TW202110874A - Ｍｐｓ修飾之肽及其用途 - Google Patents

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霖 吳
陳靜賢
大衛 Ｃ 楊
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Abstract

本揭示內容提供分離之多肽治療劑，亦提供編碼該等多肽之聚核苷酸及結合至該等多肽之抗體。進一步提供治療及診斷用途。

Description

MPS修飾之肽及其用途
MARCKS蛋白之鑑別回溯至1982年，此時發現大鼠腦神經末梢中87kDa之酸性蛋白可經由PKC之活化而由鈣及攜鈣蛋白調控(Wu, W.C.等人(1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79(17):5249-5253)。隨後，該蛋白官方命名為富含肉豆蔻醯化丙胺酸之C激酶受質(m yristoylateda lanine-r ichCk inases ubstrate，MARCKS或MARKS) (Albert, K.A.等人(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83(9):2822-2826)。MARCKS在各種物種及組織中遍在表現(Albert, K.A.等人(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(20):7046-7050；Stumpo, D.J.等人 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(11):4012-4016)，而其他MARCKS家族成員MARCKS相關蛋白(MRP，亦稱為MacMARCKS、F52或MLP) (一種20 kDa蛋白質)在腦、生殖組織及巨噬細胞中高度表現(Aderem, A. (1992) Trend. Biochem. Sci. 17(10):438-443；Blacksher, P.J. (1993) J. Biol. Chem. 268:1501-1504)。MRP，與MARCKS相似，亦含有相同之三個進化保守之結構域；N-末端肉豆蔻醯化結構域、多同源性2 (MH2)結構域及效應物結構域(ED)。未知功能之MH2結構域類似於陽離子非依賴性甘露糖-6-磷酸受體之胞質尾區。蛋白質磷酸化發生在ED結構域之Ser159/163 。N-末端(肉豆蔻醯化)及ED (磷酸化或未磷酸化)之間之合作對於控制該等分子與膜之締合係必需的。
本揭示內容提供包含選自SEQ ID NO: 45或40-59之群之胺基酸序列、或另一選擇為基本上由其組成或仍由其組成之分離之多肽或MPS多肽、或其每一者之等效物。在一態樣中，分離之多肽之等效物包含如下多肽、或另一選擇為基本上由其組成、或仍由其組成：與分離之多肽具有至少80%序列一致性之多肽、或由與編碼分離之多肽之分離之聚核苷酸或其補體雜交的聚核苷酸編碼之多肽、或由與編碼選自SEQ ID No. 45或40-59之群之胺基酸序列的聚核苷酸具有至少80%序列一致性之聚核苷酸編碼的多肽。在一態樣中，等效多肽與如下多肽具有至少80%序列一致性：分離之多肽、或由與編碼分離之多肽之分離之聚核苷酸或其補體雜交的聚核苷酸編碼之多肽、或由與編碼胺基酸序列且在為D-胺基酸且其保留D-胺基酸之殘基處未經取代之聚核苷酸具有至少80%序列一致性之聚核苷酸編碼的多肽。
在另一態樣中，分離之多肽或其等效物包含不超過51個胺基酸，或另一選擇為基本上由其組成或仍由其組成。在另一態樣中，分離之多肽或其等效物包含不超過35個胺基酸，或另一選擇為基本上由其組成或仍由其組成。在另一態樣中，分離之多肽或其等效物進一步包含以下中之一或多者，或另一選擇為基本上由其組成或仍由其組成：促進分離之多肽進入細胞之依可操作方式連接之胺基酸序列、靶向多肽或賦予多肽穩定性之多肽。
進一步提供編碼上述多肽之分離之聚核苷酸、聚核苷酸之補體及其每一者之等效物。
亦揭示載體，其包含本揭示內容之分離之聚核苷酸及視情況依可操作方式連接至分離之聚核苷酸用於複製及/或表現之調控序列中的一或多者，或另一選擇為基本上由其組成或更進一步由其組成。在一個特定態樣中，載體係AAV載體(腺相關病毒載體)。本文進一步揭示宿主細胞，其進一步包含本揭示內容之分離之多肽、分離之聚核苷酸或載體中之一或多者。宿主細胞係真核細胞或原核細胞。
本文提供組合物，其包含載劑及本揭示內容之分離之多肽、分離之聚核苷酸、載體或宿主細胞中之一或多者，或另一選擇為基本上由其組成或更進一步由其組成。在一態樣中，載劑係醫藥上可接受之載劑。在另一態樣中，根據預期用途，本揭示內容之組合物可進一步包含額外治療藥物，或另一選擇為基本上由其組成或更進一步由其組成，例如化學治療劑或藥物、或抗纖維變性劑或藥物。抗纖維變性劑或藥物之非限制性實例包括吡非尼酮(pirfenidone)及尼達尼布(nintedanib)。化學治療劑或藥物之非限制性實例包括(例如)酪胺酸激酶抑制劑(TKI) (例如VEGFR)、基於鉑之藥物(例如順鉑)或靶向EGFR之藥物或藥劑。
如本文揭示之組合物可在診斷、治療上有用且可用於如本文揭示之篩選方法。其亦可用於製備藥劑。另外，額外藥劑或藥物可與組合物組合在相同調配物內，或包含於單獨調配物內，但在適當條件下以治療有效量組合投與有需要之個體。藥劑可在如本文所述之治療方法中。
亦提供治療有需要之個體之與纖維化相關之疾病或疾病症狀的方法，該等方法包含向該個體投與有效量之本揭示內容之分離之多肽或分離之聚核苷酸中的一或多者，或另一選擇為基本上由其組成或更進一步由其組成。在一態樣中，與纖維化相關之疾病或症狀選自以下之群：肺纖維化、特發性肺纖維化、博來黴素(bleomycin)誘導之肺纖維化、腎纖維化、肝纖維化、皮膚纖維化、纖維母細胞病灶、活化之纖維母細胞增殖、發炎或肌纖維母細胞生成。在另一態樣中，治療方法進一步包含投與有效量之抗纖維變性劑或藥物，或另一選擇為基本上由其組成或更進一步由其組成。抗纖維變性劑或藥物之非限制性實例包括吡非尼酮及尼達尼布。
本文亦提供藉由向個體投與有效量之本揭示內容之分離之多肽或分離之聚核苷酸中之一或多者用於抑制癌細胞生長、治療癌症、抑制轉移、抑制癌症幹細胞生長、抑制腫瘤細胞遷移或恢復抗性癌細胞對化學治療劑之敏感性中之一或多者的方法，所有該等皆在有需要之個體中。在一態樣中，癌細胞或癌症係淋巴瘤、白血病或實體腫瘤。在另一態樣中，實體腫瘤係肺癌、肝癌、腎癌、腦癌、結腸直腸癌、胰臟癌、骨癌或喉癌類型之癌症。在另一態樣中，治療方法進一步包含投與有效量之可為或可不為MPS肽或編碼MPS肽之聚核苷酸的抗癌藥物或藥劑，或另一選擇為基本上由其組成或更進一步由其組成。在另一態樣中，治療方法進一步包含投與有效量之化學治療劑(例如酪胺酸激酶抑制劑)、鉑藥物或免疫治療劑，或另一選擇為基本上由其組成或更進一步由其組成。
在一個特定態樣中，本文揭示在有需要之個體中通過血腦障壁遞送本揭示內容之多肽的方法，該方法包含向個體投與有效量之如上文所揭示之載體，或另一選擇為基本上由其組成或更進一步由其組成。
投與可為局部(local)或全身性的，例如表面局部(topical)或藉由吸入療法。全身投與可包含藉由霧化器、經口、鞘內、局部、直接安裝、舌下、靜脈內、顱內、吸入療法、鼻內、陰道或直腸投與。
哺乳動物(例如馬、鼠類、貓、犬或人)可藉由本揭示內容之方法治療。
亦提供套組。套組包含以下中之一或多者，或另一選擇為基本上由其組成或更進一步由其組成：分離之多肽、分離之聚核苷酸、載體、本揭示內容之細胞或組合物，以及使用說明書。在一態樣中，說明書敘述使用本文揭示之分離之多肽、分離之聚核苷酸、細胞、載體或組合物之方法。
政府支持之聲明
本揭示內容係在政府支持下在由NIH/NHLBI頒發之授權號R01HL077902下進行。因此，美國政府對本揭示內容具有一定權利。相關申請案之交叉參考
本申請案根據35 U.S.C. 119(e)主張對2019年5月17日提出申請之美國臨時申請案第62/849,637號之優先權，其內容之全文在此以引用方式併入本申請案中。序列表
本申請案含有序列表且全文以引用方式併入本文中。創建於2020年5月14日之ASCII複本命名為060933-0741_SL.txt且大小為41,917位元組。
在闡述組合物及方法之前，應理解，本揭示內容並不限於所述特定方法、方案、細胞系、分析及試劑，此乃因該等可變化。亦應理解，本文所用之術語意欲闡述本揭示內容之特定實施例，且決不意欲限制如隨附申請專利範圍中所述之本揭示內容之範圍。
除非另外定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語皆具有與熟習本揭示內容所屬技術領域者通常所理解相同之含義。儘管在本揭示內容之實踐或測試中可使用任何與本文所述之任何方法及材料類似或等效之彼等，但現在闡述較佳方法、裝置及材料。貫穿本揭示內容，各種技術出版物由阿拉伯數字鑑別，完整之文獻目錄引用緊接申請專利範圍之前提供。
本文引用之所有技術及專利出版物皆以引用方式整體併入本文中。本文中沒有什麼內容應解釋為承認本揭示內容沒有資格早於根據先前揭示內容之此類揭示內容。
除非另外指示，否則本揭示內容之實踐將採用組織培養、免疫學、分子生物學、微生物學、細胞生物學及重組DNA之習用技術，該等習用技術在本領域之技術範圍內。參見(例如) Sambrook及Russell編輯(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版；系列Ausubel等人編輯(2007) Current Protocols in Molecular Biology；系列Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)；MacPherson等人 (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press)；MacPherson等人 (1995) PCR 2: A Practical Approach；Harlow及Lane編輯 (1999) Antibodies, A Laboratory Manual；Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 第5版；Gait編輯(1984) Oligonucleotide Synthesis；美國專利第4,683,195號；Hames及Higgins編輯 (1984) Nucleic Acid Hybridization；Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization；Hames及Higgins編輯 (1984) Transcription and Translation；Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986))；Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning；Miller及Calos編輯 (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory)；Makrides編輯(2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells；及Mayer及Walker編輯 (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London)。
所有數字名稱(例如pH、溫度、時間、濃度及分子量，包括範圍)皆係以0.1之增量(+)或(-)變化之近似值。應理解，儘管不總是明確地說明，但所有數字名稱前面皆有術語「約」。亦應理解，儘管不總是明確地說明，但本文所述之試劑僅係實例性的，且其等效物為業內已知。定義
除非上下文明確指示其他含義，否則說明書及申請專利範圍中使用之單數形式「一((a)、(an))」及「該」包括複數個指示物。舉例而言，術語「細胞」包括複數個細胞，包括其混合物。
本文所用術語「包含(comprising或comprises)」欲指組合物及方法包括所列舉要素，但不排除其他要素。當使用「基本上由……組成」來定義組合物及方法時，其應意指出於所述目的排除對組合有任何本質意義之其他要素。因此，基本上由本文所定義之要素組成之組合物將不排除來自分離及純化方法之痕量污染物及醫藥上可接受之載劑，例如磷酸鹽緩衝鹽水、防腐劑及諸如此類。「由……組成」應意指排除多於其他成分之痕量要素及用於投與本揭示內容之組合物之實質方法步驟或產生組合物或實現預期結果之方法步驟。由該等過渡術語中之每一者定義之實施例在本發明之範圍內。
如本文所用之關於核酸(例如DNA或RNA)之術語「分離之」係指分別與巨分子之天然來源中存在之其他DNA或RNA分開之分子。術語「分離之肽片段」意指包括並非天然存在之片段且在天然狀態下將找不到之肽片段。術語「分離之」在本文中亦用於指自其他細胞蛋白質分離之多肽及蛋白質，且意指涵蓋純化及重組之多肽。在其他實施例中，術語「分離之」意指自成分、細胞及其他物質中分離，其中細胞、組織、聚核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或其片段通常在自然界中締合。舉例而言，分離之細胞係自具有不相似表型或基因型之組織或細胞分離之細胞。如熟習此項技術者顯而易見，非天然存在之聚核苷酸、肽、多肽、蛋白質、抗體或其片段不需要「分離」以將其與其天然存在之對應體區分。
如本文所用術語「結合(binding或binds)」意指包括分子之間之相互作用，其可使用(例如)雜交分析來檢測。該等術語亦意指包括分子之間之「結合」相互作用。相互作用可為(例如)天然之蛋白質-蛋白質、抗體-蛋白質、蛋白質-核酸、蛋白質-小分子或小分子-核酸。此結合可導致形成包含相互作用分子之「複合物」。「複合物」係指藉由共價鍵或非共價鍵、相互作用或力保持在一起之兩個或更多個分子之結合。
術語「MARCKS」欲指正式命名為富含肉豆蔻醯化丙胺酸之C激酶受質(MARCKS或MARKS)之蛋白質(Albert, K.A.等人(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83(9):2822-2826)。MARCKS在各種物種及組織中遍在表現(Albert, K.A.等人(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(20):7046-7050；Stumpo, D.J.等人 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(11):4012-4016)，而其他MARCKS家族成員MARCKS相關蛋白(MRP，亦稱為MacMARCKS、F52或MLP) (一種20 kDa蛋白質)在腦、生殖組織及巨噬細胞中高度表現(Aderem, A. (1992) Trend. Biochem. Sci. 17(10):438-443；Blackshear, P.J. (1993) J. Biol. Chem. 268:1501-1504)。MRP，與MARCKS相似，亦含有相同之三個進化保守之結構域；N-末端肉豆蔻醯化結構域、多同源性2 (MH2)結構域及效應物結構域(ED)。未知功能之MH2結構域類似於陽離子非依賴性甘露糖-6-磷酸受體之胞質尾區。蛋白質磷酸化發生在ED結構域之Ser159/163。N-末端(肉豆蔻醯化)及ED (磷酸化或未磷酸化)之間之合作對於控制該等分子與膜之締合係必需的。
在一態樣中，本揭示內容之MPS多肽包含至少6個胺基酸且不超過51個胺基酸，或另一選擇為基本上由其組成或仍由其組成。在另一態樣中，多肽係至少6個胺基酸且不超過51個胺基酸、或另一選擇為至少45個胺基酸、或另一選擇為40個胺基酸、或另一選擇為35個胺基酸、或另一選擇為30個胺基酸、或另一選擇為不超過25個胺基酸、或另一選擇為不超過20個胺基酸、或另一選擇為不超過15個胺基酸或另一選擇為其每一者之等效物。在一態樣中，等效物係其中一或多個胺基酸經保守胺基酸取代來取代之多肽。
MPS多肽及其等效物具有「生物活性」或以下之生物能力：抑制MARCKS之表現用於預防、減少、延遲、抑制或阻抑與MARCKS磷酸化及/或自細胞膜解離及/或PIP2螯合效應、或PIP3產生、或AKT活化、或發炎、纖維化、或活化之纖維母細胞增殖、或肌纖維母細胞生成及分化、或轉化生長因子-β (TGF-β)信號傳導途徑、或癌症、腫瘤細胞生長、實體腫瘤細胞生長或轉移、或癌症幹細胞生長、癌症幹性、或腫瘤細胞遷移相關之疾病或疾病症狀；及視情況用於促進細胞凋亡、或恢復抗性癌細胞對化學治療劑之敏感性。在一態樣中，MPS多肽及等效物具有預防、減少、延遲、抑制或阻抑與肺纖維化、特發性肺纖維化、或吸煙、博來黴素誘導之肺纖維化、腎纖維化、肝纖維化、皮膚纖維化、纖維母細胞病灶、活化之纖維母細胞增殖、發炎、或肌纖維母細胞生成相關之疾病或疾病症狀的能力。在另一態樣中，MPS多肽及等效物具有預防、減少、延遲、抑制或阻抑與淋巴瘤、白血病或實體腫瘤或癌症(癌瘤或肉瘤)相關之疾病或疾病症狀的能力。實體腫瘤之非限制性實例包括癌症、肺癌、腎癌、卵巢癌、腦癌、結腸直腸癌、胰臟癌、骨癌或喉癌。在一態樣中，「治療」排除防止或預防。
術語「多肽」與術語「蛋白質」及「肽」可互換使用，且在其最廣泛意義上係指兩個或更多個亞單位胺基酸、胺基酸類似物或肽模擬物之化合物。亞單位可藉由肽鍵連接。在另一實施例中，亞單位可藉由其他鍵(例如酯、醚等)連接。在一態樣中，多肽含有非天然或合成胺基酸，包括甘胺酸及天然存在之胺基酸之D及L光學異構物、胺基酸類似物及肽模擬物。若肽鏈較短，則三個或更多個胺基酸之肽通常稱為寡肽。若肽鏈較長，則肽通常稱為多肽或蛋白質。如本文所用術語「肽片段」亦係指肽鏈。
片語「等效物多肽」或「等效物肽片段」係指在高度嚴格條件下由聚核苷酸編碼之蛋白質、聚核苷酸或肽片段，該聚核苷酸與編碼編碼所例示多肽之聚核苷酸之所例示多肽或其補體的聚核苷酸雜交，及/或與標準或對照生物活性相比，該蛋白質、聚核苷酸或肽片段展現類似活體內生物活性，例如大約100%，或另一選擇為超過90%，或另一選擇為超過85%，或另一選擇為超過70%。藉由具有超過60%、或另一選擇為超過65%、或另一選擇為超過70%、或另一選擇為超過75%、或另一選擇為超過80%、或另一選擇為超過85%、或另一選擇為超過90%、或另一選擇為超過95%、或另一選擇為超過97%、或另一選擇為超過98%或99%序列同源性鑑別本揭示內容之範圍內之額外實施例。同源性百分比可藉由序列比較使用程式(例如在適當條件下運行之BLAST)來測定。在一態樣中，程式係在預設參數下運行。
「保守胺基酸取代」係其中胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基替代者。業內已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基之家族，包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、具有不帶電極性側鏈之胺基酸(例如，甘胺酸、天冬醯胺、麩胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、具有β分支側鏈之胺基酸(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及具有芳香族側鏈之胺基酸(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，免疫球蛋白多肽中之非必需胺基酸殘基較佳經來自同一側鏈家族之另一胺基酸殘基替代。在另一實施例中，胺基酸串可用結構上類似之串替代，該結構上類似之串在側鏈家族成員之次序及/或組成方面不同。
下表中提供保守胺基酸取代之非限制性實例，其中類似性評分為0或更高指示兩個胺基酸之間之保守取代。
C G P S A T D E N Q H K R V M I L F Y W
W -8 -7 -6 -2 -6 -5 -7 -7 -4 -5 -3 -3 2 -6 -4 -5 -2 0 0 17
Y 0 -5 -5 -3 -3 -3 -4 -4 -2 -4 0 -4 -5 -2 -2 -1 -1 7 10   
F -4 -5 -5 -3 -4 -3 -6 -5 -4 -5 -2 -5 -4 -1 0 1 2 9      
L -6 -4 -3 -3 -2 -2 -4 -3 -3 -2 -2 -3 -3 2 4 2 6         
I -2 -3 -2 -1 -1 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4 2 5            
M -5 -3 -2 -2 -1 -1 -3 -2 0 -1 -2 0 0 2 6               
V -2 -1 -1 -1 0 0 -2 -2 -2 -2 -2 -2 -2 4                  
R -4 -3 0 0 -2 -1 -1 -1 0 1 2 3 6                     
K -5 -2 -1 0 -1 0 0 0 1 1 0 5                        
H -3 -2 0 -1 -1 -1 1 1 2 3 6                           
Q -5 -1 0 -1 0 -1 2 2 1 4                              
N -4 0 -1 1 0 0 2 1 2                                 
E -5 0 -1 0 0 0 3 4                                    
D -5 1 -1 0 0 0 4                                       
T -2 0 0 1 1 3                                          
A -2 1 1 1 2                                             
S 0 1 1 1                                                
P -3 -1 6                                                   
G -3 5                                                      
C 12                                                         
術語「聚核苷酸」係指任何長度之核苷酸之聚合形式，即去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。聚核苷酸可具有任何三維結構，且可實施任何已知或未知功能。以下係聚核苷酸之非限制性實例：基因或基因片段(例如，探針、引子或EST)、外顯子、內含子、信使RNA (mRNA)、轉運RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、RNAi、siRNA、重組聚核苷酸、分支聚核苷酸、質體、載體、任何序列之分離之DNA、任何序列之分離之RNA、核酸探針及引子。聚核苷酸可包含經修飾核苷酸，例如甲基化核苷酸及核苷酸類似物。若存在，可在聚合物組裝之前或之後賦予對核苷酸結構之修飾。核苷酸之序列可由非核苷酸組分中斷。多聚核苷酸可在聚合後(例如)藉由與標記組分偶聯進一步經修飾，在一態樣中，該標記組分係多聚核苷酸及標籤之非天然存在之組合。該術語亦係指雙鏈及單鏈分子。除非另有說明或要求，否則本揭示內容之任何實施例(其係聚核苷酸)涵蓋雙鏈形式以及已知或預測構成雙鏈形式之兩個互補單鏈形式中之每一者。
聚核苷酸由四種核苷酸鹼基之特定序列構成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鳥嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；且當聚核苷酸係RNA時，用尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶。因此，術語「聚核苷酸序列」係聚核苷酸分子之字母表示。此字母表示可輸入至具有中央處理單元之電腦中之資料庫中，且用於生物資訊學應用，例如功能基因體及同源性搜索。
「同源性」或「一致性」或「相似性」係同義的，且係指兩個肽之間或兩個核酸分子之間之序列相似性。同源性可藉由比較各序列中之位置來測定，該序列可出於比較目的經比對。當比較序列中之位置由相同鹼基或胺基酸佔據時，則分子在該位置處同源。序列間之同源性程度隨序列所共有之匹配或同源位置的數目而變化。「不相關」或「非同源」序列與本揭示內容之序列之一共用小於40%之一致性、或另一選擇為小於25%之一致性。
聚核苷酸或聚核苷酸區(或多肽或多肽區)與另一序列具有某一百分比(例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%)之「序列一致性」意指，在比對時，在比較兩個序列中，該百分比之鹼基(或胺基酸)係相同的。此比對及同源性或序列一致性百分比可使用業內已知之軟體程式(例如Ausubel等人編輯(2007) Current Protocols in Molecular Biology中所述之彼等)來測定。較佳地，預設參數用於比對。一個比對程式係BLAST，使用預設參數。具體而言，程式係BLASTN及BLASTP，使用以下預設參數：遺傳密碼=標準；篩選=無；鏈=兩條；截止值= 60；預期= 10；矩陣= BLOSUM62；說明=50個序列；分選依據=高評分；資料庫=非冗餘，基因庫+ EMBL + DDBJ + PDB + 基因庫CDS轉譯+ SwissProtein + SPupdate + PIR。該等程式之詳情可參見以下網際網路地址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi，2007年11月26日最後登錄。等效聚核苷酸係具有指定同源性百分比及/或編碼具有相同或相似生物活性之多肽的彼等。
「基因」係指含有至少一個開放閱讀框(ORF)之聚核苷酸，其在被轉錄及轉譯後能夠編碼特定多肽或蛋白質。本文所述之任何聚核苷酸或多肽序列可用於鑑別與其相關之基因之更大片段或全長編碼序列。分離較大片段序列之方法為熟習此項技術者已知。
