TW201936047A - 具新特性木瓜及生產此種番木瓜植物方法 - Google Patents

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Abstract

本申請案與由於真核轉譯起始因子4e及/或真核轉譯起始因子iso4e基因中的突變導致非功能性真核轉譯起始因子4e及/或真核轉譯起始因子iso4e蛋白質而與野生型植株相較下對木瓜輪點病毒具有增加的抗性的木瓜植株有關。描述了生產對木瓜輪點病毒具有增加的抗性的這種木瓜植株的方法。

Description

具新特性木瓜及生產此種番木瓜植物方法
本發明與木瓜植株中的新特性有關，與野生型木瓜相較下，該木瓜植株表現出對木瓜輪點病毒（PRSV）感染的抗性增加。本發明亦提供了使用新方法產生此種木瓜植株的方法。
木瓜（Carica papaya L.）是一種屬於Caricacea 科的軟木草本雙子葉植物。Caricaceae 科包含三十五個含有乳膠的品種，分佈在六個屬，即Carica （ 1 種） 、Cylicomorpha （ 2 種） 、Jarilla （ 3 種） 、Jacaratia （ 7 種）、 Horovitzia （ 1 種）以及 Vasconcellea （ 21 種） （Fuentes以及Santamaria，2014）。只有Carica 屬；用作果樹，現在也用作保健營養品以及藥用植物（O'Hare以及Williams，2014）。木瓜源自南墨西哥以及中美洲（Fuentes以及Santamaria，2014年）、並傳播到世界各地。木瓜有9對染色體（2n = 18）以及大約372MB基因組大小（Ming等，2008年）。木瓜在所消費的水果中排名第一（Hui等，2001年）、並且在營養成分中也排名第一（Bari等人，2006年；Ming等人，2008年；Manshardt，1992年）。過去50年來已生產木瓜的主要五個國家是印度、奈及利亞、巴西、墨西哥以及印尼（Kumar等人，2014）。
木瓜輪點病毒（“PRSV”）是對幾種作物植株具有致病性並且是木瓜中最具破壞性的疾病的植物病毒的馬鈴薯病毒群的一員。病毒的名稱取自在感染樹木果實上形成的輪點。感染PRSV的樹木會出現例如葉片嵌紋以及黃化、葉柄以及樹幹上部水浸的油性條斑、幼葉嚴重變形以及果實上形成輪紋狀斑點等的病徵。如果在苗期或種植後兩個月內感染，樹木可能不會結果，導致100％的損失。不存在表現出對PRSV具有抗性的野生木瓜品種（可用於育種）。因此，植物育種者越來越必要發展抗病毒（例如來自馬鈴薯Ｙ病毒（Potyviridae ）科的病毒）感染的植株。
PRSV藉由多種蚜蟲以非持久的方式被傳播到葫蘆以及木瓜的有限宿主範圍。目前，用於限制PRSV損失的已知解決方案是藉由載體的化學控制，其成本高並且不提供100％保護。另一種解決方案是經由轉基因途徑誘發抗性，這不僅昂貴而且消費者也不能接受。已經進行了各種嘗試來控制或預防PRSV對作物的感染，但是這些嘗試僅取得了有限的成功。US7078586 B2（Gonsalves等人，2006）描述了誘發對病毒的抗性的轉基因方法。此種方法涉及在轉基因木瓜植株'Sunup'中編碼輕度突變體PRSV菌株的外殼蛋白的核酸序列的表現，其有助於防止PRSV感染到Hawaiin品系。然而，轉基因植物沒有顯示出對夏威夷以外的PRSV品系（例如泰國以及牙買加PRSV品系）的抗性（Gonsalves，2014）。品種‘Sunup’是一種轉基因木瓜輪點病毒抗性水果作物，目前在美國夏威夷種植。在2008年，Ming等人首先定序了品種‘Sunup’的木瓜基因組，具有3x基因組覆蓋率（2008年Ming等人、2008年Rachel）。因為缺少基因重複，這與其他植物物種相當不同，木瓜基因組被報告為具有約13311個候選基因（Ming等人，2008）。在基因組大小方面，基因組大約是模式植物阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana ）大小的三倍，並且含有數量少得多的抗病基因（Ming等人，2008）。因為與其他物種相較下估計的基因數量非常少，木瓜中的基因可能涉及多種功能。此外，木瓜基因組是高度真染色的(Minget al ., 2008)。Siar等人（2011）描述了藉由在木瓜（C. papaya ）以及槲葉番木瓜（Vasconcellea quercifolia ）之間的屬間雜交後回交（BC）木瓜植株產生PRSV抗性植株具有大的困難度。在從回交1代BC1 的940個果實中解剖出114,839個種子後，產生一株PRSV-P抗性植物。上述育種方法有其自己的缺點，例如在雜交後不斷努力生產大量植株以用於篩選、以及不容易進行的有效胚胎培養要求。此外，目前大多數市場不願意接受以及消費轉基因水果。再者，解除調節這些轉基因木瓜種子的成本可能非常高。目前，世界上沒有可以容易雜交的天然PRSV抗性木瓜物種（Gonsalves，2014）。由於木瓜的基因組已經被定序，因此可以藉由進行密集資料挖掘以及與其他經定序的作物的比較分析得到特定的基因相關資訊。本發明人已開發了藉由誘發木瓜基因組中的突變並使用對偶基因偵測平台（ADP）（定向誘導基因組局部突變（TILLING）的一種變形）方法（Kumar等人，2014）篩選期望的突變體來生產非轉基因PRSV抗性木瓜植株的新穎方法。
