CN107875148A - 鲁伯斯塔在制备预防和治疗肺纤维化和肝硬化药物中的应用及其药物制剂 - Google Patents

鲁伯斯塔在制备预防和治疗肺纤维化和肝硬化药物中的应用及其药物制剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了鲁伯斯塔(Ruboxistaurin)为有效成分可应用于预防和治疗肺纤维化以及肝硬化。本发明提供了式Ι所示化合物鲁伯斯塔在制备预防和治疗肺纤维化及肝硬化药物中的应用。本发明还提供了一种用于预防和治疗肺纤维化和肝硬化的药物，以鲁伯斯塔为活性成分，单独或加入一种或多种药用辅料制备而成；剂型优选为口服制剂、喷雾制剂或注射制剂。本发明提供了鲁伯斯塔对预防或治疗肺纤维化及肝硬化提供了一种有效的方法。

Description

鲁伯斯塔在制备预防和治疗肺纤维化和肝硬化药物中的应用 及其药物制剂
技术领域
本发明属于有机合成和化学药物领域，具体涉及鲁伯斯塔在制备预防和治疗肺纤维化和肝硬化药物中的应用及其药物制剂。
背景技术
肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是以成纤维细胞(fibroblast，FB)增殖及大量细胞外基质(ECM)聚集为特征，以弥漫性的肺泡炎、肺间质炎症和间质纤维化为组织学特点的一组疾病群，涵盖多种疾病。肺纤维化是一种进行性致死性疾病，发病率逐年增加，死亡率相当高，平均生存时间2-2.5年；目前多数疾病缺乏有效的治疗手段，预后极差。引起肺纤维化的原因是有多种因素，如职业性粉尘、放射性损伤及某些药物(博莱霉素)等。
此外还有一类不明病因的肺纤维化——特发性肺纤维化(idiopathic pulmonaryfibrosis，IPF)。IPF是一种组织学或影像学表现为寻常型间质性肺炎的病因不明、呈慢性进行性加重的间质性肺疾病。IPF好发于老年患者，50岁以下人群罕见，男性发病率高于女性。IPF与家族基因异常有关，是一种恶性进展性间质性肺炎。其发病机制涉及多种因素如持续性损伤肺泡上皮致肺泡上皮-间充质细胞(EMT)的细胞内环境失调，转移生长因子-β(TGF-β)、Wnt、Notch等信号通路激活、上皮细胞功能障碍和细胞凋亡、疤痕组织形成等导致的肺内环境稳定破坏。
目前肺纤维化发生的确切机制尚不清楚，早期防治亦未获得突破性进展。对肺纤维化的临床研究主要集中在特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)方面，因其进展快、死亡率高被世界卫生组织(WHO)列为疑难疾病，也是遍及全世界的疾病。IPF目前尚无有效的治疗药物，其预后不良，IPF患者的中位生存期为3年。由于IPF病理机制复杂，病因尚未完全阐明，临床上目前多采用药物联合治疗，如泼尼松、硫唑嘌呤和环磷酰胺联合治疗方案，大剂量N-乙酰半胱氨酸联合泼尼松和硫唑嘌呤。也有单药治疗的糖皮质激素、吡非尼酮、秋水仙碱、环孢素、干扰素(IFN)-γ1b、波生坦、依那西普等药物，但疗效一般不理想。肺纤维化晚期多引起心、肺功能衰竭而死亡，对人类危害极大，急需有效的药物予以预防或治疗。
发明内容
为克服上述在肺纤维化治疗中的技术缺陷，本发明提供了鲁伯斯塔作为主要药效成分在制备预防和治疗肺纤维化和肝硬化药物中的应用。
本发明提供了式(Ι)所示化合物鲁伯斯塔在制备预防和治疗肺纤维化及肝硬化药物中的应用。化合物鲁伯斯塔结构式(I)如下：
本发明还提供了一种用于预防和治疗肺纤维化和肝硬化的药物，以鲁伯斯塔为活性成分，单独或加入一种或多种药用辅料制备而成。
优选的，所述药物为口服制剂、喷雾制剂或注射制剂。
本发明提供了鲁伯斯塔在制备预防和治疗肺纤维化及肝硬化药物中的应用，能比较有效的预防或治疗肺纤维化及肝硬化。