術語「表現」係指基因產物(例如RNA或多肽或蛋白質)之產生。
如本文所用之「表現」係指聚核苷酸轉錄成mRNA之過程及/或轉錄之mRNA隨後轉譯成肽、多肽或蛋白質之過程。若聚核苷酸源自基因組體DNA，則表現可包括在真核細胞中剪接mRNA。
「基因產物」或「基因表現產物」係指當基因轉錄時之RNA或當基因轉錄及轉譯時產生之胺基酸(例如肽或多肽)。
術語「編碼」當應用於聚核苷酸時係指若聚核苷酸在其天然狀態下或當藉由熟習此項技術者熟知之方法操縱時，其可經轉錄及/或轉譯以產生多肽及/或其片段之mRNA，則稱其「編碼」該多肽。反義鏈係該核酸之補體，且可自其推斷出編碼序列。
申請者在本文中提供用於下述基因及蛋白質轉移及表現技術之多肽及/或聚核苷酸序列。應理解，儘管並不總是明確地說明，但本文提供之序列可用於提供表現產物以及產生具有相同生物性質之蛋白質之實質上相同的序列。該等「等效」或「生物活性」多肽由如本文所述之等效聚核苷酸編碼。當使用在預設條件下運行之序列一致性方法進行比較時，其可具有與參考多肽至少60%、或另一選擇為至少65%、或另一選擇為至少70%、或另一選擇為至少75%、或另一選擇為至少80%、或另一選擇為至少85%、或另一選擇為至少90%、或另一選擇為至少95%、或另一選擇為至少98%一致之一級胺基酸序列。提供具體多肽序列作為特定實施例之實例。
「基因遞送媒劑」定義為任何可攜帶插入之聚核苷酸進入宿主細胞之分子。核酸遞送媒劑之實例係脂質體、膠束、生物相容性聚合物(包括天然聚合物及合成聚合物)；脂蛋白；多肽；多醣；脂多醣；人工病毒包膜；金屬粒子；及細菌、或病毒，例如桿狀病毒、腺病毒及反轉錄病毒、噬菌體、黏粒、質體、真菌載體及業內通常所用且已闡述用於表現於各種真核及原核宿主中且可用於基因療法一級用於簡單蛋白質表現之其他重組媒劑。
本揭示內容之聚核苷酸可使用基因遞送媒劑遞送至細胞或組織。如本文所用之「基因遞送」、「基因轉移」、「轉導」及諸如此類係指將外源聚核苷酸(有時稱為「轉基因」)引入宿主細胞、而與引入所用之方法無關的術語。該等方法包括多種眾所周知之技術，例如載體介導之基因轉移(藉由例如病毒感染/轉染、或各種其他基於蛋白質或基於脂質之基因遞送複合物)以及促進「裸」聚核苷酸遞送之技術(例如電穿孔、「基因槍」遞送及用於引入聚核苷酸之各種其他技術)。引入之聚核苷酸可穩定地或瞬時維持於宿主細胞中。穩定維持通常需要引入之聚核苷酸含有與宿主細胞相容之複製起點，或整合至宿主細胞之複製子(例如染色體外複製子(例如質體)或核或線粒體染色體)中。已知許多載體能夠介導基因轉移至哺乳動物細胞中，如業內已知及本文所述。
如本文所用術語「載體」係指經設計用於在不同宿主之間轉移之核酸構築體，該等宿主包括(但不限於)質體、病毒、黏粒、噬菌體、BAC、YAC等。「病毒載體」定義為重組產生之病毒或病毒顆粒，其包含將在活體內、離體或活體外遞送至宿主細胞中之聚核苷酸。在一些實施例中，質體載體可自市售載體製備。在其他實施例中，病毒載體可根據業內已知之技術自桿狀病毒、反轉錄病毒、腺病毒、AAV等產生。在一個實施例中，病毒載體係慢病毒載體。病毒載體之實例包括反轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、α病毒載體及諸如此類。基於傳染性煙草嵌紋病毒(TMV)之載體可用於製造蛋白質，且已報導在煙草葉中表現格瑞弗森(Griffithsin) (O'Keefe等人(2009) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 106(15):6099-6104)。α病毒載體(例如基於塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus)之載體及基於辛得比斯病毒(Sindbis virus)之載體)亦已經研發用於基因治療及免疫治療。參見Schlesinger及Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439及Ying等人 (1999) Nat. Med. 5(7):823-827。在基因轉移由反轉錄病毒載體介導之態樣中，載體構築體係指包含反轉錄病毒基因體或其部分之聚核苷酸，以及感興趣之基因。關於用於基因轉移之載體之現代方法的其他詳情可參見(例如)Kotterman等人 (2015) Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook Annual Review of Biomedical Engineering 17。含有啟動子及聚核苷酸依可操作方式連接至其中之選殖位點的載體為業內所熟知。該等載體能夠在活體外或活體內轉錄RNA，且可自諸如Agilent Technologies (Santa Clara, Calif.)及Promega Biotech (Madison, Wis.)等來源商購獲得。
「病毒載體」定義為重組產生之病毒或病毒顆粒，其包含將在活體內、離體或活體外遞送至宿主細胞中之聚核苷酸。病毒載體之實例包括反轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、α病毒載體及諸如此類。α病毒載體(例如基於塞姆利基森林病毒之載體及基於辛得比斯病毒之載體)亦已經研發發用於基因治療及免疫治療。參見Schlesinger及Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439及Ying等人 (1999) Nat. Med. 5(7):823-827。在基因轉移由反轉錄病毒載體介導之態樣中，載體構築體係指包含反轉錄病毒基因體或其部分之聚核苷酸，以及治療基因。
如本文所用之「反轉錄病毒介導之基因轉移」或「反轉錄病毒轉導」具有相同含義，且係指藉助病毒進入細胞並將其基因體整合至宿主細胞基因體中而將基因或核酸序列穩定地轉移至宿主細胞中的過程。病毒可經由其正常感染機制進入宿主細胞，或經修飾使得其結合至不同宿主細胞表面受體或配體以進入細胞。如本文所用，反轉錄病毒載體係指能夠經由病毒或病毒樣進入機制將外源核酸引入細胞中之病毒顆粒。
反轉錄病毒以RNA之形式攜帶其遺傳資訊；然而，一旦病毒感染細胞，RNA反轉錄成DNA形式，其整合至感染細胞之基因體DNA中。整合之DNA形式稱為原病毒。
在基因轉移由DNA病毒載體(例如腺病毒(Ad)或腺相關病毒(AAV))介導之態樣中，載體構築體係指包含病毒基因體或其部分之聚核苷酸，以及轉基因。腺病毒(Ad)係一種相對充分表徵之同源病毒組，包括超過50種血清型。參見例如國際PCT公開案第WO 95/27071號。Ad不需要整合至宿主細胞基因體中。亦構築重組Ad源載體，特別係降低野生型病毒之重組及產生之潛能的彼等。參見國際PCT公開案第WO 95/00655號及第WO 95/11984號。野生型AAV具有整合至宿主細胞基因體中之高感染性及特異性。參見Hermonat及Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470及Lebkowski等人 (1988) Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996。
含有啟動子及聚核苷酸依可操作方式連接至其中之選殖位點之載體為業內所熟知。該等載體能夠在活體外或活體內轉錄RNA，且可自諸如Stratagene (La Jolla, CA)及Promega Biotech (Madison, WI)等來源商購獲得。為了最佳化表現及/或活體外轉錄，可能需要去除、添加或改變純系之5’及/或3’非轉譯部分，以消除額外的潛在不適當轉譯起始密碼子或在轉錄或轉譯之位準下可干擾或降低表現的其他序列。或者，可將共有核糖體結合位點直接插入起始密碼子之5’以增強表現。
基因遞送媒劑亦包括DNA/脂質體複合物、膠束及靶向病毒蛋白-DNA複合物。亦包含靶向抗體或其片段之脂質體可用於本揭示內容之方法中。為了增強向細胞之遞送，本揭示內容之核酸或蛋白質可偶聯至結合細胞表面抗原之抗體或其結合片段。除了將聚核苷酸遞送至細胞或細胞群體之外，可藉由蛋白轉染之非限制性技術將本文所述之蛋白直接引入細胞或細胞群體，或者，可增強本揭示內容之蛋白質之表現及/或促進其活性之培養條件係其他非限制性技術。
術語「培養(culture或culturing)」係指細胞、組織或生物體在各種培養基上或在培養基中之活體外繁殖。應理解，在培養物中生長之細胞之後代可能與親細胞不完全相同(即，形態學、遺傳學或表型)。
術語「抗體」係以最廣泛含義使用且特定而言包括全長單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現期望生物活性即可。如本文所用術語「抗體」及「免疫球蛋白」包括任何同型之抗體或免疫球蛋白、保留與抗原特異性結合之抗體之片段，包括但不限於Fab、Fab'、F(ab)2 、Fv、scFv、dsFv、Fd片段、dAb、VH、VL、VhH及V-NAR結構域；微小抗體、雙價抗體、三價抗體、四價抗體及κ體；由抗體片段及一或多個分離之CDR或功能性互補位形成之多特異性抗體片段；嵌合抗體、人類化抗體、單鏈抗體及包含抗體之抗原結合部分及非抗體蛋白之融合蛋白。免疫球蛋白分子之重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合結構域。抗體(Ab)之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織之結合。
如本文所用，「單株抗體」係指自實質上同源之抗體群體獲得之抗體。單株抗體係高度特異性的，此乃因每一單株抗體皆針對抗原上之單一決定子。抗體可經(例如)放射性同位素、產生可檢測產物之酶、螢光蛋白及諸如此類可檢測地標記。抗體可進一步與其他部分(例如特異性結合對之成員，例如生物素(生物素-抗生物素蛋白特異性結合對之成員)及諸如此類)偶聯。抗體亦可結合至固體支持物(包括但不限於聚苯乙烯板或珠粒及諸如此類)。
單株抗體可使用業內已知之雜交瘤技術或重組DNA方法產生。用於產生或選擇抗體之替代技術包括將淋巴球活體外暴露於感興趣之抗原，及在細胞、噬菌體或類似系統中篩選抗體展示文庫。
如本文所使用之術語「人類抗體」意欲包括具有源自人類種系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區之抗體。本揭示內容之人類抗體可包括不由人類種系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如，藉由活體外隨機或位點特異性誘變或藉由活體內體細胞突變引入之突變)。然而，如本文所用術語「人類抗體」並不意欲包括源自另一哺乳動物物種(例如小鼠)種系之CDR序列已移植至人類框架序列上之抗體。因此，如本文所用術語「人類抗體」係指其中實質上蛋白質之每個部分(例如CDR、框架、CL 、CH 結構域(例如CH1 、CH2 、CH3 )、鉸鏈、(VL、VH))在人類中實質上係非免疫原性的、僅具有微小序列變化或變異之抗體。類似地，抗體命名之靈長類動物(猴、狒狒、黑猩猩等)、齧齒類動物(小鼠、大鼠、兔、天竺鼠、倉鼠及諸如此類)及其他哺乳動物命名該等物種、亞屬、屬、亞科、科特異性抗體。此外，嵌合抗體包括上述之任何組合。相對於未修飾之抗體，該等改變或變異視情況且較佳地保留或降低在人類或其他物種中之免疫原性。因此，人類抗體與嵌合或人類化抗體不同。需要指出的是，人類抗體可由能夠表現功能上重排之人類免疫球蛋白(例如重鏈及/或輕鏈)基因之非人類動物或原核或真核細胞來產生。此外，當人類抗體係單鏈抗體時，其可包含在天然人類抗體中未發現之連接體肽。舉例而言，Fv可包含連接重鏈之可變區及輕鏈之可變區的連接體肽，例如兩個至約八個甘胺酸或其他胺基酸殘基。該等連接體肽被視為具有人類起源。
如本文所用，若抗體係自系統使用人類免疫球蛋白序列、例如藉由對攜帶人類免疫球蛋白基因之轉基因小鼠實施免疫或藉由篩選人類免疫球蛋白基因文庫，則人類抗體「源自」特定種系序列。「源自」人類種系免疫球蛋白序列之人類抗體可藉由將人類抗體之胺基酸序列與人類種系免疫球蛋白之胺基酸序列進行比較來鑑別。所選人類抗體之胺基酸序列通常與由人類種系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列至少90%一致，且含有當與其他物種之種系免疫球蛋白胺基酸序列(例如鼠類種系序列)相比時將人類抗體鑑別為人類之胺基酸殘基。在某些情形下，人類抗體之胺基酸序列可與由種系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列至少95%、或甚至至少96%、97%、98%或99%一致。通常，源自特定人類種系序列之人類抗體將展示與由人類種系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列不超過10個的胺基酸差異。在某些情形下，人類抗體可展示與由種系免疫球蛋白基因編碼之胺基酸序列不超過5個或甚至不超過4個、3個、2個或1個的胺基酸差異。
「人類單株抗體」係指展示單一結合特異性之抗體，其具有源自人類種系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區。該術語亦意指重組人類抗體。本文闡述製備該等抗體之方法。
如本文所用術語「重組人類抗體」包括藉由重組方式製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，例如自對人類免疫球蛋白基因轉基因或轉染色體之動物(例如小鼠)或自其製備之雜交瘤分離之抗體；自經轉化以表現該抗體之宿主細胞、例如自轉染瘤分離之抗體；自重組、組合人類抗體文庫分離之抗體；及藉由涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列之任何其他方式製備、表現、產生或分離的抗體。該等重組人類抗體具有源自人類種系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區。然而，在某些實施例中，可使該等重組人類抗體經歷活體外誘變(或，當使用人類Ig序列之轉基因動物時，經歷活體內體細胞誘變)，且因此重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列儘管源自人類種系VH及VL序列並與其相關，但其係可不天然存在於人類活體內抗體種系譜內的序列。本文闡述製備該等抗體之方法。
如本文所用，嵌合抗體係其輕鏈及重鏈基因通常藉由基因改造自屬不同物種之抗體可變區及恆定區基因構築的抗體。
如本文所用術語「人類化抗體」或「人類化免疫球蛋白」係指含有源自非人類免疫球蛋白之最小序列之人類/非人類嵌合抗體。對於大多數部分，人類化抗體係如下人類免疫球蛋白(接受者抗體)：其中來自接受者之可變區之殘基由來自非人類物種(供體抗體)(例如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物)之可變區之具有期望特異性、親和性及能力的殘基替代。人類化抗體可包含在接受者抗體或供體抗體中未發現之殘基。人類化抗體亦可視情況包含免疫球蛋白恆定區(Fc)(通常為人類免疫球蛋白)之至少一部分、在框架區、恆定區或CDR中含有已經來自人類抗體之相應位置之胺基酸取代之一或多個胺基酸的非人類抗體。一般而言，與相同抗體之非人類化形式相比，預計人類化抗體在人類宿主中產生降低之免疫反應。人類化抗體可具有對抗原結合或其他抗體功能實質上無效應之保守胺基酸取代。保守取代組包括：甘胺酸-丙胺酸、纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸、絲胺酸-蘇胺酸及天冬醯胺-麩醯胺酸。
如本文所用術語「抗體衍生物」包含全長抗體或抗體之片段，其中一或多個胺基酸藉由烷基化、聚乙二醇化、醯化、酯形成或醯胺形成或諸如此類例如用於將抗體與第二分子連接而經化學修飾。此包括(但不限於)聚乙二醇化抗體、半胱胺酸-聚乙二醇化抗體及其變體。
「組合物」欲指活性多肽、聚核苷酸或抗體及另一化合物或組合物之組合，該另一化合物或組合物係惰性的(例如可檢測之標記)或活性的(例如基因遞送媒劑)，其單獨或與載劑組合，在一個實施例中，該載劑可為簡單載劑，如鹽水或醫藥上可接受的或如下定義之固體支持物。
「醫藥組合物」意欲包括活性多肽、聚核苷酸或抗體與惰性或活性載劑(例如固體支持物)之組合，使得組合物適於活體外、活體內或離體診斷或治療用途。
本文所用術語「醫藥上可接受之載劑」涵蓋任何標準醫藥載劑，例如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水及乳液，例如油/水或水/油乳液，以及各種類型之潤濕劑。組合物亦可包括穩定劑及防腐劑。對於載劑、穩定劑及佐劑之實例，參見Martin (1975) Remington’s Pharm. Sci., 第15版(Mack Publ. Co., Easton)。
片語「固體支持物」係指非水性表面，例如「培養板」、「基因晶片」或「微陣列」。該等基因晶片或微陣列可藉由熟習此項技術者已知之多種技術用於診斷及治療目的。在一種技術中，寡核苷酸佈置在基因晶片上，用於藉由例如美國專利第6,025,136號及第6,018,041號中概述之雜交方法測定DNA序列。本揭示內容之聚核苷酸可經修飾為探針，其進而可用於檢測遺傳序列。該等技術已闡述於(例如)美國專利第5,968,740號及第5,858,659號中。亦可將探針固定至電極表面用於電化學檢測核酸序列，例如Kayem等人之美國專利第5,952,172號及Kelley等人(1999) Nucleic Acids Res. 27:4830-4837所述。
術語「個體(subject)」、「宿主」、「個體(individual)」及「患者」在本文中可互換使用，係指動物、通常哺乳動物。任何適宜哺乳動物皆可藉由本文所述之方法、細胞或組合物治療。哺乳動物之非限制性實例包括人類、非人類靈長類動物(例如，猿、長臂猿、黑猩猩、猩猩、猴、獼猴及諸如此類)、家畜(例如，狗及貓)、農場動物(例如，馬、牛、山羊、綿羊、豬)及實驗動物(例如，小鼠、大鼠、兔、天竺鼠)。在一些實施例中，哺乳動物係人類。哺乳動物可為任何年齡或處於任何發育階段(例如，成人、青少年、兒童、嬰兒或子宮內之哺乳動物)。哺乳動物可為雄性或雌性。哺乳動物可為懷孕之雌性。在一些實施例中，個體係人類。在一些實施例中，個體患有或懷疑患有癌症或腫瘤性病症。
「細胞」、「宿主細胞」或「重組宿主細胞」在本文中可互換使用。應理解，該等術語不僅係指特定受試細胞，而且指該細胞之子代或潛在子代。細胞可為鼠類、大鼠、兔、猿、牛、羊、豬、犬、貓、馬及靈長類動物(特定而言人類)類型中之任何一或多種。由於因突變或環境影響可使後續各代發生某些修飾，因此，此子代實際上可能與親細胞不同，但仍包括於本文所用術語之範疇內。
「真核細胞」包括除無核原生物之外之所有生命界。其可經由膜結合核容易地區分。動物、植物、真菌及原生生物係真核生物或生物體，其之細胞藉由內膜及細胞骨架組織成複雜結構。最具特徵性之膜結合結構係核。除非特別說明，否則術語「宿主」包括真核宿主，包括例如酵母、高等植物、昆蟲及哺乳動物細胞。真核細胞或宿主之非限制性實例包括猿、牛、豬、鼠類、大鼠、禽類、爬蟲類動物及人類。
「原核細胞」通常無核或任何其他膜結合細胞器，並分為兩個領域,細菌及古細菌。除了染色體DNA之外，該等細胞亦可在稱為游離基因體之環狀環中含有遺傳資訊。細菌細胞非常小，大約係動物線粒體之大小(直徑約1-2 μm且長10 μm)。原核細胞之特徵在於三種主要形狀：桿狀、球形及螺旋形。代替經歷複雜之複製過程(如真核生物)，細菌細胞藉由二分裂分化。實例包括(但不限於)芽孢桿菌屬(Bacillus )細菌、大腸桿菌屬(E. coli )細菌及沙門桿菌屬(Salmonella )細菌。
如本文所用，個體中疾病之「治療(treating或treatment)係指(1)預防個體中發生之症狀或疾病，該個體易患或尚未展現疾病之症狀；(2)抑制疾病或停止其發展或復發；或(3)改善或引起疾病或疾病症狀之消退。如業內所理解，「治療」係用於獲得有益或期望結果(包括臨床結果)之方法。出於本技術之目的，有益或期望結果可包括但不限於以下中之一或多者：緩和或改善一或多種症狀、減輕病況(包括疾病)之程度、病況(包括疾病)之穩定(即，不惡化)狀態、延遲或減緩病況(包括疾病)進展、改善或緩解病況(包括疾病)狀態及緩解(無論部分或全部)，無論可檢測或不可檢測。在一態樣中，術語「治療」不包括防止或預防。
當疾病係癌症時，以下臨床終點係治療之非限制性實例：腫瘤負荷之降低、腫瘤生長之減緩、更長之總體存活、更長之腫瘤進展時間、轉移之抑制、癌症幹性之降低或腫瘤轉移之減少。在一態樣中，治療不包括預防。當疾病係纖維化時，以下臨床終點係治療之非限制性實例：纖維化組織減少、發炎減少、纖維母細胞病灶減少、活化之纖維母細胞增殖減少、肌纖維母細胞生成減少；強制肺活量(FVC)下降速率降低，其中FVC係肺功能測試期間呼出之空氣總量；FVC自基線之絕對及相對增加、FVC自基線之絕對增加(%預測)、無進展存活時間之增加、聖喬治呼吸問卷(St George's Respiratory Questionnaire，SGRQ)總評分自基線之減少，其中SGRQ係健康相關之生活品質問卷，分為3個組分：症狀、活動及影響以及總評分(總計加權)可在0至100之範圍內，其中較低之評分表示較好之健康狀態；及高解析度電腦化斷層攝影(HRCT)定量肺纖維化(QLF)評分自基線相對降低，其中QLF評分在0至100%之範圍內，且更大之值表示更大量之肺纖維化且被認為係較差健康狀態。可實施以量測該等臨床終點之纖維化治療及測試之臨床終點的非限制性實例闡述於以下臨床試驗中：NCT03733444 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03733444)(2019年1月9日最後登錄)、NCT00287729 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00287729)(2019年1月9日最後登錄)、NCT00287716 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00287716)(2019年1月9日最後登錄)、NCT02503657(clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02503657)(2019年1月9日最後登錄)、NCT00047645 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00047645)(2019年1月9日最後登錄)、NCT02802345 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02802345)(2019年1月9日最後登錄)、NCT01979952 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01979952)(2019年1月9日最後登錄)、NCT00650091 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00650091)(2019年1月9日最後登錄)、NCT01335464 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01335464)(2019年1月9日最後登錄)、NCT01335477 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01335477)(2019年1月9日最後登錄)、NCT01366209 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01366209)(2019年1月9日最後登錄)。可實施以量測該等臨床終點之纖維化治療及測試之臨床終點的其他非限制性實例闡述於King等人，(2014) N Engl J Med.  5月29日；370(22):2083-92及Richeldi等人， (2014) N Engl J Med.  5月29日；370(22):2071-82中。
「癌症幹細胞」(「CSC」)欲指當移植至動物宿主中時具有自我更新、分化及致瘤性之能力之腫瘤內之細胞或細胞亞群體。基於臨床證據及實驗觀察，CSC似乎具有癌症惡性腫瘤之長期純系維持且即使在許多嚴苛治療處理之後亦存活。用於定義CSC之黃金標準係連續活體內移植，但許多細胞表面標記物(例如Sox2、Slug、CD44、CD24及CD133)已證明可用於研究患者樣本及實驗系統中之CSC。由微小RNA及Wnt/β-連環蛋白、Notch及Hedgehog信號傳導路徑組成之調控網路控制CSC性質。如本文所用，該等中之一或多者意欲作為癌症幹細胞標記物。額外標記物提供於圖 15 及17 中。該等標記物之表現可藉由本文及業內已知及闡述之方法檢測及監測。
Sox2 (性別決定區Y (SRY) -盒2)欲指參與維持胚胎幹細胞自我更新及多能性之轉錄因子。該蛋白之表現在各種人類惡性腫瘤中係異常的，且已報導用作食管鱗狀細胞癌(SCC)中之致癌基因。亦報導促進牙髓幹細胞(DPSC)之增殖、遷移及黏附能力。已知其參與尤因氏肉瘤(Ewing's sarcoma)細胞增殖，且其不活化以PI3K (磷酸肌醇3-激酶)/Akt路徑介導之方式導致細胞凋亡及G1/S阻滯。檢測及監測表現之單株抗體可商購自例如Sigma-Aldrich及Novus Biologicals (2020年5月6日最後登錄)。
CD133或CD133抗原(亦稱為prominin-1)係一種在人類中由PROM1基因編碼之醣蛋白。其係特異性定位於細胞突起之五跨跨膜醣蛋白之成員。檢測及監測表現之單株抗體可商購自例如Abcam及ThermoFisher (2020年5月6日最後登錄)。
Slug或(SNAI2)係轉錄因子及上皮至間質過渡之誘導物，其在發育及腫瘤侵襲期間介導細胞遷移。Devendra等人 (2014) Stem Cells, Dec. 32(12):3209-3218, 10.1002/stem.1809。檢測及監測表現之方法為業內已知，例如Devendra等人 (2014)，上文文獻。
術語「患有」在與術語「治療」相關時係指已經診斷有或易患疾病之患者或個體。患者亦可稱為「處於患有疾病之風險」。此患者尚未發展出特徵性疾病病理，然而已知由於家族史而易患該疾病，遺傳上易於發展出該疾病，或診斷為患有易於使患者發展出欲治療之疾病的疾病或病症。
