TW202214266A - 用於免疫增強及/或免疫平衡以及用於佐劑用途的β-葡聚醣 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種用於誘導、增強及/或平衡免疫反應的組合物，其包含由出芽短梗黴AFO-202 (FERM BP-19327)產生的β-葡聚醣。本發明亦提供一種疫苗佐劑，其包含由出芽短梗黴AFO-202 (FERM BP-19327)產生的β-葡聚醣。本發明進一步提供一種使用由出芽短梗黴AFO-202 (FERM BP-19327)產生的β-葡聚醣來誘導、增強及/或平衡免疫反應的方法。

Description

用於免疫增強及/或免疫平衡以及用於佐劑用途的β-葡聚醣

相關申請案之交互參照

本申請案主張2020年6月16日提交的題為「TREATMENT OR PREVENTION AGENT FOR VIRAL INFECTION」的日本申請案第2020-104116號；2020年8月13日提交的題為「BETA-GLUCAN -WIDE-SPECTRUM IMMUNE-BALANCING FOOD-SUPPLEMENT-BASED ENTERIC (Β-WIFE) VACCINE APPROACH TO COVI」的日本申請案第2020-136861號；及2021年3月25日提交的題為「BETA-GLUCAN VACCINE ADJUVANT」的日本申請案第2021-51608號的提交日期的權益；該等申請案的內容各自以全文引用方式併入本文。

本發明係關於用於免疫增強及/或免疫平衡以及佐劑用途的β-葡聚醣。

本發明亦係關於一種用於調節細胞介素產生、調節免疫細胞或抑制凝血的組合物，其可治療或預防病毒感染，尤其SARS-CoV-2。

本發明亦係關於β-葡聚醣疫苗佐劑，其用於藉由免疫增強來戰勝癌症及/或在特定免疫受損人群中治療癌症。

癌症係一種致命疾病，並且作為全球第二大死因，每年導致估計960萬患者死亡[C1]。最常見的癌症係肺癌、乳腺癌、結腸直腸癌、前列腺癌、皮膚癌(黑色素瘤)及胃癌。癌症的治療方法係多管齊下的，化療、放療及手術係主要的治療手段。免疫系統在癌症的各個態樣都發揮著重要作用，包括其起源、發展、轉移、治療及預防。癌細胞及免疫系統處於不斷的交流中，其中癌細胞經歷三個階段：i.消除，ii.平衡，iii.逃跑。在消除階段，免疫細胞，尤其先天免疫細胞處於持續監視狀態，消除正常情況下改變的細胞。消除過程使癌細胞經歷免疫編輯或雕刻，並且免疫原性降低並對免疫監視過程產生抵抗力的細胞數量增加。此階段係平衡階段。此等變得具有抗性的細胞會逃離免疫系統並發展成全面的癌症(Kim)。

SARS-CoV-2等病原體病毒對全人類持續構成威脅。為了應對病毒的威脅，最重要的係擁有在最前沿防止病毒在生物體內入侵及增殖的免疫系統。然而，眾所周知，控制免疫系統一端的細胞介素可能會在感染時引起細胞介素風暴並陷入無法控制的狀態。在此類情況下，各個領域都在尋找能夠調節細胞介素產生、免疫細胞增殖等的物質。

持續的COVID-19大流行於2019年底在中國武漢市爆發。COVID-19被歸因於一種新型冠狀病毒，世界衛生組織將其命名為「新型冠狀病毒-2019」(SARSCoV-2)。SARSCoV-2的基因組序列與2002年及2003年爆發的嚴重急性呼吸症候群冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)(約79%同源性)及2012年至2019年之間爆發的中東呼吸症候群冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)(約50%同源性)相似。冠狀病毒係冠狀病毒科及冠狀病毒亞科的成員，根據基因組測序及系統發育關係，它們由四個屬組成：阿爾法冠狀病毒、β冠狀病毒、伽馬冠狀病毒及德爾塔冠狀病毒。SARS-CoV-2屬於β冠狀病毒屬(A1,2)。

截至2020年5月3日，已向世衛組織報道了3,356,205例COVID-19確診病例，包括238,730例死亡(A3)。SARS-CoV-2的潛伏期為3-6天，最長為14天。COVID-19的臨床體征及症狀包括低熱至高燒、乾咳、肌痛、呼吸困難、疲勞、白血球計數標準或減少，以及胸部X光檢查證實的肺炎證據。SARS-CoV-2感染的不太常見症狀包括頭痛、腹痛、頭暈、噁心、嘔吐及腹瀉。關於治療態樣，目前沒有針對COVID-19(A4)的特定療法。體征及症狀較輕的患者使用抗菌藥物治療肺炎，包括阿奇黴素、氟喹諾酮類及阿莫西林。正在測試抗病毒藥物，如病毒甲基轉移酶抑制劑、硝唑尼特(nitazoxanide)、核苷酸前藥GS-5734瑞德西韋、利巴韋林與洛匹那韋的組合、干擾素療法及恢復期血漿療法，以治療COVID-19。據報道，病死率(case fatality rate，CFR)介於中國的2.3%(44,672例確診病例中有1,023例死亡)到英國的15.80%之間(A4,5)。患有共病病狀的患者由於損害其免疫系統的病狀而處於COVID-19導致的較高死亡率風險下(A4)。

然而，尚無已知的組合物能夠藉由攝取而獲得對抗病原體病毒例如SARS-CoV-2的簡單且充分的控制效果。

在這裡，我們介紹了在存在合併症的情況下COVID-19對免疫系統的影響以及增強免疫力的方法，重點係營養補充劑。

藉由不同方法對抗COVID-19的常規疫苗開發處於不同的進展階段。COVID-19的複雜性，例如(i)導致抗原漂移的病毒突變以及疫苗誘導的免疫力可能持續的持續時間的不確定性，被認為係在不久的將來解決方案的主要障礙。在此背景下，我們在此建議基於生物反應調節劑葡聚醣的替代臨時策略，該等葡聚醣例如出芽短梗黴(Aureobasidium pullulans)AFO-202衍生的β葡聚醣，據報道，該葡聚醣藉由在骨髓中樞水準下之表觀遺傳修飾來誘導類似於卡介苗(Bacille Calmette-Guerin，BCG)疫苗的訓練免疫(Trained immunity，TRIM)。此等β葡聚醣充當病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，藉由連接特定的病原體識別受體(pathogen recognition receptor，PRR)諸如Dectin-1來活化黏膜免疫，並藉由到達遠處的淋巴器官來活化適應性及先天免疫。β-葡聚醣也被用作疫苗如流感疫苗的免疫佐劑。因此，在常規疫苗問世之前，此類具有安全記錄及產生持久廣譜免疫潛力的口服疫苗樣生物仿製藥值得深入研究，經驗證後可考慮用於臨床試驗。

COVID-19大流行對全世界數十億人的生活造成了造成嚴重破壞，具有前所未有的後果及影響。COVID生物學及病理學非常複雜，因此對臨床及藥物管理提出了巨大挑戰。因此，全球的研究人員正在制定開發藥物、抗體、疫苗及其他療法的策略，以對抗致命的SARS-CoV-2病毒[B1]。目前，存在超過124種候選疫苗，其中大部分集中於在病毒表面的刺突(spike，S)蛋白中誘導中和抗體(neutralizing antibody，nAb)[B1,2]。疫苗方法通常使用減毒活病毒、滅活病毒蛋白、多醣結合亞單位疫苗、病毒樣顆粒、核酸(DNA及RNA)疫苗、病毒載體及重組蛋白。該疫苗誘導細胞免疫的能力(B細胞產生的抗體除外)已被證明係合理疫苗設計所必需的，因為nAb反應迅速減弱[B1]。此外，冠狀病毒基因組極易發生突變，此等突變可能導致遺傳漂移及逃避免疫識別——已經確定了幾種可能導致漂移的變異[B3]。嗜伊紅性球浸潤或感染性增加形式的不良免疫增強作用阻礙了COVID-19的幾種候選疫苗，目前係疫苗生物學中的一個挑戰[B3]。

理想的疫苗[B4]將滿足以下所有或大部分標準： (i) 為正在出現或以後可能出現的各種亞株及新變種提供廣譜保護； (ii) 具有諸如最小的不希望的免疫增強等特徵； (iii) 適合儲存，適合成年醫護人員及＞ 60歲或患有潛在糖尿病或高血壓的成年人[B4]； (iv) 在所有年齡的接種受試者中產生持久有效的免疫力；及 (v) 安全、穩定且易於獲得及投與。

鑒於上述標準，我們評估了β葡聚醣的適用性，因為據報道它們對人類及動物健康具有多種有益影響[B5]。

關鍵詞：COVID-19，疫苗，β-葡聚醣，AFO-202β-葡聚醣，訓練免疫

嚴重急性呼吸系統症候群冠狀病毒2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV 2)，冠狀病毒病(Coronavirus disease，COVID-19)大流行背後的新型病毒正在世界範圍內造成嚴重破壞。正在不斷努力瞭解疾病背後的病理生理過程，以減輕併發症。雖然嚴重的急性呼吸窘迫症候群係死亡的主要原因，但其他器官衰竭，如急性腎功能衰竭及急性心臟損傷也與該疾病有關(a1)。

在COVID-19感染期間炎症反應高度增加，並且該過程為器官衰竭的發生奠定了基礎。Thl細胞介素干擾素(interferon，IFN)-γ、炎性細胞介素白介素(interleukin，IL)-1、IL-6及IL-12、嗜中性球趨化因子IL-8、單核球趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、Th1趨化因子IFN-γ誘導蛋白-1(a2)的升高都導致細胞介素風暴(CS)，稱為巨噬細胞活化症候群(macrophage activation syndrome，MAS)或繼發性噬血細胞淋巴組織細胞增生症(secondary hemophagocytic lymphohistiocytosis，sHLH)，從而導致組織損傷(a3)。包括補體活化在內的其他免疫失調相關現象也在導致器官衰竭的病毒中起作用。宿主的先天免疫及適應性免疫必須在不同方面發揮作用，包括產生各種促炎性細胞介素、活化T細胞、CD4及CD8+T細胞以控制病毒感染及下調炎症(a3)。

嚴重急性呼吸系統症候群冠狀病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)患者據報道出現凝血病。雖然在COVID-19中，凝血病導致靜脈血栓栓塞事件、繼發於類似於彌散性血管內凝血的微血管病的終末器官衰竭及中風都已被報道，但所有此等後遺症都將出現在嚴重的COVID-19患者中。然而，值得注意地，即使在沒有晚期COVID-19的情況下，也有大動脈卒中的報道(a4)。糖尿病、高血壓(a5)及心血管疾病(a6)等合併症已經與COVID-19引起的併發症及死亡風險增加有關。在此，我們報道了我們的觀點，即易患凝血病及血栓形成事件的人實際上可能成為COVID-19併發症高風險的主要目標，以及此等易患人群可能採取的預防措施以成功保護他們身體免受COVID-19引起的併發症。 引用列表 專利文獻

PTL 1: US 6,956,120 B2 PTL 2: US 10,307,479 B2 PTL 3: CN 1697659 (A) PTL 4: US 20090053221 A1 PTL 5: US 10,307,470 B2 非專利文獻

NPL 1: Vetvicka V, Vetvickova J. Glucan supplementation enhances the immune response against an influenza challenge in mice.Ann Transl Med.2015 Feb;3(2):22. doi: 10.3978/j.issn.2305-5839.2015.01.08. NPL 2: Jung K, Ha Y, Ha SK, Han DU, Kim DW, Moon WK, Chae C. Antiviral effect of Saccharomyces cerevisiae beta-glucan to swine influenza virus by increased production of interferon-gamma and nitric oxide.J Vet Med B Infect Dis Vet Public Health.2004 Mar;51(2):72-6. doi: 10.1111/j.1439-0450.2004.00732

COVID-19大流行已導致不同嚴重程度的疾病。有些人沒有症狀，有些人會發展成嚴重的疾病，導致不同年齡段的死亡。此懸殊差別促使我們探索原因，背景係有效免疫的疫苗或應對COVID-19的藥物還遠未變成現實。我們已經討論了使用包括營養補充劑在內的簡單措施，藉由增強免疫來對抗COVID-19的策略。

本發明的一個目的係提供一種可以方便地攝入，並具有足夠的細胞介素產生控制、免疫細胞控制、凝血抑制等作用的組合物，特別係一種能夠治療或預防SARS-CoV-2感染或由感染引起或加重的疾病的組合物。

為了解決上述目的，本發明人著眼於出芽短梗黴菌株FO-68[(登錄號)FERM BP-19327]生產的葡聚醣，並對其利用進行了詳細研究。

結果，本發明人發現將FO-68產生的葡聚醣口服攝入人體具有良好的免疫細胞調節及細胞介素產生調節等作用。本發明人經過進一步研究，發現葡聚醣具有凝血抑制作用，從而完成了本發明。

癌症係一種致命疾病並且係全球第二大死亡原因。儘管人們不斷努力尋找副作用更少的有效治療方法，但癌症的發病率繼續上升，有報道表明，與遺傳原因一樣，糖尿病等疾病中發生的慢性微炎症及免疫系統減弱會導致癌症的發展。在癌症患者中，化療、放療及手術係治療的主流方法，但所有此等療法，包括手術干預，都會導致免疫系統虛弱，此情況轉而已被證明會增加轉移擴散。

此外，化學療法相關的免疫功能低下已被表明係導致癌症擴散的邊門。因此，只有在免疫系統受損及慢性微炎症得到良好控制的情況下，才能預防普通人群的癌症及其在接受手術或化學治療的人群中的擴散。在此綜述中，我們提供了生物反應調節劑(biological response modifier，BRM)葡聚醣的證據。葡聚醣在動物模型中平衡代謝參數諸如血糖及血脂水準；增加外周血細胞對癌症的細胞毒性；減輕化療的副作用的有益作用表明，此係一種潛在的策略，可以為患有免疫功能低下等特定疾病或遺傳易患癌症的人的長期預防鋪平道路。在必要的驗證後，據報道所提到的β-葡聚醣具有疫苗佐劑潛力，並且可以藉由免疫增強方法幫助戰勝癌症。

本發明涉及以下內容： 1. 一種用於誘導、增強及/或平衡免疫反應的組合物，包含由出芽短梗黴AFO-202 (FERM BP-19327)產生的β-葡聚醣。 2. 第1項的組合物，其用於治療及/或預防病毒感染。 3. 第1項的組合物，用於抑制凝血。 4. 第1項至第3項中任一項的組合物，用於治療或預防SARS-CoV-2感染或由SARS-CoV-2引起或加重的疾病。 5. 第1項或第2項的組合物，其用於治療及/或預防癌症。 6. 第5項的組合物，其中癌症係腎癌。 7. 第1、2、5、6項中任一項的組合物，用於減輕化療副作用。 8. 一種疫苗佐劑，包含由出芽短梗黴AFO-202 (FERM BP-19327)產生的β-葡聚醣。 9. 第8項的疫苗佐劑，用於預防及/或治療SARS-CoV-2感染或由SARS-CoV-2引起或加重的疾病。 10. 第9項的疫苗佐劑，其用於預防及/或治療癌症或特定免疫功能低下人群中的癌症。

