TW202144000A - 一種治療帕金森氏症的方法和藥物 - Google Patents

Abstract

本發明涉及一種預防和治療帕金森氏症的方法，包括給藥受試者治療有效量的纖維蛋白溶酶原激活途徑組分。本發明還涉及用於治療上述病症的包含纖維蛋白溶酶原激活途徑組分的藥物、藥物組合物、製品、試劑盒。

Description

一種治療帕金森氏症的方法和藥物

本發明涉及一種治療帕金森氏症的方法，包括給藥受試者有效量的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物，例如纖溶酶原，以改善臨床症狀和體徵。

帕金森氏症（Parkinson’s disease，PD）是一種常見的神經系統變性疾病，老年人多見，平均發病年齡爲60歲左右，40歲以下起病的青年帕金森氏症較少見。大部分帕金森氏症患者爲散發病例，僅有不到10%的患者有家族史。帕金森氏症最主要的病理改變是中腦黑質多巴胺（dopamine, DA）能神經元的變性死亡，由此而引起紋狀體DA含量顯著性減少而致病。導致這一病理改變的確切病因目前仍不清楚，遺傳因素、環境因素、年齡老化、氧化應激等均可能參與PD多巴胺能神經元的變性死亡過程。

帕金森氏症突出的病理改變是中腦黑質多巴胺（dopamine, DA）能神經元的變性死亡、紋狀體DA含量顯著性減少以及黑質殘存神經元胞質內出現嗜酸性包涵體，即路易小體（Lewy body）。除多巴胺能系統外，帕金森氏症患者的非多巴胺能系統亦有明顯的受損。如Meynert基底核的膽鹼能神經元，藍斑的去甲腎上腺素能神經元，腦幹中縫核的5-羥色胺能神經元，以及大腦皮質、腦幹、脊髓、以及外周自主神經系統的神經元。紋狀體多巴胺含量顯著下降與帕金森氏症運動症狀的出現密切相關。中腦-邊緣系統和中腦-皮質系統多巴胺濃度的顯著降低與帕金森氏症患者出現智能減退、情感障礙等密切相關。

帕金森氏症起病隱襲，進展緩慢。首發症狀通常是一側肢體的震顫或活動笨拙，進而累及對側肢體。臨床上主要表現爲靜止性震顫、運動遲緩、肌强直和姿勢步態障礙。近年來人們越來越多的注意到抑鬱、便秘和睡眠障礙等非運動症狀亦是帕金森氏症患者常見的主訴，它們對患者生活質量的影響甚至超過運動症狀。

藥物治療是帕金森氏症最主要的治療手段，能在一定程度上改善症狀，但不能阻止病情的進展，需要尋找其他的治療方法和藥物。

本發明研究發現纖溶酶原能夠促進帕金森氏症受試者記憶功能恢復、改善認知能力、促進黑質DTA表達、促進紋狀體尼氏體恢復、促進黑質GLP-1R表達、增加黑質TH陽性細胞數量、促進紋狀體髓鞘修復、促進腦組織中α-突觸核蛋白降解、促使紋狀體NF表達、促進軸索損傷修復、減少紋狀體GFAP表達、減輕紋狀體神經元損傷、促進腦組織中Pro-BDNF裂解形成BDNF、改善抑鬱或焦慮症狀，從而具有開發成爲治療帕金森氏症藥物的潜力。

具體地，本發明涉及如下各項：

一方面，本申請涉及一種預防和治療帕金森氏症的方法，包括給藥帕金森氏症受試者治療有效量的選自如下的一種或多種化合物：纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分、能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物、模擬纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶之活性的化合物、能夠上調纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶原激活劑表達的化合物、纖維蛋白溶酶原類似物、纖維蛋白溶酶類似物、tPA或uPA類似物和纖溶抑制劑的拮抗劑。

一方面，本申請涉及選自如下的一種或多種化合物在製備治療帕金森氏症的藥物中的用途，所述一種或多種化合物選自：纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分、能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物、模擬纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶之活性的化合物、能夠上調纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶原激活劑表達的化合物、纖維蛋白溶酶原類似物、纖維蛋白溶酶類似物、tPA或uPA類似物和纖溶抑制劑的拮抗劑。

一方面，本申請涉及用於治療帕金森氏症的包含選自如下的一種或多種化合物的藥物或藥物組合物，所述一種或多種化合物選自：纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分、能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物、模擬纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶之活性的化合物、能夠上調纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶原激活劑表達的化合物、纖維蛋白溶酶原類似物、纖維蛋白溶酶類似物、tPA或uPA類似物和纖溶抑制劑的拮抗劑。

2. 項1所述的方法、用途、藥物或藥物組合物，其中所述纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分選自纖維蛋白溶酶原、重組人纖維蛋白溶酶、Lys-纖維蛋白溶酶原、Glu-纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、含有纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶的一個或多個kringle結構域和蛋白酶結構域的纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶變體及類似物、小纖維蛋白溶酶原(mini-plasminogen)、小纖維蛋白溶酶(mini-plasmin)、微纖溶酶原（micro-plasminogen）、微纖溶酶（micro-plasmin）、delta-纖溶酶原、delta-纖溶酶（delta-plasmin）、纖維蛋白溶酶原激活劑、tPA和uPA。

3. 項1的方法、用途、藥物或藥物組合物，所述纖溶抑制劑的拮抗劑爲PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的抑制劑，例如抗體。

4．項1-3任一項的方法、用途、藥物或藥物組合物，其中所述化合物對帕金森氏症受試者具有如下一項或多項作用：促進記憶功能恢復、改善認知能力、促進黑質DTA表達、促進紋狀體尼氏體恢復、促進黑質GLP-1R表達、增加黑質TH陽性細胞數量、促進紋狀體髓鞘修復、促進腦組織中α-突觸核蛋白降解、促使紋狀體NF表達、促進軸索損傷修復、減少紋狀體GFAP表達、減輕紋狀體神經元損傷、促進腦組織中Pro-BDNF裂解形成BDNF、緩解抑鬱或焦慮症狀。

5. 項1-4任一項的方法、用途、藥物或藥物組合物，其中所述化合物爲纖溶酶原。

6. 項1-5任一項的方法、用途、藥物或藥物組合物，其中所述纖溶酶原爲人全長纖溶酶原或其保守取代變體。

7. 項1-5任一項的方法、用途、藥物或藥物組合物，其中所述纖溶酶原與序列2具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原的賴氨酸結合活性或蛋白水解活性。

8. 項1-5任一項的方法、用途、藥物或藥物組合物，所述纖溶酶原包含與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列、並且仍然具有纖溶酶原的蛋白水解活性的蛋白質。

9.項1-5任一項的方法、用途、藥物或藥物組合物，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原的蛋白水解活性的變體。

10. 項1-5任一項的方法、用途、藥物或藥物組合物，所述纖溶酶原包含序列2、6、8、10、12所示的氨基酸序列或包含序列2、6、8、10、12所示氨基酸序列的保守取代變體。

11. 項1-10任一項的方法、用途、藥物或藥物組合物，其中所述化合物與一種或多種其他治療方法或藥物聯合使用。

12. 項11的方法、用途、藥物或藥物組合物，其中所述其他治療方法包括細胞治療（包括幹細胞治療）和物理治療。

13. 項11的方法、用途、藥物或藥物組合物，其中所述其他藥物爲治療帕金森氏症的其它藥物。

14. 項1-13任一項的方法、用途、藥物或藥物組合物，其中所述化合物通過鼻腔吸入、霧化吸入、滴鼻液、滴眼液、滴耳液、靜脈內、腹膜內、皮下、顱內、鞘內、動脈內(例如經由頸動脈)或肌肉內給藥。在本發明的上述任一實施方案中，所述纖溶酶原可與序列2、6、8、10或12具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原活性，例如賴氨酸結合活性或蛋白水解活性。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸，並且仍然具有纖溶酶原活性，例如賴氨酸結合活性或蛋白水解活性的蛋白質。

在一些實施方案中，所述纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖溶酶原活性，例如賴氨酸結合活性或蛋白水解活性的蛋白質。在一些實施方案中，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原活性，例如蛋白水解活性的變體。在一些實施方案中，所述纖溶酶原爲天然或合成的人纖溶酶原、或其仍然保留纖溶酶原活性，例如賴氨酸結合活性或蛋白水解活性的變體或片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原爲來自靈長類動物或嚙齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性，例如賴氨酸結合活性或蛋白水解活性的變體或片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原的氨基酸如序列2、6、8、10或12所示。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是人天然纖溶酶原。

在一些實施方案中，所述受試者是人。在一些實施方案中，所述受試者缺乏或缺失纖溶酶原。在一些實施方案中，所述缺乏或缺失是先天的、繼發的和/或局部的。

在一些實施方案中，所述藥物組合物包含藥學上可接受的載劑和用於前述方法的纖溶酶原。在一些實施方案中，所述試劑盒可以是預防性或治療性試劑盒，其包含：(i)用於前述方法的纖溶酶原和(ii)用於遞送所述纖溶酶原至所述受試者的構件(means)。在一些實施方案中，所述構件爲注射器或小瓶。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含標籤或使用說明書，該標籤或使用說明書指示將所述纖溶酶原投予所述受試者以實施前述任一方法。

在一些實施方案中，所述製品包含：含有標籤的容器；和包含(i)用於前述方法的纖溶酶原或包含纖溶酶原的藥物組合物，其中所述標籤指示將所述纖溶酶原或組合物投予所述受試者以實施前述任一方法。

在一些實施方案中，所述試劑盒或製品還包含另外的一個或多個構件或容器，該構件或容器中含有其他藥物。

在前述方法的一些實施方案中，所述纖溶酶原通過全身或局部給藥，較佳通過以下途徑施用：靜脈內、肌內、皮下給予纖溶酶原來進行治療。在前述方法的一些實施方案中，所述纖溶酶原與適當的多肽載體或穩定劑組合施用。在前述方法的一些實施方案中，所述纖溶酶原以每天0.0001-2000 mg/kg、0.001-800 mg/kg、0.01-600 mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg（以每公斤體重計算）或0.0001-2000mg/cm2、0.001-800 mg/cm2、0.01-600 mg/cm2、0.1-400 mg/cm2、1-200 mg/cm2、1-100 mg/cm2、 10-100 mg/cm2（以每平方公分體表面積計算）的劑量施用，較佳至少重複一次，較佳至少每天施用。

本發明明確涵蓋了屬於本發明實施方案之間的技術特徵的所有組合，並且這些組合後的技術方案在本申請中已經明確公開，就像上述技術方案  已經單獨且明確公開一樣。另外，本發明還明確涵蓋各個實施方案及其要素的之間的組合，該組合後的技術方案在本文中明確公開。

纖維蛋白溶解系統（Fibrinolytic system）亦稱纖溶系統，爲參與纖維蛋白溶解（纖溶）過程的一系列化學物質組成的系統，主要包括纖維蛋白溶解酶原（纖溶酶原）、纖溶酶、纖溶酶原激活物、纖溶抑制劑。纖溶酶原激活物包括組織型纖溶酶原激活物（t-PA）和尿激酶型纖溶酶原激活物（u-PA）。t-PA是一種絲氨酸蛋白酶，由血管內皮細胞合成。t-PA激活纖溶酶原，此過程主要在纖維蛋白上進行；尿激酶型纖溶酶原激活物（u-PA）由腎小管上皮細胞和血管內皮細胞産生，可以直接激活纖溶酶原而不需要纖維蛋白作爲輔因子。纖溶酶原（PLG）由肝臟合成，當血液凝固時，PLG大量吸附在纖維蛋白網上，在t-PA或u-PA的作用下，被激活爲纖溶酶，促使纖維蛋白溶解。纖溶酶（PL）是一種絲氨酸蛋白酶，作用如下：降解纖維蛋白和纖維蛋白原；水解多種凝血因子Ⅴ、Ⅷ、Ⅹ、Ⅶ、Ⅺ、Ⅱ等；使纖溶酶原轉變爲纖溶酶；水解補體等。纖溶抑制物：包括纖溶酶原激活物抑制劑（PAI）和α2抗纖溶酶（α2-AP）。PAI主要有PAI-1和PAI-2兩種形式，能特異性與t-PA以1：1比例結合，從而使其失活，同時激活PLG。α2-AP由肝臟合成，與PL以1：1比例結合形成複合物，抑制PL活性；FⅩⅢ使α2-AP以共價鍵與纖維蛋白結合，減弱了纖維蛋白對PL作用的敏感性。體內抑制纖溶系統活性的物質：PAI-1，補體C1抑制物；α2抗纖溶酶；α2巨球蛋白。

本發明的術語“纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分”涵蓋：

1. 纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、Glu-纖維蛋白溶酶原、微纖溶酶原（micro-plasminogen）、delta-纖溶酶原；它們的變體或類似物；

2. 纖維蛋白溶酶以及它們的變體或類似物；和

3. 纖維蛋白溶酶原激活劑，例如tPA和uPA以及包含一個或多個tPA或uPA的結構域(如一個或多個kringle結構域和蛋白水解結構域)的tPA或uPA變體和類似物。

上述纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“變體”包括所有天然存在的人類遺傳變體以及這些蛋白質的其他哺乳動物形式，以及通過添加、删除和/或取代例如1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸、仍然具有纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA活性的蛋白質。例如，纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“變體”包括通過例如1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個保守性氨基酸取代獲得的這些蛋白質的突變變體。

