₂SO₄乾燥後，過濾並減壓蒸發除去溶劑，殘餘物使用製備HPLC純化得到目標化合物3-k(2.1g,956umol，收率為20.1%)。

¹HNMR：(400MHz,DMSO-d ₆)δ 7.84-7.81(m,5H),7.12-7.07(m,3H),5.21(d,J=3.6Hz,4H),4.99-4.96(m,4H),4.49(d,J=8.4Hz,4H),4.06-4.00(m,24H),3.88-3.86(m,4H),3.55-3.52(m,4H),3.49-3.43(m,4H),3.25-3.05(m,4H),2.94-2.93(m,8H),2.11(s,12H),2.00(s,16H),1.90(s,12H),1.78(s,12H),1.46-1.44(m,8H),1.38-1.35(m,8H),1.26-1.24(m,8H),1.18-1.16(m,6H),1.09-0.99(m,2H)。

MS m/z：C₉₆H₁₅₃N₁₁O₄₆，實測m/z：2197.5。

步驟八

將化合物3-k(100mg,45.5umol)加入DMF(1mL)中，再將化合物2-b(21.1mg,54umol)加入反應中，再加入HBTU(21.8mg,57.3umol)和DIEA((17.7mg,136umol)，保持15℃反應16h。反應完畢後，經二氯甲烷(10mL)稀釋反應液，並依次用飽和NaHCO₃和飽和食鹽水洗滌，有機相無水Na₂SO₄乾燥，過濾後減壓濃縮，殘餘物經過製備液相純化(column：Phenomenex Gemini-NX 150*30mm*5um；mobile phase：[水-ACN]；B%：35%-75%,12min)，得到化合物3-l。MS m/z：C₁₂₀H₁₇₅N₁₁O₅₁，實測：2586.9。

步驟九

將化合物3-l(14mg,5.4umol)和丁二酸酐(1.08mg,10.8umol)溶解於二氯甲烷溶液(1mL)中，向反應液中加入DMAP(2.0mg,16umol)和TEA(1.1mg,10.8umol,1.5uL)，保持在15℃下攪拌16h。待反應完畢後，加入甲醇(0.9mg)，並攪拌反應10min，然後將反應液用二氯甲烷稀釋反應液，並用飽和NaHCO₃洗滌2次。將反應液減壓濃縮抽乾得到化合物3-m(18mg)。

MS m/z：C₁₂₄H₁₇₉N₁₁O⁵⁴，實測：2687.2。

步驟十

將上步得到的化合物3-m(18mg，6.7ummol)加入乙腈(3mL)，再加入HBTU(5.1mg，13.4umol)，加入表面胺基修飾的固相支撐物(CPG-NH2，200mg)，加入DIEA(4.3mg,33.5umol,5.8uL)，保持30℃震盪反應16h。反應完成後，過濾，並依次用甲醇(2mL x 4)、二氯甲烷(2mL x 4)洗滌。固體繼續加入吡啶：乙酸酐(v：v=4：1,2mL)中，繼續保持30℃震盪反應16h。反應完成後，過濾，並依次用甲醇、二氯甲烷洗滌。得到目標產物連接在固相載體上的化合物3-n 200mg。

實施例9 連接到固相載體上的胺基半乳糖化合物4-c

合成路線如下：

1)化合物4-c的合成

步驟一

將化合物3-k(149.5mg,68ummol)，DIEA(141.0mg,1.09mmol),3A分子篩(500mg)和DEPBT(163.4mg,0.55mmol)溶於5mL的DCM中，室溫下加入化合物1-q(400mg,0.18mmol)，在室溫下攪拌過夜。反應完畢後，將分子篩過濾掉，濾液旋乾並經反相製備HPLC(Column：Boston Green ODS 150*30mm*5um，條件：5-50%(A：水，B： CH3CN)，流速：45mL/min)，凍乾後得到化合4-a(118mg，32ummol，收率為62.6%)。

MS m/z：C₁₂₈H₁₈₈N₁₂O₅₂，實測[M+HCOO^-]=2770.6。

步驟二

將化合物4-a(110mg,4.0umol)、DMAP(7.4mg,40umol)、3A分子篩(100mg)和丁二酸酐(11.9mg,120umol)溶於5mL的THF中，氬氣保護，40℃下攪拌4h。反應完畢後，將分子篩過濾掉，濾液旋乾並經反相製備HPLC純化(Column：Boston Green ODS 150*30mm*5um，條件：5-50%(A：水，B：CH₃CN)，流速：45mL/min)，凍乾後得到化合物4-b(80mg,28.3ummol，收率為70.8%)。

MS m/z：C₁₃₂H₁₉₂N₁₂O₅₅，[M-H]⁺實測：2824.6。

步驟三

將上步得到的化合物38(71mg，25ummol)加入乙腈(5mL)，再加入HBTU(19.0mg，50umol)，加入表面胺基修飾的固相支撐物(CPG-NH2，0.86g)，加入DIEA(16.2mg,125umol,21.6uL)，保持30℃震盪反應16h。反應完成後，過濾，並依次用甲醇(5mL x 4)、二氯甲烷(5mL x 4)洗滌。固體繼續加入吡啶：乙酸酐(v：v=4：1,6.0mL)中，繼續保持30℃震盪反應16h。反應完成後，過濾，並依次用甲醇、二氯甲烷洗滌。得到連接在固相載體上的化合物4-c 0.74g。

實施例10. 對照化合物L96的製備

按照專利WO2014025805A1所述的方法製備了對照化合物L96。

實施例11 合成胺基半乳糖分子簇綴合的siRNA

用於測試的siRNA，靶向小鼠TTR基因mRNA的siRNA(Molecular Therapy Vol.26 No 3 March 2018)如下，在SS鏈的3’末端藉由共價鍵連接胺基半乳糖分子簇M，

SS鏈(5'-3‘)：CmsAmsGmUmGfUmUfCfUfUmGmCmUmCmUmAmUmAm Am-M

AS鏈(5'-3’)：UmsUfsAmUmAmGfAmGmCmAmAmGmAmAfCmAfCmUmGmsUmsUm

參照前述亞磷醯胺固相合成法，區別在於在合成SS鏈時，使用連接有胺基半乳糖簇的CPG載體代替Universal-CPG載體。

簡要描述如下：於Dr.Oligo48合成器(Biolytic)上，以上述合成的胺基半乳糖連接的CPG載體為起始，根據合成程序逐個連接核苷亞磷醯胺單體。核苷單體原料2’-F RNA、2’-O-甲基RNA等核苷亞磷醯胺單體購自上海兆維或蘇州吉瑪。採用5-乙基硫-1H-四唑(ETT)作為活化劑(0.6M乙腈溶液)，使用0.22M的PADS溶於1：1體積比的乙腈和三甲基吡啶(蘇州柯樂瑪)溶液作為硫化試劑，使用碘吡啶/水溶液(柯樂瑪)作為氧化劑。

所得到的單鏈寡核苷酸，根據等莫耳比，按照互補配對，與AS鏈退火，最後所得到的雙鏈siRNA溶於1×PBS中，並調整至實驗所需濃度。

合成胺基半乳糖簇綴合的siRNA，實驗所用siRNA靶向小鼠TTR mRNA。M=

(對照化合物)。

表13.靶向配體活性評價siRNA編號和序列

實施例12胺基半乳糖分子簇綴合的siRNA在肝原代細胞對mRNA表達的抑制

參照Severgini等報導的方法(Cytotechnology.2012；64(2)：187-195.)分離獲得新鮮小鼠原代肝細胞。

原代肝細胞分離後，按照10萬每孔接種於24孔板中，按照終濃度為50nM、10nM、2nM、0.4nM、0.08nM、0.016nM、0.0032nM、0.00064nM分別加入待測siRNA。隨後，將原代肝細胞置於37℃，5% CO₂的環境中培養24h。24h後，採用qPCR方法檢測mTTR的mRNA表達水平。

如圖4所示，S-1、S-2、S-3、S-4均表現了優秀的mTTR基因表達抑制效率。S-1及S-4的IC50值低於其他兩組，與對照組S-L96的IC50值0.280nM相比，S-1的IC50值為0.131nM，S-4的IC50值為0.135nM，表明綴合S-1及S-4化合物的siRNA體外被原代肝細胞自由攝取的效率優於對照組，S-1及S-4化合物能更高效介導siRNA進入原代肝細胞。

