TW202128197A - 肝前驅或幹細胞、其溶胞產物、及/或條件培養基於血管高通透性表徵之病症的用途 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及肝前驅或幹細胞、其溶胞產物、及/或可藉由在培養基中培養肝前驅或幹細胞獲得的條件培養基，供用於治療因為血管通透性增加所致的疾病及/或病況，或用於在個體發炎及/或感染之後於該個體體內回復細胞和組織的血管完整性。更具體地，本發明是有關於肝前驅或幹細胞、或可藉由在培養基中培養肝前驅或幹細胞獲得的條件培養基於敗血症和敗血症引起的疾病中的治療用途，敗血症和敗血症引起的疾病為諸如心肌水腫，急性腎損傷和肺臟敗血症。

Description

肝前驅或幹細胞、其溶胞產物、及/或條件培養基於血管高通透性表徵之病症的用途
本發明是有關於肝前驅或幹細胞、其溶胞產物、及/或藉由培養該等肝前驅或幹細胞而獲得之條件培養基供治療與預防目的之技術領域。特別地，該等治療與預防目的是有關於血管通透性增加所導致的病症及/或病況，而血管通透性增加則肇因於例如在發炎及/或感染之後的血管完整性障礙。本發明亦有關藉助於如上所述的細胞或衍生物活化AMPK路徑。
由不同形態和功能的血管所組成的血管分布將血液分配到所有組織，並維持生理組織恆定。整個血管循環系統內襯有內皮細胞，其在血液和組織之間形成動態屏障。在靜止狀態下，內皮細胞除了調節血管張力外，還顯示出更多非常重要的功能，包括液體過濾、止血，嗜中性球募集與激素運輸。此外，良好的內皮結構會限制較大的分子和細胞從血液外滲到組織。
內皮屏障功能缺陷是許多病症的一個共同特徵，包括癌症和慢性發炎性病況。實際上，血管屏障崩解與較大的分子和細胞滲漏增加有關，這導致水腫、發炎，且若滲漏變成長期的話，經常與疾病進展有關。構成血管滲漏的機制可能具有器官特異性並取決於特化的血管分布。目前已提出兩種主要模型：第一個模型將取決於從囊泡或空泡形成跨內皮通道(囊泡-空泡胞器(vesiculo-vacuolar organelle, VVO))，而第二個模型涉及內皮間連結(IEJ)；迄今已描述過四種不同類型，包括緊密連結(tight junction)、間隙連結(gap junction)，黏連連結(adherens junction)與韌帶連結(syndesmos)，它們可以瞬間分解並允許滲漏。
血管滲漏可能導致新的，不穩定且高通透性血管過量形成，伴隨著血流不良，從而進一步促進缺氧和疾病傳播。長期血管通透性也可能促使癌症的轉移擴散。在與創傷、缺血-再灌注損傷、敗血症、成人呼吸窘迫症候群、糖尿病，血栓形成和癌症相關的血管發炎方面，這也是一個重要問題。經由血漿液體和蛋白質的細胞旁滲漏增加是構成此一過程的重要機制。因此，特異地抑制過量血管通透性在一些如上提及的疾病中可能具有治療益處。
在全世界，特別是開發中國家，敗血症是主要死因之一，且健保系統的成本巨大。敗血症是加護病房中是最常見的死因，而敗血症引起的疾病(諸如與敗血症相關的急性腎臟損傷)代表了死亡的一個獨立且額外的風險因子。敗血症和敗血性休克代表一個複雜的生物學和病理生理學的異質譜。儘管在了解敗血症的基本機制方面已有了實質進展，但將這些進展轉化成臨床有效療法卻令人失望。抗生素，輸液復甦術和基本支持照護以外的新穎療法在這個領域內是臨床醫生和研究人員的熱門話題。
幹細胞可被定義為能夠自我更新並同時能夠實際上分化成所有類型人類細胞的細胞。基本上有兩群主要的幹細胞，第一群由胚胎幹細胞(embryonic stem cell, ESC)構成，其位於新生囊胚的內細胞團中；第二群由體幹細胞(somatic stem cell, SSC)構成，其存在於所有組織中，但表現出的分化潛能有限。體幹細胞包括位於骨髓中，且在所謂的間質幹細胞(mesenchymal stem cell, MSC)中代表造血前驅和非造血幹細胞中的造血幹細胞。因為間質幹細胞獨特的性質，其目前為關注焦點。同種異體或自體MSC改善發炎、缺血，或對活體組織的物理損傷所造成的症狀。
MSC是多效性細胞，能夠根據細胞外環境(特別是那些含有細胞介素者)而有不同表現。除了免疫調節，免疫抑制和抗纖維化特性外，MSC還被證明會刺激組織的內源性再生性潛能。例如，已知源於骨髓的間質幹細胞天生透過分泌許多營養分子(包括可溶性細胞外基質糖蛋白，細胞介素和生長因子)來支持造血作用。研究已證明，MSC具有低免疫原性，可以抑制免疫反應的形成，並使各式各樣免疫細胞群從促發炎性轉向抗發炎性/調節性表型。在這種情況下，使用MSC的細胞類療法的免疫改寫特性(immune-reprogramming properties)在敗血症和相關器官功能障礙方面象徵了一個新興治療策略。在不同的動物研究中，已凸顯出MSC可能為敗血症提供一種有希望的新型治療方法，但在現階段，這些方法尚未指向新的商業化治療方法。
EP 1 969 118報導了源自成年肝臟的經分離肝前驅或幹細胞(也稱為ADHLSC)，其用於肝臟學、先天性肝臟代謝錯誤、移植，傳染病及/或肝衰竭。EP 1 969 118報導了分離並特徵鑑定這些細胞的方法，以及它們供移植或供人工器官裝置的用途。EP 1 969 118的肝前驅細胞的特徵鑑定及其製備方法在此全部引入本文作為參考資料。根據技藝中已知的方法，例如像是EP 1 969 118、EP 3 039 123、EP 3 140 393或EP 3 423 566中所述，從肝臟或部分肝臟中分離前驅細胞或幹細胞。
以更大規模生產的ADHLSC和HALPC (人類同種異體肝前驅細胞)(為了實施臨床研究在GMP條件下產生的，在文獻中也被稱為HHALPC)是膠原酶消化正常成年肝臟並初代培養經分離實質部分之後所獲得的未分化前驅細胞。這些人類肝前驅或幹細胞展示出自我更新的能力，並具有表現間質和肝細胞標記且顯示出晚期肝細胞源性分化潛能的特質。這些細胞在靶向人類肝臟疾病(包括肝纖維化、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)與急性加慢性肝衰竭(ACLF))和其他人類疾病尤其令人感到興趣。
WO 2015 001 124是有關藉由在細胞培養基中培養成年來源的人類肝幹細胞/前驅細胞並分離所得條件培養基而獲得的無細胞組合物。WO 2015 001 124描述了這些無細胞組合物供治療涉及器官損傷，器官衰竭之疾病的用途，以及供器官或細胞移植(特別是在肝臟內)的用途。
WO 2016 200 340描述了帶有特定標記的人類肝幹細胞，其供用於治療傳染病，慢性肝衰竭和肝癌。
EP 3 016 665是有關於一種可藉由在細胞培養基中培養成年來源的人類肝幹細胞/前驅細胞並將細胞培養基與細胞分離而獲得的無細胞條件培養基。
最後，EP 1 969 118揭示具有特定標記的人類肝前驅或幹細胞，其供用於治療肝臟疾病，肝癌和肝臟感染。
本發明旨在提供肝前驅或幹細胞、其溶胞產物、及/或藉由培養如請求項1之該等肝前驅或幹細胞而獲得的條件培養基的治療用途。用於此目的之可用成年肝臟來源的前驅或幹細胞，其細胞株或細胞群實例揭示於EP 1 969 118、EP 3 039 123、EP 3 140 393和EP 3 423 566中，且做為參考資料被併入本文。在WO 2015 001 124中詳細報導了藉由在細胞培養基中培養成年來源的人類肝前驅或幹細胞而獲得的可能有用條件培養基，並作為參考資料被併入本文。
內皮的屏障功能是源於內皮結構的完整性，而此完整性是由膜細胞間連結所提供。這些連結的改變促使血管對液體和溶質的通透性過高，並且會明顯促進與多種病理狀態(諸如敗血症、癌症，器官衰竭與類似者)相關的損傷。細胞間連結的結構完整性和功能完整性是血管通透性的一個重要決定因素。
在細胞中不同的角色中，經AMP活化的蛋白激酶(AMPK)已知會調節內皮間連結(IEJ)並因而牽涉到維護內皮細胞的功能完整性。藉由調控內皮屏障完整性，AMPK扮演一個對抗敗血症損傷和高通透性的防禦措施。因此，在內皮細胞中，活化AMPK對血管內皮的功能完整性具有潛在有益作用。
已出乎意料發現到，肝前驅或幹細胞，藉由溶解該等細胞獲得之溶胞產物及/或可藉由培養該等肝前驅或幹細胞獲得之條件培養基或其一部分，可以使用在與血管通透性增加或有所改變的病況中，及/或用來調控或影響受損的血管通透性。
該等肝前驅或幹細胞、其溶胞產物及/或可藉由培養該等肝前驅或幹細胞獲得之條件培養基或其一部分是透過活化AMPK來促進組裝或回復形成緊密連結與黏連連結。
這些作用暗示一種在發炎性以及感染病況中，促進內皮功能性結構回復的有益作用機制。
較佳具體例如依附請求項2至19所示。
依據請求項20，本發明亦是有關於一種得自於培養人類肝前驅細胞的條件培養基。特別地，該培養基包含至少30 ng/百萬個總細胞的神經鞘胺醇-1-磷酸鹽。
定義
除非另有定義，否則在揭示本發明中使用的所有術語，包括技術和科學術語，均具有本發明所屬領域中具有通常技術者一般所理解的含義。藉由進一步的指導，納入術語定義以便更為充分地理解本發明的教示。
如本文所用，以下術語具有以下含義：
如本文所用，術語「經分離細胞」通常是指不與一或多個細胞或一或多個細胞組分連接的細胞，而該一或多個細胞或一或多個細胞組分在活體內是與與該細胞相連接的。例如，經分離細胞可能已經從其天然環境中移出，或者可能是因為已經從其天然環境中移出的細胞增殖(例如離體增殖)而產生的。
如本文所用，術語「活體外」是指動物或人類身體之外或外部。如本文所用，術語「活體外」應理解為包括「離體」。術語「離體」通常是指從動物或人類身體中取出並在身體之外(在例如培養容器中)維持或增殖的組織或細胞。
術語「肝前驅細胞」是指藉由培養分離自肝臟或其一部分的細胞而產生的非特化且具有增殖能力的細胞，而其或其後代可以產生至少一種相對更為特化的細胞類型。肝前驅細胞可產生沿一或多個譜系分化的後代，以產生越來越多更為的特化細胞(但較佳是肝細胞或肝活性細胞)，其中此類後代本身可能是前驅細胞，甚至產生終末分化的肝細胞(例如完全特化的細胞，特別是呈現出與初代人類肝細胞相似形態和功能特徵的細胞)。
術語「幹細胞」是指能夠自我更新的前驅細胞，即可以不分化而增殖，因此，幹細胞或其至少一部分的後代基本上保有了未特化或特化較低的表型、分化潛能，以及母幹細胞的增殖能力。該術語含括能夠基本上無限地自我更新的幹細胞(即與母細胞相比，後代或其部分進一步增殖的能力實質上並未降低)，以及展現出自我更新受限的幹細胞(即，其中與母細胞相比，後代或其部分進一步增殖的能力明顯降低)。
術語「肝前驅或幹細胞」是指以較大規模生產以供實施臨床研究用之成年來源的人類肝臟幹細胞/前驅細胞(ADHLSC)和人類同種異體肝前驅細胞(HALPC)，並且與「人類成年肝臟衍生的前驅細胞」、「異源人類成年肝臟衍生的前驅細胞」(縮寫為「HHALPC」以同義來使用。這些細胞代表可如本文所述獲得的一種特定類型人類肝臟衍生的前驅細胞。
基於產生各式各樣細胞類型的能力，前驅或幹細胞通常被描述為全能(totipotent)、多能(pluripotent)，多能(multipotent)或單能。單個「全能」細胞被定義為能夠生長(即發育)為一個完整生物體。「多能(pluripotent)」細胞不能生長成一個完整生物體，但是能夠產生源於所有三種胚層(即中胚層，內胚層和外胚層)的細胞類型，並且可以是能夠產生一個生物體的所有細胞類型。「多能(multipotent)」細胞能夠產生生物體的兩個或更多個不同器官或組織中的每一者的至少一種細胞類型，其中該等細胞類型可源於相同或不同胚層，但是不能夠產生一個生物體的所有細胞類型。「單能」細胞只能夠分化成一種細胞譜系的細胞。
術語「間質幹細胞」應理解為主要從間質細胞或從基質細胞衍生或分離而來的多能基質細胞。該等間質幹細胞能夠分化成各種細胞類型，包括但不限於肝細胞、成骨細胞、軟骨細胞，肌腱細胞和脂肪細胞。
術語「肝細胞」含括上皮肝細胞和實質肝細胞，包括但不限於不同大小或倍數性的肝細胞(例如，二倍體、四倍體、八倍體)。
如本文所用，術語「萃取物」或「溶胞產物」是指溶解的細胞內容物。較佳地，這種萃取物或溶胞產物尚未進一步純化，因而含有整個細胞溶胞產物內容物。在另一個較佳方案中，萃取物是指蛋白質萃取物、RNA萃取物，脂質或膜囊泡。
