CN110004177A - 一种检测抗ox40抗体的方法及其应用 - Google Patents

一种检测抗ox40抗体的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测抗OX40抗体的方法及其应用，所述方法是基于构建Jurkat‑OX40‑NFκB‑Luc单克隆细胞系所建立的生物活性检测方法，该方法可以快速方便的检测抗OX40抗体，具有较高的特异性、敏感性、准确性和精密性。本发明同时公开了检测含有报告基因的高表达OX40的单克隆细胞株及其构建方法。

Description

一种检测抗OX40抗体的方法及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种检测抗OX40抗体的方法及其应用。
背景技术
OX 40(CD134)是TNFR超家族成员之一，为I型跨膜糖蛋白，相对分子质量约为48～50kD。人的OX40基因位于第1号染色体上，并与其他TNF受体家族成员如CD30、4-1BB、TNFR-II和DR3成簇排列在人染色体h36的远侧带。不同于CD28的组成性表达，OX40属活化后诱导表达，即只表达于活化的T细胞表面，且主要是CD4+T细胞，CD8+T细胞表面有少量表达，CD4+CD25十Foxp3十Treg及中性粒细胞表面均有表达。其与受体OX40L(CD252)共同作用，不仅可以刺激T细胞扩增，促进分化及抗原特异性T淋巴细胞形成，还可以调节CD4十CD25十Foxp3十Treg抑制功能，除此之外研究表明OX40共刺激信号可显著影响T细胞存活。OX40L主要表达于成熟的树突状细胞(DC)、活化的B细胞、血管内皮细胞(VEC)、脐带静脉血管内皮细胞(HUVEC)、巨噬细胞以及某些组织器官包括心、骨骼肌、睾丸和肺等。OX40/OX40L相互作用在炎性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤以及移植免疫的发生发展中起非常重要的作用，其通过调控生存蛋白和细胞周期蛋白的表达激活Akt/NF-κB、PI3K、PKB、NFAT信号通路进而提高免疫反应。
由于OX40主要表达在炎症部位的抗原特异性T细胞上，使其成为一个理想的免疫干预的靶分子，有望通过在体内阻断OX40/OX40L的相互作用或消除OX40+T细胞来减弱自身免疫性疾病及移植排斥反应，而应用激发型抗OX40的单抗来增强OX40信号、促进细胞因子的分泌和增加抗原特异性记忆细胞的数量，从而提高机体抗肿瘤的能力。
虽然OX40作为二代免疫检查点的代表性靶点成为研究的热点，但是并没有针对OX40的药物上市，而目前用于肿瘤免疫治疗的抗OX40的单抗都处在临床I期或II期，如MEDI-6469、PF-04518600、GSK-3174998、INCAGNO-1949、BMS-986178、tavolixizumab等。国内已有多家药企争相进入OX40靶点抗体类药物生物类似药及创新制品研发领域。
药物质量控制是人民安全用药的基本保证，而生物学活性是抗体类药物的关键质量属性，其准确测定是保证药物安全性和有效性的基本前提。抗体类药物发挥治疗作用主要通过以下方式：阻止配体和受体的结合，从而阻断细胞杀伤、细胞信号通路的传导等；通过特异性结合细胞表面抗原招募免疫系统引起效应功能从而杀伤靶细胞。目前抗体类药物生物学活性测定主要是根据其体内作用机制，在体外建立相应的细胞评价模型，将实验结果进行直线性或曲线性拟合，并与参比品比较评价其相对生物学活性。
在体外，针对OX40靶点的活性测定方法主要包括酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay，Elisa)、表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)效价测定法、人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC)增殖抑制法和Transwell细胞迁移实验。其中Elisa和SPR效价测定法仅能反应出抗体和抗原的结合能力，Transwell细胞迁移实验法操作复杂且难以定量。而目前应用最广泛的HUVEC增殖抑制法方法具有原代细胞难以培养、实验周期长、变异度高的缺点。鉴于OX40靶点抗体类药物市场的快速发展，急需建立一种快速、稳定、简单、灵敏的生物学活性检测方法。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种能够快速简便的检测抗OX40抗体的生物活性的单克隆细胞株的构建方法。
