CN117925709A - 用于抗体生产的细胞培养方法和组合物 - Google Patents

用于抗体生产的细胞培养方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于产生抗α4β7抗体(例如维多珠单抗)的细胞培养方法及其组合物。

Description

用于抗体生产的细胞培养方法和组合物
本申请是申请日为2020年6月10日、申请号为202080056112.2、发明名称为“用于抗体生产的细胞培养方法和组合物”的中国发明专利申请的分案申请。
相关申请
本申请要求2019年6月10日提交的美国临时申请号62/859,563和2019年6月10日提交的美国临时申请号62/859,596的优先权。前述优先权申请的全部内容以引用的方式并入本文。
序列表
本申请含有序列表，所述序列表已以ASCII格式经由EFS-Web提交并且特此以引用的方式整体并入。2020年6月10日创建的所述ASCII副本被命名为“T103022_1110WO_SL.TXT”，并且大小为14.0千字节。
发明领域
本发明涉及用于在哺乳动物宿主细胞中产生抗α4β7抗体的方法和组合物。
背景技术
哺乳动物细胞培养技术常用于生产治疗性生物制剂，包括治疗性单克隆抗体。在制药工业中，哺乳动物细胞通常比其他形式的真核细胞(诸如酵母)或原核细胞(诸如细菌)更优选用于蛋白质生产，因为哺乳动物细胞中产生的蛋白质的翻译后修饰与人体产生的蛋白质更类似。然而，哺乳动物细胞培养可能很困难，因为这些细胞存在许多挑战，特别是在以商业规模制造用于人类的治疗性抗体的情形下。生产方法必须使细胞的抗体产量最大化，同时保持蛋白质产品的安全性以及效率和成本效益。因此，生产需求很重要，因为需要保持所期望的产品质量属性诸如糖基化特征、聚集体水平、电荷异质性和氨基酸序列完整性(Li等人,2010,mAbs,2(5):466-477)。
鉴于细胞培养过程的复杂性，可能难以确定可解决与产生治疗性抗体相关联的挑战的细胞培养参数，包括保持高质量的药物产品，同时产生足够的蛋白质产品以满足制造需求和治疗要求。
发明内容
尽管哺乳动物细胞培养过程在过去几十年中一直是研究的主题，但仍然需要改进重组抗体的大规模商业生产。哺乳动物宿主细胞培养的细胞活力、寿命和比生产力的增加，以及所产生的重组蛋白滴度的提高对所产生的重组蛋白的价格有真正的影响，并且在治疗性蛋白的情况下，对药物产品的价格和供应有影响。此外，鉴于需要保持所产生的治疗性抗体质量的一致性，此类增加可能尤其具有挑战性。
本文提供的发明尤其公开了用于在哺乳动物宿主细胞中产生抗α4β7抗体(诸如维多珠单抗(vedolizumab))的细胞培养方法和组合物。本文还提供了包含使用所述方法获得的抗α4β7抗体(诸如维多珠单抗)的组合物。
在一个方面，本发明提供了产生包含人源化抗α4β7抗体的组合物的方法，所述方法包括在生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，以及将包含尿苷、锰和半乳糖的补充剂添加到生产培养基中，从而产生包含人源化抗α4β7抗体的组合物，其中哺乳动物宿主细胞被基因工程改造以表达人源化抗α4β7抗体，所述抗体是IgG1抗体，包含重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:4所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:3所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:2所列示的CDR1结构域；并且包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ IDNO:8所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:7所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:6所列示的CDR1结构域。
在上述方面的一些实施方案中，所述方法是产生人源化抗α4β7抗体的碱性同工型(如通过阳离子交换色谱法(CEX)所测定)的量减少的组合物的方法，所述方法包括所述在生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，以及所述将包含尿苷、锰和半乳糖的补充剂添加到生产培养基中，从而产生与在缺少补充剂的情况下培养的表达人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞相比，人源化抗α4β7抗体的碱性同工型的量减少的组合物。
在上述方面的一些实施方案中，本发明的特征在于一种产生具有约16％或更少的人源化抗α4β7抗体的碱性同工型(如通过CEX所测定)的组合物的方法，所述方法包括所述在生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，以及所述将包含尿苷、锰和半乳糖的补充剂添加到生产培养基中，从而产生具有约16％或更少的人源化抗α4β7抗体的碱性同工型的组合物。
在一个实施方案中，组合物包含约14％或更少的人源化抗α4β7抗体的碱性同工型。
在另一个实施方案中，组合物包含约13％或更少的人源化抗α4β7抗体的碱性同工型。
在一个实施方案中，将补充剂添加到生产培养基中或添加到补料培养基中，补料培养基随后被添加到生产培养基中。
在一个实施方案中，在补充与收获之间在生产培养基中添加的尿苷的累积浓度为约1至约7mM；其中在补充与收获之间在生产培养基中添加的锰的累积浓度为约0.002至约0.015mM；且/或其中在补充与收获之间在生产培养基中添加的半乳糖的累积浓度为约3至约20mM。在某些实施方案中，补料培养基还包含锌。在一种实施方案中，在补充与收获之间在生产培养基中添加的锌的累积浓度为约0.05mM至约0.045mM。
在一个实施方案中，锰作为补充剂多次添加到生产培养基中，每次添加约0.1至10μM、约0.2至1.5μM、约0.2至5μM、约0.25至2μM、约0.3至1.2μM或约0.3至0.8μM。在某些实施方案中，锰作为补充剂多次添加到生产培养基中，每次添加约0.2至1.5μM。
在一个实施方案中，尿苷作为补充剂多次添加到生产培养基中，每次添加约25至1000μM、约75至750μM、约55至620μM、约100至600μM、约150至450μM、约100至700μM、约100至600μM或约170至630μM。在某些实施方案中，尿苷作为补充剂多次添加到生产培养基中，添加量为约100至700μM。
在一个实施方案中，半乳糖作为补充剂添加多次添加到生产培养基中，每次添加约0.1至10mM、0.2至7.5mM、0.5至5mM、0.4至2.8mM、0.5至3.5mM、0.7至2.9mM、0.75至2.5mM或约1.2mM或1.4mM。在某些实施方案中，半乳糖作为补充剂以约0.5至3.5mM多次添加到生产培养基中。
在一个实施方案中，补充剂每天或每两天添加一次。在某些实施方案中，补充剂从生产阶段培养的第4天开始添加。
在一个实施方案中，尿苷添加到补料培养基中至最终浓度为约15至120mM。在一个实施方案中，尿苷添加到补料培养基中至最终浓度为约20至70mM尿苷。在一个实施方案中，尿苷添加到补料培养基中至最终浓度为约1至40mM尿苷。
在一个实施方案中，锰添加到补料培养基中至最终浓度为约0.02至0.3mM。在一个实施方案中，锰添加到补料培养基中至最终浓度为约0.04至0.15mM。在一个实施方案中，锰添加到补料培养基中至最终浓度为约0.0001至0.1mM。
在另一实施方案中，半乳糖添加到补料培养基中至最终浓度为约85mM至600mM。在一个实施方案中，半乳糖添加到补料培养基中至最终浓度为约160至340mM。在一个实施方案中，半乳糖添加到补料培养基中至最终浓度为约50至150mM。
在另一个实施方案中，补料培养基还包含锌。在一个实施方案中，补料培养基中锌的浓度为约90μM至120μM。在一个实施方案中，补料培养基中锌的浓度为约50μM至150μM。
在一个实施方案中，相对于在缺少补充剂的情况下培养的表达人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞中产生的酸性种类的百分比，所述方法还减少了人源化抗α4β7抗体的酸性种类的百分比
在一个实施方案中，相对于在缺少添加到生产培养基中的包含尿苷、锰和半乳糖的补料培养基的情况下产生的主要同工型种类的百分比，所述方法还增加了人源化抗α4β7抗体的主要同工型种类的百分比。
在一个实施方案中，所述方法是补料分批方法。
在一个实施方案中，从生产阶段的约第四天开始将补料培养基添加到生产培养基中。
在另一个方面，本发明提供了一种产生包含人源化抗α4β7抗体的组合物的方法，所述方法包括在包含锌的生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，从而产生包含人源化抗α4β7抗体的组合物，其中哺乳动物宿主细胞被基因工程改造以表达人源化抗α4β7抗体，所述抗体是IgG1抗体；包含重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:4中所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:3所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:2所列示的CDR1结构域；并且包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:8中所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:7所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:6所列示的CDR1结构域。
在上述方面的一些实施方案中，所述方法是产生人源化抗α4β7抗体的碱性同工型(如通过阳离子交换色谱法(CEX)所测定)的量减少的组合物的方法，所述方法包括所述在包含锌的生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，从而产生与在缺少锌的情况下培养的表达人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞相比，人源化抗α4β7抗体的碱性同工型的量减少的组合物。
在上述方面的一些实施方案中，所述方法是产生具有约16％或更少的人源化抗α4β7抗体的碱性同工型(如通过CEX所测定)的组合物的方法，所述方法包括所述在包含锌的生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，从而产生具有约16％或更少的人源化抗α4β7抗体的碱性同工型的组合物。
在一个实施方案中，组合物包含约14％或更少的人源化抗α4β7抗体的碱性同工型。
在一个实施方案中，组合物包含约13％或更少的人源化抗α4β7抗体的碱性同工型。
在一个实施方案中，生产培养基中锌的浓度为2μM至60μM。
在另一实施方案中，所述方法包括通过向生产培养基中添加包含锌的补料培养基来用锌补充生产培养基。在一个实施方案中，从生产阶段的约第四天开始将补料培养基添加到生产培养基中。
在一个实施方案中，补料培养基中锌的浓度为约90μM至120μM。
在一个实施方案中，生产培养基包含5.0至8.8g/L赖氨酸和3.0至12.0g/L精氨酸。在一个实施方案中，生产培养基包含4.5至5.5g/L赖氨酸。在一个实施方案中，生产培养基包含5.5至8.8g/L赖氨酸。在一个实施方案中，生产培养基包含5.4至7.4g/L精氨酸。在一个实施方案中，生产培养基包含7.4至12g/L精氨酸。
在另一个方面，本发明的特征在于一种产生包含人源化抗α4β7抗体的组合物的方法，所述方法包括在生产阶段在生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，使得产生包含人源化抗α4β7抗体的组合物，其中生产培养基具有约37摄氏度的平均温度，其中宿主细胞被基因工程改造以表达人源化IgG1抗α4β7抗体，其中人源化抗α4β7包含重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:4所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:3所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:2所列示的CDR1结构域；并且包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ IDNO:8中所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:7所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:6所列示的CDR1结构域。
在上述方面的一些实施方案中，所述方法是产生包含2.5％或更少的人源化抗α4β7抗体的HMW种类(如通过SEC测定)的组合物的方法，所述方法包括所述在生产阶段在生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，使得产生包含2.5％或更少的人源化抗α4β7抗体的HMW种类(如通过SEC测定)的组合物。
在再一方面，本发明提供了一种产生包含人源化抗α4β7抗体的组合物的方法，所述方法包括在扩增阶段在生长培养基中培养哺乳动物宿主细胞，其中哺乳动物宿主细胞被基因工程改造以表达人源化抗α4β7抗体，以及在生产阶段在生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，使得产生包含人源化抗α4β7抗体的组合物，其中哺乳动物宿主细胞在扩增阶段和生产阶段在大约相同的温度下培养，并且其中人源化抗α4β7抗体是IgG1抗体；包含重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:4中所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:3所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:2所列示的CDR1结构域；并且包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:8中所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:7所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:6所列示的CDR1结构域。
在上述方面的一些实施方案中，所述方法是产生包含高水平的人源化抗α4β7抗体的单体(如通过SEC所测定)的组合物的方法，所述方法包括所述在扩增阶段在生长培养基中培养哺乳动物宿主细胞，其中哺乳动物宿主细胞被基因工程改造以表达人源化抗α4β7抗体，以及所述在生产阶段在生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，适当产生包含高水平的人源化抗α4β7抗体的单体(如通过SEC所测定)的组合物。
在一个实施方案中，温度为36至38摄氏度。在另一个实施方案中，平均温度为36.5至37.5摄氏度。在再一实施方案中，温度为约37摄氏度的平均温度。
在一个实施方案中，本文所公开的方法的生产培养基的温度范围为36至38摄氏度。在一个实施方案中，温度范围为36.5至37.5摄氏度。在一个实施方案中，温度为约37摄氏度的平均温度。在一个实施方案中，生产培养基的pH范围为6.5至7。
在一个实施方案中，本文所公开的方法的生产培养基的pH范围为6.8至7.0。
在一个实施方案中，本文所公开的方法的生产培养基的葡萄糖水平在生产阶段期间保持在约7g/L或更低。
在一个实施方案中，生产阶段为14天或更短。在另一个实施方案中，生产阶段的范围为10天至17天。
在上述方面的一些实施方案中，所述方法在大规模生物反应器中进行。在某些实施方案中，大规模生物反应器选自由200升(L)生物反应器、2000L生物反应器、3000L和6000L生物反应器组成的组。
在一些实施方案中，生产阶段使得人源化抗α4β7抗体的滴度大于3g/L。在某些实施方案中，人源化抗α4β7抗体的滴度为约3至约8g/L。在其他实施方案中，人源化抗α4β7抗体的滴度为约5至约7g/L。
在上述方面的一些实施方案中，哺乳动物宿主细胞是中国仓鼠卵巢(ChineseHamster Ovary)(CHO)细胞。在某些实施方案中，CHO细胞是GS-CHO细胞。
在上述方面的一些实施方案中，人源化抗α4β7抗体包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO:1所列示的氨基酸序列，并且包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含如SEQ ID NO:5所列示的氨基酸序列。
在上述方面的一些实施方案中，人源化抗α4β7抗体是维多珠单抗。
在上述方面的一些实施方案中，所述方法包括抗体的收获和纯化。在一些此类实施方案中，纯化包括(i)去除任何细胞碎片、不需要的蛋白质、盐、矿物质或其他不合需要的元素的纯化步骤，和(ii)从污染物可溶性蛋白质和多肽中纯化抗体。在某些实施方案中，所述方法还包括制备适用于人类治疗用途的纯化抗体的药物制剂。
在特定实施方案中，药物制剂是液体药物制剂。在一些此类实施方案中，液体药物制剂通过超滤/渗滤制备。
在其他实施方案中，药物制剂是冻干的干抗体制剂。在一些此类实施方案中，抗体的药物制剂是从纯化后通过超滤/渗滤制备的液体药物抗体制剂冻干而来的干抗体制剂。
在一些实施方案中，本发明提供了一种产生人源化抗α4β7抗体的G0F糖型(如通过亲水相互作用色谱法(HILIC)所测定)的量减少的组合物的方法，所述方法包括所述在生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，以及所述将包含尿苷、锰和半乳糖的补充剂添加到生产培养基中，从而产生与在缺少补充剂的情况下培养的表达人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞相比，人源化抗α4β7抗体的G0F糖型的量减少的组合物。
在一个实施方案中，与在缺少补充剂的情况下培养的表达人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞相比，所述组合物包含至少约15％减少水平的人源化抗α4β7抗体的G0F糖型。
在一个实施方案中，与在缺少补充剂的情况下培养的表达人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞相比，所述组合物包含至少约20％减少的人源化抗α4β7抗体的G0F糖型。
在一些实施方案中，本发明提供了一种产生具有约65％或更少的人源化抗α4β7抗体的G0F糖型(如通过HILIC所测定)的组合物的方法，所述方法包括所述在生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，以及所述将包含尿苷、锰和半乳糖的补充剂添加到生产培养基中，从而产生具有约65％或更少的人源化抗α4β7抗体的G0F糖型的组合物。
在一个实施方案中，组合物包含约60％或更少的人源化抗α4β7抗体的G0F糖型。
在一个实施方案中，组合物包含约55％或更少的人源化抗α4β7抗体的G0F糖型。
在一些实施方案中，本发明提供了一种产生人源化抗α4β7抗体的G1F糖型(如通过亲水相互作用色谱法(HILIC)所测定)的量增加的组合物的方法，所述方法包括所述在生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，以及所述将包含尿苷、锰和半乳糖的补充剂添加到生产培养基中，从而产生与在缺少补充剂的情况下培养的表达人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞相比，人源化抗α4β7抗体的G1F糖型的量增加的组合物。
在一个实施方案中，与在缺少补充剂的情况下培养的表达人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞相比，所述组合物包含至少约2倍增加的人源化抗α4β7抗体的G1F糖型。
在一个实施方案中，与在缺少补充剂的情况下培养的表达人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞相比，所述组合物包含至少约3倍增加的人源化抗α4β7抗体的G1F糖型。
在一些其他实施方案中，本发明提供了一种产生具有约25％或更多的人源化抗α4β7抗体的G1F糖型(如通过HILIC所测定)的组合物的方法，所述方法包括所述在生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，以及所述将包含尿苷、锰和半乳糖的补充剂添加到生产培养基中，从而产生具有约25％或更多的人源化抗α4β7抗体的G1F糖型的组合物。
在一个实施方案中，组合物包含约30％或更多的人源化抗α4β7抗体的G1F糖型。
在一些实施方案中，本发明提供了一种产生人源化抗α4β7抗体的G2F糖型(如通过亲水相互作用色谱法(HILIC)所测定)的量增加的组合物的方法，所述方法包括所述在生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，以及所述将包含尿苷、锰和半乳糖的补充剂添加到生产培养基中，从而产生与在缺少补充剂的情况下培养的表达人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞相比，人源化抗α4β7抗体的G2F糖型的量增加的组合物。
在一个实施方案中，与在缺少补充剂的情况下培养的表达人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞相比，所述组合物包含至少约3倍增加的人源化抗α4β7抗体的G2F糖型。
在一个实施方案中，与在缺少补充剂的情况下培养的表达人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞相比，所述组合物包含至少约4倍增加的人源化抗α4β7抗体的G2F糖型。
在一些实施方案中，本发明提供了一种产生具有约3％或更多的人源化抗α4β7抗体的G2F糖型(如通过HILIC所测定)的组合物的方法，所述方法包括所述在生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，以及所述将包含尿苷、锰和半乳糖的补充剂添加到生产培养基中，从而产生具有约3％或更多的人源化抗α4β7抗体6的G2F糖型的组合物。
在一个实施方案中，组合物包含约4％或更多的人源化抗α4β7抗体的G2F糖型。
在一个实施方案中，将补充剂添加到生产培养基中或添加到补料培养基中，补料培养基随后被添加到生产培养基中。
在一个实施方案中，补料培养基包含约15至100mM尿苷。在一个实施方案中，补料培养基包含约20至50mM尿苷。在一个实施方案中，补料培养基包含约1至40mM尿苷。
在一个实施方案中，补料培养基包含约0.02至0.3mM锰。在一个实施方案中，补料培养基包含约0.02至0.1mM锰。在一个实施方案中，补料培养基包含约0.001至0.1mM锰。
在一个实施方案中，补料培养基包含85mM至600mM半乳糖。在一个实施方案中，补料培养基包含85mM至100mM半乳糖。在一个实施方案中，补料培养基包含50mM至150mM半乳糖。
在又一实施方案中，生产培养基还包含锌。在一个实施方案中，补料培养基中锌的浓度为约50μM至150μM。
在一个实施方案中，相对于在缺少补充剂的情况下培养的表达人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞中产生的酸性种类的百分比，所述方法还减少了人源化抗α4β7抗体的酸性种类的百分比。
在一个实施方案中，相对于在缺少添加到生产培养基中的包含尿苷、锰和半乳糖的补料培养基的情况下产生的主要同工型种类的百分比，所述方法还增加了人源化抗α4β7抗体的主要同工型种类的百分比。
在一个实施方案中，所述方法是补料分批方法。
在一个实施方案中，从生产阶段的约第四天开始将补料培养基添加到生产培养基中。在一个实施方案中，从生产阶段的约第4天开始，每天将补料培养基添加到生产培养基中。
在一个实施方案中，本文所公开的方法在大规模生物反应器中进行。在一个实施方案中，大规模生物反应器选自由200升(L)生物反应器、2000L生物反应器、3000L和6000L生物反应器组成的组。
在一个实施方案中，生产阶段使得人源化抗α4β7抗体的滴度大于3g/L。在一个实施方案中，人源化抗α4β7抗体的滴度为约3至约8g/L。在一个实施方案中，人源化抗α4β7抗体的滴度为约5至约7g/L。
在一个实施方案中，哺乳动物宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一个实施方案中，CHO细胞是GS-CHO细胞。
在一个实施方案中，生产培养基的pH为约6.8至约7.1。
在一个实施方案中，人源化抗α4β7抗体包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO:1所列示的氨基酸序列，并且包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含如SEQ ID NO:5所列示的氨基酸序列。
在一个实施方案中，抗α4β7抗体是维多珠单抗。
在一些实施方案中，所述方法包括抗体的收获和纯化。在一些此类实施方案中，纯化包括(i)去除任何细胞碎片、不需要的蛋白质、盐、矿物质或其他不合需要的元素的纯化步骤，和(ii)从污染物可溶性蛋白质和多肽中纯化抗体。在某些实施方案中，所述方法还包括制备适用于人类治疗用途的纯化抗体的药物制剂。
在特定实施方案中，药物制剂是液体药物制剂。在一些此类实施方案中，液体药物制剂通过超滤/渗滤制备。
在其他实施方案中，药物制剂是冻干的干抗体制剂。在一些此类实施方案中，抗体的药物制剂是从纯化后通过超滤/渗滤制备的液体药物抗体制剂冻干而来的干抗体制剂。
在另一个方面，本文提供了一种细胞培养物，其包含被基因工程改造以表达人源化抗α4β7抗体的宿主细胞，以及补充有尿苷、锰和半乳糖(UMG)的生产培养基，其中所述人源化抗α4β7抗体是IgG1抗体并且包含含有SEQ ID NO:1中所列示的氨基酸序列的重链可变区和含有SEQ ID NO:5中所列示的氨基酸序列的轻链可变区。
在上述方面的一些实施方案中，生产培养基包含浓度为约15-100mM的尿苷、浓度为约20-200nM的锰和浓度为约85-500mM的半乳糖。
在上述方面的一些实施方案中，生产培养基包含在收获当天浓度为约1-7mM的补充尿苷、浓度为约2-15μM的补充锰和浓度为约3-20mM的补充半乳糖。在一些实施方案中，生产培养基还包含在收获当天浓度为约5-45μM的补充锌。
在上述方面的一些实施方案中，在收获当天，生产培养基包含浓度为约1-7mM的尿苷、浓度为约2-15μM的锰和浓度为约3-20mM的半乳糖。在一些实施方案中，在收获当天，生产培养基还包含浓度为约5-45μM的锌。
在某些实施方案中，所表达的人源化抗α4β7抗体的同工型分布包括(a)16％或更少、15％或更少、14％或更少、13％或更少、或12％或更少的碱性同工型；和/或(b)至少65％、至少68％、至少70％、至少72％或至少75％的主要同工型。
