JP2022536658A - 抗体生産のための細胞培養方法及び組成物 - Google Patents

抗体生産のための細胞培養方法及び組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、抗α４β７抗体、例えば、ベドリズマブ、及びその組成物を生産するための細胞培養法を提供する。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、２０１９年６月１０日に出願された米国仮出願番号６２／８５９，５６３及び２０１９年６月１０日に出願された米国仮出願番号６２／８５９，５９６に対する優先権を主張する。前述の優先出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２０年６月１０日に作成された上述のＡＳＣＩＩコピーは、「Ｔ１０３０２２＿１１１０ＷＯ＿ＳＬ．ＴＸＴ」という名称であり、１４．０キロバイトのサイズである。
本発明は、哺乳動物宿主細胞において抗α４β７抗体を生産するための方法及び組成物に関する。
哺乳動物の細胞培養技術は、治療用モノクローナル抗体を含む治療用生物製剤の製造に一般的に使用されている。哺乳動物細胞で生産されるタンパク質は一般に、ヒトにおいて生産されるタンパク質により類似した翻訳後修飾を有するため、哺乳動物細胞は通常、タンパク質生産のために他の形態の真核細胞（酵母など）または原核細胞（細菌など）よりも製薬業界において好ましい。しかしながら、哺乳動物細胞の培養は、これらの細胞が多くの課題を提示するため、特にヒトで使用するために商業規模で製造される治療用抗体の状況では困難な場合がある。生産方法は、タンパク質製品の安全性、効率、及び費用対効果を維持しながら、細胞からの抗体収量を最大化する必要がある。したがって、グリコシル化プロファイル、凝集体レベル、電荷の不均一性、及びアミノ酸配列の完全性など、製品の望ましい品質特性を維持する必要があるため、生産要求は重要である（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０，ｍＡｂｓ，２（５）：４６６－４７７）。
細胞培養プロセスの複雑さを考えると、高品質の医薬品を維持しながら、製造需要と治療の要求性を満たすのに十分なタンパク質製品を生産することを含む、治療用抗体の生産に関連する課題に対処できる細胞培養パラメーターを特定することは難しい場合がある。
哺乳動物細胞の培養プロセスは過去数十年にわたって研究の対象となってきたが、組換え抗体の大規模な商業的生産における改善の必要性が残っている。哺乳動物宿主細胞培養物の細胞生存率、寿命、及び比生産性の増加、ならびに生産される組換えタンパク質の力価の改善は、生産される組換えタンパク質の価格、ならびに治療用タンパク質の場合、医薬品の価格及び入手可能性に真の影響を及ぼす。さらに、そのような増加は、生産される治療用抗体の品質の一貫性を維持する必要性を考えると、特に困難である可能性がある。
本明細書で提供される本発明は、とりわけ、哺乳動物の宿主細胞における、ベドリズマブなどの抗α４β７抗体を生産するための細胞培養方法及び組成物を開示する。また、本明細書で提供されるのは、前記方法を用いて得られるベドリズマブなどの抗α４β７抗体を含む組成物である。
一態様では、本発明はヒト化抗α４β７抗体を含む組成物の生産方法であって、前記方法は、生産培地において哺乳動物宿主細胞を培養することと、ウリジン、マンガン、及びガラクトースを含む補充成分を生産培地添加することとを含み、それによって、ヒト化抗α４β７抗体を含む組成物を生産し、哺乳動物宿主細胞をＩｇＧ１抗体であり、配列番号４に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載のＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含み、配列番号８に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載のＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変ドメインを含む、ヒト化抗α４β７抗体を発現するように遺伝子操作されている、方法を提供する。
前述の態様のいくつかの実施形態では、この方法は、（陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）によって決定されるとき）ヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームの減少した量を有する組成物の生産方法であって、前記方法は、生産培地中で哺乳動物宿主細胞を培養することと、ウリジン、マンガン、及びガラクトースを含む補充成分を生産培地に前記添加することとを含み、それによって、補充成分の非存在下で培養されたヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、ヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームの減少した量を有する組成物を生産する、方法である。
上述の態様のいくつかの実施形態では、本発明は、（ＣＥＸによって決定されるとき）約１６％以下のヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームを有する組成物の生産方法であって、前記方法は、生産培地中で哺乳動物宿主細胞を培養することと、ウリジン、マンガン、及びガラクトースを含む補充成分を生産培地に前記添加することとを含み、それによって、約１６％以下のヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームを有する組成物を生産する、方法を特徴とする。
一実施形態では、組成物は、約１４％以下のヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームを含む。
別の実施形態では、組成物は、約１３％以下のヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームを含む。
一実施形態では、補充成分は、生産培地に添加されるか、または供給培地に添加された後にその供給培地が生産培地に添加される。
一実施形態では、補充と回収の間に生産培地に添加されるウリジンの累積濃度は、約１～約７ｍＭであり、補充と回収の間に生産培地に添加されるマンガンの累積濃度は、約０．００２～約０．０１５ｍＭであり、及び／または、補充と回収の間に生産培地に添加されるガラクトースの累積濃度は、約３～約２０ｍＭである。特定の実施形態では、供給培地は、亜鉛をさらに含む。一実施形態では、補充と回収の間に生産培地に添加される亜鉛の累積濃度は、約０．０５ｍＭ～約０．０４５ｍＭである。
一実施形態では、マンガンは、各添加ごとに約０．１～１０μＭ、約０．２～１．５μＭ、約０．２～５μＭ、約０．２５～２μＭ、約０．３～１．２μＭ、または約０．３～０．８μＭずつ、補充成分として生産培地に複数回添加される。特定の実施形態では、マンガンは、各添加ごとに約０．２～１．５μＭずつ、補充成分として生産培地に複数回添加される。
一実施形態では、ウリジンは、各添加ごとに約２５～１０００μＭ、約７５～７５０μＭ、約５５～６２０μＭ、約１００～６００μＭ、約１５０～４５０μＭ、約１００～７００μＭ、約１００～６００μＭ、または約１７０～６３０μＭずつ、補充成分として生産培地に複数回添加される。特定の実施形態では、ウリジンは、約１００～７００μＭずつ、補充成分として生産培地に複数回添加される。
一実施形態では、ガラクトースは、各添加ごとに、約０．１～１０ｍＭ、０．２～７．５ｍＭ、０．５～５ｍＭ、０．４～２．８ｍＭ、０．５～３．５ｍＭ、０．７～２．９ｍＭ、０．７５～２．５ｍＭ、または約１．２ｍＭもしくは１．４ｍＭずつ、補充成分として生産培地に複数回添加される。特定の実施形態では、ガラクトースは、約０．５～３．５ｍＭずつ、補充成分として生産培地に複数回添加される。
一実施形態では、補充成分は、毎日または２日ごとに添加される。特定の実施形態では、補充成分は、生産段階培養の４日目から添加される。
一実施形態では、ウリジンは、約１５～１２０ｍＭの最終濃度で供給培地に添加される。一実施形態では、ウリジンは、約２０～７０ｍＭのウリジンの最終濃度になるように供給培地に添加される。一実施形態では、ウリジンは、約１～４０ｍＭのウリジンの最終濃度になるように供給培地に添加される。
一実施形態では、マンガンは、約０．０２～０．３ｍＭの最終濃度で供給培地に添加される。一実施形態では、マンガンは、約０．０４～０．１５ｍＭの最終濃度になるように供給培地に添加される。一実施形態では、マンガンは、約０．０００１～０．１ｍＭの最終濃度になるように供給培地に添加される。
さらなる実施形態の実施形態では、ガラクトースは、約８５ｍＭ～６００ｍＭの最終濃度になるように供給培地に添加される。一実施形態では、ガラクトースは、約１６０～３４０ｍＭの最終濃度になるように供給培地に添加される。一実施形態では、ガラクトースは、約５０～１５０ｍＭの最終濃度になるように供給培地に添加される。
別の実施形態では、供給培地は亜鉛をさらに含む。一実施形態では、供給培地中の亜鉛の濃度は、約９０μＭ～１２０μＭである。一実施形態では、供給培地中の亜鉛の濃度は、約５０μＭ～１５０μＭである。
一実施形態では、この方法はさらに、補充成分の非存在下で培養されたヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞において生産された酸性種のパーセンテージと比較して、ヒト化抗α４β７抗体の酸性種のパーセンテージを減少させる。
一実施形態では、この方法はさらに、生産培地に添加される、ウリジン、マンガン、及びガラクトースを含む供給培地の非存在下で生産された主要アイソフォーム種のパーセンテージと比較して、ヒト化抗α４β７抗体の主要アイソフォーム種のパーセンテージを増加させる。
一実施形態では、この方法は流加培養法である。
一実施形態では、供給培地は、生産段階の約４日目から生産培地に添加される。
別の態様では、本発明は、ヒト化抗α４β７抗体を含む組成物の生産方法であって、前記方法は、亜鉛を含む生産培地において哺乳動物宿主細胞を培養することを含み、それによって、ヒト化抗α４β７抗体を含む組成物を生産し、哺乳動物宿主細胞は、ＩｇＧ１抗体であり、配列番号４に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載のＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含み、配列番号８に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載のＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域を含む、ヒト化抗α４β７抗体を発現するように遺伝子操作されている、方法を提供する。
前述の態様のいくつかの実施形態では、この方法は、（陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）によって決定されるとき）ヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームの減少した量を有する組成物の生産方法であって、前記方法は、亜鉛を含む生産培地中で哺乳動物宿主細胞を培養することを含み、それによって、亜鉛の非存在下で培養されたヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、ヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームの減少した量を有する組成物を生産する、方法である。
上述の態様のいくつかの実施形態では、この方法は、（ＣＥＸによって決定されるとき）約１６％以下のヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームを有する組成物の生産方法であって、前記方法は、亜鉛を含む生産培地中で哺乳動物宿主細胞を培養することを含み、それによって、約１６％以下のヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームを有する組成物を生産する、方法である。
一実施形態では、組成物は、約１４％以下のヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームを含む。
一実施形態では、組成物は、約１３％以下のヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームを含む。
一実施形態では、生産培地中の亜鉛の濃度は２μＭ～６０μＭである。
さらなる実施形態では、この方法は、亜鉛を含む供給培地を生産培地に添加することによって、生産培地に亜鉛を補充することを含む。一実施形態では、供給培地は、生産段階の約４日目から生産培地に添加される。
一実施形態では、供給培地中の亜鉛の濃度は、約９０μＭ～１２０μＭである。
一実施形態では、生産培地は、５．０～８．８ｇ／Ｌのリジンと、３．０～１２．０ｇ／Ｌのアルギニンとを含む。一実施形態では、生産培地は、４．５～５．５ｇ／Ｌのリジンを含む。一実施形態では、生産培地は、５．５～８．８ｇ／Ｌのリジンを含む。一実施形態では、生産培地は、５．４～７．４ｇ／Ｌのアルギニンを含む。一実施形態では、生産培地は、７．４～１２ｇ／Ｌのアルギニンを含む。
さらなる態様では、本発明は、ヒト化抗α４β７抗体を含む組成物の生産方法であって、前記方法は、生産段階において生産培地中で哺乳動物宿主細胞を培養することを含み、ヒト化抗α４β７抗体を含む組成物が生産されるようにし、生産培地は摂氏約３７度の平均温度を有し、宿主細胞は、ヒト化ＩｇＧ１抗α４β７抗体を発現するように遺伝子操作され、ヒト化抗α４β７は、配列番号４に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載のＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含み、配列番号８に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載のＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域を含む、方法を特徴とする。
前述の態様のいくつかの実施形態では、この方法は、（ＳＥＣによって決定されるとき）ヒト化抗α４β７抗体の２．５％以下のＨＭＷ種を含む組成物の生産方法であって、前記方法は、生産段階において（ＳＥＣによって決定されるとき）ヒト化抗α４β７抗体の２．５％以下のＨＭＷ種を含む組成物が生産されるように生産培地中で哺乳動物宿主細胞の前記培養することを含む、方法である。
さらに別の態様では、本発明は、ヒト化抗α４β７抗体を含む組成物の生産方法であって、前記方法は、拡大段階において増殖培地中で哺乳動物宿主細胞を培養することを含み、哺乳動物宿主細胞は、ヒト化抗α４β７抗体を発現するように遺伝子操作され、生産段階においてヒト化抗α４β７抗体を含む組成物が生産されるように生産培地中で哺乳動物宿主細胞を培養することを含み、哺乳動物宿主細胞は、拡大段階と生産段階の両方において、およそ同一である温度で培養され、ヒト化抗α４β７抗体は、ＩｇＧ１抗体であり、配列番号４に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載のＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含み、配列番号８に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載のＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域を含む、方法を提供する。
前述の態様のいくつかの実施形態では、この方法は、（ＳＥＣによって決定されるとき）ヒト化抗α４β７抗体の単量体の高いレベルを含む組成物の生産方法であって、前記方法は、拡大段階において増殖培地中で哺乳動物宿主細胞を前記培養することを含み、哺乳動物宿主細胞は、ヒト化抗α４β７抗体を発現するように遺伝子操作され、生産段階においてヒト化抗α４β７抗体の単量体の高いレベルを含む組成物が生産されるように生産培地中で哺乳動物宿主細胞の前記培養することを含む。
一実施形態では、温度は摂氏３６～３８度である。別の実施形態では、平均温度は、摂氏３６．５～３７．５度である。さらに別の実施形態では、温度は、摂氏約３７度の平均温度である。
一実施形態では、本明細書に開示される方法の生産培地は、摂氏３６～３８度の範囲の温度を有する。一実施形態では、温度は、摂氏３６．５～３７．５度の範囲である。一実施形態では、温度は、摂氏約３７度の平均温度である。一実施形態では、生産培地は、６．５～７の範囲のｐＨを有する。
一実施形態では、本明細書に開示される方法の生産培地は、６．８～７．０の範囲のｐＨである。
一実施形態では、本明細書に開示される方法の生産培地は、生産段階で約７ｇ／Ｌ以下に維持されるグルコースレベルを有する。
一実施形態では、生産段階は１４日以内である。別の実施形態では、生産段階は１０日～１７日の範囲である。
上述の態様のいくつかの実施形態では、この方法は、大規模なバイオリアクターで実施される。特定の実施形態では、大規模なバイオリアクターは、２００リットル（Ｌ）のバイオリアクター、２０００Ｌのバイオリアクター、３０００Ｌ、及び６０００Ｌのバイオリアクターからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、生産段階により、３ｇ／Ｌより大きいヒト化抗α４β７抗体の力価がもたらされる。特定の実施形態では、ヒト化抗α４β７抗体の力価は、約３～約８ｇ／Ｌである。他の実施形態では、ヒト化抗α４β７抗体の力価は、約５～約７ｇ／Ｌである。
上述の態様のいくつかの実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。特定の実施形態では、ＣＨＯ細胞は、ＧＳ－ＣＨＯ細胞である。
上述の態様のいくつかの実施形態では、ヒト化抗α４β７抗体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
上述の態様のいくつかの実施形態では、ヒト化抗α４β７抗体はベドリズマブである。
前述の態様のいくつかの実施形態では、この方法は、抗体の回収及び精製を含む。いくつかのそのような実施形態では、精製は、（ｉ）細胞残屑、望ましくないタンパク質、塩、ミネラル、または他の望ましくない要素を除去する精製ステップと、（ｉｉ）混入汚染物質の可溶性タンパク質及びポリペプチドからの抗体の精製と、を含む。特定の実施形態では、この方法は、ヒトの治療用途に適した精製抗体の製剤を調製することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、医薬製剤は、液体医薬製剤である。いくつかのそのような実施形態では、液体医薬製剤は、限外濾過／透析濾過によって調製される。
他の実施形態では、医薬製剤は凍結乾燥された乾燥抗体製剤である。いくつかのそのような実施形態では、抗体の医薬製剤は、精製に続いて限外濾過／透析濾過によって調製された液体医薬抗体製剤から凍結乾燥された乾燥抗体製剤である。
いくつかの実施形態では、本発明は、（親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）によって決定されるとき）ヒト化抗α４β７抗体のＧ０Ｆ糖型の減少した量を有する組成物の生産方法であって、前記方法は、生産培地中で哺乳動物宿主細胞を培養することと、ウリジン、マンガン、及びガラクトースを含む補充成分を生産培地に前記添加することとを含み、それによって、補充成分の非存在下で培養されたヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、ヒト化抗α４β７抗体のＧ０Ｆ糖型の減少した量を有する組成物を生産する、方法を提供する。
一実施形態では、この組成物は、補充成分の非存在下で培養されたヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、ヒト化抗α４β７抗体のＧ０Ｆ糖型の少なくとも約１５％減少したレベルを含む。
一実施形態では、この組成物は、補充成分の非存在下で培養されたヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、ヒト化抗α４β７抗体のＧ０Ｆ糖型の少なくとも約２０％の減少を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約６５％以下のヒト化抗α４β７抗体のＧ０Ｆ糖型を有する組成物の生産方法であって、前記方法は、生産培地中で哺乳動物宿主細胞を培養することと、ウリジン、マンガン、及びガラクトースを含む補充成分を生産培地に前記添加することとを含み、それによって、約６５％以下のヒト化抗α４β７抗体のＧ０Ｆ糖型を有する組成物を生産する、方法である。
一実施形態では、組成物は、約６０％以下のヒト化抗α４β７抗体のＧ０Ｆ糖型を含む。
一実施形態では、組成物は、約５５％以下のヒト化抗α４β７抗体のＧ０Ｆ糖型を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、（親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）によって決定されるとき）ヒト化抗α４β７抗体のＧ１Ｆ糖型の増加した量を有する組成物の生産方法であって、前記方法は、生産培地中で哺乳動物宿主細胞を培養することと、ウリジン、マンガン、及びガラクトースを含む補充成分を生産培地に前記添加することとを含み、それによって、補充成分の非存在下で培養されたヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、ヒト化抗α４β７抗体のＧ１Ｆ糖型の増加した量を有する組成物を生産する、方法である。
一実施形態では、この組成物は、補充成分の非存在下で培養されたヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、ヒト化抗α４β７抗体のＧ１Ｆ型の少なくとも約２倍の増加を含む。
一実施形態では、この組成物は、補充成分の非存在下で培養されたヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、ヒト化抗α４β７抗体のＧ１Ｆ糖型の少なくとも約３倍の増加を含む。
さらにいくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約２５％以上のヒト化抗α４β７抗体のＧ１Ｆ糖型を有する組成物の生産方法であって、前記方法は、生産培地中で哺乳動物宿主細胞を培養することと、ウリジン、マンガン、及びガラクトースを含む補充成分を生産培地に前記添加することとを含み、それによって、約２５％以上のヒト化抗α４β７抗体のＧ１Ｆ糖型を有する組成物を生産する、方法である。
一実施形態では、組成物は、約３０％以上のヒト化抗α４β７抗体のＧ１Ｆ糖型を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、（親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）によって決定されるとき）ヒト化抗α４β７抗体のＧ２Ｆ糖型の増加した量を有する組成物の生産方法であって、前記方法は、生産培地中で哺乳動物宿主細胞を培養することと、ウリジン、マンガン、及びガラクトースを含む補充成分を生産培地に前記添加することとを含み、それによって、補充成分の非存在下で培養されたヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、ヒト化抗α４β７抗体のＧ２Ｆ糖型の増加した量を有する組成物を生産する、方法である。
一実施形態では、この組成物は、補充成分の非存在下で培養されたヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、ヒト化抗α４β７抗体のＧ２Ｆ糖型の少なくとも約３倍の増加を含む。
一実施形態では、この組成物は、補充成分の非存在下で培養されたヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、ヒト化抗α４β７抗体のＧ２Ｆ糖型の少なくとも約４倍の増加を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約３％以上のヒト化抗α４β７抗体のＧ２Ｆ糖型を有する組成物の生産方法であって、前記方法は、生産培地中で哺乳動物宿主細胞を培養することと、ウリジン、マンガン、及びガラクトースを含む補充成分を生産培地に前記添加することとを含み、それによって、約３％以上のヒト化抗α４β７抗体６のＧ２Ｆ糖型を有する組成物を生産する、方法である。
一実施形態では、組成物は、約４％以上のヒト化抗α４β７抗体のＧ２Ｆ糖型を含む。
一実施形態では、補充成分は、生産培地に添加されるか、または供給培地に添加された後にその供給培地が生産培地に添加される。
一実施形態では、供給培地は、約１５～１００ｍＭのウリジンを含む。一実施形態では、供給培地は、約２０～５０ｍＭのウリジンを含む。一実施形態では、供給培地は、約１～４０ｍＭのウリジンを含む。
一実施形態では、供給培地は、約０．０２～０．３ｍＭのマンガンを含む。一実施形態では、供給培地は、約０．０２～０．１ｍＭのマンガンを含む。一実施形態では、供給培地は、約０．００１～０．１ｍＭのマンガンを含む。
一実施形態では、供給培地は、８５ｍＭ～６００ｍＭのガラクトースを含む。一実施形態では、供給培地は、約８５～１００ｍＭのガラクトースを含む。一実施形態では、供給培地は、約５０～１５０ｍＭのガラクトースを含む。
さらに別の実施形態では、生産培地は亜鉛をさらに含む。一実施形態では、供給培地中の亜鉛の濃度は、約５０μＭ～１５０μＭである。
一実施形態では、この方法はさらに、補充成分の非存在下で培養されたヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞において生産された酸性種のパーセンテージと比較して、ヒト化抗α４β７抗体の酸性種のパーセンテージを減少させる。
一実施形態では、この方法はさらに、生産培地に添加される、ウリジン、マンガン、及びガラクトースを含む供給培地の非存在下で生産された主要アイソフォーム種のパーセンテージと比較して、ヒト化抗α４β７抗体の主要アイソフォーム種のパーセンテージを増加させる。
一実施形態では、この方法は流加培養法である。
一実施形態では、供給培地は、生産段階の約４日目から生産培地に添加される。一実施形態では、供給培地は、生産段階の約４日目から毎日生産培地に添加される。
一実施形態では、本明細書に開示される方法は、大規模なバイオリアクターで実施される。一実施形態では、大規模なバイオリアクターは、２００リットル（Ｌ）のバイオリアクター、２０００Ｌのバイオリアクター、３０００Ｌ、及び６０００Ｌのバイオリアクターからなる群から選択される。
一実施形態では、生産段階は、３ｇ／Ｌを超えるヒト化抗α４β７抗体の力価をもたらす。一実施形態では、ヒト化抗α４β７抗体の力価は、約３～約８ｇ／Ｌである。一実施形態では、ヒト化抗α４β７抗体の力価は、約５～約７ｇ／Ｌである。
一実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。一実施形態では、ＣＨＯ細胞はＧＳ－ＣＨＯ細胞である。
一実施形態では、生産培地は、約６．８～約７．１のｐＨを有する。
一実施形態では、ヒト化抗α４β７抗体は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む。
一実施形態では、抗α４β７抗体は、ベドリズマブである。
いくつかの実施形態では、この方法は、抗体の回収及び精製を含む。いくつかのそのような実施形態では、精製は、（ｉ）細胞残屑、望ましくないタンパク質、塩、ミネラル、または他の望ましくない要素を除去する精製ステップと、（ｉｉ）混入汚染物質の可溶性タンパク質及びポリペプチドからの抗体の精製と、を含む。特定の実施形態では、この方法は、ヒトの治療用途に適した精製抗体の製剤を調製することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、医薬製剤は、液体医薬製剤である。いくつかのそのような実施形態では、液体医薬製剤は、限外濾過／透析濾過によって調製される。
他の実施形態では、医薬製剤は凍結乾燥された乾燥抗体製剤である。いくつかのそのような実施形態では、抗体の医薬製剤は、精製に続いて限外濾過／透析濾過によって調製された液体医薬抗体製剤から凍結乾燥された乾燥抗体製剤である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、ヒト化抗α４β７抗体を発現するように遺伝子操作された宿主細胞と、ウリジン、マンガン、及びガラクトース（ＵＭＧ）を補充した生産培地と、を含む細胞培養物であり、ヒト化抗α４β７抗体はＩｇＧ１抗体であり、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
上述の態様のいくつかの実施形態では、生産培地は、約１５～１００ｍＭの濃度のウリジン、約２０～２００ｎＭの濃度のマンガン、及び約８５～５００ｍＭの濃度のガラクトースを含む。
上述の態様のいくつかの実施形態では、生産培地は、回収日において、約１～７ｍＭの濃度の補充されたウリジン、約２～１５μＭの濃度の補充されたマンガン、及び約３～２０ｍＭの濃度の補充されたガラクトースを含む。いくつかの実施形態では、生産培地は、回収日において、約５～４５μＭの濃度の補充された亜鉛をさらに含む。
上述の態様のいくつかの実施形態では、回収日において、生産培地は、約１～７ｍＭの濃度のウリジン、約２～１５μＭの濃度のマンガン、及び約３～２０ｍＭの濃度のガラクトースを含む。いくつかの実施形態では、生産培地は、回収日において、約５～４５μＭの濃度の亜鉛をさらに含む。
特定の実施形態では、発現したヒト化抗α４β７抗体は、（ａ）１６％以下、１５％以下、１４％以下、１３％以下、または１２％以下の塩基性アイソフォーム、及び／または（ｂ）少なくとも６５％、少なくとも６８％、少なくとも７０％、少なくとも７２％、または少なくとも７５％の主要アイソフォームを含むアイソフォーム分布を有する。
他の実施形態では、発現したヒト化抗α４β７抗体は、（ａ）６５％以下、６０％以下、または５５％以下のＧ０Ｆ、及び／または（ｂ）２５％以上、２７％以上、または３０％以上のＧ１Ｆ；及び／または（ｃ）２．５％以上、３％以上、３．５％以上、４％以上、または４．５％以上のＧ２Ｆを含むフコシル化Ｎ－グリカン含量を有する。
上述の態様のいくつかの実施形態では、発現したヒト化抗α４β７抗体は、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、または少なくとも９５％の、合計フコシル化Ｎ－グリカン（Ｇ０Ｆ＋Ｇ１Ｆ＋Ｇ２Ｆ）の含量を有する。
他の実施形態では、発現したヒト化抗α４β７抗体は、９２～９５％の合計フコシル化Ｎ－グリカン（Ｇ０Ｆ＋Ｇ１Ｆ＋Ｇ２Ｆ）の含量を有する。
代替的な実施形態では、発現したヒト化抗α４β７抗体は、９１～９２％、９１～９２．５％、または９１～９３％の合計フコシル化Ｎ－グリカン（Ｇ０Ｆ＋Ｇ１Ｆ＋Ｇ２Ｆ）の含量を有する。
上述の態様のいくつかの実施形態では、細胞培養物は亜鉛をさらに含む。他の実施形態では、細胞培養物はさらにアルギニン及び／またはリジンをさらに含む。
上述の態様のいくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。特定の実施形態では、ＣＨＯ細胞は、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）をコードする遺伝子を欠損している。
別の態様において、本開示は、本明細書で上述される、細胞培養物によって産生されるヒト化抗α４β７抗体を提供する。
さらに別の態様では、本開示は、ヒト化抗α４β７抗体を含む組成物を提供し、前記方法は、第１のｐＨを有する第１の生産培地においてヒト化抗α４β７抗体を発現するように遺伝子操作された哺乳動物宿主細胞を培養することと、第２のｐＨを有する第２の生産培地において哺乳動物宿主細胞を培養することと、を含み、第２のｐＨは第１のｐＨよりも低く、ヒト化抗α４β７抗体は、ＩｇＧ１抗体であり、配列番号４に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載のＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含み、配列番号８に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載のＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。
前述の態様のいくつかの実施形態では、第２のｐＨは、第１のｐＨよりも０．１～０．５ｐＨ単位低い。特定の実施形態では、第１のｐＨはｐＨ６．８～７．２の範囲にあり、第２のｐＨはｐＨ６．７～６．９５の範囲にある。
いくつかの実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、第１のｐＨで１２０時間以下培養される。特定の実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、第１のｐＨで８５～１１０時間培養される。他の実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、第１のｐＨで９０～１００時間培養される。
いくつかの実施形態では、方法は、第２の生産培地から抗α４β７抗体を回収することをさらに含む。特定の実施形態では、抗α４β７抗体は、１３～１５日の期間の、第１の生産培地及び第２の生産培地中での哺乳動物宿主細胞の培養に続いて回収される。
いくつかの実施形態では、組成物は、哺乳動物宿主細胞がｐＨシフトせずに第１のｐＨで培養された対照組成物と比較して、抗α４β７抗体の主要なアイソフォームの増加したレベルを有している。
別の態様において、本発明は本明細書に開示される方法のうちのいずれか１つを用いて生産されたヒト化抗α４β７抗体を含む組成物を含む。一実施形態では、本明細書に開示される方法は、９２％以上の総アシアロ、アガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ０Ｆ）、アシアロ、モノガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ１Ｆ）、及び／またはアシアロ、ジガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ２Ｆ）の、グリコシル化バリアントを有する、ヒト化抗α４β７抗体の集団を提供する。
さらに、本発明はまた、以下の実施形態を含む：
１．（陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）によって決定されるとき）ヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームの減少した量を有する組成物の生産方法であって、前記方法は、
生産培地において哺乳動物宿主細胞を培養することと、
ウリジン、マンガン、及びガラクトースを含む補充成分を前記生産培地に添加し、それによって前記補充成分の非存在下で培養された前記ヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、前記ヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームの減少した量を有する組成物を生産することと、を含み、
前記哺乳動物宿主細胞が、ＩｇＧ１であり、配列番号４に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載のＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含み、配列番号８に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載のＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変域を含む、ヒト化抗α４β７抗体を発現するように遺伝子鎖操作されている、前記方法。
２．（ＣＥＸによって決定されるとき）約１６％以下のヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームを有する組成物の生産方法であって、前記方法は、
生産培地において哺乳動物宿主細胞を培養することと、
ウリジン、マンガン、及びガラクトースを含む補充成分を前記生産培地に添加し、それによって約１６％以下の前記ヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームを有する組成物を生産することと、を含み、
前記哺乳動物宿主細胞が、ＩｇＧ１であり、配列番号４に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載のＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含み、配列番号８に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載のＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変域を含む、ヒト化抗α４β７抗体を発現するように遺伝子鎖操作されている、前記方法。