實施例13 胺基半乳糖分子簇綴合的siRNA在體內對mRNA表達的抑制

使用8週齡的C57BL/6小鼠(昭衍生物、SPF級，雌性)，採用上述的siRNA經皮下注射遞送。在第1天，在小鼠肩頸部的鬆弛皮膚上，給予100μl溶液的皮下注射，其含有PBS或PBS配置的1mg/kg(mpk)，0.2mpk劑量的對應的siRNA(S-L96、S-3、S-2、S-4或S-1)。各個組別注射6隻小鼠。

在給藥3天後，短頸處死小鼠，使用qPCR檢測小鼠肝組織mTTR的mRNA表達水平。

如圖5所示，S-1、S-2、S-3、S-4均表現了優秀的mTTR基因表達抑制效率。其中，S-2、S-3、S-4與對照組S-L96相比，在1mpk及 0.2mpk的活性相近。S-1在1mpk及0.2mpk的活性水平優於對照組S-L96。

實施例14 胺基半乳糖分子簇綴合的siRNA在體內對mRNA表達抑制的長效性實驗

按照實施例11中合成方法再次合成兩組siRNA化合物S-1-2和S-L96-2(SS鏈和AS鏈參見表13)，用於小鼠體內給藥。使用8週齡的C57BL/6小鼠(昭衍生物，SPF級，雌性)，採用上述的胺基半乳糖分子簇綴合的siRNA經皮下注射遞送。在第0天，在小鼠肩頸部的鬆弛皮膚上，給予100μl溶液的皮下注射，其含有PBS(稱為Mock組，即空白對照組)或PBS配置的1mg/kg(mpk)劑量的對應的胺基半乳糖分子簇綴合的siRNA(S-1和S-L96)。各個組別注射9隻小鼠。

分別在給藥7天、14天、28天後，斷頸處死各3隻小鼠，每隻小鼠取兩份肝組織樣本，使用qPCR檢測小鼠肝組織mTTR的mRNA表達水平。

給藥7天、14天和28天，S-1-2與PBS組相比的mRNA比例分別是0.13、0.12和0.21；S-L96-2與PBS組相比的mRNA比例分別是0.17、0.13和0.29。

圖6也顯示了給藥化合物S-1-2和S-L96-2後的7天、14天及28天，小鼠肝組織中mRNA的表達水平。

結果顯示，所給藥siRNA在28天仍顯示出高效的mRNA抑制率，與對照組S-L96-2相比，S-1-2的抑制率更高。

三、活性驗證

實施例15合成siRNA綴合物

藉由固相亞磷醯胺法，按照核苷酸排布順序自3’-5’方向逐一連接核苷單體。每連接一個核苷單體都包括脫保護、偶聯、蓋帽、氧化或硫化四步反應。有義鏈和反義鏈採用相同的合成條件。

寡核酸合成儀器設備型號：Biolytic Dr.Oligo 48寡核酸固相合成儀，GE oligo pilot100寡核酸固相合成儀。

表14. 合成siRNA綴合物使用的試劑

檢測方法如下：使用水s Acquity UPLC-SQD2 LCMS(column：ACQUITY UPLC BEH C18)檢測上述有義鏈和反義鏈純度並分析分子量。實測值與理論值相符，表明所合成的是3’末端綴合分子的有義鏈以及反義鏈。該siRNA具有表15中所示的有義鏈和反義鏈。

表15. 合成siRNA、siRNA綴合物序列

其中，將由2-羥甲基-1,3-丙二醇為起始原料合成的核苷酸定義hmpNA；

(-)hmpNA(A)為實施例1.1節中核苷亞磷醯胺單體1-1a藉由固相合成獲得；

(-)hmpNA(G)為實施例1.6節中核苷亞磷醯胺單體1-6a藉由固相合成獲得；

(-)hmpNA(C)為實施例1.8節中核苷亞磷醯胺單體1-8a藉由固相合成獲得；

(-)hmpNA(U)為實施例1.7節中核苷亞磷醯胺單體1-7a藉由固相合成獲得；

表15中，NAG1結構如實施例11中所示。

實施例16 siRNA活性及脫靶水平驗證

在HEK293A細胞中對本公開化合物進行體外分子水平模擬在靶及脫靶水平篩選。

分別構建siRNA序列對應的在靶序列和脫靶序列，插入到psiCHECK-2質粒中。該質粒包含海腎螢光素酶基因及螢火蟲螢光素酶基因。作為雙報告基因系統，siRNA的靶序列插入到海腎螢光素酶基因的3’UTR區域，siRNA對於靶標序列的活性可以藉由經螢火蟲螢光素酶校準後的海腎螢光素酶表達情況的檢測來反映，檢測使用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega，E2940)。

HEK293A細胞培養於含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，在37℃，5% CO₂條件下培養。轉染前24h，將HEK293A細胞接種於96孔板，接種密度為每孔1萬個細胞，每孔100μL培養基。

按照說明書，使用Lipofectamine2000(ThermoFisher，11668019)對細胞共轉染siRNA及對應質粒，每孔使用0.2μL Lipofectamine2000。質粒轉染量為10ng每孔。對於在靶序列質粒和脫靶序列質粒，siRNA共設置5個濃度點或11個濃度點。5個濃度點條件下，轉染時最高濃度點為10nM，10倍梯度稀釋；11個濃度點條件下，轉染時最高濃度點終濃度為20nM，3倍梯度稀釋。轉染後24h，採用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega，E2940)檢測脫靶水平。

表16-表19結果表明，本公開的化合物TRD006890和TRD006924具有高的在靶活性的同時，還具有低脫靶性，均顯著優於陽性對照AD81890。

表20結果表明，GNA修飾具有明顯的序列位點依賴性。當GNA修飾位點在AS鏈5’第7位(TRD006912)或第6位時(AD81890)，脫靶活性均較高，預示著毒性較大。此外，TRD006912相對於AD81890，在靶活性進一步降低(0.68降低為0.96)。

表16. TRD006890活性及脫靶IC50值

表17. TRD006924活性IC50值

表18. AD81890活性及脫靶IC50值

表19. AD66810活性及脫靶IC50值

表20. TRD006912活性及脫靶IC50值

實施例17應用HepG2.2.15細胞評價siRNA化合物體外抗HBV活性

第1天種HepG2.2.15細胞到96孔板，每孔2萬個細胞。種細胞同時用RNAiMax將不同濃度的siRNA轉入HepG2.2.15細胞；第4天收集細胞培養上清，ELISA檢測HBsAg(剩餘上清凍存備用)。最後收集細胞，提取細胞內RNA，RT-PCR分別檢測總HBV RNA(包括3.5kb+2.4kb+2.1kb+0.7kb RNA)和3.5kb HBV RNA(包括pgRNA+preCore RNA)，同時檢測GAPDH基因RNA作為內參。待測化合物為5個濃度點，平行測定2複孔。培養液中DMSO的終濃度為0.5%。

抑制百分比計算公式如下：

% HBsAg抑制率=(1-樣品中HBsAg含量/DMSO對照組中HBsAg含量)×100

% HBV RNA抑制率=(1-樣品中HBV的RNA含量/DMSO對照組中HBV的RNA含量)×100

%細胞活力=(樣品吸光值-培養液對照的吸光值)/(DMSO對照的吸光值-培養液對照的吸光值)×100。

應用Graphpad Prism軟體分析(four parameter logistic equations)計算EC50值。

表21. 化合物在HepG2.2.15的抗病毒活性

如表21所示，參比對照化合物AD66810及AD81890，綜合抗病毒活性檢測指標，測試化合物TRD006890、TRD006894、TRD006895、TRD006896、TRD006897、TRD006899、TRD006900、 TRD006905、TRD006906、TRD006907和TRD006908在HepG2.2.15細胞上展現出優秀的抗病毒活性。