本发明的目的之二在于提供一种能够快速简便的检测抗OX40抗体的生物活性的单克隆细胞株。
本发明的目的之三在于提供一种快速、稳定、简单、准确、特异性的抗OX40抗体活性检测方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种测定抗OX40抗体生物活性的细胞株的构建方法，包括以下步骤：
a.将连接有OX40的质粒转染到细胞中，加压筛选出高表达OX40的细胞株；
b.以含荧光素酶报告基因的质粒为载体，连接NF-κB的反应元件，构建含NF-κB基因的重组质粒；
c.将b中的重组质粒转染到a中筛选出的高表达OX40的细胞株中，加压筛选出高表达荧光素酶的细胞株。
作为可选择的实施方案，所述细胞株包括Jurkat细胞、HUVEC细胞、293细胞、COS7细胞、L929细胞、HepG2细胞、CHO细胞、3T3细胞；作为一种优选的实施方案，所述细胞为Jurkat细胞。
本发明携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等；作为一种优选的实施方案，所述载体为质粒。
在本发明的具体实施方案中，携带OX40的质粒为pLVX-OX40，含NF-κB基因和荧光素酶报告基因的重组质粒为pMetLuc-NFκB。
在本发明中，进行目标基因转染时通常进行加压筛选，以使细胞稳定的高表达目的基因，所述加压筛选试剂包括但不限于G418、潮霉素、嘌呤霉素、6-硫鸟嘌呤、氨苄青霉素。作为优选的实施方案，所述加压试剂为嘌呤霉素、潮霉素。作为更为优选的实施方案，筛选高表达OX40的细胞株时，加压试剂为嘌呤霉素；在筛选高表达荧光素酶的细胞株时，加压试剂为潮霉素B。
本发明的第二方面提供了一种单克隆细胞株，所述细胞株由本发明第一方面所述的方法构建而成。在本发明的具体实施方式中，所述细胞株为Jurkat-OX40-NFκB–Luc细胞株。
本发明的第三方面提供了一种检测抗OX40抗体的生物活性的产品，所述产品包括本发明第二方面所述的单克隆细胞株。
本发明的第四方面提供了如下任一项所述的应用：
a.本发明第一方面所述的构建方法在制备检测抗OX40抗体的生物活性的细胞株中的应用；
b.本发明第二方面所述的单克隆细胞株在制备检测抗OX40抗体的生物活性的产品中的应用；
c.本发明第二方面所述的单克隆细胞株在筛选治疗与OX40相关的疾病的候选药物中的应用；
d.本发明第三方面所述的产品在检测抗OX40抗体的生物活性中的应用。
进一步，与OX40相关的疾病包括炎性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤。所述炎性疾病包括但不限于溃疡性结肠炎、慢性肠炎、急性冠状动脉综合征；所述自身免疫性疾病包括但不限于银屑病、重症肌无力、系统性红斑狼疮；所述肿瘤包括但不限于乳腺癌、结肠癌、黑素瘤、淋巴瘤、头颈癌。
进一步，筛选候选药物的步骤如下：
加入待筛选物质处理含有Jurkat-OX40-NFκB–Luc细胞株的体系；
加入荧光素酶检测试剂进行酶标检测；
其中，若荧光检测值增加，说明该待筛选物质为候选药物。
本发明的第五方面提供了一种检测抗OX40抗体的生物活性的方法，包括以下步骤：
a.将Raji细胞种到96孔板中；
b.将本发明第二方面所述的细胞株加到培养了Raji细胞的96孔板中；
c.加入经过系列稀释的抗OX40抗体；
d.将96孔板放到37℃、5％CO2的培养箱中进行培养；
e.向各孔中加入荧光素酶检测试剂，进行酶标检测。