本發明還涉及以下內容： A1. 一種用於調節細胞介素產生、調節免疫細胞或抑制凝血的組合物，其包含由出芽短梗黴菌株FO-68 [(登錄號)FERM BP-19327]產生的葡聚醣。 A2. 請求項A1的組合物，其中菌株FO-68產生的葡聚醣為β-1,3-1,6葡聚醣。 A3. 請求項A1的組合物，其中調節細胞介素產生具有抗病毒細胞介素升高作用。 A4. 請求項A3的組合物，其中抗病毒細胞介素係1型-IFN或IL-7。 A5. 請求項A1的組合物，其中調節細胞介素產生具有維持或減少炎性細胞介素的作用。 A6. 請求項A5所述的組合物，其中炎性細胞介素為選自IL-1β、IL-6、IL-12(p70+40)、IFN-γ及TNF-α中的一種或多種細胞介素。 A7. 請求項A1所述的組合物，其中調節免疫細胞係抗病毒免疫細胞活化或增殖作用。 A8. 請求項A7的組合物，其中抗病毒免疫細胞係一種或多種選自NK細胞、選自Th2、Treg、CD8及CD4的T細胞、B細胞及樹突細胞的免疫細胞。 A9. 請求項A1的組合物，其中凝血係由於病毒感染。 A10. 請求項A1的組合物，其中凝血的抑制係由D-二聚體或凝血酶原的維持或減少作用介導的。 A11. 請求項A1-11所述的組合物，用於治療或預防SARS-CoV-2感染或由SARS-CoV-2感染引起或加重的疾病。 A12. 請求項A11所述的組合物，其中SARS-CoV-2引起的疾病為血栓形成或血栓形成介導的多器官衰竭。

本發明還涉及以下內容： [B1]. 包含衍生自FERM BP-19327的β-葡聚醣的腸疫苗佐劑

本發明還涉及以下內容： [C1]一種用於治療癌症的藥物組合物，其包含由出芽短梗黴AFO-202(FERM BP-19327)產生的β-葡聚醣。 [C2]一種用於在受試者中誘導、增強及/或平衡免疫反應的藥物組合物，其包含由出芽短梗黴AFO-202 (FERM BP-19327)產生的β-葡聚醣。 [C3] 一種藉由免疫增強戰勝癌症及/或在特定免疫功能低下人群中治療癌症的疫苗佐劑，包含由出芽短梗黴AFO-202 (FERM BP-19327)產生的β-葡聚醣。 本發明的效果

根據本發明，可以提供一種能夠調節細胞介素產生、調節免疫細胞及抑制凝血的組合物。特別係調節細胞介素的產生具有增加有益的抗病毒細胞介素如1型干擾素及IL-7的產生及減少在細胞介素風暴中所涉及的有害的炎性細胞介素如IL-6及IL-12等的產生的作用。

此外，該組合物可以增強成熟T細胞的發育及存活，防止細胞凋亡的Fas產生，從而下調炎症反應，活化NK細胞及CD8+細胞，活化CD4+細胞，例如Th-1細胞，活化Treg細胞以便調節及抑制細胞介素風暴，活化B細胞，從而藉由上述對細胞介素產生的調節或藉由獨立機制，增強病毒特異性抗體(IgG、IgM、SIgA)的產生。

此外，本發明抑制病毒感染過程中血纖維蛋白的減少，從而維持或降低D-二聚體及凝血酶等，從而有效抑制因血栓形成等引起的凝血。

因此，本發明可以有效治療或預防病毒感染，尤其SARS-CoV-2感染或由此類感染引起的繼發性疾病的發展或惡化。

進一步地，本發明的組合物中所含的葡聚醣來源於出芽短梗黴，其安全性已被長期食用經驗充分證實，因此可以安全、方便地攝入。

根據本發明，可以提供疫苗佐劑，其可用於預防及/或治療癌症、特定免疫功能低下人群的癌症、SARS-CoV-2感染及/或由SARS-CoV-2引起或加重的疾病。

我們在此將討論集中在特定的β-葡聚醣：來自稱為出芽短梗黴AF 202菌株(A41, 42)的黑酵母的1-3,1-6 β-葡聚醣。此1-3,1-6 β葡聚醣由出芽短梗黴分泌到細胞外，並從培養基中收集，無需額外純化(A43)。多項研究報道稱，β-葡聚醣係一種強大的免疫刺激劑，可以活化巨噬細胞並對免疫系統中的B淋巴球、自然殺傷細胞及抑制性T細胞產生積極的免疫作用(A44-46)。此等作用並非直接的，而是由於β葡聚醣係增強免疫力的生物反應調節劑(biological response modifier，BRM) (A43)。

此AF 202 β葡聚醣亦係生物反應調節劑葡聚醣(biological response-modifier glucan，BRMG)，其生物反應調節劑(biological response modifier，BRM)特性非常高(A43)，因為其係沒有額外純化步驟的胞外多醣，純化步驟可能會妨礙此性質。正如Vetvicka及Vetvickova在他們的結論(A37-39)中所指出的，由於AF 202 β-1,3-1,6-葡聚醣係高度純度及活性的，它具有顯著的免疫作用。此AF 202 β-1,3-1,6-葡聚醣被免疫系統識別為PAMP等價物，因此發揮免疫作用。此AF 202 β-1,3-1,6-葡聚醣係一種可溶性β-葡聚醣，同時含有高分子量及低分子量的β-葡聚醣。已發現高分子β-葡聚醣(High molecular beta-glucan，H-BG)成分具有更強的刺激淋巴球增殖作用。另一方面，低分子β-葡聚醣(low molecular beta-glucan，L-BG)成分會降低炎症生物標誌物(主要係細胞介素)的水準，以及對細胞介素及趨化因子信號通路的刺激。此外，L-BG與dectin-1(β-葡聚醣受體)有效結合，並已被證明具有拮抗作用，如巨噬細胞、樹突狀細胞及內皮細胞等多種免疫細胞的活性氧產生及細胞介素合成。由於此β-葡聚醣同時含有H-BG及L-BG，它具有調節整個免疫反應以實現生物穩態的能力(A43)。源自酵母的β-1,3/1,6-葡聚醣已被美國FDA列為公認安全(generally recognized as safe，GRAS)類別(A47)。此AFO-202β葡聚醣已經過以下研究：基因毒性試驗、單次口服試驗、28天或90天重複劑量研究、長期口服試驗(1年)，並已被證明係安全的(A48)。此外，此β葡聚醣在過去二十年中已作為人類食用的商業食品補充劑來利用，並獲得日本衛生部的批准(49)。

Dectin-1係II型跨膜受體及參與針對外來抗原及病原體的先天性及適應性免疫反應的主要β-葡聚醣受體；它也係作為免疫功能調節劑(A43)的β葡聚醣的受體。在對β葡聚醣識別的先天免疫反應中，Dectin-1與模式識別受體(pattern-recognition receptor，PRR)及Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)合作。池脅等人報道，此AFO 202衍生的β葡聚醣藉由培養的外周血單核球(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)及U937細胞誘導IL-8及sFas的產生，但不刺激IL-1β、IL-6、IL-12(p70+40)、IFN-γ或TNF-α，實際上會降低IL-6水準(A43)。AF 202 β-1,3-1,6-葡聚醣增強免疫反應與多種信號轉導通路相關，該等通路藉由細胞內機制而涉及多種磷酸酶，如蛋白激酶C (protein kinase C，PKC)、蛋白激酶A (protein kinase A，PKA)抑制劑H-89及蛋白酪胺酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)。AFO 202衍生的β葡聚醣顯示可藉由Dectin-1、CD11a CD54(細胞間黏附分子-1；intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、HLA II類、TLR-2及TLR-4在PBMC中誘導DNA合成(細胞增殖)及誘導sFas的產生。AFO202衍生的β葡聚醣還刺激U937細胞(一種人類單核球樣細胞系)藉由Dectin-1誘導sFas的產生，而並非TLR-2或TLR-4。此β葡聚醣產生的sFas可以防止由Fas/FasL系統調節的細胞凋亡的發生，並可能下調炎症反應(A43)。研究表明，單向人類混合淋巴球反應(mixed lymphocyte reaction，MLR)檢測系統中的β葡聚醣可以活化抑制細胞，尤其係調節性T細胞(regulatory T cell，Treg)，並誘導抑制性細胞介素(A43)的產生，這將有助於抑制在COVID-19中觀察到的細胞介素風暴。雖然AF 202 β葡聚醣的免疫作用係明顯的，並且可能藉由免疫抑制促炎細胞介素來對抗COVID-19感染，但幾項研究還報道說，此β葡聚醣可以藉由增加細胞毒性細胞例如NK細胞及巨噬細胞的水準來增強免疫力，它們將成為抵禦病毒的實際防線。在亞馬遜利什曼原蟲感染(A50)患者中，此β葡聚醣顯著增加了NK細胞活性。在對北京鴨(A51)的研究中，此β葡聚醣對家禽非特異性細胞免疫具有調節或增強特性，並可能增強對A型禽流感H5疫苗的免疫反應(A52)。此AFO 202 β葡聚醣增加了癌症患者及老年患者的NK細胞及巨噬細胞計數(A53)。補充葡聚醣可增強小鼠對流感攻擊的免疫反應(A54)。在一項分析此AFO-202 β葡聚醣對保護感染了A/Puerto Rico/8/34 (PR8; H1N1)流感病毒毒株致死滴度的小鼠方面的功效的研究中，在PR8病毒亞致死感染後投與β葡聚醣顯著提高了存活率，並且用β葡聚醣進行預處理顯著抑制了PR8病毒的複製(A55)。在一項雙盲、隨機、安慰劑對照研究(A56)中，酵母(1,3)-(1,6)-β-葡聚醣還降低了上呼吸道感染的嚴重程度。

本發明的組合物中所含的葡聚醣可以係源自出芽短梗黴菌株FO-68(本文也稱為「菌株AFO 202」)的葡聚醣，較佳衍生自FO-68的β-1,3-1,6葡聚醣(在本文中也簡稱為「葡聚醣」、「AFO 202葡聚醣」或「AF 202 β葡聚醣」)。「出芽短梗黴菌株FO-68」已寄存在國立先進工業科學技術研究所專利生物寄存中心，寄存號為FERMP-19327。

雖然國內寄存係在2003年4月23日進行的，但出芽短梗黴菌株FO-68已於2021年4月21日轉移到獨立行政法人製品評價技術基盤機構特許生物寄存中心(120室，2-5-8, Kazusa 鎌足，木更津市，千葉縣，292-0818日本)，登錄號：FERM BP-19327。

出芽短梗黴菌株FO-68也稱為短梗黴菌株FERM P-18099。

FO-68的科學特性 此真菌產生高黏度的高分子多醣。此物質容易與乙醇凝集，因此可以簡單地收集。此多醣係β型多醣，係具有1,3鍵主鏈及3位及6位支鏈的酸性多醣。它含有羧酸，例如作為有機酸的蘋果酸及磷酸。此外，它容易與鋁離子等發生凝集。此物質對於作為飼料促進生長及廢水處理也有效。作為食品添加劑及具有免疫力的功能性食品係有效的。

FO-68在25℃培養7天的馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂斜面上形成黑褐色菌落。菌落邊緣呈絲狀生長，逐漸變成淡黑褐色。細胞呈絲狀，有時形成節孢子、酵母樣出芽分生孢子、橢圓形酵母樣單細胞，有時形成厚壁孢子細胞。生長溫度為25℃，並且該等細胞分解葡萄糖、果糖及半乳糖等己糖、蔗糖及澱粉。培養基變得明顯黏稠。根據FO-68的真菌學特性，其為半知菌綱黑木耳家族中的一種出芽短梗黴。

β-葡聚醣係從不同來源獲得的天然存在的多醣，例如燕麥、大麥、細菌、酵母、藻類及蘑菇。來自不同來源的β-葡聚醣在其結構上存在差異，此導致了不同的生物學特性(A35)。已有近7000篇出版物報道了β-葡聚醣的免疫調節作用(A37)。免疫調節特性取決於β-葡聚醣的主要化學結構。源自真菌及酵母的β-葡聚醣由(1,3)-β-連接的主鏈及少量(1,6)-β-連接的側鏈組成，以其免疫調節作用而聞名(A36)。Vetvicka及Vetvickova發表了幾項研究(A37-39)，比較不同市售β葡聚醣在吞噬作用、IL-2產生、抗體分泌、超氧化物產生、IFNγ產生及抑制實驗癌症模型方面的免疫學特性，他們的研究得出的結論係i.葡聚醣通常對免疫系統的大多數方面都有很強的刺激作用；ii.測試的葡聚醣之間存在顯著差異；iii.高度純化及高活性的葡聚醣具有刺激免疫反應各個方面的強大及多效作用，而定義不明確的葡聚醣僅具有中等(如果有)生物效應。β葡聚醣，例如來自蘑菇平菇(Pleurotus ostreatus)的pleuran，能夠降低上呼吸道感染(upper respiratory tract infection，URTI)症狀的發生率，並增加循環NK細胞的數量(A40)。因此，β-葡聚醣將成為基於免疫系統對抗COVID-19的重要參與者。

分離的真菌的真菌學特徵 FO-68菌落起初表面光滑，然後長成灰白色、黏液及有光澤的油滴狀(脂肪狀)酵母樣物質。絲狀菌體從其邊緣呈放射狀生長，導致起皺、絲狀及樹突狀生長。此絲狀菌體不僅在培養基表面生長良好，在培養基中也能很好地生長。短時間內，菌落表面處處出現淺黑褐色斑點，逐漸變成黑色斑點，最終整體表面變成深黑色。在此絲狀菌體上，橫向產生大量淡褐色、橢圓形或卵圓形的分生孢子。此分生孢子很容易碎成碎片。而油滴狀菌落的表面則到處佈滿分生孢子。

作為培養FO-68的方法及使用FO-68生產β-1,3-1,6葡聚醣的方法，可以使用已知方法，例如，參見JP 2004-329077A。

在一些實施例中，本發明涉及用於誘導、增強及/或平衡免疫反應的組合物，其包含由出芽短梗黴AFO-202(FERM BP-19327)產生的β-葡聚醣。另一態樣，本發明還涉及出芽短梗黴AFO-202 (FERM BP-19327)用於誘導、增強及/或平衡免疫反應的用途，特別涉及藉由對受試者投與出芽短梗黴AFO-202 (FERM BP-19327)來誘導、增強及/或平衡免疫反應的方法。

在本發明中使用的組合物中，FO-68的培養物可以不經純化直接使用，或者可以使用從培養物中分離的葡聚醣或根據需要進一步純化。另外，例如，將本發明的培養物粉碎成濃縮物、糊狀物、噴霧乾燥物、冷凍乾燥物、真空乾燥物、轉鼓乾燥物、分散在介質中的液體產物、稀釋的產物及乾燥的產物。

本發明的組合物在被包括人類在內的哺乳動物攝取時發揮其功能。本文所用術語「攝入」不限於任何投與途徑，只要能進入人體即可，可以藉由口服、管內投與、腸內投與等所有已知的投與方法來實現。通常，較佳經消化道經口攝取及腸內攝取。