「有效量」意欲指示最可能導致對治療之期望反應之投與或遞送至患者之化合物或藥劑的量。該量由患者之臨床參數(包括但不限於疾病之階段、年齡、性別、組織學、敏感性、毒性及腫瘤復發之可能性)憑經驗確定。在一態樣中，「有效量」係治療有效量。
如本文所用，「癌症」係特徵在於在個體中存在展現異常不受控制複製之細胞之疾病狀態，且可與術語「腫瘤」互換使用。在一些實施例中，癌症係實體腫瘤、肺癌、肝癌、腎癌、腦癌、卵巢癌、結腸直腸癌、胰臟癌、骨癌、喉癌、淋巴瘤或白血病。
「腫瘤」係由不受控制之、進行性細胞增殖引起之組織異常生長，且不用於生理功能。「腫瘤」亦稱為贅瘤。
如本文所用術語「I期癌症」、「II期癌症」、「III期癌症」及「IV期」係指癌症之TNM分期分類。I期癌症通常鑑別原發性腫瘤限於起源器官。II期欲指原發性腫瘤已擴散到周圍組織中，且淋巴結立即引流腫瘤之區域。III期欲指原發腫瘤較大，固定至更深之結構。IV期欲指原發腫瘤較大，固定至更深之結構。參見第20及21頁, CANCER BIOLOGY, 第2版, Oxford University Press (1987)。
當比較一個患者與另一患者、或另一選擇為比較一個患者群體與另一患者群體時，使用「具有相同癌症」。舉例而言，兩個患者或患者群體將各自具有或患有結腸癌。
「投與」在整個療程中可以一個劑量、連續或間歇地實現。確定最有效之投與方式及劑量之方法為熟習此項技術者已知，且將隨著用於療法之組合物、療法之目的、所治療之靶細胞、所治療之疾病及所治療之個體而變化。可實施單次或多次投與，劑量值及模式由治療醫師選擇。適宜劑量調配物及投與藥劑之方法為業內已知。投與途徑亦可經確定且確定最有效之投與途徑之方法為熟習此項技術者所知，且將隨者用於治療之組合物、治療目的、所治療個體之健康狀況或疾病階段以及靶細胞或組織而變化。投與途徑之非限制性實例包括經口投與、經鼻投與、吸入、注射及局部應用。
本揭示內容之藥劑可藉由任何適宜投與途徑投與用於療法。亦應理解，較佳途徑將隨著接受者之狀況及年齡以及所治療之疾病而變化。
酪胺酸激酶抑制劑(「TKI」)係抑制細胞中酪胺酸激酶之作用之試劑(小分子或生物製劑)。酪胺酸激酶係藉由信號轉導級聯反應負責活化許多蛋白質之酶。TKI通常用作抗癌藥物。酪胺酸激酶抑制劑之實例包括(但不限於) ErbB：HER1/EGFR (厄洛替尼(Erlotinib)、吉非替尼(Gefitinib)、拉帕替尼(Lapatinib)、凡德他尼(Vandetanib)、舒尼替尼(Sunitinib)、來那替尼(Neratinib))；HER2/neu (拉帕替尼、來那替尼)；RTK III類：C-套組(阿西替尼(Axitinib)、舒尼替尼、索拉菲尼(Sorafenib))；FLT3 (來他替尼)；PDGFR (阿西替尼、舒尼替尼、索拉菲尼)；及VEGFR (凡德他尼、西馬夏尼(Semaxanib)、西地尼布(Cediranib)、阿西替尼、索拉菲尼)；bcr-abl (伊馬替尼(Imatinib)、尼羅替尼(Nilotinib)、達沙替尼(Dasatinib))；Src (伯舒替尼(Bosutinib))及傑納斯激酶(Janus kinase) 2 (來他替尼)  小分子TKI為業內已知且列示於包含oncolink.org/treatment/article.cfm?id=452 (2014年7月17日最後登錄)之網址處。
PTK/ZK係具有廣泛特異性之「小」分子酪胺酸激酶抑制劑，其靶向所有VEGF受體(VEGFR)、血小板源生長因子(PDGF)受體、c-KIT及c-Fms。Drevs (2003) Idrugs 6(8):787-794。PTK/ZK係藉由抑制所有已知之結合VEGF之受體(包括VEGFR-1 (Flt-1)、VEGFR-2 (KDR/Flk-1)及VEGFR-3 (Flt-4))之活性來阻斷血管生成及淋巴管生成的靶向藥物。PTK/ZK之化學名稱係1-[4-氯苯胺基]-4-[4-吡啶基甲基]酞嗪琥珀酸鹽或1-酞嗪胺、N-(4-氯苯基)-4-(4-吡啶基甲基)-, 丁二酸鹽(1:1)。PTK/ZK之同物異名及類似物已知為瓦他拉尼(Vatalanib)、CGP79787D、PTK787/ZK 222584、CGP-79787、DE-00268、PTK-787、PTK-787A、VEGFR-TK抑制劑、ZK 222584及ZK。
如本文所用術語「基於鉑之藥物」欲指係基於鉑之化合物的抗癌藥物，該基於鉑之化合物係DNA烷基化劑之亞類。該等藥劑為業內所熟知，且用於治療多種癌症，例如肺癌、頭頸癌、卵巢癌、結腸直腸癌及前列腺癌。該等藥劑之非限制性實例包括卡鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)、奈達鉑(nedaplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、四硝酸三鉑、沙鉑(Satraplatin)、阿柔鉑(Aroplatin)、洛鉑(Lobaplatin)及JM-216。(參見McKeage等人 (1997) J. Clin. Oncol. 201:1232-1237及通常CHEMOTHERAPY FOR GYNECOLOGICAL NEOPLASM, CURRENT THERAPY AND NOVEL APPROACHES, 於the Series Basic and Clinical Oncology中, Angioli等人 編輯，2004)。「奧沙利鉑」 (Eloxatin®)係在與順鉑及卡鉑相同之家族中之基於鉑之化學療法藥物。其通常與氟尿嘧啶及甲醯四氫葉酸(leucovorin)以稱為FOLFOX之組合來組合投與，用於治療結腸直腸癌。與順鉑相比，兩個胺基由環己基二胺替代以改良抗腫瘤活性。氯配體由源自草酸之草酸根二齒化合物替代，以便改良水溶性。奧沙利鉑之等效物為業內已知且包括但不限於順鉑、卡鉑、阿柔鉑、洛鉑、奈達鉑及JM-216 (參見McKeage等人 (1997) J. Clin. Oncol. 201:1232-1237及通常CHEMOTHERAPY FOR GYNECOLOGICAL NEOPLASM, CURRENT THERAPY AND NOVEL APPROACHES, in the Series Basic and Clinical Oncology, Angioli等人 編輯，2004)。實施本揭示內容之方法 分離之多肽及組合物
本揭示內容提供包含選自SEQ ID NO 40-56、58及59之群之胺基酸序列、或另一選擇為基本上由其組成或仍由其組成的分離之多肽或MPS多肽、或其每一者之等效物。在一態樣中，分離之多肽包括實質上同源及等效之多肽。在一態樣中，本揭示內容之分離之多肽包含不超過51個胺基酸，或另一選擇為基本上由其組成或仍由其組成。在另一態樣中，本揭示內容之分離之多肽包含不超過35個胺基酸，或另一選擇為基本上由其組成或仍由其組成。在又一態樣中，多肽係至少6個胺基酸且不超過51個胺基酸、或另一選擇為至少45個胺基酸、或另一選擇為40個胺基酸、或另一選擇為35個胺基酸、或另一選擇為30個胺基酸、或另一選擇為不超過25個胺基酸、或另一選擇為不超過20個胺基酸、或另一選擇為不超過15個胺基酸或另一選擇為其每一者之等效物。在一態樣中，分離之多肽之等效物包含如下多肽、或另一選擇為基本上由其組成或仍由其組成：與分離之多肽具有至少80%序列一致性之多肽、或由與編碼分離之多肽之分離之聚核苷酸或其補體雜交的聚核苷酸編碼之多肽、或由與編碼選自SEQ ID No. 40-56、58及59之群之胺基酸序列的聚核苷酸具有至少80%序列一致性之聚核苷酸編碼的多肽。
高嚴格雜交條件通常在約60℃下在約1 × SSC中實施。實質上同源及等效之多肽以及實質上同源及等效之聚核苷酸欲指與上述彼等具有至少80%同源性、或另一選擇為至少85%同源性、或另一選擇為至少90%同源性、或另一選擇為至少95%同源性、或另一選擇為至少98%同源性之彼等，每一同源性係如使用熟習此項技術者已知及本文鑑別之方法確定，此時係在預設參數下運行。當使用在預設條件下運行之序列一致性方法比較時，其可具有與參考多肽至少60%、或另一選擇為至少65%、或另一選擇為至少70%、或另一選擇為至少75%、或另一選擇為至少80%、或另一選擇為至少85%、或另一選擇為至少90%、或另一選擇為至少95%或另一選擇為至少98%一致之一級胺基酸序列，或另一選擇為具有與參考聚核苷酸一致之核酸序列。在一個具體態樣中，當使用在預設條件下運行之序列一致性方法比較時，其可具有與參考多肽至少60%、或另一選擇為至少65%、或另一選擇為至少70%、或另一選擇為至少75%、或另一選擇為至少80%、或另一選擇為至少85%、或另一選擇為至少90%、或另一選擇為至少95%或另一選擇為至少98%一致之一級胺基酸序列，或另一選擇為具有與參考聚核苷酸一致之核酸序列。在一態樣中，等效物係其中一或多個胺基酸經保守胺基酸取代來取代之多肽。在一態樣中，分離之多肽具有至少一個係經修飾之天然存在之胺基酸(例如D-離胺酸)的胺基酸。
在一態樣中，本揭示內容之MPS多肽包含至少6個胺基酸且不超過51個胺基酸，或另一選擇為基本上由其組成或仍由其組成。在另一態樣中，多肽係至少6個胺基酸且不超過51個胺基酸、或另一選擇為至少45個胺基酸、或另一選擇為40個胺基酸、或另一選擇為35個胺基酸、或另一選擇為30個胺基酸、或另一選擇為不超過25個胺基酸、或另一選擇為不超過20個胺基酸、或另一選擇為不超過15個胺基酸或另一選擇為其每一者之等效物。在一態樣中，等效物係其中一或多個胺基酸經保守胺基酸取代來取代之多肽。在另一態樣中，肉豆蔻酸偶聯或接合至N-末端胺基酸，包括其等效物，例如，其中所有絲胺酸皆經丙胺酸替代。在一態樣中，分離之多肽具有至少一個係經修飾之天然存在之胺基酸(例如D-離胺酸)的胺基酸。
在一態樣中，上述分離之多肽具有添加至MPS及其每一者之等效物之羧基-末端或胺基末端的額外胺基酸，使得多肽之長度包含額外至少10個胺基酸、或另一選擇為至少15個胺基酸、或另一選擇為至少20個胺基酸、或另一選擇為至少25個胺基酸、或另一選擇為至少30個胺基酸、或另一選擇為至少35個胺基酸或胺基酸添加高達總共51個胺基酸。
熟習此項技術者已知可對任何肽進行修飾以提供具有改變性質之肽。本揭示內容之肽片段可經修飾以包括非天然胺基酸。因此，肽可包含D-胺基酸、D-及L-胺基酸之組合及各種「設計者」胺基酸(例如β-甲基胺基酸、C-α-甲基胺基酸及N-α-甲基胺基酸等)以向肽傳遞特殊性質。另外，藉由在特定偶合步驟分配特定胺基酸，可產生具有α-螺旋、β轉角、β褶疊、α-轉角及環肽之肽。通常，據信α-螺旋二級結構或無規二級結構較佳。在一態樣中，所揭示之多肽含有非天然胺基酸。
熟習此項技術者已知，藉由用一或多個功能等效之胺基酸取代一或多個胺基酸，可對任何肽進行修飾，該修飾不改變肽之生物功能。在一態樣中，胺基酸由具有相似之固有性質(包括但不限於疏水性、大小或電荷)之胺基酸取代。用於確定欲經取代之適當胺基酸及用於此之胺基酸之方法為熟習此項技術者已知。非限制性實例包括如Layoff等人 (1978) In Atlas of Protein Sequence and Structure 第5卷，增刊2 (ed. MR. Day off), 第345-352頁. National Biomedical Research Foundation, Washington DC所述之經驗取代模型；PAM矩陣，包括Day off矩陣(Layoff等人 (1978), 上文文獻；或如由Jones等人 (1992) Compute. Appl. Basic. 8:275-282及Gannet等人 (1992) Science 256:1443-1145所述之JET矩陣；由Adak及Hasegawa (1996) J. Mol. Evil. 42:459-468所述之經驗模型；如由Henrico及Henrico (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919所述之塊取代矩陣(BLOSSOM)；如由Neil (1987) Molecular Evolutionary Genetics. Columbia University Press, New York.所述之泊松(Poisson)模型；及如由Muller等人 (2002) Mol. Biol. Evil. 19:8-13所述之最大可能性(ML)方法。
因此，在又一態樣中，分離之多肽或肽片段可包含由本文所述之等效聚核苷酸編碼之「等效」或「生物活性」多肽，或另一選擇為基本上由其組成或更進一步由其組成。當使用在預設條件下運行之序列一致性方法進行比較時，其可具有與參考多肽至少60%、或另一選擇為至少65%、或另一選擇為至少70%、或另一選擇為至少75%、或另一選擇為至少80%、或另一選擇為至少85%、或另一選擇為至少90%、或另一選擇為至少95%、或另一選擇為至少98%一致之一級胺基酸序列。
分離之多肽或MPS多肽及等效物具有以下能力：抑制MARCKS之表現用於預防、減少、延遲、抑制或阻抑與MARCKS磷酸化及/或自細胞膜解離及/或PIP2螯合效應、或PIP3產生、或AKT活化、或發炎、纖維化、或活化之纖維母細胞增殖、或肌纖維母細胞生成及分化、或轉化生長因子-β (TGF-β)信號傳導途徑、或癌症、或實體腫瘤細胞生長或轉移、或癌症幹細胞生長、或腫瘤細胞遷移相關之疾病或疾病症狀；及視情況用於促進細胞凋亡、或恢復抗性癌細胞對化學治療劑之敏感性。在一態樣中，分離之多肽及等效物具有預防、減少、延遲、抑制或阻抑與肺纖維化、特發性肺纖維化或吸煙、博來黴素誘導之肺纖維化、腎纖維化、肝纖維化、皮膚纖維化、纖維母細胞病灶、活化之纖維母細胞增殖、發炎或肌纖維母細胞生成相關之疾病或疾病症狀的能力。在另一態樣中，分離之多肽及等效物具有預防、減少、延遲、抑制或阻抑與淋巴瘤、白血病或實體腫瘤相關之疾病或疾病症狀的能力。實體腫瘤之非限制性實例包括癌症、腎癌、腦癌、結腸直腸癌、胰臟癌、骨癌或喉癌。
多肽在治療上可用於抑制或阻抑實體腫瘤生長，例如癌細胞在活體外或活體內之癌細胞侵襲、轉移、遷移及存活。其亦促進細胞凋亡並抑制癌症幹細胞(例如表現CD133+之彼等)、惡性腫瘤及癌細胞之生長，增加或誘導癌細胞死亡。
在另一態樣中，進一步提供分離之多肽，其進一步包含以下中之一或多者，或另一選擇為基本上由其組成：促進分離之多肽進入細胞之依可操作方式連接之胺基酸序列；靶向多肽或賦予多肽穩定性之多肽。亦提供分離之多肽，其中胺基酸序列包含依可操作方式連接之多肽，或另一選擇為基本上由其組成或另一選擇為由其組成，該依可操作方式連接之多肽將多肽靶向特定細胞類型或穩定多肽，或更進一步包含便於細胞進入之轉導結構域或腫瘤靶向結構域及如本文所述之MPS多肽。
包含本揭示內容之胺基酸序列或另一選擇為基本上由其組成或更進一步由其組成的多肽可藉由在適當宿主細胞中表現編碼本揭示內容之多肽序列之聚核苷酸來製備。此可藉由熟習此項技術者已知之重組DNA技術之方法來完成。因此，本揭示內容亦提供在真核或原核宿主細胞中重組產生本揭示內容之多肽之方法，在一態樣中，本揭示內容之多肽進一步自宿主細胞中分離。本揭示內容之蛋白質及肽片段亦可藉由化學合成使用市售自動化肽合成器(例如Perkin Elmer/Applied Biosystems, Inc., 430A或431A型, Foster City, CA, USA製造之彼等)來獲得。合成之蛋白質或多肽可沈澱並例如藉由高效液相層析(HPLC)進一步純化。因此，本揭示內容亦提供化學合成本揭示內容之蛋白質的方法，其係提供蛋白質及試劑(例如胺基酸及酶)之序列，並以適當取向及線性順序將胺基酸連接在一起。
蛋白質及肽片段依可操作方式連接至轉導結構域，以促進細胞進入。蛋白質轉導提供基因療法之替代方案，用於將治療性蛋白質遞送至靶細胞中，且涉及蛋白質轉導之方法在本揭示內容之範圍內。蛋白質轉導係蛋白質自外部環境內化至宿主細胞中。內化過程依賴於能夠穿透細胞膜之蛋白質或肽。為了對通常非轉導性蛋白質賦予此能力，可將非轉導性蛋白質與轉導介導性蛋白質(例如觸角足肽、HIV TAT蛋白質轉導結構域或單純疱疹病毒VP22蛋白)融合。參見Ford等人(2001) Gene Ther. 8:1-4。因此，本揭示內容之多肽可(例如)包括修飾，該修飾可增加諸如穩定性、半衰期、進入細胞之能力及有助於投藥(例如本揭示內容之多肽之活體內投藥)等屬性。舉例而言，本揭示內容之多肽可包含HIV TAT蛋白質之蛋白質轉導結構域，或另一選擇為基本上由其組成或更進一步由其組成，如Schwarze等人 (1999) Science 285:1569-1572中所述。另外，或另一選擇為，多肽包括可使該多肽靶向欲處理之細胞或組織及/或穩定該多肽之胺基酸序列。
在另一態樣中，本揭示內容之任何蛋白質、肽或聚核苷酸可與可檢測之標記(例如染料)組合，以易於檢測。該等標記之非限制性實例包括放射性同位素、螢光染料、化學發光化合物、染料及蛋白質，包括酶。
多肽可與另一藥物或藥劑(例如蛋白質、多肽、抗體片段，其可為或可不為抗癌藥物或藥劑)，諸如抗癌藥物或藥劑(例如TKI、基於鉑之藥物或靶向EGFR之藥物或藥劑)組合。在另一態樣中，組合物與MARCKS蛋白質、多肽或其片段組合，其中MARCKS片段包含的多肽片段之胺基酸序列不與本揭示內容之多肽或國際PCT公開案第WO 2015/013669號及第WO 2015/095789號中揭示之MPS多肽重疊。該等組合物可與載劑(例如醫藥上可接受之載劑)組合，用於本文揭示之診斷、篩選及治療方法。
本揭示內容亦提供活體外及活體內使用之醫藥組合物，其包含治療有效量之MPS多肽或編碼MPS多肽之聚核苷酸，或另一選擇為基本上由其組成或更進一步由其組成，當以小於約10微莫耳、或另一選擇為小於約9微莫耳、或另一選擇為小於約8微莫耳、或另一選擇為小於約7微莫耳、或另一選擇為小於約6微莫耳、或另一選擇為小於約5微莫耳、或另一選擇為小於約4微莫耳、或另一選擇為小於約3微莫耳、或另一選擇為小於約2微莫耳、或另一選擇為小於約1微莫耳、或另一選擇為小於約0.5微莫耳、或另一選擇為小於約0.25微莫耳之莫耳濃度施加時，與不接受組合物之對照相比，其在本文提供之方法中引起至少約75%、或另一選擇為至少約80%、或另一選擇為至少約85%、或另一選擇為至少約90%、或另一選擇為至少約95%、或另一選擇為至少約99%之有效性。比較有效性可藉由業內已知之適宜活體外或活體內方法來確定。
本揭示內容亦提供用於活體外及活體內使用之組合物，其包含本文所述之一或多種分離之多肽或聚核苷酸及醫藥上可接受之載劑，或另一選擇為基本上由其組成或更進一步由其組成。在一態樣中，組合物係用於本揭示內容之治療方法中之醫藥調配物。在另一態樣中，本揭示內容提供醫藥組合物，其包含分離之多肽或聚核苷酸，或另一選擇為基本上由其組成或更進一步由其組成，該分離之多肽或聚核苷酸之濃度使得治療有效量之多肽或藥理劑量之組合物引起與未接受組合物之對照相比，細胞生長減少至少75%、或另一選擇為至少80%、或另一選擇為至少85%、或另一選擇為至少90%、或另一選擇為至少95%或另一選擇為至少97%，例如當以小於1微莫耳之莫耳濃度施加至反應性癌細胞之培養物時。分離之聚核苷酸及組合物
本揭示內容亦提供編碼上述多肽之分離之聚核苷酸。在一態樣中，本揭示內容亦提供編碼上述多肽之分離之聚核苷酸及分離之抗MPS shRNA。本揭示內容之多肽之非限制性實例包括SEQ ID No.40-56、58及59及其等效物。本揭示內容亦提供與上文鑑別之序列互補之聚核苷酸及其等效物。互補可使用傳統雜交在中等或高嚴格條件下確定。在一態樣中，聚核苷酸編碼本揭示內容之分離之多肽之等效物。在另一態樣中，本文提供分離之聚核苷酸或其補體之等效物，其中等效物與本揭示內容之聚核苷酸具有至少80%之序列一致性。
分離之聚核苷酸或其補體之等效物包含與編碼本揭示內容之分離之多肽之聚核苷酸或其等效物具有至少80%序列一致性的聚核苷酸，或另一選擇為基本上由其組成或仍由其組成，本揭示內容之分離之多肽之聚核苷酸或其等效物與編碼分離之多肽或其補體之分離之聚核苷酸雜交。亦提供編碼實質上同源及等價之多肽或肽片段之聚核苷酸。實質上同源及等效欲指具有不同程度之同源性之彼等，例如如上定義之至少65%、或另一選擇為至少70%、或另一選擇為至少75%、或另一選擇為至少80%、或另一選擇為至少85%、或另一選擇為至少90%、或另一選擇為至少95%、或另一選擇為至少97%同源，且其編碼具有如本文所述之生物活性之多肽。應理解，儘管並不總是明確地說明，但實質上同源之肽及聚核苷酸之實施例意欲用於本揭示內容之每一態樣，例如肽、聚核苷酸及抗體。
或者，等效物係由在嚴格條件下與編碼多肽之核酸或補體雜交之核酸編碼之多肽，或者當係聚核苷酸時，係在高嚴格性條件下與參考聚核苷酸或其補體雜交之聚核苷酸。等效聚核苷酸在高嚴格性條件下與編碼本揭示內容之多肽或其等效物之聚核苷酸或每一之補體雜交。雜交反應可在不同「嚴格性」之條件下實施。一般而言，低嚴格性雜交反應係在約40℃下在約10 x SSC或等效離子強度/溫度之溶液中實施。中等嚴格性雜交通常係在約50℃下在約6 x SSC中實施，且高嚴格性雜交反應通常係在約60℃下在約1 x SSC中實施。雜交反應亦可在熟習此項技術者熟知之「生理條件」下實施。生理條件之非限制性實例係溫度、離子強度、pH及通常在細胞中發現之Mg2+ 之濃度。等效聚核苷酸係在嚴格條件下與參考聚核苷酸或參考聚核苷酸之補體雜交之聚核苷酸、在一態樣中具有與參考聚核苷酸相似之生物活性者。
在另一態樣中，聚核苷酸及其補體以及其每一者之等效物經可檢測之標記物或標籤(例如染料或放射性同位素)標記，以易於檢測。可將聚核苷酸插入表現載體中並遞送至靶細胞(例如癌細胞)中，用於如本文揭示之診斷及治療方法。
如本文所用術語聚核苷酸欲指DNA及RNA以及修飾之核苷酸。舉例而言，本揭示內容提供該等序列或其補體之反義聚核苷酸鏈，例如反義RNA或siRNA (shRNA)。可使用編碼MPS多肽之序列使用熟習此項技術者已知之方法(其中遺傳密碼之簡併性提供編碼相同多肽之若干聚核苷酸序列)或Van der Krol等人 (1988) BioTechniques 6:958中所述之方法獲得反義RNA。
本揭示內容之聚核苷酸可使用習用重組技術複製。或者，聚核苷酸可使用PCR技術複製。PCR係美國專利第4,683,195號、第4,800,159號、第4,754,065號及第4,683,202號之標的物且闡述於以下PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis等人編輯，Birkhauser Press, Boston (1994))及其中引用之參考文獻中。此外，熟習此項技術者可使用本文提供之序列及商業DNA合成器來複製DNA。因此，本揭示內容亦提供用於獲得本揭示內容之肽片段之方法，其藉由提供聚核苷酸之線性序列、適當引子分子、化學品(例如酶)及其複製之說明書，以及以適當定向化學複製或連接核苷酸以獲得聚核苷酸。在單獨實施例中，該等聚核苷酸進一步經分離。更進一步，熟習此項技術者可將聚核苷酸依可操作方式連接至調控序列，以用於其在宿主細胞中之表現。將聚核苷酸及調控序列插入宿主細胞(原核或真核)中以進行複製及擴增。如此擴增之DNA可藉由熟習此項技術者熟知之方法自細胞中分離。本文進一步提供藉由此方法獲得聚核苷酸之方法以及如此獲得之聚核苷酸。
在一態樣中，聚核苷酸係RNA分子，其係短干擾RNA，亦稱為siRNA。製備及篩選干擾RNA以及選擇阻斷聚核苷酸表現之能力的方法為業內已知且下文顯示其非限制性實例。該等干擾RNA單獨或與適宜載體組合或在宿主細胞內由本揭示內容提供。進一步提供含有RNAi之組合物。RNAi可用於剔除或敲低細胞或組織中之選擇功能，如業內已知及本文所述。
藉由獲得靶mRNA序列並確定適當siRNA互補序列，可設計siRNA序列。本揭示內容之siRNA經設計以與靶序列相互作用，此意味著其與靶序列足夠互補以與該序列雜交。siRNA可與靶序列100%一致。然而，siRNA序列與靶序列之同源性可小於100%，只要siRNA可與靶序列雜交即可。因此，例如，siRNA分子可與靶序列或靶序列之補體至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致。因此，亦可使用相對於靶具有插入、缺失或單點突變之siRNA分子。推薦每個靶mRNA產生若干不同siRNA序列，以允許篩選最佳靶序列。應實施同源性搜索(例如BLAST搜索)，以確保siRNA序列不含有與任何已知哺乳動物基因之同源性。
一般而言，較佳地，靶序列位於距AUG起始密碼子至少100-200個核苷酸處，且距靶mRNA之終止密碼子至少50-100個核苷酸處(Duxbury (2004) J. Surgical Res. 117:339-344)。
研究者已確定某些特徵在siRNA分子中係常見的，其有效地沉默其靶基因(Duxbury (2004) J. Surgical Res. 117:339-344；Ui-Tei等人 (2004) Nucl.Acids Res. 32:936-48)。作為一般性指導，包括以下條件中之一或多者之siRNA尤其可用於哺乳動物細胞中之基因沉默：GC比率在45-55%之間，沒有超過9個G/C殘基之運行，G/C在有義鏈之5'端；反義鏈之5'端之A/U；及在反義鏈之5'末端之前7個鹼基中之至少5個A/U殘基。
siRNA之長度通常為約10至約30個核苷酸。舉例而言，siRNA可為10-30個核苷酸長、12-28個核苷酸長、15-25個核苷酸長、19-23個核苷酸長或21-23個核苷酸長。當siRNA含有不同長度之兩條鏈時，較長之鏈命名siRNA之長度。在此情況下，較長鏈之未配對核苷酸將形成懸突。
術語siRNA包括短髮夾RNA (shRNA)。shRNA包含形成莖環結構之RNA單鏈，其中莖由包含雙鏈siRNA之互補之有義鏈及反義鏈組成，且環係不同大小之連接體。shRNA之莖結構通常為約10至約30個核苷酸長。舉例而言，莖可為10-30個核苷酸長、12-28個核苷酸長、15-25個核苷酸長、19-23個核苷酸長或21-23個核苷酸長。
輔助siRNA設計之工具係公眾容易獲得的。舉例而言，基於電腦之siRNA設計工具在網際網路www.dharmacon.com (2007年11月26日最後登錄)上可用。
本揭示內容亦提供用於活體外及活體內使用之組合物，其包含本文所述一或多種分離之聚核苷酸及醫藥上可接受之載劑，或另一選擇為實質上由其組成或更進一步由其組成。在一態樣中，組合物係用於本揭示內容之治療方法中之醫藥調配物。在另一態樣中，本揭示內容提供醫藥組合物，其包含分離之聚核苷酸，或另一選擇為基本上由其組成或更進一步由其組成，該分離聚核苷酸之濃度使得治療有效量之或藥理劑量之組合物引起，與未接受組合物之對照相比，癌細胞生長、存活率或遷移減少至少75%、或另一選擇為至少80%、或另一選擇為至少85%、或另一選擇為至少90%、或另一選擇為至少95%或另一選擇為至少97%。比較有效性可藉由業內已知及本文所述之適宜活體外或活體內方法來確定。dsRNA 及 siRNA 之合成