Raji细胞为Burkitt's淋巴瘤细胞，可以表达FcγR。对于一些抗肿瘤的抗体药物，抗体Fc端与激活性/抑制性的FcγR结合后，会激活/抑制细胞吞噬作用，从而会引起肿瘤毒性，这种肿瘤毒性是由抗体依赖的细胞毒性(ADCC，Antibody-dependent cellularcytotoxicity)介导引起的，ADCC主要是通过NK细胞，巨噬细胞等表达型FcγR效应细胞执行。
为了探索抗OX40抗体生物活性测定的最优方法，本发明对检测时间以及细胞密度进行了摸索。作为可选择的实施方式中，作为可选择的实施方式，Raji细胞的数目为1×104～5×104个/孔；作为优选的实施方式，Raji细胞数目为5×104个/孔。
作为可选择的实施方式，Jurkat细胞的数目为1×104～5×104个/孔，作为优选的实施方式，Jurkat细胞数目为1×104个/孔。
作为可选择的实施方式，培养箱中培养的时间为为6-20h，作为优选的实施方式，培养时间为16h。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次提供了一种可检测检测OX40抗体生物活性的方法，该方法成本低，操作简便，周期短，不需要进行动物实验，结果稳定可靠，准确度高，特异性好，有利于促进药品的研究开发，质量控制与临床应用，具有较高的应用价值。
本发明提供了一种单克隆细胞株及其构建方法，使用该单克隆细胞株，可检测抗OX40抗体生物活性，具有较高的准确性、安全性。
附图说明
图1是Jurkat-OX40-NFκB-Luc稳定细胞株的构建情况图；其中图A是流式细胞仪检测Jurkat细胞的OX40表达水平图，图B是流式细胞仪检测Jurkat-OX40细胞的OX40表达水平图；图C是检测不同细胞株的荧光反应信号图。
图2是生物活性检测方法各参数的优化图；其中图A是孵育6h的Raji细胞和Jurkat-OX40-NFκB-Luc细胞的数目变化图，图B是孵育16h的Raji细胞和Jurkat-OX40-NFκB-Luc细胞的数目变化图，图C是孵育20h的Raji细胞和Jurkat-OX40-NFκB-Luc细胞的数目变化图，图D是抗OX40抗体的起始浓度的优化图，图E是抗OX40抗体稀释倍数的优化图，图F是孵育时间的优化图。
图3是生物活性检测方法特征验证图；其中图A是性能变化的抗体的剂量效应曲线图，图B是不同靶点抗体剂量效应曲线图，图C是不同细胞系的抗体剂量效应曲线图，图D是不同效价水平的抗体相对活性理论值与实测值线性拟合图；图E是不同实验室检测抗体相对活性的重现性图。
图4是Jurkat-OX40-NFκB-Luc细胞的稳定性图，其中图A是不同代次的细胞的剂量效应曲线图，图B是不同代次的细胞的信噪比图。
图5是不同的抗OX40抗体的剂量效应曲线图。
具体的实施方式
本发明通过向Jurkat细胞中转染含有OX40的质粒以及包含NF-κB反应元件的报告基因，通过加压筛选和单克隆细胞分离得到稳转细胞株。通过方法的优化和验证，建立用于针对OX40靶点抗体类生物治疗类药物的生物活性的测定方法。
下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1 Jurkat-OX40-NFκB-Luc单克隆细胞株的构建及筛选
1、试剂和材料
Jurkat细胞购买于ATCC公司，
FBS、嘌呤霉素购买于Gibco公司，
潮霉素B购买于Invitrgen公司，
IgG1购买于BD公司，
PHA购买于Sigma公司，
抗人CD3/抗人CD28抗体购买于Biolegend公司，
Bright-GloTM荧光检测试剂购买于Promega公司，
酶标仪：M5.2.5，
Jurkat-OX40-NFκB-Luc细胞培养基：RPMI 1640培养基+2.05mM L-g谷氨酰胺+200μg/ml潮霉素B+2μg/ml嘌呤霉素+10％FBS，
Raji细胞培养基：RPMI 1640培养基+10％FBS，
检测缓冲液：DPBS+2％FBS。
2、Jurkat-OX40-NFκB-Luc单克隆细胞株的构建和筛选
1)Jurkat-OX40细胞的构建
