TW202122583A - 創造重組微生物以產生發酵產物的方法 - Google Patents

創造重組微生物以產生發酵產物的方法 Download PDF

Info

Publication number
TW202122583A
TW202122583A TW109121925A TW109121925A TW202122583A TW 202122583 A TW202122583 A TW 202122583A TW 109121925 A TW109121925 A TW 109121925A TW 109121925 A TW109121925 A TW 109121925A TW 202122583 A TW202122583 A TW 202122583A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
ethanol
fermentation
recombinant microorganism
fermentation product
pyruvate
Prior art date
Application number
TW109121925A
Other languages
English (en)
Inventor
李思禹
慎志軒
Original Assignee
李思禹
慎志軒
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 李思禹, 慎志軒 filed Critical 李思禹
Publication of TW202122583A publication Critical patent/TW202122583A/zh

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/065—Ethanol, i.e. non-beverage with microorganisms other than yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01039—Ribulose-bisphosphate carboxylase (4.1.1.39)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/01019—Phosphoribulokinase (2.7.1.19)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本發明提供一種創造重組微生物以產生發酵產物的方法，包含：提供碳固定模組；以及提供發酵產物生產模組；其中碳固定模組包含：(a) 提供具有剔除酵素編碼基因的重組微生物；及(b) 提供二氧化碳至核糖-1,5-雙磷酸羧化酶/加氧酶及磷酸核糖激酶；其中發酵產物生產模組包含：(c) 丙酮酸僅與丙酮酸轉化酵素反應以產生二氧化碳。本發明亦提供一種製備發酵產物的方法及用於製備發酵產物的重組微生物。

