TW202130661A - 抗ox40抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及尤其是新型抗OX40抗體，包含所述抗OX40抗體的組合物，編碼所述抗OX40抗體的核酸，製備所述抗OX40抗體的方法，和所述抗OX40抗體的用途。

Description

抗OX40抗體及其用途
發明領域
此申請案主張提申日期本發明涉及尤其是新型抗OX40抗體，包含所述抗OX40抗體的組合物，編碼所述抗OX40抗體的核酸，製備所述抗OX40抗體的方法，和所述抗OX40抗體的用途。
發明背景
具有實體腫瘤的患者中的抗腫瘤免疫反應已經通過使用生物製劑進行治療而增強。例如，兩種抗PD-1單株抗體：納武單抗(nivolumab)(OPDIVO®)和派姆單抗(pembrolizumab)(KEYTRUDA®)，已在美國和歐盟批准用於治療不可切除或轉移性黑色素瘤和轉移性非小細胞肺癌等疾病。使用這些藥物治療患者已經產生通過無進展存活期和/或總體存活期的改善而衡量的抗腫瘤反應。本領域仍然需要更多的癌症治療產品和方法以補充現有標準護理。
PD-1和CTLA-4在T細胞活化過程中發揮免疫抑制作用，從而抑制T細胞對腫瘤細胞的免疫殺傷功能；因而針對這兩個靶點的阻斷性單株抗體可以解除這種免疫抑制，恢復T細胞抗腫瘤免疫功能。除了這樣的抑制型免疫檢查點分子之外，活化型免疫檢查點分子正逐漸成為藥物研發的新靶標。
活化型免疫檢查點分子，主要指T細胞活化的共刺激信號分子-T細胞共刺激受體，屬於腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)家族，用於調節T細胞的增殖、活化和分化，包括OX40、CD40、4-1BB和GITR等。
OX40受體，也稱為CD134和TNFRSF4(腫瘤壞死因子受體超家族成員4)，是TNFR超家族受體的成員，其不在靜息初始T細胞上組成型表現，與CD28不同。OX40是次級共刺激免疫檢查點分子，在活化後24至72小時表現；其配體OX40L(也成為CD252、TNFSF4)也不在靜息抗原呈現細胞上表現，而是在其活化後表現。OX40的表現依賴於T細胞的完全活化。
OX40與其配體OX40L結合傳遞共刺激信號。OX40和OX40L的相互作用能夠在OX40的胞內區域內招募TNFR相關(TRAFs)分子，形成包含IKKα和IKKβ以及PI3k和PKB(Akt)的信號傳導複合物；OX40還與TCR信號協同作用，通過未知機制增強細胞內Ca2+ ，從而增強NFAT入核。OX40可活化經典的NF-κB1途徑或非經典的NF-κB2途徑、PI3k/PKB和NFAT途徑，進而調控制T細胞分裂和存活的基因，以及促進細胞介素基因的轉錄以及細胞介素受體的表現，對於細胞存活至關重要。OX40信號傳導會引起包括CTLA-4和Foxp3的下調。
當OX40與其配體OX40L結合時，有助於提高免疫系統反應能力：1. 增加效應T細胞和記憶T細胞的存活和擴增，增加細胞介素(例如IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ)的分泌；2. 降低調節性T細胞的免疫抑制活性，進一步放大T細胞活化效應。在腫瘤微環境中，免疫活化可導致OX40表現。可增強效應T細胞的活化和增殖，並抑制調節性T細胞，從而導致複雜的抗腫瘤免疫反應。目前在Clinical Trials網站上已經可以檢索到若干抗OX40抗體治療癌症的臨床專案。
本領域需要更多的新型抗OX40抗體以提供新的癌症治療選擇。
發明概要
本發明通過提供特異性結合和活化OX40的新型抗OX40抗體而滿足了上述需要。
在一個方面，本發明提供了一種分離的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含：具有SEQ ID NO: 1所示重鏈CDR1結構域，SEQ ID NO: 2所示重鏈CDR2結構域，和SEQ ID NO: 3所示重鏈CDR3結構域的重鏈可變區；和具有SEQ ID NO: 9所示輕鏈CDR1結構域，SEQ ID NO: 10所示輕鏈CDR2結構域，和SEQ ID NO: 11所示輕鏈CDR3結構域的輕鏈可變區。
在一個方面，本發明提供了一種分離的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含：具有SEQ ID NO: 17所示重鏈CDR1結構域，SEQ ID NO: 18所示重鏈CDR2結構域，和SEQ ID NO: 19所示重鏈CDR3結構域的重鏈可變區；和具有SEQ ID NO: 25所示輕鏈CDR1結構域，SEQ ID NO: 26所示輕鏈CDR2結構域，和SEQ ID NO: 27所示輕鏈CDR3結構域的輕鏈可變區。
在一個方面，本發明提供了一種分離的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含：具有SEQ ID NO: 33所示重鏈CDR1結構域，SEQ ID NO: 34所示重鏈CDR2結構域，和SEQ ID NO: 35所示重鏈CDR3結構域的重鏈可變區；和具有SEQ ID NO: 41所示輕鏈CDR1結構域，SEQ ID NO: 42所示輕鏈CDR2結構域，和SEQ ID NO: 43所示輕鏈CDR3結構域的輕鏈可變區。
在一個方面，本發明提供了一種抗體-藥物綴合物，其包含本文所述的OX40抗體或其抗原結合片段和另外的治療劑；優選地，所述抗OX40抗體或其抗原結合片段與所述另外的治療劑通過接頭連接。
在一個方面，本發明提供了一種核酸，其編碼本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段。
在一個方面，本發明提供了一種表現載體，其包含本文所述的核酸。
在一個方面，本發明提供了一種宿主細胞，其包含本文所述的核酸或本文所述的表現載體。
在一個方面，本發明提供了一種用於產生本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段的方法，其包括在適合於抗體或其抗原結合片段表現的條件下培養本文所述的宿主細胞，和從培養基中回收表現的抗體或其抗原結合片段。
在一個方面，本發明提供了一種藥物組合物，其包含本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，或本文所述的抗體-藥物綴合物，或本文所述的核酸，或本文所述的表現載體，及藥學上可接受的載體。
在一個方面，本發明提供了本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，或本文所述的抗體-藥物綴合物，或本文所述的藥物組合物，其用於治療癌症。
在一個方面，本發明提供了一種用於治療癌症的方法，其包括向需要的受試者施用治療有效量的本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，或本文所述的抗體-藥物綴合物，或本文所述的藥物組合物，從而治療所述癌症。
在一個方面，本發明提供了本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，或本文所述的抗體-藥物綴合物，或本文所述的藥物組合物，在製備用於治療癌症的藥物中的用途。
在一個方面，本發明提供了本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，或本文所述的抗體-藥物綴合物，或本文所述的藥物組合物，其用於下述一項或多項：抑制Treg功能(例如抑制Treg的遏制性功能)、殺死表現OX40的細胞(例如表現高位準OX40的細胞)、提高效應T細胞功能和/或提高記憶T細胞功能、降低腫瘤免疫、增強T細胞功能和/或消減表現OX40的細胞。
在一個方面，本發明提供了本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，或本文所述的抗體-藥物綴合物，或本文所述的藥物組合物，在製備用於治療下述一項或多項的藥物中的用途：抑制Treg功能(例如抑制Treg的遏制性功能)、殺死表現OX40的細胞(例如表現高位準OX40的細胞)、提高效應T細胞功能和/或提高記憶T細胞功能、降低腫瘤免疫、增強T細胞功能和/或消減表現OX40的細胞。
在一個方面，本發明提供了一種藥物組合，其包含本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，或本文所述的抗體-藥物綴合物，或本文所述的藥物組合物，以及一種或多種另外的治療劑。
在一個方面，本發明提供了一種試劑盒，其包括本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，或本文所述的抗體-藥物綴合物，或本文所述的藥物組合物，優選其進一步包括給藥裝置。
較佳實施例之詳細說明
在一個方面，本發明提供了一種分離的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含：具有SEQ ID NO: 1所示重鏈CDR1結構域，SEQ ID NO: 2所示重鏈CDR2結構域，和SEQ ID NO: 3所示重鏈CDR3結構域的重鏈可變區；和具有SEQ ID NO: 9所示輕鏈CDR1結構域，SEQ ID NO: 10所示輕鏈CDR2結構域，和SEQ ID NO: 11所示輕鏈CDR3結構域的輕鏈可變區。
在一個方面，本發明提供了一種分離的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含：具有SEQ ID NO: 17所示重鏈CDR1結構域，SEQ ID NO: 18所示重鏈CDR2結構域，和SEQ ID NO: 19所示重鏈CDR3結構域的重鏈可變區；和具有SEQ ID NO: 25所示輕鏈CDR1結構域，SEQ ID NO: 26所示輕鏈CDR2結構域，和SEQ ID NO: 27所示輕鏈CDR3結構域的輕鏈可變區。
在一個方面，本發明提供了一種分離的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含：具有SEQ ID NO: 33所示重鏈CDR1結構域，SEQ ID NO: 34所示重鏈CDR2結構域，和SEQ ID NO: 35所示重鏈CDR3結構域的重鏈可變區；和具有SEQ ID NO: 41所示輕鏈CDR1結構域，SEQ ID NO: 42所示輕鏈CDR2結構域，和SEQ ID NO: 43所示輕鏈CDR3結構域的輕鏈可變區。
在一個實施方式中，本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO: 4所示重鏈可變區，或與SEQ ID NO: 4所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的重鏈可變區；和SEQ ID NO: 12所示輕鏈可變區，或與SEQ ID NO: 12所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的輕鏈可變區。
在一個實施方式中，本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO: 20所示重鏈可變區，或與SEQ ID NO: 20所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的重鏈可變區；和SEQ ID NO: 28所示輕鏈可變區，或與SEQ ID NO: 28所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的輕鏈可變區。
在一個實施方式中，本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO: 36所示重鏈可變區，或與SEQ ID NO: 36所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的重鏈可變區；和SEQ ID NO: 44所示輕鏈可變區，或與SEQ ID NO: 44所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的輕鏈可變區。
在一個實施方式，本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段進一步包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區；優選地，所述重鏈恆定區為SEQ ID NO: 5或21所示重鏈恆定區，或與SEQ ID NO: 5或21所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的重鏈恆定區；和/或優選地，所述輕鏈恆定區為SEQ ID NO: 13所示輕鏈恆定區，或與SEQ ID NO: 13所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的輕鏈恆定區。
在一個實施方式中，本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段進一步包含連接到所述重鏈可變區的重鏈信號肽和/或連接到所述輕鏈可變區的重鏈信號肽；優選地，所述重鏈信號肽為SEQ ID NO: 6所示重鏈信號肽，或與SEQ ID NO: 6所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的重鏈信號肽；和/或優選地，所述輕鏈信號肽為SEQ ID NO: 14所示輕鏈信號肽，或與SEQ ID NO: 14所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的輕鏈信號肽。
在一個實施方式中，本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段為IgG抗體或其抗原結合片段，優選為IgG1抗體或其抗原結合片段。
在一個實施方式中，本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段為單株抗體或其抗原結合片段。
在一個實施方式中，本文所述的抗OX40抗原結合片段為Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv或sdAb。
在一個方面，本發明提供了一種抗體-藥物綴合物，其包含根據本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段和另外的治療劑；優選地，所述抗OX40抗體或其抗原結合片段與所述另外的治療劑通過接頭連接。
在一個方面，本發明提供了一種核酸，其編碼本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段。
在一個實施方式中，本文所述的核酸包含： (a)SEQ ID NO: 49所示重鏈可變區核苷酸編碼序列和/或SEQ ID NO: 51所示輕鏈可變區核苷酸編碼序列； (b)SEQ ID NO: 53所示重鏈可變區核苷酸編碼序列和/或SEQ ID NO: 55所示輕鏈可變區核苷酸編碼序列；或 (c)SEQ ID NO: 57所示重鏈可變區核苷酸編碼序列和/或SEQ ID NO: 59所示輕鏈可變區核苷酸編碼序列；
優選地，所述核酸進一步包含SEQ ID NO: 50或54所示重鏈恆定區核苷酸編碼序列和/或SEQ ID NO: 52所示輕鏈恆定區核苷酸編碼序列。
在一個方面，本發明提供了一種表現載體，其包含本文所述的核酸。
在一個方面，本發明提供了一種宿主細胞，其包含本文所述的核酸或表現載體。
在一個方面，本文提供了一種用於產生本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段的方法，其包括在適合於抗體或其抗原結合片段表現的條件下培養本文所述的宿主細胞，和從培養基中回收表現的抗體或其抗原結合片段。
在一個方面，本發明提供了一種藥物組合物，其包含本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，或本文所述的抗體-藥物綴合物，或本文所述的核酸，或本文所述的表現載體，及藥學上可接受的載體。
在一個實施方式中，本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，或本文所述的抗體-藥物綴合物，或本文所述的藥物組合物用於治療癌症。在一個實施方式中，所述癌症選自鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鱗癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包括胃腸癌和胃腸基質癌)、胰腺癌、成膠質細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝瘤、乳腺癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌，肛門癌、陰莖癌、黑色素瘤、淺表擴散性黑色素瘤、惡性雀斑樣痣黑色素瘤、肢端黑色素瘤、結節性黑色素瘤、多發性骨髓瘤和B細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、毛細胞性白血病、慢性成髓細胞性白血病、和移植後淋巴增殖性病症(PTLD)、以及與瘢痣病、水腫(例如與腦瘤有關的)和梅格斯氏(Meigs)綜合症有關的異常血管增殖、腦瘤和腦癌、以及頭頸癌，及相關轉移。
在一個方面，本發明提供了一種用於治療癌症的方法，其包括向需要的受試者施用治療有效量的本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，或本文所述的抗體-藥物綴合物，或本文所述的藥物組合物，從而治療所述癌症。在一個實施方式中，所述癌症選自鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鱗癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包括胃腸癌和胃腸基質癌)、胰腺癌、成膠質細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝瘤、乳腺癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌，肛門癌、陰莖癌、黑色素瘤、淺表擴散性黑色素瘤、惡性雀斑樣痣黑色素瘤、肢端黑色素瘤、結節性黑色素瘤、多發性骨髓瘤和B細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、毛細胞性白血病、慢性成髓細胞性白血病、和移植後淋巴增殖性病症(PTLD)、以及與瘢痣病、水腫(例如與腦瘤有關的)和梅格斯氏(Meigs)綜合症有關的異常血管增殖、腦瘤和腦癌、以及頭頸癌，及相關轉移。
在一個方面，本發明提供了本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，或本文所述的抗體-藥物綴合物，或本文所述的藥物組合物，在製備用於治療癌症的藥物中的用途。在一個實施方式中，所述癌症選自鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鱗癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包括胃腸癌和胃腸基質癌)、胰腺癌、成膠質細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝瘤、乳腺癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌，肛門癌、陰莖癌、黑色素瘤、淺表擴散性黑色素瘤、惡性雀斑樣痣黑色素瘤、肢端黑色素瘤、結節性黑色素瘤、多發性骨髓瘤和B細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、毛細胞性白血病、慢性成髓細胞性白血病、和移植後淋巴增殖性病症(PTLD)、以及與瘢痣病、水腫(例如與腦瘤有關的)和梅格斯氏(Meigs)綜合症有關的異常血管增殖、腦瘤和腦癌、以及頭頸癌，及相關轉移。
在一個方面，本文提供了本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，或本文所述的抗體-藥物綴合物，或本文所述的藥物組合物用於下述一項或多項：抑制Treg功能(例如抑制Treg的遏制性功能)、殺死表現OX40的細胞(例如表現高位準OX40的細胞)、提高效應T細胞功能和/或提高記憶T細胞功能、降低腫瘤免疫、增強T細胞功能和/或消減表現OX40的細胞。
在一個方面，本文提供了本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，或本文所述的抗體-藥物綴合物，或本文所述的藥物組合物在製備用於治療下述一項或多項的藥物中的用途：抑制Treg功能(例如抑制Treg的遏制性功能)、殺死表現OX40的細胞(例如表現高位準OX40的細胞)、提高效應T細胞功能和/或提高記憶T細胞功能、降低腫瘤免疫、增強T細胞功能和/或消減表現OX40的細胞。
在一個方面，本發明提供了一種藥物組合，其包含本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，或本文所述的抗體-藥物綴合物，或本文所述的藥物組合物，以及一種或多種另外的治療劑。
在一個方面，本發明提供了一種試劑盒，其包括本文所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，或本文所述的抗體-藥物綴合物，或本文所述的藥物組合物，優選其進一步包括給藥裝置。
要理解，可以組合本文所述各個實施方式的一個、一些、或所有特性以形成本發明的其它實施方式。本發明的這些和其它方面對本領域技術人員會變得顯而易見。通過下面的詳述進一步描述本發明的這些和其它實施方式。
若當描述針對最大對映性比對時，兩個序列中的核苷酸或胺基酸的序列是相同的，則兩個多核苷酸或多肽序列被稱為是“相同的”。兩個序列之間的比較是通常通過於比較窗上比較所述序列而進行以識別及比較具有序列相似性的局部區域。如本文使用的“比較窗”是指具有至少約20個(通常30至約75或40至約50個)連續位置的區段，其中在兩個序列經最佳化比對後，可將序列與具有相同數量連續位置的參考序列進行比較。
用於比較的序列的最佳化比對可使用生物資訊學軟體(Inc.,Madison,WI)的套件中的程式，使用預設參數進行。此程式實施下列參考文獻中描述的數種比對方案：Dayhoff,M.O.,1978,A model of evolutionarychange in proteins-Matrices for detecting distant relationships.In Dayhoff,M.O.(編)Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical ResearchFoundation,Washington DC，第5卷，增刊3，第345至358頁；Hein J.,1990,UnifiedApproach to Alignment and Phylogenes，第626至645頁，Methods in Enzymology，第183卷，Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.及Sharp,P.M.,1989,CABIOS 5:151-153；Myers,E.W.及Muller W.,1988,CABIOS 4:11-17；Robinson,E.D.,1971,Comb.Theor.11:105；Santou,N.,Nes,M.,1987, Mol.Biol.Evol.4:406-425；Sneath,P.H.A.及Sokal,R.R.,1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of NumericalTaxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.及Lipman,D.J.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:726-730。