本發明的“纖溶酶原變體”涵蓋與序列2、6、8、10或12具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原活性，例如賴氨酸結合活性或蛋白水解活性的蛋白質。例如本發明的“纖溶酶原變體”可以是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸，並且仍然具有纖溶酶原活性，例如賴氨酸結合活性或蛋白水解活性的蛋白質。具體地，本發明纖溶酶原變體包括所有天然存在的人類遺傳變體以及這些蛋白質的其他哺乳動物形式，以及通過保守性氨基酸取代例如1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個氨基酸獲得的這些蛋白質的突變變體。

本發明的纖溶酶原可以爲來自靈長類動物或嚙齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性，例如賴氨酸結合活性或蛋白水解活性的變體，例如序列2、6、8、10或12所示的纖溶酶原，例如序列2所示的人天然纖溶酶原。

上述纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“類似物”包括分別提供與纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA基本相似的作用的化合物。

上述纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“變體”和“類似物”涵蓋包含一個或多個結構域(例如一個或多個kringle結構域和蛋白水解結構域)的纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA和uPA的“變體”和“類似物”。例如，纖維蛋白溶酶原的“變體”和“類似物”涵蓋包含一個或多個纖溶酶原結構域(例如一個或多個kringle結構域和蛋白水解結構域)的纖維蛋白溶酶原變體和類似物，例如小纖維蛋白溶酶原(mini-plasminogen)。纖維蛋白溶酶的“變體”和“類似物”涵蓋包含一個或多個纖維蛋白溶酶結構域(例如一個或多個kringle結構域和蛋白水解結構域)的纖維蛋白溶酶 “變體”和“類似物”，例如小纖維蛋白溶酶(mini-plasmin)和δ-纖維蛋白溶酶(delta-plasmin)。

上述纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA的“變體”或“類似物”是否分別具有纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA的活性，或者是否分別提供與纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、tPA或uPA基本相似的作用可以通過本領域習知方法進行檢測，例如，通過基於酶譜法(enzymography)、ELISA(酶聯免疫吸附測定)和FACS(熒光激活細胞分選方法)通過激活的纖維蛋白溶酶活性水平來衡量，例如可以參照選自如下文獻中記載的方法測量：Ny，A.，Leonardsson，G.，Hagglund，A.C，Hagglof，P.，Ploplis，V.A.，Carmeliet，P. and Ny，T. (1999). Ovulation inplasminogen-deficient mice. Endocrinology 140，5030-5035；Silverstein RL, Leung LL, Harpel PC, Nachman RL (November 1984). "Complex formation of platelet thrombospondin with plasminogen. Modulation of activation by tissue activator". J. Clin. Invest. 74 (5): 1625–33；Gravanis I, Tsirka SE (February 2008). "Tissue-type plasminogen activator as a therapeutic target in stroke". Expert Opinion on Therapeutic Targets. 12 (2): 159–70；Geiger M, Huber K, Wojta J, Stingl L, Espana F, Griffin JH, Binder BR (Aug 1989). "Complex formation between urokinase and plasma protein C inhibitor in vitro and in vivo". Blood. 74 (2): 722–8.

在本發明的一些實施方案中，本發明的“纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分”爲纖溶酶原。在一些實施方案中，所述纖溶酶原爲人全長纖溶酶原或其保留纖溶酶原活性（例如其賴氨酸結合活性和蛋白水解活性）的保守取代變體。在一些實施方案中，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原活性（例如其賴氨酸結合活性或蛋白水解活性）的變體。在一些實施方案中，所述纖溶酶原爲天然或合成的人纖溶酶原、或其仍然保留纖溶酶原活性（例如其賴氨酸結合活性或蛋白水解活性）的保守取代變體或其片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原爲來自靈長類動物或嚙齒類動物的人纖溶酶原直向同系物或其仍然保留纖溶酶原活性的保守取代變體或其片段。在一些實施方案中，所述纖溶酶原包含如序列2、6、8、10或12所示氨基酸序列。在一些實施方案中，所述纖溶酶原包含序列2、6、8、10或12所示的氨基酸序列的保守取代序列。在一些實施方案中，所述纖溶酶原的氨基酸如序列2、6、8、10或12所示。在一些實施方案中，所述纖溶酶原爲序列2、6、8、10或12所示的纖溶酶原的保守取代變體。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是人天然纖溶酶原或其保守突變體。在一些實施方案中，所述纖溶酶原是如序列2所示的人天然纖溶酶原或其保守取代變體。

“能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物”指能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的任何化合物，例如tPA、uPA、鏈激酶、沙蘆普酶、阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶、阿尼普酶、孟替普酶、拉諾替普酶、帕米普酶、葡激酶。

本發明“纖溶抑制劑的拮抗劑”爲拮抗、減弱、封閉、阻止纖溶抑制劑作用的化合物。所述纖溶抑制劑例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶和α2巨球蛋白。所述拮抗劑例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的抗體，或阻斷或下調例如PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白表達的反義RNA或小RNA，或占據PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的結合位點但無PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白功能的化合物”，或 封閉PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的結合結構域和/或活性結構域的化合物。

纖溶酶是纖溶酶原激活系統（PA系統）的關鍵組分。它是一種廣譜的蛋白酶，能夠水解細胞外基質（ECM）的幾個組分，包括纖維蛋白、明膠、纖連蛋白、層粘連蛋白和蛋白聚糖。此外，纖溶酶能將一些金屬蛋白酶前體(pro-MMPs)激活形成具有活性的金屬蛋白酶（MMPs）。因此纖溶酶被認爲是胞外蛋白水解作用的一個重要的上游調節物。纖溶酶是由纖溶酶原通過兩種生理性的PAs：組織型纖溶酶原激活劑（tPA ）或尿激酶型纖溶酶原激活劑（uPA）蛋白水解形成的。由於纖溶酶原在血漿和其他體液中相對水平較高，傳統上認爲PA系統的調節主要通過PAs的合成和活性水平實現。PA系統組分的合成受不同因素嚴格調節，如激素、生長因子和細胞因子。此外，還存在纖溶酶和PAs的特定生理抑制劑。纖溶酶的主要抑制劑是α2-抗纖溶酶（α2-antiplasmin）。PAs的活性同時被uPA 和tPA 的纖溶酶原激活劑抑制劑-1（PAI-1）抑制以及主要抑制uPA的溶酶原激活劑抑制劑-2（PAI-2）調節。某些細胞表面具有直接水解活性的uPA特異性細胞表面受體(uPAR)。

纖溶酶原是一個單鏈糖蛋白，由791個氨基酸組成，分子量約爲92 kDa。纖溶酶原主要在肝臟合成，大量存在於胞外液中。血漿中纖溶酶原含量約爲2 μM。因此纖溶酶原是組織和體液中蛋白質水解活性的一個巨大的潜在來源。纖溶酶原存在兩種分子形式：谷氨酸-纖溶酶原（Glu-plasminogen）和賴氨酸-纖溶酶原(Lys-plasminogen)。天然分泌和未裂解形式的纖溶酶原具有一個氨基末端（N-末端）谷氨酸，因此被稱爲谷氨酸-纖溶酶原。然而，在纖溶酶存在時，谷氨酸-纖溶酶原在Lys76-Lys77處水解成爲賴氨酸-纖溶酶原。與谷氨酸-纖溶酶原相比，賴氨酸-纖溶酶原與纖維蛋白具有更高的親和力，並可以更高的速率被PAs激活。這兩種形式的纖溶酶原的Arg560-Val561肽鍵可被uPA或tPA切割，導致二硫鍵連接的雙鏈蛋白酶纖溶酶的形成。纖溶酶原的氨基末端部分包含五個同源三環，即所謂的kringles，羧基末端部分包含蛋白酶結構域。一些kringles含有介導纖溶酶原與纖維蛋白及其抑制劑α2-AP特異性相互作用的賴氨酸結合位點。最新發現一個纖溶酶原爲38 kDa的片段，其中包括kringles1-4，是血管生成的有效抑制劑。這個片段被命名爲血管抑素，可通過幾個蛋白酶水解纖溶酶原産生。

纖溶酶的主要底物是纖維蛋白，纖維蛋白的溶解是預防病理性血栓形成的關鍵。纖溶酶還具有對ECM幾個組分的底物特異性，包括層粘連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖和明膠，表明纖溶酶在ECM重建中亦起著重要作用。間接地，纖溶酶還可以通過轉化某些蛋白酶前體爲活性蛋白酶來降解ECM的其他組分，包括MMP-1，MMP-2，MMP-3和MMP-9。因此，有人提出，纖溶酶可能是細胞外蛋白水解的一個重要的上游調節器。此外，纖溶酶具有激活某些潜在形式的生長因子的能力。在體外，纖溶酶還能水解補體系統的組分並釋放趨化補體片段。

“纖溶酶”是存在於血液中的一種非常重要的酶，能將纖維蛋白凝塊水解爲纖維蛋白降解産物和D-二聚體。

“纖溶酶原”是纖溶酶的酶原形式，根據swiss prot中的序列，按含有信號肽的天然人源纖溶酶原氨基酸序列（序列4）計算由810個氨基酸組成，分子量約爲90kD，主要在肝臟中合成並能夠在血液中循環的糖蛋白，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列3所示。全長的纖溶酶原包含七個結構域：位於C末端的絲氨酸蛋白酶結構域、N末端的Pan Apple(PAp)結構域以及5個Kringle結構域(Kringle1-5)。參照swiss prot中的序列，其信號肽包括殘基Met1-Gly19，PAp包括殘基Glu20-Val98，Kringle1包括殘基Cys103-Cys181，Kringle2包括殘基Glu184-Cys262，Kringle3包括殘基Cys275-Cys352，Kringle4包括殘基Cys377-Cys454，Kringle5包括殘基Cys481-Cys560。根據NCBI數據，絲氨酸蛋白酶域包括殘基Val581-Arg804。

Glu-纖溶酶原是人天然全長的纖溶酶原，由791個氨基酸組成（不含有19個氨基酸的信號肽），編碼該序列的cDNA序列如序列1所示，其氨基酸序列如序列2所示。 在體內，還存在一種是從Glu-纖溶酶原的第76-77位氨基酸處水解從而形成的Lys-纖溶酶原，如序列6所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列5所示。Delta-纖溶酶原 (δ-plasminogen)是全長纖溶酶原缺失了Kringle2-Kringle5結構的片段，僅含有Kringle1和絲氨酸蛋白酶域（亦稱蛋白酶結構域（protease domain，PD）），有文獻報導了delta-纖溶酶原的氨基酸序列（序列8），編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列7所示。小纖溶酶原（Mini-plasminogen）由Kringle5和絲氨酸蛋白酶域組成，有文獻報導其包括殘基Val443-Asn791（以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基爲起始氨基酸），其氨基酸序列如序列10所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列9所示。而微纖溶酶原（Micro-plasminogen）僅含有絲氨酸蛋白酶結構域，有文獻報導其氨基酸序列包括殘基Ala543-Asn791（以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基爲起始氨基酸），亦有專利文獻CN102154253A報導其序列包括殘基Lys531-Asn791（以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基爲起始氨基酸），在本專利申請中微纖溶酶原序列參考專利文獻CN102154253A，其氨基酸序列如序列12所示，編碼該氨基酸序列的cDNA序列如序列11所示。

全長纖溶酶原的結構亦描述在Aisina等(Aisina R B , Mukhametova L I . Structure and function of plasminogen/plasmin system[J]. Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2014, 40(6):590-605)的文章中。在該文章中，Aisina等描述纖溶酶原包括Kringle1、2、3、4、5結構域和絲氨酸蛋白酶結構域（亦稱蛋白酶結構域（protease domain，PD）），其中，Kringles負責纖溶酶原與低分子量和高分子量的配體結合（即賴氨酸結合活性），導致纖溶酶原轉變成一個更加開放的構型，從而更容易被活化；蛋白酶結構域（PD）爲殘基Val562-Asn791，tPA和UPA特異性切割纖溶酶原的Arg561-Val562位活化鍵，從而使纖溶酶原形成纖溶酶，因此，蛋白酶結構域（PD）是賦予纖溶酶原蛋白水解活性的區域。本發明的“纖溶酶”與“纖維蛋白溶酶”、“纖維蛋白溶解酶”可互換使用，含義相同；“纖溶酶原”與“纖維蛋白溶酶原”、“纖維蛋白溶解酶原”可互換使用，含義相同。

在本申請中，所述纖溶酶原“缺乏”的含義或活性爲受試者體內纖溶酶原的含量比正常人低，低至足以影響所述受試者的正常生理功能；所述纖溶酶原“缺失”的含義或活性爲受試者體內纖溶酶原的含量顯著低於正常人，甚至活性或表達極微，只有通過外源提供才能維持正常生理功能。

所屬技術領域中具有通常知識者可以理解，本發明纖溶酶原的所有技術方案適用於纖溶酶，因此，本發明描述的技術方案涵蓋了纖溶酶原和纖溶酶。在循環過程中，纖溶酶原採用封閉的非活性構象，但當結合至血栓或細胞表面時，在纖溶酶原激活劑(plasminogen activator，PA)的介導下，其轉變爲呈開放性構象的活性纖溶酶。具有活性的纖溶酶可進一步將纖維蛋白凝塊水解爲纖維蛋白降解産物和D-二聚體，進而溶解血栓。其中纖溶酶原的PAp結構域包含維持纖溶酶原處於非活性封閉構象的重要决定簇，而KR結構域則能夠與存在於受體和底物上的賴氨酸殘基結合。習知多種能夠作爲纖溶酶原激活劑的酶，包括：組織纖溶酶原激活劑(tPA)、尿激酶纖溶酶原激活劑(uPA)、激肽釋放酶和凝血因子XII(哈格曼因子)等。