實施例18應用人原代肝細胞評價siRNA化合物體外抗HBV感染活性

第0天種人原代肝細胞到48孔板，每孔細胞數量為12萬個。種細胞同時加入待測化合物，採用自由攝取的方式將siRNA轉入人原代肝細胞，siRNA起始濃度為200nM，5倍稀釋7個濃度。第1天，加入D型HBV感染人原代肝細胞。第2、4和6天，更換新鮮培養基，培養液中DMSO的終濃度為2%。第8天，收集細胞培養上清，qPCR檢測HBV DNA，ELISA檢測HBeAg和HBsAg。待測化合物和對照化合物均7個濃度點，平行測定2複孔。

表22. 化合物在人原代肝細胞的抗病毒活性

如表22所示，參比對照化合物AD81890，綜合抗病毒活性檢測指標，測試化合物TRD006894在人原代肝細胞上展現出顯著性更優的抗病毒活性。

實施例19 siRNA化合物體內抗HBV活性

第28天，小鼠(C57BL/6，雄性)經尾靜脈注射rAAV8-1.3HBV。病毒注射後第14天和第21天，所有實驗小鼠藉由頜下靜脈採血用於收集血漿。血漿用於測試HBV DNA、HBeAg和HBsAg含量。

病毒注射後第28天，根據病毒注射後第14天和第21天血漿樣品的測試結果，將小鼠隨機分組。

所有小鼠在病毒注射後第28天開始皮下給藥，給藥1次，給藥劑量為3mg/kg。給藥前所有小鼠頜下採血收集血漿，用於檢測HBV DNA、HBeAg，HBsAg和ALT。給藥當天為第0天。給藥後第7天、14天、21天所有小鼠頜下採血用於收集血漿，用於檢測。

應用qPCR定量血漿HBV DNA。應用ELISA定量血漿中HBeAg和HBsAg。

第7天，參比對照化合物AD81890，測試化合物TRD006894在小鼠體內展現出優秀的抗病毒活性。測試化合物TRD006894在體內能夠維持較長時間的活性，在第14天、第21天均能夠有效抑制病毒活性。

表23. 化合物在體內抗HBV活性

實施例20人ApoC3 siRNA的設計和合成

1)siRNA設計，以人ApoC3基因(NM_000040.3)作為靶基因，以滿足活性siRNA的一般規則設計19/21nt的siRNA。未經修飾的有義鏈及反義鏈序列詳見表14，其中未修飾siRNA的SS鏈、AS鏈均未修飾。

2)siRNA合成，使用通用固體支撐物(深圳逗點生物)介導的亞磷醯胺化學於Dr.Oligo48合成器(Biolytic)上以200納莫耳(nmol)規格合成。目標寡核苷酸收集後凍乾，並經LC-MS鑑定為目標產物，再經過UV(260nm)定量。

在合成AS鏈5’第7位修飾的核苷酸時，使用實施例1合成的亞磷醯胺單體替換母序列原核苷酸。經過AS鏈5’第7位修飾的反義鏈序列詳見表14，其中，W’選自：

、

或

；

其中，M為O或S；其中，B選自表24對應位置的天然鹼基。

ApoC3 siRNA經過2’-氟、2’-甲氧基等修飾的有義鏈和反義鏈序列詳見表25，ApoC3 siRNA綴合物有義鏈和反義鏈序列詳見表26。

按照上述步驟分別合成的有義鏈和反義鏈，根據等莫耳比進行退火，使它們藉由氫鍵形成雙鏈結構，最後將所得到的雙鏈siRNA溶於1×PBS中，並調整至實驗所需濃度。

表24. 人ApoC3 siRNA的有義鏈和反義鏈

表25. 人ApoC3 siRNA的經修飾的有義鏈和反義鏈

表26. 人ApoC3 siRNA綴合物的經修飾的有義鏈和反義鏈

表25至表26中，將由2-羥甲基-1,3-丙二醇為起始原料合成的核苷酸定義hmpNA；hmpNA為消旋結構；

(-)hmpNA(A)為實施例1.1節中核苷亞磷醯胺單體1-1a藉由固相合成獲得；(+)hmpNA(A)為旋光異構體；

(-)hmpNA(G)為實施例1.6節中核苷亞磷醯胺單體1-3a藉由固相合成獲得；(+)hmpNA(G)為旋光異構體；

(-)hmpNA(C)為實施例1.8節中核苷亞磷醯胺單體1-8a藉由固相合成獲得；(+)hmpNA(C)為旋光異構體；

(-)hmpNA(U)為實施例1.7節中核苷亞磷醯胺單體1-7a藉由固相合成獲得；(+)hmpNA(U)為旋光異構體。

小寫字母m表示該字母m左側相鄰的一個核苷酸為2'-甲氧基修飾的核苷酸；小寫字母f表示該字母f左側相鄰的一個核苷酸為2'-氟修飾的核苷酸；

小寫字母s在大寫字母中間時表示與該字母s左右相鄰的兩個核苷酸之間的連接為硫代磷酸酯基連接；

小寫字母s在3’端第一個時表示與該字母s左側相鄰的一個核苷酸末端為硫代磷酸酯基。

表26中，NAG1結構如實施例11中所示。

實施例21 siRNA對Huh7細胞中人ApoC3的抑制-單濃度點抑制活性篩選

在體外測試靶向人ApoC3的siRNA對人ApoC3 mRNA表達水平的影響。Huh7細胞培養於含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，在37℃，5% CO₂條件下培養。轉染前24h，將Huh7細胞接種於96孔板，接種密度為每孔1萬個細胞，每孔100μL培養基。

參照產品說明手冊，使用Lipofectamine RNAiMAX(ThermoFisher，13778150)轉染siRNA，siRNA轉染的終濃度為10nM。在處理24小時後，使用TaqMan^TM Fast Advanced Cells-to-CT^TM Kit(ThermoFisher,A35378)進行細胞裂解、一步法反轉錄和定量實時PCR檢測，測定人ApoC3的mRNA水平，根據ACTIN內參基因水平對人ApoC3的mRNA水平進行校正。

96孔板細胞活性篩選(Cells-to-CT)實驗材料和儀器參見實施例3.1節表1和表2。

96孔板細胞活性篩選(Cells-to-CT)實驗步驟：

(一)細胞轉染實驗，轉染複合物成分的用量如表27所示：

表27. 96孔板每孔所需轉染複合物用量

(二)Cells-to-CT法提取細胞RNA實驗和細胞RNA逆轉錄實驗，逆轉錄反應體系如表29所示，反應條件如表30所示。

表28. Cells-to-CT試劑盒組分及儲存條件

表29. 細胞RNA逆轉錄反應體系

表30. 逆轉錄反應條件

逆轉錄結束後，樣本可放4℃冰箱中待Taqman Q-PCR用或保存於-40℃冰箱(6個月)。

(三)Taqman探針Q-PCR檢測實驗

1.反應試劑盒(ThermoFisher TaqMan Fast Advanced Master Mix(4444964)，檢查試劑盒保質期，試劑盒組分保存於-40℃冰箱，溶解使用後存放於4℃冰箱)；

2.在Microtube中配製下列反應混合液(表32)，引子的工作濃度為10μM。

表31. Taqman探針引子信息表

表32. Taqman探針Q-PCR檢測反應檢測液

將樣品放入RT-PCR儀中，按表33的反應程序進行反應(40個循環反應)。

表33. RT-PCR反應程序

3.結果分析方法

Taqman探針Q-PCR檢測實驗完畢後，按照系統自動設定的閾值獲取相應的Ct值，可以藉由Ct值比較，相對定量某個基因的表達：比較Ct指的是藉由與內參基因Ct值之間的差值來計算基因表達差異，也稱之是2^-△△ct，△△Ct=[(Ct實驗組目的基因-Ct實驗組內參)-(Ct對照組目的基因-Ct對照組內參)]。抑制率(%)=(1-目的基因表達剩餘量)*100%。

實驗結果以相對於經過對照siRNA處理的細胞人ApoC3 mRNA表達的剩餘百分比來表示，結果見表34。

表34. siRNA對Huh7細胞中人ApoC3抑制作用單濃度點篩選結果

實施例22 siRNA對Huh7細胞中人ApoC3的抑制-五濃度點抑制活性

在Huh7細胞中採用5個濃度梯度siRNA進行篩選。各個siRNA樣品轉染起始終濃度為10nM，10倍梯度稀釋，五個濃度點。

Huh7細胞培養於含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，在37℃，5% CO₂條件下培養。轉染前24h，將Huh7細胞接種於96孔板，接種密度為每孔1萬個細胞，每孔100μL培養基。