dsRNA及siRNA可在活體外化學或酶促合成，如Micura (2002) Agnes Chem. Int. Ed. Emgl. 41:2265-2269；Betz (2003) Promega Notes 85:15-18；及Paddison及Hannon (2002) Cancer Cell. 2:17-23中所述。化學合成可經由人工或自動化方法實施，該兩種方法皆係業內熟知，如Micura (2002), 上文文獻中所述。siRNA亦可在細胞內以shRNA之形式內源性表現，如Yu等人(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:6047-6052；及McManus等人 (2002) RNA 8:842-850中所述。內源表現已使用基於質體之表現系統使用小核RNA啟動子(例如RNA聚合酶III U6或H1、或RNA聚合酶II U1)來達成，如Brummelkamp等人 (2002) Science 296:550-553 (2002)；及Novarino等人(2004)J. Immunol. 24:5322-5330)中所述。
活體外酶促dsRNA及siRNA合成可使用RNA聚合酶介導之方法實施，以產生個別有義鏈及反義鏈，其在遞送至選擇之細胞中之前活體外退火，如以下中所述：Fire等人 (1998) Nature 391:806-811；Donze及Picard (2002) Nucl.Acids Res. 30(10):e46；Yu等人 (2002)；及Shim等人 (2002) J. Biol. Chem. 277:30413-30416。若干製造商(Promega、Ambion、New England Biolabs及Stragene)生產用於實施活體外合成之轉錄套組。
siRNA之活體外合成可藉由(例如)使用一對短的雙鏈寡核苷酸作為DNA模板來達成，該等雙鏈體寡核苷酸在有義及反義RNA序列之上游含有T7 RNA聚合酶啟動子。雙鏈體之每一寡核苷酸係用於合成siRNA之一條鏈之單獨模板。然後，合成之單獨短RNA鏈退火以形成siRNA，如Protocols and Applications, 第2章: RNA interference, Promega Corporation, (2005)中所述。
dsRNA之活體外合成可藉由例如在兩條DNA靶序列鏈之5'-端使用T7 RNA聚合酶啟動子來達成。此係藉由使用單獨DNA模板來達成，每一模板含有相對於T7啟動子在不同定向上之靶序列，在兩個單獨反應中轉錄。將所得轉錄本混合並轉錄後退火。用於此反應之DNA模板可藉由PCR或藉由使用兩個線性化之質體模板產生，每一線性化模板在靶序列之不同端含有T7聚合酶啟動子。Protocols and Applications, 第2章: RNA interference, Promega Corporation (2005)。
RNA可藉由首先將DNA聚核苷酸插入適宜原核或真核宿主細胞中來獲得。DNA可藉由任何適當方法、例如藉由使用適當基因遞送媒劑(例如脂質體、質體或載體)或藉由電穿孔來插入。當細胞複製且DNA轉錄成RNA時，然後可使用熟習此項技術者熟知之方法分離RNA，例如，如Sambrook及Russell (2001)上文文獻中所述。例如，mRNA可根據Sambrook及Russell (2001)上文文獻中所述之程序使用各種裂解酶或化學溶液分離，或遵循製造商提供之附帶說明書藉由核酸結合樹脂萃取。
為了表現本文所述之蛋白質，可藉由若干技術遞送編碼感興趣之基因之核酸序列。其實例包括如本文所述之病毒技術(例如反轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、α病毒載體及諸如此類)及非病毒技術(例如DNA/脂質體複合物、膠束及靶向病毒蛋白-DNA複合物)。一旦在感興趣之細胞內，轉基因之表現可在遍在啟動子(例如EF-1)或組織特異性啟動子(例如鈣攜鈣蛋白激酶2 (CaMKI)啟動子、NSE啟動子及人類Thy-1啟動子)之控制下。或者，表現量可藉由使用誘導型啟動子系統(例如Tet開/關啟動子)控制，如Wiznerowicz等人 (2005) Stem Cells77 :8957-8961中所述。
啟動子之非限制性實例包括(但不限於)巨細胞病毒(CMV)啟動子(Kaplitt等人 (1994) Nat. Genet. 8:148-154)、CMV/人類ÿ-珠蛋白啟動子(Mandel等人 (1998) J. Neurosci. 18:4271-4284)、NCX1啟動子、ÿMHC啟動子、MLC2v啟動子、GFAP啟動子(Xu等人(2001) Gene Ther. 8:1323-1332)、1.8-kb神經元特異性烯醇酶(NSE)啟動子(Klein等人 (1998) Exp. Neurol. 150:183-194)、雞β肌動蛋白(CBA)啟動子(Miyazaki (1989) Gene 79:269-277)及β-葡萄糖醛酸苷酶(GUSB)啟動子(Shipley等人 (1991) Genetics 10:1009-1018)、人類血清白蛋白啟動子、α-1-抗胰蛋白酶啟動子。為了改良表現，其他調節元件可另外依可操作方式連接至轉基因，例如土撥鼠肝炎病毒後調控元件(WPRE) (Donello等人 (1998) J. Virol. 72: 5085-5092)或牛生長激素(BGH)多聚腺苷酸化位點。
本揭示內容進一步提供本揭示內容之分離之聚核苷酸，其依可操作方式連接至RNA轉錄之啟動子以及用於DNA或RNA之複製及/或瞬時或穩定表現之其他調控序列。如本文所用術語「依可操作方式連接」意指以啟動子將指導RNA轉錄離開DNA分子之方式定位。該等啟動子之實例係SP6、T4及T7。在某些實施例中，細胞特異性啟動子用於插入之聚核苷酸之細胞特異性表現。含有啟動子或啟動子/增強子、具有終止密碼子及可選標記物序列、以及選殖位點之載體在業內眾所周知且可商業上可獲得，在該選殖位點中，插入之DNA片依可操作方式連接至該啟動子。關於一般方法學及選殖策略，參見Gene Expression Technology (Goeddel編輯, Academic Press, Inc. (1991))及其中引用之參考文獻以及Vectors: Essential Data Series (Gacesa及Ramji編輯, John Wiley & Sons, N.Y. (1994))，其含有圖譜、功能性質、商業供應商及關於各種適宜載體之GenEMBL登錄號之參考。較佳地，該等載體能夠在活體外或活體內轉錄RNA。
含有該等核酸之表現載體可用於獲得宿主載體系統以產生蛋白質及多肽。此暗指該等表現載體必須作為游離基因體或作為染色體DNA之整合部分在宿主生物中可複製。適宜表現載體包括質體、病毒載體，包括腺病毒、腺相關病毒、反轉錄病毒、黏粒等。腺病毒載體尤其可用於將基因引入活體內組織中，此乃因其在活體外及活體內皆具有高程度細胞表現及有效轉化。當將核酸插入適宜宿主細胞(例如原核或真核細胞)中且宿主細胞複製時，可重組產生蛋白質。適宜宿主細胞將取決於載體，且可包括如上所述之哺乳動物細胞、動物細胞、人類細胞、猿細胞、昆蟲細胞、酵母細胞及細菌細胞，且使用眾所周知之方法構築。參見Sambrook及Russell (2001)，上文文獻。除了使用病毒載體將外源核酸插入細胞中外，亦可藉由業內熟知之方法(例如轉變細菌細胞；使用磷酸鈣沈澱轉染哺乳動物細胞；DEAE-聚葡萄糖；電穿孔；或顯微注射)將核酸插入宿主細胞中。關於此方法，參見Sambrook及Russell (2001)，上文文獻。
本揭示內容亦提供適於將本揭示內容之聚核苷酸遞送至細胞中(無論係在活體內、離體或活體外)之遞送媒劑。本揭示內容之聚核苷酸可包含於基因遞送媒劑、選殖載體或表現載活體內。該等載體(尤其表現載體)可進而經操縱以呈現可(例如)促進遞送至細胞及/或進入細胞之多種形式中之任一者。
在一態樣中，當編碼兩種或更多種肽(其中至少一者係MPS、SEQ ID NO: 40-56、58及59、或其每一者之等效物)之聚核苷酸意欲經轉譯且視情況表現時，編碼多肽之聚核苷酸可組織在重組mRNA或cDNA分子內，該重組mRNA或cDNA分子產生在單一mRNA分子上表現至少兩種肽之轉錄本。此係藉由使用具有位於編碼該兩種肽之聚核苷酸之間之內部核糖體進入位點(IRES)之生物活性的聚核苷酸來完成。IRES元件起始聚核苷酸之轉譯，而不使用傳統上認為在真核細胞中轉譯蛋白質所必需之「帽」結構。最初結合個別微小RNA病毒(例如脊髓灰白質炎病毒及腦心肌炎病毒)之非轉譯區闡述，IRES元件稍後顯示在真核細胞中有效地起始閱讀框之轉譯，且當位於真核啟動子之下游時，其將不影響第一順反子之「帽」依賴性轉譯。當病毒中存在時，IRES元件通常至少450個核苷酸長，且在其3'端具有保守「UUUC」序列，其之後係痕量多聚嘧啶、貧G間隔體及AUG三聯體。
如本文所用術語「IRES」意欲包括任何分子，例如mRNA聚核苷酸或其反轉錄本(cDNA)，其能夠在真核細胞中起始聚核苷酸下游基因之轉譯，而無帽位點之益處。「IRES」元件可與自然界中發現之序列(例如微小RNA病毒IRES)相同，或其可為當轉染至適宜宿主細胞中時實施相同功能之非天然或非自然序列。含有天然存在之IRES元件之雙順反子及多順反子表現載體為業內已知，且闡述於以下中：例如，Pestova等人 (1998) Genes Dev. 12:67-83及國際PCT公開案第WO 01/04306號，其進而在第17頁第35至38行參考若干文獻參考，其包括(但不限於) Ramesh等人 (1996) Nucl.Acids Res. 24:2697-2700；Pelletier等人(1988) Nature 334:320-325；Jan等人(1989) J. Virol. 63:1651-1660；及Davies等人 (1992) J. Virol. 66:1924-1932。美國專利申請公開案第2005/0014150 A1號之第[0009]段揭示若干授權之美國專利，其中使用病毒源之IRES元件在哺乳動物細胞、植物細胞及通常在真核細胞中之線性多順反子mRNA中表現外源基因。美國專利申請公開案第2004/0082034 A1號揭示在昆蟲細胞中有活性之IRES元件。鑑別新元件之方法亦闡述於美國專利第6,833,254號中。
與美國專利第6,653,132號中揭示之細胞序列相似之細胞序列亦在術語「IRES」元件內。該專利揭示由源自VEGF (血管內皮生長因子基因)之5'-UTR之序列構成的序列元件(命名為SP163)，推測其係經由先前未知之選擇式剪接模式產生。專利權人報導，SP163之優點在於其係天然細胞IRES元件，相對於已知之細胞IRES元件，其作為轉譯刺激物及作為帽非依賴性轉譯之介體具有優越性能，且在應激條件下維持該等功能。
包括起IRES元件作用之人工序列亦在術語「IRES」元件內，其闡述於例如美國專利申請公開案第2005/0059004 A1號中。
可操作地且單獨地連接至IRES元件者係肽轉譯及適當處理所必需之序列。該序列之實例包括(但不限於)真核啟動子、增強子、終止序列及多聚腺苷酸化序列。該等序列之構築及使用為業內已知，且使用重組方法與IRES元件及蛋白序列組合。「依可操作方式連接」應意指兩個或更多個組分以允許其為了其預期目的而接合之方式並置。啟動子係驅動標記物或靶蛋白轉錄之序列。其必須經選擇用於特定宿主細胞，即哺乳動物、昆蟲或植物。病毒或哺乳動物啟動子將在哺乳動物細胞中起作用。啟動子可為組成型或誘導型，其實例係業內已知及闡述的。
在一態樣中，肽自單獨重組聚核苷酸轉錄及轉譯，且在宿主細胞中組合成功能蛋白。此重組聚核苷酸無需IRES元件或標記物蛋白，但在一態樣中，其可存在。
該等含有本揭示內容之聚核苷酸之分離之宿主細胞可用於本文所述之方法以及用於聚核苷酸之重組複製及用於肽之重組產生及用於高通量篩選。載體及宿主細胞
如本文所用術語「載體」係指經設計用於在不同宿主之間轉移之核酸構築體，該等宿主包括(但不限於)質體、病毒、黏粒、噬菌體、BAC、YAC等。「病毒載體」定義為重組產生之病毒或病毒顆粒，其包含將在活體內、離體或活體外遞送至宿主細胞中之聚核苷酸。在一些實施例中，質體載體可自市售載體製備。在其他實施例中，病毒載體可根據業內已知之技術自桿狀病毒、反轉錄病毒、腺病毒、AAV等產生。在一個實施例中，病毒載體係慢病毒載體。病毒載體之實例包括反轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、α病毒載體及諸如此類。基於傳染性煙草嵌紋病毒(TMV)之載體可用於製造蛋白質，且已報導在煙草葉中表現格瑞弗森(O'Keefe等人(2009) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 106(15):6099-6104)。α病毒載體(例如基於塞姆利基森林病毒之載體及基於辛得比斯病毒之載體)亦已經研發發用於基因治療及免疫治療。參見Schlesinger及Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439及Ying等人 (1999) Nat. Med. 5(7):823-827。在基因轉移由反轉錄病毒載體介導之態樣中，載體構築體係指包含反轉錄病毒基因體或其部分之聚核苷酸，以及感興趣之基因。關於用於基因轉移之載體之現代方法的其他詳情可參見(例如)Kotterman等人 (2015) Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook Annual Review of Biomedical Engineering 17。含有啟動子及聚核苷酸依可操作方式連接至其中之選殖位點的載體為業內所熟知。該等載體能夠在活體外或活體內轉錄RNA，且可自諸如Agilent Technologies (Santa Clara, Calif.)及Promega Biotech (Madison, Wis.)等來源商購獲得。
本文提供載體，其包含本揭示內容之分離之聚核苷酸及視情況依可操作方式連接至分離之聚核苷酸用於複製及/或表現之調控序列，或另一選擇為基本上由其組成或更進一步由其組成。載體之非限制性實例包括質體或病毒載體，例如反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體或腺相關病毒載體。在一個特定態樣中，載體係AAV載體(腺相關病毒載體)。
在一態樣中，調控序列包含啟動子、增強子元件及/或報導基因，或另一選擇為實質上由其組成或更進一步由其組成。在一態樣中，載體進一步包含可檢測標記物或純化標記物，或另一選擇為實質上由其組成或更進一步由其組成。
如本文所用術語「可檢測標記物」係指能夠直接或間接產生可檢測信號之至少一種標記物。此標記物之非排他性清單包括例如藉由比色法、螢光、發光產生可檢測信號之酶，例如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸去氫酶；發色團，例如螢光、發光染料；具有藉由電子顯微鏡或藉由其電學性質(例如電導率、電流分析法、伏安法、阻抗)檢測之電子密度之基團；可檢測基團，例如其分子具有足夠之大小以誘導其物理及/或化學性質之可檢測修飾的基團，該檢測可藉由光學方法(例如繞射、表面電漿共振、表面變化、接觸角變化)或物理方法(例如原子力光譜學)、隧道效應、或放射性分子(例如32 P、35 S或125 I)來完成。
如本文所用術語「純化標記物」係指至少一種用於純化或鑑別之標記物。此標記物之非排他性清單包括His、lacZ、GST、麥芽糖結合蛋白、NusA、BCCP、c-myc、CaM、FLAG、GFP、YFP、cherry、硫氧還蛋白、聚(NANP)、V5、Snap、HA、殼多糖結合蛋白、Softag 1、Softag 3、Strep或S-蛋白。適宜直接或間接螢光標記物包含FLAG、GFP、YFP、RFP、dTomato、cherry、Cy3、Cy 5、Cy 5.5、Cy 7、DNP、AMCA、生物素、地高辛配基(Digoxigenin)、Tamra、德克薩斯紅(Texas Red)、玫瑰紅(rhodamine)、Alexa fluors、FITC、TRITC或任何其他螢光染料或半抗原。
本文進一步揭示宿主細胞，其進一步包含本揭示內容之分離之多肽、分離之聚核苷酸或載體中之一或多者，或另一選擇為實質上由其組成或更進一步由其組成。
含有多肽及/或聚核苷酸之適宜細胞包括原核及真核細胞，其包括但不限於細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、鼠類細胞、大鼠細胞、綿羊細胞、猿細胞及人類細胞。細菌細胞之實例包括大腸桿菌、腸道沙門桿菌(Salmonella enterica )及戈氏鏈球菌(Streptococcus gordonii )。細胞可自商業供應商(例如美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC，Rockville Maryland, USA))購買，或使用業內已知之方法自分離株培養。適宜真核細胞之實例包括(但不限於) 293T HEK細胞、以及倉鼠細胞系BHK-21；命名為NIH3T3、NS0、C127之鼠細胞系、猿細胞系COS、Vero；及人類細胞系HeLa、PER.C6 (可自Crucell商購獲得) U-937及Hep G2。昆蟲細胞之非限制性實例包括草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda )。用於表現之酵母之實例包括(但不限於)酵母屬(Saccharomyces )、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces )、漢遜酵母屬(Hansenula )、念珠菌屬(Candida )、球擬酵母屬(Torulopsis )、耶羅威亞酵母屬(Yarrowia )或畢赤酵母屬(Pichia )。參見(例如)美國專利第4,812,405號、第4,818,700號、第4,929,555號、第5,736,383號、第5,955,349號、第5,888,768號及第6,258,559號。
除了物種特異性之外，細胞可為任何特定組織類型，例如體細胞或胚胎幹細胞，例如能或不能分化成終末分化細胞之幹細胞。幹細胞可為人類或動物起源，例如哺乳動物。抗體組合物
本揭示內容亦提供能夠與本揭示內容之多肽(例如SEQ ID No: 40-56之多肽)特異性形成複合物的抗體，其可用於篩選該等多肽。在一態樣中，抗體或其片段特異性結合至MARCKS蛋白之磷酸化位點結構域(PSD)，其可防止MARCKS磷酸化及/或螯合與MARCKS天然相互作用之蛋白。在另一態樣中，抗體或其片段與肽或其他分子偶聯以促進進入細胞。術語「抗體」係如上所述且包括多株抗體及單株抗體、抗體片段及其衍生物。該等抗體包括(但不限於)牛、兔、山羊、小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、綿羊、狗、貓、猴、黑猩猩、猿等。抗體亦可用於鑑別及純化治療性及/或診斷性多肽。亦提供產生本揭示內容之單株抗體之雜交瘤細胞系。
本揭示內容之多株抗體可使用業內已知之習用技術產生且在文獻中充分闡述。存在若干用於產生多株抗體之方法。舉例而言，多株抗體通常藉由對適宜哺乳動物(例如但不限於雞、山羊、天竺鼠、倉鼠、馬、小鼠、大鼠及兔)實施免疫來產生。將抗原注射至哺乳動物中，其誘導B淋巴球產生對抗原具有特異性之IgG免疫球蛋白。自哺乳動物血清中純化此IgG。此方法之變化包括改變佐劑、投與途徑及部位、每個部位之注射體積及每個動物之部位數量用於動物之最佳產生及人道處理。舉例而言，佐劑通常用於改良或增強對抗原之免疫反應。大部分佐劑提供注射部位抗原貯庫，其允許抗原緩慢釋放至引流淋巴結中。其他佐劑包括表面活性劑及免疫刺激分子，該表面活性劑促進蛋白抗原分子在大表面積上之集中。用於多株抗體產生之佐劑之非限制性實例包括弗氏(Freund’s)佐劑、Ribi佐劑系統及Titermax。多株抗體可使用美國專利第7,279,559號、第7,119,179號、第7,060,800號、第6,709,659號、第6,656,746號、第6,322,788號、第5,686,073號及第5,670,153號中所述之方法來產生。
本揭示內容之單株抗體可使用業內已知及文獻中充分闡述之習用雜交瘤技術產生。舉例而言，雜交瘤係藉由融合以下各項產生：適宜永生細胞系(例如，骨髓瘤細胞系，例如但不限於Sp2/0、Sp2/0-AG14、NSO、NS1、NS2、AE-1、L.5、＞243、P3X63Ag8.653、Sp2 SA3、Sp2 MAI、Sp2 SS1、Sp2 SA5、U397、MLA 144、ACT IV、MOLT4、DA-1、JURKAT、WEHI、K-562、COS、RAJI、NIH 3T3、HL-60、MLA 144、NAMAIWA、NEURO 2A、CHO、PerC.6、YB2/O)或諸如此類、或異源骨髓瘤、其融合產物、或自其分離之任何細胞或融合細胞、或如業內已知之任何其他適宜細胞系(例如，參見www.atcc.org, www.lifetech.com.，在2007年11月26日最後登錄，及諸如此類)與抗體產生細胞，例如但不限於含有分離或選殖之脾、外周血、淋巴、扁桃腺或其他免疫或B細胞的細胞或以以下形式表現重鏈或輕鏈恆定或可變或框架或CDR序列之任何其他細胞：內源或異源核酸、重組或內源性之病毒、細菌、藻類、原核、兩棲動物、昆蟲、爬蟲類動物、魚、哺乳動物、齧齒類動物、馬、羊、山羊、綿羊、靈長類動物、真核生物之基因體DNA、cDNA、rDNA、粒線體DNA或RNA、葉綠體DNA或RNA、hnRNA、mRNA、tRNA (單鏈、雙鏈或三鏈、雜交及諸如此類)或其任一組合。抗體產生細胞亦可自已用感興趣之抗原免疫之人類或其他適宜動物的外周血或較佳脾或淋巴結獲得。任何其他適宜宿主細胞亦可用於表現編碼本揭示內容之抗體、其特定片段或變體之異源或內源核酸。融合細胞(雜交瘤)或重組細胞可使用選擇性培養條件或其他適宜已知方法分離，並藉由有限稀釋或細胞分選或其他已知方法選殖。
在一個實施例中，本文所述抗體可使用多抗原肽(MAP)系統產生。MAP系統利用三個或七個放射狀分支之離胺酸殘基之肽基核，在其上可使用標準固相化學構築感興趣之抗原肽。離胺酸核產生具有肽表位之約4至8個拷貝之MAP，此取決於通常佔總分子量之小於10%之內核。MAP系統不需要用於偶聯之載體蛋白。MAP中抗原性表位之多個拷貝之高莫耳比及緻密包裝已顯示產生強免疫原性反應。此方法闡述於美國專利第5,229,490號中。
可使用產生或分離具有必需特異性之抗體之其他適宜方法，包括但不限於使用業內已知之方法自肽或蛋白質文庫(例如但不限於噬菌體、核糖體、寡核苷酸、RNA、cDNA或諸如此類之展示文庫；例如，如可自諸如Cambridge Antibody Technologies (Cambridgeshire, UK)、MorphoSys (Martinsreid/Planegg, Del.)、Biovation (Aberdeen, Scotland, UK) BioInvent (Lund, Sweden)之各商業供應商獲得)選擇重組抗體的方法。參見美國專利第4,704,692號、第5,723,323號、第5,763,192號、第5,814,476號、第5,817,483號、第5,824,514號及第5,976,862號。替代方法取決於能夠產生人類抗體之譜系之轉基因動物的免疫(例如SCID小鼠，Nguyen等人 (1977) Microbiol. Immunol. 41:901-907 (1997)；Sandhu等人(1996) Crit. Rev. Biotechnol. 16:95-118；Eren等人 (1998) Immunol. 93:154-161)，如業內已知及/或如本文所述。該等技術包括(但不限於)核糖體展示(Hanes等人 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937-4942；Hanes等人(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14130-14135)；單細胞抗體產生技術(例如選擇之淋巴球抗體方法(「SLAM」) (美國專利第5,627,052號，Wen等人(1987) J. Immunol. 17:887-892；Babcook等人 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848)；凝膠微滴及流式細胞術(Powell等人 (1990) Biotechnol. 8:333-337；One Cell Systems, (Cambridge, Mass)；Gray等人 (1995) J. Imm. Meth. 182:155-163；及Kenny等人 (1995) Bio. Technol. 13:787-790)；B細胞選擇(Steenbakkers等人 (1994) Molec. Biol. Reports 19:125-134。
本揭示內容之抗體衍生物亦可藉由將編碼本揭示內容之抗體之聚核苷酸遞送至適宜宿主來製備，例如以提供在其乳汁中產生該等抗體之轉基因動物或哺乳動物(例如山羊、牛、馬、綿羊及諸如此類)。該等方法為業內已知且闡述於例如美國專利第5,827,690號、第5,849,992號、第4,873,316號、第5,849,992號、第5,994,616號、第5,565,362號及第5,304,489號。
術語「抗體衍生物」包括對抗體或片段之線性多肽序列之轉譯後修飾。舉例而言，美國專利第6,602,684 B1號闡述產生修飾之二醇形式之抗體之方法，該等抗體包括完整抗體分子、抗體片段或融合蛋白，其包括等效於免疫球蛋白Fc區之區，具有增強之Fc介導之細胞毒性，以及如此產生之醣蛋白。
