TW202112819A - 用於抗體製備之細胞培養方法及組合物 - Google Patents
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Abstract
本發明提供用於製備抗α4β7抗體，例如維多珠單抗以及其組合物之細胞培養方法。
Description
本發明係關於用於在哺乳動物宿主細胞中製備抗α4β7抗體之方法及組合物。
哺乳動物細胞培養技術常用於製備治療性生物劑，包括治療性單株抗體。在醫藥行業中，相較於用於蛋白質製備之其他形式之真核細胞(諸如酵母)或原核細胞(諸如細菌)，哺乳動物細胞通常較佳，因為在哺乳動物細胞中所製備之蛋白質通常具有更類似於在人類中所製備之蛋白質的轉譯後修飾。然而，哺乳動物細胞培養可能為困難的，因為此等細胞呈現許多挑戰，尤其在以商業規模製造之用於人類之治療性抗體之情形中。製備方法必須使來自細胞之抗體產率最大化，同時維持蛋白質產物之安全性以及效率及成本有效性。因此，製備需求為重要的，正如需要維持產物之所需品質特徵，諸如糖基化型態、聚集物含量、電荷異質性及胺基酸序列完整性(Li等人, 2010,mAbs
, 2(5):466-477)。
鑒於細胞培養方法之複雜性，鑑定可解決與製備治療性抗體相關之挑戰的細胞培養參數，包括維持高品質藥物產品，同時製備足夠之滿足製造需求及治療要求之蛋白質產物可為困難的。
雖然在過去幾十年裏，哺乳動物細胞培養方法一直為研究主題，但仍需要改良重組抗體之大規模商業製備。哺乳動物宿主細胞培養物之細胞活力、壽命及單位生產率的增加及所製備之重組蛋白之效價的改良對所製備之重組蛋白之價格及(在治療性蛋白質情況下)藥物產品之價格及可獲得性具有真實的影響。另外，鑒於需要維持所製備之治療性抗體之品質的一致性，此類增加可能尤其具挑戰性。
本文所提供之發明尤其揭示用於在哺乳動物宿主細胞中製備抗α4β7抗體(諸如維多珠單抗)之細胞培養方法及組合物。本文亦提供包含使用該等方法獲得之抗α4β7抗體(諸如維多珠單抗)之組合物。
在一個態樣中，本發明提供一種製備包含人類化抗α4β7抗體之組合物之方法，該方法包括在製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，及將包含尿苷、錳及半乳糖之補充物添加至製備培養基中，由此製備包含人類化抗α4β7抗體之組合物，其中哺乳動物宿主細胞經遺傳工程化以表現人類化抗α4β7抗體，該人類化抗α4β7抗體為IgG1抗體，包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 4中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 3中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 2中所列之CDR1結構域；且包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 8中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 7中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 6中所列之CDR1結構域。
在上述態樣之一些實施例中，該方法為製備具有降低量之人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型(如藉由陽離子交換層析(CEX)所測定)之組合物的方法，該方法包括該在製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，及該將包含尿苷、錳及半乳糖之補充物添加至製備培養基中，由此製備與在不存在該補充物之情況下培養之表現該人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比具有降低量之人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型的組合物。
在以上態樣之一些實施例中，本發明提供一種製備具有約16%或更少之人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型(如藉由CEX所測定)之組合物的方法，該方法包括該在製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，及該將包含尿苷、錳及半乳糖之補充物添加至製備培養基中，由此製備具有約16%或更少之人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型的組合物。
在一個實施例中，組合物包含約14%或更少之人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型。
在另一實施例中，組合物包含約13%或更少之人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型。
在一個實施例中，將補充物添加至製備培養基中或添加至隨後添加至製備培養基中之饋料培養基中。
在一個實施例中，製備培養基中尿苷之平均濃度為約1至約7 mM；其中製備培養基中錳之平均濃度為約0.002至約0.015 mM；及/或其中製備培養基中半乳糖之平均濃度為約3至約20 mM。在某些實施例中，饋料培養基進一步包含鋅。在一個實施例中，製備培養基中鋅之平均濃度為約0.05 mM至約0.045 mM。
在一個實施例中，將尿苷以約15至120 mM之最終濃度添加至饋料培養基中。在一個實施例中，將尿苷添加至饋料培養基中達至約20至70 mM尿苷之最終濃度。在一個實施例中，將尿苷添加至饋料培養基中達至約1至40 mM尿苷之最終濃度。
在一個實施例中，將錳以約0.02至0.3 mM之最終濃度添加至饋料培養基中。在一個實施例中，將錳添加至饋料培養基中達至約0.04至0.15 mM之最終濃度。在一個實施例中，將錳添加至饋料培養基中達至約0.0001至0.1 mM之最終濃度。
在另一實施例中，將半乳糖添加至饋料培養基中達至約85 mM至600 mM之最終濃度。在一個實施例中，將半乳糖添加至饋料培養基中達至約160至340 mM之最終濃度。在一個實施例中，將半乳糖添加至饋料培養基中達至約50至150 mM之最終濃度。
在另一實施例中，饋料培養基進一步包含鋅。在一個實施例中，饋料培養基中鋅之濃度為約90 μM至120 μM。在一個實施例中，饋料培養基中鋅之濃度為約50 μM至150 μM。
在一個實施例中，相對於在不存在補充物之情況下培養之表現人類化抗α4β7抗體之對照哺乳動物宿主細胞中製備之酸性種類之百分比，該方法進一步降低人類化抗α4β7抗體之酸性種類之百分比。
在一個實施例中，相對於在不存在添加至製備培養基中之包含尿苷、錳及半乳糖之饋料培養基的情況下產生之主要同種型種類之百分比，該方法進一步增加人類化抗α4β7抗體之主要同種型種類之百分比。
在一個實施例中，該方法為分批饋料方法。
在一個實施例中，在製備階段之約第四天開始將饋料培養基添加至製備培養基中。
在另一態樣中，本發明提供一種製備包含人類化抗α4β7抗體之組合物之方法，該方法包括在包含鋅之製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，由此製備包含人類化抗α4β7抗體之組合物，其中哺乳動物宿主細胞經遺傳工程化以表現人類化抗α4β7抗體，其為IgG1抗體；包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 4中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 3中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 2中所列之CDR1結構域；且包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 8中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 7中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 6中所列之CDR1結構域。
在上述態樣之一些實施例中，該方法為製備具有降低量之人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型(如藉由陽離子交換層析(CEX)所測定)之組合物的方法，該方法包括該在包含鋅之製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，由此與在不存在鋅之情況下培養之表現人類化抗α4β7抗體之對照哺乳動物宿主細胞相比，製備具有降低量之人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型的組合物。
在以上態樣之一些實施例中，該方法為製備具有約16%或更少之人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型(如藉由CEX所測定)之組合物的方法，該方法包括該在包含鋅之製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，由此製備具有約16%或更少之人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型的組合物。
在一個實施例中，組合物包含約14%或更少之人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型。
在一個實施例中，組合物包含約13%或更少之人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型。
在一個實施例中，製備培養基中鋅之濃度為2 μM至60 μM。
在另一實施例中，該方法包括藉由將包含鋅之饋料培養基添加至製備培養基中為製備培養基補充鋅。在一個實施例中，在製備階段之約第四天開始將饋料培養基添加至製備培養基中。
在一個實施例中，饋料培養基中鋅之濃度為約90 μM至120 μM。
在一個實施例中，製備培養基包含5.0至8.8 g/L離胺酸及3.0至12.0 g/L精胺酸。在一個實施例中，製備培養基包含4.5至5.5 g/L離胺酸。在一個實施例中，製備培養基包含5.5至8.8 g/L離胺酸。在一個實施例中，製備培養基包含5.4至7.4 g/L精胺酸。在一個實施例中，製備培養基包含7.4至12 g/L精胺酸。
在另一態樣中，本發明提供一種製備包含人類化抗α4β7抗體之組合物之方法，該方法包括在製備階段中在製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，使得產生包含人類化抗α4β7抗體之組合物，其中製備培養基具有約37攝氏度之平均溫度，其中宿主細胞經遺傳工程化以表現人類化IgG1抗α4β7抗體，其中人類化抗α4β7包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 4中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 3中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 2中所列之CDR1結構域；且包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 8中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 7中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 6中所列之CDR1結構域。
在上述態樣之一些實施例中，該方法為製備包含2.5%或更少之人類化抗α4β7抗體之HMW種類(如藉由SEC所測定)之組合物的方法，該方法包括該在製備階段中在製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，使得產生包含2.5%或更少之人類化抗α4β7抗體之HMW種類(如藉由SEC所測定)的組合物。
在另一態樣中，本發明提供一種製備包含人類化抗α4β7抗體之組合物之方法，該方法包括在擴增階段中在生長培養基中培養哺乳動物宿主細胞，其中哺乳動物宿主細胞經遺傳工程化以表現人類化抗α4β7抗體，及在製備階段中在製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，使得產生包含人類化抗α4β7抗體之組合物，其中在擴增階段與製備階段中在大致相同之溫度下培養哺乳動物宿主細胞，且其中人類化抗α4β7抗體為IgG1抗體；包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 4中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 3中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 2中所列之CDR1結構域；且包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 8中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 7中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 6中所列之CDR1結構域。
在上述態樣之一些實施例中，該方法為製備包含高含量之人類化抗α4β7抗體之單體(如藉由SEC所測定)之組合物的方法，該方法包括該在擴增階段中在生長培養基中培養哺乳動物宿主細胞，其中哺乳動物宿主細胞經遺傳工程化以表現人類化抗α4β7抗體，及該在製備階段中在製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，使得產生包含高含量之人類化抗α4β7抗體之單體(如藉由SEC所測定)的組合物。
在一個實施例中，溫度為36至38攝氏度。在另一實施例中，平均溫度為36.5至37.5攝氏度。在其他實施例中，溫度為約37攝氏度之平均溫度。
在一個實施例中，本文所揭示之方法之製備培養基具有36至38攝氏度之溫度範圍。在一個實施例中，溫度範圍為36.5至37.5攝氏度。在一個實施例中，溫度為約37攝氏度之平均溫度。在一個實施例中，製備培養基具有在6.5至7範圍內之pH值。
在一個實施例中，本文所揭示之方法之製備培養基具有在6.8至7.0範圍內之pH值。
在一個實施例中，在製備階段期間，本文所揭示之方法之製備培養基具有維持在約7 g/L下或更小之葡萄糖含量。
在一個實施例中，製備階段為14天或更短時間。在另一實施例中，製備階段在10天至17天範圍內。
在以上態樣之一些實施例中，該方法在大規模生物反應器中進行。在某些實施例中，大規模生物反應器選自由以下組成之群：200公升(L)生物反應器、2000 L生物反應器、3000L及6000 L生物反應器。
在一些實施例中，製備階段產生大於3 g/L之人類化抗α4β7抗體效價。在某些實施例中，人類化抗α4β7抗體之效價為約3至約8 g/L。在其他實施例中，人類化抗α4β7抗體之效價為約5至約7 g/L。
在以上態樣之一些實施例中，哺乳動物宿主細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在某些實施例中，CHO細胞為GS-CHO細胞。
在以上態樣之一些實施例中，人類化抗α4β7抗體包含含有如SEQ ID NO: 1中所列之胺基酸序列的重鏈可變結構域，且包含含有如SEQ ID NO: 5中所列之胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
在以上態樣之一些實施例中，人類化抗α4β7抗體為維多珠單抗。
在上述態樣之一些實施例中，該方法包括收穫及純化抗體。在一些此類實施例中，純化包括(i)移除任何細胞碎屑、不想要之蛋白質、鹽、礦物質或其他不需要之分子的純化步驟，及(ii)自污染性可溶性蛋白質及多肽純化抗體。在某些實施例中，該方法進一步包括製備適合於人類治療用途之經純化抗體之醫藥調配物。
在特定實施例中，醫藥調配物為液體醫藥調配物。在一些此類實施例中，液體醫藥調配物係藉由超濾/滲濾製備。
在其他實施例中，醫藥調配物為凍乾之乾燥抗體調配物。在一些此類實施例中，抗體之醫藥調配物為自在純化之後藉由超濾/滲濾製備之液體醫藥抗體調配物凍乾的乾燥抗體調配物。
在一些實施例中，本發明提供一種製備具有降低量之人類化抗α4β7抗體之G0F糖型(如藉由親水性相互作用層析(HILIC)所測定)之組合物的方法，該方法包括該在製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，及該將包含尿苷、錳及半乳糖之補充物添加至製備培養基中，由此與在不存在補充物之情況下培養之表現人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，製備具有降低量之人類化抗α4β7抗體之G0F糖型的組合物。
在一個實施例中，與在不存在補充物之情況下培養之表現人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，組合物包含含量降低至少約15%之人類化抗α4β7抗體之G0F糖型。
在一個實施例中，與在不存在補充物之情況下培養之表現人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，組合物包含減少至少約20%之人類化抗α4β7抗體之G0F糖型。
在一些實施例中，本文提供一種製備具有約65%或更少之人類化抗α4β7抗體之G0F糖型(如藉由HILIC所測定)之組合物的方法，該方法包括該在製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，及該將包含尿苷、錳及半乳糖之補充物添加至製備培養基中，由此製備具有約65%或更少之人類化抗α4β7抗體之G0F糖型的組合物。
在一個實施例中，組合物包含約60%或更少之人類化抗α4β7抗體之G0F糖型。
在一個實施例中，組合物包含約55%或更少之人類化抗α4β7抗體之G0F糖型。
在一些實施例中，本文提供一種製備具有增加量之人類化抗α4β7抗體之G1F糖型(如藉由親水性相互作用層析(HILIC)所測定)之組合物的方法，該方法包括該在製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，及該將包含尿苷、錳及半乳糖之補充物添加至製備培養基中，由此與在不存在補充物之情況下培養之表現人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，製備具有增加量之人類化抗α4β7抗體之G1F糖型的組合物。
在一個實施例中，與在不存在補充物之情況下培養之表現人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，組合物包含增加至少約2倍之人類化抗α4β7抗體之G1F糖型。
在一個實施例中，與在不存在補充物之情況下培養之表現人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，組合物包含增加至少約3倍之人類化抗α4β7抗體之G1F糖型。
在一些其他實施例中，本文提供一種製備具有約25%或更多之人類化抗α4β7抗體之G1F糖型(如藉由HILIC所測定)之組合物的方法，該方法包括該在製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，及該將包含尿苷、錳及半乳糖之補充物添加至製備培養基中，由此製備具有約25%或更多之人類化抗α4β7抗體之G1F糖型的組合物。
在一個實施例中，組合物包含約30%或更多之人類化抗α4β7抗體之G1F糖型。
在一些實施例中，本文提供一種製備具有增加量之人類化抗α4β7抗體之G2F糖型(如藉由親水性相互作用層析(HILIC)所測定)之組合物的方法，該方法包括該在製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，及該將包含尿苷、錳及半乳糖之補充物添加至製備培養基中，由此與在不存在補充物之情況下培養之表現人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，製備具有增加量之人類化抗α4β7抗體之G2F糖型的組合物。
在一個實施例中，與在不存在補充物之情況下培養之表現人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，組合物包含增加至少約3倍之人類化抗α4β7抗體之G2F糖型。
在一個實施例中，與在不存在補充物之情況下培養之表現人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，組合物包含增加至少約4倍之人類化抗α4β7抗體之G2F糖型。
在一些實施例中，本文提供一種製備具有約3%或更多之人類化抗α4β7抗體之G2F糖型(如藉由HILIC所測定)之組合物的方法，該方法包括該在製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，及該將包含尿苷、錳及半乳糖之補充物添加至製備培養基中，由此製備具有約3%或更多之人類化抗α4β7抗體6之G2F糖型的組合物。
在一個實施例中，組合物包含約4%或更多之人類化抗α4β7抗體之G2F糖型。
在一個實施例中，將補充物添加至製備培養基中或添加至隨後添加至製備培養基中之饋料培養基中。
在一個實施例中，饋料培養基包含約15至100 mM尿苷。在一個實施例中，饋料培養基包含約20至50 mM尿苷。在一個實施例中，饋料培養基包含約1至40 mM尿苷。
在一個實施例中，饋料培養基包含約0.02至0.3 mM錳。在一個實施例中，饋料培養基包含約0.02至0.1 mM錳。在一個實施例中，饋料培養基包含約0.001至0.1 mM錳。
在一個實施例中，饋料培養基包含85 mM - 600 mM半乳糖。在一個實施例中，饋料培養基包含85至100 mM半乳糖。在一個實施例中，饋料培養基包含50至150 mM半乳糖。
在另一實施例中，製備培養基進一步包含鋅。在一個實施例中，製備培養基中鋅之濃度為約50 μM至150 μM。
在一個實施例中，相對於在不存在補充物之情況下培養之表現人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞中產生之酸性種類之百分比，該方法進一步降低人類化抗α4β7抗體之酸性種類之百分比。
在一個實施例中，相對於在不存在添加至製備培養基中之包含尿苷、錳及半乳糖之饋料培養基的情況下產生之主要同種型種類之百分比，該方法進一步增加人類化抗α4β7抗體之主要同種型種類之百分比。
在一個實施例中，該方法為分批饋料方法。
在一個實施例中，在製備階段之約第四天開始將饋料培養基添加至製備培養基中。
在一個實施例中，本文所揭示之該方法係在大規模生物反應器中進行。在一個實施例中，大規模生物反應器選自由以下組成之群：200公升(L)生物反應器、2000 L生物反應器、3000 L及6000 L生物反應器。
在一個實施例中，製備階段產生大於3 g/L之人類化抗α4β7抗體效價。在一個實施例中，人類化抗α4β7抗體之效價為約3至約8 g/L。在一個實施例中，人類化抗α4β7抗體之效價為約5至約7 g/L。
在一個實施例中，哺乳動物宿主細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在一個實施例中，CHO細胞為GS-CHO細胞。
在一個實施例中，製備培養基具有約6.8至約7.1之pH值。
在一個實施例中，人類化抗α4β7抗體包含含有如SEQ ID NO: 1中所列之胺基酸序列的重鏈可變結構域，且包含含有如SEQ ID NO: 5中所列之胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
在一個實施例中，抗α4β7抗體為維多珠單抗。
在一些實施例中，該方法包括收穫及純化抗體。在一些此類實施例中，純化包括(i)移除任何細胞碎屑、不想要之蛋白質、鹽、礦物質或其他不需要之分子的純化步驟，及(ii)自污染性可溶性蛋白質及多肽純化抗體。在某些實施例中，該方法進一步包括製備適合於人類治療用途之經純化抗體之醫藥調配物。
在特定實施例中，醫藥調配物為液體醫藥調配物。在一些此類實施例中，液體醫藥調配物係藉由超濾/滲濾製備。
在其他實施例中，醫藥調配物為凍乾之乾燥抗體調配物。在一些此類實施例中，抗體之醫藥調配物為自在純化之後藉由超濾/滲濾製備之液體醫藥抗體調配物凍乾的乾燥抗體調配物。
在另一態樣中，本文提供一種細胞培養物，其包含經遺傳工程化以表現人類化抗α4β7抗體之宿主細胞及補充有尿苷、錳及半乳糖(UMG)之製備培養基，其中人類化抗α4β7抗體為IgG1抗體且包含含有SEQ ID NO:1中所列之胺基酸序列的重鏈可變區及含有SEQ ID NO: 5中所列之胺基酸序列的輕鏈可變區。
在以上態樣之一些實施例中，製備培養基包含濃度為約15-100 mM之尿苷、濃度為約20-200 nM之錳及濃度為約85-500 mM之半乳糖。
在以上態樣之一些實施例中，製備培養基包含濃度為約1-7 mM之尿苷、濃度為約2-15 μM之錳及濃度為約3-20 mM之半乳糖。在一些實施例中，製備培養基進一步包含濃度為約5-45 μM之鋅。
在某些實施例中，所表現之人類化抗α4β7抗體具有包含以下之同種型分佈：(a) 16%或更少、15%或更少、14%或更少、13%或更少或12%或更少之鹼性同種型；及/或(b)至少65%、至少68%、至少70%、至少72%或至少75%之主要同種型。
在其他實施例中，所表現之人類化抗α4β7抗體具有包含以下之岩藻糖基化N-聚醣含量：(a) 65%或更少、60%或更少、或55%或更少之G0F；(b) 25%或更多、27%或更多或30%或更多之G1F；及/或(c) 2.5%或更多、3%或更多、3.5%或更多、4%或更多或4.5%或更多之G2F。
在以上態樣之一些實施例中，所表現之人類化抗α4β7抗體具有至少92%、至少93%、至少94%或至少95%之總岩藻糖基化N-聚醣含量(G0F + G1F + G2F)。
在其他實施例中，所表現之人類化抗α4β7抗體具有92-95%之總岩藻糖基化N-聚醣含量(G0F + G1F + G2F)。
在替代實施例中，所表現之人類化抗α4β7抗體具有91-92%、91-92.5%或91-93%之總岩藻糖基化N-聚醣含量(G0F + G1F + G2F)。
在以上態樣之一些實施例中，細胞培養物進一步包含鋅。在其他實施例中，細胞培養物進一步包含精胺酸及/或離胺酸。
在以上態樣之一些實施例中，宿主細胞為CHO細胞。在某些實施例中，CHO細胞缺乏編碼麩醯胺合成酶(GS)之基因。
在另一態樣中，本發明提供一種藉由上文描述之細胞培養物製備之人類化抗α4β7抗體。
在另一態樣中，本發明提供一種包含人類化抗α4β7抗體之組合物，該方法包括在具有第一pH值之第一製備培養基中培養經遺傳工程化以表現人類化抗α4β7抗體之哺乳動物宿主細胞；及在具有第二pH值之第二製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞；其中第二pH值為低於第一pH值，且其中人類化抗α4β7抗體為IgG1抗體；包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 4中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 3中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 2中所列之CDR1結構域；且包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 8中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 7中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 6中所列之CDR1結構域。
在上述態樣之一些實施例中，第二pH值比第一pH值低0.1至0.5個pH單位。在某些實施例中，第一pH值在pH 6.8-7.2範圍內，且第二pH值在pH 6.7-6.95範圍內。
在一些實施例中，將哺乳動物宿主細胞在第一pH值下培養120小時或更短時間。在某些實施例中，將哺乳動物宿主細胞在第一pH值下培養85-110小時。在其他實施例中，將哺乳動物宿主細胞在第一pH值下培養90-100小時。
在一些實施例中，該方法進一步包括自第二製備培養基收穫抗α4β7抗體。在某些實施例中，在將哺乳動物宿主細胞在第一製備培養基及第二製備培養基中培養13-15天之時間後收穫抗α4β7抗體。
在一些實施例中，相對於在沒有pH轉變之情況下在第一pH值下培養哺乳動物宿主細胞之對照組合物，組合物具有增加之抗α4β7抗體主要同種型含量。
在另一態樣中，本發明包括一種包含使用本文所揭示之方法中之任一者製備之人類化抗α4β7抗體的組合物。在一個實施例中，本文所揭示之方法提供人類化抗α4β7抗體之群體，其具有92%或更多之去唾液酸基-去半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G0F)、去唾液酸基-單半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G1F)及/或去唾液酸基-二半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G2F)糖基化變異體總量。
另外，本發明亦包含以下實施例：
1. 一種製備具有降低量之人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型(如藉由陽離子交換層析(CEX)所測定)之組合物的方法，該方法包括
在製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，及
