TW202118869A - 用於體外擴增暨活化自然殺手細胞之細胞培養基 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種用於體外擴增暨活化自然殺手細胞之培養基，該培養基包含納豆激酶，專屬針對自然殺手細胞提供優化的培養環境，且在不使用癌餵養細胞共同培養的條件下，使用該培養基可有效提升細胞擴增倍數，並產生高純度及對癌細胞具有高度毒殺活性之自然殺手細胞。

Description

用於體外擴增暨活化自然殺手細胞之細胞培養基

本發明係關於一種用於體外擴增暨活化自然殺手細胞之細胞培養基。

自然殺手細胞(Natural Killer Cells；NK細胞)是一群具備CD3^-CD56⁺表現型的細胞，通常存在於淋巴結、各器官及周邊血液中。NK細胞在人體周邊血液淋巴球中約佔5~20%，因此周邊血液是NK細胞方便的來源之一。NK細胞在1970年代被發現具有毒殺癌細胞之特性，且事先不需要經過教育或致敏(Priming)的過程。俟後之研究發現，NK細胞除了可以毒殺癌細胞之外，還可以殺死病毒感染之細胞、癌化之細胞及老化受壓力之細胞(Stressed Cells)。

過去的研究已顯示NK細胞具有治療腫瘤之潛力。自體NK細胞治療癌症之做法，係將病人周邊血液之NK細胞分離後，以體外細胞擴增暨活化之技術培養約14天，再輸注入該病人體內以達到治療癌症之效果。過去實施體外細胞擴增暨活化方法時，多數將NK細胞與癌餵養細胞(Cancer feeder cell)共同培養，以達到大幅提高NK細胞數量之目的。惟使用癌餵養細胞之擴增方法仍無法解決安全性的問題。在將擴增後自然殺手細胞輸注 病人體內前，難以確定癌餵養細胞是否已完全去除，因此產生安全性的疑慮。再者，即使體外培養後之NK細胞數量有大幅提升，倘該NK細胞毒殺癌細胞之活性不佳，後續應用於自體細胞療法之效果仍非常有限。據此，有必要開發一種培養基，在不使用癌餵養細胞共同培養之條件下，使用該培養基能有效率地提升NK細胞擴增倍數，並產生高純度及高癌細胞毒殺活性之NK細胞。

納豆激酶(nattokinase)是納豆枯草桿菌(Bacillus subtilis natto)所分泌的胞外酵素，已知具有溶解血栓的活性及分解纖維蛋白之功能，可應用於心血管疾病之預防及治療。納豆激酶目前係以口服投與，以營養補充品之形式使用。儘管已有研究探討個體食用納豆或納豆萃取物，有助於調節個體的免疫力(Takeda et al.,Traditional & Kampo Medicine,Vol.3 Iss.2 100-106,2016)，惟其作用之有效成分及相關機制目前仍不清楚。此外，納豆激酶應用於體外免疫細胞培養方法與效用，目前未有相關研究。

本發明於一方面，係提供一種用於體外擴增暨活化自然殺手細胞之培養基，該培養基包含濃度範圍介於5FU/ml至20FU/ml之納豆激酶。

本發明於另一方面，係提供一種用於體外擴增暨活化自然殺手細胞之培養基，該培養基更包含輔酶Q10。

於本發明之一些具體實施態樣，該培養基包含濃度介於100nM至1000nM之輔酶Q10。

本發明於另一方面，係提供一種用於體外擴增暨活化自然殺手細胞之培養基，該培養基更包含介白素-2(IL-2)、介白素-12(IL-12)以及介 白素-18(IL-18)；其中該介白素-2(IL-2)於該培養基中之濃度介於200~1000IU/ml；其中該介白素-12(IL-12)於該培養基中之濃度介於10~50ng/ml；其中該介白素-18(IL-18)於該培養基中之濃度介於100~200ng/ml。

本發明於另一方面，係提供一種用於體外擴增暨活化自然殺手細胞之培養基，該培養基更包含基礎培養基；其中該基礎培養基為AIM V、X-VIV015、CellGro SCGM、KBM 501、DMEM或RPM1-1640培養基。