TILLING提供了操作內在基因以用於在沒有轉基因方法下改良作物的替代方法。TILLING是一種反向遺傳學技術，其使用傳統的化學突變誘發以創建突變誘發個體庫，這些個體隨後進行敏感的分子篩選，以發現序列已知的基因中的誘發突變。利用TILLING，可以鑑定感興趣的基因的新對偶變異體，因此可以分離具有潛在高農藝價值的新基因型，並在回交至親本系後直接轉移用於商業化。如Robaglia以及Caranta（2006）、Neito等（2006）、Neito等（2007）、Ruffel等（2002）、Nicaise等（2003）、Gao等（2004）、Kang等（2005）、Ruffel等（2005）、Piron等（2010）所述，使用這種技術已經在例如甜瓜、番茄等的作物中開發了各種作物中的馬鈴薯病毒抗性品系。例如，Piron等人（2010）教導了使用TILLING以在番茄中誘發對馬鈴薯Y病毒（PVY）以及番椒斑紋病毒（PepMoV）的馬鈴薯病毒抗性。最近，Pyott等人（2016）利用CRISPR-Cas9技術在阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana ）的eIF(iso)4e 基因座處引入序列特異的有害點突變，成功地建造對蕪菁嵌紋病毒（Turnip Mosaic Virus ，TuMV）（田間種植的蔬菜作物中的主要病原體）的完全抗性。然而，到目前為止，這些方法尚未用於誘發木瓜植株中的突變以發展PRSV抗性植物。
因此，本發明的實施方式可以改善一個或多個上述問題：
本發明的實施方式可以提供一種木瓜植株，與野生型木瓜植株相較下，由於eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因中的突變，該木瓜植株對木瓜輪點病毒具有增加的抗性。
本發明的另一個實施方式可以提供一種木瓜植株，與野生型木瓜植株相較下，由於eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因中的突變導致非功能性eIF4e及/或eIF(iso)4e 蛋白質，該木瓜植株對木瓜輪點病毒具有增加的抗性。
本發明的另一個實施方式可提供含有從木瓜植株取得的木瓜果實的食物以及食品，其中，eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因中的突變以及非功能性eIF4e及/或eIF(iso)4e蛋白質造成該木瓜植株對木瓜輪點病毒具有增加的抗性。
本發明的另一個實施方式可以提供一種藉由下列步驟生產的對木瓜輪點病毒具有增加抗性的木瓜植株：從親本木瓜植株獲得植物材料、藉由用誘變劑處理該植物材料以誘發該植物材料的eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因中的至少一個複製中的至少一個突變以產生誘變植物材料、培養以及種植該誘變植物材料以生產後代木瓜植株、從後代木瓜植株分離出DNA或RNA以及分析後代木瓜植株以偵測eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因中的至少一個複製中的至少一個突變、導致eIF4e 及/或eIF(iso)4e 蛋白質的功能喪失、以及選擇對木瓜輪點病毒具備增加抗性的後代木瓜植株以及表現型植株；以及重複培養該後代木瓜植株的循環，以生產與野生型木瓜植株相較下對木瓜輪點病毒具有增加抗性的其他植株。
本發明的一些或所有這些以及其他目的可以經由此後描述的發明來實現。
因此，本發明的一個方面提供了一種木瓜植株，與野生型植物相較下，由於eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因中的突變導致非功能性eIF4e及/或eIF(iso)4e蛋白質，該木瓜植株對木瓜輪點病毒具有增加的抗性。
本發明的另一方面可提供生產對木瓜輪點病毒具有增加的抗性的木瓜植株的方法，該方法由數個步驟建立，該步驟包括：
a. 用誘變劑處理木瓜種子並種植這些植株；
b. 萃取DNA及/或RNA、以及分析子代木瓜植株以偵測eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因/ RNA轉錄本中的至少一個複製中的至少一個突變，該至少一個突變導致非功能性eIF4e及/或eIF(iso)4e蛋白質；
c. 選擇攜帶該突變以及表現型上具有對木瓜輪點病毒的增加的抗性的後代木瓜植株；
d. 藉由在疾病存在下種植該後代木瓜植株以直接選出增加的抗病性；
e. 重複種植以及培養該後代木瓜植株的循環，以產生對木瓜輪點病毒具有增加抗性的更多的植株；以及
f. 將對於兩個親本中存在的eIF4e 基因中的突變皆同型接合的兩個品系進行組合以產生雜種；或者將兩個親本中存在的eIF(iso)4e 基因中的同型接合突變體進行組合以產生雜種；或者將兩種不同親本植株中存在的eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因中的同型接合突變體進行組合以藉由基因堆疊產生雜種。
本發明的另一方面可提供含有木瓜果實的食物以及食品，與野生型木瓜植株相較下，藉由eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因中的突變導致非功能性eIF4e及/或eIF(iso)4e蛋白質，該木瓜果實對木瓜輪點病毒具有增加的抗性。
如本文所使用的，術語「植株」包括整個植株或其任何部分或衍生物，例如植物器官（例如，收穫的或未收穫的果實、花、葉、莖、根等）、植物細胞、植物原生質體、從其可以再生整株植物的植物細胞或組織培養物、可再生或非可再生的植物細胞、植物癒合組織、植物細胞團塊以及植株中完整的植物細胞；或植株的部分，例如胚、花粉、胚珠、子房、果實、花、葉、種子、塊莖、無性繁殖的植物、根、莖、子葉、下胚軸、根尖等。此外，還包括任何發育階段，例如幼苗、未成熟的以及成熟的等。
「M1族群」是特定植物品系或栽培品種的多個誘變種子/植株。「M2、M3、M4等」是指最先誘變的種子/植物（M1）的自交後獲得的連續世代。
術語「自交」意指自花授粉，例如，當花粉自花授粉同一植株的胚珠時。