３．前記組成物が、約１４％以下の前記ヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームを含む、条項２の方法。
４．前記組成物が、約１３％以下の前記ヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームを含む、条項２の方法。
５．前記補充成分が、前記生産培地に添加されるか、または供給培地に添加された後に前記供給培地が前記生産培地に添加される、条項１～４のいずれか１つの方法。
６．ウリジンが、約１５～１２０ｍＭの最終濃度で前記供給培地に添加される、条項５の方法。
７．前記ウリジンが、約２０～７０ｍＭのウリジンの最終濃度になるように前記供給培地に添加される、条項６の方法。
８．マンガンが、約０．０２～０．３ｍＭの最終濃度で前記供給培地に添加される、条項５の方法。
９．マンガンが、約０．０４～０．１５ｍＭの最終濃度になるように前記供給培地に添加される、条項８の方法。
１０．ガラクトースが、約８５ｍＭ～６００ｍＭの最終濃度になるように前記供給培地に添加される、条項５の方法。
１１．ガラクトースが、約１６０～３４０ｍＭの最終濃度になるように前記供給培地に添加される、条項１０の方法。
１２．前記供給培地が、亜鉛をさらに含む、条項１～１１のいずれか１つの方法。
１３．前記供給培地中の亜鉛の濃度が、約９０μＭ～１２０μＭである、条項１２の方法。
１４．前記方法がさらに、前記補充成分の非存在下で培養された前記ヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞において生産された酸性種のパーセンテージと比較して、前記ヒト化抗α４β７抗体の酸性種のパーセンテージを減少させる、条項１～１３のいずれか１つの方法。
１５．前記方法がさらに、前記生産培地に添加される、ウリジン、マンガン、及びガラクトースを含む供給培地の非存在下で生産された主要アイソフォーム種のパーセンテージと比較して、前記ヒト化抗α４β７抗体の主要アイソフォーム種のパーセンテージを増加させる、条項１～１４のいずれか１つの方法。
１６．前記方法が流加培養法である、条項１～１５のいずれか１つの方法。
１７．前記供給培地が、生産段階の約４日目から前記生産培地に添加される、条項１６の方法。
１８．（陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）によって決定されるとき）ヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームの減少した量を有する組成物の生産方法であって、前記方法は、亜鉛を含む生産培地中で哺乳動物宿主細胞を培養することを含み、それによって、亜鉛の非存在下で培養された前記ヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、前記ヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームの減少した量を有する組成物を生産し、
前記哺乳動物宿主細胞が、ＩｇＧ１であり、配列番号４に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載のＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含み、配列番号８に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載のＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変域を含む、ヒト化抗α４β７抗体を発現するように遺伝子鎖操作されている、前記方法。
１９．（ＣＥＸによって決定されるとき）約１６％以下のヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームを有する組成物の生産方法であって、前記方法は、亜鉛を含む生産培地中で哺乳動物宿主細胞を培養することを含み、それによって、約１６％以下の前記ヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームを有する組成物を生産し、
前記哺乳動物宿主細胞が、ＩｇＧ１であり、配列番号４に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載のＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含み、配列番号８に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載のＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変域を含む、ヒト化抗α４β７抗体を発現するように遺伝子鎖操作されている、前記方法。
２０．前記組成物が、約１４％以下の前記ヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームを含む、条項１９の方法。
２１．前記組成物が、約１３％以下の前記ヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームを含む、条項１９の方法。
２２．前記生産培地中の前記亜鉛の濃度が２μＭ～６０μＭである、条項１８～２１のいずれか１つの方法。
２３．前記方法が、亜鉛を含む供給培地を前記生産培地に添加することによって、前記生産培地に亜鉛を補充することを含む、条項１８～２２のいずれか１つの方法。
２４．前記供給培地が、生産段階の約４日目から前記生産培地に添加される、条項２３の方法。
２５．前記供給培地中の前記亜鉛の濃度が、約９０μＭ～１２０μＭである、条項２４の方法。
２６．前記生産培地が、５．０～８．８ｇ／Ｌのリジンと、３．０～１２．０ｇ／Ｌのアルギニンとを含む、条項１～２５のいずれか１つの方法。
２７．前記生産培地が、４．５～５．５ｇ／Ｌのリジンを含む、条項２６の方法。
２８．前記生産培地が、５．５～８．８ｇ／Ｌのリジンを含む、条項２６の方法。
２９．前記生産培地が、５．４～７．４ｇ／Ｌのアルギニンを含む、条項２６の方法。
３０．前記生産培地が、７．４～１２ｇ／Ｌのアルギニンを含む、条項２６の方法。
３１．（ＳＥＣによって決定されるとき）２．５％以下のヒト化抗α４β７抗体のＨＭＷ種を含む組成物の生産方法であって、前記方法は、
生産段階において（ＳＥＣによって決定されるとき）２．５％以下の前記ヒト化抗α４β７抗体のＨＭＷ種を含む組成物が生産されるように生産培地中で哺乳動物宿主細胞を培養することを含み、
前記生産培地が摂氏約３７度の平均温度を有し、前記宿主細胞は、ヒトのＩｇＧ１抗α４β７抗体を発現するように遺伝子操作され、
前記ヒト化抗α４β７抗体が、配列番号４に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載のＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含み、配列番号８に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載のＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変域を含む、前記方法。
３２．（ＳＥＣによって決定されるとき）ヒト化抗α４β７抗体の単量体の高いレベルを含む組成物の生産方法であって、前記方法は、
拡大段階において増殖培地中で哺乳動物宿主細胞を培養することであって、前記哺乳動物宿主細胞がヒト化抗α４β７抗体を発現するように遺伝子操作されている、培養することと、
生産段階において（ＳＥＣによって決定されるとき）前記ヒト化抗α４β７抗体の単量体の高いレベルを含む組成物が生産されるように生産培地中で前記哺乳動物宿主細胞を培養することと、を含み、
前記哺乳動物宿主細胞が、前記拡大段階と前記生産段階の両方でほぼ同じ温度で培養され、
前記ヒト化抗α４β７抗体が、ＩｇＧ１抗体であり、配列番号４に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載のＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含み、配列番号８に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載のＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変域を含む、前記方法。
３３．前記温度が摂氏３６～３８度である、条項３１または３２の方法。
３４．前記平均温度が摂氏３６．５～３７．５度である、条項３１または３２の方法。
３５．前記温度が摂氏約３７度の平均温度である、条項３１または３２の方法。
３６．前記生産培地が摂氏３６～３８度の範囲の温度を有する、条項１～３５のいずれか１つの方法。
３７．前記温度が摂氏３６．５度～３７．５度の範囲である、条項３６の方法。
３８．前記温度が摂氏約３７度の平均温度である、条項３６の方法。
３９．前記生産培地が６．５～７の範囲のｐＨを有する、条項１～３８のいずれか１つの方法。
４０．前記生産培地が６．８～７．０の範囲のｐＨを有する、条項３９の方法。
４１．前記生産培地が、前記生産段階で約７ｇ／Ｌ以下に維持されるグルコースレベルを有する、条項１～４０のいずれか１つに記載の方法。
４２．前記生産段階が１４日以内である、条項１～４１のいずれか１つの方法。
４３．前記生産段階が１０日～１７日の範囲である、条項１～４２のいずれか１つの方法。
４４．大規模なバイオリアクターで実施される、条項１～４３のいずれか１つの方法。
４５．前記大規模なバイオリアクターが、２００リットル（Ｌ）のバイオリアクター、２０００Ｌのバイオリアクター、３０００Ｌ、及び６０００Ｌのバイオリアクターからなる群から選択される、条項４４の方法。
４６．前記生産段階が、３ｇ／Ｌを超える前記ヒト化抗α４β７抗体の力価をもたらす、条項１～４５のいずれか１つの方法。
４７．前記ヒト化抗α４β７抗体の力価が、約３～約８ｇ／Ｌである、条項４６の方法。
４８．前記ヒト化抗α４β７抗体の力価が、約５～約７ｇ／Ｌである、条項４６の方法。
４９．前記哺乳動物宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、条項１～４８のいずれか１つの方法。
５０．前記ＣＨＯ細胞がＧＳ－ＣＨＯ細胞である、条項４９の方法。
５１．前記ヒト化抗α４β７抗体が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、条項１～５０のいずれか１つの方法。
５２．前記ヒト化抗α４β７抗体がベドリズマブである、条項１～５０のいずれか１つの方法。
５３．条項１～５２のいずれか１つの方法を用いて生産されたヒト化抗α４β７抗体を含む組成物。
５４．９２％以上の総アシアロ、アガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ０Ｆ）、アシアロ、モノガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ１Ｆ）、及び／またはアシアロ、ジガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ２Ｆ）の、グリコシル化バリアントを有する、ヒト化抗α４β７抗体の集団を含む、条項５３の組成物。
５５．（親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）によって決定されるとき）ヒト化抗α４β７抗体のＧ０Ｆ糖型の減少した量を有する組成物の生産方法であって、前記方法は、
生産培地において哺乳動物宿主細胞を培養することと、
ウリジン、マンガン、及びガラクトースを含む補充成分を前記生産培地に添加し、それによって前記補充成分の非存在下で培養された前記ヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、前記ヒト化抗α４β７抗体のＧ０Ｆ糖型の減少した量を有する組成物を生産することと、を含み、
前記哺乳動物宿主細胞が、ＩｇＧ１であり、配列番号４に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載のＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含み、配列番号８に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載のＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変域を含む、ヒト化抗α４β７抗体を発現するように遺伝子鎖操作されている、前記方法。
５６．前記組成物が、前記補充成分の非存在下で培養された前記ヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、少なくとも約１５％減少したレベルの前記ヒト化抗α４β７抗体のＧ０Ｆ糖型を含む、条項５５の方法。
５７．前記組成物が、前記補充成分の非存在下で培養された前記ヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、前記ヒト化抗α４β７抗体のＧ０Ｆ糖型の少なくとも約２０％の減少を含む、条項５５の方法。
５８．（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約６５％以下のヒト化抗α４β７抗体のＧ０Ｆ糖型を有する組成物の生産方法であって、前記方法は、
生産培地において哺乳動物宿主細胞を培養することと、
ウリジン、マンガン、及びガラクトースを含む補充成分を前記生産培地に添加し、それによって約６５％以下の前記ヒト化抗α４β７抗体のＧ０Ｆ糖型を有する組成物を生産することと、を含み、
前記哺乳動物宿主細胞が、ＩｇＧ１であり、配列番号４に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載のＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含み、配列番号８に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載のＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変域を含む、ヒト化抗α４β７抗体を発現するように遺伝子鎖操作されている、前記方法。
５９．前記組成物が、約６０％以下の前記ヒト化抗α４β７抗体のＧ０Ｆ糖型を含む、条項５８の方法。
６０．前記組成物が、約５５％以下の前記ヒト化抗α４β７抗体のＧ０Ｆ糖型を含む、条項５８の方法。
６１．（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）ヒト化抗α４β７抗体のＧ１Ｆ糖型の増加した量を有する組成物の生産方法であって、前記方法は、
生産培地において哺乳動物宿主細胞を培養することと、
ウリジン、マンガン、及びガラクトースを含む補充成分を前記生産培地に添加し、それによって前記補充成分の非存在下で培養された前記ヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、前記ヒト化抗α４β７抗体のＧ１Ｆ糖型の増加した量を有する組成物を生産することと、を含み、
前記哺乳動物宿主細胞が、ＩｇＧ１であり、配列番号４に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載のＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含み、配列番号８に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載のＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変域を含む、ヒト化抗α４β７抗体を発現するように遺伝子鎖操作されている、前記方法。
６２．前記組成物が、前記補充成分の非存在下で培養された前記ヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、前記ヒト化抗α４β７抗体のＧ１Ｆ糖型の少なくとも約２倍の増加を含む、条項６１の方法。
６３．前記組成物が、前記補充成分の非存在下で培養された前記ヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、前記ヒト化抗α４β７抗体のＧ１Ｆ糖型の少なくとも約３倍の増加を含む、条項６１の方法。
６４．（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約２５％以上のヒト化抗α４β７抗体のＧ１Ｆ糖型を有する組成物の生産方法であって、前記方法は、
生産培地において哺乳動物宿主細胞を培養することと、
ウリジン、マンガン、及びガラクトースを含む補充成分を前記生産培地に添加し、それによって約２５％以上の前記ヒト化抗α４β７抗体のＧ１Ｆ糖型を有する組成物を生産することと、を含み、
前記哺乳動物宿主細胞が、ＩｇＧ１であり、配列番号４に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載のＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含み、配列番号８に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載のＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変域を含む、ヒト化抗α４β７抗体を発現するように遺伝子鎖操作されている、前記方法。
６５．前記組成物が、約３０％以上の前記ヒト化抗α４β７抗体のＧ１Ｆ糖型を含む、条項６４の方法。
６６．（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）ヒト化抗α４β７抗体のＧ２Ｆ糖型の増加した量を有する組成物の生産方法であって、前記方法は、
生産培地において哺乳動物宿主細胞を培養することと、
ウリジン、マンガン、及びガラクトースを含む補充成分を前記生産培地に添加し、それによって前記補充成分の非存在下で培養された前記ヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、前記ヒト化抗α４β７抗体のＧ２Ｆ糖型の増加した量を有する組成物を生産することと、を含み、
前記哺乳動物宿主細胞が、ＩｇＧ１であり、配列番号４に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載のＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含み、配列番号８に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載のＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変域を含む、ヒト化抗α４β７抗体を発現するように遺伝子鎖操作されている、前記方法。
６７．前記組成物が、前記補充成分の非存在下で培養された前記ヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、前記ヒト化抗α４β７抗体のＧ２Ｆ糖型の少なくとも約３倍の増加を含む、条項６６の方法。
６８．前記組成物が、前記補充成分の非存在下で培養された前記ヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、前記ヒト化抗α４β７抗体のＧ２Ｆ糖型の少なくとも約４倍の増加を含む、条項６６の方法。
６９．（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約３％以上のヒト化抗α４β７抗体のＧ２Ｆ糖型を有する組成物の生産方法であって、前記方法は、
生産培地において哺乳動物宿主細胞を培養することと、
ウリジン、マンガン、及びガラクトースを含む補充成分を前記生産培地に添加し、それによって約３％以上の前記ヒト化抗α４β７抗体のＧ２Ｆ糖型を有する組成物を生産することと、を含み、
前記哺乳動物宿主細胞が、ＩｇＧ１であり、配列番号４に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載のＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含み、配列番号８に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載のＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変域を含む、ヒト化抗α４β７抗体を発現するように遺伝子鎖操作されている、前記方法。
７０．前記組成物が、約４％以上の前記ヒト化抗α４β７抗体のＧ２Ｆ糖型を含む、条項６９の方法。
７１．前記補充成分が、前記生産培地に添加されるか、または供給培地に添加された後に前記供給培地が前記生産培地に添加される、条項５５～７０のいずれか１つの方法。
７２．前記供給培地が、約１５～１００ｍＭのウリジンを含む、条項７１の方法。
７３．前記供給培地が、約２０～５０ｍＭのウリジンを含む、条項７２の方法。
７４．前記供給培地が約０．０２～０．３ｍＭのマンガンを含む、条項７１の方法。
７５．前記供給培地が、約０．０２～０．１ｍＭのマンガンを含む、条項７４の方法。
７６．前記供給培地が、８５ｍＭ～６００ｍＭのガラクトースを含む、条項７１の方法。
７７．前記供給培地が、８５～１００ｍＭのガラクトースを含む、条項７６の方法。
７８．前記生産培地が、亜鉛をさらに含む、条項５５～７７のいずれか１つの方法。
７９．前記生産培地中の前記亜鉛の濃度が、約５０μＭ～１５０μＭである、条項７８の方法。
８０．前記方法がさらに、前記補充成分の非存在下で培養された前記ヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞において生産された酸性種のパーセンテージと比較して、前記ヒト化抗α４β７抗体の酸性種のパーセンテージを減少させる、条項５５～７９のいずれか１つの方法。
８１．前記方法がさらに、前記生産培地に添加される、ウリジン、マンガン、及びガラクトースを含む供給培地の非存在下で生産された主要アイソフォーム種のパーセンテージと比較して、前記ヒト化抗α４β７抗体の主要アイソフォーム種のパーセンテージを増加させる、条項５５～８０のいずれか１つの方法。
８２．前記方法が流加培養法である、条項５５～８１のいずれか１つの方法。
８３．前記供給培地が、生産段階の約４日目から前記生産培地に添加される、条項８２の方法。
８４．前記生産培地が約６．８～約７．１のｐＨを有する、条項１～８３のいずれか１つの方法。
生産細胞培養のｐＨ、温度、ガラクトースＧａｌ＋の添加、ＵＭＧの添加、供給戦略条件を含む、さまざまな培養条件を試験する実験に基づいた予測プロファイラーからの結果を提供する。 抗体力価（Ａ）、酸性種（Ｂ）、塩基性種（Ｃ）、主要種（Ｄ）、Ｇ０Ｆ種のパーセンテージ（Ｅ）、Ｇ１Ｆ種のパーセンテージ（Ｆ）、Ｇ２Ｆ種のパーセンテージ（Ｇ）、及びグリカン種の合計（Ｈ）に対する、ウリジン、ガラクトース、及びマンガン（ＵＭＧ）の補充（３３×ＵＭＧ、５０×ＵＭＧ、６６×ＵＭＧ）とｐＨ（ｐＨ７．０５対ｐＨ６．８５）の効果を比較した結果をグラフで示す。ＵＭＧ補充成分を含まない結果（「＋」記号によって示される）は比較のために示されている。 抗体力価（Ａ）、酸性種（Ｂ）、塩基性種（Ｃ）、主要種（Ｄ）、Ｇ０Ｆ種のパーセンテージ（Ｅ）、Ｇ１Ｆ種のパーセンテージ（Ｆ）、Ｇ２Ｆ種のパーセンテージ（Ｇ）、及びグリカン種の合計（Ｈ）に対する、ウリジン、ガラクトース、及びマンガン（ＵＭＧ）の補充（３３×ＵＭＧ、５０×ＵＭＧ、６６×ＵＭＧ）とｐＨ（ｐＨ７．０５対ｐＨ６．８５）の効果を比較した結果をグラフで示す。ＵＭＧ補充成分を含まない結果（「＋」記号によって示される）は比較のために示されている。 抗体力価（Ａ）、酸性種（Ｂ）、塩基性種（Ｃ）、主要種（Ｄ）、Ｇ０Ｆ種のパーセンテージ（Ｅ）、Ｇ１Ｆ種のパーセンテージ（Ｆ）、Ｇ２Ｆ種のパーセンテージ（Ｇ）、及びグリカン種の合計（Ｈ）に対する、ウリジン、ガラクトース、及びマンガン（ＵＭＧ）の補充（３３×ＵＭＧ、５０×ＵＭＧ、６６×ＵＭＧ）とｐＨ（ｐＨ７．０５対ｐＨ６．８５）の効果を比較した結果をグラフで示す。ＵＭＧ補充成分を含まない結果（「＋」記号によって示される）は比較のために示されている。 抗体力価（Ａ）、酸性種（Ｂ）、塩基性種（Ｃ）、主要種（Ｄ）、Ｇ０Ｆ種のパーセンテージ（Ｅ）、Ｇ１Ｆ種のパーセンテージ（Ｆ）、Ｇ２Ｆ種のパーセンテージ（Ｇ）、及びグリカン種の合計（Ｈ）に対する、ウリジン、ガラクトース、及びマンガン（ＵＭＧ）の補充（３３×ＵＭＧ、５０×ＵＭＧ、６６×ＵＭＧ）とｐＨ（ｐＨ７．０５対ｐＨ６．８５）の効果を比較した結果をグラフで示す。ＵＭＧ補充成分を含まない結果（「＋」記号によって示される）は比較のために示されている。 抗体力価（Ａ）、酸性種（Ｂ）、塩基性種（Ｃ）、主要種（Ｄ）、Ｇ０Ｆ種のパーセンテージ（Ｅ）、Ｇ１Ｆ種のパーセンテージ（Ｆ）、Ｇ２Ｆ種のパーセンテージ（Ｇ）、及びグリカン種の合計（Ｈ）に対する、ウリジン、ガラクトース、及びマンガン（ＵＭＧ）の補充（３３×ＵＭＧ、５０×ＵＭＧ、６６×ＵＭＧ）とｐＨ（ｐＨ７．０５対ｐＨ６．８５）の効果を比較した結果をグラフで示す。ＵＭＧ補充成分を含まない結果（「＋」記号によって示される）は比較のために示されている。 抗体力価（Ａ）、酸性種（Ｂ）、塩基性種（Ｃ）、主要種（Ｄ）、Ｇ０Ｆ種のパーセンテージ（Ｅ）、Ｇ１Ｆ種のパーセンテージ（Ｆ）、Ｇ２Ｆ種のパーセンテージ（Ｇ）、及びグリカン種の合計（Ｈ）に対する、ウリジン、ガラクトース、及びマンガン（ＵＭＧ）の補充（３３×ＵＭＧ、５０×ＵＭＧ、６６×ＵＭＧ）とｐＨ（ｐＨ７．０５対ｐＨ６．８５）の効果を比較した結果をグラフで示す。ＵＭＧ補充成分を含まない結果（「＋」記号によって示される）は比較のために示されている。 抗体力価（Ａ）、酸性種（Ｂ）、塩基性種（Ｃ）、主要種（Ｄ）、Ｇ０Ｆ種のパーセンテージ（Ｅ）、Ｇ１Ｆ種のパーセンテージ（Ｆ）、Ｇ２Ｆ種のパーセンテージ（Ｇ）、及びグリカン種の合計（Ｈ）に対する、ウリジン、ガラクトース、及びマンガン（ＵＭＧ）の補充（３３×ＵＭＧ、５０×ＵＭＧ、６６×ＵＭＧ）とｐＨ（ｐＨ７．０５対ｐＨ６．８５）の効果を比較した結果をグラフで示す。ＵＭＧ補充成分を含まない結果（「＋」記号によって示される）は比較のために示されている。 抗体力価（Ａ）、酸性種（Ｂ）、塩基性種（Ｃ）、主要種（Ｄ）、Ｇ０Ｆ種のパーセンテージ（Ｅ）、Ｇ１Ｆ種のパーセンテージ（Ｆ）、Ｇ２Ｆ種のパーセンテージ（Ｇ）、及びグリカン種の合計（Ｈ）に対する、ウリジン、ガラクトース、及びマンガン（ＵＭＧ）の補充（３３×ＵＭＧ、５０×ＵＭＧ、６６×ＵＭＧ）とｐＨ（ｐＨ７．０５対ｐＨ６．８５）の効果を比較した結果をグラフで示す。ＵＭＧ補充成分を含まない結果（「＋」記号によって示される）は比較のために示されている。 塩基性種のパーセンテージ（Ａ）及び抗体力価（Ｂ）に対するさまざまなアルギニン及びリジンの濃度の影響を比較した結果をグラフで示す。Ｘ軸のラベルは、表５に概説されているように、高濃度（Ｈ）、中濃度（Ｍ）、または低濃度（Ｌ）のリジンとアルギニンに対応する。 異なるレベルのリジンとアルギニンを含む培養条件のＪＭＰ分析からの最大の望ましさの予測結果（低リジンと低アルギニン（ＬＬ）－Ａ；低リジンと中アルギニン（ＬＭ）－Ｂ；低リジンと高アルギニン（ＬＨ）－Ｃ）。高濃度（Ｈ）、中濃度（Ｍ）、または低濃度（Ｌ）のリジンとアルギニンに対応する濃度は表５に概説されている。 異なるレベルのリジンとアルギニンを含む培養条件のＪＭＰ分析からの最大の望ましさの予測結果（低リジンと低アルギニン（ＬＬ）－Ａ；低リジンと中アルギニン（ＬＭ）－Ｂ；低リジンと高アルギニン（ＬＨ）－Ｃ）。高濃度（Ｈ）、中濃度（Ｍ）、または低濃度（Ｌ）のリジンとアルギニンに対応する濃度は表５に概説されている。 異なるレベルのリジンとアルギニンを含む培養条件のＪＭＰ分析からの最大の望ましさの予測結果（低リジンと低アルギニン（ＬＬ）－Ａ；低リジンと中アルギニン（ＬＭ）－Ｂ；低リジンと高アルギニン（ＬＨ）－Ｃ）。高濃度（Ｈ）、中濃度（Ｍ）、または低濃度（Ｌ）のリジンとアルギニンに対応する濃度は表５に概説されている。 培養１４日後、１５日後、１６日後、１７日後及び１８日後の抗体力価（Ａ）、塩基性種のパーセンテージ（Ｂ）、酸性種のパーセンテージ（Ｃ）、主要種のパーセンテージ（Ｄ）、Ｇ０Ｆ種のパーセンテージ（Ｅ）、Ｇ１Ｆ種のパーセンテージ（Ｆ）、Ｇ２Ｆ種のパーセンテージ（Ｇ）、及びグリカン種の合計（Ｈ）に対する亜鉛の影響を比較する時間経過データをグラフで示す。ｘ軸の数字は、表６に概説されている亜鉛濃度に対応している。 培養１４日後、１５日後、１６日後、１７日後及び１８日後の抗体力価（Ａ）、塩基性種のパーセンテージ（Ｂ）、酸性種のパーセンテージ（Ｃ）、主要種のパーセンテージ（Ｄ）、Ｇ０Ｆ種のパーセンテージ（Ｅ）、Ｇ１Ｆ種のパーセンテージ（Ｆ）、Ｇ２Ｆ種のパーセンテージ（Ｇ）、及びグリカン種の合計（Ｈ）に対する亜鉛の影響を比較する時間経過データをグラフで示す。ｘ軸の数字は、表６に概説されている亜鉛濃度に対応している。 培養１４日後、１５日後、１６日後、１７日後及び１８日後の抗体力価（Ａ）、塩基性種のパーセンテージ（Ｂ）、酸性種のパーセンテージ（Ｃ）、主要種のパーセンテージ（Ｄ）、Ｇ０Ｆ種のパーセンテージ（Ｅ）、Ｇ１Ｆ種のパーセンテージ（Ｆ）、Ｇ２Ｆ種のパーセンテージ（Ｇ）、及びグリカン種の合計（Ｈ）に対する亜鉛の影響を比較する時間経過データをグラフで示す。ｘ軸の数字は、表６に概説されている亜鉛濃度に対応している。 培養１４日後、１５日後、１６日後、１７日後及び１８日後の抗体力価（Ａ）、塩基性種のパーセンテージ（Ｂ）、酸性種のパーセンテージ（Ｃ）、主要種のパーセンテージ（Ｄ）、Ｇ０Ｆ種のパーセンテージ（Ｅ）、Ｇ１Ｆ種のパーセンテージ（Ｆ）、Ｇ２Ｆ種のパーセンテージ（Ｇ）、及びグリカン種の合計（Ｈ）に対する亜鉛の影響を比較する時間経過データをグラフで示す。ｘ軸の数字は、表６に概説されている亜鉛濃度に対応している。 培養１４日後、１５日後、１６日後、１７日後及び１８日後の抗体力価（Ａ）、塩基性種のパーセンテージ（Ｂ）、酸性種のパーセンテージ（Ｃ）、主要種のパーセンテージ（Ｄ）、Ｇ０Ｆ種のパーセンテージ（Ｅ）、Ｇ１Ｆ種のパーセンテージ（Ｆ）、Ｇ２Ｆ種のパーセンテージ（Ｇ）、及びグリカン種の合計（Ｈ）に対する亜鉛の影響を比較する時間経過データをグラフで示す。ｘ軸の数字は、表６に概説されている亜鉛濃度に対応している。 培養１４日後、１５日後、１６日後、１７日後及び１８日後の抗体力価（Ａ）、塩基性種のパーセンテージ（Ｂ）、酸性種のパーセンテージ（Ｃ）、主要種のパーセンテージ（Ｄ）、Ｇ０Ｆ種のパーセンテージ（Ｅ）、Ｇ１Ｆ種のパーセンテージ（Ｆ）、Ｇ２Ｆ種のパーセンテージ（Ｇ）、及びグリカン種の合計（Ｈ）に対する亜鉛の影響を比較する時間経過データをグラフで示す。ｘ軸の数字は、表６に概説されている亜鉛濃度に対応している。 培養１４日後、１５日後、１６日後、１７日後及び１８日後の抗体力価（Ａ）、塩基性種のパーセンテージ（Ｂ）、酸性種のパーセンテージ（Ｃ）、主要種のパーセンテージ（Ｄ）、Ｇ０Ｆ種のパーセンテージ（Ｅ）、Ｇ１Ｆ種のパーセンテージ（Ｆ）、Ｇ２Ｆ種のパーセンテージ（Ｇ）、及びグリカン種の合計（Ｈ）に対する亜鉛の影響を比較する時間経過データをグラフで示す。ｘ軸の数字は、表６に概説されている亜鉛濃度に対応している。 培養１４日後、１５日後、１６日後、１７日後及び１８日後の抗体力価（Ａ）、塩基性種のパーセンテージ（Ｂ）、酸性種のパーセンテージ（Ｃ）、主要種のパーセンテージ（Ｄ）、Ｇ０Ｆ種のパーセンテージ（Ｅ）、Ｇ１Ｆ種のパーセンテージ（Ｆ）、Ｇ２Ｆ種のパーセンテージ（Ｇ）、及びグリカン種の合計（Ｈ）に対する亜鉛の影響を比較する時間経過データをグラフで示す。ｘ軸の数字は、表６に概説されている亜鉛濃度に対応している。 塩基性種のパーセンテージ（Ａ）、グリカン種の合計（Ｂ）、凝集体（高分子量（ＨＭＷ）形成（Ｃ）、力価（Ｄ）、及び酸性アイソフォーム（Ｅ）に対する亜鉛、培養日数、ならびに温度（３３℃、３５℃、及び３７℃）の影響を比較する時間経過データをグラフで示す。Ａ、Ｃ、及びＥの黒い実線は、各属性の上位のプロセス基準を表し、Ｂの黒い線は、下位の受け入れ基準を表す。ｘ軸の数字は、表６に概説されている亜鉛濃度に対応している。 塩基性種のパーセンテージ（Ａ）、グリカン種の合計（Ｂ）、凝集体（高分子量（ＨＭＷ）形成（Ｃ）、力価（Ｄ）、及び酸性アイソフォーム（Ｅ）に対する亜鉛、培養日数、ならびに温度（３３℃、３５℃、及び３７℃）の影響を比較する時間経過データをグラフで示す。Ａ、Ｃ、及びＥの黒い実線は、各属性の上位のプロセス基準を表し、Ｂの黒い線は、下位の受け入れ基準を表す。ｘ軸の数字は、表６に概説されている亜鉛濃度に対応している。 塩基性種のパーセンテージ（Ａ）、グリカン種の合計（Ｂ）、凝集体（高分子量（ＨＭＷ）形成（Ｃ）、力価（Ｄ）、及び酸性アイソフォーム（Ｅ）に対する亜鉛、培養日数、ならびに温度（３３℃、３５℃、及び３７℃）の影響を比較する時間経過データをグラフで示す。Ａ、Ｃ、及びＥの黒い実線は、各属性の上位のプロセス基準を表し、Ｂの黒い線は、下位の受け入れ基準を表す。ｘ軸の数字は、表６に概説されている亜鉛濃度に対応している。 塩基性種のパーセンテージ（Ａ）、グリカン種の合計（Ｂ）、凝集体（高分子量（ＨＭＷ）形成（Ｃ）、力価（Ｄ）、及び酸性アイソフォーム（Ｅ）に対する亜鉛、培養日数、ならびに温度（３３℃、３５℃、及び３７℃）の影響を比較する時間経過データをグラフで示す。Ａ、Ｃ、及びＥの黒い実線は、各属性の上位のプロセス基準を表し、Ｂの黒い線は、下位の受け入れ基準を表す。ｘ軸の数字は、表６に概説されている亜鉛濃度に対応している。 塩基性種のパーセンテージ（Ａ）、グリカン種の合計（Ｂ）、凝集体（高分子量（ＨＭＷ）形成（Ｃ）、力価（Ｄ）、及び酸性アイソフォーム（Ｅ）に対する亜鉛、培養日数、ならびに温度（３３℃、３５℃、及び３７℃）の影響を比較する時間経過データをグラフで示す。Ａ、Ｃ、及びＥの黒い実線は、各属性の上位のプロセス基準を表し、Ｂの黒い線は、下位の受け入れ基準を表す。ｘ軸の数字は、表６に概説されている亜鉛濃度に対応している。 ２セットの実験からの、酸性種のパーセンテージ（Ａ）、塩基性種のパーセンテージ（Ｂ）、主要種のパーセンテージ（Ｃ）、抗体力価（Ｄ）に対するベドリズマブ培養物の日数の影響を比較する時間経過データをグラフで示す。Ａ～Ｄでは、実行２は白丸で表され、実行１のデータ点は黒丸で表されている。 ２セットの実験からの、酸性種のパーセンテージ（Ａ）、塩基性種のパーセンテージ（Ｂ）、主要種のパーセンテージ（Ｃ）、抗体力価（Ｄ）に対するベドリズマブ培養物の日数の影響を比較する時間経過データをグラフで示す。Ａ～Ｄでは、実行２は白丸で表され、実行１のデータ点は黒丸で表されている。 ２セットの実験からの、酸性種のパーセンテージ（Ａ）、塩基性種のパーセンテージ（Ｂ）、主要種のパーセンテージ（Ｃ）、抗体力価（Ｄ）に対するベドリズマブ培養物の日数の影響を比較する時間経過データをグラフで示す。Ａ～Ｄでは、実行２は白丸で表され、実行１のデータ点は黒丸で表されている。 ２セットの実験からの、酸性種のパーセンテージ（Ａ）、塩基性種のパーセンテージ（Ｂ）、主要種のパーセンテージ（Ｃ）、抗体力価（Ｄ）に対するベドリズマブ培養物の日数の影響を比較する時間経過データをグラフで示す。Ａ～Ｄでは、実行２は白丸で表され、実行１のデータ点は黒丸で表されている。 アイソフォーム分布とｐＨシフトパラメーターの相関関係をグラフで示す。最終的な細胞培養ｐＨ（ｐＨシフト後）と酸性アイソフォーム種％（左パネル）または主要アイソフォーム％（右パネル）との相関を示す。 アイソフォーム分布とｐＨシフトパラメーターの相関関係をグラフで示す。ｐＨシフト期間と酸性アイソフォーム種％（左パネル）または主要アイソフォーム％（右パネル）との相関を示す。 ベドリズマブなどの抗α４β７抗体の集団に存在する可能性のあるＮ－グリカンの構造を示す。グリカンの凡例は図に示されている。
Ｉ．定義
本発明が、より容易に理解され得るために、特定の用語を最初に定義する。
（全体にわたって互換的に使用される）細胞表面分子である、「α４β７インテグリン」または「α４β７」は、α４鎖（ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ４）とβ７鎖（ＩＴＧＢ７）とのヘテロダイマーである。ヒトのα４インテグリンとβ７インテグリン遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ（米国国立バイオテクノロジー情報センター、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）のＲｅｆＳｅｑアクセッション番号ＮＭ＿０００８８５とＮＭ＿０００８８９は、それぞれ、Ｂ及びＴリンパ球、特にメモリーＣＤ４＋リンパ球によって発現される。多くのインテグリンの典型である、α４β７は、休止または活性化された状態のいずれかで存在し得る。α４β７のリガンドは、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）、フィブロネクチン、及び粘膜アドレシン（ＭＡｄＣＡＭ（例えば、ＭＡｄＣＡＭ－１））を含む。α４β７インテグリンに結合する抗体は、本明細書で、「抗α４β７抗体」と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「α４β７複合体に対する結合特異性」を有する抗体、またはその抗原結合断片は、α４β７に結合するが、α４β１またはαＥＢ７に結合しない。ベドリズマブは、α４β７複合体に対する結合特異性を有する抗体の例である。