如本文所用，術語「部分(fraction)」是指可從本發明條件培養基獲得的一部分，組合物或衍生物。
如本文所使用，術語「脂多醣」或縮寫「LPS」表示複雜病原體相關分子模式的單個組分，其是由革蘭氏陰性生物體所釋放。LPS是由脂質和多醣組成的大分子，該多醣由O-抗原，外核與內核透過共價鍵連接而構成，它們存在於革蘭氏陰性細菌的外膜中。
術語「肝臟」是指肝臟器官。術語「肝臟的一部分」通常是指衍生自肝臟器官的任一部分的組織樣品，而對該部分的數量或其源自於肝臟器官的區域並沒有任何限制。較佳地，存在於肝臟器官中的所有細胞類型也可以由肝臟的該部分所表示。肝臟的部分的數量可以至少部分地基於實施考慮，需要獲得足夠的初代肝細胞以便合理地實施本發明的方法。因此，肝臟的一部分可相當於肝臟器官的百分比(例如至少1%、10%、20%、50%、70%、90%或更多，通常為w/w)。在其他非限制性實例中，肝臟的一部分可以按重量定義(例如，至少1 g、10 g、100 g、250 g，500 g或更多)。例如，肝臟的一部分可以是肝葉(例如右葉或左葉)，或包括在分割肝臟手術期間或在肝臟生檢中切除之包含大量細胞的任何節段或組織樣品。
術語「成年肝臟」是指產後(即出生後任何時間，較佳足月)之個體的肝臟，並且可以例如為出生後至少1天大、1週大，1個月大或超過1個月大，或至少1、5、10歲或更大。因此，可以在人類個體中發現「成年肝臟」或成熟肝臟，其在其他方面將以常規術語「嬰兒」、「兒童」，「青少年」或「成年」來描述。習於技藝者將理解到，在不同的動物物種中，肝臟可以在出生後的不同時間間隔內達到相當程度的發育成熟度，且在提到個別物種時可以正確地理解術語「成年肝臟」。
術語「哺乳動物」包括這樣分類的任何動物，包括但不限於人類、馴養和農場動物、動物園動物、運動動物、寵物動物，伴侶動物和實驗動物，諸如小鼠、大鼠、兔、狗、貓、牛、馬，豬和靈長類動物(例如猴子和猿)。
如本文所用，術語「分離」通常是指部分或完全破壞組織或器官的細胞組織，即部分或完全破壞組織或器官之細胞與細胞組分之間的結合。如可由習於技藝者所理解的，分離組織或器官之目的在於從該組織或器官獲得細胞懸浮液，即細胞群。懸浮液可包含單個細胞或單一細胞，以及經物理附接以形成兩個或多個細胞簇或叢的細胞。分離較佳不導致細胞生存力降低或導致細胞生存力降低盡可能小。
如本文所用，術語「初代細胞」包括存在於從個體組織或器官(例如肝臟)獲得的細胞懸浮液中的細胞，該細胞懸浮液是藉由用適當技術使存在於此等移出組織或器官中的細胞分離而獲得。
術語「培養」在本技藝中是常見的，並且廣泛地指細胞及/或其後代的維持及/或生長。
術語「繼代」在本技藝中是常見的，並且是指使培養的細胞與培養基質和細胞彼此脫離和分離。為了簡明起見，在本發明的方法中，在貼壁培養條件下第一次生長細胞之後進行的繼代在本文中稱為「第一代」(或第1代，P1)。細胞可以繼代至少一次，較佳兩次或更多次。在本文中，第1代之後的每次繼代均遞增1，例如第2、3、4、5代或P1、P2、P3、P4、P5等。
術語「匯合度」如本文所用是指培養細胞的密度，其中細胞互相接觸，基本上覆蓋了生長可用的所有平面上(即完全匯合)。
術語「血漿」是如習知定義並指不形成人體或動物身體一部分的組合物。
按習知，術語「血清」是從全血樣品獲得的，其是先在樣品中進行凝血，然後藉由適當的技術(通常藉由離心)將由此形成之血塊和血液樣品和細胞成分與液體成分(血清)分離。惰性催化劑(例如玻璃珠或粉末)可以促進凝血。有利地，可以使用血清分離管(SST)製備血清，該分離管含有針對哺乳動物的惰性催化劑。
術語「細胞培養基(cell medium或cell culture medium)」或「培養基」是指包含營養物的水性液體或凝膠狀物質，其可用於細胞的維持或生長。細胞培養基可含有血清或可不含血清。
如本文所用，術語「生長因子」是指一種生物活性物質，其影響各種細胞類型的增殖、生長、分化，存活及/或遷移，並且可以單獨或當受到其他物質調節時在生物體中造成生物的發育，形態和功能變化。生長因子通常可以(作為配體)透過結合至存在於細胞中的受體(例如，表面或細胞內受體)來發揮作用。本文中的生長因子可以特別地是包含一或多個多肽鏈的蛋白質實體。術語「生長因子」含括纖維母細胞生長因子(FGF)家族、骨形態發生蛋白(BMP)家族、血小板衍生生長因子(PDGF)家族、轉化生長因子β (TGF-β)家族、神經生長因子(NGF)家族、表皮生長因子(EGF)家族、胰島素相關生長因子(IGF)家族、肝細胞生長因子(HGF)家族、介白素6 (IL-6)家族(例如抑瘤素M，OSM)、造血生長因子(HeGF)家族、血小板衍生內皮細胞生長因子(PD-ECGF)、血管生成素、血管內皮生長因子(VEGF)家族、糖皮質激素的成員。當該方法用於人類肝細胞時，本方法中使用的生長因子可以是人類或重組生長因子。較佳在本方法中使用人類與重組生長因子，因為預期這樣的生長因子對細胞功能引發所希望的作用。
如本文所用，術語「細胞介素」是指一種傳訊分子，諸如由免疫細胞或其他細胞分泌的生長，分化或化學營養因子，其對免疫系統的細胞或對多能細胞(諸如，但不限於T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞、組織細胞，包括造血細胞、間質幹細胞和前驅細胞的多能細胞)或其他細胞類型產生作用。代表性細胞介素包括，但不限於吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)、前列腺素E2 (PGE2)、前列腺素內過氧化物合酶2 (PTGS2)、肝細胞生長因子(HGF)，構成介白素之群為諸如但不限於介白素1α (IL-1α)、介白素1β (IL-1β)，介白素2(IL-2)、介白素3 (IL-3)、介白素4 (IL-4)、介白素6 (IL-6)、介白素10 (IL-10)、干擾素(諸如干擾素-α (INF-α)和干擾素-γ (INF-γ))、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)，和顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)。
術語「細胞群」和「細胞之群」通常是指一群細胞。除非另有指明，否則該術語是指基本上由如本文定義的細胞組成或包含如本文定義的細胞之細胞群。細胞群可以由基本上具有共同表型的細胞組成，或者可以包含至少一部分具有共同表型的細胞。當細胞在一或多個可證明的特徵(包括但不限於形態外觀、特定細胞組分或產物(例如，RNA或蛋白質)的表現量、某些生物化學路徑的活性、增殖能力及/或動力學，分化潛能及/或在活體外培育過程中對分化信號的反應或行為(例如貼壁或單層生長)方面實質上類似或相同時，它們被稱為具有共同表型。因此，此等可證明的特徵可以界定細胞群或其一部分。如果基本上大多數細胞具有共同的表型，則細胞群可以是「基本上均質」。「基本上均質」的細胞群可以包含至少60%，例如至少70%、至少80%、至少90%，至少95%或甚至至少99%具有共同表型的細胞，諸如特別提及的表型(例如，本發明的肝前驅或幹細胞的表型，或本發明的肝前驅或幹細胞的後代的表型)。此外，若細胞群中存在的任何其他細胞並未改變或對細胞群的整體特質有實質影響，則細胞群可以基本上由具有共同表型的細胞組成，表型為諸如本發明的肝前驅或幹細胞(即，本發明的肝前驅或幹細胞的後代)的表型。
如本文所用的縮寫「AMPK」是指經5' AMP-活化的蛋白激酶或經5'腺苷單磷酸-活化的蛋白激酶，一種在細胞能量恆定中發揮作用的酵素，當細胞能量低時，主要活化葡萄糖和脂肪酸的攝取和氧化。
如本文所用的術語「醫藥上可接受的載劑」是指不會對個體造成明顯刺激且不會消除所投與組合物之生物學活性和性質的載劑或稀釋劑。在不受限制的情況下，載劑的實例包括丙二醇、鹽水，乳液和有機溶劑與水的混合物。
如本文所用的術語「病症」表示器官/器官系統的系統性功能和生理結構受到破壞。
術語「治療」是指治療性治療和防範性或預防性措施，其中目的是要預防或減慢(減輕)所指向之目標病理病況或病症。那些需要治療的人包括已經患有該疾病的人以及容易罹患該疾病的人或要預防該疾病的人。
如本文所用的術語「同種異體」表示來自接受者以外的不同個體之捐贈材料，儘管該個體與接受者通常有親屬關係。同種異體幹細胞移植是指一個人接受來自另一個在遺傳上相似但不相同的捐贈者之幹細胞的程序。這通常是姐妹或兄弟，但也可能是不相干的捐贈者。
如本文所用的術語「血管通透性」應理解為血管壁允許小分子(藥物、營養物、水、離子)或甚至整個細胞流入和流出血管的能力。
術語「血管通透性增加」，如本文所用，意味著各種分子穿過血管壁的通行增加，包括那些可能是急性和慢性發炎、癌症，和傷口癒合之病因的分子通行。該通透性增加或甚至高通透性是可以透過急性或慢性暴露於血管通透劑(特別是血管通透性因子/血管內皮生長因子(VPF/VEGF，VEGF-A))來媒介。
如本文所用的術語「血管完整性」是指維持血管恆定的血管壁的各種組分的適當功能。血管完整性惡化的早期標誌之一是通透性增加，其主要受到內皮連結穩定性所控制。血管通透性的選擇性調節是藉由調節旁細胞間隙的大小和狀態以及控制跨細胞轉運來實現。
如本文所用的術語「心臟疾病」是指影響心臟的任何疾病及/或病況。該等心臟疾病可包括尤其是血管疾病(諸如冠狀動脈疾病)；心律問題(心律不整)以及先天性心臟缺陷等。
術語「心臟疾病」通常與術語「心血管疾病」交替使用。心血管疾病通常是指涉及血管狹窄或阻塞的病況，其可能導致心臟病發作、胸痛(心絞痛)或中風。其他心臟病況，諸如那些影響心臟肌肉，瓣膜或節律者，也被視為心臟病的形式。
如本文所用的術語「肺部疾病」是指任何肺臟疾病，其是肺中妨礙肺臟正常工作的任何問題。
如本文所用的術語「缺血性疾病」是指由於血流減少以及組織/器官或器官系統補充氧氣充分減少而與該組織/器官或器官系統功能受損相關的任何疾病及/或病況。缺血性疾病的類型包括但不限於冠心病、大腦或腦缺血、肺缺血、腎缺血與類似者。
如本文所用的術語「糖尿病」是指一群代謝病症，其中長期存在高血糖含量。高血糖的症狀包括頻尿，口渴增加和飢餓感增加。糖尿病可引起許多併發症，特別是若未及時治療的話。急性併發症可包括糖尿病性酮酸中毒，高滲壓高血​​糖狀態或死亡。嚴重的長期併發症包括心血管疾病、中風、慢性腎臟病，足潰瘍和眼睛損傷。
如本文所用的術語「眼部疾病」是指影響眼睛的疾病和病況。
如本文所用的術語「癌症」是指涉及細胞異常生長並可能侵入或擴散到身體其他部位的一群疾病。
如本文所用的術語「實體腫瘤」是指通常不包含囊腫或液體區域的異常組織塊。實體腫瘤可能是良性的(非癌症)或惡性的(癌症)。不同類型的實體腫瘤因形成它們的細胞類型來命名。實體腫瘤的實例為肉瘤，癌瘤和淋巴瘤。白血病通常不形成實體腫瘤。
如本文所用的術語「克拉克森氏病(Clarkson’s disease)」是指特發性系統性微血管滲漏症候群(SCLS)，是一種罕見病症，特徵在於被認為是由可逆性微血管屏障功能障礙引起的低血壓性休克和全身水腫的短暫發作。這種潛在致命疾病的特徵是不同強度的低血容量性休克和廣泛性水腫的刻版型「發作」，並伴有濃血症(hemoconcentration)(如由血容比濃度升高所檢測)和低白蛋白血症，通常發生在無蛋白尿的情況下。
如本文所用的術語「敗血症」是指由宿主對感染做出的反應失調所引起的致命器官功能障礙。敗血症的特徵在於由微生物感染引起的瀰漫性發炎性反應。敗血症通常導致免疫抑制狀態，特徵在於淋巴細胞凋亡和對院內感染的易感性。
如本文所用的術語「敗血症引起的」是指發生在組織，器官及/或器官系統中的所有疾病和病況，這是敗血症和相關事件的結果。這樣的病況可以包括但不限於敗血症引起的心肌病、敗血症引起的凝血病、器官功能不良、急性腎損傷、肺臟敗血症，器官功能不良及/或血流不足與類似者。
如本文所用的術語「敗血性心肌病」或「敗血症引起的心肌水腫」表示患有嚴重敗血症的患者的心血管併發症，特徵在於收縮期及/或舒張期左心室(LV)功能可逆性降低，在敗血症期間伴隨著左心室壁水腫。
術語「結腸結紮和穿孔」是指一種由盲腸穿孔構成的病症，其允許糞便物質釋放到腹膜腔中，產生由多菌性感染引起的惡化性免疫反應。針穿孔後的糞便溢出產生了多菌性敗血症。盲腸結紮和穿孔模式代表了一種金標準，是研究敗血症最常用的模型，因為它與人類敗血症的進程及特徵非常相似。
