TW202034017A - 落射頂錐殼層光超解析系統及顯微鏡 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種落射頂錐殼層光超解析系統及落射螢光顯微鏡。落射頂錐殼層光超解析系統包含：發光元件、透鏡組及物鏡。發光元件發出的激發光通過透鏡組後折射為環形光，並聚焦至物鏡的後物鏡後焦平面，物鏡將環形光聚焦形成環形光錐並聚焦於樣本位置，環形光錐具有固定之厚度。此外，激發及取像皆使用同一物鏡，進而達成落射螢光顯微鏡。

Description

落射頂錐殼層光超解析系統及顯微鏡
本發明涉及一種落射頂錐殼層光超解析系統，特別涉及一種產生環形光錐的落射頂錐殼層光超解析系統及包含其的落射螢光顯微鏡。
現今對生物組織的研究中，透過光學顯微鏡來觀察是不可或缺的技術，一般的光學顯微鏡須將樣本製成薄片，再以光源輔助使其便於觀察。而在將樣本製成薄片的時候，不可避免的會對組織產生破壞，甚至使樣本原本應具有的特徵消失。
然而，當要觀察的樣本具有厚度時，反射光僅能觀察表面，而穿透光又難以穿透樣本，造成對樣本觀察或是攝影上的困難。為了解決這個問題，應用螢光的螢光顯微術應運而生。此種螢光顯微術即是透過對目標組織接合螢光蛋白，或是直接對組織以螢光染劑染色以進行後續觀察。
接著，含有螢光物質的樣品在受到激發光的照射下產生螢光，使得觀察者收集這些螢光訊號後，得到樣品的螢光影像；但隨著照射的時間以及強度，會讓可發光的螢光分子數量逐漸減低，最終，因螢光分子用罄而無法觀察螢光影像。
在傳統樣品激發的方式(垂直穿透)下觀察厚樣品，由於不論是在觀察/取像樣品的哪一層(垂直深度的位置)，都可能同時地造成非觀察層(即，非影像焦平面)螢光分子的耗竭，以至於越後面取像層的訊號越衰弱，甚至與雜訊無異。
為解決上述問題，在現有技術中，已知使用雙鏡頭層光顯微術(light-sheet)及雙光子顯微術(two-photon)來避免非焦光平面的螢光分子消耗，但雙鏡頭層光顯微術為了同時只激發整個成像平面的螢光分子，需要較複雜的光路設計，而後者使用的雙光子雷射原售價昂貴，在實際應用上會產生不小的限制。
為解決上述問題，本發明之目的在於提供一種落射頂錐殼層光超解析系統，在能夠針對特定取像平面的螢光物質進行激發，得到具有深度資訊的影像並能建構出立體圖像之餘，還能簡化構造，降低裝置成本。
根據本發明之一目的，提供了一種落射頂錐殼層光超解析系統，包含：發光元件，產生第一激發光；透鏡組，由複數個透鏡組成，透鏡組包含第一透鏡以及第二透鏡；其中第一透鏡係為錐透鏡，第一透鏡位於發光元件與第二透鏡之間，第一透鏡與第二透鏡隔有第一預定距離，第一透鏡之錐面係背向發光元件，並將第一激發光折射為厚度固定的環形激發光；第二透鏡將環形激發光聚焦至物鏡後焦平面；分色濾鏡，用於反射環型激發光；以及物鏡，係為凸透鏡，位於物鏡後焦平面與樣本之間，將聚焦的環形激發光擴張至樣本寬度，並將環型激發光聚焦於樣本位置；其中環形激發光聚焦於樣本位置前的能量低於一激發閾值，而聚焦於樣本位置時的能量總和高於激發閾值。
較佳地，落射頂錐殼層光超解析系統可進一步包含放大鏡片組，位於發光元件與透鏡組之間，由一對凸透鏡組成，將第一激發光從第一寬度擴張至第二寬度，並將第一激發光準直。放大鏡片組
較佳地，落射頂錐殼層光超解析系統的第二透鏡係可包含錐透鏡及微透鏡陣列，錐透鏡之錐面面向第一透鏡並將環型激發光準直後照射至微透鏡陣列，微透鏡陣列將該環形激發光以微透鏡陣列中的複數個微凸透鏡分別聚焦，構成複數個第二激發光，複數個第二激發光係呈環形排列，且複數個第二激發光的焦點位於物鏡後焦平面。。