將包含尿苷、錳及半乳糖之補充物添加至該製備培養基中，由此與在不存在該補充物之情況下培養之表現該人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，製備具有降低量之該人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型的組合物，
其中該哺乳動物宿主細胞經遺傳工程化以表現人類化抗α4β7抗體，其為IgG1抗體；包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 4中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 3中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 2中所列之CDR1結構域；且包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 8中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 7中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 6中所列之CDR1結構域。
2. 一種製備具有約16%或更少之人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型(如藉由CEX所測定)之組合物的方法，該方法包括
在製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，及
將包含尿苷、錳及半乳糖之補充物添加至該製備培養基中，由此製備具有約16%或更少之該人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型的組合物，
其中該哺乳動物宿主細胞經遺傳工程化以表現人類化抗α4β7抗體，其為IgG1抗體，包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 4中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 3中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 2中所列之CDR1結構域；且包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 8中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 7中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 6中所列之CDR1結構域。
3. 如第2項之方法，其中該組合物包含約14%或更少之該人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型。
4. 如第2項之方法，其中該組合物包含約13%或更少之該人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型。
5. 如第1項至第4項中任一項之方法，其中將該補充物添加至該製備培養基中或添加至隨後添加至該製備培養基中之饋料培養基中。
6. 如第5項之方法，其中將尿苷以約15至120 mM之最終濃度添加至該饋料培養基中。
7. 如第6項之方法，其中將該尿苷以約20至70 mM尿苷之最終濃度添加至該饋料培養基中。
8. 如第5項之方法，其中將錳以約0.02至0.3 mM之最終濃度添加至該饋料培養基中。
9. 如第8項之方法，其中將錳添加至該饋料培養基中達至約0.04至0.15 mM之最終濃度。
10. 如第5項之方法，其中將半乳糖添加至該饋料培養基中達至約85 mM至600 mM之最終濃度。
11. 如第10項之方法，其中將半乳糖添加至該饋料培養基中達至約160至340 mM之最終濃度。
12. 如第1項至第11項中任一項之方法，其中該饋料培養基進一步包含鋅。
13. 如第12項之方法，其中該饋料培養基中鋅之濃度為約90 μM至120 μM。
14. 如第1項至第13項中任一項之方法，其中相對於在不存在該補充物之情況下培養之表現該人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞中產生之酸性種類之百分比，該方法進一步降低該人類化抗α4β7抗體之酸性種類之百分比。
15. 如第1項至第14項中任一項之方法，其中相對於在不存在添加至該製備培養基中之包含尿苷、錳及半乳糖之饋料培養基的情況下產生之主要同種型種類之百分比，該方法進一步增加該人類化抗α4β7抗體之主要同種型種類之百分比。
16. 如第1項至第15項中任一項之方法，其中該方法為分批饋料方法。
17. 如第16項之方法，其中在製備階段之約第四天開始將該饋料培養基添加至該製備培養基中。
18. 一種製備具有降低量之人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型(如藉由陽離子交換層析(CEX)所測定)之組合物的方法，該方法包括在包含鋅之製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，由此與在不存在鋅之情況下培養之表現該人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，製備具有降低量之該人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型的組合物，
其中該哺乳動物宿主細胞經遺傳工程化以表現人類化抗α4β7抗體，其為IgG1抗體；包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 4中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 3中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 2中所列之CDR1結構域；且包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 8中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 7中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 6中所列之CDR1結構域。
19. 一種製備具有約16%或更少之人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型(如藉由CEX所測定)之組合物的方法，該方法包括在包含鋅之製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，由此製備具有約16%或更少之該人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型的組合物，
其中該哺乳動物宿主細胞經遺傳工程化以表現人類化抗α4β7抗體，其為IgG1抗體，包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 4中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 3中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 2中所列之CDR1結構域；且包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 8中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 7中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 6中所列之CDR1結構域。
20. 如第19項之方法，其中該組合物包含約14%或更少之該人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型。
21. 如第19項之方法，其中該組合物包含約13%或更少之該人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型。
22. 如第18項至第21項中任一項之方法，其中該製備培養基中鋅之濃度為2 μM至60 μM。
23. 如第18項至第22項中任一項之方法，其中該方法包括藉由將包含鋅之饋料培養基添加至該製備培養基中為該製備培養基補充鋅。
24. 如第23項之方法，其中在製備階段之約第四天開始將該饋料培養基添加至該製備培養基中。
25. 如第24項之方法，其中該饋料培養基中鋅之濃度為約90 μM至120 μM。
26. 如第1項至第25項中任一項之方法，其中該製備培養基包含5.0至8.8 g/L離胺酸及3.0至12.0 g/L精胺酸。
27. 如第26項之方法，其中該製備培養基包含4.5至5.5 g/L離胺酸。
28. 如第26項之方法，其中該製備培養基包含5.5至8.8 g/L離胺酸。
29. 如第26項之方法，其中該製備培養基包含5.4至7.4 g/L精胺酸。
30. 如第26項之方法，其中該製備培養基包含7.4至12 g/L精胺酸。
31. 一種製備包含2.5%或更少之人類化抗α4β7抗體之HMW種類(如藉由SEC所測定)之組合物的方法，該方法包括
在製備階段中在製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，使得產生包含2.5%或更少之該人類化抗α4β7抗體之HMW種類(如藉由SEC所測定)的組合物，
其中該製備培養基具有約37攝氏度之平均溫度，其中該宿主細胞經遺傳工程化以表現人類化IgG1抗α4β7抗體
其中該人類化抗α4β7包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 4中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 3中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 2中所列之CDR1結構域；且包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 8中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 7中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 6中所列之CDR1結構域。
32. 一種製備包含高含量之人類化抗α4β7抗體之單體(如藉由SEC所測定)之組合物的方法，該方法包括
在擴增階段中在生長培養基中培養哺乳動物宿主細胞，其中該哺乳動物宿主細胞經遺傳工程化以表現人類化抗α4β7抗體，及
在製備階段中在製備培養基中培養該哺乳動物宿主細胞，使得產生包含高含量之該人類化抗α4β7抗體之單體(如藉由SEC所測定)的組合物，
其中在該擴增階段與該製備階段中在大致相同之溫度下培養該哺乳動物宿主細胞，且
其中該人類化抗α4β7抗體為IgG1抗體；包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 4中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 3中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 2中所列之CDR1結構域；且包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 8中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 7中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 6中所列之CDR1結構域。
33. 如第31項或第32項之方法，其中該溫度為36至38攝氏度。
34. 如第31項或第32項之方法，其中平均溫度為36.5至37.5攝氏度。
35. 如第31項或第32項之方法，其中該溫度為約37攝氏度之平均溫度。
36. 如第1項至第35項中任一項之方法，其中該製備培養基具有36至38攝氏度之溫度範圍。
37. 如第36項之方法，其中該溫度範圍為36.5至37.5攝氏度。
38. 如第36項之方法，其中該溫度為約37攝氏度之平均溫度。
39. 如第1項至第38項中任一項之方法，其中該製備培養基具有在6.5至7範圍內之pH值。
40. 如第39項之方法，其中該製備培養基具有在6.8至7.0範圍內之pH值。
41. 如第1項至第40項中任一項之方法，其中在該製備階段期間該製備培養基具有維持在約7 g/L下或更低之葡萄糖含量。
42. 如第1項至第41項中任一項之方法，其中該製備階段為14天或更短時間。
43. 如第1項至第42項中任一項之方法，其中該製備階段在10天至17天範圍內。
44. 如第1項至第43項中任一項之方法，其在大規模生物反應器中進行。
45. 如第44項之方法，其中該大規模生物反應器選自由以下組成之群：200公升(L)生物反應器、2000 L生物反應器、3000 L及6000 L生物反應器。
46. 如第1項至第45項中任一項之方法，其中該製備階段產生大於3 g/L之該人類化抗α4β7抗體效價。
47. 如第46項之方法，其中該人類化抗α4β7抗體之效價為約3至約8 g/L。
48. 如第46項之方法，其中該人類化抗α4β7抗體之效價為約5至約7 g/L。
49. 如第1項至第48項中任一項之方法，其中該哺乳動物宿主細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
50. 如第49項之方法，其中該CHO細胞為GS-CHO細胞。
51. 如第1項至第50項中任一項之方法，其中該人類化抗α4β7抗體包含含有如SEQ ID NO: 1中所列之胺基酸序列的重鏈可變結構域，且包含含有如SEQ ID NO: 5中所列之胺基酸序列的輕鏈可變結構域。
52. 如第1項至第50項中任一項之方法，其中該人類化抗α4β7抗體為維多珠單抗。
53. 一種組合物，其包含使用如第1項至第52項之方法中之任一者製備的人類化抗α4β7抗體。
54. 如第53項之組合物，其包含人類化抗α4β7抗體之群體，其具有92%或更多之去唾液酸基-去半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G0F)、去唾液酸基-單半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G1F)及/或去唾液酸基-二半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G2F)糖基化變異體總量。
55. 一種製備具有降低量之人類化抗α4β7抗體之G0F糖型(如藉由親水性相互作用層析(HILIC)所測定)之組合物的方法，該方法包括
在製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，及
將包含尿苷、錳及半乳糖之補充物添加至該製備培養基中，由此與在不存在該補充物之情況下培養之表現該人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，製備具有降低量之該人類化抗α4β7抗體之該G0F糖型的組合物，
其中該哺乳動物宿主細胞經遺傳工程化以表現人類化抗α4β7抗體，其為IgG1抗體；包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 4中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 3中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 2中所列之CDR1結構域；且包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 8中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 7中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 6中所列之CDR1結構域。
56. 如第55項之方法，其中與在不存該補充物在之情況下培養之表現該人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，該組合物包含含量降低至少約15%之該人類化抗α4β7抗體之該G0F糖型。
57. 如第55項之方法，其中與在不存在該補充物之情況下培養之表現該人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，該組合物包含減少至少約20%之該人類化抗α4β7抗體之該G0F糖型。
58. 一種製備具有約65%或更少之人類化抗α4β7抗體之G0F糖型(如藉由HILIC所測定)之組合物的方法，該方法包括
在製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，及
將包含尿苷、錳及半乳糖之補充物添加至該製備培養基中，由此製備具有約65%或更少之該人類化抗α4β7抗體之G0F糖型的組合物，
其中該哺乳動物宿主細胞經遺傳工程化以表現人類化抗α4β7抗體，其為IgG1抗體，包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 4中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 3中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 2中所列之CDR1結構域；且包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 8中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 7中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 6中所列之CDR1結構域。
59. 如第58項之方法，其中該組合物包含約60%或更少之該人類化抗α4β7抗體之G0F糖型。
60. 如第58項之方法，其中該組合物包含約55%或更少之該人類化抗α4β7抗體之G0F糖型。
61. 一種製備具有增加量之人類化抗α4β7抗體之G1F糖型(如藉由HILIC所測定)之組合物的方法，該方法包括
在製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，及
將包含尿苷、錳及半乳糖之補充物添加至該製備培養基中，由此與在不存在該補充物之情況下培養之表現該人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，製備具有增加量之該人類化抗α4β7抗體之該G1F糖型的組合物，
其中該哺乳動物宿主細胞經遺傳工程化以表現人類化抗α4β7抗體，其為IgG1抗體；包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 4中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 3中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 2中所列之CDR1結構域；且包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 8中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 7中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 6中所列之CDR1結構域。
62. 如第61項之方法，其中與在不存在該補充物之情況下培養之表現該人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，該組合物包含增加至少約2倍之該人類化抗α4β7抗體之該G1F糖型。
63. 如第61項之方法，其中與在不存在該補充物之情況下培養之表現該人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，該組合物包含增加至少約3倍之該人類化抗α4β7抗體之該G1F糖型。
64. 一種製備具有約25%或更多之人類化抗α4β7抗體之G1F糖型(如藉由HILIC所測定)之組合物的方法，該方法包括
在製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，及
將包含尿苷、錳及半乳糖之補充物添加至該製備培養基中，由此製備具有約25%或更多之該人類化抗α4β7抗體之G1F糖型的組合物，
其中該哺乳動物宿主細胞經遺傳工程化以表現人類化抗α4β7抗體，其為IgG1抗體，包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 4中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 3中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 2中所列之CDR1結構域；且包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 8中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 7中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 6中所列之CDR1結構域。
65. 如第64項之方法，其中該組合物包含約30%或更多之該人類化抗α4β7抗體之G1F糖型。
66. 一種製備具有增加量之人類化抗α4β7抗體之G2F糖型(如藉由HILIC所測定)之組合物的方法，該方法包括
在製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，及
將包含尿苷、錳及半乳糖之補充物添加至該製備培養基中，由此與在不存在該補充物之情況下培養之表現該人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，製備具有增加量之該人類化抗α4β7抗體之該G2F糖型的組合物，
其中該哺乳動物宿主細胞經遺傳工程化以表現人類化抗α4β7抗體，其為IgG1抗體；包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 4中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 3中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 2中所列之CDR1結構域；且包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 8中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 7中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 6中所列之CDR1結構域。
67. 如第66項之方法，其中與在不存在該補充物之情況下培養之表現該人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，該組合物包含增加至少約3倍之該人類化抗α4β7抗體之該G2F糖型。
68. 如第66項之方法，其中與在不存在該補充物之情況下培養之表現該人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，該組合物包含增加至少約4倍之該人類化抗α4β7抗體之該G2F糖型。
69. 一種製備具有約3%或更多之人類化抗α4β7抗體之G2F糖型(如藉由HILIC所測定)之組合物的方法，該方法包括
在製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，及
將包含尿苷、錳及半乳糖之補充物添加至該製備培養基中，由此製備具有約3%或更多之該人類化抗α4β7抗體之G2F糖型的組合物，
其中該哺乳動物宿主細胞經遺傳工程化以表現人類化抗α4β7抗體，其為IgG1抗體，包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 4中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 3中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 2中所列之CDR1結構域；且包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 8中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 7中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 6中所列之CDR1結構域。
70. 如第69項之方法，其中該組合物包含約4%或更多之該人類化抗α4β7抗體之G2F糖型。
71. 如第55項至第70項中任一項之方法，其中將該補充物添加至該製備培養基中或添加至隨後添加至該製備培養基中之饋料培養基中。
72. 如第71項之方法，其中該饋料培養基包含約15至100 mM尿苷。
73. 如第72項之方法，其中該饋料培養基包含約20至50 mM尿苷。
74. 如第71項之方法，其中該饋料培養基包含約0.02至0.3 mM錳。
75. 如第74項之方法，其中該饋料培養基包含約0.02至0.1 mM錳。
76. 如第71項之方法，其中該饋料培養基包含85 mM-600 mM半乳糖。
77. 如請求項76之方法，其中該饋料培養基包含85 mM-100 mM半乳糖。
78. 如第55項至第77項中任一項之方法，其中該製備培養基進一步包含鋅。
79. 如第78項之方法，其中該製備培養基中鋅之濃度為約50 μM至150 μM。
80. 如第55項至第79項中任一項之方法，其中相對於在不存在該補充物之情況下培養之表現該人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞中產生之酸性種類之百分比，該方法進一步降低該人類化抗α4β7抗體之酸性種類之百分比。
81. 如第55項至第80項中任一項之方法，其中相對於在不存在添加至該製備培養基中之包含尿苷、錳及半乳糖之饋料培養基的情況下產生之主要同種型種類之百分比，該方法進一步增加該人類化抗α4β7抗體之主要同種型種類之百分比。
82. 如第55項至第81項中任一項之方法，其中該方法為分批饋料方法。
83. 如第82項之方法，其中在製備階段之約第四天開始將該饋料培養基添加至該製備培養基中。
84. 如第1項至第83項中任一項之方法，其中該製備培養基具有約6.8至約7.1之pH值。
相關申請案
本申請案主張於2019年6月10日申請之美國臨時申請案第62/859,563號及於2019年6月10日申請之美國臨時申請案第62/859,596號的優先權。前述優先申請案之全部內容以引用之方式併入本文中。I. 定義
為使本發明可更容易理解，首先定義某些術語。
細胞表面分子「α4β7整合素」或「α4β7」(在通篇中可互換使用)為α4鏈(CD49D、ITGA4)及β7鏈(ITGB7)之異二聚體。人類α4-整合素及β7-整合素基因基因庫(National Center for Biotechnology Information,Bethesda, Md.) RefSeq登錄號分別為NM_000885及NM_000889)由B淋巴細胞及T淋巴細胞(特定而言為記憶性CD4+淋巴細胞)表現。許多整合素中之典型α4β7可以靜息或活化狀態存在。α4β7之配位體包括血管細胞黏附分子(VCAM)、纖連蛋白及黏膜地址素(MAdCAM (例如MAdCAM-1))。結合於α4β7整合素之抗體在本文中稱為「抗α4β7抗體」。
如本文所用，「對α4β7複合物具有結合特異性」之抗體或其抗原結合片段結合於α4β7，但不結合於α4β1或αE
B7。維多珠單抗為對α4β7複合物具有結合特異性之抗體的實例。
術語「約」表示跟在值後的並非精確值，而為值+/-5%之值的範圍之中心點。若值為以百分比給出之相對值，則術語「約」亦表示跟在值後的並非精確值，而為值+/-5%之範圍的中心點，藉此範圍之上限不能超過值之100%。
如本文所用，術語「聚集物」係指兩個或更多個抗體或抗體片段之締合。舉例而言，聚集物可為抗體及/或抗體片段之二聚體、三聚體、四聚體或大於四聚體之多聚體。抗體聚集物可為可溶性或不溶性的。聚集分子之間的締合可為共價或非共價的，不管使其締合機制為何。締合可為聚集分子之間直接締合或通過將其鍵聯在一起之其他分子間接締合。後者之實例包括但不限於與其他蛋白質二硫鍵鍵聯、與脂質疏水性締合、與DNA電荷締合、與浸出之蛋白質A親和力締合或與多種組分混合模式締合。聚集物可在細胞培養中之蛋白質表現期間、在下游加工中之蛋白質純化期間或在藥物產品之儲存期間不可逆地形成。溶液中聚集物之存在可使用例如尺寸排阻層析法(SEC) (例如使用UV偵測之SEC、使用光散射偵測之SEC (SEC-LSD))、場流分級法、分析超速離心沈降速度或毛細管電泳-十二烷基硫酸鈉(CE-SDS，還原及非還原)來確定。