於本發明之一些具體實施態樣，以前述培養基培養後之細胞中，21%至41%係NKG2A⁺CD3^-CD56⁺細胞。

於本發明之一些具體實施態樣，以前述培養基培養後之細胞中，41%至71%係TRAIL⁺CD3^-CD56⁺細胞。

於本發明之一些具體實施態樣，以前述培養基培養後之細胞中，92%至97%係自然殺手細胞。

於本發明之一些具體實施態樣，以前述培養基培養後之細胞，當該細胞與K562細胞在活體外以5：1之比率共同培養時，該等細胞具有63%至81%之癌細胞毒殺活性。

圖一：S11~S14‧‧‧步驟

圖1係本發明實施例一之NK細胞體外擴增暨活化方法流程圖；

圖2係本發明所產生之細胞擴增倍數分析；

圖3係本發明所產生之NK細胞毒殺癌細胞之能力測試結果，其中圖3A係以K562作為被NK細胞毒殺之癌細胞株，其中圖3B係以HepG2、HT-29以及 A549作為被NK細胞毒殺之癌細胞株；

圖4係本發明所產生之NK細胞抑制癌細胞生長之小鼠實驗結果。

有鑑於上述待解決之問題，本發明提出一種用於體外擴增暨活化NK細胞之培養基，在不使用癌餵養細胞共同培養之條件下，所述培養基含有納豆激酶，可提供NK細胞良好的培養環境，有效率地提升NK細胞擴增倍數，並產生高純度及高癌細胞毒殺活性之NK細胞。

定義

用於本說明書，「自然殺手細胞」(Natural killer cell，簡稱NK細胞)係指細胞表面抗原呈現CD3^-CD56⁺的細胞。

用於本說明書，「癌餵養細胞」(cancer feeder cell)係指體外免疫細胞培養中，加入活的癌細胞共同培養以達到提升免疫細胞擴增之效果，加入之其他活的癌細胞稱之為癌餵養細胞。

用於本說明書，「細胞擴增倍數」係以下列方式判斷：「經體外培養14天後之細胞數量」除以「自周邊血單核球細胞分離出之起始NK細胞數量」。

用於本說明書，「毒殺癌細胞之活性」係以K562細胞株或其他癌細胞株為目標細胞(target cell)，並以NK細胞為作用細胞(effector cell)，在作用細胞與目標細胞之比例(E：T ratio)為5：1的情況下，將目標細胞死亡之比例做為毒殺效率。

材料與方法

本發明所述周邊血檢體，係依據倫理委員會通過之計畫，自 受試者手臂採集全血，置於無菌採血管，於室溫存放待後續處理。

本發明所使用之基礎培養基可選用自：CellGro SCGM(CellGenix公司)、KBM 501(Kohjin Bio公司)、AIM-V(Thermo Fisher公司)、X-VIV015(Lonza公司)、DMEM及RPMI-1640等市售培養基。

本發明所述培養基中，有時含有適當的蛋白質、細胞激素、抗體、血清、化合物等成分。所述細胞激素有時為介白素-2(IL-2)、介白素-3(IL-3)、介白素-7(IL-7)、介白素-12(IL-12)、介白素-15(IL-15)、介白素-18(IL-18)或介白素-21(IL-21)。

自PBMC分離NK細胞之方法

包括但不限於使用Dynabeads(Invitrogen公司)、CliniMACS磁珠(Miltenyi Biotec公司)或其他市售的免疫磁珠，將表達細胞表面抗原CD3和/或CD34的細胞分離除去，達到純化NK細胞之效果。

以流式細胞儀方式分析細胞表面抗原

以2x10⁵細胞/50μl將擴增暨活化後的細胞置於96孔盤，並加入3μl螢光標記之抗體於4℃反應15分鐘，接著以磷酸鹽緩衝生理食鹽水(Phosphate buffer saline；簡稱PBS)清洗3次後，加入400μl PBS懸浮細胞，再以流式細胞儀(Beckman公司)分析細胞表面之螢光標記。上述螢光標記之抗體包含anti-CD3抗體(Invitrogen公司)、anti-CD56抗體(Invitrogen公司)、anti-TRAIL抗體(BD Bioscience公司)以及anti-NKG2A抗體(R&D system公司)。