「約」という用語は、その後に続く値が正確な値ではなく、値の＋／－５％の値である範囲の中心点であることを意味する。値がパーセンテージで示される相対値である場合、「約」という用語は、その後に続く値が正確な値ではなく、値の＋／－５％の値である範囲の中心点であり、それによって範囲の上限が１００％の値を超えることができないことを意味する。
本明細書で使用される場合、「凝集体」または「凝集体（複数）」という用語は、２つ以上の抗体または抗体断片の会合を指す。例えば、凝集体は、抗体及び／または抗体断片の二量体、三量体、四量体、または四量体よりも大きい多量体であり得る。抗体凝集体は可溶性または不溶性であり得る。凝集分子間の会合は、それらが関連するメカニズムに関係なくいずれかの共有結合または非共有結合であってもよい。会合は、凝集した分子間で直接的であっても、それらを一緒に連結する他の分子を介して間接的であってもよい。後者の例には、他のタンパク質とのジスルフィド結合、脂質との疎水性会合、ＤＮＡとの電荷会合、浸出プロテインＡとの親和性会合、または複数の成分との混合モード会合が含まれるが、これらに限定されない。凝集体は、細胞培養物でのタンパク質発現中、下流のプロセスでのタンパク質精製中、または医薬品の保管中に不可逆的に形成される可能性がある。溶液中の凝集体の存在は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（例えば、ＵＶ検出を備えたＳＥＣ、光散乱検出を備えたＳＥＣ（ＳＥＣ－ＬＳＤ））、フィールドフロー分画、分析用超遠心分離沈降速度、またはキャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ－ＳＤＳ、還元及び非還元）を使用して決定できる。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続された４つのポリペプチド鎖である、２つの重鎖（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン分子を指すことを意図している。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書において、ＨＣＶＲまたはＶＨと略記される）及び重鎖定常領域からなる（ＣＨ）。重鎖定常領域は３つのドメインである、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３からなる。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書において、ＬＣＶＲまたはＶＬと略される）と軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬからなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに分割される。各々のＶＨ及びＶＬには、３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。いくつかの実施形態では、抗体は、断片結晶化可能（Ｆｃ）領域を有する。特定の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプであり、カッパ軽鎖を有する。
本明細書で使用される場合、「荷電種」、「荷電アイソフォーム」、または「荷電アイソフォーム種」という用語は、抗体またはその抗原結合部分の主要な種とは異なる全体的な電荷によってによって特徴づけられる、抗体またはその抗原結合部分（例えば、ベドリズマブ、またはその抗原結合部分）のバリアントを指し、抗体またはその抗原結合部分の荷電アイソフォーム種は、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）、例えば、カチオン交換－高速液体クロマトグラフィー（ＣＥＸ－ＨＰＬＣ）、ＣＥＸ－質量分析、または等電点電気泳動などの当該技術分野で知られている種々の方法によって検出することができる。例えば、一般に、抗体調製物がＣＥＸ、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ、またはＣＥＸ－質量分析を使用して分離される場合、抗体の大部分は、その抗体の優勢な（主要な）アイソフォームの特性である保持時間でＣＥＸ樹脂から溶出する。これは、ＣＥＸ樹脂の保持時間の関数として樹脂から溶出される抗体の量をプロットすることで視覚化できる。このように視覚化された場合、抗体またはその抗原結合部分の主要アイソフォームは、最大のピーク内でＣＥＸ樹脂から溶出する抗体またはその抗原結合部分の画分である。この方法を使用すると、主要アイソフォームとは異なる保持時間を持つことで、荷電アイソフォーム種を特定できる。例えば、荷電アイソフォーム種がＣＥＸ、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ、またはＣＥＸ質量分析によって検出される場合、酸性アイソフォーム種は、抗体またはその抗原結合部分の主要アイソフォームよりも短い保持時間で樹脂から溶出でき、塩基性アイソフォーム種は、抗体またはその抗原結合部分の主要アイソフォームよりも長い保持時間で樹脂から溶出することができる。
本明細書で使用される場合、「酸性種」または「酸性アイソフォーム種」という用語は、全体的な酸性電荷によって特徴付けられる抗体またはその抗原結合部分（例えば、ベドリズマブ、またはその抗原結合部分）のバリアントを指す。抗体またはその抗原結合部分の酸性種は、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）、例えば、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＣＥＸ－ＨＰＬＣ）、ＣＥＸ－質量分析、または等電点電気泳動などの当該技術分野で知られている種々の方法によって検出することができる。一般に、抗体またはその抗原結合部分の酸性種は、抗体またはその抗原結合部分の主要アイソフォームよりも短い保持時間でＣＥＸ樹脂から溶出する。抗体の酸性種には、電荷バリアント、構造バリアント、及び／または画分化バリアントが含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合部分を含む組成物は、１つを超えるタイプの酸性アイソフォーム種を含み得る。いくつかの実施形態では、複数の酸性アイソフォーム種は、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ分離中の保持時間の違いに基づいて同定することができる。例えば、抗体、例えばベドリズマブを含む組成物をＣＥＸを使用して分析する場合、それぞれが抗体の１つ以上の酸性アイソフォーム種を表す１つ以上の酸性アイソフォームピークを同定することができる。
本明細書で使用される場合、「塩基性種」または「塩基性アイソフォーム種」という用語は、全体的な塩基性電荷によって特徴付けられる抗体またはその抗原結合部分（例えば、ベドリズマブ）のバリアントを指す。抗体またはその抗原結合部分の塩基性種は、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）、例えば、陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＣＥＸ－ＨＰＬＣ）、ＣＥＸ－質量分析、または等電点電気泳動などの当該技術分野で知られている種々の方法によって検出することができる。一般に、抗体またはその抗原結合部分の塩基性種は、抗体またはその抗原結合部分の主要アイソフォームよりも長い保持時間でＣＥＸ樹脂から溶出する。抗体の塩基性種には、電荷バリアント、構造バリアント、及び／または画分化バリアントが含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合部分を含む組成物は、１つを超えるタイプの塩基性アイソフォーム種を含み得る。いくつかの実施形態では、複数の塩基性アイソフォーム種は、ＣＥＸ－ＨＰＬＣ分離中の保持時間の違いに基づいて同定することができる。例えば、抗体、例えばベドリズマブを含む組成物をＣＥＸを使用して分析する場合、それぞれが抗体の１つ以上の塩基性アイソフォーム種を表す１つ以上の塩基性アイソフォームピークを同定することができる。一実施形態では、ベドリズマブの塩基性アイソフォームは、カルボキシル末端リジン（Ｃ－Ｌｙｓ）を有するベドリズマブである。一次配列により、宿主細胞不純物、または抗体もしくはその抗原結合部分に関連しない他の不純物は、抗体またはその抗原結合部分の「塩基性種」または「塩基性アイソフォーム種」とはみなされない。
「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域内に散在する超可変性の領域である。
本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合断片」または「抗原結合部分」という用語は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、一本鎖抗体、機能的重鎖抗体（ナノボディ）、ならびに特異的結合についてインタクトな抗体と競合する、少なくとも１つの所望のエピトープに対して特異性を有する抗体の任意の部分（例えば、エピトープに特異的に結合するのに十分なフレームワーク配列を有する相補性決定領域の単離された部分）を指す。抗原結合断片は、組換え技術によって、または抗体の酵素的もしくは化学的切断によって生成することができる。
本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、親抗体の抗原結合特性を保持するかまたは実質的に保持するが、ヒトでは免疫原性が低い非ヒト抗体（例えば、マウス）に由来する抗体を指す。
細胞培養法を使用して組換え哺乳動物宿主細胞株によって生産される抗体などのポリペプチドは、「組換えポリペプチド」、「タンパク質」、または抗体に関しては「組換え抗体」と呼ばれる。発現したタンパク質は、細胞内で生産されるか、またはそれが回収もしくは収集され得る培地に分泌され得る。一実施形態では、組換え抗体は、抗体、例えば、組換え抗α４β７抗体、例えば、ベドリズマブのようなα４β７複合体に対する結合特異性のある抗体である。本明細書に記載の方法及び組成物は、組換え抗体を生産するための組成物及び細胞培養方法に関するので、別段の定めがない限り、「抗体」という用語は、本明細書では「組換え抗体」という用語と互換的に使用される。
「組換え宿主細胞」または「宿主細胞」という用語は、遺伝子組換えポリペプチド、例えば、抗体を発現するように遺伝子操作された細胞を指す。一実施形態では、組換え宿主細胞は、抗体重鎖、軽鎖、またはその両方をコードする核酸を含む発現ベクターを含む。「宿主細胞」という用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も指すことを意図することも理解されたい。突然変異または環境の影響のいずれかに起因して、特定の改変が後続の世代で発生する可能性があるため、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一でない可能性があるが、本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に依然として含まれる。さらに、別段の定めがない限り、「細胞」という用語、例えば、宿主細胞、哺乳動物細胞、または哺乳動物宿主細胞が使用される場合、この用語が細胞の集団を含むことを意図することを理解されたい。
本明細書で使用される場合、「細胞培養プロセス」という用語は、組換えポリペプチド、例えば、抗体の生産に関連する細胞培養段階を集団的に指す。「細胞培養プロセス」という用語は、一般に、制御された条件下で細胞を増殖または維持するプロセスを指す。細胞培養プロセスは、インビトロまたはエクスビボで行うことができる。いくつかの実施形態では、細胞培養プロセスは、拡大段階と生産段階の両方を有する。いくつかの実施形態では、拡大段階と生産段階は、移行段階またはシフト段階によって分離されている。細胞を「培養すること」とは、細胞を増殖または維持するのに適した条件下で細胞を細胞培養培地と接触させることを指す。細胞培養物は、特定の実施形態では、目的の組換えポリペプチド、例えば、抗α４β７抗体を生産することのできる宿主細胞の集団の生成または維持するための方法を指す。例えば、発現ベクターが適切な哺乳動物宿主細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞に組み込まれると、宿主は、関連するヌクレオチドコード配列の発現に適した条件下で培養することができる。「細胞培養物」は、細胞を含む溶液を指すこともある。
「培地」及び「細胞培養培地」（複数、「培地」）という用語は、細胞を増殖または維持するために使用される栄養源を指す。当業者によって理解されるように、栄養源は、細胞が増殖及び／または生存するために必要な成分を含み得、または細胞の増殖及び／または生存を助ける成分を含み得る。ビタミン、必須または非必須のアミノ酸（例えば、システイン及びシスチン）、ならびに微量元素（例えば、銅）は、培地成分の例である。細胞培養培地の例としては、増殖培地及び生産培地が挙げられる。
細胞培養培地はまた、例えば、組換えポリペプチドの生産を増加させるか、細胞の生存率を改善することにより、細胞培養プロセスを助ける１つ以上の成分を含む、例えば、「培地補充成分」または「補充成分」を補充され得る。一実施形態では、補充成分は、細胞培養培地とともに製剤化されず、例えば、生産培地または供給培地とともに製剤化されない。補充成分は、供給溶液または培地との組み合わせが補充成分の最終的な低濃度をもたらす濃縮形態で調製することができる。補充成分は、出発点、例えば、ストックまたはベース、培地にすでに存在する１つ以上の成分を含み得、及び／または補充成分は、培地において新しい１つ以上の成分を含み得る。一実施形態では、補充成分が供給溶液に添加される。
補充成分は、例えば、細胞培養物の特定の態様に影響を及ぼし、細胞型、増殖フォーマット、及び産物（目的のタンパク質）の特性に応じて、細胞増殖を改善、または組換えポリペプチド産生を増加させることができる。補充成分によって添加され得る物質の例としては、１つ以上の微量元素、１つ以上のホルモン、１つ以上のアミノ酸、１つ以上のビタミン、１つまたは１つ以上の脂肪酸、１つ以上の非イオン性洗浄剤、１つ以上のヌクレオチド、及び／または１つ以上の糖が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、補充成分は、インスリン、植物の加水分解物、及び／または動物の加水分解物を含む。１つ以上の補充成分は、細胞培養プロセスの１つの段階またはその複数の段階で添加され得る。
細胞培養培地及び／または補充成分は、成分（複数可）の性質、例えば、１つ以上の元素、無機塩または有機イオンまたは糖などの既知の化学組成物として供給されるか、または混合物、例えば加水分解物などの複雑な成分として供給されるかに基づいて、ばらつきの源がおそらく既知であるか不明であるかという点で、特定の度合いで「定義されている」かまたは「定義されていない」としてもよい。培地中にタンパク質または加水分解物などの複雑な成分が存在すると、定義度合いが低下する。
本明細書で互換的に使用される「増殖段階」、「増殖段階」、「拡大段階」及び「拡大段階」という用語は、培養される宿主細胞が急速に分裂し、数が増加している期間を指す。拡大段階の間、細胞は一般に、増殖培地（または拡大培地）中で、細胞増殖を最大化するように設計された条件下で培養され得る。増殖段階は、例えば、バッチ培養において、時間的に生産段階に先行することができ、それにより、２つの段階は、移行段階によって分離され得る（または分離されない場合がある）。
本明細書で使用される場合、「生産段階」または「生産段階」という用語は、宿主細胞が組換え抗体などの組換えポリペプチドの最大量を生産している期間を指す。生産段階は、典型的には、拡大段階中よりも細胞分裂が少ないことを特徴とし、ポリペプチド生産を最大化するように設計された培地及び培養条件の使用も含み得る。
「増殖培地」という用語は、培養細胞の増殖、すなわち数の増加を促進し、細胞培養プロセスの増殖段階または拡大段階中に使用される細胞培養培地を指す。
「生産培地」とは、組換えポリペプチド、例えば、目的の抗体、例えば、抗α４β７抗体の生産を促進する細胞培養培地である。
本明細書で使用される場合、「供給溶液」または「供給培地」は、増殖培地または生産培地中の細胞によって生産されるタンパク質の態様を改善または維持するために、増殖培地または生産培地中の細胞培養物に添加される、細胞培養培地を指す。例えば、細胞によって生産される特定のタンパク質力価レベルを維持するために、供給溶液を添加することができる。供給溶液は当該技術分野で知られている。一実施形態では、供給溶液は、哺乳動物細胞からのタンパク質の生産に有益であると同定された追加の栄養素で補充される。
増殖は生産培地でも起こり得ること、及び生産は増殖培地で起こり得、その結果、増殖培地と生産培地は同一であり得ることが理解されるであろう。しかしながら、一実施形態では、増殖培地が使用された場合よりも、目的のポリペプチドの生産を促進する生産培地が選択される。
本明細書で使用される場合、「バッチ培養」という用語は、細胞培養のためのすべての成分（細胞及びすべての培養栄養素を含む）が培養プロセスの開始時に培養容器に供給される培養を指す。
本明細書で使用される「流加細胞培養」という用語は、細胞及び培地が最初に培養容器に供給され、追加の補充成分、例えば、栄養素が（供給溶液を介して）連続的に、または離散的な増分で供給される、培養の終了前の定期的な細胞及び／または産物の回収を伴うか、または伴わない、バッチ培養を指す。
本明細書で使用される「灌流培養物」という用語は、培養プロセスの開始時に細胞及び補充成分が培養容器に供給され、追加の補充成分（複数可）が培養物に連続的に供給され、産物が、培養プロセス中に培地から継続的に回収される培養物を指す。
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、それに連結された別の核酸を輸送することのできる核酸分子を指すことを意図する。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントを連結することができる環状の二本鎖ＤＮＡを指す。別のタイプのベクターは、ファージベクターである。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに連結され得る。あるベクターは、それらが導入された宿主細胞において自律的複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入の際、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって、宿主ゲノムと共に複製され得る。さらに、特定ベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を駆動し得る。そのようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」または単に「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技法における利用される発現ベクターは、プラスミドの形態である場合が多い。
「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、及び／またはそれらの類似体、ＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼによって、または合成反応によってポリマーに組み込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体のような、修飾されたヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの組立て前または後に付与され得る。
「単離された核酸」は、その通常の文脈の外にあるか、またはそれから分離された、天然に存在しない、組換えの、または天然に存在する配列を意味し、包含する。単離された核酸分子は、それが天然に見出される形態または状況以外のものである。したがって、単離された核酸分子は、天然の細胞に存在するような核酸分子とは区別される。しかしながら、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なる染色体位置にある通常にタンパク質を発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。
本明細書で使用される場合、「精製された」（または「単離された」）は、他の成分を実質的に含まない核酸分子（例えば、ポリヌクレオチド）またはアミノ酸分子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）を指す。いくつかの実施形態では、精製されたポリヌクレオチドまたは精製されたポリペプチドは、それが生産される環境に存在する他の成分から回収または分離される。例えば、単離されたポリペプチドは、それが生産された細胞の他の成分（例えば、小胞体または細胞質タンパク質及びＲＮＡ）から分離されたものである。単離されたポリヌクレオチドは、他の核成分（例えば、ヒストン）及び／または上流または下流の核酸配列から分離されたものである。
「培養容器」という用語は、細胞を培養するために使用される容器を指す。培養容器は、細胞の培養に有用である限り、任意のサイズにすることができる。
本明細書で使用される場合、「接種」または「播種」という用語は、培養を開始する培地への細胞の添加、または培養のためのバイオリアクターまたは別の容器に細胞培養物を提供するプロセスを指す。細胞は、以前に別のバイオリアクターまたは容器内で増殖していてもよい。代替的に、細胞は凍結されており、それらをバイオリアクターまたは容器に提供する直前に解凍されてもよい。この用語は、単一の細胞を含む任意の数の細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「力価」という用語は、細胞培養によって生産された組換え発現ポリペプチド、例えば抗体の総量を所与の量の培地容量で割ったものを指す。力価は典型的には、ミリリットルあたりの抗体のミリグラムまたは培地のリットルあたりのグラムの単位で表される。力価は、異なる培養条件下でタンパク質産物を得るのと比較した力価の増加パーセンテージなど、相対的な測定値の観点から表現または評価することができる。
本明細書で使用される場合、「回収」という用語は、例えば、宿主細胞から分泌される発現タンパク質について、細胞培養物の細胞及び細胞残屑からの細胞培養培地（目的の発現タンパク質を含む）の分離を指す。（分泌されないタンパク質を回収すると、細胞が回収され、培地が廃棄される。）目的のタンパク質を含む培地は、「培養上清」と呼ばれる。回収は、遠心分離、精密濾過、深層濾過、及び絶対孔径膜による濾過を含むがこれらに限定されない、いくつかの手法のいずれかを使用して実行される。回収後、例えば、上清または細胞から、清澄化を含む、所望のタンパク質を単離するためのその後のステップは、一般に、精製ステップであるとみなされる。
「清澄回収」という用語は、目的の組換えポリペプチド、例えば抗α４β７抗体を含有する培養上清に由来する液体材料を指す。清澄化された回収物は、目的のポリペプチドを細胞培養物の細胞及び細胞残屑から分離するために、及び／または液体からより細かい固体粒子と粒子状不純物を除去するために、１つ以上のプロセスステップを経た細胞培養培地から得られる。このような分離技術の例としては、沈降、凝集、遠心分離、及び／または濾過が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、組換えポリペプチド、例えば、抗体、調製物の文脈における「上流プロセス」という用語は、細胞からのポリペプチド（例えば、抗体）の生産及び収集を含む活動を指す（例えば、タンパク質、例えば、目的の抗体の細胞培養中）。
本明細書で使用される場合、「下流プロセス」という用語は、タンパク質、例えば目的の抗体を精製するために上流プロセスの後に使用される１つ以上の技術を指す。例えば、下流プロセスは、例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを含むアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィーなどのイオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、または置換クロマトグラフィーを用いるタンパク質産物の生成を含む。
本明細書で使用される場合、「グリコシル化プロファイル」という用語は、オリゴ糖を含む翻訳後修飾の種の複合体を指す。抗α４β７抗体に関連して、グリコシル化プロファイルは、抗体のＦｃ領域におけるＮ結合型のグリコシル化を記載する。ベドリズマブに関連して、グリコシル化プロファイルは、配列番号１３の重鎖のアスパラギン３０１に結合したグリコシル化種を指す。
ＩＩ．本発明の方法及び組成物
本明細書で提供されるのは、哺乳動物、例えば非ヒトの細胞培養物において、ベドリズマブなどの抗α４β７抗体を生産するための方法及び組成物である。本発明は、少なくとも部分的に、哺乳動物細胞培養で高い抗α４β７抗体力価レベル、すなわち、１ｇ／Ｌを超えるもの、例えば、３～１０ｇ／Ｌ、４～８ｇ／Ｌ、または５～７ｇ／Ｌを達成するために使用することができる細胞培養パラメーターに基づく。さらに本明細書で提供されるのは、ベドリズマブなどの抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームの低下したレベルを達成するための方法及び組成物；ベドリズマブなどの抗α４β７抗体の低い凝集レベルを達成するための方法及び組成物；ならびにベドリズマブなどの抗α４β７抗体の特定のグリカン型を達成するための方法及び組成物である。さらに本明細書で提供されるのは、塩基性アイソフォーム種のレベルが低下したレベル；低レベルの高分子量凝集体；及び／または特定のグリカン型を有する、ベドリズマブなどの抗α４β７抗体を含む組成物である。
特に、本明細書に開示される方法及び組成物は、抗α４β７抗体ベドリズマブ、またはベドリズマブの抗原結合領域を有する抗体を生産するために使用することができる。ベドリズマブはまた、その商標ＥＮＴＹＶＩＯ（登録商標）（Ｔａｋｅｄａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）で知られている。ベドリズマブは、変異したヒトＩｇＧ１フレームワーク領域とマウス抗体Ａｃｔ－１からの抗原結合ＣＤＲとを含むヒト化抗体である（参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，１４７，８５１号に記載されている）。
ベドリズマブはα４β７インテグリンに特異的に結合し、α４β７インテグリンと粘膜アドレシン細胞接着分子－１（ＭＡｄＣＡＭ－１）及びフィブロネクチンとの相互作用をブロックし、内皮を通過する炎症を起こした胃腸実質組織へのメモリーＴリンパ球の移動を阻害する。ベドリズマブは、α４β１及びαＥβ７インテグリンに結合またはその機能を阻害せず、α４インテグリンと血管細胞接着分子－１（ＶＣＡＭ－１）との相互作用と拮抗しない。
α４β７インテグリンは、消化管に優先的に移動するメモリーＴリンパ球の個別のサブセットの表面に発現する。ＭＡｄＣＡＭ－１は腸内皮細胞に発現し、腸リンパ組織へのＴリンパ球のホーミングに重要な役割を果たす。α４β７インテグリンとＭＡｄＣＡＭ－１の相互作用は、潰瘍性大腸炎及びクローン病の特徴である慢性炎症などの粘膜炎症の重要な原因であるとされている。ベドリズマブは、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、ＨＩＶ、慢性嚢炎を含む嚢炎、瘻孔形成クローン病、移植片対宿主疾患、及び腹腔疾患を治療するために使用され得る。
ベドリズマブの重鎖可変領域は配列番号１に提供され、ベドリズマブの軽鎖可変領域は配列番号５に提供されている。ベドリズマブは、配列番号２に記載のＣＤＲ１、配列番号３に記載のＣＤＲ２、及び配列番号４に記載のＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含む。ベドリズマブは、配列番号６に記載のＣＤＲ１、配列番号７に記載のＣＤＲ２、及び 配列番号８に記載のＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。軽鎖可変領域をコードする核酸配列は、配列番号９に記載される。重鎖可変領域をコードする核酸配列は、配列番号１０に記載されている。ベドリズマブの軽鎖をコードする完全長の核酸配列は、配列番号１１として記載されている。ベドリズマブの重鎖をコードする全長核酸配列は、配列番号１２として記載されている。ベドリズマブをコードする核酸配列はまた、米国特許公開２０１０／０２９７６９９に記載され、その全内容が本明細書に組み込まれる。ベドリズマブ及びベドリズマブの配列は、米国特許公開２０１４／０３４１８８５及び米国特許公開２０１４／０３７７２５１にさらに記載され、参照によりそれぞれの全内容の全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
本明細書で提供される方法及び組成物は、抗α４β７抗体、特にベドリズマブまたはベドリズマブの結合領域、すなわちＣＤＲまたは可変領域を有する抗体、または哺乳動物細胞において抗α４β７抗体の抗原結合断片を生産するために有用である。
本明細書に開示される方法及び組成物は、哺乳動物細胞培養プロセスに関する。哺乳動物細胞は、主に適切に折りたたまれて組み立てられた異種タンパク質を生産する能力、及びヒトの細胞によって作られたものと同様の修飾などの翻訳後修飾の能力のために、臨床、例えばヒト治療、用途のための哺乳動物タンパク質の生産のための主要なシステムになっている。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ならびに、例えば、マウス骨髄腫（ＮＳ０）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ－２９３）、ヒト網膜細胞などの他のさまざまな哺乳動物源から得られた細胞株は、治療用抗体を含むバイオ医薬品の製造について規制当局によって承認されている。これらのうち、ＣＨＯ細胞は、異種タンパク質の生産に広く使用されている最も一般的に使用されている産業用宿主の１つである。したがって、ジヒドロ葉酸レダクターゼ陰性（ＤＨＦＲ－）またはグルタミンシンターゼ陰性（ＧＳ－）のＣＨＯ細胞を含む、ＣＨＯ細胞における抗体の大規模生産のための方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｔｒｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６（５）：５５３－６０（１９９５）、Ｂｉｒｃｈ ａｎｄ Ｒａｃｈｅｒ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ５８：６７１－６８５（２００６）、及び米国特許第６，６１０，５１６号を参照されたい）。本明細書で提供される組成物及び方法での使用に適したＣＨＯ細胞株の例としては、ＧＳ－ＣＨＯ、ＣＨＯ－Ｋ１ ＤＵＸ Ｂ１１及びＤＰ－１２ ＣＨＯ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で提供される組成物及び方法での使用に適したＣＨＯ細胞は、以下の文献に記載されている：米国特許第４，７６６，０７５号；同第４，８５３，３３０号；同第５，１８５，２５９号；同第５，１２２，４６４号；同第５，５９１，６３９号；同第５，８７９，９３６号；Ｌｕｂｉｎｉｅｃｋｉ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，Ｓｐｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８９），ｐｐ．４４２－４５１。本明細書での使用に適した既知のＣＨＯ誘導体としては、例えば、ＣＨＯ／－ＤＨＦＲ（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６ （１９８０））、ＣＨＯ－Ｋ１ ＤＵＸ Ｂ１１（Ｓｉｍｏｎｓｅｎ ａｎｄ Ｌｅｖｉｎｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２４９５－２４９９（１９８３）；Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ、前出）、及びＤＰ－１２ ＣＨＯ細胞（１９８９年３月１５日に公開されたＥＰ３０７，２４７、または米国特許第５，７２１，１２１号）が挙げられる。
適切な哺乳動物細胞株の他の例としては、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶＩ株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ（商標）ＣＲＬ１６５１）；ヒト胎児腎臓株２９３Ｓ（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏ．，３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ（商標）ＣＣＬ １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶＩ－７６、ＡＴＣＣ（商標）ＣＣＬ ７０）；アフリカングリーンモンキー腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ（商標）ＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ（商標）ＣＣＬ ２）；イヌの腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ（商標）ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ（商標）ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ（商標）ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２．ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣＶ ＣＣＬ ５１）；ラット肝癌細胞（ＨＴＣ、ＭＩ．５４、Ｂａｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，８５：１（１９８０））、３Ｔ３細胞；２９３Ｔ細胞（Ｐｅａｒ，Ｗ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０：８３９２－８３９６（１９９３））；ＮＳ０細胞（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，２４：１２２３（１９８８））；ＳＰ２／０（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６５：１７６１（１９８７））；及びＴＲ－１細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４（１９８２））、及びハイブリドーマ細胞株が挙げられる。
多くの宿主細胞型は、コードされた組換えポリペプチドを生産することができるが、ある宿主細胞で生産された特定の核酸によってコードされた産物は、別の宿主細胞でその核酸によってコードされた産物とは異なる場合がある。違いは、１つ以上の生化学的特性にある可能性がある。生化学的特性の例としては、一次、二次、または三次構造などの基本的なタンパク質構造、またはシグナルペプチドプロセシング、グリコシル化、Ｎ末端アセチル化、脂質化、またはリン酸化などの翻訳後修飾が挙げられる。特定の違いは、細胞の酵素機構、及び／または培地または増殖条件に依存する可能性がある。組換え治療用抗体の場合、生化学的特性の変化は、結合能力、抗体エフェクター機能、免疫原性、クリアランス、溶解性、または保存安定性などの１つ以上の抗体の特徴に影響を与える可能性がある。
いくつかの実施形態では、参照産物との違いを有する産物は、精製、例えば、下流プロセス技術によって低減または排除され得る。他の実施形態では、参照産物との違いを有する産物は、細胞の酵素機構、例えば、上流プロセス技術を制御することによって低減または排除することができる。いくつかの実施形態では、細胞の酵素機構を制御することは、その遺伝的背景を組換え的に改変するための細胞の変異、例えば、酵素を変異またはその発現を改変することを含む。いくつかの実施形態では、細胞の酵素機構を制御することは、特定の培養培地を提供することまたは１つ以上の補充成分を添加することなど、培養培地中の成分を制御することを含む。いくつかの実施形態では、細胞の酵素機構を制御することは、温度、ｐＨ、または大気ガスなどの増殖条件の維持または調整を含む。