如本文所用之術語「抗體」意在指包含藉由二硫鍵相互連接之四條多肽鏈(兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈)之免疫球蛋白分子。各重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為HCVR或VH)及重鏈恆定區(CH)。重鏈恆定區包含三個結構域：CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為LCVR或VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個結構域(CL)。VH及VL區可進一步再分成稱為互補決定區(CDR)之高變異性區域，其間分散有稱為構架區(FR)之較保守的區域。各VH及VL由三個CDR及四個FR組成，自胺基端至羧基端按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在一些實施例中，抗體具有片段可結晶(Fc)區。在某些實施例中，抗體為IgG1同型且具有κ輕鏈。
如本文所用，術語「帶電荷之種類」、「帶電荷之同種型」或「帶電荷之同種型種類」係指以不同於抗體之主要種類或其抗原結合部分的總電荷為特徵之抗體變異體或其抗原結合部分(例如維多珠單抗或其抗原結合部分)。抗體之帶電荷之同種型種類或其抗原結合部分可藉由此項技術中已知之各種方法來偵測，諸如陽離子交換層析(CEX)，例如陽離子交換-高效液相層析(CEX-HPLC)、CEX-質譜法或等電聚焦。舉例而言，一般而言，當使用CEX、CEX-HPLC或CEX-質譜法解析抗體製劑時，大部分抗體以作為彼抗體之主導(主要)同種型之特徵的滯留時間自CEX樹脂溶離。此可藉由繪製抗體自樹脂溶離之量隨在CEX樹脂上之滯留時間而變的曲線而可視化。當以此方式可視化時，抗體之主要同種型或其抗原結合部分為最大峰內自CEX樹脂溶離之抗體或其抗原結合部分的級分。使用此方法，可藉由具有不同於主要同種型之滯留時間來鑑定帶電荷之同種型種類。舉例而言，當藉由CEX、CEX-HPLC或CEX-質譜法偵測帶電荷之同種型種類時，酸性同種型種類可以與抗體之主要同種型或其抗原結合部分相比較短的滯留時間自樹脂溶離，且鹼性同種型種類可以與抗體之主要同種型或其抗原結合部分相比較長的滯留時間自樹脂溶離。
如本文所用，術語「酸性種類」或「酸性同種型種類」係指以總體酸性電荷為特徵之抗體變異體或其抗原結合部分(例如維多珠單抗或其抗原結合部分)。抗體之酸性種類或其抗原結合部分可藉由此項技術中已知之各種方法來偵測，諸如陽離子交換層析(CEX)，例如陽離子交換-高效液相層析(CEX-HPLC)、CEX-質譜法或等電聚焦。一般而言，抗體之酸性種類或其抗原結合部分以與抗體之主要同種型或其抗原結合部分相比較短的滯留時間自CEX樹脂溶離。抗體之酸性種類可包括但不限於電荷變異體、結構變異體及/或片段化變異體。在一些實施例中，包含抗體或其抗原結合部分之組合物可包含超過一種類型之酸性同種型種類。在一些實施例中，可基於CEX-HPLC分離期間之滯留時間的差異鑑定多個酸性同種型種類。舉例而言，當使用CEX分析包含抗體(例如維多珠單抗)之組合物時，可鑑定一或多個酸性同種型峰，其各自表示抗體之一或多個酸性同種型種類。
如本文所用，術語「鹼性種類」或「鹼性同種型種類」係指以總體鹼性電荷為特徵之抗體變異體或其抗原結合部分，例如維多珠單抗。抗體之鹼性種類或其抗原結合部分可藉由此項技術中已知之各種方法來偵測，諸如陽離子交換層析(CEX)，例如陽離子交換-高效液相層析(CEX-HPLC)、CEX-質譜法或等電聚焦。一般而言，抗體之鹼性種類或其抗原結合部分以與抗體之主要同種型或其抗原結合部分相比較長的滯留時間自CEX樹脂溶離。抗體之鹼性種類可包括但不限於電荷變異體、結構變異體及/或片段化變異體。在一些實施例中，包含抗體或其抗原結合部分之組合物可包含超過一種類型之鹼性同種型種類。在一些實施例中，可基於CEX-HPLC分離期間之滯留時間的差異鑑定多個鹼性同種型種類。舉例而言，當使用CEX分析包含抗體(例如維多珠單抗)之組合物時，可鑑定一或多個鹼性同種型峰，其各自表示抗體之一或多個鹼性同種型種類。在一個實施例中，維多珠單抗之鹼性同種型為具有羧基端離胺酸(C-Lys)之維多珠單抗。根據一級序列不與抗體或其抗原結合部分有關之宿主細胞雜質或其他雜質不被視為抗體之「鹼性種類」或「鹼性同種型種類」或其抗原結合部分。
「CDR」或「互補決定區」為分散於稱為「構架區」(FR)之較保守區域內之高變異性區域。
如本文所用，術語抗體之「抗原結合片段」或「抗原結合部分」係指Fab、Fab'、F(ab')2
及Fv片段、單鏈抗體、官能性重鏈抗體(奈米抗體)以及抗體之對至少一個所需抗原決定基具有特異性之任何部分，其與完整抗體競爭特異性結合(例如互補決定區之具有充足構架序列以便特異性結合於抗原決定基之經分離部分)。抗原結合片段可藉由重組技術或藉由抗體之酶促或化學裂解來產生。
如本文所用，術語「人類化抗體」係指衍生自非人類抗體(例如鼠)且保留或實質上保留母體抗體之抗原結合特性但在人類中之免疫原性較小的抗體。
使用細胞培養方法由重組哺乳動物宿主細胞株產生之多肽(諸如抗體)稱為「重組多肽」、「蛋白質」或就抗體而言為「重組抗體」。所表現之蛋白質可在細胞內產生或分泌至可自其中進行回收及/或收集之培養基中。在一個實施例中，重組抗體為重組抗α4β7抗體，例如特異性結合於α4β7複合物之抗體，諸如維多珠單抗。因為本文所描述之方法及組合物係關於用於製備重組抗體之組合物及細胞培養方法，故除非另外指明，否則術語「抗體」在本文中可與術語「重組抗體」互換使用。
術語「重組宿主細胞」或「宿主細胞」係指已經遺傳工程化以表現重組多肽(例如抗體)之細胞。在一個實施例中，重組宿主細胞包含含有編碼抗體重鏈、輕鏈或兩者之核酸之表現載體。應瞭解，術語「宿主細胞」旨在不僅指特定本發明細胞，而且指此類細胞之後代。由於後續各代中可能歸因於突變或環境影響而產生某些修飾，故此類後代事實上可不與親本細胞相同，但其仍包括在如本文所用之術語「宿主細胞」範圍內。另外，應瞭解，除非另外指定，否則在使用術語「細胞」，例如宿主細胞、哺乳動物細胞或哺乳動物宿主細胞之情況下，該術語旨在包括細胞群體。
如本文所用，術語「細胞培養方法」總地來說指與重組多肽(例如抗體)製備相關之細胞培養階段。術語「細胞培養方法」總體上指使細胞生長或維持在控制條件下之方法。細胞培養方法可在活體外或離體進行。在一些實施例中，細胞培養方法具有擴增階段與製備階段兩者。在一些實施例中，擴增及製備階段由過渡或轉變階段隔開。「培養」細胞係指使細胞與細胞培養基在適合於生長或維持細胞之條件下接觸。在某些實施例中，細胞培養係指用於產生或維持能夠產生相關重組多肽(例如抗α4β7抗體)之宿主細胞群體的方法。舉例而言，在表現載體已併入適當哺乳動物宿主細胞(例如中國倉鼠卵巢(CHO)宿主細胞)中後，可將宿主在適合於表現相關核苷酸編碼序列之條件下培養。「細胞培養物」亦可指含有細胞之溶液。
術語「培養基(medium)」及「細胞培養基」(複數「培養基(media)」)係指用於使細胞生長或維持細胞之營養物來源。如熟習此項技術者所瞭解，營養物來源可含有細胞生長及/或存活所需之組分或可含有幫助細胞生長及/或存活之組分。維生素、必需或非必需胺基酸(例如半胱胺酸及胱胺酸)及痕量元素(例如銅)為培養基組分之實例。細胞培養基之實例包括生長培養基及製備培養基。
細胞培養基亦可補充有例如「培養基補充物」或「補充物」，且組分中之任何一或多者例如藉由增加重組多肽產量或改良細胞活力來輔助細胞培養方法。在一個實施例中，補充物不與細胞培養基一起調配，例如不與製備培養基或饋料培養基一起調配。補充物可經製備呈濃縮形式，其中其與饋料溶液或培養基之組合產生最終較低濃度之補充組分。補充物可包含已存在於起始(例如儲備或基礎)培養基中之一或多種組分，及/或補充物可包含對培養基而言之一或多種新的組分。在一個實施例中，將補充物添加至饋料溶液中。
根據細胞類型、生長模式及產物(相關蛋白質)特徵，補充物可影響細胞培養之特定態樣，例如改良細胞生長或增加重組多肽產量。可藉由補充物添加之物質的實例包括但不限於一或多種痕量元素、一或多種激素、一或多種胺基酸、一或多種維生素、一或多種脂肪酸、一或多種非離子洗滌劑、一或多種核苷酸及/或一或多種糖。在一些實施例中，補充物包含胰島素、植物水解產物及/或動物水解產物。可在細胞培養方法之一個時期或在其多個時期添加一或多種補充物。
細胞培養基及/或補充物可在特定程度上為「確定」的或「不確定」的，因為基於組分之性質，例如是否以諸如元素、無機鹽或有機離子或糖中之一或多者的已知化學組合物的形式供應或是否以複合組分(諸如混合物，例如水解產物)形式供應，變異性來源可能為已知或未知的。複合組分(諸如蛋白質或水解產物)存在於培養基中使確定程度降低。
術語「生長階段」、「生長期」、「擴增階段」及「擴增期」在本文中可互換使用，指期間所培養之宿主細胞快速分裂及增加數目的時間段。在擴增階段期間，通常可在生長培養基(或擴增培養基)中且在經設計以使細胞增殖最大化之條件下培養細胞。生長階段之時間可在製備階段之前(例如在分批培養中)，藉此兩個階段可能(或可能不)由過渡階段隔開。
如本文所用之術語「製備階段」或「製備期」係指期間宿主細胞產生最大量之重組多肽(諸如重組抗體)之時間段。製備階段典型地以與擴增階段期間相比細胞分裂較少為特徵，且亦可包括使用經設計以使多肽產量最大化之培養基及培養條件。
術語「生長培養基」係指有利於所培養細胞之生長(亦即，數目增加)的細胞培養基且在細胞培養方法之生長或擴增階段期間使用。
「製備培養基」為有利於重組多肽(例如相關抗體，例如抗α4β7抗體)之產生的細胞培養基。
如本文所用，「饋料溶液」或「饋料培養基」係指添加至生長或製備培養基中之細胞培養物中以改良或維持在生長或製備培養基中由細胞產生之蛋白質的態樣的細胞培養基。舉例而言，可添加饋料溶液以維持由細胞產生之某一蛋白質效價水準。饋料溶液為此項技術中已知的。在一個實施例中，為饋料溶液補充經鑑定有益於哺乳動物細胞產生蛋白質之其他營養物。
應瞭解，生長亦可在製備培養基中發生且製備可在生長培養基中進行，使得生長及製備培養基可為相同的。然而，在一個實施例中，製備培養基經選擇有利於在比若採用生長培養基更大之程度上產生相關多肽。
如本文所用，術語「分批培養」係指在培養製程開始時將用於細胞培養之所有組分(包括細胞及所有培養營養物)供應至培養容器之培養。
如本文所用，術語「分批饋料細胞培養」係指如下分批培養，其中最初將細胞及培養基供應至培養容器，且在培養製程期間將其他補充物(例如營養物)連續地或以離散增量饋送(經由饋料溶液)至培養物中，且在終止培養之前進行或不進行週期性細胞及/或產物收穫。
如本文所用，術語「灌注培養」係指如下培養，其中在培養製程開始時將細胞及補充物供應至培養容器且將另一補充物連續饋送至培養物中，同時在培養製程期間連續地自培養基收穫產物。
如本文所用，術語「載體」旨在指能夠轉運與其鍵聯之另一核酸的核酸分子。一種類型之載體為「質粒」，其指其他DNA區段可連結至其中之環狀雙股DNA。另一類型之載體為噬菌體載體。另一類型之載體為病毒載體，其中其他DNA區段可連結至病毒基因組中。某些載體能夠在其引入之宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點之細菌載體及附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如非附加型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞後整合至宿主細胞之基因組中，且由此與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠引導與其可操作地鍵聯之基因的表現。此類載體在本文中稱為「重組表現載體」或簡稱為「表現載體」。一般而言，用於重組DNA技術中之表現載體常常呈質粒形式。
「核酸」係指任何長度之核苷酸聚合物，且包括DNA及RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾核苷酸或鹼基及/或其類似物或可由DNA或RNA聚合酶或藉由合成反應併入聚合物中之任何受質。聚核苷酸可包含經修飾核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。可在聚合物組裝之前或之後賦予對核苷酸結構之修飾(若存在)。
「經分離之核酸」意謂且涵蓋在通常背景以外或與通常背景分離之非天然存在、重組或天然存在之序列。經分離之核酸分子不同於其在自然界中被發現之形式或設置。因此，經分離之核酸分子不同於其存在於天然細胞中時之核酸分子。然而，經分離之核酸分子包括含於通常表現蛋白質之細胞中的核酸分子，其中例如核酸分子位於不同於天然細胞之染色體位置。
如本文所用，「經純化」(或「經分離」)係指核酸分子(例如聚核苷酸)或胺基酸分子(例如多肽或蛋白質)實質上不含其他組分。在一些實施例中，經純化聚核苷酸或經純化多肽移除了存在於產生它之環境中之其他組分或與存在於產生它之環境中之其他組分分離。舉例而言，經分離多肽為與產生它之細胞之其他組分(例如內質網或胞漿蛋白及RNA)分離的多肽。經分離之聚核苷酸為與其他核組分(例如組蛋白)及/或與上游或下游核酸序列分離之聚核苷酸。
術語「培養容器」係指用於培養細胞之容器。培養容器可具有任何尺寸，只要其適用於培養細胞即可。
如本文所用，術語「接種(inoculation/seeding)」係指將細胞添加至培養基中以開始培養或指將細胞培養物提供至生物反應器或用於培養之另一容器中之製程。細胞可先前已在另一生物反應器或容器中增殖。或者，細胞可已經冷凍且在將其提供至生物反應器或容器中之前即刻解凍。該術語係指任何數目之細胞，包括單一細胞。
如本文所用之術語「效價」係指藉由細胞培養產生之重組表現多肽(例如抗體)之總量除以給定量之培養基體積。效價典型地以每毫升培養基之抗體毫克數或每公升培養基之公克數的單位表示。效價可以相對量測，諸如與在不同培養條件下獲得蛋白質產物相比之效價增長百分比來表示或評估。
如本文所用，例如用於由宿主細胞分泌之所表現蛋白質的術語「收穫」係指將細胞培養基(含有相關所表現蛋白質)與細胞培養物之細胞及細胞碎屑分離。(用於不分泌之蛋白質的收穫將收集細胞且棄去培養基。)含有相關蛋白質之培養基稱為「條件培養基」。使用若干技術中之任一者進行收穫，包括但不限於離心、微量過濾、深度過濾及經絕對孔徑膜過濾。在收穫之後，用於例如自上清液或自細胞分離所需蛋白質之包括淨化之後續步驟通常被視為純化步驟。
術語「淨化收穫」係指衍生自條件培養基之液體材料含有相關重組多肽，例如抗α4β7抗體。淨化收穫係獲自已經歷一或多個方法步驟以將相關多肽與細胞培養物之細胞及細胞碎屑分離及/或自液體移除較精細之固體粒子及微粒雜質的細胞培養基。此類分離技術之實例包括但不限於沈降、絮凝、離心及/或過濾。
如本文所用，在重組多肽(例如抗體)製備之情形中，術語「上游方法」係指涉及自細胞產生及收集之多肽(例如抗體)的活動(例如在相關蛋白質(例如抗體)之細胞培養期間)。
如本文所用，術語「下游方法」係指在上游方法之後用於純化相關蛋白質(例如抗體)之一或多種技術。舉例而言，下游方法包括使用例如親和層析(包括蛋白質A親和層析)、尺寸排阻層析、離子交換層析(諸如陰離子或陽離子交換層析)、疏水相互作用層析(HIC)或置換層析對蛋白質產物之純化。
如本文所用，術語「糖基化型態」係指包含寡醣之轉譯後修飾之種類的複合物。關於抗α4β7抗體，糖基化型態描述抗體之Fc區中的N
-鍵聯糖基化。關於維多珠單抗，糖基化型態係指鍵聯至重鏈SEQ ID NO:13之天冬醯胺301之糖基化種類。II. 本發明之方法及組合物
本文提供用於在哺乳動物(例如非人類)細胞培養中製備抗α4β7抗體(諸如維多珠單抗)之方法及組合物。本發明至少部分係基於可用於在哺乳動物細胞培養中達成大於1 g/L (例如3-10 g/L、4-8 g/L或5-7 g/L)之高抗α4β7抗體效價水準的細胞培養參數。本文亦描述用於達成降低含量之抗α4β7抗體(諸如維多珠單抗)之鹼性同種型的方法及組合物；用於達成抗α4β7抗體(諸如維多珠單抗)之低聚集物含量的方法及組合物；及用於達成抗α4β7抗體(諸如維多珠單抗)之特定聚醣形式的方法及組合物。本文亦提供包含抗α4β7抗體(諸如維多珠單抗)之組合物，其具有降低含量之鹼性同種型種類；低含量之高分子量聚集物；及/或特定聚醣形式。
特定而言，本文所揭示之方法及組合物可用於製備抗α4β7抗體維多珠單抗，或具有維多珠單抗之抗原結合區的抗體。維多珠單抗亦因其商標名ENTYVIO®
(Takeda Pharmaceuticals, Inc.)而為人所知。維多珠單抗為包含突變人類IgGl構架區及來自鼠抗體Act-1 (其描述於以引用之方式併入本文中之美國專利第7,147,851號中)之抗原結合性CDR的人類化抗體。
維多珠單抗特異性結合於α4β7整合素且阻斷α4β7整合素與黏膜地址素細胞黏附分子-1 (MAdCAM-1)及纖連蛋白之相互作用且抑制記憶性T-淋巴細胞之遷移穿過內皮進入發炎之胃腸道薄壁組織。維多珠單抗不結合於α4β1及αEβ7整合素或抑制其功能且不拮抗α4整合素與血管細胞黏附分子-1 (VCAM-1)之相互作用。
α4β7整合素在優先遷移至胃腸道中之記憶性T-淋巴細胞之離散子集的表面表現。MAdCAM-1在腸道內皮細胞上表現且在使T-淋巴細胞歸巢至腸道淋巴組織中發揮關鍵作用。α4β7整合素與MAdCAM-1之相互作用已被認為是黏膜炎症(諸如作為潰瘍性結腸炎及克羅恩氏病(Crohn's disease)之標誌的慢性炎症)之重要貢獻者。維多珠單抗可用於治療炎性腸道疾病，包括克羅恩氏病及潰瘍性結腸炎、HIV、結腸袋炎(包括慢性結腸袋炎)、瘺管性克羅恩氏病、移植物抗宿主疾病及乳糜瀉。
維多珠單抗之重鏈可變區提供於SEQ ID NO:1中，且維多珠單抗之輕鏈可變區提供於SEQ ID NO:5中。維多珠單抗包含含有SEQ ID NO:2中所描述之CDR1、SEQ ID NO:3中所描述之CDR2及SEQ ID NO:4中所描述之CDR3的重鏈可變區。維多珠單抗包含含有SEQ ID NO:6中所描述之CDR1、SEQ ID NO:7中所描述之CDR2及SEQ ID NO:8中所描述之CDR3的輕鏈可變區。編碼輕鏈可變區之核酸序列列於SEQ ID NO:9中。編碼重鏈可變區之核酸序列列於SEQ ID NO:10中。編碼維多珠單抗之輕鏈的全長核酸序列以SEQ ID NO:11列出且編碼維多珠單抗之重鏈的全長核酸序列以SEQ ID NO:12列出。編碼維多珠單抗之核酸序列亦描述於美國專利公開案第2010/0297699號中，該專利公開案之全部內容併入本文中。維多珠單抗及維多珠單抗之序列進一步描述於美國專利公開案第2014/0341885號及美國專利公開案第2014/0377251號中，該等專利公開案之全部內容各自明確地以全文引用之方式併入本文中。
本文所提供之方法及組合物適用於在哺乳動物細胞中製備抗α4β7抗體，特定而言為維多珠單抗或具有維多珠單抗之結合區(亦即CDR或可變區)的抗體，或抗α4β7抗體之抗原結合片段。
本文所揭示之方法及組合物係關於哺乳動物細胞培養方法。哺乳動物細胞已成為用於製備用於臨床(例如人類治療)應用之哺乳動物蛋白質的主導系統，此主要歸因於其產生適當摺疊及組裝之異源蛋白質的能力，及其轉譯後修飾(諸如類似於由人類細胞形成之彼等修飾的修飾)的能力。中國倉鼠卵巢(CHO)細胞及獲自各種其他哺乳動物來源之細胞株(諸如小鼠骨髓瘤(NS0)、幼倉鼠腎(BHK)、人類胚胎腎(HEK-293)及人類視網膜細胞)已由管理機構批准用於製備生物製藥產品，包括治療性抗體。其中，CHO細胞屬於最常用之工業宿主，其廣泛用於製備異源蛋白質。因此，用於在CHO細胞，包括二氫葉酸還原酶陰性(DHFR-)或麩醯胺合酶負性(GS-) CHO細胞中大規模製備抗體之方法為此項技術中熟知的(參見例如Trill等人, Curr. Opin. Biotechnol. 6(5):553-60 (1995)；Birch及Racher, Adv. Drug Delivery Reviews 58:671-685 (2006)及美國專利第6,610,516號)。適合用於本文所提供之組合物及方法中之CHO細胞株的實例包括但不限於GS-CHO、CHO-K1 DUX B11及DP-12 CHO細胞。適合用於本文所提供之組合物及方法中之CHO細胞亦描述於以下文件中：美國專利第4,766,075號；第4,853,330號；第5,185,259號；第5,122,464號；第5,591,639號；第5,879,936號；Lubiniecki等人, Advances in Animal Cell Biology and Technology forBioprocesses, Spier等人編. (1989), 第442-451頁。適合用於本文中之已知CHO衍生物包括例如CHO/-DHFR (Urlaub及Chasin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980))、CHO-K1 DUX B11 (Simonsen及Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2495-2499(1983)；Urlaub及Chasin，同上)，及DP-12 CHO細胞(1989年3月15日公佈之EP 307,247，或美國專利第5,721,121號)。
適合之哺乳動物細胞株之其他實例包括由SV40轉型之猴腎CVI株(COS-7，ATCCTM
CRL 1651)；人類胚胎腎株293S (Graham等人, J. Gen. Virolo., 36:59 (1977))；幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCCTM
CCL 10)；小鼠足細胞(TM4，Mather, Biol. Reprod., 23:243 (1980))；猴腎細胞(CVI-76，ATCCTM
CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCCTM
CRL-1587)；人類子宮頸癌細胞(HELA，ATCCTM
CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCCTM
CCL 34)；布法羅大鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL 3A，ATCC.RTM. CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCCTM
CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2. HB 8065)；小鼠乳房腫瘤細胞(MMT 060562，ATCCV CCL 51)；大鼠肝細胞瘤細胞(HTC，MI.54，Baumann等人, J. Cell Biol., 85:1 (1980))、3T3細胞；293T細胞(Pear,W. S.等人,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
,90
:8392-8396 (1993))；NS0細胞(Sato等人. Tissue Culture Association
, 24:1223 (1988))；SP2/0 (Sato等人. J. Exp. Med.
, 165:1761 (1987))；及TR-1細胞(Mather等人, Annals N.Y. Acad. Sci.,383:44 (1982))及雜交瘤細胞株。
雖然許多宿主細胞類型能夠產生所編碼之重組多肽，但在一種宿主細胞中產生之由特定核酸編碼之產物可不同於另一宿主細胞中由彼核酸編碼之產物。差異可存在於一或多種生物化學特性中。生物化學特性之實例包括基礎蛋白質結構，諸如一級、二級或三級結構；或轉譯後修飾，諸如信號肽加工、糖基化、N端乙醯化、脂化或磷酸化。特定差異可視細胞之酶促機制及/或培養基或生長條件而定。對於重組治療性抗體，生物化學特性之改變可影響一或多種抗體特徵，諸如結合能力、抗體效應功能、免疫原性、清除率、溶解度或儲存穩定性。
在一些實施例中，與參考產物有差異之產物可藉由純化(例如下游方法技術)減少或消除。在其他實施例中，與參考產物有差異之產物可藉由控制細胞之酶促機制(例如上游方法技術)減少或消除。在一些實施例中，控制細胞之酶促機制包括使細胞突變以重組修飾其遺傳背景，例如突變或改變酶之表現。在一些實施例中，控制細胞之酶促機制包括控制培養基中之成分，諸如提供特定培養基或添加一或多種補充物。在一些實施例中，控制細胞之酶促機制包括維持或調節生長條件，諸如溫度、pH值或大氣氣體。
已描述製備抗α4β7抗體(諸如維多珠單抗)之方法(參見例如美國專利第7,402,410號及美國專利申請公開案第20070122404號)。在此等公開案中，描述了抗體之某些特徵，例如結合親和力、效應功能及生物化學特性，諸如電荷型態、分子量及糖基化模式。當在NS0細胞中培養時，抗體具有某些特徵，當在CHO細胞中培養時該等特徵有所改變。當變為CHO細胞之不同變異體，例如自DHFR-細胞變為GS-細胞時，重組蛋白(例如抗體)之特徵亦可改變。本文描述例如在重組蛋白(例如抗體)之製備中控制此等變化且當在GS-CHO細胞(本文中亦簡稱為「GS-CHO」細胞)中表現抗體(例如維多珠單抗)時限制特徵之改變或使特徵之改變最小化的方法及培養基組合物。在某些實施例中，本文描述用於在GS-CHO細胞中製備抗α4β7抗體(諸如維多珠單抗)之方法及組合物。
當在細胞培養中製備抗α4β7抗體(諸如維多珠單抗)時可改變之特徵的實例包括其電荷型態、糖基化型態及高分子量(HMW)雜質種類。諸如溫度、pH值、剪切應力、溶解氧及培養基組成之培養條件可促成改變之特性。酶之電荷可因存在或不存在C端離胺酸、N端焦麩胺酸或唾液酸之變化及/或去醯胺化或氧化之變化而改變。糖基化型態可因諸如存在或不存在唾液酸或末端半乳糖、高甘露糖種類之加工的變化而改變(參見Hossler等人(2009)Glycobiology
19:936-949)。培養基補充物可控制此類變化。
在一些實施例中，細胞培養中所製備之抗α4β7抗體之包括但不限於電荷變化、聚醣變化及聚集物含量的特徵可藉由調節培養基(例如製備階段培養基)中之糖(例如半乳糖)、金屬共因子(例如錳)及/或核苷(例如尿苷)的量加以控制。在一些實施例中，細胞培養中所製備之抗α4β7抗體之包括但不限於電荷變化、聚醣變化及聚集物含量的特徵可藉由調節培養基(例如製備階段培養基)中之離胺酸及精胺酸的量加以控制。在一些實施例中，細胞培養中所製備之抗α4β7抗體之包括但不限於電荷變化、聚醣變化及聚集物含量的特徵可藉由調節用於培養基(例如製備階段培養基)中之鋅的量加以控制。另外，在製備期間可採用溫度轉變。雖然此項技術中已知溫度轉變可證實有益於抗體製備(Moore等人. (1997)Cytotechnology
23:47-54)，但本文提供基於維持細胞培養溫度之方法，亦即，其中培養條件不包括實質性轉變，例如高於或低於37攝氏度超過1度。A. 鋅之補充
在一些實施例中，本文提供用於在製備階段期間補充鋅之CHO細胞培養中製備人類化抗α4β7抗體(例如維多珠單抗)或其抗原結合部分之方法及組合物。在一些實施例中，鋅用作培養基補充物用於控制CHO細胞培養中抗α4β7抗體之電荷變化。在其他實施例中，鋅用作培養基補充物用於控制在CHO細胞培養中所製備之抗α4β7抗體製劑中高分子量(HMW)聚集物之含量。金屬離子可呈鹽酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、溴化物鹽、乙酸鹽、硬脂酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽形式。培養基補充物可以濃縮形式與饋料一起、在批料開始時、在擴增階段期間或在製備階段中提供於培養物中。培養基補充物可以濃縮形式提供於饋料溶液中，其亦為濃縮補充物。在此類實施例中，可根據補充物製備之各個時期將補充物稀釋超過一次。
在一些實施例中，可將金屬離子(例如鋅)添加至製備階段培養物中。用於製備抗α4β7抗體(諸如維多珠單抗)之鋅的存在可使抗體之鹼性同種型之含量降低(相對於對照方法有所降低，對照方法為除添加鋅外相同之方法)。在一些實施例中，可向製備階段培養物中添加鋅超過一次。在一個實施例中，將鋅添加在製備階段培養之起始製備培養基之補充物中。在一個實施例中，在起始天之後將鋅直接地或在饋料溶液中添加至製備培養物中，例如對於製備階段培養。在一個實施例中，將鋅添加在起始製備培養基之補充物中及起始日之後的製備培養基之補充物中，例如將鋅添加至添加至製備階段培養物中之饋料溶液中。在一些實施例中，在製備階段培養之起始日之後多次將鋅添加在補充物中。舉例而言，每天、每兩天、每三天、每四天、每一至三天、每二至四天或每週將鋅添加在補充物中。在一些實施例中，在製備階段培養之起始日之後多次添加之鋅不是在製備階段培養之第一、第二、第三、第四、第五或第六天添加，而是在此後，每天或每兩天進行添加。在一個實施例中，將鋅添加在起始培養基之補充物中及製備階段培養基之每天補充物中。在另一實施例中，將鋅添加在起始培養基之補充物中且在製備階段培養之第四天開始添加在製備階段培養基之每天補充物中。可補充鋅直至收穫之前一天、收穫之前兩天或收穫之前三天為止。在一個實施例中，將鋅添加在起始培養基之補充物中且在製備階段培養之第四天開始添加在製備階段培養基之每天補充物中直至收穫之前一天為止。
在某些實施例中，將鋅包括在製備具有約16%或更少之人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型(如藉由CEX所測定)之組合物的方法中，其中人類化抗體(例如維多珠單抗)係在包含鋅之製備培養基中在哺乳動物宿主細胞(例如GS-CHO細胞)中製備。在某些實施例中，將含有鋅之補充饋料添加至製備培養基中提供包含約14%或更少之人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型的組合物。在某些實施例中，將鋅包括在製備培養基之補充物中提供包含約13%或更少之人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型的組合物。在某些實施例中，將鋅包括在製備培養基之補充物中提供包含約12%或更少之人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型的組合物。在某些實施例中，將鋅包括在製備培養基之補充物中提供包含約11%或更少之人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型的組合物。在一些實施例中，可在細胞培養之第14天(亦即細胞培養之接種之後14天)量測鹼性同種型之含量。在其他實施例中，可在細胞培養之第15天量測鹼性同種型之含量。
