TW202045732A

TW202045732A - 一種基於晶片引物表面萃取的基因高通量合成方法

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Publication number: TW202045732A
Application number: TW108140278A
Authority: TW
Inventors: 王建鵬; 范玉峰; 吳政憲
Original assignee: 大陸商南京金斯瑞生物科技有限公司
Priority date: 2018-11-06
Filing date: 2019-11-06
Publication date: 2020-12-16
Also published as: CN113166803A; CN113166803B; WO2020094040A1

Abstract

本發明提供一種基於晶片引物表面萃取的基因高通量合成方法，該方法將引物按群集分類後合成在晶片的固定區域並進行切割，隨後使用取樣機將不同群集的引物溶解並轉移至96孔盤中進行基因合成。

Description

一種基於晶片引物表面萃取的基因高通量合成方法

本發明關於基因合成領域，具體關於晶片引物合成以及基於該晶片引物的基因高通量自動化合成方法。

基因合成通常係基於聚合酶鏈式組裝(PCA)以及聚合酶鏈式反應(PCR)，將預先設計好的引物序列按照兩兩首尾互補配對的方法拼接成目的基因序列。常規基因合成中的引物係藉由柱合成的方式，並將引物逐條混合。由於引物的合成規模(25nmol)遠大於基因合成時所需引物的量(50pmol)，因此常規基因合成具有通量低、成本高、操作複雜等缺點。為克服上述缺點而發展出高通量基因合成方法，該方法依賴於高通量引物合成平台，該平台可將上萬條甚至上百萬條引物合成在面積僅為幾平方厘米至幾十平方厘米的晶片上，每條引物的合成規模在fmol级别，極大地降低引物的合成成本。隨後利用諸如特異性PCR等方式將引物分成若干個文庫，每個文庫中包含合成某一目的基因所需的所有引物序列，在利用諸如酶切的方式除去引物上的標簽序列後，將引物文庫逐個組裝成相應的目的基因(Nature,2004,1050-1054)。該高通量基因合成方法，雖然極大地提升通量及降低成本，仍然存在以下問題：1)整體操作流程較為複雜，需要將引物先合併再分組，並經過繁瑣的酶切、純化等操作，自動化程度較低。2)引物利用率低，突變率高。由於需在每條引物兩端加上PCR結合位點及酶切位點等序列，因此用於基因合成的引物序列通常僅占引物全長的50%甚至更低，另一方面引物合成長度越長則突變率越高，導致最终基因合成的突變率較高。3)特異性低以及交叉污染風險。所有的引物在經過切割後均混在一起，不同PCR引物序列之間的特異性差别將會極大地影響PCR效率，因此存在較大的交叉污染的可能。

前述高通量基因合成方法，雖然極大地提升通量及降低成本，仍然存在以下問題：1)整體操作流程較為複雜，需要將引物先合併再分組，並經過繁瑣的酶切、純化等操作，自動化程度較低。2)引物利用率低，突變率高。由於需在每條引物兩端加上PCR結合位點及酶切位點等序列，因此用於基因合成的引物序列通常僅占引物全長的50%甚至更低，另一方面引物合成長度越長則突變率越高，導致最终基因合成的突變率較高。3)特異性低以及交叉污染風險。所有的引物在經過切割後均混在一起，不同PCR引物序列之間的特異性差别將會極大地影響PCR效率，因此存在較大的交叉污染的可能。

本發明一方面提供一種基於晶片引物表面萃取的基因高通量合成方法，前述方法包含將引物按群集分類後合成在晶片的不同區域，氨解方法切割晶片上的引物群集，隨後使用液體轉移工作站將不同群集的引物溶解，並將溶解後的各引物群集分别轉移至適於基因合成的獨立的反應容器中，在適於基因合成的條件下進行基因合成反應，收獲合成的目的基因片段。

在部分實施方案中，前述按群集分類的引物為編碼複數個目的基因片段的引物群集，其中每個引物群集包含編碼同一個目的基因片段的全部引物。在部分實施方案中，前述不同引物群集分别在晶片的不同區域內合成，前述不同區域之間留有空白區域。在部分實施方案中，前述空白區域上合成複數個疏水基團。

在部分實施方案中，在晶片上合成引物時使每個引物的3’端額外添加至少1個可藉由氨解切割的連接臂及至少3個dT作為保護鹼基。在部分實施方案中，在前述晶片上合成引物時使引物的3’端額外添加2個、3個、4個或5個可藉由氨解切割的連接臂及3個、4個、5個或6個dT作為保護鹼基。在部分更理想的實施方案中，在前述晶片上合成引物時使引物的3’端額外添加2個可藉由氨解切割的連接臂及5個dT作為保護鹼基。前述連接臂選自任何氨解後可以使引物產生3’自由烴基的結構，理想為基於亞磷醯胺結構並能提供3’端自由羥基的結構，更理想為琥珀醯己胺亞磷醯胺。在部分實施方案中，前述氨解方法切割的引物含有3'自由羥基。

在部分實施方案中，前述氨解方法係用不含水的胺化劑氨解；理想地，前述胺化劑選自氨氣、一甲胺，更理想為一甲胺。在部分實施方案中，前述氨解在充滿胺化劑的高壓反應容器中進行。在部分實施方案中，前述氨解係在25℃~120℃以及20~120psi的條件下氨解15分鐘~4小時；理想地，前述氨解係在60℃~90℃以及20~60psi的條件下氨解1~4小時；更理想地，前述氨解係在80℃以及40psi的條件下氨解3小時。

在部分實施方案中，前述基因高通量合成方法中液體轉移工作站為取樣機。在部分實施方案中，前述液體轉移工作站為Biodot AD 1500取樣品台。在一個實施方案中，將氨解後的晶片置於取樣平台上，進行位置校正後，轉移溶解引物的溶劑。

在部分實施方案中，引物溶解使用的溶劑選自可進行PCR反應的溶劑，理想為TE溶液或蒸餾水，更理想為蒸餾水。在部分實施方案中，前述引物溶解包含利用取樣機向每個引物群集中滴加10~1000nL的溶劑如蒸餾水，靜置0.5~3分鐘後使用針頭吹吸使其溶解。理想地，前述引物溶解包含利用取樣機向每個引物群集中滴加50nL的蒸餾水，靜置1分鐘後使用針頭吹吸使其溶解。