本發明的劑量可以考慮投與途徑、年齡、體重、症狀等各種因素適當設定。本發明的組合物的劑量沒有特別限制，但葡聚醣的量較佳為0.05 mg/kg/天或更多，更佳0.5 mg/kg/天或更多，特別較佳1.0 mg/kg/天。然而，當長期攝取時，該量可能小於上述較佳量。另外，本發明中使用的葡聚醣具有足夠的食用體驗，在安全性方面沒有問題。因此，量遠遠超過上述量(例如，10 mg/kg/天)或更多)。

本發明的組合物可用作食品或飲料。該食品或飲料可以用作例如具有抗病毒作用，尤其抗SARS-CoV-2感染的食品或飲料。本發明的組合物作為特定用途的食品，例如特定保健用食品及營養功能食品，藉由對人等動物投與，可以達成對各種感染、由感染引起的繼發性疾病的發展或惡化的治療或預防。

藉由將本發明的組合物作為特殊用途食品如特定保健用途食品及具有營養功能的食品投與動物如人，治療或預防各種感染或由感染引起的繼發疾病的發生或惡化。

藉由將本發明的組合物投與於動物，例如人，可以達成針對包括凝血、癌症、化療副作用等在內的各種疾病、病症及病狀的治療、預防及/或緩解。

當本發明的組合物用作食品或飲料時，食品或飲料的類型沒有特別限制。此外，食品或飲料的形狀沒有特別限制，並且可以係通常使用的任何形狀的食品或飲料。例如，它可以係任何形式，例如固體形式(包括粉末及顆粒形式)、糊狀、液體形式及懸浮液形式，並且不限於此等形式。

當用作藥物時，可口服投與的劑型係較佳的，因為本發明的組合物到達腸。本發明藥物的較佳劑型的實例包括錠劑、包衣錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、溶液劑、糖漿劑、糖錠等。此等各種製劑係根據常規方法藉由使用作為活性成分的葡聚醣、賦形劑、黏合劑、崩解劑、潤滑劑、著色劑、調味劑、增溶劑、懸浮劑、包衣劑等來製備的。它可以藉由混合藥物製劑技術領域中常用的助劑來配製。

在一些實施例中，本發明可以與其他食物、飲料、藥物及任何其他物質組合使用以增強本發明的功效。

在一些實施例中，本發明誘導、增強及/或平衡免疫反應。免疫系統中的此控制具有多種應用，例如治療及/或預防病毒感染、SARS-CoV-2感染、由SARS-CoV-2引起或加重的疾病及/或癌症、減輕化療副作用、及抑制凝血等。

本發明的細胞介素產生控制具有增加有益抗病毒細胞介素產生及減少參與細胞介素風暴的有害炎性細胞介素產生的作用。

抗病毒細胞介素可以係但不限於I型IFN、IL-7等。炎性細胞介素可以係IL-1β、IL-6、IL-12(p70+40)、IFN-γ、TNF-α等。受試者中此等細胞介素的產生量可以藉由公知的方法測定。

本發明中對免疫細胞的調節可以係但不限於抗病毒免疫細胞的活化或增殖作用。抗病毒免疫細胞可以係但不限於選自NK細胞、選自Th2、Treg、CD8+、CD4+、B細胞及樹突細胞的T細胞的一種或多種免疫細胞。B細胞可包括幼稚B細胞、漿母細胞，並且樹突細胞可包括pDC、單核球衍生的DC、cDC、CD8+DC、CD11b+DC。

在本發明的一態樣，免疫細胞可以係嗜中性球、先天淋巴球(innate lymphocyte，ILC1、ILC2、ILC3)、嗜鹼性球、粒細胞、肥大細胞、造血幹細胞、CLP、間充質幹細胞。在本發明的一態樣，免疫細胞的調節可以係抑制Th1活性或增殖。此等細胞的活性或增殖可以藉由已知方法量測。

本發明中的凝血抑制可以藉由已知的方法量測從受試者採集的血液的凝固性。非限制性地，藉由量測凝血酶原時間(秒)、凝血酶原時間(%活性)、凝血活酶時間、血栓測試、纖維蛋白原量、抗凝血酶III活性、凝血酶/抗凝血酶複合物量、D-二聚體等來確定。熟習此項技術者可以用已知的方法量測。

凝血病已被證明係死亡率的強預測因子及冠狀病毒病(Coronavirus disease，COVID-19)疾病嚴重程度的指標。在此，我們敘述了我們對凝血病與COVID-19之間關聯的可能病理生理機制的看法，其中免疫系統相關的細胞介素風暴已被認為係導致凝血機制失調的主要事件，其次係由於病毒入侵引起的直接內皮損傷。入院時D-二聚體及凝血酶原的評估將有助於預測預後，這已被推薦為一項基本程序。凝血病的種族易感人群、老年人及患有糖尿病、高血壓及心血管疾病等合併症的人群構成了脆弱的高危人群。雖然根據最近的指南，建議對所有COVID-19住院患者進行血栓預防，但尚未對住院前的預防策略進行充分研究。建議補充生物反應調節劑，尤其係在易感人群中，對於減少嚴重COVID-19的發展及降低死亡率至關重要。

凝血病；Covid-19的誘發因素及應對策略 凝血病-COVID-19嚴重程度的關鍵風險因素及預測指標；在易感人群中使用非藥物生物反應調節劑進行住院前預防的病理生理機制及建議策略的觀點

凝血病及COVID-19-病理機制 在COVID 19中，已發現兩個獨立的病理過程在產生凝血病的臨床表現中起作用，I.病毒侵入引起的局部直接血管及內皮損傷，導致微血管凝塊形成及血管病，ii.炎症產生單核及多形核浸潤以及內皮細胞及單核球凋亡的後果。高血纖維蛋白原血症導致大血管血栓形成及嚴重血栓栓塞後遺症也應考慮。d-二聚體水準異常升高係在COVID-19易感性凝血病患者中觀察到的最常見及關鍵特徵。d-二聚體升高與預後不良、凝血酶原時間(prothrombin time，PT)及活化部分凝血活酶時間(activated partial throm-boplastin time，aPTT)增加有關、血小板計數降低、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)及鐵蛋白水準增加係幾項研究報道的其他相關發現(a7)。Iba等人解釋了COVID-19中凝血相關事件及血栓形成的四種途徑。i.細胞介素風暴及促炎細胞介素如白介素(IL)-1β及IL-6刺激免疫細胞上組織因子的表現，從而啟動外源性凝血級聯活化；ii.藉由降低尿激酶型纖溶酶原活化劑的活性及增加纖溶酶原活化劑抑制劑-1的釋放來抑制纖維蛋白溶解系統；iii各種促炎細胞介素活化血小板，受損的內皮細胞很容易與活化的血小板結合；iv.炎症引起的直接內皮損傷。

ACE2受體在內皮細胞內廣泛表現，這可以解釋它們對SARS-CoV-2結合、膜融合及病毒進入的易患性，從而導致感染及直接血管損傷(a7)。在一項研究中，據報道，高血壓、糖尿病及心血管疾病中預先存在的纖溶酶活性增加，藉由切割其刺突蛋白來增強SARS-CoV-2病毒的毒力及傳染性，進而聚集此與凝血相關的過程(a8)。

凝血病及COVID-19-發病率及易感人群 由於與COVID-19相關的血栓形成很複雜且知之甚少，因此推測可能存在獨特的「COVID-19誘導的凝血病模式」(a9)。Guan等人2020年2月28日首次報道了COVID-19患者的止血障礙(a10)。在1099名COVID-19住院患者的初始隊列中，46.4%的患者在初次就診時發現D-二聚體水準升高至0.5 mg/L以上(a11)。在191名COVID-19住院患者中，81%的非倖存者入院時D-二聚體水準大於1 mg/L (a12)。與43.2%的非嚴重COVID-19患者相比，在59.6%的嚴重感染患者中發現了更高的D-二聚體水準。事實上，彌散性血管內凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)已成為死亡率的強預測因子，71.4%的非倖存者符合DIC標準，而只有0.6%的倖存者符合此等標準(a13)。

因此，建議定期監測COVID-19中的D-二聚體、凝血酶原及纖維蛋白原係必不可少的，因為在第10-14天觀察到非存活者中D-二聚體及凝血酶原顯著增加而纖維蛋白原減少，據報道，升高的D-二聚體(高於1微克/毫升)係該易感人群的一個強的獨立危險因素(a10)。其他關於COVID-19凝血病發生率的報道包括150名Covid-19患者，其中25名患者(16.7%)發生肺栓塞，兩名患者發生3次血栓性迴路閉塞(a14)。在接受測試的57名患者中有50名(87.7%)偵測到狼瘡抗凝劑(a15)。Oxley等人報道了5名伴有缺血性卒中的急性大血管閉塞患者(a16)。在中國武漢報道的原始病例中，5%的患者出現中風(a17)。另一份報道表明，接受重症監護的COVID-19患者的血栓併發症發生率為16-49%(a18)。關於深靜脈血栓形成(deep-vein thrombosis，DVT)，在因COVID-19住院的143名患者中，66名患者發生了下肢DVT(a19)。

由於COVID-19凝血病資料大部分來自中國患者，這係由於中國首次報道了COVID-19，並且由於靜脈血栓栓塞的發生率在中國人中大約低3-4倍(a20)，因此中國醫院的凝血病及血栓栓塞事件意義較低，血栓預防的使用也較少。然而，由於該疾病對白種人的影響比中國大幾倍，因此瞭解血栓形成事件的種族相關風險至關重要。白種人的血栓形成風險高於中國及其他亞洲人群，在非裔美國患者中甚至更高(a21,22)。與此一致地，一項針對白人患者的COVID-19凝血病研究。他們的研究結果表明，雖然白種人發生凝血病的風險較高，但由於該研究中的患者接受了LMWH血栓預防，他們很少發生明顯的DIC，並且在DIC發生的情況下，僅在疾病的後期階段發生。該研究還報道說，存在一種新的肺部特異性血管病變，我們將其稱為與COVID-19相關的肺血管內凝血病(pulmonary intravascular coagulopathy，PIC)，與DIC不同(a23,24)。

隨著年齡的增長及年齡相關的凝血級聯變化的先天免疫活化也係據報道導致老年人易患COVID-19凝血病的因素(a25)。肺泡巨噬細胞(Alveolar macrophage，AM)在衰老過程中增加，但它們在促炎及抗炎狀態之間轉換的可塑性大大降低。此情況在老年人中早期階段會加速COVID-19，而在晚期會導致過度的肺損傷。衰老過程中嗜中性球活性下降使此等細胞失去遷移到感染部位及殺死受感染細胞的能力。有助於黏膜屏障的黏蛋白及保護性醣蛋白的產生及多樣性也會隨著衰老而改變(a26)。老年人適應性免疫系統的免疫衰老也有助於老年人發展為嚴重的COVID-19。新鮮幼稚T細胞的產生減少、T細胞受體(T cell receptor，TCR)庫的擴展性降低、T細胞代謝功能障礙及T細胞活化減弱也導致老年人對COVID-19的免疫脆弱性。當在患有凝血病的易感人群老年人中探索免疫系統與凝血病之間的聯繫時，發現COVID-19致命病例中有二分之一經歷了細胞介素風暴，其中82%的人年齡在60歲以上。

炎性衰老係發生在老年人中的此增加的細胞介素風暴的主要驅動因素，肥胖、不良飲食及口腔健康、微生物失調及久坐的生活方式加劇了細胞介素風暴。據報道，包括IL-6、TNF-α、IL-1α及CRP在內的促炎細胞介素的基礎循環水準較高與年齡相關。NLRP3係炎性體的主要蛋白質成分，隨著年齡的增長而增加。NLRP3有被SARS-CoV-2抗原過度活化的風險，由於sirtuin 2 (SIRT2)直接控制NLRP3，老年人中sirtuin 2 (SIRT2)的活性降低會進一步加劇此情況(a25)。此細胞介素風暴破壞了由抗凝血酶III、組織因子途徑抑制劑及蛋白C系統對凝血酶產生進行反饋控制的機制，從而易導致微血栓形成、彌散性血管內凝血發展(a27)。

凝血病似乎為預測COVID19進展的核心因素。此情況也解釋了為什麼兒童很少因COVID-19而患上嚴重疾病，因為在沒有潛在癌症或中心靜脈通路裝置的情況下，兒科年齡組的血栓併發症很少見。雖然應該預計孕婦很容易發生凝血病，但實際上已經發現由於妊娠期間她們的免疫抑制，以避免胎兒排斥反應，因此免疫血栓形成不會發揮作用，因此病情較輕(a28)。 具有肥胖、高血壓及糖尿病等心血管危險因素的患者對COVID-19疾病嚴重程度的脆弱性已得到充分證實(a25)。作為糖尿病的併發症的凝血與纖溶之間的不平衡與凝血因子水準升高及纖溶系統的相對抑制、內皮功能障礙、血小板聚集及活化增強造成高凝促血栓狀態的發展，從而解釋了在疾病嚴重程度方面，糖尿病患者對COVID-19的脆弱性商數(a29)。

關於高血壓、其他心血管疾病，除了血管及血栓形成因素的改變之外，由於直接病毒攻擊及細胞介素風暴導致的肺及外周內皮損傷已被表明係此等患者中高凝的誘導物(a30)。

COVID-19凝血病的預防及治療態樣 在確定了與COVID-19嚴重程度相關的凝血病的各種易感人群後，我們轉向可能的治療解決方案及預防策略。最近的指南建議對所有住院的COVID-19患者進行血栓預防或全治療強度抗凝(a26)。抗血小板藥物、溶栓、免疫調節劑及抗補體藥物係建議的方法。對於抗凝，選擇的藥物係低分子肝素，對於可能有嚴重腎功能損害或出血風險極高的患者，推薦使用普通肝素(a28)。預防態樣涉及治療合併症，並以最大程度的血栓預防結束，但所有此等都係在患者住院後建議的。

我們探討了是否有任何其他預防策略可用。補充生物反應調節劑可能係易感人群的解決方案。β葡聚醣係有效的生物反應調節劑。已發現可溶性β1,3葡聚醣可藉由作用於細胞介素的產生及調節凝血活化來減少敗血症併發症並提高存活率(a32)。輻射暴露及/或糖尿病誘導的氧化應激藉由增強血小板聚集(platelet aggregation，PA)及增加凝血酶水準而導致量測的凝血參數紊亂，此情況被酵母β葡聚醣逆轉(a33)。據報道，來自黑酵母出芽短梗黴的生物反應調節劑葡聚醣(biological response modifier glucan，BRMG)係一種有效的免疫調節劑，該調節劑經由其在先天免疫反應中與模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)及Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)協同作用之受體Dectin-1來起作用。該BRMG降低IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、TNF-α、IFN-γ及sFasL的水準，同時增加IL8及sFAS。此舉將與COVID-19治療反應所需的關鍵行動直接相關，即減弱由IL-6等促炎細胞介素引起的細胞介素風暴。據報道，此BRMG還具有NK細胞活性及巨噬細胞活性，從而有助於抗病毒反應(a34)。因此，此BRMG有助於維持血糖及血脂水準，有助於治療與COVID-19嚴重性風險相關的合併症(a35,36)，因此被建議作為一種可能的預防策略，以對抗上述脆弱人群中凝血病誘發的嚴重COVID-19風險。