在某些實施例中，將鋅包括在製備具有約70%或更多之人類化抗α4β7抗體之主要同種型(如藉由CEX所測定)之組合物的方法中，其中人類化抗體(例如維多珠單抗)係在包含鋅之製備培養基中在哺乳動物宿主細胞(例如GS-CHO細胞)中製備。在某些實施例中，將含有鋅之補充饋料添加至製備培養基中提供包含約71%或更多之人類化抗α4β7抗體之主要同種型的組合物。在某些實施例中，將含有鋅之補充饋料添加至製備培養基中提供包含約72%或更多之人類化抗α4β7抗體之主要同種型的組合物。在某些實施例中，將含有鋅之補充饋料添加至製備培養基中提供包含約73%或更多之人類化抗α4β7抗體之主要同種型的組合物。在某些實施例中，將含有鋅之補充饋料添加至製備培養基中提供包含約74%或更多之人類化抗α4β7抗體之主要同種型的組合物。在一些實施例中，可在細胞培養之第14天量測主要同種型之含量。在其他實施例中，可在細胞培養之第15天量測主要同種型之含量。
在其他實施例中，鋅補充可用於限制包含抗α4β7抗體之製劑中HMW污染物之含量。在一些實施例中，以約10-200 μM、約50-150 μM或約100-130 μM之濃度將鋅添加至培養基中可使HMW聚集物之含量降低至＜5%、＜4%、＜3%、＜2.5%、＜2%、＜1.5%或＜1% (如藉由SEC所測定)。
可將鋅直接添加至製備培養基中或在饋料補充物中添加至製備培養基中。
可對培養基(例如製備階段培養基)進行補充之鋅離子的最終濃度為10至200 μM、10至100 μM、15至90 μM、20至80 μM、10至80 μM、10至70 μM、約14至55 μM、約10至60 μM、約10至30 μM、約10至20 μM、約14 μM、約50 μM、約55 μM、約57 μM或約15 μM。如上文所描述，可多次添加鋅離子。在一個實施例中，將鋅添加至製備階段培養之製備培養基中，使得製備培養基中鋅之濃度為約2至60 μM、5至57 μM、5至50 μM、5至40 μM、8至30 μM、10至20 μM、12至15 μM或約14 μM。在一個實施例中，考慮直至在收穫時補充，製備培養基中鋅之累積濃度為約15.5 μM，其中每次補充將約1至約4 μM鋅添加至培養基中。在一個實施例中，將鋅添加至製備階段培養之製備培養基中，使得製備培養基中鋅之濃度為約50-150 μM、75-150 μM、100-150 μM、80-130 μM或100-130 μM。在一些實施例中，將鋅添加至製備階段培養之製備培養基中，使得製備培養基中鋅之濃度為約10 μM、20 μM、30 μM、40 μM、50 μM、60 μM、70 μM、80 μM、90 μM、100 μM、110 μM、120 μM、130 μM、140 μM、150 μM、160 μM、170 μM、180 μM、190 μM或200 μM。在某些情況下，起始培養物中之鋅過多可能會降低細胞之活力及/或降低抗體之效價。
在一些實施例中，將鋅添加至培養基(例如製備階段培養基)中持續10- 16天(例如10-17天、10-15天或12-14天)之時間。在一些實施例中，可將鋅補充物例如作為饋料溶液之一部分逐漸添加至細胞培養物中。舉例而言，可在第0天、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天或第14天將鋅添加至培養基中。在一些實施例中，可每天或每隔一天添加鋅。在一些實施例中，每天或每隔一天添加鋅可在細胞達至製備階段時開始。因此，在一些實施例中，可在細胞培養之第4天、第5天或第6天開始每天或每隔一天將鋅添加至製備培養基中。在一個實施例中，可自約第4天至約第10天每天添加鋅。在一個實施例中，可自約第4天至約第14天每天添加鋅。在一個實施例中，在製備階段之起始日之後以補充物形式添加鋅以按約10至80 μM之濃度對來自饋料之製備培養基進行補充，或達至約50至150 μM之濃度。在一個實施例中，添加鋅以對製備階段培養之起始培養基進行補充，使得製備培養基中鋅之濃度為約50至150 μM、2至60 μM、5至57 μM、5至50 μM、5至40 μM、8至30 μM、10至20 μM、12至15 μM或約14 μM且亦在起始日之後(例如在培養之第二天至第十天之間一天、第二天至第八天之間的一天、第二天至第六天之間的一天、第三天至第六天之間的一天或在第四天開始)以每次添加至製備階段培養物中0.1至10 μM、0.5至5 μM、0.75至4 μM、0.9至3 μM、1.0至2.7 μM或以約1.4 μM或1.9 μM進行多次添加以對製備培養基進行補充。在另一實施例中，添加鋅以對製備培養之起始培養基進行補充，使得製備培養基中鋅之濃度為約2至50 μM、5至40 μM、8至30 μM、10至20 μM、12至15 μM或約14 μM且亦在製備階段培養之第四天開始每天以每次添加至製備階段培養物中0.1至10 μM、0.5至5 μM、0.75至4 μM、0.9至3 μM、1.0至2.7 μM或以約1.4 μM或1.9 μM進行添加以對製備階段培養基進行補充。在一些實施例中，將饋料溶液添加至製備培養基中，使得製備培養基中有總鋅濃度為約10至20 μM (例如15至17 μM)之鋅添加至製備培養基中。在一些實施例中，將本文所描述之鋅補充物添加至CHO細胞培養基，例如國際專利公開案第WO98/08934A1號中所提供之培養基中，該專利公開案之全部內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，將本文所描述之鋅補充物添加至CD-CHO培養基中。在一些實施例中，將本文所描述之鋅補充物添加至CD-CHO AGT (目錄號12490-001 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中。
在一個實施例中，添加鋅以對饋料溶液進行補充，使得饋料溶液之濃度為約90至120 μM、約95至120 μM、約100至120 μM、約105至120 μM、約110至120 μM或約117 μM。可接著將此類饋料補充物添加至製備培養基中。
在一些實施例中，本文提供一種細胞培養物，其包含表現抗α4β7抗體或其抗原結合部分之宿主細胞(或宿主細胞之群體)；及包含或補充有鋅之製備培養基。在其他實施例中，本文提供一種細胞培養物，其可藉由在包含或補充有鋅之製備培養基中培養表現抗α4β7抗體或其抗原結合部分之宿主細胞來獲得。
前述細胞培養物可併有本文所描述之實施例中之任一者。舉例而言，在一些實施例中，宿主細胞為CHO細胞，例如GS-CHO細胞或DHFR-
CHO細胞。在一些實施例中，宿主細胞表現包含SEQ ID NO:1之重鏈可變區及SEQ ID NO:5之輕鏈可變區的抗體或其抗原結合部分。在一些實施例中，宿主細胞表現包含含有SEQ ID NO:2中所描述之CDR1、SEQ ID NO:3中所描述之CDR2及SEQ ID NO:4中所描述之CDR3的重鏈可變區及含有SEQ ID NO:6中所描述之CDR1、SEQ ID NO:7中所描述之CDR2及SEQ ID NO:8中所描述之CDR3的輕鏈可變區之抗體或其抗原結合部分。在一些實施例中，宿主細胞表現維多珠單抗或其抗原結合部分。在一些實施例中，宿主細胞包含SEQ ID NO:9中所列之核酸(編碼抗α4β7抗體之輕鏈可變區)及SEQ ID NO:10中所列之核酸(編碼抗α4β7抗體之重鏈可變區)。在一些實施例中，宿主細胞包含SEQ ID NO:11中所列之核酸(編碼維多珠單抗之輕鏈)及SEQ ID NO:12中所列之核酸(編碼維多珠單抗之重鏈)。
在一些實施例中，細胞培養物含有濃度為約10至100 μM、10至100 μM、約15至90 μM、約20至80 μM、約10至80 μM、約10至70 μM、約14至55 μM、約10至60 μM、約10至30 μM、約10至20 μM、約14 μM、約50 μM、約55 μM、約57 μM或約15 μM之鋅。在一些實施例中，細胞培養物含有濃度為約2至60 μM、5至57 μM、5至50 μM、5至40 μM、8至30 μM、10至20 μM、12至15 μM或約14 μM之鋅。在一些實施例中，細胞培養物含有濃度為約5至45 μM、50-150 μM、75-150 μM、100-150 μM、80-130 μM或100-120 μM之鋅。在一些實施例中，細胞培養物含有濃度為約1-10 μM、10-30 μM、30-50 μM、50-70 μM或70-90 μM之鋅。在一些實施例中，細胞培養物含有濃度為約1-30 μM、10-40 μM、20-50 μM、30-60 μM、40-70 μM或60-90 μM之鋅。在一些實施例中，細胞培養物含有濃度為約1-50 μM、20-60 μM、30-70 μM、40-80 μM或50-100 μM之鋅。在一些實施例中，細胞培養物含有濃度為約10 μM、20 μM、30 μM、40 μM、50 μM、60 μM、70 μM、80 μM、90 μM、100 μM、110 μM、120 μM、130 μM、140 μM、150 μM、160 μM、170 μM、180 μM、190 μM或200 μM之鋅。
在一些實施例中，本文提供一種細胞培養物，其可藉由在包含或補充有濃度為50至150 μM、100至120 μM或100至120 μM之鋅的製備培養基中培養表現抗α4β7抗體或其抗原結合部分之GS-CHO宿主細胞來獲得。在一些實施例中，抗體為維多珠單抗或其抗原結合部分。
在一些實施例中，相對於包含缺乏鋅之培養基或未補充鋅之培養基的等效細胞培養，細胞培養之細胞表現具有降低含量之鹼性同種型(如藉由CEX所測定)的抗α4β7抗體或其抗原結合部分。在一些實施例中，所表現之抗體包含約16%或更少之鹼性同種型。在一些實施例中，所表現之抗體包含約15%或更少之鹼性同種型。在一些實施例中，所表現之抗體包含約14%或更少之鹼性同種型。在一些實施例中，所表現之抗體包含約13%或更少之鹼性同種型。在一些實施例中，所表現之抗體包含約12%或更少之鹼性同種型。在一些實施例中，所表現之抗體包含約11%或更少之鹼性同種型。
在一些實施例中，本文提供一種製備單株抗體之方法，包含(i)將本文所提供之包含表現抗α4β7抗體或其抗原結合部分之宿主細胞以及包含或補充有鋅之製備培養基的細胞培養物培養足以使宿主細胞表現抗α4β7抗體或其抗原結合部分的一段時間，及(ii)自細胞培養物中回收抗α4β7抗體或其抗原結合部分。在一些實施例中，相對於自包含缺乏鋅之培養基或未補充鋅之培養基的等效細胞培養物回收之抗α4β7抗體或其抗原結合部分之群體，自細胞培養物回收之抗α4β7抗體或其抗原結合部分之群體包含降低之鹼性同種型含量及/或增加之主要同種型含量(如藉由CEX所測定)。在一些實施例中，相對於自包含缺乏鋅之培養基或未補充鋅之培養基的等效細胞培養物回收之抗α4β7抗體或其抗原結合部分之群體，自細胞培養物回收之抗α4β7抗體或其抗原結合部分之群體包含降低之聚集物含量及/或增加之單體含量(如藉由SEC所測定)。在一些實施例中，將細胞培養物培養5-20天。在一些實施例中，將細胞培養物培養10-16天。在一些實施例中，將細胞培養物培養13-15天。在一些實施例中，將細胞培養物培養5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。本文亦提供一種藉由前述方法獲得或藉由前述方法可獲得之抗α4β7抗體。
在本文所描述之各實施例中，在一些實施例中，細胞培養基可進一步補充有糖、核苷及/或金屬共因子。舉例而言，細胞培養基可進一步補充有尿苷、錳及鋅。另外地或可替代地，細胞培養基可以進一步補充離胺酸及/或精氨酸。B. 糖、核苷及 / 或金屬共因子之補充
在一些實施例中，本文提供用於在製備階段期間補充糖、核苷及/或金屬共因子之CHO細胞培養物中製備人類化抗α4β7抗體(例如維多珠單抗)或其抗原結合部分之方法及組合物。
在一些實施例中，用於控制CHO細胞培養中抗α4β7抗體之糖基化型態之培養基補充物包含糖。舉例而言，補充物中之糖可為葡萄糖、海藻糖或半乳糖。
在一些實施例中，用於控制CHO細胞培養中抗α4β7抗體之糖基化型態之培養基補充物包含核苷。舉例而言，補充物中之核苷可為腺苷、尿苷、胞苷、鳥苷、胸苷及/或肌苷。
在一些實施例中，用於控制CHO細胞培養中抗α4β7抗體之糖基化型態之培養基補充物包含金屬共因子。舉例而言，補充物中之金屬共因子可為鎂、錳、鐵或銅。
在一些實施例中，用於控制CHO細胞培養中抗α4β7抗體之糖基化型態之培養基補充物包含糖及核苷。在一些實施例中，用於控制CHO細胞培養中抗α4β7抗體之糖基化型態之培養基補充物包含糖及金屬共因子。在一些實施例中，用於控制CHO細胞培養中抗α4β7抗體之糖基化型態之培養基補充物包含糖、核苷及金屬共因子。
在一些實施例中，本文提供用於在製備階段期間補充半乳糖、尿苷及錳之CHO細胞培養物中製備人類化抗α4β7抗體(例如維多珠單抗)或其抗原結合部分之方法及組合物。在一些實施例中，所補充之組分位於相同之培養基補充物中。在一些實施例中，所補充之組分位於不同之培養基補充物中。在一些實施例中，在添加至細胞培養物中之前將不同培養基補充物組合。在一些實施例中，所補充之用於控制抗α4β7抗體之糖基化型態的組分為多次添加。舉例而言，其可在製備階段培養之起始日之後添加或在製備階段培養之第一、第二、第三、第四、第五或第六天不添加，而在此後，每天或每兩天進行添加。在一個實施例中，將用於控制糖基化型態之組分添加在製備階段培養基之每天補充物中。在另一實施例中，在製備階段培養之第四天開始將用於控制糖基化型態之組分添加在製備階段培養基之每天補充物中。
在一些實施例中，在擴增階段期間將用於控制糖基化之培養基補充物提供至用於製備抗α4β7抗體之CHO細胞培養物中；在其他實施例中，將其添加至製備階段中。在一些實施例中，用於控制糖基化之培養基補充物係以20至400倍、25至300倍、30至250倍、40至120倍、約50倍、約60倍、約100倍或約200倍於其在培養基中之最終濃度的濃度而提供。在一些實施例中，對培養基進行補充之量忽略細胞之消耗，細胞之消耗可將補充組分中之一些代謝為其他化學形式。
在一個實施例中，將金屬共因子(諸如錳)組分在具有金屬離子(諸如鋅)之培養基補充物中提供至細胞培養物中。在一些實施例中，金屬共因子(例如錳)濃縮可為10,000至50,000倍於其在培養基中之最終濃度、20,000至40,000倍於其在培養基中之最終濃度或約30,000倍於其在培養基中之最終濃度。
在一些實施例中，錳可以0.1至100 μM、0.5至50 μM、1.0至25 μM、2.0至15 μM、3至10 μM、1至50 μM、1至100 μM、20至50 μM、30至60 μM、40至70 μM、50至80 μM、70至100 μM、20至70 μM、30至80 μM、40至90 μM或50至100 μM之濃度存在於培養基中或可以該濃度添加以對培養基(例如製備階段培養基)進行補充。在一個實施例中，製備階段培養基中錳之濃度為約5.15 μM。因此，可根據用於達成約5.15 μM錳之平均濃度之時程對製備階段培養基進行補充。在一些實施例中，錳可以約1 μM、約5 μM、約10 μM、約20 μM、約30 μM、約40 μM、約50 μM、約60 μM、約70 μM、約80 μM約90 μM或約100 μM之濃度存在於培養基中或可以該濃度添加以對培養基(例如製備階段培養基)進行補充。
在一個實施例中，在起始日之後以補充物形式以每次添加0.1至10 μM、0.2至1.5 μM、0.2至5 μM、0.25至2 μM、0.3至1.2 μM、0.3至0.8 μM或以約0.5 μM或0.56 μM多次添加錳以對製備階段培養基進行補充。在一個實施例中，在起始日之後以補充物形式以每次添加約0.2至1.5 μM多次添加錳以對製備階段培養基進行補充。在一個實施例中，在起始日之後以補充物形式以每次添加約0.31至1.2 μM多次添加錳以對製備階段培養基進行補充。在一些實施例中，在製備階段培養之第四天開始每天或每兩天添加錳補充物。在一些實施例中，在收穫當天不添加補充物。
在一個實施例中，將錳作為補充物添加至饋料培養基中，使得饋料培養基中錳之濃度為最終濃度為0.02 mM至0.2 mM、0.03 mM至0.15 mM、0.03 mM至0.10 mM、0.03 mM至0.05 mM、0.03 mM至0.04 mM、約0.03 mM、約0.04 mM、約0.05 mM、約0.06 mM、約0.07 mM、約0.08 mM、約0.1 mM或約0.14 mM。在一個實施例中，將錳作為補充物添加至饋料培養基中，使得饋料培養基中錳之濃度為最終濃度為0.1至100 μM。在一個實施例中，將錳作為補充物添加至饋料培養基中，使得饋料培養基中錳之濃度為最終濃度為約39 μM。在一個實施例中，在製備階段培養之起始日之後(例如在製備階段培養之第二天至第十天之間、第二天至第八天之間、第二天至第六天之間、第三天至第六天之間的一天或第四天開始)將補充有錳之饋料培養基添加至製備培養基中(例如多次，例如每天或每兩天)。在某些實施例中，在製備階段培養之第四天開始將補充有錳之饋料培養基添加至製備培養基中。
可出於超過一種原因添加尿苷。其可與其他核苷一起添加在營養補充物中以支持細胞生長。尿苷亦可作為用於控制抗α4β7抗體之糖基化型態之補充物而添加。在一些實施例中，尿苷可以0.1至20 mM、0.9至3.0 mM、1至20 mM、0.5至12 mM、1至8 mM、1.5至4 mM、0.1至1.5 mM、1至5 mM、1至7 mM、1至6 mM、1至5 mM、1至4 mM、2至4 mM、2至5 mM、2至3 mM、1 mM至10 mM、10 mM至15 mM、10 mM至20 mM、10 mM至30 mM、1 mM至40 mM、1 mM至50 mM或10 mM至30 mM之濃度存在於培養基中或可以該濃度添加以對培養基(例如製備階段培養基)進行補充。在一些實施例中，尿苷可以約0.9 mM、1.0 mM、約2 mM、約1.5 mM、約2.0 mM、約2.7 mM、約2.5 mM、約2.7 mM、約2.8 mM、約5 mM、約6 mM、約7 mM、約8 mM、約9 mM、約10 mM、約11 mM、約12 mM、約13 mM、約14 mM、約15 mM、約16 mM、約17 mM、約18 mM、約19 mM或約20 mM之濃度存在於培養基中或可以該濃度添加以對培養基(例如製備階段培養基)進行補充。在一些實施例中，在製備培養基中所描述之量解釋了基礎培養基或補充物中所提供之量且不解釋消耗(由細胞代謝之量或產生之量)。在一些實施例中，在製備培養基中所描述之量為作為到收穫日所有添加之總和的累積量。為控制抗α4β7抗體之糖基化型態，尿苷可以0.1至20 mM、0.5至12 mM、1至8 mM、1.5至5 mM、1.6至4.8 mM或約2.4 mM對製備階段培養基進行補充。在一個實施例中，在起始日之後以補充物形式以每次添加25至1000 μM、75至750 μM、55至620 μM、100至600 μM、150至450 μM、100至600 μM、170至630 μM或以約250 μM或約300 μM多次添加尿苷以對製備階段培養基進行補充。在一些實施例中，在製備階段培養之第四天開始每天或每兩天添加此等尿苷補充物，且另外在收穫當天可不添加尿苷補充物。在一個實施例中，含有核苷(例如尿苷)之補充物為10至500倍於其在培養基中之最終濃度、20至400倍、25至300倍、40至250倍、約50倍、約60倍、約100倍或約200倍於其在培養基中之最終濃度。
在一個實施例中，將尿苷作為補充物添加至饋料培養基中，使得饋料培養基中尿苷之濃度為最終濃度為約1至40 mM、15至25 mM、15至100 mM、20至90 mM、15至70 mM、15至50 mM、15至30 mM、約18 mM、約19 mM、約19.3 mM、約20 mM、約33 mM、約50 mM或約66 mM。在一個實施例中，在製備階段培養之起始日之後(例如在製備階段培養之第二天至第十天之間、第二天至第八天之間、第二天至第六天之間、第三天至第六天之間的一天或第四天開始)將補充有尿苷之饋料培養基添加至製備培養基中(例如多次，例如每天或每兩天)。在某些實施例中，在製備階段培養之第四天開始將補充有尿苷之饋料培養基添加至製備培養基中。
在一個實施例中，含有糖(例如半乳糖)之補充物為10至500倍於其在培養基中之最終濃度、20至400倍、25至300倍、30至250倍、40至120倍、約50倍、約60倍、約100倍或約200倍於其在培養基中之最終濃度，以便控制抗α4β7抗體之糖基化型態。在一些實施例中，半乳糖可以0.1至100 mM、1至75 mM、2.5至50 mM、3至20 mM、5至35 mM、約8至25 mM、0.1至10 mM、0.1至20 mM、0.1至30 mM、1至10 mM、1至20 mM、1至30 mM、1至40 mM、1至50 mM、1至60 mM、1至70 mM、1至80 mM、1至90 mM、1至100 mM、20至40 mM、40至60 mM、60至80 mM、80至100 mM、20至50 mM、30至60 mM、40至70 mM、50至80 mM、70至100 mM、20至70 mM、30至80 mM、40至90 mM、50至100 mM或50至150 mM之濃度存在於培養基中或可以該濃度添加以對培養基(例如製備階段培養基)進行補充。在一些實施例中，半乳糖可以約0.1 mM、約0.2 mM、約0.3 mM、約0.4 mM、約0.5 mM、約0.6 mM、約0.7 mM、約0.8 mM、約0.9 mM、約1 mM、約2 mM、約3 mM、約5 mM、約6 mM、約7 mM、約8 mM、約9 mM、約10μM、約12.5 mM、約12 mM、約12.8 mM、約13 mM、約15 mM、約20 mM、約30 mM、約40 mM、約50 mM、約60 mM、約70 mM、約80 mM、約90 mM或約100 mM之濃度存在於培養基中或可以該濃度添加以對培養基(例如製備階段培養基)進行補充。在一個實施例中，在起始日之後以補充物形式以每次添加0.1至10 mM、0.2至7.5 mM、0.5至5 mM、0.4至2.8 mM、0.5至3.5 mM、0.7至2.9 mM、0.75至2.5 mM或以約1.2 mM或1.4 mM多次添加半乳糖以對製備階段培養基進行補充。在一些實施例中，在製備階段培養之第四天開始每天或每兩天添加此等半乳糖補充物，且另外在收穫當天可不添加。
在一個實施例中，將半乳糖作為補充物添加至饋料培養基中，使得饋料培養基中半乳糖之濃度為最終濃度為50至150 mM、85 mM至500 mM、90 mM至400 mM、90 mM至300 mM、90mM至200 mM、90 mM至100 mM、約95 mM、約96 mM、約97、約100 mM、約165 mM、約250 mM或約330 mM。在一個實施例中，在製備階段培養之起始日之後(例如在製備階段培養之第二天至第十天之間、第二天至第八天之間、第二天至第六天之間、第三天至第六天之間的一天或第四天開始)將補充有半乳糖之饋料培養基添加至製備培養基中(例如多次，例如每天或每兩天)。在某些實施例中，在製備階段培養之第四天開始將補充有半乳糖之饋料培養基添加至製備培養基中。
在一些實施例中，為控制抗α4β7抗體之糖基化型態，為製備階段培養基補充尿苷、錳及半乳糖(UMG)。在一個實施例中，將UMG添加至製備培養基中，使得達成濃度為約1-7 mM之尿苷、濃度為約2-15 μM之錳及濃度為約3-20 mM之半乳糖。在一些實施例中，製備培養基進一步包含濃度為約5-45 μM之鋅。
在一些實施例中，可將UMG補充物例如作為饋料溶液之一部分逐漸添加至細胞培養物中。舉例而言，可每天或每兩天添加含有UMG補充物之饋料溶液。
在一些實施例中，補充物將0.1-0.7 mM尿苷、0.2-1.5 μM錳及0.5-3.5 mM半乳糖提供至製備階段培養基中。在一些實施例中，可在第0天、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天或第14天將UMG添加至培養基中。在一些實施例中，可每天或每隔一天添加UMG。在一些實施例中，每天或每隔一天添加UMG可在細胞達至製備階段時開始。因此，在一些實施例中，可在細胞培養之第4天、第5天或第6天開始每天或每隔一天將UMG添加至製備培養基中。在一個實施例中，可自約第4天至約第10天每天添加UMG。在一個實施例中，可自約第4天至約第14天每天添加UMG。在一些實施例中，以1.0至25 μM、2.0至15 μM、3至10 μM或約5 μM，例如以平均每天添加約0.2-1.5 μM為製備階段培養基補充錳；以1至8 mM、1.5至5 mM、1.6至4.8 mM或約2.4 mM或2.7 mM，例如以平均每天添加約100-700 μM補充尿苷；及以2.5至50 mM、5至35 mM、約8至25 mM或約12 mM或12. 6 mM，例如以平均每天添加約0.5-3.5 mM補充半乳糖。在某些實施例中，在製備階段培養之第四天開始進行平均每天添加。在一些實施例中，將本文所描述之UMG補充物添加至CHO細胞培養基，例如國際專利公開案第WO98/08934A1號中所提供之培養基中，該專利公開案之全部內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，將本文所描述之UMG補充物添加至CD-CHO培養基中。在一些實施例中，將本文所描述之UMG補充物添加至CD-CHO AGT (目錄號12490-001 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中。
在一個實施例中，將尿苷、錳及半乳糖(UMG)作為補充物添加至饋料培養基中，使得饋料培養基中尿苷之濃度為最終濃度為1至40 mM、15至100 mM、15至90 mM、15至70 mM、15至50 mM、15至30 mM、約18 mM、約19 mM、約20 mM、約21 mM、約33 mM、約50 mM或約66 mM尿苷；饋料培養基中錳之濃度為最終濃度為0.02 mM至0.2 mM、0.03 mM至0.15 mM、0.03 mM至0.10 mM、0.03 mM至0.05 mM、0.03 mM至0.04 mM、約0.03 mM、約0.04 mM、約0.05 mM、約0.06 mM、約0.07 mM、約0.08 mM、約0.1 mM或約0.14 mM錳；且饋料培養基中半乳糖之濃度為最終濃度為85 mM至500 mM、90 mM至400 mM、90 mM至300 mM、90 mM至200 mM、50 mM至150 mM、90 mM至100 mM、約95 mM、約96 mM、約97 mM、約100 mM、約165 mM、約250 mM或約330 mM半乳糖。在一個實施例中，在製備階段培養之起始日之後(例如在製備階段培養之第二天至第十天之間、第二天至第八天之間、第二天至第六天之間、第三天至第六天之間的一天或第四天開始)將補充有尿苷、錳及半乳糖之饋料培養基添加至製備培養基中(例如多次，例如每天或每兩天)。在某些實施例中，在製備階段培養之第四天開始例如每天將補充有尿苷、錳及半乳糖之饋料培養基添加至製備培養基中。
在某些實施例中，將含有尿苷、錳及半乳糖(UMG)之組合補充物添加至製備培養基中(或添加至隨後添加至製備培養基中之饋料溶液中)，以便製備包含抗α4β7抗體(諸如維多珠單抗)之組合物，其中組合物具有降低之鹼性抗體同種型含量。在一個實施例中，鹼性同種型之含量為約16%或更少(如藉由CEX所測定)。在一個實施例中，鹼性同種型之含量為約15%或更少(如藉由CEX所測定)。在一個實施例中，鹼性同種型之含量為約14%或更少(如藉由CEX所測定)。在一個實施例中，鹼性同種型之含量為約13%或更少(如藉由CEX所測定)。在一個實施例中，鹼性同種型之含量為約12%或更少(如藉由CEX所測定)。
將UMG添加至製備培養基中亦可影響由哺乳動物細胞產生之抗α4β7抗體(諸如維多珠單抗)之組合物中抗體之酸性種類及/或主要種類的含量。
將UMG添加至製備培養基中亦可影響由哺乳動物細胞產生之抗α4β7抗體(諸如維多珠單抗)之組合物中抗體之G0F、G1F及/或G2F糖型的含量。可存在於抗α4β7抗體(諸如維多珠單抗)之群體中之N-聚醣之結構的描述以圖9提供。
在某些實施例中，將含有尿苷、錳及半乳糖(UMG)之組合補充物添加至製備培養基中(或添加至隨後添加至製備培養基中之饋料溶液中)，以便製備包含抗α4β7抗體(諸如維多珠單抗)之組合物，其中組合物具有降低之G0F糖型含量。在一個實施例中，G0F糖型之含量為約70%或更少(如藉由親水性相互作用層析(HILIC)所測定)。在一個實施例中，G0F糖型之含量為約69%或更少(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G0F糖型之含量為約68%或更少(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G0F糖型之含量為約67%或更少(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G0F糖型之含量為約66%或更少(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G0F糖型之含量為約65%或更少(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G0F糖型之含量為約64%或更少(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G0F糖型之含量為約63%或更少(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G0F糖型之含量為約62%或更少(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G0F糖型之含量為約61%或更少(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G0F糖型之含量為約60%或更少(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G0F糖型之含量為約59%或更少(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G0F糖型之含量為約58%或更少(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G0F糖型之含量為約57%或更少(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G0F糖型之含量為約56%或更少(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G0F糖型之含量為約55%或更少(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G0F糖型之含量為約40-75%。在一個實施例中，G0F糖型之含量為約45-65% (如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G0F糖型之含量為約50-60% (如藉由HILIC所測定)。