“纖溶酶原活性片段” 是指具有與底物靶序列中賴氨酸結合的活性（賴氨酸結合活性）、或發揮蛋白水解功能的活性（蛋白水解活性）、或蛋白水解活性和賴氨酸結合活性的片段。本發明涉及纖溶酶原的技術方案涵蓋了用纖溶酶原活性片段代替纖溶酶原的技術方案。在一些實施方案中，本發明所述的纖溶酶原活性片段包含纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶結構域或由纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶結構域組成。在一些實施方案中，本發明所述的纖溶酶原活性片段包含序列14、或包含與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列，或由序列14組成、或由與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列組成。在一些實施方案中，本發明所述的纖溶酶原活性片段包含選自Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4、Kringle 5中一個或多個的區域或其保守取代變體，或由選自Kringle 1、Kringle 2、Kringle 3、Kringle 4、Kringle 5中一個或多個的區域或其保守取代變體組成。在一些實施方案中，本發明所述的纖溶酶原包括含有上述纖溶酶原活性片段的蛋白質。目前，對於血液中纖溶酶原及其活性測定方法包括：對組織纖溶酶原激活劑活性的檢測(t-PAA)、血漿組織纖溶酶原激活劑抗原的檢測(t-PAAg)、對血漿組織纖溶酶原活性的檢測(plgA)、血漿組織纖溶酶原抗原的檢測(plgAg) 、血漿組織纖溶酶原激活劑抑制物活性的檢測、血漿組織纖溶酶原激活劑抑制物抗原的檢測、血漿纖維蛋白溶酶-抗纖維蛋白溶酶複合物檢測(PAP)。其中最常用的檢測方法爲發色底物法：向受檢血漿中加鏈激酶(SK)和發色底物，受檢血漿中的PLG在SK的作用下，轉變成PLM，後者作用於發色底物，隨後用分光光度計測定，吸光度增加與纖溶酶原活性成正比。此外亦可採用免疫化學法、凝膠電泳、免疫比濁法、放射免疫擴散法等對血液中的纖溶酶原活性進行測定。

“直系同源物或直系同系物（ortholog）”指不同物種之間的同源物，既包括蛋白同源物亦包括DNA同源物，亦稱爲直向同源物、垂直同源物。其具體指不同物種中由同一祖先基因進化而來的蛋白或基因。本發明的纖溶酶原包括人的天然纖溶酶原，還包括來源於不同物種的、具有纖溶酶原活性的纖溶酶原直系同源物或直系同系物。

“保守取代變體”是指其中一個給定的氨基酸殘基改變但不改變蛋白質或酶的整體構象和功能，這包括但不限於以相似特性（如酸​​性，鹼性，疏水性，等）的氨基酸取代親本蛋白質中氨基酸序列中的氨基酸。具有類似性質的氨基酸是衆所周知的。例如，精氨酸、組氨酸和賴氨酸是親水性的鹼性氨基酸並可以互換。同樣，異亮氨酸是疏水氨基酸，則可被亮氨酸，蛋氨酸或纈氨酸替換。因此，相似功能的兩個蛋白或氨基酸序列的相似性可能會不同。例如，基於MEGALIGN算法的70％至99％的相似度（同一性）。“保守取代變體”還包括通過BLAST或FASTA算法確定具有60％以上的氨基酸同一性的多肽或酶，若能達 75％以上更好，最好能達85％以上，甚至達90％以上爲最佳，並且與天然或親本蛋白質或酶相比具有相同或基本相似的性質或功能。

“分離的”纖溶酶原是指從其天然環境分離和/或回收的纖溶酶原蛋白。在一些實施方案中，所述纖溶酶原會純化(1)至大於90%、大於95%、或大於98%的純度(按重量計)，如通過Lowry法所確定的，例如超過99% (按重量計)，(2)至足以通過使用旋轉杯序列分析儀獲得N端或內部氨基酸序列的至少15個殘基的程度，或(3)至同質性，該同質性是通過使用考馬斯藍或銀染在還原性或非還原性條件下的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定的。分離的纖溶酶原亦包括通過生物工程技術從重組細胞製備，並通過至少一個純化步驟分離的纖溶酶原。

術語“多肽”、“肽”和“蛋白質”在本文中可互換使用，指任何長度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遺傳編碼的和非遺傳編碼的氨基酸，化學或生物化學修飾的或衍生化的氨基酸，和具有經修飾的肽主鏈的多肽。該術語包括融合蛋白，包括但不限於具有異源氨基酸序列的融合蛋白，具有異源和同源前導序列(具有或沒有N端甲硫氨酸殘基)的融合物；等等。

關於參照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分數（%）”定義爲在必要時引入缺口以實現最大百分比序列同一性後，且不將任何保守替代視爲序列同一性的一部分時，候選序列中與參照多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分率。爲測定百分比氨基酸序列同一性目的的對比可以以本領域技術範圍內的多種方式實現，例如使用公衆可得到的計算機軟件，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign（DNASTAR）軟件。所屬技術領域中具有通常知識者能决定用於比對序列的適宜參數，包括對所比較序列全長實現最大對比需要的任何算法。然而，爲了本發明的目的，氨基酸序列同一性百分數值是使用序列比較計算機程序ALIGN-2産生的。

在採用ALIGN-2來比較氨基酸序列的情况中，給定氨基酸序列A相對於給定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性（或者可表述爲具有或包含相對於、與、或針對給定氨基酸序列B的某一%氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A）如下計算：

分數X/Y 乘 100

其中X是由序列比對程序ALIGN-2在該程序的A和B比對中評分爲相同匹配的氨基酸殘基的數目，且其中Y是B中的氨基酸殘基的總數。應當領會，在氨基酸序列A的長度與氨基酸序列B的長度不相等的情况下，A相對於B的%氨基酸序列同一性會不等於B相對於A的%氨基酸序列同一性。除非另有明確說明，本文中使用的所有%氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2計算機程序獲得的。

如本文中使用的，術語“治療”指獲得期望的藥理和/或生理效果。所述效果可以是完全或部分預防疾病或其症狀的發生、發作，部分或完全減輕疾病和/或其症狀，和/或部分或完全治愈疾病和/或其症狀，包括：(a)預防疾病在受試者體內發生或發作，所述受試者可以具有疾病的素因，但是尚未診斷爲具有疾病；(b)抑制疾病，即阻滯其形成；和(c)減輕疾病和/或其症狀，即引起疾病和/或其症狀消退或消失。

術語“個體”、“受試者”和“患者”在本文中可互換使用，指哺乳動物，包括但不限於鼠(大鼠、小鼠)、非人靈長類、人、犬、猫、有蹄動物(例如馬、牛、綿羊、猪、山羊)等。

“治療有效量”或“有效量”指在對哺乳動物或其它受試者施用以治療疾病時足以實現對疾病的所述預防和/或治療的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物（例如纖溶酶原）的量。“治療有效量”會根據所使用的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物（例如纖溶酶原）、要治療的受試者的疾病和/或其症狀的嚴重程度以及年齡、體重等而變化。

本發明纖溶酶原的製備

纖溶酶原可以從自然界分離並純化用於進一步的治療用途，亦可以通過標準的化學肽合成技術來合成。當通過化學合成多肽時，可以經液相或固相進行合成。固相多肽合成(SPPS) (其中將序列的C末端氨基酸附接於不溶性支持物，接著序貫添加序列中剩餘的氨基酸)是適合纖溶酶原化學合成的方法。各種形式的SPPS，諸如Fmoc和Boc可用於合成纖溶酶原。用於固相合成的技術描述於Barany和Solid-Phase Peptide Synthesis; 第3-284頁於The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology.第2卷：Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield,等 J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963); Stewart等, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984);和Ganesan A. 2006 Mini Rev. Med Chem. 6:3-10和Camarero JA等 2005 Protein Pept Lett. 12:723-8中。簡言之，用其上構建有肽鏈的功能性單元處理小的不溶性多孔珠。在偶聯/去保護的重複循環後，將附接的固相游離N末端胺與單個受N保護的氨基酸單元偶聯。然後，將此單元去保護，露出可以與別的氨基酸附接的新的N末端胺。肽保持固定在固相上，之後將其切掉。

可以使用標準重組方法來生産本發明的纖溶酶原。例如，將編碼纖溶酶原的核酸插入表達載體中，使其與表達載體中的調控序列可操作連接。表達調控序列包括但不限於啓動子(例如天然關聯的或異源的啓動子)、信號序列、增强子元件、和轉錄終止序列。表達調控可以是載體中的真核啓動子系統，所述載體能夠轉化或轉染真核宿主細胞(例如COS或CHO細胞)。一旦將載體摻入合適的宿主中，在適合於核苷酸序列的高水平表達及纖溶酶原的收集和純化的條件下維持宿主。

合適的表達載體通常在宿主生物體中作爲附加體或作爲宿主染色體DNA的整合部分複製。通常，表達載體含有選擇標誌物(例如氨苄青黴素抗性、潮黴素抗性、四環素抗性、卡那黴素抗性或新黴素抗性)以有助於對外源用期望的DNA序列轉化的那些細胞進行檢測。

大腸桿菌(Escherichia coli)是可以用於複製主題抗體編碼多核苷酸的原核宿主細胞的例子。適合於使用的其它微生物宿主包括桿菌，諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和其他腸桿菌科(enterobacteriaceae)，諸如沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、和各種假單胞菌屬(Pseudomonas)物種。在這些原核宿主中，亦可以生成表達載體，其通常會含有與宿主細胞相容的表達控制序列(例如複製起點)。另外，會存在許多公知的啓動子，諸如乳糖啓動子系統，色氨酸(trp)啓動子系統，beta-內醯胺酶啓動子系統，或來自噬菌體λ的啓動子系統。啓動子通常會控制表達，任選在操縱基因序列的情况中，並且具有核糖體結合位點序列等，以啓動並完成轉錄和翻譯。

其他微生物，諸如酵母亦可用於表達。酵母(例如釀酒酵母(S. cerevisiae))和畢赤酵母(Pichia)是合適的酵母宿主細胞的例子，其中合適的載體根據需要具有表達控制序列(例如啓動子)、複製起點、終止序列等。典型的啓動子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。誘導型酵母啓動於特別包括來自醇脫氫酶、異細胞色素C、和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啓動子。

在微生物外，哺乳動物細胞(例如在體外細胞培養物中培養的哺乳動物細胞)亦可以用於表達並生成本發明的抗-Tau抗體(例如編碼主題抗-Tau抗體的多核苷酸)。參見Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)。合適的哺乳動物宿主細胞包括CHO細胞系、各種Cos細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、和經轉化的B細胞或雜交瘤。用於這些細胞的表達載體可以包含表達控制序列，如複製起點，啓動子和增强子(Queen等, Immunol. Rev. 89:49 (1986))，以及必需的加工信息位點，諸如核糖體結合位點，RNA剪接位點，多聚腺苷酸化位點，和轉錄終止子序列。合適的表達控制序列的例子是白免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細胞病毒等衍生的啓動子。參見Co等, J. Immunol. 148:1149 (1992)。

一旦合成(化學或重組方式)，可以依照本領域的標準規程，包括硫酸銨沉澱，親和柱，柱層析，高效液相層析(HPLC)，凝膠電泳等來純化本發明所述的纖溶酶原。該纖溶酶原是基本上純的，例如至少約80%至85%純的，至少約85%至90%純的，至少約90%至95%純的，或98%至99%純的或更純的，例如不含污染物，所述污染物如細胞碎片，除目標産物以外的大分子，等等。

藥物配製劑

可以通過將具有所需純度的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物（例如纖溶酶原）與可選的藥用載體，賦形劑，或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16版，Osol, A. ed.(1980))混合形成凍乾製劑或水溶液製備治療配製劑。可接受的載體、賦形劑、穩定劑在所用劑量及濃度下對受者無毒性，並包括緩衝劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化苄烷銨(benzalkonium chloride)，苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多肽(少於約10個殘基)；蛋白質如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬複合物(例如鋅-蛋白複合物)；和/或非離子表面活性劑，例如 TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。較佳凍乾的抗-VEGF抗體配製劑在WO 97/04801中描述，其包含在本文中作爲參考。

本發明的配製劑亦可含有需治療的具體病症所需的一種以上的活性化合物，較佳活性互補並且相互之間沒有副作用的那些。

本發明的纖溶酶原可包裹在通過諸如凝聚技術或界面聚合而製備的微膠囊中，例如，可置入在膠質藥物傳送系統(例如，脂質體，白蛋白微球，微乳劑，納米顆粒和納米膠囊)中或置入粗滴乳狀液中的羥甲基纖維素或凝膠-微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊中。這些技術公開於Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.(1980)。

用於體內給藥的本發明的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物（例如纖溶酶原）必需是無菌的。這可以通過在冷凍乾燥和重新配製之前或之後通過除菌濾膜過濾而輕易實現。