如本文所用的術語「敗血症引起的肺損傷」表示繼發於敗血症的急性肺損傷或病症。肺臟是最常受到敗血症相關全身性發炎性反應所影響的器官，從而導致急性肺損傷或更為嚴重的急性呼吸窘迫症候群。 發明詳細說明
本發明涉及經分離肝前驅或幹細胞、其溶胞產物、及/或可藉由在培養基中培養該等肝前驅或幹細胞獲得之條件培養基的用途，其供治療血管通透性增加所致的疾病和病況。在另一個或其他具體例中，該等細胞、其溶胞產物及/或條件培養基可用於在個體發炎及/或感染之後，於該個體體內回復細胞和組織的血管完整性。替代地或另外地，該等細胞、其溶胞產物及/或條件培養基可用於透過AMPK活化來調控個體(較佳為人類個體)的AMP信號傳導。
經AMP活化的蛋白激酶(AMPK)是一種能量感測分子，它可受到諸如缺氧、熱休克，缺血和葡萄糖缺乏的細胞壓力源而「開啟」。其活化會抑制合成代謝(消耗ATP)的路徑，並誘導刺激分解代謝(產生ATP)的路徑。已知AMPK會調節IEJ、維持內皮細胞的功能完整性，內皮屏障完整性並因此充當作為對抗敗血性損傷和高通透性的防禦措施。細胞中的AMPK活化可能對血管內皮的功能完整性提供潛在有益作用。
肝前驅或幹細胞及用於分離肝幹細胞的方法為本技藝中熟知的，例如EP 1 969 118、EP 3 039 123，EP 3 140 393或EP 3 423 566所表明，它們被併入本文作為參考資料。同樣已詳述過肝前驅或幹細胞供治療肝臟疾病的用途。透過在細胞培養基中培養成人衍生之人類肝前驅或幹細胞而獲得的組合物，及其供治療涉及器官損傷、器官衰竭之疾病的用途，還有供器官或細胞移植(特別是肝臟)中的用途是WO 2015 001 124的宗旨。
在本文中，首次證明肝前驅或幹細胞，以及其溶胞產物和藉由在培養基中培養該等細胞獲得的條件培養基可用於回復細胞和組織的血管完整性，其是透過促進回復內皮的功能性結構，尤其是經由AMPK活化。因此，肝前驅或幹細胞，以及其溶胞產物和藉由在培養基中培養該等細胞所獲得的條件培養基為與血管高通透性增加相關之病況與疾病提供治療。
本發明中所使用的細胞是肝前驅或幹細胞，較佳為哺乳動物細胞，諸如人類肝前驅或幹細胞。
在一個具體例中，人類肝前驅或幹細胞對至少一個間質標記呈陽性。間質標記包括但不限於波形蛋白(vimentin)、CD13、CD90、CD73、CD44、CD29，α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)和CD140b。另外，肝前驅細胞可分泌HGF及/或PGE2。此外，它們可能視情況對至少一種肝標記呈陽性及/或展現出至少一種肝臟特異性活性。例如，肝標記包括但不限於HNF-3B、HNF-4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1，CYP3A4和α-1抗胰蛋白酶，並且還可以包括白蛋白(ALB)。肝臟特異性活性可包括但不限於尿素分泌、膽紅素結合，α-1-抗胰蛋白酶分泌和CYP3A4活性。
在本發明的另一個具體例中，人類肝前驅或幹細胞表現選自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29，波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)的至少一種間質標記，且它們還分泌HGF。
在本發明的另一個具體例中，人類肝前驅或幹細胞表現選自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29，波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)的至少一種間質標記，且它們還分泌HGF和PGE2。
在本發明的另一個具體例中，人類肝前驅或幹細胞表現選自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29，波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)的至少一種間質標記，且它們還視情況表現至少一種肝標記及/或展現出肝臟特異性活性及/或展現出臟肝特異性活性。
在一個具體例中，人類肝前驅或幹細胞的特徵可能在於它們共表現(即，呈陽性)至少一種間質標記，該至少一種間質標記包括但不限於CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、波形蛋白、CD29，和α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)，其中至少一種肝或肝細胞標記包括但不限於α-胎蛋白(AFP)、α-1抗胰蛋白酶，HNF-4及/或MRP2轉運蛋白，視情況加上肝細胞標記白蛋白(ALB)。它們還視情況展現出肝臟特異性活性，其可選自尿素分泌、膽紅素結合，α-1-抗胰蛋白酶分泌和CYP3A4活性。此外，HALPC較佳表現HGF和PGE-2。
在一個具體例中，該等細胞較佳為對至少一種肝標記和至少一種間質標記呈陽性並且展示至少一種肝臟特異性活性的人類肝前驅或幹細胞。例如，肝標記包括但不限於HNF-3B、HNF-4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1，CYP3A4和α-1抗胰蛋白酶，且還可包括白蛋白(ALB)。間質標記包括但不限於波形蛋白、CD13、CD90、CD73、CD44、CD29，α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)和CD140b。肝臟特異性活性包括但不限於尿素分泌、膽紅素結合，α-1抗胰蛋白酶分泌和CYP3A4活性。
該等肝前驅或幹細胞，或包含此等細胞的細胞群將能夠至少產生肝細胞樣細胞。較佳地，該等細胞不分化為骨細胞或脂肪細胞。
在本發明的一個較佳具體例中，所用人類肝前驅或幹細胞將對選自下列之群的標記中的至少一者呈陽性：α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)、白蛋白(ALB)、CD140b，和MMP1；且對選自下列之群的標記中的至少一者呈陰性：含壽司域蛋白2 (sushi domain containing protein 2, SUSD2)和細胞角蛋白-19 (CK-19)。
在本發明的另一個具體例中，人類肝前驅或幹細胞經測定對α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)、CD140b，和視情況白蛋白(ALB)呈陽性；且對細胞角蛋白-19 (CK-19)呈陰性。
在進一步的具體例中，人類肝前驅或幹細胞經測定對α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)，CD140b，和視情況白蛋白(ALB)和含壽司域蛋白2 (SUSD2)呈陽性；且對細胞角蛋白19 (CK-19)呈陰性。
在本發明的另一個具體例中，人類肝前驅或幹細胞經測定對α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)、CD140b，和視情況白蛋白(ALB)呈陽性；且對含壽司域蛋白2 (SUSD2)和細胞角蛋白-19 (CK-19)呈陰性。
在本發明的另一個具體例中，人類肝前驅或幹細胞經測定對CD90、CD73，波形蛋白和ASMA呈陽性。
在本發明的又一個具體例中，人類肝前驅或幹細胞對CD90、CD73，波形蛋白和ASMA呈陽性，且每次中期(metaphase)展現平均少於約2.5%純系變形(clonal aberration)及/或每次中期少於約15%的非純系變形。
在另一個具體例中，人類肝前驅或幹細胞經測定對CD90、CD73，波形蛋白和ASMA呈陽性，且對CK-19呈陰性。
在另一個或進一步的較佳具體例中，該等人類肝前驅或幹細胞經測定對選自以下之群的一或多個標記呈陽性： -  α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)、白蛋白(ALB)、CD140b、MMP1； -  至少一種選自HNF-3B、HNF-4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1、CYP3A4的肝標記； -  至少一種選自波形蛋白、CD90、CD73、CD44、CD29的間質標記； -  至少一種選自尿素分泌、膽紅素結合，α-1抗胰蛋白酶分泌和CYP3A4活性的肝臟特異性活性； -  至少一種選自ATP2B4、ITGA3、TFRC、SLC3A2、CD59、ITGB5、CD151、ICAM1、ANPEP、CD46、CD81的標記；及 -  至少一種選自ITGA11、FMOD、KCND2、CCL11、ASPN，KCNK2和HMCN1的標記。
在本發明的又另一個或更多具體例中，HALPC細胞進一步經測定對以下呈陽性： -  至少一個選自HNF-3B、HNF-4、CYP1A2、CYP2C9，CYP2E1和CYP3A4和視情況白蛋白的肝標記； -  至少一個選自波形蛋白、CD90、CD73、CD44和CD29的間質標記； -  至少一個選自尿素分泌、膽紅素結合，α-1-抗胰蛋白酶分泌和CYP3A4活性的肝臟特異性活性； -  至少一個選自ATP2B4、ITGA3、TFRC、SLC3A2、CD59、ITGB5、CD151、ICAM1、ANPEP、CD46和CD81的標記；以及 -  至少一個選自MMP1、ITGA11、FMOD、KCND2、CCL11、ASPN、KCNK2，和HMCN1的標記。
將理解的是，細胞可對如上文所提供的標記的任何組合呈陽性。在一個尤佳的具體例中，該等細胞對於以上所有標記均呈陽性。
在另一個或進一步的具體例中，該等細胞經測定對一或多個選自以下之群的標記呈陰性： -  含壽司域蛋白2 (SUSD2)和細胞角蛋白-19 (CK-19)； -  CD271； -  至少一個選自ITGAM、ITGAX、IL1R2，CDH5和NCAM1的標記；以及 -  至少一個選自HP、CP、RBP4、APOB、LBP、ORM1、CD24，CPM和APOC1的標記。
將理解的是，細胞對如上文提供的標記的任何組合可能呈陰性。在一個尤佳的具體例中，該等細胞對以上所有標記均呈陰性。
在又一個具體例中，該等細胞對HLA-DR呈陰性。
在又一個具體例中，HALPC對某些標記(諸如CD133、CD45，CK19及/或CD31)呈陰性。
在又一個具體例中，HALPC經測定對WO2016/030525，表6中列出的一或多種酶活性呈陽性。在一些具體例中，這種類型的成年肝前驅細胞可以進一步由一系列陰性標記來特徵鑑定，尤其是對由ITGAM、ITGAX、IL1R2，CDH5和NCAM 1組成之群中的一或多者。此外，HALPC也經測定對由HP、CP、RBP4、APOB、LBP、ORM 1、CD24，CPM和APOC1中的一或多者呈陰性。
上面列出的生物學活性，標記和形態/功能特徵可能以標記的不同組合形式存在於HALPC中，諸如： -  對α-平滑肌肌動蛋白、波形蛋白、CD90、CD73、CD44、CD29，CD140b和CYP3A4活性以及視情況白蛋白呈陽性；以及 -  對含壽司域蛋白2，細胞角蛋白-19和CD271呈陰性。
還可以以任何功能和技術組合來確定上述具體例之HALPC的更多特徵，例如藉由測量對選自ATP2B4、ITGA3、TFRC、SLC3A2、CD59、ITGB5、CD151、ICAM1、ANPEP，CD46和CD81的至少又一個標記呈陽性。在一些這樣的具體例中，HALPC可經測定對選自由ITGAM、ITGAX、IL1R2，CDH5和NCAM1組成之群的至少又另一個標記呈陰性。在一些這樣的具體例中，HALPC可以經測定對HP、CP、RBP4、APOB、LBP、ORM1、CD24，CPM和APOC1中的至少一者呈陰性。
在用於識別此等標記並測量它們呈陽性或陰性的技術中，較佳為西方墨點法、流動式細胞測量術、免疫細胞化學和ELISA，因為這些技術允許在蛋白質層次偵測標記，即使在這個步驟僅有少量的肝前驅或幹細胞可用。