在一些實施方式中，“序列同一性的百分比”是通過在具有至少20個位置的比較的窗上比較兩個經最佳化比對的序列進行測定，其中比較窗中的多核苷酸或多肽序列的部分相較於針對兩個序列的最佳化比對的參考序列(其不包含添加或刪除)可包含20%或以下、通常5%至15%或10%至12%的添加或刪除(即，間隙)。該百分比是通過以下計算：通過測定其中兩個序列中均出現相同核酸鹼基或胺基酸殘基的位置數量以產生具有匹配位置的數量，將匹配位置的數量除以參考序列中的位置的總數量(即，窗尺寸)及使所述結果乘以100以產生序列同一性的百分比。
或者，變體亦可與天然基因或其的部分或補體基本上同源。這些多核苷酸變體可在中度嚴格的條件下與編碼天然抗體(或互補序列)的天然生成的DNA序列雜交。
合適的“中度嚴格的條件”包括在5X SSC，0.5%SDS，1.0mM EDTA(pH 8.0)的溶液中預洗；在50°C至65°C，5X SSC下雜交整夜；接著在65°C下清洗兩次，歷時20分鐘，及每次清洗使用含有0.1%SDS的2X、0.5X及0.2X SSC。
如本文使用，“高度嚴格的條件”或“高嚴格性條件”是那些下列者：(1)針對清洗採用低離子強度及高溫，例如在50°C下用0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉；(2)在雜交期間採用變性劑，諸如甲醯胺，例如，具有在pH 6.5下的0.1%牛血清白蛋白/0.1%聚蔗糖/0.1%聚乙烯吡咯啶酮/50mM磷酸鈉緩衝劑及在42°C下的750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉的50%(v/v)甲醯胺；或(3)在42°C下採用50%甲醯胺、5X SSC(0.75M NaCl、0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5X Denhardt雜交溶液、經聲處理的鮭魚精子DNA(50μg/mL)、0.1%SDS及10%硫酸葡聚糖，及在42°C下於0.2X SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)及在55°C下於50%甲醯胺中清洗，接著在55°C下於由含有EDTA的0.1X SSC組成的高嚴格性清洗液中進行清洗。本領域技術人員將知曉為適應諸如探針長度及類似物的因素，如何任選地調節溫度、離子強度等。
本領域普通技術人員將知曉由於遺傳密碼子的簡併性，因此存在許多編碼如本文描述的多肽的核苷酸序列。這些多核苷酸中的一些與具有任何天然基因的核苷酸序列具有最小同源性。然而，本發明具體預期因密碼子使用中的差異而改變的多核苷酸。此外，包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因是於本發明的範圍內。等位基因是由於核苷酸的一個或更多個突變諸如刪除、添加及/或取代而變化的內源性基因。所得mRNA及蛋白質可(但無需)具有經改變的結構或功能。等位基因可使用標準技術(諸如雜交、擴增及/或資料庫序列比較)進行識別。
本發明的多核苷酸可使用化學合成、重組方法或PCR獲得。化學多核苷酸合成的方法是本領域中熟知及本文中無需詳細描述。本領域技術人員可使用本文提供的序列及市售DNA合成劑以產生所需DNA序列。
就使用重組方法製備多核苷酸而言，可將包含所需序列的多核苷酸插入合適的載體內，及可將該載體進一步引入合適的宿主細胞內，以用於複製及擴增，如本文進一步討論。多核苷酸可通過本領域中已知的任何方式插入宿主細胞內。細胞是通過直接攝取、內吞作用、轉染、F-雜交或電穿孔以引入外源性多核苷酸而進行轉化。一經引入，外源性多核苷酸可作為非整合性載體(諸如質體)維持於細胞內或整合於宿主細胞基因體內。經如此擴增的多核苷酸可通過本領域內熟知的方法自宿主細胞分離。參見，例如，Sambrook等人，1989。
或者，PCR容許DNA序列的複製。。
RNA可通過在合適的載體中使用經分離的DNA及將其插入於合適的宿主細胞內獲得。當細胞複製及將DNA轉錄成RNA時，該RNA可然後使用本領域技術人員公知的方法進行分離。
合適的殖株及表現載體可包括各種元件，諸如啟動子、增強子及其他轉錄調節序列。該載體亦可經構建以容許接著將抗體可變結構域選殖至不同載體內。
合適的選殖載體可根據標準技術進行構建或可選擇自本領域中可獲得的大量選殖載體。儘管所選選殖載體可根據預期使用的宿主細胞而改變，但有用的選殖載體將通常具有自我複製的能力，可具有針對特定限制核酸內切酶的單一靶及/或可攜載針對可用於選擇含有該載體的殖株中的標記物的基因。合適的實例包括質體及細菌病毒，例如，pUC18、pUC19、Bluescript(例如，pBS SK+)及其衍生物，mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體DNA及穿梭載體(諸如pSA3及pAT28)。這些及許多其他選殖載體是可獲得自商業供貨商(諸如BioRad、Strategene及Invitrogen)。
進一步提供表現載體。表現載體通常是可複製多核苷酸構建體，其含有根據本發明的多核苷酸。其暗示表現載體必須於宿主細胞中可複製，以游離基因的形式或以染色體DNA的整體部分的形式。合適的表現載體包括(但不限於)質體、病毒載體，其包括腺病毒、腺相關病毒、反轉錄病毒、黏質體及揭示於PCT公開第WO 87/04462號中的表現載體。載體元件可通常包括(但不限於)下列中的一或更多者：信號序列；複製起點；一個或更多個標記基因；合適的轉錄控制元件(諸如啟動子、增強子及終止子)。就表現(即，轉譯)而言，亦通常需一個或更多個轉錄控制元件，諸如核糖體結合位點、轉譯起始位點及終止密碼子。
含有目的多核苷酸的載體及/或所述多核苷酸本身可通過許多適當方式中的任何一者引入宿主細胞內，所述方式包括電穿孔、採用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質的轉染；微粒轟擊(microprojectile bombardment)；脂質轉染；及感染(例如，其中該載體是感染劑，諸如痘瘡病毒)。引入載體或多核苷酸的選擇將通常取決於該宿主細胞的特徵。
本發明的抗體包括通過重組方法製備、表現、產生或分離的人類抗體，例如利用轉染入宿主細胞的重組表現載體表現的抗體(在以下部分II中進一步介紹)、從重組組合人類抗體文庫分離的抗體(在以下部分III中進一步介紹)、從人類免疫球蛋白基因轉基因動物(例如小鼠)分離的抗體(參見例如(Taylor，L.D.等(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)或者涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接為其他DNA序列的任何其他方法製備、表現、產生或分離的抗體。這樣的重組人抗體具有人種系免疫球蛋白序列來源的可變區和恆定區(參見Kabat，E.A.，et al.(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)。
可通過在宿主細胞中重組表現免疫球蛋白輕鏈基因和重鏈基因，製備本發明的抗體或抗體部分。為了重組表現抗體，用一個或多個攜帶編碼所述抗體的免疫球蛋白輕鏈和重鏈的DNA片段的重組表現載體轉染宿主細胞，使得所述輕鏈和重鏈在宿主細胞中表現，而且優選分泌入培養所述宿主細胞的培養基中，從該培養基中可回收所述抗體。標準重組DNA方法學用來獲得抗體重鏈基因和抗體輕鏈基因，使這些基因導入重組表現載體中，然後使所述載體導入宿主細胞中，所述標準方法例如為以下文獻介紹的方法：Sambrook，Fritsch和Maniatis(編輯)，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，Ausubel，F.M.等(編輯)CurrentProtocols in Molecuar Biology，Greene Publishing Associates，(1989)和Boss等的美國專利第4,816,397號。
抗體或其抗原結合片段可使用合適的宿主細胞重組製造。編碼該抗體或其抗原結合片段的核酸可選殖至表現載體內，其可然後引入宿主細胞諸如大腸桿菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、類人猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞內，其中該細胞不另外產生免疫球蛋白，以於重組宿主細胞中獲得抗體的合成。在本領域熟知的許多細胞中，優選的宿主細胞包括CHO細胞、人類胚胎腎(HEK)293細胞或Sp2.0細胞。
抗體片段可通過重組方法或通過化學合成由全長抗體的蛋白質水解或其他降解產生。抗體的多肽片段(尤其多達約50個胺基酸的較短多肽)可通過化學合成便利地製成。用於蛋白質及肽的化學合成的方法是本領域中已知及是可購買獲得。
本發明的抗體或其抗原結合片段可經親和力成熟。例如，經親和力成熟的抗體可由本領域中已知的程式(Marks等人，1992,Bio/Technology,10:779-783；Barbas等人，1994,Proc Nat.Acad.Sci,USA 91:3809-3813；Schier等人，1995,Gene,169:147-155；Yelton等人，1995,J.Immunol.,155:1994-2004；Jackson等人，1995,J.Immunol.,154(7):3310-9；Hawkins等人，1992,J.Mol.Biol.,226:889-896；及WO2004/058184)產生。 抗體變體
在某些實施方式中，涵蓋本文中提供的抗體的胺基酸序列變體。例如，可以期望改善抗體的結合親和力和/或其它生物學特性。可以通過將合適的修飾引入編碼抗體的核苷酸序列中，或者通過肽合成來製備抗體的胺基酸序列變體。此類修飾包括例如對抗體的胺基酸序列內的殘基的刪除，和/或插入和/或替代。可以進行刪除，插入，和替代的任何組合以得到最終的構建體，只要最終的構建體擁有期望的特徵，例如，抗原結合。 a)替代，插入，和刪除變體
在某些實施方式中，提供了具有一處或多處胺基酸替代的抗體變體。替代誘變感興趣的位點包括HVR和FR。保守替代在表A中在"優選的替代"的標題下顯示。更實質的變化在表A中在"例示性替代"的標題下提供，並且如下文參照胺基酸側鏈類別進一步描述的。可以將胺基酸替代引入感興趣的抗體中，並且對產物篩選期望的活性，例如保留/改善的抗原結合，降低的免疫原性，或改善的ADCC或CDC。
Figure 02_image001
依照共同的側鏈特性，胺基酸可以如下分組： (1)疏水性的：正白胺酸，Met，Ala，Val，Leu，IIe; (2)中性，親水性的：Cys, Ser, Thr, Asn, Gin; (3)酸性的：Asp，Glu; (4)鹼性的：His，Lys，Arg; (5)影響鏈取向的殘基:Gly，Pro; (6)芳香族的：Trp，Tyr ,Phe。 非保守替代會需要用這些類別之一的成員替換另一個類別的。
一類替代變體牽涉替代親本抗體(例如人源化或人類抗體)的一個或多個高變區殘基。一般地，為進一步研究選擇的所得變體相對於親本抗體會具有某些生物學特性的改變(例如改善)(例如升高的親和力，降低的免疫原性)和/或會基本上保留親本抗體的某些生物學特性。例示性的替代變體是親和力成熟的抗體，其可以例如使用基於噬菌體展示的親和力成熟技術諸如本文中所描述的那些技術來方便地生成。簡言之，將一個或多個HVR殘基突變，並將變體抗體在噬菌體上展示，並對其篩選特定的生物學活性(例如結合親和力)。
可以對HVR做出變化(例如，替代)，例如以改善抗體親和力。可以對HVR"熱點"，即由在體細胞成熟過程期間以高頻率經歷突變的密碼子編碼的殘基(見例如Chowdhury， Methods Mol. Biol. 207:179-196(2008))，和/或接觸抗原的殘基做出此類變化，其中對所得的變體VH或VL測試結合親和力。通過次級文庫的構建和再選擇進行的親和力成熟已經記載於例如Hoogenboom等，於Methods in Molecular Biology 178: l_37(0'Brien等編， Human Press，Totowa，NJ，(2001))。在親和力成熟的一些實施方式中，通過多種方法(例如，易錯PCR，鏈改組，或寡核苷酸指導的誘變)將多樣性引入為成熟選擇的可變基因。然後，創建次級文庫。然後，篩選文庫以鑒定具有期望的親和力的任何抗體變體。另一種引入多樣性的方法牽涉HVR指導的方法，其中將幾個HVR殘基(例如，一次4-6個殘基)隨機化。可以例如使用丙胺酸掃描誘變或建模來特異性鑒定牽涉抗原結合的HVR殘基。特別地，經常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些實施方式中，可以在一個或多個HVR內發生替代，插入，或刪除，只要此類變化不實質性降低抗體結合抗原的能力。例如，可以對HVR做出保守變化(例如，保守替代，如本文中提供的)，其不實質性降低結合親和力。例如，此類變化可以在HVR中的抗原接觸殘基以外。在上文提供的變體VH和VL序列的某些實施方式中，每個HVR是未改變的，或者含有不超過1，2或3處胺基酸替代。
一種可用於鑒定抗體中可以作為誘變靶位的殘基或區域的方法稱作"丙胺酸掃描誘變"，如由Cunningham和Wells (1989) Science, 244:1081-1085所描述的。在此方法中，將殘基或靶殘基的組(例如，帶電荷的殘基諸如arg，asp，his，lys，和glu)鑒定，並用中性或帶負電荷的胺基酸(例如，丙胺酸或多丙胺酸)替換以測定抗體與抗原的相互作用是否受到影響。可以在對初始替代表明功能敏感性的胺基酸位置引入進一步的替代。或者/另外，利用抗原-抗體複合物的晶體結構來鑒定抗體與抗原間的接觸點。作為替代的候選，可以靶向或消除此類接觸殘基和鄰近殘基。可以篩選變體以確定它們是否含有期望的特性。
胺基酸序列插入包括長度範圍為1個殘基至含有100或更多個殘基的多肽的胺基和/或羧基端融合，及單個或多個胺基酸殘基的序列內插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫胺醯基殘基的抗體。抗體分子的其它插入變體包括抗體的N或C端與酶(例如對於ADEPT)或延長抗體的血清半衰期的多肽的融合物。 b)糖基化變體
在某些實施方式中，改變本文中提供的抗體以提高或降低抗體糖基化的程度。可以通過改變胺基酸序列，使得創建或消除一個或多個糖基化位點來方便地實現對抗體的糖基化位點的添加或刪除。
在抗體包含Fc區的情況中，可以改變其附著的碳水化合物。由哺乳動物細胞生成的天然抗體通常包含分支的，雙觸角寡糖，其一般通過N連接附著於Fc區的CH2域的Asn297。見例如Wright等，TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可以包括各種碳水化合物，例如，甘露糖，N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)，半乳糖，和唾液酸，以及附著於雙觸角寡糖結構"主幹"中的GIcNAc的岩藻糖。在一些實施方式中，可以對本發明抗體中的寡糖進行修飾以創建具有某些改善的特性的抗體變體。
在一個實施方式中，提供了抗體變體，其具有缺乏附著(直接或間接)於Fc區的岩藻糖的碳水化合物結構。例如，此類抗體中的岩藻糖量可以是1%至80%，1%至65%，5%至65%或20%至40%。通過相對於附著於Asn297的所有糖結構(例如，複合的，雜合的和高甘露糖的結構)的總和，計算Asn297處糖鏈內岩藻糖的平均量來測定岩藻糖量，如通過MALDI-TOF質譜術測量的，例如如記載於WO 2008/077546的。Asn297指位於Fc區中的約第297位(Fe區殘基的Eu編號方式)的天冬醯胺殘基;然而，Asn297也可以由於抗體中的微小序列變異而位於第297位上游或下游約±3個胺基酸，即在第294位和第300位之間。此類岩藻糖基化變體可以具有改善的ADCC功能。見例如美國專利公開文本No.US 2003/0157108(Presta，L.); US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co. ,Ltd)。涉及"脫岩藻糖基化的"或"岩藻糖缺乏的"抗體變體的出版物的例子包括:US 2003/0157108;W0 2000/61739;W0 2001/29246;US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704； US 2004/0110282；US 2004/0109865；W0 2003/085119；W0 2003/084570；W0 2005/035586； TO 2005/035778;TO2005/053742;TO2002/031140;0kazaki等，J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki等, Biotech .Bioeng.87:614(2004)。能夠生成脫岩藻糖基化抗體的細胞系的例子包括蛋白質岩藻糖基化缺陷的L e c I 3 C H O細胞(R i p k a等， Arch . Biochem. Biophys .249 :533-545(1986);美國專利申請No US 2003/0157108A1， Presta，L;及WO 2004/056312A1，Adams等)，和敲除細胞系，諸如α-l，6-岩藻糖基轉移酶基因FUT8敲除CHO細胞(見例如Yamane-Ohnuki等，Biotech.Bioeng· 87 :614 (2004);Kanda，Y.等，Biotechnol.Bioeng., 94(4):680-688(2006);及W02003/085107)。
進一步提供了具有兩分型寡糖的抗體變體，例如其中附著於抗體Fc區的雙觸角寡糖是通過GIcNAc兩分的。此類抗體變體可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此類抗體變體的例子記載於例如WO2003/011878( Jean-Mairet等)；美國專利No. 6，602， 684(Umana等)；及US 2005/0123546(Umana等)。還提供了在附著於Fc區的寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的抗體變體。此類抗體變體可以具有改善的CDC功能。此類抗體變體記載於例如WO 1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju，S.);及WO 1999/22764(Raju，S·)。 c)Fc區變體
在某些實施方式中，可以將一處或多處胺基酸修飾引入本文中提供的抗體的Fc區中，由此生成Fc區變體。Fc區變體可以包含在一個或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾(例如替代)的人類Fc區序列(例如，人類IgGl，IgG2，IgG3或IgG4Fc區)。
在某些實施方式中，本發明涵蓋擁有一些但不是所有效應器功能的抗體變體，所述效應器功能使其成為如下應用的期望候選物，其中抗體的體內半衰期是重要的，而某些效應器功能(諸如補體和ADCC)是不必要的或有害的。可以進行體外和/或體內細胞毒性測定法以確認CDC和/或ADCC活性的降低/消減。例如，可以進行Fc受體(FcR)結合測定法以確保抗體缺乏Fc γR結合(因此有可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn結合能力。介導ADCC的主要細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI，FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet,Annu.Rev. Tmmunol ·9:457-492(1991)的第464頁上的表3中匯總了造血細胞上的FcR表現。評估感興趣分子的ADCC活性的體外測定法的非限制性例子記載於美國專利No. 5,500,362(見例如Hellstrom, I ·等，Proc. Nat'I Acad. Sci USA 83: 7059-7063( 1986))和 Hellstrom，I等，Proc.Nat'I Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985);5，821，337(見Bruggemann，Μ·等，J.Exp.Med. 166:1351-1361(1987))。或者，可以採用非放射性測定方法 (見例如用於流式細胞術的ACT ITM 非放射性細胞毒性測定法(Cell Technology， Inc .Mountain View，CA;和CytoTox96非放射性細胞毒性測定法(Promega ,Madison， WI ))。對於此類測定法有用的效應細胞包括外周血單個核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞。或者/另外，可以在體內評估感興趣分子的ADCC活性，例如在動物模型中，諸如披露於Clynes等，Proc Nat 'I Acad Sci USA 95:652-656(1998)的。也可以實施Clq結合測定法以 確認抗體不能結合Clq，並且因此缺乏CDC活性。見例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的Clq和C3c結合ELISA。為了評估補體活化，可以實施CDC測定法(見例如Gazzano-Santoro等，J·Immunol. Methods 202:163( 1996); Cragg，Μ S.等，Blood 101:1045-1052 (2003);及Cragg，Μ·S·和M. J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。也可以使用本領域中已知的方法來實施FcRn結合和體內清除/半衰期測定(見例如Petkova，S.B.等，Int' I. Immunol.18(12):1759-1769(2006))。
具有降低的效應器功能的抗體包括那些具有Fc區殘基238，265，269，270，297，327和329中的一個或多個的替代的(美國專利No. 6,737,056)。此類Fc突變體包括在胺基酸位置265，269，270，297和327中的兩處或更多處具有替代的Fc突變體，包括殘基265和297替代成丙胺酸的所謂的"DANA"Fc突變體(美國專利No. 7，332，581)。
描述了具有改善的或降低的對FcR的結合的某些抗體變體(見例如美國專利No.6,737,056;WO 2004/056312,及Shields等，J.Biol.Chem.9(2): 6591-6604(2001))。
在某些實施方式中，抗體變體包含具有改善ADCC的一處或多處胺基酸替代，例如Fc區的位置298,333,和/或334(殘基的EU編號方式)的替代的Fc區。
在一些實施方式中，對Fc區做出改變，其導致改變的(即，改善的或降低的)Clq結合和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，例如，如記載於美國專利No. 6,194,551，WO 99/51642， 及Idusogie等，J.Tmmunol·164:4178-4184(2000)的。