附图说明
图1是对小鼠成纤维细胞采用四种不同处理方式后对胞内豆蔻酰化富丙氨酸激酶c底物MARCKS的磷酸化的Western Blot的分析结果图；
图2是小鼠成纤维细胞采用四种不同处理方式后细胞迁移率的结果图；
图3是对来源于特发性肺纤维化(IPF)患者的人成纤维细胞系(LL29)采用六种不同方式处理后对胞内豆蔻酰化富丙氨酸激酶c底物MARCKS的磷酸化的Western Blot分析结果图；
图4是对来源于特发性肺纤维化(IPF)患者的人成纤维细胞系(LL29)采用六种不同方式处理后细胞迁移率结果图；
图5是六组不同给药方式处理后小鼠的肺组织样品羟脯氨酸浓度测定结果图；
图6是药物处理组织形态学照片。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。以下实施例里，鲁伯斯塔结构式(I)如下：
实施例1：鲁伯斯塔(Ruboxistaurin)抑制小鼠成纤维细胞迁移(在体外实验中纤维化标记物)实验
在Transwell细胞迁移实验中，小鼠成纤维细胞经无血清培养饥饿一晚上，然后用含0.1％胎牛血清的DMEM培养基重新悬浮细胞，接种到24孔板的Transwell上室中，每孔接种5×104细胞。下室中加入0.1％胎牛血清的DMEM培养基并如图1示包含或不包含溶血磷脂酸(LPA，lysophosphatidic acid)或鲁伯斯塔(Ruboxistaurin，Rbx)。共有4种细胞处理方式(上图从左至右)：第一种，Transwell下室中加入含0.1％胎牛血清的DMEM培养基；第二种，Transwell下室中加入含0.1％胎牛血清及5μM的LPA的DMEM培养基；第三种，Transwell下室中加入含0.1％胎牛血清、5μM的LPA及3uM的鲁伯斯塔(Rbx)的DMEM培养基；第四种，Transwell下室中加入含0.1％胎牛血清、5μM的LPA及1uM的鲁伯斯塔(Rbx)的DMEM培养基。细胞培养4小时后对下室中的细胞进行计数，第二、三和四种细胞处理方式的细胞数分别除以第一种处理方式的细胞数即为细胞的迁移率(Cell Motility)，试验重复三次，取平均值。同时四种处理方式的细胞也通过Western Blot的方法对其胞内豆蔻酰化富丙氨酸激酶c底物MARCKS(myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate)的磷酸化进行分析。图1为对小鼠成纤维细胞采用四种不同处理方式后对胞内豆蔻酰化富丙氨酸激酶c底物MARCKS的磷酸化的Western Blot的分析结果图。图2为小鼠成纤维细胞采用四种不同处理方式后细胞迁移率的结果图。图1和图2中从左到右，细胞处理方式依次为：第一种，加入含0.1％胎牛血清的DMEM培养基，第二种，加入含0.1％胎牛血清及5μM的LPA的DMEM培养基，第三种，加入含0.1％胎牛血清、5μM的LPA及3μM的鲁伯斯塔(Rbx)的DMEM培养基，第四种，加入含0.1％胎牛血清、5μM的LPA及1μM的鲁伯斯塔(Rbx)的DMEM培养基。
从第一种和第二种细胞处理方式可以看到，细胞的迁移率在LPA处理后明显升高，并且LPA处理使得MARCKS磷酸化明显上升；但鲁伯斯塔(Rbx)处理后，LPA引起的细胞迁移率和MARCKS磷酸化明显下降(第三种和第四种细胞处理方式)，而且随着鲁伯斯塔处理量增大，则MARCKS磷酸化减少更多，细胞迁移率下降更多。证明鲁伯斯塔可以抑制成纤维细胞的迁移，从而提示其可抑制小鼠器官的纤维化。
实施例2：鲁伯斯塔(Ruboxistaurin)抑制来源于特发性肺纤维化(IPF)患者的人成纤维细胞系(LL29)迁移的实验