較佳地，微透鏡陣列為最密堆積或棋盤堆積。
較佳地，第二透鏡係為凸透鏡。
較佳地，發光元件可包含一濾色片，改變第一激發光之波長。
本發明還提供了一種落射螢光顯微鏡，包含上述的落射頂錐殼層光超解析系統；影像擷取裝置，係擷取樣本所發出之螢光；載物台，係位於樣本位置且承載樣本；調節輪，係調節載物台的高度；以及目鏡，係用於成像至影像擷取裝置。
承上所述，依本發明之落射頂錐殼層光超解析系統，其可具有一或多個下述優點：
(1)透過本發明之落射頂錐殼層光超解析系統，可以對有厚度的樣本進行螢光激發。
(2)在激發樣本中的螢光物質時，可以僅激發特定區域的螢光物質，使其他區域的螢光物質仍保留螢光活性。
(3)可以透過激發不同深度的樣本以得到立體的樣本資訊，並且可以透過簡單的結構來降低裝置的成本。
(4)可透過本發明之落射螢光顯微鏡，使用更高數值孔徑的物鏡，以達成更佳的影像解析度和品質。
為利瞭解本發明之技術特徵、內容與優點及其所能達成之功效，茲將本發明配合附圖，並以實施例之表達形式詳細說明如下，而其中所使用之圖式，其主旨僅為示意及輔助說明書之用，未必為本發明實施後之真實比例與精準配置，故不應就所附之圖式的比例與配置關係解讀、侷限本發明於實際實施上的權利範圍。
以下將參照相關圖式，說明依本發明之落射頂錐殼層光超解析系統的實施例，為使便於理解，下述實施例中之相同元件係以相同之符號標示來說明。
請參照第1圖，第1圖係為依據本發明實施例之落射頂錐殼層光超解析系統應用於共軛焦螢光顯微鏡之結構示意圖。落射顯微鏡係指激發光通過物鏡照射在樣本上，且樣本被激發後所產生的被激發光透過相同物鏡放大，以透過目鏡觀察之顯微鏡。本發明實施例之落射頂錐殼層光超解析系統1可包含：發光元件10、透鏡組20、微透鏡陣列30、物鏡40、放大鏡片組50、目鏡60、影像擷取裝置70以及分色濾鏡80。
發光元件10發出具有第一寬度200的第一激發光100，為控制環形光錐的厚度，可在第一激發光100的光路上設置放大鏡片組50，放大鏡片組50係可由第一凸透鏡51、第二凸透鏡52組成，透過第一凸透鏡51將第一激發光100折射後，藉由第二凸透鏡52將擴張至第二寬度201後的第一激發光100準直以得到具有第二寬度201的第一激發光。透鏡組20係可由錐面彼此相對的第一錐透鏡21與第二錐透鏡22組成，當第一激發光100通過第一錐透鏡21時，將被折射為厚度固定的環形激發光101，並由第二錐透鏡22將環形激發光101準直，第一錐透鏡21與第二錐透鏡22之間具有第一預定距離。
準直後的環形激發光101接著通過微透鏡陣列30，此微透鏡陣列30可為棋盤堆積或最密堆積。棋盤堆積係為微透鏡在平面上以彼此垂直的兩方向上延伸排列，每個微透鏡與四個微透鏡相鄰接，構成類似棋盤的方正結構；最密堆積係為每個微透鏡與六個微透鏡相鄰接，構成類似蜂巢的六邊形結構，在平面上能夠堆積最多微透鏡的排列方式。微透鏡陣列30可以將平行的光源分別聚焦為構成複數個第二激發光102，且複數個第二激發光102呈環形排列，並且分別聚焦於物鏡後焦平面400上，且此時複數個第二激發光102所構成的環形的直徑與準直後的環形激發光101直徑相同。
