TW202000797A - 適於噴印的組織染色組成物及組織染色的方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種適於噴印的組織染色組成物及組織染色的方法，其中適於噴印的組織染色組成物能夠填裝於墨水匣中，透過印表機流暢且穩定的噴印於待測樣品上。結合目前的自動化機台進行檢測，可大幅降低傳統組織染色所需要的染色劑用量，以減少廢水的產生。透過噴印於待測樣品的方式，不僅染色劑的用量極少，同時還可將測試樣品數量大幅增加10倍以上。此外，由於組織染色組成物填充於墨水匣中，故可防止組成物接觸空氣造成氧化，進而提高組成物的儲存安定性。

Description

適於噴印的組織染色組成物及組織染色的方法

本發明係關於一種適於噴印的組織染色組成物及組織染色的方法，特別是關於搭配印表機噴印使用的一種適於噴印的組織染色組成物及組織染色的方法。

染色是增強顯微圖像對比度的一項輔助技術，以方便觀察細胞型態或判別細胞變異，染色常在生物學和藥學領域被用於提高生物組織的可見度，如肌肉組織和結締組織。在生物化學領域中也可利用抗體與抗原間專一性結合，來偵測組織或細胞中目標蛋白的表現量及位置，因此具有抗原性的物質，如：蛋白質、多醣、核酸、病原體及基因突變都可偵測，加入具有選擇性（如對DNA、蛋白質、脂類以及糖類等）的染劑也可定性或定量分析特定化合物含量。

現有的組織染色手法除了常見的傳統浸染式之外，近年來還有開發出改良的流動浸染式和滴染式，並且搭配機器自動化開啟批量式染片的全新時代，其中切片染色品質控制尤其重要，不僅是為了滿足診斷的需要，更是為了達到每張切片染色均一的效果，因此高效率、高品質成為染色重要發展的方向。

目前浸染式染色法雖然在相同批次內的可以有一致的染片結果，但批次間的染色存在差異，且需人工更換染劑。以蘇木精－伊紅（Hematoxylin and Eosin, H&E）染色為例，染色深淺會隨著試劑使用時間的變長而降低，染色污染程度會隨著試劑使用次數的變多而增加：例如蘇木精使用一段時間後，表面易出現亮晶狀氧化漂浮物，必須勤過濾，否則黏附於組織上時不易去掉，或是部分組織掉片飄浮於染液中，造成二次污染或非特異性染色。因此，更換試劑的時機需要仰賴人員及其經驗，依據切片染色效果是否減低或是染劑顏色是否已經改變來決定。再者，頻繁更換染劑浴液時，還會伴隨大量廢水產出，於是也增加了後續處理的成本。

針對滴染式染色法，由於每張組織切片均為新鮮試劑，因此可完全避免交叉污染的情形，且背景乾淨、不需要人為判斷是否需要更換試劑，同時批次之間染色不存在明顯差異。然而，以單一染色劑比較，當浸染式染色法每張切片消耗0.64mL時，滴染式染色法每張切片卻需要消耗1.1mL，約增加一半的染劑消耗，因此，滴染式染色法存在試劑消耗量較大且成本較高的問題。

鑒於上述先前技術所存在的問題，本發明的目的在於提供一種適於噴印的組織染色組成物及組織染色的方法，製備一種適合印表機噴印的組織染色組成物，再將其少量填入墨水匣中，於合適的條件下透過印表機直接將組成物噴印於樣品上方即可完成染色步驟，使得染色變得快速且簡單，且還可針對特定區域進行定量噴印或者重塗。

本發明的另一目的在於提供一種適於噴印的組織染色組成物及組織染色的方法，所製備的組成物適合用於印表機的噴印，藉由印表機的噴頭能夠產生數量眾多的微小墨滴並均勻噴印在待測樣品的表面上，以精準控制所施加的液體體積，進而減少該組成物的使用量，並且減少廢水產出，更能夠使用少量組成物即可將測試樣品數量大幅增加10倍以上。