将pLVX-OX40载体转染到Jurkat细胞中，加入嘌呤霉素(2μg/mL)作为筛选压力，通过有限稀释法获得单克隆细胞株，使用流式细胞仪分析单克隆细胞株的OX40的表达，其中使用抗OX40抗体作为检测抗体，IgG1作为阴性对照，流式细胞仪的检测结果如图1A和1B所示，说明OX40在单克隆细胞株中高表达。
2)Jurkat-OX40-NFκB-Luc细胞的构建
将pMetLuc-NFκB载体转染到Jurkat-OX40细胞中，加入潮霉素B(200μg/mL)作为筛选压力，通过有限稀释法获得单克隆细胞株，使用PHA刺激5h筛选高表达荧光素酶的单克隆细胞株，对单克隆细胞株进行荧光检测，首先，使用检测缓冲液洗细胞2次；向细胞中加入10μg/mL的抗OX40抗体和阴性对照(IgG1)，置于冰上培养30min后用检测缓冲液进行清洗；然后使用检测缓冲液进行重悬，采用流式细胞仪进行分析。
检测结果如图1C所示，单克隆细胞株Jurkat-OX40-NFκB-Luc荧光反应信号最高。
实施例2抗体生物活性检测方法的建立
为了确定生物活性检测方法，对细胞密度、抗体浓度以及稀释倍数、培养时间进行了优化。Raji细胞和抗体采用分析缓冲(RPMI-1640+10％FBS)进行稀释，Jurkat-OX40-NFκB-Luc采用分析培养基(RPMI-1640+10％FBS+8μg/ml抗人CD3/抗人CD28抗体)进行稀释。
1、细胞密度的优化
对Raji细胞和Jurkat-OX40-NFκB-Luc细胞的细胞铺板密度进行优化，根据正交试验设计，Raji细胞和Jurkat-OX40-NFκB-Luc细胞分别设置为每孔10000个、20000、30000、40000和50000个细胞，先向96孔板中种Raji细胞，然后种Jurkat-OX40-NFκB-Luc细胞，加入抗OX40抗体(100μg/mL)设定为阳性值，分析缓冲液设定为阴性值，检测不同的培养时间(6h、16h、20h)细胞数目的变化。
结果如图2A-C所示，在培养时间为16h(图2B)和20h(图2C)时，细胞数目的变化超过5倍，与之相对应的细胞组为Raji细胞50000个/孔+Jurkat-OX40-NFκB-Luc 10000个/孔；而在6h(图2A)时，所有的细胞组(5×5)的细胞数目变化都少于2.5倍，根据细胞数目的倍数变化，选择Raji细胞50000个/孔和Jurkat-OX40-NFκB-Luc 10000个/孔进行后续的实验。
2、抗体浓度的优化
1)抗体初始浓度的优化
采用选择的细胞浓度进行抗体初始浓度的优化，设置一个较高的抗OX40抗体浓度300μg/mL作为稀释起始点，12个浓度梯度，3倍稀释。根据剂量反应曲线的上、下平台和线性部分，选取最合适的起始浓度点。
方法：将Raji细胞50000个/孔种到96孔白板中，然后种入10000个/孔的Jurkat-OX40-NFκB-Luc细胞，加入系列稀释的抗OX40抗体，抗体的起始浓度为300μg/mL，3倍稀释，共12个浓度梯度，37℃，5％CO2进行培养，16h后加入荧光检测试剂，检测发光值。
结果如图2D所示，根据剂量反应曲线选择50μg/mL作为起始浓度。
2)抗体稀释倍数的优化
根据已经确定的起始浓度50μg/mL，设置稀释倍数，首先进行2倍稀释(1个梯度)，然后进行4倍稀释，共10个浓度梯度。根据剂量反应曲线来判断抗体的稀释倍数。
方法：将Raji细胞50000个/孔种到96孔白板中，然后种入10000个/孔的Jurkat-OX40-NFκB-Luc细胞，加入系列稀释的抗OX40抗体，抗体的起始浓度为50μg/mL，抗体首先进行2倍稀释(1个梯度)，然后进行4倍稀释，共10个浓度梯度，37℃，5％CO2进行培养，16h、20h后加入荧光检测试剂，检测发光值。
结果如图2E所示，从图中可以看出抗体采用上述稀释倍数具有较好的剂量反应曲线。
3)培养时间的优化
采用选择的细胞数目(Raji细胞50000个/孔、Jurkat-OX40-NFκB-Luc 10000个/孔)以及确定的抗体起始浓度50μg/mL和稀释倍数，对培养时间进行优化，根据剂量反应曲线选择最优的培养时间。