在其他实施方案中，所表达的人源化抗α4β7抗体的岩藻糖基化N-聚糖含量包括(a)65％或更少、60％或更少、或55％或更少的G0F；(b)25％或更多、27％或更多、或30％或更多的G1F；和/或(c)2.5％或更多、3％或更多、3.5％或更多、4％或更多、或4.5％或更多的G2F。
在上述方面的一些实施方案中，所表达的人源化抗α4β7抗体的总岩藻糖基化N-聚糖含量(G0F+G1F+G2F)为至少92％、至少93％、至少94％或至少95％。
在其他实施方案中，所表达的人源化抗α4β7抗体的总岩藻糖基化N-聚糖含量(G0F+G1F+G2F)为92％-95％。
在替代实施方案中，所表达的人源化抗α4β7抗体的总岩藻糖基化N-聚糖含量(G0F+G1F+G2F)为91％-92％、91％-92.5％或91％-93％。
在上述方面的一些实施方案中，细胞培养物还包含锌。在其他实施方案中，细胞培养物还包含精氨酸和/或赖氨酸。
在上述方面的一些实施方案中，宿主细胞是CHO细胞。在某些实施方案中，CHO细胞的编码谷氨酰胺合成酶(GS)的基因有缺陷。
在另一个方面，本公开提供了由上文所述的细胞培养物产生的人源化抗α4β7抗体。
在又一方面，本公开提供了包含人源化抗α4β7抗体的组合物，所述方法包括在具有第一pH的第一生产培养基中培养被基因工程改造以表达人源化抗α4β7抗体的哺乳动物宿主细胞；以及在具有第二pH的第二生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞；其中第二pH低于第一pH，并且其中人源化抗α4β7抗体是IgG1抗体；包含重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:4所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:3所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:2所列示的CDR1结构域；并且包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:8中所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:7所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:6所列示的CDR1结构域。
在上述方面的一些实施方案中，第二pH比第一pH低0.1至0.5个pH单位。在某些实施方案中，第一pH在pH 6.8-7.2的范围内，并且第二pH在pH 6.7-6.95的范围内。
在一些实施方案中，哺乳动物宿主细胞在第一pH下培养120小时或更短时间。在某些实施方案中，哺乳动物宿主细胞在第一pH下培养85-110小时。在其他实施方案中，哺乳动物宿主细胞在第一pH下培养90-100小时。
在一些实施方案中，所述方法还包括从第二生产培养基中收获抗α4β7抗体。在某些实施方案中，将哺乳动物宿主细胞在第一生产培养基和第二生产培养基中培养13-15天的时间段后收获抗α4β7抗体。
在一些实施方案中，相对于其中哺乳动物宿主细胞在第一pH下培养且没有pH变化的对照组合物，所述组合物具有增加水平的抗α4β7抗体的主要同工型。
在另一方面，本发明包括一种组合物，其包含使用本文所公开方法中的任一种产生的人源化抗α4β7抗体。在一个实施方案中，本文公开的方法提供了人源化抗α4β7抗体的群体，其具有92％或更多的总去唾液酸、无半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G0F)，去唾液酸、单半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G1F)，和/或去唾液酸、二半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G2F)糖基化变体。
另外，本发明还包括以下实施方案：
1.一种产生人源化抗α4β7抗体的碱性同工型(如通过阳离子交换色谱法(CEX)所测定)的量减少的组合物的方法，所述方法包括
在生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，以及
向生产培养基中添加包含尿苷、锰和半乳糖的补充剂，从而产生与在缺少补充剂的情况下培养的表达人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞相比，人源化抗α4β7抗体的碱性同工型的量减少的组合物，
其中所述哺乳动物宿主细胞被基因工程改造以表达人源化抗α4β7抗体，所述抗体是IgG1抗体；包含重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:4所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:3所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:2所列示的CDR1结构域；并且包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:8所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:7所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:6所列示的CDR1结构域。
2.一种产生具有约16％或更少的人源化抗α4β7抗体的碱性同工型(如通过CEX所测定)的组合物的方法，所述方法包括
在生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，以及
向生产培养基中添加包含尿苷、锰和半乳糖的补充剂，从而产生具有约16％或更少的人源化抗α4β7抗体的碱性同工型的组合物，
其中所述哺乳动物宿主细胞被基因工程改造以表达人源化抗α4β7抗体，所述抗体是IgG1抗体，包含重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:4所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:3所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:2所列示的CDR1结构域；并且包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:8中所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:7所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:6所列示的CDR1结构域。
3.如项目2所述的方法，其中所述组合物包含约14％或更少的所述人源化抗α4β7抗体的碱性同工型。
4.如项目2所述的方法，其中所述组合物包含约13％或更少的所述人源化抗α4β7抗体的碱性同工型。
5.如项目1至4中任一项所述的方法，其中将所述补充剂添加到所述生产培养基中或添加到补料培养基中，所述补料培养基随后被添加到所述生产培养基中。
6.如项目5的所述方法，其中尿苷添加到所述补料培养基中至最终浓度为约15至120mM。
7.如项目6所述的方法，其中所述尿苷添加到所述补料培养基中至最终浓度为约20至70mM尿苷。
8.如项目5的所述方法，其中锰添加到所述补料培养基中至最终浓度为约0.02至0.3mM。
9.如项目8的所述方法，其中锰添加到所述补料培养基中至最终浓度为约0.04至0.15mM。
10.如项目5的所述方法，其中半乳糖添加到所述补料培养基中至最终浓度为约85mM至600mM。
11.如项目10的所述方法，其中半乳糖添加到所述补料培养基中至最终浓度为约160mM至340mM。
12.如项目1-11中任一项所述的方法，其中所述补料培养基还包含锌。
13.如项目12所述的方法，其中所述补料培养基中锌的浓度为约90μM至120μM。
14.如项目1-13中任一项所述的方法，其中相对于在缺少所述补充剂的情况下培养的表达所述人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞中产生的酸性种类的百分比，所述方法还减少了所述人源化抗α4β7抗体的酸性种类的百分比
15.如项目1-14中任一项所述的方法，其中相对于在缺少添加到所述生产培养基中的包含尿苷、锰和半乳糖的补料培养基的情况下产生的主要同工型种类的百分比，所述方法还增加了所述人源化抗α4β7抗体的主要同工型种类的百分比。
16.如项目1-15中任一项所述的方法，其中所述方法是补料分批方法。
17.如项目16所述的方法，其中从生产阶段的约第四天开始将所述补料培养基添加到所述生产培养基中。
18.一种产生人源化抗α4β7抗体的碱性同工型(如通过阳离子交换色谱法(CEX)所测定)的量减少的组合物的方法，所述方法包括在包含锌的生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，从而产生与在缺少锌的情况下培养的表达所述人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞相比，所述人源化抗α4β7抗体的碱性同工型的量减少的组合物，
其中所述哺乳动物宿主细胞被基因工程改造以表达人源化抗α4β7抗体，所述抗体是IgG1抗体；包含重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:4所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:3所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:2所列示的CDR1结构域；并且包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:8所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:7所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:6所列示的CDR1结构域。
19.一种产生具有约16％或更少的人源化抗α4β7抗体的碱性同工型(如通过CEX所测定)的组合物的方法，所述方法包括在包含锌的生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，从而产生具有约16％或更少的所述人源化抗α4β7抗体的碱性同工型的组合物，
其中所述哺乳动物宿主细胞被基因工程改造以表达人源化抗α4β7抗体，所述抗体是IgG1抗体，包含重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:4所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:3所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:2所列示的CDR1结构域；并且包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:8中所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:7所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:6所列示的CDR1结构域。
20.如项目19所述的方法，其中所述组合物包含约14％或更少的所述人源化抗α4β7抗体的碱性同工型。
21.如项目19所述的方法，其中所述组合物包含约13％或更少的所述人源化抗α4β7抗体的碱性同工型。
22.如项目18至21中任一项所述的方法，其中所述生产培养基中锌的浓度为2μM至60μM。
23.如项目18至22中任一项所述的方法，其中所述方法包括通过向所述生产培养基中添加包含锌的补料培养基来用锌补充所述生产培养基。
24.如项目23所述的方法，其中从生产阶段的约第四天开始将所述补料培养基添加到所述生产培养基中。
25.如项目24所述的方法，其中所述补料培养基中锌的浓度为约90μM至120μM。
26.如项目1-25中任一项所述的方法，其中所述生产培养基包含5.0至8.8g/L赖氨酸和3.0至12.0g/L精氨酸。
27.如项目26所述的方法，其中所述生产培养基包含4.5至5.5g/L赖氨酸。
28.如项目26所述的方法，其中所述生产培养基包含5.5至8.8g/L赖氨酸。
29.如项目26所述的方法，其中所述生产培养基包含5.4至7.4g/L精氨酸。
30.如项目26所述的方法，其中所述生产培养基包含7.4至12g/L精氨酸。
31.一种产生包含2.5％或更少的人源化抗α4β7抗体的HMW种类(如通过SEC所测定)的组合物的方法，所述方法包括
在生产阶段在生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，使得产生包含2.5％或更少的人源化抗α4β7抗体的HMW种类(如通过SEC所测定)的组合物，
其中所述生产培养基具有约37摄氏度的平均温度，其中所述宿主细胞被基因工程改造以表达人源化IgG1抗α4β7
抗体，其中所述人源化抗α4β7包含重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ IDNO:4所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:3所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:2所列示的CDR1结构域；并且包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:8中所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:7所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:6所列示的CDR1结构域。
32.一种产生包含高水平的人源化抗α4β7抗体的单体(如通过SEC所测定)的组合物的方法，所述方法包括
在扩增阶段在生长培养基中培养哺乳动物宿主细胞，其中所述哺乳动物宿主细胞被基因工程改造以表达人源化抗α4β7抗体，以及
在生产阶段在生产培养基中培养所述哺乳动物宿主细胞，使得产生包含高水平的所述人源化抗α4β7抗体的单体(如通过SEC所测定)的组合物。
其中所述哺乳动物宿主细胞在所述扩增阶段和所述生产阶段在大约相同的温度下培养，并且
其中所述人源化抗α4β7抗体是IgG1抗体；包含重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:4所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:3所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:2所列示的CDR1结构域；并且包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:8中所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:7所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:6所列示的CDR1结构域。
33.如项目31或32所述的方法，其中所述温度为36至38摄氏度。
34.如项目31或32所述的方法，其中所述平均温度为36.5至37.5摄氏度。
35.如项目31或32所述的方法，其中所述温度为约37摄氏度的平均温度。
36.如项目1-35中任一项所述的方法，其中所述生产培养基的温度范围为36至38摄氏度。
37.如项目36所述的方法，其中所述温度范围为36.5至37.5摄氏度。
38.如项目36所述的方法，其中所述温度为约37摄氏度的平均温度。
39.如项目1-38中任一项所述的方法，其中所述生产培养基的pH范围为6.5至7。
40.如项目39所述的方法，其中所述生产培养基的pH范围为6.8至7.0。
41.如项目1-40中任一项所述的方法，其中所述生产培养基的葡萄糖水平在所述生产阶段期间保持在约7g/L或更低。
42.如项目1-41中任一项所述的方法，其中所述生产阶段为14天或更短。
43.如项目1-42中任一项所述的方法，其中所述生产阶段的范围为10天至17天。
44.如项目1-43中任一项所述的方法，其在大规模生物反应器中进行。
45.如项目44所述的方法，其中所述大规模生物反应器选自由200升(L)生物反应器、2000L生物反应器、3000L和6000L生物反应器组成的组。
46.如项目1-45中任一项所述的方法，其中所述生产阶段产生的所述人源化抗α4β7抗体的滴度大于3g/L。
47.如项目46所述的方法，其中所述人源化抗α4β7抗体的滴度为约3至约8g/L。
48.如项目46所述的方法，其中所述人源化抗α4β7抗体的滴度为约5至约7g/L。
49.如项目1-48中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
50.如项目49所述的方法，其中所述CHO细胞是GS-CHO细胞。
51.如项目1-50中任一项所述的方法，其中所述人源化抗α4β7抗体包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO:1所列示的氨基酸序列，并且包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含如SEQ ID NO:5所列示的氨基酸序列。
52.如项目1-50中任一项所述的方法，其中所述人源化抗α4β7抗体是维多珠单抗。
53.一种组合物，其包含使用项目1-52中任一项所述的方法产生的人源化抗α4β7抗体。
54.如项目53所述的组合物，其包含人源化抗α4β7抗体的群体，所述群体具有92％或更多的总去唾液酸、无半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G0F)，去唾液酸、单半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G1F)，和/或去唾液酸、二半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G2F)糖基化变体。
55.一种产生人源化抗α4β7抗体的G0F糖型(如通过亲水相互作用色谱法(HILIC)所测定)的量减少的组合物的方法，所述方法包括
在生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，以及
向所述生产培养基中添加包含尿苷、锰和半乳糖的补充剂，从而产生与在缺少所述补充剂的情况下培养的表达所述人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞相比，所述人源化抗α4β7抗体的G0F糖型的量减少的组合物，
其中所述哺乳动物宿主细胞被基因工程改造以表达人源化抗α4β7抗体，所述抗体是IgG1抗体；包含重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:4所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:3所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:2所列示的CDR1结构域；并且包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:8所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:7所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:6所列示的CDR1结构域。
56.如项目55所述的方法，其中与在缺少所述补充剂的情况下培养的表达所述人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞相比，所述组合物包含至少约15％减少水平的所述人源化抗α4β7抗体的G0F糖型。
57.如项目55所述的方法，其中与在缺少所述补充剂的情况下培养的表达所述人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞相比，所述组合物包含至少约20％减少的所述人源化抗α4β7抗体的G0F糖型。
58.一种产生具有约65％或更少的人源化抗α4β7抗体的G0F糖型(如通过HILIC所测定)的组合物的方法，所述方法包括
在生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，以及
向所述生产培养基中添加包含尿苷、锰和半乳糖的补充剂，从而产生具有约65％或更少的所述人源化抗α4β7抗体的G0F糖型的组合物，
其中所述哺乳动物宿主细胞被基因工程改造以表达人源化抗α4β7抗体，所述抗体是IgG1抗体，包含重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:4所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:3所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:2所列示的CDR1结构域；并且包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:8中所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:7所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:6所列示的CDR1结构域。
59.如项目58所述的方法，其中所述组合物包含约60％或更少的所述人源化抗α4β7抗体的G0F糖型。
60.如项目58所述的方法，其中所述组合物包含约55％或更少的所述人源化抗α4β7抗体的G0F糖型。
61.一种产生人源化抗α4β7抗体的G1F糖型(如通过HILIC所测定)的量增加的组合物的方法，所述方法包括
在生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，以及
向所述生产培养基中添加包含尿苷、锰和半乳糖的补充剂，从而产生与在缺少所述补充剂的情况下培养的表达所述人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞相比，所述人源化抗α4β7抗体的G1F糖型的量增加的组合物，
其中所述哺乳动物宿主细胞被基因工程改造以表达人源化抗α4β7抗体，所述抗体是IgG1抗体；包含重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:4所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:3所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:2所列示的CDR1结构域；并且包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:8所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:7所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:6所列示的CDR1结构域。
62.如项目61所述的方法，其中与在缺少所述补充剂的情况下培养的表达所述人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞相比，所述组合物包含至少约2倍增加的所述人源化抗α4β7抗体的G1F糖型。
63.如项目61所述的方法，其中与在缺少所述补充剂的情况下培养的表达所述人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞相比，所述组合物包含至少约3倍增加的所述人源化抗α4β7抗体的G1F糖型。
64.一种产生具有约25％或更多的人源化抗α4β7抗体的G1F糖型(如通过HILIC所测定)的组合物的方法，所述方法包括
在生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，以及
向所述生产培养基中添加包含尿苷、锰和半乳糖的补充剂，从而产生具有约25％或更多的所述人源化抗α4β7抗体的G1F糖型的组合物，
其中所述哺乳动物宿主细胞被基因工程改造以表达人源化抗α4β7抗体，所述抗体是IgG1抗体，包含重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:4所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:3所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:2所列示的CDR1结构域；并且包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:8中所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:7所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:6所列示的CDR1结构域。
65.如项目64所述的方法，其中所述组合物包含约30％或更多的所述人源化抗α4β7抗体的G1F糖型。
66.一种产生人源化抗α4β7抗体的G2F糖型(如通过HILIC所测定)的量增加的组合物的方法，所述方法包括
在生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，以及
向所述生产培养基中添加包含尿苷、锰和半乳糖的补充剂，从而产生与在缺少所述补充剂的情况下培养的表达所述人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞相比，所述人源化抗α4β7抗体的G2F糖型的量增加的组合物，
其中所述哺乳动物宿主细胞被基因工程改造以表达人源化抗α4β7抗体，所述抗体是IgG1抗体；包含重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:4所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:3所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:2所列示的CDR1结构域；并且包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:8所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:7所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:6所列示的CDR1结构域。