在針對蛋白質的核酸分子編碼中的「突變」是例如藉由一個或多個核苷酸的置換、缺失或插入而與野生型序列相較下的一個或多個核苷酸的變化。「點突變」是單一核苷酸的置換、或單一核苷酸的插入或缺失。
如本文使用的，「抗病性」是指植株獲得（即遺傳）的能力以在暴露於可引起野生型植株的疾病的病原體後存活（例如生長以及隨意地繁殖）及/或限制病原體的增殖。換句話說，與野生型植株相較下，該植株具有表現型上的改變，使得其受影響較小並且缺乏病徵。在植株中，抗病性可以是天然存在的或是由例如基因工程或藉由組織培養或誘變所產生的變異體的選擇等的技術誘發的。因此，「抗病」植株是一種對在通常會殺死相同物種的野生型植株或抑制相同物種的野生型植株正常生長的程度的疾病具有抗性的植株。「增加的抗性」的植株可以被定義為：與野生型植株相較下，具有增加的能力以在暴露於通常會影響野生型植株的疾病後存活（例如生長以及隨意地繁殖、缺乏病徵）的植株。
「功能喪失型蛋白質」是指突變體eIF4e或eIF(iso)4e蛋白質，該突變體eIF4e或eIF(iso)4e蛋白質可以是將不編碼功能性真核RNA轉譯起始因子的截斷的蛋白質。「非功能性以及功能喪失」可以互換使用。
本發明可提供產生木瓜植株的方法，與野生型木瓜植株相較下，該木瓜植株由於其eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因中的至少一者中的突變導致木瓜基因體中不包括外源核酸的非功能性蛋白質，而對木瓜輪點病毒具有增加的抗性。
本發明還可提供eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因中的一系列獨立的突變；具有在其eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因中的至少一種中的這些突變的木瓜植株；以及一種在木瓜的eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因中產生以及鑑定相似及/或另外突變的方法。
如序列表中列出的，
- SEQ ID NO：1屬於木瓜中的野生型eIF4e 基因核苷酸序列（從定序報告以及NCBI序列所註解的：ABIM01000000、ABIM01005433.1、LG8片段重疊群(contig)5440）；
- SEQ ID NO：2屬於木瓜中突變的eIF4e 核苷酸序列（木瓜突變系編號M2(0.3)-1709 G2112A (UGG-＞ UGA) W140*）；
- SEQ ID NO：3屬於木瓜中突變的eIF4e 核苷酸序列（木瓜突變系編號M2(0.3)-1220 G2301A (GGA-＞ GAA) G173E）；
- SEQ ID NO：4屬於木瓜中的野生型eIF4e 基因(mRNA)序列（基因庫(GenBank)：FJ644949.1）；
- SEQ ID NO：5屬於木瓜中突變的eIF4e 基因(mRNA)序列（木瓜突變系編號M2(0.3)-1709）；
- SEQ ID NO：6屬於木瓜中的野生型eIF4e胺基酸序列（protein_id = “ACN38307.1”）；
- SEQ ID NO：7屬於木瓜中突變的eIF4e胺基酸序列（木瓜突變系編號M2(0.3)-1709）；
- SEQ ID NO：8、10、12、14、16以及18屬於木瓜eIF4e 正向引子序列；
- SEQ ID NO：9、11、13、15、17以及19屬於木瓜eIF4e 反向引子序列；
- SEQ ID NO：20屬於野生型木瓜中的eIF(iso)4e 基因核苷酸序列(gb|ABIM01010894.1|:25000-29500，木瓜(Carica papaya)染色體LG6 contig_10909，全基因體鳥槍序列)；
- SEQ ID NO：21屬於木瓜中的eIF(iso)4e 突變體核苷酸序列（木瓜突變系編號，M2(0.3)-552 G2046A (GGG-＞GAG) G105E）；
- SEQ ID NO：22屬於木瓜中的野生型eIF(iso)4e 基因（mRNA）序列（GenBank：FJ595992.1）；
- SEQ ID NO：23屬於木瓜中突變的eIF(iso)4e 基因（mRNA）序列（木瓜突變系編號M2(0.3)-552）；
- SEQ ID NO：24屬於木瓜中的野生型eIF(iso)4e胺基酸序列；
- SEQ ID NO：25屬於木瓜中突變的eIF(iso)4e胺基酸序列（木瓜系編號M2(0.3)-552）；
- SEQ ID NO：26-37屬於木瓜eIF(iso)4e 正向引子序列；以及
- SEQ ID NO：38-49屬於木瓜eIF(iso)4e 反向引子序列。
本發明的發明人使用稱為TILLING（定向誘導基因組局部突變）的方法（McCallum等人，2000年；Till等人，2003年，Triques等人，2007年）。TILLING依賴於使用化學或物理誘變劑處理種子引起的基因組中的隨機突變，其導致標的基因組中的單一核苷酸多型性突變。來自所得誘變植株的樣本的DNA或RNA被匯集、並經受對關注的基因中的突變進行篩選。一旦在關注的基因中鑑定出突變，則種植攜帶該突變的植株的種子，並使用基因標記以針對異型接合及同型接合突變體對該攜帶該突變的植株的種子進行基因型分型。然後可以對來自所選科的M2植株進行人工接種病毒，並進行ELISA測試以檢查幼株抗性，並且也在熱點（目標疾病感染的發生率非常高的地方）中生長以檢查成株抗性。M2植株進一步生長成成株並收穫M3種子。M3植株在疾病熱點中再次被篩選，並針對與關注的基因相關聯的抗病表現型特徵來篩選該M3植株。