在Transwell细胞迁移实验中，LL29细胞经无血清培养饥饿一晚上，然后用含0.1％胎牛血清的DMEM培养基重新悬浮细胞，接种到24孔板的Transwell上室中，每孔接种5×104细胞。下室中加入0.1％胎牛血清的DMEM培养基并如上图所示包含或不包含LPA、PP242(一种mTOR抑制剂)或鲁伯斯塔(Ruboxistaurin，Rbx)。6种细胞处理方式(图4从左至右)依次为：第一种，Transwell下室中加入含0.1％胎牛血清的DMEM培养基；第二种，Transwell下室中加入含0.1％胎牛血清及2μM的LPA的DMEM培养基；第三种，Transwell下室中加入含0.1％胎牛血清及0.5μM的PP242的DMEM培养基；第四种，Transwell下室中加入含0.1％胎牛血清、2μM的LPA及0.5μM的PP242的DMEM培养基；第五种，Transwell下室中加入含0.1％胎牛血清及0.1μM的鲁伯斯塔(Rbx)的DMEM培养基；第六种，Transwell下室中加入含0.1％胎牛血清、2μM的LPA及0.1μM的鲁伯斯塔(Rbx)的DMEM培养基。细胞培养4小时后对下室中的细胞进行计数，第二、三、四、五和第六种细胞处理方式的细胞数分别除以第一种处理方式的细胞数即为细胞的迁移率(Cell Motility)，试验重复三次，取平均值。同时六种处理方式的细胞也通过Western Blot的方法对其胞内MARCKS(myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate)的磷酸化进行分析。图3为对来源于特发性肺纤维化(IPF)患者的人成纤维细胞系(LL29)采用六种不同方式处理后对胞内豆蔻酰化富丙氨酸激酶c底物MARCKS的磷酸化的Western Blot分析结果图。图4为对来源于特发性肺纤维化(IPF)患者的人成纤维细胞系(LL29)采用六种不同方式处理后细胞迁移率结果图。
从第一种和第二种细胞处理方式可以看到，细胞的迁移率在LPA处理后明显升高，并且使得MARCKS磷酸化明显上升；但鲁伯斯塔(Rbx)处理后，LPA引起的细胞迁移率和MARCKS磷酸化明显下降(第六种细胞处理方式)，这和没有LPA处理的几乎没有区别(第五种细胞处理方式)；另一种mTOR抑制剂PP242也可以和鲁伯斯塔一样，能使LPA引起的细胞迁移率和MARCKS磷酸化明显下降至无LPA处理的水平(第三和第四种细胞处理方式)。证明鲁伯斯塔可抑制人成纤维细胞的迁移，从而暗示其可抑制人器官的纤维化，进而可作为一种潜在的肺和肝纤维化的治疗药物。
实施例3：在延迟诱发小鼠肺纤维化形成模型中检测鲁伯斯塔(Ruboxistaurin)在肺纤维化形成过程中的作用
(一)实验所用试剂配制如下：
鲁伯斯塔(Ruboxistaurin)溶液和空白对照的制备：
1、用纯净水制备浓度为0.8％的水溶性羟乙基纤维素250HHX溶液(Natrosol，250HHX)；
2、加Tween80至上述高分子溶液中，Tween80的终浓度为0.5％；
3、按0.5mg/ml的浓度在上述高分子溶液中加入鲁伯斯塔(Ruboxistaurin)固体样品，并且搅拌均匀。
上述溶液在使用之前配制，并且需在一小时之内用完。
(二)实验按如下步骤操作：
1、将10周的C57BL/6小鼠每天通过鼻饲滴注50μl博来霉素，按2.5mg/kg的剂量滴注以诱发肺纤维化形成。
2、滴射7天后，小鼠分6组(图5中自左至右)通过口腔灌胃的方式进行给药试验，持续7天。每组试验4只小鼠：
第一组：为正常小鼠对照，没有博来霉素处理，仅每天通过鼻饲滴注50ul PBS。
第二组：为肺纤维化小鼠阳性对照，小鼠仅按2.5mg/kg的剂量每天通过鼻饲滴注50μl博来霉素7天。