NK細胞毒殺癌細胞能力測試方式

將擴增暨活化後的細胞做為作用細胞(effector cell)，並以 K562細胞株(慢性骨髓性血癌細胞株)、HepG2細胞株(肝癌細胞株)、HT-29細胞株(大腸癌細胞株)或A549細胞株(肺癌細胞株)做為毒殺標的細胞(target cell)。將作用細胞及標的細胞以0.25：1、0.5：1、1：1或5：1混合培養後，反應4小時，再以7-AAD進行細胞染色，藉此測定凋亡之細胞數量。

體外擴增暨活化NK細胞之方法

如圖一所示，步驟11係自血液檢體分離周邊血單核球細胞(PBMC)。將未經冷藏或冷凍之周邊血檢體置於50ml離心管內並離心。離心結束後，去除上層之血漿，加入適量之PBS稀釋後，再加入3ml之Ficoll-paque Plus(GE Healthcare公司)。於室溫離心20分鐘後，吸取PBMC層之細胞，並以PBS清洗3次，所得之細胞即為PBMC。

接著，自PBMC中純化NK細胞(如圖一步驟12)：在每1x10⁷ PBMC的條件下，以80μl含有0.5% BSA、2mM EDTA的PBS懸浮PBMC。在每1x10⁷細胞的條件下，添加30μl CD3磁珠(MACS CD3 MicroBeads human,Miltenyi Biotec公司)到所述PBMC懸浮液中，將所述包含磁珠的PBMC懸浮液均勻攪拌後，置於4℃下15分鐘。之後，所述PBMC懸浮液以300 xg離心10分鐘並去除上清液後，以500μl含有0.5% BSA、2mM EDTA的PBS懸浮PBMC，再將所述PBMC懸浮液通過LD Column層析管(Miltenyi Biotec公司)，藉由磁力將細胞表面表達CD3抗原的細胞從所述懸浮液中分離，以2 x 1ml含有0.5% BSA、2mM EDTA的PBS清洗層析管，收集流出的細胞，即取得純化後的NK細胞。

接著，進行NK細胞擴增暨活化：將NK細胞以培養基均勻的配製成濃度介於2~10x10⁵/ml之細胞懸浮液後，轉移至培養盤，在37℃及5% CO₂的環境下進行NK細胞之擴增(如圖一步驟13)。所述NK細胞培養基係以AIM-V培養基(Thermo Fisher Scientific公司)為基礎培養基，並添加濃度範圍介於200~1000IU/ml的介白素-2(IL-2)(Thermo Fisher Scientific公司)、濃度範圍介於10~50ng/ml的介白素-12(IL-12)(Sigma-Aldrich公司)、濃度範圍介於100~200ng/mL的介白素-18(IL-18)(Thermo Fisher Scientific公司)，以及濃度範圍介於5~20FU/ml之納豆激酶(NSK-SD；Japan Bio Science Laboratory公司)。所述培養基，可另添加濃度範圍介於100~1000nM之輔酶Q10(Sigma-Aldrich公司)。本發明之一較佳實施例中，於所述培養基另添加100nM之輔酶Q10(Sigma-Aldrich公司)。

此後，每隔二至三天觀察細胞之生長狀況，依細胞生長狀況更換新鮮的NK細胞培養基至14±2天為止(如圖一步驟14)。所述每隔二至三天更換之NK細胞培養基，係以第0036段所述方式配製之。最後，將培養盤中的細胞與培養基混合液移至離心管，以離心方式收集所述混合液中之細胞，再以PBS清洗，重複此步驟三次後，以PBS將細胞均勻的打散，如此即獲得擴增暨活化後的NK細胞。