可以將表現出抗病表現型的eIF4e 或eIF(iso)4e 基因中的單一同型接合突變體與另一個同型接合eIF4e 或eIF(iso)4e 突變系組合，以產生PRSV抗性雜種木瓜品種。單一基因eIF4e 突變體也可以與eIF(iso)4e 基因中的突變體雜交，以產生攜帶抗性的雜種，該抗性得自藉由堆疊eIF4e 以及eIF(iso)4e 中的單一突變體的組合，導致較長期間的抗性「(持久抗性)」。
使用TILLING的方法，本發明的發明人已經誘發木瓜中eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因的獨立突變，導致單一核苷酸多型性，該多型性導致非功能性蛋白質，從而，與野生型木瓜植株相較下，導致對木瓜輪點病毒的增加的抗性。eIF4e 基因編碼真核RNA轉譯起始因子。已知來自阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana ）的真核生物轉譯起始因子eIF4e 的異構體與蕪菁嵌紋病毒（TuMV）的病毒蛋白VPg相互作用。顯示出來自不同作物的抗馬鈴薯Y病毒的數種天然抗性基因編碼eIF4e 以及eIF(iso)4e 的缺陷形式，例如，pvr2 針對抗馬鈴薯Y病毒（PVY）、煙草蝕刻病毒（Tobacco Etch Virus ，TEV）的胡椒抗性；mo1 針對萵苣對萵苣嵌紋病毒（LMV）的抗性；sbm1 針對豌豆對豌豆種子嵌紋病毒（Pea Seed-Borne Mosaic Virus ，PSbMV）的抗性；以及pot-1 針對番茄對馬鈴薯Y病毒（PVY）以及煙草蝕刻病毒（TEV）的抗性（Caranta等人，1996年）。儘管這些基因控制著不同的抗性表現型，但在所有情況中的抗性都是由具有點突變的隱性抗性對偶基因所編碼的蛋白質中的少量胺基酸變化引起的。甜瓜壞疽斑點病毒（Melon Necrotic Spot Virus ，MNSV）抗性甜瓜植株已經藉由甜瓜中的eIF4e 基因的TILLING而產生（Nieto等人，2007年）。由於PRSV是馬鈴薯Y病毒，因此假設對木瓜eIF4e 以及eIF(iso)4e 基因的異種同源物進行TILLING具有產生PRSV抗性品系的良好潛力。US 919,677 B2（CARANTA等人，2004年）展示出在馬鈴薯Y病毒的VPg基因與eIF4e 之間存在相關性，並且eIF4e 中的突變導致茄科（Solanaceae）、葫蘆科（Cucurbitaceae）、十字花科（Cruciferae）以及菊科（Compositae）植物的抗性。然而，並不存在教導使用此種方法以用於誘發木瓜中的馬鈴薯Y病毒抗性的習知技術。
因此，本發明的一個方面可以提供一種木瓜植株，由於該木瓜植株的eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因中的至少其中之一中的突變，與野生型木瓜植株相較下，該木瓜植株對木瓜輪點病毒具有增加的抗病性。
基於突變類型，與野生型相比，抗病性的增加可以是60％；與野生型相比，抗病性的增加可以是70％；與野生型相比，抗病性的增加可以是80％；與野生型相比，抗病性的增加可以是90％；與野生型相比，抗病性的增加可以是100％；與野生型相比，抗病性增加的範圍可以從60％至100％；與野生型相比，抗病性增加的範圍可以從60％至90％；與野生型相比，抗病性增加的範圍可以從70％至100％；與野生型相比，抗病性增加的範圍可以從80％至100％；與野生型相比，抗病性增加的範圍可以從90％至100％；與野生型相比，抗病性增加的範圍可以從70％至90％；與野生型相比，抗病性增加的範圍可以從70％至80％；與野生型相比，抗病性增加的範圍可以從80％至90％。
在一個實施方式中，木瓜植株可包括植物器官（例如，收穫的或未收穫的果實、花、葉等）、植物細胞、植物原生質體、從其可以再生整株植物的植物細胞或組織培養物、可再生或不可再生的植物細胞、植物癒合組織、植物細胞團塊、以及植株或植株的部分（例如，胚、花粉、胚珠、子房、果實（例如收穫的組織或器官、如收穫的木瓜或其部分）、花、葉、種子、塊莖、無性繁殖的植株、根、莖、子葉、下胚軸、根尖等）中完整的植物細胞。此外，包括任何發育階段，例如幼苗、未成熟以及成熟等。
在一個實施方式中，使用可以是化學或物理誘變劑的誘變劑來誘發突變。
在一個實施方式中，所使用的化學誘變劑可以選自但不限於甲基磺酸乙酯（EMS）、甲基磺酸甲酯（MMS）、N-乙基-N-亞硝基尿素（ENU）、三乙基三聚氰胺（triethylmelamine，TEM）、N-甲基-N-亞硝基尿素（MNU）、甲基苄肼（procarbazine）、氯芥苯丁酸（chlorambucil）、環磷醯胺、硫酸二乙酯、丙烯醯胺單體、黴法蘭、氮芥、長春新鹼、二甲基亞硝胺、N-甲基-N'-硝基-亞硝基胍(MNNG)、亞硝基胍、2-胺基嘌呤、7,12二甲基苯并(a)蒽(DMBA)、環氧乙烷、六甲基磷酸三胺、白消安、二環氧烷烴（二環氧辛烷（DEO）、二環氧丁烷（BEB）等）、2-甲氧基-6-氯-9[3(乙基-2-氯-乙基)胺基丙胺基]吖啶二鹽酸鹽(ICR- l 70)、以及甲醛。
在一個實施方式中，使用物理誘變劑（例如快中子）或電磁輻射（例如X射線或γ射線）來誘發突變。
在一個實施方式中，可以誘發像是缺失以及插入之類的突變的方法可以包括但不限於包括使用TALEN、鋅指核酸酶（ZFN）、寡核苷酸定點誘變（ODM）以及CRISPR-Cas9的靶向基因編輯的新育種技術（NBT）。基因編輯技術可用於在木瓜基因eIF4e 及/或eIF(iso)4e 以及此基因家族的其他成員中誘發靶向突變、插入或缺失，其涉及分子機制的梯瀑，例如木瓜細胞內PRSV基因複製所需的宿主蛋白-病毒蛋白相互作用，導致木瓜中的PRSV抗性。