Description

創造重組微生物以產生發酵產物的方法
本發明係關於一種創造重組微生物的方法，特別是關於一種製備用於產生發酵產物之重組微生物的方法。
本申請請求根據35 U.S.C. §119(e) 授予2019年12月2日提交的申請號為62/942,210的美國臨時專利申請案的權益，其完整內容在此透過引用結合於此。
在過去的十年中，透過標準異營生物（如大腸桿菌及釀酒酵母）的基因工程，將操作碳固定的方式擴展到了光合自營生物之外。工程化異營生物的使用通常不利用二氧化碳作為碳源，其互補了自營生物進行的研究，並提供了擴展的實驗工具來應對提高二氧化碳固定率的生物技術挑戰。在先前的一些研究中，透過1,5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶（Rubisco；Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase）及磷酸核酮糖激酶（Prk；Phosphoribulokinase）的異源表達獲得了混營（mixotrophic）大腸桿菌，因此已證明該大腸桿菌能夠在戊糖和葡萄糖同化過程中原位回收二氧化碳。嘗試透過將發酵產物限制為僅C-2（乙醇及乙酸）及C-1（甲酸及二氧化碳）來量化原位二氧化碳再循環的性能。 這樣就可以使用C-2 / C-1的比例來監測原位二氧化碳的再循環。
生物乙醇是一種替代的生物燃料，已成為最大宗的生物技術產品，2017年在全球生產了約1000億升。釀酒酵母，運動發酵單胞菌及大腸桿菌等均用於均發酵乙醇生產中。 其中的前兩個以高收率自然生產乙醇。 但是，它們僅代謝一些己糖。 該代謝範圍窄是一個缺點，因為取決於波動及不穩定的原料價格，原料佔總生產成本的10-80%。相反地，大腸桿菌可以同化低成本農業和林業廢物中存在的多種己糖和戊糖。然而，大腸桿菌也厭氧產生混合酸，且乙醇產率通常較低。
基因工程（誘變，特定基因剃除和代謝操控）是消除這些不利特徵並將這些微生物轉變為競爭性乙醇生產者的有效方法，理論乙醇產率為85-95%。
在上述背景說明段落中所揭露之內容，僅為增進對本發明之背景技術的瞭解，因此，上述之內容含有不構成阻礙本發明之先前技術，且應為本領域習知技藝者所熟知。
原料占基於生物的（bio-based）化學品生產的主要部分。在過去的幾十年中，纖維素乙醇的生產已取得了巨大的進步，與此同時，對二氧化碳直接轉化為生物燃料的研究也受到了廣泛而深入的研究。在本發明中，提出了新一代的乙醇生產。本發明建構了大腸桿菌的重組菌株，其能夠產生混營的乙醇，其中葡萄糖和二氧化碳同時轉化為乙醇。為此，將pflB 基因（編碼丙酮酸甲酸裂解酶）從大腸桿菌MZLF（BL21（DE3）Δ zwf ΔldhA Δfrd 中剔除，其中碳流進入氧化戊糖磷酸、乳酸和琥珀酸的途徑被阻擋）染色體以獲得大腸桿菌菌株FB（MZLFΔpflB ）。然後，將丙酮酸脫羧酶（pyruvate decarboxylase；Pdc）介導（Pdc-mediated）的途徑導入FB，以獲得FB295（包含pLOI295（pdc 及adhB ）的FB）。最後，將由rbcLS 和prk （編碼1,5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶（Rubisco）和磷酸核酮糖激酶（Prk））組成的異源基於Rubisco工程途徑導入FBL295，以建構FB295A。FB295A可以在60小時內實現幾乎均質發酵的乙醇生產，其中乙醇的產量、濃度、發酵產物的百分率/百分比以及二氧化碳排放/乙醇產量分別為2.3±0.2 mol / mol，256±19 mM及0.13±0.02 molCO2 / molEtOH 。透過第二代的次培養，總發酵時間可以縮短30小時，因此，混營乙醇的生產率提高到7.1±0.5 mmol·L-1 ·h-1 ，同時保持顯著的乙醇產率為2.4±0.1 mol / molglucose 。FB295A的表現達到原位二氧化碳循環理論的100%。
為了達到前述效果，本發明提供一種創造重組微生物以產生發酵產物的方法，包含：提供碳固定模組；以及提供發酵產物生產模組；其中碳固定模組包含：(a) 提供具有剔除酵素編碼基因的重組微生物；及(b) 提供二氧化碳至1,5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶及磷酸核酮糖激酶；其中發酵產物生產模組包含：(c) 丙酮酸僅與丙酮酸轉化酵素反應以產生二氧化碳。
於本發明一較佳實施例中，酵素編碼基因包含zwf 。
於本發明一較佳實施例中，步驟(c)包含從重組微生物剔除frd 、ldhA 、及pflB 。
於本發明一較佳實施例中，丙酮酸轉化酵素為丙酮酸脫羧酶。
於本發明一較佳實施例中，重組微生物為藍細菌、運動發酵單胞菌、大腸桿菌、酵母、芽孢桿菌或其組合。
於本發明一較佳實施例中，發酵產物為一源自氧化還原反應的化學產物。
其中，該化學產物為乙醇。
此外，本發明亦提供一種製備發酵產物的方法，包含利用上述方法所製備的重組微生物執行發酵製程。
另外，本發明更提供一種用於製備發酵產物的重組微生物，係利用上述方法所製備。
而為了讓上述目的、技術特徵以及實際實施後之增益性更為明顯易懂，於下文中將係以較佳之實施範例輔佐對應相關之圖式來進行更詳細之說明。
本發明之優點及特徵以及達到其方法將參照例示性實施例及附圖進行更詳細地描述而更容易理解。然而，本發明可以不同形式來實現且不應該被理解僅限於此處所陳述的實施例。相反地，對所屬技術領域具有通常知識者而言，所提供的此些實施例將使本揭露更加透徹與全面且完整地傳達本發明的範疇，且本發明將僅為所附加的申請專利範圍所定義。
除非另外定義，所有使用於本文的術語(包含科技及科學術語)具有與本發明所屬該領域的技術人士一般所理解相同的意思。將更可理解的是，例如於一般所使用的字典所定義的那些術語應被理解為具有與相關領域的意義一致的意思，且除非明顯地定義於本文，將不以過度正式的意思理解。
除非本文另外清楚地指出，單數形式”一”、”至少一”與”該”用於本文中亦可包含複數個指涉物。如本文中所使用的，術語”及/或”包含任何及所有一或多相關所列物件的組合。
在本文中，對於用以界定本發明範圍的數值與參數，本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差，因而大多是以約略的數量值來表示，然而於具體實施例中則盡可能精確呈現的相關數值。在本文中，「約」通常視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定，一般係指代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，例如，該實際數值為在一特定數值或範圍的±10%、±5%、±1%、或±0.5%以內。