經前述方法所獲得之擴增暨活化後的NK細胞，可混合於適當之賦形劑中保存，所述賦形劑可為一磷酸緩衝液，最後製備成醫藥組合物。

實施例

實施例1、NK細胞擴增倍數測試

為測試並優化NK細胞擴增暨活化方法，本實施例探討所述NK細胞培養基之添加物及其添加量，試驗組分別使用培養基A、培養基B 或培養基C，對照組則使用培養基D。所述對照組與實驗組皆以同一受試者之周邊血分離出之PBMC進行測試。所述培養基A、培養基B、培養基C及培養基D，皆係以AIM-V培養基(Thermo Fisher Scientific公司)為基礎培養基，並添加濃度範圍介於200~1000IU/ml的介白素-2(IL-2)(Thermo Fisher Scientific公司)、濃度範圍介於10~50ng/ml的介白素-12(IL-12)(Sigma-Aldrich公司)，以及濃度範圍介於100~200ng/mL的介白素-18(IL-18)(Thermo Fisher Scientific公司)。為測試添加納豆激酶對於NK細胞體外擴增暨活化的效用，所述實驗組(培養基A、培養基B及培養基C)添加有20FU/ml(FU係指纖維蛋白分解單位，fibrin degradation unit)或5FU/ml之納豆激酶。為測試同時添加納豆激酶與輔酶Q10對於NK細胞體外擴增暨活化的效用，於所述培養基A同時加入20FU/ml之納豆激酶與100nM之輔酶Q10。培養基A、培養基B、培養基C及培養基D的成份彙整如下表一。

表一、培養基成份

圖2之實驗結果顯示，使用含有納豆激酶之培養基A、培養基B或培養基C培養14天後，NK細胞擴增倍數皆達到1000倍以上，具體而言，擴增倍數為1135至1750倍。相較與此，使用無添加納豆激酶之培養基D 培養14天後，NK細胞擴增倍數只有498倍。由此可知添加5~20FU/ml之納豆激酶，能有效提升NK細胞的擴增倍數。比較培養基A及培養基B之實驗結果，顯示在含有納豆激酶之培養基中再添加輔酶Q10，NK細胞擴增倍數自1326倍提升至1750倍。

實施例3、NK細胞對癌細胞之毒殺能力測試

為進一步探討以本發明擴增後之NK細胞活性，本實施例測試以不同培養基擴增後NK細胞對癌細胞之毒殺能力。首先，試驗組分別使用培養基A、培養基B或培養基C，對照組則使用培養基D，所述培養基成份如表一所示。所述對照組與實驗組皆以同一受試者之周邊血分離出之PBMC進行擴增暨活化。實驗結果顯示(圖3A)，使用含有納豆激酶之培養基A、培養基B或培養基C培養14天後，當E：T比例為5：1且以K562作為被NK細胞毒殺之癌細胞株時，毒殺效率皆達到60%以上，具體而言，毒殺效率為63.1%~81.2%。相較與此，使用無添加納豆激酶之培養基D培養14天後，毒殺效率只有39.8%。由此可知培養基中添加5~20FU/ml之納豆激酶，不僅能提升NK細胞的擴增倍數，擴增後之NK細胞對於癌細胞也具有較高之毒殺活性。比較培養基A及培養基B之實驗結果，顯示在含有納豆激酶之培養基中再添加輔酶Q10，NK細胞對於癌細胞之毒殺能力還可再提高，自68.3%增加至81.2%。

承上，以一較佳的實施例培養基A擴增暨活化後的NK細胞，測試該NK細胞對不同癌細胞株之毒殺能力。實驗結果顯示(圖3B)，使用含有納豆激酶及輔酶Q10培養基擴增暨活化後之NK細胞(即培養基A組)，皆能有效毒殺HepG2細胞株(肝癌細胞株)、HT-29細胞株(大腸癌細胞株) 及A549細胞株(肺癌細胞株)，且相較於使用不含納豆激酶之培養基(即培養基D組)，對於癌細胞明顯有較高的毒殺能力。

實施例4、細胞表面抗原分析

為測試本發明所產生之細胞中，NK細胞的占比(即純度)，以及該NK細胞之活化狀態，因此使用anti-CD3、anti-CD56、anti-TRAIL以及anti-NKG2A抗體標示細胞表面抗原，再以流式細胞儀分析，結果如表二所示。活化狀態的NK細胞表面表現TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)分子，具有較佳的癌細胞毒殺活性。NKG2A係位於NK細胞表面的抑制性受體，若NK細胞表面表現NKG2A，顯示該NK細胞之活性屬於被抑制之狀態。換言之，當NK細胞表面不表現NKG2A抗原，該NK細胞具有較佳的癌細胞毒殺活性。