本發明的纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物（例如纖溶酶原）可製備緩釋製劑。緩釋製劑的適當實例包括具有一定形狀且含有糖蛋白的固體疏水聚合物半通透基質，例如膜或微膠囊。緩釋基質實例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)(Langer等，J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277(1981)；Langer, Chem. Tech., 12:98-105(1982))或聚(乙烯醇)，聚交酯(美國專利3773919, EP 58,481)，L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22:547(1983))，不可降解的乙烯－乙烯乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出處同上)，或可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨醯脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能持續釋放分子100天以上，而一些水凝膠釋放蛋白的時間却較短。可以根據相關機理來設計使蛋白穩定的合理策略。例如，如果發現凝聚的機理是通過硫代二硫鍵互換而形成分子間S-S鍵，則可通過修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍乾、控制濕度、採用合適的添加劑、和開發特定的聚合物基質組合物來實現穩定。

給藥和劑量

可以通過不同方式，例如通過鼻腔吸入、霧化吸入、滴鼻液或滴眼液，靜脈內，腹膜內、皮下、顱內、鞘內、動脈內(例如經由頸動脈)、肌內、直腸給藥來實現本發明藥物組合物的施用。

用於胃腸外施用的製備物包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳劑。非水性溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，和可注射有機酯，如油酸乙酯。水性載體包括水、醇性/水性溶液、乳劑或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質。胃腸外媒介物包含氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、或固定油。靜脈內媒介物包含液體和營養補充物、電解質補充物，等等。亦可以存在防腐劑和其他添加劑，諸如例如，抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、和惰性氣體，等等。

醫務人員會基於各種臨床因素確定劑量方案。如醫學領域中公知的，任一患者的劑量取决於多種因素，包括患者的體型、體表面積、年齡、要施用的具體化合物、性別、施用次數和路徑、總體健康、和同時施用的其它藥物。本發明包含纖溶酶原的藥物組合物的劑量範圍可以例如爲每天約0.0001至2000 mg/kg，或約0.001至500 mg/kg (例如0.02 mg/kg，0.25 mg/kg，0.5 mg/kg，0.75 mg/kg，10 mg/kg，50 mg/kg等等)受試者體重。例如，劑量可以是1 mg/kg體重或50 mg/kg體重或在1-50 mg/kg的範圍，或至少1 mg/kg。高於或低於此例示性範圍的劑量亦涵蓋在內，特別是考慮到上述的因素。上述範圍中的中間劑量亦包含在本發明的範圍內。受試者可以每天、隔天、每周或根據通過經驗分析確定的任何其它日程表施用此類劑量。例示性的劑量日程表包括連續幾天0.01-100mg/kg。在本發明的藥物施用過程中需要實時評估治療效果和安全性。

製品或藥盒

本發明的一個實施方案涉及一種製品或藥盒，其包含纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物（例如纖溶酶原）。所述製品較佳包括一個容器，標籤或包裝插頁。適當的容器有瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑料製成。所述容器含有組合物，所述組合物可有效治療本發明的疾病或病症並具有無菌入口(例如所述容器可爲靜脈內溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射針穿透的塞子的)。所述組合物中至少一種活性劑爲纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物（例如纖溶酶原）。所述容器上或所附的標籤說明所述組合物用於治療本發明所述病症。所述製品可進一步包含含有可藥用緩衝液的第二容器，諸如磷酸鹽緩衝的鹽水，林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可進一步包含從商業和使用者角度來看所需的其它物質，包括其它緩衝液，稀釋劑，過濾物，針和注射器。此外，所述製品包含帶有使用說明的包裝插頁，包括例如指示所述組合物的使用者將包含纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分或其相關化合物（例如纖溶酶原）的組合物以及治療伴隨的疾病的其它藥物給藥患者。

實施例

以下所有實施例中使用的人纖溶酶原來自捐贈者血漿，基於如下文獻描述的方法：KennethC Robbins,Louis Summaria,David Elwyn et al.Further Studies on the Purification and Characterization of Human Plasminogen and Plasmin. Journal of Biological Chemistry , 1965 , 240 (1) :541-550；Summaria L, Spitz F, Arzadon L et al. Isolation and characterization of the affinity chromatography forms of human Glu- and Lys-plasminogens and plasmins. J Biol Chem. 1976 Jun 25;251(12):3693-9；HAGAN JJ, ABLONDI FB, DE RENZO EC. Purification and biochemical properties of human plasminogen. J Biol Chem. 1960 Apr;235:1005-10，並進行製程優化，從人捐贈者血漿中純化所得。纖溶酶原單體的純度＞98%。

實施例 1 纖溶酶原改善帕金森模型小鼠自發活動及趨避性行爲

取10-12周齡雄性C57BL/6J小鼠28隻，造模前1天所有小鼠稱重並根據體重隨機分爲2組，空白對照組8隻，模型組20隻。空白對照組小鼠腹腔注射生理鹽水溶液200μl，模型組小鼠按照35mg/kg/隻腹腔注射1-甲基- 4-苯基- 1, 2, 3, 6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）溶液，連續注射5天，建立帕金森模型^[1] 。MPTP溶液配製：取45mg MPTP（Sigma，M0896）溶解在9ml生理鹽水溶液中，配製最終濃度爲5mg/ml。造模完成後即造模第6天所有小鼠進行體重測量及曠場行爲學檢測。模型組小鼠按體重及曠場結果隨機分爲2組，給藥組10隻小鼠和溶媒組10隻小鼠，並開始給藥，記爲第1天，給藥組小鼠尾靜脈注射1mg/100μl /隻纖溶酶原溶液，溶媒組注射100μl/隻溶媒溶液(10mM檸檬酸-檸檬酸鈉溶液，pH7.4），持續給藥14天，於給藥第15天進行曠場實驗。

MPTP是一種特定的强黑質毒素，其代謝產物MPP+（1-methyl-4-phenylpyridinium)是線粒體複合體Ⅰ抑制劑，可透過血腦屏障，阻斷線粒體氧化呼吸鏈等途徑損傷黑質體和紋狀體中多巴胺神經元，模擬人類帕金森症狀^[2] 。

曠場實驗

實驗時，小鼠放入曠場（40×40×40cm）底面中心，同時進行攝像和計時，持續觀察5分鐘，每隻小鼠進行3次實驗。記錄參數包括總移動距離、邊界靜息時間率、邊界區運動路程、邊界區運動路程百分率、邊界區慢速運動時間百分率、邊界區時間百分率、進入邊界區次數、中心區運動路程、中心區運動路程百分率、中心區最大運動速度、中心區時間百分率、進入中心區次數、運動軌跡。每次實驗後採用70%酒精擦拭箱體防止嗅覺産生的偏好。

曠場實驗的設計原理是基於小鼠的趨避性，指的是小鼠畏懼開闊、未知、可能存在潜在危險的場所，因而其有“貼牆”活動的天性。總路程和平均速度被視爲反映小鼠自發活動的主要數據，趨避性是以小鼠在曠野周邊區（四個角和四個邊）的活動來評價的。從反映趨避性的周邊區活動時間看，時間減少，說明小鼠更富有“冒險”傾向。在中央區活動時間顯著增多，說明趨避性和焦慮（抑鬱）水平較低。

總體活動情况

總運動路程

總運動路程是指規定測試時間內運動軌跡的長度。

結果顯示，空白對照組在實驗期間會運動一定路程；給纖溶酶原組小鼠總運動路程明顯短於溶媒對照組，統計差異顯著（*表示P＜0.05），且給纖溶酶原組總運動路程接近於空白對照組（圖1）。說明纖溶酶原可使帕金森模型小鼠自發活動行爲恢復。

邊界區活動情况

邊界區靜息時間率

邊界區爲曠野周邊區（四個角和四個邊）。邊界區靜息時間率是指：邊界區靜息時間與總靜息時間（包括邊界區靜息時間和中心區靜息時間）的比值。結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的邊界區靜息時間率；給纖溶酶原組小鼠邊界區靜息時間率明顯大於溶媒對照組，統計差異極爲顯著（**表示P＜0.01），且給纖溶酶原組邊界靜息時間率接近於空白對照組（圖2）。說明纖溶酶原可增强帕金森模型小鼠趨避性行爲，緩解其焦慮。

邊界區運動路程

邊界區運動路程指規定測試時間內邊界區運動軌跡的長度。結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的邊界運動路程；溶媒對照組小鼠邊界運動路程長於給纖溶酶原組，統計差異接近顯著（P=0.05）；且給纖溶酶原組邊界區運動路程接近空白對照組（圖3）。說明纖溶酶原可增强帕金森模型小鼠的趨避性，緩解其焦慮。

邊界區運動路程百分率

邊界區運動路程百分率指邊界區運動路程與總運動路程（包括邊界區運動路程和中心區運動路程）的比值。

結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的邊界運動路程百分率；給藥纖溶酶原組小鼠邊界區運動路程百分率明顯高於溶媒對照組，統計差異極爲顯著（**表示P＜0.01）；且給藥纖溶酶原組小鼠邊界運動路程百分率接近空白對照組（圖4）。說明纖溶酶原可增强帕金森模型小鼠趨避性行爲，緩解其焦慮。

邊界區慢速運動時間百分率

邊界區慢速運動時間百分率指測試時間內邊界區慢速運動的時間與總測試時間的比值。

結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的邊界區慢速運動時間百分率；給纖溶酶原組小鼠邊界慢速運動時間百分率明顯小於溶媒對照組，統計差異極爲顯著（**表示P＜0.01）；且給纖溶酶原組邊界慢速運動時間百分率接近於空白對照組（圖5）。說明纖溶酶原可增强帕金森模型小鼠趨避性，緩解其焦慮。

邊界區時間百分率

邊界區時間百分率指邊界區時間與總的測試時間的比值。

結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的邊界區時間百分率；給纖溶酶原組小鼠邊界區時間百分率明顯高於溶媒對照組小鼠，統計差異接近顯著（P=0.06），且給藥纖溶酶原組邊界區時間百分率接近空白對照組（圖6）。說明纖溶酶原可提高帕金森模型小鼠趨避性行爲水平，緩解其焦慮。

進入邊界區次數

結果顯示，空白對照組小鼠具有一定進入邊界區次數；給纖溶酶原組小鼠進入邊界區次數明顯低於溶媒對照組小鼠，統計差異顯著（*表示P＜0.05）；且給藥纖溶酶原組小鼠進入邊界區的次數接近空白對照組（圖7）。說明纖溶酶原可增强帕金森模型小鼠趨避性，緩解其焦慮。

中心區活動情况

中心區運動路程

中心區運動路程指測試時間內中心區運動軌跡的長度。

結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的中心區運動路程；給藥纖溶酶原組小鼠中心區運動路程明顯低於溶媒對照組小鼠，統計差異顯著（*表示P＜0.05）；且給藥纖溶酶原組小鼠中心區運動路程接近空白對照組（圖8）。說明纖溶酶原可增强帕金森模型小鼠的趨避性，緩解其焦慮。

中心區運動路程百分率

中心區運動路程百分率指測試時間內中心區運動軌跡的長度與總的運動軌跡長度的比值。

結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的中心區運動路程百分率；給藥纖溶酶原組小鼠中心區運動路程百分率明顯低於溶媒對照組小鼠，統計差異顯著（*表示P＜0.05）；且給藥纖溶酶原組小鼠中心區運動路程百分率接近空白對照組（圖9）。說明纖溶酶原可增强帕金森模型小鼠趨避性，緩解其焦慮。

中心區最大運動速度

中心區最大運動速度指測試時間內中心區的最快運動速度。

結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的中心區最大運動速度；給藥纖溶酶原組小鼠中心區最大運動速度明顯小於溶媒對照組，統計差異極爲明顯（**表示P＜0.01），且給纖溶酶原組中心區最大運動速度接近於空白對照組（圖10）。說明纖溶酶原可增强帕金森模型小鼠趨避性，緩解其焦慮。

中心區時間百分率

中心區時間百分率指中心區的運動時間與總測試時間的比值。

結果顯示，空白對照組小鼠具有一定地進入中心區時間百分率；給藥纖溶酶原組小鼠中心區時間百分率明顯小於溶媒對照組，統計差異接近顯著（P=0.06）；且給纖溶酶原組中心區時間百分率接近於空白對照組（圖11）。說明纖溶酶原可增强帕金森模型小鼠趨避性，緩解其焦慮。

進入中心區次數

結果顯示，空白對照組小鼠很少進入中心區，表現出正常的趨避天性；給藥纖溶酶原組小鼠進入中心區次數明顯少於溶媒對照組，統計差異明顯（*表示P＜0.05）；且給藥纖溶酶原組小鼠進入中心區次數接近空白對照組（圖12）。說明纖溶酶原可增强帕金森模型小鼠趨避性，緩解其焦慮。

運動軌跡

結果顯示，曠場實驗期間空白對照組小鼠具有一定的總運動路程並且幾乎沒有中心區活動；相比於溶媒對照組，給藥纖溶酶原組小鼠表現出總運動路程和中心區活動均有明顯減少的趨勢，且接近於空白對照組小鼠（圖13）。說明纖溶酶原可增强帕金森模型小鼠趨避性，緩解其焦慮。