接著，呈環形排列的複數個第二激發光102通過凸透鏡的物鏡40時，將會被折射成具有樣本寬度202的圓錐狀激發光，並且聚焦於樣本位置300。此處透過微透鏡陣列30聚焦而改變光的行進路線，並且配合物鏡的凸透鏡特性，可以使圓錐狀激發光的樣本寬度202維持固定，而不會在光路的不同位置出現不同寬度，可以確保在樣本位置300處的光束不會發生形變，進而可以確保在樣本位置300處的激發光強度足以激發其中的螢光物質。在激發光抵達樣本位置300後，此處的樣本中的螢光物質將會被超過閾值的激發光激發而開始發出螢光。
在包含依據本發明之落射頂錐殼層光超解析系統1的落射螢光顯微鏡中，可包含目鏡60及影像擷取裝置70，樣本被激發後所產生的螢光可以經由目鏡60成像後以影像擷取裝置70擷取，以進行後續的影像處理。此螢光顯微鏡還可包含承載樣本的載物台以及調節樣本位置的調節輪。此螢光顯微鏡可為一般的顯微鏡，亦可為共軛焦顯微鏡，可在目鏡60與影像擷取裝置70之間進一步包含具有針孔的檔板，以阻擋非來自物鏡後焦平面的雜訊光進入影像擷取裝置70，藉此提升所得到的影像的清晰度並得到更高的對比度。在另一個實施例中，可以透過調節第一預定距離來改變環形激發光101的直徑，環形激發光101直徑的變化會影響環形激發光101通過微透鏡陣列30的位置，進而改變後續聚焦後樣本位置300的位置。例如當第一預定距離縮短時，環形激發光101的直徑變小，在通過微透鏡陣列30聚焦時所產生的複數個第二激發光102所構成的環形的直徑也會變小，在經過物鏡40後聚焦的樣本位置300將會離物鏡40更近。
在此種落射螢光顯微鏡中，由於可以選擇數值孔徑更高的物鏡來作為激發和取像的鏡頭，所成像的物理解析度便可以顯著的提升。在作為隨機定域光學重組超解析顯微鏡時，此一鏡頭的特性可以顯著的提升定域點的精確度和重組影像的解析度。
此外，發光元件10還可以包含濾色片以提供適合激發各種不同螢光物質的光源，亦可以直接具有多種光源。在其他的實施例中，發光元件10僅發出單種激發光，而在激發光的光路上設置濾色片以達成對應不同螢光物質的效果，例如設置於發光元件10與放大鏡片組50之間、放大鏡片組50與透鏡組20之間、透鏡組20與微透鏡陣列30之間、微透鏡陣列30與物鏡40之間，或任何適當的位置。
接著參考第2圖，第2圖係為依據本發明另一實施例之落射頂錐殼層光超解析制系統2之結構示意圖。 在此實施例中，可以利用一個第三凸透鏡123取代第二錐透鏡22以及微透鏡陣列30；為利用第一錐透鏡121和第三凸透鏡123在適當間距下做出環形光直徑約略等於物鏡140的後孔徑且環形光徑不隨距離變化，而在第三凸透鏡123的後聚焦面上聚焦成細線的環形激發光1104。而此時第三凸透鏡123距離物鏡140的距離將必須為第三凸透鏡123的焦距，且環形光的直徑也需小於等於物鏡140的後孔徑。相較於原本實施例中，第二錐透鏡122和物鏡140之間的距離除了機構限制外，其他則基本上不受限制。
接著以實際例子對本發明之落射頂錐殼層光超解析系統應用於共軛焦螢光顯微鏡，並以具有厚度的樣本(果蠅眼)說明本發明之效果。
首先將樣本以螢光染劑進行染色，接著分別以傳統激發光束以及包含本發明之落射頂錐殼層光超解析系統對樣本進行螢光激發，之後再以共軛焦螢光顯微鏡對樣本取像，以觀察螢光物質消耗的狀況。為使本發明之環形光錐效果更為明顯，在激發時將激發光強度控制為可激發螢光物質之強度。
第3圖係為傳統螢光顯微鏡的光路的特性，如第3圖(A)所示，當激發光束106以圓柱狀通過具有厚度的樣本301時，在激發光束106對樣本中的螢光物質在對應於第3圖(A)的高度所施加的激發光強度如第3圖(B)所示，不管在任意高度中激發光強度均高於閾值。第3圖(C)的上圖為以XY平面為剖面的示意圖，下圖則為以XZ平面為剖面的示意圖，當激發光束106通過時，在Z軸上的任意XY剖面皆可以看到如第3圖(C)的上圖的被激發樣本分布呈圓形(白色處)，而在XZ平面上可以看到如第3圖(C)的下圖所示的被激發樣本分布呈長條型(白色處)，即是整個圓柱狀的光柱所經過的樣本中的螢光物質皆會被激發。