方法：将Raji细胞50000个/孔种到96孔白板中，然后种入10000个/孔的Jurkat-OX40-NFκB-Luc细胞，加入系列稀释的抗OX40抗体，抗体的起始浓度为50μg/mL，抗体首先进行2倍稀释(1个梯度)，然后进行4倍稀释，共10个浓度梯度，37℃，5％CO2进行培养，16h后加入荧光检测试剂，检测发光值。
结果如图2F所示，当培养时间为16h时具有较高的信噪比，因此选择16h作为最优的培养时间。
根据以上参数优化的实验结果，整理得到基于报告基因的抗OX40抗体生物学活性方法的实验参数如表1所示：
表1抗OX40抗体生物学性测定方法实验参数优化
实施例3生物活性检测方法的验证
1、敏感性检测
将抗OX40抗体进行加速稳定性处理，置于25℃，3个月，将未处理的抗OX40抗体作为对照进行实验。对比两者之间的差异，验证本方法的敏感性。
结果如图3A所示，经过加速稳定性处理的抗OX40抗体与未经处理的抗体相比，生物活性降低，说明本方法能够检测出抗体的特定变化。
2、特异性验证
1)抗体特异性验证
本方法是针对抗OX40抗体的生物学活性方法，因此，对其特异性的验证采用不同靶点的单抗药物：贝伐珠单抗(Bevacizumab，靶点为VEGF)、西妥昔单抗(Cetuximab，靶点为EGFR)、伊匹单抗(Ipilimumab，靶点为CTLA4)、英利昔单抗(Infliximab，靶点为TNF-α)、Keytruda(Pembrolizumab，靶点为PD-1)。将六种单抗按照与抗OX40抗体相同的实验条件进行荧光检测。
结果如图3B所示，说明本方法不适于除OX40靶点以外的其他靶点的药物，证明本方法特异性高。
2)细胞株特异性验证
本方法是基于构建OX40的稳转细胞株，因此，对其特异性的检测验证采用转染不同报告基因的细胞株：Jurkat细胞、Jurkat-NFAT细胞、Jurkat-NFAT-Luc细胞、Jurkat-LAG3-NFAT-Luc细胞。将上述几种细胞按照与Jurkat-OX40-NFκB-Luc相同的实验条件进行荧光检测。
结果如图3C所示，Jurkat-NFAT细胞、Jurkat-NFAT-Luc细胞、Jurkat-LAG3-NFAT-Luc细胞不呈现剂量依赖关系，说明本方法具有较高的细胞特异性。
3、准确性和线性验证
将50μg/mL抗OX40抗体作为对照，分别按照其起始浓度的150％(75μg/mL)、125％(62.5μg/mL)、100％(50μg/mL)、75％(37.5μg/mL)和50％(25μg/mL)制备不同效价水平的样品。按照优化好的实验条件，每个效价水平重复3次，根据拟合的四参数曲线方程，分别计算其与参比品的相对生物学活性，并与理论值比较，计算回收率。相对活性(％)＝参比品EC50/样品EC50×100％。回收率(％)＝相对活性测定值/相对活性理论值×100％。回收率范围在80％～120％之间，相对标准差RSD<10％，则认为本方法准确性较好。将五组样品的相对生物活性测定值与理论值的平均值进行线性拟合，绘制线性拟合曲线。
结果如表2和图3D所示，根据测定值与理论值计算出来的每个效价水平的回收率的平均值为和RSD值，RSD值在2.16％～6.12％之间，而线性拟合曲线的R2值为0.9986，说明该方法准确性较好。
表2不同效价水平测定抗OX40抗体的回收率和RSD
4、精密性验证
精密度的验证分为重复性和重现性。
1)重复性。
选取5个效价水平浓度，150％(75μg/mL)、125％(62.5μg/mL)、100％(50μg/mL)、75％(37.5μg/mL)和50％(25μg/mL)各重复三次，根据拟合的四参数曲线方程，计算其相对活性的平均值以及相对标准差RSD。结果如表2所示，RSD值在2.16％～6.12％之间，说明该方法具有较好的重复性。
2)重现性。
重现性测定的是在不同实验室，由不同实验员测定结果之间的精密度。由本实验室进行1个效价水平100％(50μg/mL)的实验，重复六次，另一实验室另一实验员同样进行效价水平100％(50μg/mL)的实验，重复六次，将两人测定结果整合，计算相对活性的平均值，以及12次实验的RSD。
结果如表3所示和图3E，RSD小于10％，说明该方法具有较好的重现性。