ベドリズマブなどの抗α４β７抗体を製造する方法は記載されている（例えば、米国特許第７，４０２，４１０号及び米国特許出願公開２００７０１２２４０４を参照されたい）。これらの刊行物では、抗体の特定の特性、例えば、結合親和性、エフェクター機能、及び電荷プロファイル、分子量、及びグリコシル化パターンなどの生化学的特性が記載されていた。抗体はＮＳ０細胞で培養すると特定の特性を示し、ＣＨＯ細胞で培養すると変化した。組換えタンパク質、例えば抗体の特性もまた、ＣＨＯ細胞の異なるバリアントに変更するとき、例えば、ＤＨＦＲ－細胞からＧＳ－細胞に変更するときに変化し得る。本明細書に記載されるのは、例えば、組換えタンパク質、例えば、抗体の生産におけるこれらの変動を制御し、ＧＳ－ＣＨＯ細胞（本明細書では単に「ＧＳ－ＣＨＯ」細胞とも呼ばれる）において抗体、例えば、ベドリズマブを発現するときの特性の変化を制限または最小化する方法及び培地組成物である。特定の実施形態では、本明細書に記載されるのは、ＧＳ－ＣＨＯ細胞において抗α４β７抗体、例えばベドリズマブを生産するための方法及び組成物である。
細胞培養物でベドリズマブなどの抗α４β７抗体を生産するときに変化する可能性のある特性の例としては、その電荷プロファイル、グリコシル化プロファイル、及び高分子量（ＨＭＷ）不純物種が挙げられる。温度、ｐＨ、せん断応力、溶存酸素、培地組成などの培養条件が、特性の変化に寄与する可能性がある。酵素の電荷は、Ｃ末端のリジン、Ｎ末端のピログルタミン酸、またはシアル酸の存在もしくは非存在の変動、及び／または脱アミド化または酸化の変動により変化する可能性がある。グリコシル化プロファイルは、シアル酸または末端ガラクトースの存在または非存在、高マンノース種の処理などの変動により変化する可能性がある（Ｈｏｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １９：９３６－９４９を参照されたい）。培地補充成分はそのような変化を制御し得る。
いくつかの実施形態では、電荷変動、グリカン変動、及び凝集体含有量を含むがこれらに限定されない、細胞培養において生産される抗α４β７抗体の特性は、培地、例えば、生産段階培地中の糖（例えば、ガラクトース）、金属補因子（例えば、マンガン）、及び／またはヌクレオシド（例えば、ウリジン）の量を調節することによって制御し得る。いくつかの実施形態では、電荷変動、グリカン変動、及び凝集体含有量を含むがこれらに限定されない、細胞培養において生産される抗α４β７抗体の特性は、培地、例えば、生産段階培地中のリジン及びアルギニンの量を調節することによって制御し得る。いくつかの実施形態では、電荷変動、グリカン変動、及び凝集体含有量を含むがこれらに限定されない、細胞培養において生産される抗α４β７抗体の特性は、培地、例えば、生産段階培地中で使用される亜鉛の量を調節することによって制御し得る。さらに、生産中に温度シフトを使用することができる。温度シフトが抗体生産に有益であることが証明される可能性があることは当該技術分野で知られているが（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：４７－５４），本明細書で提供されるのは、細胞培養温度を維持することに基づく方法、すなわち、培養条件が実質的なシフトを含まない、例えば、摂氏３７度より上または下で１度を超えるシフトを含まない方法である。
Ａ．亜鉛の補充
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、亜鉛を生産段階中に補充されたＣＨＯ細胞培養において、ヒト化抗α４β７抗体、例えば、ベドリズマブまたはその抗原結合部分を生産するための方法及び組成物である。いくつかの実施形態では、亜鉛は、ＣＨＯ細胞培養物における抗α４β７抗体の電荷変動を制御するための培地補充成分として使用される。他の実施形態では、亜鉛は、ＣＨＯ細胞培養物で生産される抗α４β７抗体の調製において高分子量（ＨＭＷ）凝集体のレベルを制御するための培地補充成分として使用される。金属イオンは、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、臭化物塩、酢酸塩、ステアリン酸塩、クエン酸塩、リン酸塩の形態であり得る。培地補充成分は、バッチの開始時、拡大段階中、または生産段階で、供給と一緒に濃縮された形で培養物に提供され得る。培地補充成分は、濃縮補充成分でもある供給溶液に濃縮形態で提供することができる。そのような実施形態では、補充成分は、補充成分調製の各段階ごとに１回を超えて希釈され得る。
いくつかの実施形態では、金属イオン、例えば、亜鉛は、生産段階の培養物に添加され得る。ベドリズマブなどの抗α４β７抗体の生産のための亜鉛の存在は、抗体の塩基性アイソフォームのレベルを低下（亜鉛の添加を除いて同じプロセスである対照プロセスと比較して低下）させ得る。いくつかの実施形態では、亜鉛は、生産段階の培養物に１回を超えて添加され得る。一実施形態では、亜鉛は、生産段階培養の開始生産培地への補充成分として添加される。一実施形態では、亜鉛は、例えば、生産段階培養物に、開始日後に生産培養物に直接または供給溶液中で添加される。一実施形態では、亜鉛は、開始生産培地への補充成分及び開始日後の生産培地への補充成分で添加され、例えば、亜鉛は、生産段階培養物に添加される供給溶液に添加される。いくつかの実施形態では、亜鉛は、生産段階の培養の開始日後に補充成分で複数回添加される。例えば、亜鉛は補充成分で毎日、２日ごと、３日ごと、４日ごと、１～３日ごと、２～４日ごと、または毎週追加される。いくつかの実施形態では、生産段階培養の開始日後に複数回添加される亜鉛は、生産段階培養の第１、第２、第３、第４、第５、または第６日に添加されないが、その後、毎日または２日ごとに添加される。一実施形態では、亜鉛は、出発培地への補充成分及び生産段階培地への毎日の補充成分で添加される。別の実施形態では、亜鉛は、開始培地への補充成分として、及び生産段階培養の４日目から生産段階培地への毎日の補充成分として添加される。亜鉛は、回収の１日前、回収の２日前、または回収の３日前まで補充することができる。一実施形態では、亜鉛は、開始培地への補充成分として、及び生産段階培養の４日目から回収の１日前まで生産段階培地への毎日の補充成分として添加される。
特定の実施形態では、亜鉛は、（ＣＥＸによって決定されるとき）約１６％以下のヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームを有する組成物の生産方法であって、ヒト化抗体、例えばベドリズマブが、亜鉛を含む生産培地中で哺乳動物宿主細胞、例えばＧＳ－ＣＨＯ細胞で生産される、方法に含まれる。特定の実施形態では、生産培地に亜鉛を含む補充成分供給を添加することは、約１４％以下のヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームを含む組成物を提供する。特定の実施形態では、生産培地のための補充成分に亜鉛を含むことは、約１３％以下のヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームを含む組成物を提供する。特定の実施形態では、生産培地のための補充成分に亜鉛を含むことは、約１２％以下のヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームを含む組成物を提供する。特定の実施形態では、生産培地のための補充成分に亜鉛を含むことは、約１１％以下のヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、塩基性アイソフォームのレベルは、細胞培養の１４日目、すなわち、細胞培養物の接種の１４日後に測定することができる。他の実施形態では、塩基性アイソフォームのレベルは、細胞培養の１５日目に測定することができる。
特定の実施形態では、亜鉛は、（ＣＥＸによって決定されるとき）約７０％以上のヒト化抗α４β７抗体の主要アイソフォームを有する組成物の生産方法であって、ヒト化抗体、例えばベドリズマブが、亜鉛を含む生産培地中で哺乳動物宿主細胞、例えばＧＳ－ＣＨＯ細胞で生産される、方法に含まれる。特定の実施形態では、生産培地に亜鉛を含む補充成分供給を添加することは、約７１％以上のヒト化抗α４β７抗体の主要アイソフォームを含む組成物を提供する。特定の実施形態では、生産培地に亜鉛を含む補充成分供給を添加することは、約７２％以上のヒト化抗α４β７抗体の主要アイソフォームを含む組成物を提供する。特定の実施形態では、生産培地に亜鉛を含む補充成分供給を添加することは、約７３％以上のヒト化抗α４β７抗体の主要アイソフォームを含む組成物を提供する。特定の実施形態では、生産培地に亜鉛を含む補充成分供給を添加することは、約７４％以上のヒト化抗α４β７抗体の主要アイソフォームを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、主要アイソフォームのレベルは、細胞培養の１４日目に測定することができる。他の実施形態では、主要アイソフォームのレベルは、細胞培養の１５日目に測定することができる。
他の実施形態では、亜鉛補充を使用して、抗α４β７抗体を含む調製物中のＨＭＷ混入汚染のレベルを制限することができる。いくつかの実施形態では、約１０～２００μＭ、約５０～１５０μＭ、または約１００～１３０μＭの濃度で培養培地に亜鉛を添加することにより、ＨＭＷ凝集体のレベルのレベルを（ＳＥＣによって決定されるとき）、＜５％、＜４％、＜３％、＜２．５％、＜２％、＜１．５％、または＜１％に低下させることができる。
亜鉛は、生産培地に直接添加することも、生産培地への供給補充成分に添加することもできる。
亜鉛イオンは、培地、例えば生産段階培地に補充することができる最終濃度は、１０～２００μＭ、１０～１００μＭ、１５～９０μＭ、２０～８０μＭ、１０～８０μＭ、１０～７０μＭ、約１４～５５μＭ、約１０～６０μＭ、約１０～３０μＭ、約１０～２０μＭ、約１４μＭ、約５０μＭ、約５５μＭ、約５７μＭ、または約１５μＭである。上述のように、亜鉛イオンは複数回添加することができる。一実施形態では、亜鉛は生産段階培養物の生産培地に添加され、結果として、生産培地は、約２～６０μＭ、５～５７μＭ、５～５０μＭ、５～４０μＭ、８～３０μＭ、１０～２０μＭ、１２～１５μＭ、または約１４μＭの濃度の亜鉛を有する。一実施形態では、生産培地中の亜鉛の累積濃度は、回収時までの補充によって説明される、約１５．５μＭであり、各補充成分は、培地に約１～約４μＭの亜鉛を添加する。一実施形態では、亜鉛は、生産培地が約５０～１５０μＭ、７５～１５０μＭ、１００～１５０μＭ、８０～１３０μＭ、または１００～１３０μＭの亜鉛濃度を有するように、生産段階培養物の生産培地に添加される。いくつかの実施形態では、亜鉛は、生産培地が約１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、１１０μＭ、１２０μＭ、１３０μＭ、１４０μＭ、１５０μＭ、１６０μＭ、１７０μＭ、１８０μＭ、１９０μＭ、または２００μＭの亜鉛濃度を有するように、生産段階培養物の生産培地に添加される。場合によっては、開始培養で亜鉛が多すぎると、細胞の生存率が低下し、及び／または抗体の力価を下げる場合がある。
いくつかの実施形態では、亜鉛は、培養培地（例えば、生産段階培養培地）に１０～１６日、例えば、１０～１７日、１０～１５日、または１２～１４日の期間に添加される。いくつかの実施形態では、亜鉛補充成分は、例えば、供給溶液の一部として、細胞培養物に漸進的に添加され得る。例えば、亜鉛は、０日目、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、または１４日目に培地に添加することができる。いくつかの実施形態では、亜鉛は、毎日または１日おきで添加することができる。いくつかの実施形態では、亜鉛の毎日または１日おきでの添加は、細胞が生産段階に達したときに開始することができる。したがって、いくつかの実施形態では、亜鉛は、細胞培養の４日目、５日目、または６日目から、毎日または１日おきで生産培地に添加することができる。一実施形態では、亜鉛は、約４日目～約１０日目まで毎日添加することができる。一実施形態では、亜鉛は、約４日目～約１４日目まで毎日添加することができる。一実施形態では、亜鉛は、約１０～８０μＭの濃度で、または約５０～１５０μＭの濃度で供給から生産培地を補充するために、生産段階の開始日後に補足として添加される。一実施形態では、亜鉛は、生産培地が、約５０～１５０μＭ、２～６０μＭ、５～５７μＭ、５～５０μＭ、５～４０μＭ、８～３０μＭ、１０～２０μＭ、１２～１５μＭ、または約１４μＭの亜鉛濃度を有するように生産段階培養物の開始培地を補充するために添加され、また、開始日後に生産培地を補うために、（例えば、培養の２日目～１０日目、２日目～８日目、２日目～６日目、３日目～６日目の日から、または４日目から）生産段階培養物への各添加ごとに０．１～１０μＭ、０．５～５μＭ、０．７５～４μＭ、０．９～３μＭ、１．０～２．７μＭ、または約１．４μＭまたは１．９μＭずつ、複数回添加される。別の実施形態では、亜鉛は、生産培地が約２～５０μＭ、５～４０μＭ、８～３０μＭ、１０～２０μＭ、１２～１５μＭまたは約１４μＭの亜鉛濃度を有するように生産培養の開始培地を補うために添加され、及び、生産段階の培養の４日目から生産段階の培地に、生産段階培養物への各添加ごとに０．１～１０μＭ、０．５～５μＭ、０．７５～４μＭ、０．９～３μＭ、１．０～２．７μＭ、または約１．４μＭ、または１．９μＭずつ補充するように、毎日添加される。いくつかの実施形態では、生産培地が約１０～２０μＭ（例えば、１５～１７μＭ）の総亜鉛濃度を有するように亜鉛が生産培地に添加されるように、供給溶液が生産培地に添加される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の亜鉛補充成分は、ＣＨＯ細胞培養培地、例えば、国際特許公開ＷＯ９８／０８９３４Ａ１に提供される培養培地に添加され、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の亜鉛補充成分は、ＣＤ－ＣＨＯ培地に添加される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の亜鉛補充成分は、ＣＤ－ＣＨＯ ＡＧＴ（カタログ番号１２４９０－００１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ））に添加される。
一実施形態では、亜鉛は、供給溶液が約９０～１２０μＭ、約９５～１２０μＭ、約１００～１２０μＭ、約１０５～１２０μＭ、約１１０～１２０μＭ、または約１１７μＭの濃度を有するように供給溶液を補充するように添加される。次いで、このような供給補充成分を生産培地に添加することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、抗α４β７抗体またはその抗原結合部分を発現する宿主細胞（または宿主細胞の集団）、及び亜鉛を含むかまたは補充される生産培地を含む細胞培養物である。他の実施形態では、本明細書で提供されるのは、亜鉛を含むかまたは補充された生産培地中で、抗α４β７抗体またはその抗原結合部分を発現する宿主細胞を培養することによって得られる細胞培養物である。
前述の細胞培養物は、本明細書に記載の実施形態のいずれかを組み込むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、例えば、ＧＳ－ＣＨＯ細胞、またはＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、配列番号１の重鎖可変領域と、配列番号５の軽鎖可変領域を含む抗体またはその抗原結合部分を発現する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、配列番号２に記載のＣＤＲ１ドメイン、配列番号３に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号４に記載のＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号６に記載のＣＤＲ１ドメイン、配列番号７に記載のＣＤＲ２ドメイン、配列番号８に記載のＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変域を含む、抗体またはその抗原結合部分を発現する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ベドリズマブ、またはその抗原結合部分を発現する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、配列番号９に記載の核酸（抗α４β７抗体の軽鎖可変領域をコードする）と、配列番号１０に記載の核酸（抗α４β７抗体の重鎖可変領域をコードする）とを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、配列番号１１に記載の核酸（ベドリズマブの軽鎖をコードする）と、配列番号１２に記載の核酸（ベドリズマブの重鎖をコード化する）と、を含む。
いくつかの実施形態では、細胞培養物は、約１０～１００μＭ、１０～１００μＭ、約１５～９０μＭ、約２０～８０μＭ、約１０～８０μＭ、約１０～７０μＭ、約１４～５５μＭ、約１０～６０μＭ、約１０～３０μＭ、約１０～２０μＭ、約１４μＭ、約５０μＭ、約５５μＭ、約５７μＭ、または約１５μＭの濃度で亜鉛を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、約２～６０μＭ、５～５７μＭ、５～５０μＭ、５～４０μＭ、８～３０μＭ、１０～２０μＭ、１２～１５μＭ、または約１４μＭの濃度で亜鉛を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、約５～４５μＭ、５０～１５０μＭ、７５～１５０μＭ、１００～１５０μＭ、８０～１３０μＭ、または１００～１２０μＭの亜鉛の濃度で亜鉛を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、約１～１０μＭ、１０～３０μＭ、３０～５０μＭ、５０～７０μＭまたは７０～９０μＭの濃度で亜鉛を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、約１～３０μＭ、１０～４０μＭ、２０～５０μＭ、３０～６０μＭ、４０～７０μＭ、または６０～９０μＭの濃度で亜鉛を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、約１～５０μＭ、２０～６０μＭ、３０～７０μＭ、４０～８０μＭまたは５０～１００μＭの濃度で亜鉛を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、約１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、１１０μＭ、１２０μＭ、１３０μＭ、１４０μＭ、１５０μＭ、１６０μＭ、１７０μＭ、１８０μＭ、１９０μＭ、または２００μＭの濃度で亜鉛を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、抗α４β７抗体またはその抗原結合部分を発現するＧＳ－ＣＨＯ宿主細胞を、５０～１５０μＭ、１００～１２０μＭ、または１００～１２０μＭの濃度で亜鉛を含むまたは亜鉛を補充する生産培地中で培養することによって得ることのできる細胞培養物である。いくつかの実施形態では、抗体は、ベドリズマブ、またはその抗原結合部分である。
いくつかの実施形態では、細胞培養物の細胞は、亜鉛を欠く培地、または亜鉛を補充しない培地を含む同等の細胞培養物と比較して、（ＣＥＸによって決定されるとき）塩基性アイソフォームの減少したレベルを有する抗α４β７抗体、またはその抗原結合部分を発現する。いくつかの実施形態では、発現した抗体は、約１６％以下の塩基性アイソフォームを含む。いくつかの実施形態では、発現した抗体は、約１５％以下の塩基性アイソフォームを含む。いくつかの実施形態では、発現した抗体は、約１４％以下の塩基性アイソフォームを含む。いくつかの実施形態では、発現した抗体は、約１３％以下の塩基性アイソフォームを含む。いくつかの実施形態では、発現した抗体は、約１２％以下の塩基性アイソフォームを含む。いくつかの実施形態では、発現した抗体は、約１１％以下の塩基性アイソフォームを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、モノクローナル抗体の生産方法であって、（ｉ）抗α４β７抗体またはその抗原結合部分を発現する宿主細胞、及び、亜鉛を含むか補充した生産培地を含む本明細書に提供される細胞培養物を、宿主細胞が抗α４β７抗体またはその抗原結合部分を発現するのに十分な期間培養することと、（ｉｉ）細胞培養物から抗α４β７抗体またはその抗原結合部分を回収することと、を含む、方法である。いくつかの実施形態では、細胞培養物から回収された抗α４β７抗体、またはその抗原結合部分の集団は、亜鉛を欠く培地または亜鉛を補充しない培地を含む同等の細胞培養物から回収された、抗α４β７抗体またはその抗原結合部分の集団と比較して、（ＣＥＸによって決定されるとき）減少したレベルの塩基性アイソフォーム及び／または増加したレベルの主要アイソフォームを含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物から回収された抗α４β７抗体、またはその抗原結合部分の集団は、亜鉛を欠く培地または亜鉛を補充しない培地を含む同等の細胞培養物から回収された、抗α４β７抗体またはその抗原結合部分の集団と比較して、（ＳＥＣによって決定されるとき）減少したレベルの凝集体及び／または増加したレベルの単量体を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、５～２０日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、１０～１６日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、１３～１５日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日間培養される。さらに提供されるのは、本明細書で提供される前述の方法によって得られる、またはそれによって得ることのできる抗α４β７抗体である。
本明細書に記載の各実施形態では、細胞培養培地は、いくつかの実施形態では、糖、ヌクレオシド、及び／または金属補因子でさらに補充することができる。例えば、細胞培養培地は、ウリジン、マンガン、及び亜鉛でさらに補充することができる。追加的または代替的に、細胞培養培地はさらにリジン及び／またはアルギニンで補充することができる。
Ｂ．糖、ヌクレオシド、及び／または金属補因子での補充
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、糖、ヌクレオシド、及び／または金属補因子を生産段階中に補充されたＣＨＯ細胞培養において、ヒト化抗α４β７抗体、例えば、ベドリズマブまたはその抗原結合部分を生産するための方法及び組成物である。
いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞培養において抗α４β７抗体のグリコシル化プロファイルを制御するための培地補充成分は、糖を含む。例えば、補充成分中の糖は、グルコース、フコース、またはガラクトースであり得る。
いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞培養において抗α４β７抗体のグリコシル化プロファイルを制御するための培地補充成分は、ヌクレオシドを含む。例えば、補充成分中のヌクレオシドは、アデノシン、ウリジン、シチジン、グアノシン、チミジン、及び／またはイノシンであり得る。
いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞培養において抗α４β７抗体のグリコシル化プロファイルを制御するための培地補充成分は、金属補因子を含む。例えば、補充成分中の金属補因子は、マグネシウム、マンガン、鉄、または銅であり得る。
いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞培養において抗α４β７抗体のグリコシル化プロファイルを制御するための培地補充成分は、糖とヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞培養において抗α４β７抗体のグリコシル化プロファイルを制御するための培地補充成分は、糖と金属補因子を含む。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞培養において抗α４β７抗体のグリコシル化プロファイルを制御するための培地補充成分は、糖、ヌクレオシド、及び金属補因子を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、ガラクトース、ウリジン、及びマンガンを生産段階中に補充されたＣＨＯ細胞培養において、ヒト化抗α４β７抗体、例えば、ベドリズマブまたはその抗原結合部分を生産するための方法及び組成物である。いくつかの実施形態では、補充された成分は、同じ培地補充成分に存在する。いくつかの実施形態では、補充された成分は、異なる培地補充成分に存在する。いくつかの実施形態では、異なる培地補充成分は、細胞培養物に添加する前に組み合わされる。いくつかの実施形態では、抗α４β７抗体のグリコシル化プロファイルを制御するための補充された成分は、複数回添加される。例えば、それらは、生産段階培養の開始日後に添加されてもよく、または生産段階培養の第１、第２、第３、第４、第５、または第６日に添加されないが、その後、毎日または２日ごとに添加される。一実施形態では、グリコシル化プロファイルを制御するための成分は、毎日の補充成分で生産段階培地に添加される。別の実施形態では、グリコシル化プロファイルを制御するための成分は、生産段階の培養の４日目から生産段階培地に毎日の補充成分で添加される。
いくつかの実施形態では、グリコシル化を制御するための培地補充成分が、拡大段階中に抗α４β７抗体を生産するためにＣＨＯ細胞培養物に提供される。他の実施形態では、それは生産段階に追加される。いくつかの実施形態では、グリコシル化を制御するための培地補充成分は、培地中の最終濃度の２０～４００倍、２５～３００倍、３０～２５０倍、４０～１２０倍、約５０倍、約６０倍、約１００倍、または約２００倍の濃縮物で提供される。いくつかの実施形態では、培地を補充する量は、細胞による消費を無視し、これは、補充された成分のいくつかを他の化学形態に代謝する可能性がある。
一実施形態では、マンガンなどの金属補因子成分が、亜鉛などの金属イオンを含む培地補充成分で細胞培養物に提供される。いくつかの実施形態では、金属補因子、例えばマンガンの濃縮物は、培地中のその最終濃度の１０，０００～５０，０００倍、培地中のその最終濃度の２０，０００～４０，０００倍、または培地中のその最終濃度の約３０，０００倍であってよい。
いくつかの実施形態では、マンガンは、０．１～１００μＭ、０．５～５０μＭ、１．０～２５μＭ、２．０～１５μＭ、３～１０μＭ、１～５０μＭ、１～１００μＭ、２０～５０μＭ、３０～６０μＭ、４０～７０μＭ、５０～８０μＭ、７０～１００μＭ、２０～７０μＭ、３０～８０μＭ、４０～９０μＭ、または５０～１００μＭの濃度で、例えば生産段階培地である、培地中に存在してもよく、または培地を補充するために添加してもよい。一実施形態では、生産段階培地中のマンガンの濃度は約５．１５μＭである。したがって、生産段階培地は、スケジュールに従って補充され、約５．１５μＭのマンガンの平均濃度を達成することができる。いくつかの実施形態では、マンガンは、約１μＭ、約５μＭ、約１０μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、約６０μＭ、約７０μＭ、約８０μＭ、約９０μＭ、または約１００μＭの濃度で、例えば生産段階培地である、培地中に存在し得るか、または培地を補充するために添加してもよい。
一実施形態では、マンガンは、各添加ごとに０．１～１０μＭ、０．２～１．５μＭ、０．２～５μＭ、０．２５～２μＭ、０．３～１．２μＭ、０．３μＭ～０．８μＭ、または約０．５μＭ、または０．５６μＭずつ、生産段階培地を補充するために、開始日後に補充成分として複数回添加される。一実施形態では、マンガンは、各添加ごとに約０．２～１．５μＭずつ、生産期培地を補充するために、開始日後に補充成分として複数回添加される。一実施形態では、マンガンは、各添加ごとに約０．３１～１．２μＭずつ、生産期培地を補充するために、開始日後に補充成分として生産培地に複数回添加される。いくつかの実施形態では、マンガン補充成分は、生産段階培養の４日目から、毎日または２日ごとに添加される。いくつかの実施形態では、補充成分は回収日に添加されない。
一実施形態では、マンガンは、供給培地中のマンガンの濃度が０．０２ｍＭ～０．２ｍＭ、０．０３ｍＭ～０．１５ｍＭ、０．０３ｍＭ～０．１０ｍＭ、０．０３ｍＭ～０．０５ｍＭ、０．０３ｍＭ～０．０４ｍＭ、約０．０３ｍＭ、約０．０４ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．０６ｍＭ、約０．０７ｍＭ、約０．０８ｍＭ、約０．１ｍＭ、または約０．１４ｍＭの最終濃度になるように、供給培地に補充成分として添加される。一実施形態では、マンガンは、供給培地中のマンガンの濃度が、０．１～１００μＭの最終濃度となるように供給培地に補充成分として添加される。一実施形態では、マンガンは、供給培地中のマンガンの濃度が、３９μＭの最終濃度となるように供給培地に補充成分として添加される。一実施形態では、マンガンを補充した供給培地を、生産段階培養の開始日後（例えば、生産段階培養の２日目～１０日目、２日目～８日目、２日目～６日目、３日目～６日目、または４日目から）、生産培地に添加する（例えば、複数回、例えば、毎日、または２日ごと）。一実施形態では、マンガンが補充された供給培地は、生産段階培養の４日目から生産培地に添加される。
ウリジンは、１を超える理由で追加される場合がある。細胞の増殖をサポートするために、他のヌクレオシドと一緒に栄養補充成分に添加することができる。ウリジンは、抗α４β７抗体のグリコシル化プロファイルを制御するための補充成分として添加することもできる。いくつかの実施形態では、ウリジンは、約０．１～２０ｍＭ、約０．９～３．０ｍＭ、約１～２０ｍＭ、約０．５～１２ｍＭ、約１～８ｍＭ、約１．５～４ｍＭ、約０．１～１．５ｍＭ、約１～５ｍＭ、約１～７ｍＭ、約１～６ｍＭ、約１～５ｍＭ、約１～４ｍＭ、約２～４ｍＭ、約２～５ｍＭ、約２～３ｍＭ、約１ｍＭ～１０ｍＭ、約１０ｍＭ～１５ｍＭ、約１０ｍＭ～２０ｍＭ、約１０ｍＭ～３０ｍＭ、約１ｍＭ～４０ｍＭ、約１ｍＭ～５０ｍＭ、または約１０ｍＭ～３０ｍＭの濃度で、例えば生産期培地である、培地中に存在し得るか、または培地を補充うするために添加され得る。いくつかの実施形態では、ウリジンは、約０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、約２ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２．０ｍＭ、約２．７ｍＭ、約２．５ｍＭ、約２．７ｍＭ、約２．８ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１１ｍＭ、約１２ｍＭ、約１３ｍＭ、約１４ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、または約２０ｍＭの濃度で、例えば生産期培地である、培地中に存在し得るか、または培地を補充するために添加され得る。いくつかの実施形態では、生産培地に記載された量は、基本培地または補充成分で提供された量を説明し、消費、代謝された量、または細胞によって生産された量を考慮しない。いくつかの実施形態では、生産培地に記載されている量は、回収日までのすべての添加の合計としての累積量である。一実施形態では、ウリジンは、生産段階培地を０．１～２０ｍＭ、０．５～１２ｍＭ、１～８ｍＭ、１．５～５ｍＭ、１．６～４．８ｍＭまたは約２．４ｍＭ補充することができる。
一実施形態では、ウリジンは、各添加ごとに２５～１０００μＭ、７５～７５０μＭ、５５～６２０μＭ、１００～６００μＭ、１５０～４５０μＭ、１００～６００μＭ、１７０～６３０μＭまたは約２５０、または約３００μＭずつ、生産段階培地を補充するために、開始日後に補充成分として複数回添加される。いくつかの実施形態では、これらのウリジンの補充成分は、生産期培養の４日目から、毎日または２日毎に添加され、さらに、ウリジンの補充成分は回収日に追加されなくてもよい。一実施形態では、ヌクレオシド、例えば、ウリジンを含有する補充成分は、培地中の最終濃度の１０～５００倍、培地中の最終濃度の２０～４００倍、２５～３００倍、４０～２５０倍、約５０倍、約６０倍、約１００倍、または約２００倍である。
一実施形態では、ウリジンは、供給培地中のウリジンの濃度が約１～４０ｍＭ、１５～２５ｍＭ、１５～１００ｍＭ、２０～９０ｍＭ、１５～７０ｍＭ、１５～５０ｍＭ、１５～３０ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約１９．３ｍＭ、約２０ｍＭ、約３３ｍＭ、約５０ｍＭ、または約６６ｍＭの最終濃度になるように、供給培地への補充成分として添加される。一実施形態では、ウリジンを補充した供給培地は、生産段階培養の開始日後（例えば、生産段階培養の２日目～１０日目、２日目～８日目、２日目～６日目、３日目～６日目、または４日目から）に、生産培地に添加される（例えば、複数回、例えば、毎日または２日ごと）。特定の実施形態では、ウリジンを補充した供給培地は、生産段階培養の４日目から生産培地に添加される。
一実施形態では、糖、例えば、ガラクトースを含有する補充成分は、抗α４β７抗体のグリコシル化プロファイルを制御するための培地中の最終濃度の１０～５００倍、培地中の最終濃度の２０～４００倍、２５～３００倍、３０～２５０倍、４０～１２０倍、約５０倍、約６０倍、約１００倍、または約２００倍である。いくつかの実施形態では、ガラクトースは、０．１～１００ｍＭ、１～７５ｍＭ、２．５～５０ｍＭ、３～２０ｍＭ、５～３５ｍＭ、約８～２５ｍＭ、０．１～１０ｍＭ、０．１～２０ｍＭ、０．１～３０ｍＭ、１～１０ｍＭ、１～２０ｍＭ、１～３０ｍＭ、１～４０ｍＭ、１～５０ｍＭ、１～６０ｍＭ、１～７０ｍＭ、１～８０ｍＭ、１～９０ｍＭ、１～１００ｍＭ、２０～４０ｍＭ、４０～６０ｍＭ、６０～８０ｍＭ、８０～１００ｍＭ、２０～５０ｍＭ、３０～６０ｍＭ、４０～７０ｍＭ、５０～８０ｍＭ、７０～１００ｍＭ、２０～７０ｍＭ、３０～８０ｍＭ、４０～９０ｍＭ、５０～１００ｍＭ、または５０～１５０ｍＭの濃度で、例えば生産段階培地である、培地中に存在し得るか、または培地を補充するために添加され得る。いくつかの実施形態では、ガラクトースは、約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０μＭ、約１２．５ｍＭ、約１２ｍＭ、約１２．８ｍＭ、約１３ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、または約１００ｍＭの濃度で、例えば生産段階培地である、培地に存在し得るか、または培地を補充するために添加され得る。一実施形態では、ガラクトースは、各添加ごとに、約０．１～１０ｍＭ、０．２～７．５ｍＭ、０．５～５ｍＭ、０．４～２．８ｍＭ、０．５～３．５ｍＭ、０．７～２．９ｍＭ、０．７５～２．５ｍＭ、または約１．２ｍＭもしくは１．４ｍＭずつ、生産段階培地を補充するために、開始日後に補充成分として複数回添加される。いくつかの実施形態では、これらのガラクトースの補充成分は、生産期培養の４日目から、毎日または２日毎に添加され、さらに、回収日に追加されなくてもよい。
一実施形態では、ガラクトースは、供給培地中のガラクトースの濃度が５０～１５０ｍＭ、８５ｍＭ～５００ｍＭ、９０ｍＭ～４００ｍＭ、９０ｍＭ～３００ｍＭ、９０ｍＭ～２００ｍＭ、９０ｍＭ～１００ｍＭ、約９５ｍＭ、約９６ｍＭ、約９７、約１００ｍＭ、約１６５ｍＭ、約２５０ｍＭ、または約３３０ｍＭの最終濃度になるように、供給培地への補充成分として添加される。一実施形態では、ガラクトースを補充した供給培地は、生産段階培養の開始日後（例えば、生産段階培養の２日目～１０日目、２日目～８日目、２日目～６日目、３日目～６日目、または４日目から）に、生産培地に添加される（例えば、複数回、例えば、毎日または２日ごと）。特定の実施形態では、ガラクトースを補充した供給培地は、生産段階培養の４日目から生産培地に添加される。
いくつかの実施形態では、抗α４β７抗体のグリコシル化プロファイルを制御するため、生産段階培地はウリジン、マンガン、及びガラクトース（ＵＭＧ）が補充される。いくつかの実施形態では、ＵＭＧ補充成分は、例えば、供給溶液の一部として、細胞培養物に漸進的に添加され得る。例えば、ＵＭＧ補充成分を含む供給溶液は、毎日または２日ごとに添加できる。