本發明的組合物可用於治療或預防病毒感染或由病毒感染引起的繼發性疾病。該病毒較佳為但不限於屬於冠狀病毒科的病毒，較佳屬於β-冠狀病毒屬的SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、人冠狀病毒HKU1及人冠狀病毒OC43。

它可能有益於SARS-CoV-2感染或SARS-CoV-2感染引起的繼發性疾病，尤其血栓形成。

攝入的受試者可以處於任何狀態，但從降低SARS-CoV-2死亡風險的角度來看，較佳患有慢性腎病、糖尿病、心臟病等基礎疾病的患者。

COVID-19及免疫系統： COVID-19感染的特有特徵係藉由高水準的不同細胞介素來表徵的促炎狀態，該等細胞介素包括白介素(interleukin，IL)-1β、IL-1Rα、IL-2、IL-10、纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor，G-CSF)、干擾素-γ-誘導蛋白(IP10)、單核球趨化蛋白(monocyte chemoattractant protein，MCP1)、巨噬細胞炎症蛋白1α (macrophage inflammatory protein 1 alpha，MIP1A)、血小板源性生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNFα)及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。此外，發現需要入住重症監護病房(intensive care unit，ICU)的危重患者的IL-2、IL-10、G-CSF、IP10、MCP1、MIP1A、TNFα及IL-6濃度顯著升高。重要地，IL-6水準增加也與死亡率增加相關。在嚴重的COVID-19中，已觀察到自然殺傷細胞，亦即CD4+及CD8+T淋巴球，以及CD4+細胞中的IFN-γ表現的減少，以及由於細胞介素釋放症候群導致的適應性免疫系統受阻，此可歸因於IL-6、IL-10及TNFα水準與淋巴球計數的逆相關性(A6-8)。在另一份報道中，據報道，CD4+T細胞、CD8+T細胞、B細胞及自然殺傷(NK)細胞數量急劇減少的淋巴細胞減少症係重症COVID-19患者的一個共同特徵，而在較輕的病例中則沒有觀察到此現象。此外，CD4+T細胞、CD8+T細胞、B細胞及NK細胞的數量在康復或恢復期患者中恢復正常。細胞毒性淋巴球(包括NK細胞及CD8+T細胞)上的耗竭標誌物，例如NKG2A，在患有嚴重疾病的患者中增加，並在從COVID-19中康復後恢復到正常水準(A9)。據報道，嗜中性球與淋巴球比率(neutrophil‐to‐lymphocyte ratio，NLR)及淋巴球與C反應蛋白比率(lymphocyte‐to‐C‐reactive protein ratio，LCR)的增加反映了炎症過程的增強，表明重症COVID-19患者的預後較差(A10)。

因此，總而言之，在導致細胞介素風暴的炎症途徑的情況下，促炎因子例如IL-6、IL-8、IL-1β及GM-CSF及趨化因子例如CCL2、CCL-5、IP-10及CCL3與活性氧一起造成了導致肺纖維化及死亡的急性呼吸窘迫症候群(Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS)。在COVID-19中，已經報道了與沒有併發症的SARS相比，在嚴重疾病的病例中偵測到高水準的血清促炎細胞介素(IFN-γ、IL-1、IL-6、IL-12及TGFβ)及趨化因子(CCL2、CXCL10、CXCL9及IL-8)(A11)。雖然抑制此促炎細胞介素風暴被認為係對抗COVID-19必不可少的，但一些細胞介素如I型干擾素及IL-7已被發現係有益的。正在進行多項研究以研究IFN-α及IFN-β作為抗SARS-CoV-2藥物的有效性。由於淋巴球減少及淋巴球耗竭係COVID-19的標誌，IL-7(促進淋巴球擴增及可能逆轉T細胞耗竭的主要細胞介素)被認為有助於恢復免疫系統穩態。有趣地，在輕度/中度或重度COVID-19患者的血清中，發現負責各種T細胞亞群擴增及分化的細胞介素IL-2及IL-7的水準升高，最有可能代表免疫系統逆轉淋巴細胞減少及T細胞耗竭的嘗試(A12)。

心血管疾病及COVID-19對免疫系統的影響： 在中國，發現2.3%的CFR對於高血壓患者而言為6.0%，對於糖尿病患者而言為7.3%，對於心血管疾病患者而言為10.5%(A13)。多項研究報道稱，患有潛在心血管合併症的患者處於需要ICU護理的嚴重COVID-19感染以及可能導致死亡的急性呼吸窘迫症候群(acute respiratory distress syndrome，ARDS)等併發症的更高風險下。該機制歸因於此類CVD患者的心血管功能儲備減少或受損，並因COVID-19誘發的心肌梗塞，導致心肌需求增加、缺血及壞死惡化或代謝需求增加而惡化，進而導致心力衰竭及死亡。由於壓倒性的免疫炎症反應及細胞介素風暴，COVID-19感染間接導致心臟損傷。其他提出的機制包括SARS-CoV-2病毒入侵及心肌細胞的直接損傷，以及由於急性呼吸系統損傷導致的嚴重缺氧以及與血管緊張素轉換酶2 (angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)相關的另一個重要過程引起的心肌損傷，該轉換酶在心臟中表現，並且SARS-CoV-2將其用作進入細胞的受體(A14)。在COVID-19細胞介素風暴中升高的細胞介素中，IL-6很重要，因為其為與冠心病(coronary heart disease，CHD)相關性最強的細胞介素(A15)。介白素1b (Interleukin-1b，IL-1b)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)及IL-17也被報道係可以減少心血管進展的有效標靶(A16)。

糖尿病及COVID-19對免疫系統的影響： 根據Yang等人(A17)，在因COVID-19死亡的人員中，22%患有腦血管疾病，22%患有糖尿病。一項針對1,099名確診的COVID-19患者的研究表明，在173名患有嚴重疾病的患者中，23.7%患有高血壓，16.2%還患有糖尿病，5.8%還患有冠心病，2.3%還患有腦血管疾病。在另一項研究中，140名因COVID-19入院的患者中，30%患有高血壓，12%患有糖尿病(A18)。糖尿病患者對COVID-19易感性增加的所提出機制包括「1)更高親和力的細胞結合及有效的病毒進入，2)病毒清除率降低，3)T細胞功能減弱，4)對過度炎症及細胞介素風暴症候群的易感性增加,及5)CVD的存在」(A19)。當分析與COVID-19相關的糖尿病細胞介素概況時，焦點再次集中在IL-6上，據報道，IL-6在COVID-19感染中發揮更有害的作用(A19)。

慢性腎病及COVID-19對免疫系統的影響： 慢性腎病，尤其係依賴透析的終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)患者，也屬於因COVID-19而獲得嚴重疾病及死亡的高風險類別。當分析潛在的免疫概況時，觀察到細胞介素如介白素1β (interleukin-1 beta，IL-1 β)、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)及IL-6誘導炎症狀態，在透析相關發病率中發揮重要作用(A20)，再次指向IL-6。在另一份報道中，30%至50%的血液透析患者血清炎症標誌物水準升高，如C反應蛋白及IL-6(A21)。此外，CKD與免疫衰老(A22)及炎症生物標誌物(A23)的增加有關。

癌症及COVID-19中其他形式的免疫抑制對免疫系統的影響 在1,590例確診的COVID-19病例中，Liang等人發現18名患者有癌症病史。他們得出的結論係，與沒有癌症的人相比，癌症患者患COVID-19的風險更高，預後更差(A24)。根據Liang等人，雖然壓倒性的炎症及細胞介素相關的肺損傷與癌症患者COVID-19的嚴重程度有關(A25)，Xia等人(A26)指出，以免疫抑制細胞介素過度表現、促炎危險信號的誘導受到抑制、樹突細胞成熟受損及功能性免疫抑制白血球群增強為特徵的免疫狀態遲鈍，可能係加劇癌症患者COVID-19嚴重程度的實際潛在因素(A25)。重要地，由於免疫系統的性質改變，免疫功能低下的患者經常表現出病毒性疾病例如COVID的非典型表現(A26)。在藉由PCR檢測出SARS-CoV-2呈陽性的10名接受免疫抑制的腎移植受者中，9名患者住院，3名患者(30%)死亡，5名(50%)發生急性腎損傷(A27)。對89項關於免疫抑制或免疫刺激藥物的研究的回顧顯示，沒有確鑿的證據表明細胞毒性化療對COVID-19感染的益處(但在活體外研究中觀察到了此等益處)或對使用非甾體抗炎藥物(non-steroidal anti-inflammatory drug，NSAID)及TNFα阻斷劑的益處。雖然有明確證據表明IL-6峰值水準與肺部併發症的嚴重程度之間存在關聯，但沒有證據表明IL-6抑制劑對調節COVID-19有有益影響(A28)。因此，據報道免疫抑制有助於COVID-19，而不係細胞介素風暴，感染SARS CoV2的腎移植患者僅表現出輕度疾病(A29)，從而更加突出了過度炎症係COVID-19進展的潛在機制。此為面向未來前景的主要研究領域。

對抗COVID-19的免疫策略 概述了尤其具有合併症的COVID-19中的免疫系統特徵，讓我們關注裝備免疫系統以對抗COVID-19的策略。先天免疫反應對於對抗病毒感染非常關鍵，並且絕對依賴於干擾素(interferon，IFN) I型反應，其下游級聯控制病毒感染以及誘導有效的適應性免疫反應。先天免疫細胞藉由病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patternPAMP)以病毒基因組RNA或病毒複製過程中的中間體(包括dsRNA)的形式識別病毒的入侵(A30)。此識別事件導致下游信號級聯被活化，最終導致I型IFN及其他促炎細胞介素的表現。此初始反應包括在進入部位抵禦病毒感染的第一道防線。對於SARS-CoV及MERS-CoV，I型干擾素對病毒感染的反應實際上受到抑制，此與疾病的嚴重程度密切相關。SARS-CoV-2也採用了類似的抑制I型干擾素反應的策略。此外，失調的I型IFN及炎性單核球-巨噬細胞流入係導致致命性肺炎的主要原因。因此，針對COVID-19提出的免疫對抗策略包括藉由使用一些關鍵促炎細胞介素的拮抗劑來抑制細胞介素風暴，增加有益細胞介素，如IL7、I型干擾素，以及使用抗病毒藥物進行治療(A30)。雖然基於先天免疫系統的策略係治療的關鍵，但適應性免疫系統係疫苗開發的關鍵(A30)。我們假設一種更簡單、更有效的方法係營養干預。

COVID-19的預防及治療性營養干預 補充維生素A及D可增強對流感病毒疫苗接種的免疫反應(A31)。儘管人們普遍認為維生素C有助於預防病毒感染，尤其普通感冒，但對640項研究的文獻綜述未能確定維生素C預防普通感冒的任何確鑿證據(A31,32)。補充微量營養素的結果好壞參半。一項針對725名住院老年患者的RCT顯示，與對照組相比，低劑量鋅及硒補充劑可增強疫苗接種後的體液反應(A33)，而在另一項RCT中，每天補充多種維生素礦物質或補充維生素E(200毫克/天)均沒有對營養良好的非住院老年參與者的急性呼吸道感染的發生率及嚴重程度顯示出有利的影響(A34)。

營養保健品藉由增強免疫反應來緩解感染了封裝的RNA病毒(例如流感及冠狀病毒)的人。

AFO 202 β葡聚醣及其與患有合併症的COVID-19患者的相關性 雖然因為IFN-γ受抑制係SARS-COv2感染的特徵(A30)，AFO 202 β葡聚醣補充劑具有增加IFN-γ能力方面的免疫增強活性(A35)，所以該補充劑可能係對抗COVID-19感染的潛在策略，但是對患有合併症的人應強調食用該補充劑。IL-6係慢性微炎症疾病例如CVD、糖尿病及CKD引起的細胞介素風暴中最常見的升高的細胞介素(A12,13,17,18)。此AFO 202 β葡聚醣可降低IL-6水準(A43)。sFAS的增加有助於藉由免疫抑制調節免疫反應，對於調節與COVID-19相關的細胞介素風暴及過度炎症非常有價值(A43)。關於手稿(A11,12)介紹部分中列出的促炎及有益細胞介素，AFO 202 β葡聚醣至IL8導致嗜中性球的活化、遷移及趨化性，以殺死病毒感染的細胞。此β葡聚醣還會導致CCL2(單核球趨化蛋白1；Monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)的減少及CXCL10水準的降低，因此會阻止對單核球/巨噬細胞、T細胞、NK細胞及樹突細胞的化學吸引，從而抑制免疫反應。此外，T細胞與內皮細胞的黏附及抗腫瘤活性的促進伴隨著免疫反應的增強。AFO 202 β葡聚醣增加I型干擾素的產生有助於殺死病毒感染的細胞(A43)。此外，IL-7產量的增加導致成熟T細胞的發育及存活以維持體內平衡。CD8+(細胞毒性T細胞)的活化有助於抗病毒免疫，而CD4+(主要係Th1細胞)及Treg細胞的活化有助於調節免疫反應及抑制具有嚴重炎症的細胞介素風暴。B細胞的活化導致產生病毒特異性抗體(IgG、IgM及sIgA)以中和病毒毒性(A43)。第A1圖簡要說明了AFO 202 β-葡聚醣對抑制促炎因子及增強COVID-19有益因子的作用。

AFO-202β-葡聚醣(A35)增強的調節免疫概況將有助於癌症患者的免疫調節。對於腎移植受者及免疫抑制患者，NK細胞及巨噬細胞增強活性將在抗病毒免疫中發揮作用(A43)，從而幫助他們對抗COVID-19。

另一個有趣的態樣係腸道微生物群可以影響先天記憶的產生及骨髓祖細胞的功能重編程，從而有助於防止感染(A57)。它們的生態失調還會導致各種免疫介導的炎症性疾病(A57)。β葡聚醣在減少CVD等疾病方面的有益作用也歸因於它們影響腸道微生物群的作用(A58)，並且β葡聚醣藉由作用於腸道微生物群來進行的免疫調節可以幫助緩解炎症免疫概況(A59)，從而產生有益的效果。此等優勢意味著β葡聚醣在對抗COVID-19方面應該更重要，尤其在存在慢性炎症相關併發症的情況下。因此，對於彼等患有多種合併症的高危人群而言，食用此食品補充劑—其安全性已在20多年的食用中得到證明(A43,47,48)—將係一種前瞻性的預防選擇，甚至在與此致命的COVID-19大流行作鬥爭的治療期間，充當一種支持性選擇。