在部分實施方案中，前述適於基因合成的獨立的反應容器為多孔盤的孔，可選自96孔盤、24孔盤、384孔盤。在部分實施方案中，前述轉移至適於基因合成的獨立反應容器中的步驟包含將液體轉移工作站針頭高度調整至晶片表面並吸取晶片內溶解液轉移至多孔盤內。在部分實施方案中，在吸取晶片內溶解液轉移至多孔盤內之後，進一步藉由清洗程序對取樣針頭進行清洗，接著重複引物溶解及轉移步驟，直至所有引物群集被轉移完全。

在部分實施方案中，前述基因合成步驟包含向每個獨立反應容器中加入基因合成反應液及/或目的基因片段的F/R引物，進行合成反應。在部分實施方案中，前述基因合成反應溶液選自PCA反應液及PCR反應液。在部分實施方案中，前述基因合成步驟包含，向每個反應容器中加入PCA反應液，使引物群集進行組裝反應，接著加入PCR反應液及目的基因片段的F/R引物，進行PCR反應。

本發明的另一方面提供一種基於晶片引物表面萃取的基因高通量合成方法，包含以下步驟：

1)在晶片上合成編碼複數個目的基因片段的引物群集，其中每個引物群集包含編碼同一個目的基因片段的全部引物，編碼不同目的基因片段的引物群集分别在晶片的不同區域合成；

2)將合成完成後的晶片進行氨解以將引物從晶片上切割下來，並使切割下來的引物含有3'自由羥基；

3)向每個引物群集滴加溶劑，使該引物群集中的引物充分溶解，收集每個溶解的引物群集並分别轉移至獨立的反應容器中；

4)向反應容器中加入基因合成反應液，進行基因合成；

5)回收反應產物，得到複數個目的基因片段。

在部分實施方案中，前述步驟1)的前述不同區域之間留有空白區域。在另一實施方案中，在前述空白區域上合成複數個疏水基團。

在部分實施方案中，前述步驟1)在晶片上合成引物時，各引物的3’端額外添加至少1個可藉由氨解切割的連接臂及至少3個dT作為保護鹼基。在部分實施方案中，使各引物的3’端額外添加2個、3 個、4個或5個可藉由氨解切割的連接臂及3個、4個、5個或6個dT作為保護鹼基。在部分實施方案中，在前述晶片上合成引物時使引物的3’端額外添加2個可藉由氨解切割的連接臂及5個dT作為保護鹼基。前述連接臂選自任何可以使引物產生3’自由羥基的基團，理想為基於亞磷醯胺結構並能提供3’端自由羥基的結構，更理想為琥珀醯己胺亞磷醯胺。在部分實施方案中，前述氨解方法切割的引物含有3'自由羥基。

在部分實施方案中，前述步驟2)包含用不含水的胺化劑氨解；理想地，前述胺化劑選自氨氣、一甲胺；更理想為一甲胺。在部分實施方案中，前述氨解在充滿胺化劑的高壓反應容器中進行。在部分實施方案中，前述氨解係在25℃~120℃以及20~120psi的條件下氨解15分鐘~4小時；理想地，前述氨解係在60℃~90℃以及20~60psi的條件下氨解1~4小時；更理想地，前述氨解係在80℃以及40psi的條件下氨解3小時。

在部分實施方案中，前述步驟3)中引物溶解的溶劑選自可進行PCR反應的溶劑；理想為TE溶液或蒸餾水；更理想為蒸餾水。在部分具體實施方案中，前述引物溶解包含利用取樣機向每個引物群集中滴加10~1000nL的蒸餾水，靜置0.5~3分鐘後使用針頭吹吸使其溶解。理想地，前述引物溶解包含利用取樣機向每個引物群集中滴加50nL的蒸餾水，靜置1分鐘後使用針頭吹吸使其溶解。

在部分實施方案中，前述步驟3)中獨立的反應容器為多孔盤的孔，多孔盤可選自96孔盤、24孔盤、384孔盤。在部分實施方案中，前述轉移至獨立的反應容器的步驟包含將液體轉移工作站如取樣機的針頭高度調整至晶片表面並吸取晶片內溶解液轉移至多孔盤內。在部分實施方案中，在吸取晶片內溶解液轉移至多孔盤內之後，進一步包含使用清洗程序對取樣針頭進行清洗後重複步驟3)的操作直至所有引物群集被轉移完全。

在部分實施方案中，前述步驟4)中的基因合成反應液選自PCA反應液及PCR反應液。在部分實施方案中，選擇性地，前述步驟4)在加入基因反應液前將反應容器中的溶劑抽乾。在部分實施方案中，前述基因合成包含將反應容器中的溶劑抽乾，向每個反應容器中加入PCA反應液，使引物群集進行組裝反應，接著加入PCR反應液及目的基因片段的F/R引物，進行PCR反應。

本發明另一方面提供一種用於基因高通量合成的引物群集的合成方法，前述方法包含將引物按群集分類，將不同引物群集合成在晶片的不同區域，氨解方法切割晶片上的引物群集，隨後使用液體轉移工作站將不同群集的引物溶解，收集每個溶解的引物群集。

在部分實施方案中，前述每個引物群集包含編碼同一個目的基因片段的全部引物，前述晶片上包含合成編碼複數個目的基因片段的引物群集，編碼不同目的基因片段的引物群集分别在晶片的不同區域合成，前述不同區域之間留有空白區域。理想地，在前述空白區域上合成複數個疏水基團。

在部分實施方案中，在晶片上合成引物時使各引物的3’端額外添加至少1個可藉由氨解切割的連接臂及至少3個dT作為保護鹼基。在部分實施方案中，使各引物的3’端額外添加2個、3個、4個或5 個可藉由氨解切割的連接臂及3個、4個、5個或6個dT作為保護鹼基。在部分實施方案中，在前述晶片上合成引物時使引物的3’端額外添加2個可藉由氨解切割的連接臂及5個dT作為保護鹼基。前述連接臂選自任何可以使引物產生3’自由羥基的結構，理想為基於亞磷醯胺結構並能提供3’端自由羥基的結構，更理想為琥珀醯己胺亞磷醯胺。在部分實施方案中，前述氨解方法切割的引物含有3'自由羥基。