本發明中使用的生物材料依據專利法第27條規定不需寄存，因為本發明的生物材料為所屬技術領域中具有通常知識者易於獲得，或可在不進行過度實驗的情況下進行製造或分離。
現今，代謝工程已被用於開發用於多種原料用途的重組菌株。例如，現在不僅可以發酵糖和澱粉，而且可以發酵木質纖維素和有機廢物來生產生物乙醇。這些新近開發的重組菌株已經證明了自然與工業社會之間的和諧。在本發明中，追求新一代的乙醇生產方式。透過結合來自三種細菌物種的基因組，即藍細菌（Cyanobacteria），運動發酵單胞菌（Zymomonas mobilis ），大腸桿菌（Escherichia coli ），酵母（Yeast），芽孢桿菌（Bacillus）或其組合，重組大腸桿菌現在可以有效地轉化糖和二氧化碳。由於重組大腸桿菌的生長取決於糖和二氧化碳，因此產生的乙醇稱為混營乙醇（mixotrophic ethanol）。最後，混營行為是一個通用平台，可用於其他生物基化學產品。理論上，發酵產物可以是任何接收電子的化學製品。
在本發明中，為了實現混營乙醇的生產，建構了大腸桿菌菌株FB295A（圖1）。首先，將基因pflB （編碼丙酮酸甲酸裂解酶）從大腸桿菌染色體MZLF中剔除，以獲得大腸桿菌FB（MZLFΔpflB ）。其次，將Pdc介導途徑（使用丙酮酸脫羧酶進行）導入FB，以獲得FB295菌株（含有pdc 及adhB 的FB）。 最後，將由rbcLS 和prk （編碼1,5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶（Rubisco）和磷酸核酮糖激酶（Prk））組成的基於Rubisco異源工程途徑導入FB295，以建構FB295A。 於實施例中討論了FB295A在均質發酵和混營乙醇生產中的效能。
以下將配合圖式詳細敘述例示實施例。然而，這些實施例可以包含於不同的形式中，且不應被解釋為用以限制本發明之申請專利範圍。這些實施例之提供使得本發明之揭露完整與明暸，熟知此技術之人將能經由該些實施例瞭解本發明之範疇。
以下將結合具體實施例對本實用發明的具體技術方案作進一步清楚、完整地說明。材料與方法 細菌株與質體
本發明中使用的所有細菌菌株和質體，以及其來源如下表1所示。表 1. 細菌菌株及質體列表
大腸桿菌菌株 敘述 取得方式
MZLF 大腸桿菌BL21（DE3）Δ zwf 、Δ ldh 、Δ frd ，氧化戊糖磷酸途徑的活性受損，乳酸生成，琥珀酸生成。 Yang et. al.
FB MZLFΔpflB ，丙酮酸厭氧轉化至乙醯輔酶A（acetyl Co-A）的活性受損。 本發明
FBL FBΔpdhR ::FRT -P pflB ，P pflB 啟動子在染色體中的整合，用於丙酮酸脫氫酶複合物的厭氧表達。 本發明
FB295 FB攜帶有pLOI295，FB菌株含有異源乙醇產生途徑。 本發明
FBL295 FBL攜帶有pLOI295，FB菌株含有異源乙醇產生途徑。 本發明
FB295A FB攜帶有PBAD -his6-prkA -pACYC184，rbcLS -pET30a+及pLOI295，FB菌株包含基於Rubisco的途徑和異源乙醇生產途徑。 本發明
質體 敘述 取得方式
PBAD -his6-prkA -pACYC184 重組質體帶有prkA 基因（源自Synechococcus PCC7942），用於在PBAD 啟動子的控制下過度表達磷酸核酮糖激酶（Prk）。 Ichiro Matsumura教授
rbcLS -pET30a+ 重組質體帶有rbcLS基因（來自Synechococcus PCC6301），在PT7啟動子的控制下過度表達 Rubisco。 Ichiro Matsumura教授
pLOI295 重組質體帶有pdc 及adh 基因（源自運動發酵單胞菌），在lac啟動子的控制下過度表達丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶II。 美國菌種保存中心 (ATCC)
pRED/ET araC 、bla 、oriR101、repA101（Ts）、γ，β，exo，RecA（red重組酶），溫度條件複製子（replicon）。 Gene Bridges GmbH, 德國
pKD13 bla FRT-kan-FRT 趙雲鵬教授
pCP20 FLP+, λ c1857+,λ pR Pepts, bla, catF 趙雲鵬教授
pTOL01 從pKD13擴增的Frt-kan-Frt區域（1.3 kb）在Nde I和Xho I位點插入pCDFDuet-1。 本發明
pTOL01PpflB 從BL21（DE3）基因組擴增的pflB啟動子區域（0.30 kb）在Xho I和Sal I位點插入pTOL01。 本發明
1. MZLF係由Yang et. al.獲得(C.-H. Yang, E.-J. Liu, Y.-L. Chen, F.-Y. Ou-Yang and S.-Y. Li,Microbial cell factories , 2016, 15, 133-133.)。 2. 質體 PBAD -his6-prkA -pACYC184及rbcLS -pET30a+自chiro Matsumura教授獲得 (美國埃默里大學生物化學系)。 3. 質體 pKD13及 pCP20自逢甲大學化學工程系趙雲鵬教授獲得。pTOL01PpflB 的選殖 (cloning)
從pKD13（使用引子FRTNde-F（SEQ ID NO：1）和FRTXho-R（SEQ ID NO：2））擴增FRT-KAN-FRT基因片段，並將其選殖在載體pCDFDuet-1的Nde I-Xho I位點之間產生pTOL01。
大腸桿菌DH5α菌株用作選殖宿主。使用pflB啟動子-f（SEQ ID NO：3）/ pflB啟動子-r（SEQ ID NO：4）的引子對（請參見表2），從大腸桿菌BL21（DE3）染色體中擴增pflB啟動子DNA片段。透過將PflB核糖體結合位點的序列添加到引子上，得到的PCR產物（PpflB ），其包含Fnr框（Fnr box）的轉錄融合基因。然後將Ppf1B DNA片段選殖到上述pTOL01中。大腸桿菌DH5α和大腸桿菌BL21（DE3）自台灣逢甲大學化學工程系的趙雲鵬教授獲得。引子序列在表2中列出。那些引子可從波仕特生物科技股份有限公司（台灣）獲得。表 2. 本發明所用到的引子序列