因此，在此實施方式中，可以根據本領域中已知的方法以使用1M KNO3 溶液清潔及處理來自各種品系的木瓜種子，以改善發芽。之後，可以清洗種子並用誘變劑（M1種子）處理種子，使得所選的誘變劑引起點突變。然後使M1種子生長至成熟，並從每個植株中單獨收穫M2種子。然後播種M2種子，接著準備植株以使用任何適合的植物DNA製備方法進行DNA萃取，以製備用於eIF4e 及/或eIF(iso)4e 突變篩選的木瓜植株DNA，例如遵照製造商的操作步驟使用商業DNA萃取試劑盒（例如，QiagenDneasy植物迷你試劑盒或類似的已知DNA試劑盒）。然後，可合併木瓜M2 DNA樣本以加速篩選來自誘變植物組織的M2植物家族的整個族群的eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因的突變。合併群組的大小可能取決於所使用的篩選方法的靈敏度。根據本發明範例性實施方式的一個方面，合併每一M2家族的四個或更多個單獨木瓜植株的群組。
在一個實施方式中，在合併DNA樣本後，對合併的DNA樣本進行eIF4e 及/或eIF(iso)4e 序列特異性擴增技術，例如聚合酶連鎖反應（PCR）。任何對eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因座特異的引子、或與eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因座緊鄰的序列都可用於擴增合併的DNA樣本內的eIF4e 及/或eIF(iso)4e 序列。較佳地，引子被設計以擴增最有可能出現有用突變的eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因座的區域。最佳地，引子被設計以偵測eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因的編碼區中的突變。較佳地，所使用的引子可以使得其避免已知的多型性位點以便於篩選點突變。因此，在一個實施方式中，本發明可以為此目的提供適合的引子（序列ID 8至19以及26至49）。
在一個實施方式中，來自經誘變的木瓜植株或後續世代的DNA及/或RNA可以藉由例如使用Illumina/PacBio/BioNano/Nanopore或其他下一代定序（NGS）平台的各種定序方法定序。
為了便於在凝膠上偵測PCR產物，可以使用紅外染料（IRdye）或任何常規標記方法來標記PCR引子。在一個替代實施方式中，可以使用其他擴增以及篩選方法，例如變性高壓液相層析（dHPLC）、恆定變性毛細管電泳（CDCE）、溫度梯度毛細管電泳（TGCE）（參見Li等人，Electrophoresis 23(10)：1499-1511，2002年），或藉由使用例如在Colbert等人(2001年)、Triques等人(2007)描述的高通量方法中使用的酶剪切的片段化並結合如上所述的下一代定序平台（Kumar等人，2017）。
在一個替代實施方式中，定序的靶向基因型分型（GBS）可用於偵測eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因中的突變。
PCR擴增產物可以與核酸內切酶一起培養，該核酸內切酶優先剪切在野生型與突變序列之間的異源雙股中的錯配，在異源雙股中的錯配進行辨識及剪切。適合的核酸內切酶可包括但不限於溶解酶、核醣核酸酶、噬菌體T4核酸內切酶VII、噬菌體T7、核酸內切酶I、啤酒酵母核酸內切酶XI、啤酒酵母核酸內切酶X2、啤酒酵母核酸內切酶X3、SI核酸酶、CEL I、PI核酸酶、ENDO I核酸酶、或綠豆核酸酶。在一個實施方式中，使用例如Licor（LICOR Inc.）之類的自動定序凝膠裝置對剪切產物進行電泳，並根據製造商的說明、借助於標準商業圖像處理軟體來分析凝膠圖像。
本發明人已經確定，與野生型植株相比，為了在木瓜中實現增加的抗性，理想是要改變以及完全消除eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因功能的突變。較佳的突變包括誤義、無意義以及剪接點變化，包括提早截斷eIF4e 及/或eIF(iso)4e 蛋白從傳訊RNA的轉譯、或產生非功能性蛋白質的突變，例如在eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因的編碼區或剪接點內產生終止密碼子或密碼子變化的那些突變。此類突變包括插入、重複序列、修飾的開讀框（ORF）、缺失、內含子-外顯子剪接點突變、以及最佳是導致功能性蛋白喪失的單核苷酸多型性。
因此，在一個實施方式中，本發明與編碼蛋白質的核酸序列（或基因）有關，該蛋白質的胺基酸序列在本文中描述，或者該蛋白質是藉由在母體蛋白的胺基酸序列中一或數個胺基酸（例如2、3、4、5、6、7、8、9個胺基酸）、或更多胺基酸（例如10個、或大於10個胺基酸）的取代、缺失或添加以及喪失或部分喪失該母體蛋白質活性而從此（eIF4e及/或eIF(iso)4e）蛋白質衍生出。
在一個實施方式中，一旦鑑定出具有突變的eIF4e 及/或eIF(iso)4e 序列的M2植株，就可以分析該突變以確定其對蛋白質的表現、轉譯及/或活性的作用。因此，在一個實施方式中，可以使用標準定序技術對含有該突變的PCR片段進行定序，以確定相對於整個eIF4e 及/或eIF(iso)4e 序列的突變確切位置。評估每一個突變以使用例如SIFT、PARSESNP、CODDLE、CLUSTAL-W、BLASTP、BLASTN、PDB或本領域中已知的其他工具之類的電腦化生物資訊學工具來預測其對蛋白質功能的影響（即，完全耐受至功能喪失）、改變的胺基酸的鍵結形態中的分子變化、以及新基因中的改變的核苷酸相互作用。