具有延長的半衰期和改善的對新生兒Fc受體(FcRn)的結合的抗體記載於US2005/ 0014934A1 (Hinton等)，新生兒Fc受體(FcRn)負責將母體IgG轉移至胎兒 (Guyer等， J. Immunol · 117:587 (1976)及Kim等 J. Immunol · 24:249 (1994))。那些抗體包含其中具有改善Fc區對FcRn結合的一處或多處替代的Fc區。此類Fc變體包括那些在Fc區殘基238, 256， 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424或434中的一處或多處具有替代，例如，Fc區殘基434的替代的(美國專利No. 7,371,826)。
還可見Duncan和Winter，Nature 322:738-40 (1988);美國專利No 5,648,260;美國專利No.5,624,821;及WO 94/29351，其關注Fc區變體的其它例子。 d)經半胱胺酸工程化改造的抗體變體
在某些實施方式中，可以期望創建經半胱胺酸工程化改造的抗體，例如，"thioMAb"，其中抗體的一個或多個殘基用半胱胺酸殘基替代。在具體的實施方式中，替代的殘基存在於抗體的可接近位點。通過用半胱胺酸替代那些殘基，反應性硫醇基團由此定位於抗體的可接近位點，並且可以用於將抗體與其它模組，諸如藥物模組或接頭-藥物模組綴合，以創建免疫綴合物，如本文中進一步描述的。在某些實施方式中，可以用半胱胺酸替代下列殘基之任一個或多個:輕鏈的V205(Kabat編號方式)；重鏈的A118(EU編號方式)；和重鏈Fc區的S400(EU編號方式)。可以如例如美國專利No.7,521,541所述生成經半胱胺酸工程化改造的抗體。 e)抗體衍生物
在某些實施方式中，可以進一步修飾本文中提供的抗體以含有本領域知道的且易於獲得的額外非蛋白質性質模組。適合於抗體衍生化的模組包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限於聚乙二醇(PEG)，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纖維素，右旋糖苷，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1，3-二氧戊環，聚-1，3，6-三噁烷，乙烯/馬來酸酐共聚物，聚胺基酸(均聚物或隨機共聚物)，和右旋糖苷或聚(η-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，環氧丙烷/環氧乙烷共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)，聚乙烯醇及其混合物。由於其在水中的穩定性，聚乙二醇丙醛在生產中可能具有優勢。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附著到抗體上的聚合物數目可以變化，而且如果附著了超過一個聚合物，那麼它們可以是相同或不同的分子。一般而言，可根據下列考慮來確定用於衍生化的聚合物的數目和/或類型，包括但不限於抗體要改進的具體特性或功能，抗體衍生物是否將用於指定條件下的治療等。
在另一個實施方式中，提供了抗體和可以通過暴露於輻射選擇性加熱的非蛋白質性質模組的綴合物。在一個實施方式中，非蛋白質性質模組是碳納米管(Kam等，Proc .Natl .Acad.Sci .USA 102:11600-11605(2005))。輻射可以是任何波長的，並且包括但不限於對普通細胞沒有損害，但是將非蛋白質性質模組加熱至抗體-非蛋白質性質模組附近的細胞被殺死的溫度的波長。 測定法
可以通過本領域中已知的多種測定法對本文中提供的抗OX40抗體鑒定，篩選，或表徵其物理/化學特性和/或生物學活性。 1. 結合測定法和其它測定法
一方面，對本發明的抗體測試其抗原結合活性，例如通過已知的方法諸如ELISA，Western墨點，等來進行。可使用本領域已知方法來測定OX40結合，本文中公開了例示性方法。在一個實施方式中，使用放射免疫測定法測量結合。例示了一種例示性放射免疫測定法。將OX40抗體碘化，並製備含有固定濃度的碘化抗體和遞減濃度的連續稀釋的未標記OX40抗體的競爭反應混合物。將表現OX40的細胞(例如經人類OX40穩定轉染的BT474細胞)添加至反應混合物。溫育後，清洗細胞將游離的碘化OX40抗體與結合至細胞的OX40抗體分開。測定結合的碘化OX40抗體的位準，例如通過對與細胞聯合的放射性計數來進行，並使用標準方法測定結合親和力。在另一個實施方式中，使用流式細胞術評估OX40抗體結合表面表現的OX40(例如在T細胞子集上)的能力。獲得外周白血球(例如來自人類，食蟹猴，大鼠或小鼠)，並用血清封閉細胞。以連續稀釋液添加經標記的OX40抗體，還對T細胞染色以鑒定T細胞子集(使用本領域已知方法)。樣品溫育和清洗後，使用流式細胞儀分選細胞，並使用本領域公知方法分析數據。在另一個實施方式中，可使用表面電漿子共振來分析OX40結合。例示了一種例示性表面電漿子共振方法。
另一方面，可使用競爭測定法來鑒定與本文中公開的任何抗OX40抗體競爭對OX40的結合的抗體。在某些實施方式中，此類競爭性抗體結合與本文中公開的任何抗OX40抗體所結合表位相同的表位(例如線性或構象表位)。用於定位抗體所結合表位的詳細例示性方法見Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols”，Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press，Totowa，NJ)。例示了一種競爭測定法。
在一種例示性競爭測定法中，在包含第一經標記抗體(其結合OX，例如mab 1A7. gr. 1，mab 3C8. gr5)和第二未標記抗體(其要測試與第一抗體競爭對OX40的結合的能力)的溶液中溫育固定化OX40。第二抗體可存在於雜交瘤上清液中。作為對照，在包含第一經標記抗體但不包含第二未標記抗體的溶液中溫育固定化OX40。在允許第一抗體結合OX40的條件下溫育後，除去過量的未結合抗體，並測量與固定化OX40聯合的標記物的量。如果測試樣品中與固定化OX40聯合的標記物的量與對照樣品相比實質性降低，那麼這指示第二抗體與第一抗體競爭對OX40的結合。參見Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)。 2. 活性測定法
一方面，提供用於鑒定具有生物學活性的抗OX40抗體的測定法。生物學活性可以包括例如結合OX40(例如結合人類和/或食蟹猴OX40)，提高OX40介導的信號轉導(例如提高NFkB介導的轉錄)，消減表現人類OX40的細胞(例如T細胞)，通過ADCC和/或吞噬消減表現人類OX40的細胞，增強T效應細胞功能(例如CD4+效應T細胞)(例如通過提高效應T細胞增殖和/或提高效應T細胞的細胞介素生成(例如γ干擾素))，增強記憶T細胞功能(例如CD4+記憶T細胞)(例如通過提高記憶T細胞增殖和/或提高記憶T細胞的細胞介素生成(例如γ干擾素))，抑制調節T細胞功能(例如通過降低效應T細胞功能(例如CD4+效應T細胞功能))的Treg遏制)，結合人類效應細胞。還提供在體內和/或在體外具有此類生物學活性的抗體。
在某些實施方式中，對本發明的抗體測試此類生物學活性。
可以使用本領域已知的方法來測定T細胞共刺激，而且本文中公開了例示性方法。例如，可以自外周白血球獲得T細胞(例如記憶或效應T細胞)(例如使用Ficoll梯度離心自人類全血分離)。可以使用本領域已知的方法自PBMC分離記憶T細胞(例如CD4+記憶T細胞)或效應T細胞(例如CD4+Teff細胞)。例如，可以使用MiItenyiCD4+記憶T細胞分離試劑盒或Miltenyi幼稚CD4+T細胞分離試劑盒。在抗原呈遞細胞(例如經過照射的表現CD32和CD80的L細胞)存在下培養分離的T細胞，並通過在OX40促效性抗體存在或缺失下添加抗CD3抗體來活化。可以使用本領域公知的方法來測量促效性OX40抗體對T細胞增殖的影響。例如，可以使用Cell Titer Glo試劑盒(Promega)，並在多標記物讀數儀(Perkin Elmer)上讀取結果。還可以通過分析由T細胞生成的細胞介素來測定促效性OX40抗體對T細胞功能的影響。在一個實施方式中，測定CD4+T細胞的干擾素γ生成，例如通過測量細胞培養物上清液中的干擾素γ。用於測量干擾素γ的方法是本領域公知的。
可以使用本領域已知的方法來測定Treg細胞功能，而且本文中公開了例示性方法。在一個例子中，測定Treg遏制效應T細胞增殖的能力。使用本領域已知的方法自人類全血分離T細胞(例如分離記憶T細胞或幼稚T細胞)。標記純化後的CD4+幼稚T細胞(例如用CFSE)，並用不同試劑標記純化後的Treg細胞。將經過照射的抗原呈遞細胞(例如表現CD32和CD80的L細胞)與經過標記的純化後的幼稚CD4+Τ細胞和純化後的Treg共培養。使用抗CD3抗體活化共培養物，並在促效性OMO抗體存在或缺失下測試。合適時間(例如共培養6天)後，使用FACS分析通過降低的標記物染色(例如降低的CFSE標記物染色)中的染料稀釋來跟蹤CD4+幼稚T細胞增殖的位準。
可以使用本領域公知的方法來測定OX40信號傳導，而且本文中公開了例示性方法。在一個實施方式中，生成表現人類OX40和報告基因(包含融合至報告基因(例如β螢光素酶)的NFkB啟動子)的轉基因細胞。對細胞添加OX40促效性抗體導致NFkB轉錄升高，這使用針對報告基因的測定法來檢測。
可以例如通過使用單核細胞衍生的巨噬細胞或U937細胞(一種具有成熟巨噬細胞的形態和特徵的人類組織細胞性淋巴瘤細胞系)來測定吞噬作用。在抗OX40促效性抗體存在或缺失下將表現OX40的細胞添加至單核細胞衍生的巨噬細胞或U937細胞。將細胞培養合適時間段後，通過檢查針對1)巨噬細胞或U937細胞和2)表現OX40的細胞的標誌物雙重染色的細胞的百分比，並將此除以顯示表現OX40的細胞的標誌物(例如GFP)的細胞的總數來測定吞噬百分比。可以通過流式細胞術來進行分析。在另一個實施方式中，可以通過螢光顯微術分析來進行分析。
可以例如使用本領域公知的方法測定ADCC。定義部分中描述了例示性方法。在一些實施方式中，表徵在ADCC測定法中用於測試的表現OX40的細胞上的OX40位準。將細胞用可檢測標記的抗OX40抗體(例如PE標記的)染色，然後使用流式細胞術測定螢光位準，並以中值螢光強度(MFI)呈現結果。在另一個實施方式中，可以通過CellTiter Glo測定法試劑盒來分析ADCC，而且可以通過化學發光來測定細胞存活力/細胞毒性。
可以使用相應重組Fcγ受體在基於ELISA的配體結合測定法中測量各種抗體對Fc γ RIA，Fc γ RIIA，Fc γ RIIB，和Fc γ RIIIA的兩種同種異型(F158和V158)的結合親和力。以含有連接至C端Gly/6xHis/麩胱甘肽S-轉移酶(GST)多肽標籤的受體γ鏈胞外域的融合蛋白表現純化後的人類Fc γ受體。如下測定抗體對那些人類Fc γ受體的結合親和力。對於低親和力受體，即Fc γRIIA(CD32A)，Fc γRIIB(CD32B)，和Fe γRIIIA(CD16)的兩種同種異型，F-158和V-158,可以通過用山羊抗人類卡帕鏈的F(ab')2片段(ICN Biomedical; Irvine，CA)交聯(以近似莫耳比1:3抗體：交聯用F(ab')2)作為多聚體測試抗體。將板用抗GST抗體(Genentech)包被，並用牛血清清蛋白(BSA)封閉。用含有0.05%Tween-20的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)及ELx405™洗板儀(Biotek Instruments;Winooski，VT)清洗後，以25ng/孔將Fc γ 受體添加至板，並於室溫溫育1小時。清洗板後，作為多聚體複合物添加測試抗體的系列稀釋液，並將板於室溫溫育2小時。清洗板以去除未結合的抗體後，用辣根過氧化物酶(HRP)綴合的山羊抗人類F(ab')2的F(ab')2片段(Jackson ImmunoResearch Laboratories ;West Grove，PA)檢測結合至Fc γ受體的抗體，接著添加底物，四甲基聯苯胺(TMB) (Kirkegaard and Perry Laboratories;Gaithersburg，MD)。取決於所測試的Fc γ受體，將板於室溫溫育 5-20分鐘以容許顯色。用IM H3PO4終止反應，並用微量板讀數儀(SpectraMax® 190， Molecular Devices;Sunnyvale，CA)測量450nm處的吸光度。通過將來自一式兩份抗體稀釋液的均值吸光值針對抗體濃度繪圖，生成劑量-反應結合曲線。使用SoftMax 190 (Molecular Devices)用四參數方程擬合結合曲線後確定檢測到來自結合Fc γ受體的最大反應50%時的有效抗體濃度的值(EC50)。
為了選擇誘導細胞死亡的抗體，可相對於對照評估通過例如碘化丙啶(PI)，錐蟲藍或7AAD攝取顯示的膜完整性喪失。PI攝取測定法可在補體和免疫效應細胞缺失下實施。在單獨的培養基或含有濃度為例如約10 μg/ml的適宜單株抗體的培養基中溫育表現OX40的細胞。將細胞溫育某個時段(例如1或3天)。每次處理後，將細胞清洗並等分。在一些實施方式中，將細胞等分到35 mm蓋有濾網(strainer-capped)的12x75管中(每管1 ml，每個處理組3管)以除去細胞團塊。然後向管中加入PI(10 μg/ml)。可以使用FACSCAN™流式細胞儀和FACSCONVERT™ CellQuest軟體(Becton Dickinson)分析樣品。
供任何上述體外測定法使用的細胞包括天然表現OX40或經改造而表現OX40的細胞或細胞系。此類細胞包括天然表現OX40的活化後的T細胞，Treg細胞和活化後的記憶T細胞。此類細胞還包括表現OX40的細胞系和並非正常情況下表現OX40但已經用編碼OX40的核酸轉染的細胞系。本文中提供的供任何上述體外測定法使用的例示性細胞系包括表現人類OX40的轉基因BT474細胞(一種人類乳腺癌細胞系)。
理解的是，可以使用本發明的免疫綴合物替換或補充抗OX40抗體來進行任何上述測定法。
理解的是，可以使用抗OX40抗體和別的治療劑來進行任何上述測定法。 配方及用途
本發明的抗體或其抗原結合片段可調配成藥物組合物。該藥物組合物可進一步包含藥學上可接受的載體、賦形劑及/或穩定劑(Remington:The Science and practice ofPharmacy，第20版，2000,Lippincott Williams and Wilkins,Ed.K.E.Hoover)，以凍乾配方或水溶液的形式。可接受的載體、賦形劑或穩定劑在劑量及濃度下對接受者是無毒的，及可包含緩衝劑諸如磷酸、檸檬酸及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六羥季銨；殺藻胺；氯化本索寧；酚醇、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他醣，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相反離子，諸如鈉；金屬絡合物(例如，Zn-蛋白質絡合物)；及/或非離子型表面活性劑，諸如TWEENTM 、PLURONICSTM 或聚乙二醇(PEG)。本文進一步描述藥學上可接受的賦形劑。
本發明的抗體或其抗原結合片段可用於各種治療或診斷目的。例如，本發明的抗體或其抗原結合片段可用作親和力純化劑(例如，用於活體外純化)；用作診斷劑(例如，用於檢測特異性細胞、組織或血清中的表現)。
本發明的抗體或其抗原結合片段的例示性治療用途包括治療癌症。本發明的抗體或其抗原結合片段亦可用於預防性治療。
就治療應用而言，本發明的抗體或其抗原結合片段可通過常規技術向哺乳動物、尤其人類施用，所述技術諸如靜脈內(作為推注或通過經時的連續輸注)、肌內、腹腔內、腦內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、經口、局部或通過吸入。本發明的抗體或其抗原結合片段亦可適當通過腫瘤內、腫瘤周圍、病灶內或病灶周圍途徑施用。
在某些實施方式中，本發明的抗體或其抗原結合片段是經皮下施用。在某些實施方式中，本發明的抗體或其抗原結合片段是經靜脈內施用。
藥物組合物可以可隨疾病的嚴重性變化的頻率向有此需要的受試者施用。在預防治療的情況下，該頻率可取決於該受試者疾病的易發性或傾向而變化。
所述組合物可作為推注或通過連續輸注向有此需要的患者施用。例如，以Fab片段呈現的抗體的推注施用可以自0.0025至100mg/kg體重、0.025至0.25mg/kg、0.010至0.10mg/kg或0.10至0.50mg/kg的量進行施用。就連續輸注而言，以Fab片段呈現的抗體可以0.001至100mg/kg體重/分鐘、0.0125至1.25mg/kg/min、0.010至0.75mg/kg/min、0.010至1.0mg/kg/min或0.10至0.50mg/kg/min的量施用，持續1至24小時、1至12小時、2至12小時、6至12小時、2至8小時或1至2小時。
就以全長抗體(具有完整恆定區)呈現的抗體的施用而言，劑量可為自約1mg/kg至約10mg/kg、自約2mg/kg至約10mg/kg、自約3mg/kg至約10mg/kg、自約4mg/kg至約10mg/kg、自約5mg/kg至約10mg/kg、自約1mg/kg至約20mg/kg、自約2mg/kg至約20mg/kg、自約3mg/kg至約20mg/kg、自約4mg/kg至約20mg/kg、自約5mg/kg至約20mg/kg、約1mg/kg或更多、約2mg/kg或更多、約3mg/kg或更多、約4mg/kg或更多、約5mg/kg或更多、約6mg/kg或更多、約7mg/kg或更多、約8mg/kg或更多、約9mg/kg或更多、約10mg/kg或更多、約11mg/kg或更多、約12mg/kg或更多、約13mg/kg或更多、約14mg/kg或更多、約15mg/kg或更多、約16mg/kg或更多、約17mg/kg或更多、約19mg/kg或更多或約20mg/kg或更多。施用的頻率將取決於病症的嚴重性。頻率可在自每週三次至每兩周或三週一次的範圍內變化。
另外，所述組合物可經由皮下注射向患者施用。例如，1至100mg抗OX40抗體的劑量可經由皮下或靜脈內注射以一周兩次、一週一次、每兩週一次、每三週一次、每四周一次、每五週一次、每六週一次、每七週一次、每八週一次、每九週一次、每十週一次、一個月兩次、一個月一次、每兩個月一次或每三個月一次的頻率向患者施用。
在某些實施方式中，抗OX40抗體於人類中的半衰期是約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天、約15天、約16天、約17天、約18天、約19天、約20天、約21天、約22天、約23天、約24天、約25天、約26天、約27天、約28天、約29天、約30天、自約5天至約40天、自約5天至約35天、自約5天至約30天、自約5天至約25天、自約10天至約40天、自約10天至約35天、自約10天至約30天、自約10天至約25天、自約15天至約40天、自約15天至約35天、自約15天至約30天、或自約15天至約25天。
在某些實施方式中，該藥物組合物是以以下的劑量每2至6周進行皮下或靜脈內施用：自約0.1mg/kg至約10mg/kg、自約0.5mg/kg至約10mg/kg、自約1mg/kg至約10mg/kg、自約1.5mg/kg至約10mg/kg、自約2mg/kg至約10mg/kg、自約0.1mg/kg至約8mg/kg、自約0.5mg/kg至約8mg/kg、自約1mg/kg至約8mg/kg、自約1.5mg/kg至約8mg/kg、自約2mg/kg至約8mg/kg、自約0.1mg/kg至約5mg/kg、自約0.5mg/kg至約5mg/kg、自約1mg/kg至約5mg/kg、自約1.5mg/kg至約5mg/kg、自約2mg/kg至約5mg/kg、約0.5mg/kg、約1.0mg/kg、約1.5mg/kg、約2.0mg/kg、約2.5mg/kg、約3.0mg/kg、約3.5mg/kg、約4.0mg/kg、約4.5mg/kg、約5.0mg/kg、約5.5mg/kg、約6.0mg/kg、約6.5mg/kg、約7.0mg/kg、約7.5mg/kg、約8.0mg/kg、約8.5mg/kg、約9.0mg/kg、約9.5mg/kg或約10.0mg/kg。
在某些實施方式中，該藥物組合物是以約2.0mg/kg的劑量每2至6周進行皮下注射或靜脈內施用。在某些實施方式中，該藥物組合物是以自約2.0mg/kg至約10.0mg/kg的劑量每2至6周進行皮下注射或靜脈內施用。
在一個例示性實施方式中，藥物組合物是每2周皮下施用。 本發明的抗體或其抗原結合片段可用作單藥療法或與其他療法組合以治療癌症。 定義
除非本文另有定義，否則結合本發明使用的科學及技術術語應具有本領域普通技術人員通常所瞭解的含義。此外，除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數及複數術語應包括單數。通常，結合本文描述的細胞及組織培養物、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質及核酸化學及雜交使用的術語表及技術是那些本領域中熟知及常用者。
抗體的“抗原結合片段”是指全長抗體的保留特異性結合至抗原的能力的片段(優選地，具有基本上相同的結合親和力)。抗原結合片段的實例包括(i)Fab片段，其為由VL、VH、CL及CH1域組成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，其為包含於鉸鏈區通過雙硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH及CH1域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂的VL及VH域組成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341:544-546)，其由VH域組成；及(vi)經分離的互補決定區(CDR)、經雙硫鍵連接的Fvs(dsFv)及抗-特應(抗-Id)抗體及胞內抗體。此外，儘管Fv片段的兩個域(VL及VH)是由不同基因編碼，但其可使用重組方法通過合成連接體連接，該合成連接體使得其被製成單一蛋白鏈，其中VL及VH區配對以形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv))；參見例如，Bird等人Science 242:423-426(1988)及Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))。單鏈抗體的其他形式(諸如雙抗體)亦包含於本發明中。雙抗體是二價雙特異性抗體，其中VH及VL域是表現於單一多肽鏈上，但使用太短以致於無法容許在相同鏈上的兩個鏈之間配對的連接體，藉此迫使所述域與另一鏈的互補域配對，及產生兩個抗原-結合位點(參見例如，Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)；Poljak等人，1994,Structure 2:1121-1123)。
抗體“可變域”是指抗體輕鏈(VL)的可變區或抗體重鏈(VH)的可變區，單獨或組合。如本領域中已知，重鏈及輕鏈的可變區各由三個互補決定區(CDR)組成，及由四個框架區(FR)連接，及有助於抗體的抗原結合位點的形成。
可變域中的殘基是根據Kabat編號，Kabat是用於抗體的編譯的重鏈可變域或輕鏈可變域的編號系統。參見Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。使用此編號系統，實際直鏈胺基酸序列可含有較少或額外的胺基酸，其對應於可變域的FR或CDR的縮短或插入。對於給定抗體，殘基的Kabat編號可通過於該抗體的序列與“標準”Kabat編號的序列具有同源性的區域的比對來測定。用於分配Kabat編號的各種演算法是可獲得的。除非本文另有說明，否則本文使用2012年發佈的Abysis(www.abysis.org)中執行的演算法將Kabat編號分配至可變區。
抗體中的具體胺基酸殘基位置(諸如互補位殘基)是亦根據Kabat編號。