引子 序列 SEQ. ID NO:
FRTNde-F GCATGCCATATGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (1)
FRTXho-R GACTCGCTCGAGGAATTAATTCCGGGGATCCG (2)
pflB 引子-f GGAGACTCGAGAACCATGCGAGTTACGGGCCTATAA (3)
pflB 引子-r GGAGATTAATTAAGTAACACCTACCTTCTTGTGCCTGTGCCAGTGGTTGCTGTGA (4)
pflB-HP1 TGTCGAAGTACGCAGTAAATAAAAAATCCACTTAAGAAGGTAGGTGTTACGTGTAGGCTGGAGCTGCTT (5)
pflB-HP2 GTGGAGCCTTTATTGTACGCTTTTTACTGTACGATTTCAGTCAAATCTAAATTCCGGGGATCCGTCGAC (6)
Gko-pflB引子-HP1 CTCCTTTCCTACGTAAAGTCTACATTTGTGCATAGTTACAACTTTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (7)
Gko-pflB引子-HP2 GCGAGTTTCGATCGGATCCACGTCATTTGGGAAACGTTCTGACATGTAACACCTACCTTCTTGTG (8)
大腸桿菌 FB 及 FBL 的建構
大腸桿菌FB的選殖係依循先前描述的程序。 使用pflB-HP1（SEQ ID NO：5）/ pflB-HP2（SEQ ID NO：6）引子對從模板pKD13擴增基因片段（請參見表2）。該基因片段的中心具有FRT-kan-FRT基因序列，在其5'端融合有pflB 編碼區上游的45-bp序列，而在 3'端融合有pflB 編碼區下游的45-bp序列。透過電泳（2.5 KV，25μF及200Ω）將擴增的DNA分離至帶有pRed / ET的大腸桿菌MZLF中，然後篩選卡那黴素抗藥性（kanamycin-resistant）菌落。透過PCR驗證卡那黴素抗藥性標記在FB :: FRT-kan-FRT中的整合後，使用FLP重組酶和質體pCP20去除標記以建構菌株FB。
本發明開發了透過基因敲入製程（knock-in process）產生的大腸桿菌FBL。使用與FB相似的方法，pTOL01P pflB 作為透過PCR產生線性片段的模板，引子對為Gko-pflBpromoter-HP1（SEQ ID NO：7）/ Gko-pflBpromoter-HP2（SEQ ID NO： 8）（請參閱表2）。所擴增基因片段的中心具有FRT-kan-FRT-PpflB 序列，在5'端融合了pdhR 編碼區上游的45-bp序列，在3'端融合了aceE 編碼區的45-bp序列。透過電泳將該線性DNA片段分離至攜帶pRed/ET的大腸桿菌FB中，以建構FB::FRT-kan-FRT-PpflB。透過PCR驗證卡那黴素抗藥性標記在FB::FRT-kan-FRT-PpflB中的整合後，透過使用FLP重組酶和質體pCP20將其去除以建構菌株FBL。
另外，MZLF菌株得自Yang等人論文（C.-H. Yang, E.-J. Liu, Y.-L. Chen, F.-Y. Ou-Yang and S.-Y. Li,Microbial cell factories , 2016, 15, 133-133.）。FB 295由帶有pLOI295的FB製備，FBL由帶有pLOI295的FBL製備。 此外，FB295A由含有PBAD -his6-prk A-pACYC184，rbcLS -pET30a+及pLOI295的FB製備。這些建構方法係為習知，在此不再贅述。培養基及生長條件
細菌預培養物在37℃下的5 ml LB培養基中以200 rpm搖動生長。預培養用於在250 ml血清瓶中接種25ml作為複合培養基（complex medium）的LB（Becton，Dickinson and Company，USA）、或作為基本培養基（minimun medium）的嗎啉丙磺酸（Morpholino-propanesulfonic；MOPS，VWR Corporate，USA），以固定來源。細胞密度於0.05的MOPS包含：0.4 mM MOPS； 0.04 mM三(羥甲基)甲基甘氨酸（Tricine）；0.1 mM的七水合硫酸亞鐵（FeSO4 •7H2 O）；95 mM的氯化銨；2.76 mM的硫酸鉀；0.005 mM的二水合氯化鈣（CaCl2 •2H2 O）；5.25 mM的氯化鎂；500 mM的氯化鈉；0.029 mM的四水合鉬酸銨（(NH4 )6 Mo7 O24 •4H2 O）；0.004 mM的單質子酸；0.0003 mM的氯化鈷；0.0001 mM的硫酸銅；0.0008 mM的氯化錳；0.0001 mM的硫酸鋅；1.32 mM的磷酸氫二鉀。為了確保嚴格的厭氧條件，血清瓶中的頂部空間充滿了氮氣。 細菌細胞在37℃下以200 rpm搖動厭氧培養。透過使用ThermoSpectonic GENESYSTM 10系列分光光度計在600 nm處測量光密度來監測細胞生長。基於 Rubisco 的工程途徑將二氧化碳轉化為乙醇的化學計量
方程式（a）顯示EMP途徑的習知化學計量反應。方程式（b）代表理論化學計量反應，其描述了透過碳重新配置和基於Rubisco的工程途徑產生的混營丙酮酸（圖1）。方程式（c）代表習知乙醇生產的化學計量反應，而方程式（d）是理論上描述大腸桿菌中混營乙醇生產的化學計量反應。
(a) Glucose + 2 ADP + 2 NAD+ → 2 pyruvate + 2 ATP + 2 NADH
(b) Glucose + 1.2 CO2 → 2.4 pyruvate
(c) Glucose + 2 ADP → 2 ethanol + 2 CO2 + 2 ATP
(d) Glucose + 2.4 NADH → 2.4 ethanol + 1.2 CO2 + 2.4 NAD+ 代謝物分析
使用Thermo Scientific Dionex Ultimate 3000 LC系統對葡萄糖，甲酸，乙酸，乙醇，乳酸，琥珀酸和丙酮酸進行定性與定量。用HPLC的Aminex HPX-87H柱（300×7.8mm，Bio-rad，美國）達成混合物的分離，並使用折射率（RI）或UV檢測器進行測量。流動相為5 mM H2 SO4 。溫度保持在45℃，流速為每分鐘0.6毫升。將所有樣品以17,000 x g離心5分鐘以除去細胞，並使用0.2μm PVDF過濾器過濾上清液，然後透過自動進樣品器注入10µL樣品。