67.如项目66所述的方法，其中与在缺少所述补充剂的情况下培养的表达所述人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞相比，所述组合物包含至少约3倍增加的所述人源化抗α4β7抗体的G2F糖型。
68.如项目66所述的方法，其中与在缺少所述补充剂的情况下培养的表达所述人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞相比，所述组合物包含至少约4倍增加的所述人源化抗α4β7抗体的G2F糖型。
69.一种产生具有约3％或更多的人源化抗α4β7抗体的G2F糖型(如通过HILIC所测定)的组合物的方法，所述方法包括
在生产培养基中培养哺乳动物宿主细胞，以及
向所述生产培养基中添加包含尿苷、锰和半乳糖的补充剂，从而产生具有约3％或更多的所述人源化抗α4β7抗体的G2F糖型的组合物，
其中所述哺乳动物宿主细胞被基因工程改造以表达人源化抗α4β7抗体，所述抗体是IgG1抗体，包含重链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO:4所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:3所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:2所列示的CDR1结构域；并且包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:8中所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:7所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:6所列示的CDR1结构域。
70.如项目69所述的方法，其中所述组合物包含约4％或更多的所述人源化抗α4β7抗体的G2F糖型。
71.如项目55-70中任一项所述的方法，其中将所述补充剂添加到所述生产培养基中或添加到补料培养基中，所述补料培养基随后被添加到所述生产培养基中。
72.如项目71所述的方法，其中所述补料培养基包含约15至100mM尿苷。
73.如项目72所述的方法，其中所述补料培养基包含约20至50mM尿苷。
74.如项目71所述的方法，其中所述补料培养基包含约0.02至0.3mM锰。
75.如项目74所述的方法，其中所述补料培养基包含约0.02至0.1mM锰。
76.如项目71所述的方法，其中所述补料培养基包含约85mM-600mM半乳糖。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述补料培养基包含约85mM-100mM半乳糖。
78.如项目55-77中任一项所述的方法，其中所述生产培养基还包含锌。
79.如项目78所述的方法，其中所述生产培养基中锌的浓度为约50μM至150μM。
80.如项目55-79中任一项所述的方法，其中相对于在缺少所述补充剂的情况下培养的表达所述人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞中产生的酸性种类的百分比，所述方法还减少了所述人源化抗α4β7抗体的酸性种类的百分比
81.如项目55-80中任一项所述的方法，其中相对于在缺少添加到所述生产培养基中的包含尿苷、锰和半乳糖的补料培养基的情况下产生的主要同工型种类的百分比，所述方法还增加了所述人源化抗α4β7抗体的主要同工型种类的百分比。
82.如项目55-81中任一项所述的方法，其中所述方法是补料分批方法。
83.如项目82所述的方法，其中从生产阶段的约第四天开始将所述补料培养基添加到所述生产培养基中。
84.如项目1-83中任一项所述的方法，其中所述生产培养基具有约6.8至约7.1的pH。
附图说明
图1.提供了基于测试各种培养条件的实验的预测分析器的结果，所述培养条件包括生产细胞培养物的pH、温度、半乳糖Gal+添加、UMG添加和补料策略条件。
图2A至图2H以图形描绘了比较尿苷、半乳糖和锰(UMG)补充(33xUMG、50xUMG和66xUMG)和pH(pH 7.05相对于pH 6.85)对抗体滴度(图2A)、酸性种类(图2B)、碱性种类(图2C)、主要种类的百分比(图2D)、G0F种类的百分比(图2E)、G1F种类的百分比(图2F)、G2F种类的百分比(图2G)和聚糖种类总和(图2H)的影响的结果。示出了没有UMG补充的情况下的结果(如“+”符号所指示)以供比较。
图3A和图3B以图形描绘了比较不同精氨酸和赖氨酸浓度对碱性种类的百分比(图3A)和抗体滴度(图3B)的影响的结果。X轴上的标记对应于高(H)、中等(M)或低(L)浓度的赖氨酸和精氨酸，如表5所示。
图4A至图4C.由不同赖氨酸和精氨酸水平的培养条件的JMP分析产生的最大合意性预测结果(低赖氨酸和低精氨酸(LL)–图4A；低赖氨酸和中等精氨酸(LM)–图4B；低赖氨酸和高精氨酸(LH)–图4C)。表5示出了对应于高(H)、中(M)或低(L)浓度的赖氨酸和精氨酸的浓度。
图5A至图5H以图形描绘了在14、15、16、17和18天培养后比较锌对抗体滴度(图5A)、碱性种类的百分比(图5B)、酸性种类的百分比(图5C)、主要种类的百分比(图5D)、G0F种类的百分比(图5E)、G1F种类的百分比(图5F)、G2F种类的百分比(图5G)和聚糖种类总和(图5H)的影响的时间进程数据。x轴上的数字对应于表6中示出的锌浓度。
图6A至图6E以图形描绘了比较锌、培养天数和温度(33℃、35℃和37℃)对碱性种类的百分比(图6A)、聚糖种类总和(图6B)、聚集体(高分子量(HMW))形成(图6C)、滴度(图6D)和酸性同工型(图6E)的影响的时间进程数据。图6A、图6C和图6E中的黑色实线代表每个属性的较高工艺标准，而图6B中的黑色实线代表较低验收标准。x轴上的数字对应于表6中示出的锌浓度。
图7A至图7D以图形描绘了比较来自两组实验的维多珠单抗培养天数对酸性种类的百分比(图7A)、碱性种类的百分比(图7B)、主要种类的百分比(图7C)和抗体滴度(图7D)的影响的时间进程数据。图7A至图7D中的运行2由空心圆圈表示，而运行1数据点由实心圆圈表示。
图8A至图8B以图形描绘了同工型分布与pH变化参数之间的相关性。图8A描绘了最终细胞培养物pH(在pH变化之后)与％酸性同工型种类(左图)或％主要同工型(右图)之间的相关性。图8B描绘了pH变化持续时间与％酸性同工型种类(左图)或％主要同工型(右图)之间的相关性。
图9描绘了可存在于抗α4β7抗体(诸如维多珠单抗)的群体中的N-聚糖的结构。图中提供了聚糖的图示。
具体实施方式
I.定义
为了更容易的理解本发明，首先定义某些术语。
细胞表面分子“α4β7整合素”或“α4β7”(通篇可互换使用)是α4链(CD49D、ITGA4)和β7链(ITGB7)的异源二聚体。人α4-整合素和β7-整合素基因(GenBank(National Centerfor Biotechnology Information,Bethesda,Md.)参考序列登录号分别为NM_000885和NM_000889)由B和T淋巴细胞，特别是记忆CD4+淋巴细胞表达。作为许多整合素的典型，α4β7可以静息或激活状态存在。α4β7的配体包括血管细胞粘附分子(VCAM)、纤连蛋白和粘膜寻址素(MAdCAM(例如，MAdCAM-1))。结合α4β7整合素的抗体在本文中被称为“抗α4β7抗体”。
如本文所用，具有“对α4β7复合物的结合特异性”的抗体或其抗原结合片段与α4β7结合，但不与α4β1或αEB7结合。维多珠单抗是对α4β7复合物具有结合特异性的抗体的一个实例。
术语“约”表示其后面跟随的值不是精确值而是所述值的+/-5％范围的中心点。如果所述值是以百分比给出的相对值，则术语“约”还表示其后面跟随的值不是精确值而是所述值的+/-5％范围的中心点，因此范围的上限不能超过值的100％。
如本文所用，术语“聚集体(aggregate)”或“聚集体(aggregates)”是指两个或更多个抗体或抗体片段的缔合。例如，聚集体可以是抗体和/或抗体片段的二聚体、三聚体、四聚体或大于四聚体的多聚体。抗体聚集体可以是可溶的或不可溶的。聚集分子之间的缔合可以是共价的或非共价的，而与它们缔合的机制无关。所述缔合可以是聚集分子之间的直接缔合，或通过将其连接在一起的其他分子的间接缔合。后者的实例包括但不限于与其他蛋白质的二硫键、与脂质的疏水缔合、与DNA的电荷缔合、与浸出的蛋白A的亲和缔合或与多种组分的混合模式缔合。在细胞培养中的蛋白质表达过程中、下游加工中的蛋白质纯化过程中或药物产品的储存过程中会不可逆地形成聚集体。溶液中聚集体的存在可使用例如尺寸排阻色谱法(SEC)(例如，带有UV检测器的SEC、带有光散射检测器的SEC(SEC-LSD))、场流分级分离法、分析超速离心沉降速率技术或十二烷基硫酸钠-毛细管电泳(CE-SDS，还原和非还原)来确定。
如本文所用，术语“抗体”意图指代由通过二硫键互连的四条多肽链、两条重(H)链和两条轻(L)链构成的免疫球蛋白分子。每条重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区(CH)构成。重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2和CH3)构成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域(CL)构成。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其散布于更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在一些实施方案中，抗体具有片段可结晶(Fc)区。在某些实施方案中，抗体是IgG1同种型并且具有κ轻链。
如本文所用，术语“带电种类”、“带电同工型”或“带电同工型种类”是指抗体或其抗原结合部分(例如维多珠单抗或其抗原结合部分)的变体，其特征在于与抗体或其抗原结合部分的主要种类不同的总体电荷，抗体或其抗原结合部分的带电同工型种类可通过本领域已知的各种方法(诸如阳离子交换色谱法(CEX)，例如阳离子交换-高效液相色谱法(CEX-HPLC)、CEX-质谱法或等电聚焦)进行检测。例如，一般而言，当使用CEX、CEX-HPLC或CEX-质谱法解析抗体制品时，大部分抗体从CEX树脂中洗脱，其中保留时间是所述抗体的优势(主要)同工型的特性。这可通过绘制从树脂中洗脱的抗体量作为CEX树脂上的保留时间的函数来实现可视化。当以这种方式可视化时，抗体或其抗原结合部分的主要同工型是抗体或其抗原结合部分从CEX树脂洗脱的最大峰内的级分。使用这种方法，带电同工型种类可通过具有与主要同工型的保留时间不同的保留时间来鉴定。例如，当通过CEX、CEX-HPLC或CEX-质谱法检测带电同工型种类时，酸性同工型种类可以比抗体或其抗原结合部分的主要同工型更短的保留时间从树脂中洗脱，并且碱性同工型种类可以比抗体或其抗原结合部分的主要同工型更长的保留时间从树脂中洗脱。
如本文所用，术语“酸性种类”或“酸性同工型种类”是指抗体或其抗原结合部分(例如维多珠单抗或其抗原结合部分)的变体，其特征在于总体酸性电荷。抗体或其抗原结合部分的酸性种类可通过本领域已知的各种方法(诸如阳离子交换色谱法(CEX)，例如阳离子交换-高效液相色谱法(CEX-HPLC)、CEX-质谱法或等电聚焦)进行检测。通常，抗体或其抗原结合部分的酸性种类以比抗体或其抗原结合部分的主要同工型更短的保留时间从CEX树脂中洗脱。抗体的酸性种类可包括但不限于电荷变体、结构变体和/或碎片化变体。在一些实施方案中，包含抗体或其抗原结合部分的组合物可包含多于一种类型的酸性同工型种类。在一些实施方案中，可基于CEX-HPLC分离期间保留时间的差异来鉴定多种酸性同工型种类。例如，当使用CEX分析包含抗体(例如维多珠单抗)的组合物时，可鉴定一个或多个酸性同工型峰，每个峰代表抗体的一种或多种酸性同工型种类。
如本文所用，术语“碱性种类”或“碱性同工型种类”是指抗体或其抗原结合部分(例如维多珠单抗)的变体，其特征在于总体碱性电荷。抗体或其抗原结合部分的碱性种类可通过本领域已知的各种方法(诸如阳离子交换色谱法(CEX)，例如阳离子交换-高效液相色谱法(CEX-HPLC)、CEX-质谱法或等电聚焦)进行检测。一般而言，抗体或其抗原结合部分的碱性种类以比抗体或其抗原结合部分的主要同工型更长的保留时间从CEX树脂中洗脱。抗体的碱性种类可包括但不限于电荷变体、结构变体和/或碎片化变体。在一些实施方案中，包含抗体或其抗原结合部分的组合物可包含多于一种类型的碱性同工型种类。在一些实施方案中，可基于CEX-HPLC分离期间保留时间的差异来鉴定多种碱性同工型种类。例如，当使用CEX分析包含抗体(例如维多珠单抗)的组合物时，可鉴定一个或多个碱性同工型峰，每个峰代表抗体的一种或多种碱性同工型种类。在一个实施方案中，维多珠单抗的碱性同工型是具有羧基末端赖氨酸(C-Lys)的维多珠单抗。根据一级序列，宿主细胞杂质或与抗体或其抗原结合部分无关的其他杂质不被视为抗体或其抗原结合部分的“碱性种类”或“碱性同工型种类”。
“CDR”或“互补决定区”是高变区，其散布于更保守的区域，称为框架区(FR)。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合片段”或“抗原结合部分”是指Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、单链抗体、功能性重链抗体(纳米抗体)、以及对至少一个所需表位具有特异性的抗体的任何部分，其与完整抗体竞争特异性结合(例如，具有足够框架序列以便特异性结合表位的互补决定区的分离部分)。抗原结合片段可通过重组技术或通过抗体的酶促裂解或化学裂解产生。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指衍生自非人抗体(例如鼠)的抗体，其保留或基本上保留亲本抗体的抗原结合特性但对人的免疫原性较低。
使用细胞培养方法由重组哺乳动物宿主细胞系产生的多肽诸如抗体，被称为“重组多肽”、“蛋白质”，或就抗体而言，被称为“重组抗体”。表达的蛋白质可在胞内产生或分泌到可从中将其回收和/或收集的培养基中。在一个实施方案中，重组抗体是重组抗α4β7抗体，例如对α4β7复合物具有结合特异性的抗体，诸如维多珠单抗。由于本文所述的方法和组合物涉及用于产生重组抗体的组合物和细胞培养方法，除非另有说明，否则术语“抗体”在本文中与术语“重组抗体”可互换使用。
术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指已被基因工程改造以表达重组多肽(例如抗体)的细胞。在一个实施方案中，重组宿主细胞包含含有编码抗体重链、轻链或两者的核酸的表达载体。应当理解，术语“宿主细胞”不仅意图指代特定的受试细胞，而且还指代此类细胞的后代。因为某些修饰可由于突变或环境影响而在继代中出现，所以此类后代实际上不会与亲本细胞相同，但仍包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。此外，应当理解，除非另有说明，否则在使用术语“细胞”时，例如宿主细胞、哺乳动物细胞或哺乳动物宿主细胞，所述术语意图包括细胞群体。
如本文所用，术语“细胞培养过程”统称为与重组多肽(例如抗体)生产相关联的细胞培养阶段。术语“细胞培养过程”通常是指细胞在受控条件下生长或保持的过程。细胞培养过程可在体外或离体进行。在一些实施方案中，细胞培养过程具有扩增阶段和生产阶段。在一些实施方案中，扩增阶段和生产阶段被过渡阶段或变化阶段分开。“培养”细胞是指在适合于细胞生长或保持的条件下使细胞与细胞培养基接触。在某些实施方案中，细胞培养是指用于生成或保持能够产生所关注的重组多肽(例如抗α4β7抗体)的宿主细胞群体的方法。例如，一旦将表达载体掺入到适当的哺乳动物宿主细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞)中，就可以在适合于相关核苷酸编码序列表达的条件下培养宿主。“细胞培养物”还可指含有细胞的溶液。
术语“培养基”和“细胞培养基(medium)”(复数，“培养基(media)”)是指用于生长或保持细胞的营养源。如本领域技术人员所理解，营养源可含有细胞生长和/或存活所需的组分或可含有有助于细胞生长和/或存活的组分。维生素、必需或非必需氨基酸(例如，半胱氨酸和胱氨酸)和微量元素(例如，铜)是培养基组分的实例。细胞培养基的实例包括生长培养基和生产培养基。
细胞培养基还可补充有，例如“培养基补充剂”或“补充剂”，其含有例如通过增加重组多肽产量或改善细胞活力而有助于细胞培养过程的组分中的任一种或多种。在一个实施方案中，补充剂不与细胞培养基一起配制，例如不与生产培养基或补料培养基一起配制。可以浓缩形式制备补充剂，其中所述补充剂与补料溶液或培养基的组合产生的补充组分的最终浓度较低。补充剂可包含一种或多种已经存在于起始培养基(例如原液培养基或基础培养基)中的组分，且/或补充剂可包含一种或多种对于培养基而言的新组分。在一个实施方案中，将补充剂添加到补料溶液中。
补充剂可影响细胞培养的特定方面，例如，改善细胞生长或增加重组多肽产量，这取决于细胞类型、生长形式和产品(所关注的蛋白质)特性。可通过补充剂添加的物质的实例包括但不限于微量元素中的一种或多种、激素中的一种或多种、氨基酸中的一种或多种、维生素中的一种或多种、脂肪酸中的一种或多种、非离子去污剂中的一种或多种、核苷酸中的一种或多种和/或糖中的一种或多种。在一些实施方案中，补充剂包含胰岛素、植物水解产物和/或动物水解产物。可在细胞培养过程的一个阶段或在其多个阶段添加一种或多种补充剂。
细胞培养基和/或补充剂可在特定程度上“定义”或“未定义”，因为可变性的来源可能是已知的或未知的，这基于组分的性质，例如，是否以已知的化学组成(诸如元素、无机盐或有机离子或糖中的一种或多种)供应，或者是否以复合组分(诸如混合物，例如水解物)供应。培养基中复合组分(诸如蛋白质或水解产物)的存在降低了定义的程度。
术语“生长阶段(growth phase)”、“生长阶段(growth stage)”、“扩增阶段(expansion phase)”和“扩增阶段(expansion stage)”在本文中可互换使用，是指培养的宿主细胞快速分裂和数量增加的时期。在扩增阶段期间，细胞通常可在生长培养基(或扩增培养基)中并在设计成使细胞增殖最大化的条件下培养。生长阶段可例如在分批培养中在时间上先于生产阶段，由此两个阶段可(或可不)被过渡阶段分开。
如本文所用，术语“生产阶段(production phase)”或“生产阶段(productionstage)”是指宿主细胞生产最大量的重组多肽诸如重组抗体的时期。生产阶段的典型特征在于细胞分裂少于扩增阶段期间，并且还可包括使用设计成使多肽产量最大化的培养基和培养条件。
术语“生长培养基”是指有利于培养细胞的生长(即数量增加)并且在细胞培养过程的生长或扩增阶段期间使用的细胞培养基。
“生产培养基”是有利于生产所关注的重组多肽(例如抗体，例如抗α4β7抗体)的细胞培养基。
如本文所用，“补料溶液”或“补料培养基”是指被添加到生长培养基或生产培养基中的细胞培养物中以改善或保持由生长培养基或生产培养基中的细胞产生的蛋白质的一个方面的细胞培养基。例如，可添加补料溶液以保持由细胞产生的特定蛋白质滴度水平。补料溶液是本领域已知的。在一个实施方案中，补料溶液补充有被鉴定为有益于哺乳动物细胞的蛋白质生产的额外的营养物。
应当理解，生长还可发生在生产培养基中，并且生产可在生长培养基中进行，使得生长培养基和生产培养基可以是相同的。然而，在一个实施方案中，选择与如果采用生长培养基的情况相比在更大程度上有利于所关注的多肽生产的生产培养基。
如本文所用，术语“分批培养”是指在培养过程开始时将用于细胞培养的所有组分(包括细胞和所有培养营养物)供应到培养容器的一种培养。
如本文所用，术语“补料分批细胞培养”是指一种分批培养，其中细胞和培养基最初被供应到培养容器，并且在培养过程中，将额外的补充剂(例如营养物)连续或以离散的增量(经由补料溶液)补料到培养物中，在培养终止前进行或不进行定期细胞和/或产物收获。
如本文所用，术语“灌流培养”是指如下的一种培养，其中在培养过程开始时将细胞和补充剂供应到培养容器，并且将额外的补充剂连续补料到培养物中，同时在培养过程中从培养基中连续收获产物。
如本文所用，术语“载体”意图指代能够转运已与其连接的另一个核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，所述质粒是指可将额外的DNA区段连接到其中的环状双链DNA。另一种类型的载体是噬菌体载体。另一种类型的载体是病毒载体，其中可将额外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可在引入到宿主细胞中之后整合到宿主细胞的基因组中，并且因此与宿主基因组一起复制。而且，某些载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”，或简称为“表达载体”。一般而言，在重组DNA技术中有用的表达载体经常呈质粒的形式。
“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物，并且包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基，和/或它们的类似物，或可通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应掺入聚合物中的任何底物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸诸如甲基化的核苷酸及其类似物。如果存在，那么可在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。
“分离的核酸”意指并涵盖在其通常情形之外或与其通常情形分开的非天然存在的、重组的或天然存在的序列。分离的核酸分子不同于其在自然界中被发现时的形式或环境。因此，分离的核酸分子不同于当它存在于天然细胞中时的核酸分子。然而，分离的核酸分子包括包含在通常表达蛋白质的细胞中的核酸分子，例如，在所述细胞中核酸分子位于与天然细胞的染色体位置不同的染色体位置。
如本文所用，“纯化的”(或“分离的”)是指基本上不含其他组分的核酸分子(例如多核苷酸)或氨基酸分子(例如多肽或蛋白质)。在一些实施方案中，将纯化的多核苷酸或纯化的多肽从其产生的环境中存在的其他组分中去除或与所述其他组分分开。例如，分离的多肽是与产生所述多肽的细胞的其他组分(例如，内质网或细胞质蛋白和RNA)分开的多肽。分离的多核苷酸是与其他核组分(例如组蛋白)和/或上游或下游核酸序列分开的多核苷酸。
术语“培养容器”是指用于培养细胞的容器。培养容器可以是任何尺寸，只要它可用于细胞培养即可。
如本文所用，术语“接种(inoculation)”或“接种(seeding)”是指将细胞添加到培养基中以开始培养或将细胞培养物提供给生物反应器或其他用于培养的容器的过程。细胞可能先前已经在另一个生物反应器或容器中繁殖过。可选地，细胞可能已经被冷冻并在将它们提供给生物反应器或容器之前立即解冻。所述术语是指任意数量的细胞，包括单个细胞。
如本文所用，术语“滴度”是指由细胞培养物产生的重组表达多肽(例如抗体)的总量除以给定量的培养基体积。滴度通常以每毫升培养基中的抗体的毫克数或每升培养基中的抗体的克数为单位表示。滴度可根据相对测量值(诸如与在不同培养条件下获得蛋白质产物相比滴度增加的百分比)来表示或评估。
如本文所用，术语“收获”，例如对于从宿主细胞分泌的表达蛋白，是指从细胞培养物的细胞和细胞碎片中分开细胞培养基(含有所关注的表达蛋白)。(收获非分泌的蛋白质，将收集细胞并弃掉培养基。)含有所关注蛋白质的培养基被称为“条件培养基”。使用几种技术中的任一种进行收获，所述技术包括但不限于离心、微滤、深层过滤和通过绝对孔径膜的过滤。收获后，例如从上清液或从细胞中分离所需蛋白质的后续步骤(包括澄清)通常被认为是纯化步骤。
术语“澄清的收获物”是指衍生自条件培养基的液体材料，其含有所关注的重组多肽，例如抗α4β7抗体。从细胞培养基中获得澄清的收获物，所述培养基已经历了一个或多个方法步骤以将所关注的多肽与细胞培养物的细胞和细胞碎片分开和/或从液体中去除更细小的固体颗粒和颗粒杂质。此类分开技术的实例包括但不限于沉降、絮凝、离心和/或过滤。
如本文所用，术语“上游加工”在重组多肽(例如抗体)制备的情形中是指涉及从细胞生产和收集多肽(例如抗体)的活动(例如，在所关注的蛋白质(例如抗体)的细胞培养期间)。
如本文所用，术语“下游加工”是指在上游加工之后用于纯化所关注的蛋白质(例如抗体)的一种或多种技术。例如，下游加工包括使用例如亲和色谱法(包括蛋白A亲和色谱法)、尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法(诸如阴离子或阳离子交换色谱法)、疏水相互作用色谱法(HIC)或置换色谱法进行的蛋白质产物的纯化。
如本文所用，术语“糖基化特征”是指包含寡糖的翻译后修饰种类的复合。关于抗α4β7抗体，糖基化特征描述了抗体Fc区的N-连接的糖基化。关于维多珠单抗，糖基化特征是指与重链SEQ ID NO:13的天冬酰胺301连接的糖基化种类。
II.本发明的方法和组合物
本文提供了用于在哺乳动物(例如非人)细胞培养物中产生抗α4β7抗体(诸如维多珠单抗)的方法和组合物。本发明至少部分基于可用于在哺乳动物细胞培养物中实现高抗α4β7抗体滴度水平(即大于1g/L，例如，3-10g/L、4-8g/L或5-7g/L)的细胞培养参数。本文还描述了用于实现抗α4β7抗体(诸如维多珠单抗)的碱性同工型的降低水平的方法和组合物；用于实现抗α4β7抗体(诸如维多珠单抗)的低聚集体水平的方法和组合物；以及用于实现抗α4β7抗体(诸如维多珠单抗)的特定聚糖形式的方法和组合物。本文还提供了包含抗α4β7抗体(诸如维多珠单抗)的组合物，其具有降低水平的碱性同工型种类；低水平的高分子量聚集体；和/或特定的聚糖形式。
具体地说，本文公开的方法和组合物可用于产生抗α4β7抗体维多珠单抗，或具有维多珠单抗的抗原结合区的抗体。维多珠单抗还以其商品名(TakedaPharmaceuticals,Inc.)为人所知。维多珠单抗是一种人源化抗体，其包含突变的人IgG1框架区和来自鼠抗体Act-1(其描述于美国专利号7,147,851中，以引用方式并入本文)的抗原结合CDR。
维多珠单抗与α4β7整合素特异性结合并阻断α4β7整合素与粘膜寻址素细胞粘附分子1(MAdCAM-1)和纤连蛋白的相互作用，并抑制记忆T淋巴细胞跨内皮向发炎的胃肠实质组织的迁移。维多珠单抗不结合α4β1和αEβ7整合素或抑制其功能，并且不拮抗α4整合素与血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)的相互作用。
α4β7整合素在优先迁移到胃肠道的记忆T淋巴细胞的离散子集的表面上表达。MAdCAM-1在肠道内皮细胞上表达，并在T淋巴细胞归巢至肠道淋巴组织中起关键作用。α4β7整合素与MAdCAM-1的相互作用被认为是引起粘膜炎症(诸如作为溃疡性结肠炎和克罗恩病的标志的慢性炎症)的重要因素。维多珠单抗可用于治疗炎性肠病，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎、HIV、结肠袋炎包括慢性结肠袋炎、瘘管性克罗恩病、移植物抗宿主病和乳糜泻。