在COVID-19中考慮AFO 202 β葡聚醣類型的營養補充劑的局限性及障礙 個體對COVID-19的易感性的變異歸因於一些固有因素，例如人類白血球抗原(human leukocyte antigen，HLA)多態性方面的遺傳變異(A60)、ACE-2基因的突變(A61)、年齡、一般健康狀況及營養(A62)。獲得性變異，例如由針對COVID-19的BCG疫苗(A63)及日本腦炎(Japanese encephalitis，JE)疫苗(A64)等疫苗提供的交叉免疫係其他態樣。雖然合併症會影響COVID-19的臨床病程，但由於AFO 202 β葡聚醣等營養補充劑尚未在COVID-19患者中實際嘗試過，因此強調以下觀點係謹慎的：只有在將該等補充劑應用於COVID-19的不同臨床表現，尤其係具有影響疾病易感性的不同變異的人群時，使用包含AFO 202 β-葡聚醣的此等營養補充劑作為COVID-19預防及治療支持的常規措施的實際臨床實用性才會得到認可。此外，一旦疾病在呼吸系統疾病、多器官功能障礙(A65)、大血管中風(A66)等方面確立，儘管建議藉由包括AFO-202 β葡聚醣在內的補充劑提供營養支持，使免疫系統能夠回到對抗感染的軌道上，但是它在現實中的可行性需要驗證。

在一些實施例中，本發明涉及一種疫苗佐劑，其包含由出芽短梗黴AFO-202 (FERM BP-19327)產生的β-葡聚醣，其可用於預防及/或治療SARS-CoV-2感染或由SARS-CoV-2引起或加重的疾病，及/或用於預防及/或治療癌症或特定免疫功能低下人群的癌症。

β-葡聚醣及免疫： 訓練免疫(Trained immunity，TRIM)誘導係很有前途的針對COVID-19的防禦策略[B6]。廣為人知的卡介苗(Bacille Calmette-Guerin，BCG)疫苗可誘導TRIM，預防嚴重形式的結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，TB)——對肺結核的作用有限——並賦予針對無關感染及死亡的非特異性保護作用[B6]。BCG的非特異性保護作用與T細胞及B細胞無關，由先天免疫細胞(如單核球、巨噬細胞及NK(自然殺傷(natural killer))細胞)的功能性及表觀遺傳重編程介導，此保護作用稱為TRIM。

β-葡聚醣係酵母、細菌及真菌細胞壁中豐富的一組異質多醣，據報道可誘導TRIM，但其誘導機制與BCG不同。β-葡聚醣在先天免疫細胞中誘導表觀遺傳重編程，導致細胞活化、細胞介素產生增加及代謝功能變化，將細胞代謝從氧化磷酸化轉變為藉由Akt/mTOR(哺乳動物雷帕黴素標靶)/HIF1α(缺氧誘導因子1α)通路來介導的葡萄糖發酵[B7]，並且此代謝轉變係有效誘導TRIM的關鍵因素。表觀遺傳改變組蛋白甲基化及乙醯化導致基因表現的正調控。當此經過表觀遺傳「訓練」的細胞與異源二級刺激物接觸時，它們會被編程以產生更強大的免疫反應[B4,7]。據報道，此等細胞沒有經過外周訓練，但β葡聚醣可能會影響骨髓(bone marrow，BM)並導致持久的TRIM表型。腹腔內投與β-葡聚醣特異性擴增BM中的Lin-Sca1+cKit+(LSK)及多能骨髓祖細胞3 (Mul-tipotent Myeloid Progenitor 3，MPP3)造血幹細胞(hematopoietic stem cell，HSC)，此等經訓練的HSC會產生「中央」記憶[B7]。由β-葡聚醣驅動的表觀遺傳修飾會被繼發感染或刺激物(如病毒)迅速活化，因此可作為針對COVID-19的疫苗的有效策略[B4]。β葡聚醣充當病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，因為它們存在於某些致病酵母及細菌的細胞壁中，從而導致人體免疫系統識別及清除微生物。到達腸道後，β-葡聚醣被腸上皮細胞及/或M細胞內化，然後呈遞給派爾氏斑塊內的免疫細胞。β-葡聚醣顆粒也可以藉由血液或淋巴到達遠處的淋巴器官。在派爾氏斑塊中，β-葡聚醣顆粒藉由特定病原體識別受體(pathogen recognition receptor，PRR)的連接被識別，例如Toll樣(toll-like，TLR)及C型凝集素樣受體。在C型凝集素樣受體中，Dectin-1係研究最多的受體，它與各種來源的β葡聚醣結合。Dectin-1表現於單核球、巨噬細胞、嗜中性球、樹突狀細胞及T淋巴球的表面，此等細胞均被β葡聚醣結合活化。此結合藉由調節炎性體及轉錄因子活化導致許多細胞反應，從而導致細胞介素、趨化因子及活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產生。β葡聚醣藉由直接與NKp30活化受體結合來刺激NK細胞的細胞毒活性，作為先天免疫反應的一部分[B8,9]。β葡聚醣的先天免疫目標係單核球、巨噬細胞、樹突細胞及NK細胞。β-葡聚醣也能活化單核球及嗜中性球的抗微生物活性[B8]。關於T細胞，β葡聚醣有助於CD4+T細胞免疫調節浸潤腫瘤，從而抑制腫瘤生長[B10]。口服β葡聚醣已到達脾臟及淋巴結，活化DC，從而擴大及活化抗原特異性CD4及CD8 T細胞以及IFN-γ的產生，從而顯著降低腫瘤負荷[B11]。β-葡聚醣還誘導B淋巴球產生抗體。短期補充β葡聚醣可改善唾液免疫球蛋白(sIgM、sIgG及sIgA)的水準[B12]。口服β葡聚醣可顯著穩定IgG1水準，從而維持抗感染免疫力。因此，免疫系統的所有態樣都被β葡聚醣活化及調節，使其值得考慮作為理想的疫苗，產生持久有效免疫，對生物體的所有變體具有廣泛的保護作用，對所有年齡段的所有接種受試者都有效並且穩定且易於給藥[B13]。目前，對受COVID影響的患者而言，持久免疫係一個巨大的挑戰[B14]。β葡聚醣已藉由實驗證明可產生針對多種病原體的持久的訓練免疫[B15]。此外，β-葡聚醣對所有年齡段的人食用都係安全的，它們屬於FDA公認的安全(generally recognized as safe，GRAS)類別[B16]。β葡聚醣係穩定的，可以作為食品補充劑持續食用[B5]。存在多種類型的β葡聚醣，但與其他類型的β葡聚醣相比，源自酵母及蘑菇的β葡聚醣對免疫系統具有深遠的影響。口服β葡聚醣已被嚴格地描述為預防性補充劑，可藉由其TRIM作用增強免疫反應並消除COVID-19症狀[B5]。雖然SARS-Cov-2主要被認為係一種影響呼吸系統的病毒，但病毒宿主受體ACE2出現在胃腸道上皮細胞的細胞質中，而病毒核衣殼蛋白出現在直腸、十二指腸及胃上皮細胞的細胞質中——表明腸道可能與COVID-19的發病機制有關，並且係可能的感染途徑[B17]。因此，從腸道開始具有免疫作用的β-葡聚醣可能係COVID-19的有利補充策略。腸道生態失調亦係確定感染相關疾病的關鍵因素。β-葡聚醣還可以調節腸道細菌，進一步改善免疫反應[B18]。在包括隨機對照試驗在內的多項研究中，β-葡聚醣補充劑降低了上呼吸道感染的發生率[B19-22]。來自食用香菇(「shiitake mushroom/Lentinus edodes」)的β葡聚醣提取物最近產生了不同的活體外免疫調節及肺細胞保護作用，適用於COVID-19免疫療法。該研究比較了兩種香菇多糖提取物，它們分別降低了人肺泡上皮A549細胞中細胞介素誘導的NF-κB活化，並減弱了促炎細胞介素的產生(TNF-α、IL-8、IL-2、IL-6、IL-22)以及TGF-β及IL-10。該研究表明，β-葡聚醣作為量身定製的混合物提供，適合未來針對COVID-19的基於營養食品的干預措施。該研究還提到了一個主要缺點：保持功能性生物活性及增加β葡聚醣產量需要較少有害的提取過程，無需酶及苛刻的化學品使用。此提取過程對於使用β葡聚醣對抗COVID-19至關重要[B23]。

AFO-202 β-葡聚醣-臨時疫苗替代品： 我們在此描述了一種黑色酵母出芽短梗黴AFO-202菌株(也稱為FO-68[(登錄號)FERM BP-19327])，其衍生的β葡聚醣係唯一地由該黑色酵母作為胞外多醣分泌的。因此，它不需要任何類型的提取到純化過程，從而產生具有顯著生物功能活性的高純度β葡聚醣[B24]。此AFO-202 β葡聚醣可以產生與COVID-19相關的各種陽性免疫反應。它降低了IL-6水準，該IL-6為COVID-19細胞介素風暴中最常見的升高的細胞介素，該細胞介素風暴係導致器官損傷及死亡的主要機制。它增強了IFN-γ及sFAS。它與導致嗜中性球病毒細胞毒性的活化、遷移及趨化性的IL8產生增加有關。它降低CCL2及CXCL10水準，從而防止對單核球/巨噬細胞、T細胞、NK細胞及樹突細胞的化學吸引。化學吸引的預防然後調節免疫反應。它還增加了IL-7的產生，導致成熟T細胞的存活及發育。活化CD8+(細胞毒性T細胞)、CD4+(主要係Th1細胞)及Treg細胞有助於平衡調節性免疫反應。此AFO-202 β葡聚醣活化B細胞會導致產生病毒特異性抗體[B24,25]。此AFO-202 β葡聚醣可增強NK細胞對亞馬遜利什曼原蟲感染的活性[B26]。此AFO-202 β葡聚醣也存在於白色念珠菌的內壁中，從而加強了其作為PAMP的作用並獲得了PRR的有效識別。此AFO-202 β-葡聚醣自1996年日本監管機構批准其作為食品添加劑以來一直被食用。它已在多項研究中被證明係安全有效的，包括對老年患者的研究[B27]。此AFO-202 β葡聚醣還有助於維持血糖及血脂水準[B28,29]，從而解決COVID-19發病機制中糖尿病及心臟病等併發症的高風險。

AFO202-作為廣譜免疫效應物： 口服疫苗在腸道相關淋巴組織(gut-associated lymphoid tissue，GALT)中產生免疫力，該組織由淋巴結、派爾氏斑塊(含有75%的B細胞及20%的T細胞)及胃腸道(gastrointestinal tract，GIT)中的分離淋巴濾泡組成。M細胞將疫苗中的抗原穿過黏膜屏障轉運到派爾氏斑塊，抗原藉由抗原呈遞細胞(antigen-presenting cell，APC)呈遞給T細胞。CD4+T細胞被活化，該等T細胞支持生髮中心發育、B細胞親和力成熟及類別轉換為IgA，以及CD40/CD40配體相互作用及細胞介素分泌。抗原引發的B細胞然後遷移到遠處的效應區，在那裡它們分化成分泌二聚或多聚IgA分子的漿細胞。此等分子以SIgA、分泌性IgA (secretory IgA，sIgA)抗體的形式被轉運到腸腔中，此等抗體可防止附著及病原體入侵，並藉由疫苗來中和腸毒素並誘導血清IgG抗體，從而對抗黏膜及全身侵入性病原體。疫苗還活化針對細胞內細菌及病毒的細胞介導的免疫反應(cell-mediated immune，CMI)以及抗體依賴性細胞毒性反應[B30,31]。

在皮內接種疫苗後，皮膚上皮中存在的免疫細胞(例如DC、T淋巴球、NK細胞、巨噬細胞及肥大細胞)主要藉由朗格漢斯細胞(在抗原捕獲後遷移至淋巴結中並啟動適應性免疫反應的特定DC子集)來觸發皮膚的炎症級聯反應。藉由包括toll樣受體(toll-like receptor，TLR)及胰島蛋白(CD207)的一系列生殖系編碼的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)，此等細胞受到病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)的刺激。皮膚的常駐肥大細胞藉由釋放含有炎症介質的顆粒來誘導皮膚的先天免疫反應[B31]。

取決於用於進入免疫系統的網狀內皮系統或單核吞噬細胞系統[B32]的成分，免疫系統觸發口服及皮內接種疫苗的途徑。口服疫苗從黏膜相關淋巴組織(mucosal-associated lymphoid tissue，MALT)及GALT開始，皮內疫苗從外周淋巴組織開始。

β-葡聚醣被認為係有前景的抗感染疫苗佐劑，因為它們單獨可以刺激各種免疫反應，包括抗體產生而沒有任何不良反應。β-葡聚醣已被用作魯氏耶爾森氏菌疫苗的佐劑，儘管在此情況中它並非疫苗的直接組成部分[B33]。已發現β-葡聚醣作為佐劑可增強B型肝炎疫苗、流感疫苗、全身性麯黴病及球黴菌病疫苗的免疫原性。AFO-202 β-葡聚醣已被證明係一種潛在的免疫佐劑，因為當它與禽流感H5亞型疫苗一起投與時，它啟動了顯著更高的免疫反應，具有更高的血球凝集抑制(hemagglutination inhibition，HI)效價及10-20% ELISA血清轉化[B34] 實例

下文將基於以下文獻研究及實例更具體地描述本發明。需注意，本實施例並不限制本發明。

文獻研究

研究1 需要用於預防癌症的持續補充方法的脆弱人群： 因此，從上述描述中，我們可以確定處於癌症發展高風險中或患有癌症但需要干預以防止癌症進展的脆弱人群的子集。

他們係： i.炎性衰老的老年人：有足夠的證據表明，包括癌症、心血管疾病及2型糖尿病在內的與年齡相關的病理係如何揭示常見的炎症背景的，此過程被稱為炎性衰老。感染引起的慢性抗原負荷、細胞衰老、DNA損傷反應失調、腸道微生物群改變、代謝性炎症及一些與衰老相關的miR也會影響其他致癌因素，從而共同影響及促進炎症，進而導致癌症形成及進展(Leonardi)

ii.自身具有或由於對免疫系統的影響而具有癌症發展遺傳風險變異的人[C19]：基因與癌症之間的關聯係眾所周知的。例如，所有癌症中最常見的突變基因係TP53。BRCA1及BRCA2基因的遺傳突變與遺傳性乳腺癌及卵巢癌症候群有關[C19]。Imai等人的關於免疫系統虛弱及癌症發展的里程碑式研究非常重要。他們在1986年至1990年間，藉由同位素釋放測定法在大多數在40歲以上的日本人口的3625名居民中評估了外周血單核球的天然細胞毒活性。他們還對隊列成員進行了為期11年的隨訪調查，研究癌症發病率及死亡率。他們的隨訪清楚地表明，外周血淋巴球的中高細胞毒活性與降低癌症風險有關，而低活性與癌症風險增加有關[C23]。

iii.生活方式及代謝病症的個體[C10]：70多年來，人們一直假設糖尿病等代謝病症與癌症之間存在關聯[C10]。流行病學資料還表明，糖尿病患者患各種癌症的風險增加，死亡率也增加。已經提出了幾種用於糖尿病與癌症之間關聯的途徑：i．高血糖經由增加氧化應激及DNA損傷而導致癌症風險增加，ii.外源性胰島素或胰島素類似物引起的高胰島素血症(該觀點已受到多項研究的挑戰)，以及iii.細胞介素失調的慢性微炎症[C10]。糖尿病的高血糖藉由為癌細胞提供能量來促進惡性細胞生長。在糖尿病患者中觀察到慢性炎症標誌物水準升高，例如介白素(interleukin，IL)-1β、IL-6及腫瘤壞死因子(tumour necrosis factor，TNF)-α，此情況突出了癌症細胞進展及發展過程中免疫反應的活化。由糖化生物分子及晚期糖基化終產物的慢性積累引起的糖尿病中不受控制的促炎反應環境藉由活化轉錄因子核因子(nuclear factor，NF)-кB及細胞中活性氧的形成而產生慢性炎症狀態，從而促進有利於腫瘤的微環境，並可能引發免疫系統過度活化，最終導致癌症生長[C13,14]。關於代謝症候群、慢性炎症及癌症，已經提出了慢性及穩定的背景炎症。它被稱為「下丘腦微炎症」[C17]，因為隨著年齡的增長及代謝症候群的發展，下丘腦非典型地經歷促炎信號活化。據報道，此下丘腦微炎症還可以程序性地控制全身衰老[C17]。由於衰老與慢性炎症狀態相關，與長壽呈負相關，與神經退行性疾病呈正相關，因此下丘腦與導致癌症的微炎症狀態之間的關聯變得更加明顯[C17]。

iv.由於i、ii或iii導致免疫系統弱點的人

v.接受化療、放療或手術的癌症患者，該等過程導致治療誘導的免疫功能障礙[C27-29]。據報道，化學療法或化學及放射療法組合會顯著延遲免疫恢復至治療前的基線水準。手術帶來了機會窗口[C28]，它允許殘留的癌細胞，包括遠處轉移，在沒有NK細胞監測的情況下獲得立足點。