いくつかの実施形態では、補充成分は、０．１～０．７ｍＭのウリジン、０．２～１．５μＭのマンガン、及び０．５～３．５ｍＭのガラクトースを生産段階培地に提供する。いくつかの実施形態では、ＵＭＧは、０日目、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、または１４日目に培地に添加することができる。いくつかの実施形態では、ＵＭＧは、毎日または１日おきで添加することができる。いくつかの実施形態では、ＵＭＧの毎日または１日おきでの添加は、細胞が生産段階に達したときに開始することができる。したがって、いくつかの実施形態では、ＵＭＧは、細胞培養の４日目、５日目、または６日目から、毎日または１日おきで生産培地に添加することができる。一実施形態では、ＵＭＧは、約４日目～約１０日目まで毎日添加することができる。一実施形態では、ＵＭＧは、約４日目～約１４日目まで毎日添加することができる。いくつかの実施形態では、生産段階培地は、１．０～２５μＭ、２．０～１５μＭ、３～１０μＭ、または５μＭ、例えば約０．２～１．５μＭ、または０．３～１．２μＭの１日平均添加量でのマンガンと；１～８ｍＭ、１．５～５ｍＭ、１．６～４．８ｍＭ、または約２．４ｍＭ、または２．７ｍＭ、例えば、約１００～７００μＭの１日平均添加量でのウリジンと；０．５～３．５ｍＭ、０．７～２．９ｍＭ、２．５～５０ｍＭ、５～３５ｍＭ、約８～２５ｍＭ、または約１２ｍＭまたは１２．６ｍＭ、例えば、約０．５～３．５ｍＭの１日平均添加量でのガラクトースで補充される。特定の実施形態では、平均的な毎日の添加は、生産段階培養の４日目に開始する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＵＭＧ補充成分は、ＣＨＯ細胞培養培地、例えば、国際特許公開ＷＯ９８／０８９３４Ａ１に提供される培養培地に添加され、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＵＭＧ補充成分は、ＣＤ－ＣＨＯ培地に添加される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＵＭＧ補充成分は、ＣＤ－ＣＨＯ ＡＧＴ（カタログ番号１２４９０－００１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ））に添加される。
一実施形態では、ＵＭＧは、補充から回収までに添加されるＵＭＧの累積濃度が約１～７ｍＭのウリジン、約２～１５μＭのマンガン、及び約３～２０ｍＭのガラクトースであるように生産培地に添加される。いくつかの実施形態では、補充から回収まで生産培地に添加される亜鉛の累積濃度は、約５～４５μＭである。
一実施形態では、ウリジンは、マンガン、及びガラクトース（ＵＭＧ）は、供給培地中のウリジンの濃度が、１～４０ｍＭ、１５～１００ｍＭ、１５～９０ｍＭ、１５～７０ｍＭ、１５～５０ｍＭ、１５～３０ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約３３ｍＭ、約５０ｍＭ、または約６６ｍＭの最終濃度のウリジンであり；供給培地中のマンガンの濃度が、約０．０００１～０．１ｍＭ、０．０２ｍＭ～０．２ｍＭ、０．０３ｍＭ～０．１５ｍＭ、０．０３ｍＭ～０．１０ｍＭ、０．０３ｍＭ～０．０５ｍＭ、０．０３ｍＭ～０．０４ｍＭ、約０．０３ｍＭ、約０．０４ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．０６ｍＭ、約０．０７ｍＭ、約０．０８ｍＭ、約０．１ｍＭ、または約０．１４ｍＭの最終濃度のマンガンであり；供給培地中のガラクトースの濃度が、８５ｍＭ～５００ｍＭ、９０ｍＭ～４００ｍＭ、９０ｍＭ～３００ｍＭ、９０ｍＭ～２００ｍＭ、５０ｍＭ～１５０ｍＭ、９０ｍＭ～１００ｍＭ、約９５ｍＭ、約９６ｍＭ、約９７ｍＭ、約１００ｍＭ、約１６５ｍＭ、約２５０ｍＭ、または約３３０ｍＭの最終濃度のガラクトースであるように、供給培地に補充成分として添加される。一実施形態では、ウリジン、マンガン、及びガラクトースを補充した供給培地は、生産段階培養の開始日後（例えば、生産段階培養の２日目～１０日目、２日目～８日目、２日目～６日目、３日目～６日目、または４日目から）に、生産培地に添加される（例えば、複数回、例えば、毎日または２日ごと）。特定の実施形態では、ウリジン、マンガン、及びガラクトースを補充した供給培地は、生産段階培養の４日目から、例えば毎日、生産培地に添加される。
特定の実施形態では、ウリジン、マンガン、及びガラクトース（ＵＭＧ）を含む複合補充成分は、抗α４β７抗体、例えばベドリズマブを含む組成物であって減少したレベルの塩基性抗体アイソフォームを有する組成物を生産するために、生産培地（またはその後生産培地に添加される供給溶液）に添加される。一実施形態では、塩基性アイソフォームのレベルは、（ＣＥＸによって決定されるとき）約１６％以下である。一実施形態では、塩基性アイソフォームのレベルは、（ＣＥＸによって決定されるとき）約１５％以下である。一実施形態では、塩基性アイソフォームのレベルは、（ＣＥＸによって決定されるとき）約１４％以下である。一実施形態では、塩基性アイソフォームのレベルは、（ＣＥＸによって決定されるとき）約１３％以下である。一実施形態では、塩基性アイソフォームのレベルは、（ＣＥＸによって決定されるとき）約１２％以下である。
生産培地へのＵＭＧの添加も、哺乳動物細胞によって生産される、ベドリズマブなどの抗α４β７抗体の組成物中の酸性種及び／または主要種のレベルに影響を及ぼし得る。
生産培地へのＵＭＧの添加も、哺乳動物細胞によって生産される、ベドリズマブなどの抗α４β７抗体の組成物中のＧ０Ｆ、Ｇ１Ｆ及び／またはＧ２Ｆ糖型のレベルに影響を及ぼし得る。ベドリズマブなどの抗α４β７抗体の集団に存在する可能性のあるＮ－グリカンの構造の描写は図９に提供される。
特定の実施形態では、ウリジン、マンガン、及びガラクトース（ＵＭＧ）を含む複合補充成分は、抗α４β７抗体、例えばベドリズマブを含む組成物であって減少したレベルのＧ０Ｆ糖型を有する組成物を生産するために、生産培地（またはその後生産培地に添加される供給溶液）に添加される。一実施形態では、Ｇ０Ｆ糖型のレベルは、（親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）によって決定されるとき）約７０％以下である。一実施形態では、Ｇ０Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約６９％以下である。一実施形態では、Ｇ０Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約６８％以下である。一実施形態では、Ｇ０Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約６７％以下である。一実施形態では、Ｇ０Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約６６％以下である。一実施形態では、Ｇ０Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約６５％以下である。一実施形態では、Ｇ０Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約６４％以下である。一実施形態では、Ｇ０Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約６３％以下である。一実施形態では、Ｇ０Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約６２％以下である。一実施形態では、Ｇ０Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約６１％以下である。一実施形態では、Ｇ０Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約６０％以下である。一実施形態では、Ｇ０Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約５９％以下である。一実施形態では、Ｇ０Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約５８％以下である。一実施形態では、Ｇ０Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約５７％以下である。一実施形態では、Ｇ０Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約５６％以下である。一実施形態では、Ｇ０Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約５５％以下である。一実施形態では、Ｇ０Ｆ糖型のレベルは、約４０～７５％である。一実施形態では、Ｇ０Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約４５～６５％である。一実施形態では、Ｇ０Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約５０～６０％である。
特定の実施形態では、ウリジン、マンガン、及びガラクトース（ＵＭＧ）を含む複合補充成分は、抗α４β７抗体、例えばベドリズマブを含む組成物であって、補充成分の非存在下で培養された抗α４β７を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して減少したレベルのＧ０Ｆ糖型を有する組成物を生産するために、生産培地（またはその後生産培地に添加される供給溶液）に添加される。一実施形態では、この組成物は、補充成分の非存在下で培養されたヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、ヒト化抗α４β７抗体のＧ０Ｆ糖型の少なくとも約２０～４０％（例えば、２０～４０％、２０～３０％、２０～２５％）の減少を含む。一実施形態では、この組成物は、補充成分の非存在下で培養されたヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、ヒト化抗α４β７抗体のＧ０Ｆ糖型の少なくとも約２０％の減少を含む。一実施形態では、この組成物は、補充成分の非存在下で培養されたヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、ヒト化抗α４β７抗体のＧ０Ｆ糖型の少なくとも約２５％の減少を含む。比較対照は、異なると指定されたパラメーター以外の実質的に同様の条件下で、例えば、補充成分の非存在下で実施される。
特定の実施形態では、ウリジン、マンガン、及びガラクトース（ＵＭＧ）を含む複合補充成分は、抗α４β７抗体、例えばベドリズマブを含む組成物であって増加したレベルのＧ１Ｆ糖型を有する組成物を生産するために、生産培地（またはその後生産培地に添加される供給溶液）に添加される。一実施形態では、Ｇ１Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約２０％以上である。一実施形態では、Ｇ１Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約２１％以上である。一実施形態では、Ｇ１Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約２２％以上である。一実施形態では、Ｇ１Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約２３％以上である。一実施形態では、Ｇ１Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約２４％以上である。一実施形態では、Ｇ１Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約２５％以上である。一実施形態では、Ｇ１Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約２６％以上である。一実施形態では、Ｇ１Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約２７％以上である。一実施形態では、Ｇ１Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約２８％以上である。一実施形態では、Ｇ１Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約２９％以上である。一実施形態では、Ｇ１Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約３０％以上である。一実施形態では、Ｇ１Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約３１％以上である。一実施形態では、Ｇ１Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約３２％以上である。一実施形態では、Ｇ１Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約３３％以上である。一実施形態では、Ｇ１Ｆ糖型のレベルは、約２０～４５％である。一実施形態では、Ｇ１Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約２５～４５％である。一実施形態では、Ｇ１Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約３０～４０％である。
特定の実施形態では、ウリジン、マンガン、及びガラクトース（ＵＭＧ）を含む複合補充成分は、抗α４β７抗体、例えばベドリズマブを含む組成物であって、補充成分の非存在下で培養された抗α４β７を発現する哺乳動物宿主細胞を含む対照細胞培養物と比較して、増加した量のＧ１Ｆ糖型を有する組成物を生産するために、生産培地（またはその後生産培地に添加される供給溶液）に添加される。一実施形態では、この組成物は、補充成分の非存在下で培養されたヒト化抗α４β７抗体を発現する哺乳動物宿主細胞を含む対照細胞培養物と比較して、ヒト化抗α４β７抗体のＧ１Ｆ糖型の少なくとも約２倍～３．５倍（例えば、２～３．５倍、２～３．３倍、２～３倍）の増加を含む。一実施形態では、この組成物は、補充成分の非存在下で培養されたヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞を含む細胞培養物と比較して、ヒト化抗α４β７抗体のＧ１Ｆ型の少なくとも約２倍の増加を含む。一実施形態では、この組成物は、補充成分の非存在下で培養されたヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞を含む細胞培養物と比較して、ヒト化抗α４β７抗体のＧ１Ｆ糖型の少なくとも約３倍の増加を含む。対照細胞培養物は、特定のパラメーター、例えば補充成分を除いて、実質的に同じ条件下で培養される。
特定の実施形態では、ウリジン、マンガン、及びガラクトース（ＵＭＧ）を含む複合補充成分は、抗α４β７抗体、例えばベドリズマブを含む組成物であって増加したレベルのＧ２Ｆ糖型を有する組成物を生産するために、生産培地（またはその後生産培地に添加される供給溶液）に添加される。一実施形態では、Ｇ２Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約２％以上である。一実施形態では、Ｇ２Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約２．５％以上である。一実施形態では、Ｇ２Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約３％以上である。一実施形態では、Ｇ２Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約３．５％以上である。一実施形態では、Ｇ２Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約４％以上である。一実施形態では、Ｇ２Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約４．５％以上である。一実施形態では、Ｇ２Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約５％以上である。一実施形態では、Ｇ２Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約５．５％以上である。一実施形態では、Ｇ２Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約６％以上である。一実施形態では、Ｇ２Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約６．５％以上である。一実施形態では、Ｇ２Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約７％以上である。一実施形態では、Ｇ２Ｆ糖型のレベルは１０％以下である。一実施形態では、Ｇ２Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約２～４％である。一実施形態では、Ｇ２Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約３～５％である。一実施形態では、Ｇ２Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約２～７％である。
特定の実施形態では、ウリジン、マンガン、及びガラクトース（ＵＭＧ）を含む複合補充成分は、抗α４β７抗体、例えばベドリズマブを含む組成物であって増加したレベルのＧ２Ｆ糖型を有する組成物を生産するために、生産培地（またはその後生産培地に添加される供給溶液）に添加される。一実施形態では、Ｇ２Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約２％以上である。一実施形態では、Ｇ２Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約３％以上である。一実施形態では、Ｇ２Ｆ糖型のレベルは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約４％以上である。
特定の実施形態では、ウリジン、マンガン、及びガラクトース（ＵＭＧ）を含む複合補充成分は、抗α４β７抗体、例えばベドリズマブを含む組成物であって、補充成分の非存在下で培養された抗α４β７を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して増加したレベルのＧ２Ｆ糖型を有する組成物を生産するために、生産培地（またはその後生産培地に添加される供給溶液）に添加される。一実施形態では、この組成物は、補充成分の非存在下で培養されたヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞を含む細胞培養物と比較して、ヒト化抗α４β７抗体のＧ２Ｆ糖型の少なくとも約２倍～５倍（例えば、２～５倍、２～４倍、３～４倍）の増加を含む。一実施形態では、この組成物は、補充成分の非存在下で培養されたヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞を含む細胞培養物と比較して、ヒト化抗α４β７抗体のＧ２Ｆ糖型の少なくとも約３倍の増加を含む。一実施形態では、この組成物は、補充成分の非存在下で培養されたヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞を含む細胞培養物と比較して、ヒト化抗α４β７抗体のＧ２Ｆ糖型の少なくとも約４倍の増加を含む。対照細胞培養物は、特定のパラメーター、例えば補充成分を除いて、実質的に同じ条件下で培養される。
特定の実施形態では、ウリジン、マンガン、及びガラクトース（ＵＭＧ）を含む複合補充成分は、抗α４β７抗体、例えばベドリズマブを含む組成物であって、補充成分の非存在下で培養された抗α４β７を発現する哺乳動物宿主細胞を含む対照細胞培養物と比較して、増加した量のＧ１Ｆ糖型及びＧ２Ｆ糖型を有する組成物を生産するために、生産培地（またはその後生産培地に添加される供給溶液）に添加される。一実施形態では、この組成物は、補充成分の非存在下で培養されたヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞を含む細胞培養物と比較して、ヒト化抗α４β７抗体のＧ１Ｆ糖型の少なくとも約２倍～５倍（例えば、２～５倍、２～４倍、３～４倍）の増加、及びＧ２Ｆ糖型の少なくとも約２倍～５倍（例えば、２～５倍、２～４倍、３～４倍）の増加を含む。一実施形態では、この組成物は、補充成分の非存在下で培養されたヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞を含む細胞培養物と比較して、ヒト化抗α４β７抗体のＧ１Ｆ糖型及びＧ２Ｆ糖型の少なくとも約３倍の増加を含む。一実施形態では、この組成物は、補充成分の非存在下で培養されたヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞を含む細胞培養物と比較して、ヒト化抗α４β７抗体のＧ１Ｆ型の少なくとも約２倍の増加オ及びＧ２Ｆ型の少なくとも約４倍の増加を含む。対照細胞培養物は、特定のパラメーター、例えば補充成分を除いて、実質的に同じ条件下で培養される。
特定の実施形態では、ウリジン、マンガン、及びガラクトース（ＵＭＧ）を含む複合補充成分は、組成物が、８８％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、または９５％以上の総アシアロ、アガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ０Ｆ）、アシアロ、モノガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ１Ｆ）、及び／またはアシアロ、ジガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ２Ｆ）の、グリコシル化バリアントを有する、抗α４β７抗体を含む組成物を生産するために、生産培地（またはその後生産培地に添加される供給溶液）に添加される。一実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、９１～９６％、９２～９５％、９１～９２％、９１～９２．５％、９１～９３％、または９１～９５％の総アシアロ、アガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ０Ｆ）、アシアロ、モノガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ１Ｆ）、及び／またはアシアロ、ジガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ２Ｆ）の、グリコシル化バリアントを有する、ヒト化抗α４β７抗体の集団を生産することができる。一実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、９２～９８％、９２～９７％、９２～９６％、９２～９５％の総アシアロ、アガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ０Ｆ）、アシアロ、モノガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ１Ｆ）、及び／またはアシアロ、ジガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ２Ｆ）の、グリコシル化バリアントを有する、ヒト化抗α４β７抗体の集団を生産することができる。
培地補充成分は、水、基本培地、またはアスコルビン酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、（４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ヒスチジン、グルタミン酸塩、酢酸塩、コハク酸塩、グルコン酸塩、ヒスチジン、リン酸塩、マレイン酸塩、カコジル酸塩、２－［Ｎ－モルホリノオ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス［ヒドロキシメチル］メタン（Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ）、Ｎ－［２－アセトアミド］－２－イミノ２酢酸（ＡＤＡ）、グリシルグリシン、及びその他の有機酸または両性イオン緩衝液などの緩衝液中で提供され得る。いくつかの実施形態では、培地補充成分は、５．５～７．０、６．０～７．５、または５．９～６．１のｐＨを有する。他の実施形態では、培地補充成分は、１．５～５．５、１．８～３．０、３．２～４．５、または１．９～２．１のｐＨを有する。他の実施形態では、培地補充成分は、７．５～９．０のｐＨを有する。
いくつかの実施形態では、亜鉛及びＵＭＧは、生産段階培養の４日目から毎日添加される供給溶液を補充するために使用される。
特定の実施形態では、金属、例えば、亜鉛またはマンガンを含有する補充成分は、クエン酸塩または酢酸塩緩衝液などの低ｐＨの緩衝液である。クエン酸塩はまた、金属イオンをキレート化して金属イオン補充成分の毒性を制限するように機能し得る。一実施形態では、金属含有補充成分は、亜鉛及びマンガン、例えば、１００～１４０ｍＭまたは１１５～１２５ｍＭのクエン酸緩衝液中の亜鉛及びマンガンを含む。一実施形態では、補充成分を含む金属用の緩衝液は、１１８～１２２ｍＭのクエン酸、ｐＨ１．９～２．１を含む。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、抗α４β７抗体またはその抗原結合部分を発現するＧＳ－ＣＨＯ宿主細胞を、１１５～１２５ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ１．９～２．１中の、５０～１５０μＭの亜鉛及び１０～５０ｍＭのマンガンの溶液を補充した生産培地中で培養することによって得られる細胞培養物である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、抗α４β７抗体またはその抗原結合部分を発現するＧＳ－ＣＨＯ宿主細胞を、１１５～１２５ｍＭクエン酸緩衝液供給補充成分、ｐＨ１．９～２．１中に亜鉛及びマンガンを添加したことによる、１０～１００μＭの亜鉛及び０．１～１００μＭのマンガンの濃度を補充した生産培地中で培養することによって得られる細胞培養物である。いくつかの実施形態では、クエン酸塩緩衝金属補充成分は、例えば、生産培養の４日目から毎日、供給補充成分に添加される。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、抗α４β７抗体またはその抗原結合部分を発現する宿主細胞（または宿主細胞の集団）、及び金属イオン、ヌクレオシド、糖、及び／または金属補因子を含むかまたは補充される生産培地を含む細胞培養物である。他の実施形態では、本明細書で提供されるのは、金属イオン、ヌクレオシド、糖、及び／または金属補因子を含むかまたは補充された生産培地中で、抗α４β７抗体またはその抗原結合部分を発現する宿主細胞を培養することによって得られる細胞培養物である。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、抗α４β７抗体またはその抗原結合部分を発現する宿主細胞（または宿主細胞の集団）、及び糖、ヌクレオシド、及び／または金属補因子を含むまたは補充される生産培地を含む細胞培養物である。他の実施形態では、本明細書で提供されるのは、糖、ヌクレオシド、及び／または金属補因子を含むかまたは補充された生産培地中で、抗α４β７抗体またはその抗原結合部分を発現する宿主細胞を培養することによって得られる細胞培養物である。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、抗α４β７抗体またはその抗原結合部分を発現する宿主細胞（または宿主細胞の集団）、及びウリジン、マンガン、及びガラクトース（ＵＭＧ）を含むかまたは補充される生産培地を含む細胞培養物である。他の実施形態では、本明細書で提供されるのは、ウリジン、マンガン、及びガラクトース（ＵＭＧ）を含むかまたは補充された生産培地中で、抗α４β７抗体またはその抗原結合部分を発現する宿主細胞を培養することによって得られる細胞培養物である。
前述の細胞培養物は、本明細書に記載の実施形態のいずれかを組み込むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、例えば、ＧＳ－ＣＨＯ細胞、またはＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、配列番号１の重鎖可変領域と、配列番号５の軽鎖可変領域と、を含む抗体またはその抗原結合断片を発現する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、配列番号２に記載のＣＤＲ１ドメイン、配列番号３に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号４に記載のＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号６に記載のＣＤＲ１ドメイン、配列番号７に記載のＣＤＲ２ドメイン、配列番号８に記載のＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変域を含む、抗体またはその抗原結合部分を発現する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ベドリズマブ、またはその抗原結合部分を発現する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、配列番号９に記載の核酸（抗α４β７抗体の軽鎖可変領域をコードする）と、配列番号１０に記載の核酸（抗α４β７抗体の軽鎖可変領域をコードする）とを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、配列番号１１に記載の核酸（ベドリズマブの軽鎖をコードする）と、配列番号１２に記載の核酸（ベドリズマブの重鎖をコード化する）と、を含む。
いくつかの実施形態では、細胞培養物は、０．１～２０ｍＭの濃度でウリジンを含む。例えば、いくつかの実施形態では、細胞培養物は、０．１～２０ｍＭ、１～２０ｍＭ、０．５～１２ｍＭ、１～８ｍＭ、１．５～４ｍＭ、０．１～１．５ｍＭ、０．１～５ｍＭ、５ｍＭ～１０ｍＭ、１０ｍＭ～１５ｍＭ、１５ｍＭ～２０ｍＭ、０．１ｍＭ～１０ｍＭ、１０ｍＭ～２０ｍＭ、１～７ｍＭ、７～１４ｍＭ、または１４～２０ｍＭを含む。他の実施形態では、細胞培養物は、１０～５０ｍＭ、２０～６０ｍＭ、３０～７０ｍＭ、４０～８０ｍＭ、５０～９０ｍＭ、６０～１００ｍＭ、または０．１～１００ｍＭの濃度でウリジンを含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約１６ｍＭ、約１７ｍＭ、約１８ｍＭ、約１９ｍＭ、約２０ｍＭ、約２１ｍＭ、約２２ｍＭ、約２５ｍＭ、約２７ｍＭ、約３０ｍＭ、約３３ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６６ｍＭ、または約７０ｍＭの濃度でウリジンを含む。
いくつかの実施形態では、細胞培養物は、０．１～１００μの濃度でマンガンを含む。例えば、いくつかの実施形態では、細胞培養物は、０．１～１００μＭ、０．５～５０μＭ、１．０～２５μＭ、２．０～１５μＭ、３～１０μＭ、０．１～１０μＭ、０．１～２０μＭ、０．１～３０μＭ、１～１０μＭ、１～２０μＭ、１～３０μＭ、１～４０μＭ、１～５０μＭ、１～６０μＭ、１～７０μＭ、１～８０μＭ、１～９０μＭ、１～１００μＭ、２０～４０μＭ、４０～６０μＭ、６０～８０μ、８０～１００μＭ、２０～５０μＭ、３０～６０μＭ、４０～７０μＭ、５０～８０μＭ、７０～１００μＭ、２０～７０μＭ、３０～８０μＭ、４０～９０μＭ、または５０～１００μＭの濃度でマンガンを含む。他の実施形態では、細胞培養物は、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約５μＭ、約１０μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、約６０μＭ、約７０μＭ、約８０μＭ、約９０μＭ、または約１００μＭの濃度でマンガンを含む。
いくつかの実施形態では、細胞培養物は、約０．１～１００ｍＭの濃度でガラクトースを含む。例えば、いくつかの実施形態では、細胞培養物は、１～７５ｍＭ、２．５～５０ｍＭ、５～３５ｍＭ、約８～２５ｍＭ、０．１～１０ｍＭ、０．１～２０ｍＭ、０．１～３０ｍＭ、１～１０ｍＭ、１～２０ｍＭ、１～３０ｍＭ、１～４０ｍＭ、１～５０ｍＭ、１～６０ｍＭ、１～７０ｍＭ、１～８０ｍＭ、１～９０ｍＭ、１～１００ｍＭ、２０～４０ｍＭ、４０～６０ｍＭ、６０～８０ｍＭ、８０～１００ｍＭ、２０～５０ｍＭ、３０～６０ｍＭ、４０～７０ｍＭ、５０～８０ｍＭ、７０～１００ｍＭ、２０～７０ｍＭ、３０～８０ｍＭ、４０～９０ｍＭ、または５０～１００ｍＭの濃度でガラクトースを含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、約０．１ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０μＭ、約１２．５ｍＭ、約１２ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、または約１００ｍＭの濃度でガラクトースを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、ウリジン、マンガン、及びガラクトース（ＵＭＧ）を含むかまたは補充される生産培地中で、抗α４β７抗体またはその抗原結合部分を発現する宿主細胞（または宿主細胞の集団）を培養することによって得ることのできる細胞培養物である。例えば、いくつかの実施形態では、細胞培養物は、０．１～２０ｍＭのウリジン（及びその中の範囲）、０．１～１００μＭのマンガン（及びその中の範囲）、ならびに０．１～１００ｍＭのガラクトース（及びその中の範囲）を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、本明細書に記載されるように、亜鉛をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、本明細書に記載されるように、リジン及び／またはアルギニンをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、亜鉛、リジン、及びアルギニンをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、抗α４β７抗体またはその抗原結合部分（例えば、ベドリズマブ）を発現する宿主細胞（または宿主細胞の集団）、及び生産培地を含む細胞培養物であり、生産培地には、約１～約７ｍＭのウリジン、約２～約１５μＭのマンガン、約３～約２０ｍＭのガラクトース、及び／または約０．００５～０．０４５μＭの亜鉛の累積濃度が、例えば、生産段階の間に、例えば４日目から回収までに添加される。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、ウリジン、マンガン、ガラクトース、及び亜鉛を含むかまたは補充される生産培地中で、抗α４β７抗体またはその抗原結合部分を発現する宿主細胞（または宿主細胞の集団）を培養することによって得ることのできる細胞培養物である。例えば、いくつかの実施形態では、細胞培養物は、０．１～２０ｍＭのウリジン（及びその中の範囲）、０．１～１００μＭのマンガン（及びその中の範囲）、０．１～１００ｍＭのガラクトース（及びその中の範囲）、ならびに１０～１００μＭの亜鉛（及びその中の範囲）を含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、ウリジン、マンガン、ガラクトース、亜鉛、リジン、及び／またはアルギニンを含むかまたは補充される生産培地中で抗α４β７抗体またはその抗原結合部分を発現する宿主細胞（または宿主細胞の集団）を培養することによって得ることのできる細胞培養物である。例えば、いくつかの実施形態では、細胞培養物は、０．１～２０ｍＭのウリジン（及びその中の範囲）、０．１～１００μＭのマンガン（及びその中の範囲）、０．１～１００ｍＭのガラクトース（及びその中の範囲）、１０～１００μＭの亜鉛（及びその中の範囲）、５．０～８．８ｇ／Ｌのリジン（及びその中の範囲）、及び／または３．０～１２．０ｇ／Ｌのアルギニン（及びその中の範囲）を含み得る。
いくつかの実施形態では、細胞培養物の細胞は、ウリジン、マンガン、及びガラクトースを欠く培地、またはウリジン、マンガン、及びガラクトースを補充しない培地を含む同等の細胞培養物と比較して、（ＣＥＸによって決定されるとき）塩基性アイソフォームの減少したレベルを有する抗α４β７抗体、またはその抗原結合部分を発現する。いくつかの実施形態では、発現した抗体は、（ＣＥＸによって決定されるとき）約１６％以下の塩基性アイソフォームを含む。いくつかの実施形態では、発現した抗体は、（ＣＥＸによって決定されるとき）約１５％以下の塩基性アイソフォームを含む。いくつかの実施形態では、発現した抗体は、（ＣＥＸによって決定されるとき）約１４％以下の塩基性アイソフォームを含む。いくつかの実施形態では、発現した抗体は、（ＣＥＸによって決定されるとき）約１３％以下の塩基性アイソフォームを含む。いくつかの実施形態では、発現した抗体は、（ＣＥＸによって決定されるとき）約１２％以下の塩基性アイソフォームを含む。いくつかの実施形態では、発現した抗体は、（ＣＥＸによって決定されるとき）約１１％以下の塩基性アイソフォームを含む。