實施例 2 纖溶酶原可促進帕金森模型小鼠黑質 DTA 表達

取10-12周齡雄性C57BL/6J小鼠40隻，造模前1天所有小鼠稱重並根據體重隨機分爲2組，空白對照組8隻，模型組32隻。空白對照組小鼠腹腔注射溶媒溶液200μl，模型組小鼠按照40mg/kg/隻腹腔注射1-甲基- 4-苯基- 1, 2, 3, 6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）溶液，連續注射5天，建立帕金森模型^[1] 。MPTP溶液配製：取45mg MPTP（Sigma，M0896）溶解在9ml生理鹽水溶液中，配製最終濃度爲5mg/ml。造模完成後即造模第6天，模型組小鼠按體重隨機分爲兩組，溶媒組和給藥組，每組各16隻，並開始給藥，記爲第1天，給藥組小鼠尾靜脈注射1mg/100μl /隻纖溶酶原溶液，溶媒組注射100μl/隻溶媒溶液（10mM檸檬酸-檸檬酸鈉溶液，pH7.4），持續給藥14天，於給藥第15天犧牲，取材小鼠黑質於10%中性甲醛溶液固定24-48小時。固定後的黑質組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。切片厚度爲3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01MPBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液（Vector laboratories,Inc.,USA）封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液，滴加兔抗鼠多巴胺轉運蛋白(dopamine transporter，DAT)抗體(ab7260, Abcam) 4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories, Inc,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明幷中性樹膠封片，切片在400倍光學顯微鏡下觀察。

帕金森氏症（Parkinson disease，PD）是一種神經退行性疾病，其病理特徵爲黑質紋狀體多巴胺能神經元進行性死亡，以及殘存的多巴胺能神經元胞漿內路易小體形成，基底節區多巴胺缺乏，進而導致發生PD經典運動障礙症狀。多巴胺轉運蛋白(dopamine transporter，DAT)位於多巴胺神經元突觸前膜，能重新攝取釋放至突觸間隙的多巴胺遞質，反映多巴胺神經元突觸前功能。DAT減少與PD發展關係密切^[3] 。

結果顯示，空白對照組（圖14A）小鼠黑質多巴胺神經元表達一定量的DTA（箭頭標識），溶媒組（圖14B）小鼠黑質DTA的表達量低於空白對照組，給藥纖溶酶原組（圖14C）小鼠黑質DTA的表達量高於溶媒組。該結果表明纖溶酶原可增强帕金森模型小鼠黑質DTA的表達。

實施例 3 纖溶酶原可促使帕金森模型小鼠紋狀體尼氏體恢復

取10-12周齡雄性C57BL/6J小鼠40隻，造模前1天所有小鼠稱重並根據體重隨機分爲2組，空白對照組8隻，模型組32隻。空白對照組小鼠腹腔注射溶媒溶液200μl，模型組小鼠按照40mg/kg/隻腹腔注射1-甲基- 4-苯基- 1, 2, 3, 6-四氫吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP）溶液，連續注射5天，建立帕金森模型^[1] 。MPTP溶液配製：取45mg MPTP（Sigma，M0896）溶解在9ml生理鹽水溶液中，配製最終濃度爲5mg/ml。造模完成後即造模第6天，模型組小鼠按體重隨機分爲兩組，溶媒組和給藥組，每組各16隻，並開始給藥，記爲第1天，給藥組小鼠尾靜脈注射1mg/100μl /隻纖溶酶原溶液，溶媒組注射100μl/隻溶媒溶液(10mM檸檬酸-檸檬酸鈉溶液，pH7.4），持續給藥14天，於給藥第15天犧牲，取材小鼠紋狀體於10%中性甲醛溶液固定24-48小時。固定後的紋狀體組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度爲3μm，脫蠟至水後，用0.4%焦油紫染液（pH=3）進行染色。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。切片在400倍光學顯微鏡下觀察拍照。

PD主要的病理變化是黑質紋狀體多巴胺能神經元進行性變性壞死，導致紋狀體多巴胺遞質水平下降，從而引起整個基底神經節環路功能紊亂^[3] 。尼氏體又稱嗜染質，是神經細胞所特有的結構，由許多平行排列的粗面內質網和分布期間的游離核糖體組成，具有合成蛋白的功能，其數量和分布與神經元的功能狀態密切相關，被視爲神經細胞存活的標誌^[4] 。結果顯示，空白對照組（圖15A）小鼠紋狀體神經元存在一定數量的尼氏體（箭頭標識）；溶媒對照組（圖15B）小鼠紋狀體神經元尼氏體數量明顯多於空白對照組，且統計差異接近顯著（P=0.085）；給纖溶酶原組（圖15C）小鼠紋狀體神經元尼氏體數量與空白對照組無明顯差異，但明顯低於溶媒對照組，且統計差異顯著（*表示P＜0.05）（圖15D）。該結果表明纖溶酶原能夠促進帕金森模型小鼠紋狀體尼氏體恢復。

實施例 4 纖溶酶原可促使帕金森模型小鼠黑質尼氏體數量恢復

取10~12周齡C57BL/6J雄性小鼠28隻，造模前1天稱重，根據體重隨機分爲2組，空白對照組8隻，模型組20隻。造模時間定在每日早上9點，空白對照組腹腔注射200μl生理鹽水；模型組腹腔注射35mg/kg/隻5mg/ml MPTP溶液，連續注射5天，建立帕金森模型^[5] 。MPTP溶液配製：取45mg MPTP（sigma，M0896）溶解在9ml 生理鹽水溶液中，配製最終濃度爲5mg/ml。造模完成後即造模第6天，模型組小鼠按體重隨機分爲兩組，溶媒組和給藥組，每組各10隻，並開始給藥，記爲第1天，給藥組小鼠尾靜脈注射1mg/100μl /隻纖溶酶原溶液，溶媒組注射100μl/隻溶媒溶液(10mM檸檬酸-檸檬酸鈉溶液，pH7.4），持續給藥14天，於給藥第15天犧牲，取材小鼠黑質於10%中性甲醛溶液固定24-48小時。固定後的黑質組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度爲3μm，脫蠟至水後，用0.4%焦油紫染液（pH=3）進行染色。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。切片在400倍光學顯微鏡下觀察拍照。

結果顯示，空白對照組（圖16A）小鼠黑質中有一定量的尼氏體（箭頭標識），溶媒組（圖16B）小鼠黑質中尼氏體數減少，給纖溶酶原組（圖16C）小鼠黑質尼氏體數高於溶媒組。該結果表明纖溶酶原可促進帕金森模型小鼠黑質尼氏體數量恢復。

實施例 5 纖溶酶原可促進帕金森模型小鼠黑質 GLP-1R 的表達

取9周齡C57雄性小鼠12隻，造模前1天稱重，小鼠按照30mg/kg體重每天腹腔注射5mg/ml MPTP溶液，連續注射5天，建立帕金森模型^[6-7] 。MPTP溶液配製：用注射器吸取10ml去離子水，加入到100mg MPTP粉末（sigma，M0896）中，配製成10mg/ml的母液，然後吸取1ml母液於安瓶中，再加入1ml 去離子水，最終濃度爲5mg/ml。造模完成後小鼠隨機分爲兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組各6隻小鼠，並開始給藥，記爲第1天，給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1ml /隻/天尾靜脈注射纖溶酶原溶液，給溶媒PBS對照組尾靜脈給予相同體積 PBS，持續給藥14天。於給藥第15天犧牲小鼠，快速取材大腦於4%多聚甲醛固定24-48小時。固定後的腦組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。定位切片黑質，切片厚度爲4μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液（Vector laboratories, Inc., USA）封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液， 滴加兔抗小鼠GLP-1R抗體(NOVUS,NBP1-97308) 4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明幷中性樹膠封片，切片在200倍光學顯微鏡下觀察。

胰高血糖素樣肽1受體（glucagon-like peptide 1 receptor，GLP-1R）是胰高血糖素受體家族成員之一，是一種G蛋白偶聯受體，能通過促進胰島素的分泌調節血糖水平^[8-9] 。帕金森氏病的特點是黑質紋狀體神經元多巴胺能信號缺失，而黑質紋狀體亦表達GLP-1R^[10] 。

結果顯示，給纖溶酶原組（圖17B）小鼠黑質GLP-1R的表達量（箭頭標識）明顯多於溶媒PBS對照組(圖17A)，且統計差異顯著（*表示P＜0.05）（圖17C）。該結果表明，纖溶酶原能夠增强帕金森模型小鼠黑質GLP-1R的表達。

實施例 6 纖溶酶原可促進帕金森模型小鼠黑質 TH 的表達

取9周齡C57雄性小鼠12隻，造模前1天稱重，小鼠按照30mg/kg體重每天腹腔注射5mg/ml MPTP溶液，連續注射5天，建立帕金森模型^[6-7] 。MPTP溶液配製：用注射器吸取10ml去離子水，加入到100mg MPTP粉末（sigma，M0896）中，配製成10mg/ml的母液，然後吸取1ml母液於安瓶中，再加入1ml去離子水，最終濃度爲5mg/ml。造模完成後小鼠隨機分爲兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組各6隻小鼠，並開始給藥，記爲第1天，給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1ml /隻/天尾靜脈注射纖溶酶原溶液，給溶媒PBS對照組尾靜脈給予相同體積 PBS，持續給藥14天。於給藥第15天犧牲小鼠，取材小鼠黑質於4%多聚甲醛固定24-48小時。固定後的腦組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。定位切片黑質，切片厚度爲3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液（Vector laboratories, Inc., USA）封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液， 滴加兔抗小鼠TH抗體(Proteintech, 25859-1-AP) 4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明幷中性樹膠封片，切片在400倍光學顯微鏡下觀察。

酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase,TH）是酪氨酸合成左旋多巴（L-dopa）的限速酶，僅在胞漿中表達，多巴胺神經元中含量豐富。黑質中TH陽性神經元大多是多巴胺能的，因此TH可作爲黑質中多巴胺能神經元的標誌物，黑質中TH表達量成爲檢測PD 的指標^[11] 。

結果顯示，空白對照組（圖18A）小鼠黑質中有一定量的TH陽性細胞（箭頭標識），溶媒組（圖18B）小鼠黑質中TH陽性細胞數減少，給纖溶酶原組（圖18C）小鼠黑質中TH陽性細胞數明顯高於溶媒組。該結果表明纖溶酶原可增加帕金森模型小鼠黑質中TH陽性細胞數量。

實施例 7 纖溶酶原影響帕金森模型小鼠黑質小膠質細胞數量

取9周齡C57雄性小鼠12隻，造模前1天稱重，小鼠按照30mg/kg體重每天腹腔注射5mg/ml MPTP溶液，連續注射5天，建立帕金森模型^[6-7] 。MPTP溶液配製：用注射器吸取10ml去離子水，加入到100mg MPTP粉末（sigma，M0896）中，配製成10mg/ml的母液，然後吸取1ml母液於安瓶中，再加入1ml去離子水，最終濃度爲5mg/ml。造模完成後小鼠隨機分爲兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組各6隻小鼠，並開始給藥，記爲第1天，給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1ml /隻/天尾靜脈注射纖溶酶原溶液，給溶媒PBS對照組尾靜脈給予相同體積 PBS，持續給藥14天。於給藥第15天犧牲小鼠，取材小鼠中腦黑質於4%多聚甲醛固定24-48小時。固定後的黑質經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。定位切片黑質，切片厚度爲3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液（Vector laboratories, Inc., USA）封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液， 滴加兔抗小鼠Iba-1抗體(Abcam, ab178847) 4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明幷中性樹膠封片，切片在400倍光學顯微鏡下觀察。

小膠質細胞是中樞神經系統固有免疫細胞，在腦病變或損傷時被活化。活化的小膠質細胞遷移到損傷部位，發揮多種功能，例如吞噬死細胞、增加促炎性細胞因子等，參與各種中樞神經系統疾病^[12-14] 。Iba-1（Ionized calcium binding adapter molecule 1）是一約 17kDa 的鈣結合蛋白，在中樞神經系統小膠質細胞中特異性表達，已被廣泛用作小膠質細胞標記物^[15-17] 。

結果顯示，空白對照組（圖19A）小鼠黑質有一定數量的小膠質細胞（箭頭標識），溶媒對照組（圖19B）小鼠黑質中小膠質細胞數高於空白對照組，給纖溶酶原組（圖19C）小鼠黑質中小膠質細胞數明顯低於溶媒對照組，且接近於空白對照組。該結果顯示纖溶酶原影響帕金森模型小鼠黑質小膠質細胞數量。

實施例 8 纖溶酶原可促進帕金森模型小鼠紋狀體髓鞘恢復

取9周齡C57雄性小鼠12隻，造模前1天稱重，小鼠按照30mg/kg體重每天腹腔注射5mg/ml MPTP溶液，連續注射5天，建立帕金森模型^[6-7] 。MPTP溶液配製：用注射器吸取10ml去離子水，加入到100mg MPTP粉末（sigma，M0896）中，配製成10mg/ml的母液，然後吸取1ml母液於安瓶中，再加入1ml去離子水，最終濃度爲5mg/ml。造模完成後小鼠隨機分爲兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組各6隻，並開始給藥，記爲第1天，給纖溶酶原組小鼠按照1mg/0.1ml /隻/天尾靜脈注射纖溶酶原溶液，給溶媒PBS對照組尾靜脈給予相同體積 PBS，持續給藥14天。於給藥第15天犧牲小鼠，取材小鼠紋狀體於10%中性甲醛溶液固定24-48小時。固定後的紋狀體組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度爲3μm，脫蠟至水後，用0.1%LFB染液進行染色密封浸染8-16h。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。切片在400倍光學顯微鏡下觀察拍照。

神經退行性疾病是指由大腦和脊髓的神經元或其髓鞘的喪失所導致的疾病。LFB（Luxol fast blue）是一種髓鞘特異性染色方法，可反映髓鞘受損情况^[18-19] 。