“互補決定區”(CDR)可根據本領域中熟知的Kabat、Chothia、Kabat及Chothia兩者的聚集、AbM、接觸(contact)及/或構形定義或CDR測定的任何方法的定義加以識別。參見例如Kabat等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版(高度可變區)；Chothia等人，1989,Nature 342:877-883(結構性環結構)。CDR的AbM定義是在Kabat與Chothia之間折衷及使用Oxford Molecular的AbM抗體建模軟體CDR的“接觸”定義是基於闡述於MacCallum等人，1996,J.Mol.Biol.,262:732-745中的可見抗原接觸。CDR的“構象”定義是基於製造有助於抗原結合的焓的殘基(參見，例如，Makabe等人，2008,Journal of Biological Chemistry,283:1156-1166)。又其他CDR邊界定義可非嚴格遵守上文方法中的一者，但雖然如此仍將與Kabat CDR的至少一部分重疊，然而其可根據特定殘基或殘基組或甚至全部CDR不顯著影響抗原結合的預測或實驗發現而經縮短或延長。如本文使用，CDR可是指通過本領域中已知的任何方法(包括方法的組合)定義的CDR。
“抗原決定基”是指抗原(Ag)中抗體特異性結合的範圍或區域，例如，包含與該抗體(Ab)相互作用的胺基酸殘基的範圍或區域。抗原決定基可為直鏈或非直鏈(例如，構象)的。
當相應的抗體或其抗原結合片段的結合呈互相排外性時，抗體或其抗原結合片段基本上結合與另一抗體或其抗原結合片段相同的抗原決定基。即，一種抗體或其抗原結合片段的結合排除其他抗體或其抗原結合片段的同時或連續結合。若該抗原可適應兩種相應的抗體或其抗原結合片段的同時結合，則認為抗原決定基是獨一無二的或不是實質性地相同。
術語“互補位”是通過扭轉角度衍生自“抗原決定基”的上文定義，及是指抗體分子中涉及抗原結合的範圍或區域，例如，包含與該抗原相互作用的殘基的範圍或區域。互補位可為直鏈或構象的(諸如CDR中的不連續殘基)。
給定抗體/抗原結合對的抗原決定基/互補位可使用各種實驗及計算抗原決定基定位方法在不同細節層次下經定義及特徵分析。實驗方法包括誘變、X射線晶體學、核磁共振(NMR)光譜學、氫/氘交換質譜法(HX-MS)及各種競爭結合方法。因為各方法依賴於獨一無二的原則，所以抗原決定基的描述是與已測定該抗原決定基的方法緊密聯繫。因此，給定抗體/抗原對的抗原決定基/互補位將取決於採用的定位方法而不同地定義。
在其最細節層次下，用於抗體(Ab)與抗原(Ag)間相互作用的抗原決定基/互補位可通過界定存在於Ag-Ab相互作用中的原子接觸的空間座標及有關其對結合熱力學的相對貢獻的資訊進行定義。在一種程度下，抗原決定基/互補位殘基可通過界定Ag與Ab間原子接觸的空間座標進行特徵分析。在一個方面，該抗原決定基/互補位殘基可通過特定標準，例如Ab及Ag中原子間的距離(例如，距同源抗體的重原子及該抗原的重原子等於或小於約界定。在另一方面，抗原決定基/互補位殘基的特徵為參與與同源抗體/抗原，或與亦經氫結合至同源抗體/抗體(經水介導的氫結合)的水分子的氫鍵相互作用。在另一方面，抗原決定基/互補位殘基的特徵為與同源抗體/抗原的殘基形成鹽橋。在又另一方面，抗原決定基/互補位殘基的特徵可為因與同源抗體/抗原的相互作用而於掩蔽表面積(BSA)中具有非零變化的殘基。在較為不詳細的程度下，抗原決定基/互補位可通過函數進行特徵描述，例如，通過與其他Ab的競爭結合。該抗原決定基/互補位亦可更一般地定義為包含胺基酸殘基，其中通過另一胺基酸的取代將變更於Ab與Ag之間的相互作用的特徵(例如，丙胺酸掃描)。
自抗原決定基的描述及定義依賴於所用抗原決定基作圖(mapping)方法及在不同細節層次下獲得的事實，推斷於相同Ag上不同Ab的抗原決定基的比較可在不同細節層次下類似地進行。例如，於胺基酸層面描述，例如自X射線結構測定的抗原決定基，若其含有相同胺基酸殘基組，則認為其是相同的。若相應抗體的結合是相互排他性的，即，一種抗體的結合排除其他抗體的同時或連續結合，則認為以競爭結合為特徵的抗原決定基為重疊的；及若該抗原可適應兩個相應抗體同時結合，則認為抗原決定基是各別(獨特)的。
給定抗體/抗原對的抗原決定基及互補位可通過例行方法鑒別。例如，抗原決定基的一般位置可通過評估抗體結合至不同片段或變體多肽的能力測定，如本文先前更充分地描述。可與抗體內的特異性殘基接觸的OX40內的特異性殘基亦可使用例行方法測定。例如，抗體/抗原複合體可經結晶。該晶體結構可經測定及用以鑒別在抗體與抗原之間相互作用的特異性位點。
術語“特異性結合”是本領域中熟知的術語，且本領域中亦熟知用以測定這些特異性結合的方法。若分子與特定細胞或物質反應或結合比該分子與替代細胞或物質反應或結合更頻繁、更快速、更久持續時間及/或更大親和力，則認為該分子顯示“特異性結合”。若抗體或其抗原結合片段結合靶相較於結合其他物質以更大親和力、結合性、更容易及/或更久持續時間，則該抗體或其抗原結合片段“特異性結合”至靶。
例如，特異性結合OX40的抗體或其抗原結合片段是抗體結合其同源抗原相較於結合其他抗原，以更大親和力、結合性、更容易及/或更久持續時間。例如，在標準結合分析條件下，抗OX40抗體可特異性結合樣本中的人類OX40，但基本上不識別或結合該樣本中的其他分子。亦瞭解特異性結合第一靶的抗體或其抗原結合片段可或可不特異性結合至第二靶。因此，“特異性結合”不一定要求(雖然其可包括)排他性結合。通常，但未必，“結合”的提及意謂特異性結合。
可使用各種分析模式以選擇特異性結合目的分子的抗體或其抗原結合片段。例如，在許多測定中，固相ELISA免疫測定、免疫沈澱、BiacoreTM (GE Healthcare)、KinExA、螢光活化的細胞分選(FACS)、OctetTM (FortéBio,Inc.)及Western墨點分析可用以識別特異性結合抗原的抗體或其抗原結合片段。通常，特異性結合將是背景信號或雜訊的至少兩倍，更通常是背景的至少10倍、背景的至少50倍、背景的至少100倍、背景的至少500倍、背景的至少1000倍或背景的至少10,000倍。
抗體結合的特異性可通過測定抗體與OX40之間的特異性結合的KD 值及比較該KD 值與已知不結合至OX40的對照抗體的KD 值來評估。一般而言，當該KD 是約×10-5 M或更小時，認為抗體”、“特異性”結合抗原。
當相較於抗體或其抗原結合片段結合其他抗原，該抗體或其抗原結合片段不以更大親和力、結合性、更容易及/或以更久持續時間結合至一抗原時，該抗體或其抗原結合片段“基本上不結合”至該抗原。通常，該結合將不大於背景信號或雜訊的兩倍。一般而言，其以1×10-4 M或更大、1×10-3 M或更大、1×10-2 M或更大或1×10-1 M或更大的KD 結合該抗原。
如本文關於抗體使用的術語“競爭”意謂第一抗體或其抗原-結合部分結合至抗原減少後續第二抗體或其抗原-結合部分對相同抗原的結合。一般而言，第一抗體的結合產生空間位阻、構象變化或結合至共同抗原決定基(或其部分)，使得第二抗體對相同抗原的結合是減少。可使用標準競爭性結合分析以判定兩種抗體是否相互競爭。
用於抗體競爭的一種合適的分析涉及使用Biacore技術，該技術可使用表面電漿子共振(SPR)技術，通常使用生物感測器系統(諸如系統)測量相互作用的程度。例如，SPR可用於活體外競爭性結合抑制分析中以測定一種抗體抑制第二抗體的結合的能力。用於測量抗體競爭的另一分析使用基於ELISA的方法。此外，一種基於抗體的競爭來“分級”抗體的高通量方法是描述於WO2003/48731中。若一種抗體或其抗原結合片段減少另一抗體或其抗原結合片段對OX40的結合，則存在競爭。例如，可使用順序結合競爭分析，及順序添加不同抗體。可添加第一抗體以達成接近飽和的結合。然後，添加第二抗體。若第二抗體對OX40的結合無法檢測到或相較於在缺乏該第一抗體的情況下(其中值可設定為100%)的平行分析是顯著減少(例如，至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%減少)，則所述兩個抗體視為互相競爭。
亦可進行競爭性結合分析，其中抗體對抗原的結合是相較於靶對具該靶的另一結合配偶體(諸如原本結合該靶的另一抗體或可溶受體)的結合。50%抑制發生時的濃度被稱為Ki 。在理想條件下，該Ki 是等於KD 。因此，一般而言，Ki 的測量可便利地經取代以提供KD 的上限值。與不同分子相互作用相關聯的結合親和力(例如，不同抗體針對給定抗原的結合親和力的比較)可通過針對個別抗體/抗原複合體的KD 值的比較而進行比較。針對抗體或其他結合配偶體的KD 值可使用本領域中業已建立的方法進行測定。
“Fc融合”蛋白是其中一個或更多個多肽以可操作方式連接至Fc多肽的蛋白質。Fc融合組合免疫球蛋白的Fc區及融合配偶體。該“Fc區”可為天然序列Fc區或變體Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈的Fc區的邊界可改變，該人類IgG重鏈Fc區通常被定義為自位置Cys226的胺基酸殘基或自Pro230延伸至其羧基端。Fc區中的殘基的編號是具有EU指數的編號，如描述於Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991中。免疫球蛋白的Fc區通常包含兩個恆定域(CH2 及CH3 )。如本領域中已知，Fc區可以二聚物或單體形式存在。
術語“治療有效量”意謂抗OX40抗體或其抗原結合片段或包含此抗體或其抗原結合片段的組合足以達成預期目的的量。精確量將取決於許多因素，包括(但不限於)治療組合物的組分及物理特徵、預期患者群體、個別患者注意事項等，及可由本領域技術人員判定。
術語“治療”包括預防性及/或治療性治療。若在疾病、失調症或病症的臨床表現前施用，則認為該治療是預防性的。治療性治療包括(例如)減輕或減弱疾病、失調症或病症的嚴重性或縮短疾病、失調症或病症的長度。
如本文使用，術語“約”是指值的+/-10%。 治療性方法和組合物
本文中提供的任何抗人類OX40抗體可以在治療方法中使用。
在一個方面，提供抗人類OX40促效性抗體，其用作藥物。在又一些方面，提供抗人類OX40促效性抗體，其用於治療癌症。在某些實施方式中，提供抗人類OX40促效性抗體，其用於治療方法。在某些實施方式中，提供抗人類OX40促效性抗體，其用於治療具有癌症的個體的方法，包括對該個體施用有效量的該抗人類OX40促效性抗體。在一個此類實施方式中，該方法進一步包括對該個體施用有效量的至少一種別的治療劑，例如下文所述。
在一個方面，提供的是抗人類OX40促效性抗體，其用於在具有癌症的個體中增強免疫功能(例如通過上調細胞介導的免疫反應)，包括對該個體施用有效量的該抗人類OX40促效性抗體。在一個方面，提供的是抗人類OX40促效性抗體，其用於在具有癌症的個體中增強T細胞功能，包括對該個體施用有效量的該抗人類OX40促效性抗體。在一個方面，提供的是抗人類OX40促效性抗體，其用於消減表現人類OX40的細胞(例如表現OX40的T細胞，例如表現OX40的Treg)，包括對該個體施用有效量的該抗人類OX40促效性抗體。在一些實施方式中，消減是通過ADCC進行的。在一些實施方式中，消減是通過吞噬進行的。提供的是抗人類OX40促效性抗 體，其用於治療具有腫瘤免疫的個體。
在又一些方面，提供抗人類OX40促效性抗體，其用於治療感染(例如細菌或病毒或其它病原體感染)。在某些實施方式中，本發明提供抗人類OX40促效性抗體，其用於治療具有感染的個體的方法，包括對該個體施用有效量的該抗人類OX40促效性抗體。在一些實施方式中，感染是病毒和/或細菌感染。在一些實施方式中，感染是病原體感染。
在又一個方面，本發明提供抗OX40抗體製造或製備藥物的用途。在一個實施方式中，該藥物用於治療癌症。在又一個實施方式中，該藥物用於治療癌症的方法，其包括對具有癌症的個體施用有效量的該藥物。在一個此類實施方式中，該方法進一步包括對該個體 施用有效量的至少一種別的治療劑，例如下文所述。
在一個方面，該藥物用於在具有癌症的個體中增強免疫功能(例如通過上調細胞介導的免疫反應)，其包括對該個體施用有效量的該藥物。在一個方面，該藥物用於在具有癌症的個體中增強T細胞功能，其包括對該個體施用有效量的該藥物。在一些實施方式中，該T細胞功能障礙性病症是癌症。在一個方面，該藥物用於消減表現人類OX40的細胞(例如表現高OX40的細胞，例如表現OX40的T細胞)，其包括對該個體施用有效量的該藥物。在一些實施方式中，消減是通過ADCC進行的。在一些實施方式中，消減是通過吞噬進行的。在一個方面，該藥物用於治療具有腫瘤免疫的個體。
在又一些方面，提供藥物，其用於治療感染(例如細菌或病毒或其它病原體感染)。在某些實施方式中，該藥物用於治療具有感染的個體的方法，包括對該個體施用有效量的該藥物。在一些實施方式中，感染是病毒和/或細菌感染。在一些實施方式中，感染是病原體感染。
在又一個方面，本發明提供用於治療癌症的方法。在一個實施方式中，該方法包括對具有此類癌症的個體施用有效量的抗OX40抗體。在一個此類實施方式中，該方法進一步包括對該個體施用有效量的至少一種別的治療劑，例如下文所述。依照任何上述實施方式的“個體”可以是人類。
在一個方面，提供的是用於在具有癌症的個體中增強免疫功能(例如通過上調細胞介導的免疫反應)的方法，包括對該個體施用有效量的該抗人類OX40促效性抗體。在一個方面，提供的是用於在具有癌症的個體中增強T細胞功能的方法，包括對該個體施用有效量的該抗人類OX40促效性抗體。在一個方面，提供的是用於消減表現人類OX40的細胞(例如表現高位準OX40的細胞，例如表現OX40的T細胞)的方法，包括對該個體施用有效量的該抗人類OX40促效性抗體。在一些實施方式中，消減是通過ADCC進行的。在一些實施方式中，消減是通過吞噬進行的。提供的是抗人類OX40促效性抗體，其用於治療具有腫瘤免疫的個體。
在一些實施方式中，癌症的例子進一步包括但不限於B細胞淋巴瘤(包括低級/濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)，小淋巴細胞性(SL)NHU中級/濾泡性NHL，中級彌漫性NHL，高級成免疫細胞性NHL，高級成淋巴細胞性NHL，高級小無核裂細胞性NHL，貯積病(bulky disease)NHL，套細胞淋巴瘤，AIDS相關淋巴瘤，和瓦爾登斯特倫氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症)，慢性淋巴細胞性白血病(CLL)，急性成淋巴細胞性白血病(ALL)，毛細胞性白血病，慢性成髓細胞性白血病，和移植後淋巴增殖性病症(PTLD)，以及與瘢痣病(phakomatoses)，水腫(諸如與腦瘤有關的)，B細胞增殖性病症，和梅格斯氏(Meigs)綜合症有關的異常血管增殖。更具體例子包括但不限於復發性或頑固性NHL，前線(front line)低級NHL，階段III/IV NHL，化療耐受性NHL，前體B成淋巴細胞性白血病和/或淋巴瘤，小淋巴細胞性淋巴瘤，B細胞慢性淋巴細胞性白血病和/或前淋巴細胞性白血病和/或小淋巴細胞性淋巴瘤，B細胞前淋巴細胞性淋巴瘤，免疫細胞瘤和/或淋巴漿細胞性(lymphoplasmacytic)淋巴瘤，淋巴漿細胞性淋巴瘤，邊緣區B細胞淋巴瘤，脾邊緣區淋巴瘤，節外邊緣區(extranodal marginal zone)_MALT淋巴瘤，節邊緣區(nodal marginal zone)淋巴瘤，毛細胞性白血病，眾細胞瘤和/或漿細胞骨髓瘤，低級/濾泡淋巴瘤，中級/濾泡NHL，套細胞淋巴瘤，濾泡中心淋巴瘤(濾泡的)，中級彌漫性NHL，彌漫性大B細胞淋巴瘤，攻擊性(agressive)NHL(包括攻擊性前線NHL和攻擊性復發性NHL)，自體幹細胞移植後復發性或頑固性NHL，原發性縱隔大B細胞淋巴瘤，原發性滲出性淋巴瘤，高級成免疫細胞NHL，高級成淋巴細胞NHL，高級小無核裂細胞NHL，貯積病(bulky disease)NHL，伯基特氏(Burkitt)淋巴瘤，前體(外周)大粒狀淋巴細胞白血病，蕈樣肉芽腫病和/或塞紮裡(Sezary)綜合症，皮膚淋巴瘤，間變性大細胞淋巴瘤，血管中心性淋巴瘤。
在一些實施方式中，癌症的例子進一步包括但不限於B細胞增殖性病症，其進一步包括但不限於淋巴瘤(例如B細胞非霍奇金氏淋巴瘤(NHL))和淋巴細胞性白血病。此類淋巴瘤和淋巴細胞性白血病包括例如a)濾泡性淋巴瘤，b)小無核裂細胞淋巴瘤(small Non-Cleaved Cell Lymphoma)/伯基特(Burkitt)氏淋巴瘤(包括地方性伯基特氏淋巴瘤，散發性伯基特氏淋巴瘤和非伯基特氏淋巴瘤)，c)邊緣區淋巴瘤(包括結外邊緣區B細胞淋巴瘤(粘膜相關淋巴組織淋巴瘤，MALT)，結邊緣區B細胞淋巴瘤和脾邊緣區淋巴瘤)，d)套細胞淋巴瘤(MCL)，e)大細胞淋巴瘤(包括B細胞彌漫性大細胞淋巴瘤(DLCL)，彌漫性混合細胞淋巴瘤，免疫母細胞性淋巴瘤，原發性縱隔B細胞淋巴瘤，血管中心性淋巴瘤-肺B細胞淋巴瘤)，f)毛細胞白血病，g)淋巴細胞性淋巴瘤，瓦爾登斯特倫(waldenstrom)氏巨球蛋白血症，h)急性淋巴細胞性白血病(ALL)，慢性淋巴細胞性白血病(CLL)/小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)，B細胞幼淋巴細胞白血病，i)漿細胞贅生物，漿細胞骨髓瘤，多發性骨髓瘤，漿細胞瘤，和/或j)霍奇金氏病。
在任何方法的一些實施方式中，該癌症是B細胞增殖性病症。在一些實施方式中，該B細胞增殖性病症是淋巴瘤，非霍奇金(Hodgkin)氏淋巴瘤(NHL)，攻擊性NHL，復發性攻擊性NHL，復發性無痛性NHL，頑固性NHL，頑固性無痛性NHL，慢性淋巴細胞性白血病(CLL)，小淋巴細胞淋巴瘤，白血病，毛細胞白血病(HCL)，急性淋巴細胞性白血病(ALL)，或套細胞淋巴瘤。在一些實施方式中，該B細胞增殖性病症是NHL，諸如無痛性NHL和/或攻擊性NHL。在一些實施方式中，該B細胞增殖性病症是無痛性濾泡性淋巴瘤或彌漫性大B細胞淋巴瘤。
在又一個方面，本發明提供藥物配製劑，其包含本文中提供的任何抗OX40抗體，例如用於任何上述治療方法。在一個實施方式中，藥物配製劑包含本文中提供的任何抗OX40抗體和藥學可接受載劑。在另一個實施方式中，藥物配製劑包含本文中提供的任何抗OX40抗體和至少一種別的治療劑，例如下文所述。
在本發明的任何方法的一些實施方式中，該抗人類OX40促效性抗體通過抑制Treg功能(例如抑制Treg的遏制性功能)，殺死表現OX40的細胞(例如表現高位準OX40的細胞)，提高效應T細胞功能和/或提高記憶T細胞功能來抑制腫瘤免疫。在本發明的任何方法的一些實施方式中，該抗人類OX40促效性抗體通過抑制Treg功能(例如抑制Treg的遏制性功能)，殺死表現OX40的細胞(例如表現高位準OX40的細胞)，提高效應T細胞功能和/或提高記憶T細胞功能來治療癌症。在本發明的任何方法的一些實施方式中，該抗人類OX40促效性抗體通過抑制Treg功能(例如抑制Treg的遏制性功能)，殺死表現OX40的細胞(例如表現高位準OX40的細胞)，提高效應T細胞功能和/或提高記憶T細胞功能來增強免疫功能。在本發明的任何方法的一些實施方式中，該抗人類OX40促效性抗體通過抑制Treg功能(例如抑制Treg的遏制性功能)，殺死表現OX40的細胞(例如表現高位準OX40的細胞)，提高效應T細胞功能和/或提高記憶T細胞功能來增強T細胞功能。
在任何方法的一些實施方式中，該抗人類OX40促效性抗體是消減性抗人類OX40促效性抗體。在一些實施方式中，該抗人類OX40促效性抗體處理導致細胞消減(例如消減表現OX40的細胞，例如消減表現高位準OX40的細胞)。在一些實施方式中，消減是通過ADCC進行的。在一些實施方式中，消減是通過吞噬進行的。
在任何方法的一些實施方式中，相對於施用該OX40促效性抗體之前的Treg功能，該抗人類OX40促效性抗體例如通過抑制效應和/或記憶T細胞功能(在一些實施方式中，效應T細胞和/或記憶T細胞增殖和/或細胞介素分泌)的Treg遏制來抑制Treg功能。在任何方法的一些實施方式中，相對於施用該OX40促效性抗體之前的效應T細胞增殖，該抗人類OX40促效性抗體提高效應T細胞增殖。在任何方法的一些實施方式中，相對於施用該OX40促效性抗體之前的記憶T細胞增殖，該抗人類OX40促效性抗體提高記憶T細胞增殖。在任何方法的一些實施方式中，相對於施用該OX40促效性抗體之前的效應T細胞細胞介素生成，該抗人類OX40促效性抗體提高效應T細胞細胞介素生成(例如γ-干擾素生成)。在任何方法的一些實施方式中，相對於施用該OX40促效性抗體之前的記憶T細胞細胞介素生成，該抗人類OX40促效性抗體提高記憶T細胞細胞介素生成(例如γ-干擾素生成)。在任何方法的一些實施方式中，相對於施用該OX40促效性抗體之前的CD4+效應T細胞增殖和/或CD8+效應T細胞增殖，該抗人類OX40促效性抗體提高CD4+效應T細胞增殖和/或CD8+效應T細胞增殖。在任何方法的一些實施方式中，相對於施用該OX40促效性抗體之前的記憶T細胞增殖，該抗人類OX40促效性抗體提高記憶T細胞增殖(例如CD4+記憶T細胞增殖)。在一些實施方式中，相對於施用該抗人類OX40促效性抗體的之前的增殖，細胞介素分泌和/或溶胞活性，個體中的CD4+效應T細胞具有增強的增殖，細胞介素分泌和/或溶胞活性。
在本發明的任何方法的一些實施方式中，CD4+效應T細胞的數目相對於施用該抗人類OX40促效性抗體之前升高。在一些實施方式中，CD4+效應T細胞細胞介素分泌相對於施用該抗人類OX40促效性抗體之前升高。在任何方法的一些實施方式中，個體中的CD8+效應T細胞具有相對於施用該抗人類OX40促效性抗體之前增強的增殖，細胞介素分泌和/或溶胞活性。在一些實施方式中，CD8+效應T細胞的數目相對於施用該抗人類OX40促效性抗體之前升高。在一些實施方式中，CD8+效應T細胞細胞介素分泌相對於施用該抗人類OX40促效性抗體之前升高。
在本發明的任何方法的一些實施方式中，該抗人類OX40促效性抗體結合人類效應細胞，例如結合由人類效應細胞表現的FcγR。在一些實施方式中，該人類效應細胞實施ADCC效應器功能。在一些實施方式中，該人類效應細胞實施吞噬效應器功能。
在本發明的任何方法的一些實施方式中，包含變異IgG1Fc多肽(其包含消除對人類效應細胞的結合的突變，例如DANA或N297G突變)的抗人類OX40促效性抗體具有相對於包含天然序列IgG1Fc部分的抗人類OX40促效性抗體降低的活性(例如CD4+效應T細胞功能，例如增殖)。在一些實施方式中，包含變異IgG1Fc多肽(其包含消除對人類效應細胞的結合的突變，例如DANA或N297G突變)的抗人類OX40促效性抗體並不擁有實質性活性(例如CD4+效應T細胞功能，例如增殖)。
在本發明的任何方法的一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體功能需要抗體交聯。在一些實施方式中，功能是刺激CD4+效應T細胞增殖。在一些實施方式中，抗體交聯是通過提供粘附至固體表面(例如細胞培養板)的抗人類OX40促效性抗體而測定的。在一些實施方式中，抗體交聯是通過在該抗體的IgG1Fc部分中引入突變(例如DANA或N297S突變)並測試突變體抗體的功能而測定的。
在任何方法的一些實施方式中，個體中的記憶T細胞具有相對於施用該抗人類OX40促效性抗體之前增強的增殖和/或細胞介素分泌。在一些實施方式中，記憶T細胞的數目相對於施用該抗人類OX40促效性抗體之前升高。在一些實施方式中，記憶T細胞細胞介素分泌(位準)相對於施用該抗人類OX40促效性抗體之前升高。在任何方法的一些實施方式中，個體中的Treg具有相對於施用該抗人類OX40促效性抗體之前降低的效應T細胞功能(例如增殖和/或細胞介素分泌)抑制。在一些實施方式中，效應T細胞的數目相對於施用該抗人類OX40促效性抗體之前升高。在一些實施方式中，效應T細胞細胞介素分泌(位準)相對於施用該抗人類OX40促效性抗體之前升高。
在本發明的任何方法的一些實施方式中，腫瘤內(浸潤性)CD4+效應T細胞的數目(例如CD4+效應T細胞的總數，或例如CD45+細胞中CD4+細胞的百分比)相對於施用該抗人類OX40促效性抗體之前升高。在本發明的任何方法的一些實施方式中，表現γ-干擾素的腫瘤內(浸潤性)CD4+效應T細胞的數目(例如總的表現γ-干擾素的CD4+細胞，或例如總的CD4+細胞中表現γ-干擾素的CD4+細胞的百分比)相對於施用抗人類OX40促效性抗體之前升高。