在部分實施方案中，氨解方法包含用不含水的胺化劑氨解；理想地，前述胺化劑選自氨氣、一甲胺；更理想為一甲胺。在部分實施方案中，前述氨解在充滿胺化劑的高壓反應容器中進行。在部分實施方案中，前述氨解係在25℃~120℃以及20~120psi的條件下氨解15分鐘~4小時；理想地，前述氨解係在60℃~90℃以及20~60psi的條件下氨解1~4小時；更理想地，前述氨解係在80℃以及40psi的條件下氨解3小時。

在部分實施方案中，前述合成引物群集的方法中前述液體轉移工作站為取樣機。在部分實施方案中，液體轉移工作站為Biodot AD 1500取樣品台。在部分實施方案中，將氨解後的晶片置於Biodot AD 1500平台，進行位置校正後，轉移溶解引物的溶劑。

在部分實施方案中，前述合成引物群集的方法中，前述引物溶解的溶劑為選自可進行PCR反應的溶劑；理想為TE溶液或蒸餾水；更理想為蒸餾水。在部分具體實施方案中，前述引物溶解包含利用取樣機向每個引物群集中滴加10~1000nL的的蒸餾水，靜置0.5~3分鐘後使用針頭吹吸使其溶解。理想地，前述引物溶解包含利用取樣機向每個引物群集中滴加50nL的蒸餾水，靜置1分鐘後使用針頭吹吸使其溶解。

在部分實施方案中，前述合成引物群集的方法進一步包含將每個溶解的引物群集轉移至獨立的反應容器內，前述獨立的反應容器為多孔盤的孔，多孔盤可選自96孔盤、24孔盤、384孔盤。在部分實施方案中，轉移至獨立的反應容器的步驟包含將取樣機針頭高度調整至晶片表面並吸取晶片內溶解液轉移至多孔盤內。在部分實施方案中，前述轉移至獨立的反應容器步驟進一步包含使用清洗程序對取樣針頭進行清洗後重複引物溶解及轉移操作直至所有引物群集被轉移完全。

本發明提供一種用於基因高通量合成的引物群集的合成方法，包含如下步驟：

1)在晶片上合成編碼複數個目的基因片段的引物群集，其中編碼每個目的基因片段的引物群集包含編碼該目的基因片段的全部引物，編碼不同目的基因片段的引物群集分别在晶片的不同固定區域合成，前述不同區域之間留有空白區域；

3)向每個引物群集滴加溶劑，使該引物群集中的引物充分溶解，收集每個溶解的引物群集。

在部分實施方案中，前述步驟1)在晶片上合成引物時使引物的3’端額外添加至少1個可藉由氨解切割的連接臂及至少3個dT作為保護鹼基。在部分實施方案中，使各引物的3’端額外添加2個、3個、4個或5個可藉由氨解切割的連接臂及3個、4個、5個或6個dT作為保護鹼基。在部分實施方案中，在前述晶片上合成引物時使引物的3’端額外添加2個可藉由氨解切割的連接臂及5個dT作為保護鹼基。前述連接臂選自任何可以使引物產生3’自由羥基的結構，理想為基於亞磷醯胺結構並能提供3’端自由羥基的結構；更理想為琥珀醯己胺亞磷醯胺。

在部分實施方案中，前述步驟3)的溶劑選自可進行PCR反應的溶劑；理想為TE溶液或蒸餾水；更理想為蒸餾水。在部分具體實施方案中，前述引物溶解包含利用取樣機向每個引物群集中滴加10~1000nL的蒸餾水，靜置0.5~3分鐘後使用針頭吹吸使其溶解。理想地，前述引物溶解包含利用取樣機向每個引物群集中滴加50nL的蒸餾水，靜置1分鐘後使用針頭吹吸使其溶解。

在部分實施方案中，前述合成引物群集的方法進一步包含將每個溶解的引物群集轉移至獨立的反應容器內，前述獨立的反應容器為多孔盤的孔，多孔盤可選自96孔盤、24孔盤、384孔盤。在部分實施方案中，前述轉移至獨立的反應容器的步驟包含將取樣機針頭高度調整至晶片表面並吸取晶片內溶解液轉移至多孔盤內。在部分實施方案中，前述轉移至獨立的反應容器步驟進一步包含使用清洗程序對取樣針頭進行清洗後重複溶解及轉移操作直至所有引物群集被轉移完全。

上述方法合成的引物群集可用於基因的高通量合成，包含將合成的引物群集轉移至獨立的反應容器，在適於基因合成的條件下進行基因合成，收獲合成的基因片段。

本發明之功效在於：

首先，由於整體策略的改進，本發明可以極大地縮短所需合成的晶片引物的長度，這一方面縮短基因合成的週期，另一方面也降低基因合成的突變率。其次，本發明徹底改變基於晶片引物的基因高通量合成中先混合再分組的方案，簡化流程並提升自動化的可行性。最後，藉由避免使用PCR進行分組的方式，本發明提升特異性，降低交叉污染的可能。

藉由以下詳細的描述並結合圖式將更充分地理解本發明，其中相似的元件以相似的方式編號。

【圖1】表示晶片合成區域引物排佈示意圖。

【圖2】表示晶片表面引物萃取示意圖。

【圖3】晶片排佈及其放大圖。

【圖4】Gene_Frag 4定序結果圖。

【圖5】Gene_Frag 13定序結果圖。

【圖6】表示基因合成後目的基因電泳膠圖。

本發明在所有引物的3’端加上可切割的連接臂以及保護鹼基以確保經過氨解後的引物有3’自由羥基。並將按目的基因分組後的引物合成在晶片上的特定區域，區域之間留有一定空白區域以避免萃取時產生交叉污染(如圖1)。為了進一步降低產生交叉污染的可能，可在空白區域合成一系列疏水基團以提高表面能。合成好的晶片需使用氣體氨解的方式，將引物從晶片表面切割下來，並保留在相應的合成位置。隨後使用取樣機往各區域的引物群集滴加適量的蒸餾水以溶解引物(如圖2)，並將溶解有引物的蒸餾水轉移至96孔盤中進行相應的基因合成。為了提高引物轉移效率，可在萃取時使用反覆吹吸的方式增強溶解效果。在不同引物群集轉移的間隔中需對轉移針頭進行清洗以避免交叉污染。

在晶片上合成引物的方法係本領域已知的，例如可採用噴墨打印法或光活化的方法。

本發明中，引物群集係指編碼同一個目的基因片段的全部引物的集合，不同的引物群集編碼不同的目的基因片段。此處的引物也可以被稱為短核酸片段，係指彼此之間部分重疊並覆蓋整個目的基因片段的單鏈短核酸片段，此等短核酸片段互為引物及模板，在存在聚合酶的條件下可以藉由多輪變性、退火、延伸循環，最终獲得目的基因。本發明中，一個引物群集中的全部引物例如可以藉由聚合酶鏈式組裝(PCA)合成目的基因片段。