在又一個較佳具體例中，該等肝前驅或幹細胞具有間質樣形態，包含以單層生長、扁平形式，明顯細胞質且具有一或兩個核仁的卵核中的任一者或全部。
這些前驅或幹細胞能夠保有其增殖能力並且培育在特定培養基中，從而使細胞能夠特異地分化為肝特異性細胞類型而非中胚層細胞類型。
在本發明的一個具體例中，使用如上所述細胞的細胞溶胞產物，而不是實際細胞。該細胞溶胞產物可以透過技藝中已知的任何方式獲得，諸如酶消化細胞或細胞培養物，清潔劑及/或緩衝劑處理與類似者。
在另一個較佳具體例中，該肝前驅或幹細胞是人類的。在一個尤佳的具體例中，該人類肝前驅或幹細胞是成年的。
如上所述的人類肝前驅或幹細胞可透過技藝中已知的任何合適方法獲得，例如如例如EP 1 969 118、EP 3 039 123，EP 3 140 393或EP 3 423 566 (參見實例1)中所述。簡言之，首先分離肝臟或其一部分而獲得肝臟初代細胞群，以從該肝臟或其部分形成肝臟初代細胞群。隨後，較佳在貼附條件下培養此製備物中所包含的細胞，較佳地以允許細胞貼附並生長在撐體上。接下來，使這些細胞繼代至少一次，較佳在70%，80%或90%匯合度下。最後，分離細胞，其對至少一種肝標記和至少一種間質標記呈陽性，並且具有至少一種肝臟特異性活性。
在一個較佳具體例中，此方法包含以下步驟： (a)分離成年肝臟或其一部分，以形成初代肝細胞群； (b)   產生(a)的初代肝細胞製備物； (c)   將(b)之製備物中所含的細胞培養在撐體上，其容許細胞貼附並生長至其上且出現細胞群； (d)   使(c)的細胞繼代至少一次； (e)   分離在(d)繼代後獲得並且對發明說明中鑑定之標記呈陽性的細胞群。
用於分離肝臟或其部分以獲得初代細胞群(懸浮物)的合適方法可以是技藝中周知的任何方法，包括但不限於酶消化、機械分離、過濾，離心及其組合。
關於方法的步驟(a)，分離步驟包含獲得肝臟或其一部分，其包含一定量之可以用於產生肝前驅或幹細胞的初代細胞連同完全分化的肝細胞。
肝臟或其部分是得自「個體」，「捐贈者個體」或「捐贈者」，可交換地指脊椎動物，較佳哺乳動物，更佳人類。肝臟的一部分可以是源自肝臟任何部分的組織樣品，並且可包含存在於肝臟中的不同細胞類型。根據本發明的細胞較佳地分離自哺乳動物肝臟或肝臟的一部分，其中術語哺乳動物是指被分類為哺乳動物的任何動物，包括人類，馴養和農場動物，以及動物園、實驗室、運動或寵物動物，諸如狗、馬、貓、牛、小鼠、大鼠，兔等，更佳地，肝前驅細胞或幹細胞是分離自人類肝臟或其一部分，較佳為人類成年肝臟或其一部分。依據本發明，衍生自成年人類個體肝臟的肝前驅或幹細胞，細胞株或其後代可以有利地用於例如研究和治療患有涉及不樂見免疫反應之病症的患者，特別是人類患者，不樂見免疫反應為例如，但不限於發炎，自體免疫疾病和移植排斥反應，包括肝臟疾病。相對於其他幹細胞來源(諸如例如容易產生腫瘤生長的胚胎幹細胞)，源自成年肝臟的幹細胞可降低偏向致癌性的風險，從而使其更為安全地用於細胞移植。
在本發明的替代具體例中，成年肝臟或其部分可以來自非人類動物個體，較佳非人類哺乳動物個體。如本文所述衍生自非人類動物或非人類哺乳動物個體肝臟的前驅或幹細胞或細胞株或其後代可有利地用於例如研究與治療其成員，相關或其他非人類動物或非人類哺乳動物物種，或甚至用於治療患有肝臟疾病的人類患者(例如異種移植，包含非人類動物或非人類哺乳動物細胞的生物人工肝臟裝置)的肝臟疾病中。藉助實例而非限制，用於人類療法之特別合適的非人類哺乳動物細胞可以源自豬。
根據技藝中公認的標準，諸如例如「心肺」標準(通常涉及循環和呼吸功能不可逆的停止)或「腦死」標準(通常涉及整個腦部(包括腦幹)所有功能不可逆的停止)，捐贈者個體可能是活的或死亡的。收取可能包含技藝中已知的程序，諸如例如生檢，截斷或切除。
習於技藝者將理解到，從捐贈者個體收取肝臟或其一部分的至少某些方面要遵從對應的法律和道德規範。藉助實例而非限制，從活著的人類捐贈者收取肝臟組織可能需要兼顧維持捐贈者的餘生。因此，典型地，例如可以使用生檢或截斷從活著的人類捐贈者取出僅只一部分肝臟，從而在捐贈者體內維持足夠水平的生理肝臟功能。另一方面，從非人類動物收取肝臟或其部分可以但不必要兼顧非人類動物的進一步存活下來。例如，非人類動物可在收取組織後被人道撲殺。這些和類似的考量對習於技藝者來說將是顯而易見的，並且反映了法律和道德標準。
肝臟或其部分可得自具有持續循環(例如，跳動的心臟)和持續呼吸功能(例如，仍在呼吸的肺臟或人工通氣)的捐贈者，較佳為人類捐贈者。在遵從道德和法律規範的情況下，捐贈者可能需要或不需要腦死(例如取出整個肝臟或其部分無法兼顧人類捐贈者進一步存活下來，但在腦死人類來說是容許的)。從這樣的捐贈者收取肝臟或其部分是有利的，因為組織沒有遭受到通常因為缺血(循環停止)引起的實質性缺氧(缺少氧合)。
或者，可從捐贈者(較佳人類捐贈者)獲得肝臟或其部分，該位捐贈者在收取組織時已停止循環(例如心臟無搏動)，及/或已停止呼吸功能(例如無呼吸的肺臟且無人工通氣)。儘管來自這些捐贈者的肝臟或其部分可能至少遭受到某種程度的缺氧，但也可以從此類組織中分離出有活力的前驅或幹細胞。可以在捐贈者的循環(例如心跳)停止後約24小時內，例如在捐贈者的循環(例如心跳)停止後約20小時內、例如在約16小時內、更佳在約12小時內、例如在約8小時內、甚至更佳約6小時內、例如約5小時內、約4小時內或約3小時內、還更佳約2小時內、最佳約1小時內，例如約45，30或15分鐘內，收取肝臟或其部分。
可以將收取的組織冷卻至大約室溫，或者冷卻至低於室溫的溫度，但是通常避免冷凍組織或其部分，特別是在這種冷凍將導致成核或冰晶生長。例如，組織可以保持在約1℃至室溫之間、約2℃至室溫之間，約3℃至室溫之間或約4℃至室溫之間的任何溫度下，並且可以是有利地保持在約4℃下。如技藝中已知的，也可以將組織保持在「冰上」。可以在全部或部分缺血時間(即在捐贈者停止循環後的時間)內冷卻組織。也就是組織可能經歷過熱缺血，冷缺血或熱缺血和冷缺血的組合。所收取的組織可以在加工處理之前這樣保存例如至多48小時，較佳少於24小時、例如少於16小時、更佳少於12小時、例如少於10小時、少於6小時、少於3小時，少於2小時或少於1小時。
所收取的組織可以有利地但不必然被保持在例如合適的介質中，例如完全或至少部分地被浸沒其中，及/或可以但不必然被合適的介質灌注，然後進一步加工處理組織。習於技藝者能夠選擇合適的介質，該介質可以在處理之前的期間支持組織細胞的存活。
根據技藝中已知的方法，例如如EP 1 969 118、EP 3 039 123、EP 3 140 393或EP 3 423 566 (參見實例1)中所述，從肝臟或一部分肝臟中分離前驅細胞或幹細胞。
簡言之，首先從分離肝臟或其部分來獲得肝臟初代細胞群，以形成來自該肝臟或其部分的初代細胞群。隨後，較佳地在貼附條件下培養該製備物中所包含的細胞，較佳地允許細胞貼附並生長在撐體上。接下來，使這些細胞繼代至少一次，較佳在70%匯合度下。最後，分離對至少一種肝標記以及至少一種間質標記呈陽性，並具有至少一種肝臟特異性活性的細胞。
關於方法的步驟(b)，如界定並在此藉由分離肝臟或其部分而獲得的初代細胞群通常可能是異質的，也就是它可能包含屬於一或多種歸於任何肝臟組成細胞類型的細胞類型的細胞，包括肝實質及/或肝非實質部分中可能已經存在的前驅或幹細胞。例示性肝臟組成細胞類型包括，但不限於肝細胞、膽管細胞(膽道細胞)、庫弗細胞、肝星狀細胞(Ito細胞)，卵圓形細胞和肝內皮細胞。以上術語具有本技藝中已確定的含義，並且在本文中被廣泛地解釋為涵蓋據此分類的任何細胞類型。
透過施予任何合適的技術，基於物理性質(尺寸、形態)、生存力，細胞培養條件或細胞表面標記，根據用於分離肝臟的方法及/或任何用於分離或增濃肝細胞及/或其他細胞類型之初始製備物的方法，初代細胞群可包含不同比例的肝細胞(佔總細胞的0.1%、1%，10%或更多)。
如界定並藉由分離肝臟(或其部分)獲得的初代細胞群可立即用於建立細胞培養物，作為新鮮的初代肝細胞，或者較佳使用慣用技術以初代肝細胞的冷凍保存製備物來長期保存。
關於步驟(c)，在步驟(b)中得到的肝初代細胞製備物接著直接培養在全合成撐體(例如，塑膠或任何聚合物質)上或預塗覆有餵養細胞、蛋白質萃取物，或任何其他生物來源材料的合成撐體上，其允許相似的初代細胞貼附並增殖以及出現具有所需標記的成年肝前驅或幹細胞群，這些標記較佳是藉由以下方法在蛋白質層次上進行鑑定：免疫組織化學，流動式細胞測量術或其他基於抗體的技術。初代細胞培養在維持貼附與增殖和出現均質細胞群的細胞培養基中。如上所界定的初代肝細胞的培養步驟導致培養物中出現和增殖肝前驅或幹細胞，並且可以持續進行直到肝前驅或幹細胞已充分增殖。例如，可以繼續培養直到細胞群達到某個程度的匯合度(例如至少50%、70%，80%或至少90%或更高匯合度)。
步驟(c)中獲得的肝前驅或幹細胞可以透過技術來進一步特徵鑑定，該技術允許在此階段(即步驟(d)所示繼代細胞之前)偵測相關標記，如EP 3 140 393或EP 3 423 566中所述。在用於識別此等標記並測量它們為陽性或陰性的技術中，西方墨點法、流動式細胞測量術、免疫細胞化學，和ELISA是較佳的，因為這些技術允許在蛋白質層次下偵測標記，即使在這個步驟僅有少量的肝前驅或幹細胞可用。
然後可以基於存在陽性標記來分離肝前驅或幹細胞，肝前驅或幹細胞對至少一種間質標記呈陽性。間質標記包括，但不限於波形蛋白、CD13、CD90、CD73、CD44、CD29、α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)和CD140-b。此外，肝前驅細胞可分泌HGF及/或PGE2。再者，它們可以視情況對至少一種肝標記呈陽性及/或展現出至少一種肝臟特異性活性。例如，肝標記包括但不限於HNF-3B、HNF-4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1、CYP3A4和α-1抗胰蛋白酶，且還可以包括白蛋白(ALB)。肝臟特異性活性可包括但不限於尿素分泌、膽紅素結合，α-1-抗胰蛋白酶分泌和CYP3A4活性。
在一個特定具體例中，可以基於存在選自波形蛋白、CD13、CD90、CD73、CD44、CD29、α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)和CD140-b的陽性間質標記，以及視情況基於分泌HGF及/或PGE2來分離肝前驅或幹細胞。
在一個具體例中，接著可以基於存在陽性標記來分離肝前驅或幹細胞，肝前驅或幹細胞對於至少一種肝標記和至少一種間質標記呈陽性，且具有至少一種肝臟特異性活性。例如，肝標記包括但不限於白蛋白(ALB)、HNF-3B、HNF-4、CYP1A2、CYP2C9、CYP2E1、CYP3A4和α-1抗胰蛋白酶。間質標記包括但不限於波形蛋白、CD13、CD90、CD73、CD44、CD29、α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)和CD140b。肝臟特異性活性包括但不限於尿素分泌、膽紅素結合、α-1抗胰蛋白酶分泌和CYP3A4活性。
關於方法的步驟(d)，初代細胞培養在維持其貼附並增殖且出現均質細胞群的細胞培養基中，其在繼代至少一次之後，逐漸地富含肝前驅或幹細胞。這些肝前驅或幹細胞可以快速擴增，以生成足夠的細胞而獲得具有所需性質的後代(如EP 3 140 393或EP 3 423 566中所述)，且細胞數在48-72小時內倍增並維持具有所需性質的肝前驅或幹細胞至少持續2、3、4、5或更多代。
將經分離肝前驅或幹細胞鋪在允許細胞貼附的基質上，並將在維持其進一步增殖的培養基中進行培養，該培養基通常為液體培養基，其可以含有血清或可以不含血清。通常，允許細胞貼附至其的基質可以是任何基本上親水的基質。用於生長貼附細胞的當前標準實務可能涉及在添加或不添加牛，人類或其他動物血清的情況下使用限定化學培養基。這些可補充有機或無機化合物之適當混合物的培養基，除了提供營養物及/或生長促進劑外，還可以促進特定細胞類型的生長/附著或消除/脫離。除了提供營養物及/或生長促進劑外，所添加的血清還可以透過在經處理過的塑膠表面上塗覆一層基質，從而使細胞更為充分地附著，從而促進細胞附著。如那些習於技藝者所理解的，可以對細胞進行計數，以便於隨後以期望的密度來鋪盤細胞。