维多珠单抗的重链可变区在SEQ ID NO:1中提供，并且维多珠单抗的轻链可变区在SEQ ID NO:5中提供。维多珠单抗包含重链可变区，所述重链可变区包含描述于SEQ IDNO:2中的CDR1、描述于SEQ ID NO:3中的CDR2和描述于SEQ ID NO:4中的CDR3。维多珠单抗包含轻链可变区，所述轻链可变区包含描述于SEQ ID NO:6中的CDR1、描述于SEQ ID NO:7中的CDR2和描述于SEQ ID NO:8中的CDR3。编码轻链可变区的核酸序列在SEQ ID NO:9中列示。编码重链可变区的核酸序列在SEQ ID NO:10中列示。编码维多珠单抗轻链的全长核酸序列如SEQ ID NO:11所列示，并且编码维多珠单抗重链的全长核酸序列如SEQ ID NO:12所列示。编码维多珠单抗的核酸序列也描述于美国专利公开号2010/0297699中，所述公开的全部内容并入本文。维多珠单抗和维多珠单抗的序列进一步描述于美国专利公开号2014/0341885和美国专利公开号2014/0377251中，所述公开各自的全部内容明确地以引用的方式整体并入本文。
本文提供的方法和组合物可用于在哺乳动物细胞中产生抗α4β7抗体，特别是维多珠单抗或具有维多珠单抗的结合区(即CDR或可变区)的抗体，或抗α4β7抗体的抗原结合片段。
本文公开的方法和组合物涉及哺乳动物细胞培养过程。哺乳动物细胞已成为生产用于临床(例如人类治疗)应用的哺乳动物蛋白的主要系统，这主要是因为它们能够生产正确折叠和组装的异源蛋白，以及它们能够进行翻译后修饰，诸如类似于人类细胞所进行的修饰。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和获自各种其他哺乳动物来源的细胞系，例如像小鼠骨髓瘤细胞(NS0)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、人胚胎肾细胞(HEK-293)和人视网膜细胞，已被监管机构批准用于生产生物制药产品，包括治疗性抗体。在这些细胞中，CHO细胞是最常用的工业宿主之一，其被广泛采用以生产异源蛋白。因此，用于在CHO细胞(包括二氢叶酸还原酶阴性(DHFR-)或谷氨酰胺合酶阴性(GS-)CHO细胞)中大规模生产抗体的方法是本领域众所周知的(参见例如，Trill等人,Curr.Opin.Biotechnol.6(5):553-60(1995)，Birch和Racher,Adv.Drug Delivery Reviews 58:671-685(2006)和美国专利号6,610,516)。适合于在本文提供的组合物和方法中使用的CHO细胞系的实例包括但不限于GS-CHO、CHO-K1 DUX B11和DP-12CHO细胞。适合于在本文提供的组合物和方法中使用的CHO细胞也已描述于以下文件中：美国专利号4,766,075；4,853,330；5,185,259；5,122,464；5,591,639；5,879,936；Lubiniecki等人,in Advances in Animal Cell Biology and Technology forBioprocesses,Spier等人,编辑.(1989),第442-451页。适合于在本文中使用的已知CHO衍生物包括例如，CHO/-DHFR(Urlaub和Chasin.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980))、CHO-K1 DUX B11(Simonsen和Levinson,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:2495-2499(1983)；Urlaub和Chasin,同上)和DP-12CHO细胞(1989年3月15日公布的EP 307,247或美国专利号5,721,121)。
合适的哺乳动物细胞系的其他实例包括由SV40转化的猴肾CVI系(COS-7，ATCCTMCRL 1651)；人胚胎肾系293S(Graham等人,J.Gen.Virolo.,36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCCTM CCL 10)；小鼠支持细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.,23:243(1980))；猴肾细胞(CVI-76，ATCCTM CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCCTM CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCCTM CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCCTM CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC.RTM.CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCCTM CCL 75)；人肝细胞(Hep G2.HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562，ATCCV CCL 51)；大鼠肝细胞瘤细胞(HTC，MI.54，Baumann等人,J.Cell Biol.,85:1(1980))，3T3细胞；293T细胞(Pear,W.S.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:8392-8396(1993))；NS0细胞(Sato等人Tissue CultureAssociation,24:1223(1988))；SP2/0(Sato等人J.Exp.Med.,165:1761(1987))；和TR-1细胞(Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44(1982))和杂交瘤细胞系。
虽然许多宿主细胞类型能够生产编码的重组多肽，但由在一种宿主细胞中产生的特定核酸编码的产物可与由另一种宿主细胞中的所述核酸编码的产物不同。差异可在于一种或多种生化特性。生化特性的实例包括基本蛋白质结构诸如一级、二级或三级结构，或翻译后修饰诸如信号肽加工、糖基化、N-末端乙酰化、脂化或磷酸化。特定的差异可取决于细胞的酶促机制和/或培养基或生长条件。对于重组治疗性抗体，生化特性的改变可影响一种或多种抗体特征诸如结合能力、抗体效应子功能、免疫原性、清除率、溶解性或储存稳定性。
在一些实施方案中，可通过纯化(例如下游加工技术)来减少或消除与参考产品不同的产品。在其他实施方案中，可通过控制细胞的酶促机制(例如上游加工技术)来减少或消除与参考产品不同的产品。在一些实施方案中，控制细胞的酶促机制包括细胞突变以重组修饰其遗传背景，例如突变或改变酶的表达。在一些实施方案中，控制细胞的酶促机制包括控制培养基中的成分，诸如提供特定培养基或添加一种或多种补充剂。在一些实施方案中，控制细胞的酶促机制包括保持或调整生长条件，诸如温度、pH或大气气体。
已经描述了产生抗α4β7抗体(诸如维多珠单抗)的方法(参见例如，美国专利号7,402,410和美国专利申请公布号20070122404)。在这些出版物中，描述了抗体的某些特性，例如结合亲和力、效应子功能和生化特性诸如电荷特征、分子量和糖基化模式。所述抗体在NS0细胞中培养时具有某些特性，而在CHO细胞中培养时会发生改变。当改变为CHO细胞的不同变体，例如从DHFR-细胞改变为GS-细胞时，重组蛋白(例如抗体)的特性也会改变。本文描述了在GS-CHO细胞(本文也简称为“GS-CHO”细胞)中表达抗体(例如维多珠单抗)时，例如在重组蛋白(例如抗体)的生产中控制这些变化并限制或最小化特性改变的方法和培养基组合物。在某些实施方案中，本文描述了用于在GS-CHO细胞中产生抗α4β7抗体(诸如维多珠单抗)的方法和组合物。
在细胞培养物中产生抗α4β7抗体(诸如维多珠单抗)时会改变的特性的实例包括其电荷特征、糖基化特征和高分子量(HMW)杂质种类。诸如温度、pH、剪切应力、溶解氧和培养基组成的培养条件可导致特性的改变。酶的电荷可因C-末端赖氨酸、N-末端焦谷氨酸或唾液酸的存在或缺少的变化，和/或脱酰胺作用或氧化作用的变化而发生改变。糖基化特征可因诸如唾液酸或末端半乳糖的存在或缺少、高甘露糖种类的加工的变化而发生改变(参见Hossler等人(2009)Glycobiology 19:936-949)。培养基补充剂可控制此类变化。
在一些实施方案中，细胞培养物中产生的抗α4β7抗体的特性(包括但不限于电荷变化、聚糖变化和聚集体含量)可通过调节培养基(例如生产阶段培养基)中糖(例如半乳糖)、金属辅因子(例如锰)和/或核苷(例如尿苷)的量来进行控制。在一些实施方案中，细胞培养物中产生的抗α4β7抗体的特性(包括但不限于电荷变化、聚糖变化和聚集体含量)可通过调节培养基(例如生产阶段培养基)中赖氨酸和精氨酸的量来进行控制。在一些实施方案中，细胞培养物中产生的抗α4β7抗体的特性(包括但不限于电荷变化、聚糖变化和聚集体含量)可通过调节培养基(例如生产阶段培养基)中使用的锌的量来进行控制。此外，在生产期间可采用温度变化。虽然本领域已知温度变化可证明有利于抗体生产(Moore等人(1997)Cytotechnology 23:47-54)，但本文提供了基于保持细胞培养温度的方法，即其中培养条件不包括明显变化，例如高于或低于37摄氏度超过1摄氏度。
A.补充锌
在一些实施方案中，本文提供了用于在生产阶段期间补充有锌的CHO细胞培养物中产生人源化抗α4β7抗体(例如维多珠单抗)或其抗原结合部分的方法和组合物。在一些实施方案中，锌用作控制CHO细胞培养物中抗α4β7抗体的电荷变化的培养基补充剂。在其他实施方案中，锌用作控制在CHO细胞培养物中产生的抗α4β7抗体制备中的高分子量(HMW)聚集体的水平培养基补充剂。金属离子可呈盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、溴化盐、醋酸盐、硬脂酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐的形式。培养基补充剂可在批次开始时、在扩增阶段期间或在生产阶段以浓缩形式与补料一起提供给培养物。培养基补充剂可以浓缩形式提供给补料溶液，所述培养基充剂也是浓缩补充剂。在此类实施方案中，在补充剂制备的每个阶段，补充剂可被稀释多于一次。
在一些实施方案中，可以将金属离子(例如锌)添加到生产阶段培养物中。用于产生抗α4β7抗体(诸如维多珠单抗)的锌的存在可提供降低水平的抗体的碱性同工型(相对于除了添加锌以外相同过程的对照过程，水平降低)。在一些实施方案中，锌可被多于一次地添加到生产阶段培养物中。在一个实施方案中，锌以补充剂的形式添加到生产阶段培养物的起始生产培养基中。在一个实施方案中，在例如生产阶段培养的起始日之后将锌直接或以补料溶液的形式添加到生产培养物中。在一个实施方案中，锌以补充剂的形式添加到起始生产培养基中，并在起始日之后以补充剂的形式添加到生产培养基中，例如将锌添加到补料溶液中，所述补料溶液被添加到生产阶段培养物中。在一些实施方案中，在生产阶段培养的起始日之后，锌以补充剂的形式多次添加。例如，锌以补充剂的形式每天、每两天、每三天、每四天、每一至三天、每两至四天或每周添加一次。在一些实施方案中，在生产阶段培养的起始日之后多次添加的锌不是在生产阶段培养的第一天、第二天、第三天、第四天、第五天或第六天添加，而是在这之后每天或每两天添加一次。在一个实施方案中，锌以补充剂的形式添加到起始培养基中，并以每日补充剂的形式添加到生产阶段培养基中。在另一个实施方案中，锌以补充剂的形式添加到起始培养基中，并从生产阶段培养的第四天开始，以每日补充剂的形式添加到的生产阶段培养基中。锌可补充至收获前一天、收获前两天或收获前三天。在一个实施方案中，锌以补充剂的形式添加到起始培养基中，并从生产阶段培养的第四天开始，以每日补充剂的形式添加到的生产阶段培养基中直至收获前一天。
在某些实施方案中，锌被包括在产生具有约16％或更少的人源化抗α4β7抗体的碱性同工型(如通过CEX所测定)的组合物的方法中，其中人源化抗体(例如维多珠单抗)在包含锌的生产培养基中的哺乳动物宿主细胞(例如GS-CHO细胞)中产生。在某些实施方案中，将含有锌的补充料添加到生产培养基中提供了包含约14％或更少的人源化抗α4β7抗体的碱性同工型的组合物。在某些实施方案中，在用于生产培养基的补充剂中包含锌提供了包含约13％或更少的人源化抗α4β7抗体的碱性同工型的组合物。在某些实施方案中，在用于生产培养基的补充剂中包含锌提供了包含约12％或更少的人源化抗α4β7抗体的碱性同工型的组合物。在某些实施方案中，在用于生产培养基的补充剂中包含锌提供了包含约11％或更少的人源化抗α4β7抗体的碱性同工型的组合物。在一些实施方案中，可在细胞培养的第14天，即细胞培养物接种后14天测量碱性同工型的水平。在其他实施方案中，可在细胞培养的第15天测量碱性同工型的水平。
在某些实施方案中，锌被包括在产生具有约70％或更多的人源化抗α4β7抗体的主要同工型(如通过CEX所测定)的组合物的方法中，其中人源化抗体(例如维多珠单抗)在包含锌的生产培养基中的哺乳动物宿主细胞(例如GS-CHO细胞)中产生。在某些实施方案中，将含有锌的补充料添加到生产培养基中提供了包含约71％或更多的人源化抗α4β7抗体的主要同工型的组合物。在某些实施方案中，将含有锌的补充料添加到生产培养基中提供了包含约72％或更多的人源化抗α4β7抗体的主要同工型的组合物。在某些实施方案中，将含有锌的补充料添加到生产培养基中提供了包含约73％或更多的人源化抗α4β7抗体的主要同工型的组合物。在某些实施方案中，将含有锌的补充料添加到生产培养基中提供了包含约74％或更多的人源化抗α4β7抗体的主要同工型的组合物。在一些实施方案中，可在细胞培养的第14天测量主要同工型的水平。在其他实施方案中，可在细胞培养的第15天测量主要同工型的水平。
在其他实施方案中，锌补充可用于限制包含抗α4β7抗体的制品中HMW污染物的水平。在一些实施方案中，以约10-200μM、约50-150μM或约100-130μM的浓度将锌添加到培养基中可将HMW聚集体的水平降低至<5％、<4％、<3％、<2.5％、<2％、<1.5％或<1％(如通过SEC所测定)。
锌可直接添加到生产培养基中，或以补料补充剂的形式添加到生产培养基中。
可补充培养基(例如生产阶段培养基)的锌离子的最终浓度为10至200μM、10至100μM、15至90μM、20至80μM、10至80μM、10至70μM、约14至55μM、约10至60μM、约10至30μM、约10至20μM、约14μM、约50μM、约55μM、约57μM或约15μM。如上所述，可以多次添加锌离子。在一个实施方案中，将锌添加到生产阶段培养的生产培养基中，使得生产培养基的锌浓度为约2至60μM、5至57μM、5至50μM、5至40μM、8至30μM、10至20μM、12至15μM或约14μM。在一个实施方案中，生产培养基中锌的累积浓度为约15.5μM，按收获时的补充量计算，其中每次补充添加约1至约4μM锌到培养基中。在一个实施方案中，将锌添加到生产阶段培养的生产培养基中，使得生产培养基的锌浓度为约50-150μM、75-150μM、100-150μM、80-130μM，或100-130μM。在一些实施方案中，将锌添加到生产阶段培养的生产培养基中，使得生产培养基的锌浓度为约10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、110μM、120μM、130μM、140μM、150μM、160μM、170μM、180μM、190μM或200μM。在某些情况下，起始培养物中的锌过多会降低细胞的活力和/或降低抗体的滴度。
在一些实施方案中，将锌添加到培养基(例如生产阶段培养基)中持续10-16天，例如10-17天、10-15天或12-14天的时间段。在一些实施方案中，锌补充剂可例如作为补料溶液的一部分递增地添加到细胞培养物中。例如，锌可在第0天、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天或第14天添加到培养基中。在一些实施方案中，锌可每天或每隔一天添加一次。在一些实施方案中，锌可在细胞达到生产阶段时开始每天或每隔一天添加一次。因此，在一些实施方案中，锌可从细胞培养的第4天、第5天或第6天开始每天或每隔一天一次添加到生产培养基中。在一个实施方案中，锌可从约第4天至约第10天每天添加一次。在一个实施方案中，锌可从约第4天至约第14天每天添加一次。在一个实施方案中，在生产阶段的起始日之后添加锌作为补充剂，以便以约10至80μM的浓度从补料中补充生产培养基，或补充至约50至150μM的浓度。在一个实施方案中，添加锌以补充生产阶段培养的起始培养基，使得生产培养基的锌浓度为约50至150μM、2至60μM、5至57μM、5至50μM、5至40μM、8至30μM、10至20μM、12至15μM或约14μM，并且在起始日之后还多次添加到生产阶段培养物中以补充生产培养基，每次添加0.1至10μM、0.5至5μM、0.75至4μM、0.9至3μM、1.0至2.7μM、或约1.4μM或1.9μM(例如，从培养的第二天至第十天、第二天至第八天、第二天至第六天、第三天至第六天之间的一天开始，或从培养的第四天开始)。在另一个实施方案中，添加锌以补充生产培养的起始培养基，使得生产培养基的锌浓度为约2至50μM、5至40μM、8至30μM、10至20μM、12至15μM或约14μM，并且从生产阶段培养的第四天开始还每天一次添加到生产阶段培养物中以补充生产阶段培养基，每次添加0.1至10μM、0.5至5μM、0.75至4μM、0.9至3μM、1.0至2.7μM、或约1.4μM或1.9μM。在一些实施方案中，将补料溶液添加到生产培养基中，使得生产培养基的总锌浓度为约10至20μM(例如，15至17μM)的锌，添加至生产培养基中。在一些实施方案中，将本文所述的锌补充剂添加到CHO细胞培养基(例如，国际专利公开号WO98/08934A1中提供的培养基)中，所述公开的全部内容以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，将本文所述的锌补充剂添加到CD-CHO培养基中。在一些实施方案中，将本文所述的锌补充剂添加到CD-CHO AGT(目录号12490-001(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中。
在一个实施方案中，添加锌以补充补料溶液，使得补料溶液的浓度为约90至120μM、约95至120μM、约100至120μM、约105至120μM、约110至120μM、或约117μM。然后可将这种补料补充剂添加到生产培养基中。
在一些实施方案中，本文提供了包含表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的宿主细胞(或宿主细胞群体)的细胞培养物和包含或补充有锌的生产培养基。在其他实施方案中，本文提供了可通过在包含或补充有锌的生产培养基中培养表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的宿主细胞而获得的细胞培养物。
前述细胞培养物可并入本文所述的实施方案中的任一项中。例如，在一些实施方案中，宿主细胞是CHO细胞，例如GS-CHO细胞或DHFR-CHO细胞。在一些实施方案中，宿主细胞表达包含SEQ ID NO:1的重链可变区和SEQ ID NO:5的轻链可变区的抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，宿主细胞表达包含以下的抗体或其抗原结合部分：包含描述于SEQID NO:2中的CDR1、描述于SEQ ID NO:3中的CDR2和描述于SEQ ID NO:4中的CDR3的重链可变区以及包含描述于SEQ ID NO:6中的CDR1、描述于SEQ ID NO:7中的CDR2和描述于SEQ IDNO:8中的CDR3的轻链可变区。在一些实施方案中，宿主细胞表达维多珠单抗或其抗原结合部分。在一些实施方案中，宿主细胞包含列示于SEQ ID NO:9中的核酸(编码抗α4β7抗体的轻链可变区)和列示于SEQ ID NO:10中的核酸(编码抗α4β7抗体的重链可变区)。在一些实施方案中，宿主细胞包含列示于SEQ ID NO:11中的核酸(编码维多珠单抗的轻链)和如SEQID NO:12所列示的核酸(编码维多珠单抗的重链)。
在一些实施方案中，细胞培养物含有浓度为约10至100μM、10至100μM、约15至90μM、约20至80μM、约10至80μM、约10至70μM、约14至55μM、约10至60μM、约10至30μM、约10至20μM、约14μM、约50μM、约55μM、约57μM或约15μM的锌。在一些实施方案中，细胞培养物含有浓度为约2至60μM、5至57μM、5至50μM、5至40μM、8至30μM、10至20μM、12至15μM或约14μM的锌。在一些实施方案中，细胞培养物含有浓度为约5至45μM、50-150μM、75-150μM、100-150μM、80-130μM或100-120μM的锌。在一些实施方案中，细胞培养物含有浓度为约1-10μM、10-30μM、30-50μM、50-70μM或70-90μM的锌。在一些实施方案中，细胞培养物含有浓度为约1-30μM、10-40μM、20-50μM、30-60μM、40-70μM或60-90μM的锌。在一些实施方案中，细胞培养物含有浓度为约1-50μM、20-60μM、30-70μM、40-80μM或50-100μM的锌。在一些实施方案中，细胞培养物含有浓度为约10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、110μM、120μM、130μM、140μM、150μM、160μM、170μM、180μM、190μM或200μM的锌。
在一些实施方案中，本文提供了可通过在包含或补充有浓度为50至150μM、100至120μM、或100至120μM的锌的生产培养基中培养表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的GS-CHO宿主细胞而获得的细胞培养物。在一些实施方案中，抗体是维多珠单抗或其抗原结合部分。
在一些实施方案中，相对于包含缺乏锌的培养基或未补充锌的培养基的等效细胞培养物，所述细胞培养物的细胞表达碱性同工型水平降低(如通过CEX所测定)的抗α4β7抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，表达的抗体包含约16％或更少的碱性同工型。在一些实施方案中，表达的抗体包含约15％或更少的碱性同工型。在一些实施方案中，表达的抗体包含约14％或更少的碱性同工型。在一些实施方案中，表达的抗体包含约13％或更少的碱性同工型。在一些实施方案中，表达的抗体包含约12％或更少的碱性同工型。在一些实施方案中，表达的抗体包含约11％或更少的碱性同工型。
在一些实施方案中，本文提供了一种产生单克隆抗体的方法，其包括(i)培养本文提供的细胞培养物持续一段足以使宿主细胞表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的时间，所述细胞培养物包含表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的宿主细胞以及包含或补充有锌的生产培养基，以及(ii)从细胞培养物中回收抗α4β7抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，相对于从包含缺乏锌的培养基或未补充锌的培养基的等效细胞培养物中回收的抗α4β7抗体或其抗原结合部分的群体，从所述细胞培养物中回收的抗α4β7抗体或其抗原结合部分的群体包含降低水平的碱性同工型和/或增加水平的主要同工型(如通过CEX所测定)。在一些实施方案中，相对于从包含缺乏锌的培养基或未补充锌的培养基的等效细胞培养物中回收的抗α4β7抗体或其抗原结合部分的群体，从所述细胞培养物中回收的抗α4β7抗体或其抗原结合部分的群体包含降低水平的聚集体和/或增加水平的单体(如通过SEC所测定)。在一些实施方案中，细胞培养物培养5-20天。在一些实施方案中，细胞培养物培养10-16天。在一些实施方案中，细胞培养物培养13-15天。在一些实施方案中，细胞培养物培养5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。本文还提供了通过前述方法获得或可通过前述方法获得的抗α4β7抗体。
在本文所述的每个实施方案中，细胞培养基在一些实施方案中还可补充有糖、核苷和/或金属辅因子。例如，细胞培养基还可补充有尿苷、锰和锌。另外地或可选地，细胞培养基还可补充有赖氨酸和/或精氨酸。
B.补充糖、核苷和/或金属辅因子
在一些实施方案中，本文提供了用于在生产阶段期间补充有糖、核苷和/或金属辅因子的CHO细胞培养物中产生人源化抗α4β7抗体(例如维多珠单抗)或其抗原结合部分的方法和组合物。
在一些实施方案中，用于控制CHO细胞培养物中抗α4β7抗体的糖基化特征的培养基补充剂包含糖。例如，补充剂中的糖可以是葡萄糖、岩藻糖或半乳糖。
在一些实施方案中，用于控制CHO细胞培养物中抗α4β7抗体的糖基化特征的培养基补充剂包含核苷。例如，补充剂中的核苷可以是腺苷、尿苷、胞苷、鸟苷、胸苷和/或肌苷。
在一些实施方案中，用于控制CHO细胞培养物中抗α4β7抗体的糖基化特征的培养基补充剂包含金属辅因子。例如，补充剂中的金属辅因子可以是镁、锰、铁或铜。
在一些实施方案中，用于控制CHO细胞培养物中抗α4β7抗体的糖基化特征的培养基补充剂包含糖和核苷。在一些实施方案中，用于控制CHO细胞培养物中抗α4β7抗体的糖基化特征的培养基补充剂包含糖和金属辅因子。在一些实施方案中，用于控制CHO细胞培养物中抗α4β7抗体的糖基化特征的培养基补充剂包含糖、核苷和金属辅因子。
在一些实施方案中，本文提供了用于在生产阶段期间补充有半乳糖、尿苷和锰的CHO细胞培养物中产生人源化抗α4β7抗体(例如维多珠单抗)或其抗原结合部分的方法和组合物。在一些实施方案中，补充组分在同一个培养基补充剂中。在一些实施方案中，补充组分在不同的培养基补充剂中。在一些实施方案中，不同的培养基补充剂在添加到细胞培养物之前被组合。在一些实施方案中，多次添加用于控制抗α4β7抗体的糖基化特征的补充组分。例如，它们可在生产阶段培养的起始日之后添加，或不在生产阶段培养的第一天、第二天、第三天、第四天、第五天或第六天添加，而在这之后每天或每两天添加一次。在一个实施方案中，用于控制糖基化特征的组分以每日补充剂的形式添加到生产阶段培养基中。在另一个实施方案中，用于控制糖基化特征的组分在生产阶段培养的第四天开始以每日补充剂的形式添加到生产阶段培养基中。
在一些实施方案中，用于控制糖基化的培养基补充剂在扩增阶段期间提供给用于产生抗α4β7抗体的CHO细胞培养物；在其他实施方案中，它被添加到生产阶段。在一些实施方案中，用于控制糖基化的培养基补充剂以其在培养基中最终浓度的20至400倍、25至300倍、30至250倍、40至120倍、约50倍、约60倍、约100倍或约200倍的浓缩液形式提供。在一些实施方案中，补充培养基的量忽略了细胞的消耗，这会将一些补充组分代谢成其他化学形式。
在一个实施方案中，金属辅因子(诸如锰)组分提供给补充有金属离子(诸如锌)的培养基中的细胞培养物。在一些实施方案中，金属辅因子(例如锰)浓缩液可以是其在培养基中的最终浓度的10,000至50,000倍、其在培养基中的最终浓度的20,000至40,000倍、或其在培养基中的最终浓度的约30,000倍。