未來的道路係確定一種持續補充方法作為干預措施；此舉將有助於持續保持免疫系統的正常功能，從而增強其免疫監視及抗腫瘤特性，在預防癌症方面也發揮潛在作用。

癌症的疫苗方法： 根據美國疾病控制中心(Centers for Disease Control，CDC)，「疫苗係一種能夠刺激人體免疫系統對特定疾病產生免疫力的產物」[C31]。癌症疫苗可能為治療性的或預防性的。預防性癌症疫苗包括彼等可以引發或增強預先存在的抗腫瘤免疫力，從而消除癌症並產生長期記憶以防止其復發的蛋白質、肽、DNA或RNA [C32]。治療性癌症疫苗的目的係控制癌症負擔。此類考量的疫苗包括源自患者的自體免疫細胞疫苗、表現腫瘤抗原的重組病毒疫苗、肽疫苗、DNA疫苗及源自已建立的人類腫瘤細胞系的異源全細胞疫苗[C33]。雖然有幾個疫苗正在進行臨床試驗，但個性化樹突狀細胞疫苗sipuleucel-T (Provenge)及重組病毒性前列腺癌疫苗PSA-TRICOM (Prostvac-VF)係眾所周知的處於預批准/授權批准/末期臨床試驗階段的疫苗[C34]。疫苗通常與佐劑一起投與，從而有助於改善免疫原性較差的疫苗」[C35]。

不同類型的新型佐劑已被鑑定並應用於癌症疫苗。它們包括無機奈米粒子、有機分子及聚合物[C36]。病原體藉由病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)刺激「危險感知」信號。基於無機奈米粒子的佐劑藉由像PAMP一樣起作用，刺激抗腫瘤免疫。基於有機分子的佐劑包括基於小分子的佐劑，例如修飾的PAMP、PPR的新配體等。作為可調節先天性及適應性免疫反應的I型跨膜蛋白的toll樣受體家族的促效劑[C36]；及STING(干擾素基因刺激劑)[C37]皆為有機佐劑的實例。基於聚合物的佐劑既有助於藥物遞送，又可作為免疫系統活化的PAMP。

然而，出現了一個問題：是否存在基於營養的補充劑可以作為潛在的疫苗佐劑來預防性地及治療性地有助於正在進行的針對癌症的鬥爭？

征服癌症的β-葡聚醣疫苗佐劑(B-VACCIEN)方法： β-葡聚醣係天然存在的多醣，該等多醣係某些細菌及真菌細胞壁的成分[C38]。據報道，酵母來源的1,3-1,6β葡聚醣具有更有效的生物反應調節劑作用[C39]。「免疫調節劑被定義為能夠與免疫系統相互作用導致上調或下調免疫反應的特定部分的物質」[C40]。免疫調節劑由一系列合成、天然及重組分子組成。天然分子，如薑黃素、百里香、月桂葉、白藜蘆醇、鞣花酸、人參、紫錐菊、蘆薈、黃芪、金銀花、黃酮類及精油中的天然分子，都被作為營養補充劑、針對免疫調節特性經研究。然而，對單個免疫調節劑的直接比較研究非常有限。Vetvcika指出，在已發表的20,000多項研究中，葡聚醣在其他免疫調節劑中處於最佳位置[C40]。葡聚醣係生物反應調節劑，對免疫系統的各個分支都有顯著影響。葡聚醣被巨噬細胞、單核球、樹突細胞及NK細胞等細胞膜上存在的模式識別受體識別，關鍵受體係Dectin-1及CR3 (CD11b/CD18)。其他受體係Toll-2、乳糖神經醯胺及清除受體家族[C40]。

在癌症免疫方面，β-葡聚醣已被證明藉由活化免疫系統的適應性及先天臂，刺激免疫細胞如白血球、T輔助細胞及NK細胞以及抗凝血作用，而在增加對感染的抵抗力(特別係在病毒相關癌症中很重要)、抗腫瘤作用方面發揮著關鍵作用，(Chaichian，2020)。β葡聚醣藉由充當PAMP活化早期先天反應。已顯示葡聚醣活化的B細胞藉由牽連到多種分子(如Dectin-1受體、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)及轉錄因子NF-κB及AP-1)來分泌促炎淋巴因子，如介白素8。β-葡聚醣已被證明係細胞免疫的強活化劑。β-葡聚醣的抗感染作用已被證明可對抗以下感染：大利什曼原蟲、杜氏利什曼原蟲、白色念珠菌、剛地弓形蟲、豬鏈球菌、伯氏瘧原蟲、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、科氏中殖孔絛蟲、克氏錐蟲、蠕形艾美球蟲及炭疽芽孢桿菌。許多動物及人類研究已經證明了β葡聚醣對多種腫瘤的抗腫瘤作用[C40]。最近的研究證明，β-葡聚醣與天然存在於癌症中的抗體具有很強的協同作用[C40]。

關於癌症的輔助免疫療法，已顯示免疫療法需要樹突細胞引發及檢查點抑制劑阻斷兩者[C41]。β葡聚醣係一種理想的候選物，因為它們既具有樹突細胞引發作用，又可以增強針對免疫檢查點分子的抗體[C39]。使用β-葡聚醣及靶向免疫檢查點分子(如PD-1及PD-L1)的mAb的聯合療法已在臨床前模型中進行了研究，具有良好的抗腫瘤功效，並正在轉化為I期臨床試驗[C39]。受過訓練的先天免疫(Trained innate immunity，TRIM)係藉由成熟骨髓細胞或其骨髓祖細胞的調節來誘導的先天免疫系統記憶。此過程有助於調節對次級挑戰的持續增強反應。據報道，可以藉由誘導訓練免疫來增強抗腫瘤免疫[C42]。

值得注意地，β-葡聚醣係TRIM的有效誘導劑，尤其藉由在骨髓(中央TRIM)和外周TRIM水準對先天免疫細胞進行表觀遺傳重編程[C43,44]。Vetvicka及Vetvickova [C45]指出，高度純化的活性葡聚醣在癌症中具有顯著的多效性作用。癌細胞耐藥性係抗癌治療中的重要障礙。β-葡聚醣係克服癌症治療耐藥性的潛在候選物。這已在抗治療的Lewis肺癌細胞系(LL/2)細胞中得到證實，其中念珠菌細胞壁β-葡聚醣對親代細胞系及源自該細胞系的癌症幹細胞均顯示出顯著的細胞毒作用(Sadeghi)。

慢性微炎症、癌症及β-葡聚醣 已經有足夠的證據確定了慢性炎症易患癌症。潛在的感染或炎症與25%的所有癌症病例有關。由於免疫反應的精確控制失敗而導致的任何未解決的炎症都會繼續擾亂細胞微環境，導致癌症相關基因的改變以及參與細胞週期、DNA修復及細胞凋亡的關鍵細胞信轉導蛋白的翻譯後修飾。即使在腫瘤發展的早期階段，鑑定與增生及異型區域密切相關的單核炎性細胞(mononuclear inflammatory cell，MIC)進一步支持了炎症係促進腫瘤發生及/或初始腫瘤進展的主要驅動力的概念.巨噬細胞、肥大細胞及嗜中性球等免疫細胞對非特異性促炎細胞介素(干擾素-γ、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、介白素(interleukin，IL)-1α/β或IL-6)的上調已被證明可促進腫瘤發展(Neiro)。癌症本身引發的炎症過程很可能參與了它們的進展。

炎症也係許多癌症風險因素的共同作用機制，該等風險因素例如感染、肥胖、吸煙、飲酒、接觸微粒、生態失調及慢性炎性疾病，包括胰腺炎及結腸炎。服用包括阿司匹林的某些抗炎藥也已被證明可以顯著降低癌症風險。預防或逆轉炎症被視為控制癌症的重要方法(Todoric)。

最終導致癌症的慢性微炎症也需要關注代謝病症，例如糖尿病及癌症形成。已經提出了幾種用於糖尿病及癌症之間關聯的途徑，例如藉由增加氧化應激及DNA損傷導致癌症風險增加的高血糖症、高胰島素血症、具有細胞介素失調的慢性微炎症需要特別關注。由糖化生物分子及晚期糖基化終產物的慢性積累引起的糖尿病中不受控制的促炎反應環境藉由活化轉錄因子核因子(nuclear factor，NF)-кB及細胞中活性氧的形成而產生慢性炎症狀態，從而促進有利於腫瘤的微環境並可能引發免疫系統過度活化，最終導致癌症生長。

進一步關於慢性炎症及癌症，已提出被稱為「下丘腦微炎症」的慢性及穩定的背景炎症[C17]，該炎症係下丘腦隨著年齡的增加及代謝症候群的發展而非典型地經歷促炎信號活化。β葡聚醣，尤其酵母衍生的β葡聚醣有助於對抗慢性微炎症，促進預防癌症的反應，並且β葡聚醣所具有的代謝平衡活性也增加了它們在癌症預防中的作用。在對酵母衍生的β-葡聚醣的研究中，藉由H2O2清除的抗氧化活性、在髓過氧化物酶活性方面的活體內抗炎潛力以及MDA及NO的減少都得到了證明(Bacha)。在另一項研究中，已證明定期攝入β葡聚醣藉由作用於IL-6而具有抗炎作用，IL-6係一種在平衡促炎及抗炎通路的急性期反應中起關鍵作用的多效性細胞介素(Barera)。一種具有高純度及功能性的源自稱為出芽短梗黴AFO-202菌株(也稱為FO-68[(登錄號)FERM BP-19327])的黑酵母的AFO-202生物反應調節劑葡聚醣(biological response modifier glucan，BRMG)係水溶性β葡聚醣並供人類食用了幾十年[C46]，由於其具有以下特徵及屬性，該葡聚醣可以作為一種藉由免疫增強來戰勝癌症的潛在的β-葡聚醣疫苗佐劑；亦即治療癌症的B-VACCIEN輔助方法。多項人體研究表明，AFO-202 β葡聚醣有助於將血糖水準及脂質水準維持在正常範圍內[C47-49]，從而有助於預防導致癌症的代謝性微炎症及慢性炎症。AFO-202 β葡聚醣已被證明可刺激介白素8 (interleukin-8，IL-8)或可溶性Fas (soluble Fas，sFas)的產生，但不能刺激IL-1β、IL-6、干擾素-γ (interferon-gamma，IFNG)、腫瘤壞死因子-α (tumour necrosis factor-alpha，TNF-α)或可溶性Fas配體(soluble Fas ligand，sFasL)的產生[C46]。

IL8具有抗炎活性並有助於T細胞的募集。它還可以增強ROS(活性氧(reactive oxygen species))的代謝。它充當抵禦入侵微生物的屏障，氣道上皮釋放IL-8藉由促進嗜中性球趨化性來促進宿主的免疫防禦(Qazi)。已顯示腫瘤表現Fas配體(Fas ligand，FasL)並下調Fas以逃避宿主免疫監視。血清sFasL水準升高與疾病進展相關(Kozlowski)細胞介素如IL1及IL6係炎性細胞介素，尤其在大範圍的實體瘤中觀察到的腫瘤微環境中由免疫細胞分泌的IL-1、IL-4及IL-6，癌細胞表現該等細胞介素的受體有助於癌細胞的免疫逃避(Setrerrahmane)。由於IL-6促進腫瘤生長，其升高的血清水準及腫瘤組織中的表現增加係癌症患者生存的陰性預後標誌物(Chonovoc)。

雖然長期以來一直認為IFNG係抗腫瘤免疫的核心參與者，但它也具有促腫瘤作用。IFNG介導的非經典MHC Ia類基因活化已被證明有助於黑色素瘤細胞逃避CTL介導的細胞溶解，進而導致黑色素瘤肽疫苗的臨床失敗。IFNG還與單核球及骨髓來源的顆粒性抑制細胞流入腫瘤微環境有關，從而導致抗癌T細胞反應的抑制。IFNG誘導癌細胞上的PD-L1/2配體，導致它們與免疫抑制受體PD-1結合，從而抑制T細胞及NK細胞的免疫效應活性，促進癌症進展(Zaidi)。

主要由腫瘤相關巨噬細胞分泌的TNF-α引發慢性炎症。TNF-α還具有雙重作用，當高劑量投與時它會導致腫瘤細胞凋亡，但長期低劑量投與已被證明會加速腫瘤侵襲及轉移。TNF-α還藉由ERK1/2信號通路(Zhao)上調腫瘤相關鈣信號轉導蛋白(TROP)-2，從而誘導血管生成因子的表現、促進腫瘤血管生成及加速腫瘤轉移。因此，藉由使活化抗癌細胞介素及抑制促腫瘤細胞介素得到平衡，AFO-202 β葡聚醣可以在預防化療或其他癌症治療引起的細胞介素失衡炎症及幫助抗癌治療方面發揮關鍵作用。此舉改善了癌症的預防及治療[C27-29]。

據報道，基於Dectin-1的腫瘤細胞識別使先天免疫細胞的抗腫瘤反應得以協調[C50]。AFO-202發揮其生物反應調節作用的關鍵受體係Dectin-1 [C46]。此AFO-202 β葡聚醣已被證明有助於抵抗感染。例如，它藉由增加NK活性及細胞免疫來增強對亞馬遜利什曼原蟲及瘧疾的免疫力，藉由對抗感染來擴大抗癌潛力[C51]。據報道，AFO-202 β葡聚醣的疫苗佐劑作用係增強對A型禽流感H5N1及H5N2疫苗的免疫反應的潛在效應物[C52]。