舖有細胞的環境可至少包含細胞培養基，在本發明的方法中通常為液體培養基，其支持經分離肝前驅細胞的存活及/或生長。液體培養基可以在細胞引入之前，同時或之後被添加到系統中。
通常，培養基將包含技藝中熟知的基礎培養基配方。許多基礎培養基配方可用於培養本文的初代細胞，包括但不限於伊格氏最低基本培養基(MEM)、經杜貝可氏改良的伊格氏培養基(DMEM)、α經改良最低必須培養基(alpha-MEM)、基礎必須培養基(BME)、經伊可夫氏改良的杜貝可氏培養基(IMDM)、BGJb培養基、F-12營養混合物(Ham)、Liebovitz L-15、DMEM/F-12、必須經改良伊格氏培養基(EMEM)、RPMI-1640、培養基199，Waymouth培養基MB 752/1或威廉氏培養基E，及其改良及/或組合。上述基礎培養基的組成一般為本技藝中周知的，並且根據所培養細胞的需要來改良或調控培養基及/或培養基補充劑的濃度在本領域技術人員的能力範圍內。較佳的基礎培養基配方可以是那些市售之一，例如威廉氏培養基E，IMDM或DMEM，據報導它們可以維持成年肝細胞的活體外培養，並且包括生長因子的混合物以供其適當生長、增殖、維持所需標記及/或生物活性或長期儲存。另一種較佳培養基是支持肝前驅或幹細胞生長的商用無血清培養基，諸如例如來自Miltenyi的StemMacs™，來自FUJIFILM Irvine Scientific的Prime-XV或DMEM 10% FBS (Gibco)。
這樣的基礎培養基配方含有哺乳動物細胞發育本身已知所必需的成分。藉助說明而非限制，這些成分可以包括無機鹽(特別是含有Na、K、Mg、Ca、Cl、P以及可能Cu、Fe、Se和Zn的鹽)、生理緩衝劑(例如HEPES，碳酸氫鹽)、核苷酸，核苷及/或核酸鹼基、核糖、去氧核糖、胺基酸、維生素，抗氧化劑(例如麩胱甘肽)和碳源(例如葡萄糖、丙酮酸鹽，例如丙酮酸鈉，乙酸鹽，例如乙酸鈉)等。同樣顯而易見的是，許多有或沒有丙酮酸鈉的培養基都可以作為低葡萄糖配方來使用。
有關在培養方面的用途，可以向基礎培養基提供一或多種其他組分。例如，可以使用額外補充劑為細胞提供必要的微量元素和物質，以實現最佳的生長和擴張。這樣的補充劑包括胰島素、轉鐵蛋白，硒鹽及其組合。這些組分可以包含在鹽溶液中，諸如但不限於漢克氏平衡鹽溶液(HBSS)、Earle氏鹽溶液。可以添加更多抗氧化劑補充劑，例如β-巰基乙醇。儘管許多基礎培養基已經含有胺基酸，但稍後可以補充一些胺基酸，例如L-麩醯胺酸，已知其在溶液中較不穩定。可以進一步向培養基提供抗生素及/或抗真菌化合物，例如典型地青黴素和鏈黴素的混合物，及/或其他化合物，例如但不限於兩性黴素、胺芐青黴素、慶大黴素、博來黴素、潮黴素、卡那黴素、絲裂黴素、黴酚酸、萘啶酸、新黴素、制黴素、巴龍黴素、多黏菌素、嘌呤黴素、利福平、壯觀黴素、四環素，泰樂菌素和吉歐黴素。
激素也可以有利地用於細胞培養物中，且包括但不限於D-醛固酮、己烯雌酚(DES)、地塞米松、雌二醇、氫化可的松、胰島素、催乳素、孕酮、生長抑素/人類生長激素(HGH)、促甲狀腺激素、甲狀腺素、L-甲狀腺素，表皮生長因子(EGF)和肝細胞生長因子(HGF)。肝細胞也可以受益於與三碘甲腺胺酸、α-生育酚乙酸酯，和升糖素一起進行培養。
脂質和脂質載劑也可以用於補充細胞培養基。這樣的脂質和載劑可以包括但不限於尤其是環糊精、膽固醇、與白蛋白結合的亞油酸、與白蛋白結合的亞油酸和油酸、未結合的亞油酸、與白蛋白結合的亞油酸-油酸-花生四烯酸、未結合和與白蛋白結合的油酸。白蛋白可類似地用於無脂肪酸配方中。
也考慮到細胞培養基補充有哺乳動物血漿或血清。血漿或血清往往含有生存力和擴張所必需的細胞介素和組分。也考量使用合適的血清替代物。如本文所述用於培養基的合適血漿或血清可包括人類血漿或血清；或衍生自非人類動物的血漿或血清，較佳為非人類哺乳動物，諸如例如非人類靈長類動物(例如狐猴、猴子、猿)、胎兒或成年牛、馬、豬、羊、山羊、狗、兔，小鼠或大鼠血清或血漿等。在另一個具體例中，上述血漿及/或血清的任何組合可以使用在細胞培養基中。
繼代時，所培養的細胞與培養基質還有彼此脫離且分離。細胞的脫離和分離可以如本技藝中通常已知的進行，例如藉由用蛋白水解酶(例如選自胰蛋白酶、膠原酶，例如第I，II，III或IV型、分散酶、鏈黴蛋白酶，木瓜蛋白酶等)進行酶處理、用二價離子螯合劑(例如EDTA或EGTA)進行處理或機械處理(例如透過小口徑移液器或移液器吸頭反覆移液)或這些處理的任何組合。
合適的細胞脫離和分散方法應確保所需程度的細胞脫離和分散，同時保留培養物中大部分的細胞。較佳地，所培養細胞的脫離和分離將產生相當比例的細胞為單個活細胞(例如，至少50%、70%、80%、90%細胞或更多)。其餘細胞可以存在於細胞簇中，每個細胞簇包含相對少量的細胞(例如，平均1至100個細胞之間)。
接下來，可以將這樣脫離和分離的細胞(通常是等滲緩衝液或培養基中的細胞懸浮液)重新鋪在允許細胞附著至其的基質上，然後在如上所述的培養基中培養以支持進一步擴增HALPC和HALPC後代。然後可藉由以10至105 個細胞/cm2 的密度以及約1/16至1/2 (較佳約1/8至1/2，更佳約1/4至1/2)的分裂比重新鋪盤來培養這些細胞。分裂比表示接種到空的(通常是新的)培養容器中的繼代細胞的分數，該培養容器的表面積與獲得細胞的容器之表面積相同。培養容器的類型以及允許細胞貼附到培養容器和細胞培養基中的表面的類型可以與最初使用的相同並且如上所述，或者可以不同。較佳地，將細胞維持在CellBind，或用細胞外基質蛋白(例如膠原蛋白，較佳第I型膠原蛋白)或在GMP條件下可接受的合成肽塗覆的任何其他合適的撐體上。
關於上述步驟(e)，HALPC群的分離適用於對所列標記呈陽性的細胞，進一步驗證了最初在上述步驟(c)鑑定HALPC的標準，但只要繼代後可用的細胞量高，就可以更為容易地確立。
本發明同樣是有關一種可藉由培養人類肝前驅或幹細胞獲得以供上述使用的條件培養基。除細胞本身以外，自細胞培養物收取的培養基通常被稱為條件培養基，經證實促進內皮細胞的緊密連結和黏連連結組配。
在一個尤佳的具體例中，本發明的該條件培養基是無細胞的。無細胞性質可以透過技藝中的常規方法來獲得，常規方法為諸如過濾、酶消化、離心、吸附，及/或透過層析分離，或者重複及/或合併此等方法。該條件培養基還包含可溶性蛋白，微泡和胞外體。
可藉由培養上述肝前驅或幹細胞獲得的條件培養基被發現到包含可溶性蛋白，尤其是生長因子、趨化介素、基質金屬蛋白酶，和促發炎性細胞介素與抗發炎性細胞介素，其存在可以提供有用的生物活性。經推測這些成分是由培養基中的細胞所分泌。
在一個具體例中，將經分離肝前驅或幹細胞鋪在允許細胞附著至其的基質上，並在支持其進一步增殖的培養基中進行培養，該培養基通常為液體培養基，其可以含有血清或可以不含血清。通常允許細胞貼附於至其的基質可以是任何基本上親水的基質。用於生長貼附細胞的當前標準實務可能包含在添加或不添加牛，人類或其他動物血清的情況下使用限定化學培養基。在一個尤佳的具體例中，此等培養基包含血清。這些可以補充有機或無機化合物之適當混合物的培養基，除了提供營養物及/或生長促進劑外，還可以促進特定細胞類型的生長/貼附或消除/脫離。除了提供營養物及/或生長促進劑外，所添加的血清還可以透過在經處理過的塑膠表面上塗覆一層基質，使細胞更為充分地附著，從而促進細胞貼附。如習於技藝者所理解的，可以對細胞進行計數，便於隨後以期望的密度鋪盤細胞。在另一個尤佳的具體例中，這樣的培養基不含血清。
如本文所教示用於產生無細胞條件培養基的方法包含以下步驟：透過上述方法中的任一者獲得人類肝前驅或幹細胞、在細胞培養基中培養人類肝前驅或幹細胞，以及將細胞培養基與人類肝前驅或幹細胞予以分離。
細胞鋪設其中的環境可以至少包含細胞培養基，在本發明的方法中通常為液體培養基，其支持經分離肝前驅或幹細胞的存活及/或生長。可以在將細胞引入之前，同時或之後將液體培養基添加至系統。上面已經描述了較佳的培養基配方。
該方法可藉由使用細胞培養基(細胞培養基是無血清培養基)、藉由改良細胞培養的特定條件，及/或以給定時間點(例如至少2、4、6、8、12、24小時)培養人類肝前驅或幹細胞之後藉由將細胞培養基與該等人類肝前驅或幹細胞分離來實施。所得到的條件培養基具有富含(或耗乏)可溶性蛋白、RNA、胞外體及/或微泡的組成，其在條件培養基內降解(或不穩定)或不以常規方式由人類肝前驅或幹細胞僅只在某些小時數之前或之後分泌(因此不會逐漸累積在條件培養基中)。相關時間點可以是更短(例如，2小時或更短)或更長(諸如24小時，在36小時或更多個小時)。透過在這些時間點或在中間者(諸如1、2、4、6、8、12或18小時)獲得樣品，並測試此等樣品的組成及/或活性，可以確定用於獲得衍生自人類肝前驅或幹細胞之所需條件培養基的最佳時間點。
在一個具體例中，該條件培養基是衍生自無細胞條件培養基的產物，條件培養基可藉由培養肝前驅或幹細胞而獲得。該產物是一個透過分離該條件培養基而獲得的部分。這種分離可以包含施予一或多種技藝中已知的技術，諸如例如過濾、酶消化、離心，吸附及/或藉由層析分離。
本發明的條件培養基及/或其部分通常含有可溶性蛋白，RNA，胞外體及/或微泡。
在一個較佳具體例中，條件培養基包含選自肝細胞生長因子(HGF)、介白素6 (IL-6)，介白素8 (IL-8)和血管內皮生長因子(VEGF)之群的一或多種組分。
在另一個較佳具體例中，條件培養基及/或其部分至少包含肝細胞生長因子(HGF)、介白素6 (IL-6)，介白素8 (IL-8)和血管內皮生長因子(VEGF)。
在某些具體例中，條件培養基及/或其部分包括： (a)   至少一種選自以下組成之群的可溶性蛋白質：肝細胞生長因子(HGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、嗜酸性球趨化介素(eotaxin)(CCL11)，介白素6 (IL-6)和介白素8 (IL-8)；以及視情況 (b)   至少一種選自以下組成之群的可溶性蛋白：基質金屬蛋白酶、生長因子，趨化介素和細胞介素。
這樣的可溶性蛋白可較佳地以至少1 ng/ml的濃度存在於條件培養基及/或其部分中。特別地，HGF、VEGF、CCL11，IL-6或IL-8中的一或多者(較佳全部)可以至少1 ng/ml的濃度存在。
在一個替代具體例中，條件培養基及/或其部分中存在的一或多種選自HGF、VEGF、CCL11，IL-6和IL-8組成之群的可溶性蛋白的濃度為至少1 ng/ml/百萬個細胞。
在另一個具體例中，條件培養基及/或其部分含有微泡，其經特徵鑑定且若適當的話，根據它們的大小(在某些具體例中，大小小於0.40 μm)，分子量及/或組成來選擇。
在另一個與再一個具體例中，條件培養基及/或其部分含有胞外體，其經特徵鑑定(在某些具體例中，大小小於80 nm)且若適當的話，根據它們的大小，分子量及/或組成來選擇。
在另一個較佳具體例中，條件培養基及其部分包含RNA，例如miRNA。
此等可溶性蛋白、RNA，胞外體及/或微泡條件培養基及/或其部分中的特別期望濃度可以例如藉由適當濃縮(或稀釋)各別製備物至少約5倍、至少約10倍、至少約20倍，至少約50倍或至少約100倍來獲得。因此，某些具體例提供這樣濃縮或這樣稀釋的條件培養基及/或其部分。
在又一個較佳具體例中，本發明提供了一種可從該條件培養基獲得的部分，該部分包括肝細胞生長因子(HGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、嗜酸性球胞趨化介素(CCL11)、介白素-6 (IL-6)和介白素8 (IL-8)，每一者以至少1 ng/ml的濃度存在。
在一個替代具體例中，得自該條件培養基的部分包含一或多種選自以下組成之群的可溶性蛋白：HGF、VEGF、CCL11，IL-6和IL-8，每一者濃度為至少1 ng/ml/百萬個細胞。