第三组：博来霉素处理7天以后，口腔灌胃200ul PBS一周，方式为2次/天。期间依然每天通过鼻饲滴注50μl博来霉素。
第四组：博来霉素处理7天以后，口腔灌胃鲁伯斯塔一周，剂量为5mg/kg溶解于200ul PBS中，2次/天。期间依然每天通过鼻饲滴注50μl博来霉素。
第五组：博来霉素处理7天以后，口腔灌注甲苯吡啶酮(Pirfenidone，一种用于治疗肺纤维化的药物)一周，剂量为10mg/kg溶解于200ul PBS中，1次/天。期间依然每天通过鼻饲滴注50μl博来霉素。
第六组：博来霉素处理7天以后，口腔灌注鲁伯斯塔一周，剂量为5mg/kg溶解于200ul PBS中，2次/天；同时也口腔灌注甲苯吡啶酮一周，剂量为10mg/kg溶解于200ul PBS中，1次/天。期间依然每天通过鼻饲滴注50μl博来霉素。
3、检测实验中肺部样品的收集
(1)收集左肺和右肺的上叶，对其进行组织学检查(H&E，Hematoxylin and EosinStain)或者masson三色染色(Masson's trichrome staining))；
(2)收集右肺的中叶、下叶和后腔叶，对其进行羟脯氨酸测定(hydroxyprolineassays)。羟脯氨酸测定方法就是测定组织中胶原蛋白(Collagen)的含量，胶原蛋白是组织纤维化的主要成分，因而羟脯氨酸测定法可用于测定组织纤维化程度。其具体测定步骤如下：
将肺组织样品在2.0ml蒸馏水中匀质，并与125ul的浓度为50％的三氯乙酸一起在冰上孵育20分钟。然后离心样品，将颗粒与1ml浓度为12mol/L的盐酸混合并在110℃下烘烤14-18小时，直到样品干燥。然后，将样品重新悬浮在2ml去离子水中，在室温下孵育72小时，间歇涡流。随后取少量样品(200ul)与1ml含有氯胺-t(chloramine-T)、0.5M乙酸钠和10％异丙醇的溶液，在室温下孵育20分钟。最后，加入1ml埃利希试剂，并在65℃孵育15分钟。样品温度恢复到室温后，测定这些样品和标准物(反-4-羟基-l-脯氨酸)在550nm的吸光度，根据羟脯氨酸浓度标准曲线计算肺组织样品的羟脯氨酸浓度。
结果如图5所示，图5为六组不同给药方式处理后小鼠的肺组织样品羟脯氨酸浓度测定结果图。由图5可见，小鼠在经过博来霉素处理一周后(第二组)和没有处理的相比(第一组)其肺部羟脯氨酸含量明显上升，表明肺部出现了大量的纤维化；博来霉素处理后的小鼠再经口腔灌注鲁伯斯塔处理(第四组)、甲苯吡啶酮处理(第五组)或者鲁伯斯塔和甲苯吡啶酮同时处理(第六组)和对照相比(第三组，仅博来霉素处理)其肺部羟脯氨酸含量明显下降，表明鲁伯斯塔和甲苯吡啶酮一样能够显著抑制小鼠肺纤维化的形成。图6是药物处理组织形态学照片。从图6中可以看到，经博来霉素处理1周后小鼠肺部开始出现纤维化，处理2周后，小鼠肺部出现了大量的纤维，肺泡明显减少；小鼠经博来霉素处理2周但同时也口腔灌注鲁伯斯塔或甲苯吡啶酮，其肺部纤维明显减少，仍然有大量的肺泡存在，进一步表明鲁伯斯塔和甲苯吡啶酮一样能够显著抑制小鼠肺纤维化的形成。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (3)

1.式Ι所示化合物鲁伯斯塔在制备预防和治疗肺纤维化和肝硬化药物中的应用
2.一种用于预防和治疗肺纤维化和肝硬化的药物，其特征在于，以鲁伯斯塔为活性成分，单独或加入一种或多种药用辅料制备而成。
3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，所述药物为口服制剂、喷雾制剂或注射制剂。
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