在進行引物合成時，每條引物可以在其所屬的區域中被合成多遍，例如被合成3~8遍。對於一條引物而言，「被合成多遍」的含義係指在該區域中的複數個位置上均合成該條引物。

本發明中，目的基因片段可以係為任何目的合成的基因片段。例如，前述目的基因片段可以係一個長度為幾百bp的完整的短基因。前述目的基因片段亦可以係一個較長基因的一部分，例如，對於長基因，在合成時，可以將其拆分為複數個短基因片段，此等短基因片段即可以係本發明的目的基因片段，將每一個短基因片段再拆分為複數個引物，利用本發明的方法合成每一個短基因片段，接著再把此等短基因片段組裝成完整的長基因。

本發明中，不同的引物群集在晶片的不同區域合成。晶片的不同區域可以藉由任何適當的方式劃分，例如可以確定每個區域的行及列。各區域的形狀及大小可以根據具體需要確定。各區域之間可以留出空白區域，目的在於避免在萃取時產生交叉污染，空白區域的大小可由所屬技術領域中具有通常知識者根據情况確定。空白區域上亦可以合成一系列疏水基團以提高表面能，從而進一步避免在萃取時產生交叉污染。

本發明中，為了進行後續的基因合成，需要使引物群集在從晶片上被切割下來以後具有3'自由羥基，可以藉由各種可能的方法並使切割下來的引物含有3'自由羥基，部分這樣的方式係本領域已知的，例如可以藉由氨解的方式。理想地，可以在合成時使引物的3'端額外添加至少1個可藉由氨解切割的連接臂及至少3個dT作為保護鹼基，當進行氨解時可將連接臂及dT切割下來，在引物3'端形成自由羥基。在部分實施方案中，使引物的3'端額外添加2個、3個、4個或5個可藉由氨解切割的連接臂及3個、4個、5個或6個dT作為保護鹼基。在部分實施方案中，使引物的3'端額外添加2個可藉由氨解切割的連接臂及5個dT作為保護鹼基。前述連接臂可以係任何可以在氨解後使引物產生3'自由羥基的結構，理想為基於亞磷醯胺結構並可以提供3’端自由羥基的結構，如琥珀醯己胺亞磷醯胺。本發明中，前述的「連接臂」的目的係用於藉由氨解在引物3’形成自由羥基。引物的3’端在連接臂外額外添加至少3個dT的目的係作為保護鹼基。

本發明中，氨解的方法係本領域習知的，特别適用於本發明的例如可以係不含水的胺化劑，例如氨氣、一甲胺等。氨解例如可以在充滿胺化劑的高壓反應容器中進行。在部分實施方案中，氨解係在25℃~120℃以及20~120psi的條件下氨解15分鐘~4小時；理想地，前述氨解係在60℃~90℃以及20~60psi的條件下氨解1~4小時；更理想地，前述氨解係在80℃以及40psi的條件下氨解3小時。

psi係本領域習知的壓力單位，根據本領域的習知技術，1psi=6.895kPa。

本發明中，可以使用任何可溶解並轉移晶片上合成的引物的液體轉移工作站，例如可以使用取樣機。在部分實施方案中，前述液體轉移工作站為Biodot AD 1500取樣品台。在部分實施方案中，可以將前述氨解後的晶片置於取樣平台上，進行位置校正後，轉移用於溶解引物的溶劑。

本發明中，用於溶解引物的溶劑可以係任何可用於進行PCR反應的溶劑，例如TE溶液或蒸餾水，理想蒸餾水。在部分實施方案中，溶解引物的過程包含利用液體轉移工作站(例如取樣機)向每個引物群集中滴加10~1000nL的溶劑(例如蒸餾水)，靜置0.5~3分鐘後使用針頭吹吸使其溶解。理想地，向每個引物群集中滴加50nL的蒸餾水，靜置1分鐘後使用針頭吹吸使其溶解。

可以藉由本領域習知的方法使晶片上的引物充分溶解，例如使用針頭吹吸1~3次(例如2次)使引物充分溶解。在部分實施方案中，例如可使用Biodot取樣機向每個引物群集加入蒸餾水後靜置一段時間(例如1分鐘)，接著用針頭吹吸1~3次(例如2次)。

本發明中，適於基因合成的獨立的反應容器可以係多孔盤的孔或其他任何適合的獨立反應容器。多孔盤可選自96孔盤、24孔盤、384孔盤。在部分體實施方案中，將溶解的引物群集轉移至獨立的反應容器的步驟包含將液體轉移工作站針頭高度調整至晶片表面並吸取晶片內溶解液轉移至多孔盤的孔內。在部分實施方案中，可以先轉移部分引物群集，隨後清洗取樣針頭後重複轉移其餘的引物群集，例如可以先轉移部分引物群集，接著使用清洗程序對取樣針頭進行清洗後重複轉移操作直至所有引物群集被轉移完全。

本發明中，基因合成反應可以包含向每個孔中加入基因合成反應液及/或目的基因片段的F/R引物，進行PCR反應。基因合成反應溶液可以選自PCA反應液及PCR反應液。例如可以先加入PCA反應液，使引物群集進行組裝反應，接著再加入PCR反應液及目的基因片段的F/R引物，進行PCR反應。在進行基因合成反應之前，可以先將反應容器中的溶劑抽乾，接著加入基因合成反應液及/或目的基因片段的F/R引物，或者也可以直接向反應容器中加入基因合成反應液及/或目的基因片段的F/R引物。本發明中，聚合酶鏈式組裝(polymerase chain assembly,PCA)係一種基於聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)原理的方法，係指使彼此之間部分重疊並覆蓋整個目的基因的單鏈寡核苷酸互為引物及模板，在存在聚合酶的條件下藉由多輪變性、退火、延伸循環，最终獲得目的基因。在部分情况下，藉由聚合酶鏈式組裝獲得的產物可以使用能與該產物序列兩端相結合的引物進行擴增，例如藉由PCR反應進行擴增。