如所提到的，條件培養基及/或其部分適用於如上所述的用途。這種醫學上的用途(例如預防或治療用途)可能涉及單獨或與可被適當添加的一或多種外源性活性成分組合來使用條件培養基及/或其部分。此類外源性活性成分的實例包括細胞(例如，肝前驅或幹細胞或其他適合離體或活體內應用的細胞)、蛋白質(例如，基質金屬蛋白酶、生長因子、趨化介素、細胞介素、激素，抗原或抗體)、營養物(例如，糖或維生素)及/或化學品(例如，帶有抗微生物，消炎或抗病毒性質的藥物)，其最初不存在於條件培養基及/或其部分中，且已知可有效作為所需適應症的藥劑。
在本發明的一個具體例中，使用如上所述細胞的細胞溶胞產物，而不是實際細胞。該細胞溶胞產物可以藉由技藝中已知的任何方式獲得，例如酶消化細胞或細胞培養物，清潔劑及/或緩衝劑處理與類似者。
在又一個較佳具體例中，本發明提供了醫藥調配物，其包含醫藥有效量的肝前驅或幹細胞、其溶胞產物及/或條件細胞培養基。醫藥調配物還可視情況包含醫藥有效量的一或多種外源性活性成分，其可以是上述類型的，例如細胞、蛋白質，營養物及/或化學品。外源性活性成分可以是上面討論的類型，例如細胞、蛋白質，營養物及/或化學品。
已知一些間質前驅和幹細胞可在動物的幾種敗血症模型中減輕器官功能障礙並提高存活率，暗示著其可用於治療敗血症患者的潛力。間質幹細胞具有遷移至受傷組織(諸如肺臟、心肌、腦、肝臟與腎臟)的固有能力，並且經由減少促發炎性細胞介素產生以及增加抗發炎性細胞介素產生，藉著降低局部和全身性發炎來改善病灶。
已經出乎意料地發現到，肝前驅或幹細胞、細胞溶胞產物，及/或藉由在培養基中培養前驅或幹細胞獲得的條件培養基有效用於治療血管通透性增加引起的疾病及/或病況，或用於在個體發炎及/或感染後回復個體細胞和組織的血管完整性。內皮屏障功能缺損是許多病症的共同特徵。肝前驅或幹細胞，細胞溶胞產物或藉由在培養基中培養該等細胞獲得的條件培養基可用於治療疾病，例如周邊血管疾病、中風、心臟病、糖尿病、胰島素阻抗、慢性腎衰竭、腫瘤生長、轉移，靜脈血栓形成和嚴重的病毒感染疾病。
在又一個較佳具體例中，本發明提供了肝前驅或幹細胞、其細胞溶胞產物及/或藉由在培養基中培養前驅或幹細胞獲得的條件培養基，其供用於治療(作為預防或治療)一系列病症及/或病況，包括但不限於： -  肺部疾病(不包括成人呼吸窘迫症候群)，諸如氣喘、急性肺損傷、呼吸器引起的肺損傷以及其他導致肺水腫的病況； -  缺血性疾病，諸如缺血再灌注損傷和任何其他病症，其是指在心肌梗死和器官移植後通常觀察到的血液供應回到先前的缺血區域後的組織傷害； -  糖尿病和眼部(視網膜)疾病，以及影響多重器官的一系列併發症，表現為視網膜病變、心肌病、腎病，腦血管和周邊血管疾病； -  與微循環功能異常和內皮屏障損傷有關的疾病和病症； -  癌症，尤其是實體腫瘤，像是肉瘤，癌瘤和內皮功能障礙；與癌症相關的微循環障礙； -  心臟疾病，諸如心肌病理學、心肌梗塞，心肌水腫和缺血性心臟疾病； -  克拉克森氏病；和 -  敗血症和敗血症引起的疾病，諸如敗血症引起的心肌水腫，敗血症引起的腎衰竭和肺臟敗血症。
本發明細胞、溶胞產物及/或條件培養基因此可用於治療高血管通透性相關的疾病及/或病況，包括但不限於心臟疾病、肺部疾病、缺血性疾病、糖尿病、眼部疾病、中風、癌症，克拉克森氏病和敗血症。已經顯示，大多數的促發炎性細胞介素(包括IFN-γ，TNF-α和IL-1β)導致內皮細胞的緊密連結通透性增加，而一些抗發炎性細胞介素(諸如IL-10和TGF-β)則保護免於腸緊密連結屏障受到破壞以及發炎生成。
肝前驅或幹細胞、細胞溶胞產物及/或藉由在培養基中培養該等細胞獲得的條件培養基適於治療個體的克拉克森氏病。
肝前驅或幹細胞、細胞溶胞產物及/或藉由在培養基中培養該等細胞獲得的條件培養基特別適用於治療個體體內因為發炎及/或感染所觸發的血管高通透性。
在一個較佳具體例中，該等肝前驅或幹細胞、細胞溶胞產物及/或藉由在培養基中培養該等細胞獲得的條件培養基特別適於治療由感染引起的血管通透性增加，不論是革蘭氏陽性細菌(肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌)或革蘭氏陰性細菌(綠膿桿菌)引起的血管通透性增加，較佳為革蘭氏陰性細菌引起的血管通透性增加，最佳為脂多醣引起的血管通透性增加。
如上所述，因為肝前驅或幹細胞、其細胞溶胞產物及/或藉由在該培養基中培養該等細胞獲得之條件培養基的血管完整性回復性質，可向個體(例如人類患者)投與以保護受到血管通透性增加所影響的組織，器官及/或其器官系統。
這在個體的微生物感染，特別是個體的細菌感染期間尤其有利。在一個尤佳的具體例中，肝前驅或幹細胞、其細胞溶胞產物及/或藉由在該培養基中培養該等細胞獲得的條件培養基特別適於治療個體的敗血症或敗血症引起的疾病。特別地，個體體內由敗血症引起的疾病可以是敗血症引起的心肌水腫，敗血症引起的急性腎損傷或肺臟敗血症。
敗血症是由感染引起的，並且涉及病原體和宿主免疫細胞之間的複雜交互作用。這種狀態的特徵在於全身性發炎狀態。免疫反應的作用對於抵抗感染至關重要；但它也是造成發炎組織浸潤和嚴重器官損傷(皆為敗血症特徵)的原因。有證據暗示，調控促發炎性因子和抗發炎性因子在敗血症期間造成了抑制免疫效應細胞、誘導全身性發炎，並導致組織損傷。意外發現到肝前驅或幹細胞，其細胞溶胞產物，及/或藉由在該培養基中培養該等細胞獲得的條件培養基是有效的免疫反應調節劑，其具有調節先天性和適應性免疫反應這兩者的能力。
已經發現到，肝前驅或幹細胞，其細胞溶胞產物，及/或藉由在該培養基中培養該等細胞獲得的條件培養基是透過分泌尤其在級聯中活化經AMP活化蛋白激酶信號傳導的抗通透性因子來展現對內皮完整性的保護功能。
在一個較佳具體例中，對血管內皮的功能完整性展現有益作用的該等抗通透性因子至少是選自包含以下之群的因子：纖維母細胞生長因子(FGF)家族、血管生成素-1、神經鞘胺醇-1-磷酸鹽(S1P)、TGF-β、PDGF、HGF，TIMP1和TIMP2。
在一個具體例中，本發明的條件培養基包含來自以下之群的至少一種組分：FGF家族、血管生成素-1、神經鞘胺醇-1-磷酸鹽、TGF-β、HGF，TIMP1和TIMP2。
在另一個具體例中，本發明的條件培養基包含至少一種選自神經鞘胺醇-1-磷酸鹽，TGF-β1，HGF和TIMP2的組分。
在又一個較佳具體例中，本發明的條件培養基至少包含神經鞘胺醇-1-磷酸鹽(S1P)。
本發明還有關於從培養人類肝前驅細胞獲得的條件培養基，其包含至少30 ng/百萬個總細胞的神經鞘胺醇-1-磷酸鹽，較佳至少50 ng/百萬個總細胞的神經鞘胺醇-1-磷酸鹽、至少100 ng/百萬個總細胞的神經鞘胺醇-1-磷酸鹽、至少150 ng/百萬總細胞的神經鞘胺醇-1-磷酸鹽、至少200 ng/百萬個總細胞的神經鞘胺醇-1-磷酸鹽，至少250 ng/百萬個總細胞的神經鞘胺醇-1-磷酸鹽或至少300 ng/百萬個總細胞的神經鞘胺醇-1-磷酸鹽。在一個具體例中，如上文或下文任一具體例中所述獲得條件培養基。
敗血症常導致免疫抑制狀態，特徵為淋巴細胞凋亡和對醫院感染的易感性。然而，臨床醫生也知道敗血症患者通常會發生進行性皮下和體腔水腫，暗示著血管通透性普遍增加。實質和間質液的積聚導致嚴重組織水腫，這可能因為增加氧氣擴散所需的距離增加還有因為間質壓升高損害到微血管灌注而危害器官功能。細胞介素和其他發炎性媒介因子透過拆卸細胞間連結，透過改變細胞的細胞骨架結構或透過直接破壞細胞單層而在內皮細胞之間導致間隙。從敗血症恢復表現為自發性利尿，伴隨水腫減少，與血管完整性的回復一致。
已經出乎意料地發現，肝前驅或幹細胞、其細胞溶胞產物及/或藉由在該培養基中培養該等細胞獲得的條件培養基可以促進存在於內皮細胞壁中4種類型的細胞連結的組裝。該等細胞連結在結構和功能上都不同，且為是1)緊密連結、2)黏連連結、3)間隙連結，以及4)韌帶連結。因此，本發明的細胞、其溶胞產物、及/或條件培養基在治療血管通透性和回復正常血管通透性方面尤其有效，其是任何四種類型細胞連結障礙和功能不良的結果。
在另一個具體例中，肝前驅或幹細胞、其溶胞產物或藉由在該培養基中培養該等細胞獲得的條件培養基是透過減少在敗血症狀態血液、脾臟、腹膜液與類似者中存在的細菌菌落形成單位(CFU)數量來展現抗菌活性。
在另一個具體例中，肝前驅或幹細胞、其溶胞產物及/或藉由在該培養基中培養該等細胞獲得的條件培養基可用在治療腫瘤相關異常血管分布，特別是實體腫瘤相關異常血管分布。實體腫瘤本身可以被概念化為「器官」，其由癌細胞、基質細胞，免疫細胞以及血液和淋巴管組成，所有這些都包埋在基質中。數十年來，已公認大多數腫瘤都具有大量血管。在另一方面，實體腫瘤是已知釋放促進雜亂無章，滲漏血管網絡增長的因子，其顯示血流紊亂，發炎性細胞浸潤和腫瘤細胞外滲。
肝前驅或幹細胞及/或其溶胞產物、及/或藉由培養本發明之該等細胞獲得的條件培養基尤其適用於敗血症和敗血症引起的疾病，其中回復生理循環和減少水腫是患者存活的關鍵要素。
應理解的是，肝前驅或幹細胞、其溶胞產物、及/或藉由在培養基中培養該等細胞獲得的條件培養基可以被投與給有需要的個體，諸如哺乳動物，更佳為人類，或者可替換地，如在不偏離本發明範疇的情況下，作為適當醫藥組合物的一部分。在本發明的一個具體例中，肝前驅或幹細胞，其細胞溶胞產物及/或條件培養基作為組合物投與，該組合物進一步包含醫藥上可接受的載劑。選定醫藥上可接受的載劑或稀釋劑，其中本發明的細胞保持活力並維持其血管修復和免疫調節性質。載劑可以是醫藥上可接受的溶劑或分散介質，含有例如水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液態聚乙二醇與類似物)及其合適的混合物。因此，本發明揭示了一種醫藥組合物，其包含經分離肝前驅或幹細胞及/或細胞溶胞產物及/或條件培養基。較佳地，包含本發明經分離肝前驅細胞的組合物可包含至少103 個、106 個，109 個或更多個細胞(例如，每劑量或每次投藥5百萬和500百萬之間或5百萬與250百萬之間或50百萬與500百萬之間或50百萬與250百萬之間或100百萬與500百萬之間或100百萬與250百萬之間的細胞)。此等基於細胞的組合物也可包括其他生物來源之藥劑(例如抗體或生長因子)或化學來源的藥劑(例如藥物，細胞保存或標記化合物)，它們可提供進一步的治療，診斷或任何其他有用的作用。文獻提供了與基於細胞的醫藥組合物相容之視情況選用的添加劑、賦形劑，媒劑及/或載劑的幾個實例，該基於細胞的醫藥組合物可以進一步包括特定緩衝劑，生長因子或佐劑，其中組合物的每種組分之量均受到限制(以微克/毫克，體積或百分比表示)，以及將它們與肝前驅細胞結合的方式。
一個關於本發明前驅或幹細胞的治療用途的問題是達到最佳效果所需的細胞量。投藥劑量可能是可變的，可包括初始投藥接著後續投藥，並且可以由習於技藝者基於本揭示內容來確定。通常，一或多個投藥劑量將提供治療有效量的細胞，即達到期望局部或全身作用和成果的細胞數量。另外，習於技藝者可以容易地決定要投與給個體的本發明醫藥組合物中選用的添加劑、媒劑及/或載劑。
在又一個具體例中，本發明組合物可以呈醫藥組合物的形式提供，其可呈組合物形式(以新鮮或呈適於長期儲存的配方(例如冷凍保存的細胞))用於活體內投藥(在人類或動物模型中)或活體外施用的治療方法中，該組合物包括經分離肝前驅或幹細胞、其溶胞產物及/或條件培養基。這些醫藥組合物可以作為HALPC產物提供，視情況將HALPC與適合於所需治療方法，選定的投藥路徑及/或儲存方式，還有在提供此等醫藥組合物的較佳方式中(例如在套組中)合適的液體載劑(例如細胞培養基或緩衝液)組合。可以提供任何其他有用作用的其他生物學來源藥劑(例如抗體或生長因子)或化學來源藥劑(例如藥物，防腐或標記化合物)也可以組合在此類組合物中。
例如，在分離程序之後或在冷凍保存後解凍之後，可以將細胞作為細胞懸浮液提供在任何保存介質中。作為實例，可以用無菌稀釋劑(諸如無菌水溶液)製備細胞懸浮液，其視情況包含與患者在生理上相容的賦形劑(諸如pH調節劑及/或人類血清白蛋白)。
無菌可注射溶液可藉由將在實施本發明時所用的細胞併入所需量合適溶劑來製備，該溶劑依需要具有不同量的其他成分。這樣的組合物可以進一步與合適的載劑，稀釋劑或賦形劑(諸如無菌水、生理鹽水、葡萄糖，右旋糖或類似物)混合。組合物可包含輔助物質，諸如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑，膠凝或增黏添加劑、防腐劑、調味劑、顏料與類似物，取決於投藥路徑和所需的製備物。