表二、細胞表面抗原分析結果

表二顯示，使用培養基A、培養基B或培養基C所產生之細胞中，92%至97%係NK細胞，顯示本發明可產生極高純度之NK細胞。再者， 使用培養基A、培養基B或培養基C所產生之細胞中，41%至71%係TRAIL⁺CD3^-CD56⁺細胞，顯示多數細胞為高度活化狀態之NK細胞；相較於此，使用不含納豆激酶之培養基D所產生之細胞中，僅37%至54%係TRAIL⁺CD3^-CD56⁺細胞。另外，使用培養基A、培養基B或培養基C所產生之細胞中，僅21%至41%係NKG2A⁺CD3^-CD56⁺細胞，顯示多數細胞具有較佳的癌細胞毒殺活性；相較於此，使用不含納豆激酶之培養基D所產生之細胞中，高達41%至53%係NKG2A+CD3-CD56+細胞。

實施例5、NK細胞抑制腫瘤細胞增生之小鼠實驗

所有動物實驗係依據適當的動物照護，並使用實驗動物照護及使用委員會或小組(IACUC)所核定的合乎道德的實驗步驟與準則進行。為測試以本發明擴增後之NK細胞抑制癌細胞增生的能力，將雌性NOD/SCID小鼠(平均體重為20公克)分配至不同組別，一組對照組(n=5)、一組實驗組(n=5)。將100μl含有1x10⁷的K562細胞(腫瘤細胞)以皮下注射方式給予對照組及實驗組小鼠，稱為實驗第0天。在實驗第0天、第4天、第8天、第12天及第14天，將100μl含有1x10⁷以一較佳的實施例培養基A產生的細胞，靜脈注射方式給予實驗組；並於同樣的時間點，將相同體積100μl之生理食鹽水以靜脈注射方式給予對照組。持續記錄小鼠的活動力、體重、毛色及皮下腫瘤的生長情況至第18天。實驗結果顯示，於第18天，實驗組小鼠體內的腫瘤體積為97.6mm³，明顯小於對照組之腫瘤體積364.8mm³。據此，本實施例以含有納豆激酶及輔酶Q10培養基擴增暨活化後NK細胞，在活體內能有效抑制腫瘤細胞之生長，表示擴增後NK細胞之活性極佳，具有臨床治療之應用性。

Claims (10)

1. 一種用於體外擴增暨活化自然殺手細胞之培養基，其包含濃度範圍介於5FU/ml至20FU/ml之納豆激酶。
2. 如申請專利範圍第1項之培養基，其另包含輔酶Q10。
3. 如申請專利範圍第2項之培養基，其中該輔酶Q10之濃度介於100nM至1000nM。
4. 如申請專利範圍第3項之培養基，其另包含介白素-2(IL-2)、介白素-12(IL-12)以及介白素-18(IL-18)；其中該介白素-2(IL-2)於該培養基中之濃度介於200~1000IU/ml；其中該介白素-12(IL-12)於該培養基中之濃度介於10~50ng/ml；其中該介白素-18(IL-18)於該培養基中之濃度介於100~200ng/ml。
5. 如申請專利範圍第4項之培養基，其另包含基礎培養基；其中該基礎培養基為AIM V、X-VIV015、CellGro SCGM、KBM 501、DMEM或RPM1-1640培養基。
6. 如申請專利範圍第1至第5項中任一項之培養基，其中該培養基所培養之細胞無需添與癌餵養細胞共同培養，即可達到介於1135倍至1750倍的細胞擴增倍數。
7. 如申請專利範圍第1至第5項中任一項之培養基，其培養後之細胞中21%至41%係NKG2A⁺CD3^-CD56⁺細胞。
8. 如申請專利範圍第1至第5項中任一項之培養基，其培養後之細胞中41%至71%係TRAIL⁺CD3^-CD56⁺細胞。
9. 如申請專利範圍第1至第5項中任一項之培養基，其培養後之細胞中包含92%至97%之自然殺手細胞。
10. 如申請專利範圍第1至第5項中任一項之培養基，當該自然殺手細胞與K562細胞在活體外以5：1之比率共同培養時，該等自然殺手細胞具有63%~81%之癌細胞毒殺活性。

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