參照產品說明手冊，使用Lipofectamine RNAiMAX(ThermoFisher，13778150)轉染siRNA，siRNA轉染的終濃度為10nM、1nM、0.1nM、0.01nM、0.001nM。在處理24小時後，使用TaqMan^TM Fast Advanced Cells-to-CT^TM Kit(ThermoFisher,A35378)進行細胞裂解、一步法反轉錄和定量實時PCR檢測，測定人ApoC3的mRNA水平，根據ACTIN內參基因水平對人ApoC3的mRNA水平進行校正。

結果以相對於經過對照siRNA處理的細胞的人ApoC3 mRNA表達剩餘百分比來表示。抑制率的IC50結果見表35。

實驗步驟參考實施例21中的96孔板細胞活性篩選(Cells-to-CT)實驗步驟。

表35. siRNA對Huh7細胞中人ApoC3的多劑量抑制活性

實施例23 siRNA的psiCHECK在靶活性及脫靶水平驗證

在Huh 7細胞中採用11個濃度梯度對siRNA進行體外分子水平模擬在靶及脫靶水平篩選。結果表明，本公開的siRNA具有高活性的同時，還具有低脫靶性。

Huh 7細胞培養於含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，在37℃，5% CO₂條件下培養。轉染前24h，將Huh7細胞接種於96孔板，接種密度為每孔1萬個細胞，每孔100μL培養基。

按照說明書，使用Lipofectamine2000(ThermoFisher，11668019)對細胞共轉染siRNA及對應質粒，每孔使用0.2μL Lipofectamine2000。質粒轉染量為10ng每孔。對於在靶和脫靶質粒，siRNA共設置11個濃度點，最高濃度點終濃度為40nM，3倍梯度稀釋(40nM，13.3nM，4.44nM，1.48nM，0.494nM，0.165nM，0.0549nM，0.0183nM，0.00609nM，0.00203nM和0.000677nM)。轉染後24h，採用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega，E2940)檢測脫靶水平。結果如表37-表40所示。

在Huh7細胞系裡、藉由進行psi-CHECK篩選實驗檢測表35中活性較好的siRNA的在靶/脫靶活性。

Psi-CHECK質粒購自於蘇州泓迅生物科技股份有限公司和生工生物工程(上海)股份有限公司。

實驗材料和儀器詳見實施例3.1表1和表2，實驗結果詳見表37-表40。psiCHECK活性篩選實驗步驟參見實施例3.2，其中，siRNA樣品多濃度稀釋方案如表36所示。結果如表37-表40所示。

表36. siRNA樣品多濃度稀釋方案

表37. siRNA的psiCHECK在靶活性篩選結果(GSCM)

表38. siRNA的AS鏈種子區psiCHECK脫靶活性篩選結果(GSSM)

表39. 脫靶活性篩選結果(PSCM)

表40. 脫靶活性篩選結果(PSSM)

實施例24 siRNA對Huh7細胞中人ApoC3的抑制-11個濃度點抑制活性

在Huh7細胞中採用11個濃度梯度對實施17中表現出80%或更高的體外抑制(20%或更低mRNA剩餘表達水平)的siRNA進行脫靶修飾(AS鏈第7位修飾)後進行Huh7細胞活性篩選。各個siRNA樣品轉染起始終濃度為40nM，3倍梯度稀釋，11個濃度點。

參照產品說明手冊，使用Lipofectamine RNAiMAX(ThermoFisher，13778150)轉染siRNA，siRNA轉染的終濃度為40nM、13.3nM、4.44nM、1.48nM、0.494nM、0.165nM、0.0549nM、0.0183nM、0.00609nM、0.00203nM和0.000677nM。在處理24小時後，使用TaqMan^TM Fast Advanced Cells-to-CT^TM Kit(ThermoFisher,A35378)進行細胞裂解、一步法反轉錄和定量實時PCR檢測，測定人ApoC3的mRNA水平，根據ACTIN內參基因水平對人ApoC3的mRNA水平進行校正。

結果以相對於經過對照siRNA處理的細胞的人ApoC3 mRNA表達剩餘百分比來表示。抑制率的IC50結果見表41。

表41. siRNA對Huh7細胞中人ApoC3的多劑量抑制活性

實施例25 siRNA的psiCHECK在靶活性及脫靶水平驗證

在HEK293A細胞中採用11個濃度梯度對siRNA修飾(AS鏈第7位修飾)後進行體外分子水平模擬在靶及脫靶活性篩選。結果表明，本公開的siRNA具有高活性的同時，還具有低脫靶性。實驗步驟參見實施例16，其中，針對siRNA的反義鏈，為了提高檢測靈敏度，構建了GSSM-5hits脫靶質粒，即5條相同的GSSM序列藉由TTCC連接組成。

結果如表43-表46所示。結果表明，siRNA都具有高水平的體外在靶抑制活性(GSCM IC50值小於0.3nM)，無明顯脫靶現象。

psiCHECK活性篩選實驗步驟

在HEK293A細胞系裡、藉由進行psi-CHECK活性實驗檢測siRNA的活性。實驗材料和儀器詳見實施例3.1表1和表2，實驗結果詳見表43-表46。

psiCHECK活性篩選實驗步驟參見實施例3.2，其中，siRNA樣品多濃度稀釋方案如表42所示。

表42. 多濃度siRNA稀釋方案

表43. siRNA的psiCHECK在靶活性篩選結果(GSCM)

表44. siRNA的AS鏈種子區psiCHECK脫靶活性篩選結果(GSSM-5hits)

表45. siRNA的SS鏈psiCHECK脫靶活性篩選結果(PSCM)

表46. siRNA的SS鏈種子區psiCHECK脫靶活性篩選結果(PSSM)

實施例26 siRNA對Huh7細胞中人ApoC3的抑制-11個濃度點抑制活性

在Huh7細胞中採用11個濃度梯度對siRNA進行修飾(AS鏈第7位)後再進行Huh7細胞活性篩選。各個siRNA樣品轉染起始終濃度為20nM，3倍梯度稀釋，11個濃度點。

參照產品說明手冊，使用Lipofectamine RNAi MAX(ThermoFisher，13778150)轉染siRNA，siRNA轉染的終濃度為20nM、6.67nM、2.22nM、0.741nM、0.247nM、0.0823nM、0.0274nM、0.00914nM、0.00305nM、0.00102nM和0.000339nM。在處理24小時後，使用高通量細胞RNA提取試劑盒進行細胞總RNA提取、RNA逆轉錄實驗和定量實時PCR檢測，測定人ApoC3的mRNA水平，根據ACTIN內參基因水平對人ApoC3的mRNA水平進行校正。

結果以相對於經過對照siRNA處理的細胞的人ApoC3 mRNA表達剩餘百分比來表示。抑制率的IC50結果見表53。

96孔板細胞活性篩選(核酸提取儀)實驗材料參見表1和表2。

96孔板細胞活性篩選(核酸提取儀)實驗步驟：

I.細胞轉染實驗

參照實施例21中的細胞轉染實驗操作。

其中，轉染複合物成分的用量如表47所示：

表47. 96孔板每孔所需轉染複合物用量

II.核酸提取儀(磁珠法)提取細胞RNA實驗

1.實驗準備：高通量細胞RNA提取試劑盒((FG0417-L/FG0418-XL，磁珠法)。

表48. 細胞RNA提取試劑盒組分及儲存條件

2.向6個深孔板中分別加入以下試劑。

表49. 6個深孔板中分別加入不同的試劑組分和體積

細胞裂解液配製：200μL裂解液LB+3.5μL 1M DTT溶液；吸盡96孔板中的培養基上清，加入200μL/孔，裂解5分鐘。

DNase I Mix溶液：3.4μL DNase I+5μL DNase稀釋液+41.6μL 0.1% DEPC水(50μL每孔，充分混勻，DNase I Mix配置好後置於冰上。