在一個實施方式中，如果對M2植株中的突變的初始評估表明其具有期望的性質並且在eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因內的有用位置，則可以使用人工接種PRSV菌株以及ELISA測試以及在PRSV感染發生率非常高的疾病熱點中種植突變植株以對含有該突變的所選木瓜植株進行表現型分析。可以使用各種方法來獲得根據本發明的木瓜品系，首先使用標記輔助選擇（MAS）將選擇的M2植株與原始親本回交至少兩次或更多次以產生回交1代（BC1）後代植株來消除背景突變。回交的BC1植株可以自花授粉以產生其可以是eIF4e 及/或eIF(iso)4e 突變的同型接合的BC1F2植株。可以評估這些同型接合eIF4e 以及eIF(iso)4e 突變植株的幾種表現型特徵，以確定該突變是否導致木瓜植株中有用且期望的基因型以及表現型變化。
在一個方面，本發明可以提供在木瓜基因組的eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因中的新突變，這種突變可以根據本發明的各種實施方式而被產生以及鑑定。先前沒有被報導的eIF4e 基因（序列ID No. 1）的突變以及從核苷酸位置2112（G2112A）（序列ID No. 2）開始的木瓜中的蛋白質（序列ID No. 6），其中，在eIF4e 基因中，鳥糞嘌呤（G）至腺嘌呤（A）的單一核苷酸多型性（SNP）轉換導致在140的胺基酸位置處從色胺酸（W）形成終止密碼子，導致蛋白質以及功能完全喪失（序列ID No. 7）。木瓜eIF4e 基因中的STOP突變（G2112A，W140 *）顯示出超過140處的胺基酸位置的蛋白質序列的進一步轉譯停止。本發明的突變引起缺陷的eIF4e 基因，其導致基因的完整轉錄以及轉譯成功能性蛋白質的喪失，從而導致木瓜輪點病毒RNA增殖所需的eIF4e轉譯起始因子蛋白質的非可用性，從而導致PRSV症狀缺乏並因此導致抗性。已經顯示出，對於成功的PRSV感染，PRSV的外殼蛋白與eIF4e 及/或eIF(iso)4e 蛋白完全相互作用以進行增殖（Caranta等人，1996；Piron等人，2010）。
在一個實施方式中，本發明還可以提供eIF4e 中的其他突變，其也導致對木瓜中PRSV的類似類型的抗性，如表1所示。
因此，本發明的一個方面可以提供一種木瓜植株，其在2112核苷酸位置處具有eIF4e 基因中的突變，導致序列ID 7的140胺基酸位置上的終止密碼子，導致無功能蛋白質，與野生型木瓜植株相較下，對木瓜輪點病毒的抗性增加。
如將在實施例中說明的，可以評估這些同型接合eIF4e 及/或eIF(iso)4e 突變植株的幾種物理特徵，以確定突變是否導致木瓜植株中對木瓜輪點病毒的增加的抗性。評估突變木瓜植株與正常（例如，野生型）木瓜植株相較下的抗性程度。此種評估可包括但不限於抗病性篩選生物測定以及表現型評估。
可以使用PRSV篩選技術來觀察突變體對PRSV感染的抗性。藉由TILLING鑑定並藉由定序確認的突變種子浸泡在水中並在濕布中培養三天。此外，將突變種子播種在木瓜培養基中（椰殼纖維以及沙子，比例為3：1）。藉由收集PRSV症狀性木瓜葉來製備用於接種的PRSV菌株，PRSV症狀性木瓜葉是藉由用接種緩衝液在研缽以及研杵中壓碎收集的葉子而被均質化。隨後將均質化的PRSV接種物接種在野生型以及突變植株的葉子上，並在接種後7、14以及21天（DAI）進行觀察。觀察到不同的感染等級，並且嚴重性表示如下：0級表示無感染、4級表示植株的嚴重葉片斑點以及發育遲緩。基於突變植株以及野生型植株之間病毒感染嚴重性分級的差異來確定抗性等級。病毒負荷量的值可以使用ELISA測試而被計算、並且基於嚴重性分級而與突變的百分比（％）增加相關。因此，與野生型木瓜植株相較，0級可以與抗性增加100％相關。
因此，在一個實施方式中，基於突變的類型，在一些情況下，本發明的木瓜突變體中的抗病性的增加可以在70％至100％的範圍。
因此，在一個實施方式中，本發明可以提供一種其具有eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因中的突變的木瓜植株，使得該木瓜與野生型木瓜植株相較下具有高達70％至100％的增加的抗性。
在本發明的一個方面，可以從木瓜中提供包括G2112A突變的eIF4e 基因；其中G2112A突變包括eIF4e 基因內的核苷酸變化；以及其中核苷酸變化是根據序列ID No. 2而被鑑定。
在本發明的一個方面，可以在eIF(iso)4e 基因中提供新的突變，這種突變可以根據本發明的各種實施方式產生以及鑑定。先前沒有報導在核苷酸位置2046（G2046A）處開始的木瓜的eIF(iso)4e 基因（序列ID No. 20）以及蛋白質（序列ID No.24）中的突變（序列ID No. 21），其中在eIF(iso)4e 基因中鳥糞嘌呤（G）至腺嘌呤（A）的單一核苷酸多型性（SNP）轉換導致在105的胺基酸位置處從甘胺酸（G）至E的誤義密碼子的形成，導致非功能性蛋白質（G105E）（序列ID No. 25）。木瓜eIF(iso)4e 基因中的非耐受性誤義突變（G2046A）顯示出由於胺基酸位置105處的蛋白質序列的變化（G105E）而形成非功能性蛋白質。本發明的突變引起缺陷的eIF(iso)4e 基因，其導致非功能性蛋白質的基因表現，從而導致木瓜輪點病毒RNA增殖的eIF(iso)4e 轉譯起始因子蛋白質的非可用性，從而導致PRSV症狀缺乏並因此導致抗性。在一個實施方式中，本發明可以在eIF(iso)4e 中呈現其他突變，其也導致非功能性蛋白質，導致木瓜中對PRSV的類似類型的抗性。