在另一個或又一個具體例中，本發明組合物可以以細胞懸浮液，海綿或其他三維結構的形式提供，其中細胞可以在活體外及/或活體內生長並分化， 包括生物人工肝臟裝置、天然或合成基質，或其他允許細胞在適當位置移植和發揮功能的系統(包括表現趨化介素有助於細胞歸巢和移植的發炎或組織損傷的區域)。特別地，包含本發明肝前驅或幹細胞、其溶胞產物、及/或條件培養基的組合物可經由注射投藥(也包含導管投藥，靜脈內或動脈內)或植入，例如局部注射、全身注射、脾內注射、關節內注射、腹膜內注射、門內注射、向肝髓注射(例如在肝囊下方)、非經腸投藥，或子宮內注射入胚或胎。
肝前驅或幹細胞、其溶胞產物、及/或條件培養基可以被投與至個體之關注的組織，較佳特徵在於血管通透性增加的組織及/或器官，以支持內皮屏障並為血管內皮的功能完整性提供潛在的有益作用。
在前述具體例的任一者中，包含肝前驅細胞或幹細胞的組合物可以呈無菌液體的形式被投與給患者。
該無菌液體可由肝前驅細胞或幹細胞的還原懸浮液液來製備，例如藉由用無菌稀釋劑(諸如無菌水溶液，視情況包含諸如pH調節劑及/或人類血清白蛋白的賦形劑)稀釋經解凍的濃縮肝前驅細胞或幹細胞懸浮液來製備。
透過以下非限制性實例進一步說明本發明，非限制性實例進一步舉例說明本發明，並且無意於也不應解釋為限制本發明的範疇。 實例
實例1：生產細胞及條件培養基
根據WO 2007 071 339、WO 2016 030 525，或EP 3 423 566中所述的方案從三位不同捐贈者取得細胞。
如在EP 3 140 393或EP 3 423 566中所述，從健康屍體或非心臟跳動的捐贈者肝臟分離人類成體肝前驅細胞。
簡言之，將肝細胞製備物重新懸浮於補充有9% FBS、10 mg/ml INS，1 mM DEX和1% P/S的威廉氏E培養基中。初代細胞培養在Coring® CellBIND® 燒瓶上並在37℃下培養於含有5% CO2 的完全潮濕氛圍中。24小時後，更換培養基以消除非貼附細胞，此後每週更新兩次，爾後每天都在顯微鏡下觀察培養物。12-16天後，將培養基切換為補充有9% FBS (有或無0.9% P/S)的高葡萄糖DMEM。具有間質樣形態的細胞類型出現並增殖。當達到70-95%匯合度時，將細胞用重組胰蛋白酶和1 mM EDTA進行胰蛋白酶處理，並以1-10 x 103 個細胞/cm2 的密度重新鋪盤。在每次繼代時，在80-90%匯合度下對細胞進行胰蛋白酶處理。
如後所述獲得條件培養基：在第4或5代時，洗滌細胞，並用新鮮培養基(DMEM + 0.5至10% FBS)代替培養基。6至96小時後，通常24小時培育，收集上清液並藉助離心收集且清除漂浮細胞和碎片，及儲存供於進一步分析。分泌蛋白質的濃度表示為106 個細胞在24小時內分泌的毫微克(ng)或皮克(pg)。
在條件培養基中，使用ELISA分析內皮通透性的以下潛在可溶性媒介因子的存在：血管生成素1、神經鞘胺醇-1-磷酸鹽、TGF-β1，HGF和TIMP2。結果如下表所示，數據是基於n = 2批次。
媒介因子 在細胞培養基中分泌？ 分泌量 ( 指示性 )
血管生成素-1 是 0至3500 pg/百萬個總細胞
神經鞘胺醇-1-磷酸鹽 是 300至2500 ng/百萬個總細胞
TGF-β1 是 1000至2000 pg/百萬個總細胞
HGF 是 2000至30000 pg/百萬個總細胞
TIMP2 是 50 – 200 ng/百萬個總細胞
這些ELISA結果證明，在條件培養基中存在由細胞分泌的中至高量的至少神經鞘胺醇-1-磷酸鹽、TGF-β1，HGF和TIMP2。此外，ELISA分析顯示條件培養基中分泌的血管生成素-1存在程度不一且少量。
檢驗條件培養基對人類皮膚血管上皮細胞(HDBEC)的細胞連結和血管通透性的影響。已進行三種不同類型的分析：內皮間連結(IEJ)標記的免疫染色、通透性分析，AMPK磷酸化，如實例2、3，4和5中所述。
實例2：內皮間連結(IEJ)的形態，IEJ標記的免疫染色。
關於細胞連結研究，HDBEC (2 x 104 個細胞)接種在置於24孔盤的蓋玻片上，並在37℃下於含有5% CO2 的潮濕氛圍中於完全EGM-2MV培養基(1 ml，含5% FBS)中生長至匯合。或者，將HDBEC (2 x 104 個細胞)暴露於與完全EGM-2MV培養基混合且含有10% FBS (500 μl)的條件培養基(CM，500 μl)歷時24小時。在這兩種情況下，於使用LPS (50 μg/ml)處理6小時之前，將培養基更換成補充有1% FBS的EGM-2MV歷時2小時。LPS刺激後，將HDBEC固定，予以滲透並用特定抗體(ZO-1，連結蛋白43和VE-鈣黏蛋白)進行免疫染色。5-胺基咪唑-4-甲醯胺核糖核苷酸(AICAR)是AMPK的有效藥理學活化因子，被用作陽性對照。
用Zeiss Axio成像儀顯微鏡(Zeiss，Wetzlar，德國)在螢光下檢查切片。這些分析以三重複進行(每個單獨實驗n = 6)。
ZO-1免疫染色(400x)
藉由評估ZO-1免疫染色來測量細胞連結-完整性。透過分析參數(諸如細胞的密度、規則性，線性模式和間隙形成)來研究本發明條件培養基對ZO-1結構的影響。
基礎狀態的HDBEC (對照)和經過LPS處理的HDBEC (對照-LPS)的比較確認了LPS一如預期在細胞膜處引起ZO-1線性表現模式的不規則性。當用本發明條件培養基(HepaStem CM-LPS)處理細胞時，這些不規則性似乎減少了。在所有測試的捐贈者中都觀察到了這一點(圖2A，2B和2C，分別是捐贈者1、2和3)。在無LPS刺激(HepaStem CM)和有LPS刺激(HepaStem CM - LPS)的情況下經條件培養基處理後，HDBEC的影像幾乎沒有差異，並證實了本發明條件培養基在此測試中的保護作用。
Cx 43免疫染色(200x)
在對照組(對照)，以及在有或無LPS處理的情況下經條件培養基(HepaStem CM)處理的組別中，藉由連結蛋白43 (Cx43)免疫染色來評估本發明條件培養基對間隙連結的作用。捐贈者3的細胞在用條件培養基處理後與對照組的影像顯示於圖3。與ZO-1相反，Cx43的染色未顯示出明顯調節是受到藉由培養本發明的肝前驅或幹細胞獲得的條件培養基所誘導。
VE-cad免疫染色(200x)
藉由VE-鈣黏蛋白的免疫染色來評估內皮細胞的黏連連結。影像顯示在圖4 (200x)並凸顯出相較於對照，對LPS挑戰做出反應而被條件培養基加強細胞間連結。該染色大大證實了藉由培養本發明肝前驅或幹細胞獲得的條件培養基對於保護連結完整性的保護作用，與ZO-1觀察到緊密連結的作用類似。
實例3：內皮單層通透性的分析。
內皮通透性分析是透過使用伊凡氏藍染料(EBD)來進行。
將塗覆在Transwell插片上的HDBEC (5 x 104 個細胞)培養在含有5% FBS的完全EGM-2MV培養基(1 ml)中，或暴露於與含有10% FBS (500 μl)的完全EGM-2MV培養基混合的本發明條件培養基(CM，500 μl)歷時24小時。在伊凡氏藍染料(EBD)放入之前，將培養基更換為補充有1% FBS的EGM-2MV歷時2小時。之後，立即用LPS (50 μg/ ml)處理細胞歷時6小時。
這些分析是以生物三重複(每個單獨實驗n = 6)來進行。
本發明條件培養基對內皮通透性分析的作用顯示於圖5中。此分析顯示，非條件培養基NCM (GIBCO僅培養基，無細胞)與CM條件(本發明的條件培養基)之間於不存在LPS挑戰的情況下有相似的細胞通透性，而在LPS挑戰下，相較於NCM，觀察到條件培養基的細胞通透性有重大降低。所觀察到的作用暗示著，在加入本發明條件培養基後，對於經LPS預處理的皮膚內皮細胞來說，連結的內皮間結構的保護作用。因為細胞首先與HepaStem條件培養基和內皮細胞培養基的混合物(1：1)培育24小時，其次與低FBS培育1小時隨後與LPS培育6小時，在培育的最後7小時期間沒有更多的CM。故，觀察到對內皮通透性的作用是預防/保護而不是回復。
實例4：內皮單層在阻斷S1P活性後的通透性。
如前所述(實例3)，使用HBDEC和伊凡氏藍染料，利用Transwell分析在活體外測試HepaStem條件培養基對LPS誘導的內皮細胞通透性的作用，以評估通透性。進行功能喪失實驗，其中使用了神經鞘胺醇-1-磷酸鹽受體抑制劑(S1P3抑制劑)來阻斷S1P活性(n = 3 HepaStem批次)。S1P在條件細胞培養基中是由細胞大量分泌的化合物，如實例1中所示。
在下面四種條件中測試相對內皮細胞通透性：存在或不存在LPS挑戰下的非條件培養基(NCM)，或存在或不存在LPS挑戰的HepaStem條件培養基(CM)。這四種條件的每一者隨後均用S1P3抑制劑或假(CM)處理。
結果顯示，在HepaStem CM存在下添加S1P3抑制劑會增加內皮通透性，表明S1P參與了防止LPS誘導的通透性增加。結果顯示於圖6中。
實例5：透過本發明條件培養基評估AMPK活化
HDBEC在6孔盤中生長(105 個細胞/盤)，並暴露於含有5% FBS的EGM-2MV培養基(2 ml)，或暴露於利用肝前驅細胞獲得的條件培養基(CM，1 ml)(混合有含10% FBS (1 ml)的完全EGM-2MV培養基)歷時24小時。處理後，用PBS沖洗細胞，並在含有SDS的緩衝液中溶解。在4-20%凝膠上分離蛋白質萃取物，並轉移到PVDF膜上。用特定抗體(抗磷酸-ACC，抗ACC，抗eIF2α)染色後，用ECL使膜顯影。
參照測試的三位捐贈者(未處理的肝前驅或幹細胞)的平均值顯示如圖1。乙醯基-CoA羧化酶(ACC)是AMPK的一個下游目標，而5-胺基咪唑-4-甲醯胺核糖核苷酸(AICAR)是AMPK的一個潛在藥理學活化因子，用作為陽性對照。
西方墨點法分析顯示，來自肝前驅或幹細胞的條件培養基導致AMPK活化，如由ACC磷酸化顯著增加所反映。值得注意的是，在LPS存在下，這個增加達到了更高的程度。
實例6：肝前驅或幹細胞對於由內毒血症引起的心肌水腫的效用。
敗血性心肌病在嚴重敗血症患者中是一種公認的心血管併發症，特徵在於敗血症期間收縮期及/或舒張期左心室(LV)功能可逆性降低，伴隨有左心室壁水腫。小鼠的內毒血症活體內模型被用來評估肝前驅或幹細胞對心肌水腫的效用。簡言之，對8週大的雄性C57BL/6小鼠進行實驗。動物維持在12:12小時光-暗週期下，可自由取用食物和水。藉由腹膜內(IP)注射LPS (或鹽水媒劑)而在小鼠體內誘發內毒血症。在有或沒有事先給予肝前驅或幹細胞或其溶胞產物或條件培養基的情況下，伊凡氏藍染料(EBD)(白蛋白滲漏的標記)(20 mg/kg)連同LPS或生理鹽水一起IP給藥。在6或24小時後，用戊巴比妥300 mg/kg IP將動物安樂死。
讀值：評估血管滲漏
胸部是在LPS注射後6小時與24小時之時被打開，並將30 mL鹽水沖入通過左心室(LV)。取出心臟並冷凍。血管滲漏相當於在血管外隔室中的染料量，是藉由影像J軟體被量化為冷凍切片(7 μm厚度)上的螢光(594 nm)相對表面。
讀值：IHC免疫組織化學
冷凍心臟。七μm心臟切片用冰冷卻丙酮或三聚甲醛4%進行固定。然後組織在0.1% Triton X-100中予以滲透並用5% BSA溶液阻斷。用抗-ZO-1 (1：50)對組織進行免疫染色。
讀值：心臟超音波評估(心臟功能性)
在基線和LPS注射後6和24小時之時，透過吸入異氟烷麻醉小鼠，然後進行心臟超音波圖。紀錄胸骨旁長軸和短軸視圖、四腔視圖，和二尖瓣脈衝波都卜勒。M模式數據是從胸骨旁長軸視圖獲得的。LV尺寸分別在心臟舒張末期和收縮末期進行測量。
實例7：肝前驅或幹細胞在盲腸結紮和穿孔(CLP)模型中的效用。
為了研究人類敗血症的病因，研究人員已經開發出不同的動物模型。盲腸結紮和穿孔(CLP)所誘導的多菌性敗血症是最常用的模型，因為它與人類敗血症的進展和特徵非常相似。CLP模型包括盲腸穿孔，使得糞便物質釋放到腹膜腔中，從而產生由多菌性感染引起的免疫反應加劇。針穿孔後的糞便溢出產生了多菌性敗血症。