在一些实施方案中，锰可存在于培养基中，或可以0.1至100μM、0.5至50μM、1.0至25μM、2.0至15μM、3至10μM、1至50μM、1至100μM、20至50μM、30至60μM、40至70μM、50至80μM、70至100μM、20至70μM、30至80μM、40至90μM、或50至100μM的浓度添加以补充培养基，例如生产阶段培养基。在一个实施方案中，生产阶段培养基中锰的浓度为约5.15μM。因此，生产阶段培养基可根据计划进行补充以达到约5.15μM锰的平均浓度。在一些实施方案中，锰可存在于培养基中，或可以约1μM、约5μM、约10μM、约20μM、约30μM、约40μM、约50μM、约60μM、约70μM、约80μM、约90μM或约100μM的浓度添加以补充培养基，例如生产阶段培养基。
在一个实施方案中，在起始日之后多次添加锰作为补充剂以补充生产阶段培养基，每次添加0.1至10μM、0.2至1.5μM、0.2至5μM、0.25至2μM、0.3至1.2μM、0.3至0.8μM或约0.5μM或0.56μM。在一个实施方案中，在起始日之后多次添加锰作为补充剂以补充生产阶段培养基，每次添加约0.2至1.5μM。在一个实施方案中，在起始日之后多次添加锰作为补充剂以补充生产阶段培养基，每次添加约0.31至1.2μM。在一些实施方案中，从生产阶段培养的第四天开始，每天或每两天添加一次锰补充剂。在一些实施方案中，在收获当天不添加补充剂。
在一个实施方案中，将锰作为补充剂添加到补料培养基中，使得补料培养基中锰的浓度为0.02mM至0.2mM、0.03mM至0.15mM、0.03mM至0.10mM、0.03mM至0.05mM、0.03mM至0.04mM、约0.03mM、约0.04mM、约0.05mM、约0.06mM、约0.07mM、约0.08mM、约0.1mM或约0.14mM的最终浓度。在一个实施方案中，将锰作为补充剂添加到补料培养基中，使得补料培养基中锰的浓度为0.1至100μM的最终浓度。在一个实施方案中，锰作为补充剂添加到补料培养基中，使得补料培养基中锰的浓度为约39μM的最终浓度。在一个实施方案中，在生产阶段培养的起始日之后(例如，从生产阶段培养的第二天至第十天、第二天至第八天、第二天至第六天、第三天至第六天之间的一天开始，或从生产阶段培养的第四天开始)将补充有锰的补料培养基添加到生产培养基中(例如，多次，例如每一天或每两天一次)。在某些实施方案中，从生产阶段培养的第四天开始，将补充有锰的补料培养基添加到生产培养基中。
添加尿苷的原因多于一个。尿苷可与其他核苷一起以营养补充剂的形式添加以支持细胞生长。还可添加尿苷作为用于控制抗α4β7抗体糖基化特征的补充剂。在一些实施方案中，尿苷可存在于培养基中，或可以约0.1至20mM、约0.9至3.0mM、约1至20mM、约0.5至12mM、约1至8mM、约1.5至4mM、约0.1至1.5mM、约1至5mM、约1至7mM、约1至6mM、约1至5mM、约1至4mM、约2至4mM、约2至5mM、约2至3mM、约1mM至10mM、约10mM至15mM、约10mM至20mM、约10mM至30mM、约1mM至40mM、约1mM至50mM、或约10mM至30mM的浓度添加以补充培养基，例如生产阶段培养基。在一些实施方案中，尿苷可存在于培养基中，或可以约0.9mM、1.0mM、约2mM、约1.5mM、约2.0mM、约2.7mM、约2.5mM、约2.7mM、约2.8mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM或约20mM的浓度添加以补充培养基，例如生产阶段培养基。在一些实施方案中，生产培养基中描述的量考虑了基础培养基或补充剂中提供的量并且不考虑消耗、代谢的量或细胞产生的量。在一些实施方案中，生产培养基中描述的量是作为到收获那天所有添加的总和的累积量。在一个实施方案中，尿苷可以0.1至20mM、0.5至12mM、1至8mM、1.5至5mM、1.6至4.8mM或约2.4mM来补充生产阶段培养基。
在一个实施方案中，尿苷在起始日之后作为补充剂多次添加以补充生产阶段培养基，每次添加25至1000μM、75至750μM、55至620μM、100至600μM、150至450μM、100至600μM、170至630μM、或约250μM或约300μM。在一些实施方案中，这些尿苷补充剂从生产阶段培养的第四天开始每天或每两天添加一次，此外，在收获当天可不添加尿苷补充剂。在一个实施方案中，含有核苷(例如尿苷)的补充剂是其在培养基中最终浓度的10至500倍，是其在培养基中最终浓度的20至400倍、25至300倍、40至250倍、约50倍、约60倍、约100倍或约200倍。
在一个实施方案中，将尿苷作为补充剂添加到补料培养基中，使得补料培养基中尿苷的浓度为约1至40mM、15至25mM、15至100mM、20至90mM、15至70mM、15至50mM、15至30mM、约18mM、约19mM、约19.3mM、约20mM、约33mM、约50mM或约66mM的最终浓度。在一个实施方案中，在生产阶段培养的起始日之后(例如，从生产阶段培养的第二天至第十天、第二天至第八天、第二天至第六天、第三天至第六天之间的一天开始，或从生产阶段培养的第四天开始)将补充有尿苷的补料培养基添加到生产培养基中(例如，多次，例如每一天或每两天一次)。在某些实施方案中，从生产阶段培养的第四天开始，将补充有尿苷的补料培养基添加到生产培养基中。
在一个实施方案中，含有糖(例如半乳糖)的补充剂是其在用于控制抗α4β7抗体的糖基化特征的培养基中的最终浓度的10至500倍，是其在培养基中的最终浓度的20至400倍、25至300倍、30至250倍、40至120倍、约50倍、约60倍、约100倍或约200倍。在一些实施方案中，半乳糖可存在于培养基中，或可以0.1至100mM、1至75mM、2.5至50mM、3至20mM、5至35mM、约8至25mM、0.1至10mM、0.1至20mM、0.1至30mM、1至10mM、1至20mM、1至30mM、1至40mM、1至50mM、1至60mM、1至70mM、1至80mM、1至90mM、1至100mM、20至40mM、40至60mM、60至80mM、80至100mM、20至50mM、30至60mM、40至70mM、50至80mM、70至100mM、20至70mM、30至80mM、40至90mM、50至100mM、或50至150mM的浓度添加以补充培养基，例如生产阶段培养基。在一些实施方案中，半乳糖可存在于培养基中，或可以约0.1mM、约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1mM、约2mM、约3mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10μM、约12.5mM、约12mM、约12.8mM、约13mM、约15mM、约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM或约100mM的浓度添加以补充培养基，例如生产阶段培养基。在一个实施方案中，在起始日后多次添加半乳糖以补充生产阶段培养基，每次添加0.1至10mM、0.2至7.5mM、0.5至5mM、0.4至2.8mM、0.5至3.5mM、0.7至2.9mM、0.75至2.5mM或约1.2mM或1.4mM。在一些实施方案中，这些半乳糖补充剂从生产阶段培养的第四天开始每天或每两天添加一次，并且此外，在收获当天可不添加半乳糖补充剂。
在一个实施方案中，将半乳糖作为补充剂添加到补料培养基中，使得补料培养基中半乳糖的最终浓度为50至150mM、85mM至500mM、90mM至400mM、90mM至300mM、90mM至200mM、90mM至100mM、约95mM、约96mM、约97、约100mM、约165mM、约250mM或约330mM。在一个实施方案中，在生产阶段培养的起始日之后(例如，从生产阶段培养的第二天至第十天、第二天至第八天、第二天至第六天、第三天至第六天之间的一天开始，或从生产阶段培养的第四天开始)将补充有半乳糖的补料培养基添加到生产培养基中(例如，多次，例如每一天或每两天一次)。在某些实施方案中，从生产阶段培养的第四天开始，将补充有半乳糖的补料培养基添加到生产培养基中。
在一些实施方案中，对于控制抗α4β7抗体的糖基化特征，生产阶段培养基补充有尿苷、锰和半乳糖(UMG)。在一些实施方案中，UMG补充剂可例如作为补料溶液的一部分递增地添加到细胞培养物中。例如，含有UMG补充剂的补料溶液可每天或每两天添加一次。
在一些实施方案中，补充剂向生产阶段培养基提供0.1-0.7mM尿苷、0.2-1.5μM锰和0.5-3.5mM半乳糖。在一些实施方案中，UMG可在第0天、第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天或第14天添加到培养基中。在一些实施方案中，UMG可每天或每隔一天添加一次。在一些实施方案中，UMG可在细胞达到生产阶段时开始每天或每隔一天添加一次。因此，在一些实施方案中，UMG可从细胞培养的第4天、第5天或第6天开始每天或每隔一天一次添加到生产培养基中。在一个实施方案中，UMG可从约第4天至约第10天每天添加一次。在一个实施方案中，UMG可从约第4天至约第14天每天添加一次。在一些实施方案中，生产阶段培养基补充有锰1.0至25μM、2.0至15μM、3至10μM或约5μM，例如平均每天添加约0.2-1.5μM或0.3至1.2μM；尿苷1至8mM、1.5至5mM、1.6至4.8mM或约2.4mM或2.7mM，例如平均每天添加约100-700μM；以及半乳糖0.5至3.5mM、0.7至2.9mM、2.5至50mM、5至35mM、约8至25mM或约12mM或12.6mM，例如平均每天添加约0.5-3.5mM。在某些实施方案中，从生产阶段培养的第四天开始实行平均每天添加。在一些实施方案中，将本文所述的UMG补充剂添加到CHO细胞培养基(例如，国际专利公开号WO98/08934A1中提供的培养基)中，所述公开的全部内容以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，将本文所述的UMG补充剂添加到CD-CHO培养基中。在一些实施方案中，将本文所述的UMG补充剂添加到CD-CHO AGT(目录号12490-001(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中。
在一个实施方案中，将UMG添加到生产培养基中，使得从补充到收获添加的UMG的累积浓度为约1-7mM尿苷、约2-15μM锰和约3-20mM半乳糖。在一些实施方案中，从补充到收获添加到生产培养基中的锌的累积浓度为约5-45μM。
在一个实施方案中，将尿苷、锰和半乳糖(UMG)作为补充剂添加补料培养基中，使得补料培养基中尿苷的浓度为1至40mM、15至100mM、15至90mM、15至70mM、15至50mM、15至30mM、约18mM、约19mM、约20mM、约21mM、约33mM、约50mM或约66mM尿苷的最终浓度；补料培养基中锰的浓度为约0.0001至0.1mM、0.02mM至0.2mM、0.03mM至0.15mM、0.03mM至0.10mM、0.03mM至0.05mM、0.03mM至0.04mM、约0.03mM、约0.04mM、约0.05mM、约0.06mM、约0.07mM、约0.08mM、约0.1mM或约0.14mM锰的最终浓度；并且补料培养基中半乳糖的浓度为85mM至500mM、90mM至400mM、90mM至300mM、90mM至200mM、50mM至150mM、90mM至100mM、约95mM、约96mM、约97mM、约100mM、约165mM、约250mM或约330mM半乳糖的最终浓度。在一个实施方案中，在生产阶段培养的起始日之后(例如，从生产阶段培养的第二天至第十天、第二天至第八天、第二天至第六天、第三天至第六天之间的一天开始，或从生产阶段培养的第四天开始)将补充有尿苷、锰和半乳糖的补料培养基添加到生产培养基中(例如，多次，例如每一天或每两天一次)。在某些实施方案中，从生产阶段培养的第四天开始，将补充有尿苷、锰和半乳糖的补料培养基例如每天一次添加到生产培养基中。
在某些实施方案中，将含有尿苷、锰和半乳糖(UMG)的组合补充剂添加到生产培养基中(或添加到随后被添加到生产培养基的补料溶液中)，用于产生包含抗α4β7抗体(诸如维多珠单抗)的组合物，其中所述组合物的碱性抗体同工型的水平降低。在一个实施方案中，碱性同工型的水平为约16％或更少(如通过CEX所测定)。在一个实施方案中，碱性同工型的水平为约15％或更少(如通过CEX所测定)。在一个实施方案中，碱性同工型的水平为约14％或更少(如通过CEX所测定)。在一个实施方案中，碱性同工型的水平为约13％或更少(如通过CEX所测定)。在一个实施方案中，碱性同工型的水平为约12％或更少(如通过CEX所测定)。
在生产培养基中添加UMG还会影响由哺乳动物细胞产生的抗α4β7抗体(诸如维多珠单抗)的组合物中抗体的酸性种类和/或主要种类的水平。
在生产培养基中添加UMG还会影响由哺乳动物细胞产生的抗α4β7抗体(诸如维多珠单抗)的组合物中抗体的G0F、G1F和/或G2F糖型的水平。可存在于抗α4β7抗体(诸如维多珠单抗)的群体中的N-聚糖的结构描绘如图9所提供。
在某些实施方案中，将含有尿苷、锰和半乳糖(UMG)的组合补充剂添加到生产培养基中(或添加到随后被添加到生产培养基的补料溶液中)，用于产生包含抗α4β7抗体(诸如维多珠单抗)的组合物，其中所述组合物的G0F糖型的水平减少。在一个实施方案中，G0F糖型的水平为约70％或更少(如通过亲水相互作用色谱法(HILIC)所测定)。在一个实施方案中，G0F糖型的水平为约69％或更少(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G0F糖型的水平为约68％或更少(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G0F糖型的水平为约67％或更少(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G0F糖型的水平为约66％或更少(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G0F糖型的水平为约65％或更少(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G0F糖型的水平为约64％或更少(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G0F糖型的水平为约63％或更少(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G0F糖型的水平为约62％或更少(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G0F糖型的水平为约61％或更少(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G0F糖型的水平为约60％或更少(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G0F糖型的水平为约59％或更少(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G0F糖型的水平为约58％或更少(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G0F糖型的水平为约57％或更少(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G0F糖型的水平为约56％或更少(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G0F糖型的水平为约55％或更少(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G0F糖型的水平为约40％-75％。在一个实施方案中，G0F糖型的水平为约45％-65％(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G0F糖型的水平为约50％-60％(如通过HILIC所测定)。
在某些实施方案中，将含有尿苷、锰和半乳糖(UMG)的组合补充剂添加到生产培养基中(或添加到随后被添加到生产培养基的补料溶液中)，用于产生包含抗α4β7抗体(诸如维多珠单抗)的组合物，其中与在缺少补充剂的情况下培养的表达抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞相比，所述组合物的G0F糖型的量减少。在一个实施方案中，与在缺少补充剂的情况下培养的表达人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞相比，所述组合物包含至少约20％-40％(例如，20％-40％、20％-30％、20％-25％)减少的人源化抗α4β7抗体的G0F糖型。在一个实施方案中，与在缺少补充剂的情况下培养的表达人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞相比，所述组合物包含至少约20％减少的人源化抗α4β7抗体的G0F糖型。在一个实施方案中，与在缺少补充剂的情况下培养的表达人源化抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞相比，所述组合物包含至少约25％减少的人源化抗α4β7抗体的G0F糖型。除了指定为不同的参数(例如，缺少补充剂)之外，在基本上类似的条件下进行比较对照。
在某些实施方案中，将含有尿苷、锰和半乳糖(UMG)的组合补充剂添加到生产培养基中(或添加到随后被添加到生产培养基的补料溶液中)，用于产生包含抗α4β7抗体(诸如维多珠单抗)的组合物，其中所述组合物的G1F糖型水平增加。在一个实施方案中，G1F糖型的水平为约20％或更多(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G1F糖型的水平为约21％或更多(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G1F糖型的水平为约22％或更多(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G1F糖型的水平为约23％或更多(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G1F糖型的水平为约24％或更多(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G1F糖型的水平为约25％或更多(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G1F糖型的水平为约26％或更多(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G1F糖型的水平为约27％或更多(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G1F糖型的水平为约28％或更多(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G1F糖型的水平为约29％或更多(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G1F糖型的水平为约30％或更多(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G1F糖型的水平为约31％或更多(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G1F糖型的水平为约32％或更多(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G1F糖型的水平为约33％或更多(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G1F糖型的水平为约20％-45％。在一个实施方案中，G1F糖型的水平为约25％-45％(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G1F糖型的水平为约30％-40％(如通过HILIC所测定)。
在某些实施方案中，将含有尿苷、锰和半乳糖(UMG)的组合补充剂添加到生产培养基中(或添加到随后被添加到生产培养基的补料溶液中)，用于产生包含抗α4β7抗体(诸如维多珠单抗)的组合物，其中与在缺少补充剂的情况下培养的包含表达抗α4β7抗体的哺乳动物宿主细胞的对照细胞培养物相比，所述组合物的G1F糖型的量增加。在一个实施方案中，与在缺少补充剂的情况下培养的包含表达人源化抗α4β7抗体的哺乳动物宿主细胞的对照细胞培养物相比，所述组合物包含至少约2倍至3.5倍(例如，2至3.5倍、2至3.3倍、2至3倍)增加的人源化抗α4β7抗体的G1F糖型。在一个实施方案中，与在缺少补充剂的情况下培养的包含表达人源化抗α4β7抗体的哺乳动物宿主细胞的对照细胞培养物相比，所述组合物包含至少约2倍增加的人源化抗α4β7抗体的G1F糖型。在一个实施方案中，与在缺少补充剂的情况下培养的包含表达人源化抗α4β7抗体的哺乳动物宿主细胞的对照细胞培养物相比，所述组合物包含至少约3倍增加的人源化抗α4β7抗体的G1F糖型。所述对照细胞培养物在除指定参数(例如补充剂)外基本上相同的条件下培养。
在某些实施方案中，将含有尿苷、锰和半乳糖(UMG)的组合补充剂添加到生产培养基中(或添加到随后被添加到生产培养基的补料溶液中)，用于产生包含抗α4β7抗体(诸如维多珠单抗)的组合物，其中所述组合物的G2F糖型水平增加。在一个实施方案中，G2F糖型的水平为约2％或更多(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G2F糖型的水平为约2.5％或更多(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G2F糖型的水平为约3％或更多(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G2F糖型的水平为约3.5％或更多(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G2F糖型的水平为约4％或更多(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G2F糖型的水平为约4.5％或更多(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G2F糖型的水平为约5％或更多(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G2F糖型的水平为约5.5％或更多(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G2F糖型的水平为约6％或更多(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G2F糖型的水平为约6.5％或更多(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G2F糖型的水平为约7％或更多(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G2F糖型的水平小于或等于10％。在一个实施方案中，G2F糖型的水平为约2％-4％(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G2F糖型的水平为约3％-5％(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G2F糖型的水平为约2％-7％(如通过HILIC所测定)。
在某些实施方案中，将含有尿苷、锰和半乳糖(UMG)的组合补充剂添加到生产培养基中(或添加到随后被添加到生产培养基的补料溶液中)，用于产生包含抗α4β7抗体(诸如维多珠单抗)的组合物，其中所述组合物的G2F糖型水平增加。在一个实施方案中，G2F糖型的水平为约2％或更多(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G2F糖型的水平为约3％或更多(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，G2F糖型的水平为约4％或更多(如通过HILIC所测定)。
在某些实施方案中，将含有尿苷、锰和半乳糖(UMG)的组合补充剂添加到生产培养基中(或添加到随后被添加到生产培养基的补料溶液中)，用于产生包含抗α4β7抗体(诸如维多珠单抗)的组合物，其中与在缺少补充剂的情况下培养的表达抗α4β7抗体的对照哺乳动物宿主细胞相比，所述组合物的G2F糖型的量增加。在一个实施方案中，与在缺少补充剂的情况下培养的包含表达人源化抗α4β7抗体的哺乳动物宿主细胞的对照细胞培养物相比，所述组合物包含至少约2倍至5倍(例如2至5倍、2至4倍、3至4倍)增加的人源化抗α4β7抗体的G2F糖型。在一个实施方案中，与在缺少补充剂的情况下培养的包含表达人源化抗α4β7抗体的哺乳动物宿主细胞的对照细胞培养物相比，所述组合物包含至少约3倍增加的人源化抗α4β7抗体的G2F糖型。在一个实施方案中，与在缺少补充剂的情况下培养的包含表达人源化抗α4β7抗体的哺乳动物宿主细胞的对照细胞培养物相比，所述组合物包含至少约4倍增加的人源化抗α4β7抗体的G2F糖型。所述对照细胞培养物在除指定参数(例如补充剂)外基本上相同的条件下培养。
在某些实施方案中，将含有尿苷、锰和半乳糖(UMG)的组合补充剂添加到生产培养基中(或添加到随后被添加到生产培养基的补料溶液中)，用于产生包含抗α4β7抗体(诸如维多珠单抗)的组合物，其中与在缺少补充剂的情况下培养的包含表达抗α4β7抗体的哺乳动物宿主细胞的对照细胞培养物相比，所述组合物的G1F和G2F糖型的量增加。在一个实施方案中，与在缺少补充剂的情况下培养的包含表达人源化抗α4β7抗体的哺乳动物宿主细胞的对照细胞培养物相比，所述组合物包含至少约2倍至5倍(例如2至5倍、2至4倍、3至4倍)增加的人源化抗α4β7抗体的G1F糖型以及至少约2倍至5倍(例如2至5倍、2至4倍、3至4倍)增加的人源化抗α4β7抗体的G2F糖型。在一个实施方案中，与在缺少补充剂的情况下培养的包含表达人源化抗α4β7抗体的哺乳动物宿主细胞的对照细胞培养物相比，所述组合物包含至少约3倍增加的人源化抗α4β7抗体的G1F和G2F糖型。在一个实施方案中，与在缺少补充剂的情况下培养的包含表达人源化抗α4β7抗体的哺乳动物宿主细胞的对照细胞培养物相比，所述组合物包含至少约2倍增加的人源化抗α4β7抗体的G1F糖型的量以及4倍增加的人源化抗α4β7抗体的G2F糖型。所述对照细胞培养物在除指定参数(例如补充剂)外基本上相同的条件下培养。