本發明的又一目的在於提供一種適於噴印的組織染色組成物及組織染色的方法，所製備的組成物填充於墨水匣，減少與外界氧氣的氧化，以維持組成物儲存安定性，使組織樣品的顯色狀態保持一致。

為了實現上述目的，本發明提出的適於噴印的組織染色組成物以重量百分比計包含：50～90%的組織染色劑、5～40%的溶劑、以及5～10%的保濕劑。

在本發明的一實施例中，組織染色劑為蘇木精、伊紅染料、或者IHC染料。

在本發明的一實施例中，溶劑為具有二個以上羥基的多元醇。

在本發明的一實施例中，溶劑為選自乙二醇、二乙二醇、丙二醇、二縮三乙二醇、1,3-丁二醇、丙三醇、山梨醇、以及聚乙二醇組成的群組中的至少其中一種。

在本發明的一實施例中，保濕劑為尿素，或者將溶劑同時作為保濕劑時，溶劑佔10～50%。

在本發明的一實施例中，基於適於噴印的組織染色組成物的重量百分比為100%，進一步包含0.01～0.3%的表面活性劑、0.01～0.1%的消泡劑、以及0.01～0.1%的pH值調整劑。

在本發明的一實施例中，適於噴印的組織染色組成物與該組織染色劑的pH值差異在±1內。

為實現上述目的本發明另提供一種組織染色的方法，包含：將上述任一實施例中適於噴印的組織染色組成物透過噴墨印表機噴印在組織的表面上。

在本發明的另一實施例中，噴墨印表機為壓電式噴墨印表機或熱氣泡式噴墨印表機。

在本發明的另一實施例中，壓電式噴墨印表機的壓電噴印電壓為9V～15V。

以下，詳細說明本發明的適於噴印的組織染色組成物（簡稱染色組成物）以及利用其進行組織染色的方法。

在本發明的一實施例中，為了能夠透過印表機噴印的方式來進行組織染色，因此提供一種能夠填充於印表機墨水匣的染色組成物，相對染色組成物整體以重量百分比計，包含：50～90%的組織染色劑、5～40%的溶劑、以及5～10%的保濕劑。

組織染色劑是透過對不同部分的組織結構有不同的結合程度，而將組織上的特定部分進行染色。較佳地，組織染色劑可為蘇木精，其與組織中的嗜鹼性結構（例如：核醣體、細胞核以及核醣核酸）有高結合性，因此可用於將細胞核染色成藍紫色；伊紅染料可與組織中的嗜酸性結構（例如，蛋白質）染成粉紅色；或者IHC染料可與組織中具有抗原性的物質（例如蛋白質、多醣、核酸、病原體或基因）結合染為黃褐色。

溶劑可為與組織染色劑相容性佳的極性溶劑，較佳為具有二個以上羥基的多元醇，更佳可為選自乙二醇、二乙二醇、丙二醇、二縮三乙二醇、1,3-丁二醇、丙三醇、山梨醇、以及聚乙二醇組成的群組中的至少其中一種。當醇類具有二個以上羥基時，其本身的高黏度特性還可提供組成物具有適當黏度。染色組成物的黏度會影響噴印時墨滴向外、向下擴張速率及乾燥速度，進而影響到噴印的品質以及噴印速度。因此，對應不同廠牌類型的噴頭，組成物的黏度可作調整，組成物的黏度較佳為2～20cps。

保濕劑同樣地也是為了控制墨滴的乾燥速度，還可以減緩因為染色組成物乾燥而堵塞印表機噴頭的速度。依照選擇的組織染色劑來挑選適當的多元醇當主溶劑時，多元醇本身也具有一定的保濕作用，若無法達到需要的保濕時間，則可以再加入多元醇以外的保濕劑增強保濕能力，因此醇類以外的保濕劑較佳為尿素。需要注意的是，組織染色劑的組成比例越高越不會影響其物性與染色環境。此外，在多元醇同時作為溶劑及保濕劑的情況下，較佳佔染色組成物的10～50%。