儀器程序選擇：Cell RNA 96。

3.將6個深孔板分別置於核酸提取儀相應的6個卡槽裡且做好相應標記，並將磁棒套放於96深孔板3中，啟動儀器運行細胞RNA提取程序，35分鐘之後暫停程序，取出96深孔板2並向其中加入220μL緩衝液WB1並繼續運行細胞RNA提取程序。

4.核酸提取完成後，測定濃度後，用鋁箔封口膜封住96深孔板，並做好完整標記，可放4度冰箱中待逆轉錄實驗使用或保存於-40℃冰箱。

III.細胞RNA逆轉錄實驗

1.實驗準備：①逆轉錄試劑盒(Takara PrimeScript^TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(6210A)，檢查試劑盒保質期，試劑盒組分均保存於-40℃冰箱)。

表50. 逆轉錄試劑盒組分

2.在Microtube中配製下列反應混合液(Mix1)。

表51. 反應混合液Mix1

65℃保溫5min後，冰上迅速冷卻2min。(注：上述處理可使模板RNA變性，提高反轉錄效率。

3.在Microtube管中配製下列反轉錄反應液(Mix2)。

表52. 反應混合液Mix2

取10μL Mix2反應液加入Mix1中，總體積共20μL，按以下過程進行反轉：42℃ 45min--95℃ 5min--4℃ Forever。

4.反轉結束後，向各管補DEPC水80μL(終濃度10ng/μL)，樣本可放4度冰箱中待Taqman Q-PCR用或保存於-40℃冰箱。

IV. Taqman探針Q-PCR檢測實驗，實驗步驟參見實施例16，實驗結果見表53。

表53. siRNA對Huh7細胞中人ApoC3的多劑量抑制活性

實施例27 siRNA的PsiCHECK在靶活性及脫靶水平驗證

在HEK293A細胞中採用11個濃度梯度對待測化合物進行體外分子水平模擬在靶及脫靶水平篩選。結果表明，本公開的siRNA具有高活性的同時，還具有低脫靶性。Psi-CHECK質粒購自於蘇州泓迅生物科技股份有限公司和生工生物工程(上海)股份有限公司。實驗步驟參見實施例16，針對siRNA的反義鏈，為了提高檢測靈敏度，構建了GSSM-5hits脫靶質粒，即5條相同的GSSM序列藉由TTCC連接組成。

結果表明，6條siRNA都具有高水平的體外在靶抑制活性(GSCM IC50值小於0.3nM)。siRNA的脫靶評估(GSSM-5hits，PSCM，PSSM)結果表明，5條siRNA無明顯脫靶現象。

在HEK293A細胞系裡、藉由進行psi-CHECK活性實驗檢測6條siRNA的活性。實驗結果詳見表54-表57。

表54. siRNA的psiCHECK在靶活性篩選結果(GSCM)

表55. siRNA的AS鏈種子區psiCHECK脫靶活性篩選結果(GSSM-5hits)

表56. siRNA的SS鏈psiCHECK脫靶活性篩選結果(PSCM)

表57. siRNA的SS鏈種子區psiCHECK脫靶活性篩選結果(PSSM)

實施例28 siRNA對Hep3B細胞中人ApoC3的抑制-11個濃度點抑制活性

在Hep3B細胞中採用11個濃度梯度對待測化合物進行Hep3B細胞活性篩選。各個siRNA樣品轉染起始終濃度為20nM，3倍梯度稀釋，11個濃度點。

Hep3B細胞培養於含10%胎牛血清的MEM培養基中，在37℃，5% CO₂條件下培養。轉染前24h，將Hep3B細胞接種於96孔板，接種密度為每孔1萬個細胞，每孔100μL培養基。

參照產品說明手冊，使用Lipofectamine RNAi MAX(ThermoFisher，13778150)轉染siRNA，siRNA轉染的終濃度為20nM、6.67nM、2.22nM、0.741nM、0.247nM、0.0823nM、0.0274nM、0.00914nM、0.00305nM、0.00102nM和0.000339nM。在處理24小時後，使用高通量細胞RNA提取試劑盒進行細胞總RNA提取、RNA逆轉錄實驗和定量實時PCR檢測，測定人ApoC3的mRNA水平，根據ACTIN內參基因水平對人ApoC3 mRNA水平進行校正。

結果以相對於經過對照siRNA處理的細胞的人ApoC3 mRNA表達剩餘百分比來表示。抑制率的IC50結果見表58。

表58. siRNA對Hep3B細胞中人ApoC3的多劑量抑制活性

實施例29 siRNA對人原代肝細胞(PHH)中人ApoC3的抑制-11個濃度點抑制活性

在人原代肝細胞(PHH)中採用11個濃度梯度對待測化合物進行人原代肝細胞(PHH)活性篩選。各個siRNA樣品轉染起始終濃度為20nM，3倍梯度稀釋，11個濃度點。

人原代肝細胞(PHH)凍存於液氮中，轉染前24h，將人原代肝細胞(PHH)復蘇後接種於96孔板，接種密度為每孔4萬個細胞，每孔100μL培養基。

參照產品說明手冊，使用Lipofectamine RNAi MAX(ThermoFisher，13778150)轉染siRNA，siRNA轉染的梯度終濃度為20nM、6.67nM、2.22nM、0.741nM、0.247nM、0.0823nM、0.0274nM、0.00914nM、0.00305nM、0.00102nM和0.000339nM。在處理24小時後，使用高通量細胞RNA提取試劑盒進行細胞總RNA提取、RNA逆轉錄實驗和定量實時PCR檢測，測定人ApoC3的mRNA水平，根據ACTIN內參基因水平對人ApoC3的mRNA水平進行校正。

結果以相對於經過對照siRNA處理的細胞的人ApoC3 mRNA表達剩餘百分比來表示。抑制率的IC50結果見表59，均能有效抑制人ApoC3 mRNA表達。

表59. siRNA對人原代肝細胞(PHH)中人ApoC3的多劑量抑制活性

實施例30 siRNA對猴原代肝細胞中猴ApoC3的抑制-11個濃度點抑制活性

在猴原代肝細胞中採用11個濃度梯度對待測化合物進行猴原代肝細胞活性篩選。各個siRNA樣品轉染起始終濃度為20nM，3倍梯度稀釋，11個濃度點。

參照產品說明手冊，使用Lipofectamine RNAi MAX(ThermoFisher，13778150)轉染siRNA，siRNA轉染的梯度終濃度為20nM，6.67nM，2.22nM，0.741nM，0.247nM，0.0823nM，0.0274nM，0.00914nM，0.00305nM，0.00102nM和0.000339nM；提前配製好以上濃度的處理液並加入到96孔板中。猴原代肝細胞凍存於液氮中，將猴原代肝細胞復蘇後接種於96孔板(已加siRNA樣品)，接種密度為每孔3萬個細胞，每孔100μL培養基。

在逆向轉染處理24小時後，更換培養基並繼續培養24小時後，使用高通量細胞RNA提取試劑盒進行細胞總RNA提取、RNA逆轉錄實驗和定量實時PCR檢測，測定猴ApoC3的mRNA水平，根據GAPDH內參基因水平對猴ApoC3的mRNA水平進行校正。

結果以相對於經過對照siRNA處理的細胞的猴ApoC3 mRNA表達剩餘百分比來表示。抑制率的IC50結果見表61，均能有效抑制猴原代肝細胞中猴ApoC3 mRNA表達。

表60. Taqman探針引子信息表(工作濃度為10μM)

表61. siRNA對猴原代肝細胞中猴ApoC3的多劑量抑制活性

實施例31 siRNA試劑於Apoc3轉基因小鼠中的體內測試

為了評價和評估某些ApoC3 siRNA試劑的體內效應，商購並使用ApoC3轉基因小鼠(The Jackson Laboratory,006907-B6；CBA-Tg(APOC3)3707Bres/J)。對於ApoC3轉基因小鼠，根據試劑盒(Roche Cobas C311：CHOL2 & TRIGL；MSD Human ApoC3 antibody set(B21ZV-3))製造商的推薦，進行實驗並測量血清中的人ApoC3蛋白、甘油三酯和總膽固醇。