在某些实施方案中，将含有尿苷、锰和半乳糖(UMG)的组合补充剂添加到生产培养基中(或添加到随后被添加到生产培养基的补料溶液中)，用于产生包含抗α4β7抗体(诸如维多珠单抗)的组合物，其中所述组合物具有88％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、或95％或更多的总去唾液酸、无半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G0F)，去唾液酸、单半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G1F)，和/或去唾液酸、二半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G2F)糖基化变体。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法可产生人源化抗α4β7抗体的群体，其具有91％-96％、92％-95％、91％-92％、91％-92.5％、91％-93％或91％-95％的总去唾液酸、无半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G0F)，去唾液酸、单半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G1F)，和/或去唾液酸、二半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G2F)糖基化变体。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法可生产人源化抗α4β7抗体的群体，其具有92％至98％、92％至97％、92％至96％或92％至95％的总去唾液酸、无半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G0F)，去唾液酸、单半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G1F)，和/或去唾液酸、二半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G2F)糖基化变体，
培养基补充剂可在水、基础培养基或诸如以下的缓冲液中提供：抗坏血酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐、(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、组氨酸、谷氨酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、葡萄糖酸盐、组氨酸、磷酸盐、马来酸盐、二甲胂酸盐、2-[N-吗啉代]乙磺酸(MES)、双(2-羟乙基)亚氨基三[羟甲基]甲烷(Bis-Tris)、N-[2-乙酰氨基]-2-亚氨基二乙酸(ADA)、双甘氨肽和其他有机酸或两性离子缓冲液。在一些实施方案中，培养基补充剂具有5.5至7.0、6.0至7.5或5.9至6.1的pH。在其他实施方案中，培养基补充剂具有1.5至5.5、1.8至3.0、3.2至4.5或1.9至2.1的pH。在其他实施方案中，培养基补充剂具有7.5至9.0的pH。
在一些实施方案中，锌和UMG用于补充从生产阶段培养的第四天开始每天添加的补料溶液。
在某些实施方案中，含有金属(例如锌或锰)的补充剂是低pH下的缓冲液，诸如柠檬酸盐或乙酸盐缓冲液。柠檬酸盐还可起到螯合金属离子以限制金属离子补充剂毒性的作用。在一个实施方案中，含有金属的补充剂包含锌和锰，例如柠檬酸盐缓冲液中的100至140mM或115至125mM的锌和锰。在一个实施方案中，含有金属的补充剂的缓冲液包含118至122mM柠檬酸，pH 1.9至2.1。因此，在一些实施方案中，本文提供了可通过在补充有在pH1.9至2.1的115至125mM柠檬酸盐缓冲液中的50-150μM锌和10-50mM锰溶液的生产培养基中培养表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的GS-CHO宿主细胞而获得的细胞培养物。在一些实施方案中，本文提供了可通过在补充至浓度为10-100μM锌和0.1-100μM锰浓度的生产培养基(通过添加在pH 1.9至2.1的115至125mM柠檬酸盐缓冲补料补充剂中的锌和锰)中培养表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的GS-CHO宿主细胞而获得的细胞培养物。在一些实施方案中，将柠檬酸盐缓冲金属补充剂例如从生产培养的第4天开始添加到每日补料补充剂中。
在一些实施方案中，本文提供了包含表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的宿主细胞(或宿主细胞群体)的细胞培养物和包含或补充有金属离子、核苷、糖和/或金属辅因子的生产培养基。在其他实施方案中，本文提供了可通过在包含或补充有金属离子、核苷、糖和/或金属辅因子的生产培养基中培养表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的宿主细胞而获得的细胞培养物。
在一些实施方案中，本文提供了包含表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的宿主细胞(或宿主细胞群体)的细胞培养物和包含或补充有糖、核苷和/或金属辅因子的生产培养基。在其他实施方案中，本文提供了可通过在包含或补充有糖、核苷和/或金属辅因子的生产培养基中培养表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的宿主细胞而获得的细胞培养物。
在一些实施方案中，本文提供了包含表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的宿主细胞(或宿主细胞群体)的细胞培养物和包含或补充有尿苷、锰和半乳糖(UMG)的生产培养基。在其他实施方案中，本文提供了可通过在包含或补充有尿苷、锰和半乳糖(UMG)的生产培养基中培养表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的宿主细胞而获得的细胞培养物。
前述细胞培养物可并入本文所述的实施方案中的任一项中。例如，在一些实施方案中，宿主细胞是CHO细胞，例如GS-CHO细胞或DHFR-CHO细胞。在一些实施方案中，宿主细胞表达包含SEQ ID NO:1的重链可变区和SEQ ID NO:5的轻链可变区的抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，宿主细胞表达包含以下的抗体或其抗原结合部分：包含描述于SEQID NO:2中的CDR1、描述于SEQ ID NO:3中的CDR2和描述于SEQ ID NO:4中的CDR3的重链可变区以及包含描述于SEQ ID NO:6中的CDR1、描述于SEQ ID NO:7中的CDR2和描述于SEQ IDNO:8中的CDR3的轻链可变区。在一些实施方案中，宿主细胞表达维多珠单抗或其抗原结合部分。在一些实施方案中，宿主细胞包含列示于SEQ ID NO:9中的核酸(编码抗α4β7抗体的轻链可变区)和列示于SEQ ID NO:10中的核酸(编码抗α4β7抗体的轻链可变区)。在一些实施方案中，宿主细胞包含列示于SEQ ID NO:11中的核酸(编码维多珠单抗的轻链)和如SEQID NO:12所列示的核酸(编码维多珠单抗的重链)。
在一些实施方案中，细胞培养物含有浓度为0.1至20mM的尿苷。例如，在一些实施方案中，细胞培养物含有0.1至20mM、1至20mM、0.5至12mM、1至8mM、1.5至4mM、0.1至1.5mM、0.1至5mM、5mM至10mM、10mM至15mM、15mM至20mM、0.1mM至10mM、10mM至20mM、1至7mM、7至14mM或14至20mM。在其他实施方案中，细胞培养物含有浓度为10-50mM、20-60mM、30-70mM、40-80mM、50-90mM、60-100mM或0.1至100mM的尿苷。在一些实施方案中，细胞培养物含有浓度为约10mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM、约20mM、约21mM、约22mM、约25mM、约27mM、约30mM、约33mM、约35mM、约40mM、约45mM、约50mM、约55mM、约60mM、约66mM或约70mM的尿苷。
在一些实施方案中，细胞培养物含有浓度为0.1至100μM的锰。例如，在一些实施方案中，细胞培养物含有浓度为0.1至100μM、0.5至50μM、1.0至25μM、2.0至15μM、3至10μM、0.1至10μM、0.1至20μM、0.1至30μM、1至10μM、1至20μM、1至30μM、1至40μM、1至50μM、1至60μM、1至70μM、1至80μM、1至90μM、1至100μM、20至40μM、40至60μM、60至80μM、80至100μM、20至50μM、30至60μM、40至70μM、50至80μM、70至100μM、20至70μM、30至80μM、40至90μM、或50至100μM的锰。在其他实施方案中，细胞培养物含有浓度为约0.1μM、约0.2μM、约0.3μM、约0.4μM、约0.5μM、约0.6μM、约0.7μM、约0.8μM、约0.9μM、约1μM、约2μM、约3μM、约5μM、约10μM、约20μM、约30μM、约40μM、约50μM、约60μM、约70μM、约80μM、约90μM或约100μM的锰。
在一些实施方案中，细胞培养物含有浓度为0.1至100mM的半乳糖。例如，在一些实施方案中，细胞培养物含有浓度为1至75mM、2.5至50mM、5至35mM、约8至25mM、0.1至10mM、0.1至20mM、0.1至30mM、1至10mM、1至20mM、1至30mM、1至40mM、1至50mM、1至60mM、1至70mM、1至80mM、1至90mM、1至100mM、20至40mM、40至60mM、60至80mM、80至100mM、20至50mM、30至60mM、40至70mM、50至80mM、70至100mM、20至70mM、30至80mM、40至90mM、或50至100mM的半乳糖。在一些实施方案中，细胞培养物含有浓度为约0.1mM、约0.2mM、约0.3mM、约0.4mM、约0.5mM、约0.6mM、约0.7mM、约0.8mM、约0.9mM、约1mM、约2mM、约3mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10μM、约12.5mM、约12mM、约15mM、约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM或约100mM的半乳糖。
在一些实施方案中，本文提供了可通过在包含或补充有尿苷、锰和半乳糖的生产培养基中培养表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的宿主细胞(或宿主细胞群体)而获得的细胞培养物。例如，在一些实施方案中，细胞培养物可包含0.1至20mM(及其中的范围)的尿苷、0.1至100μM(及其中的范围)的锰和0.1至100mM(及其中的范围)的半乳糖。在一些实施方案中，细胞培养物可另外包含锌，如本文所述。在一些实施方案中，细胞培养物可另外包含赖氨酸和/或精氨酸，如本文所述。在一些实施方案中，细胞培养物可另外包含锌、赖氨酸和精氨酸。在一些实施方案中，本文提供了包含表达抗α4β7抗体(例如维多珠单抗)或其抗原结合部分的宿主细胞(或宿主细胞群体)和生产培养基的细胞培养物，在生产阶段期间(例如第4天至收获)，向所述生产培养基中添加了累积浓度为约1至约7mM的尿苷、约2至约15μM的锰、约3至约20mM的半乳糖和/或约0.005至约0.045mM的锌。
在一些实施方案中，本文提供了可通过在包含或补充有尿苷、锰、半乳糖和锌的生产培养基中培养表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的宿主细胞(或宿主细胞群体)而获得的细胞培养物。例如，在一些实施方案中，细胞培养物可包含0.1至20mM(及其中的范围)的尿苷、0.1至100μM(及其中的范围)的锰、0.1至100mM(及其中的范围)的半乳糖和10至100μM(及其中的范围)的锌。
在一些实施方案中，本文提供了可通过在包含或补充有尿苷、锰、半乳糖、锌、赖氨酸和/或精氨酸的生产培养基中培养表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的宿主细胞(或宿主细胞群体)而获得的细胞培养物。例如，在一些实施方案中，细胞培养物可包含0.1至20mM(及其中的范围)的尿苷、0.1至100μM(及其中的范围)的锰、0.1至100mM(及其中的范围)的半乳糖、10至100μM(及其中的范围)的锌、5.0至8.8g/L(及其中的范围)的赖氨酸和/或3.0至12.0g/L(及其中的范围)的精氨酸。
在一些实施方案中，相对于包含缺乏尿苷、锰和/或半乳糖的培养基或未补充尿苷、锰和/或半乳糖的培养基的等效细胞培养物，所述细胞培养物的细胞表达碱性同工型水平降低(如通过CEX所测定)的抗α4β7抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，表达的抗体包含约16％或更少的碱性同工型(如通过CEX所测定)。在一些实施方案中，表达的抗体包含约15％或更少的碱性同工型(如通过CEX所测定)。在一些实施方案中，表达的抗体包含约14％或更少的碱性同工型(如通过CEX所测定)。在一些实施方案中，表达的抗体包含约13％或更少的碱性同工型(如通过CEX所测定)。在一些实施方案中，表达的抗体包含约12％或更少的碱性同工型(如通过CEX所测定)。在一些实施方案中，表达的抗体包含约11％或更少的碱性同工型(如通过CEX所测定)。
在一些实施方案中，相对于包含缺乏尿苷、锰和/或半乳糖的培养基或未补充尿苷、锰和/或半乳糖的培养基的等效细胞培养物，所述细胞培养物的细胞表达G0F糖型水平降低(如通过HILIC所测定)的抗α4β7抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，细胞培养物的细胞表达G0F含量为70％或更少、65％或更少、60％或更少、或55％或更少的抗α4β7抗体(如通过HILIC所测定)。在一些实施方案中，细胞培养物的细胞表达G0F含量为85％或更少、80％或更少、75％或更少、70％或更少、69％或更少、68％或更少、67％或更少、66％或更少、65％或更少、64％或更少、63％或更少、62％或更少、61％或更少、60％或更少、59％或更少、58％或更少、57％或更少、56％或更少、或55％或更少的抗α4β7抗体(如通过HILIC所测定)。在一些实施方案中，细胞培养物的细胞表达G0F含量为45％-65％的抗α4β7抗体。在一些实施方案中，细胞培养物的细胞表达G0F含量为50％-60％的抗α4β7抗体。在一些实施方案中，细胞培养物的细胞表达G0F含量为45％-85％的抗α4β7抗体。在一些实施方案中，细胞培养物的细胞表达G0F含量为45％-82％的抗α4β7抗体。在一些实施方案中，相对于由包含缺乏尿苷、锰和/或半乳糖的培养基或未补充尿苷、锰和/或半乳糖的培养基的等效细胞培养物产生的等效抗α4β7抗体的G0F含量，由包含含有或补充有如本文所述的尿苷、锰、和/或半乳糖的培养基的细胞培养物产生的抗α4β7抗体的G0F含量降低了至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、或至少40％。
在一些实施方案中，相对于包含缺乏尿苷、锰和/或半乳糖的培养基或未补充尿苷、锰和/或半乳糖的培养基的等效细胞培养物，所述细胞培养物的细胞表达G1F糖型水平增加(如通过HILIC所测定)的抗α4β7抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，细胞培养物的细胞表达G1F含量为10％或更多、15％或更多、20％或更多、21％或更多、22％或更多、23％或更多、24％或更多、25％或更多、26％或更多、27％或更多、28％或更多、29％或更多、30％或更多、31％或更多、32％或更多、或33％或更多的抗α4β7抗体(如通过HILIC所测定)。在一些实施方案中，细胞培养物的细胞表达G1F含量为25％-45％的抗α4β7抗体。在一些实施方案中，细胞培养物的细胞表达G1F含量为30％-40％的抗α4β7抗体。在一些实施方案中，细胞培养物的细胞表达G1F含量为10％-45％的抗α4β7抗体。在一些实施方案中，相对于由包含缺乏尿苷、锰和/或半乳糖的培养基或未补充尿苷、锰和/或半乳糖的培养基的等效细胞培养物产生的等效抗α4β7抗体的G1F含量，由包含含有或补充有如本文所述的尿苷、锰、和/或半乳糖的培养基的细胞培养物产生的抗α4β7抗体的G1F含量增加至少2倍、至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍、至少3倍、至少3.25倍、或至少3.5倍。
在一些实施方案中，相对于包含缺乏尿苷、锰和/或半乳糖的培养基或未补充尿苷、锰和/或半乳糖的培养基的等效细胞培养物，所述细胞培养物的细胞表达G2F糖型水平增加(如通过HILIC所测定)的抗α4β7抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，细胞培养物的细胞表达G2F含量为0.5％或更多、1％或更多、1.5％或更多、2％或更多、2.5％或更多、3％或更多、3.5％或更多、4％或更多、4.5％或更多、5％或更多、5.5％或更多、6％或更多、6.5％或更多、7％或更多、或8％或更多的抗α4β7抗体(如通过HILIC所测定)。在一些实施方案中，细胞培养物的细胞表达G2F含量为2％-4％的抗α4β7抗体。在一些实施方案中，细胞培养物的细胞表达G2F含量为3％-5％的抗α4β7抗体。在一些实施方案中，细胞培养物的细胞表达G2F含量为2％-7％的抗α4β7抗体。在一些实施方案中，细胞培养物的细胞表达G2F含量为0.5％-7.5％的抗α4β7抗体。在一些实施方案中，相对于由包含缺乏尿苷、锰和/或半乳糖的培养基或未补充尿苷、锰和/或半乳糖的培养基的等效细胞培养物产生的等效抗α4β7抗体的G1F含量，由包含含有或补充有如本文所述的尿苷、锰、和/或半乳糖的培养基的细胞培养物产生的抗α4β7抗体的G2F含量增加至少2倍、至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍、至少3倍、至少3.25倍、至少3.5倍、至少3.75倍、至少4倍、至少4.25倍、至少4.5倍、至少4.75倍、或至少5倍。
在一些实施方案中，本文提供的细胞培养物可产生人源化抗α4β7抗体的群体，其中所述群体具有88％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、或95％或更多的总去唾液酸、无半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G0F)，去唾液酸、单半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G1F)，和/或去唾液酸、二半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G2F)糖基化变体(如通过HILIC所测定)。在一些实施方案中，所述细胞培养物可产生人源化抗α4β7抗体的群体，其具有91％-96％、92％-95％、91％-92％、91％-92.5％、91％-93％、或91％-95％的总去唾液酸、无半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G0F)，去唾液酸、单半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G1F)，和/或去唾液酸、二半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G2F)糖基化变体(如通过HILIC所测定)。在一些实施方案中，所述细胞培养物可产生人源化抗α4β7抗体的群体，其具有92％至98％、92％至97％、92％至96％、或92％至95％的总去唾液酸、无半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G0F)，去唾液酸、单半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G1F)，和/或去唾液酸、二半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G2F)糖基化变体。
在一些实施方案中，本文提供了一种产生单克隆抗体的方法，其包括(i)培养包含表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的宿主细胞以及包含或补充有尿苷、锰和/或半乳糖的生产培养基的细胞培养物，持续一段足以使宿主细胞表达抗α4β7抗体或其抗原结合部分的时间，以及(ii)从细胞培养物中回收抗α4β7抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，相对于从包含缺乏尿苷、锰和/或半乳糖的培养基或未补充尿苷、锰和/或半乳糖的培养基的等效细胞培养物中回收的抗α4β7抗体或其抗原结合部分的群体，从所述细胞培养物中回收的抗α4β7抗体或其抗原结合部分的群体包含降低水平的碱性同工型(如通过CEX所测定)。在一些实施方案中，相对于从包含缺乏尿苷、锰和/或半乳糖的培养基或未补充尿苷、锰和/或半乳糖的培养基的等效细胞培养物中回收的抗α4β7抗体或其抗原结合部分的群体，从所述细胞培养物中回收的抗α4β7抗体或其抗原结合部分的群体包含降低水平的G0F)。在一些实施方案中，生产培养基还包含或还补充有锌。在一些实施方案中，生产培养基还包含或还补充有赖氨酸和/或精氨酸。在一些实施方案中，细胞培养物培养5-20天。在一些实施方案中，细胞培养物培养10-16天。在一些实施方案中，细胞培养物培养13-15天。在一些实施方案中，细胞培养物培养5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。本文还提供了通过前述方法获得或可通过前述方法获得的抗α4β7抗体。
在一个实施方案中，本文提供了一种包含维多珠单抗的组合物，所述维多珠单抗具有88％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、或95％或更多的总去唾液酸、无半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G0F)，去唾液酸、单半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G1F)，和/或去唾液酸、二半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G2F)糖基化变体。在一个实施方案中，本文提供了一种包含维多珠单抗的组合物，所述维多珠单抗具有91％-96％、92％-95％、91％-92％、91％-92.5％、91％-93％、或91％-95％的总去唾液酸、无半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G0F)，去唾液酸、单半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G1F)，和/或去唾液酸、二半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G2F)糖基化变体。在一些实施方案中，前述组合物可通过在补充有尿苷、锰和半乳糖的生产培养基中培养重组表达维多珠单抗的GS-CHO细胞而获得。在一些实施方案中，前述组合物可通过在补充有尿苷、锰、半乳糖和锌的生产培养基中培养重组表达维多珠单抗的GS-CHO细胞而获得。在一些实施方案中，前述组合物可通过在补充有尿苷、锰、半乳糖、锌、精氨酸和/或赖氨酸的生产培养基中培养重组表达维多珠单抗的GS-CHO细胞而获得。
在一个实施方案中，本文提供了一种包含维多珠单抗的组合物，所述维多珠单抗具有85％或更少、80％或更少、75％或更少、70％或更少、69％或更少、68％或更少、67％或更少、66％或更少、65％或更少、64％或更少、63％或更少、62％或更少、61％或更少、60％或更少、59％或更少、58％或更少、57％或更少、56％或更少、或55％或更少的去唾液酸、无半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G0F)(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，本文提供了一种包含维多珠单抗的组合物，所述维多珠单抗具有45％-65％或50％-60％的去唾液酸、无半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G0F)(如通过HILIC所测定)。在一些实施方案中，前述组合物可通过在补充有尿苷、锰和半乳糖的生产培养基中培养重组表达维多珠单抗的GS-CHO细胞而获得。在一些实施方案中，前述组合物可通过在补充有尿苷、锰、半乳糖和锌的生产培养基中培养重组表达维多珠单抗的GS-CHO细胞而获得。在一些实施方案中，前述组合物可通过在补充有尿苷、锰、半乳糖、锌、精氨酸和/或赖氨酸的生产培养基中培养重组表达维多珠单抗的GS-CHO细胞而获得。
在一个实施方案中，本文提供了一种包含维多珠单抗的组合物，所述维多珠单抗具有10％或更多、15％或更多、20％或更多、21％或更多、22％或更多、23％或更多、24％或更多、25％或更多、26％或更多、27％或更多、28％或更多、29％或更多、30％或更多、31％或更多、32％或更多、或33％或更多的去唾液酸、单半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G1F)(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，本文提供了一种包含维多珠单抗的组合物，所述维多珠单抗具有25％-45％或30％-40％的去唾液酸、单半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G1F)(如通过HILIC所测定)。在一些实施方案中，前述组合物可通过在补充有尿苷、锰和半乳糖的生产培养基中培养重组表达维多珠单抗的GS-CHO细胞而获得。在一些实施方案中，前述组合物可通过在补充有尿苷、锰、半乳糖和锌的生产培养基中培养重组表达维多珠单抗的GS-CHO细胞而获得。在一些实施方案中，前述组合物可通过在补充有尿苷、锰、半乳糖、锌、精氨酸和/或赖氨酸的生产培养基中培养重组表达维多珠单抗的GS-CHO细胞而获得。
在一个实施方案中，本文提供了一种包含维多珠单抗的组合物，所述维多珠单抗具有0.5％或更多、1％或更多、1.5％或更多、2％或更多、2.5％或更多、3％或更多、3.5％或更多、4％或更多、4.5％或更多、5％或更多、5.5％或更多、6％或更多、6.5％或更多、7％或更多、或8％或更多的去唾液酸、二半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G2F)(如通过HILIC所测定)。在一个实施方案中，本文提供了一种包含维多珠单抗的组合物，所述维多珠单抗具有2％-4％、3％-5％、或2％-7％的去唾液酸、二半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G2F)(如通过HILIC所测定)。在一些实施方案中，前述组合物可通过在补充有尿苷、锰和半乳糖的生产培养基中培养重组表达维多珠单抗的GS-CHO细胞而获得。在一些实施方案中，前述组合物可通过在补充有尿苷、锰、半乳糖和锌的生产培养基中培养重组表达维多珠单抗的GS-CHO细胞而获得。在一些实施方案中，前述组合物可通过在补充有尿苷、锰、半乳糖、锌、精氨酸和/或赖氨酸的生产培养基中培养重组表达维多珠单抗的GS-CHO细胞而获得。