在某些實施例中，將含有尿苷、錳及半乳糖(UMG)之組合補充物添加至製備培養基中(或添加至隨後添加至製備培養基中之饋料溶液中)，以便製備包含抗α4β7抗體(諸如維多珠單抗)之組合物，其中與在不存在補充物之情況下培養之表現抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，組合物具有降低量之G0F糖型。在一個實施例中，與在不存在補充物之情況下培養之表現人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，組合物包含減少至少約20%-40% (例如20%-40%、20%-30%、20%-25%)之人類化抗α4β7抗體之G0F糖型。在一個實施例中，與在不存在補充物之情況下培養之表現人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，組合物包含減少至少約20%之人類化抗α4β7抗體之G0F糖型。在一個實施例中，與在不存在補充物之情況下培養之表現人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，組合物包含減少至少約25%之人類化抗α4β7抗體之G0F糖型。比較對照在實質上相似條件下進行，除了指定之參數為不同的，例如不存在補充物。
在某些實施例中，將含有尿苷、錳及半乳糖(UMG)之組合補充物添加至製備培養基中(或添加至隨後添加至製備培養基中之饋料溶液中)，以便製備包含抗α4β7抗體(諸如維多珠單抗)之組合物，其中組合物具有增加之G1F糖型含量。在一個實施例中，G1F糖型之含量為約20%或更多(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G1F糖型之含量為約21%或更多(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G1F糖型之含量為約22%或更多(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G1F糖型之含量為約23%或更多(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G1F糖型之含量為約24%或更多(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G1F糖型之含量為約25%或更多(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G1F糖型之含量為約26%或更多(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G1F糖型之含量為約27%或更多(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G1F糖型之含量為約28%或更多(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G1F糖型之含量為約29%或更多(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G1F糖型之含量為約30%或更多(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G1F糖型之含量為約31%或更多(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G1F糖型之含量為約32%或更多(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G1F糖型之含量為約33%或更多(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G1F糖型之含量為約20-45%。在一個實施例中，G1F糖型之含量為約25-45% (如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G1F糖型之含量為約30-40% (如藉由HILIC所測定)。
在某些實施例中，將含有尿苷、錳及半乳糖(UMG)之組合補充物添加至製備培養基中(或添加至隨後添加至製備培養基中之饋料溶液中)，以便製備包含抗α4β7抗體(諸如維多珠單抗)之組合物，其中與包含在不存在補充物之情況下培養之表現抗α4β7抗體之哺乳動物宿主細胞的對照細胞培養物相比，組合物具有增加量之G1F糖型。在一個實施例中，與包含在不存在補充物之情況下培養之表現人類化抗α4β7抗體之哺乳動物宿主細胞的對照細胞培養物相比，組合物包含增加至少約2倍至3.5倍(例如2倍至3.5倍、2倍至3.3倍、2倍至3倍)之人類化抗α4β7抗體之G1F糖型。在一個實施例中，與包含在不存在補充物之情況下培養之表現人類化抗α4β7抗體之哺乳動物宿主細胞的對照細胞培養物相比，組合物包含增加至少約2倍之人類化抗α4β7抗體之G1F糖型。在一個實施例中，與包含在不存在補充物之情況下培養之表現人類化抗α4β7抗體之哺乳動物宿主細胞的對照細胞培養物相比，組合物包含增加至少約3倍之人類化抗α4β7抗體之G1F糖型。對照細胞培養物係在實質上相同條件下培養，除了指定參數，例如補充物。
在某些實施例中，將含有尿苷、錳及半乳糖(UMG)之組合補充物添加至製備培養基中(或添加至隨後添加至製備培養基中之饋料溶液中)，以便製備包含抗α4β7抗體(諸如維多珠單抗)之組合物，其中組合物具有增加之G2F糖型含量。在一個實施例中，G2F糖型之含量為約2%或更多(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G2F糖型之含量為約2.5%或更多(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G2F糖型之含量為約3%或更多(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G2F糖型之含量為約3.5%或更多(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G2F糖型之含量為約4%或更多(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G2F糖型之含量為約4.5%或更多(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G2F糖型之含量為約5%或更多(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G2F糖型之含量為約5.5%或更多(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G2F糖型之含量為約6%或更多(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G2F糖型之含量為約6.5%或更多(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G2F糖型之含量為約7%或更多(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G2F糖型之含量小於或等於10%。在一個實施例中，G2F糖型之含量為約2-4% (如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G2F糖型之含量為約3-5% (如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G2F糖型之含量為約2-7% (如藉由HILIC所測定)。
在某些實施例中，將含有尿苷、錳及半乳糖(UMG)之組合補充物添加至製備培養基中(或添加至隨後添加至製備培養基中之饋料溶液中)，以便製備包含抗α4β7抗體(諸如維多珠單抗)之組合物，其中組合物具有增加之G2F糖型含量。在一個實施例中，G2F糖型之含量為約2%或更多(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G2F糖型之含量為約3%或更多(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，G2F糖型之含量為約4%或更多(如藉由HILIC所測定)。
在某些實施例中，將含有尿苷、錳及半乳糖(UMG)之組合補充物添加至製備培養基中(或添加至隨後添加至製備培養基中之饋料溶液中)，以便製備包含抗α4β7抗體(諸如維多珠單抗)之組合物，其中與在不存在補充物之情況下培養之表現抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，組合物具有增加量之G2F糖型。在一個實施例中，與包含在不存在補充物之情況下培養之表現人類化抗α4β7抗體之哺乳動物宿主細胞的對照細胞培養物相比，組合物包含增加至少約2倍至5倍(例如2倍至5倍、2倍至4倍、3倍至4倍)之人類化抗α4β7抗體之G2F糖型。在一個實施例中，與包含在不存在補充物之情況下培養之表現人類化抗α4β7抗體之哺乳動物宿主細胞的對照細胞培養物相比，組合物包含增加至少約3倍之人類化抗α4β7抗體之G2F糖型。在一個實施例中，與包含在不存在補充物之情況下培養之表現人類化抗α4β7抗體之哺乳動物宿主細胞的對照細胞培養物相比，組合物包含增加至少約4倍之人類化抗α4β7抗體之G2F糖型。對照細胞培養物係在實質上相同條件下培養，除了指定參數，例如補充物。
在某些實施例中，將含有尿苷、錳及半乳糖(UMG)之組合補充物添加至製備培養基中(或添加至隨後添加至製備培養基中之饋料溶液中)，以便製備包含抗α4β7抗體(諸如維多珠單抗)之組合物，其中與包含在不存在補充物之情況下培養之表現抗α4β7抗體之哺乳動物宿主細胞的對照細胞培養物相比，組合物具有增加量之G1F及G2F糖型。在一個實施例中，與包含在不存在補充物之情況下培養之表現人類化抗α4β7抗體之哺乳動物宿主細胞的對照細胞培養物相比，組合物包含增加至少約2倍至5倍(例如2倍至5倍、2倍至4倍、3倍至4倍)之人類化抗α4β7抗體之G1F糖型及增加至少約2倍至5倍(例如2倍至5倍、2倍至4倍、3倍至4倍)之G2F糖型。在一個實施例中，與包含在不存在補充物之情況下培養之表現人類化抗α4β7抗體之哺乳動物宿主細胞的對照細胞培養物相比，組合物包含增加至少約3倍之人類化抗α4β7抗體之G1F及G2F糖型。在一個實施例中，與包含在不存在補充物之情況下培養之表現人類化抗α4β7抗體之哺乳動物宿主細胞的對照細胞培養物相比，組合物包含量增加至少約2倍之人類化抗α4β7抗體之G1F糖型及增加4倍之G2F糖型。對照細胞培養物係在實質上相同條件下培養，除了指定參數，例如補充物。
在某些實施例中，將含有尿苷、錳及半乳糖(UMG)之組合補充物添加至製備培養基中(或添加至隨後添加至製備培養基中之饋料溶液中)，以便製備包含抗α4β7抗體(諸如維多珠單抗)之組合物，其中組合物具有88%或更多、90%或更多、91%或更多、92%或更多、93%或更多、94%或更多或95%或更多之去唾液酸基-去半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G0F)、去唾液酸基-單半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G1F)及/或去唾液酸基-二半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G2F)糖基化變異體總量。在一些實施例中，本文所描述之組合物及方法可製備人類化抗α4β7抗體群體，其具有91-96%、92-95%、91-92%、91-92.5%、91-93%或91-95%之去唾液酸基-去半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G0F)、去唾液酸基-單半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G1F)及/或去唾液酸基-二半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G2F)糖基化變異體總量。在一些實施例中，本文所描述之組合物及方法可製備人類化抗α4β7抗體群體，其具有92%至98%、92%至97%、92%至96%或92%至95%之去唾液酸基-去半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G0F)、去唾液酸基-單半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G1F)及/或去唾液酸基-二半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G2F)糖基化變異體總量。培養基補充物可提供於水中(基礎培養基)或諸如以下之緩衝液中：抗壞血酸鹽、檸檬酸鹽、碳酸鹽、(4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、組胺酸、麩胺酸鹽、乙酸鹽、丁二酸鹽、葡糖酸鹽、組胺酸、磷酸鹽、順丁烯二酸鹽、二甲胂酸鹽、2-[N-嗎啉基]乙磺酸(MES)、雙(2-羥基乙基)亞胺基參[羥甲基]甲烷(Bis-Tris)、N-[2-乙醯胺基]-2-亞胺基二乙酸(ADA)、甘胺醯甘胺酸及其他有機酸或兩性離子緩衝液。在一些實施例中，培養基補充物具有5.5至7.0、6.0至7.5或5.9至6.1之pH值。在其他實施例中，培養基補充物具有1.5至5.5、1.8至3.0、3.2至4.5或1.9至2.1之pH值。在其他實施例中，培養基補充物具有7.5至9.0之pH值。
在一些實施例中，使用鋅及UMG對在製備階段培養之第四天開始每天添加之饋料溶液進行補充。
在某些實施例中，含有金屬(例如鋅或錳)之補充物為在低pH值下之緩衝液，諸如檸檬酸鹽或乙酸鹽緩衝液。檸檬酸鹽亦可用以螯合金屬離子以限制金屬離子補充物之毒性。在一個實施例中，含有金屬之補充物包含鋅及錳，例如在100至140 mM或115至125 mM下之含鋅及錳之檸檬酸鹽緩衝液。在一個實施例中，用於含有金屬之補充物之緩衝液包含118至122 mM檸檬酸，pH 1.9至2.1。因此，在一些實施例中，本文提供一種細胞培養物，其可藉由在以於115至125 mM檸檬酸鹽緩衝液(pH 1.9至2.1)中之50-150 μM鋅及10-50 mM錳溶液進行補充之製備培養基中培養表現抗α4β7抗體或其抗原結合部分之GS-CHO宿主細胞來獲得。在一些實施例中，本文提供一種細胞培養物，其可藉由在藉由添加在pH 1.9至2.1下之115至125 mM檸檬酸鹽緩衝液饋料補充物中之鋅及錳補充至濃度為10-100 μM鋅及0.1-100 μM錳的製備培養基中培養表現抗α4β7抗體或其抗原結合部分之GS-CHO宿主細胞來獲得。在一些實施例中，例如在製備培養之第4天開始將檸檬酸鹽緩衝金屬補充物添加至每天饋料補充物中。
在一些實施例中，本文提供一種細胞培養物，其包含表現抗α4β7抗體或其抗原結合部分之宿主細胞(或宿主細胞群體)及包含或補充有金屬離子、核苷、糖及/或金屬共因子之製備培養基。在其他實施例中，本文提供一種細胞培養物，其可藉由在包含或補充有金屬離子、核苷、糖及/或金屬共因子之製備培養基中培養表現抗α4β7抗體或其抗原結合部分之宿主細胞來獲得。
在一些實施例中，本文提供一種細胞培養物，其包含表現抗α4β7抗體或其抗原結合部分之宿主細胞(或宿主細胞群體)及包含或補充有糖、核苷及/或金屬共因子之製備培養基。在其他實施例中，本文提供一種細胞培養物，其可藉由在包含或補充有糖、核苷及/或金屬共因子之製備培養基中培養表現抗α4β7抗體或其抗原結合部分之宿主細胞來獲得。
在一些實施例中，本文提供一種細胞培養物，其包含表現抗α4β7抗體或其抗原結合部分之宿主細胞(或宿主細胞群體)及包含或補充有尿苷、錳及半乳糖(UMG)之製備培養基。在其他實施例中，本文提供一種細胞培養物，其可藉由在包含或補充有尿苷、錳及半乳糖(UMG)之製備培養基中培養表現抗α4β7抗體或其抗原結合部分之宿主細胞來獲得。
前述細胞培養物可併有本文所描述之實施例中之任一者。舉例而言，在一些實施例中，宿主細胞為CHO細胞，例如GS-CHO細胞或DHFR-
CHO細胞。在一些實施例中，宿主細胞表現包含SEQ ID NO:1之重鏈可變區及SEQ ID NO:5之輕鏈可變區的抗體或其抗原結合部分。在一些實施例中，宿主細胞表現包含含有SEQ ID NO:2中所描述之CDR1、SEQ ID NO:3中所描述之CDR2及SEQ ID NO:4中所描述之CDR3的重鏈可變區及含有SEQ ID NO:6中所描述之CDR1、SEQ ID NO:7中所描述之CDR2及SEQ ID NO:8中所描述之CDR3的輕鏈可變區之抗體或其抗原結合部分。在一些實施例中，宿主細胞表現維多珠單抗或其抗原結合部分。在一些實施例中，宿主細胞包含SEQ ID NO:9中所列之核酸(編碼抗α4β7抗體之輕鏈可變區)及SEQ ID NO:10中所列之核酸(編碼抗α4β7抗體之輕鏈可變區)。在一些實施例中，宿主細胞包含SEQ ID NO:11中所列之核酸(編碼維多珠單抗之輕鏈)及SEQ ID NO:12中所列之核酸(編碼維多珠單抗之重鏈)。
在一些實施例中，細胞培養物含有濃度為0.1至20 mM之尿苷。舉例而言，在一些實施例中，細胞培養物含有0.1至20 mM、1至20 mM、0.5至12 mM、1至8 mM、1.5至4 mM、0.1至1.5 mM、0.1至5 mM、5 mM至10 mM、10 mM至15 mM、15 mM至20 mM、0.1 mM至10 mM、10 mM至20 mM、1至7 mM、7至14 mM或14至20 mM。在其他實施例中，細胞培養物含有濃度為10-50 mM、20-60 mM、30-70 mM、40-80 mM、50-90 mM、60-100 mM或0.1至100 mM之尿苷。在一些實施例中，細胞培養物含有濃度為約10 mM、約15 mM、約16 mM、約17 mM、約18 mM、約19 mM、約20 mM、約21 mM、約22 mM、約25 mM、約27 mM、約30 mM、約33 mM、約35 mM、約40 mM、約45 mM、約50 mM、約55 mM、約60 mM、約66 mM或約70 mM之尿苷。
在一些實施例中，細胞培養物含有濃度為0.1至100 μM之錳。舉例而言，在一些實施例中，細胞培養物含有濃度為0.1至100 μM、0.5至50 μM、1.0至25 μM、2.0至15 μM、3至10 μM、0.1至10 μM、0.1至20 μM、0.1至30 μM、1至10 μM、1至20 μM、1至30 μM、1至40 μM、1至50 μM、1至60 μM、1至70 μM、1至80 μM、1至90 μM、1至100 μM、20至40 μM、40至60 μM、60至80 μM、80至100 μM、20至50 μM、30至60 μM、40至70 μM、50至80 μM、70至100 μM、20至70 μM、30至80 μM、40至90 μM或50至100 μM之錳。在其他實施例中，細胞培養物含有濃度為約0.1 μM、約0.2 μM、約0.3 μM、約0.4 μM、約0.5 μM、約0.6 μM、約0.7 μM、約0.8 μM、約0.9 μM、約1 μM、約2 μM、約3 μM、約5 μM、約10 μM、約20 μM、約30 μM、約40 μM、約50 μM、約60 μM、約70 μM、約80 μM、約90 μM或約100 μM之錳。
在一些實施例中，細胞培養物含有濃度為0.1至100 mM之半乳糖。舉例而言，在一些實施例中，細胞培養物含有濃度為1至75 mM、2.5至50 mM、5至35 mM、約8至25 mM、0.1至10 mM、0.1至20 mM、0.1至30 mM、1至10 mM、1至20 mM、1至30 mM、1至40 mM、1至50 mM、1至60 mM、1至70 mM、1至80 mM、1至90 mM、1至100 mM、20至40 mM、40至60 mM、60至80 mM、80至100 mM、20至50 mM、30至60 mM、40至70 mM、50至80 mM、70至100 mM、20至70 mM、30至80 mM、40至90 mM或50至100 mM之半乳糖。在一些實施例中，細胞培養物含有濃度為約0.1 mM、約0.2 mM、約0.3 mM、約0.4 mM、約0.5 mM、約0.6 mM、約0.7 mM、約0.8 mM、約0.9 mM、約1 mM、約2 mM、約3 mM、約5 mM、約6 mM、約7 mM、約8 mM、約9 mM、約10 μM、約12.5 mM、約12 mM、約15 mM、約20 mM、約30 mM、約40 mM、約50 mM、約60 mM、約70 mM、約80 mM、約90 mM或約100 mM之半乳糖。
在一些實施例中，本文提供一種細胞培養物，其可藉由在包含或補充有尿苷、錳及半乳糖之製備培養基中培養表現抗α4β7抗體或其抗原結合部分之宿主細胞(或宿主細胞群體)來獲得。舉例而言，在一些實施例中，細胞培養可包含0.1至20 mM尿苷(及其中之範圍)、0.1至100 μM錳(及其中之範圍)及0.1至100 mM半乳糖(及其中之範圍)。在一些實施例中，如本文所描述，細胞培養物可另外包含鋅。在一些實施例中，如本文所描述，細胞培養物可另外包含離胺酸及/或精胺酸。在一些實施例中，細胞培養物可另外包含鋅、離胺酸及精胺酸。因此，在一些實施例中，本文提供一種細胞培養物，其包含表現抗α4β7抗體或其抗原結合部分(例如維多珠單抗)之宿主細胞(或宿主細胞群體)及包含濃度為約1至約7 mM尿苷、約2至約15 μM錳、約3至約20 mM半乳糖及約0.005至約0.045 mM鋅之製備培養基。
在一些實施例中，本文提供一種細胞培養物，其可藉由在包含或補充有尿苷、錳、半乳糖及鋅之製備培養基中培養表現抗α4β7抗體或其抗原結合部分之宿主細胞(或宿主細胞群體)來獲得。舉例而言，在一些實施例中，細胞培養物可包含0.1至20 mM尿苷(及其中之範圍)、0.1至100 μM錳(及其中之範圍)、0.1至100 mM半乳糖(及其中之範圍)及10至100 μM鋅(及其中之範圍)。
在一些實施例中，本文提供一種細胞培養物，其可藉由在包含或補充有尿苷、錳、半乳糖、鋅、離胺酸及/或精胺酸之製備培養基中培養表現抗α4β7抗體或其抗原結合部分之宿主細胞(或宿主細胞群體)來獲得。舉例而言，在一些實施例中，細胞培養物可包含0.1至20 mM尿苷(及其中之範圍)、0.1至100 μM錳(及其中之範圍)、0.1至100 mM半乳糖(及其中之範圍)、10至100 μM鋅(及其中之範圍)、5.0至8.8 g/L離胺酸(及其中之範圍)及/或3.0至12.0 g/L精胺酸(及其中之範圍)。
在一些實施例中，相對於包含缺乏尿苷、錳及/或半乳糖之培養基或未補充尿苷、錳及/或半乳糖之培養基的等效細胞培養物，細胞培養物之細胞表現具有降低之鹼性同種型含量(如藉由CEX所測定)的抗α4β7抗體或其抗原結合部分。在一些實施例中，所表現之抗體包含約16%或更少之鹼性同種型(如藉由CEX所測定)。在一些實施例中，所表現之抗體包含約15%或更少之鹼性同種型(如藉由CEX所測定)。在一些實施例中，所表現之抗體包含約14%或更少之鹼性同種型(如藉由CEX所測定)。在一些實施例中，所表現之抗體包含約13%或更少之鹼性同種型(如藉由CEX所測定)。在一些實施例中，所表現之抗體包含約12%或更少之鹼性同種型(如藉由CEX所測定)。在一些實施例中，所表現之抗體包含約11%或更少之鹼性同種型(如藉由CEX所測定)。
在一些實施例中，相對於包含缺乏尿苷、錳及/或半乳糖之培養基或未補充尿苷、錳及/或半乳糖之培養基的等效細胞培養物，細胞培養物之細胞表現具有降低之G0F糖型含量(如藉由HILIC所測定)的抗α4β7抗體或其抗原結合部分。在一些實施例中，細胞培養物之細胞表現具有70%或更少、65%或更少、60%或更少或55%或更少之G0F含量(如藉由HILIC所測定)的抗α4β7抗體。在一些實施例中，細胞培養物之細胞表現具有85%或更少、80%或更少、75%或更少、70%或更少、69%或更少、68%或更少、67%或更少、66%或更少、65%或更少、64%或更少、63%或更少、62%或更少、61%或更少、60%或更少、59%或更少、58%或更少、57%或更少、56%或更少或55%或更少之G0F含量(如藉由HILIC所測定)的抗α4β7抗體。在一些實施例中，細胞培養物之細胞表現具有45-65%之G0F含量的抗α4β7抗體。在一些實施例中，細胞培養物之細胞物表現具有50-60%之G0F含量的抗α4β7抗體。在一些實施例中，細胞培養物之細胞表現具有45-85%之G0F含量的抗α4β7抗體。在一些實施例中，細胞培養物之細胞表現具有45-82%之G0F含量的抗α4β7抗體。在一些實施例中，相對於由包含缺乏尿苷、錳及/或半乳糖之培養基或未補充尿苷、錳及/或半乳糖之培養基的等效細胞培養物製備之等效抗α4β7抗體之G0F含量，由如本文所描述包含含有或補充有尿苷、錳及/或半乳糖之培養基的細胞培養物製備之抗α4β7抗體之G0F含量降低至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%、至少25%、至少26%、至少27%、至少28%、至少29%、至少30%、至少31%、至少32%、至少33%、至少34%、至少35%、至少36%、至少37%、至少38%、至少39%或至少40%。
在一些實施例中，相對於包含缺乏尿苷、錳及/或半乳糖之培養基或未補充尿苷、錳及/或半乳糖之培養基的等效細胞培養物，細胞培養物之細胞表現的抗α4β7抗體或其抗原結合部分具有增加之G1F糖型含量(如藉由HILIC所測定)。在一些實施例中，細胞培養物之細胞表現具有10%或更多、15%或更多、20%或更多、21%或更多、22%或更多、23%或更多、24%或更多、25%或更多、26%或更多、27%或更多、28%或更多、29%或更多、30%或更多、31%或更多、32%或更多或33%或更多之G1F含量(如藉由HILIC所測定)的抗α4β7抗體。在一些實施例中，細胞培養物之細胞表現具有25-45%之G1F含量的抗α4β7抗體。在一些實施例中，細胞培養物之細胞表現具有30-40%之G1F含量的抗α4β7抗體。在一些實施例中，細胞培養物之細胞表現具有10-45%之G1F含量的抗α4β7抗體。在一些實施例中，相對於由包含缺乏尿苷、錳及/或半乳糖之培養基或未補充尿苷、錳及/或半乳糖之培養基的等效細胞培養物製備之等效抗α4β7抗體的G1F含量，由如本文所描述包含含有或補充有尿苷、錳及/或半乳糖之培養基的細胞培養物製備之抗α4β7抗體的G1F含量增加至少2倍、至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍、至少3倍、至少3.25倍或至少3.5倍。
在一些實施例中，相對於包含缺乏尿苷、錳及/或半乳糖之培養基或未補充尿苷、錳及/或半乳糖之培養基的等效細胞培養物，細胞培養物之細胞表現的抗α4β7抗體或其抗原結合部分具有增加之G2F糖型含量(如藉由HILIC所測定)。在一些實施例中，細胞培養物之細胞表現具有0.5%或更多、1%或更多、1.5%或更多、2%或更多、2.5%或更多、3%或更多、3.5%或更多、4%或更多、4.5%或更多、5%或更多、5.5%或更多、6%或更多、6.5%或更多、7%或更多或8%或更多之G2F含量(如藉由HILIC所測定)的抗α4β7抗體。在一些實施例中，細胞培養物之細胞表現具有2-4%之G2F含量的抗α4β7抗體。在一些實施例中，細胞培養物之細胞表現具有3-5%之G2F含量的抗α4β7抗體。在一些實施例中，細胞培養物之細胞表現具有2-7%之G2F含量的抗α4β7抗體。在一些實施例中，細胞培養物之細胞表現具有0.5-7.5%之G2F含量的抗α4β7抗體。在一些實施例中，相對於由包含缺乏尿苷、錳及/或半乳糖之培養基或未補充尿苷、錳及/或半乳糖之培養基的等效細胞培養物製備之等效抗α4β7抗體的G1F含量，由如本文所描述包含含有或補充有尿苷、錳及/或半乳糖之培養基的細胞培養物製備之抗α4β7抗體的G2F含量增加至少2倍、至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍、至少3倍、至少3.25倍、至少3.5倍、至少3,75倍、至少4倍、至少4.25倍、至少4.5倍、至少4.75倍或至少5倍。
在一些實施例中，本文所提供之細胞培養物可產生人類化抗α4β7抗體群體，其中該群體具有88%或更多、90%或更多、91%或更多、92%或更多、93%或更多、94%或更多或95%或更多之去唾液酸基-去半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G0F)、去唾液酸基-單半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G1F)及/或去唾液酸基-二半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G2F)糖基化變異體總量(如藉由HILIC所測定)。在一些實施例中，細胞培養物可產生具有91-96%、92-95%、91-92%、91-92.5%、91-93%或91-95%之去唾液酸基-去半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G0F)、去唾液酸基-單半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G1F)及/或去唾液酸基-二半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G2F)糖基化變異體總量(如藉由HILIC所測定)之人類化抗α4β7抗體群體。在一些實施例中，細胞培養物可產生具有92%至98%、92%至97%、92%至96%或92%至95%之去唾液酸基-去半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G0F)、去唾液酸基-單半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G1F)及/或去唾液酸基-二半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G2F)糖基化變異體總量之人類化抗α4β7抗體群體。