抗體衍生物亦可藉由遞送本揭示內容之聚核苷酸以提供在植物部分或自其培養之細胞中產生該等抗體、特定部分或變體的轉基因植物及培養之植物細胞(例如但不限於煙草、玉蜀黍及浮萍)來製備。舉例而言，Cramer等人 (1999) Curr. Top. Microbol. Immunol. 240:95-118及其中引用之參考文獻闡述例如使用誘導型啟動子產生表現大量重組蛋白之轉基因煙草葉。轉基因玉蜀黍已用於以商業生產程度表現哺乳動物蛋白質，其生物活性等效於在其他重組系統中產生或自天然來源純化之彼等。參見(例如) Hood等人 (1999) Adv. Exp. Med. Biol. 464:127-147及其中引用之參考文獻。抗體衍生物亦已自轉基因植物種子大量產生，包括抗體片段，例如單鏈抗體(scFv)，該等轉基因植物種子包括煙草種子及馬鈴薯塊莖。參見(例如) Conrad等人 (1998) Plant Mol. Biol. 38:101-109及其中引用之參考文獻。因此，本揭示內容之抗體亦可根據已知方法使用轉基因植物產生。
抗體衍生物亦可例如藉由添加外源序列以修飾免疫原性或降低、增強或修飾結合、親和性、結合速率、解離速率、親合力、特異性、半衰期或任何其他適宜特徵來產生。通常，維持部分或全部非人類或人類CDR序列，而可變區及恆定區之非人類序列經人類或其他胺基酸替代。
一般而言，CDR殘基直接且最為實質性地參與影響抗原結合  本揭示內容之抗體之人類化或工程化可使用任何已知方法實施，例如但不限於美國專利第5,723,323號、第5,976,862號、第5,824,514號、第5,817,483號、第5,814,476號、第5,763,192號、第5,723,323號、第5,766,886號、第5,714,352號、第6,204,023號、第6,180,370號、第5,693,762號、第5,530,101號、第5,585,089號、第5,225,539號及第4,816,567號中所述之彼等方法。
製備部分至完全人類抗體之技術為業內已知，且可使用任何該等技術。根據一實施例，在經工程化以表現人類重鏈及輕鏈抗體基因之轉基因小鼠中製備完全人類抗體序列。已製備可產生不同種類抗體之該等轉基因小鼠之多個株。可融合來自產生期望抗體之轉基因小鼠之B細胞，以製備雜交瘤細胞系用於連續產生期望抗體。(例如，參見Russel等人 (2000) Infection and Immunity 2000年4月：1820-1826；Gallo等人 (2000) European J. of Immun. 30:534-540；Green (1999) J. of Immun. Methods 231:11-23；Yang等人 (1999) J. of Leukocyte Biology 66:401-410；Yang (1999) Cancer Research 59(6):1236-1243；Jakobovits (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 31:33-42；Green及Jakobovits (1998) J. Exp. Med. 188(3):483-495；Jakobovits (1998) Exp. Opin. Invest. Drugs 7(4):607-614；Tsuda等人 (1997) Genomics 42:413-421；Sherman-Gold (1997) Genetic Engineering News 17(14)；Mendez等人 (1997) Nature Genetics 15:146-156；Jakobovits (1996) Weir’s Handbook of Experimental Immunology, The Integrated Immune System 第IV卷, 194.1-194.7；Jakobovits (1995) Current Opinion in Biotechnology 6:561-566；Mendez等人 (1995) Genomics 26:294-307；Jakobovits (1994) Current Biology 4(8):761-763；Arbones等人 (1994) Immunity 1(4):247-260；Jakobovits (1993) Nature 362(6417):255-258；Jakobovits等人 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(6):2551-2555；及美國專利第6,075,181號。)
本揭示內容之抗體亦可經修飾以產生嵌合抗體。嵌合抗體係其中抗體重鏈及輕鏈之各種結構域由來自超過一個物種之DNA編碼之彼等抗體。例如，參見美國專利第4,816,567號。
或者，本揭示內容之抗體亦可經修飾以產生飾面抗體。飾面抗體係其中一種物種之抗體之外部胺基酸殘基審慎地經第二物種之彼等替代或「飾面」以使得第一物種之抗體在第二物種中將無免疫原性、藉此降低抗體之免疫原性的彼等。由於蛋白質之抗原性主要取決於其表面之性質，故可藉由替代與通常在其他哺乳動物物種抗體中發現之殘基不同之暴露殘基來降低抗體之免疫原性。外部殘基之此審慎替代對內部結構域或結構域間接觸之效應應該很小或沒有。因此，配體結合性質應不會由於限於可變區框架殘基之改變而受到影響。該過程被稱為「飾面」，此乃因僅抗體之外表面或皮膚經改變，支持殘基保持未受干擾。
「飾面」之程序利用Kabat等人 (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第4版, Bethesda, Md., 國立衛生研究院、此資料庫之更新，以及其他可訪問之美國及國外資料庫(核酸及蛋白質)。用於產生飾面抗體之方法之非限制性實例包括EP519596；美國專利第6,797,492號；且闡述於Padlan等人 (1991) Mol. Immunol. 28(4-5):489-498中。
術語「抗體衍生物」亦包括「雙價抗體」，其係具有兩個抗原結合位點之小抗體片段，其中片段在同一多肽鏈中包含與輕鏈可變結構域(VL)連接之重鏈可變結構域(VH)。(參見例如EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等人，(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA  90:6444-6448。)藉由使用過短而不允許在同一鏈上之兩個結構域之間配對之連接體，迫使該等結構域與另一鏈之互補結構域配對並產生兩個抗原結合位點。(亦參見Chen等人之美國專利第6,632,926號，其揭示具有一或多個插入親代抗體之超變區中之胺基酸及對靶抗原之結合親和性比親代抗體對抗原之結合親和性強至少約兩倍的抗體變體。)
術語「抗體衍生物」進一步包括「線性抗體」。製備線性抗體之程序為業內已知且闡述於Zapata等人 (1995) Protein Eng.8 (10):1057-1062中。簡言之，該等抗體包含一對串聯Fd區段(VH -CH 1-VH -CH 1)，其形成一對抗原結合區。線性抗體可為雙特異性或單特異性的。
本揭示內容之抗體可藉由已知方法自重組細胞培養物回收及純化，該等已知方法包括(但不限於)蛋白A純化、硫酸銨或乙醇沈澱、酸萃取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥磷灰石層析及凝集素層析。高效液相層析(「HPLC」)亦可用於純化。
本揭示內容之抗體包括天然純化之產物、化學合成程序之產物及藉由重組技術自真核宿主(例如酵母、高等植物、昆蟲及哺乳動物細胞)或另一選擇為自如上所述原核細胞產生之產物。
若所測試之單株抗體與蛋白質或多肽結合，則所測試之抗體及本揭示內容之雜交瘤提供之抗體係等效物。亦可在不進行過度實驗之情況下，藉由確定所測試之抗體是否阻止本揭示內容之單株抗體與單株抗體正常反應之蛋白質或多肽結合，來確定抗體是否具有與本揭示內容之單株抗體相同之特異性。若所測試之抗體與本揭示內容之單株抗體競爭，如由本揭示內容之單株抗體之結合降低所示，則很可能兩種抗體結合至相同或密切相關之表位。或者，可將本揭示內容之單株抗體與其正常反應之蛋白質一起預培育，並確定所測試之單株抗體是否在其結合抗原之能力方面受到抑制。若所測試之單株抗體受到抑制，則其完全可能具有與本揭示內容之單株抗體相同或密切相關之表位特異性。
術語「抗體」亦意欲包括所有同型之抗體。單株抗體之特定同型可直接藉由自初始融合選擇來製備，或其次自分泌不同同型之單株抗體之親代雜交瘤藉由使用sib選擇技術以使用以下中所述之程序分離類別轉換變體來製備：Steplewski等人(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8653或Spira等人(1984) J. Immunol. Methods 74:307。
熟習此項技術者藉由產生抗個體遺傳型抗體，亦可完成分離分泌具有本揭示內容之單株抗體之特異性的單株抗體之其他雜交瘤。Herlyn等人 (1986) Science 232:100。抗個體遺傳型抗體係識別由感興趣之雜交瘤產生之單株抗體上存在的獨特決定子的抗體。
兩個雜交瘤之單株抗體之間之個體遺傳型一致性展現，兩個單株抗體關於其對相同表位決定子之識別係相同的。因此，藉由使用針對單株抗體上之表位決定子之抗體，可鑑別表現相同表位特異性之單株抗體的其他雜交瘤。
亦可使用抗個體遺傳型技術來產生模擬表位之單株抗體。舉例而言，針對第一單株抗體製備之抗個體遺傳型單株抗體在超變區中具有結合結構域，其係由第一單株抗體結合之表位之鏡像。因此，在此情況下，抗個體遺傳型單株抗體可用於免疫以產生該等抗體。
抗體可與例如醫藥劑(例如化學治療藥物或毒素)偶聯。其可與細胞介素、配體、另一抗體連接。用於偶合抗體以達成抗腫瘤效應之適宜藥劑包括細胞介素，例如介白素2 (IL-2)及腫瘤壞死因子(TNF)；用於光動力學療法之光敏劑，包括酞青素四磺酸鋁(III)、紫質及酞青素；放射性核種，例如碘-131 (131 I)、釔-90 (90 Y)、鉍-212 (212 Bi)、鉍-213 (213 Bi)、鍀-99m (99m Tc)、錸-186 (186 Re)及錸-188 (188 Re)；抗生素，例如多柔比星(doxorubicin)、阿德力黴素(adriamycin)、道諾黴素(daunorubicin)、胺甲喋呤(methotrexate)、道諾黴素(daunomycin)、新製癌菌素(neocarzinostatin)及卡鉑；細菌、植物及其他毒素，例如白喉毒素、假單胞菌屬外毒素A、葡萄球菌腸毒素A、相思子素-A毒素、蓖麻毒蛋白A (去醣基化蓖麻毒蛋白A及天然蓖麻毒蛋白A)、TGF-α毒素、來自中華眼鏡蛇(Chinese cobra)(眼鏡蛇(naja naja atra))之細胞毒素及白樹素(植物毒素)；來自植物、細菌及真菌之核糖體不活化蛋白質，例如侷限麴菌素(restrictocin) (由侷限黴菌(Aspergillus restrictus )產生之核糖體不活化蛋白質)、肥皂草毒素(來自肥皂草(Saponaria officinalis )之核糖體不活化蛋白質)及RNa酶；酪胺酸激酶抑制劑；ly207702 (二氟化嘌呤核苷)；含有抗囊性劑之脂質體(例如反義寡核苷酸、編碼毒素之質體、胺甲喋呤(methotrexate)等)；及其他抗體或抗體片段，例如F(ab)。
本揭示內容之抗體亦可結合至許多不同載體。因此，本揭示內容亦提供含有抗體及另一活性或惰性物質之組合物。眾所周知之載體之實例包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚葡萄糖、耐綸、澱粉酶、天然及經修飾之纖維素、聚丙烯醯胺、瓊脂糖及磁鐵礦。出於本揭示內容之目的，載體之性質可為可溶的或不可溶的。熟習此項技術者將知道用於結合單株抗體之其他適宜載體，或將能夠使用常規實驗確定該等載體。用於治療之組合物
本文提供組合物，其包含載劑以及本揭示內容之分離之多肽、分離之聚核苷酸、載體或宿主細胞中之一或多者，或另一選擇為實質上由其組成或更進一步由其組成，例如，在一態樣中，組合物包含SEQ ID No: 1-59或另一選擇為SEQ ID No: 40-56、59或40-56、58及59之原樣分離之多肽、或編碼多肽之聚核苷酸或其每一者之等效物。其他診斷組合物包括結合多肽或其等效物或其片段之抗體。在一態樣中，載劑係醫藥上可接受之載劑。在另一態樣中，編碼該等組合物及siRNA、載體或宿主細胞之上述抗體、抗體片段、抗體衍生物、多肽或聚核苷酸中之一或多者可進一步包含化學治療劑或藥物、或抗纖維變性劑或藥物，或另一選擇為實質上由其組成或更進一步由其組成。抗纖維變性劑或藥物之非限制性實例包括吡非尼酮及尼達尼布。化學治療劑或藥物之非限制性實例包括酪胺酸激酶抑制劑(TKI)、基於鉑之藥物、靶向EGFR之藥物或藥劑、或MANS多肽或其片段，其中片段包含多肽及載劑、醫藥上可接受之載劑或適於在診斷或治療方法中使用組合物之醫療裝置，或另一選擇為實質上由其組成或更進一步由其組成。因此，組合物包含上述組合物中之一或多者與載劑、醫藥上可接受之載劑或醫療裝置的組合，或另一選擇為實質上由其組成或更進一步由其組成。
載劑可為液相載劑或固相載劑，例如珠粒、凝膠、微陣列或載劑分子，例如脂質體。組合物可視情況進一步包含至少一種其他化合物、蛋白質或組合物。
「載劑」之額外實例包括治療活性劑，例如另一肽或蛋白質(例如Fab'片段)。舉例而言，本揭示內容之抗體、其衍生物或片段可功能性連接(例如，藉由化學偶合、基因融合、非共價締合或其他方式)至一或多個其他分子實體，例如另一抗體(例如，以產生雙特異性或多特異性抗體)、細胞毒素、細胞配體或抗原。因此，本揭示內容涵蓋多種抗體偶聯物、雙特異性及多特異性分子及融合蛋白，無論其是否靶向與本揭示內容之抗體相同之表位。
「載劑」之額外實例亦包括治療活性劑，例如另一肽或蛋白質(例如Fab'片段)或用於治療以下中之一或多者之試劑：阻抑MARCKS磷酸化及/或自細胞膜解離；阻抑或降低Th2細胞介素(IL-4、IL-5、IL-13及伊紅趨素)產生及/或IgE含量；阻抑黏膜化生；抑制或阻抑發炎細胞(單核球、嗜中性球、淋巴球)之浸潤；與過敏性發炎或高反應性相關之疾病或疾病症狀。
載劑之其他實例係有機分子(亦稱為修飾劑)或活化劑，其可直接或間接共價連接至本揭示內容之多肽、抗體、抗體片段、抗體衍生物、編碼該等之聚核苷酸、或RNAi、載體或宿主細胞。分子之連接可改良藥物動力學性質(例如增加之活體內血清半衰期)。有機分子之實例包括(但不限於)親水性聚合物基團、脂肪酸基團或脂肪酸酯基團。如本文所用術語「脂肪酸」包括一元羧酸及二元羧酸。本文所用術語「親水性聚合物基團」係指在水中比在辛烷中更可溶之有機聚合物。
適於修飾本揭示內容之抗體之親水性聚合物可為線性的或具支鏈，且包括例如聚烷烴二醇(例如PEG、單甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、PPG及諸如此類)、碳水化合物(例如聚葡萄糖、纖維素、寡醣、多醣及諸如此類)、親水性胺基酸之聚合物(例如聚離胺酸、聚精胺酸、聚天冬胺酸鹽及諸如此類)、聚環氧烷(例如聚氧化乙烯、聚氧化丙烯及諸如此類)及聚乙烯吡咯啶酮。修飾本揭示內容之抗體之適宜親水性聚合物作為單獨分子實體具有約800至約150,000道爾頓之分子量。親水性聚合物基團可經一個至約六個烷基、脂肪酸基團或脂肪酸酯基團取代。經脂肪酸基團或脂肪酸酯基團取代之親水性聚合物可藉由採用適宜方法來製備。舉例而言，包含胺基之聚合物可與脂肪酸或脂肪酸酯之羧酸酯偶合，且脂肪酸或脂肪酸酯上之活化羧酸酯(例如經N,N-羰基二咪唑活化)可與聚合物上之羥基偶合。
適於修飾本揭示內容之抗體之脂肪酸及脂肪酸酯可為飽和的或可含有一或多個不飽和單元。該等之實例包括(但不限於)正十二烷酸酯、正十四烷酸酯、正十八烷酸酯、正二十烷酸酯、正二十二烷酸酯、正三十烷酸酯、正二十四烷酸酯、順式-Δ9-十八烷酸酯、全順式-Δ5,8,11,14-二十碳四烯酸酯、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸及諸如此類。適宜脂肪酸酯包括包含直鏈或具支鏈低碳烷基之二羧酸之單酯。低碳烷基可包含1至約12個、較佳1至約6個碳原子。
本揭示內容提供組合物，其包含本揭示內容之至少一種抗體、其衍生物或片段，或另一選擇為基本上由其組成或更進一步由其組成，該至少一種抗體、其衍生物或片段適於以有效量投與以抑制MARCKS之表現用於預防、減少、延遲、抑制或阻抑與MARCKS磷酸化及/或自細胞膜解離及/或PIP2螯合效應、或PIP3產生、或AKT活化、或發炎、纖維化、或活化之纖維母細胞增殖、或肌纖維母細胞生成及分化、或轉化生長因子-β (TGF-β)信號傳導途徑、或癌症、或實體腫瘤細胞生長或轉移、或癌症幹細胞生長、或腫瘤細胞遷移相關之疾病或疾病症狀；及視情況用於促進細胞凋亡、或恢復抗性癌細胞對化學治療劑之敏感性。在一態樣中，組合物具有預防、減少、延遲、抑制或阻抑與肺纖維化、特發性肺纖維化或吸煙、博來黴素誘導之肺纖維化、腎纖維化、肝纖維化、皮膚纖維化、纖維母細胞病灶、活化之纖維母細胞增殖、發炎或肌纖維母細胞生成相關之疾病或疾病症狀的能力。在另一態樣中，組合物具有預防、減少、延遲、抑制或阻抑與淋巴瘤、白血病或實體腫瘤相關之疾病或疾病症狀的能力。實體腫瘤之非限制性實例包括癌症、腎癌、腦癌、結腸直腸癌、胰臟癌、骨癌或喉癌。
組合物包括(例如)醫藥及診斷組合物/套組，其包含醫藥上可接受之載劑及至少一種本揭示內容之抗體、其變體、衍生物或片段。如上所述，組合物可進一步包含額外抗體或治療劑，其組合提供為提供最大治療益處而定製之多種療法。
或者，本揭示內容之組合物可與其他治療劑(例如小分子或肽)共投與，無論是否與其連接或以相同劑量投與。其可與該等藥劑同時(例如，在單一組合物中或分開)共投與，或可在投與該等藥劑之前或之後投與。用於診斷之組合物
上述組合物中之一或多者可進一步與載劑、醫藥上可接受之載劑或醫療裝置組合，該醫療裝置適於在診斷或治療方法中使用組合物。在一態樣中，組合物包含SEQ ID No: 1-59、或另一選擇為SEQ ID No: 40-59、或另一選擇為SEQ ID No: 40-56、58及59之分離之多肽、或編碼該多肽之聚核苷酸、或其每一者之等效物。其他診斷組合物包括結合多肽或其等效物或其片段之抗體。
載劑可為液相載劑或固相載劑，例如珠粒、凝膠、基因晶片、微陣列或載劑分子，例如脂質體。組合物可視情況進一步包含至少一種其他化合物、蛋白質或組合物、抗癌劑或其他小分子、蛋白質、多肽、抗體或抗體片段，例如TKI抑制劑、靶向EGFR之藥物或藥劑、基於鉑之藥物或MARCKS多肽或其片段，或另一選擇為實質上由其組成或更進一步由其組成。
「載體」之額外實例包括治療活性劑，例如另一肽或蛋白質(例如Fab'片段)。舉例而言，抗體、其衍生物或片段可功能性連接(例如，藉由化學偶合、基因融合、非共價締合或其他方式)至一或多個其他分子實體，例如另一抗體(例如，以產生雙特異性或多特異性抗體)、細胞毒素、細胞配體或抗原。另外，抗體或其片段可連接至本揭示內容之多肽以促進靶向選擇之細胞或組織及/或穩定多肽。因此，本揭示內容涵蓋多種抗體偶聯物、雙特異性及多特異性分子及融合蛋白，無論其是否靶向與本揭示內容之抗體相同之表位。
載劑之額外實例係有機分子(亦稱為修飾劑)或活化劑，其可直接或間接地共價連接至本揭示內容之抗體。分子之連接可改良藥物動力學性質(例如增加之活體內血清半衰期)。有機分子之實例包括(但不限於)親水性聚合物基團、脂肪酸基團或脂肪酸酯基團。如本文所用術語「脂肪酸」包括一元羧酸及二元羧酸。本文所用術語「親水性聚合物基團」係指在水中比在辛烷中更可溶之有機聚合物。
適於修飾本揭示內容之抗體之親水性聚合物可為線性的或具支鏈，且包括例如聚烷烴二醇(例如PEG、單甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、PPG及諸如此類)、碳水化合物(例如聚葡萄糖、纖維素、寡醣、多醣及諸如此類)、親水性胺基酸之聚合物(例如聚離胺酸、聚精胺酸、聚天冬胺酸鹽及諸如此類)、聚環氧烷(例如聚氧化乙烯、聚氧化丙烯及諸如此類)及聚乙烯吡咯啶酮。修飾本揭示內容之抗體之適宜親水性聚合物作為單獨分子實體具有約800至約150,000道爾頓之分子量。親水性聚合物基團可經一個至約六個烷基、脂肪酸基團或脂肪酸酯基團取代。經脂肪酸基團或脂肪酸酯基團取代之親水性聚合物可藉由採用適宜方法來製備。舉例而言，包含胺基之聚合物可與脂肪酸或脂肪酸酯之羧酸酯偶合，且脂肪酸或脂肪酸酯上之活化羧酸酯(例如經N,N-羰基二咪唑活化)可與聚合物上之羥基偶合。
適於修飾本揭示內容之抗體之脂肪酸及脂肪酸酯可為飽和的或可含有一或多個不飽和單元。該等之實例包括(但不限於)正十二烷酸酯、正十四烷酸酯、正十八烷酸酯、正二十烷酸酯、正二十二烷酸酯、正三十烷酸酯、正二十四烷酸酯、順式-Δ9-十八烷酸酯、全順式-Δ5,8,11,14-二十碳四烯酸酯、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸及諸如此類。適宜脂肪酸酯包括包含直鏈或具支鏈低碳烷基之二羧酸之單酯。低碳烷基可包含1至約12個、較佳1至約6個碳原子。
亦提供含有至少一種本揭示內容之抗體之組合物。組合物包括(例如)醫藥及診斷組合物/套組，其包含醫藥上可接受之載劑及至少一種本揭示內容之抗體、其變體、衍生物或片段。如上所述，組合物可進一步包含額外抗體或治療劑，其組合提供為提供最大治療益處而定製之多種療法。
或者，本揭示內容之組合物可與其他治療劑共投與，無論是否與其連接或以相同劑量投與。其可與該等藥劑同時(例如，在單一組合物中或分開)共投與，或可在投與該等藥劑之前或之後投與。該等藥劑可包括抗癌療法，例如厄洛替尼(erlotinib)、伊立替康(irinotecan)、5-氟尿嘧啶、爾必得舒(Erbitux)、西妥昔單抗(Cetuximab)、FOLFOX或放射療法或熟習此項技術者已知之其他藥劑。利用重組 DNA 技術及生物資訊學之診斷方法
本揭示內容之聚核苷酸可連接至固體支持物，例如陣列或高密度晶片，以使用業內已知之方法用於高通量篩選分析。舉例而言，編碼MPS之聚核苷酸(例如SEQ ID NO: 1-59、或另一選擇為40-56、或另一選擇為SEQ ID No: 40-56、58及59或其每一者之等效物)可用作探針以鑑別受試樣品中之表現。晶片可使用美國專利第5,405,783號、第5,412,087號及第5,445,934號中揭示之方法在衍生化玻璃表面上合成。光保護之核苷亞磷醯胺可偶合至玻璃表面，藉由光微影遮罩之光解選擇性地去保護，並與第二保護之核苷亞磷醯胺反應。重複偶合/去保護過程，直至期望探針完全。
可使用化學合成來提供本揭示內容之分離之聚核苷酸。聚核苷酸之化學合成可使用許多方案來完成，包括使用固體支持物化學，其中寡核苷酸係在錨定於無機聚合物的同時一次一個核苷地合成。使用聚合物上之反應性基團將第一核苷酸連接至無機聚合物，該反應性基團與核苷上之反應性基團反應形成共價鏈接。然後藉由以下步驟將每一隨後之核苷添加至第一核苷分子：1)在初始核苷與具有保護基團之新核苷之間形成亞磷酸酯鏈接；2)藉由氧化將亞磷酸酯鏈接轉化為磷酸酯鏈接；及3)去除一個保護基團以形成下一核苷之新反應位點，如美國專利第4,458,066號、第5,153,319號、第5,132,418號及第4,973,679號中所述，所有該等專利皆以引用方式併入本文中。寡核苷酸之固相合成消除在添加每個核苷酸鹼基後分離及純化中間產物之需要。合成RNA後，將寡核苷酸去保護(美國專利第5,831,071號)並純化以除去副產物、不完全合成產物及諸如此類。
美國專利第5,686,599號闡述在適於自2'羥基位置去除保護基團之條件下使RNA一鍋去保護之方法。美國專利第5,804,683號闡述使用烷基胺去除環外保護基團之方法。美國專利第5,831,071號闡述使用乙胺、丙胺或丁胺使RNA去保護之方法。美國專利第5,281,701號闡述使用5'-O-保護之-2'-O-烷基矽基-腺苷亞磷醯胺及5'-O-保護之-2'-O-烷基矽基鳥苷亞磷醯胺單體合成RNA之方法及試劑，其中該等單體使用乙硫基四唑去保護。Usman及Cedergren (1992) Trends in Biochem. Sci. 17:334-339闡述用於2'羥基之作用之研究的RNA-DNA嵌合體之合成。Sproat等人 (1995) Nucleosides & Nucleotides 14:255-273闡述使用5-乙硫基-1H-四唑作為活化劑來提高寡核苷酸合成之品質及產物產率。Gait等人 (1991) Oligonucleotides and Analogues, 編輯F. Eckstein, Oxford University Press 25-48闡述RNA之合成之一般方法。美國專利第4,923,901號、第5,723,599號、第5,674,856號、第5,141,813號、第5,419,966號、第4,458,066號、第5,252,723號；Weetall等人 (1974) Methods in Enzymology 34:59-72；Van Aerschot等人 (1988) Nucleosides and Nucleotides 7:75-90；Maskos及Southern (1992) Nucleic Acids Research 20: 1679-1684；Van Ness等人 (1991) Nucleic Acids Research 19:3345-3350；Katzhendler等人 (1989) Tetrahedron 45:2777-2792；Hovinen等人 (1994) Tetrahedron 50:7203-7218；GB 2,169,605；EP 325,970；國際PCT公開案第WO 94/01446號；德國專利第280,968號；及BaGerman專利第4,306,839號皆闡述用於寡核苷酸合成之固體支持物之具體實例及使用某些寡核苷酸之具體方法。另外，如熟習此項技術者已知之如美國專利第7,205,399號所述之寡核苷酸合成之方法及試劑，該專利以引用方式整體併入本文中。
探針及高密度寡核苷酸探針陣列亦提供監測多種基因之表現之有效手段，多種基因中之基因包括該基因。因此，表現監測方法可用於眾多種情況，包括疾病之檢測、在一時程內自同一患者分離之樣品之間之差異基因表現的鑑別、或一次或另一選擇為在一段時間內篩選上調或下調基因表現之組合物。
適用於本揭示內容之可檢測標記包括上文鑑別之彼等以及可藉由光譜、光化學、生物化學、免疫化學、電學、光學或化學手段檢測之任何組合物。本揭示內容中有用之標記包括用於用標記之鏈黴抗生物素蛋白偶聯物、磁珠(例如Dynabeads™)、螢光染料(例如螢光素、德克薩斯紅、玫瑰紅、綠色螢光蛋白及諸如此類)、放射性標記(例如3 H、125 I、35 S、14 C或32 P)、酶(例如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶及ELISA中常用之其他酶)及比色標記(例如膠體金)或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、膠乳等)珠粒染色之生物素。教示該等標記之使用之專利包括美國專利第3,817,837號、第3,850,752號、第3,939,350號、第3,996,345號、第4,277,437號、第4,275,149號及第4,366,241號。