表3不同实验室检测抗OX40抗体的相对活性
实施例4细胞稳定性检测
同时检测不同代的细胞来验证稳转细胞株的稳定性。将不同代次的Jurkat-OX40-NFκB-Luc细胞复苏，连续培养2～3代，待细胞状态良好之后，进行稳定性试验验证。本实验选取Jurkat-OX40-NFκB-Luc细胞代次分别为12、25和30，然后采用实施例3所述的方法进行抗体生物活性的检测。
结果如图4所示，不同代次之间的剂量反应曲线相类似(图4A)，其斜率比P12:P25:P30为1.2:0.81:0.80，而不同代次之间的信噪比也无显著性差异(4B)，说明不同代次的Jurkat-OX40-NFκB-Luc稳转细胞对抗OX40抗体的生物活性的检测影响不大。
实施例5不同抗OX40抗体生物活性的检测
选取不同厂家的抗OX40抗体，按照优化好的方法进行实验，测定荧光素酶的表达并根据拟合的剂量反应曲线确定实施例3所述的方法对不同抗OX40抗体的适用性。
结果如图5所示，不同厂家的抗OX40抗体均有较好的剂量反应曲线，说明实施例3所述的方法可以作为平台方法来测定抗OX40抗体的生物活性。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种测定抗OX40抗体生物活性的细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.将连接有OX40的载体转染到细胞中，加压筛选出高表达OX40的细胞株；
b.以含荧光素酶报告基因的质粒为载体，连接NF-κB的反应元件，构建含NF-κB基因的重组质粒；
c.将b中的重组质粒转染到a中筛选出的高表达OX40的细胞株中，加压筛选出高表达荧光素酶的细胞株。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述细胞株包括Jurkat细胞、HUVEC细胞、293细胞、COS7细胞、L929细胞、HepG2细胞、CHO细胞、3T3细胞；优选的，所述细胞为Jurkat细胞。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，a中所述的载体为pLVX-OX40。
4.一种单克隆细胞株，其特征在于，所述细胞株由权利要求1-3任一项所述的方法构建而成。
5.一种检测抗OX40抗体的生物活性的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求4所述的细胞株。
6.如下任一项所述的应用：
a.权利要求1-3任一项所述的构建方法在制备检测抗OX40抗体的细胞株中的应用；
b.权利要求4所述的细胞株在制备检测抗OX40抗体的生物活性的产品中的应用；
c.权利要求4所述的细胞株在筛选治疗与OX40相关的疾病的候选药物中的应用；
d.权利要求5所述的产品在检测抗OX40抗体的生物活性中的应用。
7.一种检测抗OX40抗体的生物活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.将Raji细胞种到96孔板中；
b.将权利要求4所述的单克隆细胞株加到培养了Raji细胞的96孔板中；
c.加入经过系列稀释的抗OX-40抗体；
d.将96孔板放到37℃、5％CO2的培养箱中进行培养；
e.向各孔中加入荧光素酶检测试剂，进行酶标检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述Raji细胞的数目为1×104～5×104个/孔，优选的为5×104个/孔。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，Jurkat细胞株的数目为1×104～5×104个/孔，优选的为1×104个/孔。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，培养时间为6-20h，优选的，培养时间为16h。
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