在一些實施例中，本文提供一種製備單株抗體之方法，該方法包括(i)將包含表現抗α4β7抗體或其抗原結合部分之宿主細胞及包含或補充有尿苷、錳及/或半乳糖之製備培養基的細胞培養物培養足以使宿主細胞表現抗α4β7抗體或其抗原結合部分的一段時間，及(ii)自細胞培養物回收抗α4β7抗體或其抗原結合部分。在一些實施例中，相對於自包含缺乏尿苷、錳及/或半乳糖之培養基或未補充尿苷、錳及/或半乳糖之培養基的等效細胞培養物回收之抗α4β7抗體群體或其抗原結合部分，自細胞培養物回收之抗α4β7抗體群體或其抗原結合部分包含降低之鹼性同種型含量(如藉由CEX所測定)。在一些實施例中，相對於自包含缺乏尿苷、錳及/或半乳糖之培養基或未補充尿苷、錳及/或半乳糖之培養基的等效細胞培養物回收之抗α4β7抗體群體或其抗原結合部分，自細胞培養物回收之抗α4β7抗體群體或其抗原結合部分包含降低之G0F含量)。在一些實施例中，製備培養基進一步包含或進一步補充有鋅。在一些實施例中，製備培養基進一步包含或進一步補充有離胺酸及/或精胺酸。在一些實施例中，將細胞培養物培養5-20天。在一些實施例中，將細胞培養物培養10-16天。在一些實施例中，將細胞培養物培養13-15天。在一些實施例中，將細胞培養物培養5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。本文亦提供一種藉由前述方法獲得或藉由前述方法可獲得之抗α4β7抗體。
在一個實施例中，本文提供一種組合物，其包含具有88%或更多、90%或更多、91%或更多、92%或更多、93%或更多、94%或更多或95%或更多之去唾液酸基-去半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G0F)、去唾液酸基-單半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G1F)及/或去唾液酸基-二半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G2F)糖基化變異體總量的維多珠單抗。在一個實施例中，本文提供一種組合物，其包含具有91-96%、92-95%、91-92%、91-92.5%、91-93%或91-95%之去唾液酸基-去半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G0F)、去唾液酸基-單半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G1F)及/或去唾液酸基-二半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G2F)糖基化變異體總量的維多珠單抗。在一些實施例中，前述組合物可藉由在補充有尿苷、錳及半乳糖之製備培養基中培養重組表現維多珠單抗之GS-CHO細胞來獲得。在一些實施例中，前述組合物可藉由在補充有尿苷、錳、半乳糖及鋅之製備培養基中培養重組表現維多珠單抗之GS-CHO細胞來獲得。在一些實施例中，前述組合物可藉由在補充有尿苷、錳、半乳糖、鋅、精胺酸及/或離胺酸之製備培養基中培養重組表現維多珠單抗之GS-CHO細胞來獲得。
在一個實施例中，本文提供一種組合物，其包含具有85%或更少、80%或更少、75%或更少、70%或更少、69%或更少、68%或更少、67%或更少、66%或更少、65%或更少、64%或更少、63%或更少、62%或更少、61%或更少、60%或更少、59%或更少、58%或更少、57%或更少、56%或更少或55%或更少之去唾液酸基-去半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G0F)的維多珠單抗(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，本文提供一種組合物，其包含具有45-65%或50-60%之去唾液酸基-去半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G0F)的維多珠單抗(如藉由HILIC所測定)。在一些實施例中，前述組合物可藉由在補充有尿苷、錳及半乳糖之製備培養基中培養重組表現維多珠單抗之GS-CHO細胞來獲得。在一些實施例中，前述組合物可藉由在補充有尿苷、錳、半乳糖及鋅之製備培養基中培養重組表現維多珠單抗之GS-CHO細胞來獲得。在一些實施例中，前述組合物可藉由在補充有尿苷、錳、半乳糖、鋅、精胺酸及/或離胺酸之製備培養基中培養重組表現維多珠單抗之GS-CHO細胞來獲得。
在一個實施例中，本文提供一種組合物，其包含具有10%或更多、15%或更多、20%或更多、21%或更多、22%或更多、23%或更多、24%或更多、25%或更多、26%或更多、27%或更多、28%或更多、29%或更多、30%或更多、31%或更多、32%或更多或33%或更多之去唾液酸基-單半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G1F)的維多珠單抗(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，本文提供一種組合物，其包含具有25-45%或30-40%之去唾液酸基-單半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G1F)的維多珠單抗(如藉由HILIC所測定)。在一些實施例中，前述組合物可藉由在補充有尿苷、錳及半乳糖之製備培養基中培養重組表現維多珠單抗之GS-CHO細胞來獲得。在一些實施例中，前述組合物可藉由在補充有尿苷、錳、半乳糖及鋅之製備培養基中培養重組表現維多珠單抗之GS-CHO細胞來獲得。在一些實施例中，前述組合物可藉由在補充有尿苷、錳、半乳糖、鋅、精胺酸及/或離胺酸之製備培養基中培養重組表現維多珠單抗之GS-CHO細胞來獲得。
在一個實施例中，本文提供一種組合物，其包含具有0.5%或更多、1%或更多、1.5%或更多、2%或更多、2.5%或更多、3%或更多、3.5%或更多、4%或更多、4.5%或更多、5%或更多、5.5%或更多、6%或更多、6.5%或更多、7%或更多或8%或更多之去唾液酸基-二半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G2F)的維多珠單抗(如藉由HILIC所測定)。在一個實施例中，本文提供一種組合物，其包含具有2-4%、3-5%或2-7%之去唾液酸基-二半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G2F)的維多珠單抗(如藉由HILIC所測定)。在一些實施例中，前述組合物可藉由在補充有尿苷、錳及半乳糖之製備培養基中培養重組表現維多珠單抗之GS-CHO細胞來獲得。在一些實施例中，前述組合物可藉由在補充有尿苷、錳、半乳糖及鋅之製備培養基中培養重組表現維多珠單抗之GS-CHO細胞來獲得。在一些實施例中，前述組合物可藉由在補充有尿苷、錳、半乳糖、鋅、精胺酸及/或離胺酸之製備培養基中培養重組表現維多珠單抗之GS-CHO細胞來獲得。
在一些實施例中，用於在CHO細胞培養物中製備抗α4β7抗體之方法包括向培養物中提供包含金屬離子及金屬共因子之培養基補充物及包含核苷及糖之另一培養基補充物。在一些實施例中，用於在CHO細胞培養物中製備抗α4β7抗體之方法包括向培養物中提供包含金屬離子之培養基補充物及包含核苷、糖及金屬共因子之培養基補充物。在一些實施例中，用於在CHO細胞培養物中製備抗α4β7抗體之方法包括向培養物中提供包含金屬離子、核苷、糖及金屬共因子之培養基補充物。在一些實施例中，用於在CHO細胞培養物中製備抗α4β7抗體之方法包括向培養物中提供包含金屬離子、核苷及金屬共因子之培養基補充物。
實例中所提供之示例性培養基補充物及其使用方法被視為本發明之實例。C. 離胺酸及 / 或精胺酸之補充
在前述態樣之一些實施例中，細胞培養基(例如製備階段培養基)可進一步補充有離胺酸及/或精胺酸。因此，在一些態樣中，本文所提供之方法及組合物可採用補充有鋅、離胺酸及/或精胺酸之細胞培養基，例如製備階段培養基。在其他態樣中，本文所提供之方法及組合物可採用補充有尿苷、錳、半乳糖、離胺酸及/或精胺酸之細胞培養基，例如製備階段培養基。在其他態樣中，本文所提供之方法及組合物可採用補充有尿苷、錳、半乳糖、鋅、離胺酸及/或精胺酸之細胞培養基，例如製備階段培養基。
在一個實施例中，製備培養基包含5.0至8.8 g/L離胺酸及3.0至12.0 g/L精胺酸。在一個實施例中，製備培養基包含4.5至5.5 g/L離胺酸。在一個實施例中，製備培養基包含5.5至8.8 g/L離胺酸。在一個實施例中，製備培養基包含5.4至7.4 g/L精胺酸。在一個實施例中，製備培養基包含7.4至12 g/L精胺酸。
培養基可如上文所描述補充有尿苷、錳、半乳糖及鋅。舉例而言，在一些實施例中，細胞培養基(例如製備階段培養基)補充有0.1-20 mM尿苷、0.1-100 μM錳、0.1-100 mM半乳糖及1-100 μM鋅且進一步補充有5.0-8.8 g/L離胺酸及/或3.0至12.0 g/L精胺酸。III. 上游製備方法
本發明涉及在本文中經鑑定使得抗α4β7抗體(諸如維多珠單抗)效價大於3 g/L之條件下及/或使用經鑑定使得抗α4β7抗體(諸如維多珠單抗)效價大於3 g/L之補充物在哺乳動物宿主細胞中大規模重組製備抗體，諸如抗α4β7抗體。在哺乳動物細胞培養系統中進行高水準重組抗體表現為此項技術中之已知挑戰。
總體製程包括用經基因修飾以表現抗α4β7抗體之哺乳動物細胞對細胞培養基進行接種、生長階段、製備階段及最後用以收集重組抗體之收穫期。在某些實施例中，在各個時期之間可為過渡階段。
因此，作為第一步，可將編碼所需重組抗α4β7抗體之核酸(例如cDNA)插入用於表現之可複製載體。各種載體為公共可獲得的且對熟習此項技術者而言為已知的。載體組分通常包括但不限於以下中之一或多者：信號序列、複製起點、一或多種標記基因、增強子元件、啟動子及轉錄終止序列，其中之每一者如下文所描述。可採用之視情況存在之信號序列、複製起點、標記基因、增強子元件及轉錄終止序列為此項技術中已知的且進一步詳細描述於PCT公開案WO 97/25428或美國專利第7,053,202號中。
表現載體通常含有由宿主有機體識別且可操作地連接至編碼蛋白質之核酸序列的啟動子。啟動子為定位於結構基因之起始密碼子上游(5') (通常為約100至1000 bp內)之未轉譯序列，其控制與其可操作地連接之特定核酸序列之轉錄及轉譯。此類啟動子典型地屬於兩種類型：可誘導啟動子及組成性啟動子。可誘導啟動子為在其控制下響應於培養條件之一些改變(例如存在或不存在營養物或溫度改變)起始增加水準之自DNA進行之轉錄的啟動子。此時，大量由多種潛在宿主細胞識別之啟動子為熟知的。此等啟動子藉由利用限制酶消化自來源DNA移除啟動子及將經分離啟動子序列插入載體中而可操作地連接至編碼所需蛋白質之DNA。
可採用在哺乳動物細胞中提供瞬時表現之表現載體。一般而言，瞬時表現涉及使用能夠在宿主細胞中高效複製之表現載體，使得宿主細胞累積表現載體之許多拷貝且進而合成高含量之由表現載體編碼之所需多肽(Sambrook等人，同上)。包含適合之表現載體及宿主細胞之瞬時表現系統允許由選殖之DNA編碼之多肽的方便陽性鑑定，以及針對所需生物或生理特性對此類多肽進行之快速篩選。將哺乳動物宿主細胞轉染且較佳用表現載體轉型且在經適當改良用於誘導啟動子、選擇轉型體或擴增編碼所需序列之基因的培養基中培養。接著使此類細胞生長，且最終經歷若干輪複製，轉移至較大容器用於後續生長及最終產生相關多肽。
可將哺乳動物細胞(諸如CHO細胞)以小規模培養(例如至多5 L)，諸如在5 ml、25 ml、50 ml、100 ml、250 ml、1 L、3 L或5 L容器中培養。或者，培養可在中等尺寸規模容器(諸如10 L、20 L、100 L或200 L容器)中進行。或者，培養可為在大於200 L (諸如500 L、1000 L、2000 L 3000 L、5000 L 10,000 L及15,000 L容器)之容器中的大規模培養。諸如用於製造治療性抗體之大規模細胞培養典型地維持數天，或甚至數週，同時細胞產生所需蛋白質。
出於本發明之目的，細胞培養基為適合於活體外細胞培養中動物細胞(諸如哺乳動物細胞)之生長的培養基。細胞培養基之類型之實例包括擴增細胞培養基及製備細胞培養基。
細胞培養基調配物為此項技術中熟知的。典型地，細胞培養基包含緩衝劑、鹽、碳水化合物、胺基酸、維生素及痕量必需元素。細胞培養基可能含或可能不含血清、蛋白腖、蛋白質水解物及/或蛋白質。包括不含血清及確定培養基之各種組織培養基可商購獲得，例如可使用以下細胞培養基中之任一者或其組合：RPMI-1640培養基、RPMI-1641培養基、杜爾貝科氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)、最低必需伊格爾培養基(Minimum Essential Medium Eagle)、F-12K培養基、哈姆氏F12培養基(Ham's F12 Medium)、伊斯科夫氏改良杜爾貝科培養基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)、McCoy's 5A培養基、萊伯維茲氏L-15培養基(Leibovitz's L-15 Medium)及不含血清之培養基，諸如EX-CELL.TM. 300系列(JRH Biosciences, Lenexa, Kans.)等。視所要培養之細胞及/或所需細胞培養參數之需要而定，細胞培養基可補充有其他或增加濃度之組分，諸如胺基酸、鹽、糖、維生素、激素、生長因子、緩衝劑、抗生素、脂質、痕量元素及類似物。CHO細胞培養基為此項技術中已知的，例如CD-CHO (Invitrogen)、CD-CHO-AGT™培養基(ThermoFisher Scientific)、HYCELL™ CHO培養基(GE Healthcare Life Sciences)或CHOMACS CD培養基(Militenyi Biotech)。在一些實施例中，如上文所描述可商購獲得之培養基可用作用於例如在GS-CHO細胞中製備抗α4β7抗體(諸如維多珠單抗)之製備階段培養的起始培養基。在一個較佳實施例中，在於CD-CHO培養基中生長之GS-CHO細胞中製備抗體，其中CD-CHO培養基如本文所描述進行補充。
在製備階段之前，首先在生長階段中在使細胞增殖及活力最大化之環境條件下培養哺乳動物細胞。在生長階段之後，起始製備階段，其中使用使多肽製備最大化之細胞培養條件。生長及製備階段前面可為一或多個轉變階段或由一或多個轉變階段隔開。舉例而言，在一個實施例中，細胞培養方法之製備階段前面為細胞培養之過渡階段，其中採用細胞培養之製備階段的參數。
在生長階段中，使哺乳動物細胞在針對生長最大化之條件下生長及持續針對生長最大化之時間段。培養條件(諸如溫度、pH值、溶解氧(DO2
)及類似條件)為在特定宿主情況下使用之彼等培養條件且對一般熟練技工而言將為顯而易見的。通常，使用酸(例如CO2
)或鹼(例如Na2
CO3
或NaOH)將pH值調節至約6.5與7.5之間的水準。適合用於培養諸如CHO細胞之哺乳動物細胞之溫度範圍在約30至40攝氏度之間且較佳在36至38攝氏度範圍內。
在用於藉由哺乳動物細胞製備蛋白質之商業方法中，在最終製備階段之前通常存在發生在不同(例如依次更大)培養容器中的多個(例如至少約2、3、4、5、6、7、8、9或10個)生長階段。
當細胞生長至充足數目時，將其轉移至大規模製備容器(例如生物反應器)，以開始製備階段，藉此在促使製備相關多肽(亦即抗體)之條件下培養哺乳動物宿主細胞。熟練技工可選擇使用經研發用於在特定培養之宿主細胞中進行重組多肽製備的本文所描述之細胞培養基中之一或多者。或者，可將根據本發明之方法及組合物與市售細胞培養基組合使用。
典型地，生長階段發生在高於製備階段之溫度下。舉例而言，生長階段可發生在約35攝氏度至約38攝氏度之第一溫度下，且製備階段可發生在約30攝氏度至約34攝氏度之第二溫度下。然而，如實例中所描述，本文所鑑定之改良之一為在用於製備抗α4β7抗體(例如維多珠單抗)之細胞培養中在哺乳動物細胞之生長階段與製備階段之間維持實質上類似的溫度使得細胞培養之抗體效價增加。實際上，藉由在兩個階段之間維持類似溫度，維多珠單抗之抗體效價大於1 g/L，例如約5至7 g/L。
因此，在一個實施例中，本發明提供一種在哺乳動物宿主細胞中製備人類化抗α4β7抗體之方法，其中在擴增階段中將哺乳動物宿主細胞在細胞培養基中培養，且隨後在製備階段中在細胞培養基中培養，其中擴增與製備階段均在大致相同之平均溫度下進行，例如兩個階段之平均溫度為36至38攝氏度。在一個實施例中，擴增與製備階段之平均溫度為36.5至37.5攝氏度，例如約37攝氏度。
或者，本發明提供一種在哺乳動物宿主細胞中製備人類化抗α4β7抗體之方法，其中在擴增階段中將哺乳動物宿主細胞在細胞培養基中培養，且隨後在製備階段中在細胞培養基中培養，其中擴增與製備階段均在大致相同之溫度範圍下進行，例如36至38攝氏度，例如36.5至37.5攝氏度之任何溫度範圍。
製備階段之時間長度可視細胞及所表現之抗體而變化。在某些實施例中，製備階段為約14天或更短時間。在某些實施例中，製備階段為約15天或更短時間。在某些實施例中，製備階段為約16天或更短時間。或者，製備階段為8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、10至16天、11至15天、13至17天或12至14天。此等數字內包括部分天，例如13.5天。
在一個實施例中，細胞培養基之pH值在6.0至8.0；6.5至7.5；6.7至7.0、6.7至6.9、6.95-7.05或7.1至7.2範圍內。此等pH值中間之數字(例如6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9及8.0)以及本文敍述之所有其他數字亦旨在為本發明之一部分。使用以上所敍述值中之任一者的組合作為上限及/或下限之值範圍旨在包括在本發明之範疇中。在一些實施例中，培養物之pH值可自一個pH值轉變為另一pH值，達至低於接種時之pH值。舉例而言，pH值可自6.9至7.1、6.95至7.05或pH 7.00±0.1、±0.05或±0.02之pH值範圍轉變為6.7至7.0、6.75至6.85或pH 6.8±0.1或±0.02之pH值範圍。轉變之時間可在培養2、3、4或5天之後。在一些實施例中，pH轉變在製備階段培養之第四天或第五天。
因此，在一個實施例中，本文提供一種在經遺傳工程化以表現抗體之哺乳動物宿主細胞中製備人類化抗α4β7抗體之方法，其中將哺乳動物宿主細胞在製備培養基中在第一pH值下培養，且隨後轉變為第二pH值，其中第二pH值低於第一pH值。舉例而言，在一些實施例中，在宿主細胞培養之製備階段期間第二pH值可轉變為比第一pH值低0.1至0.5個pH單位。在一個實施例中，起始pH值可在pH 6.8至pH 7.2範圍內。在pH轉變發生之後，經調節之pH值可降低0.1至0.5個pH單位，例如0.1、0.2、0.3、0.4或0.5個pH單位。因此，在一些實施例中，第二pH值可在約6.7-6.95範圍內。
如以下實例中所描述，製備階段期間之pH轉變可例如降低抗體之鹼性同種型的量、降低抗體之酸性同種型的量及/或增加抗體之主要同種型的量。
在某些實施例中，在製備階段期間細胞培養基之pH值維持在6.5至7.0之pH值範圍內。
在某些實施例中，在製備階段期間細胞培養基之pH值維持在6.7至7.0之pH值範圍內。
在某些實施例中，在製備階段期間細胞培養基之pH值為約6.85。
在製備階段時間期間，培養物可補充有含有諸如營養物及胺基酸之組分的濃縮饋料培養基，該等組分在細胞培養之製備階段過程期間被消耗。濃縮饋料培養基可基於幾乎任何細胞培養基調配物。此類濃縮饋料培養基可含有例如約5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、14倍、16倍、20倍、25至40倍、30倍、50倍、100倍、40至120倍、200倍、400倍、600倍、800倍或甚至約1000倍於正常量之大多數細胞培養基組分或其子集。濃縮饋料培養基常常用於分批饋料培養方法中。
在一個實施例中，製備階段為分批饋料培養。分批饋料培養為廣泛實踐之用於自哺乳動物細胞大規模製備蛋白質之培養方法。參見例如Chu及Robinson (2001), Current Opin. Biotechnol. 12: 180-87。抗體製備對細胞要求可能較高且基礎或起始培養基不能維持高密度之細胞及高水準之抗體製備。沒有新鮮營養物，諸如胺基酸或能量來源，產率可能受損或細胞可能死亡。舉例而言，消耗胺基酸(諸如酪胺酸)供應之培養物將停止產生抗體。哺乳動物細胞之分批饋料培養為將培養物連續或週期性地與含有營養物之濃縮饋料培養基一起饋送的培養。饋送可按例如每天、每兩天一次、每三天一次等預定時程來進行。在一個實施例中，在製備階段之第4天或約第4天開始，將例如選自由葡萄糖、鋅、錳、尿苷及半乳糖組成之群的一或多種其他營養物例如在培養基補充物中添加至細胞培養基中。饋料溶液按每天、每隔一天、每兩天及其組合之時程添加。在一些實施例中，在製備階段期間兩次(諸如在第4天及第ll天)以大劑量添加酪胺酸。在其他實施例中，每天將酪胺酸例如在饋料補充物中添加至製備階段培養物中。在一些實施例中，將葡萄糖添加至製備階段培養物中。在一些實施例中，例如藉由量測葡萄糖或代謝產物(諸如乳酸)來監測葡萄糖消耗。在一些實施例中，添加包含葡萄糖之饋料補充物，因此將葡萄糖含量控制在1至10 g/L、2至7 g/L、2.5至6 g/L或約7 g/L之水準。
在某些實施例中，將分批饋料方法用於哺乳動物細胞培養方法之擴增階段以對正在生長之細胞進行補充。
在一特定實施例中，本發明之細胞培養在大規模生物反應器中進行且採用分批饋料培養程序。在分批饋料培養之一個實施例中，最初將哺乳動物宿主細胞及培養基供應至培養容器且在培養期間連續地或以離散增量將其他培養營養物饋入培養物中，在終止培養之前進行或進行不週期性細胞及/或產物收穫。分批饋料培養可包括例如半連續分批饋料培養，其中週期性移除整個培養物(包括細胞及培養基)，且換成新鮮培養基，分批饋料培養不同於簡單分批培養，在簡單分批培養中在培養方法開始時將用於細胞培養之所有組分(包括細胞及所有培養營養物)供應至培養容器。
本文所描述之方法可用於達成人類化抗α4β7抗體之效價大於1 g/L的細胞培養。在一個實施例中，本文所描述之方法用於達成約2至約6 g/L、約3至約5 g/L、約5至約9 g/L或約4.5至約7 g/L之人類化抗α4β7抗體效價。
本文所揭示之方法可用於達成具有某些糖基化模式之抗體組合物。在一個實施例中，本文所描述之方法提供人類化抗α4β7抗體群體，其中該群體具有88%或更多、90%或更多、或91%或更多之去唾液酸基-去半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G0F)、去唾液酸基-單半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G1F)及/或去唾液酸基-二半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G2F)糖基化變異體總量。
本文所揭示之方法亦可用於達成具有一定量之抗體主要同種型的抗體組合物。在一個實施例中，本文所揭示之方法提供具有如藉由陽離子交換層析(CEX)所測定大於或等於61%之主要抗體同種型量的組合物(例如包含維多珠單抗之淨化收穫)。在另一實施例中，本文所揭示之方法提供具有如藉由CEX所測定大於或等於62%之主要抗體同種型量的組合物(例如包含維多珠單抗之淨化收穫)。在一個實施例中，本文所揭示之方法提供具有如藉由CEX所測定大於或等於63%之主要抗體同種型量的組合物(例如包含維多珠單抗之淨化收穫)。在一個實施例中，本文所揭示之方法提供具有如藉由CEX所測定大於或等於64%之主要抗體同種型量的組合物(例如包含維多珠單抗之淨化收穫)。在一個實施例中，本文所揭示之方法提供具有如藉由CEX所測定大於或等於65%之主要抗體同種型量的組合物(例如包含維多珠單抗之淨化收穫)。IV. 下游製備方法
本發明之包含抗α4β7抗體或其抗原結合部分(例如維多珠單抗)之組合物可藉由上游細胞培養方法及本文所提供之組合物來製備。此等上游方法技術可視情況與下游製備方法結合用於分離、純化及/或調配抗體或其抗原結合部分。在製備階段之後，可收穫重組抗體。典型地，哺乳動物細胞經工程改造以將相關蛋白質分泌至細胞培養基中，因此純化方法中之第一步為自培養基分離細胞。所收穫之培養基可例如藉由過濾進一步淨化。接著可對培養基(例如淨化收穫)進行若干其他純化步驟，從而移除任何細胞碎屑、不想要之蛋白質、鹽、礦物質或其他不需要之分子。重組抗體可自污染性可溶性蛋白質及多肽純化，以下程序為適合之純化程序之示例，其可包括以下中之一或多者：親和層析，例如使用結合抗體Fc區之樹脂，諸如蛋白質A；在離子交換管柱或樹脂上分級，諸如陽離子交換層析(CEX)，例如SP-SepharoseTM
或CM-SepharoseTM
羥磷灰石；陰離子交換層析(AEX)；疏水相互作用層析(HIC)；混合模式層析；乙醇沈澱；層析聚焦；硫酸銨沈澱；使用例如Sephadex G-75TM
之凝膠過濾；超濾及/或滲濾；或前述各項之組合。純化方法之實例描述於Liu等人, mAbs, 2:480-499 (2010)中。純化製程結束時，重組蛋白為高度純的且適合用於人類治療用途，例如用於下文所描述之醫藥抗體調配物中。在純化之後，可將高度純之重組蛋白超濾/滲濾(UF/DF)至適合於人類投與之醫藥調配物中。
在滲濾及超濾之後，抗體調配物可保持為液體或凍乾為乾燥抗體調配物。在一個態樣中，將乾燥凍乾抗體調配物提供於包含150 mg、180 mg、240 mg、300 mg、360 mg、450 mg或600 mg之抗α4β7抗體的單劑量小瓶中且可用液體(諸如無菌水)複溶，以便投與。在另一態樣中，抗α4β7抗體(例如維多珠單抗)呈穩定液體醫藥組合物形式，其在約2-8°C下儲存於容器(例如小瓶)、注射器或藥筒中，直至將其向有需要之個體投與。在一些實施例中，抗α4β7抗體之複溶凍乾調配物或穩定液體醫藥組合物包含約0%至5.0%、0%至2%、≤2%、≤1%、≤0.6%或≤0.5%聚集物。
因此，在一些實施例中，本文提供一種包含人類化抗α4β7抗體或其抗原結合部分之複溶凍乾抗體調配物或穩定液體醫藥組合物。在一些實施例中，抗α4β7抗體之複溶凍乾調配物或穩定液體醫藥組合物包含約11%至16%、12%至15%、≤14%、≤13%、≤12%或≤11%鹼性同種型種類。在一些實施例中，抗α4β7抗體之複溶凍乾調配物或穩定液體醫藥組合物包含65%至75%、66%至74%、67%至73%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%或至少70%主要同種型。在一些實施例中，抗α4β7抗體之複溶凍乾調配物或穩定液體醫藥組合物包含92%至98%、92%至97%、92%至96%、92%至95%、至少92%、至少93%、至少94%或至少95%之去唾液酸基-去半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G0F)、去唾液酸基-單半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G1F)及/或去唾液酸基-二半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G2F)糖基化變異體(G0F + G1F + G2F)總含量。在一些實施例中，抗α4β7抗體之複溶凍乾調配物或穩定液體醫藥組合物包含45%至65%、50%至65%、55%至65%、45%至60%、50%至60%、55%至60%、45%至55%、47%至61%、47%至63%、65%或更少、64%或更少、63%或更少、62%或更少、61%或更少、60%或更少、57%或更少、55%或更少、53%或更少、52%或更少或50%或更少之G0F含量。在一些實施例中，抗α4β7抗體之複溶凍乾調配物或穩定液體醫藥組合物包含25%至45%、26%至42%、27%至40%、30%至40%、30%至45%、至少25%、至少26%、至少27%、至少28%、至少29%、至少30%、至少31%、至少32%、至少33%、至少34%、至少35%、至少36%、至少37%、至少38%、至少39%、至少40%、至少41%、至少42%或至少43%之G1F含量。在一些實施例中，抗α4β7抗體之複溶凍乾調配物或穩定液體醫藥組合物包含2%至8%、2.5%至7.5%、3%至7%、3.5%至6.5%、至少2%、至少2.5%、至少3%、至少3.5%、至少4%、至少4.5%、至少5%或至少5.5%、至少6%、至少6.5%或至少7%之G2F含量。
在一些實施例中，抗α4β7抗體之複溶凍乾調配物或穩定液體醫藥組合物可包含一或多種賦形劑，包括但不限於胺基酸(例如精胺酸、組胺酸及/或組胺酸單鹽酸鹽)、糖(例如蔗糖)、表面活性劑(例如聚山梨醇酯80)及/或緩衝劑(例如檸檬酸鹽、磷酸鹽等)。在一個實施例中，抗α4β7抗體之複溶凍乾調配物或穩定液體醫藥組合物包含L-精胺酸、L-組胺酸、L-組胺酸單鹽酸鹽、蔗糖及/或聚山梨醇酯80。在另一實施例中，抗α4β7抗體之複溶凍乾調配物或穩定液體醫藥組合物包含檸檬酸鹽、精胺酸、組胺酸及/或聚山梨醇酯80。