本發明中，目的基因片段的F/R引物係指用於擴增整個目的基因片段的正向及反向引物。

本發明中，「抽乾」係指去除反應容器中的溶劑，同時保留溶質即引物群集的操作。可以藉由本領域熟知的各種方式實現抽乾溶劑，例如可以藉由減壓乾燥將反應容器中的溶劑抽乾。

以下藉由實施例，並結合圖式，對本發明的技術手段作進一步詳細的說明，但本發明不限於以下的實施例。

實施例1 19個目的基因的合成

本實施例將利用該平台進行19個目的基因的合成，其長度如下表1所示：

以其中兩個片段Gene_Frag 4、Gene_Frag 13為例進行詳細說明。

Gene_Frag 4目的基因的合成

Gene_Frag 4的目的基因序列(SEQ ID NO.1)如下：

將其拆分成相應的引物，並在3’端加上可切割連接臂以及dT保護鹼基後的引物序列如表2所示(其中W代表可切割連接臂，為琥珀醯己胺亞磷醯胺，其中Gene_Frag 4_F以及Gene_Frag 4_R係使用25nmol合成柱合成的常規引物)：

使用CustomArray公司的B3P合成儀，按預設位置在晶片上進行Gene_Frag 4_1至Gene_Frag 4_16的引物合成。晶片的排佈見圖3中的放大圖，對應於microarray scanner(8*11)上合成的引物排佈如表3所示。

待合成結束後，將晶片置於高壓氣相氨解儀中，使用一甲胺作為氨解氣體，在80℃以及40psi的條件下氨解3小時，待晶片冷卻後將其取出並轉移至Biodot AD 1500取樣機標準玻片支架。

利用Biodot取樣機向每個引物群集滴加50nL蒸餾水，靜置一分鐘後將Biodot取樣機針頭高度調整至晶片表面並吸取60nL體積後轉移至96孔盤內，滴加1μL蒸餾水。使用清洗程序對取樣針頭進行清洗後重複上述操作直至所有引物群集被轉移完全。

配製PCA反應體系：5*HF buffer 10μL,dNTPs 1μL,NEB-Phusion 0.5μL,BSA(20mg/mL)5μL,H2O 33.5μL。以及PCR反應體系：5*HF buffer 2μL,dNTPs 0.2μL,NEB-Phusion 0.1μL,BSA(20mg/mL)1μL,Gene_Frag 4_F(10μM)以及Gene_Frag 4_R(10μM)各0.3μL,H2O 3.6μL。

將96孔盤內的樣品中溶劑藉由真空離心濃縮儀(Concentrator plus，廠家eppendorf)減壓抽乾後，向每個含有引物群集的孔中加入2.5μL PCA反應混合液並轉移至384孔中進行PCA反應，反應條件為：98℃ 3min,35個循環(98℃ 10s,58℃ 10s,72℃ 20s)，72℃ 5min。隨後將2.5μLPCA產物轉移至7.5μL PCR反應體系內進行PCR反應，反應條件為：98℃ 3min,40個循環(98℃ 10s,64℃ 10s,72℃ 35s)，72℃ 5min。

將上述反應液(即PCR產物)轉化至Top10感受態細胞，按照化學感受態細胞轉化步驟進行操作。復甦後取100μL菌液塗布在Kan抗性顯色平板上。放置37℃培養箱培養過夜。

利用菌檢引物對顯色平板上的白斑進行菌檢，挑取陽性選殖10個進行定序並分析定序結果，Gene_Frag 4定序結果如圖4所示。

Gene_Frag 13目的基因合成

Gene_Frag 13的目的基因序列(SEQ ID NO.20)如下：

將其拆分成相應的引物，並在3’端加上可切割連接臂以及dT保護鹼基後的引物序列如表4所示(其中W代表可切割連接臂，為琥珀醯己胺亞磷醯胺，其中Gene_Frag 13_F以及Gene_Frag 13_R係使用25nmol合成柱合成的常規引物)：

使用CustomArray公司的B3P合成儀，按預設位置在晶片上進行Gene_Frag 13_1至Gene_Frag 13_12的引物序列合成。晶片的排佈見圖3中的放大圖，對應於microarray scanner(8*11)上合成的引物排佈如表5所示。

待合成結束後，將晶片置於高壓氣相氨解儀中，使用一甲胺作為氨解氣體，在80℃以及40psi的條件下氨解3小時，待晶片冷卻後將其取出並轉移至Biodot AD 1500取樣機標準玻片支架上。

配製PCA反應體系：5*HF buffer 10μL,dNTPs 1μL,NEB- Phusion 0.5μL,BSA(20mg/mL)5μL,H₂O 33.5μL。以及PCR反應體系：5*HF buffer 2μL,dNTPs 0.2μL,NEB-Phusion 0.1μL,BSA(20mg/mL)1μL,Gene_Frag 13_F(10μM)以及Gene_Frag 13_R(10μM)各0.3μL,H₂O 3.6μL。

利用菌檢引物對顯色平板上的白斑進行菌檢，挑取陽性選殖10個進行定序並分析定序結果，Gene_Frag 13定序結果如圖5所示。

所有19個目的基因合成後進行電泳，電泳圖見圖6。

實施例2 晶片引物表面萃取基因合成方法與傳統方法的比較

傳統方法利用CustomArray合成儀進行高通量基因合成，參考Eroshenko N,Kosuri S,Marblestone AH，Gene Assembly from Chip-Synthesized Oligonucleotides.Curr Protoc Chem Biol.4：1-17,March 2012中的基因合成方法，在合成步驟、氨解及純化步驟、萃取步驟、擴增步驟上比較傳統方法與實施例1方法的具體步驟的時間，如表6所示：

本發明的實施方式並不限於上述實施例所記載，在不偏離本發明的精神及範圍的情况下，所屬技術領域中具有通常知識者可以在形式及細節上對本發明做出各種改變及改進，而這些均被認為落入本發明的保護範圍。