對於歸一化，將各動物在時間點的ApoC3蛋白、甘油三酯和總膽固醇除以該動物的處理前表達水平，以測定“針對給藥前歸一化”的表達比率。

可在施用ApoC3 siRNA試劑之前和之後的各時間測量ApoC3蛋白、甘油三酯和總膽固醇。除非在本文中另外所示，否則小鼠從頜下區收集血液樣品至加有肝素鈉的離心管中。血樣與肝素鈉充分混勻後，將管以3,000×g離心5分鐘以分離血漿且儲存在4℃下。

使用上述的ApoC3轉基因小鼠模型。在第0天，向各小鼠給予以下的單次皮下施用：200μl溶解於PBS(1x)中的相應siRNA試劑或對照(PBS(1x))(即Vehicle組)，其包括下表62中所示的給藥組。

表62. ApoC3轉基因小鼠的給藥組

ApoC3 siRNA試劑在皮膚和肌肉之間進行注射(即，皮下注射)。每組測試六隻小鼠(n=6)。在第-2天(在過夜禁食的情況下給藥前採血)和第7天以及第14天、第21天、第28天、第35天和第42天收集血清；小鼠在每次收集前過夜禁食。根據試劑製造商的推薦，在儀器上測量血清中的ApoC3蛋白、甘油三酯和總膽固醇。

將各動物的ApoC3蛋白水平、甘油三酯水平和總膽固醇水平歸一化。對於歸一化，將各動物在時間點的ApoC3蛋白、甘油三酯、和總膽固醇的水平分別除以該動物中的處理前表達水平(在該情況下，在第-2天)，以測定“針對處理前歸一化的”表達比率。

來自實驗的數據顯示於下文表63至表65中和圖7至圖9。各給藥組(即，組2至6)中的ApoC3 siRNA試劑各自顯示相比於對照(組1)的ApoC3蛋白水平、甘油三酯水平和總膽固醇水平均顯著降低。

表63. 針對處理前歸一化的平均總膽固醇(TC)

表64. 針對處理前歸一化的平均甘油三酯(TG)

表65.針對處理前歸一化的平均ApoC3蛋白

實施例32評估AS鏈9位和10位不同修飾

本實驗考察本公開的不同位點2’-氟修飾的siRNA綴合物在體內對靶基因mRNA表達量的抑制效率。

將雄性6-8週齡C57BL/6小鼠隨機分組，每組共6隻，每個時間點各3隻，分別向每組小鼠給予測試綴合物(TRD007047和TRD006870)、對比綴合物(TRD002218)以及PBS。

所有動物依據體總計算給藥量，採用皮下注射方式單次給藥，siRNA綴合物給藥劑量(以siRNA的量計)為1mg/kg，給藥體積為5mL/kg。給藥7天後處死小鼠，收集肝臟，用RNA later(Sigma Aldrich公司)保存；隨後用組織勻漿儀勻漿肝組織，再用組織RNA提取試劑盒(凡知醫療科技，FG0412)根據操作說明書標注的操作步驟提取得到肝組織總RNA。將總RNA反轉錄成cDNA並採用實時螢光定量PCR方法檢測肝組織中的TTR mRNA的表達量。在該螢光定量PCR法中，以甘油醛 3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因作為內參基因，使用針對TTR和GAPDH的Taqman探針引子分別檢測TTR和GAPDH的mRNA表達量。

TTR mRNA表達量按照如下等式計算：

TTR mRNA表達量=【(測試組TTR mRNA表達量/測試組GAPDH mRNA表達量)/(對照組TTR mRNA表達量/對照組GAPDH mRNA表達量)】x 100%

化合物信息見表66，小鼠體內待測化合物分組信息見表67，檢測引子的序列參見表68。

表66. 化合物信息

表67. 小鼠體內待測化合物分組信息

表68. 檢測引子的序列

給藥28天後，本公開的不同位點F修飾的siRNA綴合物的在體內對靶基因mRNA表達量的抑制效率見表69。參比陽性對照化合物 TRD002218，不同位點F修飾的siRNA化合物在給藥後28天對於TTR mRNA的表達抑制高於參比陽性化合物，9F和10F的修飾方法均表現出高抑制效率且無顯著性差異，說明9F和10F的修飾方法能夠介導更高效的siRNA抑制效率。

表69. 實驗結果

Claims

一種siRNA，其包含有義鏈和反義鏈，每條鏈具有15至35個核苷酸，該反義鏈在其5’區域的第2位至第8位中的至少一個核苷酸位置處包含式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾：

其中，Y選自O、NH和S；

每個X獨立地選自CR₄(R₄’)、S、NR₅和NH-CO，其中R₄、R₄’、R₅分別獨立地為H或C₁-C₆烷基；

J₂為H或C₁-C₆烷基；

n=0、1或2；

m=0、1或2；

s=0或1；

R₃選自H、OH、鹵素、NH₂、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-烷基胺基和(CH₂)_pR₆；其中R₆選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，p=1、2或3；

Q₁為
，Q₂為R₂；或者

Q₁為R₂，Q₂為
；

其中，

R₁選自H、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基和(CH₂)_qR₇；其中R₇選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，q=1、2或3；

J₁為H或C₁-C₆烷基；

R₂選自H、OH、鹵素、NH₂、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-烷基胺基和(CH₂)_rR₈；其中R₈選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，r=1、2或3；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

B是鹼基；

其中，該式(I)所示的化學修飾不是
；

較佳地，當X為NH-CO時，R₁不是H。
如請求項1所述的siRNA，其中該反義鏈在其5’區域的第2位至第8位中的至少一個核苷酸位置處包含式(I-1)所示的化學修飾或其互變異構體修飾：

較佳地，

Y為O或NH；

每個X獨立地選自NH-CO、CH₂和NH；

n=0或1；

m=0或1；

s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H；

R₁選自H、甲基和CH₂OH；

R₂選自H、OH、NH₂、甲基和CH₂OH；

R₃選自H、OH、NH₂、甲基和CH₂OH；

任選地，R₁和R₂直接相連成環。
如請求項1所述的siRNA，其中該反義鏈在其5’區域的第2位至第8位中的至少一個核苷酸位置處包含式(I-2)所示的化學修飾或其互變異構體修飾：

其中

R₁選自H、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基和(CH₂)_qR₇；其中R₇選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，q=1、2或3；R₂選自H、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-烷基胺基和(CH₂)_rR₈；其中R₈選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基；r=1、2或3；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

較佳地，

Y為O或NH；

每個X獨立地選自NH-CO、CH₂和NH；

n=0或1；

m=0或1；

s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H；

R₁選自H、甲基和CH₂OH；

R₂選自H、甲基和CH₂OH；

R₃選自H、OH、NH₂、甲基和CH₂OH；

任選地，R₁和R₂直接相連成環。
如請求項1所述的siRNA，其中，

每個X獨立地選自CR₄(R₄’)、S、NR₅和NH-CO，其中R₄、R₄’、R₅分別獨立地為H、甲基、乙基、正丙基或異丙基；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或甲基；

R₃選自H、OH、F、Cl、NH₂、甲基、乙基、正丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、乙烯基、烯丙基、乙炔基、炔丙基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-甲基胺基、-O-乙基胺基和(CH₂)_pR₆；其中R₆選自OH、F、Cl、甲氧基、乙氧基、N₃、乙烯基、烯丙基、乙炔基和炔丙基，p=1或2；

R₁選自H、甲基、乙基、正丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、乙烯基、烯丙基、乙炔基、炔丙基和(CH₂)_qR₇；其中R₇選自OH、F、Cl、甲氧基、乙氧基、N₃、乙烯基、烯丙基、乙炔基和炔丙基，q=1或2；

R₂選自H、OH、F、Cl、NH₂、甲基、乙基、正丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、乙烯基、烯丙基、乙炔基、炔丙基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-甲基胺基、-O-乙基胺基和(CH₂)_rR₈；其中R₈選自OH、F、Cl、甲氧基、乙氧基、N₃、乙烯基、烯丙基、乙炔基和炔丙基，r=1或2；