使用Sentry ST303紅外線擴散式CO2 分析儀測量培養液頂部空間的CO2 氣體濃度。計算總CO2 的方法是透過以下所述的方法完成的。培養液頂部空間中的氣態CO2 濃度是透過基於紅外線擴散式CO2 分析儀（Sentry ST303）進行測量的。基於氣態CO2 濃度計算總CO2 濃度，詳細計算如下所述。可透過以下公式估算釋放出的二氧化碳總量：
(e) CO2 總量 (莫耳數) = CO2 (l) + CO2 (g) + HCO3 -
其中CO2 總量（莫耳數）是釋放出的CO2 總量，CO2 （e）是溶解在發酵液中的CO2 總量，CO2 是密閉發酵槽頂部空間中氣態CO2 的總莫耳數，HCO3 - 是發酵液中碳酸氫根離子的總莫耳數。氣態CO2 的總莫耳數可以透過密封的發酵槽頂部空間的體積（0.225 L）和透過基於紅外線擴散式CO2 分析儀（Sentry ST303）測量的氣態CO2 的分壓來計算。結果 細胞內氧化還原平衡對於在 MOPS 基本培養基中使大腸桿菌 FB 的厭氧生長是關鍵的
如圖2（a）所示，當葡萄糖是唯一的碳源時，大腸桿菌FB（大腸桿菌BL21（DE3）Δzwf 、ΔldhA 、Δfrd 、ΔpflB ）無法厭氧生長。這與以前的某些習知研究一致，這些研究表明ldhA 和pflB 的雙重突變會導致氧化還原失衡。為了解決氧化還原電位的不平衡，首先透過在大腸桿菌FB中導入染色體攜帶（chromosomal-borne）的PDHc介導（PDHc-mediated）途徑來建構FBL。其中丙酮酸脫氫酶複合物（Pyruvate dehydrogenase complex；PDHc）的天然啟動子被內源性pflB 啟動子（PpflB 包括Fnr框、pflBp6啟動子及PflB核糖體結合位點的轉錄融合）替代，這些技術是習知的，在此不再贅述。這允許丙酮酸脫氫酶複合物（PDHc）的厭氧表達，否則只能在氧氣存在下表達。大腸桿菌中的PDHc將丙酮酸轉化為乙醯輔酶A和二氧化碳，同時產生NADH。但是，PDHc在pdhR-aceEF-lpdA 操縱子中的表達在厭氧條件下受到抑制。另一方面，在FNR的所有調控下，多種基因和操縱子（如focA-pflB ）很容易在厭氧條件下在大腸桿菌中表達。這種特性使PpflB成為厭氧驅動基因轉錄的理想工具。如圖2（a）所示，菌株FBL可以在60小時內厭氧生長至OD600 為0.392±0.006，並且能夠代謝9.8±0.0mM葡萄糖（圖2(b)）。大部分葡萄糖分別轉化為丙酮酸和乙醇，產率分別為0.56±0.03和1.25±0.10 mol / molglucose （圖2(c)）。
當將Pdc介導途徑（pLOI295）導入FB時，菌株FB295的OD600 為0.497±0.005（圖2(a)），在60小時的葡萄糖消耗為29.9±0.2mM（圖2(b) ）。FB295產生乙醇，產率為1.8±0.2mol / molglucose 。未檢測到丙酮酸，乙酸和甲酸對FB295的生長。FBL295具有與FB295相當的發酵特性。圖2顯示了由染色體攜帶（chromosomal-borne）的PDHc介導途徑是在無氧條件下挽救FB生長受損的另一種方法。然而，丙酮酸的累積（圖2(c)）表明可以進一步改善染色體攜帶（chromosomal-borne）的PDHc介導途徑的功效。請注意，FBL和FBL295的生長沒有產生甲酸。基於 Rubisco 的工程途徑的導入實質證明大腸桿菌中的混營乙醇產生
當使用複合培養基時，FB295的生長可以進一步改善。 從圖3（a）及圖4（b）可以看出，FB295進入固定相並在24小時內消耗了112 mM葡萄糖。當使用LB培養基可以補償NADH的再生和ATP的供應時，FB295可以有效地將葡萄糖轉化為乙醇，而無需輔因子的再生。乙醇產率達到2.09±0.01 mol / mol葡萄糖，比理論最大值高5%。
當將基於Rubisco的工程途徑（其包含Prk和Rubisco，命名為A）導入菌株FB295時，在所得菌株FB295A中觀察到的乙醇產率顯著提高（2.32±0.16 mol/molglucose ）（p = 0.043））。利用原位二氧化碳（in situ CO2 ）循環（方程式d）所得到的乙醇，基本上是唯一的發酵產物。FB295A中的均質發酵乙醇生產係伴隨著OD600 為4.03±0.08（圖3(a)）及葡萄糖消耗為111±5 mM，在60小時內消耗了所有葡萄糖（圖3(b)））。另外，FB295A的二氧化碳排放降低至0.3±0.03mol/molglucose 。應注意的是，FB295A的最終乙醇濃度達到256±19 mM。FB295A 的繼代培養證明強勁而快速的混營乙醇產生
該實施例驗證了在FB295A的繼代培養過程中能否以約2.5％的稀釋率維持產生乙醇的高產量。除了初始葡萄糖濃度為108 mM（約20 g / L）外，還測試了69 mM初始葡萄糖濃度，以模擬木質纖維素水解液中常見的葡萄糖濃度。從圖4（a）可以看出，一次FB295A的繼代培養（第二代）在29小時內達到了穩定期，與第一代相比（圖3(a)所示）有了顯著改善。圖4（b）和4（c）顯示了OD600 與葡萄糖消耗之間的高度正相關，而與初始葡萄糖消耗無關。更進一步地，圖4（d）顯示了在從50mM到108mM的整個葡萄糖消耗中，FB295A的乙醇產率可以保持幾乎高於2.2mol / molglucose 。這指出FB295A的乙醇產量與發酵時間無關，並且還指出混營乙醇基本上是主要代謝產物。 FB295A的平均葡萄糖消耗率（108 mM初始葡萄糖濃度）可以使用最小平方法（零截距）計算為3.0±0.2mmol·L-1 ·h-1 。從圖 4（d）還計算了FB295A的乙醇產率（108mM初始葡萄糖濃度）為2.4±0.1mol / molglucose 。因此，初始葡萄糖濃度為108 mM時，混營乙醇的生產率為7.1±0.5mmol·L-1 ·h-1 。乙醇是液體培養基中唯一的發酵產物。討論