				                                    SEQUENCE LISTING
				<110>  大陸商南京金斯瑞生物科技有限公司 (Nanjingjinsirui Science & Technology Biology Corp.)
				<120>  一種基於晶片引物表面萃取的基因高通量合成方法
				<130>  1
				<150> CN 201811313909.7
				<151> 2018-11-06
				<160>  34    
				<170>  PatentIn version 3.5
				<210>  1
				<211>  732
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 4
				<400>  1
				atgaggagcc ggaagctcac aggtgcagtg cggtcttcag cgcgcttgaa agcacgaagt       60
				tgttcggcag ccaggttggc ctctgcccag gaagttgctg gttccacgtc tgccaagaca      120
				gcatgtctga cttcctcatc ccacaaagcc acagacacgc gaacgtccaa gaagttcaaa      180
				tgtgacaaag gacatcttgt gaagtcagaa ttacagaagc ttgtccctaa gaatgacagc      240
				gcttctttgc caaaagtgac acctgagacc ccttgtgaaa atgagtttgc tgaaggcagt      300
				gccttgcttc caggcagcga ggctggcgtt tctgtgcagc agggggctgc aagtcttcct      360
				ctcggtggct gcagagttgt gagtgactct cgcttagcaa agactagaga tggcctgtcc      420
				gtgccaaaac acagtgccgg gtccggagca gaagaatcca acagcagctc cactgtgcag      480
				aagcagaatg agccagggct acagacagag gatgtgcaga agccaccact tcagatggac      540
				aacagcgtct ttctagatga cgacagcaat cagccaatgc ccgtgagccg gttctttgga      600
				aacgttgagc tcatgcagga cctcccacct gcgtcttcat cttgtccttc aatgagcaga      660
				cgagagttca gaaaaatgca tttcagagcc aaagatgatg atgatgacga cgacgatgat      720
				gcagaaatgt ag                                                          732
				<210>  2
				<211>  72
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 4_1
				<400>  2
				atgaggagcc ggaagctcac aggtgcagtg cggtcttcag cgcgcttgaa agcacgaagt       60
				tgttcwwttt tt                                                           72
				<210>  3
				<211>  71
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 4_2
				<400>  3
				acgtggaacc agcaacttcc tgggcagagg ccaacctggc tgccgaacaa cttcgtgctt       60
				tcaawwtttt t                                                            71
				<210>  4
				<211>  67
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 4_3
				<400>  4
				gttgctggtt ccacgtctgc caagacagca tgtctgactt cctcatccca caaagccaca       60
				wwttttt                                                                 67
				<210>  5
				<211>  71
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 4_4
				<400>  5
				acaagatgtc ctttgtcaca tttgaacttc ttggacgttc gcgtgtctgt ggctttgtgg       60
				gatgwwtttt t                                                            71
				<210>  6
				<211>  68
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 4_5
				<400>  6
				tgtgacaaag gacatcttgt gaagtcagaa ttacagaagc ttgtccctaa gaatgacagc       60
				gwwttttt                                                                68
				<210>  7
				<211>  62
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 4_6
				<400>  7
				cacaaggggt ctcaggtgtc acttttggca aagaagcgct gtcattctta gggacwwttt       60
				tt                                                                      62
				<210>  8
				<211>  70
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 4_7
				<400>  8
				acctgagacc ccttgtgaaa atgagtttgc tgaaggcagt gccttgcttc caggcagcga       60
				ggcwwttttt                                                              70
				<210>  9
				<211>  72
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 4_9
				<400>  9
				gcagccaccg agaggaagac ttgcagcccc ctgctgcaca gaaacgccag cctcgctgcc       60
				tggaawwttt tt                                                           72
				<210>  10
				<211>  72
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 4_9
				<400>  10
				tcctctcggt ggctgcagag ttgtgagtga ctctcgctta gcaaagacta gagatggcct       60
				gtccgwwttt tt                                                           72
				<210>  11
				<211>  62
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 4_10
				<400>  11
				tggattcttc tgctccggac ccggcactgt gttttggcac ggacaggcca tctctwwttt       60
				tt                                                                      62
				<210>  12
				<211>  69
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 4_11
				<400>  12
				ccggagcaga agaatccaac agcagctcca ctgtgcagaa gcagaatgag ccagggctac       60
				agwwttttt                                                               69
				<210>  13
				<211>  67
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 4_12
				<400>  13
				acgctgttgt ccatctgaag tggtggcttc tgcacatcct ctgtctgtag ccctggctca       60
				wwttttt                                                                 67
				<210>  14
				<211>  71
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 4_13
				<400>  14
				cagatggaca acagcgtctt tctagatgac gacagcaatc agccaatgcc cgtgagccgg       60
				ttctwwtttt t                                                            71
				<210>  15
				<211>  69
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 4_14
				<400>  15
				gatgaagacg caggtgggag gtcctgcatg agctcaacgt ttccaaagaa ccggctcacg       60
				ggwwttttt                                                               69
				<210>  16
				<211>  72
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 4_15
				<400>  16
				ccacctgcgt cttcatcttg tccttcaatg agcagacgag agttcagaaa aatgcatttc       60
				agagcwwttt tt                                                           72
				<210>  17
				<211>  71
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 4_16
				<400>  17
				ctacatttct gcatcatcgt cgtcgtcatc atcatcatct ttggctctga aatgcatttt       60
				tctgwwtttt t                                                            71
				<210>  18
				<211>  65
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 4_F
				<400>  18
				atgaggagcc ggaagctcac aggtgcagtg cggtcttcag cgcgcttgaa agcacgaagt       60
				tgttc                                                                   65
				<210>  19
				<211>  64
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 4_R
				<400>  19
				ctacatttct gcatcatcgt cgtcgtcatc atcatcatct ttggctctga aatgcatttt       60
				tctg                                                                    64
				<210>  20
				<211>  500
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 13
				<400>  20
				ccgagctcgg atccgccacc atatgggcat ggagggtctt ctccagaact ccactaactt       60
				cgtcctcaca ggcctcatca cccatcctgc cttccccggg cttctctttg caatagtctt      120
				ctccatcttt gtggtggcta taacagccaa cttggtcatg attctgctca tccacatgga      180
				ctcccgcctc cacacaccca tgtacttctt gctcagccag ctctccatca tggataccat      240
				ctacatctgt atcactgtcc ccaagatgct ccaggacctc ctgtccaagg acaagaccat      300
				ttccttcctg ggctgtgcag ttcagatctt cctctacctg accctgattg gaggggaatt      360
				cttcctgctg ggtctcatgg cctatgaccg ctatgtggct gtgtgcaacc ctctacggta      420
				ccctctcctc atgaaccgca gggtttgctt attcatggtg gtcggctcct gggttggtgg      480
				ttccttggat gggttcatgc                                                  500
				<210>  21
				<211>  72
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 13_1
				<400>  21
				ccgagctcgg atccgccacc atatgggcat ggagggtctt ctccagaact ccactaactt       60
				cgtccwwttt tt                                                           72
				<210>  22
				<211>  66
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 13_2
				<400>  22
				gaagcccggg gaaggcagga tgggtgatga ggcctgtgag gacgaagtta gtggagttcw       60
				wttttt                                                                  66
				<210>  23
				<211>  66
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 13_3
				<400>  23
				gccttccccg ggcttctctt tgcaatagtc ttctccatct ttgtggtggc tataacagcw       60
				wttttt                                                                  66
				<210>  24
				<211>  64
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 13_4
				<400>  24
				cgggagtcca tgtggatgag cagaatcatg accaagttgg ctgttatagc caccacawwt       60
				tttt                                                                    64
				<210>  25
				<211>  62
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 13_5
				<400>  25
				tccacatgga ctcccgcctc cacacaccca tgtacttctt gctcagccag ctctcwwttt       60
				tt                                                                      62
				<210>  26
				<211>  67
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 13_6
				<400>  26
				gcatcttggg gacagtgata cagatgtaga tggtatccat gatggagagc tggctgagca       60
				wwttttt                                                                 67
				<210>  27
				<211>  62
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 13_7
				<400>  27
				cactgtcccc aagatgctcc aggacctcct gtccaaggac aagaccattt ccttcwwttt       60
				tt                                                                      62
				<210>  28
				<211>  66
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 13_8
				<400>  28
				cagggtcagg tagaggaaga tctgaactgc acagcccagg aaggaaatgg tcttgtcctw       60
				wttttt                                                                  66
				<210>  29
				<211>  62
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 13_9
				<400>  29
				ttcctctacc tgaccctgat tggaggggaa ttcttcctgc tgggtctcat ggcctwwttt       60
				tt                                                                      62
				<210>  30
				<211>  63
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 13_10
				<400>  30
				gggtaccgta gagggttgca cacagccaca tagcggtcat aggccatgag acccagwwtt       60
				ttt                                                                     63
				<210>  31
				<211>  65
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 13_11
				<400>  31
				aaccctctac ggtaccctct cctcatgaac cgcagggttt gcttattcat ggtggtcgww       60
				ttttt                                                                   65
				<210>  32
				<211>  62
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 13_12
				<400>  32
				gcatgaaccc atccaaggaa ccaccaaccc aggagccgac caccatgaat aagcawwttt       60
				tt                                                                      62
				<210>  33
				<211>  65
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 13_F
				<400>  33
				ccgagctcgg atccgccacc atatgggcat ggagggtctt ctccagaact ccactaactt       60
				cgtcc                                                                   65
				<210>  34
				<211>  55
				<212>  DNA
				<213>  人工序列
				<220>
				<223>  Gene_Frag 13_R
				<400>  34
				gcatgaaccc atccaaggaa ccaccaaccc aggagccgac caccatgaat aagca            55