在一個替代實施方式中，本發明可以提供與野生型木瓜植株相較下對木瓜輪點病毒具有增加的抗病性的木瓜植株，該木瓜植株包括在其基因組中結合的（a）SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列；（b）SEQ ID NO：3中所示的核苷酸序列；（c）編碼SEQ ID NO：7中所示多肽的核苷酸序列；（d）編碼對SEQ ID NO：7中所示胺基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％序列一致性的多肽的核苷酸序列，其中該多肽包括本文所述的至少一個突變；（e）對SEQ ID NO：2中所示核苷酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％一致性且編碼如本文所述的轉譯起始因子eIF4e 的多肽的核苷酸序列；（f）對SEQ ID NO：3中所示胺基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％一致性且編碼如本文所述的轉譯起始因子eIF4e 的多肽的核苷酸序列；或（g）與（a）至（f）中任一個完全互補的核苷酸序列。
在一個替代實施方式中，與野生型木瓜相較，本發明可以提供對木瓜輪點病毒感染具有增加的抗病性的木瓜植株，包括在其基因組中併入（a）SEQ ID No. 21中所示的核苷酸序列；（b）編碼SEQ ID No. 25中所示多肽的核苷酸序列；（c）編碼對SEQ ID NO：25中所示胺基酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％序列一致性的多肽的核苷酸序列，其中該多肽包括本文所述的至少一個突變；（d）對SEQ ID NO：21中所示核苷酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％一致性且編碼如本文所述的轉譯起始因子eIF(iso)4e 的多肽的核苷酸序列；或（e）與(a)至(d)中任一個完全互補的核苷酸序列。
在一方面，本發明可提供一種木瓜植株，該木瓜植株與野生型木瓜植株相較下對木瓜輪點病毒具有增加的抗性，該木瓜植株包括eIF4e 基因中的突變，使得其在對應的核苷酸序列中引入終止密碼子，使其產生非功能性多肽。
在一方面，本發明可以提供一種木瓜植株，該木瓜植株與野生型木瓜植株相較下對木瓜輪點病毒具有增加的抗性，該木瓜植株包括eIF(iso)4e 基因中的突變，使得其產生非功能性多肽。
因此，本發明的一個方面可以提供產生木瓜植株的方法，該木瓜植株對木瓜輪點病毒具有增加的抗性，該方法由數個步驟建立，該步驟包括：
a. 以誘變劑處理木瓜種子並種植這些植株；
b. 萃取DNA及/或RNA、以及分析子代木瓜植株以偵測導致非功能性eIF4e及/或eIF(iso)4e蛋白質的eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因/ RNA轉錄本的至少一個複本中的至少一個突變；
c. 選擇攜帶該突變且表現型上具有對木瓜輪點病毒的增加的抗性的後代木瓜植株；
d. 藉由在疾病存在下種植該後代木瓜植株以直接選出增加的抗病性。
e. 重複種植以及培養該後代木瓜植株的循環，以產生對木瓜輪點病毒具有增加抗性的其他植株；以及
f. 將兩個品系組合以產生雜種，兩個品系對於兩個親本中存在的eIF4e 基因中的突變是同型接合的；或者將兩個親本中存在的eIF(iso)4e 基因中的同型接合的突變體進行組合以產生雜種；或者將兩種不同親本植株中存在的eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因中的同型接合的突變體進行組合以藉由基因堆疊產生雜種。
本發明的另一方面可提供含有木瓜果實的食物以及食品，木瓜果實具有由eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因突變導致非功能的eIF4e及/或eIF(iso)4e蛋白質所引起對木瓜輪點病毒的增加的抗性。
本發明提供優於習知技術的若干優點。TILLING方法導致產生穩定的突變木瓜植株，該突變木瓜植株經由木瓜基因組中的新突變而顯現出對木瓜輪點病毒的抗病性增加。與其他方法（例如，基因轉殖方法、以及習知技術中該具有極大難度的與野生種雜交）相較，本發明中使用的方法既新穎又具有進步性並且具有成本效益。本發明的木瓜植株導致用於控制木瓜輪點病毒載體的農用化學品的使用減少。本發明產生更容易被全世界的消費者接受的非基因轉殖植株。這些以及其他優點將在下面的實例中進一步說明。以下實例僅作為說明而被提供、且並非限制。應理解，下面的突變僅僅是範例性的，並且也考慮了導致非功能性蛋白質的類似突變。
實例：
實例 1 ：誘變 以及DNA 萃取
將育種品系（BVC＃13243-2398）的木瓜種子（10,000個種子，稱為M0）以水洗滌並以1M KNO3 處理，然後置於振盪器（100 rpm）上隔夜培養。在通風櫥中，將誘變劑甲磺酸乙酯（EMS）加入到浸潤種子中，至最終濃度範圍約0.1％至約1.6％（v/v）。然後將處理過的種子（稱為M1）培養為期6至12小時，接著用流水沖洗種子約1小時。將經誘變的種子種植在穴盤中並使其在苗圃中發芽。將4至6週齡的植株轉移到田地中以生長成完全成熟的M1植株。成熟的M1植株上的花是兩性花並且自花授粉，然後從各個植株收集M2種子。
根據製造商的說明，使用Qiagen植物DNA萃取試劑盒進行M2的DNA萃取。將每個M2族的10個種子播種在溫室內的育苗盆中，並從四個葉期M2植株收集葉子。將葉樣本收集在96孔收集盤中，每孔含有兩個4mm鋼珠。在DNA萃取前，將樣本在液態氮中冷凍並儲存在-80℃。用於DNA萃取的操作步驟來自DNeasy 96-植物試劑盒（Qiagen-Hilden，Germany）。在定制的振動震盪器的幫助下將樣本研磨成粉末（Abraham等人，2009年）。所萃取的基因組DNA在0.8％w/v瓊脂糖凝膠（Invitrogen）上運行以檢查品質。用Nanodrop（Implen）定量M2 DNA的量。將M2 DNA標準化至50 ng/µl，製備8倍合併盤以用於TILLING。