在本發明的任何方法的一些實施方式中，腫瘤內(浸潤性)CD8+效應T細胞的數目(例如CD8+效應T細胞的總數，或例如CD45+細胞中CD8+的百分比)相對於施用抗人類OX40促效性抗體之前升高。在本發明的任何方法的一些實施方式中，表現γ-干擾素的腫瘤內(浸潤性)CD8+效應T細胞的數目(例如總的CD8+細胞中表現γ-干擾素的CD8+細胞的百分比)相對於施用抗人類OX40促效性抗體之前升高。
在本發明的任何方法的一些實施方式中，腫瘤內(浸潤性)Treg的數目(例如Treg的總數或例如CD4+細胞中Fox3p+細胞的百分比)相對於施用抗人類OX40促效性抗體之前降低。
在本發明的任何方法的一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體的施用與腫瘤抗原的施用組合。在一些實施方式中，該腫瘤抗原包含蛋白質。在一些實施方式中，該腫瘤抗原包含核酸。在一些實施方式中，該腫瘤抗原是腫瘤細胞。
在本發明的任何方法的一些實施方式中，該癌症展示人類效應細胞(例如受到人類效應細胞浸潤)。用於檢測人類效應細胞的是方法本領域公知的，包括例如通過IHC。在一些實施方式中，該癌症展示高位準的人類效應細胞。在一些實施方式中，人類效應細胞是NK細胞，巨噬細胞，單核細胞中的一項或多項。在一些實施方式中，該癌症是本文中描述的任何癌症。在一些實施方式中，該癌症是非小細胞肺癌(NSCLC)，成膠質細胞瘤，成神經細胞瘤，黑色素瘤，乳腺癌(例如三重陰性乳腺癌)，胃癌，結直腸癌(CRC)，或肝細胞癌。
在本發明的任何方法的一些實施方式中，該癌症展示表現FcR的細胞(例如受到表現FcR的細胞浸潤)。用於檢測FcR的方法是本領域公知的，包括例如通過IHC。在一些實施方式中，該癌症展示高位準的表現FcR的細胞。在一些實施方式中，FcR是FcγR。在一些實施方式中，FcR是活化性FcγR。在一些實施方式中，該癌症是非小細胞肺癌(NSCLC)，成膠質細胞瘤，成神經細胞瘤，黑色素瘤，乳腺癌(例如三重陰性乳腺癌)，胃癌，結直腸癌(CRC)，或肝細胞癌。
依照任何上述實施方式的"個體"優選是人類。
可以單獨或與療法中的其它藥劑組合使用本發明的抗體。例如，可以與至少一種別的治療劑共施用本發明的抗體。
上文記錄的此類組合療法涵蓋組合施用(其中兩種或更多種治療劑包含在同一配製劑或分開的配製劑中)，和分開施用，在該情況中，可以在施用別的治療劑和/或藥劑之前，同時，和/或之後發生本發明的抗體的施用。在一個實施方式中，抗OX40抗體的施用和別的治療劑的施用彼此在約一個月內，或約一，兩或三周內，或約1，2，3，4，5，或6天內發生。也可以與放射療法組合使用本發明的抗體。
在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與化療或化療劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與放療或放療劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與靶向療法或靶向治療劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與免疫療法或免疫治療劑，例如單株抗體聯合施用。
在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與PARP抑制劑(例如Olaparanib，Rucaparib，Niraparib，Cediranib，BMN673，Veliparib)，Trabectedin，nab-paclitaxel(清蛋白結合的帕利他賽，ABRAXANE)，Trebananib，Pazopanib，Cediranib，Palbociclib，everolimus，氟尿嘧啶(例如FOLFOX，F0LFIRI)，IFL，regorafenib，Reolysin，Alimta，Zykadia，Sutent，Torisel(temsirolimus)，Inlyta(axitinib，Pfizer)，Afinitor(everolimus，Novartis)，Nexavar(sorafenib，Onyx/Bayer)，Votrient，Pazopanib，axitinib，IMA-901，AGS_003，cabozantinib，Vinflunine，Hsp90抑制劑(例如apatorsin)，Ad-GM-CSF(CT-0070)，Temazolomide，IL-2，IFNa，vinblastine，Thalomid，dacarbazine，cyclophosphamide，lenalidomide，azacytidine，lenalidomide，bortezomid(VELCADE)，amrubicine，carfilzomib，pralatrexate，和/或enzastaurin聯合施用。
在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與PD-1軸結合拮抗劑聯合施用。PD-1軸結合拮抗劑包括但不限於PD-1結合拮抗劑，PD-L1結合拮抗劑和PD-L2結合拮抗劑。“PD-1”的備選名稱包括CD279和SLEB2。“PD-L1”的備選名稱包括B7-Hl，B7-4，CD274和B7-H。“PD-L2”的備選名稱包括B7-DC，Btdc，和CD273。在一些實施方式中，PD-l，PD-Ll，和PD-L2是人類PD-1，PD-L1和PD-L2。在一些實施方式中，PD-1結合拮抗劑是抑制PD-1結合其配體結合配偶的分子。在一個具體方面，PD-1配體結合配偶是PD-Ll和/或PD-L2。在另一個實施方式中，PD-Ll結合拮抗劑是抑制PD-Ll結合其結合配偶的分子。在一個具體方面，PD-Ll結合配偶是PD-1和/或B7-1。在另一個實施方式中，PD-L2結合拮抗劑是抑制PD-L2結合其結合配偶的分子。在一個具體方面，PD-L2結合配偶是PD-1。拮抗劑可以是抗體，其抗原結合片段，免疫粘附素，融合蛋白，或寡肽。在一些實施方式中，PD-1結合拮抗劑是抗PD-1抗體(例如人類抗體，人源化抗體，或嵌合抗體)。在一些實施方式中，抗PD-1抗體選自下組：MDX-1106(nivolumab，0PDIV0)，Merck 3475(MK-3475，pembrolizumab，KEYTRUDAWPCT-011 (Pidilizumab)。在一些實施方式中，PD-1結合拮抗劑是免疫粘附素(例如包含融合至恆定區(例如免疫球蛋白序列的Fc區)的，PD-L1或PD-L2的胞外或PD-1結合部分的免疫粘附素)。在一些實施方式中，PD-1結合拮抗劑是AMP-224。在一些實施方式中，PD-Ll結合拮抗劑是抗PD-Ll抗體。在一些實施方式中，抗PD-Ll結合拮抗劑選自下組:YW243.55. S70，MPDL3280A，MEDI4736和MDX-1105。MDX-1105，也稱作BMS-936559，是WO2007/005874中記載的抗PD-Ll抗體。抗體YW243.55.S70是WO 2010/077634 A1 中記載的抗PD-Ll。MDX-1106，也稱作MDX-1106-04，0N0-4538，BMS-936558或 nivolumab，是WO2006/121168中記載的抗PD-1抗體。Merck 3475，也稱作MK-3475，SCH- 900475或pembrolizumab，是WO2009/114335中記載的抗PD-1 抗體。CT-011，也稱作hBAT， hBAT-1 或 pidil izumab，是WO2009/101611中記載的抗PD-1抗體。AMP-224，也稱作 B7-DCIg， 是WO2010/027827和WO2011/066342中記載的PD-L2-Fc融合可溶性受體。在一些實施方式 中，抗PD-1抗體是MDX-1106。“MDX-1106”的備選名稱包括MDX-1106-04，0N0-4538，BMS-936558或nivoIumab。在一些實施方式中，抗PD-1抗體是nivolumab (CAS註冊號：946414-94-4)。
在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與針對活化性共刺激分子的促效劑聯合施用。在一些實施方式中，活化性共刺激分子可包括CD40，CD226，CD28，GITR，CD137，CD27, HVEM，或CD127。在一些實施方式中，針對活化性共刺激分子的促效劑是結合CD40，CD226，CD28，OX40，GITR，CDl37，CD27，HVEM，或CDl27的促效性抗體。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與針對抑制性共刺激分子的拮抗劑聯合施用。在一些實施方式中，抑制性共刺激分子可包括CTLA-4(也稱作CD152)，PD-1，ΊΊΜ-3，BTLA，VISTA，LAG-3，B7-H3，B7-H4，IDO，TIGIT，MICA/B，或精胺酸酶。在一些實施方式中，針對抑制性共刺激分子的拮抗劑是結合CTLA-4，PD-1，ΊΊΜ-3，BTLA，VISTA，LAG-3(例如LAG-3-IgG融合蛋白(IMP321))，B7-H3，B7-H4，IDO，TIGIT，MICA/B，或精胺酸酶的拮抗性抗體。
在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與針對CTLA_4(也稱作CD152)的拮抗劑，例如阻斷性抗體聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與ipiIimumab(也稱作MDX-010，MDX-101，或Yervoy®)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與tremelimumab (也稱作ticilimumab或CP-675，206)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與針對B7-H3 (也稱作CD276)的拮抗劑，例如阻斷性抗體聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與MGA271聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與針對TGFP的拮抗劑，例如metelimumaM也稱作CAT-192)，fresoIimumab(也稱作GC1008)，或LY2157299聯合施用。
在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與包含過繼轉移表現嵌合抗原受體 (CAR)的T細胞(例如細胞毒性T細胞或CTL)的治療聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與UCART19聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與WT128z聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與KTE-C19(Kite)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與CTL019(Novartis)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與包含過繼轉移包含顯性陰性TGFI3受體，例如，顯性陰性TGFWI型受體的T細胞的治療聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與包含HERCREEM方案的治療(參見例如ClinicalTrials.gov Identifier NCT00889954)聯合施用。
在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與針對CD19的拮抗劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與M0R00208聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與針對CD38的拮抗劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與daratumumab聯合施用。
在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與針對CD137(也稱作TNFRSF9，4-1BB，或ILA)的促效劑，例如活化性抗體聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與urelumab(也稱作BMS-663513)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與針對CD40的促效劑，例如活化性抗體聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與CP-870893聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與針對OX40(也稱作CDl34)的促效劑，例如活化性抗體聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與不同的抗OX40抗體(例如AgonOX)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與針對CD27的促效劑，例如活化性抗體聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與CDX-1127聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與針對吲哚胺-2，3_雙加氧酶(IDO)的拮抗劑聯合施用。在一些實施方式中，該IDO拮抗劑是1-甲基-D-色胺酸(也稱作I-D-MT)。
在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與針對CD137(也稱作TNFRSF9，4-1BB，或ILA)的促效劑，例如活化性抗體聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與urelumab(也稱作BMS-663513)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與針對CD40的促效劑，例如活化性抗體聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與CP-870893或R07009789聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與針對OX40(也稱作CD134)的促效劑，例如活化性抗體聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與針對CD27的促效劑，例如活化性抗體聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與CDX-1127(也稱作varlilumab)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與針對吲哚胺-2，3-雙加氧酶(IDO)的拮抗劑聯合施用。在一些實施方式中，該IDO拮抗劑是1-甲基-D-色胺酸(也稱作1-D-MT)。在一些實施方式中，該IDO拮抗劑是W02010/005958(通過此處記錄明確收錄其內容)中所示IDO拮抗劑。在一些實施方案中，該IDO詰抗劑是4_({2_[(胺基磺醯基)胺基]乙基}胺基)-N_(3-溴-4-氟苯基)-Ν'-羥基-1，2，5-噁二唑-3-甲脒(例如如W02010/005958實施例23中記載的)。在一些實施方式實施方式中，該IDO拮抗劑是
Figure 02_image003
在一些實施方式中，該IDO拮抗劑是INCB24360。在一些實施方式中，該IDO拮抗劑是Indoximod(l-甲基-色胺酸的D異構體)。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與抗體-藥物綴合物聯合施用。在一些實施方式中，該抗體-藥物綴合物包含mertansine或單甲基奧瑞司他汀E(MMAE)。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與抗NaPi2b抗體-MMAE綴合物(也稱作DNIB0600A，RG7599或Iifastuzumab vedotin)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與trastuzumab emtansine(也稱作T-DM1，ado_trastuzumab emtansine，或KADCYL.A® ,Genentech)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與抗MUC16抗體-MMAE綴合物，DMUC5754A聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與抗MUC16抗體-MMAE綴合物，DMUC4064A聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與靶向內皮縮血管肽B受體(EDNBR)的抗體-藥物綴合物，例如綴合有MMAE的針對EDNBR的抗體聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與靶向淋巴細胞抗原6複合物，基因座E(Ly6E)的抗體-藥物綴合物，例如綴合有MMAE的針對Ly6E的抗體(也稱作DLYE5953A)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與polatuzumab vedotin聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與靶向CD30的抗體-藥物綴合物聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與ADCETRIS(也稱作brentuximab vedotin)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與polatuzumab vedotin聯合施用。
在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與血管發生抑制劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與針對VEGF，例如VEGF-A的抗體聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與貝伐珠單抗(也稱作AVASTIN®,Genentech)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與針對血管生成素2(也稱作Ang2)的抗體聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與MEDI3617聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與針對VEGFR2的抗體聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與ramucirumab聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與VEGF受體融合蛋白聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與aflibercept聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與ziv-aflibercept(也稱作VEGF陷阱或ZALTRAP®)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與針對VEGF和Ang2的雙特異性抗體聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與RG7221(也稱作vanucizumab)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與血管發生抑制劑聯合和與PD-1軸結合拮抗劑(例如PD-1結合拮抗劑諸如抗PD-1抗體，PD-Ll結合拮抗劑諸如抗PD-Ll抗體，和PD-L2結合拮抗劑諸如抗PD-L2抗體)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與貝伐珠單抗和PD-1軸結合拮抗劑(例如PD-1結合拮抗劑諸如抗PD-1抗體，PD-L1結合拮抗劑諸如抗PD-Ll抗體，和PD-L2結合拮抗劑諸如抗PD-L2抗體)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與貝伐珠單抗和MDX-1106(nivolumab，OPDIVO)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與貝伐珠單抗和Merck 3475(MK-3475，pembrolizumab，KEYTRUDA)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與貝伐珠單抗和CT-011(Pidilizumab)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與貝伐珠單抗和YW243.55. S70聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與貝伐珠單抗和MPDL3280A聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與貝伐珠單抗和MEDI4736聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與貝伐珠單抗和MDX-1105聯合施用。
在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與抗腫瘤劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與靶向CSF-1R(也稱作M-CSFR或CD115)的藥劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與抗CSF-1R抗體(也稱作IMC-CS4或LY3022855)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與抗CSF-1R抗體，RG7155(也稱作R05509554或emactuzumab)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與干擾素，例如干擾素-α或干擾素-γ聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與Roferon-A(也稱作重組干擾素a-2a)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與GM-CSF(也稱作重組人類粒細胞巨噬細胞集落刺激因子，rhu GM-CSF，sargramostim，或Leukine®)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與IL-2(也稱作aldesleukin或Proleukin®)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與IL-12聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與IL27聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與IL-15聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與ALT-803聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與靶向CD20的抗體聯合施用。在一些實施方式中，靶向CD20的抗體是奧奴珠單抗(也稱作GAlO 1或Gazyva®)或利妥昔單抗。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與靶向GITR的抗體聯合施用。在一些實施方式中，靶向GITR的抗體是TRX518。在一些實施方式中，靶向GITR的抗體是MK04166(Merck)。