Claims

一種基於晶片引物表面萃取的基因高通量合成方法，其特徵係其包含將引物按群集分類後合成在晶片的不同區域，氨解方法切割晶片上的引物群集，隨後使用液體轉移工作站將不同群集的引物溶解並將溶解後的各引物群集分别轉移至適於基因合成的獨立反應容器中，在適於基因合成的條件下進行基因合成反應，收獲合成的目的基因片段。
如申請專利範圍第1項所記載之方法，其中，前述按群集分類的引物為編碼複數個目的基因片段的引物群集，其中，每個引物群集包含編碼同一個目的基因片段的全部引物。
如申請專利範圍第1或2項所記載之方法，其中，不同引物群集分别在晶片的不同區域內合成，前述不同區域之間留有空白區域；理想地，前述空白區域上合成複數個疏水基團。
如申請專利範圍第1至3項中任一項所記載之方法，其中，在晶片上合成引物時使每個引物的3’端額外添加至少1個可藉由氨解切割的連接臂及至少3個dT作為保護鹼基，理想為額外添加2個可藉由氨解切割的連接臂及5個dT作為保護鹼基；前述連接臂選自任何氨解後可以使引物產生3’自由羥基的結構，理想為基於亞磷醯胺結構並能提供3’端自由羥基的結構，更理想為琥珀醯己胺亞磷醯胺。
如申請專利範圍第1至4項中任一項所記載之方法，其中，前述氨解方法係用不含水的胺化劑氨解；理想地，前述胺化劑選自氨氣、一甲胺，更理想為一甲胺。
如申請專利範圍第5項所記載之方法，其中，前述氨解在充滿胺化劑的高壓反應容器中進行。
如申請專利範圍第5或6項所記載之方法，其中，前述氨解係在25℃~120℃以及20~120psi的條件下氨解15分鐘~4小時；理想地，前述氨解係在80℃以及40psi的條件下氨解3小時。
如申請專利範圍第1至7項中任一項所記載之方法，其中，前述液體轉移工作站為取樣機，前述引物溶解使用的溶劑選自可進行PCR反應的溶劑，理想為TE溶液或蒸餾水，更理想為蒸餾水。
如申請專利範圍第8項所記載之方法，其中，前述引物溶解包含利用取樣機向每個引物群集中滴加10~1000nL的溶劑，靜置0.5~3分鐘後使用針頭吹吸使其溶解；理想地，前述引物溶解包含利用取樣機向每個引物群集中滴加50nL的蒸餾水，靜置1分鐘後使用針頭吹吸使其溶解。
如申請專利範圍第1至9項中任一項所記載之方法，其中，前述適於基因合成的獨立反應容器為多孔盤的孔，理想為96孔盤的孔；前述轉移至適於基因合成的獨立反應容器中的步驟包含將液體轉移工作站的針頭高度調整至晶片表面並吸取晶片內溶解液轉移至多孔盤內；理想地，在吸取晶片內溶解液轉移至多孔盤內之後，進一步藉由清洗程序對取樣針頭進行清洗，接著重複引物溶解及轉移步驟，直至所有引物群集被轉移完全。
如申請專利範圍第1至10項中任一項所記載之方法，其中，前述在適於基因合成的條件下進行基因合成反應包含向每個獨立反應容器中加入基因合成反應液及/或目的基因片段的F/R引物，進行合成反應；前述基因合成反應溶液選自PCA反應液及PCR反應液。
如申請專利範圍第1至11項中任一項所記載之方法，其中，前述基因合成反應包含向每個反應容器中加入PCA反應液，使引物群集進行組裝反應，接著加入PCR反應液及目的基因片段的F/R引物，進行PCR反應。
一種基於晶片引物表面萃取的基因高通量合成方法，其特徵係包含以下步驟：