いくつかの実施形態では、細胞培養物の細胞は、ウリジン、マンガン、及びガラクトースを欠く培地、またはウリジン、マンガン、及びガラクトースを補充しない培地を含む同等の細胞培養物と比較して、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）Ｇ０Ｆ糖型の減少したレベルを有する抗α４β７抗体、またはその抗原結合部分を発現する。いくつかの実施形態では、細胞培養物の細胞は、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）７０％以下、６５％以下、６０％以下、または５５％以下のＧ０Ｆ含有量を有する抗α４β７抗体を発現する。いくつかの実施形態では、細胞培養物の細胞は、（ＨＩＬＩＣによる決定されるとき）８５％以下、８０％以下、７５％以下、７０％以下、６９％以下、６８％以下、６７％以下、６６％以下、６５％以下、６４％以下、６３％以下、６２％以下、６１％以下、６０％以下、５９％以下、５８％以下、５７％以下、５６％以下、または５５％以下のＧ０Ｆ含有量を有する抗α４β７抗体を発現する。いくつかの実施形態では、細胞培養物の細胞は、４５～６５％のＧ０Ｆ含有量を有する抗α４β７抗体を発現する。いくつかの実施形態では、細胞培養物の細胞は、５０～６０％のＧ０Ｆ含有量を有する抗α４β７抗体を発現する。いくつかの実施形態では、細胞培養物の細胞は、４５～８５％のＧ０Ｆ含有量を有する抗α４β７抗体を発現する。いくつかの実施形態では、細胞培養物の細胞は、４５～８２％のＧ０Ｆ含有量を有する抗α４β７抗体を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のウリジン、マンガン、及び／またはガラクトースを含むかまたは補充された培地を含む細胞培養物によって生産された抗α４β７抗体のＧ０Ｆ含有量は、ウリジン、マンガン、及び／またはガラクトースを欠く培地、またはウリジン、マンガン、及び／またはガラクトースを補充されない培地を含む同等の細胞培養物によって生産された抗α４β７抗体のＧ０Ｆ含有量と比較して、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、または少なくとも４０％、減少している。
いくつかの実施形態では、細胞培養物の細胞は、ウリジン、マンガン、及びガラクトースを欠く培地、またはウリジン、マンガン、及びガラクトースを補充しない培地を含む同等の細胞培養物と比較して、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）Ｇ１Ｆ糖型の増加したレベルを有する抗α４β７抗体、またはその抗原結合部分を発現する。いくつかの実施形態では、細胞培養物の細胞は、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）１０％以上、１５％以上、２０％以上、２１％以上、２２％以上、２３％以上、２４％以上、２５％以上、２６％以上、２７％以上、２８％以上、２９％以上、３０％以上、３１％以上、３２％以上、または３３％以上のＧ１Ｆ含有量を有する抗α４β７抗体を発現する。いくつかの実施形態では、細胞培養物の細胞は、２５～４５％のＧ１Ｆ含有量を有する抗α４β７抗体を発現する。いくつかの実施形態では、細胞培養物の細胞は、３０～４０％のＧ１Ｆ含有量を有する抗α４β７抗体を発現する。いくつかの実施形態では、細胞培養物の細胞は、１０～４５％のＧ１Ｆ含有量を有する抗α４β７抗体を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のウリジン、マンガン、及び／またはガラクトースを含むかまたは補充された細胞培養物によって生産される抗α４β７抗体のＧ１Ｆ含有量は、ウリジン、マンガン、及び／またはガラクトースを欠く培地、またはウリジン、マンガン、及び／またはガラクトースを補充されていない培地を含む同等の細胞培養物によって生産される抗α４β７抗体のＧ１Ｆ含有量と比較して、少なくとも２倍、少なくとも２．２５倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．７５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．２５倍、または少なくとも３．５倍、増加する。
いくつかの実施形態では、細胞培養物の細胞は、ウリジン、マンガン、及びガラクトースを欠く培地、またはウリジン、マンガン、及びガラクトースを補充しない培地を含む同等の細胞培養物と比較して、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）Ｇ２Ｆ糖型の増加したレベルを有する抗α４β７抗体、またはその抗原結合部分を発現する。いくつかの実施形態では、細胞培養物の細胞は、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）０．５％以上、１％以上、１．５％以上、２％以上、２．５％以上、３％以上、３．５％以上、４％以上、４．５％以上、５％以上、５．５％以上、６％以上、６．５％以上、７％以上、または８％以上のＧ２Ｆ含有量を有する抗α４β７抗体を発現する。いくつかの実施形態では、細胞培養物の細胞は、２～４％のＧ２Ｆ含有量を有する抗α４β７抗体を発現する。いくつかの実施形態では、細胞培養物の細胞は、３～５％のＧ２Ｆ含有量を有する抗α４β７抗体を発現する。いくつかの実施形態では、細胞培養物の細胞は、２～７％のＧ２Ｆ含有量を有する抗α４β７抗体を発現する。いくつかの実施形態では、細胞培養物の細胞は、０．５～７．５％のＧ２Ｆ含有量を有する抗α４β７抗体を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のウリジン、マンガン、及び／またはガラクトースを含むかまたは補充された細胞培養物によって生産される抗α４β７抗体のＧ２Ｆ含有量は、ウリジン、マンガン、及び／またはガラクトースを欠く培地、またはウリジン、マンガン、及び／またはガラクトースを補充されていない培地を含む同等の細胞培養物によって生産される抗α４β７抗体のＧ１Ｆ含有量と比較して、少なくとも２倍、少なくとも２．２５倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．７５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．２５倍、少なくとも３．５倍、少なくとも３，７５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．２５倍、少なくとも４．５倍、少なくとも４．７５倍、または少なくとも５倍、増加する。
本明細書で提供される細胞培養物は、いくつかの実施形態では、集団が、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）８８％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、または９５％以上の総アシアロ、アガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ０Ｆ）、アシアロ、モノガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ１Ｆ）、及び／またはアシアロ、ジガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ２Ｆ）の、グリコシル化バリアントを有する、ヒト化抗α４β７抗体の集団を生産することができる。一実施形態では、細胞培養物は、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）９１～９６％、９２～９５％、９１～９２％、９１～９２．５％、９１～９３％、または９１～９５％の総アシアロ、アガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ０Ｆ）、アシアロ、モノガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ１Ｆ）、及び／またはアシアロ、ジガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ２Ｆ）の、グリコシル化バリアントを有する、ヒト化抗α４β７抗体の集団を生産することができる。一実施形態では、細胞培養物は、９２～９８％、９２～９７％、９２～９６％、９２～９５％の総アシアロ、アガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ０Ｆ）、アシアロ、モノガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ１Ｆ）、及び／またはアシアロ、ジガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ２Ｆ）の、グリコシル化バリアントを有する、ヒト化抗α４β７抗体の集団を生産することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるのは、モノクローナル抗体の生産方法であって、（ｉ）抗α４β７抗体またはその抗原結合部分を発現する宿主細胞、及び、ウリジン、マンガン、及び／またはガラクトースを含むか補充した生産培地を含む細胞培養物を、宿主細胞が抗α４β７抗体またはその抗原結合部分を発現するのに十分な期間培養することと、（ｉｉ）細胞培養物から抗α４β７抗体またはその抗原結合部分を回収することと、を含む、方法である。いくつかの実施形態では、細胞培養物から回収された抗α４β７抗体、またはその抗原結合部分の集団は、ウリジン、マンガン、及び／またはガラクトースを欠く培地またはウリジン、マンガン、及び／またはガラクトースを補充しない培地を含む同等の細胞培養物から回収された、抗α４β７抗体またはその抗原結合部分の集団と比較して、（ＣＥＸによって決定されるとき）減少したレベルの塩基性アイソフォームを含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物から回収された抗α４β７抗体、またはその抗原結合部分の集団は、ウリジン、マンガン、及び／またはガラクトースを欠く培地またはウリジン、マンガン、及び／またはガラクトースを補充しない培地を含む同等の細胞培養物から回収された、抗α４β７抗体またはその抗原結合部分の集団と比較して、減少したレベルのＧ０Ｆを含む。いくつかの実施形態では、生産培地は、亜鉛をさらに含むかまたはさらに補充される。いくつかの実施形態では、生産培地は、リジン及び／またはアルギニンをさらに含むかまたはさらに補充される。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、５～２０日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、１０～１６日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、１３～１５日間培養される。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日間培養される。さらに提供されるのは、本明細書で提供される前述の方法によって得られる、またはそれによって得ることのできる抗α４β７抗体である。
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、８８％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、または９５％以上の総アシアロ、アガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ０Ｆ）、アシアロ、モノガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ１Ｆ）、及び／またはアシアロ、ジガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ２Ｆ）の、グリコシル化バリアントを有する、ベドリズマブを含む組成物である。一実施形態では、本明細書で提供されるのは、９１～９６％、９２～９５％、９１～９２％、９１～９２．５％、９１～９３％、または９１～９５％の総アシアロ、アガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ０Ｆ）、アシアロ、モノガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ１Ｆ）、及び／またはアシアロ、ジガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ２Ｆ）の、グリコシル化バリアントを有する、ベドリズマブを含む組成物である。いくつかの実施形態では、前述の組成物は、ウリジン、マンガン、及びガラクトースを補充した生産培地中でベドリズマブを組換え発現するＧＳ－ＣＨＯ細胞を培養することによって得ることができる。いくつかの実施形態では、前述の組成物は、ウリジン、マンガン、ガラクトース、及び亜鉛を補充した生産培地中でベドリズマブを組換え発現するＧＳ－ＣＨＯ細胞を培養することによって得ることができる。いくつかの実施形態では、前述の組成物は、ウリジン、マンガン、ガラクトース、亜鉛、アルギニン、及び／またはリジンを補充した生産培地中でベドリズマブを組換え発現するＧＳ－ＣＨＯ細胞を培養することによって得ることができる。
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）８５％以下、８０％以下、７５％以下、７０％以下、６９％以下、６８％以下、６７％以下、６６％、６５％以下、６４％以下、６３％以下、６２％以下、６１％以下、６０％以下、５９％以下、５８％以下、５７％以下、５６％以下、または５５％以下のアシアロ、アガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ０Ｆ）を有するベドリズマブを含む組成物である。一実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）４５～６５％、または５０～６０％のアシアロ、アガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ０Ｆ）を有するベドリズマブを含む組成物である。いくつかの実施形態では、前述の組成物は、ウリジン、マンガン、及びガラクトースを補充した生産培地中でベドリズマブを組換え発現するＧＳ－ＣＨＯ細胞を培養することによって得ることができる。いくつかの実施形態では、前述の組成物は、ウリジン、マンガン、ガラクトース、及び亜鉛を補充した生産培地中でベドリズマブを組換え発現するＧＳ－ＣＨＯ細胞を培養することによって得ることができる。いくつかの実施形態では、前述の組成物は、ウリジン、マンガン、ガラクトース、亜鉛、アルギニン、及び／またはリジンを補充した生産培地中でベドリズマブを組換え発現するＧＳ－ＣＨＯ細胞を培養することによって得ることができる。
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）１０％以上、１５％以上、２０％以上、２１％以上、２２％以上、２３％以上、２４％以上、２５％以上、２６％以上、２７％以上、２８％以上、２９％以上、３０％以上、３１％以上、３２％以上、または３３％以上のアシアロ、モノガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ１Ｆ）を有するベドリズマブを含む組成物である。一実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）２５～４５％、または３０～４０％のアシアロ、モノガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ１Ｆ）を有するベドリズマブを含む組成物である。いくつかの実施形態では、前述の組成物は、ウリジン、マンガン、及びガラクトースを補充した生産培地中でベドリズマブを組換え発現するＧＳ－ＣＨＯ細胞を培養することによって得ることができる。いくつかの実施形態では、前述の組成物は、ウリジン、マンガン、ガラクトース、及び亜鉛を補充した生産培地中でベドリズマブを組換え発現するＧＳ－ＣＨＯ細胞を培養することによって得ることができる。いくつかの実施形態では、前述の組成物は、ウリジン、マンガン、ガラクトース、亜鉛、アルギニン、及び／またはリジンを補充した生産培地中でベドリズマブを組換え発現するＧＳ－ＣＨＯ細胞を培養することによって得ることができる。
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）０．５％以上、１％以上、１．５％以上、２％以上、２．５％以上、３％以上、３．５％以上、４％以上、４．５％以上、５％以上、５．５％以上、６％以上、６．５％以上、７％以上、または８％以上のアシアロ、ジガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ２Ｆ）を有するベドリズマブを含む組成物である。一実施形態では、本明細書で提供されるのは、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）２～４％、３～５％、または２～７％のアシアロ、ジガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ２Ｆ）を有するベドリズマブを含む組成物である。いくつかの実施形態では、前述の組成物は、ウリジン、マンガン、及びガラクトースを補充した生産培地中でベドリズマブを組換え発現するＧＳ－ＣＨＯ細胞を培養することによって得ることができる。いくつかの実施形態では、前述の組成物は、ウリジン、マンガン、ガラクトース、及び亜鉛を補充した生産培地中でベドリズマブを組換え発現するＧＳ－ＣＨＯ細胞を培養することによって得ることができる。いくつかの実施形態では、前述の組成物は、ウリジン、マンガン、ガラクトース、亜鉛、アルギニン、及び／またはリジンを補充した生産培地中でベドリズマブを組換え発現するＧＳ－ＣＨＯ細胞を培養することによって得ることができる。
いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞培養物における抗α４β７抗体の生産方法は、培養物に、金属イオン及び金属補因子を含む培地補充成分、ならびにヌクレオシド、及び糖を含む別の培地補充成分を提供することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞培養物における抗α４β７抗体の生産方法は、培養物に、金属イオンを含む培地補充成分、ならびにヌクレオシド、糖、及び金属補因子を含む別の培地補充成分を提供することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞培養物における抗α４β７抗体の生産方法は、培養物に、金属イオン、ヌクレオシド、糖、及び金属補因子を含む培地補充成分を提供することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞培養物における抗α４β７抗体の生産方法は、培養物に、金属イオン、ヌクレオシド、及び金属補因子を含む培地補充成分を提供することを含む。
実施例に提供される例示的な培地補充成分及びそれらの使用方法は、本発明の実施形態とみなされる。
Ｃ．リジン及び／またはアルギニンの補充
前述の態様のいくつかの実施形態では、細胞培養培地、例えば、生産段階培地は、リジン、及び／またはアルギニンをさらに補充することができる。したがって、いくつかの態様では、本明細書で提供される方法及び組成物は、亜鉛、リジン、及び／またはアルギニンで補充された、細胞培養培地、例えば、生産段階培地を採用することができる。他の態様では、本明細書で提供される方法及び組成物は、ウリジン、マンガン、ガラクトース、リジン、及び／またはアルギニンで補充された、細胞培養培地、例えば、生産段階培地を採用することができる。他の態様では、本明細書で提供される方法及び組成物は、ウリジン、マンガン、ガラクトース、亜鉛、リジン、及び／またはアルギニンで補充された、細胞培養培地、例えば、生産段階培地を採用することができる。
一実施形態では、生産培地は、５．０～８．８ｇ／Ｌのリジンと、３．０～１２．０ｇ／Ｌのアルギニンとを含む。一実施形態では、生産培地は、４．５～５．５ｇ／Ｌのリジンを含む。一実施形態では、生産培地は、５．５～８．８ｇ／Ｌのリジンを含む。一実施形態では、生産培地は、５．４～７．４ｇ／Ｌのアルギニンを含む。一実施形態では、生産培地は、７．４～１２ｇ／Ｌのアルギニンを含む。
培地には、上述のようにウリジン、マンガン、ガラクトース、及び亜鉛を補充することができる。例えば、いくつかの実施形態では、細胞培養培地、例えば、生産段階培地は、０．１～２０ｍＭのウリジン、０．１～１００μＭのマンガン、０．１～１００ｍＭのガラクトース、及び１～１００μＭの亜鉛が補充され、５．０～８．８ｇ／Ｌのリジン、及び／または３．０～１２．０ｇ／Ｌのアルギニンがさらに補充される。
ＩＩＩ．上流の生産方法
本発明は、３ｇ／Ｌを超える力価のベドリズマブなどの抗α４β７抗体をもたらす本明細書で同定された条件及び／または補充成分を用いる、哺乳動物宿主細胞における抗α４β７抗体などの抗体の大規模な組換え生産に関する。哺乳動物細胞培養システムにおける高レベルの組換え抗体発現は、当該技術分野における既知の課題である。
全体的なプロセスには、抗α４β７抗体を発現するように遺伝子操作された哺乳動物細胞を細胞培養培地に接種すること、増殖段階、生産段階、そして最後に組換え抗体を回収する回収段階が含まれる。種々の段階の間に、特定の実施形態では、移行段階が存在し得る。
したがって、最初のステップとして、所望の組換え抗α４β７抗体をコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ）を、発現のための複製可能なベクターに挿入することができる。種々のベクターは、公衆に利用可能であり、当業者に知られている。ベクターの構成要素は、一般的に、以下の１つ以上を含むがこれらに限定されない：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー因子、プロモーター、及び転写終結配列。このそれぞれは以下に記載される。使用できる任意選択のシグナル配列、複製起点、マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、及び転写ターミネーター配列は当該技術分野で知られており、ＰＣＴ公開ＷＯ９７／２５４２８または米国特許第７，０５３，２０２号にさらに詳細に記載されている。
発現ベクターは、通常、宿主生物によって認識され、及びタンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されるプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の開始コドンの上流（５’）に位置する非翻訳配列（一般に約１００～１０００ｂｐ以内）であり、それらが作動可能に連結されている特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する。そのようなプロモーターは、典型的には、２つのクラス、誘導性プロモーター及び構成的プロモーターに分けられる。誘導性プロモーターは、培養条件のいくらかの変化、例えば、栄養素の存在もしくは非存在、または温度の変化に応答してそれらの制御下でＤＮＡから増加したレベルの転写を開始する。種々の潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが現時点で周知である。これらのプロモーターは、制限酵素消化により源のＤＮＡからプロモーターを回収し、単離したプロモーター配列をベクターに挿入することにより、所望のタンパク質をコードするＤＮＡに作動可能に連結される。
哺乳動物細胞における一過性の発現を提供する発現ベクターを使用することができる。一般に、一過性発現は、宿主細胞において効率的に複製することができる発現ベクターの使用を含み、その結果、宿主細胞は、発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、結果として、発現ベクターによってコードされる所望のポリペプチドを高レベルで合成する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、前出）。適切な発現ベクター及び宿主細胞を含む一過性発現システムは、クローン化されたＤＮＡによってコードされるポリペプチドの便利な陽性同定、及び所望の生物学的または生理学的特性についてのそのようなポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。哺乳動物宿主細胞は、上述の発現ベクターでトランスフェクトされ、好ましくは形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適切になるように改変された従来の栄養素培地で培養される。次いで、そのような細胞を増殖させ、最終的に、数回の複製を経て、その後の増殖及び最終的に目的のポリペプチドの生産のために、より大きな容器に移される。
ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞は、小規模培養、例えば５Ｌまで、例えば５ｍｌ、２５ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌ、２５０ｍｌ、１Ｌ、３Ｌ、または５Ｌの容器において培養してもよい。代替的に、培養物は、例えば、１０Ｌ、２０Ｌ、１００Ｌ、または２００Ｌの容器などの中規模の容器であってよい。代替的に、培養物は、５００Ｌ、１０００Ｌ、２０００Ｌ、３０００Ｌ、５０００Ｌ、１０，０００Ｌ、及び１５，０００Ｌの容器など、２００Ｌを超える容器での大規模培養であってよい。治療用抗体の製造などの大規模な細胞培養物は、典型的に、細胞が目的のタンパク質（複数可）を生産する間、数日または数週間も維持される。
本発明の目的のために、細胞培養培地は、インビトロ細胞培養物における哺乳動物細胞などの動物細胞の増殖に適した培地である。細胞培養培地の種類の例としては、拡大細胞培養培地及び生産細胞培養培地が挙げられる。
細胞培養培地製剤は当該技術分野でよく知られている。典型的には、細胞培養培地は、緩衝液、塩、炭水化物、アミノ酸、ビタミン、及び微量の必須元素で構成されている。細胞培養培地には、血清、ペプトン、タンパク質加水分解物、及び／またはタンパク質が含まれていても含まれていなくてもよい。無血清及び定義済み培地を含む種々の組織培養培地が市販されており、例えば、以下の細胞培養培地のいずれか１つまたは組み合わせを使用することができる：とりわけ、ＲＰＭＩ－１６４０培地、ＲＰＭＩ－１６４１培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地イーグル、Ｆ－１２Ｋ培地、ハムのＦ１２培地、イスコフの改変ダルベッコ培地、マッコイの５Ａ培地、ライボビッツのＬ－１５培地、及びＥＸ－ＣＥＬＬ（商標）３００シリーズ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，Ｋａｎｓ．）などの無血清培地。細胞培養培地は、培養される細胞の要求性及び／または所望の細胞培養パラメーターに応じて、アミノ酸、塩、糖、ビタミン、ホルモン、増殖因子、緩衝液、抗生物質、脂質、微量元素などの成分の追加または増加した濃度で補充することができる。ＣＨＯ細胞培地は、当該技術分野で知られており、例えば、ＣＤ－ＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＤ－ＣＨＯ－ＡＧＴ（商標）培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＨＹＣＥＬＬ（商標）ＣＨＯ培地（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、またはＣＨＯＭＡＣＳ ＣＤ培地（Ｍｉｌｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）である。いくつかの実施形態では、上述のように市販の培地は、ＧＳ－ＣＨＯ細胞における、抗α４β７抗体、例えばベドリズマブを生産するための生産段階の培養物のための出発培地として使用することができる。１つの好ましい実施形態では、抗体は、ＣＤ－ＣＨＯ培地で増殖するＧＳ－ＣＨＯ細胞において生産され、ＣＤ－ＣＨＯ培地は、本明細書に記載されるように補充される。
生産段階の前に、哺乳動物細胞は、細胞増殖と生存率を最大化する環境条件下で、最初に増殖段階で培養される。増殖段階に続いて、生産段階が開始され、それにより、ポリペプチド生産を最大化する細胞培養条件が使用される。増殖段階と生産段階は、１つ以上の移行段階に先行するか、またはそれらによって分離され得る。例えば、一実施形態では、細胞培養プロセスの生産段階の前に、細胞培養の生産段階のパラメーターが関与する細胞培養の移行段階が先行する。
増殖段階では、哺乳動物細胞は、増殖のために最大化される条件下及び期間にわたって増殖する。温度、ｐＨ、溶解酸素（ＤＯ２）などの培養条件は、特定の宿主で使用されるものであり、当業者には明らかである。一般に、ｐＨは、酸（例えば、ＣＯ２）または塩基（例えば、Ｎａ２ＣＯ３またはＮａＯＨ）のいずれかを使用して、約６．５～７．５のレベルに調整される。ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞を培養するための適切な温度範囲は、摂氏約３０～４０度の間であり、好ましくは摂氏３６～３８度の範囲である。
哺乳動物細胞によるタンパク質の生産のための商業的プロセスでは、一般に、複数の、例えば、異なる、例えば、最終生産段階に先立つ、連続的に大きくなる培養容器で起きる、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の増殖段階が存在する。
細胞が十分な数に増殖すると、それらは大規模な生産容器、例えばバイオリアクターに移されて生産段階を開始し、それによって哺乳動物宿主細胞は目的のポリペプチド、すなわち抗体の生産を促進する条件下で培養される。当業者は、特定の培養宿主細胞における組換えポリペプチド生産のために開発された、本明細書に記載の細胞培養培地のうちの１つ以上を使用することを選択することができる。代替的に、本発明による方法及び組成物は、市販の細胞培養培地と組み合わせて使用することができる。
典型的に、増殖段階は生産段階よりも高い温度で起きる。例えば、増殖段階は、摂氏約３５度～摂氏約３８度までの第１の温度で起こり得、生産段階は、摂氏約３０度～摂氏約３４度までの第２の温度で起こり得る。しかしながら、実施例に記載されるように、本明細書で同定された改善の１つは、抗α４β７抗体、例えばベドリズマブの生産のための細胞培養物における哺乳動物細胞の増殖段階と生産段階との間で実質的に同様の温度を維持することであり、細胞培養物からの抗体力価の増加をもたらす。実際、２つの段階の間で同様の温度を維持することにより、ベドリズマブの抗体力価は１ｇ／Ｌより大きく、例えば約５～７ｇ／Ｌであった。
したがって、一実施形態では、本発明は、哺乳動物宿主細胞において、ヒト化抗α４β７抗体を生産する方法であって、哺乳動物宿主細胞は、拡大段階で細胞培養培地中で培養され、その後生産段階において細胞培養培地で培養され、拡大段階と生産段階の両方がほぼ同じ平均温度、例えば、摂氏３６～３８度の両方の段階の平均温度で実行される、方法を特徴とする。一実施形態では、拡大段階と生産段階の両方の平均温度は、摂氏３６．５～３７．５度、例えば、摂氏約３７度である。
代替的に、本発明は、哺乳動物宿主細胞において、ヒト化抗α４β７抗体を生産する方法であって、哺乳動物宿主細胞は、拡大段階で細胞培養培地中で培養され、その後生産段階において細胞培養培地で培養され、拡大段階と生産段階の両方がほぼ同じ平均温度範囲、例えば、摂氏３６～３８度、例えば、摂氏３６．５～３７．５度の範囲の任意の温度で実行される、方法を特徴とする。
生産段階の長さは、細胞及び発現される抗体に応じて変化する可能性がある。特定の実施形態では、生産段階は約１４日以内である。特定の実施形態では、生産段階は約１５日以内である。特定の実施形態では、生産段階は約１６日以内である。代替的に、生産段階は、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１０～１６日、１１～１５日、１３～１７日、または１２～１４日である。これらの数値には、部分的な日数、例えば１３．５日が含まれる。
一実施形態では、細胞培養培地のｐＨは、６．０～８．０、６．５～７．５、６．７～７．０、６．７～６．９、６．９５～７．０５、または７．１～７．２の範囲である。これらのｐＨ値の中間の数値、例えば、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、及び８．０は、本明細書に記載されている他のすべての番号と同様に、本発明の一部であることも意図されている。上述の値のいずれかの組み合わせを上限及び／または下限として使用した値の範囲は、本発明の範囲に含まれることが意図されている。いくつかの実施形態では、培養物のｐＨは、あるｐＨから別のｐＨ、例えば接種時よりも低いｐＨにシフトし得る。例えば、ｐＨは、６．９～７．１、６．９５～７．０５、またはｐＨ７．００±０．１、±０．０５または±０．０２のｐＨ範囲から、６．７～７．０、６．７５～６．８５またはｐＨ６．８±０．１または±０．０２のｐＨ範囲にシフトし得る。シフトのタイミングは、培養で２、３、４、または５日後であってよい。いくつかの実施形態では、ｐＨシフトは、生産段階培養の４日目または５日目である。
したがって、一実施形態では、本明細書で提供されるのは、抗体を発現するように遺伝子操作された哺乳動物宿主細胞におけるヒト化抗α４β７抗体の生産方法であって、哺乳動物宿主細胞が第１のｐＨの生産培地で培養され、その後第２のｐＨにシフトされ、第２のｐＨは第１のｐＨよりも低い、方法である。例えば、いくつかの実施形態では、第２のｐＨは、宿主細胞培養物の生産段階の間、第１のｐＨよりも０．１～０．５ｐＨ単位低くシフトされ得る。一実施形態では、開始ｐＨは、ｐＨ６．８～ｐＨ７．２の範囲であり得る。ｐＨシフトが起こった後、調整されたｐＨは、０．１～０．５ｐＨ単位、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、または０．５ｐＨ単位だけ減少させることができる。したがって、いくつかの実施形態では、第２のｐＨは、約６．７～６．９５の範囲にあり得る。
以下の実施例で説明するように、生産段階でのｐＨシフトは、例えば、抗体の塩基性アイソフォームの量を減らし、抗体の酸性アイソフォームの量を減らすことができ、及び／または抗体の主要アイソフォームの量を増やすことができる。
一部の実施形態では、培養培地のｐＨは、生産段階中、６．５～７．０の範囲内のｐＨに維持される。
一部の実施形態では、培養培地のｐＨは、生産段階中、６．７～７．０の範囲内のｐＨに維持される。
特定の実施形態では、生産段階中の細胞培養培地のｐＨは、約６．８５である。
生産段階の期間中、培養物は、細胞培養物の生産段階の過程で消費される栄養素及びアミノ酸などの成分を含む濃縮供給培地で補充することができる。濃縮供給培地は、ほぼすべての細胞培養培地製剤に基づくことができる。そのような濃縮供給培地は、細胞培養培地の成分のほとんどまたはサブセットを、例えば、通常量の約５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１２×、１４×、１６×、２０×、２５～４０×、３０×、５０×、１００×、４０～１２０×、２００×、４００×、６００×、８００×、さらには約１０００×で含むことができる。濃縮供給培地は、流加培養プロセスでよく使用される。
一実施形態では、生産段階は流加培養である。流加培養は、哺乳動物細胞からタンパク質を大規模に生産するために広く実施されている培養方法である。例えば、Ｃｈｕ ａｎｄ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（２００１），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：１８０－８７を参照されたい。抗体生産は細胞にとって要求が厳しい場合があり、基本培地または出発培地では高密度の細胞及び高レベルの抗体生産を維持することができない。アミノ酸やエネルギー源などの新鮮な栄養素がないと、収量が低下したり、細胞が死んだりする可能性がある。例えば、チロシンなどのアミノ酸の供給を消費する培養物は、抗体の生産を停止する。哺乳動物細胞の流加培養は、培養物に栄養素を含む濃縮供給培地を継続的または定期的に供給する培養である。供給は、例えば、毎日、２日に１回、３日に１回などの所定のスケジュールで行うことができる。一実施形態では、例えば、グルコース、亜鉛、マンガン、ウリジン、及びガラクトースからなる群から選択される１つ以上の追加の栄養素が、生産段階の４日目またはその前後から、例えば培地補充成分で細胞培養培地に添加される。供給溶液は、毎日、１日おき、２日ごと、及びそれらの組み合わせのスケジュールで添加される。いくつかの実施形態では、チロシンは、生産段階中、例えば４日目と１１日目の２回ボーラスで添加される。他の実施形態では、チロシンは、例えば、供給補充成分において、生産段階の培養物に毎日添加される。いくつかの実施形態では、グルコースは、生産段階の培養物に添加される。いくつかの実施形態では、グルコース消費は、例えば、グルコースまたはその代謝産物、例えば乳酸を測定することによってモニターされる。いくつかの実施形態では、グルコースを含む供給補充成分が添加され、グルコースレベルが１～１０ｇ／Ｌ、２～７ｇ／Ｌ、２．５～６ｇ／Ｌ、または約７ｇ／Ｌのレベルに制御される。