第4圖為以傳統激發光束激發後，再將整體樣本激發觀察的照片，在第4圖(A)、(D)中可以看出樣本中間有黯淡的圓形痕跡(箭頭處所示)，即為第3圖(C)的上圖所示的XY剖面的實際例子。而在第4圖(B)、(C)中則可以看到黯淡的長條型痕跡(箭頭處所示)，即為第3圖(C)的下圖所示的XZ剖面的實際例子。此即為傳統激發光束將路徑中樣本的螢光物質消耗殆盡的證據。
第5圖是本發明的落射頂錐殼層光超解析系統的光路的特性，第5圖(A)為其所產生的環形光錐107通過有厚度的樣本302時的示意圖，對應於第5圖(A)的樣本在不同高度所通過的激發光量如第5圖(B)所示，由於單一的激發光的激發光強度均低於閾值而不會激發樣本中的螢光物質，僅有在樣本位置處(激發光交會處)會超出閾值，而因此激發樣本中的螢光物質。因此，以本發明的落射頂錐殼層光超解析系統所產生的環形光錐的路徑(白色處)會如第5圖(C)所示呈現X型，並且僅有在環形光錐所交會的樣本位置(圓圈斜紋處)的樣本會被激發。
第6圖為使用本發明的落射頂錐殼層光超解析系統的激發光激發後再將整體樣本激發觀察的照片(為使效果清楚，此處使用高於閾值的激發光強度)。第6圖(A)及(D)可見到類似環形的圓形痕跡(箭頭處)，為較樣本位置略下方(遠離物鏡)的XY剖面處的照片，顯示樣本302在經過本發明的環形光錐激發後，在其下方的樣本仍具有未被激發的螢光物質可供激發。在第6圖(B)中的光源方向為從右側向左側，第6圖(C)中的光源方向為從下側向上側，其中隱約可見有X字型的黯淡痕跡(箭頭處)，此X字型即為環形光錐在XZ剖面所經過的路徑，顯示了本發明的激發光束調製系統確實可以產生環形光錐，並且聚焦於所需的位置。
如此，透過本發明之落射頂錐殼層光超解析系統可以對 取像平面的樣本進行螢光激發，透過影像擷取裝置擷取影像和Z軸調節機構上升或下降後，即能透過影像軟體拼湊出指定樣本部位的立體影像。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。
1、2:落射頂錐殼層光超解析系統 10、110:發光元件 100、1100:第一激發光 101、1101:環形激發光 102:第二激發光 1104:聚焦的環形激發光 106:激發光束 107:環形光錐 20、120:透鏡組 21、121:第一錐透鏡 22:第二錐透鏡 123:第三凸透鏡 200、1200:第一寬度 201、1201:第二寬度 202:樣本寬度 30:微透鏡陣列 300、1300:樣本位置 301、302:樣本 40、140:物鏡後焦平面 50、150:放大鏡片組 51、151:第一凸透鏡 52、152:第二凸透鏡 60、160:目鏡 70、170:影像擷取裝置 80、180:分色濾鏡
第1圖係為依據本發明實施例之落射頂錐殼層光超解析制系統之結構示意圖。
第2圖係為依據本發明另一實施例之落射頂錐殼層光超解析制系統之結構示意圖。
第3圖係為傳統螢光顯微鏡的光路的特性，其中(A)為傳統螢光顯微鏡照射樣本時之光路示意圖、(B)為對應於(A)中光路在不同高度的激發光強度的示意圖、(C)為光路在XY、XZ剖面的的示意圖。
第4圖係為傳統螢光顯微鏡之光路施用於樣本後殘餘的螢光的照片。