在本發明的一實施例中，基於染色組成物的重量百分比為100%時，還可以根據需要包含0.01～0.3%的表面活性劑、0.01～0.1%的消泡劑、以及0.01～0.1%的pH值調整劑。

當染色組成物經噴嘴形成液滴向外飛行時，液滴的形狀與大小會受到表面張力的影響，因此較佳地透過添加表面活性劑，將染色組成物的表面張力控制在20~75dyne/cm，使染色組成物可以在使用期間穩定且流暢的從墨水匣中噴出。

應注意染色組成物的pH值變化，若pH變化過大時則會影響染色的結果。以蘇木精為例，其染色的pH建議值約為3，因此較佳添加pH值調整劑，並控制染色組成物與該組織染色劑的pH值差異在±1內，即2～4的pH值範圍內，可使染色組成物的pH值穩定而染色均勻。

接著，在本發明的另一實施例中，說明使用上述染色組成物來進行組織染色的方法。組織染色的方法是將本發明的染色組成物注入墨水匣中，再透過噴墨印表機直接將染色組成物噴印在組織的表面上，還可以透過電腦程式的控制，定量噴印組織的特定表面，或者是針對特定表面作重複性的噴印。

噴墨印表機的類型並沒有特別限制，但以噴印機制來區分時，較佳為壓電式噴墨印表機或熱氣泡式噴墨印表機。

當噴墨印表機為壓電式時，壓電噴印電壓可為9V～15V。

以下，透過具體實施例的方式來說明本發明的染色組成物及組織染色的方法所得出的效果。然而，所述的發明可以採用多種變化的實施方式，當不能只限定於這些實施例。

實施例1

常溫常壓下，於製備器皿中將以下的成分混合攪拌，攪拌均勻後過濾，得到適用於印表機噴印的染色組成物： 1. 蘇木精：59.8g 2. 乙二醇：30g 3. 尿素：10g 4. 表面活性劑：0.2g 5. 消泡劑：0.01g 6. pH調整劑：0.01g 需要注意的是，雖然攪拌速率並沒有特別限制，但攪拌速率過快時，染色組成物含有的生物活性可能會被影響，因此應以低速攪拌，能夠將溶劑攪拌均勻即可。

於25°C量測上述染色組成物的黏度、表面張力以及pH值並將數值記錄在表1。將上述比例的染色組成物42mL填裝入市售電壓式印表機的墨水匣中，於電壓9V的條件下進行連續噴印1分鐘測試、墨水匣不加蓋靜置30分鐘後再噴印的出墨測試，然後觀察染色組成物噴印在組織樣品上的染色狀況。墨水匣噴印染色實測數據記錄在表2，並且記錄觀察組織的染色狀況。

實施例2

常溫常壓下，於製備器皿中將以下的成分混合攪拌，攪拌均勻後過濾，得到適用於印表機噴印的免疫組織化學（Immunohistochemistry, IHC）染色組成物： 1. IHC染色劑：70g 2. 甘油：29.9g 3. 表面活性劑：0.1g 4. 消泡劑：0.01g 5. pH值調整劑：0.01g

如同實施例1，測量其黏度、表面張力以及pH值並將數值記錄在表1。接著觀察染色組成物的噴印狀況，以及噴印在樣品上的染色狀況。

實驗結果

[表1]

由表1可知，實施例1、2所製備的染色組成物其黏度與表面張力皆符合印表機噴印的規格要求。接著將染色組成物進行噴印測試後，於電壓9V下皆可順暢連續噴印1分鐘不斷墨。將墨水匣靜置於空氣中30分鐘也不乾頭，依舊可順利連續噴印1分鐘而不斷墨，即使放置一個月依舊可以噴印且顯色能力並未明顯衰退。

[表2]

在噴印領域中，術語「Pass」是指畫面成型需要噴印的次數（單位面積的覆蓋次數），Pass數越高噴印速度越慢，相對的質量也就越好，否則就相反。換句話說，「Single Pass」是指每一個像素點僅需要1次覆蓋來完成，噴印速度快（高速噴印）；而「5 Pass」就是5次覆蓋，噴印速度慢但質量相對佳（精密噴印）。