結果顯示，空白對照組（圖20A）小鼠紋狀體存在一定量的髓鞘，溶媒組（圖20B）小鼠紋狀體髓鞘染色少於空白對照組，給纖溶酶原組（圖20C）小鼠紋狀體髓鞘染色明顯多於溶媒組，且接近空白對照組。該結果顯示纖溶酶原可使帕金森模型小鼠紋狀體髓鞘一定程度地恢復。

實施例 9 纖溶酶原可減少帕金森模型小鼠黑質 α- 突觸核蛋白表達

取10~12周齡C57BL/6J雄性小鼠28隻，造模前1天稱重，根據體重隨機分爲2組，空白對照組8隻，模型組20隻。造模時間定在每日早上9點，空白對照組腹腔注射200μL生理鹽水；模型組腹腔注射35mg/kg/隻5mg/mL MPTP溶液，連續注射5天，建立帕金森模型^[5] 。MPTP溶液配製：取45mg MPTP（sigma，M0896）溶解在9mL 生理鹽水溶液中，配製最終濃度爲5mg/mL。造模完成後即造模第6天，模型組小鼠按體重隨機分爲兩組，溶媒組和給藥組，每組各10隻，並開始給藥，記爲第1天，給藥組小鼠尾靜脈注射1mg/100μL /隻纖溶酶原溶液，溶媒組注射100μL/隻溶媒溶液（10mM檸檬酸-檸檬酸鈉溶液，pH7.4），持續給藥14天，於給藥第15天犧牲，取材小鼠黑質於4%多聚甲醛固定24-48小時。固定後的腦組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。定位切片黑質，切片厚度爲3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液（Vector laboratories, Inc., USA）封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液， 滴加兔抗小鼠α⁃synuclein抗體(Proteintech, 10842-1-AP) 4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Abcam)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明幷中性樹膠封片，切片在400倍光學顯微鏡下觀察。

目前認爲帕金森氏症是由於中腦黑質多巴胺能神經元缺失及出現路易小體所導致。α-突觸核蛋白(α-synuclein)是一個由140個氨基酸殘基組成的神經元蛋白，可導致神經元損傷，而且參與中樞神經系統神經變性的過程，研究表明神經細胞路易小體和神經突觸內聚合的α⁃synuclein是帕金森氏症中大腦病變的標誌^[20] 。

結果顯示，空白對照組（圖21A）小鼠黑質僅有少量的α-突觸核蛋白(α-synuclein)，溶媒組（圖21B）小鼠黑質α-突觸核蛋白的量明顯高於空白對照組（*表示P＜0.05），給纖溶酶原組（圖21C）小鼠黑質α-突觸核蛋白的量明顯低於溶媒組，且趨近於空白對照組，統計差異顯著（*表示P＜0.05）（圖21D）。說明纖溶酶原可減少帕金森模型小鼠黑質α-突觸核蛋白表達，改善神經元損傷變性。

實施例 10 纖溶酶原可改善帕金森模型小鼠紋狀體軸索損傷

取10~12周齡C57BL/6J雄性小鼠28隻，造模前1天稱重，根據體重隨機分爲2組，空白對照組8隻，模型組20隻。造模時間定在每日早上9點，空白對照組腹腔注射200μL生理鹽水；模型組腹腔注射35mg/kg/隻5mg/mL MPTP溶液，連續注射5天，建立帕金森模型^[5] 。MPTP溶液配製：取45mg MPTP（sigma，M0896）溶解在9mL 生理鹽水溶液中，配製最終濃度爲5mg/mL。造模完成後即造模第6天，模型組小鼠按體重隨機分爲兩組，溶媒組和給藥組，每組各10隻，並開始給藥，記爲第1天，給藥組小鼠尾靜脈注射1mg/100μL /隻纖溶酶原溶液，溶媒組注射100μL/隻溶媒溶液（10mM檸檬酸-檸檬酸鈉溶液，pH7.4），持續給藥14天，於給藥第15天犧牲，取材小鼠黑質於4%多聚甲醛固定24-48小時。固定後的腦組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。定位切片黑質，切片厚度爲3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液（Vector laboratories, Inc., USA）封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液， 滴加兔抗小鼠NF抗體(Abcam, ab207176) 4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Abcam，ab6721)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories, Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明幷中性樹膠封片，切片在400倍光學顯微鏡下觀察。

帕金森患者疾病過程中存在軸索損傷，且軸索損傷嚴重程度可能隨病程延長持續加重。神經絲蛋白（Neurofilaments，NF）是神經軸索的主要骨架蛋白，對維持神經元正常形態和軸索運輸具有至關重要的作用，可作爲軸索損傷的相關生物標記物^[21] 。

結果顯示，空白對照組（圖22A）小鼠紋狀體有一定量的NF（箭頭標識），溶媒組（圖22B）小鼠紋狀體NF的量低於空白對照組，給纖溶酶原組（圖22C）小鼠紋狀體中NF的量明顯高於溶媒組，且統計差異極顯著（**表示P＜0.01）（圖22D）。說明纖溶酶原可促使帕金森模型小鼠紋狀體NF恢復，修復帕金森軸索損傷。

實施例 11 纖溶酶原可減少帕金森模型小鼠紋狀體 GFAP 表達

取10~12周齡C57BL/6J雄性小鼠28隻，造模前1天稱重，根據體重隨機分爲2組，空白對照組8隻，模型組20隻。造模時間定在每日早上9點，空白對照組腹腔注射200μL生理鹽水；模型組腹腔注射35mg/kg/隻5mg/mL MPTP溶液，連續注射5天，建立帕金森模型[5]。MPTP溶液配製：取45mg MPTP（sigma，M0896）溶解在9mL 生理鹽水溶液中，配製最終濃度爲5mg/mL。造模完成後即造模第6天，模型組小鼠按體重隨機分爲兩組，溶媒組和給藥組，每組各10隻，並開始給藥，記爲第1天，給藥組小鼠尾靜脈注射1mg/100μL /隻纖溶酶原溶液，溶媒組注射100μL/隻溶媒溶液（10mM檸檬酸-檸檬酸鈉溶液，pH7.4），持續給藥14天，於給藥第15天犧牲，取材小鼠黑質於4%多聚甲醛固定24-48小時。固定後的腦組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。定位切片黑質，切片厚度爲3μm，切片脫蠟複水後水洗1次。PAP筆圈出組織，以3%雙氧水孵育15分鐘，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。5%的正常羊血清液（Vector laboratories, Inc., USA）封閉30分鐘；時間到後，棄除羊血清液， 滴加兔抗小鼠GFAP抗體(Abcam, ab7260) 4℃孵育過夜，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Abcam，ab6721)二抗室溫孵育1小時，0.01M PBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories, Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度酒精脫水，二甲苯透明幷中性樹膠封片，切片在400倍光學顯微鏡下觀察。

膠質細胞纖維酸性蛋白 (gilaI fibrillary acidic protein, GFAP)是構成星形膠質細胞胞體膠原蛋白的重要成分，且其僅存在於星形膠質細胞膠質原纖維中間絲中，是星形膠質細胞活化的特徵性標記物^[22] ，對神經元具有炎性損壞作用，使神經元變性^[23] ，從而引起帕金森的發生。

結果顯示，空白對照組（圖23A）小鼠紋狀體表達少量的GFAP（箭頭標識），溶媒組（圖23B）小鼠紋狀體GFAP的表達量明顯高於空白對照組，給纖溶酶原組小鼠（圖23C）紋狀體GFAP的表達量低於溶媒組。說明纖溶酶原可減少帕金森模型小鼠紋狀體GFAP表達，減輕紋狀體神經元損傷。

實施例 12 纖溶酶原促進 α- 突觸核蛋白在帕金森模型小鼠腦勻漿中降解

取11~12周齡、18-25g的C57BL/6J雄性小鼠8隻，造模前1天稱重，根據體重隨機分爲2組，空白對照組4隻，模型組4隻。造模時間定在每日早上9點，空白對照組腹腔注射200μL生理鹽水；模型組腹腔注射35mg/kg/隻5mg/mL MPTP溶液，連續注射5天，建立帕金森模型^[5] 。MPTP溶液配製：取45mg MPTP（sigma，M0896）溶解在9mL 生理鹽水溶液中，配製最終濃度爲5mg/mL。造模完成後即造模第6天，所有小鼠進行曠場實驗，鑒定造模成功。所有小鼠犧牲後取整個腦部並稱重，按150mg組織/mLPBS分別加入1×PBS（Thermo Fisher，pH7.4；10010-031，4℃下勻漿（1min，3-4次），勻漿後於4℃離心（12000rpm，20min），取上清液置於新的EP管中。

取Eppendorf (EP) 管分別設爲①空白對照組、②溶媒對照組、③纖溶酶原組，各組設置5個平行。空白對照組加入21.5μL生理鹽水、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿；溶媒對照組加入21.5μL α-突觸核蛋白溶液（上海强耀生物科技有限公司，定制表達人α-突觸核蛋白，UniProtKB - P37840，1.0mg/mL）、4.6μL溶媒溶液（10mM檸檬酸鈉，2%鹽酸精氨酸，3%甘露醇，PH7.4）、23.9μL小鼠腦勻漿；纖溶酶原組加入21.5mL α-突觸核蛋白溶液（1.0mg/mL）、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿。各組樣品加好後，37℃溫育6h後分別加入50μL 0.1%三氟乙酸溶液終止反應。

根據Tris-Tricine-SDS-PAGE凝膠製備試劑盒（Solarbio，P1320）配膠說明製備12%凝膠。各組樣品分別與4×上樣緩衝液（TaKaRa，e2139）以體積比爲3:1混勻後，100℃加熱5 min，冷却後離心2 min，然後取20μL上樣。電泳條件爲30V跑1.5h，然後100V電泳至膠底。電泳結束後剝凝膠置於1‰考馬斯亮藍染色液（1g考馬斯亮藍R250溶於1000ml乙醇：冰醋酸：純化水體積比爲5:2:13的混合液中）中染色30min，再用脫色液（純化水：冰醋酸：無水乙醇=17:2:1體積比混合）脫色至乾淨。凝膠在生物分子成像儀下拍照並定量掃描分析。

結果顯示，在帕金森模型小鼠腦勻漿中，纖溶酶原組α-突觸核蛋白的量明顯低於溶媒對照組，差異極顯著（***代表P＜0.001），且其聚合物a、b的量均明顯低於溶媒對照組，差異極顯著（**代表P＜0.01，***代表P＜0.001）；在正常小鼠腦勻漿中，纖溶酶原組α-突觸核蛋白的量明顯低於溶媒對照組，差異極顯著（***代表P＜0.001），且其聚合物a、b的量均明顯低於溶媒對照組，差異顯著（*代表P＜0.05，**代表P＜0.01）（圖24）。表明在帕金森模型小鼠和正常小鼠腦勻漿中，纖溶酶原可有效地降解人α-突觸核蛋白及其聚合物。

實施例 13 纖溶酶原促進 α- 突觸核蛋白在帕金森模型小鼠腦勻漿中降解

取11~12周齡、18-25g的C57BL/6J雄性小鼠8隻，造模前1天稱重，根據體重隨機分爲2組，空白對照組4隻，模型組4隻。造模時間定在每日早上9點，空白對照組腹腔注射200μL生理鹽水；模型組腹腔注射35mg/kg/隻5mg/mL MPTP溶液，連續注射5天，建立帕金森模型^[5] 。MPTP溶液配製：取45mg MPTP（sigma，M0896）溶解在9mL 生理鹽水溶液中，配製最終濃度爲5mg/mL。造模完成後即造模第6天，所有小鼠進行曠場實驗，鑒定造模成功。所有小鼠犧牲後取整個腦部並稱重，按150mg組織/mLPBS分別加入1×PBS（Thermo Fisher，pH7.4；10010-031，4℃下勻漿（1min，3-4次），勻漿後於4℃離心（12000rpm，20min），取上清液置於新的EP管中。

取Eppendorf (EP) 管分別設爲①空白組、②空白對照組、③溶媒對照組、④纖溶酶原組，各組設置5個平行。空白組加入21.5μL生理鹽水、4.6μL溶媒溶液（10 mM 檸檬酸鈉，2%鹽酸精氨酸，3%甘露醇，pH 7.4）、23.9μL小鼠腦勻漿；空白對照組加入21.5μL生理鹽水、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿；溶媒對照組加入21.5μL α-突觸核蛋白溶液（上海强耀生物科技有限公司，定制表達人α-突觸核蛋白，UniProtKB - P37840，1.0mg/mL）、4.6μL溶媒溶液、23.9μL小鼠腦勻漿；纖溶酶原組加入21.5mL α-突觸核蛋白溶液（1.0mg/mL）（1.0mg/mL）、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿。各組樣品加好後，37℃溫育6h後分別加入50μL 0.1%三氟乙酸溶液終止反應。

根據Tris-Tricine-SDS-PAGE凝膠製備試劑盒（Solarbio，P1320）配膠說明製備12%凝膠。各組樣品分別與4×上樣緩衝液（TaKaRa，e2139）以體積比爲3:1混勻後，100℃加熱5 min，冷却後離心2 min，然後取20μL上樣。電泳條件爲30V跑1.5h，然後100V電泳至膠底。電泳結束後剝取凝膠轉移到PVDF膜（GE，A29433753）上，電泳條件爲15V，2h。轉移後的PVDF膜浸泡在封閉液（5%脫脂乳液）中於4℃冰箱中封閉過夜，TBST（0.01M Tris-NaCl，pH7.6緩衝液）洗4次後，加入兔抗人α-突觸核蛋白抗體（Proteintech, 10842-1-AP）室溫孵育3h，TBST洗4次後，加入山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Abcam，ab6721)二抗室溫孵育1h，TBST洗4次後，將PVDF膜放於乾淨成像板上，加入Immobilon Western HRP Substrate（MILLIPORE，WBKLS0100）顯色，在生物分子成像儀下拍照並用Image J定量分析。