檢測該等標記之方法為熟習此項技術者已知。因此，例如，放射性標記可使用照相軟片或閃爍計數器檢測，螢光標記物可使用光檢測器檢測以檢測發射光。酶標記通常係藉由向酶提供受質並檢測由酶對受質之作用產生之反應產物來檢測，且比色標記藉由簡單地使有色標記可視化來檢測。
國際PCT公開案第WO 97/10365號闡述在雜交之前或另一選擇為在雜交之後將標記加至靶(樣品)核酸之方法。該等係在雜交前直接連接或納入靶(樣品)核酸之可檢測標記。相反，雜交後「間接標記」與雜交雙鏈體接合。通常，間接標記連接至結合部分，該結合部分在雜交之前連接至靶核酸。因此，例如，靶核酸可在雜交之前經生物素化。雜交後，抗生物素蛋白偶聯之螢光團將結合帶有生物素之雜交雙鏈體，從而提供容易檢測之標記。關於標記核酸及檢測標記之雜交核酸之方法的詳細綜述，參見Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology, 第24卷:  Hybridization with Nucleic Acid Probes, P. Tijssen, 編輯Elsevier, N.Y. (1993)。
核酸樣品亦可在與高密度探針陣列雜交之前經修飾，以降低樣品之複雜性，從而降低背景信號並改良使用國際PCT公開案第WO 97/10365號中揭示之方法之量測結果的靈敏度。
通常使用電腦軟體程式分析來自晶片分析之結果。參見(例如) EP 0717 113 A2及WO 95/20681。將此資訊與患病及健康個體之基因表現量之現有數據組進行比較。所獲得之數據與一組患病個體之數據之間之相關性指示受試患者中疾病之發作。鑑別治療劑之方法
本揭示內容亦提供鑑別用於治療與以下中之一或多者相關之疾病或疾病症狀的先導物及方法：預防、減少、延遲、抑制或阻抑與MARCKS磷酸化及/或自細胞膜解離及/或PIP2螯合效應、或PIP3產生、或AKT活化、或發炎、纖維化、或活化之纖維母細胞增殖、或肌纖維母細胞生成及分化、或轉化生長因子-β (TGF-β)信號傳導途徑、或癌症、或實體腫瘤細胞生長或轉移、或癌症幹細胞生長、或腫瘤細胞遷移相關之疾病或疾病症狀；及視情況用於促進細胞凋亡、或恢復抗性癌細胞對化學治療劑之敏感性。在一態樣中，組合物具有預防、減少、延遲、抑制或阻抑與肺纖維化、特發性肺纖維化或吸煙、博來黴素誘導之肺纖維化、腎纖維化、肝纖維化、皮膚纖維化、纖維母細胞病灶、活化之纖維母細胞增殖、發炎或肌纖維母細胞生成相關之疾病或疾病症狀的能力。在另一態樣中，組合物具有預防、減少、延遲、抑制或阻抑與淋巴瘤、白血病或實體腫瘤相關之疾病或疾病症狀的能力。實體腫瘤之非限制性實例包括癌症、腎癌、腦癌、結腸直腸癌、胰臟癌、骨癌或喉癌。
本揭示內容亦提供鑑別用於治療纖維化及/或癌症之先導化合物(lead)及方法的方法。在一態樣中，篩選鑑別模擬上文鑑別之多肽且可用於治療該等病症或治療或改善與病症相關之症狀的先導化合物(lead compound)或生物製劑。用於篩選之測試物質可來自任何來源。其可為天然產物之文庫、組合化學文庫、藉由重組文庫製備之生物產物等。測試物質之來源對於本揭示內容並不至關重要。本揭示內容提供用於篩選先前在其他篩選方案中可能被忽視之化合物及組合物的手段。
為了實踐篩選或活體外分析，首先提供適宜細胞培養物或組織培養物。細胞可為培養之細胞或遺傳修飾之細胞，其差異地表現受體及/或受體複合物。或者，細胞可來自如下所述之組織培養物。將細胞在條件(溫度、生長或培養基及氣體(CO2 ))下培養適當時間量以達到指數增殖而無密度依賴性限制。亦期望維持額外單獨細胞培養；一個不接受試劑，測試為對照。
如熟習此項技術者顯而易見，可在微量滴定板中培養適宜細胞，且可藉由記錄基因型變化、表型變化及/或細胞死亡同時分析若干試劑。
當試劑係除DNA或RNA核酸分子外之組合物時，適宜條件可為直接添加至細胞培養物中或添加至培養基中以進行添加。熟習此項技術者顯而易見，必須添加「有效」量，其可憑經驗確定。
篩選涉及將試劑與表現複合物之測試細胞接觸，及然後分析細胞提供與本揭示內容之多肽相似之生物反應的能力。在又一態樣中，自欲治療之個體分離測試細胞或組織樣品，並篩選一或多種潛在試劑以確定對於該個別患者之最佳治療及/或療程。
出於本揭示內容之目的，「試劑」意欲包括但不限於生物或化學化合物，例如簡單或複雜有機或無機分子、肽、蛋白質或寡核苷酸。可合成大量之化合物，例如寡聚物，例如寡肽及寡核苷酸，以及基於各種核心結構之合成有機化合物，該等亦包括在術語「試劑」中。此外，各種天然來源可提供用於篩選之化合物，例如植物或動物提取物及諸如此類。應理解，儘管並不總是明確地說明，但該試劑單獨或與另一試劑組合使用，該另一試劑具有與藉由篩選鑑別之試劑相同或不同之生物活性。該等試劑及方法亦意欲與其他療法組合。其可並行或依序投與。治療方法
本文提供治療有需要之個體之與纖維化相關之疾病或疾病症狀的方法，該等方法包含以下或另一選擇為基本上由其組成或更進一步由其組成：向該個體投與有效量之一或多種如上文鑑別之分離之多肽或分離之聚核苷酸(例如，SEQ ID No: 1-59、或另一選擇為40-59、或另一選擇為40-56、58及59)以及SEQ ID No:1-59或另一選擇為40-59、或另一選擇為40-56、58及59之肽或肽之組合物、以及包含至少6個且不超過51個胺基酸之多肽，其中胺基酸序列包含至少6個胺基酸至不超過51個或另一選擇為35個胺基酸之多肽、或另一選擇為實質上由其組成或另一選擇為由其組成，該多肽包含SEQ ID No: 1-59或另一選擇為40-59、或另一選擇為40-56、58及59，或另一選擇為實質上由其組成或仍由其組成。
在一態樣中，該肽包含下表中鑑別之肽(以出現之順序分別為SEQ ID NO 48-54、40-42、45及47，(紅色殘基係胺基酸之D-同種型))，或另一選擇為實質上由其組成或更進一步由其組成：
Figure 02_image001
在一態樣中，多肽係至少6個胺基酸且不超過51個胺基酸、或另一選擇為至少45個胺基酸、或另一選擇為40個胺基酸、或另一選擇為35個胺基酸、或另一選擇為30個胺基酸、或另一選擇為不超過25個胺基酸、或另一選擇為不超過20個胺基酸、或另一選擇為不超過15個胺基酸或其每一者之生物等效物。在一態樣中，生物等效物係其中一或多個胺基酸經保守胺基酸取代來取代之多肽。在一態樣中，所有絲胺酸皆經丙胺酸替代(A-MPS)。在另一態樣中，肉豆蔻酸偶聯或接合至肽之N-末端胺基酸，包括其生物等效物，例如，其中所有絲胺酸皆經丙胺酸替代。
在另一態樣中，多肽選自SEQ ID NO: 18之分離之多肽，其中對應於位置6之胺基酸經丙胺酸、脯胺酸或甘胺酸替代；或SEQ ID NO: 19之分離之多肽，其中對應於位置7之胺基酸經丙胺酸、脯胺酸或甘胺酸替代；或SEQ ID NO: 20之分離之多肽，其中對應於8位之胺基酸經丙胺酸、脯胺酸或甘胺酸替代。
在上述實施例中之每一者之一個態樣中，D-MPS (其中所有絲胺酸皆經天冬胺酸鹽取代)及豆蔻醯化-野生型MPS明確地排除在如本文揭示之多肽及方法之群之外。
在治療纖維化之一個態樣中，「MPS」欲指至少6個胺基酸且不超過51個胺基酸之多肽，其包含SEQ ID No: 1-59、或另一選擇為40-56、58及59，或另一選擇為實質上由其組成或仍由其組成，其中在一些實施例中，及生物等效物，其中X不存在或係鹼性胺基酸，及/或Y不存在或係疏水性胺基酸。在一態樣中，鹼性胺基酸包含一或多個離胺酸(K)、組胺酸(H)或精胺酸(R)。在一態樣中，所有X皆係離胺酸(K)。在一態樣中，Y係一或多個疏水性胺基酸，其選自丙胺酸(A)、異白胺酸(I)、白胺酸(L)、纈胺酸(V)、苯丙胺酸(F)、色胺酸(W)或酪胺酸(Y)。在一態樣中，所有絲胺酸皆係丙胺酸。在另一態樣中，所有X皆係離胺酸且所有S皆經丙胺酸取代。在另一態樣中，所有S皆係天冬胺酸鹽(D)。在又一態樣中，如本文所揭示之所有上述多肽進一步包含偶聯或接合至N-末端胺基酸之肉豆蔻酸，或另一選擇為實質上由其組成或更進一步由其組成。在一態樣中，MPS肽包含胺基酸序列，或基本上由其組成，或又一態樣。在一態樣中，所有絲胺酸皆由丙胺酸替代(A-MPS)。在另一態樣中，肉豆蔻酸偶聯或接合至SEQ ID NO.: 1-59或40-59、或另一選擇為40-56、58及59之N-末端胺基酸，包括其生物學等效物，例如，其中所有絲胺酸皆由丙胺酸替代。
多肽可為不超過51個胺基酸，包含分離之多肽或另一選擇為實質上由其組成或仍由其組成，該分離之多肽包含不超過51個胺基酸或另一選擇為實質上由其組成或更進一步由其組成，其中胺基酸序列包含SEQ ID No: 1-59或40-59、或另一選擇為40-56、58及59，及其每一者之生物等效物；且其中在一態樣中，一或多個絲胺酸(S)經一或多個可相同或不同之中性或帶正電荷之胺基酸取代，例如，丙胺酸(A)、甘胺酸(G)或脯胺酸(P)，或其每一者之生物等效物，其中生物等效物包含與上述多肽或胺基酸序列具有至少80%序列一致性之多肽，或其中生物等效物包含由分離之聚核苷酸編碼之分離之多肽，該分離之聚核苷酸在高嚴格性條件下與編碼該(等)多肽之補體聚核苷酸或編碼該等多肽之聚核苷酸雜交，且其中高嚴格性雜交條件通常係於約60℃下在約1 x SSC中實施。在一態樣中，術語亦包括多肽，其具有胺基酸序列XXXRYAYXXAYX (SEQ ID NO: 58)，其中X係任何胺基酸；或XXXXXRYAYXXAYXLAGYAYXXNXX (SEQ ID NO: 59)，其中X係任何胺基酸且Y係疏水性胺基酸殘基，包括例如酪胺酸，及視情況為聚核苷酸，其包含該等序列之任何鄰接之12個胺基酸片段，及其生物等效物；且進一步視情況其中一或多個絲胺酸(S)經一或多個可相同或不同之中性或帶正電荷之胺基酸取代，例如，一或多個絲胺酸經一或多個丙胺酸(A)、甘胺酸(G)或脯胺酸(P)取代，且其中每一X相同或不同且係鹼性胺基酸且其中每一Y相同或不同且係疏水性胺基酸。MPS多肽之非限制性實例包括分離之多肽，其包含SEQ ID NO: 1-59、或另一選擇為40-59、或另一選擇為40-56、58及59之生物等效物，其包含與SEQ ID NO: 1-59、或另一選擇為40-59、或另一選擇為40-56、58及59具有至少80%序列一致性之多肽，且視情況其中一或多個絲胺酸(S)經一或多個可相同或不同之中性或帶正電荷之胺基酸取代，例如，一或多個絲胺酸經一或多個丙胺酸(A)、甘胺酸(G)或脯胺酸(P)取代，及/或其中生物等效物包含由分離之聚核苷酸編碼之分離之多肽，該分離之聚核苷酸在高嚴格性條件下與編碼SEQ ID NO: 1-59、或另一選擇為40-59、或另一選擇為40-56、58及59之補體聚核苷酸雜交，且視情況其中一或多個絲胺酸(S)經一或多個可相同或不同之中性或帶正電荷之胺基酸取代，例如，一或多個絲胺酸經一或多個丙胺酸(A)、甘胺酸(G)或脯胺酸(P)取代，及/或與編碼SEQ ID NO: 1-59、或另一選擇為40-59、或另一選擇為40-56、58及59之聚核苷酸雜交，且視情況其中一或多個絲胺酸(S)經一或多個可相同或不同之中性或帶正電荷之胺基酸取代，例如一或多個絲胺酸經一或多個丙胺酸(A)、甘胺酸(G)或脯胺酸(P)取代，且其中高嚴格性雜交條件係於約60℃下在約1 x SSC中實施。在一態樣中，鹼性胺基酸包含一或多個離胺酸(K)、組胺酸(H)或精胺酸(R)。在一態樣中，所有X皆係離胺酸(K)。在一態樣中，Y係一或多個疏水性胺基酸，其選自丙胺酸(A)、異白胺酸(I)、白胺酸(L)、纈胺酸(V)、苯丙胺酸(F)、色胺酸(W)或酪胺酸(Y)。在一態樣中，如上所述之多肽係不超過45個胺基酸、或另一選擇為40個胺基酸、或另一選擇為35個胺基酸、或另一選擇為30個胺基酸、或另一選擇為不超過25個胺基酸、或另一選擇為不超過20個胺基酸、或另一選擇為不超過15個胺基酸或另一選擇為SEQ ID NO: 21、25、31或32、40-56、58或59之多肽，且視情況其中一或多個絲胺酸(S)經一或多個可相同或不同之中性或帶正電荷之胺基酸取代，例如，一或多個絲胺酸經一或多個丙胺酸(A)、甘胺酸(G)或脯胺酸(P)取代，及其中其每一者之生物等效物。
MPS多肽及生物等效物具有達成與上述相同或相似結果之能力。在一態樣中，鹼性胺基酸包含一或多個離胺酸(K)、組胺酸(H)或精胺酸(R)。在一態樣中，所有X皆係離胺酸(K)。在一態樣中，Y係一或多個疏水性胺基酸，其選自丙胺酸(A)、異白胺酸(I)、白胺酸(L)、纈胺酸(V)、苯丙胺酸(F)、色胺酸(W)或酪胺酸(Y)。在一態樣中，多肽係不超過45個胺基酸、或另一選擇為40個胺基酸、或另一選擇為35個胺基酸、或另一選擇為30個胺基酸、或另一選擇為不超過25個胺基酸、或另一選擇為不超過20個胺基酸、或另一選擇為不超過15個胺基酸或另一選擇為。
在一態樣中，與SEQ ID NO: 46及48相比，SEQ ID NO: 45及47之多肽係MPS多肽，其中野生型MPS肽之4個絲胺酸殘基由丙胺酸殘基替代，例如，(KKKKKRFAFKKAFKLAGFAFKKNKK (SEQ ID NO: 45)，其增加膜親和性。SEQ ID NO: 45-48之多肽係高度帶正電荷的，且與磷脂膜上之PIP2靜電相互作用。
在一態樣中，與纖維化相關之疾病或症狀選自以下之群：肺纖維化、特發性肺纖維化、博來黴素誘導之肺纖維化、腎纖維化、肝纖維化、皮膚纖維化、纖維母細胞病灶、活化之纖維母細胞增殖、發炎或肌纖維母細胞生成。
本文亦提供用於在有需要之個體中抑制癌細胞生長、治療癌症、抑制轉移、抑制癌症幹細胞生長、抑制腫瘤細胞遷移、恢復抗性癌細胞對化學治療劑之敏感性中之一或多者的方法，其包含向個體投與有效量之本揭示內容之分離之多肽或分離之聚核苷酸中之一或多者。在一態樣中，癌細胞或癌症係淋巴瘤、白血病或實體腫瘤。在另一態樣中，癌細胞或癌症係肺癌、肝癌、腎癌、腦癌、結腸直腸癌、胰臟癌、骨癌或喉癌。
本揭示內容亦提供鑑別用於治療與以下中之一或多者相關之疾病或疾病症狀的導聯及方法：預防、減少、延遲、抑制或阻抑與MARCKS磷酸化及/或自細胞膜解離及/或PIP2螯合效應、或PIP3產生、或AKT活化、或發炎、纖維化、或活化之纖維母細胞增殖、或肌纖維母細胞生成及分化、或轉化生長因子-β (TGF-β)信號傳導途徑、或癌症、或實體腫瘤細胞生長或轉移、或癌症幹細胞生長、或腫瘤細胞遷移相關之疾病或疾病症狀；及視情況用於促進細胞凋亡、或恢復抗性癌細胞對化學治療劑之敏感性。
在一態樣中，組合物具有預防、減少、延遲、抑制或阻抑與肺纖維化、特發性肺纖維化或吸煙、博來黴素誘導之肺纖維化、腎纖維化、肝纖維化、皮膚纖維化、纖維母細胞病灶、活化之纖維母細胞增殖、發炎或肌纖維母細胞生成相關之疾病或疾病症狀的能力。在另一態樣中，組合物具有預防、減少、延遲、抑制或阻抑與淋巴瘤、白血病或實體腫瘤相關之疾病或疾病症狀的能力。實體腫瘤之非限制性實例包括癌症、腎癌、腦癌、結腸直腸癌、胰臟癌、骨癌或喉癌。
因此，藉由將有效量之本揭示內容之多肽及/或其他治療組合物(例如抗體或siRNA)接觸或投與需要該治療之個體，提供在活體外或活體內達成該治療之方法。投與可藉由任何適宜方法進行，且當接觸係在活體外時，有效量可由治療醫師或熟習此項技術者憑經驗確定。
在另一態樣中，治療方法進一步包含投與有效量之抗纖維變性劑或藥物，或另一選擇為實質上由其組成或更進一步由其組成。抗纖維變性劑或藥物之非限制性實例包括吡非尼酮及尼達尼布。額外試劑包括(但不限於)尼達尼布、口服普賴松(prednisone) (或一些其他形式之皮質類固醇)、富泌舒(Fluimucil) (N-乙醯基半胱胺酸)、癌得星(Cytoxan) (環磷醯胺)；普賴松、硫唑嘌呤及N-乙醯基半胱胺酸(NAC)之組合；秋水仙鹼、D-青黴胺、吡非尼酮(5-甲基-1-苯基-2-[1H]-吡啶酮)、干擾素-β1a、鬆弛素、洛伐他汀(lovastatin)、貝拉康坦(beractant)、N-乙醯基半胱胺酸、角質細胞生長因子、卡托普利(captopril)、肝細胞生長因子、Rho激酶抑制劑、血栓調節蛋白樣蛋白、膽紅素、PPARγ (過氧化體增殖物活化受體γ)活化劑、伊馬替尼及干擾素-γ。在一態樣中，纖維化係肺纖維化且額外試劑包括以下中之一或多者：秋水仙鹼、D-青黴胺、吡非尼酮(5-甲基-1-苯基-2-[1H]-吡啶酮)、干擾素-β1a、鬆弛素、洛伐他汀、貝拉康坦、N-乙醯基半胱胺酸、角質細胞生長因子、卡托普利、肝細胞生長因子、Rho激酶抑制劑、血栓調節蛋白樣蛋白、膽紅素、PPARγ (過氧化體增殖物活化受體γ)活化劑、伊馬替尼及干擾素-γ。額外試劑在文獻中已知，例如，JP A第8-268906號、WO 00/57913、JP A第2002-371006號、JP A第2003-119138號、JP A第2005-513031號、JP A第2005-531628號、JP A第2006-502153號、WO 2006/068232及Ann Intern Med. 2001；134(2): 136-51。
在一些實施例中，患有IPF之個體「對習用治療無反應」，即對習用先前技術治療之IPF無反應，該治療包括皮質類固醇、環磷醯胺及硫唑嘌呤。
在另一態樣中，治療方法進一步包含投與有效量之抗癌藥物或藥劑，或另一選擇為實質上由其組成或更進一步由其組成。
在一態樣中，治療方法進一步包含投與有效量之抗癌藥物或藥劑，或另一選擇為實質上由其組成或更進一步由其組成。在另一態樣中，治療方法進一步包含投與有效量之酪胺酸激酶抑制劑、鉑藥物或免疫治療劑，或另一選擇為實質上由其組成或更進一步由其組成。在又一態樣中，若適當，可組合且接觸或投與有效量之藥劑或藥物(化學治療劑或其他)。在一態樣中，化學治療劑係TKI、或基於鉑之藥物、或靶向EGFR之藥劑、或更進一步地MARCKS多肽或其片段，其中該片段並非MARCKS之N-末端片段、或不具有與如上所述之多肽具有序列一致性的胺基酸序列之多肽。
亦提供恢復化學抗性癌細胞對化學治療藥物之敏感性的方法，該方法包含如下、或另一選擇為實質上由其組成或更進一步由其組成：將有效量之分離之MPS多肽或其等效物或抗MARCKS siRNA與細胞接觸或投與至有需要之個體，且視情況，其中化學治療藥物或藥劑選自TKI、基於鉑之藥物、靶向EGFR之藥物或藥劑、順鉑、太平洋紫杉醇、厄洛替尼或達沙替尼；且視情況其中化學抗性癌細胞係TKI抗性細胞。siRNA-及shRNA-MARCKS抑制RNA為業內已知(例如，參見WO 2015/013669)且本文提供序列。接觸係在活體外或活體內，且在一態樣中，細胞係哺乳動物實體腫瘤細胞。在一態樣中，與正常對應細胞相比，腫瘤細胞包含或表現更高程度之磷酸化MARCKS多肽。該等細胞之非限制性實例包括肺癌細胞、結腸癌細胞、乳癌細胞或胰腺癌細胞，且另一選擇為或另外，患者患有晚期癌症(II至IV期)。在另一態樣中，該方法進一步包含將有效量之化學治療藥物或藥劑(例如，TKI、或基於鉑之藥物或靶向EGFR之藥劑，例如順鉑、太平洋紫杉醇、厄洛替尼或達沙替尼)與細胞接觸或投與至患者或個體。
本文進一步提供在有需要之個體中增加抗纖維變性或抗癌劑或藥物中之一或多者之效能的方法，其用於以下中之一或多者：預防、減少、延遲、抑制或阻抑與以下相關之疾病或疾病症狀：MARCKS磷酸化及/或自細胞膜解離及/或PIP2螯合效應、或PIP3產生、或AKT活化、或發炎、纖維化、或纖維母細胞病灶、或活化之纖維母細胞增殖、或肌纖維母細胞生成及分化、或轉化生長因子-β (TGF-β)信號傳導途徑、或癌症、或實體腫瘤細胞生長或轉移、或癌症幹細胞生長、或腫瘤細胞遷移；及視情況用於促進細胞凋亡、或恢復抗性癌細胞對化學治療劑之敏感性，該方法包含向個體投與有效量之一或多種抗纖維變性或抗癌劑或藥物與有效量之本揭示內容之分離之多肽或分離之聚核苷酸或組合物的組合。
在一態樣中，本文揭示在有需要之個體中增加吡非尼酮或尼達尼布、或百森替尼(bemcentinib)或厄洛替尼中之一或多種之效能的方法，其用於以下中之一或多者：預防、減少、延遲、抑制或阻抑與以下相關之疾病或疾病症狀：MARCKS磷酸化及/或自細胞膜解離及/或PIP2螯合效應、或PIP3產生、或AKT活化、或發炎、或纖維化、或肺纖維化、或吸煙、或特發性肺纖維化、或博來黴素誘導之肺纖維化、或纖維母細胞病灶、或活化之纖維母細胞增殖、或肌纖維母細胞生成及分化、或轉化生長因子-β (TGF-β)信號傳導途徑、或癌症、或實體腫瘤細胞生長或轉移、或癌症幹細胞生長、或腫瘤細胞遷移；及視情況用於促進細胞凋亡、或恢復抗性癌細胞對化學治療劑之敏感性，該方法包含向個體投與有效量之尼達尼布、或百森替尼、或厄洛替尼中之一或多者與有效量之本揭示內容之分離之多肽或分離之聚核苷酸或組合物的組合。癌症之非限制性實例包括肺癌、肝癌、腎癌、腦癌、結腸直腸癌、胰臟癌、骨癌、喉癌、淋巴瘤及白血病。
在治療應用中，將含有一或多種本文所述之多肽或其他治療組合物(例如抗體或siRNA)之醫藥組合物投與懷疑患有或已經患有癌症之患者，其中該組合物以足以治癒或至少部分阻止疾病症狀(生化、組織學及/或行為學)之量投與，該等疾病症狀包括疾病發展中之併發症及中間病理學表型。在一態樣中，藉由腹膜內注射或經口投與。
在一個特定態樣中，本文揭示在有需要之個體中通過血腦障壁遞送本揭示內容之多肽的方法，該方法包含向個體投與有效量之如上文所揭示之載體，或另一選擇為基本上由其組成或更進一步由其組成。在一態樣中，在不存在促進通過血腦障壁轉運之藥劑(例如甘露醇)之情況下遞送肽。
在一態樣中，對於本文揭示之治療方法，投與係局部投與至所治療之組織或全身投與。在一個具體態樣中，局部投與包含局部或藉由吸入療法，或另一選擇為實質上由其組成或更進一步由其組成。在另一態樣中，全身投與來自靜脈內、顱內、吸入療法、鼻內、陰道或直腸投與之群。
活體內投與在整個療程中可以一個劑量、連續或間歇地實現。確定最有效之投與方式及劑量之方法為熟習此項技術者熟知，且將隨著用於療法之組合物、療法之目的、靶細胞、所治療之實體腫瘤或癌症所治療之個體而變化。可實施單次或多次投與，劑量值及模式由治療醫師選擇。適宜劑量調配物及投與試劑之方法可參見下文。美國專利第10,039,515中揭示額外投用策略。
醫藥組合物可經口、鼻內、非經腸、注射、經口投與，且可採取錠劑、菱形錠劑、顆粒、膠囊、丸劑、安瓿、栓劑或氣溶膠形式之形式。其亦可採取活性成分於水性或非水稀釋劑中之懸浮液、溶液及乳液、糖漿、顆粒或粉末之形式。除了本揭示內容之藥劑之外，醫藥組合物亦可含有其他藥學活性化合物或本揭示內容之多種化合物。
更具體而言，本揭示內容之藥劑在本文中亦稱為活性成分，可藉由任何適宜途徑投與用於療法，該等途徑包括經口、直腸、鼻、局部(包括經皮、氣溶膠、經頰及舌下)、陰道、非經腸(包括皮下、肌內、靜脈內及真皮內)及經肺。亦應理解，較佳途徑將隨著接受者之狀況及年齡以及所治療之疾病而變化。
理想地，應投與該藥劑以在疾病部位達到活性化合物之峰值濃度。此可藉由例如靜脈注射視情況在鹽水中之藥劑來達成，或例如作為含有活性成分之錠劑、膠囊或糖漿經口投與。藉由連續輸注以在疾病組織內提供治療量之活性成分，可維持藥劑之期望血液含量。預期使用有效組合以提供治療組合，其所需之每一組分藥劑的總劑量比單獨使用每一個別治療化合物或藥物時所需之更低，從而降低不良效應。
儘管該藥劑可單獨投與，但較佳以醫藥調配物之形式提供，該醫藥調配物包含至少一種如上定義之活性成分，以及一或多種醫藥上可接受之載劑及視情況其他治療劑。在可與調配物之其他成分相容且不損害患者之意義上，每一載劑必須係「可接受的」。
調配物包括適於經口、直腸、鼻、局部(包括經皮、經頰及舌下)、陰道、非經腸(包括皮下、肌內、靜脈內及皮內)及經口投與之彼等。調配物可便捷地以單位劑型存在，且可藉由製藥領域熟知之任何方法來製備。該等方法包括使活性成分與構成一或多種輔助成分之載劑結合之步驟。一般而言，調配物可藉由使活性成分與液體載劑或微細固體載劑或二者均勻且充分結合且然後(若需要)使該產物成型來製備。
適於經口投與之本揭示內容之調配物可作為離散單元提供，例如膠囊、扁囊劑或錠劑，各自含有預定量之活性成分；作為粉末或顆粒提供；作為水性或非水性液體中之溶液或懸浮液提供；或作為水包油液體乳液或油包水液體乳液提供。活性成分亦可作為濃注劑、舐劑或糊劑提供。
可藉由壓縮或模製來製備錠劑，其視情況含有一或多種輔助成分。壓縮錠劑可藉由在適宜機器中壓縮呈自由流動形式(例如粉末或顆粒)之活性成分、視情況與黏合劑(例如聚維酮(povidone)、明膠、羥丙基甲基纖維素)、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、崩解劑(例如澱粉羥乙酸鈉、交聯聚維酮、交聯羧甲纖維素鈉)、表面活性或分散劑混合。模製錠劑可藉由在適宜機器中模製經惰性液體稀釋劑潤濕之粉末狀化合物之混合物來製得。錠劑可視情況經包衣或壓痕且可使用(例如)羥丙基甲基纖維素以變化比例調配以便提供其中之活性成分之緩慢或控制釋放，以提供期望釋放曲線。錠劑可視情況提供有腸溶包衣，以在除胃外之腸之部分中提供釋放。
適於口腔中局部投與之調配物包括於矯味基質(通常為蔗糖及阿拉伯膠或黃蓍膠)中包含活性試劑之菱形錠劑、於惰性基質(例如明膠及甘油、或蔗糖及阿拉伯膠)中包含活性成分之香錠；及於適宜液體載劑中包含活性成分之漱口劑。
根據本揭示內容用於局部投與之醫藥組合物可調配為軟膏劑、乳霜、懸浮液、洗劑、粉劑、溶液、糊劑、凝膠、噴霧、氣溶膠或油。或者，調配物可包含貼劑或敷料，例如浸漬有活性成分及視情況一或多種賦形劑或稀釋劑之繃帶或黏性石膏。
若需要，乳霜基質之水相可包括(例如)至少約30% w/w之多元醇，即，具有兩個或更多個羥基之醇，例如丙二醇、丁烷-1,3-二醇、甘露醇、山梨醇、甘油及聚乙二醇及其混合物。局部調配物可期望地包括增強藥劑穿過皮膚或其他受影響區域之吸收或滲透的化合物。該等真皮滲透增強劑之實例包括二甲基亞碸及相關類似物。
本揭示內容之乳液之油相可以已知方式自已知成分構成。儘管此相可僅包含乳化劑(或者稱為利泄劑)，但其期望地包含至少一種乳化劑與脂肪或油或與脂肪及油二者之混合物。較佳地，包括親水性乳化劑以及用作穩定劑之親脂性乳化劑。亦較佳包括油及脂肪。同時，該(等)乳化劑在有或沒有穩定劑之情況下構成所謂乳化蠟，且該蠟與油及脂肪一起構成所謂乳化軟膏基質，其形成乳霜調配物之油性分散相。
適用於本揭示內容之調配物中之利瀉劑及乳液穩定劑包括Tween 60、Span 80、鯨蠟硬脂醇、肉豆蔻醇、單硬脂酸甘油酯及月桂基硫酸鈉。