插入大腸桿菌FB中使其失去活性的ldhA 和pflB 導致氧化還原失衡和葡萄糖的厭氧發酵失敗（圖2(a)）。導入丙酮酸氧化的PDHc介導途徑和Pdc介導途徑成功地使FB的生長（圖2(a)）。挽救 FBL、FB295及FB295A細菌生長並伴隨著大量乙醇的產生（圖2(c)）。FB的生長受損可歸因於氧化還原失衡，氧化還原失衡可透過PDHc介導途徑或Pdc介導途徑產生乙醇來修復。與FBL相比，FB295的高生長和高葡萄糖消耗指出，Pdc介導途徑產生的ATP需求是刺激葡萄糖消耗的有效方法（方程式c）。這是因為Pdc介導途徑僅產生乙醇而不是乙酸，因此EMP途徑成為ATP產生的主要途徑。另一方面，PDHc介導途徑會產生乙酸，而ATP是副產物。PDHc介導途徑產生的ATP特性使其成為刺激葡萄糖消耗的低效率驅動力。因此，其餘部分使用FB菌株。應注意的是，圖3中所示的FB的生長行為（無法厭氧生長）。圖2例示細胞內能量如何平衡細菌生長。
FB295菌株可以在MOPS基本培養基中生長（圖2）；但是，只有將基於Rubisco的工程途徑導入FB295中時，FB295A菌株才能在LB複合培養基中生長（數據未顯示）。葡萄糖可以途經自然EMP途徑或基於Rubisco的工程途徑（圖1）。碳流量競爭本質上是原位（in situ ）二氧化碳循環利用的一個難題，因為EMP途徑是ATP產生的主要途徑。如方程式d中所述，混營乙醇的生產需要NADH，其不能從MOPS基本培養基中明確提供。等式d還表明沒有ATP產生的來源。因此，在基本培養基中不生長FB295A，這表明FB295A具有基於Rubisco的工程途徑的強大生物體內（in vivo ）Prk活性，但缺少足夠的ATP和NADH供給。實際上，強大的Prk活性可以提供強大的驅動力，將葡萄糖流從傳統的EMP途徑引導至基於Rubisco的工程途徑。這可以由以下得到支持：當使用LB複合培養基時，基於Rubisco的工程途徑成為FB295A中有效發酵葡萄糖為乙醇（方程式d）的主要途徑。複合培養基的使用隱含了ATP和NADH的供應。
FB295A的一項強而有力的特性是，在細菌仍處於指數期（exponential phase）的60小時內，LB培養基中消耗了100 mM以上的葡萄糖（圖3(a)）。這清楚地指出，葡萄糖和二氧化碳在生長過程中被同化。在圖5和6中可以找到更強而有力的證據。在圖4（b）-4（d）中，高採樣頻率指出OD600 之中，葡萄糖消耗和高乙醇產量之間呈正相關。FB295A的另一個重要特徵是，透過繼代培養可以顯著減少總發酵時間，直至第二代，同時保持混營乙醇的產生（乙醇產量為2.4±0.1 mol / molglucose ）。透過比較圖3（a）（第1代）和4（a）（第2代），發酵時間的加速主要是由於減少了遲緩期（lag phase）。這指出基於Rubisco的乙醇生產工程途徑（方程式d）容易與當前異營大腸桿菌的代謝基礎設施相容，乙醇產率為2.4±0.1 mol / mol葡萄糖，指出葡萄糖完全透過基於Rubisco的工程途徑代謝（如方程d所示）。據先前技術文獻報導，某些廣泛的研究達到了理論最大值85-95%（如方程式c所示的傳統乙醇發酵）的發明；但本發明研究了一種新的途徑用於乙醇生產（方程式d），可達到理論最大值的100%。儘管在本發明中提出了混營乙醇生產的化學方法，但是可以進一步研究在生物反應器中使用較便宜且限定的培養基以提高混營乙醇生產的經濟性和競爭力。此外，預期透過適當的使用生物反應器可以改善混營乙醇的產率。
應該注意的是，FB295A中基於Rubisco的工程途徑的強大活性指出Rubisco在大腸桿菌中的表達不是原位二氧化碳再循環的速率控制步驟（rate-limiting step）。實際上，Rubisco不僅因其低kcat 而聞名，而且還受到其自身的受質，也就是核糖-1,5-二磷酸核糖核酸（RuBP），抑制而聞名。Rubisco的羧化能力應基於Rubisco的氨基甲醯化作用。當RuBP結合至Rubisco並形成構象（conformation）以防止氨基甲醯化時，發生RuBP抑制。在本發明中，Pdc介導途徑的導入潛在地為原位CO2 再循環（即CO2 供應）提供了優點。旺盛的二氧化碳供應可以克服體內對RuBP的抑制作用，並增強基於Rubisco的工程途徑的活性。儘管就羧基化能力而言，烯醇基輔酶A羧化酶/還原酶（Ecrs）可以說是最有競爭力的，但是本發明在工程學方面證明了Rubisco的實用性和有效性。
綜上所述，FB295A可以在60小時內實現均勻發酵的乙醇生產，其中發酵產物中乙醇的產量，濃度及純度，二氧化碳排放/乙醇產量分別為2.3±0.2mol/mol，256±19 mM、100%及0.13±0.02molCO2 /molEtOH 。透過第二代的繼代培養，總發酵時間可以縮短至30小時內，因此，混營乙醇的產率提高到7.1±0.5mmol·L-1 ·h-1 ，乙醇產率為2.4±0.1 mol/molglucose 。FB295A的表現達到了原位CO2 循環性能的理論值的100%，如方程式d所示。
應注意的是，以上實施例僅為較佳的實施例，無論是剃除何種基因，皆不應侷限於上述實施例中所剃除的frd 、ldhA 、zwf 及pflB 基因，本發明所屬技術領域通常知識者，皆可利用本發明的精神，設計所欲剔除的基因，另達成所欲達成之效果。
以上所述，乃僅記載本發明為呈現解決問題所採用的技術手段之較佳實施方式或實施例而已，並非用來限定本發明專利實施之範圍。即凡與本發明專利申請範圍文義相符，或依本發明專利範圍所做的均等變化與修飾，皆為本發明專利範圍所涵蓋。
無
經由詳細描述和附圖，將僅對本發明的實施例的附圖進行更全面的理解；因此，以下附圖僅用於解釋本發明實施例，並不限制本發明之申請專利範圍； 圖1顯示透過大腸桿菌FB295A產生混營乙醇的代謝途徑（帶有Pdc介導途徑）； 圖2顯示（a）生長曲線； （b）葡萄糖消耗量； （c）FB、FBL、FB295及FBL295菌株的乙醇和乙酸產率， 所有菌株均在含111 mM（20 g / L）葡萄糖的MOPS基本培養基中厭氧生長。誤差線代表標準差，生物學重複（biological replicate）為3； 圖3顯示（a）生長曲線； （b）葡萄糖消耗； （c）實施基於Rubisco的工程途徑（如果有的話，指定其名稱為A）時，大腸桿菌菌株的代謝產物產量，所有菌株均在含約111 mM（20 g / L）葡萄糖的LB培養基中厭氧生長60小時，誤差線代表標準差，其中FB295的生物學重複數為3，而FB295A的生物學重複數為6；及 圖4（a）顯示在初始葡萄糖濃度為69和108mM的情況下FB295及FB295A的生長曲線；圖4（b）及圖4（c）顯示初始葡萄糖濃度為69和108mM時的OD600的時間部分和FB295A的葡萄糖消耗； 圖4（d）代表乙醇產率；FB295A中的A代表基於Rubisco的工程途徑。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003