1)在晶片上合成編碼複數個目的基因片段的引物群集，其中每個引物群集包含編碼同一個目的基因片段的全部引物，編碼不同目的基因片段的引物群集分别在晶片的不同區域合成；

2)將合成完成後的晶片進行氨解以將引物從晶片上切割下來，並使切割下來的引物含有3'自由羥基；

3)向每個引物群集滴加溶劑，使該引物群集中的引物充分溶解，收集每個溶解的引物群集並分别轉移至獨立的反應容器中；

4)在反應容器中加入基因合成反應液，進行基因合成；

5)回收反應產物，得到複數個目的基因片段。
如申請專利範圍第13項所記載之方法，其中，前述步驟1)的前述不同區域之間留有空白區域；理想地，前述在前述空白區域上合成複數個疏水基團。
如申請專利範圍第13或14項所記載之方法，其中，前述步驟1)中在晶片上合成引物時，各引物的3’端額外添加至少1個可藉由氨解切割的連接臂及至少3個dT作為保護鹼基，理想為額外添加2個可藉由氨解切割的連接臂及5個dT作為保護鹼基；前述連接臂選自任何氨解後可以使引物產生3’自由羥基的結構，理想為基於亞磷醯胺結構並能提供3’端自由羥基的結構，更理想為琥珀醯己胺亞磷醯胺。
如申請專利範圍第13至15項中任一項所記載之方法，其中，前述步驟2)包含用不含水的胺化劑氨解；理想地，前述胺化劑選自氨氣、一甲胺，更理想為一甲胺。
如申請專利範圍第16項所記載之方法，其中，前述氨解在充滿胺化劑的高壓反應容器中進行。
如申請專利範圍第16或17項所記載之方法，其中，前述氨解係在25℃~120℃以及20~120psi的條件下氨解15分鐘~4小時；理想地，前述氨解係在80℃以及40psi的條件下氨解3小時。
如申請專利範圍第13至18項中任一項所記載之方法，其中，前述步驟3)中溶劑選自可進行PCR反應的溶劑，理想為TE溶液或蒸餾水，更理想為蒸餾水；前述引物溶解包含利用取樣機向每個引物群集中滴加10~1000nL的溶劑，靜置0.5~3分鐘後使用針頭吹吸使其溶解；理想地，前述引物溶解包含利用取樣機向每個引物群集中滴加50nL的蒸餾水，靜置1分鐘後使用針頭吹吸使其溶解。
如申請專利範圍第13至19項中任一項所記載之方法，其中，前述步驟3)中獨立的反應容器為多孔盤的孔，理想為96孔盤的孔。
如申請專利範圍第13至20項中任一項所記載之方法，其中，步驟3)中前述轉移至獨立的反應容器中的步驟包含將液體轉移工作站的針頭高度調整至晶片表面並吸取晶片內溶解液轉移至多孔盤內。
如申請專利範圍第21項所記載之方法，其中，在吸取晶片內溶解液轉移至多孔盤內之後，進一步藉由清洗程序對取樣針頭進行清洗，接著重複步驟3)，直至所有引物群集被轉移完全。
如申請專利範圍第13至22項中任一項所記載之方法，其中，前述步驟4)中的基因合成反應液選自PCA反應液及PCR反應液；前述基因合成包含向每個反應容器中加入配好的PCA反應液，使引物群集進行組裝反應，接著加入PCR反應液及目的基因片段的F/R引物，進行PCR反應。
一種用於基因高通量合成的引物群集的合成方法，其特徵係其包含：將引物按群集分類，將不同引物群集合成在晶片的不同區域，氨解方法切割晶片上的引物群集，隨後使用液體轉移工作站將不同群集的引物溶解，收集每個溶解的引物群集。
如申請專利範圍第24項所記載之方法，其中，前述每個引物群集包含編碼同一個目的基因片段的全部引物，前述晶片上包含合成編碼複數個目的基因片段的引物群集，編碼不同目的基因片段的引物群集分别在晶片的不同區域合成，前述不同區域之間留有空白區域；理想地，在前述空白區域上合成複數個疏水基團。
如申請專利範圍第24或25項所記載之方法，其中，在晶片上合成引物時使每個引物的3’端額外添加至少1個可藉由氨解切割的連接臂及至少3個dT作為保護鹼基，理想為額外添加2個可藉由氨解切割的連接臂及5個dT作為保護鹼基；前述連接臂選自任何氨解後可以使引物產生3’自由羥基的結構，理想為基於亞磷醯胺結構並能提供3’端自由羥基的結構，更理想為琥珀醯己胺亞磷醯胺。
如申請專利範圍第24至26項中任一項所記載之方法，其中，前述引物溶解的溶劑為蒸餾水；前述引物溶解包含利用取樣機向每個引物群集中滴加10~1000nL的蒸餾水，靜置0.5~3分鐘後使用針頭吹吸使其溶解；理想地，前述引物溶解包含利用取樣機向每個引物群集中滴加50nL的蒸餾水，靜置1分鐘後使用針頭吹吸使其溶解。
如申請專利範圍第24至27項中任一項所記載之方法，其中，前述合成方法進一步包含將每個溶解的引物群集轉移至獨立的反應容器內；理想地，前述獨立的反應容器為多孔盤的孔。
如申請專利範圍第28項所記載之方法，其中，前述轉移至獨立的反應容器的步驟包含將取樣機針頭高度調整至晶片表面並吸取晶片內溶解液轉移至多孔盤內；理想地，在吸取晶片內溶解液轉移至多孔盤內之後，進一步藉由清洗程序對取樣針頭進行清洗，接著重複引物溶解及轉移步驟，直至所有引物群集被轉移完全。
一種用於基因高通量合成的引物群集的合成方法，其特徵係其包含以下步驟：

1)在晶片上合成編碼複數個目的基因片段的引物群集，其中編碼每個目的基因片段的引物群集包含編碼該目的基因片段的全部引物，編碼不同目的基因片段的引物群集分别在晶片的不同固定區域合成，前述不同區域之間留有空白區域；

2)將合成完成後的晶片進行氨解以將引物從晶片上切割下來，並使切割下來的引物含有3'自由羥基；

3)向每個引物群集滴加溶劑，使前述引物群集中的引物充分溶解，收集每個溶解的引物群集。