由於活性化合物在大多數可能用於醫藥乳液調配物之油中之溶解度極低，故用於該調配物之適宜油或脂肪之選擇係基於達成期望化妝性質。因此，乳霜較佳地應為非油脂、未著色且可洗產品，同時其具有適宜稠度以避免自管或其他容器洩漏。可使用直鏈或具支鏈、單-或二元烷基酯，例如二-異己二酸酯、硬脂酸異鯨蠟酯、椰子脂肪酸之丙二醇二酯、肉豆蔻酸異丙基酯、油酸癸基酯、棕櫚酸異丙基酯、硬脂酸丁基酯、棕櫚酸2-乙基己基酯或稱為Crodamol CAP之具支鏈酯之摻合物，最後三個係較佳之酯。端視所需性質而定，該等物質可單獨或組合使用。或者，可使用諸如白軟石蠟及/或液體石蠟或其他礦物油等高熔點脂質。
適於局部投與至眼睛之調配物亦包括滴眼劑，其中活性成分溶於或懸浮於適宜載劑、尤其藥劑之水性溶劑中。
用於直腸投與之調配物可作為具有適宜基質(包含例如可可脂或柳酸酯)之栓劑提供。適於經陰道投與之調配物可以除含有藥劑外亦含有業內已知適當之該等載劑的子宮帽、陰道塞(tampon)、乳霜、凝膠、糊劑、發泡體或噴霧調配物形式提供。
適於經鼻投與之調配物(其中載劑係固體)包括具有例如約20至約500微米範圍內之粒徑的粗粉末，其作為乾粉或在吸入器裝置中藉由自靠近鼻子放置之粉末容器通過鼻道快速吸入而投與。適宜調配物(其中載劑係液體，用於作為例如鼻噴霧、滴鼻劑或藉由霧化器之氣溶膠投與來投與)包括藥劑之水性或油性溶液。
適於非經腸投與之調配物包括水性及非水性等滲無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及使調配物與預期接受者之血液等滲之溶質；及水性及非水性無菌懸浮液，其可包括懸浮劑及增稠劑，及脂質體或其他微粒系統，該等微粒系統經設計以將化合物靶向血液組分或一或多個器官。調配物可以單元劑量或多劑量密封容器(例如，安瓿及小瓶)提供，且可儲存於冷凍乾燥(凍乾)條件下，僅需在即將使用前添加無菌液體載劑(例如，注射用水)。臨時注射溶液及懸浮液可自先前所述之種類的無菌粉劑、顆粒及錠劑來製備。
應理解，除了上文特別提及之成分之外，本揭示內容之調配物可包括業內習用之與所討論之調配物類型有關之其他試劑，例如，適於經口投與之彼等可包括諸如甜味劑、增稠劑及矯味劑等其他試劑。亦意欲將本揭示內容之藥劑、組合物及方法與其他適宜組合物及療法組合。
本揭示內容之方法用於治療「個體(subject)」、「宿主」、「個體(individual)」及「患者」，例如動物，通常哺乳動物。任何適宜哺乳動物皆可藉由本文所述之方法、細胞或組合物治療。哺乳動物之非限制性實例包括人類、非人類靈長類動物(例如，猿、長臂猿、黑猩猩、猩猩、猴、獼猴及諸如此類)、家畜(例如，狗及貓)、農場動物(例如，馬、牛、山羊、綿羊、豬)及實驗動物(例如，小鼠、大鼠、兔、天竺鼠)。在一些實施例中，哺乳動物係人類。哺乳動物可為任何年齡或處於任何發育階段(例如，成人、青少年、兒童、嬰兒或子宮內之哺乳動物)。哺乳動物可為雄性或雌性。哺乳動物可為懷孕之雌性。在一些實施例中，個體係人類。在一些實施例中，個體患有或懷疑患有癌症或腫瘤性病症。
如本文所用，個體中疾病之「治療(treating或treatment)係指(1)預防個體中發生之症狀或疾病，該個體易患或尚未展現疾病之症狀；(2)抑制疾病或停止其發展或復發；或(3)改善或引起疾病或疾病症狀之消退。如業內所理解，「治療」係用於獲得有益或期望結果(包括臨床結果)之方法。出於本技術之目的，有益或期望結果可包括但不限於以下中之一或多者：緩和或改善一或多種症狀、減輕病況(包括疾病)之程度、病況(包括疾病)之穩定(即，不惡化)狀態、延遲或減緩病況(包括疾病)、進展、改善或緩解病況(包括疾病)、狀態及緩解(無論部分或全部)，無論可檢測或不可檢測。在一態樣中，治療不包括預防。
當疾病係癌症時，以下臨床終點係治療之非限制性實例：腫瘤負荷之降低、腫瘤生長之減緩、更長之總體存活、更長之腫瘤進展時間、轉移之抑制或腫瘤轉移之減少。在一態樣中，治療不包括預防。
當疾病係纖維化時，以下臨床終點係治療之非限制性實例：纖維化組織減少、發炎減少、纖維母細胞病灶減少、活化之纖維母細胞增殖減少、肌纖維母細胞生成減少；強制肺活量(FVC)下降速率降低，其中FVC係肺功能測試期間呼出之空氣總量；FVC自基線之絕對及相對增加、FVC自基線之絕對增加(%預測)、無進展存活時間之增加、聖喬治呼吸問卷(SGRQ)總評分自基線之減少，其中SGRQ係健康相關之生活品質問卷，分為3個組分：症狀、活動及影響以及總評分(總計加權)可在0至100之範圍內，其中較低之評分表示較好之健康狀態；及高解析度電腦化斷層攝影(HRCT)定量肺纖維化(QLF)評分自基線相對降低，其中QLF評分在0至100%之範圍內，且更大之值表示更大量之肺纖維化且被認為係較差健康狀態。纖維化治療之臨床終點及可實施以量測該等臨床終點之測試的非限制性實例闡述於以下臨床試驗中：NCT03733444 (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03733444)、NCT00287729 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00287729)、NCT00287716 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00287716)、NCT02503657(https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02503657)、NCT00047645 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00047645)、NCT02802345 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02802345)、NCT01979952 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01979952)、NCT00650091 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00650091)、NCT01335464 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01335464)、NCT01335477 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01335477)、NCT01366209 (clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01366209)。纖維化治療之臨床終點及可實施以量測該等臨床終點之測試的其他非限制性實例闡述於King等人，N Engl J Med. (2014) 5月29日；370(22):2083-92及Richeldi等人，N Engl J Med. 2014年5月29日；370(22):2071-82中。套組
本文亦揭示包含以下中之一或多者或另一選擇為實質上由其組成或更進一步由其組成的套組：本揭示內容之分離之多肽、分離之聚核苷酸、載體或組合物及使用說明書。在一態樣中，說明書敘述使用本文揭示之分離之多肽、分離之聚核苷酸、載體或組合物之方法。實驗 實驗編號 1
肺纖維化係正常肺損傷修復過程之重要步驟，此乃因肺係不斷被環境空氣污染物轟擊之主要靶器官。吸煙係誘發肺損傷及修復之病因之一，且持續吸煙會導致不受控制之肺損傷及修復；此可能導致威脅生命之疾病，例如特發性肺纖維化(IPF)，其中值存活時間僅為3至5年1-3 。靶向增加之纖維母細胞增殖及肌纖維母細胞分化已被認為係IPF管理中之治療策略；因此，迫切需要研發能夠根除肌纖維母細胞或限制其發生之藥劑。在過去二十年中，為IPF研發之絕大多數治療劑集中於抗發炎效應，而非抗纖維變性效應，且因此在臨床上取得有限之成功，其中發炎反應之非特異性阻抑及強效免疫阻抑係主要障礙。在2014年，美國食品藥品管理局(FDA)批准兩種用於IPF之新穎治療劑：吡非尼酮及尼達尼布，每種之成本為每名患者每年差不多$100,000。由於不可耐受之不良效應，一些IPF患者在中斷吡非尼酮後轉為尼達尼布4 。尼達尼布係一種強效多激酶抑制劑，其經由阻斷若干關鍵受體酪胺酸激酶(包括血小板源生長因子(PDGF)受體、纖維母細胞生長因子(FGF)受體及血管內皮生長因子(VEGF)受體)顯示抗纖維變性及抗發炎效應5, 6 。不幸的是，轉化生長因子-β (TGF-β)途徑(IPF進展中之重要決定因素7, 8 )並非此藥物之主要靶標。另外，尼達尼布療法之不良效應係常見的，且在較高劑量下會更糟，導致藥物中斷9, 10 。出於該等原因，迫切需要尋找新的更佳之治療劑用於診斷為IPF之彼等。本揭示內容之中心思想係研發用於選擇性靶向纖維發生路徑而不干擾免疫及發炎反應且亦改良尼達尼布治療之效能的有效方法。另外，申請人評估該等化合物在已確立纖維化期而非在發炎早期階段之抗纖維變性性質。為了揭示有益之抗纖維變性化合物，非常需要在動物模型之「纖維變性」期使用候選治療，其更好地反映人IPF。
申請人發現主要蛋白激酶C受質MARCKS (富含肉豆蔻醯化丙胺酸之C激酶受質)係IPF之潛在靶分子，且研發新穎基於肽之治療劑，其用於選擇性消融活化之纖維母細胞及肌纖維母細胞，而不會不利地影響正常纖維母細胞。除了作為蛋白激酶C之主要受質之外，MARCKS亦係磷脂醯肌醇4,5-二磷酸(PIP2)相關蛋白，經由其磷酸化位點結構域(PSD；亦稱為鹼性效應物結構域)結合至細胞膜。在MARCKS PSD內藉由PKC磷酸化(Ser159及Ser163)增強磷酸化MARCKS (磷酸-MARCKS)自膜之脫離並阻抑PIP2螯合效應11, 12 。最近研究已指示，MARCKS PSD在磷酸化時之重要功能係為PI3K提供PIP2池用於PIP3 (磷脂醯肌醇(3,4,5)-三磷酸)產生，藉此活化AKT13-15 。藉由靶向磷酸-MARCKS以自其酶保留PIP2來防止失調細胞中PIP3、三磷酸肌醇及二醯基甘油之異常產生，但對正常細胞過程中之酶活性無效應；此指示MARCKS本身因此可為更有效之靶標。基於MARCKS PSD之序列，申請人已鑑別25聚體肽，即靶向MARCKS PSD序列並抑制癌症中AKT之活化的MPS肽14, 16 。基於發現，已研發一系列經設計以模擬MARCKS之PSD/ED基序序列之膜曲率及PIP2保留活性的介於12-25個胺基酸範圍內之小MPS肽。已在活體內博來黴素誘導之小鼠肺纖維化模型之抑制中及在活體外肌纖維母細胞分化之阻抑中、以及離體IPF組織源纖維母細胞之生長中測試其抑制性效能，其基於PIP2及PIP3保留活性。下文係關於本揭示內容之結果。MARCKS 磷酸化之異常升高及其與 IPF 纖維母細胞之相關性
為了揭示驅動肺纖維母細胞中代表IPF特徵之基因表現的調控分子，使用比較方法，其中整合兩個不同微陣列資料集(GSE21369及GSE2052)以發現與來自非IPF患者之正常纖維母細胞相比，在分離自IPF患者之肺纖維母細胞中特異性上調的基因。目前，肌纖維母細胞之最明確之分子標記物係α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)，其指示纖維母細胞活化且在IPF之發育及進展中起關鍵作用17, 18 。值得注意的是，申請人鑑別與資料集GSE27335 (其包括肺肌纖維母細胞樣細胞之譜數據)中之α-SMA表現正相關之487個基因之簇。藉由分析與GSE21369中計算之366個基因及GSE2052中計算之213個基因之重疊基因，鑒了一組14個基因作為控制IPF中纖維母細胞活化之候選靶標，該等重疊基因與正常纖維母細胞相比顯著上調。鑒於所有已知生物標記物中之三分之一以上及三分之二以上之潛在疾病靶標係膜相關蛋白19, 20 、關鍵PIP2-結合配偶體MARCKS21 的事實，14個鑑別基因中之一者吸引注意力且經選擇用於進一步研究(圖 1A )。經由分析轉錄體資料集22 ，申請人比較自從進行肺移植之IPF患者移植之生檢或肺的手術殘餘物獲得之13個樣品及自肺癌患者切除之11個正常組織學肺樣品之間的MARCKS基因表現。觀察到在IPF肺組織中MARCKS表現顯著升高(圖 1B )。為了驗證MARCKS在IPF纖維母細胞中失調，檢查MARCKS在分離自IPF及非IPF患者之原代肺纖維母細胞中之表現及其磷酸化。圖 2 顯示與正常纖維母細胞(正常-1及-2)相比，在兩種IPF纖維母細胞(IPF-1及-2)中α-SMA、MARCKS及MARCKS在Ser159及Ser163磷酸化(磷酸-MARCKS)的表現更高，表明在IPF纖維母細胞中高磷酸-MARCKS及MARCKS表現之暗示。接下來，使用MARCKS特異性短髮夾RNA (MARCKS shRNA)消除磷酸-MARCKS及MARCKS表現，且顯示MARCKS敲低細胞之遷移降低2.9倍(圖 3 )。申請人先前研發細胞可滲透肽，即靶向MARCKS磷酸化位點結構域(M ARCKSp hosphorylations ite domain，PSD；亦稱為鹼性效應物結構域)且抑制癌症中之磷酸-MARCKS含量的MPS肽14, 16 。如所預期，在原代IPF纖維母細胞中用該肽處理確認MARCKS抑制降低細胞運動性及增殖(圖 4 )，此與MARCKS之shRNA敲低一致。該等結果表明MARCKS在與IPF有關之若干表型中起重要作用。由於MARCKS之功能取決於其磷酸化，故申請人接下來以免疫組織學方式確認在正常肺樣品及來自接受或未接受尼達尼布治療之患者(n =18)之IPF肺組織中之磷酸-MARCKS含量。MARCKS磷酸化之免疫組織化學(IHC)分析顯示來自IPF患者之組織切片中之磷酸-MARCKS信號增加(圖 5 )。在經歷尼達尼布療法之IPF患者之組織中亦觀察到強磷酸-MARCKS染色。在纖維母細胞病灶中，觀察到一些纖維母細胞樣細胞無太多免疫染色，而一些未定義之細胞展示強磷酸-MARCKS信號。目前，推測未定義之實質細胞為肌纖維母細胞；藉由用α-SMA (一種肌纖維母細胞標記物)對磷酸-MARCKS實施雙染色，可獲得此假說之確認。
MPS肽在博來黴素誘導之肺纖維化中潛在地用作抗纖維變性劑。博來黴素仍然係誘導動物中實驗性肺纖維化之標準試劑23 。因此，8週齡雌性C57BL/6J小鼠如先前所述氣管內接受鹽水或博來黴素(33 μg，在50 ml鹽水中)23 。收集來自博來黴素或鹽水處理之小鼠之肺樣本且使其經受免疫螢光染色。在博來黴素處理之肺組織中觀察到磷酸-MARCKS及α-SMA之共表現升高(圖 6 )。接下來，將自鹽水或博來黴素處理之小鼠分離之肺纖維母細胞(兩種小鼠纖維母細胞系係來自Dr. Sem H. Phan, University of Michigan School of Medicine, MI之禮物)與100 μM對照或MPS肽一起培育48小時。來自博來黴素處理之小鼠之纖維母細胞在MPS存在下展現磷酸-MARCKS、磷酸-AKT及α-SMA表現之降低(圖 7A )。此外，MTT分析確認，與處理來自鹽水處理之小鼠之纖維母細胞相比，MPS處理在降低該等纖維母細胞之細胞存活率方面極為有效(圖 7B )。測試MPS肽在博來黴素誘導之肺纖維化中作為抗纖維變性劑之可行性。在博來黴素暴露9天後，與接受鹽水之小鼠(對照組)相比，小鼠之體重明顯降低。然後每隔一天腹膜內用PBS或MPS肽(28mg/kg)處理鹽水及博來黴素暴露之小鼠。為了確定MPS肽對肺纖維化之治療效應，在模型之「纖維變性」期期間腹膜內投與MPS。總共有四組(每組五隻小鼠)：1)鹽水加PBS；2)鹽水加MPS；3)博來黴素加PBS；4)博來黴素加MPS。令人驚訝的是，申請人在暴露於博來黴素加PBS之小鼠中觀察到體重持續減輕，而在經MPS處理之博來黴素暴露之小鼠中未觀察到(圖 8 )。博來黴素暴露22天後，收集小鼠肺並處理用於組織學及馬森三色染色。博來黴素暴露之小鼠顯示肺中廣泛結構變化，而在博來黴素暴露及MPS處理之小鼠之肺中觀察到纖維母細胞病灶及沈積之細胞外基質減少(圖 9 )。該等結果表明磷酸-MARCKS可為肺纖維化之治療靶標。
MPS肽之分子基礎及其增加尼達尼布效能之潛力。鑒於PSD在MARCKS蛋白之功能性中之重要性，申請人先前設計25聚體MPS肽來模擬MARCKS PSD，且發現此肽可直接抑制癌症中磷酸-MARCKS介導之功能，而對正常人類上皮細胞無細胞毒性效應14, 16 。基於MARCKS PSD上之PIP2-結合基序(圖 10A )，測試此肽對作為AKT活化之兩個主要決定因素之PIP2結合及PIP3合成的效應15 。動力學分析確認此肽以17.64 nM之解離常數結合PIP2 (圖 10B )。如所預計，觀察到MPS處理之IPF纖維母細胞之全細胞溶解物中PIP3池減少(圖 10C )，此支持MPS肽能夠經由捕獲PIP2抑制AKT活化之觀點。鑒於目前IPF治療性尼達尼布之不良效應9, 10 ，臨床上迫切需要改良該治療在IPF中之效能。由於TGF-β受體並非尼達尼布之直接靶標，故與尼達尼布投與串聯靶向TGF-β信號傳導之元件避免了尼達尼布單一療法之缺點。鑒於在用尼達尼布治療之IPF患者之肺組織中觀察到強磷酸-MARCKS染色(圖 5 )，表明MARCKS在用此多激酶抑制劑治療下仍有活性。圖 11A 顯示尼達尼布治療後α-SMA表現之增加，此與尼達尼布誘導α-SMA之最近報導一致，儘管TGF-β信號傳導部分受高劑量尼達尼布治療之影響24 。令人驚訝的是，尼達尼布治療後磷酸-AKT無變化。基於上述觀察結果，假定TGF-β指導之磷酸-MARCKS係活化PI3K/AKT信號傳導之旁路機制(圖 11B )；因此，似乎合理的是藉由MPS治療抑制MARCKS可改良尼達尼布效能，從而允許使用較低劑量之尼達尼布。為此，測試MPS與尼達尼布之間之協同相互作用之可能性以避免尼達尼布單一療法之缺點。當用尼達尼布、MPS肽或尼達尼布與MPS肽之組合處理時，原代IPF纖維母細胞中之細胞存活率降低，在組合組中觀察到最大存活抑制(圖 12A-B )。此外，Chou及Talalay CI (組合指數)方法25 用於評估尼達尼布與MPS肽之間之治療相互作用。MPS之添加顯著增強尼達尼布之存活阻抑，在ED50下CI值約為0.5 (CI＜1)，指示藥物組合之協同效應(圖 12C )。具體而言，在ED50下該等值低於1，在ED75下約為1，且在ED90下高於1 (數據未示出)。因此，組合效應與組分劑量依賴性相關，且因此低劑量尼達尼布與低劑量MPS之組合對細胞增殖表現協同效應。同時，錐蟲藍排除測試之數據指示，與對照、MPS及尼達尼布相比，組合處理之細胞存活率顯著更低(圖 12D )。基於MPS肽之序列，設計並合成此肽中PIP2結合位點之重排，目的係增強MPS肽之效能及穩定性。圖 13 列示各種MPS衍生物之序列。鑒於各種蛋白酶之裂解位點及PIP2結合基序，申請人用D-同種型置換一些L-同種型胺基酸，且該等肽命名為MPS-12042及MPS-22026。為了進一步驗證上述MPS衍生物之效能，申請人實施經歷每一MPS衍生物處理之H1650細胞之劑量-過程分析。MTT分析顯示各種MPS相關肽之IC50值(圖 13 )。由於MPS-12042在殺死高度增殖細胞H1650方面顯示最有效，故確定其在治療IPF纖維母細胞中之作用。使用MTS分析，申請人發現與MPS肽(IC50：125～178 μM)相比，MPS-12042處理在抑制IPF纖維母細胞增殖方面具有更佳效能(IC50：1.0～1.5 μM)。應注意，1 μM之濃度在IPF纖維母細胞中而非在正常纖維母細胞中顯著降低細胞增殖達50%(圖 14 )。除了MPS-12042之靶向選擇性之外，MPS-12042之IC50低於目前FDA批准之IPF藥物尼達尼布(IC50：13.8-15.9μM)。
如本揭示內容之資料所表明，磷酸-MARCKS用作活化纖維母細胞之特異性標記物，藉由使用MPS肽抑制MARCKS活性可導致未來之臨床測試及用於IPF患者之潛在新治療。MPS肽在博來黴素誘導之肺纖維化中之治療潛力已經首次得到證實，且將有助於研發破壞活化纖維母細胞及/或肌纖維母細胞而不會不利地影響靜止纖維母細胞的治療。總之，申請人之研究潛在地定義及驗證IPF之治療靶標及/或生物標記物，此可導致研發非常需要之IPF之新治療方法。
靶向MARCKS PSD與抑制幹細胞樣細胞性質相關。鑒於PSD在MARCKS蛋白之功能性中之重要性，申請人設計25聚體MPS肽來模擬MARCKS磷酸化位點結構域(PSD)。大量研究已揭示此25聚體肽與質膜靜電相互作用。申請人已發現，MPS處理可直接抑制磷酸-MARCKS在肺癌及腎癌中之活體外及活體內功能，而此肽對正常人類上皮細胞無細胞毒性效應14,16 。由於磷酸-MARCKS驅動肺癌朝向更惡性之腫瘤進展29 且癌症幹細胞樣細胞(CSC)參與癌症惡性腫瘤，故在較高磷酸-MARCKS與癌症幹性之間可存在相關性。申請人之初步研究已顯示，肺腫瘤球中磷酸-MARCKS之升高與增加之幹性標記物(例如CD133、Oct3/4、SOX2及Nanog)平行作用(數據未包括)。腫瘤球係在如先前所述30-32 之非貼壁無血清培養條件下源自高MARCKS表現之肺癌細胞系(H1975及CL1-5)及原代肺癌細胞(LG704及LC3：自晚期患者分離之胸膜滲出液細胞)。流式細胞術確認約80%之LG704腫瘤球細胞係CD133陽性，一種主要肺CSC標記物。在球狀體條件中培養該等細胞顯示，與貼壁條件中之細胞相比，不僅對DNA損害劑及EGFR抑制劑兩者之抗性更大，且亦顯示活體內高致瘤性(數據未包括)。經由藉由RNA-seq比較PBS處理及MPS處理之LG704腫瘤球之轉錄體譜，申請人鑑別總共352個由MARCKS抑制改變之編碼基因(圖 15 ，左 )。在50 μM MPS處理後，若干預計之癌症幹性基因減少，特別是ABCC8、CDH5、PROM1 (CD133)、ALDH1L1及FGFR2 (圖 15 ，右 )。由於球體形成(或球體形成能力)係腫瘤侵襲性之指標且與癌症患者之差存活相關，故申請人接下來確認長期暴露於煙霧會增強癌症幹性(球體形成)之事實33-44 。藉由在顯微鏡下計數腫瘤球體(腫瘤球)之數目及大小來評價球體形成能力。無血清培養基及非貼壁培養條件用於自低侵襲性肺癌細胞系CL1-0細胞培養及富集癌症幹細胞樣群體，該等CL1-0細胞最初在貼壁培養條件下培養。在非貼壁無血清培養條件下暴露於PBS或煙草煙霧提取物(CSE)七天，煙霧處理之細胞展示較高之腫瘤球形成能力(圖 16 ，上圖 )及各種CSC相關轉錄因子之升高表現(圖 16 ，下圖 )。此外，將V5標記之野生型及PSD突變(S159/163A)之MARCKS構築體引入低MARCKS表現細胞。在具有V5標記之野生型MARCKS之異位表現之煙霧處理之細胞中觀察到約3.7倍之球形成能力增加，而在具有磷酸化缺陷S159/163A MARCKS過表現之細胞中未明顯觀察到煙霧增強之球體形成能力及幹性基因表現(圖 17 )。藥理學上，申請人用MPS肽處理源自H292細胞之煙霧富集之腫瘤球以靶向MARCKS PSD。圖 18 顯示MPS肽對腫瘤球之數目及大小以及幹性基因之表現的抑制效應。MPS肽對癌症幹性之該抑制可歸因於煙草煙霧誘導之MARCKS磷酸的阻抑。細胞培養
人類原代纖維母細胞經同意自UC Davis Medical Hospital (Sacramento, CA)提供之氣道組織獲得。人類組織取得及使用之方案由University Human Subject Research Review Committee定期評審及批准。自IPF患者確立原代纖維母細胞系IPF-1及IPF-2細胞。自肺生檢獲得細胞，且由患者病史、體檢、肺功能測試及IPF之典型高解析度胸部電腦斷層攝影發現支持IPF之診斷。在所有情形下，IPF之診斷係藉由肺組織之顯微鏡分析來確認，且展現常見間質性肺炎之特徵性形態學發現。所有患者皆滿足American Thoracic Society及European Respiratory Society確立之IPF診斷準則。使用非纖維變性原代對照成人肺纖維母細胞系正常-1及正常-2細胞。該等細胞系係自正常肺組織或與類癌瘤相鄰之組織學正常肺組織確立。IPF細胞系LL97A購自美國美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC) (Manassas, VA)。於37℃下在5% CO2之加濕氣氛中，在具有10%胎牛血清及1%青黴素-鏈黴素之高葡萄糖DMEM或RPMI-1640培養基中培養肺纖維母細胞系。在第4代與第8代之間使用纖維母細胞。如所述26 將細胞表徵為纖維母細胞。定量即時 PCR
藉由使用如以下引子部分所述之引子之即時反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-qPCR)檢測靶基因之mRNA表現量。管家基因TATA-盒結合蛋白(TBP)用作參照基因。與TBP之相對表現量相比之靶基因之相對表現量定義為-ΔCT = -[CT靶 -CTTBP ]。靶/TBP mRNA比率計算為2-ΔCT × K，其中K係常數。患者肺樣本及免疫組織化學染色
IPF肺組織及非IPF正常肺樣本係自具有組織學確認之IPF之患者獲得，該等患者在UC Davis Medical Center經歷手術切除。此研究由UC Davis Health System之機構審查委員會(Institutional Review Board)批准。自所有患者獲得書面知情同意書。使用福馬林(Formalin)固定及石蠟包埋之樣本，且藉由如先前所述14, 16, 27 之免疫組織化學染色分析磷酸-MARCKS之含量。該等結果亦由兩個病理學家分別審查及評分。動力學分析
使用生物層干涉(BLI)在Octet RED96系統(ForteBio)上遵循製造商之說明書評估模擬MARCKS之磷酸化位點結構域之肽(MPS肽，來自野生型MARCKS蛋白之胺基酸151至175)與生物素標記之PIP2之即時結合。簡言之，將配體，即在sn-1位用生物素標記之PIP2 (1000 nM，於ddH2 O中)固定在超級鏈黴抗生物素蛋白(SSA)生物感測器上10分鐘。用ddH2 O中之0-1000 nM之各種濃度之MPS分析物實施結合分析。監測結合及解離5分鐘。在24℃下實施分析。使用Octet數據分析軟體7.0 (ForteBio)分析數據。PI(3,4,5)P3 定量