在一些实施方案中，用于在CHO细胞培养物中产生抗α4β7抗体的方法包括向培养物提供包含金属离子和金属辅因子的培养基补充剂以及包含核苷和糖的另一种培养基补充剂。在一些实施方案中，用于在CHO细胞培养物中产生抗α4β7抗体的方法包括向培养物提供包含金属离子的培养基补充剂以及包含核苷、糖和金属辅因子的培养基补充剂。在一些实施方案中，用于在CHO细胞培养物中产生抗α4β7抗体的方法包括向培养物提供包含金属离子、核苷、糖和金属辅因子的培养基补充剂。在一些实施方案中，用于在CHO细胞培养物中产生抗α4β7抗体的方法包括向培养物提供包含金属离子、核苷和金属辅因子的培养基补充剂。
实施例中提供的示例性培养基补充剂及其使用方法被视为本发明的实施方案。
C.补充赖氨酸和/或精氨酸
在前述方面的一些实施方案中，细胞培养基(例如生产阶段培养基)还可补充有赖氨酸和/或精氨酸。因此，在一些方面，本文提供的方法和组合物可采用补充有锌、赖氨酸和/或精氨酸的细胞培养基，例如生产阶段培养基。在其他方面，本文提供的方法和组合物可采用补充有尿苷、锰、半乳糖、赖氨酸和/或精氨酸的细胞培养基，例如生产阶段培养基。在其他方面，本文提供的方法和组合物可采用补充有尿苷、锰、半乳糖、锌、赖氨酸和/或精氨酸的细胞培养基，例如生产阶段培养基。
在一个实施方案中，生产培养基包含5.0至8.8g/L赖氨酸和3.0至12.0g/L精氨酸。在一个实施方案中，生产培养基包含4.5至5.5g/L赖氨酸。在一个实施方案中，生产培养基包含5.5至8.8g/L赖氨酸。在一个实施方案中，生产培养基包含5.4至7.4g/L精氨酸。在一个实施方案中，生产培养基包含7.4至12g/L精氨酸。
培养基可补充有如上所述的尿苷、锰、半乳糖和锌。例如，在一些实施方案中，细胞培养基(例如生产阶段培养基)补充有0.1-20mM尿苷、0.1-100μM锰、0.1-100mM半乳糖和1-100μM锌，并且还补充有5.0-8.8g/L赖氨酸和/或3.0至12.0g/L精氨酸。
III.上游生产方法
本发明涉及抗体(诸如抗α4β7抗体)在本文确定的条件和/或补充剂下在哺乳动物宿主细胞中的大规模重组生产，其产生的抗α4β7抗体(诸如维多珠单抗)滴度大于3g/L。哺乳动物细胞培养系统中高水平的重组抗体表达是本领域已知的挑战。
整个过程包括细胞培养基中经基因修饰以表达抗α4β7抗体的哺乳动物细胞的接种、生长阶段、生产阶段和最后收集重组抗体的收获阶段。在某些实施方案中，各个阶段之间可以是过渡阶段。
因此，作为第一步，可将编码所需重组抗α4β7抗体的核酸(例如cDNA)插入到可复制的载体中以供表达。各种载体是公开可用的并且是本领域技术人员已知的。载体组分通常包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列，其中每一个描述如下。可采用的任选信号序列、复制起点、标记基因、增强子元件和转录终止序列是本领域已知的并且在PCT公开WO 97/25428或美国专利号7,053,202中更详细地描述。
表达载体通常含有由宿主生物体识别并可操作地连接至蛋白质编码核酸序列的启动子。启动子是位于结构基因的起始密码子上游(5')的非翻译序列(通常在约100至1000bp内)，其控制与它们可操作地连接的特定核酸序列的转录和翻译。此类启动子通常分为两类，诱导型和组成型。诱导型启动子是响应于培养条件的一些变化(例如营养物的存在或缺少或温度变化)而引发在其控制下的DNA的增加水平的转录的启动子。此时，由各种潜在宿主细胞识别的大量启动子是众所周知的。通过限制酶消化从源DNA中去除启动子并将分离的启动子序列插入到载体中，将这些启动子与编码所需蛋白质的DNA可操作地连接。
可采用在哺乳动物细胞中提供瞬时表达的表达载体。一般而言，瞬时表达涉及使用能够在宿主细胞中有效复制的表达载体，使得宿主细胞积累表达载体的许多拷贝，进而合成高水平的由表达载体编码的所需多肽(Sambrook等人，同上)。瞬时表达系统，其包括合适的表达载体和宿主细胞，允许对由克隆的DNA编码的多肽进行方便的阳性鉴定，以及快速筛选此类多肽的所需生物学或生理学特性。哺乳动物宿主细胞被转染并优选用表达载体转化，并在适当改进的营养培养基中培养，用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。然后使此类细胞生长，并最终在经历了几轮复制后转移到更大的容器中，用于随后的生长和最终所关注的多肽的生产。
哺乳动物细胞(诸如CHO细胞)可在小规模培养物中(例如至多5L，诸如5ml、25ml、50ml、100ml、250ml、1L、3L或5L容器中)培养。可选地，培养物可以是中型规模容器，例如像10L、20L、100L或200L容器。可选地，培养物可以是大于200L的容器(诸如500L、1000L、2000L、3000L、5000L、10,000L和15,000L的容器)中的大规模培养物。诸如用于制造治疗性抗体的大规模细胞培养物通常保持数天甚至数周，同时所述细胞生产所需的蛋白质。
出于本发明的目的，细胞培养基是适合于在体外细胞培养中使动物细胞(诸如哺乳动物细胞)生长的培养基。细胞培养基类型的实例包括扩增细胞培养基和生产细胞培养基。
细胞培养基制剂是本领域众所周知的。典型地，细胞培养基由缓冲液、盐、碳水化合物、氨基酸、维生素和微量必需元素构成。细胞培养基可含有或不含血清、蛋白胨、蛋白质水解产物和/或蛋白质。各种组织培养基(包括无血清和成分明确的培养基)是可商购获得的，例如，可使用以下细胞培养基中的任一种或组合：RPMI-1640培养基、RPMI-1641培养基、杜氏改良的伊格尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM)、最低必需培养基Eagle、F-12K培养基、哈姆F12培养基(Ham'sF12 Medium)、伊思考夫氏改良的杜氏培养基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)、麦考伊氏5A培养基(McCoy's 5A Medium)、莱柏维兹氏L-15培养基(Leibovitz's L-15Medium)和无血清培养基诸如EX-CELL.TM.300系列(JRH Biosciences,Lenexa,Kans.)等。细胞培养基可补充有额外的或浓度增加的组分诸如氨基酸、盐、糖、维生素、激素、生长因子、缓冲液、抗生素、脂质、微量元素等，这取决于待培养细胞的要求和/或所需的细胞培养参数。CHO细胞培养基是本领域已知的，例如CD-CHO(Invitrogen)、CD-CHO-AGTTM培养基(ThermoFisher Scientific)、HYCELLTMCHO培养基(GE Healthcare Life Sciences)或CHOMACS CD培养基(Militenyi Biotech)。在一些实施方案中，如上所述的可商购获得的培养基可用作生产阶段培养物的起始培养基，用于产生抗α4β7抗体(诸如维多珠单抗)，例如在GS-CHO细胞中。在一个优选的实施方案中，抗体在生长在CD-CHO培养基中的GS-CHO细胞中产生，其中所述CD-CHO培养基如本文所述进行补充。
在生产阶段之前，首先将哺乳动物细胞在生长阶段在使细胞增殖和活力最大化的环境条件下培养。在生长阶段之后，开始生产阶段，由此使用使多肽生产最大化的细胞培养条件。生长阶段和生产阶段之前是一个或多个过渡阶段，或生长阶段和生产阶段被一个或多个过渡阶段分开。例如，在一个实施方案中，细胞培养过程的生产阶段之前是细胞培养的过渡阶段，其中涉及细胞培养的生产阶段的参数。
在生长阶段，使哺乳动物细胞在使生长最大化的条件和时间段下生长。培养条件(诸如温度、pH、溶解氧(DO2)等)是与特定宿主一起使用的条件，并且对于普通技术人员来说是显而易见的。通常，使用酸(例如CO2)或碱(例如Na2CO3或NaOH)将pH调整至约6.5与7.5之间的水平。用于培养哺乳动物细胞(诸如CHO细胞)的合适温度范围在约30至40摄氏度之间并且优选地在36至38摄氏度的范围内。
在由哺乳动物细胞生产蛋白质的商业过程中，通常存在多个，例如至少约2、3、4、5、6、7、8、9或10个生长阶段，它们在最终生产阶段之前发生在不同的(例如，连续增大的)培养容器中。
当细胞生长到足够数量时，将它们转移到大规模生产容器(例如生物反应器)中以开始生产阶段，由此在促进所关注的多肽(即抗体)生产的条件下培养哺乳动物宿主细胞.技术人员可选择使用本文所述的细胞培养基中的一种或多种，这些细胞培养基已被开发用于在特定培养的宿主细胞中生产重组多肽。可选地，根据本发明的方法和组合物可与可商购获得的细胞培养基组合使用。
典型地，生长阶段发生在比生产阶段更高的温度下。例如，生长阶段可在约35摄氏度至约38摄氏度的第一温度下发生，并且生产阶段可在约30摄氏度至约34摄氏度的第二温度下发生。然而，如实施例中所述，本文确定的改进之一是在细胞培养物中在哺乳动物细胞的生长阶段与生产阶段之间保持基本上类似的温度以用于抗α4β7抗体(例如维多珠单抗)生产，使来自细胞培养物的抗体滴度增加。事实上，通过在两个阶段之间保持类似的温度，维多珠单抗的抗体滴度大于1g/L，例如约5至7g/L。
因此，在一个实施方案中，本发明的特征在于一种在哺乳动物宿主细胞中产生人源化抗α4β7抗体的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞在扩增阶段在细胞培养基中培养，并且随后在生产阶段在细胞培养基中培养，其中扩增阶段和生产阶段都在约相同的平均温度(例如，两个阶段的平均温度为36至38摄氏度)下进行。在一个实施方案中，扩增阶段和生产阶段的平均温度均为36.5至37.5摄氏度，例如约37摄氏度。
可选地，本发明的特征在于一种在哺乳动物宿主细胞中产生人源化抗α4β7抗体的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞在扩增阶段在细胞培养基中培养，并且随后在生产阶段在细胞培养基中培养，其中扩增阶段和生产阶段都在约相同的温度范围内(例如36至38摄氏度，例如36.5至37.5摄氏度范围内的任何温度)进行。
生产阶段的长度可因细胞和所表达的抗体而异。在某些实施方案中，生产阶段为约14天或更短。在某些实施方案中，生产阶段为约15天或更短。在某些实施方案中，生产阶段为约16天或更短。可选地，生产阶段为8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、10至16天、11至15天、13至17天或12至14天。这些数字中包括部分天数，例如13.5天。
在一个实施方案中，细胞培养基的pH范围为6.0至8.0；6.5至7.5；6.7至7.0、6.7至6.9、6.95-7.05或7.1至7.2。介于这些pH值之间的数字，例如6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9和8.0以及本文所述的所有其他数字，也旨在成为本发明的一部分。使用上述值的任一个的组合作为上限和/或下限的值范围旨在包括在本发明的范围内。在一些实施方案中，培养物的pH可以从一个pH变化为另一个pH，诸如变化为比接种时更低的pH。例如，pH可从6.9至7.1、6.95至7.05或pH 7.00±0.1、±0.05或±0.02的pH范围变化为6.7至7.0、6.75至6.85或pH 6.8±0.1或±0.02的pH范围。变化的时间可在培养2、3、4或5天之后。在一些实施方案中，pH变化是在生产阶段培养的第四天或第五天。
因此，在一个实施方案中，本文提供了一种在经基因工程改造以表达抗体的哺乳动物宿主细胞中产生人源化抗α4β7抗体的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞在第一pH下在生产培养基中培养，并且随后变化为第二pH，其中所述第二pH低于所述第一pH。例如，在一些实施方案中，在宿主细胞培养的生产阶段期间，所述第二pH可变化为比所述第一pH低0.1至0.5个pH单位。在一个实施方案中，起始pH可在pH6.8至pH 7.2的范围内。在pH变化发生之后，经调整的pH可降低0.1至0.5个pH单位，例如0.1、0.2、0.3、0.4或0.5个pH单位。因此，在一些实施方案中，第二pH可在约6.7-6.95的范围内。
如以下实施例中所述，生产阶段期间的pH变化可例如降低抗体的碱性同工型的量，降低抗体的酸性同工型的量，和/或增加抗体的主要同工型的量。
在某些实施方案中，生产阶段期间细胞培养基的pH保持在6.5至7.0的pH范围内。
在某些实施方案中，生产阶段期间细胞培养基的pH保持在6.7至7.0的pH范围内。
在某些实施方案中，生产阶段期间细胞培养基的pH为约6.85。
在生产阶段期间，培养物可补充有浓缩补料培养基，所述培养基含有在细胞培养的生产阶段过程中消耗的组分诸如营养物和氨基酸。浓缩补料培养基可基于几乎任何细胞培养基制剂。此类浓缩补料培养基可含有细胞培养基的大部分组分或组分的子集，例如其正常量的约5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12x、14x、16x、20x、25至40x、30x、50x、100x、40至120x、200x、400x、600x、800x或甚至约1000x。浓缩补料培养基经常用于补料分批培养过程中。
在一个实施方案中，生产阶段是补料分批培养。补料分批培养是用于由哺乳动物细胞大规模生产蛋白质的广泛实践的培养方法。参见例如Chu和Robinson(2001),CurrentOpin.Biotechnol.12:180-87。抗体生产会对细胞有要求，并且基础培养基或起始培养基不能维持高的细胞密度和高水平的抗体生产。在没有新鲜营养物(诸如氨基酸或能量来源)的情况下，产率会受到影响或细胞会死亡。例如，消耗其氨基酸(诸如酪氨酸)供应的培养物将停止产生抗体。哺乳动物细胞的补料分批培养是其中培养物连续或定期地用含有营养物的浓缩补料培养基进行补料的培养。补料可按预定时间表进行，例如每一天一次、每两天一次、每三天一次等。在一个实施方案中，在生产阶段的第4天或约第4天开始，将例如选自由葡萄糖、锌、锰、尿苷和半乳糖组成的组的一种或多种额外的营养物例如以培养基补充剂的形式添加到细胞培养基中。补料溶液按每天一次、每隔一天一次、每两天一次及其组合的时间表添加。在一些实施方案中，酪氨酸在生产阶段期间(诸如在第4天和第ll天)以推注形式添加两次。在其他实施方案中，将酪氨酸例如以补料补充剂的形式每天一次添加到生产阶段培养物中。在一些实施方案中，将葡萄糖添加到生产阶段培养物中。在一些实施方案中，例如通过测量葡萄糖或其代谢物(诸如乳酸)来监测葡萄糖消耗。在一些实施方案中，添加包含葡萄糖的补料补充剂以便将葡萄糖水平控制在1至10g/L、2至7g/L、2.5至6g/L或约7g/L的水平。
在某些实施方案中，在哺乳动物细胞培养过程的扩增阶段使用补料分批方法来补充生长的细胞。
在一个特定实施方案中，本发明的细胞培养在大规模生物反应器中进行并且采用补料分批培养程序。在补料分批培养的一个实施方案中，哺乳动物宿主细胞和培养基最初被供应到培养容器中，并且无论是否在培养终止前定期收获细胞和/或产物，都在培养过程中将额外的培养营养物连续或以离散的增量补料到培养物中。补料分批培养可包括例如半连续补料分批培养，其中定期地移除完整培养物(包括细胞和培养基)并用新鲜培养基替换，补料分批培养不同于简单分批培养，其中所有用于细胞培养的组分(包括细胞和所有培养营养物)在培养过程开始时都被供应到培养容器中。
本文所述的方法可用于实现细胞培养物的人源化抗α4β7抗体滴度大于1g/L。在一个实施方案中，使用本文所述的方法来实现人源化抗α4β7抗体的滴度为约2至约6g/L、约3至约5g/L、约5至约9g/L或约4.5至约7g/L。
本文公开的方法可用于获得具有特定糖基化模式的抗体组合物。在一个实施方案中，本文所述的方法提供了人源化抗α4β7抗体的群体，其中所述群体具有88％或更多、90％或更多、或91％或更多的总去唾液酸、无半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G0F)，去唾液酸、单半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G1F)，和/或去唾液酸、二半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G2F)糖基化变体。
本文公开的方法还可用于获得具有一定量的抗体的主要同工型的抗体组合物。在一个实施方案中，本文公开的方法提供了一种组合物(例如，包含维多珠单抗的澄清收获物)，其主要抗体同工型的量大于或等于61％，如通过阳离子交换色谱法(CEX)所测定。在另一个实施方案中，本文公开的方法提供了一种组合物(例如，包含维多珠单抗的澄清收获物)，其主要抗体同工型的量大于或等于62％，如通过CEX所测定。在一个实施方案中，本文公开的方法提供了一种组合物(例如，包含维多珠单抗的澄清收获物)，其主要抗体同工型的量大于或等于63％，如通过CEX所测定。在一个实施方案中，本文公开的方法提供了一种组合物(例如，包含维多珠单抗的澄清收获物)，其主要抗体同工型的量大于或等于64％，如通过CEX所测定。在一个实施方案中，本文公开的方法提供了一种组合物(例如，包含维多珠单抗的澄清收获物)，其主要抗体同工型的量大于或等于65％，如通过CEX所测定。
IV.下游生产方法
本发明的包含抗α4β7抗体(例如维多珠单抗)或其抗原结合部分的组合物可通过本文提供的上游细胞培养方法和组合物来产生。这些上游过程技术可任选地与下游生产方法相结合，用于分离、纯化和/或配制抗体或其抗原结合部分。在生产阶段之后，可收获重组抗体。典型地，哺乳动物细胞被工程改造成将所关注的蛋白质分泌到细胞培养基中，因此纯化过程中的第一步是将细胞与培养基分开。收获的培养基可例如通过过滤进一步澄清。然后可以对培养基(例如澄清收获物)进行几个额外的纯化步骤，以去除任何细胞碎片、不需要的蛋白质、盐、矿物质或其他不合需要的元素。重组抗体可从污染物可溶性蛋白质和多肽中纯化，其中以下程序是合适的纯化程序的示例，所述纯化程序可包括以下一种或多种：亲和色谱法，例如使用结合抗体的Fc区的树脂(诸如蛋白质A)；在离子交换柱或树脂上分级诸如阳离子交换色谱法(CEX)，例如SP-SepharoseTM或CM-SepharoseTM羟基磷灰石；阴离子交换色谱法(AEX)；疏水相互作用色谱法(HIC)；混合模式色谱法；乙醇沉淀；色谱聚焦；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75TM的凝胶过滤；超滤和/或渗滤，或前述的组合。纯化方法的实例描述于Liu等人,mAbs,2:480-499(2010)中。在纯化过程结束时，重组蛋白是高纯度的并且适合于人类治疗用途，例如用于下述药物抗体制剂中。纯化后，高纯度重组蛋白可被超滤/渗滤(UF/DF)成适合于人类施用的药物制剂。
在渗滤和超滤之后，抗体制剂可仍然为液体或冻干成干抗体制剂。在一个方面，干燥的、冻干的抗体制剂以包含150mg、180mg、240mg、300mg、360mg、450mg或600mg抗α4β7抗体的单剂量小瓶提供并且可用诸如无菌水的液体重构以供施用。在另一个方面，抗α4β7抗体(例如维多珠单抗)在约2-8℃下以稳定液体药物组合物形式储存在容器(例如小瓶、注射器或药筒)中，直到将其施用于有需要的受试者。在一些实施方案中，抗α4β7抗体的重构冻干制剂或稳定液体药物组合物包含约0％至5.0％、0％至2％、≤2％、≤1％、≤0.6％或≤0.5％的聚集体。
因此，在一些实施方案中，本文提供了包含人源化抗α4β7抗体或其抗原结合部分的重构冻干抗体制剂或稳定液体药物组合物。在一些实施方案中，抗α4β7抗体的重构冻干制剂或稳定液体药物组合物包含约11％至16％、12％至15％、≤14％、≤13％、≤12％或≤11％的碱性同工型种类。在一些实施方案中，抗α4β7抗体的重构冻干制剂或稳定液体药物组合物包含65％至75％、66％至74％、67％至73％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％或至少70％的主要同工型。在一些实施方案中，抗α4β7抗体的重构冻干制剂或稳定液体药物组合物包含的总去唾液酸、无半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G0F)，去唾液酸、单半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G1F)，和/或去唾液酸、二半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G2F)糖基化变体(G0F+G1F+G2F)含量为92％至98％、92％至97％、92％至96％、92％至95％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％。在一些实施方案中，抗α4β7抗体的重构冻干制剂或稳定液体药物组合物包含的G0F含量为45％至65％、50％至65％、55％至65％、45％至60％、50％至60％、55％至60％、45％至55％、47％至61％、47％至63％、65％或更少、64％或更少、63％或更少、62％或更少、61％或更少、60％或更少、57％或更少、55％或更少、53％或更少、52％或更少、或50％或更少。在一些实施方案中，抗α4β7抗体的重构冻干制剂或稳定液体药物组合物包含的G1F含量为25％至45％、26％至42％、27％至40％、30％至40％、30％至45％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、或至少43％。在一些实施方案中，抗α4β7抗体的重构冻干制剂或稳定液体药物组合物包含的G2F含量为2％至8％、2.5％至7.5％、3％至7％、3.5％至6.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4％、至少4.5％、至少5％、或至少5.5％、至少6％、至少6.5％、或至少7％。
在一些实施方案中，抗α4β7抗体的重构冻干制剂或稳定液体药物组合物可包含一种或多种赋形剂，其包括但不限于氨基酸(例如精氨酸、组氨酸和/或组氨酸单盐酸盐)、糖(例如蔗糖)、表面活性剂(例如聚山梨醇酯80)和/或缓冲液(例如柠檬酸盐、磷酸盐等)。在一个实施方案中，抗α4β7抗体的重构冻干制剂或稳定液体药物组合物包含L-精氨酸、L-组氨酸、L-组氨酸单盐酸盐、蔗糖和/或聚山梨醇酯80。在另一个实施方案中，抗α4β7抗体的重构冻干制剂或稳定液体药物组合物包含柠檬酸盐、精氨酸、组氨酸和/或聚山梨醇酯80。
注射器或药筒可以是1mL或2mL容器(例如对于160mg/mL剂量)或超过2ml，例如对于更高的剂量(至少320mg或400mg或更高)。注射器或药筒可含有至少约20mg、至少约50mg、至少约70mg、至少约80mg、至少约100mg、至少约108mg、至少约120mg、至少约155mg、至少约180mg、至少约200mg、至少约240mg、至少约300mg、至少约360mg、至少约400mg、或至少约500mg的抗α4β7抗体。在一些实施方案中，所述容器例如注射器或药筒可被制造成递送约20至120mg、约40mg至70mg、约45至65mg、约50至57mg、或约54mg的抗α4β7抗体，例如维多珠单抗。在其他实施方案中，注射器或药筒可被制造成递送约90至120mg、约95至115mg、约100至112mg、或约108mg的抗α4β7抗体，例如维多珠单抗。在其他实施方案中，注射器或药筒可被制造成递送约140至250mg、约150至200mg、约160至170mg、约160至250mg、约175mg至210mg、约220至260mg、或约160mg、约165mg、约180mg、或约200mg的抗α4β7抗体，例如维多珠单抗。
制剂的施用可通过胃肠外注射进行，诸如静脉内、皮下或肌内注射。静脉注射可以通过输注进行，诸如通过用无菌等渗盐水、缓冲液例如磷酸盐缓冲盐水或林格氏(乳酸或右旋糖)溶液进一步稀释。在一些实施方案中，抗α4β7抗体通过皮下注射进行施用，例如，在治疗开始后约每两周、三周或四周或在第三次后续剂量后以约54mg、108mg或约165mg或约216mg的剂量进行施用。
V.分析方法
本文报告的抗体或其抗原结合部分的各种参数可使用诸如以下描述的那些标准分析方法和技术进行测量。
在本文所述的各种实施方案中，阳离子交换色谱法(CEX)可用于确定抗体(例如维多珠单抗)或其抗原结合部分的群体中存在的主要同工型、碱性同工型和酸性同工型的相对量。CEX方法根据整体表面电荷对抗体种类进行分级。使用流动相稀释至低离子强度后，可将测试样品注入CEX色谱柱上，诸如Dionex Pro-PacTM WCX-10色谱柱(Thermo FisherScientific,Waltham,MA(USA))，所述色谱柱在合适的缓冲液(例如10mM磷酸钠，pH 6.6)中平衡。可在同一缓冲液中使用氯化钠梯度洗脱抗体。可以在280nm处监测蛋白质洗脱，并将峰指定为酸性、碱性或主要同工型类别。酸性峰从色谱柱中洗脱出来的保留时间比主要同工型峰短，而碱性峰从色谱柱中洗脱出来的保留时间比主要同工型峰长。报告了主要同工型百分比、酸性种类百分比总和以及碱性种类百分比总和。将样品的主要同工型保留时间与参考标准品的保留时间进行比较以确定一致性。
在一个实施方案中，CEX测定方法包括将测试样品稀释至低离子强度，注入在10mM磷酸钠、pH 6.6中平衡的CEX色谱柱上，在此缓冲液中用NaCl梯度洗脱色谱柱，在280nm处监测峰并且将峰指定为酸性、主要或碱性，其中酸性峰首先以最短保留时间洗脱，其次是主要峰，并且碱性峰以最长保留时间洗脱，并对峰面积进行定量，并将它们的量计算为所有峰面积的百分比。
在本文所列示的各种实施方案中，亲水相互作用相分离法(HILIC)可以用于确定抗体(例如维多珠单抗)或其抗原结合部分的糖型特征。HILIC方法对游离的荧光标记碳水化合物进行分级。通过用N-糖苷酶F消化，可从抗体或其抗原结合部分的样品中释放完整的聚糖。然后可使用标准技术(诸如用于来自Prozyme(Hayward,CA(USA))的GlykoPrep快速糖蛋白样品制备系统的标准技术)用荧光标签(诸如InstantAB荧光标签)立即标记释放的聚糖。可使用超高效液相色谱法对标记的聚糖进行分级。在一些实施方案中，使用ACQUITYUPLC BEH酰胺色谱柱(Waters Corporation,Milford,MA(USA))和乙腈/甲酸铵梯度系统对标记的聚糖进行分级。可使用278nm的激发波长通过344nm处的荧光发射检测标记的聚糖。因此，与本发明结合使用的HILIC是一种对游离荧光标记的糖型进行分级的HILIC方法，其中优选地，完整的糖型通过用N-糖苷酶F消化而从抗体或其抗原结合部分的样品中释放出来，然后使用标准标记技术(优选用于来自Prozyme(Hayward,CA(USA))的GlykoPrep样品制备系统的标准标记技术)用荧光标签(优选InstantAB荧光标签)立即标记释放的聚糖，其中使用超高效液相色谱法，优选使用ACQUITY UPLC BEH酰胺色谱柱(Waters Corporation,Milford,MA(USA))和乙腈/甲酸铵梯度系统对标记的糖型进行分级，并且其中使用278nm的激发波长通过344nm处的荧光发射检测标记的糖型。可通过确认可商购获得的标准品(例如，InstantAB标记的葡萄糖同聚物梯带(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA(USA)))的适当分辨率来进行测定对照。定量基于检测到的糖的相对面积百分比。报告了G0F(去唾液酸、无半乳糖基化双触角聚糖、核心岩藻糖基化)；G1F(去唾液酸、单半乳糖基化双触角聚糖、核心岩藻糖基化)；和G2F(去唾液酸、二半乳糖基化双触角聚糖、核心岩藻糖基化)种类的峰面积百分比。