Claims (11)

  1. 一種創造重組微生物以產生發酵產物的方法，包含： 提供一碳固定模組；以及 提供一發酵產物生產模組； 其中該碳固定模組包含：(a) 提供具有剔除一酵素編碼基因的該重組微生物；及(b) 提供二氧化碳至1,5-二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶及磷酸核酮糖激酶， 其中該發酵產物生產模組包含：(c) 丙酮酸僅與丙酮酸轉化酵素反應以產生該二氧化碳。
  2. 如請求項1所述之方法，其中該酵素編碼基因包含zwf 。
  3. 如請求項1所述之方法，其中該步驟(c)包含從該重組微生物剔除frd 、ldhA 、及pflB 。
  4. 如請求項1所述之方法，其中該丙酮酸轉化酵素為丙酮酸脫羧酶。
  5. 如請求項1所述之方法，其中該重組微生物為藍細菌、運動發酵單胞菌、大腸桿菌、酵母、芽孢桿菌或其組合。
  6. 如請求項1所述之方法，其中該發酵產物為一源自氧化還原反應的化學產物。
  7. 請求項6所述之方法，其中該化學產物為乙醇。
  8. 一種製備發酵產物的方法，包含利用請求項1-7任一項方法所製備的重組微生物執行發酵製程。 。
  9. 如請求項8所述之方法，其中該發酵產物為一源自氧化還原反應的化學產物。
  10. 如請求項9所述之方法，其中該化學產物為乙醇。
  11. 一種用於製備發酵產物的重組微生物，係利用如請求項1-7任一項方法所製備。
TW109121925A 2019-12-02 2020-06-29 創造重組微生物以產生發酵產物的方法 TW202122583A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962942210P 2019-12-02 2019-12-02
US62/942,210 2019-12-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202122583A true TW202122583A (zh) 2021-06-16