任選地，R₁和R₂直接相連成環。
如請求項1至4中任一項所述的siRNA，其中該化學修飾選自以下任一結構：

，較佳：

，更佳：
如請求項1至5中任一項所述的siRNA，該反義鏈在其5’區域的第5位、第6位或第7位，較佳在第7位的核苷酸位置處包含如請求項1至5中任一項所定義的式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾。
如請求項1至6中任一項所述的siRNA，除包含被請求項1至5中任一項所定義的式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾的核苷酸外，該有義鏈和/或反義鏈中的至少一條還包含至少一個其他修飾的核苷酸；

較佳地，除包含被如請求項1至5中任一項所定義的式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾的核苷酸外，該有義鏈和/或反義鏈中的其餘核苷酸為其他修飾的核苷酸。
如請求項7所述的siRNA，其中該其他修飾的核苷酸相互獨立地選自：2'-甲氧基修飾的核苷酸、2'-氟修飾的核苷酸和2'-脫氧-修飾的核苷酸。
如請求項1至8中任一項所述的siRNA，其中，

按照5'末端到3'末端的方向，該反義鏈的第2、6和14的核苷酸各自獨立地為2'-氟修飾的核苷酸；

較佳地，按照5'末端到3'末端的方向，該反義鏈的第2、6、14和16位的核苷酸各自獨立地為2'-氟修飾的核苷酸；

較佳地，按照5'末端到3'末端的方向，該反義鏈的第2、6、12和14位的核苷酸各自獨立地為2'-氟修飾的核苷酸；

更佳地，按照5'末端到3'末端的方向，該反義鏈的第2、4、6、12、14、16和18位的核苷酸各自獨立地為2'-氟修飾的核苷酸；

還更佳地，按照5'末端到3'末端的方向，該反義鏈的第2、4、6、9、12、14、16和18位的核苷酸各自獨立地為2'-氟修飾的核苷酸；

還更佳地，按照5'末端到3'末端的方向，該反義鏈的第2、4、6、10、12、14、16和18位的核苷酸各自獨立地為2'-氟修飾的核苷酸。
如請求項1至9中任一項所述的siRNA，其中，

該有義鏈具有如下式所示的核苷酸序列：

5’-N_aN_aN_aN_aXN_aN_bN_bN_bN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_a-3’；

其中，每個X獨立地為N_a或N_b；每個N_a和N_b各自獨立地表示修飾的核苷酸或者未修飾的核苷酸，且N_a和N_b上的修飾不同；和/或，

該反義鏈具有如下式所示的核苷酸序列：

5’-N_a’N_b’N_a’X’N_a’N_b’W’N_a’X’Y’N_a’X’N_a’N_b’N_a’X’N_a’X’N_a’N_a’N_a’-3’；

其中，每個X’獨立地為N_a’或N_b’，Y’為N_a’或N_b’；每個N_a’和N_b’獨立地表示修飾的核苷酸或者未修飾的核苷酸，其中N_a’和N_b’上的修飾不同；W’表示含有如請求項1至6中任一項所定義的式(I)所示的化學修飾或其互變異構體修飾的核苷酸；

較佳地，

N_a為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b為2'-氟修飾的核苷酸；和/或

N_a’為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b’為2'-氟修飾的核苷酸。
如請求項10所述的siRNA，其中該反義鏈具有如下式所示的核苷酸序列：

5’-N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’W’N_a’X’Y’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’-3’；

其中，每個X’獨立地為N_a’或N_b’，Y’為N_a’或N_b’；

N_a’為2'-甲氧基修飾的核苷酸，

N_b’為2'-氟修飾的核苷酸；

W’如請求項10所限定。
如請求項1至11中任一項所述的siRNA，其中該有義鏈具有如下式所示的核苷酸序列：

5’-N_aN_aN_aN_aN_aN_aN_bN_bN_bN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_a-3’；或，

5’-N_aN_aN_aN_aN_bN_aN_bN_bN_bN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_aN_a-3’；

其中，N_a為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b為2'-氟修飾的核苷酸。
如請求項1至12中任一項所述的siRNA，其中該反義鏈具有如下式所示的核苷酸序列：

5’-N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’W’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’-3’或，

5’-N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’W’N_a’N_b’N_a’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_b’N_a’N_a’N_a’-3’；

其中，

N_a為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b為2'-氟修飾的核苷酸；和/或

N_a’為2'-甲氧基修飾的核苷酸，N_b’為2'-氟修飾的核苷酸；

W’如請求項10所限定；

較佳地，W’表示含有選自以下結構的化學修飾或其互變異構體修飾的核苷酸；

其中，B選自鳥嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶，

較佳地，B是反義鏈在其5’區域的第7位對應位置的鹼基。
如請求項1至13中任一項所述的siRNA，其中該有義鏈和/或該反義鏈中至少一個磷酸酯基為具有修飾基團的磷酸酯基，較佳為硫代磷酸酯基。
如請求項14所述的siRNA，其中該硫代磷酸酯基存在於選自以下的位置中的至少一處：

該有義鏈的5'末端的第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；

該有義鏈的5'末端的第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；

該有義鏈的3'末端的第1個核苷酸末端；

該有義鏈的3'末端的第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；

該有義鏈的3'末端的第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；

該反義鏈的5'末端的第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；

該反義鏈的5'末端的第2個核苷酸和第3個核苷酸之間；

該反義鏈的3'末端的第1個核苷酸末端；

該反義鏈的3'末端的第1個核苷酸和第2個核苷酸之間；以及

該反義鏈的3'末端的第2個核苷酸和第3個核苷酸之間。
一種siRNA綴合物，其包含：

如請求項1至15中任一項所述的siRNA；和

連接至該siRNA的綴合基團；

較佳地，該綴合基團包含藥學上可接受的靶向配體和任選的接頭，並且

該siRNA、該接頭和該靶向配體依次共價或非共價連接；

更佳地，該靶向配體靶向肝臟；

還更佳地，該靶向配體結合脫唾液酸糖蛋白受體；

進一步更佳地，該靶向配體包括半乳糖簇或半乳糖衍生物簇，該半乳糖衍生物選自N-乙醯基-半乳糖胺、N-三氟乙醯基-半乳糖胺、N-丙醯基-半乳糖胺、N-正丁醯基-半乳糖胺或N-異丁醯基半乳糖胺。
一種醫藥組成物，其包含：

如請求項1至15中任一項所述的siRNA；或

如請求項16所述的siRNA綴合物。
一種用於抑制靶基因或其mRNA表達的方法，該方法包括：

向有其需要的受試者施用有效量或有效劑量的如請求項1至15中任一項所述的siRNA、如請求項16所述的siRNA綴合物和/或如請求項17所述的醫藥組成物。
一種式(II)所示的化合物或其互變異構體，

其中，

Y選自O、NH和S；

每個X獨立地選自CR₄(R₄’)、S、NR₅和NH-CO，其中R₄、R₄’、R₅分別獨立地為H或C₁-C₆烷基；

J₂為H或C₁-C₆烷基；

n=0、1或2；

m=0、1或2；

s=0或1；

R₃選自H、OH、鹵素、NH₂、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-烷基胺基和(CH₂)_pR₆；其中R₆選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，p=1、2或3；

Q’₁為
，Q₂為R₂；或者

Q₁為R₂，Q’₂為
；

其中，

R₁選自H、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基和(CH₂)_qR₇；其中R₇選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，q=1、2或3；

J₁為H或C₁-C₆烷基；

R₂選自H、OH、鹵素、NH₂、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-烷基胺基和(CH₂)_rR₈；其中R₈選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，r=1、2或3；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

B是鹼基；和

W是離去基團；較佳地，W為MMTr或DMTr；

Z是含磷活性反應基團；

較佳地，Z是
；

其中，該式(II)所示的化合物不是
如請求項19所述的式(II)所示的化合物或其互變異構體，其中當X為NH-CO時，R₁不是H；並且該化合物不是：

和
，其中Z如請求項19所定義。
如請求項19或20所述的式(II)所示的化合物或其互變異構體，其為式(II-1)所示的化合物或其互變異構體，

其中，

W、Y、X、Z、B、J₁、J₂、n、m、s、R₁、R₂、R₃如請求項19所限定。
如請求項19或20所述的式(II)所示的化合物或其互變異構體，其為式(II-2)所示的化合物或其互變異構體，