在本文所列示的各种实施方案中，尺寸排阻色谱法(SEC)可用于确定抗体(例如维多珠单抗)或其抗原结合部分的群体中存在的单体、高分子量(HMW)聚集体和低分子量(LMW)降解产物的相对水平。SEC方法提供抗体单体与HMW种类和LMW降解产物的基于尺寸的分离。可使用可商购获得的SEC色谱柱，使用适当的缓冲液分析测试样品和参考标准品。例如，在一些优选实施方案中，可使用G3000 SWxl色谱柱(Tosoh Bioscience,King ofPrussia,PA(USA))或优选串联连接的两个G3000Swxl色谱柱以及等度磷酸盐-氯化钠缓冲体系(pH 6.8)进行SEC分析。在280nm处监测蛋白质种类的洗脱。评估主峰(单体)和总峰面积以确定纯度。在一个实施方案中，SEC分析包括将样品注入两个串联连接的G3000SWxl色谱柱，并在等度磷酸盐-氯化钠缓冲体系(pH 6.8)中运行，其中在280nm处监测蛋白质种类的洗脱，并测量主峰(单体)和总峰面积。报告了样品的纯度(％)(计算为％单体)、％HMW聚集体和/或％LMW降解产物。
抗体制品中存在的残留CHO宿主细胞蛋白(HCP)杂质
如需要可使用标准技术通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量。许多出于此目的而设计的ELISA试剂盒是可商购获得的，诸如来自Cygnus Technologies(Southport,NC(USA))的CHO HCP ELISA试剂盒3G。可使用固定化的多克隆抗CHO HCP抗体捕获测试样品中的宿主细胞蛋白。然后可使用合适的检测剂(例如，同一抗体的辣根过氧化物酶标记型式)检测捕获的蛋白。在此示例性实施方案中，与CHO HCP的浓度成正比的捕获过氧化物酶的量可使用过氧化物酶底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)在450nm处进行比色测量。因此，CHOHCP测定包括使用多克隆抗CHO HCP抗体来捕获HCP，所述HCP在结合多克隆抗CHO HCP抗体的辣根过氧化物酶标记型式后检测，所述辣根过氧化物酶标记型式将过氧化物酶底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)转化为可在450nm处进行比色定量的物质。HCP浓度可通过与CHO HCP标准曲线(诸如包含在测试试剂盒中的CHO HCP标准曲线)进行比较来确定，并报告为抗体制品中蛋白质总水平的百分比。
以下实施例举例说明了用于在哺乳动物细胞培养物中产生抗体的改进方法和组合物。仅出于说明目的提供以下实施例，并且不意图以任何方式限制本发明的范围。除非另外指定，否则根据制造商的说明使用实施例中提及的可商购获得的试剂。
实施例
维多珠单抗先前是在二氢叶酸还原酶缺陷型(DHFR)中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系中产生的(Urlaub和Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216-4220，美国专利申请公开号20070122404)。虽然所选克隆在其维多珠单抗的表达方面是稳定的，但生产水平低于2g/L。鉴于对材料的高需求，研究人员寻求开发更高产量的细胞系。
在对数千个克隆测试各种选择系统并在生物反应器中评价一些克隆体之后，选择了谷氨酰胺合酶缺陷型(GS-)中国仓鼠卵巢(GS-CHO)细胞系。在一个实例中，GS CHO系统生产了6.7g/L抗体。另外的研究表明，培养条件和培养基补充剂会影响某些质量属性。以下实施例描述了用于改善在GS-CHO细胞中产生的维多珠单抗的质量的实验。
实施例1.细胞培养生产对产品质量属性的影响
对于改善产品质量属性，使用Plackett-Burman方法创建筛选设计来评估八个生物反应器运行中五个过程参数修改因素的影响。将细胞解冻，并使用标准放大策略以3天传代从摇瓶移动到具有1.75L工作容积的3L生产生物反应器中。使用具有两种补料(除非另有说明)的推注补料策略进行15天生物反应器生产。
设计：•本筛选研究选择了以下五个不同的因素：1)温度变化(至33℃)；2)补料策略的改变(2g/L相对于6g/L葡萄糖)；3)pH改变(6.85相对于7.05)；4)补料溶液中添加尿苷、氯化锰和半乳糖(UMG)；和5)Sigma Gal+/糖基化调整添加。这五个因素在基于Plackett-Burman筛选设计的八个不同生物反应器运行中进行了测试，描述于表1中。
表1：用于改善半乳糖基化和酸性变体的Plackett-Burman设计
因素/容器号 温度变化 补料策略 低pH 补料中添加UMG Sigma Gal+
A1 V09 是 是 是 否 是
B1 V10 否 否 是 否 否
C1 V11 否 是 否 是 否
D1 V12 否 否 是 是 是
E1 V13 是 否 否 否 否
F1 V14 是 是 是 是 否
G1 V15 是 否 否 是 是
H1 V16 否 是 否 否 是
Plackett-Burman筛选设计是通过JMP软件进行的。这种筛选设计帮助鉴定有助于实现产品质量目标的因素。每个因素由两个水平组成，如下表2所述。
表2：调查因素
本实验使用GS-CHO细胞系。
补料：用3×105个活细胞/mL接种生产生物反应器培养物，并且在第4天，基于每个研究设计的细胞生长速率和葡萄糖消耗速率，将补料培养基添加到培养物中。补料的投加量设定的葡萄糖浓度上限为7g/L。根据研究设计，温度在第7天从37摄氏度开始变化为33摄氏度或35摄氏度。在第18天或当靶细胞活力小于或等于50％时(以先达到者为准)收获所有生产生物反应器培养物。
产品质量：将表1中测试的条件的结果在JMP软件中进行分析，以便探索能够改善产品质量属性的条件(使用预测分析器)。
图1中描述了预测分析结果。通常，实现抗体滴度增加、维多珠单抗的碱性和酸性种类减少以及维多珠单抗的G2F同工型增加的条件通常是可取的。
如图1所示，所述模型预测，在基于葡萄糖消耗速率、37摄氏度、pH变化至6.85以及向补料溶液中添加UMG的补料输送下操作是最佳的。相比之下，图1中的结果表明Gal+添加不是必需的，因为它对维多珠单抗的G2同工型、酸性或碱性种类或抗体滴度几乎没有影响。此外，温度从37摄氏度变化至33摄氏度对滴度有负面影响，表明将细胞生产保持在37度是有利的，而小于7.05(例如，6.85至小于7)的pH提高了滴度同时保持较低水平的G2同工型。
预测分析器还显示出使用UMG组合实现碳水化合物目标以及抗体的更高滴度水平和更低水平的酸性种类的优势。基于葡萄糖消耗的补料策略和与pH 7相比较低的pH(6.85)显示出在实现更低的碱性种类比例方面的益处。
实施例2：UMG补充和pH对产品质量属性的影响
本实验的目的是测试补料溶液中的pH和UMG水平对产品质量属性的影响。本实验是实施例1的后续实验。
设计：本实验使用GS-CHO细胞。此实验被设计成适应在6.85或7.05下进行调查的完全析因pH以及在33X、50X和66X浓度下调查的作为补料补充剂(在生产期间)的UMG。添加了在第4天pH变化的额外条件(V10)。在实验的第1天，由于pH探针连接松动，V01的滴定剂泵严重过量泵送滴定剂，并且必须拆除反应器。由于V10具有类似的培养基和细胞，因此V10的运行模板很快被替换以反映V01的运行模板。如实施例1所述，由于没有预测到任何益处，因此没有采用温度变化。
使用基于消耗的补料方法对细胞进行补料，其中推断当前的生长速率和消耗速率以提前预测葡萄糖需求。
此实验评估了补料培养基中的UMG补充(在补料培养基中在33X(33mM尿苷、0.066mM锰和165mM半乳糖)、50X(50mM尿苷、0.1mM锰和250mM半乳糖)和66X(66mM尿苷、0.132mM锰和330mM半乳糖)浓度下调查)和pH(在7.05和6.85下调查)对产品质量属性的影响，所述质量属性包括抗体滴度、酸性种类、碱性种类、主要种类、G0F种类、G1F种类、G2F种类和聚糖总和的量。将结果与那些在未补充UMG的CD-CHO生产培养基中生长的培养物进行比较。实验设计描述于表3中。
表3：实验设计
UMG 100x量描述于上表2中。
结果：使用此实验的结果，生成预测分析，以进一步研究各种条件对细胞培养和维多珠单抗的产品质量属性的影响。预测分析结果描述于图2A至图2H(抗体滴度相对于UMG(图2A)、酸性种类％(CEX)相对于UMG(图2B)、碱性种类％(CEX)相对于UMG(图2C)、主要种类的百分比(CEX)相对于UMG(图2D)、G0F种类的百分比相对于UMG(图2E)、G1F种类的百分比(图2F)、G2F种类的百分比相对于UMG(图2G)、以及聚糖总和相对于UMG(图2H))。在图2A至图2H的每一个中，未补充UMG的容器由阴影区域(阴影区域代表UMG补充)最左侧的点显示。此外，图2A至图2H示出了测试的两个pH值(pH 7.05和pH 6.85)。
如图2D、2F、2G和2G中所述，相对于未补充UMG的培养物，具有递增的UMG补充的细胞培养物分别表现出更高百分比的主要种类、G1F种类、G2F种类和聚糖总和。此外，与未补充UMG的培养物相比，具有UMG补充的培养物表现出更低的滴度(图2A)、更低的酸性种类(图2B)、更低的碱性种类(图2C)和更低的G0F种类(图2E)。
在测试的不同UMG浓度中，UMG的浓度似乎对滴度和酸性种类的影响最小，对碱性种类的百分比影响较小(即碱性种类在较高的UMG浓度下略有减少)，而对主要种类的百分比影响较大(即主要种类随着UMG浓度的升高而增加)。响应于各种UMG浓度，碳水化合物特征没有重大变化。
最后，关于pH，在低pH(6.85)下操作似乎比在较高pH(pH 7.05)下操作表现更好，如图2A至图2H中所述。
在单独的实验中，重组表达维多珠单抗的GS-CHO细胞在CD-CHO生产培养基中以3000L规模培养，所述生产培养基补充有包含尿苷(20.91mM mM浓度)、锰(0.039mM浓度)、半乳糖(96.69mM浓度)和锌(0.117mM浓度)的补料培养基。从第4天开始，每天向培养物中添加补料。以每天添加形式添加的UMG的量如下：0.17至0.63mM尿苷、0.31至1.2μM锰和0.77至2.9mM半乳糖。到收获那天，在培养的第4天至第13天期间每天补充后，生产培养基中尿苷的平均累积补充浓度为约2.76mM；锰的平均累积补充浓度为约0.00515mM；并且半乳糖的平均累积补充浓度为约12.8mM。从第4天至第13天，每天还添加浓度为约0.117mM的锌作为补料补充剂，其中到第14天生产培养基中的平均累积补充浓度为约0.0154mM。本实施例中使用的平均值是指测试批次的平均值。
培养14天后收获抗体，并且在纯化之后使用HILIC测定岩藻糖基化聚糖的水平。结果呈现于表4中。
表4：细胞培养物补充有尿苷、锰、半乳糖和锌之后的代表性聚糖水平
批次# G0F+G1F+G2F G1F G0F G2F
1 93.08 35.47 52.01 5.60
2 93.05 35.59 51.89 5.57
3 92.94 36.23 50.57 6.14
4 93.17 35.29 52.35 5.53
5 92.74 35.43 51.70 5.61
6 92.86 36.26 50.45 6.15
实施例3：赖氨酸和精氨酸对产品质量属性的影响
本实验的目的是测试补料培养基中赖氨酸和精氨酸水平对维多珠单抗质量属性(具体地说是滴度和碱性种类的百分比)的影响。
设计：此实验被设计成评估赖氨酸和精氨酸浓度对在GS-CHO细胞中生产时的抗体滴度以及碱性种类水平(C-末端赖氨酸水平，如通过CEX所测定)的影响。测试以类似于实施例1和2的方式进行。
结果：图3A示出了比较不同精氨酸和赖氨酸浓度对碱性种类的百分比的影响的结果，并且图3B描述了示出对抗体滴度的影响的结果。图3A和图3B的X轴上的标记对应于高(H)、中等(M)或低(L)浓度的赖氨酸和精氨酸，如表5所示。例如“LM”是指低水平的赖氨酸(见表5)和中等水平的精氨酸(见表5)。这些结果表明，低水平的赖氨酸和精氨酸导致碱性种类的降低最小，但相对于对照，这些氨基酸的低水平对抗体滴度(5-4g，约20％)有负面影响。
表5：精氨酸和赖氨酸浓度总结
氨基酸 对照 低 中 高
赖氨酸(g/L) 8.80 5.0 6.0 7.1
精氨(g/L) 12.0 3.0 6.4 9.9
基于arg/lys实验进行预测分析。JMP分析预测，降低碱性种类的最佳条件是低赖氨酸和低精氨酸水平(LL)，如图4A中所述。图4B和图4C示出了“LM”(低赖氨酸和中等精氨酸)“LH”(低赖氨酸和高精氨酸)组合的预测分析。然而，由于滴度生产的影响，在实施例4中使用了低赖氨酸(5g/L)和中等精氨酸(6.5g/L)水平。
实施例4：锌对产品质量属性的影响
本实验的目的是测试锌水平对细胞培养期间(更具体地说是在培养系统的生产阶段期间)维多珠单抗质量属性的影响。
测试了三种水平的锌，如下表6中所述。培养范围为收获第14天至第18天。在22xUMG与降低的赖氨酸和精氨酸(如实施例3中所述的“LM”)的组合中评价锌补充剂。补料中赖氨酸和精氨酸的浓度分别为5g/L和6.4g/L。
表6.生产阶段期间补料培养基中的锌浓度
0锌* 2锌* 4锌*
[锌]uM 14.3 28.6 57.2
*0Zn表示未向补料培养基中添加额外的Zn补充
如图5A中所述，测试的锌浓度对抗体滴度没有实质性影响。图A中还描述了对生产培养天数的影响，其中延长的培养天数显示出对滴度生产的益处。图5B至图5G提供了在14、15、16、17和18天培养后检查锌相对于碱性种类的百分比(图5B)、酸性种类的百分比(图5C)、主要种类的百分比(图5D)、G0F种类的百分比(图5E)、G1F种类的百分比(图5F)、G2F种类的百分比(图5G)和聚糖种类总和(图5H)的影响。
如图5B和图5C中所述，随着锌水平的增加，在碱性和酸性曲线中观察到减少趋势。还观察到，直至培养第16天都实现了类似的碱性曲线。如图5D中所述，主要种类的最高水平是用57.2uM锌(4Zn)在第14天收获时获得的。
锌水平和培养天数显示出对碳水化合物特征的影响最小。总体而言，图5A至图5H中的数据表明在第16天之前结束培养和收获。
还对温度与各种锌浓度组合进行了测试，以确定是否对维多珠单抗的各种产品质量有影响。33、35和37摄氏度的温度与0至4种水平的锌组合进行了测试(见上表6)。总体而言，37度在保持所需的维多珠单抗产品质量方面最有效。例如，图6A描述了在各种锌条件和温度下的％抗体的碱性同工型。在33℃和37℃下补充57.2uM锌(4Zn)之后，碱性种类的百分比水平低于指定的碱性种类(同工型)上限(由黑线表示，即13％碱性抗体同工型(CEX))，并且因此满足规格要求。相比之下，如图6B所示，在37℃但不是33℃下补充57.2uM锌(4Zn)之后的聚糖总和高于较低的接受标准(由黑线表示)。此外，还观察到在较低温度下蛋白质聚集(HMW种类；接受标准表示为约1.4％或更少)增加，如图6C中所述。图6D中的数据表明滴度生产受益于延长培养天数，并且与第14天的33℃和35℃相比，37℃通常生产更多的维多珠单抗滴度。图6E中的数据表明抗体的酸性种类随着温度的升高和培养的延长而增加。图6E中的黑色实线代表酸性种类的可接受上限。
总体而言，图6A至图6E中的数据表明，最好在GS-CHO细胞中生产维多珠单抗的第16天停止发酵，并保持大约37度的生产温度。此外，4Zn作为补充剂提供了益处。
实施例5：培养天数对产品质量属性的影响
本实验的目的是测试培养天数对维多珠单抗质量属性的影响。
在GS-CHO细胞中培养12、13、14、15、16或17天后，在两个独立运行后评估抗体的酸性种类的百分比、抗体的碱性种类的百分比、抗体的主要种类的百分比和维多珠单抗的滴度。
如图7D所示，随着培养天数的延长，观察到滴度增加。然而，这种滴度的增加伴随着酸性种类的增加和主要种类的减少，分别如图7A和图7B中所述。在运行1期间碱性种类似乎没有受到影响，但在运行2期间观察到碱性种类有增加的趋势。数据表明，通常最好在第16天停止发酵并收获。在第15天收获抗体时，获得的酸性种类的水平最低。
实施例6：pH对产品质量属性的影响
本实验的目的是测试生产阶段细胞培养期间pH对维多珠单抗质量属性的影响。具体地说，评价了在生产阶段培养基中引入pH变化对维多珠单抗质量属性的影响。
在pH 6.8至pH 7.2的范围内评价生产阶段培养基的初始pH。在pH变化期间，培养基的pH降低至最终pH，在pH 6.6至pH 7.0的范围内对所述最终pH进行评价。研究了pH变化起始时间从86小时至108小时，以及pH变化完成时间(即达到最终pH的时间)从88小时至144小时。中间的2-36小时间隔考虑了pH斜坡时间。
在等于或高于pH 6.7的最终pH下(图8A)以及在等于或低于122小时的pH变化完成时间下(图8B)，观察到最高％主要抗体同工型(通过CEX测定)和最低％酸性抗体同工型(通过CEX测定)。此数据表明，在生产阶段细胞培养期间的pH变化可降低维多珠单抗制品中酸性抗体同工型种类的水平。
实施例7：产品质量属性的测定
在前述实施例中使用以下分析测定和方法来测定维多珠单抗的产品质量属性。
阳离子交换色谱法(CEX)根据整体表面电荷对维多珠单抗抗体种类(主要同工型、碱性种类和酸性种类)进行分级。使用流动相稀释至低离子强度后，将测试样品注入在10mM磷酸钠(pH 6.6)中平衡的Dionex Pro-PacTM WCX-10色谱柱(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA(USA))上，并在同一缓冲液中使用氯化钠梯度洗脱。在280nm处监测蛋白质洗脱，并将峰指定为酸性、碱性或主要同工型类别。报告了主要同工型百分比、酸性种类百分比总和以及碱性种类百分比总和。将样品的主要同工型保留时间与参考标准品的保留时间进行比较以确定一致性。
维多珠单抗的碳水化合物特征是通过亲水相互作用相分离(HILIC)对游离荧光标记的碳水化合物进行分级而产生的。通过用N-糖苷酶F消化，从蛋白质样品中释放完整的聚糖，然后使用来自Prozyme(Hayward,CA(USA))的GlykoPrep快速糖蛋白样品制备系统用InstantAB荧光标签立即标记所述完整的聚糖。使用ACQUITY UPLC BEH酰胺色谱柱(WatersCorporation,Milford,MA(USA))和乙腈/甲酸铵梯度系统对标记的聚糖进行分级。使用278nm的激发波长通过344nm处的荧光发射完成检测。通过确定可商购获得的InstantAB标记的葡萄糖同聚物梯带(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA(USA))的适当分辨率来进行测定对照。定量基于检测到的糖的相对面积百分比。报告了G0F(去唾液酸、无半乳糖基化双触角聚糖、核心岩藻糖基化)；G1F(去唾液酸、单半乳糖基化双触角聚糖、核心岩藻糖基化)；和G2F(去唾液酸、二半乳糖基化双触角聚糖、核心岩藻糖基化)种类的峰面积百分比。
使用尺寸排阻色谱法(SEC)来确定维多珠单抗的纯度。使用两个串联连接的G3000SWxl色谱柱(Tosoh Bioscience,King of Prussia,PA(USA))和等度磷酸盐-氯化钠缓冲体系(pH 6.8)分析参考标准品和测试样品(75μg)。所述方法提供了抗体单体与高分子量(HMW)种类以及低分子量(LMW)降解产物的分离。在280nm处监测蛋白质种类的洗脱。评估主峰(单体)和总峰面积以确定纯度。报告了样品的纯度(％)(计算为％单体)和％聚集体。
等效方案
本领域技术人员将会认识到或仅仅利用常规实验即可确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等效方案。此类等效方案旨在由以下权利要求所涵盖。本申请通篇引用的所有参考文献、专利和公布的专利申请均以引用的方式并入本文。
序列表
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Claims (36)

1.一种产生包含人源化抗α4β7抗体的组合物的方法，所述方法包括
在具有第一pH的第一生产培养基中培养被基因工程改造以表达所述人源化抗α4β7抗体的哺乳动物宿主细胞；以及
在具有第二pH的第二生产培养基中培养所述哺乳动物宿主细胞；
其中所述第二pH低于所述第一pH，并且
其中所述人源化抗α4β7抗体是IgG1抗体；包含重链可变区，所述重链可变区包含如SEQID NO:4所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:3所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:2所列示的CDR1结构域；并且包含轻链可变区，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO:8中所列示的CDR3结构域、如SEQ ID NO:7所列示的CDR2结构域和如SEQ ID NO:6所列示的CDR1结构域。
2.如权利要求2所述的方法，其中所述第二pH比所述第一pH低0.1至0.5个pH单位。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述第一pH在pH 6.8-7.2的范围内，并且其中所述第二pH在pH 6.7-6.95的范围内。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞在所述第一pH下培养120小时或更短时间。
5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞在所述第一pH下培养85-110小时。
6.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞在所述第一pH下培养90-100小时。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其还包括从所述第二生产培养基中收获所述抗α4β7抗体。
8.如权利要求7所述的方法，其中在将所述哺乳动物宿主细胞在所述第一生产培养基和所述第二生产培养基中培养13-15天后收获所述抗α4β7抗体。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中相对于其中所述哺乳动物宿主细胞在所述第一pH下培养且没有pH变化的对照组合物，所述组合物具有增加水平的所述抗α4β7抗体的主要同工型。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述生产培养基的温度范围为36至38摄氏度。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述温度范围为36.5至37.5摄氏度。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述温度为约37摄氏度的平均温度。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述生产培养基的pH范围为6.5至7。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述生产培养基的pH范围为6.8至7.0。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述生产培养基的葡萄糖水平在所述生产阶段期间保持在约7g/L或更低。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述生产阶段为14天或更短。
17.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述生产阶段的范围为10天至17天。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其在大规模生物反应器中进行。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述大规模生物反应器选自由200升(L)生物反应器、2000L生物反应器、3000L和6000L生物反应器组成的组。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述生产阶段产生的所述人源化抗α4β7抗体的滴度大于3g/L。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述人源化抗α4β7抗体的滴度为约3至约8g/L。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述人源化抗α4β7抗体的滴度为约5至约7g/L。
23.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述CHO细胞是GS-CHO细胞。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述人源化抗α4β7抗体包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含如SEQ ID NO:1所列示的氨基酸序列，并且包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含如SEQ ID NO:5所列示的氨基酸序列。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述人源化抗α4β7抗体是维多珠单抗。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述方法包括所述抗体的收获和纯化。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述纯化包括(i)去除任何细胞碎片、不需要的蛋白质、盐、矿物质或其他不合需要的元素的纯化步骤，和(ii)从污染物可溶性蛋白质和多肽中纯化所述抗体。
29.如权利要求27或28所述的方法，其中所述方法还包括制备适用于人类治疗用途的所述纯化抗体的药物制剂。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述药物制剂是液体药物制剂。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述液体药物制剂通过超滤/渗滤制备。
32.如权利要求29所述的方法，其中所述药物制剂是冻干的干抗体制剂。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述抗体的药物制剂是从所述纯化后通过超滤/渗滤制备的液体药物抗体制剂冻干而来的干抗体制剂。
34.一种组合物，其包含使用权利要求1-33中任一项所述的方法产生的人源化抗α4β7抗体。
35.一种包含人源化抗α4β7抗体的组合物，其中所述组合物可通过权利要求1-33中任一项所述的方法获得。
36.如权利要求34或35所述的组合物，其包含人源化抗α4β7抗体的群体，所述群体具有(i)90％或更多，或(ii)92％-95％的总去唾液酸、无半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G0F)，去唾液酸、单半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G1F)，和/或去唾液酸、二半乳糖、核心岩藻糖基化双触角聚糖(G2F)糖基化变体。
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