在腫瘤植入物的動物模型中，AFO-202衍生的β葡聚醣的抗腫瘤作用明顯高於其他類型的葡聚醣[C53]。當給小鼠腫瘤模型投與AFO-202 β葡聚醣時，免疫概況增加並維持在正常水準，類似於沒有化療的對照組[C54]。在Ma等人的研究中，順鉑化療後腫瘤縮小的百分比[C55]為12%，而在一項與順鉑化療一起投與AFO-202 β葡聚醣的研究[C56]中，此比例為49%(第C1圖)。11名健康人類志願者在一個月內每天3次口服15克AFO-202 β-葡聚醣，並且相對於來自人胃癌細胞系的K562細胞，評估了來自外周血來源的單核球的NK細胞的細胞毒活性。

細胞毒活性的增加率為90.9% [C54]。當健康個體NK細胞毒性增加的資料與文獻的歷史資料[C57]相關聯時，發現在所有年齡段，食用AFO-202 β-葡聚醣[C54]顯著增加了NK細胞的細胞毒性(p-值= 0.031599；第C2圖)。在另一項旨在檢查持續3個月每天3次口服15克AFO-202衍生β葡聚醣的免疫刺激作用的針對癌症患者(n = 35)的AFO-202衍生β葡聚醣的研究中，老年癌症患者的NK細胞活性的增加從32.8 %增加到37.1 % [C58]，當與文獻的歷史資料[C59]相關時，該值顯著更高(p值=0.000785；見第C3圖)。

第C4圖中給出了β-葡聚醣補充劑如何在易患免疫系統虛弱的特定人群中有助於抗腫瘤免疫及減輕癌症治療誘導的副作用的說明。

在病毒及慢性炎症的作用下，免疫系統的進化在癌症方面呈上升趨勢。隨著在上個世紀後半葉，生活方式及代謝病症成為主要醫療保健相關問題，並且隨著微炎症係導致此等個體癌症的潛在機制，老年免疫系統虛弱或炎性衰老係不可避免的。它可能發生在任何人身上，即使他們可能沒有慢性炎症。所有上述情況最終導致免疫系統出現缺陷，其解決方案需要一種整體方法，除了作為防止免疫監視系統減弱的持續支持機制外，該整體方法還可能對病毒、感染、炎症及代謝病症起作用。除了此等因素之外，免疫系統虛弱或遺傳易感癌症的遺傳成分可能會進一步使免疫系統虛弱火上澆油。遺傳學也需要解決——在此等個體中，免疫系統虛弱發展的時間或可能發生的癌症的侵襲性係未知的。

連續疫苗佐劑方法可以使用食品補充劑，例如β-葡聚醣。雖然我們不確定免疫增強是否會完全解決任何已經形成的癌症，但我們認為此舉肯定係解決免疫系統週期性或間歇性危害的潛在策略。手術後免疫系統虛弱的窗口期、以及化療或放療引起的免疫系統虛弱，需要明確檢查；免疫抑制被視為癌症治療失敗的主要原因[C60]。克服癌症治療後免疫系統虛弱的治療策略需要大規模的轉化及臨床研究。我們希望此類研究能夠對化療、手術或放療相關的癌症治療如何藉由β葡聚醣疫苗佐劑方法補充以減輕副作用產生一些見解。此目標可以藉由有效地活化免疫系統來降低與癌症不良反應相關的發病率及死亡率來達成。

值得注意地，有一項正在進行的隨機I/II期試驗研究了用於疫苗治療的OPT-821(基於皂苷的免疫佐劑OBI-821)與β-葡聚醣一起給藥時的副作用及最佳劑量以及該方案在治療年輕的神經母細胞瘤患者中的效果(https://www.cancer.gov/about-cancer/treatment/clinical-trials/search/v?id=NCI-2009-01362&r=1)

研究2 對死亡相關的合併病狀進行了文獻檢索。對於此等病狀，我們分析了促炎細胞介素，該等細胞介素可能導致免疫庫的排空。我們還分析了針對COVID-19的防禦機制/免疫監視所需的免疫標誌物，特別係藉由包括食用免疫增強營養補充劑在內的簡單方法，並且我們提出了對抗COVID-19的策略。與死亡率增加相關的主要合併症包括心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)、糖尿病、癌症免疫功能低下以及具有老年免疫系統的嚴重腎臟疾病。食用出芽短梗黴菌株(AFO 202) β 1,3-1,6葡聚醣支持增強的IL-8、sFAS巨噬細胞活性及NK細胞的細胞毒性，該毒性係對抗病毒感染的主要防禦機制。

結論 由於免疫失調而更容易發生與COVID-19相關的死亡的合併症患者可能會從食用增強免疫系統的營養補充劑中受益。我們建議臨床研究在COVID-19患者中驗證AFO 202 β葡聚醣，以證明其在克服過度炎症狀態方面的功效，從而降低死亡率，直到有明確的疫苗可用。

免疫系統係一把雙刃劍(A67)，其在防禦外來病原體、腫瘤發生及循環癌細胞的主要活性，同時保持它們的限制以免過度反應並最終處於高炎症狀態，進而導致COVID-19患者出現嚴重的細胞介素風暴之間進行平衡。儘管可以作用於此類免疫系統每個步驟的特定靶向分子及試劑可能對提供有益效果有效，但它們仍然會產生不良反應。鑒於此背景，目前認為普遍無害策略係必不可少的，因為缺乏「複合」COVID-19大流行的明確疫苗正在威脅著免疫失調的脆弱人群。藉由此分析，我們發現在多中心研究中，可以在此等患者中試用一種經過驗證的初級免疫防禦改善及免疫調節導向的營養補充劑，例如AFO 202 β葡聚醣，以證明其功效。二十多年來，將它作為食品補充劑來食用已被證明係安全的。

實例A 16名人類受試者口服無添加劑果凍(n = 8)及FO-68衍生的β-1,3-1,6葡聚醣添加果凍(n = 8)3週。之後，從所有受試者的靜脈中採集外周血，並量測各種細胞介素的產生量、免疫細胞的數量以及血液凝固性/血栓形成性參數。

相對於無添加劑的果凍攝取組，獲得添加葡聚醣的果凍攝取組的各種細胞介素產生的增加/減少、免疫細胞的數量及血液凝固性的以下結果。

[表1]

量測項目	相關物增加 ↑/ 減少 ↓	量測項目	相關物增加 ↑/ 減少 ↓
IL-1β	↑	IFN-α	↑
IL-6	↓	IFN-β	↑
IL-12	↓	IFN-ε	↑
IFN -γ	↑	IFN-ω	↑
TNF-α	↓	IFN-υ	↑
		IL-7	↑
量測項目	相關物增加 ↑/ 減少 ↓	量測項目	相關物增加 ↑/ 減少 ↓
NK細胞	↑	血纖維蛋白	↑
Th2細胞	↓	D-二聚體	↓
Th2細胞	↑	凝血酶	↓
CD8-T細胞	↓
CD4-T細胞	↑
B-細胞	↑

實例1 SD大鼠的F2S研究 方法： 將Nichi葡聚醣AFO-202投與6只SD雄性大鼠並與對照(投與注射用水)進行比較。15天後處死大鼠。淋巴球與CRP的比率：分析了淋巴球計數(數量/μL)/CRP(mg/dL)及嗜中性球與淋巴球的比率：每103/μL (NLR)中提取的嗜中性球及淋巴球的數量。

結果： 參見第1圖-第2圖。 AFO-202 β葡聚醣在投與15天後顯示LCR增加。 AFO-202 β葡聚醣在投與15天後顯示NLR下降。

論述： NLR水準升高及LCR水準降低反映了炎症過程的增強，表明癌症及感染的預後較差。 因此，導致LCR水準增加及NLR水準降低的AFO-202 β-葡聚醣在抗癌及抗微生物作用方面係有利的。

實例2 我們的小組已在健康志願者(40~60歲的男性)中啟動了一項試點研究，以評估食用AFO-202 β葡聚醣後的免疫增強及免疫調節之外的與血栓形成相關的生物標誌物，中期結果令人鼓舞。

健康男性志願者中的F4S研究 方法： 八名年齡在40至60歲之間的男性健康志願者(六名40多歲的志願者，一名50多歲的志願者，一名60多歲的志願者)參加了此臨床試驗。志願者被分成兩組。 組A：(n=4)：食用AFO-202 β葡聚醣21天 組B：(n=4)：食用AFO-202 β葡聚醣35天

結果： 參見第3圖-第6圖。 食用AFO-202 β-葡聚醣導致 - ΔIgA抗體增加 - ΔIgM抗體增加 - CD11b增加 - C-反應蛋白(C-reactive protein，CRP)減少

論述： IgA抗體在黏膜免疫防禦中起關鍵作用。IgA抗體在殺死癌細胞及入侵病原體方面具有優勢。AFO-202 β-葡聚醣增加IgA有助於增強病毒及微生物進入的黏膜及體表內壁的防禦。 IgM抗體係針對感染產生的第一組抗體。IgM抗體水準的增加係免疫防禦增強的指標。 整合素CD11b活化驅動先天免疫以減輕感染及腫瘤生長。因此，藉由AFO-202 β葡聚醣增加CD11b係有幫助的。 高水準的CRP係指示體內炎症的不良預後因素。因此，AFO-202 β葡聚醣降低CRP係有利的。

實例3 F8S(線粒體、IL6及SARS-CoV)研究 方法： -HeLa細胞(5x106個細胞/培養皿)用β-葡聚醣AFO-202 (BG-A)、NN-163 (BG-B)及NN-163 (BG-C)稀釋100倍至1 μg/mL的最終濃度並且在CO2恆溫箱中培育(刺激)24 h。24 h之後，將細胞收集並且用PBS洗滌三次，提取總RNA並且使用RNA作為模板來合成cDNA。 - 然後分別製備線粒體ATP酶、線粒體DNA (ND1)、線粒體DNA (ND5)、IL-6、ACE2受體(ACE2 receptor，ACE2R)、CD13及PDL-1的特異性引子。然後製備線粒體ATP酶、線粒體DNA (ND1)、線粒體DNA (ND5)、IL-6、ACE2受體(ACE2 receptor，ACE2R)、CD13及PDL-1的特異性引子。 -將引子及cDNA與藉由與PCR反應系統中的雙鏈DNA結合而發出螢光的試劑(嵌入劑：TB Green)，藉由偵測螢光強度即時監測產生的擴增產物的量。 - 使用ΔΔCt方法比較資料。β-肌動蛋白用作對照(對照mRNA基因)。

結果： 參見第8圖-第12圖。 AFO 202-β葡聚醣， - 增加線粒體ATP酶及線粒體DNA (ND1) - AFO 202減少IL-6 - 降低SARS-CoV2(新型冠狀病毒)ACE2受體的表現 - 降低HeLa細胞中冠狀病毒受體CD13的mRNA水準及PDL-1表現

論述： 線粒體被視為驅動免疫系統的能量中心。有氧糖酵解係活化免疫細胞的較佳代謝途徑。因此AFO 202葡聚醣可以增強線粒體功能從而增強免疫系統。 IL-6係響應於組織感染及損傷而迅速地產生的關鍵細胞介素。IL-6的失調連續合成在慢性炎症中發揮病理作用，並導致細胞介素風暴在COVID-19等感染中引起器官損傷。因此，AFO-202 β葡聚醣減少IL-6係有益的。 血管緊張素轉化酶2 (Angiotensin converting enzyme 2，ACE2)已被確定為SARS-CoV2結合併進入氣道上皮及腸上皮等人體上皮組織的受體。表現極少ACE2的細胞很少被SARS-CoV2感染。因此，AFO-202β-葡聚醣降低ACE2受體表現將具有預防COVID-19感染的潛力。 冠狀病毒受體CD13及PDL-1表現的減少將有助於預防冠狀病毒感染。

實例4 F17S(抗體)研究 方法： 根據製造商的說明，使用酶聯免疫吸附測定(ELISA套組詳細資料)測定抗CD69及抗念珠菌抗體的水準。

結果： 參見第13圖-第14圖。 AFO 202-β葡聚醣導致 - CD69抗體增加 - 抗念珠菌抗體增加

論述： 抗CD69抗體係一種潛在的藉由NK細胞作用的腫瘤治療劑。因此，AFO-202 β葡聚醣增加CD 69抗體將有助於提高抗癌免疫活性。 增加抗念珠菌抗體反應將有助於發揮抗真菌免疫力。

實例5 F20S (ATP合成)研究 方法： 金黃色葡萄球菌細菌細胞中的ATP水解率使用酚紅偵測ATP水解過程中的質子消耗來確定。

結果： 參見第15圖。 AFO-202 β葡聚醣導致細菌細胞的ATP合成增加。

論述： 細胞代謝在調節免疫反應方面很重要。因此，AFO-202 β葡聚醣增加ATP合成將有助於有效的免疫反應。

實例5 癌症患者-兩個案例研究

實例5-1 案例研究1：IV期腎癌-免疫細胞參數的改善 方法： 在IV期腎癌患者中-食用AFO-202 β-葡聚醣15天有助於增加免疫細胞參數

結果： 參見第8圖。 AFO-202 β葡聚醣有助於增加T細胞及B細胞計數。

論述： 增強T細胞及B細胞反應有助於提高抗腫瘤免疫力。因此，AFO-202 β-葡聚醣有助於抗腫瘤反應。

實例5-2

案例研究2：IV期Burkitt淋巴瘤-減輕化療副作用 在Burkitt淋巴瘤IV期患者中，持續食用AFO-202 β-葡聚醣(化療前及化療期間6克；化療週期之間3克)有助於減輕R-CHOP方案(利妥昔單抗、環磷醯胺、多柔比星、長春新鹼、潑尼松)化療6個週期的副作用。無一次嘔吐，患者對化療反應良好。

食用AFO-202 β-葡聚醣後的化療後-PET CT 與之前在其他地方完成的PET/CT相比，有： 1.網膜、腹膜及腸系膜沉積物的大小、數量及代謝活性的消退。 2.代謝活動的消退，腸系膜淋巴結大小的消退，雙側髂外及右側髂內淋巴結的消退。 3.回腸、空腸、腎上腺、肌內區域及骨髓中代謝亢進的沉積物消退。 4.吻合部位無異常。 5.在全身檢查中其他地方沒有明顯代謝活動性疾病。 整體影像學特徵提示對治療有部分反應。

論述： AFO-202 β-葡聚醣有助於消除轉移性沉積物的抗腫瘤反應，還有助於減輕化療的副作用，如噁心。

實例6 Covid-19患者-案例研究 納入標準： 1. 在實驗室藉由RT-PCR確認為SARS-CoV2陽性的18至65歲(包括年齡及性別)的成年受試者 2. 可以包括具有合併症的受試者。作為隊列進行分析 3. 被發現為Covid19陽性需要住院治療的受試者。(有症狀或無症狀) 4. 受試者及LAR願意給予參與知情同意，能夠領悟及理解治療期間的責任。 5. 參加本次試驗期間不願意參加任何其他臨床試驗的受試者。