注射器或藥筒可為1 mL或2 mL容器(例如用於160 mg/mL劑量)或超過2 mL，例如用於更高劑量(至少320 mg或400 mg或更高)。注射器或藥筒可含有至少約20 mg、至少約50 mg、至少約70 mg、至少約80 mg、至少約100 mg、至少約108 mg、至少約120 mg、至少約155 mg、至少約180 mg、至少約200 mg、至少約240 mg、至少約300 mg、至少約360 mg、至少約400 mg或至少約500 mg之抗α4β7抗體。在一些實施例中，容器(例如注射器或藥筒)可經製造用於遞送約20至120 mg、約40 mg至70 mg、約45至65 mg、約50至57 mg或約54 mg之抗α4β7抗體，例如維多珠單抗。在其他實施例中，注射器或藥筒可經製造用於遞送約90至120 mg、約95至115 mg、約100至112 mg或約108 mg之抗α4β7抗體，例如維多珠單抗。在其他實施例中，注射器或藥筒可經製造用於遞送約140至250 mg、約150至200 mg、約160至170 mg、約160至250 mg、約175 mg至210 mg、約220至260 mg或約160 mg、約165 mg、約180 mg或約200 mg之抗α4β7抗體，例如維多珠單抗。
調配物之投與可藉由非經腸注射，諸如靜脈內、皮下或肌肉內注射。靜脈內注射可藉由諸如藉由用無菌等滲鹽水緩衝液(例如磷酸鹽緩衝鹽水或林格氏(乳酸鹽或右旋糖)溶液)進一步稀釋進行輸注。在一些實施例中，以在開始治療之後約每兩週、三週或四週或在第三個後續劑量之後，藉由皮下注射投與抗α4β7抗體，例如劑量為約54 mg、108 mg或約165 mg或約216 mg。V. 分析方法
本文報道之抗體或其抗原結合部分之各種參數可使用標準分析方法及技術(諸如下文所描述之彼等)來量測。
在一個實施例中，CEX分析方法包括將測試樣品稀釋至低離子強度，注射至在10 mM磷酸鈉(pH 6.6)中平衡之CEX管柱上，將管柱在此緩衝液中用NaCl梯度溶離，在280 nm下監測峰且將峰分配為酸性、主要或鹼性，其中酸性峰以最短滯留時間首先溶離，主要峰第二個溶離且鹼性峰以最長滯留時間溶離，且定量峰面積且將其量計算為佔所有峰面積之百分比。
在本文闡述之各個實施例中，陽離子交換層析(CEX)可用於測定存在於抗體或其抗原結合部分(例如維多珠單抗)之群體中之主要同種型、鹼性同種型及酸性同種型的相對量。CEX方法根據總表面電荷對抗體種類進行分級。在使用移動相稀釋至低離子強度之後，可將測試樣品注射至在適合之緩衝液(例如10 mM磷酸鈉，pH 6.6)中平衡之CEX管柱(諸如Dionex Pro-PacTM
WCX-10管柱(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA (USA)))上。可在相同緩衝液中使用氯化鈉梯度將抗體溶離。可在280 nm下監測蛋白質溶離，且將峰分配為酸性、鹼性或主要同種型類別。酸性峰以比主要同種型峰短之滯留時間自管柱溶離，且鹼性峰以比主要同種型峰長之滯留時間自管柱溶離。報道主要同種型百分比、酸性種類百分比總和及鹼性種類百分比總和。將樣品之主要同種型滯留時間與參考標準相比較以確定一致性。
在本文闡述之各個實施例中，親水性相互作用相分離(HILIC)可用於測定抗體或其抗原結合部分(例如維多珠單抗)之糖型型態。HILIC方法將游離螢光標記碳水化合物分級。完整聚醣可藉由用N-糖苷酶F消化自抗體或其抗原結合部分之樣品釋放。接著可使用標準技術(諸如來自Prozyme (Hayward, CA (USA))之GlykoPrep快速醣蛋白樣品製備系統中所用之彼等標準技術)將釋放之聚醣即刻用螢光標籤(諸如InstantAB螢光標籤)標記。經標記之聚醣可使用超高效液相層析來分級。在一些實施例中，使用ACQUITY UPLC BEH醯胺管柱(Waters Corporation, Milford, MA (USA))及乙腈/甲酸銨梯度系統將經標記之聚醣分級。經標記之聚醣可使用278 nm之激發波長藉由在344 nm下之螢光發射來偵測。因此，HILIC在與本發明結合使用時為如下HILIC方法，其將游離螢光標記糖型分級，其中較佳地，完整糖型藉由用N-糖苷酶F消化自抗體或其抗原結合部分之樣品釋放，接著使用標準標記技術，較佳來自Prozyme (Hayward, CA (USA))之GlykoPrep快速醣蛋白樣品製備系統中所用之彼等標準標記技術，將所釋放之糖型即刻用螢光標籤，較佳InstantAB螢光標籤進行標記，其中將經標記之糖型使用超高效液相層析，較佳使用ACQUITY UPLC BEH醯胺管柱(Waters Corporation, Milford, MA (USA))及乙腈/甲酸銨梯度系統進行分級，且其中經標記之糖型使用278 nm之激發波長藉由在344 nm下之螢光發射來偵測。分析對照可藉由確認市售標準，例如InstantAB標記之葡萄糖均聚物梯形帶(Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA(USA))之適當解析來進行。基於所偵測之糖的相對面積百分比進行定量。報道G0F (去唾液酸基-非半乳糖基化雙觸角聚醣，核心岩藻糖基化)；G1F (去唾液酸基-單半乳糖基化雙觸角聚醣，核心岩藻糖基化)；及G2F (去唾液酸基-雙半乳糖基化雙觸角聚醣，核心岩藻糖基化)種類之峰面積百分比。
在本文闡述之各個實施例中，尺寸排阻層析(SEC)可用於測定存在於抗體或其抗原結合部分(例如維多珠單抗)之群體中的單體、高分子量(HMW)聚集物及低分子量(LMW)降解產物之相對含量。SEC方法提供基於尺寸之抗體單體與HMW種類及LMW降解產物之分離。可使用市售SEC管柱使用適當緩衝液對測試樣品及參考標準進行分析。舉例而言，在一些較佳實施例中，可使用G3000 SWxl管柱(Tosoh Bioscience, King of Prussia, PA (USA))或較佳為串聯連接之兩個G3000 SWxl管柱及等度磷酸鹽-氯化鈉緩衝系統(pH 6.8)進行SEC分析。在280 nm下監測蛋白質種類之溶離。對主要峰(單體)及總峰面積進行評估以確定純度。報道樣品之純度(%) (計算為單體%)、HMW聚集物%及/或LMW降解產物%。
若為酶聯免疫吸附分析(ELISA)所需，則可使用標準技術量測存在於抗體製劑中之殘餘CHO宿主細胞蛋白質(HCP)雜質。可商購獲得經設計用於此目的之許多ELISA套組，諸如來自Cygnus Technologies (Southport, NC (USA))之CHO HCP ELISA套組3G。測試樣品中之宿主細胞蛋白質可使用經固定之多株抗CHO HCP抗體捕獲。所捕獲之蛋白質可接著使用適合之偵測劑(例如相同抗體之辣根過氧化酶標記之型式)來偵測。在此示例性實施例中，可在450 nm下使用過氧化酶受質3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)以比色法量測與CHO HCP濃度成正比之所捕獲之過氧化酶量。HCP濃度可藉由與CHO HCP標準曲線(諸如測試套組中包括之CHO HCP標準曲線)相比較來測定，且報道為抗體製劑中之總蛋白質含量百分比。
以下實例例示用於在哺乳動物細胞培養物中製備抗體之改良方法及組合物。以下實例僅為說明性目的而提供，且不旨在以任何方式限制本發明之範疇。除非另外指出，否則實例中所提及之市售試劑根據製造商之說明書進行使用。實例
先前在二氫葉酸還原酶缺陷型(DHFR)中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株(Urlaub及Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216-4220，美國專利申請公開案第20070122404號)中製備了維多珠單抗。雖然所選擇之純系在其維多珠單抗表現中為穩定的，但產量水準小於2 g/L。鑒於對材料之高要求，研究者設法開發更高產之細胞株。
在基於數千個純系對各種選擇系統進行測試且在生物反應器中對一些純系進行評估之後，選擇麩醯胺合酶缺陷型(GS-)中國倉鼠卵巢(GS-CHO)細胞株。在一個實例中，GS CHO系統產生6.7 g/L抗體。其他研究表明培養條件及培養基補充物可影響某些品質特徵。以下實例描述用於改良在GS-CHO細胞中所製備之維多珠單抗之品質的實驗。實例 1. 細胞培養製備對產物品質特徵之影響
為改良產物品質特徵，使用普萊克特-伯爾曼法(Plackett-Burman method)來創建篩選設計以在八次生物反應器運行中評估五種方法參數改良因素之影響。將細胞解凍且在3天傳代之情況下使用標準放大策略自搖瓶移至具有1.75L工作體積之3L製備生物反應器中。使用兩種饋料(除非另外指明)情況下之大劑量饋送策略進行15天生物反應器製備。
設計：選擇以下五種不同因素用於此篩選研究：1)溫度轉變(至33°C)；2)饋送策略改變(2 g/L與6 g/L葡萄糖)；3) pH值改變(6.85與7.05)；4)將尿苷、氯化錳及半乳糖(UMG)添加至饋料溶液；及5) Sigma Gal+/ExCell®糖基化調節添加。基於表1中所描述之普萊克特-伯爾曼篩選設計基於八次不同生物反應器運行對此五種因素進行測試。表 1 ：用於改良半乳糖基化及酸性變異體之普萊克特 - 伯爾曼設計
| 因素 / 容器編號 | 溫度轉變 | 饋送策略 | 低 pH 值 | 將 UMG 添加至饋料中 | Sigma Gal+ |
| A1 V09 | 是 | 是 | 是 | 否 | 是 |
| B1 V10 | 否 | 否 | 是 | 否 | 否 |
| C1 V11 | 否 | 是 | 否 | 是 | 否 |
| D1 V12 | 否 | 否 | 是 | 是 | 是 |
| E1 V13 | 是 | 否 | 否 | 否 | 否 |
| F1 V14 | 是 | 是 | 是 | 是 | 否 |
| G1 V15 | 是 | 否 | 否 | 是 | 是 |
| H1 V16 | 否 | 是 | 否 | 否 | 是 |
通過JMP軟體進行普萊克特-伯爾曼篩選設計。此篩選設計幫助鑑定促進達成產物品質目標之因素。如下表2中所解釋，各因素由兩個水準組成。表 2: 調查因素
| 因素 | 水準 | 對應條件 |
| 溫度轉變 | 是 | 在第7天至33°C |
| 否 | 37°C (無轉變) | |
| 饋送策略 | 是 | 2 g/L + 葡萄糖之預期消耗 |
| 否 | 6 g/L + 葡萄糖之預期消耗 | |
| pH | 是 | 6.85 ± 0.15 |
| 否 | 7.05 ± 0.15 | |
| UMG | 是 | 100X* |
| 否 | 未添加 | |
| Sigma Gal+ | 是 | 0.3％ v/v |
| 否 | 未添加 | |
| *饋料溶液中之100X UMG、約100 mM尿苷、0.2 mM氯化錳及500 mM半乳糖添加至製備培養基中 |
使用GS-CHO細胞株進行此實驗。
饋送：將製備生物反應器培養物用每毫升3 x 105
個活細胞接種，且在第4天期間，基於每個研究設計細胞之生長速率及葡萄糖消耗速率將饋料培養基添加至培養物中。將饋料之投用量設定為以7 g/L之葡萄糖濃度結束。根據研究設計，溫度轉變在第7天起始，自37攝氏度至33攝氏度或35攝氏度。在第18天或在目標細胞活力小於或等於50%時(無論哪一情況先到來)收穫所有製備生物反應器培養物。
產品品質：在JMP軟體中對表1中所測試之條件的結果進行分析，以探索將改良產物品質特徵之條件(使用預測分析器)。
預測型態結果描述於圖1中。通常，達成抗體效價增加、維多珠單抗之鹼性及酸性種類減少及維多珠單抗之G2F同種型增加的條件總體上為所需的。
如圖1中所示，模型預測在基於葡萄糖消耗速率之饋料遞送、37攝氏度、轉變為pH 6.85及將UMG添加至饋料溶液中情況下進行操作為最佳的。相比之下，圖1中之結果表明Gal+添加並非必需的，因為它幾乎不影響維多珠單抗之G2同種型、酸性或鹼性種類或抗體效價。另外，溫度自37攝氏度轉變為33攝氏度對效價具有負面影響，表明將細胞製備維持在37度為有利的，而小於7.05 (例如6.85至小於7)之pH值改良效價，同時維持較低之G2同種型含量。
預測分析器在使用UMG組合來達成碳水化合物目標以及較高效價水準及較低抗體酸性種類含量中進一步顯示出優勢。基於葡萄糖消耗之饋送策略及與pH 7相比較低之pH值(6.85)在達成較低鹼性種類比例中顯示益處。實例 2 ： UMG 補充及 pH 值對產物品質特徵之影響
此實驗之目標為測試饋料溶液之pH值及UMG含量對產物品質特徵的影響。此實驗為實例1之後續實驗。
設計：使用GS-CHO細胞進行此實驗。將實驗設計為容納pH值，在6.85或7.05下考察；及UMG作為饋料補充物(在製備期間)，在33X、50X及66X濃度下考察之全因子實驗。增加在第4天具有pH轉變之另一條件(V10)。在實驗之第1天，V01之滴定泵因鬆弛之pH探針連接而嚴重過量泵送滴定劑，且不得不將反應器取下。由於V10具有類似培養基及細胞，快速替換V10之運行模板以反映V01之運行模板。未採用溫度轉變，因為如實例1中所描述未預測到益處。
使用基於消耗之饋送方法饋送細胞，其中將當前生長速率及消耗速率外推以向前預測葡萄糖需求。
實驗評估饋料培養基中之UMG補充(在饋料培養基中33X (33 mM尿苷、0.066 mM錳及165 mM半乳糖)、50X (50 mM尿苷、0.1 mM錳及250 mM半乳糖)及66X (66 mM尿苷、0.132 mM錳及330 mM半乳糖)濃度下考察)及pH值(在7.05及6.85下考察)對產物品質特徵，包括抗體效價、酸性種類、鹼性種類、主要種類、G0F種類、G1F種類、G2F種類及聚醣總和之量的影響。將結果與在未進行UMG補充之CD-CHO製備培養基中生長之彼等培養物相比較。實驗設計描述於表3中。表 3 ：實驗設計
| 容器 | pH | 其他 | UMG 添加 | 問題 |
| V01 | 6.85 | 不適用 | 15mL 50X UMG | 因滴定劑之過量泵送而去除 |
| V02 | 6.85 | 不適用 | 15mL 33X UMG | |
| V03 | 6.85 | 不適用 | 15mL 66X UMG | |
| V04 | 6.65 | 不適用 | 15mL 50X UMG | |
| V05 | 7.05 | 不適用 | 15mL 50X UMG | |
| V06 | 7.05 | 不適用 | 15mL 33X UMG | |
| V09 | 7.05 | 不適用 | 15mL 66X UMG | |
| V10 | 7.05 | 在第4天，pH值轉變為6.85且溫度轉變為38 | 15mL 50X UMG | 重新構建以代表V01條件 |
UMG 100x量在上文描述於表2中。
結果：使用實驗之結果，產生預測型態以進一步研究各種條件對細胞培養及維多珠單抗之產物品質特徵的影響。預測型態結果描述於圖2A-2H中(抗體效價與UMG (圖2A)、酸性種類% (CEX)與UMG (圖2B)、鹼性種類% (CEX)與UMG (圖2C)、主要種類百分比(CEX)與UMG (圖2D)、G0F種類百分比與UMG (圖2E)、G1F種類百分比(圖2F)、G2F種類百分比與UMG (圖2G)及聚醣總和與UMG (圖2H))。在圖2A至2H中之每一者中，未進行UMG補充之容器藉由陰影區(陰影區表示UMG補充)最左側之點來展示。另外，所測試之兩個pH量(pH 7.05及pH 6.85)顯示於圖2A-2H中。
如圖2D、2F、2G及2G中所描述，具有增加之UMG補充的細胞培養物相對於未進行UMG補充之培養物分別展示更高之主要種類、G1F種類、G2F種類百分比及聚醣總和。另外，相對於未進行UMG補充之培養物，進行UMG補充之培養物展現較低效價(圖2A)、較低酸性種類(圖2B)、較低鹼性種類(圖2C)及較低G0F種類(圖2E)。
在所測試之不同UMG濃度中，UMG之濃度似乎對效價及酸性種類具有極小影響，對鹼性種類百分比具有低影響(亦即，在較高UMG濃度下鹼性種類稍微減少)，且對主要種類百分比具有較高影響(亦即，在較高UMG濃度情況下主要種類增加)。響應於各種UMG濃度碳水化合物型態不存在大的改變。
最後，關於pH值，如圖2A-2H中所描述，在低pH值(6.85)下操作似乎比在較高pH值(pH 7.05)下操作表現得好。
在單獨實驗中，將重組表現維多珠單抗之GS-CHO細胞以3000L規模在補充有包含尿苷(19.33 mM濃度)、錳(0.039 mM濃度)、半乳糖(96.62 mM濃度)及鋅(0.117 mM濃度)之饋料培養基的CD-CHO製備培養基中培養。在第4天開始每天將饋料添加至培養物中。每天添加時所添加之UMG量如下：0.17至0.63 mM尿苷、0.31至1.2 μM錳及0.77至2.9 mM半乳糖。在第4天至第14天之培養期間製備培養基中尿苷之平均濃度為約2.76 mM；錳之平均濃度為約0.00515 mM；且半乳糖之平均濃度為約12.8 mM。亦每天以約0.117 mM之濃度添加鋅作為饋料補充物，其中製備培養基中之平均濃度為約0.0154 mM。
在培養14天之後收穫抗體，且在純化之後使用HILIC測定岩藻糖基化聚醣之含量。結果呈現於表4中。表 4 ：用尿苷、錳、半乳糖及鋅進行細胞培養補充之後的代表性聚醣含量
實例 3 ：離胺酸及精胺酸對產物品質特徵之影響
| 批號 | G0F+G1F+G2F | G1F | G0F | G2F |
| 1 | 93.08 | 35.47 | 52.01 | 5.60 |
| 2 | 93.05 | 35.59 | 51.89 | 5.57 |
| 3 | 92.94 | 36.23 | 50.57 | 6.14 |
| 4 | 93.17 | 35.29 | 52.35 | 5.53 |
| 5 | 92.74 | 35.43 | 51.70 | 5.61 |
| 6 | 92.86 | 36.26 | 50.45 | 6.15 |
此實驗之目標為測試饋料培養基中之離胺酸及精胺酸含量對維多珠單抗品質特徵，尤其效價及鹼性種類百分比的影響。
設計：實驗經設計用於評估當在GS-CHO細胞中製備時離胺酸及精胺酸濃度對抗體效價以及如藉由CEX所測定之鹼性種類含量(C端離胺酸含量)的影響。以類似於實例1及2之方式進行測試。
結果：比較不同精胺酸及離胺酸濃度對鹼性種類百分比之影響的結果顯示於圖3A中，且顯示對抗體效價之影響的結果描述於圖3B中。如表5中所概述，圖3A與3B之X軸上之標記對應於高(H)、中(M)或低(L)濃度之離胺酸及精胺酸。舉例而言，「LM」指低含量之離胺酸(參見表5)及中等含量之精胺酸(參見表5)。此等結果表明低含量之離胺酸及精胺酸導致鹼性種類之極低程度減少，但相對於對照低含量之此等胺基酸負面地影響抗體效價(5-4 g，約20%)。表 5 ：精胺酸及離胺酸濃度之概述
| 胺基 | 對照 | 低 | 中 | 高 |
| 離胺酸(g/L) | 8.80 | 5.0 | 6.0 | 7.1 |
| 精胺酸(g/L) | 12.0 | 3.0 | 6.4 | 9.9 |
基於arg/lys實驗進行預測分析。JMP分析預測減少鹼性種類之最佳條件為在低離胺酸及低精胺酸含量下，如圖4A中所描述為(LL)。圖4B及4C顯示「LM」(低離胺酸及中精胺酸)「LH」(低離胺酸及高精胺酸)組合的預測型態。然而，由於效價產生影響，在實例4中使用低離胺酸(5 g/L)及中精胺酸(6.5 g/L)含量。實例 4 ：鋅對產物品質特徵之影響
此實驗之目標為測試在細胞培養期間，更特定而言在培養系統之製備階段期間鋅含量對維多珠單抗品質特徵之影響。
如下文表6中所描述，測試三種含量之鋅。培養物在第14天至第18天收穫範圍內。以22x UMG與減少之離胺酸及精胺酸(如實例3中所描述之「LM」)之組合對鋅補充物進行評估。饋料中離胺酸及精胺酸之濃度分別為5 g/L及6.4 g/L。表 6. 在製備階段期間饋料培養基中之鋅濃度
*0 Zn意謂未將其他Zn補充物添加至饋料培養基中
| 0 鋅 * | 2 鋅 | 4 鋅 | |
| [ 鋅 ] uM | 14.3 | 28.6 | 57.2 |
如圖5A中所描述，所測試之鋅濃度對抗體效價沒有實質性影響。圖A中亦描述關於製備培養天數之影響，其中延長之培養天數顯示對效價產生之益處。圖5B至5G提供對鋅對於培養14、15、16、17及18天之後鹼性種類百分比(圖5B)、酸性種類百分比(圖5C)、主要種類百分比(圖5D)、G0F種類百分比(圖5E)、G1F種類百分比(圖5F)、G2F種類百分比(圖5G)及聚醣種類總和(圖5H)之影響的檢驗。
如圖5B及5C中所描述，隨鋅含量增加，在鹼性及酸性型態中觀測到降低之趨勢。進一步觀測到到培養第16天時達成類似鹼性型態。如圖5D中所描述，在57.2 uM鋅(4Zn)情況下，在第14天收穫時獲得最高之主要(主)種類含量。
鋅含量及培養天數對碳水化合物型態顯示極小之影響。總體而言，圖5A至5H中之資料表明結束培養及收穫不遲於第16天。
亦測試溫度與各種鋅濃度之組合以確定對維多珠單抗之各種產物品質是否存在影響。測試33、35及37攝氏度溫度與0至4含量之鋅的組合(參見上表6)。總體而言，37度對於維持所需維多珠單抗產物品質最有效。舉例而言，圖6A描述在各種鋅條件及溫度下抗體之鹼性同種型%。在33°C及37°C下補充57.2 uM鋅(4Zn)之後鹼性種類百分比含量降至指定鹼性種類(同種型)上限(由黑色線指示，亦即，13%鹼性抗體同種型(CEX))以下且因此滿足本說明書要求。相比之下，如圖6B中所示，在37°C下補充57.2 uM鋅(4Zn)之後聚醣總和降至接受準則下限(由黑色線指示)以上，但33°C並非如此。另外，如圖6C中所描述，觀測到在較低溫度下存在蛋白質聚集(HMW種類；接受準則指示為約1.4%或更少)增加。圖6D中之資料表明效價產生因延長之培養天數而受益，且在第14天與33°C及35°C相比37°C總體上產生更大之維多珠單抗效價。圖6E中之資料表明抗體之酸性種類隨溫度增加且隨培養延長而增加。圖6E中之黑色實線表示酸性種類之接受極限上限。
總體而言，圖6A至6E中之資料表明對於在GS-CHO細胞中製備維多珠單抗到第16天停止醱酵且維持接近37度之製備溫度為最佳的。另外，4 Zn作為補充物提供益處。實例 5 ：培養天數對產物品質特徵之影響
此實驗之目標為測試培養天數對維多珠單抗品質特徵之影響。
在兩次單獨運行之後在GS-CHO細胞中培養12、13、14、15、16或17天之後對抗體之酸性種類百分比、抗體之鹼性種類百分比、抗體之主要種類百分比及維多珠單抗之效價進行評估。
如圖7D中所示，隨培養天數延長觀測到效價增加。然而，分別如圖7A及7B中所描述，此效價增加伴隨著酸性種類增加及主要種類減少。在運行1期間鹼性種類似乎不受影響，但在運行2期間觀測到使鹼性種類增加之趨勢。資料表明到第16天停止醱酵且收穫總體上為最佳的。當到第15天收穫抗體時獲得最低之酸性種類含量。實例 6 ： pH 值對產物品質特徵之影響
此實驗之目標為測試在製備階段細胞培養期間pH值對維多珠單抗品質特徵之影響。特定而言，針對對維多珠單抗品質特徵之影響對在製備階段培養基中引入pH轉變進行評估。
製備階段培養基之初始pH值經評估在pH 6.8至pH 7.2範圍內。在pH轉變期間，培養基之pH值降低至最終pH值，該最終pH值經評估在pH 6.6至pH 7.0範圍內。所研究之pH轉變起始時間為86小時至108小時且pH轉變完成時間(亦即，達至最終pH值之時間)為88小時至144小時。中間2-36小時之間隔解釋了pH值漸變時間。
在等於或高於pH 6.7之最終pH值(圖8A)及等於或低於122小時之pH轉變完成時間(圖8B)下觀測到最高主要抗體同種型%(測定藉由CEX)及最低酸性抗體同種型%(藉由CEX測定)。此資料表明在維多珠單抗製備中製備階段細胞培養期間之pH轉變可降低酸性抗體同種型種類之含量。實例 7 ：產物品質特徵之測定
前述實例中使用以下分析分析及方法來測定維多珠單抗之產物品質特徵。
陽離子交換層析(CEX)根據總表面電荷將維多珠單抗抗體種類(主要同種型、鹼性種類及酸性種類)分級。在使用移動相稀釋至低離子強度之後，將測試樣品注射至在10 mM磷酸鈉(pH 6.6)中平衡之Dionex Pro-PacTM
WCX-10管柱(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA (USA))上，且在相同緩衝液中使用氯化鈉梯度溶離。在280 nm下監測蛋白質溶離，且將峰分配為酸性、鹼性或主要同種型類別。報道主要同種型百分比、酸性種類百分比總和及鹼性種類百分比總和。將樣品之主要同種型滯留時間與參考標準相比較以確定一致性。
藉由親水性相互作用相分離(HILIC)將游離螢光標記碳水化合物分級來產生維多珠單抗之碳水化合物型態。藉由用N-糖苷酶F消化使完整聚醣自蛋白質樣品釋放，接著即刻使用來自Prozyme (Hayward, CA (USA))之GlykoPrep快速醣蛋白樣品製備系統用InstantAB螢光標籤(Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA (USA))標記。使用ACQUITY UPLC BEH醯胺管柱(Waters Corporation, Milford, MA (USA))及乙腈/甲酸銨梯度系統將經標記之聚醣分級。使用278 nm之激發波長藉由在344 nm下之螢光發射來達成偵測。藉由確定市售InstantAB標記之葡萄糖均聚物梯形帶(Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA(USA))之適當解析來進行分析對照。基於所偵測之糖的相對面積百分比進行定量。報道G0F (去唾液酸基-非半乳糖基化雙觸角聚醣，核心岩藻糖基化)；G1F (去唾液酸基-單半乳糖基化雙觸角聚醣，核心岩藻糖基化)；及G2F (去唾液酸基-雙半乳糖基化雙觸角聚醣，核心岩藻糖基化)種類之峰面積百分比。
使用尺寸排阻層析(SEC)來測定維多珠單抗之純度。使用串聯連接之兩個G3000 SWxl管柱(Tosoh Bioscience, King of Prussia, PA (USA))及等度磷酸鹽-氯化鈉緩衝系統(pH 6.8)對參考標準及測試樣品(75 μg)進行分析。該方法提供抗體單體與高分子量(HMW)種類以及低分子量(LMW)降解產物之分離。在280 nm下監測蛋白質種類之溶離。對主要峰(單體)及總峰面積進行評估以確定純度。報道樣品之純度(%) (計算為單體%)及聚集物%。等效物
熟習此項技術者將認識到或能夠僅僅使用常規實驗確定本文所描述之本發明特定實施例的許多等效物。此類等效物旨在由以下申請專利範圍涵蓋。本申請案中所引用之所有參考文獻、專利及公佈之專利申請案的內容以引用之方式併入本文中。序列表
| SEQ ID NO: | 描述 | 序列 |
| 1 | 重鏈(HC)可變區(胺基酸) | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKGSGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGEIDPSESNTNYNQKFKGRVTLTVDISASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYDGWDYAIDYWGQGTLVTVSS |
| 2 | HC CDR1 (胺基酸) | SYWMH |
| 3 | HC CDR2 (胺基酸) | EIDPSESNTNYNQKFKG |
| 4 | HC CDR3 (胺基酸) | GGYDGWDYAIDY |
| 5 | 輕鏈(LC)可變區(胺基酸) | DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLAKSYGNTYLSWYLQKPGQSPQLLIYGISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGTHQPYTFGQGTKVEIK |
| 6 | LC CDR1 (胺基酸) | RSSQSLAKSYGNTYLS |
| 7 | LC CDR2 (胺基酸) | GISNRFS |
| 8 | LC CDR3 (胺基酸) | LQGTHQPYT |
| 9 | 輕鏈可變區(核酸) | GATGTAGTGATGACTCAAAGTCCACTCTCCCTGCCTGTCACCCCTGGAGAACCAGCTTCTATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGTCTTGCAAAGAGTTATGGGAACACCTATTTGTCTTGGTACCTGCAGAAGCCTGGCCAGTCTCCACAGCTCCTCATCTATGGGATTTCCAACAGATTTTCTGGGGTGCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGTTCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCTCGCGAGTAGAGGCTGAGGACGTGGGAGTGTATTACTGCTTACAAGGTACACATCAGCCGTACACGTTCGGACAGGGGACCAAGGTGGAGATCAAG |
| 10 | 重鏈可變區(核酸) | CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTTAAGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGGTGTCCTGCAAGGGTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCATTGGGTGAGGCAGGCGCCTGGCCAACGTCTAGAGTGGATCGGAGAGATTGATCCTTCTGAGAGTAATACTAACTACAATCAAAAATTCAAGGGACGCGTCACATTGACTGTAGACATTTCCGCTAGCACAGCCTACATGGAGCTCTCCAGCCTGAGATCTGAGGACACTGCGGTCTACTATTGTGCAAGAGGGGGTTACGACGGATGGGACTATGCTATTGACTACTGGGGTCAAGGCACCCTGGTCACCGTCAGCTCA |