結果顯示，在帕金森模型小鼠腦勻漿中，纖溶酶原組α-突觸核蛋白的量明顯低於溶媒對照組，差異極顯著（**代表P＜0.01），且其聚合物的量均明顯低於溶媒對照組，差異極顯著（***代表P＜0.001）；在正常小鼠腦勻漿中，纖溶酶原組α-突觸核蛋白的量明顯低於溶媒對照組，差異極顯著（**代表P＜0.01），且其聚合物的量均明顯低於溶媒對照組，差異顯著（***代表P＜0.001）（圖25）。表明在帕金森模型小鼠和正常小鼠腦勻漿中，纖溶酶原可有效地降解人α-突觸核蛋白及其聚合物。

實施例 14 纖溶酶原促進 Pro-BDNF 在帕金森模型小鼠腦勻漿中裂解

取11~12周齡、18-25g的C57BL/6J雄性小鼠4隻。造模時間定在每日早上9點，空白對照組腹腔注射200μL生理鹽水；模型組腹腔注射35mg/kg/隻5mg/mL MPTP溶液，連續注射5天，建立帕金森模型^[5] 。MPTP溶液配製：取45mg MPTP（sigma，M0896）溶解在9mL 生理鹽水溶液中，配製最終濃度爲5mg/mL。造模完成後即造模第6天，所有小鼠進行曠場實驗，鑒定造模成功。所有小鼠犧牲後取整個腦部並稱重，按150mg組織/mLPBS分別加入1×PBS（Thermo Fisher，pH7.4；10010-031，4℃下勻漿（1min，3-4次），勻漿後於4℃離心（12000rpm，20min），取上清液即腦勻漿液置於新的EP管中。

取Eppendorf (EP) 管分別設爲①空白組、②空白對照組、③溶媒對照組、④纖溶酶原組，各組設置5個平行。空白組加入21.5μL生理鹽水、4.6μL溶媒溶液（10 mM 檸檬酸鈉，2%鹽酸精氨酸，3%甘露醇，pH 7.4）、23.9μL小鼠腦勻漿；空白對照組加入21.5μL生理鹽水、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿；溶媒對照組加入21.5μL Pro-BDNF（南京金斯瑞，定制表達人Pro-BDNF，UniProtKB - P23560，1.0mg/mL）、4.6μL溶媒溶液、23.9μL小鼠腦勻漿；纖溶酶原組加入21.μL Pro-BDNF（1.0mg/mL）、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿。各組樣品加好後，37℃溫育6h後分別加入50μL 0.1%三氟乙酸溶液終止反應。

根據SDS-PAGE配膠說明製備12%凝膠。各組樣品分別與4×上樣緩衝液（TaKaRa，e2139）以體積比爲3:1混勻後，100℃加熱5 min，冷却後離心2 min，然後取20μL上樣。電泳條件爲30V跑45min，然後100V電泳至膠底。電泳結束後剝凝膠於1‰考馬斯亮藍染色液（1g考馬斯亮藍R250溶於1000ml乙醇：冰醋酸：純化水體積比爲5:2:13的混合液中）染色30min，再用脫色液（純化水：冰醋酸：無水乙醇=17:2:1體積比混合）脫色至乾淨。凝膠在生物分子成像儀下拍照並定量掃描分析。

腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是一類分子量爲12.3 kD 的鹼性蛋白質，由119 個氨基酸殘基構成，並含有3 對二硫鍵，在體內以二聚體的形式存在，以BDNF前體的形式合成，BDNF前體（Pro-BDNF）可經酶解作用裂解形成成熟的BDNF。文獻報導Pro-BDNF與其裂解形成的成熟的BDNF具有相反的作用。Pro-BDNF促進神經細胞雕亡，降低神經突觸可塑性。成熟的BDNF及其受體廣泛分布於中樞神經系統內，在中樞神經系統發育過程中，對神經元存活、分化、生長發育起重要作用，並能防止神經元受損傷死亡，改善神經元的病理狀態，促進受損傷神經元再生及分化等生物效應，而且亦是成熟的中樞及周圍神經系統的神經元維持生存及正常生理功能所必需的^[24] 。

結果顯示，在帕金森模型小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原組Pro-BDNF的量明顯低於溶媒對照組，差異極顯著（***代表P＜0.001）（圖26）。提示纖溶酶原能夠促進帕金森模型小鼠腦勻漿中Pro-BDNF裂解。

實施例 15 纖溶酶原促進 Pro-BDNF 在帕金森模型小鼠腦勻漿中裂解形成成熟的 BDNF

取11~12周齡、18-25g的C57BL/6J雄性小鼠8隻，造模前1天稱重，根據體重隨機分爲2組，空白對照組4隻，模型組4隻。造模時間定在每日早上9點，空白對照組腹腔注射200μL生理鹽水；模型組腹腔注射35mg/kg/隻5mg/mL MPTP溶液，連續注射5天，建立帕金森模型^[5] 。MPTP溶液配製：取45mg MPTP（sigma，M0896）溶解在9mL 生理鹽水溶液中，配製最終濃度爲5mg/mL。造模完成後即造模第6天，所有小鼠進行曠場實驗，鑒定造模成功。所有小鼠犧牲後取整個腦部並稱重，按150mg組織/mLPBS分別加入1×PBS（Thermo Fisher，pH7.4；10010-031，4℃下勻漿（1min，3-4次），勻漿後於4℃離心（12000rpm，20min），取上清液即腦勻漿液置於新的EP管中。

取Eppendorf (EP) 管分別設爲①空白組、②空白對照組、③溶媒對照組、④纖溶酶原組，各組設置5個平行。空白對照組加入21.5μL生理鹽水、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿；溶媒對照組加入21.5μL Pro-BDNF（南京金斯瑞，定制表達人Pro-BDNF，UniProtKB - P23560，1.0mg/mL）、4.6μL溶媒溶液（檸檬酸-檸檬酸鈉溶液）、23.9μL小鼠腦勻漿；纖溶酶原組加入21.μL Pro-BDNF（1.0mg/mL）、4.6μL纖溶酶原溶液（2mg/mL）、23.9μL小鼠腦勻漿。各組樣品加好後，37℃溫育6h後分別加入50μL 0.1%三氟乙酸溶液終止反應。

根據SDS-PAGE配膠說明製備12%凝膠。各組樣品分別與4×上樣緩衝液（TaKaRa，e2139）以體積比爲3:1混勻後，100℃加熱5 min，冷却後離心2 min，然後取20μL上樣。電泳條件爲30V跑45min，然後100V電泳至膠底。電泳結束後剝取凝膠轉移到活化的PVDF膜（GE，A29433753）上，電泳條件爲15V，2.5h。轉移後的PVDF膜浸泡在封閉液（5%脫脂乳液）中於4℃冰箱中封閉過夜，TBST（0.01M Tris-NaCl，pH7.6緩衝液）洗4次後，加入兔抗人BDNF抗體（Boster Biological Technology, PB9075）室溫孵育3h，TBST洗4次後，加入山羊抗兔 IgG (HRP)抗體(Abcam，ab6721)二抗室溫孵育1h，TBST洗4次後，將PVDF膜放於乾淨成像板上，加入Immobilon Western HRP Substrate（MILLIPORE，WBKLS0100）顯色，在生物分子成像儀下拍照並用Image J定量分析。

結果顯示，在帕金森模型小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原組Pro-BDNF的量明顯低於溶媒對照組，差異顯著（*代表P＜0.05，***表示P＜0.001）；纖溶酶原組BDNF的量明顯高於溶媒對照組，差異極爲顯著（圖27）。提示纖溶酶原能夠促進帕金森模型小鼠腦勻漿液Pro-BDNF裂解和成熟BDNF形成。

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無

圖1給予纖溶酶原14天後帕金森模型小鼠曠場實驗總運動路程統計結果。結果顯示，空白對照組小鼠在實驗期間會運動一定路程；給藥纖溶酶原組小鼠總運動路程明顯短於溶媒對照組，統計差異顯著（*表示P＜0.05），且給纖溶酶原組小鼠總運動路程接近於空白對照組。說明纖溶酶原可增强帕金森模型小鼠趨避性，緩解其焦慮。

圖2給予纖溶酶原14天後帕金森模型小鼠曠場實驗邊界區靜息時間率統計結果。結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的邊界區靜息時間率；給纖溶酶原組小鼠邊界區靜息時間率明顯大於溶媒對照組，統計差異極爲顯著（**表示P＜0.01），且給纖溶酶原組邊界區靜息時間率接近於空白對照組。說明纖溶酶原可增强帕金森模型小鼠趨避性，緩解其焦慮。

圖3給予纖溶酶原14天後帕金森模型小鼠曠場實驗邊界區運動路程統計結果。結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的邊界區運動路程；給纖溶酶原組小鼠邊界區運動路程明顯小於溶媒對照組，統計差異接近顯著（P=0.05），且給藥纖溶酶原組邊界區運動路程接近於空白對照組。說明纖溶酶原可增强帕金森模型小鼠趨避性，緩解其焦慮。

圖4給予纖溶酶原14天後帕金森模型小鼠曠場實驗邊界區運動路程百分率統計結果。結果顯示，空白對照組具有一定的邊界區運動路程百分率；給纖溶酶原組小鼠邊界區運動路程百分率明顯大於溶媒對照組，統計極爲差異顯著（**表示P＜0.01），且給纖溶酶原組邊界區運動路程百分率接近於空白對照組。說明纖溶酶原可增强帕金森模型小鼠趨避性，緩解其焦慮。

圖5 給予纖溶酶原14天後帕金森模型小鼠曠場實驗邊界區慢速運動時間百分率計算結果。結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的邊界區慢速運動時間百分率；給藥纖溶酶原組小鼠邊界慢速運動時間百分率明顯低於溶媒對照組，統計差異極爲顯著（**表示P＜0.01）；且給纖溶酶原組邊界慢速運動時間率接近於空白對照組。說明纖溶酶原可增强帕金森模型小鼠趨避性，緩解其焦慮。

圖6 給予纖溶酶原14天後帕金森模型小鼠曠場實驗邊界區時間百分率統計結果。結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的邊界區時間百分率；給纖溶酶原組小鼠邊界區時間百分率高於溶媒對照組，統計差異接近顯著（P=0.06），且給藥纖溶酶原組邊界區時間百分率接近空白對照組。說明纖溶酶原可提高帕金森模型小鼠趨避性行爲水平，緩解其焦慮。

圖7 給予纖溶酶原14天後帕金森模型小鼠曠場實驗進入邊界區次數統計結果。結果顯示，空白對照組小鼠具有一定進入邊界區次數；給藥纖溶酶原組小鼠進入邊界區次數明顯少於溶媒組，統計差異顯著（*表示P＜0.05），且給藥纖溶酶原組小鼠進入邊界次數接近空白對照組。說明纖溶酶原可增强帕金森模型小鼠趨避性，緩解其焦慮。

圖8 給予纖溶酶原14天後帕金森模型小鼠曠場實驗中心區運動路程統計結果。結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的中心區運動路程；給藥纖溶酶原組小鼠中心區運動路程明顯低於溶媒對照組小鼠，統計差異顯著（*表示P＜0.05）；且給藥纖溶酶原組小鼠中心區運動路程接近空白對照組。說明纖溶酶原可增强帕金森模型小鼠趨避性，緩解其焦慮。

圖9 給予纖溶酶原14天後帕金森模型小鼠曠場實驗中心區運動路程百分率統計結果。結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的中心區運動路程百分率；給藥纖溶酶原組小鼠中心區運動路程百分率明顯低於溶媒對照組小鼠，統計差異顯著（*表示P＜0.05）；且給藥纖溶酶原組小鼠中心區運動路程百分率接近空白對照組。說明纖溶酶原可增强帕金森模型小鼠趨避性，緩解其焦慮。

圖10 給予纖溶酶原14天後帕金森模型小鼠曠場實驗中心區最大運動速度統計結果。結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的中心區最大運動速度；給藥纖溶酶原組小鼠中心區最大運動速度明顯小於溶媒對照組，統計差異極爲顯著（**表示P＜0.01），且給纖溶酶原組中心 區最大運動速度接近於空白對照組。說明纖溶酶原可增强帕金森模型小鼠趨避性，緩解其焦慮。

圖11 給予纖溶酶原14天後帕金森模型小鼠曠場實驗中心區時間百分率統計結果。結果顯示，空白對照組小鼠具有一定地進入中心區時間百分率；給藥纖溶酶原組小鼠中心區時間百分率明顯小於溶媒對照組，統計差異接近顯著（P=0.06）；且給纖溶酶原組小鼠進入中心區時間百分率接近於空白對照組。說明纖溶酶原可增强帕金森模型小鼠趨避性，緩解其焦慮。

圖12 給予纖溶酶原14天後帕金森模型小鼠曠場實驗進入中心區次數統計結果。結果顯示，空白對照組小鼠具有一定的進入中心區次數；給藥纖溶酶原組小鼠進入中心區次數明顯少於溶媒對照組，統計差異明顯（*表示P＜0.05）；且給藥纖溶酶原組小鼠進入中心區次數接近空白對照組。說明纖溶酶原可增强帕金森模型小鼠趨避性，緩解其焦慮。