排除標準： 1. 先前感染過SARS-CoV2(有症狀或無症狀)並康復的受試者。 2. 已知為HIV、HBV、HCV陽性的受試者。 3. 具有正常上限的3倍或研究者認為將影響研究目標的臨床異常腎或肝功能值的受試者。 4. 在篩選日期前3年內癌症完全緩解的受試者。 5. 在隨機化前4週接受過大手術的受試者。 6. 服用抗抑鬱藥、抗精神病藥的受試者。 7. 已知有臨床意義的內分泌、胃腸道、心血管、血液、肝臟、免疫、腎臟、呼吸或泌尿生殖系統異常或疾病史的受試者；除了彼等被視為所述適應症的病因。 8. 在研究期間懷孕或哺乳或計劃懷孕的女性。

研究設計： 開放標籤、前瞻性、隨機、比較、兩臂臨床研究調查產物：Nichi葡聚醣 比較物：無僅提供常規療法。適應症：由SARS-COV2 (β COV)引起的Covid19 受試者人群：在MoH-FW及州政府批准的實驗室中藉由RT-PCR確認為SARS-COV2陽性的年齡在18至65歲之間的成人受試者(包括男女老少) 受試者數：48個受試者 治療組：兩個 治療組I：Nichi葡聚醣+常規療法：24個受試者 治療組II：常規療法：24個受試者 治療時間：每個註冊受試者最多30天

評估 1. Covid19臨床症狀：第1天、第15天、第30天 2. RT PCR：第1天、第15天、第30天 3. 免疫學參數：第1天、第15天、第30天 4. 住院參數：第1天、第15天、第30天 5. 血液參數：第1天、第15天、第30天 6. 胸部掃描：第1天、第15天、第30天 7. 生活質量問卷：第15天、第30天

免疫學：CD4、CD8、CD56、CD13、IgA、IL6 住院：死亡率、ICU入住率、氧氣/生命支持 驗血：D-二聚體、CRP、ESR、FBG 胸部掃描：CT肺 生活質量問卷

關於Nichi葡聚醣AFO-202在COVID-19中的作用的參考文獻 1. Decrease D-Dimer values -Ref: D-dimer level is associated with the severity of COVID-19.Thromb Res.2020 Nov;195:219-225. 2. Decrease IL-6 levels -Ref: Prognostic value of interleukin-6, C-reactive protein, and procalcitonin in patients with COVID-19.J Clin Virol.2020 Jun;127:104370. 3. Mounting anti-viral defense by upregulating NK cells and macrophages.Ref: Natural Killer Cell Dysfunction and Its Role in COVID-19.Int J Mol Sci.2020 Sep 1;21(17):6351. doi: 10.3390/ijms21176351. 4. Increase virus-specific antibodies (IgG, IgM and sIgA) for neutralization of virus toxicity.Ref: Serum IgA, IgM, and IgG responses in COVID-19.Cell Mol Immunol.2020 Jul;17(7):773-775. doi: 10.1038/s41423-020-0474-z. 5. Helping in maintenance of blood glucose and lipid levels thereby preventing risk of severe COVID-19 due to comorbidities such as diabetes mellitus, dyslipidemia and obesity.Ref: Commentary: Beyond "TRIM" Benefits of β-Glucan by Blood Glucose and Lipid Balancing Potentials in Its Defense Against COVID-19.Front Immunol.2021 Mar 29;12:620658. doi: 10.3389/fimmu.2021.620658 共同參考文獻： Immunological actions of Sophy beta-glucan (beta-1,3-1,6 glucan), currently available commercially as a health food supplement.Microbiol Immunol.2007;51(9):861-73. doi: 10.1111/j.1348-0421.2007.tb03982.x.

Nichi葡聚醣AFO-202在COVID-19中的初步結果 1.住院：與COVID後住院時間的對照組文獻證據相比，住院時間平均縮短5天：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7467845/) 2. IL-6水準：IL6水準與對照相比降低了10%至12% COVID-19患者的IL6水準：1.85 pg/ml至21.55 pg/ml臨界值：37.65 pg/ml https://translational-medicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12967-020-02571-x 3. 抗病毒防禦(藉由上調淋巴球)：淋巴球計數增加了1.35倍 淋巴球水準降低導致COVID死亡率增加-https://ehoonline.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40164-021-00199-1 4. 病毒特異性抗體水準：(IgG、IgM及sIgA)：抗體水準增加5倍 COVID-19患者中的抗體水準 -https://www.nature.com/articles/s41423-020-0474-z

5. 血糖及血脂水準平衡：在AFO-202 Nichi葡聚醣組中，空腹血糖水準下降4%到21%；平均Hba1C保持在8.1或降至7.7 對照組空腹血糖水準較基線升高15%；脂質水準增加18%到27%。Hba1C水準增加直至8.5%。https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33051331/ 6.D-二聚體控制：D-二聚體水準降至低於0.5微FEG/ml的正常值，而在對照組中D-二聚體值仍高於正常範圍https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7384402/ 7. RT PCR變為陰性所用的時間：與對照相比，RT-PCR陰性所需的時間減少了2.4天 RT-PCR變為陰性所需的平均時間-10至14天 https://bmcmedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12916-020-01810-8

結論 COVID-19中多器官功能障礙的擬議機制係多因素的，並且具有微循環及大循環血栓形成的高凝狀態已被確定為決定臨床病程及疾病嚴重程度的關鍵因素。D-二聚體及凝血酶原已成為由於COVID-19而導致入院時需要分析的最重要的生物標誌物。白種人、非裔美國人、老年人及合併症患者等種族脆弱群體構成了高危人群，他們需要預防此高凝狀態的發展。目前尚無預防或治療藥理學策略的COVID-19預防策略，包括用於增強免疫力及降低凝血病風險的生物反應調節劑，可能對對抗該疾病非常有益，尤其係在此等脆弱人群中。

β-葡聚醣藉由誘導腸黏膜免疫、移動到遠處效應位點(例如脾及淋巴結)並藉由在骨髓中、經由TRIM產生「中樞」免疫記憶來利用網狀內皮系統的大部分成分，從而活化免疫系統的所有態樣[B4, 8-12]並導致針對各種病原體的持續、持久的免疫反應，進而引發特異性抗病毒免疫[B24]。最重要地，除了早先被用作疫苗佐劑之外，此免疫反應有所有年齡段都安全食用超過二十年的記錄[B24-27]。

因此，在沒有針對COVID-19的確定性治療方法，並且在確定具有廣譜活性且無副作用的理想疫苗方面存在重大障礙的情況下，口服的β葡聚醣(例如AFO-202 β葡聚醣)將作為針對COVID-19的廣譜免疫平衡食品補充劑腸道(β-WIFE)疫苗方法。

已經鑑定了可以使個體易患癌症及/或促進癌症進展的若干因素及致病過程：i.由感染、衰老或代謝病症(如糖尿病)引起的慢性及微炎症，ii.遺傳原因，以及iii.由於癌症或癌症治療所導致的免疫系統虛弱。因此，只有在遵循一致且簡單的方法(例如補充營養以對抗免疫系統受損及慢性微炎症)的情況下，預防普通人群中的癌症及其在接受手術或化學治療的人群中的擴散實際上係可行的。在此綜述中，我們展示了BRM葡聚醣作為藉由免疫增強來戰勝癌症的β-葡聚醣VACCIEN佐劑方法的潛在功能。B-VACCIEN方法可能有助於在特定免疫功能低下人群中應對癌症，因為它除了在動物模型中增加外周血細胞對癌症的細胞毒性及減輕化療副作用外，還包括在平衡代謝參數(如血糖及血脂水準)方面的各種生物反應改進。因此，我們建議將此B-VACCIEN方法作為一種用於在具有此類特定免疫功能低下病狀的人或具有癌症遺傳傾向的人中進行長期預防的潛在策略。

修改及其他實施例 所描述的葡聚醣產物、組合物及方法的各種修改及變化以及本發明的概念對於熟習此項技術者而言將係顯而易見的，而不脫離本發明的範圍及精神。儘管已經結合特定的較佳實施例描述了本發明，但是應當理解，所要求保護的本發明並不意欲限於此等特定的實施例。對化學、生物、醫學、環境、化妝品或食品領域或相關領域的技術人員而言顯而易見的用於實施本發明的所述模式的各種修改都意欲在所附請求項的範圍內。

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Antitumor effects of combined therapy with intraperitoneal CDDP and oral Sofy β-glucan. Abstract presented at the 63rd General Meeting of the Japanese Society of Gastroenterology, Japan (2008). C57. Okumura T. NK cell cytotoxicity in different age groups of healthy volunteers. Gendai kagaku (Chemistry today) (1984) 11: 40. C58. Mio M. Effect of oral intake of black yeast beta-glucan on NK activity in the elderly and patients with cancer. Abstract presented at 29th Annual Meeting of the Japanese Society of Venous and Enteral Nutrition Pacifico Yokohama, Japan (2014). C59. Konjevic G, Jurisic V, Jovic V, Vuletic A, Mirjacic Martinovic K, Radenkovic S, Spuzic I. Investigation of NK cell function and their modulation in different ma-lignancies. Immunol Res (2012) 52:139-56. C60. Papaioannou NE, Beniata OV, Vitsos P, Tsitsilonis O, Samara P. Harnessing the immune system to improve cancer therapy. Ann Transl Med (2016) 4:261.

無

[第1圖]第1圖示出展示15天之後淋巴球與CRP比率(Lymphocyte-to-CRP ratio，LCR)增加的圖表。 [第2圖]第2圖示出展示15天之後嗜中性球與淋巴球比率(Neutrophil-to-Lymphocyte ratio，NLR)減少的圖表。 [第3圖]第3圖示出展示食用AFO-202 β-葡聚醣之後ΔIgA增加的圖表。 [第4圖]第4圖示出展示ΔIgM增加的圖表。 [第5圖]第5圖示出展示食用AFO-202 β葡聚醣21天的個體中的CD11b增加的圖表(左)及展示食用AFO-202 β葡聚醣35天的個體中的CD11b增加的圖表(右)。 [第6圖]第6圖示出展示AFO-202 β-葡聚醣之後C-反應蛋白(C-reactive protein，CRP)減少的圖表。 [第7圖]第7圖提供表展示改良免疫細胞參數患者與IV期腎癌。 [第8圖]第8圖示出展示線粒體ATP酶增加的圖表。 [第9圖]第9圖示出展示線粒體DNA(ND1)增加的圖表。 [第10圖]第10圖示出展示IL-6減少的圖表。 [第11圖]第11圖示出展示SARS-CoV2(新型冠狀病毒)ACE2受體減少的圖表。 [第12圖]第12圖示出展示HeLa細胞中的冠狀病毒受體表現的圖表。 [第13圖]第13圖示出展示CD69抗體增加的圖表。 [第14圖]第14圖示出展示抗念珠菌抗體增加的圖表。 [第15圖]第15圖示出展示細胞中的ATP合成增加的圖表。 [第A圖]第A圖示出了區分上調免疫增強因子及下調促炎因子的圖形表示，兩者皆係AFO 202(FO-68) 1-3,1-6 β-葡聚醣，一種生物反應調節劑(biological response modifier，BRM)的有益作用 [第B圖]第B圖示出了口服與皮內注射疫苗之間不同的機制及途徑。β-葡聚醣與兩種疫苗中的成分相互作用。示意圖描述了(i)從腸道Peyers斑塊開始的口服疫苗誘導黏膜免疫以及從皮膚免疫細胞開始誘導全身免疫的腸胃外疫苗的機制，(ii)β葡聚醣在五個不同的階段和行動中發揮疫苗作用的戰略關鍵優勢及(iii)骨髓的中樞訓練免疫(trained immunity，TRIM)。 [第C1圖]第C1圖：單用順鉑化療與添加AFO-202 β-葡聚醣作為順鉑化療的支持劑時腫瘤縮小的歷史比較。順鉑化療使腫瘤體積減小12% (Ma等人Aging and disease.7.254-66.10.14336/AD.2016.0118.)在順鉑化療中加入AFO-202 β-葡聚醣後，腫瘤大小顯著減小(49%)(資料來自Mizobuchi S等人之摘要 Analysis of innate immune stimulating effect of Sofy β-glucan during chemotherapy The 108th Regular Academic Meeting of the Japanese Society of Surgery, 2008年3月15日; Japan)。 [第C2圖]第C2圖：折線圖代表不同年齡組健康志願者的NK細胞細胞毒性(Tada, Okumura: Gendai kagaku.Chemistry today; 11, 40(1984))。條形圖表示食用AFO-202 β葡聚醣之前(藍色條)及之後(橙色條)的NK細胞細胞毒性(資料來自Mio Miyamoto.之摘要29th Annual Meeting of the Japanese Society of Venous and Enteral Nutrition (February 27-28, 2014:Pacifico Yokohama), Japan)。然而，Okumura在研究中報道的NK細胞細胞毒性百分比顯著低於在分析食用AFO-202 β葡聚醣的健康志願者的研究中報道的值(資料來自Mio Miyamoto之摘要)，(p-value = 0.001251)。 [第C3圖]第C3圖：晚期癌症患者NK細胞毒性百分比顯著降低的歷史比較(藍色條)(Konjevic G等人 Immunol Res 52, 139-156 (2012)。 https://doi.org/10.1007/s12026-012-8285-7)以及老年癌症患者食用AFO-202衍生的β葡聚醣之前(灰色條)及之後(橙色條)NK細胞細胞毒性百分比的資料(資料來自Mio Miyamoto.之摘要。29th Annual Meeting of the Japanese Society of Venous and Enteral Nutrition (February 27-28, 2014: Pacifico Yokohama), Japan。 [第C4圖]第C4圖：四個部分或時間點，在此期間免疫系統中的缺陷被視為關鍵的。在此等時候，B-VACCINE方法可以從策略上提供如上所述的益處。

國內寄存資訊(請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無 國外寄存資訊 日本，獨立行政法人製品評價技術基盤機構 特許生物寄存中心(NITE-IPOD)，2021年4月21日轉移國際寄存，FERM BP-19327

Claims (10)

1. 一種用於誘導、增強及/或平衡免疫反應的組合物，其包含由出芽短梗黴AFO-202 (FERM BP-19327)產生的β-葡聚醣。
2. 如請求項1所述之組合物，其用於治療及/或預防病毒感染。
3. 如請求項1所述之組合物，其用於抑制凝血。
4. 如請求項1至3中任一項所述之組合物，其用於治療或預防SARS-CoV-2感染或由該SARS-CoV-2引起或加重的疾病。
5. 如請求項1或2所述之組合物，其用於治療及/或預防癌症。
6. 如請求項5所述之組合物，其中癌症為腎癌。
7. 如請求項1、2、5及6中任一項所述之組合物，其用於減輕化療副作用。
8. 一種疫苗佐劑，其包含由出芽短梗黴AFO-202 (FERM BP-19327)產生的β-葡聚醣。
9. 如請求項8所述之疫苗佐劑，其用於預防及/或治療SARS-CoV-2感染或由該SARS-CoV-2引起或加重的疾病。
10. 如請求項9所述之疫苗佐劑，其用於預防及/或治療癌症或特定免疫功能低下人群中的癌症。

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