在C57BL/6小鼠(較佳為8週齡的雌性小鼠)中評估了肝前驅或幹細胞對多菌性敗血症的作用。已經觀察到雌性小鼠比雄性對抗敗血症引起的致死性更具抗性，同時就CLP之後的存活來說，大於8週的小鼠比年輕小鼠產生較少可變的結果。
每組大約n ＝ 10隻小鼠用於存活分析。動物進行秤重並藉由腹膜內(IP)氯胺酮(75 mg/kg)和賽拉嗪(15 mg/kg)來進行麻醉。藉由使用手術刀，平行於中線且在中線左側約1 cm造出一個小的縱向皮膚切口而不穿透腹膜腔。結紮盲腸(60%結紮)，以實現一個中度敗血症。注意，等於或大於75%盲腸結紮通常會導致高度敗血症，而等於或小於25%盲腸結紮會導致低度敗血症。透過使用21 G針，在結紮附近透過一個徹底穿孔(through-and through puncture)(兩個孔)對盲腸打孔。穿孔方向是從盲腸的腸系膜側到反腸系膜側。動物被再放回籠子，不限制取用食物和水。當小鼠瀕死時被安樂死(依據臨床跡象表明，如觸摸時無法移動或發紺)。每個小時檢查小鼠，以避免它們安樂死之前死去。
為了要評估細胞治療的效力，在CLP後2小時，小鼠經由尾靜脈接受靜脈內(IV)注射本發明的肝前驅或幹細胞，劑量範圍從1.0×105 至1.0×106 個細胞於200 μl磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)連同EBD。最終，在CLP後24與48小時(取決於一旦IV投與後的肝前驅或幹細胞半衰期)之時，尾靜脈額外注射在200 μl PBS中的2.5×105 個細胞。作為在存活實驗中的非細胞對照組，在相同的時間點以200 μl的體積投與PBS。
讀值：評估血管滲漏與活體內組織學
收集腎臟，肝臟和脾臟並冷凍，以藉由組織學評估損傷評分。冷凍組織。用冰冷確的丙酮或三聚甲醛4%固定七μm切片。然後在0.1% Triton X-100中將組織予以滲透，並用5% BSA溶液阻斷。用抗-ZO-1(1：50)對組織進行免疫染色。血管滲漏相當於在血管外隔室的染料量，是藉由影像J軟體被量化為冷凍切片(7-μm厚)上的螢光(594 nm)的相對表面。
實例8：肝前驅或幹細胞在敗血症相關急性腎臟損傷模型中的效用。
對先前受到盲腸結紮和穿孔(CLP)的雄性C57BL/6小鼠進行實驗。盲腸結紮和穿孔手術後24小時，敗血症小鼠生成腎臟損傷。自敗血症誘發起3小時後，小鼠靜脈內接受劑量為106 個細胞(結合EBD)的肝前驅或幹細胞。
讀值：
對腎臟、肝臟，肺臟和脾臟的冷凍切片進行活體內組織學，以評估血管滲漏和損傷評分(腎臟上的ZO-1免疫染色)。
實例9：肝前驅或幹細胞對肺臟敗血症的效用。
方法1：
一種基於在腹膜腔引入含大腸桿菌懸浮液和非無菌糞便內容物的無菌明膠膠囊以供產生肺臟敗血症的模型。簡言之，將動物秤重，然後腹膜內用氯胺酮(80 mg/kg)和賽拉嗪(20 mg/kg)的混合物予以麻醉。將每隻動物的腹部剃毛並用聚維酮碘溶液清潔。造出1 cm中線腹部切口以露出白紋。腹膜是藉由鈍解剖而打開，並透過在腹膜腔中引入無菌明膠膠囊來誘發敗血症，該明膠膠囊含有另一種帶有大腸桿菌(3 μL； Ref. ATCC 25922)懸浮液和非-無菌糞便內容物(20 mg )的無菌膠囊。動物再被分成三組： i)     假手術(植入空膠囊，並接受眼眶後注射100 μL PBS + EBD的小鼠)； ⅱ)  敗血症(誘發敗血症且小鼠接受眼眶後注射100 μL PBS + EBD)；以及 iii)   敗血症+ MSC (誘發敗血症且小鼠經眼眶後注射100 μL PBS + EBD中的1×106 個肝前驅或幹細胞治療)。
讀值：評估血管滲漏與活體內組織學
收集肺臟並冷凍以藉由組織學(抗ZO-1染色，定量血管外隔室中的染料)評估損傷評分和血管滲漏。
方法2：
可用於誘發肺臟敗血症的另一個模型包括腹膜內注射大腸桿菌的脂多醣(LPS)(12.5 mg/kg)。
然後將這些動物分為與先前模型相同的組別。
假定本發明不受限於先前描述的任何形式的實施，並且可以在不重新評估隨附申請專利範圍的情況下對製造所呈現實例進行一些改良。例如，本發明已被描述為涉及肝前驅或幹細胞，但是很明顯，本發明可以應用於例如特定人類肝前驅細胞株或其所獲得的任何溶胞產物。
無
測試條件與圖1至5中相同，並在以下列出： -  「對照」條件表示HDBEC在EGM-2MV培養基中。EGM-2MV培養基用作為對照培養基。在該對照培養基中，HDBEC不與本發明的肝前驅或幹細胞(即HepaStem)接觸。 -  「HepaStem CM」條件表示HDBEC暴露於介由培養該等肝前驅或幹細胞獲得的條件培養基。 -  「對照-LPS」條件表示HDBEC受到僅只LPS刺激，且沒有暴露於本發明的條件培養基。 -  「HepaStem CM-LPS」條件表示HDBEC暴露於該條件培養基，然後受到LPS刺激。
圖1顯示在內皮細胞與肝幹細胞的條件培養基一起培育後的AMPK活化，如藉由分析ACC (乙醯基-CoA羧化酶)磷酸化所評估。圖1A視覺化了代表性西方墨點法。AICAR：經5-胺基咪唑-4-甲醯胺核糖核苷酸處理組。圖1B視覺化了四種測試條件的相對ACC磷酸化。
圖2顯示在基礎狀態(無LPS處理)，和LPS處理後，以及LPS處理後且投與肝幹細胞的條件培養基，內皮細胞的ZO-1免疫染色和細胞連結模式。圖2A視覺化了藉由使用得自培養捐贈者1之肝前驅或幹細胞的條件培養基獲得的結果(400x)；圖2B視覺化了藉由使用得自培養捐贈者2之肝前驅或幹細胞的條件培養基獲得的結果(400x)；以及圖2C視覺化了藉由使用得自培養捐贈者3之肝前驅或幹細胞的條件培養基獲得的結果(400x)。
圖3顯示與對照組相比，在有與沒有LPS處理的情況下，肝幹細胞的條件培養基對間隙連結的作用。顯示得自培養捐贈者3的肝前驅或幹細胞之條件培養基的Cx43免疫染色結果(200x)。
圖4顯示藉由VE-鈣黏蛋白的免疫染色所評估，肝幹細胞的條件培養基對內皮細胞黏連連結的作用。圖4A，4B和4C是藉由分別使用培養捐贈者1、2和3的肝前驅或幹細胞的條件培養基獲得的結果(200x)。
圖5顯示本發明條件培養基對內皮通透性的作用。 每個點代表一名捐贈者，即分別為捐贈者1、2和3的結果。
圖6顯示本發明條件培養基抑制S1P3對預防LPS引起的內皮通透性的作用。
無

Claims (20)

  1. 一種肝前驅或幹細胞、其溶胞產物、及/或可藉由在培養基中培養該等肝前驅或幹細胞獲得的條件培養基，供用於調控或影響個體(之細胞)中受損的血管通透性。
  2. 一種肝前驅或幹細胞、其溶胞產物、及/或可藉由在培養基中培養該等肝前驅或幹細胞獲得的條件培養基，供用於治療因為血管通透性增加所致的疾病及/或病況。
  3. 如請求項1或2使用之肝前驅或幹細胞、其溶胞產物、及/或可藉由在培養基中培養該等肝前驅或幹細胞獲得的條件培養基，其中該等細胞對選自CD90、CD44、CD73、CD13、CD140b、CD29、波形蛋白和α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)中的至少一種標記呈陽性，並視情況分泌HGF及/或PGE2。
  4. 如請求項1至3使用之肝前驅或幹細胞、其溶胞產物、及/或可藉由在培養基中培養該等肝前驅或幹細胞獲得的條件培養基，其中該等細胞對選自下列之群的標記中的至少一者呈陽性：α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)、白蛋白(ALB)、CD140b、和MMP1；且對選自下列之群的標記中的至少一者呈陰性：含壽司域蛋白2 (sushi domain containing protein 2, SUSD2)和細胞角蛋白-19 (CK-19)。
  5. 如前述請求項中任一項使用之肝前驅或幹細胞、其溶胞產物、及/或可藉由在培養基中培養肝前驅或幹細胞獲得的條件培養基，其中該等細胞經測定： -      對α-平滑肌肌動蛋白(ASMA)，CD140b和視情況白蛋白(ALB)呈陽性； -      對細胞角蛋白-19 (CK-19)和視情況含壽司域蛋白2 (SUSD2)呈陰性。
  6. 如前述請求項中任一項使用之肝前驅或幹細胞、其溶胞產物、及/或可藉由在培養基中培養肝前驅或幹細胞獲得的條件培養基，其中該等細胞經測定對CD90、CD73、波形蛋白和ASMA呈陽性。
  7. 如前述請求項中任一項使用之肝前驅或幹細胞、其溶胞產物、及/或可藉由在培養基中培養肝前驅或幹細胞獲得的條件培養基，其中該等細胞是人類的。
  8. 一種如前述請求項中任一項使用之可藉由在培養基中培養該等肝前驅或幹細胞獲得的條件培養基，其中該條件培養基包含一或多種來自肝細胞生長因子(HGF)、介白素6 (IL-6)、介白素8 (IL-8)和血管內皮生長因子(VEGF)之群的組分。
  9. 如前述請求項中任一項使用之可藉由在培養基中培養肝前驅或幹細胞獲得的條件培養基，其中該條件培養基包含至少一種來自纖維母細胞生長因子蛋白、血管生成素-1、神經鞘胺醇-1-磷酸鹽、TGF-β、PDGF、HGF、TIMP1和TIMP2之群的組分。
  10. 如前述請求項中任一項使用之可藉由在培養基中培養肝前驅或幹細胞獲得的條件培養基，其中該條件培養基包含至少一種來自神經鞘胺醇-1-磷酸鹽、TGF-β1、HGF和TIMP2之群的組分。
  11. 如前述請求項中任一項使用之可藉由在培養基中培養肝前驅或幹細胞獲得的條件培養基，其中該條件培養基至少包含神經鞘胺醇-1-磷酸鹽，較佳為30 ng/百萬個總細胞的最低濃度。
  12. 如前述請求項中任一項使用之肝前驅或幹細胞、其溶胞產物、及/或可藉由在培養基中培養肝前驅或幹細胞獲得的條件培養基，其中在因血管通透性增加所致的該等疾病及/或病況選自個體內之心臟、肺部和缺血性疾病、糖尿病和眼部疾病、癌症(實體腫瘤)、克拉克森氏病和敗血症之群。
  13. 如前述請求項中任一項使用之肝前驅或幹細胞、其溶胞產物、及/或可藉由在培養基中培養肝前驅或幹細胞獲得的條件培養基，其中因血管通透性增加所致的該疾病及/或病況是個體內感染所觸發。
  14. 如前述請求項中任一項使用之肝前驅或幹細胞、其溶胞產物、及/或可藉由在培養基中培養肝前驅或幹細胞獲得的條件培養基，其中該血管通透性受損與個體內的敗血症或敗血症引起的疾病相關，或該疾病及/或病況為個體內的敗血症或敗血症引起的疾病。
  15. 如前述請求項中任一項使用之肝前驅或幹細胞、其溶胞產物、及/或可藉由在培養基中培養肝前驅或幹細胞獲得的條件培養基，其中該血管通透性受損與個體內敗血症引起的心肌水腫相關，或該疾病及/或病況為個體內敗血症引起的心肌水腫。
  16. 如前述請求項中任一項使用之肝前驅或幹細胞、其溶胞產物、及/或可藉由在培養基中培養肝前驅或幹細胞獲得的條件培養基，其中該血管通透性受損與個體內敗血症引起的急性腎損傷相關，或該疾病及/或病況為個體內敗血症引起的急性腎損傷。
  17. 如前述請求項中任一項使用之肝前驅或幹細胞、其溶胞產物、及/或可藉由在培養基中培養肝前驅或幹細胞獲得的條件培養基，其中該血管通透性受損與個體內的肺臟敗血症相關，或該疾病及/或病況為個體內的肺臟敗血症。
  18. 如前述請求項中任一項使用之肝前驅或幹細胞、其溶胞產物、及/或可藉由在培養基中培養肝前驅或幹細胞獲得的條件培養基，其中該血管通透性受損與個體內的克拉克森氏病相關，或該疾病及/或病況為個體內的克拉克森氏病。
  19. 如前述請求項中任一項使用之肝前驅或幹細胞、其溶胞產物、及/或可藉由在培養基中培養肝前驅或幹細胞獲得的條件培養基，其中該等細胞、溶胞產物及/或培養基係在無菌液體組合物中投與。
  20. 一種得自培養人類肝前驅細胞的條件培養基，其包含至少30 ng/百萬個總細胞的神經鞘胺醇-1-磷酸鹽。
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ES2359874T5 (es) * 2005-12-21 2014-12-12 Universite Catholique De Louvain Células madre hepáticas aisladas
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