Family

ID=76092026

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW109121925A TW202122583A (zh) 2019-12-02 2020-06-29 創造重組微生物以產生發酵產物的方法

Country Status (2)

Country Link
US (1) US20210163997A1 (zh)
TW (1) TW202122583A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109536398A (zh) * 2013-02-22 2019-03-29 代尔夫特理工大学 用于产量增加的方法中的重组体微生物

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114181879B (zh) * 2021-12-09 2022-11-22 中国科学院深圳先进技术研究院 具有自养能力的底盘细胞及其构建方法和应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109536398A (zh) * 2013-02-22 2019-03-29 代尔夫特理工大学 用于产量增加的方法中的重组体微生物
CN109536398B (zh) * 2013-02-22 2023-08-04 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于产量增加的方法中的重组体微生物

Also Published As

Publication number Publication date
US20210163997A1 (en) 2021-06-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Huang et al. Simultaneous production of 3-hydroxypropionic acid and 1, 3-propanediol from glycerol by a recombinant strain of Klebsiella pneumoniae
JP7139478B2 (ja) 発酵経路を経由するフラックスの増大を示す組み換え微生物体
CN105121637B (zh) 酿酒酵母中替代甘油形成的消耗电子的乙醇生产途径
EP2783007B9 (en) Microorganism strains for the production of 2,3-butanediol
Chen et al. Metabolic engineering of Klebsiella pneumoniae for the de novo production of 2-butanol as a potential biofuel
Zhang et al. Biotechnological production of acetoin, a bio-based platform chemical, from a lignocellulosic resource by metabolically engineered Enterobacter cloacae
Liu et al. Fermentation and redox potential
Celińska Klebsiella spp as a 1, 3-propanediol producer–the metabolic engineering approach
Cha et al. Design of mutualistic microbial consortia for stable conversion of carbon monoxide to value-added chemicals
CA3074086A1 (en) Production of glycolate from ethylene glycol and related microbial engineering
TW202122583A (zh) 創造重組微生物以產生發酵產物的方法
Zhu et al. Identification of the enzymes responsible for 3-hydroxypropionic acid formation and their use in improving 3-hydroxypropionic acid production in Gluconobacter oxydans DSM 2003
CA2754928A1 (en) Reducing carbon dioxide production and increasing ethanol yield during microbial ethanol fermentation
US10053712B2 (en) Use of enzymes which catalyze pyruvate synthesis from formate and acetyl-CoA and bacteria expressing same
Soo et al. Improvement of hydrogen yield of ethanol-producing Escherichia coli recombinants in acidic conditions
ES2909579T3 (es) Arginina como única fuente de nitrógeno para microorganismos fijadores de C1
Zhang et al. Engineering yeast mitochondrial metabolism for 3-hydroxypropionate production
Zhang et al. Synthetic engineering of Corynebacterium crenatum to selectively produce acetoin or 2, 3-butanediol by one step bioconversion method
Chu et al. Metabolic regulation and optimization of oxygen supply enhance the 2, 3‐butanediol yield of the novel Klebsiella sp. isolate FSoil 024
US9914943B2 (en) Modified bacteria for the production of bioalcohol
Liu et al. Engineering the 2, 3-BD pathway in Bacillus subtilis by shifting the carbon flux in favor of 2, 3-BD synthesis
CN112280725B (zh) 一种高效生产琥珀酸的重组大肠杆菌及其构建方法
US8741652B2 (en) Genetically transformed microorganisms with simultaneous enhancement of reduction potential and reductive enzyme activities for biomass fermentation
CN111662857B (zh) 人工甲基营养型枯草芽孢杆菌及其构建方法
KR20220025538A (ko) 일산화탄소로부터 유기산을 고효율로 생산하기 위한 상호공생 미생물 컨소시엄을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 방법