在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與Bruton氏酪胺酸激酶(BTK)的抑制劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與ibrutinib聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與疫苗脫氫酶I(IDH1)和/或疫苗脫氫酶2(IDH2)的抑制劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與AG-120(Agios)聯合施用。
在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與奧奴珠單抗和PD-1軸結合拮抗劑(例如PD-1結合拮抗劑諸如抗PD-1抗體，PD-Ll結合拮抗劑諸如抗PD-Ll抗體，和PD-L2結合拮抗劑諸如抗PD-L2抗體)聯合施用。
在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與癌症疫苗聯合施用。在一些實施方式中，該癌症疫苗是肽癌症疫苗，其在一些實施方式中是個性化肽疫苗。在一些實施方式中，該肽癌症疫苗是多價長肽，多重肽，肽混合物，雜合肽，或經肽脈衝的樹突細胞疫苗(參見例如Yamada et al.，Cancer Sci，104:14-21,2013)。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與佐劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與包含TLR促效劑，例如Poly-ICLC(也稱作Hiltonol® )，LPS，MPL，或CpG ODN的治療聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與腫瘤壞死因子(TNF)a聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與IL-1聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與HMGBl聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與IL-10拮抗劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與IL-4拮抗劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與IL-13拮抗劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與IL-17拮抗劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與HVEM拮抗劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與ICOS促效劑(例如通過施用ICOS-L，或針對ICOS的促效性抗體)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與靶向CX3CL1的治療聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與靶向CXCL9的治療聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與靶向CXCLl0的治療聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與靶向CCL5的治療聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與LFA-I或ICAM1促效劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與選擇蛋白促效劑聯合施用。
在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與B-Raf的抑制劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與維羅非尼(也稱作Zelboraf®)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與dabrafenib(也稱作Tafinlar®)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與encorafenib (LGX818)聯合施用。
在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與EGFR抑制劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與erlotinib(也稱作Tarceva®)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與EGFR-T790M的抑制劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與gefitinib聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與afatinib聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與西妥昔單抗(也稱作Erbitux®)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與panitumumab(也稱作Vectibix®)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與rociletinib聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與AZD9291聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與MEK，諸如MEK1(也稱作MAP2K1)和/或MEK2(也稱作MAP2K2)的抑制劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與cobimetinib(也稱作CDC-0973或XL-518)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與trametinib(也稱作Mekinist®)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與binimetinib聯合施用。
在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與B-Raf的抑制劑(例如維羅非尼或dabrafenib)和MEK(例如MEKl和/或MEK2)的抑制劑(例如cobimetinib或trametinib)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與ERK(例如ERK1/2)的抑制劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與GDC-0994聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與B-Raf的抑制劑，MEK的抑制劑，和ERK1/2的抑制劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與EGFR的抑制劑，MEK的抑制劑，和ERK1/2的抑制劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與一種或多種MAP激酶途徑抑制劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與CK127聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與K-Ras的抑制劑聯合施用。
在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與c-Met的抑制劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與onartuzumab(也稱作MetMAb)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與anaplatic淋巴瘤激酶(ALK)的抑制劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與AF802(也稱作CH5424802或alectinib)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與crizotinib聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與ceritinib聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K)的抑制劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與buparlisib(BKM-120)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與pictilisib(也稱作GDC-0941)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與buparlisib(也稱作BKM-120)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與perifosine(也稱作KRX-0401)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K)的δ選擇性抑制劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與idelalisib(也稱作GS-1101或CAL-101)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與taselisib(也稱作GDC-0032)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與BYL-719聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與Akt的抑制劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與MK2206聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與GSK690693聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與ipatasertib(也稱作CDC-0068)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與mTOR的抑制劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與sirolimus(也稱作rapamycin)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與temsirolimus(也稱作CCI-779或Torisel·®)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與everolimus(也稱作RADOO1)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與ridaforoIimus(也稱作AP-23573，MK_8669，或deforolimus)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與0SI-027聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與AZD8055聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與INK128聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與雙重PI3K/mT0R抑制劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與XL765聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與GDC-0980聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與BEZ235(也稱作NVP-BEZ235)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與BGT226聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與GSK2126458聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與PF-04691502聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與PF-05212384(也稱作PKI-587)聯合施用。
在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與選擇性降解雌激素受體的藥劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與GDC-0927聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與HER3的抑制劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與duligotuzumab聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與LSDl的抑制劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與MDM2的抑制劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與BCL2的抑制劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與venetoclax聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與CHKl的抑制劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與CDC-0575聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與活化的hedgehog信號傳導途徑的抑制劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與ERIVEDGE聯合施用。
在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與放射療法聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與吉西他濱聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與nab-pacIitaxeI(ABRAXANE)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與曲妥珠單抗聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與TVEC聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與IL27聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與環磷醯胺聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與募集T細胞至腫瘤的藥劑聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與lirilumab(IPH2102/BMS-986015)聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與Idelalisib聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與靶向CD3和CD20的抗體聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與REGN1979聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與靶向CD3和CD19的抗體聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與blinatumomab聯合施用。
在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與溶瘤病毒聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與卡鉬和nab-paclitaxel聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與卡鉑和帕利他賽聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與順鉑和培美曲塞聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與順鉑和吉西他濱聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與FOLFOX聯合施用。在一些實施方式中，抗人類OX40促效性抗體可以與F0LFIRI聯合施用。
上文記錄的此類組合療法涵蓋組合施用(其中兩種或更多種治療劑包含在同一配製劑或分開的配製劑中)，和分開施用，在該情況中，可以在施用別的治療劑和/或佐劑之前，同時，和/或之後發生本發明抗體的施用。也可以與放射療法組合使用本發明抗體。
可以通過任何合適的手段(包括胃腸外，肺內，和鼻內，及若期望用於局部治療的話，損傷內施用)來施用本發明抗體(和任何別的治療劑)。胃腸外輸注包括肌肉內，靜脈內，動脈內，腹膜內，或皮下施用。部分根據施用是短暫的還是長期的，劑量給藥可以通過任何合適的路徑(例如通過注射，諸如靜脈內或皮下注射)來進行。本文中涵蓋各種劑量給藥日程表，包括但不限於單次施用或在多個時間點裡的多次施用，推注施用，和脈衝輸注。
本發明抗體會以一種符合優秀的醫學實踐的方式配製，定劑量和施用。在此背景中考慮的因素包括所治療的特定病症，所治療的特定哺乳動物，患者個體的臨床狀況，病症的起因，藥劑投遞部位，施用方法，施用日程表及醫學從業人員知道的其它因素。抗體無需但任選與一種或多種目前用於預防或治療所討論病症的藥劑一起配製。此類其它藥物的有效量取決於配製劑中存在的抗體的量，病症或治療的類型，及上文所述其它因素。這些通常以本文所述相同的劑量和施用途徑使用，或以約1-99%的本文所述劑量使用，或以憑經驗/臨床上確定為適宜的任何劑量和任何途徑使用。
為了預防或治療疾病，本發明抗體(當單獨或與一種或多種其它別的治療劑組合使用時)的適宜劑量會取決於要治療的疾病的類型，抗體的類型，疾病的嚴重性和病程，施用抗體是預防還是治療目的，之前的療法，患者的臨床史和對抗體的反應，及主治醫師的斟酌。抗體適合於在一次或一系列的治療中施用於患者。根據疾病的類型和嚴重性，約1 μg/kg至40 mg/kg的抗體可以作為初始候選劑量施用於患者，無論是例如通過一次或多次分開的施用或者是通過連續輸注。根據上文所述因素，一種典型的日劑量可以在約l μg/kg至100 mg/kg或更多的範圍中。對於幾天或更長時間上的重複施用，根據狀況，治療通常會持續直至疾病症狀發生期望的阻抑。此類劑量可間歇施用，例如每週或每三周(例如使得患者接受約2至約20劑，或例如約6劑抗體)。可以施用較高的初始載入劑，接著是較低的一或多劑。然而，其它劑量方案可能是有用的。此療法的進展易於通過常規技術和測定法來監測。
應當理解，可以使用本發明的免疫綴合物代替或補充抗OX40抗體來實施任何上述配製劑或治療性方法。 實施例實施例 1. 抗 OX40 抗體的製備和篩選 實施例 1.1 構建報告細胞系 Jurkat/NF-κB-GFP +hOX40
NF-κB-GFP 報告基因慢病毒系統(QIAGEN，CCS-013G)的啟動子中有多個NF-κB轉錄因子結合元件，該啟動子可以驅動GFP表現。根據試劑盒的說明書，用 NF-κB-GFP 報告基因慢病毒感染 Jurkat 細胞(ATCC，TIB-152)，並用嘌呤黴素(InvivoGen，ant-pr-1)篩選感染慢病毒的 Jurkat 細胞。加入10 ng/ml TNFα 蛋白(Sino Biological，10602-HNAE)刺激利用嘌呤黴素篩選到的細胞，24h後用流式細胞儀(BD，FACSAria III)分選表現 GFP 螢光的細胞亞群，獲得Jurkat/ NF-κB-GFP 細胞。
將人類OX40 CDS(Sino Biological，HG10481-UT)構建至慢病毒核心質體pCDH(System Biosciences)中，使用標準步驟用PEI(polyscience，24885-2)向293FT 細胞(Thermo Fisher Scientific，R70007)中按1：1：1：1 共轉染所獲得的慢病毒核心質體和輔助質體pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV、pVSVG(均來自System Biosciences)，轉染6h後換液，37 ℃培養於含10%胎牛血清(Biological Industries，04-001-1A)的DMEM培養基(Lifetechnologies，C11995500CP)中，繼續培養48h收集含有人類OX40慢病毒的上清。