收穫細胞並藉由三氯乙酸沈澱。藉由甲醇: 氯仿(2:1)自三氯乙酸沈澱部分提取兩次PIP3脂質。酸化後，基於PIP3 Mass ELISA套組(Echelon Biosciences, Salt Lake, UT)之方案，使用有機相脂質進行PIP3定量。簡言之，將培養細胞之脂質提取物與PIP3特異性檢測蛋白混合，然後在PIP3包被之微板中培育用於競爭性結合。洗滌若干次後，然後將微板與HRP連接之二級檢測器及四甲基聯苯胺受質一起培育用於顯色。為了停止進一步顯色，然後添加2M H2 SO4 溶液。在450 nm之吸收波長下讀取微板。使用一系列不同稀釋之PIP3標準物確立每一反應之標準曲線。藉由比較孔中之吸光度與標準曲線中之值，可估計細胞PIP3量。實驗在一式三份之平皿中執行，且在兩個獨立之培養物中重複，細胞密度為5×106 個細胞/100-mm平皿。Transwell 遷移分析
如先前所述13, 14 ，使用Transwell室(8-μm孔徑；Costar, Cambridge, MA)實施活體外細胞遷移分析。簡言之，將2 × 104 個細胞接種在聚碳酸酯濾膜頂部，且將0.5 ml具有雜亂或MPS肽(100μM)之生長培養基添加至上孔及下孔中。培育20小時後，用棉簽擦拭濾膜，用甲醇固定，且然後用Giemsa溶液(Sigma)染色。在光學顯微鏡(10X放大)下對附著至濾膜下表面之細胞進行計數。劃傷傷口癒合分析
將細胞接種至六孔組織培養皿並生長至鋪滿。使用吸量管吸頭將線性傷口引入每一鋪滿單層，且用PBS洗滌三次。此後，觀察細胞形態及遷移，且以固定間隔拍攝達12及24小時。在光學顯微鏡下獲得遷移至無細胞區中之細胞之數目並計數。免疫印跡及免疫螢光染色
全細胞溶解物之蛋白質印跡分析及製備先前已加以闡述14, 16, 27 。對於全細胞溶解物，將細胞在溶解緩衝液(50 mM Tris-HCl (pH7.4)、1% Triton X-100、10%甘油、150 mM NaCl、1 mM EDTA、20 μg/ml亮抑肽酶、1 mM PMSF及20 μg/ml抑肽酶)中溶解，並藉由SDS-PAGE分離。用適當抗體執行免疫印跡，之後執行化學發光檢測。對於免疫螢光染色，在抗原修復步驟之後，使組織載玻片與抗FITC標記之α-SMA及TRITC偶聯之磷酸-MARCKS之抗體反應，且用DAPI染色區分核。將細胞安裝至載玻片上，且使用螢光顯微鏡(Axiovert100型；Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)或Zeiss LSM510雷射掃描共焦顯微鏡成像系統可視化。博來黴素誘導之肺纖維化
雌性C57BL/6J小鼠(8週齡)購自Jackson Laboratory (Sacramento, CA)且如先前所述23 氣管內接受鹽水或博來黴素。簡言之，用5%異氟醚麻醉小鼠，且在第0天經由氣管內吸入投與0.005 U/g小鼠之劑量之博來黴素(APP Pharmaceuticals, Schaumburg, IL)。對照動物僅接受等體積之無菌鹽水。在早期纖維發生期中，每兩天向該等小鼠腹膜內(i.p)注射PBS或MPS肽(28mg/kg)。在博來黴素損傷之21天，處死該等小鼠並收集肺用於組織學分析。小鼠實驗由UC Davis之國際動物照護及使用委員會批准。細胞增殖及群落形成分析
將細胞以5-10 ×103 個細胞/孔之密度接種至96孔板上，且培養用於指定處理。使用MTS分析套組(Promega, Madison, WI)評估細胞增殖。將20微升合併之MTS/PMS溶液添加至每一孔中，於37℃下培育3小時，且藉由使用ELISA讀數儀在490 nm下量測吸光度。對於錐蟲藍測試，將細胞平鋪於12孔板上並用指示之化學治療劑處理。72小時後，收集附著及脫離之細胞，且然後用0.2%錐蟲藍(0.1%最終濃度)染色，且在低功率顯微鏡下使用血球計數器對錐蟲藍陽性及陰性細胞之數目進行計數。對於群落形成分析，在六孔板之每一孔中接種200個細胞。將IPF-1或IPF-2原代細胞用指示濃度之肽處理10天。使用0.001%結晶紫對群落染色，且在倒置顯微鏡下對直徑大於0.5 mm之群落之數目進行計數。試劑及抗體
杜貝克氏改良鷹氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's medium)、RPMI-1640培養基、胎牛血清及青黴素-鏈黴素購自Life Technologies Inc. (Carlsbad, CA)。Lipofect-AMINE™購自Invitrogen (Carlsbad, CA)。VECTASTAIN® Elite ABC套組(兔IgG)、VECTOR® Hematoxylin QS核覆染及DAB溶液購自VECTOR Laboratories Inc. (Burlingame, CA)。抗pSer158 MARCKS (純系EP2113Y)及抗MARCKS (純系EP1446Y)購自Abcam (Cambridge, MA)。抗pSer159/163 MARCKS (純系D13D2)、抗pSer473 AKT、抗pSer308 AKT、抗AKT、抗α-SMA、抗GAPDH及抗β-肌動蛋白抗體購自Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA)。引子
所用定量即時PCR之所有引子係如下：α-SMA正向引子5'-TCCTCATCCTCCCTTGAGAA-3' (SEQ ID NO: 60)及反向引子5'-ATGAAGGATGGCTGGAACAG-3' (SEQ ID NO: 61)；COL1A1正向引子5'-ACGAAGACATCCCACCAATCACCT-3' (SEQ ID NO: 62)及反向引子5'-AGATCACGTCATCGCACAACACCT-3' (SEQ ID NO: 63)；THY1正向引子5'-AGAGACTTGGATGAGGAG-3' (SEQ ID NO: 64)及反向引子5'-CTGAGAATGCTGGAGATG-3' (SEQ ID NO: 65)；FN1正向引子5’-TCCACAAGCGTCATGAAGAG-3’ (SEQ ID NO: 66)及反向引子5’-CTCTGAATCCTGGCATTGGT-3' (SEQ ID NO: 67)；VIM正向引子5’-AACTTCTCAGCATCACGATGAC-3’ (SEQ ID NO:  68)及反向引子5’-TTGTAGGAGTGTCGGTTGTTAAG-3' (SEQ ID NO: 69)；MARCKS正向引子5’-TTGTTGAAGAAGCCAGCATGGGTG-3’ (SEQ ID NO: 70)及反向引子5’-TTACCTTCACGTGGCCATTCTCCT-3’ (SEQ ID NO: 71)。患者肺樣本及免疫組織化學染色
IPF肺組織及非IPF正常肺樣本係自具有組織學確認之IPF之患者獲得，該等患者在UC Davis Medical Center經歷手術切除。此研究由UC Davis Health System之機構審查委員會批准。自所有患者獲得書面知情同意書。使用福馬林固定及石蠟包埋之樣本，且藉由如先前所述之免疫組織化學染色分析磷酸-MARCKS之含量1 。詳細實驗程序係自製造商(Cell Signaling, Danvers, MA)提供之石蠟免疫組織化學方案進行修改。將載玻片在二甲苯中脫蠟並在分級乙醇及水中再水合。對每一一級抗體使用抗原修復步驟(10 nM檸檬酸鈉(pH6.0)，於亞沸點溫度下)。由3%過氧化氫阻斷內源過氧化酶活性，之後封閉血清，且與適當抗體在4℃下培育過夜。根據製造商之說明書(Vector Laboratories, Burlingame, CA)，藉由使用VECTASTAIN® ABC系統實施免疫染色之檢測。設計四點染色強度評分系統以確認肺樣本中磷酸-MARCKS之相對表現；評分範圍為零(無表現)至3 (最高強度染色)，如先前所述14, 27-29 。根據染色之強度及程度將結果分為兩組：在低表現組中，在0-1%之細胞中觀察到染色(染色強度評分= 0)，在小於10%之細胞中觀察到染色(染色強度評分=1)，或在10% -25%之細胞中觀察到染色(染色強度評分= 2)；在高表現組中，染色存在於超過25%之細胞中(染色強度評分= 3)。實驗編號 2 追蹤 MARCKS-PIP3 迴路以減弱慢性肺纖維化
如實驗編號1中所述，申請人發現MARCKS表現以及MARCKS磷酸化(磷酸-MARCKS)在IPF組織及細胞中升高。此展現在活體外及活體內肺纖維化之博來黴素小鼠模型中皆觀察到此現象。MARCKS含量及活性(磷酸-MARCKS)與較高之促纖維變性活性(包括細胞增殖、細胞外基質產生、侵襲力及纖維母細胞分化)相關。在用靶向MARCKS活性之MPS肽處理後，申請人觀察到該等活性之減弱。第二個顯著發現係MARCKS經由PI3K/AKT路徑介導該等促纖維變性效應。申請人展現，該信號傳導路徑在IPF組織及細胞以及博來黴素小鼠模型中皆上調。用MPS肽靶向該等活性導致AKT活性及下游促纖維變性信號降低。經由此發生之機制係經由調控PIP2在細胞膜之可用性。在未磷酸化狀態下，MARCKS能夠在細胞膜處結合PIP2，防止PI3K蛋白將PIP2轉化為PIP3，並影響下游AKT活性。在磷酸化時，MARCKS自細胞膜釋放至胞質液中，從而釋放PIP2且允許PI3K將PIP2轉化為PIP3。為了顯示MARCKS活性及含量升高與PIP3含量升高相關，申請人對IPF肺纖維母細胞及正常肺纖維母細胞進行染色，並使其經受共焦顯微術。申請人在圖 1C 及1D 中展現，與正常肺纖維母細胞相比，PIP3及MARCKS含量在IPF肺纖維母細胞中升高，且高MARCKS含量與更高之PIP3含量相關。申請人亦展現，在圖 19 中，在IPF肺纖維母細胞中觀察到更高PIP3，且在MPS處理後PIP3含量降低。申請人獲得多個IPF肺纖維母細胞，且用PBS或100 μM MPS肽將其處理12小時，且利用抗PIP3抗體經受免疫細胞化學。申請人展現，在IPF肺纖維母細胞中觀察到較高PIP3含量，且在MPS肽處理後含量降低。
另外，申請人亦修飾MPS肽以改良肽之穩定性及功效。應注意，MPS-12042展現功效之顯著改良。申請人在肺纖維化之博來黴素小鼠模型中測試此肽與目前批准之IPF治療劑尼達尼布以及MPS肽之反應。如圖 20 中所示，MPS-12042在減弱磷酸-MARCKS及磷酸-AKT以及減少暴露於博來黴素之小鼠肺中之總體纖維化及細胞外基質沈積方面具有優異效能。
總之，該等額外之證據展現，MARCKS在調控PIP2/PI3K/PIP3/AKT活性中之作用，且MPS肽係在IPF中靶向該等活性之潛在及可行之選擇。等效內容
除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與熟習本技術所屬領域技術者通常所理解之含義相同的含義。
本文闡釋性闡述之本技術可適宜地在不存在任一或多個元件、一或多個限制之情況下實施，本文中未明確揭示。因此，例如，術語「包含」、「包括」、「含有」等應廣泛理解且不受限制。另外，本文採用之術語及表達已用作說明之術語而非限制，且無意使用該等術語及表達來排除所顯示及闡述之特徵之任何等效物或其部分，但應認識到，在所主張之本技術之範圍內可進行各種修改。
因此，應理解，本文提供之材料、方法及實例代表較佳態樣，係實例性的，且並不意欲作為對本技術之範圍之限制。
本技術已經在本文中廣泛地且一般性地予以闡述。落在一般揭示內容內之更窄種類及亞屬組群中之每一者亦形成本技術之一部分。此包括對本技術之一般闡述，條件或消極限制係將任何標的物自該屬中去除，而不管所除去材料是否在本文中具體敘述。
另外，在本技術之特徵或態樣係按照馬庫什組(Markush group)闡述的情況下，熟習此項技術者應認識到，本技術亦因此按照該馬庫什組之任何個別成員或成員亞組來闡述。
本文提及之所有出版物、專利申請案、專利及其他參考文獻之全文以引用方式明確併入，其併入程度如同每個單獨地藉由引用方式併入一般。倘若出現衝突，則以本說明書(包括定義)為準。
其他態樣在以下申請專利範圍中闡述。部分序列表 加粗之胺基酸係D-同種型。 SEQ ID NO: 40 (MPS-21010) FSFGSFSLKKFSFRKKKNKK SEQ ID NO: 41 (MPS-21020) KKKKFSFGSFSLKKFSFRKKKNKK SEQ ID NO: 42 (MPS-21026) KKKKFAFGAFALKKFAFRKKKNKK SEQ ID NO: 43 (MPS-31010) KKKNKSFFGKSKKFKKKKSF SEQ ID NO: 44 (MPS-31020) KRFLSKKKNKSFFGKSKKFKKKKSF SEQ ID NO: 45 (MPS-12042) KKKKKRF AFK KAFKL AGFAFK KNK K SEQ ID NO: 46 (MPS-12041)KK KKKRFAFKKAFKLAGFAFKKNKK SEQ ID NO: 47 (MPS-22026) KKKKKF AF GAFAL KKF AFRK KKNK K SEQ ID NO: 48 (MPS-11022) KKKKKRFSFKKSFKLSGFSFKANKK SEQ ID NO: 49 (MPS-11011) KKKKKRFSFKASFKLSGFSFKKNKK SEQ ID NO: 50 (MPS-11010) KKKKKRFSFAKSFKLSGFSFKKNKK SEQ ID NO: 51 (MPS-11006) KKKKKAFSFKKSFKLSGFSFKKNKK SEQ ID NO: 52 (MPS-11003) KKAKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKK SEQ ID NO: 53 (MPS-11001) AKKKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKK SEQ ID NO: 54 (MPS-11200) Ac-KKKKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKK-NH2 加粗之胺基酸係D-同種型。 SEQ ID NO: 55 (共有) X(K/R/A)F(A/S)FRX，其中X係任何胺基酸。 SEQ ID NO: 56 (共有) X(K/R/A)F(A/S)FRX，其中一個或兩個X係K (離胺酸)。 SEQ ID NO: 57 (WT MPS) KKKKKRFSFKKSFKLSGFSFKKNKK SEQ ID NO: 58 XXXRYAYXXAYX，其中X係任何胺基酸，且Y係疏水性胺基酸殘基。 SEQ ID NO: 59 XXXXXRYAYXXAYXLAGYAYXXNXX，其中X係任何胺基酸，且Y係疏水性胺基酸殘基。參考文獻 1 Ley B, Collard HR, King TE, Jr. Clinical course and prediction of survival in idiopathic pulmonary fibrosis. 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圖 1A 及 1B ： IPF纖維母細胞中MARCKS之上調。( 圖 1A) 使用IPF纖維母細胞概況數據集(GSE21369及GSE2052)之計算分析的圖形表示。( 圖 1B) 相對於GSE2052中之正常纖維母細胞，IPF中MARCKS之正規化表現。圖 1C 及 1D ：特發性肺纖維化(IPF)中上調之MARCKS及PIP3含量。(圖 1C )。如用抗MARCKS及抗PIP3抗體染色之三種正常纖維母細胞及三種IPF纖維母細胞中MARCKS及PIP3之表現量。在共焦雷射掃描顯微鏡下觀察Tritc偶聯之MARCKS、FITC偶聯之PIP3及核覆染色之DAPI。線狀比例尺：10 µm。(圖 1D ) MARCKS及PIP3之定量細胞螢光含量。定量PIP3及MARCKS之信號強度之校正之總細胞螢光，且用ImageJ計算。
圖 2 ：IPF纖維母細胞中未調控之MARCKS。左，如藉由即時RT-q PCR量測之MARCKS mRNA之表現(n=5；* p ＜ 0.05相對於正常-1)。右，藉由西方墨點法確認MARCKS蛋白及其磷酸化。
圖 3 ：如藉由傷口癒合分析所測定之MARCKS減弱對原代IPF纖維母細胞細胞運動性的效應(n=3)。
圖 4A-4B ：使用MPS肽之MARCKS抑制降低原代IPF纖維母細胞細胞運動性(圖 4A )及群落形成能力(圖 4B ) n =4；*，p ＜ 0.05。
圖 5 ：藉由在正常肺組織(左，n=10)及來自無治療(中間，n=15)或具有尼達尼布治療(右，n=3)之患者之IPF樣品中使用抗pSer159/163 MARCKS抗體之代表性影像。
圖 6 ：左，鹽水或博來黴素處理之肺組織中之磷酸-MARCKS (淺灰色)及α-SMA (深灰色)之代表性免疫螢光影像。DAPI (藍色)：細胞核染色，右，陽性染色細胞之定量(n=3)。
圖 7A-7B ：(圖 7A )用對照或MPS肽(100 μM)處理48小時後，在自鹽水或博來黴素處理之小鼠分離之肺纖維母細胞中磷酸-MARCKS、磷酸-AKT及α-SMA表現的西方墨點分析。(圖 7B ) MPS肽對自鹽水- (mFb-鹽水)或博來黴素處理(mFb-博來黴素)之小鼠(n=4；*，p ＜ 0.05)分離之肺纖維母細胞之細胞存活率的效應。
圖 8 ：博來黴素誘導之肺纖維化及MPS處理中之小鼠體重。
圖 9 ：左，用各種處理之小鼠肺之代表性馬森(Masson)三色染色切片。放大：4倍(頂部)及20倍(底部)。右，來自小鼠肺之馬森三色染色切片之半定量纖維化評分。纖維化評分表示為每個高倍視野之陽性染色面積之百分比。用ImageJ軟體實施每個肺6至12個高倍視野之分析。*，p ＜0.05 (n=5)。
圖 10A-10C ：(圖 10A ) MARCKS之磷酸化位點結構域(p hosphorylations ited omain，PSD)上之PIP2結合基序(SEQ ID NO: 12)。圖10A揭示如SEQ ID NO: 86之MH結構域。(圖 10B ) MPS肽與生物素標記之PIP2結合之生物層干涉分析。(圖 10C )具有PBS或MPS處理之IPF纖維母細胞中PIP3含量。* p ＜ 0.05，相對於PBS (n=3)。
圖 11A-11B ：(圖 11A )用尼達尼布(1000nM)及/或MPS (100 μM)對原代IPF纖維母細胞中之α-SMA及磷酸-AKT進行48小時之西方墨點分析。(圖 11B )在尼達尼布處理後活化PI3K/AKT途徑之提出之模型。箭頭：直接交互。
圖 12A-12E ：(圖 12A-12B ) MPS肽與尼達尼布對自兩個IPF患者分離之纖維母細胞之組合效應。將細胞分別用各種劑量之尼達尼布(62.5-2000nM)及/或MPS肽(6.25-200 µM)處理72小時。在單一(線性)或組合(線性)處理後，藉由MTT分析測定細胞存活率。(圖 12C )利用Chou及Talalay CI (組合指數)方法，使用Calcusyn軟體評估尼達尼布與MPS肽之間之治療相互作用。灰色線，在CI = 1下表示MPS肽與藥物之組合之加和效應。(圖 12D )用1 μM尼達尼布、100 μM MPS肽或1 μM尼達尼布與100 μM MPS肽之組合單獨處理細胞。48小時後，藉由錐蟲藍排除分析測定細胞存活率(n+3；*，p＜0.05)。(圖 12E )顯示選擇之多肽及其相應之序列ID號。
圖 13 ：該表顯示MPS衍生物之序列(以出現之次序分別為SEQ ID NO:48-54、40-42、45及47)。肺癌細胞中之IC50 (半數最大抑制濃度；μM)值。圖13亦顯示了各種MPS相關肽之CLUSTAL O(1.2.4)多重序列比對。以紅色/粗體標記之殘基係胺基酸之D-同種型(依出現之次序為SEQ ID NO: 57、48-54、40-42、45及47)。
圖 14 ：MPS-12042 (SEQ ID NO: 45)與已知酪胺酸激酶抑制劑(TKL)對IPF纖維母細胞之處理的比較。用各種藥物處理正常及IPF肺纖維母細胞。72小時後，使細胞經受MTT分析，且測定每一藥物之IC50。
圖 15 ：左，源自LG704之腫瘤球之RNA-seq顯示325個基因由MPS處理而顯著改變。然後用GSEA分析該等基因以確定哪些功能途徑最受MARCKS影響。右，與MARCKS活性相關之癌症-幹性標記物之熱圖。
圖 16 ：頂部，無CSE (左)及具有10% CSE (右)之非黏附3-D培養物中之腫瘤球之相差顯微照片。底部，上述細胞中mRNA表現之RT-qPCR分析。
圖 17A-17B ： ( 圖 17A) 用於評估具有野生型或PSD突變(S159/163A) MARCKS之異位表現之細胞中MARCKS磷酸化對吸煙介導之幹性的效應之球體形成分析。( 圖 17B) 上述細胞中幹性標記物之WB分析。
圖 18A-18C ： ( 圖 18A) 用於評估MPS肽對吸煙介導之幹性之抑制效應的球形成分析。( 圖 18B) 腫瘤球之數量及大小之定量。( 圖 18C) 上述腫瘤球中mRNA表現之RT-qPCR分析。
圖 19 顯示靶向磷酸-MARCKS之MARCKS模擬肽(MPS)，其結合至PIP2，且抑制PIP3之產生。用PBS或100 μM MPS肽處理多個IPF肺纖維母細胞12小時，且然後經受使用抗PIP3抗體之免疫細胞化學法。顯示代表性影像(n=3)。線狀比例尺：20 µm。
圖 20A 及 20B 顯示MPS肽在活體內對肺纖維化之阻抑效應。在以一次鹽水或博來黴素(33 μg，於50 ml鹽水中，n=5)氣管內暴露9天後以每兩天之劑量向C57BL/6小鼠腹膜內給予PBS、尼達尼布(28 mg/kg)、MPS肽(28 mg/kg)或MPS-12042 (7 mg/kg)。(圖 20A )磷酸-MARCKS (Ser159/163)及磷酸-AKT (Ser473)之代表性馬森三色及免疫組織化學染色(n = 6)。( 圖 20B) 藉由羥脯胺酸ELISA分析測定上述小鼠之左肺中之羥脯胺酸含量(平均值± SD，*p ＜ 0.05)。
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Claims (33)

  1. 一種分離之多肽，其包含選自由SEQ ID NO: 45、40-56、58或59組成之群之胺基酸序列、或其每一者之等效物。
  2. 如請求項1之分離之多肽，其中該多肽包含KKKKKRF AFK KAFKL AGFAFK KNK K (SEQ ID NO: 45)或其等效物。
  3. 如請求項1之分離之多肽，其中等效物包含與如請求項1之分離之多肽具有至少80%序列一致性的多肽或由與編碼如請求項1之多肽之分離之聚核苷酸或其補體雜交的聚核苷酸編碼之多肽，且加粗之胺基酸分別經來自SEQ ID. No. 45、40-56、58或59之多肽之視情況未修飾之D-胺基酸取代。
  4. 如請求項1之分離之多肽，其中該多肽選自SEQ ID No. 45-47、58或59之群、或其等效物。
  5. 如請求項4之分離之多肽，其中該等效物包含與如請求項3之分離之多肽具有至少80%序列一致性的多肽或由與編碼如請求項4之多肽之分離之聚核苷酸或其補體雜交的聚核苷酸編碼之多肽，且其中加粗之胺基酸經D-胺基酸取代且保留該等D-胺基酸。
  6. 如請求項1之分離之多肽，其中該分離之多肽包含不超過51個胺基酸。
  7. 如請求項1之分離之多肽，其中該分離之多肽包含不超過35個胺基酸。
  8. 如請求項1之分離之多肽，其進一步包含以下一或多者：促進該分離之多肽進入細胞之胺基酸序列、靶向多肽、或賦予該多肽穩定性之多肽。
  9. 一種分離之聚核苷酸，其編碼如請求項1之分離之多肽。
  10. 一種如請求項9之聚核苷酸之補體。
  11. 一種分離之聚核苷酸，其與如請求項9或10之聚核苷酸具有至少80%序列一致性。
  12. 一種載體，其包含如請求項9或10之分離之聚核苷酸、及視情況依可操作方式連接至該分離之聚核苷酸用於複製及/或表現之調控序列。
  13. 如請求項12之載體，其中該載體係AAV載體。
  14. 一種宿主細胞，其包含一或多種如請求項1之分離之多肽。
  15. 如請求項14之宿主細胞，其中該宿主細胞係真核細胞或原核細胞。
  16. 一種組合物，其包含載劑及一或多種如請求項1之分離之多肽。
  17. 如請求項16之組合物，其中該載劑係醫藥上可接受之載劑。
  18. 如請求項16或17之組合物，其進一步包含化學治療劑或藥物、或抗纖維變性劑或藥物。
  19. 一種治療有需要之個體中與纖維化相關之疾病或疾病症狀的方法，其包含向該個體投與有效量之一或多種如請求項1之分離之多肽或其等效物。
  20. 如請求項19之方法，其中與纖維化相關之疾病或症狀係選自以下之群：肺纖維化、特發性肺纖維化、博來黴素(bleomycin)誘導之肺纖維化、腎纖維化、肝纖維化、皮膚纖維化、纖維母細胞病灶、活化之纖維母細胞增殖、發炎或肌纖維母細胞生成，其視情況對習用治療無反應。
  21. 如請求項19或20之方法，其進一步包含投與有效量之抗纖維變性劑或藥物，其視情況係尼達尼布(nintedanib)或吡非尼酮(pirfenidone)。
  22. 一種在有需要之個體中抑制癌細胞生長、治療癌症、抑制轉移、抑制癌症幹細胞生長、抑制癌症幹性、抑制腫瘤細胞遷移、恢復抗性癌細胞對化學治療劑之敏感性中之一或多者的方法，其包含向該個體投與有效量之一或多種如請求項1之分離之多肽或其等效物。
  23. 如請求項22之方法，其中該癌細胞或癌症係淋巴瘤、白血病或實體腫瘤。
  24. 如請求項22之方法，其中該癌細胞或癌症係肺癌、肝癌、腎癌、腦癌、結腸直腸癌、胰臟癌、骨癌或喉癌。
  25. 如請求項22之方法，其進一步包含向該個體投與有效量之抗癌藥物或藥劑。
  26. 如請求項25之方法，其中該抗癌藥物或藥劑係來自由以下組成之群：酪胺酸激酶抑制劑(TKI)，例如EGFR及VEGFR TKI；鉑藥物或免疫治療劑。
  27. 一種在有需要之個體中通過血腦障壁遞送多肽或其等效物的方法，其包含向該個體投與有效量之如請求項12之載體。
  28. 如請求項19之方法，其中該投與係局部投與至所治療之組織或全身投與。
  29. 如請求項28之方法，其中局部(local)投與包含表面局部(topical)或藉由吸入療法。
  30. 如請求項28之方法，其中全身投與係選自以下之群：靜脈內、顱內、吸入療法、鼻內、陰道、直腸、經口、鞘內、真皮內、直接安裝或舌下。
  31. 如請求項19之方法，其中該個體係哺乳動物。
  32. 如請求項31之方法，其中該哺乳動物係犬、鼠類、馬、貓或人類。
  33. 一種套組，其包含一或多種如請求項1之分離之多肽或其等效物，及使用說明書。
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