特定の実施形態では、流加培養法は、増殖中の細胞を補充するために、哺乳動物細胞培養プロセスの増殖段階で使用される。
特定の実施形態では、本発明の細胞培養は、大規模バイオリアクターで行われ、流加培養手順が使用される。流加培養の一実施形態では、哺乳動物宿主細胞及び培地が最初に培養容器に供給され、追加の培養栄養素が、連続的に、または離散的な増分で供給され、培養の終了前の定期的な細胞及び／または産物の回収を伴うか、または伴わない。流加培養は、例えば、定期的に全培養物（細胞及び培地を含む）が除去され、新鮮な培地に置き換えられる半連続流加培養を含むことができ、流加培養は、細胞培養のためのすべての成分（細胞及びすべての培養栄養素を含む）が、培養プロセスの開始時に培養容器に供給される単純なバッチ培養とは区別される。
本明細書に記載の方法は、１ｇ／Ｌより大きいヒト化抗α４β７抗体の力価を有する細胞培養物を達成するために使用することができる。一実施形態では、本明細書に記載の方法は、約２～約６ｇ／Ｌ、約３～約５ｇ／Ｌ、約５～約９ｇ／Ｌ、または約４．５～約７ｇ／Ｌのヒト化抗α４β７抗体の力価を達成するために使用される。
本明細書に開示される方法は、特定のグリコシル化パターンを有する抗体組成物を達成するために使用することができる。一実施形態では、本明細書に記載の方法は、集団が８８％以上、９０％以上、または９１％以上の総アシアロ、アガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ０Ｆ）、アシアロ、モノガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ１Ｆ）、及び／またはアシアロ、ジガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ２Ｆ）の、グリコシル化バリアントを有する、ヒト化抗α４β７抗体の集団を提供する。
本明細書に開示される方法はまた、一定量の抗体の主要アイソフォームを有する抗体組成物を達成するために使用され得る。一実施形態では、本明細書に開示される方法は、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）によって決定されるとき、６１％以上の主要な抗体アイソフォームの量を有する組成物（例えば、ベドリズマブを含む清澄回収）を提供する。別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＣＥＸによって決定されるとき、６２％以上の主要な抗体アイソフォームの量を有する組成物（例えば、ベドリズマブを含む清澄回収）を提供する。一実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＣＥＸによって決定されるとき、６３％以上の主要な抗体アイソフォームの量を有する組成物（例えば、ベドリズマブを含む清澄回収）を提供する。一実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＣＥＸによって決定されるとき、６４％以上の主要な抗体アイソフォームの量を有する組成物（例えば、ベドリズマブを含む清澄回収）を提供する。別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＣＥＸによって決定されるとき、６５％以上の主要な抗体アイソフォームの量を有する組成物（例えば、ベドリズマブを含む清澄回収）を提供する。
ＩＶ．下流の生産方法
抗α４β７抗体またはその抗原結合部分、例えば、本発明のベドリズマブを含む組成物は、本明細書で提供される上流の細胞培養方法及び組成物によって生産することができる。これらの上流プロセス技術は、任意選択で下流の生産方法と組み合わせて、抗体またはその抗原結合部分を、分離、精製、及び／または製剤化することができる。生産段階に続いて、組換え抗体を回収することができる。典型的には、哺乳動物細胞は、目的のタンパク質を細胞培養培地に分泌するように操作されているため、精製プロセスの最初のステップは、細胞を培地から分離することである。回収された培地は、例えば濾過によってさらに清澄化することができる。次いで、培地、例えば、清澄化された回収物は、細胞残屑、不要なタンパク質、塩、ミネラル、または他の望ましくない要素を除去するいくつかの追加の精製ステップに供することができる。組換え抗体は、混入汚染した可溶性タンパク質及びポリペプチドから精製することができ、以下の手順は、以下の１つ以上を含むことができる適切な精製手順の例示である：例えば、プロテインＡなどの抗体のＦｃ領域に結合する樹脂を使用するアフィニティークロマトグラフィー；イオン交換カラムまたは陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）などの樹脂、例えばＳＰ－セファロース（商標）またはＣＭ－セファロース（商標）ヒドロキシアパタイトでの分画化；陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）；疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）；混合モードクロマトグラフィー；エタノール沈殿；クロマトフォーカシング；硫酸アンモニウム沈殿；例えば、セファデックスＧ－７５（商標）を用いるゲル濾過；限外濾過及び／または透析濾過、または前述の組み合わせ。精製方法の例は、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ，２：４８０－４９９（２０１０）に記載される。精製プロセスの最後に、組換えタンパク質は非常に純粋であり、例えば、以下に記載される医薬抗体製剤におけるヒトの治療的使用に適している。精製後、高純度の組換えタンパク質は、ヒトの投与に適した医薬製剤へと限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）され得る。
透析濾過及び限外濾過に続いて、抗体製剤は液体のままであるか、または凍結乾燥されて乾燥抗体製剤になり得る。一態様では、乾燥した凍結乾燥抗体製剤は、１５０ｍｇ、１８０ｍｇ、２４０ｍｇ、３００ｍｇ、３６０ｍｇ、４５０ｍｇ、または６００ｍｇの抗α４β７抗体を含む単回投与バイアルで提供され、投与用の滅菌水などの液体で再構成することができる。別の態様では、抗α４β７抗体、例えば、ベドリズマブは、それを必要としている対象に投与されるまで、約２～８℃で容器、例えばバイアル、シリンジ、またはカートリッジに保管される安定な液体医薬組成物である。いくつかの実施形態では、抗α４β７抗体の再構成された凍結乾燥製剤または安定な液体医薬組成物は、約０％～５．０％、０％～２％、≦２％、≦１％、≦０．６％、または≦０．５％の凝集体を含む。
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、ヒト化抗α４β７抗体、またはその抗原結合部分を含む、再構成された凍結乾燥抗体製剤、または安定な液体医薬組成物である。いくつかの実施形態では、抗α４β７抗体の再構成された凍結乾燥製剤または安定な液体医薬組成物は、約１１％～１６％、１２％～１５％、＜１４％、＜１３％、＜１２％、または＜１１％の塩基性アイソフォーム種を含む。いくつかの実施形態では、抗α４β７抗体の再構成された凍結乾燥製剤または安定な液体医薬組成物は、６５％～７５％、６６％～７４％、６７％～７３％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、または少なくとも７０％の主要アイソフォームを含む。いくつかの実施形態では、抗α４β７抗体の再構成された凍結乾燥製剤または安定な液体医薬組成物は、９２％～９８％、９２％～９７％、９２％～９６％、９２％～９５％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、または少なくとも９５％の総アシアロ、アガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ０Ｆ）、アシアロ、モノガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ１Ｆ）、及び／またはアシアロ、ジガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ２Ｆ）グリコシル化バリアント（Ｇ０Ｆ＋Ｇ１Ｆ＋Ｇ２Ｆ）含有量を含む。いくつかの実施形態では、抗α４β７抗体の再構成された凍結乾燥製剤または安定な液体医薬組成物は、４５％～６５％、５０％～６５％、５５％～６５％、４５％～６０％、５０％～６０％、５５％～６０％、４５％～５５％、４７％～６１％、４７％～６３％、６５％以下、６４％以下、６３％以下、６２％以下、６１％以下、６０％以下、５７％以下、５５％以下、５３％以下、５２％以下、５０％以下のＧ０Ｆ含有量を含む。いくつかの実施形態では、抗α４β７抗体の再構成された凍結乾燥製剤または安定な液体医薬組成物は、２５％～４５％、２６％～４２％、２７％～４０％、３０％～４０％、３０％～４５％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、または少なくとも４３％のＧ１Ｆ含有量を含む。いくつかの実施形態では、抗α４β７抗体の再構成された凍結乾燥製剤または安定な液体医薬組成物は、２％～８％、２．５％～７．５％、３％～７％、３．５％～６．５％、少なくとも２％、少なくとも２．５％、少なくとも３％、少なくとも３．５％、少なくとも４％、少なくとも４．５％、少なくとも５％、または少なくとも５．５％、少なくとも６％、少なくとも６．５％、または少なくとも７％のＧ２Ｆ含有量を含む。
いくつかの実施形態では、抗α４β７抗体の再構成された凍結乾燥製剤または安定な液体医薬組成物は、アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン、及び／またはヒスチジン一塩酸塩）、糖（例えば、スクロース）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０）、及び／または緩衝液（例えば、クエン酸塩、リン酸塩など）を含むが、これらに限定されない。一実施形態では、抗α４β７抗体の再構成された凍結乾燥製剤または安定な液体医薬組成物は、Ｌ－アルギニン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－ヒスチジン一塩酸塩、スクロース、及び／またはポリソルベート８０を含む。別の実施形態では、抗α４β７抗体の再構成された凍結乾燥製剤または安定な液体医薬組成物は、クエン酸塩、アルギニン、ヒスチジン、及び／またはポリソルベート８０を含む。
シリンジまたはカートリッジは、１ｍＬまたは２ｍＬの容器（例えば、１６０ｍｇ／ｍＬ用量の場合）にすることができ、または、例えば、より高い用量（少なくとも３２０ｍｇまたは４００ｍｇ以上）の場合、２ｍｌより大きくすることができる。注射器またはカートリッジは、少なくとも約２０ｍｇ、少なくとも約５０ｍｇ、少なくとも約７０ｍｇ、少なくとも約８０ｍｇ、少なくとも約１００ｍｇ、少なくとも約１０８ｍｇ、少なくとも約１２０ｍｇ、少なくとも約１５５ｍｇ、少なくとも約１８０ｍｇ、少なくとも約２００ｍｇ、少なくとも約２４０ｍｇ、少なくとも約３００ｍｇ、少なくとも約３６０ｍｇ、少なくとも約４００ｍｇ、または少なくとも約５００ｍｇの抗α４β７抗体を含むことができる。いくつかの実施形態では、容器、例えば、注射器またはカートリッジは、約２０～１２０ｍｇ、約４０ｍｇ～７０ｍｇ、約４５～６５ｍｇ、約５０～５７ｍｇ、または約５４ｍｇの抗α４β７抗体、例えば、ベドリズマブを送達するように製造され得る。他の実施形態では、注射器またはカートリッジは、約９０～１２０ｍｇ、約９５～１１５ｍｇ、約１００～１１２ｍｇ、または約１０８ｍｇの抗α４β７抗体、例えば、ベドリズマブを送達するように製造され得る。他の実施形態では、注射器またはカートリッジは、約１４０～２５０ｍｇ、約１５０～２００ｍｇ、約１６０～１７０ｍｇ、約１６０～２５０ｍｇ、約１７５ｍｇ～２１０ｍｇ、約２２０～２６０ｍｇ、または約１６０ｍｇ、約１６５ｍｇ、約１８０ｍｇ、もしくは約２００ｍｇの抗α４β７抗体、例えば、ベドリズマブを送達するように製造され得る。
製剤の投与は、静脈内、皮下、または筋肉内などの非経口注射によることができる。静脈内注射は、滅菌等張食塩水、緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水またはリンガー（乳酸菌またはデキストロース）液でさらに希釈することなどによる注入によることができる。いくつかの実施形態では、抗α４β７抗体は、皮下注射によって、例えば、治療の開始後、約２、３、または４週間ごとに、または３回目のその後の投与後に、約５４ｍｇ、１０８ｍｇ、または約１６５ｍｇまたは約２１６ｍｇの用量で投与される。
Ｖ．分析方法
本明細書で報告される抗体またはその抗原結合部分の様々なパラメーターは、以下に記載されるような標準的な分析方法及び技術を使用して測定することができる。
本明細書に記載の様々な実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を使用して、抗体またはその抗原結合部分、例えば、ベドリズマブの集団に存在する主要アイソフォーム、塩基性アイソフォーム（複数可）、及び酸性アイソフォーム（複数可）の相対量を決定することができる。ＣＥＸ法は、全体的な表面電荷に従って抗体種を分画する。移動相を使用して低イオン強度に希釈した後、試験サンプルを、適切な緩衝液、例えば、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．６で平衡化したＣＥＸカラム、例えばＤｉｏｎｅｘ Ｐｒｏ－Ｐａｃ（商標）ＷＣＸ－１０カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ（ＵＳＡ））に注入できる。抗体は、同じ緩衝液中の塩化ナトリウム勾配を使用して溶出できる。タンパク質溶出は、２８０ｎｍでモニターでき、ピークを酸性、塩基性、または主要アイソフォームの分類に割り当てる。酸性ピークは、主要アイソフォームピークよりも短い保持時間でカラムから溶出し、塩基性ピークは、主要アイソフォームピークよりも長い保持時間でカラムから溶出する。主要アイソフォーム％、酸性種パーセントの合計、及び塩基性種パーセントの合計が報告される。サンプルの主要アイソフォーム保持時間を、参照標準の保持時間と比較して、立体配座を決定する。
一実施形態では、ＣＥＸアッセイ法は、試験サンプルを低イオン強度に希釈し、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．６で平衡化されたＣＥＸカラムに注入し、この緩衝液中のＮａＣｌ勾配でカラムを溶出し、ピークを２８０ｎｍでモニターし、ピークを酸性、主要、または塩基性として割り当て、酸性ピークは最初に最短の保持時間で溶出し、主要ピークは次に溶出し、塩基性ピークは最長の保持時間で溶出し、ピーク面積が定量化され、それらの量はすべてのピーク面積のパーセントとして計算される。
本明細書に記載の様々な実施形態では、親水性相互作用相分離（ＨＩＬＩＣ）を使用して、抗体またはその抗原結合部分、例えば、ベドリズマブの糖型プロファイルを決定することができる。ＨＩＬＩＣ法は、遊離の蛍光標識炭水化物を分画する。インタクトなグリカンは、Ｎ－グリコシダーゼＦで消化することにより、抗体またはその抗原結合部分のサンプルから放出できる。放出されたグリカンは、Ｐｒｏｚｙｍｅ（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ（ＵＳＡ））のＧｌｙｋｏＰｒｅｐ Ｒａｐｉｄ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍで使用されているものなどの標準的な手法を使用して、ＩｎｓｔａｎｔＡＢ蛍光タグなどの蛍光タグですぐに標識できる。標識されたグリカンは、超高速液体クロマトグラフィーを使用して分画することができる。いくつかの実施形態では、標識されたグリカンは、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨアミドカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ（ＵＳＡ））及びアセトニトリル／ギ酸アンモニウム勾配系を使用して分画される。標識されたグリカンは、２７８ｎｍの励起波長を使用した３４４ｎｍでの蛍光発光によって検出できる。したがって、本発明に関連して使用される場合、ＨＩＬＩＣは、遊離の蛍光標識糖型を分画するＨＩＬＩＣ法であり、好ましくは、インタクトな糖型が、Ｎ－グリコシダーゼＦでの消化によって抗体またはその抗原結合部分のサンプルから放出される、放出された糖型が、次いで、標準的な標識技術、好ましくはＰｒｏｚｙｍｅ（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ（ＵＳＡ））のＧｌｙｋｏＰｒｅｐ Ｒａｐｉｄ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍで使用されるものを使用して、蛍光タグ、好ましくはＩｎｓｔａｎｔＡＢ蛍光タグで直ちに標識され、高速液体クロマトグラフィー、好ましくはＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ａｍｉｄｅ Ｃｏｌｕｍｎ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ （ＵＳＡ））及びアセトニトリル／ギ酸アンモニウム勾配システムを使用して分画され、標識された糖型は、２７８ｎｍの励起波長を使用する３４４ｎｍでの蛍光発光によって検出される。アッセイ対照は、市販の標準、例えばＩｎｓｔａｎｔＡＢ標識グルコースホモポリマーラダー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ（ＵＳＡ））の適切な解像度を確認することによって実行できる。定量は、検出される糖の相対面積パーセントに基づく。Ｇ０Ｆ（アシアロ－、アガラクトシル化二分岐グリカン、コアフコシル化）；Ｇ１Ｆ（アシアロ、モノガラクトシル化二分岐グリカン、コアフコシル化）；及びＧ２Ｆ（アシアロ、ジガラクトシル化二分岐グリカン、コアフコシル化）の種のピーク面積パーセントが報告される。
本明細書に記載の種々の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、抗体またはその抗原結合部分、例えば、ベドリズマブの集団に存在する単量体、高分子量（ＨＭＷ）凝集体、及び低分子量（ＬＭＷ）分解産物の相対レベルを決定することができる。ＳＥＣ法は、は、ＨＭＷ種及びＬＭＷ分解産物からの抗体単量体のサイズに基づく分離を提供する。試験サンプルと参照標準は、適切な緩衝液を使用して、市販のＳＥＣカラムを使用して分析できる。例えば、いくつかの好ましい実施形態では、ＳＥＣ分析は、Ｇ３０００ ＳＷｘｌカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ（ＵＳＡ））、または好ましくはタンデムに接続された２つのＧ３０００ ＳＷｘｌカラム、及びアイソクラティックリン酸塩－塩化ナトリウム緩衝液系、ｐＨ６．８を使用して実施することができる。タンパク質種の溶出は、２８０ｎｍでモニターされる。主要ピーク（モノマー）と総ピーク面積を評価して、純度を決定する。一実施形態では、ＳＥＣ分析は、タンデムに接続された２つのＧ３０００ ＳＷｘｌカラムにサンプルを注入することを含み、タンパク質種の溶出が２８０ｎｍでモニターされ、主要ピーク（単量体）と総ピーク面積が測定される、アイソクラティックリン酸塩－塩化ナトリウム緩衝液系、ｐＨ６．８で実行される。サンプルの純度（％）（単量体％として計算される）、ＨＭＷ凝集体％、及び／またはＬＭＷ分解産物％が報告される。
抗体調製物に存在する残留ＣＨＯ宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）不純物は、
必要に応じて、標準的な手法を使用する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で測定することができる。Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ、ＮＣ（ＵＳＡ））のＣＨＯ ＨＣＰ ＥＬＩＳＡキット３Ｇなど、この目的のために設計された多くのＥＬＩＳＡキットが市販されている。試験サンプル中の宿主細胞タンパク質は、固定化されたポリクローナル抗ＣＨＯ ＨＣＰ抗体を使用して捕捉できる。次いで、捕捉されたタンパク質は、適切な検出剤、例えば、同じ抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識バージョンを使用して検出することができる。この例示的な実施形態では、ＣＨＯ ＨＣＰの濃度に正比例する捕捉されたペルオキシダーゼの量は、ペルオキシダーゼ基質３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を使用して、４５０ｎｍで比色分析的に測定することができる。したがって、ＣＨＯ ＨＣＰアッセイは、ペルオキシダーゼ基質３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を、４５０ｎｍで比色分析で定量化される物質へと変換する、ポリクローナル抗ＣＨＯ ＨＣＰ抗体の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識バージョンに結合した後に検出される、ポリクローナル抗ＣＨＯ ＨＣＰ抗体を使用してＨＣＰを捕捉することを含む。ＨＣＰ濃度は、試験キットに含まれているものなどのＣＨＯ ＨＣＰ標準曲線と比較することで決定でき、抗体調製物中のタンパク質の総レベルのパーセンテージとして報告される。
以下の実施例は、哺乳動物細胞培養において抗体を生産するための改善された方法及び組成物を例示している。以下の実施例は、例示の目的のためにのみ提供され、本発明の範囲を限定することを意図するものでは決してない。例において言及される市販の試薬は、別途指示がない限り製造者の取扱説明書に従って使用された。
ベドリズマブは以前に、ジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損（ＤＨＦＲ）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株で生産されていた（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６－４２２０、米国特許出願公開第２００７０１２２４０４号）。選択したクローンはベドリズマブの発現が安定していたが、生産レベルは２ｇ／Ｌ未満であった。材料に対する高い需要を考慮して、研究者はより高生産性の細胞株を開発しようとした。
数千のクローンで種々の選択システムを試験し、バイオリアクターでいくつかのクローンを評価した後、グルタミンシンターゼ欠損（ＧＳ－）チャイニーズハムスター卵巣（ＧＳ－ＣＨＯ）細胞株を選択した。一例では、ＧＳ ＣＨＯシステムは６．７ｇ／Ｌ抗体をもたらした。追加の研究は、培養条件と培地補充成分が特定の品質特性に影響を与える可能性があることを示した。以下の実施例では、ＧＳ－ＣＨＯ細胞で生産されるベドリズマブの品質を改善するための実験について説明する。
実施例１．細胞培養生産が産物の品質特性に与える影響
産物の品質特性を改善するために、Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ法を使用してスクリーニング設計を作成し、８回のバイオリアクターの実行における５つのプロセスパラメーター改変因子の影響を評価した。細胞を解凍し、標準的なスケールアップ戦略を使用して３日間継代し、振とうフラスコから作業容量１．７５Ｌの３Ｌ生産バイオリアクターに移した。１５日間のバイオリアクターの生産には、２回の供給（特に指定のない限り）によるボーラス供給戦略が使用された。
設計：このスクリーニング研究では、次の５つの異なる因子が選択された。１）温度シフト（３３℃まで）；２）供給戦略の変更（２ｇ／Ｌ対６ｇ／Ｌのグルコース）；３）ｐＨの変化（６．８５対７．０５）；４）供給溶液へのウリジン、塩化マンガン、ガラクトース（ＵＭＧ）の添加；及び５）Ｓｉｇｍａ Ｇａｌ＋／ＥｘＣｅｌｌ（登録商標）グリコシル化調整添加物。これらの５つの因子は、表１に記載されているＰｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎスクリーニング設計に基づいた８つの異なるバイオリアクターの実行で試験された。
Figure 2022536658000001
Figure 2022536658000002
供給：生産バイオリアクター培養物に３×１０５生存細胞／ｍＬを接種し、４日目に、研究設計に従って細胞の増殖速度とグルコース消費速度に基づいて、供給培地を培養物に添加した。供給の投与量は７ｇ／Ｌグルコース濃度で上限に設定された。温度のシフトは、研究設計に従って、摂氏３７度から摂氏３３度または摂氏３５度へと、７日目に開始された。すべての生産バイオリアクター培養物は、１８日目または標的細胞の生存率が５０％以下のいずれかが先に来た場合に回収された。
産物の品質：表１で試験された条件の結果は、産物の品質特性を改善する条件を（予測プロファイラーを使用して）調査するために、ＪＭＰソフトウェアで分析された。
予測プロファイルの結果を図１に示す。一般に、抗体力価の増加、ベドリズマブの塩基性及び酸性の種の減少、ならびにベドリズマブのＧ２Ｆアイソフォームの増加を達成する条件が一般的に望ましい。
図１に示すように、モデルは、グルコース消費率、摂氏３７度、ｐＨ６．８５へのシフト、及び供給溶液へのＵＭＧの添加に基づいた供給送達での操作が最適であると予測した。対照的に、図１の結果は、Ｇ２アイソフォーム、ベドリズマブの酸性または塩基性の種、または抗体力価にほとんど影響を与えなかったため、Ｇａｌ＋の添加は必須ではないことを示唆する。さらに、摂氏３７度から摂氏３３度への温度シフトは力価に悪影響を及ぼし、細胞生産を３７度に維持することが有利であるのに対し、７．０５未満（例えば、６．８５から７未満）のｐＨは、低レベルのＧ２アイソフォームを維持しながら力価を改善したことを示唆している。
予測プロファイラーはさらに、炭水化物目標を達成するためにＵＭＧの組み合わせを使用することの利点、ならびに抗体のより高い力価レベル及びより低いレベルの酸性種を示した。グルコース消費ベースの供給戦略とｐＨ７と比較して低いｐＨ（６．８５）は、より低い塩基性種の比率を達成する上で利点を示した。
実施例２：産物の品質特性に対するＵＭＧ補充とｐＨの影響
この実験の目的は、産物の品質特性に対する供給溶液のｐＨとＵＭＧレベルの影響を試験することであった。この実験は、実施例１の事後点検である。
設計：ＧＳ－ＣＨＯ細胞をこの実験に使用した。実験は、６．８５または７．０５で調査されたｐＨの要因、及び３３×、５０×、及び６６×の濃度で調査された供給補充成分（生産中）としてのＵＭＧに対応するように設計された。４日目にｐＨシフトを伴う追加条件が追加された（Ｖ１０）。実験の１日目に、Ｖ０１の滴定ポンプは、ｐＨプローブの接続が緩んでいたため、滴定剤を大幅にオーバーポンプし、反応器を停止する必要があった。Ｖ１０には同様の培地と細胞があったため、Ｖ１０の実行テンプレートはＶ０１の実行テンプレートを反映するようにすぐに置き換えられた。実施例１で説明したように、利点が予測されなかったため、温度シフトは使用されなかった。
細胞は、消費ベースの供給方法を使用して供給された。この方法では、現在の増殖率と消費率を推定して、グルコース要求性を予測する。
実験では、抗体力価の量、酸性種、塩基性種、主要種、Ｇ０Ｆ種、Ｇ１Ｆ種、Ｇ２Ｆ種、及びグリカンの合計を含む、産物の品質特性に対する、供給培地（供給培地中の、３３×（３３ｍＭのウリジン、０．０６６ｍＭのマンガン、及び１６５ｍＭのガラクトース）、５０×（５０ｍＭのウリジン、０．１ｍＭのマンガン、及び２５０ｍＭのガラクトース）、ならびに６６×（６６ｍＭのウリジン、０．１３２ｍＭのマンガン及び３３０ｍＭのガラクトース）の濃度で調査された）でのＵＭＧ補充とｐＨ（７．０５及び６．８５で調査）の効果を評価した。結果は、ＵＭＧを補充せずにＣＤ－ＣＨＯ生産培地で培養した培養物と比較した。実験設計を表３に示す。
Figure 2022536658000003
結果：実験の結果を使用して、予測プロファイルを生成し、細胞培養に対する種々の条件の影響とベドリズマブの産物の品質特性をさらに研究した。予測プロファイルの結果を図２Ａ～２Ｈに示す（抗体力価対ＵＭＧ（図２Ａ）、酸性種％（ＣＥＸ）対ＵＭＧ（図２Ｂ）、塩基性種％（ＣＥＸ）対ＵＭＧ（図２Ｃ）、主要種のパーセンテージ（ＣＥＸ）対ＵＭＧ（図２Ｄ）、Ｇ０Ｆ種のパーセンテージ対ＵＭＧ（図２Ｅ）、Ｇ１Ｆ種のパーセンテージ（図２Ｆ）、Ｇ２Ｆ種のパーセンテージ対ＵＭＧ（図２Ｇ）、及びグリカンの合計対ＵＭＧ（図２Ｈ））。図２Ａ～２Ｈのそれぞれで、ＵＭＧ補充のない容器は、影付きの領域の左端にあるドットで示される（影付きの領域はＵＭＧ補充を表す）。さらに、試験した２つのｐＨ量（ｐＨ７．０５及びｐＨ６．８５）を図２Ａ～２Ｈに示す。
図２Ｄ、２Ｆ、２Ｇ、及び２Ｇで説明されているように、ＵＭＧ補充の増加を伴う細胞培養物は、ＵＭＧ補充のない培養物と比較して、それぞれ主要種、Ｇ１Ｆ種、Ｇ２Ｆ種、及びグリカンの合計のパーセンテージが高くなった。さらに、ＵＭＧ補充のある培養物は、ＵＭＧ補充のない培養物と比較して、より低い力価（図２Ａ）、より低い酸性種（図２Ｂ）、より低い塩基性種（図２Ｃ）、及びより低いＧ０Ｆ種（図２Ｅ）を示した。
試験した様々なＵＭＧ濃度全体で、ＵＭＧの濃度は力価と酸性種への影響が最小限であり、塩基性種のパーセンテージへの影響は低く（すなわち、塩基性種はＵＭＧ濃度が高くなるとわずかに減少した）、主要な種のパーセンテージへの影響が高いように見えた（すなわち、主要な種は、ＵＭＧ濃度が高くなるにつれて増加した）。種々のＵＭＧ濃度に応じて、炭水化物プロファイルに大きな変化はなかった。
最後に、ｐＨに関しては、図２Ａ～２Ｈで説明されているように、低ｐＨ（６．８５）での操作は、高ｐＨ（ｐＨ７．０５）での操作よりもパフォーマンスが優れているように見えた。
別の実験では、ベドリズマブを組換え発現するＧＳ－ＣＨＯ細胞を、ウリジン（２０．９１ｍＭのｍＭ濃度）、マンガン（０．０３９ｍＭの濃度）、ガラクトース（９６．６９ｍＭの濃度）、及び亜鉛（０．１１７ｍＭの濃度）を含む供給培地を補充したＣＤ－ＣＨＯ生産培地中で３０００Ｌスケールで培養した。供給は４日目から培養物に毎日添加された。毎日の添加で添加されたＵＭＧの量は次のとおりであった：０．１７～０．６３ｍＭのウリジン、０．３１～１．２μＭのマンガン、及び０．７７～２．９ｍＭのガラクトース。回収日までに、培養の４日目～１３日目まで毎日補充した後の生産培地中のウリジンの平均累積補充濃度は約２．７６ｍＭ、マンガンの平均累積補充濃度は約０．００５１５ｍＭ、ガラクトースの平均累積補充濃度は約１２．８ｍＭであった。亜鉛もまた、供給補充成分として約０．１１７ｍＭの濃度で４～１３日目で毎日添加され、１４日目までの生産培地中の平均累積補充濃度は約０．０１５４ｍＭであった。この実施例で使用されている平均は、試験されたロットの平均を参照している。
培養１４日後に抗体を回収し、精製後にＨＩＬＩＣを使用してフコシル化グリカンのレベルを決定した。結果を表４に示す。
Figure 2022536658000004
実施例３：産物の品質特性に対するリジンとアルギニンの影響
この実験の目的は、ベドリズマブの品質特性、特に力価と塩基性種のパーセンテージに対する供給培地中のリジンとアルギニンのレベルの影響を試験することであった。
設計：この実験は、ＧＳ－ＣＨＯ細胞で生産された場合の抗体力価、及びＣＥＸによって決定されるときの塩基性種のレベル（Ｃ末端リジンレベル）に対するリジン及びアルギニン濃度の影響を評価するために設計された。試験は、実施例１及び２と同様の方法で実施された。
結果：塩基性種のパーセンテージに対するさまざまなアルギニン及びリジン濃度の影響を比較した結果を図３Ａに示し、抗体力価への影響を示す結果を図３Ｂに示す。図３Ａと図３Ｂの両方のＸ軸のラベルは、表５に概説したように高濃度（Ｈ）、中濃度（Ｍ）、または低濃度（Ｌ）のリジン及びアルギニンに対応する。例えば、「ＬＭ」は、低レベルのリジン（表５を参照されたい）及び中レベルのアルギニン（表５を参照されたい）を指す。これらの結果は、対照と比較して、低レベルのリジンとアルギニンが塩基性種の減少を最小限に抑えたが、これらのアミノ酸の低レベルは抗体力価に悪影響を及ぼした（５～４ｇ、約２０％））ことを示した。
Figure 2022536658000005
ａｒｇ／ｌｙｓ実験に基づいて予測分析を実行した。ＪＭＰ分析では、図４Ａに示すように、塩基性種を減らすための最適な条件は、低リジン及び低アルギニンレベル（ＬＬ）であると予測された。図４Ｂ及び４Ｃは、「ＬＭ」（低リジン及び中アルギニン）「ＬＨ」（低リジン及び高アルギニン）の組み合わせの予測プロファイルを示している。しかしながら、力価の生成に影響するため、低リジン（５ｇ／Ｌ）及び中アルギニン（６．５ｇ／Ｌ）のレベルが実施例４で使用された。
実施例４：産物の品質特性に対する亜鉛の影響
この実験の目的は、細胞培養中、より具体的には培養システムの生産段階で、ベドリズマブの品質特性に対する亜鉛レベルの影響を試験することであった。
以下の表６に記載されているように、３つのレベルの亜鉛がテストされた。培養は１４～１８日の回収の範囲であった。亜鉛補充成分は、２２×ＵＭＧと還元リジン及びアルギニン（実施例３に記載の「ＬＭ」）の組み合わせで評価された。供給中のリジンとアルギニンの濃度は、それぞれ５ｇ／Ｌ及び６．４ｇ／Ｌであった。
Figure 2022536658000006
図５Ａに示すように、試験した亜鉛濃度は抗体力価に実質的な影響を及ぼさなかった。また、図Ａには、生産培養日数への影響も示されている。培養日数が長くなると、力価の生産に利点が見られた。図５Ｂ～５Ｇは、塩基性種のパーセンテージ（図５Ｂ）、酸性種のパーセンテージ（図５Ｃ）、主要種のパーセンテージ（図５Ｄ）、Ｇ０Ｆ種のパーセンテージ（図５Ｅ）、Ｇ１Ｆ種のパーセンテージ（図５Ｆ）、Ｇ２Ｆ種のパーセンテージ（図５Ｇ）、及びグリカン種の合計（図５Ｈ）に対する亜鉛の影響の試験を示す。
図５Ｂ及び５Ｃに示すように、亜鉛レベルの増加に伴い、塩基性及び酸性プロファイルで減少傾向が観察された。さらに、培養１６日目まで同様の塩基性プロファイルが達成されたことが観察された。図５Ｄに示すように、最高レベルの主要（ｍａｉｎ）（主要（ｍａｊｏｒ））種は、回収１４日目に５７．２ｕＭの亜鉛（４Ｚｎ）で得られた。
亜鉛レベルと培養日は、炭水化物プロファイルへの影響を最小限に抑えた。全体として、図５Ａ～５Ｈのデータは、１６日目までに培養と回収を終了することを示唆している。
ベドリズマブの種々の産物品質に影響があったかどうかを判断するために、種々の亜鉛濃度と組み合わせて温度も試験した。摂氏３３、３５、及び３７度の温度を、０～４レベルの亜鉛と組み合わせて試験した（上述の表６を参照されたい）。全体として、３７度は望ましいベドリズマブ産物の品質を維持するのに最も効果的であった。例えば、図６Ａは種々の亜鉛条件及び温度下での抗体の塩基性アイソフォーム％を示す。３３℃及び３７℃で５７．２ｕＭの亜鉛（４Ｚｎ）を補充した後の塩基性種のパーセントのレベルは、塩基性種（アイソフォーム）の指定された上限を下回り（黒い線で示されている、すなわち１３％の塩基性抗体アイソフォーム（ＣＥＸ））、したがって仕様要件を満たした。対照的に、図６Ｂに示すように、３３℃ではなく３７℃で５７．２ｕＭの亜鉛（４Ｚｎ）を補充した後のグリカンの合計は、低い許容基準（黒い線で示されている）を上回った。さらに、図６Ｃに示すように、低温でタンパク質凝集（ＨＭＷ種、許容基準は約１．４％以下と示されている）が増加することが観察された。図６Ｄのデータは、培養日数を延長することで力価の生成が促進され、１４日目の３３℃及び３５℃と比較して、一般に３７℃でより多くのベドリズマブ力価が生成されたことを示している。図６Ｅのデータは、抗体の酸性種が温度の上昇と培養の延長に伴って増加したことを示唆している。図６Ｅの黒い実線は、酸性種の許容上限を表している。
全体として、図６Ａ～６Ｅのデータは、ＧＳ－ＣＨＯ細胞でのベドリズマブの生産には１６日目までに発酵を停止し、約３７度の生産温度を維持することが最善であることを示唆している。さらに４Ｚｎは補充成分としての利点を提供する。
実施例５：産物の品質特性に対する培養日数の影響
この実験の目的は、ベドリズマブの品質特性に対する培養日数の影響を試験することであった。
２回の別々の実行後のＧＳ－ＣＨＯ細胞で１２、１３、１４、１５、１６、または１７培養日後に、抗体の酸性種のパーセンテージ、抗体の塩基性種のパーセンテージ、抗体の主要種のパーセンテージ、及びベドリズマブの力価を評価した。
図７Ｄに示すように、培養日数を延長すると力価の上昇が観察された。しかしながら、この力価の増加は、それぞれ図７Ａ及び７Ｂに記載されているように、酸性種の増加及び主要種の減少を伴った。塩基性種は実行１中に影響を受けたようには見えなかったが、実行２中に塩基性種が増加する傾向が観察された。データは、１６日目までに発酵を停止して回収するのが一般的に最善であることを示している。抗体が１５日目までに回収されたときに、最低レベルの酸性種が得られた。