本文所用陽性對照OX40L和HEL的DNA序列在金唯智公司進行全基因合成。對於OX40L和HEL純化，將DNA序列插入真核表現載體pFUSE(InvivoGen，pfuse-hg1fc1)中，使用標準步驟用PEI轉染至293F細胞(Thermo Fisher Scientific，R79007)；利用Freestyle培養基(Lifetechnologies，12338026)在37 ℃搖床培養細胞。培養7天后收集上清液，並在AKTA系統(GE)上使用Superdex™ 200 Increase預裝柱(GE，28-9909-44)純化。
OX40信號轉導可以活化NF-κB通路，如果OX40成功表現於Jurkat/NF-κB-GFP 細胞膜表面，OX40L刺激將會誘導GFP的表現。將如上所述分選獲得的構建好的Jurkat/NF-κB-GFP 細胞用上述獲得的人類OX40 慢病毒上清感染，16h後加入100 nM 上述獲得的OX40L蛋白(作為陽性對照)和HEL(作為陰性對照)進行刺激，24h後用流式細胞儀單細胞分選 GFP 螢光最強的細胞至 96 孔板中。
將上述96孔板中的細胞在含有10%胎牛血清(Biological Industries，04-001-1A)的RPMI 1640培養基(Lifetechnologies，C11875500CP)中培養2周，待單細胞長起來後分別加入100 nM 上述獲得三聚化OX40L蛋白(作為陽性對照)和HEL(作為陰性對照)，挑選OX40L強陽性、HEL陰性的單株作為Jurkat/NF-κB-GFP +hOX40(簡稱NF-κB-GFP +hOX40)細胞，用於後續實驗。結果如圖1，OX40L刺激後Jurkat/NF-κB-GFP +hOX40單株GFP陽性率為70.7%，HEL刺激無活化。實施例 1.2 從噬菌體展示抗體庫中篩選抗 OX40 抗體
從天津市血液中心及上海秒通生物公司購買30例健康成人外周血，利用ficoll分離液(灝洋，LDS1075)離心獲取PBMC，離心條件：20℃，2000rpm，升5降0模式30分鐘。使用如上所述獲得的PBMC構建人類天然抗體庫，庫的構建為常規方法(phage display，Tim Clackson and Henry B. Lowman)。將獲得抗體重鏈和輕鏈可變區隨機組合以單鏈抗體 scFv 的形式展示於噬菌體衣殼蛋白 pIII 的 N 端，獲得噬菌體展示抗體庫，庫容達到 1010 。
噬菌體篩選為常規技術(Phage Display: A Laboratory Manual，Carlos F Barbas III )。首先，將生物素化OX40蛋白(acrobiosystems)與如上所述獲得的噬菌體展示抗體庫室溫孵育2h。孵育結束後直接加入150 ul鏈黴親和素磁珠 Dynabeads M280(Lifetechnologies，11205D)， 在室溫混勻儀上孵育30 min。用0.05% PBS-tween(PBS：Lifetechnologies，70011044；Tween：Sigma-Aldrich，9005-64-5)洗去不與抗原結合的噬菌體，最後用 0.2 M甘胺酸-鹽酸(PH2.2)洗脫與抗原結合的噬菌體。應用洗脫的噬菌體感染大腸桿菌XL1-blue(Agilent，200236)，加入輔助噬菌體VCSM13(Agilent，200251)擴增後用於下一輪篩選。共進行三輪篩選。三輪後，富集與 CD40 結合的抗體噬菌體，篩選結果如表1。 表1 利用噬菌體展示技術從人類天然抗體庫中篩選 抗OX40 抗體
    第第一輪 第第二輪 第第三輪
COX40 起起始數          11×1013 11×1012 11×1012
獲獲得數 33×106 34.6×107 39.6×109
為了初步評估篩選到的抗OX40抗體的陽性率，我們分別挑取第二、三輪 22 個噬菌體單株，進行噬菌體ELISA分析。噬菌體ELISA為常規技術，具體如下：從深孔板中培養的噬菌體單株中各挑取第二、三輪22 個噬菌體單株，在37 ℃ 300 rpm下振搖培養至OD = 0.5～0.8，加入輔助噬菌體VCSM13擴增後30℃ 過夜誘導噬菌體，用於抗體表現。在ELISA板(Corning，3690)上包被1 μg/ml的人類源OX40 (Acrobiosystems，OX0-H5224)，4℃過夜孵育。向過夜孵育後的ELISA板上加入過夜誘導的噬菌體上清，室溫孵育1h，0.05% PBST洗8次。利用BSA(Solarbio，A8020-100)作為陰性對照。加入HRP偶聯的抗-M13(GE，27-9421-01，M13為噬菌體衣殼蛋白)檢測結合的抗體噬菌體。將OX40結合信號是 BSA對照的3倍以上定義為陽性殖株。結果如圖2，其中第二輪篩選、第三輪篩選的陽性率分別為4.5%、40.9%。實施例 1.3 共刺激受體 OX40 的促效劑抗體的篩選
首先，我們將從第三輪噬菌體展示富集到的抗體亞殖株到分泌型慢病毒載體pCDH中，同時將N27 ScFv選殖到分泌型慢病毒載體pCDH中作為陰性對照。向293FT 細胞中按1：1：1：1 共轉染慢病毒核心質體和輔助質體pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV、pVSVG，轉染6h後換液，37 ℃培養於含10%胎牛血清(Biological Industries，04-001-1A)的DMEM培養基中，繼續培養48h收集含有抗OX40抗體慢病毒文庫的上清；用50000 pg 所獲得的抗OX40抗體的慢病毒文庫感染HEK293細胞，感染16 h後，離心去除含有慢病毒的培養基，添加新鮮培養基，利用流式分選技術將感染的HEK293細胞分選到96孔板中，使每個孔僅含有1個感染HEK293細胞，培養細胞3周，待細胞達到一定數量後取上清。上清中加入如上所述獲得的Jurkat/NF-κB-GFP+hOX40報告細胞3×105 個，同時加入2.5 μg/ml山羊抗人類Fc(SouthernBiotech，SBA-2048-01)的二抗，交聯細胞分泌的抗體以增強促效劑抗體的活化強度；培養24h後測試細胞上清的活性，陽性抗體的檢測結果如圖3；從細胞上清活性為陽性的HEK293細胞中提取抗體基因，構建至pFUSE載體進行測序，獲得陽性抗體11-1、2-1和2-2-1的序列。實施例 1.4 抗 OX40 抗體的表現和純化
根據篩選出的抗OX40抗體的序列，合成抗OX40抗體的重鏈和輕鏈編碼核苷酸序列(各自的恆定區和可變區編碼核苷酸序列參見SEQ ID NO: 49-60)(金唯智公司)，將其分別選殖至載體pFUSE中，用PEI將分別含有重鏈和輕鏈的質體二者按1：1瞬時共轉染至293F懸浮細胞，以表現全長抗體。培養1周後在AKTA系統上使用Superdex™ 200 Increase預裝柱純化。
SDS-PAGE法鑒定純化抗體，應用分子排阻預裝柱 Superdex 200分析抗體的聚集。結果如圖4，其中2-2-1的洗脫峰形對稱且洗脫時的保留時間與單個分子量的單株抗體保持一致，同時抗體中存在少量聚集體。實施例 2. 抗 OX40 抗體的結合性質 實施例 2.1 抗 OX40 抗體與 OX40 蛋白的結合動力學
Biacore T200(GE Healthcare)用於檢測抗OX40抗體的親和力。將抗體以10μL/min流過Protein A晶片，捕獲在晶片上。用Running buffer (HBS-EP+，GE)梯度稀釋待測抗原人類OX40重組蛋白(Acrobiosystems，CD0-H5228)，濃度設置為2 μM、1 μM、500 nM、250 nM、125 nM、62.5 nM、31.25 nM。將上述不同濃度OX40按30 μL/min流速流過捕獲有抗體的晶片，結合120s，然後晶片以30μL/min的流速流過Running buffer，240s，抗原逐漸從捕獲抗體的晶片上解離。資料處理使用Biacore T200儀器配套軟體BIAevaluation software S200進行，計算結合常數(Ka)、解離常數(Kd)和平衡解離常數(KD)。結果如表2所示。 表2 應用表面電漿子共振技術平臺測量抗OX40抗體與人類OX40 的親和力
感測器 抗體 抗原 KD(M) Kon (1/Ms) Kdis (1/s) Full X^2 Full R^2
Protein A 2-1 OX40 1.63E-09 1.69E+06 2.76E-03 0.0163 0.9595
Protein A 11-1 OX40 1.72E-09 6.73E+05 1.16E-03 0.0011 0.9751
Protein A 2-2-1 OX40 3.03E-09 5.51E+05 1.67E-03 0.004 0.9884
實施例 2.2 抗 OX40 抗體阻斷 OX40L 蛋白與 OX40 蛋白結合
用ELISA評價抗OX40抗體對OX40L與OX40結合的作用。首先，使用蛋白生物素化試劑盒(GeneCopoeia，BI001)，根據說明書生物素化OX40L。在ELISA板上包被1 μg/ml的人類源OX40，4℃過夜孵育。加入如實施例1.4獲得的PBS稀釋至不同濃度的抗OX40抗體，HEL為對照抗體，室溫孵育1 h後，加入2.5 μg/ml 生物素化的OX40L，室溫孵育30 min後，0.05% PBS-Tween洗8次。加入Streptavidin-HRP使用酶標儀(SpectraMax i3x)讀取OD405數值，檢測結合OX40L與OX40的結合量。結果，所測試的抗OX40抗體阻斷OX40與OX40L的結合。實施例 3. 抗 OX40 抗體的體內抗腫瘤效力
5隻人源化OX40敲入C57BL/6小鼠購自上海南方模式生物研究中心。隔離5天后，用100 μl PBS中的8×105 個MC38腫瘤細胞(由南開大學張宏愷教授提供)背部皮下接種每隻小鼠。當腫瘤大小達到70-100 mm3 時，通過以100 μl PBS中10 mg/kg和q3dx3(每三天治療一次，共治療3次)向小鼠腹膜內施用抗OX40抗體(n=5)而開始抗OX40抗體治療，或者IgG1對照(n=5)。每週兩次測量腫瘤尺寸和小鼠體重，使用卡尺在兩個方向上測量腫瘤尺寸，並且使用以下公式以mm3表述體積：V = 0.5a×b2 ，其中a和b分別是腫瘤的長直徑和短直徑。當對照組的腫瘤大小達到1000 mm3 時，處死小鼠。
如圖5所示，所測試的抗OX40抗體相對於IgG1對照顯著抑制腫瘤生長。OX40促效劑抗體在OX40人源化小鼠結腸癌模型中抑制腫瘤生長。將0.8×105 小鼠結腸癌細胞MC38移植到 OX40人源化C57BL/6小鼠背部皮下，待腫瘤體積到70-100 mm3 時腹腔注射10mg/kg OX40促效劑抗體2-2-1，11-1和IgG對照抗體(n=5)，每三天治療一次，共治療3次。實施例 4. 抗 OX40 抗體的 T 細胞調節效果
剝離小鼠的脾臟和腫瘤，脾臟直接通過研磨，200目尼龍網過濾製備成單細胞懸液，腫瘤組織切成小塊後置於2ml酶混合液中(每ml酶含膠原蛋白酶1500U, 透明質酸酶1000U和DNA酶2.5ul)，在培養箱中150rpm ，37℃振盪1h。用200目尼龍網過濾並研磨沒有消化完全的組織塊製備成單細胞懸液，350g離心7分鐘，用2ml紅細胞裂解液重懸細胞 ，冰上孵育15分鐘，用PBS洗2遍並計數。
取1×107 細胞，用兔抗鼠CD16/CD32抗體冰上封閉15分鐘，PBS洗一遍。取1×106 細胞重懸在100ul PBS中，分別加入CD45，CD3，CD4和CD45，CD3，CD8抗體各1ul，4℃避光染色30分鐘，PBS洗兩遍後流式細胞儀分析CD4+ T細胞和CD8+ T細胞比例。CD45 + CD3 +CD4+定義為CD4+ T細胞，CD45 + CD3 +CD8+定義為CD8+ T細胞。
如圖6所示，所測試的抗OX40抗體相對於對照在脾和腫瘤中明顯上調輔助CD4+ T細胞和細胞毒性CD8+ T細胞。剝離小鼠的脾臟和腫瘤並製備單細胞懸液，CD45、CD3、CD4和CD8抗體染色，流式細胞儀分析CD4+和CD8+T細胞的比例，CD45 + CD3 +CD4+定義為CD4+T細胞，CD45 + CD3 +CD8+定義為CD8+T細胞。實施例 5. 交聯和可溶性抗 OX40 抗體的劑量依賴性作用
抗OX40抗體按照其促效方式不同可分兩類，第一類OX40促效活性不依賴Fc受體的交聯；另一類需要Fc受體交聯才具有CD40促效活性｡腫瘤組織及周圍引流淋巴結有更多腫瘤相關炎性細胞的存在,Fc受體FcγR2b在腫瘤細胞周圍有更多聚集｡因此，“交聯抗體”促效劑就具有了更高的組織選擇性,在腫瘤微環境中抗體才能產生明顯的促效作用,而在身體正常組織部位,作用能力會保持在低位準,這樣就能提高治療的安全窗｡
分別取3×105 個/管如實施例1.1中獲得的NF-κB-GFP+hOX40報告細胞，分別加入如實施例1.4中獲得的稀釋至不同濃度的抗OX抗體，利用HEL抗體做陰性對照；為了交聯，各組同時加入2.5 μg/ml濃度的二抗，即山羊抗人類 Fc。在含有10%胎牛血清(Biological Industries，04-001-1A)的RPMI 1640培養基(Lifetechnologies，C11875500CP)中37℃共同培養24h後，PBS洗三次，應用流式細胞儀進行分析。獲得的數據使用GraphPad Prism 6.0擬合曲線並計算EC50。結果如圖7所示，其中2-2-1對OX40的活化依賴二抗交聯，以交聯形式活化NF-κB-GFP+hOX40報告細胞系(圖7)。
雖然上文已經結合優選實施方式描述了本發明的原理，但應當清楚地理解，該描述僅通過示例的方式進行，而非作為對本發明的範圍的限制。 序列表
編號 名稱 序列
SEQ ID NO: 1 2-2-1重鏈可變區CDR1結構域胺基酸序列 GFTFSSYA
SEQ ID NO: 2 2-2-1重鏈可變區CDR2結構域胺基酸序列 ISGSGGST
SEQ ID NO: 3 2-2-1重鏈可變區CDR3結構域胺基酸序列 ARDLSSSWYLDAFDI
SEQ ID NO: 4 2-2-1重鏈可變區胺基酸序列 QVQLLQSGEGLVQEGGSLRLSCAASGFTFSSYA MSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGST YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLSSSWYLDAFDI WGQGTMVTVSS
SEQ ID NO: 5 2-2-1重鏈恆定區胺基酸序列 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 6 2-2-1重鏈信號肽胺基酸序列 MYRMQLLSCIALSLALVTNS
SEQ ID NO: 7 2-2-1重鏈全長胺基酸序列(不含信號肽) QVQLLQSGEGLVQEGGSLRLSCAASGFTFSSYA MSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGST YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLSSSWYLDAFDI WGQGTMVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 8 2-2-1重鏈全長胺基酸序列(含信號肽) MYRMQLLSCIALSLALVTNS QVQLLQSGEGLVQEGGSLRLSCAASGFTFSSYA MSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGST YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLSSSWYLDAFDI WGQGTMVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 9 2-2-1輕鏈可變區CDR1結構域胺基酸序列 QGISSW
SEQ ID NO: 10 2-2-1輕鏈可變區CDR2結構域胺基酸序列 AAS
SEQ ID NO: 11 2-2-1輕鏈可變區CDR3結構域胺基酸序列 QQANSFPLT
SEQ ID NO: 12 2-2-1輕鏈可變區胺基酸序列 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSW LAWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLT FGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 13 2-2-1輕鏈恆定區胺基酸序列 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 14 2-2-1輕鏈信號肽胺基酸序列 MYRMQLLSCIALSLALVTNS
SEQ ID NO: 15 2-2-1輕鏈全長胺基酸序列(不含信號肽) DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSW LAWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLT FGGGTKLEIK   RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 16 2-2-1輕鏈全長胺基酸序列(含信號肽) MYRMQLLSCIALSLALVTNS DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSW LAWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLT FGGGTKLEIK   RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
編號 名稱 序列
SEQ ID NO: 17 11-1重鏈可變區CDR1結構域胺基酸序列 GYTFTGHY
SEQ ID NO: 18 11-1重鏈可變區CDR2結構域胺基酸序列 VNPDTGDT
SEQ ID NO: 19 11-1重鏈可變區CDR3結構域胺基酸序列 VRPYWNMFGAMDV
SEQ ID NO: 20 11-1重鏈可變區胺基酸序列 QVQLVQSGAEVERPGASVKVSCKASGYTFTGHYIHWVRQAPGQGLEYMGHVNPDTGDTQSVQKFEGRVTMTSDTSINTAYMELSSLTPDDTAVYYCVRPYWNMFGAMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO: 21 11-1重鏈恆定區胺基酸序列 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 22 11-1重鏈信號肽胺基酸序列 MYRMQLLSCIALSLALVTNS
SEQ ID NO: 23 11-1重鏈全長胺基酸序列(不含信號肽) QVQLVQSGAEVERPGASVKVSCKASGYTFTGHYIHWVRQAPGQGLEYMGHVNPDTGDTQSVQKFEGRVTMTSDTSINTAYMELSSLTPDDTAVYYCVRPYWNMFGAMDVWGQGTTVTVSS   ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 24 11-1重鏈全長胺基酸序列(含信號肽) MYRMQLLSCIALSLALVTNS   QVQLVQSGAEVERPGASVKVSCKASGYTFTGHYIHWVRQAPGQGLEYMGHVNPDTGDTQSVQKFEGRVTMTSDTSINTAYMELSSLTPDDTAVYYCVRPYWNMFGAMDVWGQGTTVTVSS   ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 25 11-1輕鏈可變區CDR1結構域胺基酸序列 SSDVGSYDY
SEQ ID NO: 26 11-1輕鏈可變區CDR2結構域胺基酸序列 NVN
SEQ ID NO: 27 11-1輕鏈可變區CDR3結構域胺基酸序列 TSYTSINTWV
SEQ ID NO: 28 11-1輕鏈可變區胺基酸序列 QSALTQPASVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGSYDYVSWYQQHPGTVPKPMIYNVNTQPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCTSYTSINTWVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 29 11-1輕鏈恆定區胺基酸序列 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 30 11-1輕鏈信號肽胺基酸序列 MYRMQLLSCIALSLALVTNS
SEQ ID NO: 31 11-1輕鏈全長胺基酸序列(不含信號肽) QSALTQPASVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGSYDYVSWYQQHPGTVPKPMIYNVNTQPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCTSYTSINTWVFGGGTKLTVL   RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 32 11-1輕鏈全長胺基酸序列(含信號肽) MYRMQLLSCIALSLALVTNS   QSALTQPASVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGSYDYVSWYQQHPGTVPKPMIYNVNTQPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCTSYTSINTWVFGGGTKLTVL   RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
編號 名稱 序列
SEQ ID NO: 33 2-1重鏈可變區CDR1結構域胺基酸序列 DYNFADYY
SEQ ID NO: 34 2-1重鏈可變區CDR2結構域胺基酸序列 INPNTGGT
SEQ ID NO: 35 2-1重鏈可變區CDR3結構域胺基酸序列 ATSTILDDYYAMDV
SEQ ID NO: 36 2-1重鏈可變區胺基酸序列 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASDYNFADYYIHWVRQAPGQGLEWVGWINPNTGGTEFAQQFQGRVIMTKDTSIATVYMELSSLRSDDTAVYFCATSTILDDYYAMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO: 37 2-1重鏈恆定區胺基酸序列 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 38 2-1重鏈信號肽胺基酸序列 MYRMQLLSCIALSLALVTNS