圖13 給予纖溶酶原14天後帕金森模型小鼠曠場實驗運動軌跡代表性圖片。結果顯示，空白對照組小鼠幾乎沒有中心區活動；給藥纖溶酶原組小鼠表現出中心區活動明顯減少的趨勢相比於溶媒對照組，且接近於空白對照組小鼠。說明纖溶酶原可增强帕金森模型小鼠趨避性，緩解其焦慮。

圖14A-C給予纖溶酶原14天後帕金森模型小鼠黑質DTA免疫組化結果。A爲空白對照組，B爲溶媒對照組，C爲給纖溶酶原組。結果顯示，空白對照組小鼠黑質多巴胺神經元表達一定量的DTA（箭頭標識），溶媒組小鼠黑質DTA的表達量低於空白對照組，而給藥纖溶酶原組小鼠黑質DTA的表達量高於溶媒組，且接近空白對照組。該結果表明纖溶酶原可促進帕金森模型小鼠黑質DTA的表達。

圖15A-D 給予纖溶酶原14天後帕金森模型小鼠紋狀體焦油紫染色結果。A爲空白對照組，B爲溶媒對照組，C爲給纖溶酶原組，D爲紋狀體尼氏體數量分析結果。結果顯示，空白對照組小鼠紋狀體神經元存在一定數量的尼氏體（箭頭標識）；溶媒對照組小鼠紋狀體神經元尼氏體數量明顯多於空白對照組，且統計差異接近顯著（P=0.085）；給纖溶酶原組小鼠紋狀體神經元尼氏體數量與空白對照組無明顯差異，但明顯低於溶媒對照組，且統計差異顯著（*表示P＜0.05）。該結果表明纖溶酶原能夠影響帕金森模型小鼠紋狀體尼氏體數量。

圖16A-C 給予纖溶酶原14天後帕金森模型小鼠黑質焦油紫染色結果。A爲空白對照組，B爲溶媒對照組，C爲給纖溶酶原組。結果顯示，空白對照組小鼠黑質中有一定量的尼氏體（箭頭標識）；溶媒對照組小鼠黑質中尼氏體數少於空白對照組；給纖溶酶原組小鼠黑質尼氏體數高於溶媒組。該結果表明纖溶酶原可促進帕金森模型小鼠黑質尼氏體恢復。

圖17A-C 給予纖溶酶原14天後帕金森模型小鼠黑質GLP-1R免疫組化結果。A爲溶媒PBS組，B爲給纖溶酶原組，C爲平均光密度定量分析結果。結果顯示，給纖溶酶原組小鼠黑質GLP-1R的表達量（箭頭標識）明顯多於溶媒PBS對照組，且統計差異顯著（*表示P＜0.05）。該結果表明，纖溶酶原能夠促進帕金森模型小鼠黑質GLP-1R的表達。

圖18A-D 給予纖溶酶原14天後帕金森模型小鼠黑質TH免疫組化結果。A爲空白對照組，B爲溶媒PBS組，C爲給纖溶酶原組，D爲定量分析結果。結果顯示，空白對照組小鼠黑質中存在一定量的TH陽性細胞（箭頭標識），溶媒組小鼠黑質中TH陽性細胞數減少，給纖溶酶原組小鼠黑質中TH陽性細胞數明顯高於溶媒組。該結果表明纖溶酶原可恢復帕金森模型小鼠黑質中TH陽性細胞。

圖19 A-C給予纖溶酶原14天後帕金森模型小鼠黑質Iba-1免疫組化結果。A爲空白對照組，B爲溶媒PBS組，C爲給纖溶酶原組。結果顯示，空白對照組小鼠黑質有一定量的小膠質細胞（箭頭標識），溶媒組小鼠黑質中小膠質細胞數高於空白對照組，給纖溶酶原組小鼠黑質中小膠質細胞數明顯低於溶媒對照組，且接近於空白對照組。該結果顯示纖溶酶原可促使帕金森模型小鼠黑質小膠質細胞恢復。

圖20 A-C 給予纖溶酶原14天後帕金森模型小鼠紋狀體LFB免疫組化結果。A爲空白對照組，B爲溶媒PBS組，C爲給纖溶酶原組。結果顯示，空白對照組小鼠紋狀體存在一定量的髓鞘，溶媒組小鼠紋狀體髓鞘數少於空白對照組，給纖溶酶原組小鼠紋狀體髓鞘數明顯高於溶媒組。該結果顯示纖溶酶原可使帕金森模型小鼠紋狀體髓鞘恢復。

圖21 A-D給予纖溶酶原14天後帕金森模型小鼠黑質α-突觸核蛋白（α-synuclein）免疫組化結果。A爲空白對照組，B爲溶媒組，C爲給纖溶酶原組，D爲平均光密度定量分析結果。結果顯示，空白對照組小鼠黑質僅有少量的α-突觸核蛋白；溶媒組小鼠黑質α-突觸核蛋白的量明顯高於空白對照組（*表示P＜0.05）；給纖溶酶原組小鼠黑質α-突觸核蛋白的量明顯低於溶媒組，且統計差異顯著（*表示P＜0.05）；給纖溶酶原組小鼠黑質α-突觸核蛋白的量趨近於空白對照組的。說明纖溶酶原可減少帕金森模型小鼠黑質α-突觸核蛋白的表達，改善神經損傷變性。

圖22 A-D給予纖溶酶原14天後帕金森模型小鼠紋狀體NF免疫組化結果。A爲空白對照組，B爲溶媒組，C爲給纖溶酶原組，D爲平均光密度定量分析結果。結果顯示，空白對照組小鼠紋狀體有一定量的NF（箭頭標識）；溶媒組小鼠紋狀體NF的量低於空白對照組；給纖溶酶原組小鼠紋狀體中NF的量明顯高於溶媒組，且統計差異極顯著（**表示P＜0.01）。說明纖溶酶原可促使帕金森模型小鼠紋狀體NF表達的恢復，改善帕金森紋狀體軸索損傷。

圖23 A-C給予纖溶酶原14天後帕金森模型小鼠紋狀體GFAP免疫組化結果。A爲空白對照組，B爲溶媒組，C爲給纖溶酶原組。結果顯示，空白對照組小鼠紋狀體有少量的GFAP表達（箭頭標識），溶媒組小鼠紋狀體GFAP的表達明顯高於空白對照組；給纖溶酶原組小鼠紋狀體GFAP的表達低於溶媒組。說明纖溶酶原可減少帕金森模型小鼠紋狀體GFAP表達，減輕紋狀體損傷。

圖24 A-D在小鼠腦勻漿中纖溶酶原對α-突觸核蛋白的作用結果。A爲Tricine-page，B、C、D分別爲α-突觸核蛋白、聚合物a、聚合物b條帶掃描定量分析結果。結果顯示，在帕金森模型小鼠腦勻漿中，纖溶酶原組α-突觸核蛋白的量明顯低於溶媒對照組（***代表P＜0.001），且其聚合物a、b的量均明顯低於溶媒對照組（**代表P＜0.01，***代表P＜0.001）；在正常小鼠腦勻漿中，纖溶酶原組α-突觸核蛋白的量明顯低於溶媒對照組（***代表P＜0.001），且其聚合物a、b的量均明顯低於溶媒對照組（*代表P＜0.05，**代表P＜0.01）。表明在帕金森模型小鼠和正常小鼠腦勻漿中，纖溶酶原可有效地促進人α-突觸核蛋白及其聚合物降解。

圖25 A-C 在小鼠腦勻漿中纖溶酶原對重組人α-突觸核蛋白的作用結果。A爲Western-blotting圖，B、C分別爲α-突觸核蛋白、聚合物條帶掃描定量分析結果。結果顯示，在帕金森模型小鼠腦勻漿中，纖溶酶原組α-突觸核蛋白的量明顯低於溶媒對照組（**代表P＜0.01），且其聚合物的量均明顯低於溶媒對照組（***代表P＜0.001）；在正常小鼠腦勻漿中，纖溶酶原組α-突觸核蛋白的量明顯低於溶媒對照組（**代表P＜0.01），且其聚合物的量均明顯低於溶媒對照組（***代表P＜0.001）。表明在帕金森模型小鼠和正常小鼠腦勻漿中，纖溶酶原可有效地促進重組人α-突觸核蛋白及其聚合物降解。

圖26 A-B在帕金森模型小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原對重組人Pro-BDNF的作用，A爲SDS-PAGE成像圖片，B爲SDS-PAGE條帶定量分析結果。結果顯示，在帕金森模型小鼠腦勻漿液中，給藥纖溶酶原組Pro-BDNF的量明顯低於溶媒對照組，差異極顯著（***代表P＜0.001）。提示纖溶酶原能夠促進帕金森模型小鼠腦勻漿中重組人Pro-BDNF裂解。

圖27A-C在帕金森模型小鼠腦勻漿液中，纖溶酶原對重組人Pro-BDNF的作用。A爲Western blot成像圖片，B爲Western blot中Pro-BDNF條帶光密度(OD)值分析結果，C爲Western blot中 BDNF條帶光密度(OD)值分析結果。結果顯示，在帕金森模型小鼠腦勻漿液中，給藥纖溶酶原組Pro-BDNF的量明顯低於溶媒對照組，差異顯著（*代表P＜0.05，***表示P＜0.001）；給藥纖溶酶原組BDNF的量明顯高於溶媒對照組，差異極爲顯著。提示纖溶酶原能夠促進帕金森模型小鼠腦勻漿液重組人Pro-BDNF裂解和成熟BDNF形成。

無

Claims (14)

1. 一種選自如下的一種或多種化合物在製備預防和治療帕金森氏症的藥物的用途，所述如下的一種或多種化合物選自：纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分、能夠直接激活纖維蛋白溶酶原或通過激活纖維蛋白溶酶原激活途徑上游組分而間接激活纖維蛋白溶酶原的化合物、模擬纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶之活性的化合物、能夠上調纖維蛋白溶酶原或纖維蛋白溶酶原激活劑表達的化合物、纖維蛋白溶酶原類似物、纖維蛋白溶酶類似物、tPA或uPA類似物和纖溶抑制劑的拮抗劑。
2. 如請求項1所述的用途，其中所述纖維蛋白溶酶原激活途徑的組分選自纖維蛋白溶酶原、重組人纖維蛋白溶酶、Lys-纖維蛋白溶酶原、Glu-纖維蛋白溶酶原、纖維蛋白溶酶、含有纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶的一個或多個kringle結構域和蛋白酶結構域的纖維蛋白溶酶原和纖維蛋白溶酶變體及類似物、小纖維蛋白溶酶原(mini-plasminogen)、小纖維蛋白溶酶(mini-plasmin)、微纖溶酶原（micro-plasminogen）、微纖溶酶（micro-plasmin）、delta-纖溶酶原、delta-纖溶酶（delta-plasmin）、纖維蛋白溶酶原激活劑、tPA和uPA。
3. 如請求項1的用途，所述纖溶抑制劑的拮抗劑爲PAI-1、補體C1抑制物、α2抗纖溶酶或α2巨球蛋白的抑制劑，例如抗體。
4. 如請求項1-3任一項的用途，其中所述化合物對帕金森氏症受試者具有如下一項或多項作用：促進記憶功能恢復、改善認知能力、促進黑質DTA表達、促進紋狀體尼氏體恢復、促進黑質GLP-1R表達、增加黑質TH陽性細胞數量、促進紋狀體髓鞘修復、促進腦組織中α-突觸核蛋白降解、促使紋狀體NF表達、促進軸索損傷修復、減少紋狀體GFAP表達、減輕紋狀體神經元損傷、促進腦組織中Pro-BDNF裂解形成BDNF、緩解抑鬱或焦慮症狀。
5. 如請求項1-4任一項的用途，其中所述化合物爲纖溶酶原。
6. 如請求項1-5任一項的用途，其中所述纖溶酶原爲人全長纖溶酶原或其保守取代變體。
7. 如請求項1-5任一項的用途，其中所述纖溶酶原與序列2具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖溶酶原的賴氨酸結合活性或蛋白水解活性。
8. 如請求項1-5任一項的用途，所述纖溶酶原包含與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列、並且仍然具有纖溶酶原的蛋白水解活性的蛋白質。
9. 如請求項1-5任一項的用途，所述纖溶酶原選自Glu-纖溶酶原、Lys-纖溶酶原、小纖溶酶原、微纖溶酶原、delta-纖溶酶原或它們的保留纖溶酶原的蛋白水解活性的變體。
10. 如請求項1-5任一項的用途，所述纖溶酶原包含序列2、6、8、10、12所示的氨基酸序列或包含序列2、6、8、10、12所示氨基酸序列的保守取代變體。
11. 如請求項1-10任一項的用途，其中所述化合物與一種或多種其他治療方法或藥物聯合使用。
12. 如請求項11的用途，其中所述其他治療方法包括細胞治療（包括幹細胞治療）和物理治療。
13. 如請求項11的用途，其中所述其他藥物爲治療帕金森氏症的其它藥物。
14. 如請求項1-13任一項的用途，其中所述化合物通過鼻腔吸入、霧化吸入、滴鼻液、滴眼液、滴耳液、靜脈內、腹膜內、皮下、顱內、鞘內、動脈內(例如經由頸動脈)或肌肉內給藥。

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