其中，R₁選自H、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基和(CH₂)_qR₇；其中R₇選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，q=1、2或3；

R₂選自H、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-烷基胺基和(CH₂)_rR₈；其中R₈選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基；r=1、2或3；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

W、Y、X、Z、B、J₁、J₂、n、m、s、R₃如請求項19所限定。
如請求項19或21所述的式(II)所示的化合物或其互變異構體，其中，

每個X獨立地選自CR₄(R₄’)、S、NR₅和NH-CO，其中R₄、R₄’、R₅分別獨立地為H或C₁-C₃烷基；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或C₁-C₃烷基；

R₃選自H、OH、鹵素、NH₂、C₁-C₃烷基、C₁-C₃烷氧基、C₂-C₄烯基、C₂-C₄炔基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-烷基胺基和(CH₂)_pR₆；其中R₆選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，p=1、2或3；

R₁選自H、C₁-C₃烷基、C₁-C₃烷氧基、C₂-C₄烯基、C₂-C₄炔基和(CH₂)_qR₇；其中R₇選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₄烯基和C₂-C₄炔基，q=1、2或3；

R₂選自H、OH、鹵素、NH₂、C₁-C₃烷基、C₁-C₃烷氧基、C₂-C₄烯基、C₂-C₄炔基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-烷基胺基和(CH₂)_rR₈；其中R₈選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₄烯基和C₂-C₄炔基，r=1、2或3；

任選地，R₁和R₂直接相連成環。
如請求項19或21所述的式(II)所示的化合物或其互變異構體，其中，

每個X獨立地選自CR₄(R₄’)、S、NR₅和NH-CO，其中R₄、R₄’、R₅分別獨立地為H、甲基、乙基、正丙基或異丙基；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或甲基；

R₃選自H、OH、F、Cl、NH₂、甲基、乙基、正丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、乙烯基、烯丙基、乙炔基、炔丙基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-甲基胺基、-O-乙基胺基和(CH₂)_pR₆；其中R₆選自OH、F、Cl、甲氧基、乙氧基、N₃、乙烯基、烯丙基、乙炔基和炔丙基，p=1或2；

R₁選自H、甲基、乙基、正丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、乙烯基、烯丙基、乙炔基、炔丙基和(CH₂)_qR₇；其中R₇選自OH、F、Cl、甲氧基、乙氧基、N₃、乙烯基、烯丙基、乙炔基和炔丙基，q=1或2；

R₂選自H、OH、F、Cl、NH₂、甲基、乙基、正丙基、異丙基、甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、乙烯基、烯丙基、乙炔基、炔丙基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-甲基胺基、-O-乙基胺基和(CH₂)_rR₈；其中R₈選自OH、F、Cl、甲氧基、乙氧基、N₃、乙烯基、烯丙基、乙炔基和炔丙基，r=1或2；

任選地，R₁和R₂直接相連成環。
如請求項21所述的式(II)所示的化合物或其互變異構體，Y為O或NH；每個X獨立地選自NH-CO、CH₂和NH；

n=0或1；m=0或1；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H；

R₁選自H、甲基和CH₂OH；

R₂選自H、OH、NH₂、甲基和CH₂OH；

R₃選自H、OH、NH₂、甲基和CH₂OH；

任選地，R₁和R₂直接相連成環。
如請求項22所述的式(II)所示的化合物或其互變異構體，Y為O或NH；每個X獨立地選自NH-CO、CH₂和NH；

n=0或1；m=0或1；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H；

R₁選自H、甲基和CH₂OH；

R₂選自H、甲基和CH₂OH；

R₃選自H、OH、NH₂、甲基和CH₂OH；

任選地，R₁和R₂直接相連成環。
如請求項19至26中任一項所述的式(II)所示的化合物或其互變異構體，其選自：

以及它們中的腺嘌呤被置換為鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶。
一種式(III)所示的化合物或其互變異構體，

-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-烷基胺基和(CH₂)_pR₆；其中R₆選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，p=1、2或3；

Q”₁為
，Q₂為R₂；或者

Q₁為R₂，Q”₂為
；

其中，

R₁選自H、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基和(CH₂)_qR₇；其中R₇選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，q=1、2或3；

J₁為H或C₁-C₆烷基；

R₂選自H、OH、鹵素、NH₂、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-烷基胺基和(CH₂)_rR₈；其中R₈選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，r=1、2或3；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

B是鹼基；和

W是離去基團；較佳地，W為MMTr或DMTr；

其中，該化合物不是：

較佳地，當X為NH-CO時，R₁不是H。
如請求項28所述的式(III)所示的化合物或其互變異構體，其為式(III-1)所示的化合物或其互變異構體，

較佳地，

Y為O或NH；每個X獨立地選自NH-CO、CH₂和NH；

n=0或1；m=0或1；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H；

R₁選自H、甲基和CH₂OH；

R₂選自H、OH、NH₂、甲基和CH₂OH；

R₃選自H、OH、NH₂、甲基和CH₂OH；

任選地，R₁和R₂直接相連成環。
如請求項28所述的式(III)所示的化合物或其互變異構體，其為式(III-2)所示的化合物或其互變異構體，

其中，

R₁選自H、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、C₂-C₆烯基、C₂-C₆炔基和(CH₂)_qR₇；其中R₇選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，q=1、2或3；

R₂選自H、C₁-C₆烷基、C₁-C₆烷氧基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-烷基胺基和(CH₂)_rR₈；其中R₈選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基；r=1、2或3；

任選地，R₁和R₂直接相連成環；

較佳地，

Y為O或NH；每個X獨立地選自NH-CO、CH₂和NH；

n=0或1；m=0或1；s=0或1；

每個J₁、J₂分別獨立地為H；

R₁選自H、甲基和CH₂OH；

R₂選自H、甲基和CH₂OH；

R₃選自H、OH、NH₂、甲基和CH₂OH；

任選地，R₁和R₂直接相連成環。
如請求項28所述的式(III)所示的化合物或其互變異構體，其中，

每個X獨立地選自CR₄(R₄’)、S、NR₅和NH-CO，其中R₄、R₄’、R₅分別獨立地為H或C₁-C₃烷基；

每個J₁、J₂分別獨立地為H或C₁-C₃烷基；

R₃選自H、OH、鹵素、NH₂、C₁-C₃烷基、C₁-C₃烷氧基、C₂-C₄烯基、C₂-C₄炔基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-烷基胺基和(CH₂)_pR₆；其中R₆選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₆烯基和C₂-C₆炔基，p=1、2或3；

R₁選自H、C₁-C₃烷基、C₁-C₃烷氧基、C₂-C₄烯基、C₂-C₄炔基和(CH₂)_qR₇；其中R₇選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₄烯基和C₂-C₄炔基，q=1、2或3；

R₂選自H、OH、鹵素、NH₂、C₁-C₃烷基、C₁-C₃燒氧基、C₂-C₄烯基、C₂-C₄炔基、S-CH₃、NCH₃(CH₃)、OCH₂CH₂OCH₃、-O-烷基胺基和(CH₂)_rR₈；其中R₈選自OH、鹵素、甲氧基、乙氧基、N₃、C₂-C₄烯基和C₂-C₄炔基，r=1、2或3；

任選地，R₁和R₂直接相連成環。
如請求項29至31中任一項所述的式(III)所示的化合物或其互變異構體，其選自以下任一結構：

，
以及它們中的鹼基被置換為腺嘌呤、鳥嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、6-二甲基胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、吲哚、5-硝基吲哚或3-硝基吡咯；

較佳選自：

以及它們中的腺嘌呤被置換為鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶的那些化合物。
一種製備如請求項1至15中任一項所述的siRNA或如請求項16所述的siRNA綴合物的方法，其包括以下步驟：

1)合成如請求項19至27中任一項所述的式(II)所示的化合物或其互變異構體；

2)利用步驟1)的化合物或其互變異構體合成該siRNA或siRNA綴合物；

較佳地，在步驟1)中，利用如請求項28至32中任一項所述的式(III)所示的化合物或其互變異構體合成式(II)所示的化合物或其互變異構體。