実施例６：産物の品質特性に対するｐＨの影響
この実験の目的は、ベドリズマブの品質特性に対する生産段階の細胞培養中のｐＨの影響を試験することであった。具体的には、生産段階の培地へのｐＨシフトの導入を、ベドリズマブの品質特性への影響について評価した。
生産段階の培地の初期ｐＨは、ｐＨ６．８～ｐＨ７．２の範囲で評価された。ｐＨシフト中、培地のｐＨは最終ｐＨまで低下し、ｐＨ６．６～ｐＨ７．０の範囲で評価された。ｐＨシフトの開始時間は８６時間～１０８時間まで、ｐＨシフトの完了時間（すなわち、最終ｐＨに到達するまでの時間）は８８時間～１４４時間まで調査された。間にある２～３６時間の間隔は、ｐＨランプ時間を説明する。
最高の主要抗体アイソフォーム％（ＣＥＸによって決定）、及び最低の酸性抗体アイソフォーム％（ＣＥＸによって決定）は、ｐＨ６．７以上の最終ｐＨ（図８Ａ）、及び１２２時間以下のｐＨシフト完了時間（図８Ｂ）で観察された。このデータは、生産段階の細胞培養中のｐＨシフトが、ベドリズマブ調製物中の酸性抗体アイソフォーム種のレベルを低下させ得ることを示唆している。
実施例７：産物の品質特性の判定
以下の分析アッセイ及び方法は、ベドリズマブの産物の品質特性を決定するために前述の実施例で使用された。
陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）は、全体的な表面電荷に従って、ベドリズマブ抗体種（主要アイソフォーム、塩基性種、及び酸性種）を分画する。移動相を使用して低イオン強度に希釈した後、試験サンプルを１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．６で平衡化したＤｉｏｎｅｘＰｒｏ－Ｐａｃ（商標）ＷＣＸ－１０カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ（ＵＳＡ））に注入し、同じ緩衝液中の塩化ナトリウムを使用して溶出する。タンパク質溶出は、２８０ｎｍでモニターされ、ピークを酸性、塩基性、または主要アイソフォームの分類に割り当てる。主要アイソフォーム％、酸性種パーセントの合計、及び塩基性種パーセントの合計が報告される。サンプルの主要アイソフォーム保持時間を、参照標準の保持時間と比較して、立体配座を決定する。
ベドリズマブの炭水化物プロファイルは、親水性相互作用相分離（ＨＩＬＩＣ）による遊離蛍光標識炭水化物の分画によって生成される。インタクトなグリカンは、Ｎ－グリコシダーゼＦで消化することによりタンパク質サンプルから放出され、次いで、Ｐｒｏｚｙｍｅ（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ（ＵＳＡ））のＧｌｙｋｏＰｒｅｐ Ｒａｐｉｄ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ＩｎｓｔａｎｔＡＢ蛍光タグ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ（ＵＳＡ））ですぐに標識される。標識されたグリカンは、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨアミドカラム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ（ＵＳＡ））及びアセトニトリル／ギ酸アンモニウム勾配系を使用して分画される。検出は、２７８ｎｍの励起波長を使用した３４４ｎｍでの蛍光発光によって実現される。アッセイ対照は、市販のＩｎｓｔａｎｔＡＢ標識グルコースホモポリマーラダー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ（ＵＳＡ））の適切な解像度を決定することによって実行された。定量は、検出される糖の相対面積パーセントに基づく。Ｇ０Ｆ（アシアロ－、アガラクトシル化二分岐グリカン、コアフコシル化）；Ｇ１Ｆ（アシアロ、モノガラクトシル化二分岐グリカン、コアフコシル化）；及びＧ２Ｆ（アシアロ、ジガラクトシル化二分岐グリカン、コアフコシル化）の種のピーク面積パーセントが報告される。
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、ベドリズマブの純度を決定するために使用される。参照標準サンプルと試験サンプル（７５μｇ）は、タンデムに接続された２つのＧ３０００ ＳＷｘｌカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ（ＵＳＡ））とアイソクラティックリン酸－塩化ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８を使用して分析する。この方法は、高分子量（ＨＭＷ）種及び低分子量（ＬＭＷ）分解産物から抗体単量体を分離する。タンパク質種の溶出は、２８０ｎｍでモニターされる。主要ピーク（モノマー）と総ピーク面積を評価して、純度を決定する。サンプルの純度（％）（単量体％として計算される）及び凝集体％が報告される。
均等物
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図されている。本出願を通して引用されたすべての参考文献、特許、及び公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
Figure 2022536658000007
Figure 2022536658000008
Figure 2022536658000009
Figure 2022536658000010

Claims (124)

  1. ヒト化抗α４β７抗体を含む組成物の生産方法であって、前記方法は、
    生産培地において哺乳動物宿主細胞を培養することと、
    ウリジン、マンガン、及びガラクトースを含む補充成分を前記生産培地に添加し、それによって前記ヒト化抗α４β７抗体を含む組成物を生産することと、を含み、
    前記哺乳動物宿主細胞が、ＩｇＧ１であり、配列番号４に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載のＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含み、配列番号８に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載のＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変域を含む、ヒト化抗α４β７抗体を発現するように遺伝子鎖操作されている、前記方法。
  2. 前記組成物が、前記補充成分の非存在であるが実質的に同様の条件下で培養された前記ヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、（陽イオン性クロマトグラフィー（ＣＥＸ）によって決定されるとき）前記ヒト化抗α４β７抗体塩基性アイソフォームの減少した量を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記組成物が、約１６％以下の前記ヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームを含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記組成物が、約１４％以下の前記ヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームを含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記組成物が、約１３％以下の前記ヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームを含む、請求項３に記載の方法。
  6. 前記補充成分が、前記生産培地に添加されるか、または供給培地に添加された後に前記供給培地が前記生産培地に添加される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 補充と回収の間に前記生産培地に添加されるウリジンの累積濃度が、約１～約７ｍＭであり、補充と回収の間の前記生産培地のマンガンの累積濃度が、約０．００２～約０．０１５ｍＭであり、及び／または、補充と回収の間の前記生産培地のガラクトースの累積濃度が、約３～約２０ｍＭである、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. マンガンが、各添加ごとに約０．１～１０μＭ、約０．２～１．５μＭ、約０．２～５μＭ、約０．２５～２μＭ、約０．３～１．２μＭ、または約０．３～０．８μＭずつ、補充成分として前記生産培地に複数回添加される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. マンガンが、各添加ごとに約０．２～１．５μＭずつ、補充成分として前記生産培地に複数回添加される、請求項８に記載の方法。
  10. ウリジンが、各添加ごとに約２５～１０００μＭ、約７５～７５０μＭ、約５５～６２０μＭ、約１００～６００μＭ、約１５０～４５０μＭ、約１００～７００μＭ、約１００～６００μＭ、または約１７０～６３０μＭずつ、補充成分として前記生産培地に複数回添加される、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. ウリジンが、約１００～７００μＭずつ、補充成分として前記生産培地に複数回添加される、請求項１０に記載の方法。
  12. ガラクトースが、各添加ごとに、約０．１～１０ｍＭ、０．２～７．５ｍＭ、０．５～５ｍＭ、０．４～２．８ｍＭ、０．５～３．５ｍＭ、０．７～２．９ｍＭ、０．７５～２．５ｍＭ、または約１．２ｍＭもしくは１．４ｍＭずつ、補充成分として前記生産培地に複数回添加される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記ガラクトースが、約０．５～３．５ｍＭずつ、補充成分として前記生産培地に複数回添加される、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記補充成分が毎日または２日ごとに添加される、請求項８～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記補充成分が、生産段階の培養の４日目から添加される、請求項８～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記供給培地が、亜鉛をさらに含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 補充と回収の間に前記生産培地に添加される亜鉛の累積濃度が約０．００５ｍＭ～約０．０４５ｍＭである、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記方法がさらに、前記補充成分の非存在であるが実質的に同様の条件下で培養された前記ヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞において生産された酸性種のパーセンテージと比較して、前記ヒト化抗α４β７抗体の酸性種のパーセンテージを減少させる、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記方法が流加培養法である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記方法が生産段階であり、前記補充成分が前記生産段階の約４日目から前記生産培地に添加される、請求項１９に記載の方法。
  21. ヒト化抗α４β７抗体を含む組成物の生産方法であって、前記方法は、亜鉛を含む生産培地中で哺乳動物宿主細胞を培養することを含み、それによって、前記ヒト化抗α４β７抗体を含む組成物を生産し、
    前記哺乳動物宿主細胞が、ＩｇＧ１であり、配列番号４に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載のＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含み、配列番号８に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載のＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変域を含む、ヒト化抗α４β７抗体を発現するように遺伝子鎖操作されている、前記方法。
  22. 前記組成物が、亜鉛の非存在である同じ条件下で培養された前記ヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、前記ヒト化抗α４β７抗体塩基性アイソフォームの減少した量を含む、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記組成物が、約１６％以下の前記ヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームを含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記組成物が、約１４％以下の前記ヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームを含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記組成物が、約１３％以下の前記ヒト化抗α４β７抗体の塩基性アイソフォームを含む、請求項２３に記載の方法。
  26. 前記生産培地中の前記亜鉛の濃度が２μＭ～６０μＭである、請求項２１～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記方法が、亜鉛を含む供給培地を前記生産培地に添加することによって、前記生産培地に亜鉛を補充することを含む、請求項２１～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記供給培地が、生産段階の約４日目から前記生産培地に添加される、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記生産培地が、５．０～８．８ｇ／Ｌのリジンと、３．０～１２．０ｇ／Ｌのアルギニンとを含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記生産培地が、４．５～５．５ｇ／Ｌのリジンを含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記生産培地が、５．５～８．８ｇ／Ｌのリジンを含む、請求項２９に記載の方法。
  32. 前記生産培地が、５．４～７．４ｇ／Ｌのアルギニンを含む、請求項２９～３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記生産培地が、７．４～１２ｇ／Ｌのアルギニンを含む、請求項２９～３１のいずれか１項に記載の方法。
  34. ヒト化抗α４β７抗体を含む組成物の生産方法であって、前記方法は、
    前記ヒト化抗α４β７抗体を含む組成物が生産されるように、生産段階において生産培地中で哺乳動物宿主細胞を培養することを含み、前記生産培地は摂氏約３７度の平均温度を有し、前記宿主細胞は、ヒト化ＩｇＧ１抗α４β７抗体を発現するように遺伝子操作され、前記ヒト化抗α４β７は、配列番号４に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載のＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含み、配列番号８に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載のＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域を含む、前記方法。
  35. 前記方法が、（ＳＥＣによって決定されるとき）２．５％以下の前記ヒト化抗α４β７抗体のＨＭＷ種を含む組成物の生産方法である、請求項３４に記載の方法。
  36. ヒト化抗α４β７抗体を含む組成物の生産方法であって、前記方法は、
    拡大段階において増殖培地中で哺乳動物宿主細胞を培養することであって、前記哺乳動物宿主細胞がヒト化抗α４β７抗体を発現するように遺伝子操作されている、培養することと、
    前記ヒト化抗α４β７抗体を含む組成物が生産されるように、生産段階において生産培地中で前記哺乳動物宿主細胞を培養することと、を含み、
    前記哺乳動物宿主細胞が、前記拡大段階と前記生産段階の両方でほぼ同じ温度で培養され、
    前記ヒト化抗α４β７抗体が、ＩｇＧ１抗体であり、配列番号４に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載のＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含み、配列番号８に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載のＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変域を含む、前記方法。
  37. 前記方法が、実質的に同様の条件下であるが前記拡大段階と前記生産段階の間で異なる温度で培養される対象培養物と比較して、（ＳＥＣによって決定されるとき）前記ヒト化抗α４β７抗体の高いレベルの単量体を含む組成物の生産方法である、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記温度が摂氏３６～３８度である、請求項３６または３７に記載の方法。
  39. 前記平均温度が摂氏３６．５～３７．５度である、請求項３６～３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記温度が摂氏約３７度の平均温度である、請求項３６または３７に記載の方法。
  41. 前記生産培地が摂氏３６～３８度の範囲の温度を有する、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記温度が摂氏３６．５度～３７．５度の範囲である、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記温度が摂氏約３７度の平均温度である、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記生産培地が６．５～７の範囲のｐＨを有する、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記生産培地が６．８～７．０の範囲のｐＨを有する、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記生産培地が、前記生産段階で約７ｇ／Ｌ以下に維持されるグルコースレベルを有する、請求項１～４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記生産段階が１４日以内である、請求項１～４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記生産段階が１０日～１７日の範囲である、請求項１～４６のいずれか１項に記載の方法。
  49. 大規模なバイオリアクターで実施される、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
  50. 前記大規模なバイオリアクターが、２００リットル（Ｌ）のバイオリアクター、２０００Ｌのバイオリアクター、３０００Ｌ、及び６０００Ｌのバイオリアクターからなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記生産段階が、３ｇ／Ｌを超える前記ヒト化抗α４β７抗体の力価をもたらす、請求項１～５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. 前記ヒト化抗α４β７抗体の力価が、約３～約８ｇ／Ｌである、請求項５１に記載の方法。
  53. 前記ヒト化抗α４β７抗体の力価が、約５～約７ｇ／Ｌである、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記哺乳動物宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１～５３のいずれか１項に記載の方法。
  55. 前記ＣＨＯ細胞がＧＳ－ＣＨＯ細胞である、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記ヒト化抗α４β７抗体が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１～５５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 前記ヒト化抗α４β７抗体がベドリズマブである、請求項１～５５のいずれか１項に記載の方法。
  58. 前記方法が前記抗体の回収及び精製を含む、請求項１～５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. 前記精製が、（ｉ）細胞残屑、望ましくないタンパク質、塩、ミネラル、または他の望ましくない要素を除去する精製ステップと、（ｉｉ）混入汚染物質の可溶性タンパク質及びポリペプチドからの抗体の精製と、を含む、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記方法が、ヒトの治療用途に適した前記精製された抗体の医薬製剤を調製することをさらに含む、請求項５８または５９に記載の方法。
  61. 前記医薬製剤が、液体医薬製剤である、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記液体医薬製剤が、限外濾過／透析濾過によって調製される、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記医薬製剤が凍結乾燥抗体製剤である、請求項６０に記載の方法。
  64. 前記抗体の前記医薬製剤が、前記精製に続いて限外濾過／透析濾過によって調製された液体医薬抗体製剤から凍結乾燥された乾燥抗体製剤である、請求項６３に記載の方法。
  65. 請求項１～６４のいずれか１項に記載の方法を用いて生産されたヒト化抗α４β７抗体を含む組成物。
  66. 請求項１～６４のいずれか１項に記載の方法によって取得可能である、ヒト化抗α４β７抗体を含む組成物。
  67. （ｉ）９０％以上、または（ｉｉ）９２～９５％の総アシアロ、アガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ０Ｆ）、アシアロ、モノガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ１Ｆ）、及び／またはアシアロ、ジガラクト、コアフコシル化二分岐グリカン（Ｇ２Ｆ）の、グリコシル化バリアントを有する、ヒト化抗α４β７抗体の集団を含む、請求項６５または６６の組成物。
  68. 前記方法が、前記補充成分の非存在であるが実質的に同様の条件下で培養された前記ヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、（親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）によって決定されるとき）前記ヒト化抗α４β７抗体のＧ０Ｆ糖型の減少した量を有する組成物の生産方法である、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
  69. 前記組成物が、前記補充成分の非存在である実質的に同様の条件下で培養された前記ヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、少なくとも約１５％減少したレベルの前記ヒト化抗α４β７抗体の前記Ｇ０Ｆ糖型を含む、請求項６８に記載の方法。
  70. 前記組成物が、前記補充成分の非存在の実質的に同様の条件下で培養された前記ヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、前記ヒト化抗α４β７抗体の前記Ｇ０Ｆ糖型の少なくとも約２０％の減少を含む、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記方法が、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約６５％以下の前記ヒト化抗α４β７抗体のＧ０Ｆ糖型を有する組成物の生産方法である、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
  72. 前記組成物が、約６０％以下の前記ヒト化抗α４β７抗体のＧ０Ｆ糖型を含む、請求項７１に記載の方法。
  73. 前記組成物が、約５５％以下の前記ヒト化抗α４β７抗体のＧ０Ｆ糖型を含む、請求項７１に記載の方法。
  74. 前記方法が、前記補充成分の非存在の実質的に同様の条件下で培養された前記ヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）前記ヒト化抗α４β７抗体のＧ１Ｆ糖型の増加した量を有する組成物の生産方法である、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
  75. 前記組成物が、前記対照と比較して、前記ヒト化抗α４β７抗体の前記Ｇ１Ｆ糖型の少なくとも約２倍の増加を含む、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記組成物が、前記対照と比較して、前記ヒト化抗α４β７抗体の前記Ｇ１Ｆ糖型の少なくとも約３倍の増加を含む、請求項７４に記載の方法。
  77. 前記方法が、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約２５％以上の前記ヒト化抗α４β７抗体のＧ１Ｆ糖型を有する組成物の生産方法である、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
  78. 前記組成物が、約３０％以上の前記ヒト化抗α４β７抗体のＧ１Ｆ糖型を含む、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記方法が、前記補充成分の非存在の実質的に同様の条件下で培養された前記ヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞と比較して、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）前記ヒト化抗α４β７抗体のＧ２Ｆ糖型の増加した量を有する組成物の生産方法である、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
  80. 前記組成物が、前記対照と比較して、前記ヒト化抗α４β７抗体の前記Ｇ２Ｆ糖型の少なくとも約３倍の増加を含む、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記組成物が、前記対照と比較して、前記ヒト化抗α４β７抗体の前記Ｇ２Ｆ糖型の少なくとも約４倍の増加を含む、請求項７９に記載の方法。
  82. 前記方法が、（ＨＩＬＩＣによって決定されるとき）約３％以上の前記ヒト化抗α４β７抗体のＧ２Ｆ糖型を有する組成物の生産方法である、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
  83. 前記組成物が、約４％以上の前記ヒト化抗α４β７抗体のＧ２Ｆ糖型を含む、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記方法がさらに、前記補充成分の非存在の実質的に同様の条件下で培養された前記ヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞において生産された酸性種のパーセンテージと比較して、前記ヒト化抗α４β７抗体の酸性種のパーセンテージを減少させる、請求項６８～８３のいずれか１項に記載の方法。
  85. 前記方法がさらに、前記生産培地に添加される、ウリジン、マンガン、及びガラクトースを含む供給培地の非存在の実質的に同様の条件下で培養された前記ヒト化抗α４β７抗体を発現する対照哺乳動物宿主細胞において生産された主要アイソフォーム種のパーセンテージと比較して、前記ヒト化抗α４β７抗体の主要アイソフォーム種のパーセンテージを増加させる、請求項６８～８３のいずれか１項に記載の方法。
  86. 前記方法が流加培養法である、請求項６８～８５のいずれか１項に記載の方法。
  87. 前記供給培地が、生産段階の約４日目から前記生産培地に添加される、請求項６８～８６のいずれか１項に記載の方法。
  88. 前記生産培地が約６．８～約７．１のｐＨを有する、請求項６８～８７のいずれか１項に記載の方法。
  89. 前記方法が抗体の回収及び精製を含む、請求項６８～８８のいずれか１項に記載の方法。
  90. 前記精製が、（ｉ）細胞残屑、望ましくないタンパク質、塩、ミネラル、または他の望ましくない要素を除去する精製ステップと、（ｉｉ）混入汚染物質の可溶性タンパク質及びポリペプチドからの抗体の精製と、を含む、請求項８９に記載の方法。
  91. 前記方法が、ヒトの治療用途に適した前記精製された抗体の医薬製剤を調製することをさらに含む、請求項８９または９０に記載の方法。
  92. 前記医薬製剤が、液体医薬製剤である、請求項９１に記載の方法。
  93. 前記液体医薬製剤が、限外濾過／透析濾過によって調製される、請求項９２に記載の方法。
  94. 前記医薬製剤が凍結乾燥抗体製剤である、請求項９１に記載の方法。
  95. 前記抗体の医薬製剤が、前記精製に続いて限外濾過／透析濾過によって調製された液体医薬抗体製剤から凍結乾燥された乾燥抗体製剤である、請求項９４に記載の方法。
  96. 請求項６８～８８のいずれか１項に記載の方法によって取得可能である、ヒト化抗α４β７抗体を含む組成物。
  97. ヒト化抗α４β７抗体を発現するように遺伝子操作された宿主細胞と、ウリジン、マンガン、及びガラクトース（ＵＭＧ）を補充した生産培地と、を含む細胞培養物であって、前記ヒト化抗α４β７抗体がＩｇＧ１抗体であり、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、前記細胞培養物。
  98. 前記生産培地が、回収日において、約１～約７ｍＭの濃度の補充されたウリジン、約０．００２～約０．０１５ｍＭの濃度の補充されたマンガン、及び約３～約２０ｍＭの濃度の補充されたガラクトースを含む、請求項９７に記載の細胞培養物。
  99. 前記生産培地が亜鉛をさらに含む、請求項９７または９８に記載の細胞培養物。
  100. 前記生産培地が、回収日において約０．００５ｍＭ～０．０４５ｍＭの濃度で補充された亜鉛を含む、請求項９９に記載の細胞培養物。
  101. 前記抗体が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、請求項９７～１００のいずれか１項に記載の細胞培養物。
  102. ヒト化抗α４β７抗体を発現するように遺伝子操作された宿主細胞と、亜鉛を補充した生産培地と、を含む細胞培養物であって、前記ヒト化抗α４β７抗体がＩｇＧ１抗体であり、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、前記細胞培養物。
  103. 前記生産培地が、回収日において約０．００５ｍＭ～０．０４５ｍＭの濃度で補充された亜鉛を含む、請求項１０２に記載の細胞培養物。
  104. 前記生産培地が、ウリジン、マンガン、及びガラクトース（ＵＭＧ）をさらに含む、請求項１０２または１０３に記載の細胞培養物。
  105. 前記生産培地が、回収日において、約１～約７ｍＭの濃度の補充されたウリジン、約０．００２～約０．０１５ｍＭの濃度の補充されたマンガン、及び約３～約２０ｍＭの濃度の補充されたガラクトースを含む、請求項１００に記載の細胞培養物。
  106. 前記生産培地が、回収日において、約２～約５ｍＭの濃度の補充されたウリジン、約０．００１～約０．０１ｍＭの濃度の補充されたマンガン、及び約１０～約１５ｍＭの濃度の補充されたガラクトースを含む、請求項１００に記載の細胞培養物。
  107. 前記発現したヒト化抗α４β７抗体が、
    ａ．１６％以下、１５％以下、１４％以下、１３％以下、または１２％以下の塩基性アイソフォーム；及び／または
    ｂ．少なくとも６５％、少なくとも６８％、少なくとも７０％、少なくとも７２％、または少なくとも７５％の主要アイソフォームを含むアイソフォーム分布を有する、請求項９７～１０６のいずれか１項に記載の細胞培養物。
  108. 前記発現したヒト化抗α４β７抗体が、
    ｃ．６５％以下、６０％以下、または５５％以下のＧ０Ｆ；
    ｄ．２５％以上、２７％以上、または３０％以上のＧ１Ｆ；及び／または
    ｅ．２．５％以上、３％以上、３．５％以上、４％以上、または４．５％以上のＧ２Ｆを含むフコシル化Ｎ－グリカン含量を有する、請求項９７～１０７のいずれか１項に記載の細胞培養物。
  109. 前記発現したヒト化抗α４β７抗体が、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、または少なくとも９５％の、合計フコシル化Ｎ－グリカン（Ｇ０Ｆ＋Ｇ１Ｆ＋Ｇ２Ｆ）の含量を有する、請求項９７～１０８のいずれか１項に記載の細胞培養物。
  110. 前記発現したヒト化抗α４β７抗体が、９２～９５％の合計フコシル化Ｎ－グリカン（Ｇ０Ｆ＋Ｇ１Ｆ＋Ｇ２Ｆ）の含量を有する、請求項９７～１０８のいずれか１項に記載の細胞培養物。
  111. 前記発現したヒト化抗α４β７抗体が、９１～９２％、９１～９２．５％、または９１～９３％の合計フコシル化Ｎ－グリカン（Ｇ０Ｆ＋Ｇ１Ｆ＋Ｇ２Ｆ）の含量を有する、請求項９７～１０８のいずれか１項に記載の細胞培養物。
  112. 前記細胞培養物がアルギニン及び／またはリジンをさらに含む、請求項９７～１１１のいずれか１項に記載の細胞培養物。
  113. 前記宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項９７～１１２のいずれか１項に記載の細胞培養物。
  114. 前記ＣＨＯ細胞が、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）をコードする遺伝子を欠損している、請求項１１３に記載の細胞培養物。
  115. 請求項９７～１１４のいずれか１項に記載の細胞培養物によって生産される、ヒト化抗α４β７抗体。
  116. ヒト化抗α４β７抗体を含む組成物の生産方法であって、前記方法が、
    第１のｐＨを有する第１の生産培地中で前記ヒト化抗α４β７抗体を発現するように遺伝子操作された哺乳動物宿主細胞を培養することと、
    第２のｐＨを有する第２の生産培地中で前記哺乳動物宿主細胞を培養することと、を含み、
    前記第２のｐＨが前記第１のｐＨよりも低く、
    前記ヒト化抗α４β７抗体が、ＩｇＧ１抗体であり、配列番号４に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号３に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号２に記載のＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域を含み、配列番号８に記載のＣＤＲ３ドメイン、配列番号７に記載のＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６に記載のＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変域を含む、前記方法。
  117. 前記第２のｐＨが、前記第１のｐＨよりも０．１～０．５ｐＨ単位低い、請求項１１６に記載の方法。
  118. 前記第１のｐＨがｐＨ６．８～７．２の範囲であり、前記第２のｐＨがｐＨ６．７～６．９５の範囲である、請求項１１６または１１７に記載の方法。
  119. 前記哺乳動物宿主細胞が前記第１のｐＨで１２０時間以内培養される、請求項１１６～１１８のいずれか１項に記載の方法。
  120. 前記哺乳動物宿主細胞が前記第１のｐＨで８５～１１０時間培養される、請求項１１６～１１８のいずれか１項に記載の方法。
  121. 前記哺乳動物宿主細胞が前記第１のｐＨで９０～１００時間培養される、請求項１１６～１１８のいずれか１項に記載の方法。
  122. 前記第２の生産培地から前記抗α４β７抗体を回収することをさらに含む、請求項１１６～１２１のいずれかに１項に記載の方法。
  123. 前記抗α４β７抗体が、１３～１５日の期間の、前記第１の生産培地及び前記第２の生産培地中での前記哺乳動物宿主細胞の培養に続いて回収される、請求項１２２に記載の方法。
  124. 前記組成物が、前記哺乳動物宿主細胞がｐＨシフトせずに前記第１のｐＨで培養された対照組成物と比較して、前記抗α４β７抗体の主要アイソフォームの増加したレベルを有している、請求項１１６～１２３のいずれかに１項に記載の方法。
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