SEQ ID NO: 39 2-1重鏈全長胺基酸序列(不含信號肽) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASDYNFADYYIHWVRQAPGQGLEWVGWINPNTGGTEFAQQFQGRVIMTKDTSIATVYMELSSLRSDDTAVYFCATSTILDDYYAMDVWGQGTTVTVSS   ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 40 2-1重鏈全長胺基酸序列(含信號肽) MYRMQLLSCIALSLALVTNS   QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASDYNFADYYIHWVRQAPGQGLEWVGWINPNTGGTEFAQQFQGRVIMTKDTSIATVYMELSSLRSDDTAVYFCATSTILDDYYAMDVWGQGTTVTVSS   ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 41 2-1輕鏈可變區CDR1結構域胺基酸序列 SSNIGAGYD
SEQ ID NO: 42 2-1輕鏈可變區CDR2結構域胺基酸序列 GNN
SEQ ID NO: 43 2-1輕鏈可變區CDR3結構域胺基酸序列 ATWADTLSGVV
SEQ ID NO: 44 2-1輕鏈可變區胺基酸序列 QAVLTQPSSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLSISGLQSEDEADYFCATWADTLSGVVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 45 2-1輕鏈恆定區胺基酸序列 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 46 2-1輕鏈信號肽胺基酸序列 MYRMQLLSCIALSLALVTNS
SEQ ID NO: 47 2-1輕鏈全長胺基酸序列(不含信號肽) QAVLTQPSSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLSISGLQSEDEADYFCATWADTLSGVVFGGGTKLTVL   RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 48 2-1輕鏈全長胺基酸序列(含信號肽) MYRMQLLSCIALSLALVTNS   QAVLTQPSSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLSISGLQSEDEADYFCATWADTLSGVVFGGGTKLTVL   RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
編號 名稱 序列
SEQ ID NO: 49 2-2-1重鏈可變區核苷酸序列 CAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGGGGAGGGCTTGGTACAGGAGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCTTAGCAGCAGCTGGTACCTTGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO: 50 2-2-1重鏈恆定區核苷酸序列 GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCTAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO: 51 2-2-1輕鏈可變區核苷酸序列 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTAACAGTTTTCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
SEQ ID NO: 52 2-2-1輕鏈恆定區核苷酸序列 CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTCGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGTCCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO: 53 11-1重鏈可變區核苷酸序列 CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGATGTTGGGAGTTATGACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCACAGTCCCCAAACCCATGATCTACAATGTCAATACTCAGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGTTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAATACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCACCTCATATACAAGCATCAACACCTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
SEQ ID NO: 54 11-1重鏈恆定區核苷酸序列 GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCTAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO: 55 11-1輕鏈可變區核苷酸序列 CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAAGTGGAGAGGCCTGGGGCCTCAGTGAAAGTCTCCTGTAAGGCTTCTGGATACACTTTCACCGGCCACTACATCCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTACATGGGACATGTGAACCCTGACACTGGTGACACACAGTCTGTGCAGAAGTTTGAGGGCAGGGTCACCATGACCAGCGACACGTCCATCAATACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGACGCCTGACGATACGGCCGTGTATTATTGTGTGAGACCCTACTGGAACATGTTTGGCGCTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO: 56 11-1輕鏈恆定區核苷酸序列 CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTCGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGTCCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO: 57 2-1重鏈可變區核苷酸序列 CAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCACGGCTTCTGACTACAATTTCGCCGACTATTATATACACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGGTGGGATGGATCAACCCCAACACTGGTGGCACGGAGTTTGCTCAGCAGTTTCAGGGCAGGGTCATCATGACCAAGGACACGTCCATCGCCACAGTCTACATGGAACTGAGCAGTCTGAGATCTGACGACACGGCCGTATATTTCTGTGCGACATCTACCATCTTGGACGACTACTACGCTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO: 58 2-1重鏈恆定區核苷酸序列 GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACTGTGCCCTCTAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACGCCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO: 59 2-1輕鏈可變區核苷酸序列 CAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAACAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGTCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAGGATGAGGCTGATTATTTCTGTGCAACCTGGGCTGACACCCTGAGTGGTGTGGTTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
SEQ ID NO: 60 2-1輕鏈恆定區核苷酸序列 CGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTCGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGTCCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
(無)
圖1：500nM Fc-ILZ-OX40L刺激分選的Jurkat/NF –KappaB –GFP + hOX40 報告細胞系單株，流式細胞分析刺激後細胞GFP表現陽性率。 圖2：Phage ELISA法檢測噬菌體單株與OX40重組蛋白的結合，計算噬菌體對OX40和噬菌體對BSA的OD450nm的比值。 圖3：轉染4種scFv-Fc表現質體的HEK293FT細胞培養上清加入或不加入交聯二抗，刺激Jurkat/ NF-κB-GFP +hOX40報告細胞，流式細胞分析細胞GFP陽性率。 圖4：抗OX40抗體的聚集的分析。 圖5：抗OX40抗體的體內抗腫瘤效力。抗OX40抗體相對於對照顯著抑制腫瘤生長。 圖6：抗OX40抗體的T細胞調節效果。抗OX40抗體相對於對照在脾和腫瘤中明顯上調輔助CD4+ T細胞和細胞毒性CD8+ T細胞。 圖7：交聯和可溶性抗OX40抗體的劑量依賴性作用。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
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Figure 12_A0101_SEQ_0033
Figure 12_A0101_SEQ_0034
(無)

Claims (24)

  1. 一種分離的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含： (a)具有SEQ ID NO: 1所示重鏈CDR1結構域，SEQ ID NO: 2所示重鏈CDR2結構域，和SEQ ID NO: 3所示重鏈CDR3結構域的重鏈可變區；和具有SEQ ID NO: 9所示輕鏈CDR1結構域，SEQ ID NO: 10所示輕鏈CDR2結構域，和SEQ ID NO: 11所示輕鏈CDR3結構域的輕鏈可變區； (b)具有SEQ ID NO: 17所示重鏈CDR1結構域，SEQ ID NO: 18所示重鏈CDR2結構域，和SEQ ID NO: 19所示重鏈CDR3結構域的重鏈可變區；和具有SEQ ID NO: 25所示輕鏈CDR1結構域，SEQ ID NO: 26所示輕鏈CDR2結構域，和SEQ ID NO: 27所示輕鏈CDR3結構域的輕鏈可變區；或 (c)具有SEQ ID NO: 33所示重鏈CDR1結構域，SEQ ID NO: 34所示重鏈CDR2結構域，和SEQ ID NO: 35所示重鏈CDR3結構域的重鏈可變區；和具有SEQ ID NO: 41所示輕鏈CDR1結構域，SEQ ID NO: 42所示輕鏈CDR2結構域，和SEQ ID NO: 43所示輕鏈CDR3結構域的輕鏈可變區。
  2. 如請求項1所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其包含： (a)SEQ ID NO: 4所示重鏈可變區，或與SEQ ID NO: 4所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的重鏈可變區；和SEQ ID NO: 12所示輕鏈可變區，或與SEQ ID NO: 12所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的輕鏈可變區； (b)SEQ ID NO: 20所示重鏈可變區，或與SEQ ID NO: 20所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的重鏈可變區；和SEQ ID NO: 28所示輕鏈可變區，或與SEQ ID NO: 28所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的輕鏈可變區；或 (c)SEQ ID NO: 36所示重鏈可變區，或與SEQ ID NO: 36所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的重鏈可變區；和SEQ ID NO: 44所示輕鏈可變區，或與SEQ ID NO: 44所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的輕鏈可變區。
  3. 如請求項1或2所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其進一步包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區； 優選地，所述重鏈恆定區為SEQ ID NO: 5或21所示重鏈恆定區，或與SEQ ID NO: 5所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的重鏈恆定區；和/或 優選地，所述輕鏈恆定區為SEQ ID NO: 13所示輕鏈恆定區，或與SEQ ID NO: 13所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的輕鏈恆定區。
  4. 如請求項1-3中任一項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其進一步包含連接到所述重鏈可變區的重鏈信號肽和/或連接到所述輕鏈可變區的重鏈信號肽； 優選地，所述重鏈信號肽為SEQ ID NO: 6所示重鏈信號肽，或與SEQ ID NO: 6所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的重鏈信號肽；和/或 優選地，所述輕鏈信號肽為SEQ ID NO: 14所示輕鏈信號肽，或與SEQ ID NO: 14所示序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的輕鏈信號肽。
  5. 如請求項1-4中任一項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其為IgG抗體或其抗原結合片段，優選為IgG1抗體或其抗原結合片段。
  6. 如請求項1-5中任一項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其為單株抗體或其抗原結合片段。
  7. 如請求項1-6中任一項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，其中所述抗原結合片段為Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv或sdAb。
  8. 一種抗體-藥物綴合物，其包含如請求項1-7中任一項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段和另外的治療劑；優選地，所述抗OX40抗體或其抗原結合片段與所述另外的治療劑通過接頭連接。
  9. 一種核酸，其編碼如請求項1-7中任一項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段。
  10. 如請求項9所述的核酸，其包含： (a)SEQ ID NO: 49所示重鏈可變區核苷酸編碼序列和/或SEQ ID NO: 51所示輕鏈可變區核苷酸編碼序列； (b)SEQ ID NO: 53所示重鏈可變區核苷酸編碼序列和/或SEQ ID NO: 55所示輕鏈可變區核苷酸編碼序列；或 (c)SEQ ID NO: 57所示重鏈可變區核苷酸編碼序列和/或SEQ ID NO: 59所示輕鏈可變區核苷酸編碼序列； 優選地，所述核酸進一步包含SEQ ID NO: 50或54所示重鏈恆定區核苷酸編碼序列和/或SEQ ID NO: 52所示輕鏈恆定區核苷酸編碼序列。
  11. 一種表現載體，其包含如請求項9或10所述的核酸。
  12. 一種宿主細胞，其包含如請求項9或10所述的核酸或如請求項11所述的表現載體。
  13. 一種用於產生如請求項1-7中任一項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段的方法，其包括在適合於抗體或其抗原結合片段表現的條件下培養如請求項12所述的宿主細胞，和從培養基中回收表現的抗體或其抗原結合片段。
  14. 一種藥物組合物，其包含如請求項1-7中任一項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，或如請求項8所述的抗體-藥物綴合物，或如請求項9或10所述的核酸，或如請求項11所述的表現載體，及藥學上可接受的載體。
  15. 如請求項1-7中任一項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，或如請求項8所述的抗體-藥物綴合物，或如請求項14所述的藥物組合物，其用於治療癌症。
  16. 如請求項15所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段或者抗體-藥物綴合物或者藥物組合物，其中所述癌症選自鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鱗癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包括胃腸癌和胃腸基質癌)、胰腺癌、成膠質細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝瘤、乳腺癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌，肛門癌、陰莖癌、黑色素瘤、淺表擴散性黑色素瘤、惡性雀斑樣痣黑色素瘤、肢端黑色素瘤、結節性黑色素瘤、多發性骨髓瘤和B細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、毛細胞性白血病、慢性成髓細胞性白血病、和移植後淋巴增殖性病症(PTLD)、以及與瘢痣病、水腫(例如與腦瘤有關的)和梅格斯氏(Meigs)綜合症有關的異常血管增殖、腦瘤和腦癌、以及頭頸癌，及相關轉移。
  17. 一種用於治療癌症的方法，其包括向需要的受試者施用治療有效量的如請求項1-7中任一項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，或如請求項8所述的抗體-藥物綴合物，或如請求項14所述的藥物組合物，從而治療所述癌症。
  18. 如請求項17所述的方法，其中所述癌症選自鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鱗癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包括胃腸癌和胃腸基質癌)、胰腺癌、成膠質細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝瘤、乳腺癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌，肛門癌、陰莖癌、黑色素瘤、淺表擴散性黑色素瘤、惡性雀斑樣痣黑色素瘤、肢端黑色素瘤、結節性黑色素瘤、多發性骨髓瘤和B細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、毛細胞性白血病、慢性成髓細胞性白血病、和移植後淋巴增殖性病症(PTLD)、以及與瘢痣病、水腫(例如與腦瘤有關的)和梅格斯氏(Meigs)綜合症有關的異常血管增殖、腦瘤和腦癌、以及頭頸癌，及相關轉移。
  19. 如請求項1-7中任一項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，或如請求項8所述的抗體-藥物綴合物，或如請求項14所述的藥物組合物，在製備用於治療癌症的藥物中的用途。
  20. 如請求項19所述的用途，其中所述癌症選自鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌(包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺的腺癌、和肺的鱗癌)、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包括胃腸癌和胃腸基質癌)、胰腺癌、成膠質細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝瘤、乳腺癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌，肛門癌、陰莖癌、黑色素瘤、淺表擴散性黑色素瘤、惡性雀斑樣痣黑色素瘤、肢端黑色素瘤、結節性黑色素瘤、多發性骨髓瘤和B細胞淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、毛細胞性白血病、慢性成髓細胞性白血病、和移植後淋巴增殖性病症(PTLD)、以及與瘢痣病、水腫(例如與腦瘤有關的)和梅格斯氏(Meigs)綜合症有關的異常血管增殖、腦瘤和腦癌、以及頭頸癌，及相關轉移。
  21. 如請求項1-7中任一項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，或如請求項8所述的抗體-藥物綴合物，或如請求項14所述的藥物組合物，其用於下述一項或多項：抑制Treg功能(例如抑制Treg的遏制性功能)、殺死表現OX40的細胞(例如表現高位準OX40的細胞)、提高效應T細胞功能和/或提高記憶T細胞功能、降低腫瘤免疫、增強T細胞功能和/或消減表現OX40的細胞。
  22. 如請求項1-7中任一項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，或如請求項8所述的抗體-藥物綴合物，或如請求項14所述的藥物組合物，在製備用於治療下述一項或多項的藥物中的用途：抑制Treg功能(例如抑制Treg的遏制性功能)、殺死表現OX40的細胞(例如表現高位準OX40的細胞)、提高效應T細胞功能和/或提高記憶T細胞功能、降低腫瘤免疫、增強T細胞功能和/或消減表現OX40的細胞。
  23. 一種藥物組合，其包含如請求項1-7中任一項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，或如請求項8所述的抗體-藥物綴合物，或如請求項14所述的藥物組合物，以及一種或多種另外的治療劑。
  24. 一種試劑盒，其包括如請求項1-7中任一項所述的抗OX40抗體或其抗原結合片段，或如請求項8所述的抗體-藥物綴合物，或如請求項14所述的藥物組合物，優選其進一步包括給藥裝置。
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