| 11 | 輕鏈(核酸) | GATGTAGTGATGACTCAAAGTCCACTCTCCCTGCCTGTCACCCCTGGAGAACCAGCTTCTATCTCTTGCAGGTCTAGTCAGAGTCTTGCAAAGAGTTATGGGAACACCTATTTGTCTTGGTACCTGCAGAAGCCTGGCCAGTCTCCACAGCTCCTCATCTATGGGATTTCCAACAGATTTTCTGGGGTGCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGTTCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCTCGCGAGTAGAGGCTGAGGACGTGGGAGTGTATTACTGCTTACAAGGTACACATCAGCCGTACACGTTCGGACAGGGGACCAAGGTGGAGATCAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT |
| 12 | 重鏈(核酸) | CAGGTGCAATTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTTAAGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGGTGTCCTGCAAGGGTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCATTGGGTGAGGCAGGCGCCTGGCCAACGTCTAGAGTGGATCGGAGAGATTGATCCTTCTGAGAGTAATACTAACTACAATCAAAAATTCAAGGGACGCGTCACATTGACTGTAGACATTTCCGCTAGCACAGCCTACATGGAGCTCTCCAGCCTGAGATCTGAGGACACTGCGGTCTACTATTGTGCAAGAGGGGGTTACGACGGATGGGACTATGCTATTGACTACTGGGGTCAAGGCACCCTGGTCACCGTCAGCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA |
| 13 | 重鏈胺基酸序列 | QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKGSGYTFTSYWMHWVRQAPGQRLEWIGEIDPSESNTNYNQKFKGRVTLTVDISASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYDGWDYAIDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK |
| 14 | 輕鏈胺基酸序列 | DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLAKSYGNTYLSWYLQKPGQSPQLLIYGISNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQGTHQPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC |
圖 1
提供基於測試各種培養條件之實驗由預測分析器得到之結果，該各種培養條件包括製備細胞培養物之pH值、溫度、半乳糖Gal+添加、UMG之添加及饋送策略條件。圖 2A-2H
圖解展示比較尿苷、半乳糖及錳(UMG)補充(33xUMG、50xUMG及66xUMG)及pH值(pH 7.05與pH 6.85)對抗體效價(圖2A)、酸性種類(圖2B)、鹼性種類(圖2C)、主要種類之百分比(圖2D)、G0F種類之百分比(圖2E)、G1F種類之百分比(圖2F)、G2F種類之百分比(圖2G)及聚醣種類總和(圖2H)之影響的結果。顯示無UMG補充情況下之結果(如「+」符號由所指示)用於比較。圖 3A 及 3B
圖解展示比較不同精胺酸及離胺酸濃度對鹼性種類之百分比(圖3A)及抗體效價(圖3B)之影響的結果。X軸上之標記對應於如表5中所概述之高(H)、中(M)或低(L)濃度之離胺酸及精胺酸。圖 4A-4C
. 由使用不同含量之離胺酸及精胺酸之培養條件的JMP分析得到的最大合意性預測結果(低離胺酸及低精胺酸(LL)-圖4A；低離胺酸及中精胺酸(LM)-圖4B；低離胺酸及高精胺酸(LH)-圖4C)。對應於高(H)、中(M)或低(L)濃度之離胺酸及精胺酸的濃度概述於表5中。圖 5A-5H
圖解展示比較在培養14、15、16、17及18天之後鋅對抗體效價(圖5A)、鹼性種類之百分比(圖5B)、酸性種類之百分比(圖5C)、主要種類之百分比(圖5D)、G0F種類之百分比(圖5E)、G1F種類之百分比(圖5F)、G2F種類之百分比(圖5G)及聚醣種類總和(圖5H)之影響的時間過程資料。x軸上之數字對應於表6中所概述之鋅濃度。圖 6A-6E
圖解展示比較鋅、培養天數及溫度(33°C、35°C及37°C)對鹼性種類之百分比(圖6A)、聚醣種類總和(圖6B)、聚集物(高分子量(HMW))形成(圖6C)、效價(圖6D)及酸性同種型(圖6E)之影響的時間過程資料。圖6A、6C及6E中之黑色實線表示各特徵之方法準則上限，而圖6B中之黑色線表示接受準則下限。x軸上之數字對應於表6中所概述之鋅濃度。圖 7A-7D
圖解展示比較來自兩組實驗之維多珠單抗培養之天數對酸性種類之百分比(圖7A)、鹼性種類之百分比(圖7B)、主要種類之百分比(圖7C)及抗體效價(圖7D)之影響的時間過程資料。圖 8A-8B
圖解展示同種型分佈與pH轉變參數之間的相關性。圖8A展示最終細胞培養pH值(pH轉變之後)與酸性同種型種類%(左側圖)或主要同種型%(右側圖)之間的相關性。圖8B展示pH轉變持續時間與酸性同種型種類%(左側圖)或主要同種型%(右側圖)之間的相關性。圖 9
展示可存在於抗α4β7抗體(諸如維多珠單抗)之群體中之N-聚醣的結構。
Claims (120)
- 一種製備包含人類化抗α4β7抗體之組合物之方法，該方法包括 在製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，及 將包含尿苷、錳及半乳糖之補充物添加至該製備培養基中，由此製備包含該人類化抗α4β7抗體之組合物， 其中該哺乳動物宿主細胞經遺傳工程化以表現人類化抗α4β7抗體，其為IgG1抗體，包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 4中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 3中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 2中所列之CDR1結構域；且包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 8中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 7中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 6中所列之CDR1結構域。
- 如請求項1之方法，其中與在實質上相似條件下但在不存在該補充物之情況下培養之表現該人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，該組合物包含降低量之該人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型(如藉由陽離子交換層析(CEX)所測定)。
- 如請求項1之方法，其中該組合物包含約16%或更少之該人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型(如藉由CEX所測定)。
- 如請求項3之方法，其中該組合物包含約14%或更少之該人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型。
- 如請求項3之方法，其中該組合物包含約13%或更少之該人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型。
- 如請求項1至5中任一項之方法，其中將該補充物添加至該製備培養基中或添加至隨後添加至該製備培養基中之饋料培養基中。
- 如請求項1-6中任一項之方法，其中該製備培養基中尿苷之平均濃度為約1至約7 mM；其中該製備培養基中錳之平均濃度為約0.002至約0.015 mM；及/或其中該製備培養基中半乳糖之平均濃度為約3至約20 mM。
- 如請求項1-7中任一項之方法，其中該饋料培養基進一步包含鋅。
- 如請求項8之方法，其中該製備培養基中鋅之平均濃度為約0.05 mM至約0.045 mM。
- 如請求項1-9中任一項之方法，其中相對於在實質上相似條件下但在不存在該補充物之情況下培養之表現該人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞中產生之酸性種類的百分比，該方法進一步降低該人類化抗α4β7抗體之酸性種類之百分比。
- 如請求項1-10中任一項之方法，其中該方法為分批饋料方法。
- 如請求項16之方法，其中該方法為製備階段且其中在該製備階段之約第四天開始將該補充物添加至該製備培養基中。
- 一種製備包含人類化抗α4β7抗體之組合物之方法，該方法包括在包含鋅之製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，由此製備包含該人類化抗α4β7抗體之組合物， 其中該哺乳動物宿主細胞經遺傳工程化以表現人類化抗α4β7抗體，其為IgG1抗體，包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 4中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 3中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 2中所列之CDR1結構域；且包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 8中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 7中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 6中所列之CDR1結構域。
- 如請求項13之方法，其中與在相同條件下在不存在鋅之情況下培養之表現該人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，該組合物包含降低量之該人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型。
- 如請求項14之方法，其中該組合物包含約16%或更少之該人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型。
- 如請求項15之方法，其中該組合物包含約14%或更少之該人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型。
- 如請求項15之方法，其中該組合物包含約13%或更少之該人類化抗α4β7抗體之鹼性同種型。
- 如請求項13-17中任一項之方法，其中該製備培養基中鋅之濃度為2 μM至60 μM。
- 如請求項13-18中任一項之方法，其中該方法包括藉由將包含鋅之饋料培養基添加至該製備培養基中來為該製備培養基補充鋅。
- 如請求項19之方法，其中在製備階段之約第四天開始將該饋料培養基添加至該製備培養基中。
- 如請求項1-20中任一項之方法，其中該製備培養基包含5.0至8.8 g/L離胺酸及3.0至12.0 g/L精胺酸。
- 如請求項21之方法，其中該製備培養基包含4.5至5.5 g/L離胺酸。
- 如請求項21之方法，其中該製備培養基包含5.5至8.8 g/L離胺酸。
- 如請求項21-23中任一項之方法，其中該製備培養基包含5.4至7.4 g/L精胺酸。
- 如請求項21-23中任一項之方法，其中該製備培養基包含7.4至12 g/L精胺酸。
- 一種製備包含人類化抗α4β7抗體之組合物之方法，該方法包括 在製備階段中在製備培養基中培養哺乳動物宿主細胞，使得產生包含該人類化抗α4β7抗體之組合物，其中該製備培養基具有約37攝氏度之平均溫度，其中該宿主細胞經遺傳工程化以表現人類化IgG1抗α4β7抗體，其中該人類化抗α4β7包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 4中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 3中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 2中所列之CDR1結構域；且包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 8中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 7中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 6中所列之CDR1結構域。
- 如請求項26之方法，其中該方法為製備包含2.5%或更少之該人類化抗α4β7抗體之HMW種類(如藉由SEC所測定)之組合物的方法。
- 一種製備包含人類化抗α4β7抗體之組合物之方法，該方法包括 在擴增階段中在生長培養基中培養哺乳動物宿主細胞，其中該哺乳動物宿主細胞經遺傳工程化以表現人類化抗α4β7抗體，及 在製備階段中在製備培養基中培養該哺乳動物宿主細胞，使得產生包含該人類化抗α4β7抗體之組合物， 其中在該擴增階段與該製備階段中在大致相同之溫度下培養該哺乳動物宿主細胞，且 其中該人類化抗α4β7抗體為IgG1抗體；包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 4中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 3中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 2中所列之CDR1結構域；且包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 8中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 7中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 6中所列之CDR1結構域。
- 如請求項28之方法，其中該方法為相對於在實質上相似條件下但在該擴增階段與該製備階段之間使用不同溫度培養之對照培養物，製備包含高含量之該人類化抗α4β7抗體之單體(如藉由SEC所測定)之組合物的方法。
- 如請求項28或29之方法，其中該溫度為36至38攝氏度。
- 如請求項328-30中任一項之方法，其中平均溫度為36.5至37.5攝氏度。
- 如請求項28或29之方法，其中該溫度為約37攝氏度之平均溫度。
- 如請求項1-29中任一項之方法，其中該製備培養基具有36至38攝氏度之溫度範圍。
- 如請求項33之方法，其中該溫度範圍為36.5至37.5攝氏度。
- 如請求項33之方法，其中該溫度為約37攝氏度之平均溫度。
- 如請求項1-35中任一項之方法，其中該製備培養基具有在6.5至7範圍內之pH值。
- 如請求項36之方法，其中該製備培養基具有在6.8至7.0範圍內之pH值。
- 如請求項1-37中任一項之方法，其中在該製備階段期間該製備培養基具有維持在約7 g/L下或更低之葡萄糖含量。
- 如請求項1-37中任一項之方法，其中該製備階段為14天或更短時間。
- 如請求項1-37中任一項之方法，其中該製備階段在10天至17天範圍內。
- 如請求項1-40中任一項之方法，其在大規模生物反應器中進行。
- 如請求項41之方法，其中該大規模生物反應器選自由以下組成之群：200公升(L)生物反應器、2000 L生物反應器、3000 L及6000 L生物反應器。
- 如請求項1-42中任一項之方法，其中該製備階段產生大於3 g/L之該人類化抗α4β7抗體之效價。
- 如請求項32之方法，其中該人類化抗α4β7抗體之效價為約3至約8 g/L。
- 如請求項44之方法，其中該人類化抗α4β7抗體之效價為約5至約7 g/L。
- 如請求項1-45中任一項之方法，其中該哺乳動物宿主細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
- 如請求項46之方法，其中該CHO細胞為GS-CHO細胞。
- 如請求項1-47中任一項之方法，其中該人類化抗α4β7抗體包含重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域包含如SEQ ID NO: 1中所列之胺基酸序列，且包含輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域包含如SEQ ID NO: 5中所列之胺基酸序列。
- 如請求項1-47中任一項之方法，其中該人類化抗α4β7抗體為維多珠單抗(vedolizumab)。
- 如請求項1-49中任一項之方法，其中該方法包括收穫及純化該抗體。
- 如請求項550之方法，其中該純化包括(i)移除任何細胞碎屑、不想要之蛋白質、鹽、礦物質或其他不需要之分子的純化步驟，及(ii)自污染性可溶性蛋白質及多肽純化該抗體。
- 如請求項50或51之方法，其中該方法進一步包括製備適合於人類治療用途之經純化抗體之醫藥調配物。
- 如請求項52之方法，其中該醫藥調配物為液體醫藥調配物。
- 如請求項42之方法，其中該液體醫藥調配物藉由超濾/滲濾製備。
- 如請求項52之方法，其中該醫藥調配物為凍乾之乾燥抗體調配物。
- 如請求項55之方法，其中該抗體之該醫藥調配物為自在該純化之後藉由超濾/滲濾製備之液體醫藥抗體調配物凍乾的乾燥抗體調配物。
- 一種組合物，其包含使用如請求項1-56之方法中之任一者製備的人類化抗α4β7抗體。
- 一種包含人類化抗α4β7抗體之組合物，其中該組合物可藉由如請求項1-56之方法中之任一者獲得。
- 如請求項57或58之組合物，其包含人類化抗α4β7抗體之群體，具有(i) 90%或更多，或(ii) 92-95%之去唾液酸基去半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G0F)、去唾液酸基-單半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G1F)及/或去唾液酸基-二半乳糖基核心岩藻糖基化雙觸角聚醣(G2F)糖基化變異體總量。
- 如請求項1之方法，其中該方法為與在實質上相似條件下但在不存在該補充物之情況下培養之表現該人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，製備具有降低量之人類化抗α4β7抗體之G0F糖型(如藉由親水性相互作用層析(HILIC)所測定)之組合物的方法。
- 如請求項60之方法，其中與在實質上相似條件下在不存在該補充物之情況下培養之表現該人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，該組合物包含降低至少約15%之該人類化抗α4β7抗體之該G0F糖型的含量。
- 如請求項61之方法，其中與在實質上相似條件下在不存在該補充物之情況下培養之表現該人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，該組合物包含減少至少約20%之該人類化抗α4β7抗體之該G0F糖型。
- 如請求項1之方法，其中該方法為製備具有約65%或更少之該人類化抗α4β7抗體之G0F糖型(如藉由HILIC所測定)之組合物的方法。
- 如請求項63之方法，其中該組合物包含約60%或更少之該人類化抗α4β7抗體之G0F糖型。
- 如請求項63之方法，其中該組合物包含約55%或更少之該人類化抗α4β7抗體之G0F糖型。
- 如請求項1之方法，其中該方法為與在實質上相似條件下在不存在該補充物之情況下培養之表現該人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，製備具有增加量之該人類化抗α4β7抗體之G1F糖型(如藉由HILIC所測定)之組合物的方法。
- 如請求項66之方法，其中與該對照相比，該組合物包含增加至少約2倍之該人類化抗α4β7抗體之該G1F糖型。
- 如請求項66之方法，其中與該對照相比，該組合物包含增加至少約3倍之該人類化抗α4β7抗體之該G1F糖型。
- 如請求項1之方法，其中該方法為製備具有約25%或更多之該人類化抗α4β7抗體之G1F糖型(如藉由HILIC所測定)之組合物的方法。
- 如請求項69之方法，其中該組合物包含約30%或更多之該人類化抗α4β7抗體之G1F糖型。
- 如請求項1之方法，其中該方法為與在實質上相似條件下在不存在該補充物之情況下培養之表現該人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞相比，製備具有增加量之該人類化抗α4β7抗體之G2F糖型(如藉由HILIC所測定)之組合物的方法。
- 如請求項71之方法，其中與該對照相比，該組合物包含增加至少約3倍之該人類化抗α4β7抗體之該G2F糖型。
- 如請求項71之方法，其中與該對照相比，該組合物包含增加至少約4倍之該人類化抗α4β7抗體之該G2F糖型。
- 如請求項1之方法，其中該方法為製備具有約3%或更多之該人類化抗α4β7抗體之G2F糖型(如藉由HILIC所測定)之組合物的方法。
- 如請求項74之方法，其中該組合物包含約4%或更多之該人類化抗α4β7抗體之G2F糖型。
- 如請求項60-75中任一項之方法，其中該製備培養基中尿苷之平均濃度為約1至約7 mM；其中該製備培養基中錳之平均濃度為約0.002至約0.015 mM；及/或其中該製備培養基中半乳糖之平均濃度為約3至約20 mM。
- 如請求項60-76中任一項之方法，其中該製備培養基進一步包含鋅。
- 如請求項77之方法，其中該製備培養基中鋅之平均濃度為約5 μM至45 μM。
- 如請求項60-78中任一項之方法，其中相對於在實質上相似條件下在不存在該補充物之情況下培養之表現該人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞中產生之酸性種類之百分比，該方法進一步降低該人類化抗α4β7抗體之酸性種類之百分比。
- 如請求項60-78中任一項之方法，其中相對於在實質上相似條件下在不存在添加至該製備培養基中之包含尿苷、錳及半乳糖之饋料培養基的情況下培養之表現該人類化抗α4β7抗體的對照哺乳動物宿主細胞中產生之主要同種型種類之百分比，該方法進一步增加該人類化抗α4β7抗體之主要同種型種類之百分比。
- 如請求項60-80中任一項之方法，其中該方法為分批饋料方法。
- 如請求項60-81中任一項之方法，其中在該製備階段之約第四天開始將該饋料培養基添加至該製備培養基中。
- 如請求項60-82中任一項之方法，其中該製備培養基具有約6.8至約7.1之pH值。
- 如請求項60-83中任一項之方法，其中該方法包括收穫及純化該抗體。
- 如請求項84之方法，其中該純化包括(i)移除任何細胞碎屑、不想要之蛋白質、鹽、礦物質或其他不需要之分子的純化步驟，及(ii)自污染性可溶性蛋白質及多肽純化該抗體。
- 如請求項60-83中任一項之方法，其中該方法進一步包括製備適合於人類治療用途之經純化抗體之醫藥調配物。
- 如請求項86之方法，其中該醫藥調配物為液體醫藥調配物。
- 如請求項87之方法，其中該液體醫藥調配物藉由超濾/滲濾製備。
- 如請求項86之方法，其中該醫藥調配物為凍乾之乾燥抗體調配物。
- 如請求項85之方法，其中該抗體之該醫藥調配物為自在該純化之後藉由超濾/滲濾製備之液體醫藥抗體調配物凍乾的乾燥抗體調配物。
- 一種包含人類化抗α4β7抗體之組合物，其中該組合物可藉由如請求項60-83之方法中之任一者獲得。
- 一種細胞培養物，其包含經遺傳工程化以表現人類化抗α4β7抗體之宿主細胞及補充有尿苷、錳及半乳糖(UMG)之製備培養基，其中該人類化抗α4β7抗體為IgG1抗體且包含含有SEQ ID NO:1中所列之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO: 5中所列之胺基酸序列之輕鏈可變區。
- 如請求項92之細胞培養物，其中該製備培養基包含濃度為約1至約7 mM之尿苷、濃度為約0.002至約0.015 mM之錳及濃度為約3至約20 mM之半乳糖。
- 如請求項92之細胞培養物，其中該製備培養基包含濃度為約20至70 mM之尿苷、濃度為約0.04至0.15 mM之錳及濃度為約160至340 mM之半乳糖。
- 如請求項92-94中任一項之細胞培養物，其中該製備培養基進一步包含鋅。
- 如請求項95之細胞培養物，其中該製備培養基包含濃度為約0.005 mM至0.045 mM之鋅。
- 如請求項92-96中任一項之細胞培養物，其中該抗體包含含有SEQ ID NO:1中所列之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO: 5中所列之胺基酸序列之輕鏈可變區。
- 一種細胞培養物，其包含經遺傳工程化以表現人類化抗α4β7抗體之宿主細胞及補充有鋅之製備培養基，其中該人類化抗α4β7抗體為IgG1抗體且包含含有SEQ ID NO:1中所列之胺基酸序列之重鏈可變區及含有SEQ ID NO: 5中所列之胺基酸序列之輕鏈可變區。
- 如請求項98之細胞培養物，其中該製備培養基包含濃度為約0.005 mM至0.045 mM之鋅。
- 如請求項98或99之細胞培養物，其中該製備培養基進一步包含尿苷、錳及半乳糖(UMG)。
- 如請求項100之細胞培養物，其中該製備培養基包含濃度為約1至約7 mM之尿苷、濃度為約0.002至約0.015 mM之錳及濃度為約3至約20 mM之半乳糖。
- 如請求項100之細胞培養物，其中該製備培養基包含濃度為約2至約5 mM之尿苷、濃度為約0.001至約0.01 mM之錳及濃度為約10至約15 mM之半乳糖。
- 如請求項92-102中任一項之細胞培養物，其中所表現之人類化抗α4β7抗體具有包含以下之同種型分佈： a. 16%或更少、15%或更少、14%或更少、13%或更少或12%或更少之鹼性同種型；及/或 b. 至少65%、至少68%、至少70%、至少72%或至少75%之主要同種型。
- 如請求項92-103中任一項之細胞培養物，其中該所表現之人類化抗α4β7抗體具有包含以下之岩藻糖基化N-聚醣含量： a. 65%或更少、60%或更少或55%或更少之G0F； b. 25%或更多、27%或更多或30%或更多之G1F；及/或 c. 2.5%或更多、3%或更多、3.5%或更多、4%或更多或4.5%或更多之G2F。
- 如請求項92-104中任一項之細胞培養物，其中該所表現之人類化抗α4β7抗體具有至少92%、至少93%、至少94%或至少95%之總岩藻糖基化N-聚醣含量(G0F + G1F + G2F)。
- 如請求項92-104中任一項之細胞培養物，其中該所表現之人類化抗α4β7抗體具有92-95%之總岩藻糖基化N-聚醣含量(G0F + G1F + G2F)。
- 如請求項92-104中任一項之細胞培養物，其中該所表現之人類化抗α4β7抗體具有91-92%、91-92.5%或91-93%之總岩藻糖基化N-聚醣含量(G0F + G1F + G2F)。
- 如請求項92-104中任一項之細胞培養物，其中該細胞培養物進一步包含精胺酸及/或離胺酸。
- 如請求項92-108中任一項之細胞培養物，其中該宿主細胞為CHO細胞。
- 如請求項109之細胞培養物，其中該CHO細胞缺乏編碼麩醯胺合成酶(GS)之基因。
- 一種人類化抗α4β7抗體，其係藉由如請求項92-110中任一項之細胞培養物製備。
- 一種製備包含人類化抗α4β7抗體之組合物之方法，該方法包括 在具有第一pH值之第一製備培養基中培養經遺傳工程化以表現該人類化抗α4β7抗體之哺乳動物宿主細胞；及 在具有第二pH值之第二製備培養基中培養該哺乳動物宿主細胞； 其中該第二pH值低於該第一pH值，且 其中該人類化抗α4β7抗體為IgG1抗體；包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含如SEQ ID NO: 4中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 3中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 2中所列之CDR1結構域；且包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 8中所列之CDR3結構域、如SEQ ID NO: 7中所列之CDR2結構域及如SEQ ID NO: 6中所列之CDR1結構域。
- 如請求項112之方法，其中該第二pH值比該第一pH值低0.1至0.5個pH單位。
- 如請求項112或113之方法，其中該第一pH值在pH 6.8-7.2範圍內，且其中該第二pH值在pH 6.7-6.95範圍內。
- 如請求項112-114中任一項之方法，其中將該哺乳動物宿主細胞在該第一pH值下培養120小時或更短時間。
- 如請求項112-115中任一項之方法，其中將該哺乳動物宿主細胞在該第一pH值下培養85-110小時。
- 如請求項112-116中任一項之方法，其中將該哺乳動物宿主細胞在該第一pH值下培養90-100小時。
- 如請求項112-117中任一項之方法，其進一步包括自該第二製備培養基收穫該抗α4β7抗體。
- 如請求項118之方法，其中在該第一製備培養基及該第二製備培養基中培養該哺乳動物宿主細胞13-15天之時間之後收穫該抗α4β7抗體。
- 如請求項112-119中任一項之方法，其中相對於在無pH變化之情況下在該第一pH值下培養該哺乳動物宿主細胞之對照組合物，該組合物具有增加之該抗α4β7抗體主要同種型的含量。
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