第5圖係為依據本發明之落射頂錐殼層光超解析系統之光路的特性，其中(A)為本發明的落射頂錐殼層光超解析系統照射樣本時的示意圖、(B)為對應於(A)在光路中不同高度的激發光強度的示意圖、(C)為光路在XZ剖面的示意圖。
第6圖係為依據本發明之落射頂錐殼層光超解析系統之光路施用於樣本後殘餘的螢光的照片。
1:落射頂錐殼層光超解析系統
10:發光元件
100:第一激發光
101:環形激發光
102:第二激發光
20:透鏡組
21:第一錐透鏡
22:第二錐透鏡
200:第一寬度
201:第二寬度
202:樣本寬度
30:微透鏡陣列
300:樣本位置
400:物鏡後焦平面
40:物鏡
50:放大鏡片組
51:第一凸透鏡
52:第二凸透鏡
60:目鏡
70:影像擷取裝置
80:分色濾鏡

Claims (7)

  1. 一種落射頂錐殼層光超解析系統，包含： 一發光元件，產生一第一激發光； 一透鏡組，由複數個透鏡組成，該透鏡組包含一第一透鏡以及一第二透鏡；其中該第一透鏡係為錐透鏡，該第一透鏡位於該發光元件與該第二透鏡之間，該第一透鏡與該第二透鏡隔有一第一預定距離，該第一透鏡之錐面係背向該發光元件，並將該第一激發光折射為厚度固定的一環形激發光；該第二透鏡將該環形激發光聚焦至一物鏡後焦平面； 一分色濾鏡，用於反射該環型激發光；以及 一物鏡，係為凸透鏡，位於該物鏡後焦平面與一樣本之間，將聚焦的該環形激發光擴張至一樣本寬度，並將該環型激發光聚焦於一樣本位置； 其中該環形激發光聚焦於該樣本位置前的能量低於一激發閾值，而聚焦於該樣本位置時的能量總和高於該激發閾值。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之落射頂錐殼層光超解析系統，進一步包含一放大鏡片組，位於該發光元件與該透鏡組之間，由一對凸透鏡組成，將該第一激發光從一第一寬度擴張至一第二寬度，並將該第一激發光準直。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之落射頂錐殼層光超解析系統，其中該第二透鏡係包含一錐透鏡及一微透鏡陣列，該錐透鏡之錐面面向該第一透鏡並將該環型激發光準直後照射至該微透鏡陣列，該微透鏡陣列將該環形激發光以該微透鏡陣列中的複數個微凸透鏡分別聚焦，構成複數個第二激發光，該複數個第二激發光係呈環形排列，且該複數個第二激發光的焦點位於該物鏡後焦平面。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之落射頂錐殼層光超解析系統，其中該微透鏡陣列為最密堆積或棋盤堆積。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之落射頂錐殼層光超解析系統，其中該第二透鏡係為凸透鏡。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之落射頂錐殼層光超解析系統，其中該發光元件包含一濾色片，改變該第一激發光之波長。
  7. 一種螢光顯微鏡，其包含： 如申請專利範圍第1項至第6項中的任一項所述的落射頂錐殼層光超解析系統； 一影像擷取裝置，係擷取該樣本所發出之螢光； 一載物台，係位於該樣本位置且承載該樣本； 一調節輪，係調節該載物台的高度；以及 一目鏡，係用於成像至該影像擷取裝置。
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