由表2可知，透過壓電式印表機噴印實施例1所製備的染色組成物，每個墨點所消耗的染色組成物的體積約為20～30pL（即，平均值在25×10^-12 L）。並且相對於浸染式染色法每張切片需預估會消耗染色組成物0.64mL，滴染式染色法需要消耗1.1mL的情況下，噴印1cm x 1cm面積所需的染色組成物體積僅45μL。可知染色組成物在相同體積下，使用噴印可以完成10倍數量以上的組織樣品染色。

接著觀察利用實施例1的染色組成物進行染色的結果，圖1為組織樣品經過蘇木精染色後的影像，可清晰顯示出細胞的輪廓與分布。

透過上述實施例的說明，將組織染色劑製備成可搭配印表機使用的染色組成物後，與傳統浸染式方法相比，只需填入少量的染色組成物於墨水匣中，在合適的電壓下直接將染色組成物噴印於組織樣品上方即可完成大量組織樣品染色步驟，染色組成物的使用量大幅降低，染色的樣品數量相對於傳統染色方法卻大幅增加10倍以上，且此方法操作十分快速且簡單，可以針對特定區域染色並且具重塗性與定量等優點。此外，染色的過程中所有的染色組成物被均勻的噴印在組織樣品，取代了頻繁更換染色組成物浴液的浸泡方式，因此還可以減少廢水的產生。

進一步地，將染色組成物填充於墨水匣的情況下，墨水匣為密封容器以隔絕外界的氧氣與染色組成物氧化，因此可增加染色組成物的儲存安定性、延長壽命，以在每一次的噴印時，確保染色組成物都處在新鮮未被氧化的狀態，讓不同批次之間的組織樣品的顯色狀態都盡可能地保持一致。

圖1係組織樣品經過本發明的染色組成物染色後的影像圖。

Claims (10)

1. 一種適於噴印的組織染色組成物，以重量百分比計包含： 50～90%的一組織染色劑、5～40%的一溶劑、以及5～10%的一保濕劑。
2. 如申請專利範圍第1項所述之適於噴印的組織染色組成物，其中， 該組織染色劑為蘇木精、伊紅染料、或者IHC染料。
3. 如申請專利範圍第1項所述之適於噴印的組織染色組成物，其中， 該溶劑為具有二個以上羥基的多元醇。
4. 如申請專利範圍第1項所述之適於噴印的組織染色組成物，其中， 該溶劑為選自乙二醇、二乙二醇、丙二醇、二縮三乙二醇、1,3-丁二醇、丙三醇、山梨醇、以及聚乙二醇組成的群組中的至少其中一種。
5. 如申請專利範圍第1項所述之適於噴印的組織染色組成物，其中， 該保濕劑為尿素，或者將該溶劑同時作為保濕劑時，該溶劑佔10～50%。
6. 如申請專利範圍第1項所述之適於噴印的組織染色組成物，其中， 基於該適於噴印的組織染色組成物的重量百分比為100%，進一步包含0.01～0.3%的一表面活性劑、0.01～0.1%的一消泡劑、以及0.01～0.1%的一pH值調整劑。
7. 如申請專利範圍第6項所述之適於噴印的組織染色組成物，其中，該適於噴印的組織染色組成物與該組織染色劑的pH值差異在±1內。
8. 一種組織染色的方法，包含： 將申請專利範圍第1至第7項中任一項所述之適於噴印的組織染色組成物透過一噴墨印表機噴印在一組織的表面上。
9. 如申請專利範圍第8項所述之組織染色的方法，其中， 該噴墨印表機為一壓電式噴墨印表機或一熱氣泡式噴墨印表機。
10. 如申請專利範圍第9項所述之組織染色的方法，其中， 該壓電式噴墨印表機的壓電噴印電壓為9V～15V。

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