實例 2 ：突變偵測
藉由在5ng木瓜M2基因組DNA上使用標的基因特異性引子進行巢式PCR。第一個N1 PCR擴增產物（1 µl）是藉由稀釋1:10（作為巢式PCR的模板）、使用5'端紅外染料（IRD）標記的IRD700以及IRD800 M13通用引子組合、以及具有M13序列的未標記N2引子以及N1引子序列的區段而被使用。
實例 3 ：生物資訊學分析
CODDLE（用於發現有害病變所最佳化的密碼子）用於確定標的基因的區域，其中已發生了G/C至A/T轉換，該轉換最可能導致對蛋白質的有害影響。PARSESNP（項目比對相關序列及評估SNP）用於說明標的基因內的突變分佈、以及表明每個單一突變的性質。為了預測突變對標的蛋白質序列的影響，進行了SIFT（耐受性與不耐受性分類）分析以及PPOPEN軟體分析。使用ClustalW以用於關注的基因的多序列對準。根據M13 TILLING系統為每一個基因設計引子（Triques等人，2007年）。藉由Primer 3軟體設計用於eIF4e （SEQ ID NO：8至19）以及eIF(iso)4e （SEQ ID NO：26至49）的TILLING引子，並進行進一步的TILLING。
實例 4 ：突變的鑑別以及評估（ TILLING 篩選）
來自法國INRA-URGV的M13 TILLING方法（Triques等人，2008年；Triques等人，2007年）用於篩選木瓜突變體族群。用於M13 TILLING的工作流程由設計用於突變篩選的基因的序列特異性引子開始。序列特異性反應的PCR條件是94℃的初始變性5分鐘；35個循環的94℃變性10秒、55℃黏合15秒、以及在72℃延長1分30秒；以及72°C的最後延長5分鐘，然後冷卻至4°C。藉由使用基因特異性反應的PCR產物作為模板，複合紅外標記的M13通用引子。巢式標記反應的PCR條件如下：94℃的初始變性5分鐘以及10個循環的94℃變性15秒、60℃黏合30秒、以及在72℃的延長1分30秒（特異於基因序列）；以及25個循環的94℃15秒、50℃30秒以及在72℃的延長1分30秒（特異於M13通用引子），以及72°C的最終延長5分鐘，然後冷卻至4°C。然後將標記的樣本載入瓊脂糖凝膠中以觀察並獲得應該採用多少PCR產物進行ENDO-1分解的概念。然後使樣本通過RAMP反應，其中樣本在94℃變性並以每秒-0.1℃的速率逐漸冷卻至8°C，以增強異源雙股的形成。然後將PCR產物用於在45℃下進行ENDO-1分解20分鐘，並加入5 µl 的0.15 M EDTA（pH-8.0）以終止該反應。然後使樣本通過葡聚醣凝膠（Sephadex）（GE，G-50，培養基）以純化DNA樣本。藉由在45 µl葡聚醣凝膠柱載入器的幫助下將等量混合到94孔微孔過濾盤（Multiscreen-HV，MAHVN4550）的孔中來製備葡聚醣凝膠。將葡聚醣凝膠轉移到過濾盤上後，加入約325 µl無菌蒸餾水以使葡聚醣凝膠膨脹，這需要培養至少1小時。藉由在500 G下旋轉2分鐘以將過量的水離心。以5 µl甲醯胺跑膠染料將樣本盤安裝到過濾盤上。在停止ENDO-1分解後，​​將樣本轉移到Sephadex G-50柱中，然後再次離心以在甲醯胺盤上獲得純化的樣本。將濾液於真空離心濃縮器中在65℃下進一步乾燥約1小時至5 µl。此外，樣本在裝載到遺傳分析儀（Licor，4300）之前變性。
LICOR 4300 系統上的丙烯醯胺凝膠
徹底清潔TILLING凝膠盤，且凝膠盤以及導軌是藉由將前盤以及後盤分別放置在平坦表面上而被配對。將盤夾在0.25 mm間隔物中。取出17.5 ml KB+ LICOR 6.5%凝膠基質，以及加入並輕輕混合196 µl 10％過硫酸銨以及19.6 µl。以20 ml注射器吸取混合物，並藉由輕輕敲擊前盤將凝膠擠入後盤。將塑料梳（plastic comb）（0.25mm）插入盤之間並使其聚合約90分鐘。在聚合後，移除鑄製梳，以及用Milli-Q水徹底清洗玻璃盤，以避免丙烯醯胺凝膠持續存在於外表面上。將清潔的盤置於Licor儀上，並用1X三羥甲基氨基甲烷（Tris）硼酸鹽EDTA（TBE）（Licor）緩衝液填充上部以及下部槽。用注射器清潔凹口，並開始注射針預運行，其在以下條件下進行20分鐘，即1500V、40W、40mA以及45℃。將變性的樣本與尺寸標記物在93℃下變性3分鐘，並將兩者置於冰上。使用8爪移液管將1.0 µl樣本裝載至冷樣本裝載盤上，在裝載時應將樣本裝載盤保持在冰上。藉由將膜梳插入盤中幾秒鐘來吸收樣本直至完全吸收，將梳在室溫下保持2分鐘以進行乾燥。以1X TBE緩衝液清潔凹口，且將梳子快速插入，但是以45度角輕輕插入，左邊是樣本。系統用槽蓋以及金屬絲網封閉。開始運行的條件與預運行的條件相同，最初為4分鐘，然後移出梳，且以1X TBE清洗凹口並重新開始運行。分別用IRD700以及IRD800的紅光點以及綠光點偵測TILLING圖像，圖像是使用Licor 4300提供的軟體對每個螢光圖像用黑白圖片表示。在所有七個超級庫（SP）上的eIF4e 以及eIF(iso)4e 基因上進行了TILLING。並且對可能的突變體進行了進一步的解卷積。藉由定序確認TILLING突變體，並確認突變的位置。藉由TILLING進行基因型分型以及定序以發現M2種子對於所獲得的突變是否是同型接合/異型接合/野生型。
下表1列出了在eIF4e 基因中使用TILLING方法篩選後獲得的各種突變。
表1：
下表2列出了在eIF(iso)4e 基因中使用TILLING方法篩選後獲得的各種突變。
表2：
實例 5 ：藉由人工接種的突變體的表現型分析
為了製備試驗植株，藉由將種子浸泡在水中3天且接著轉移到一層濕布中進行預發芽。種子在室溫培養3天。在預發芽之後，將種子播種在具有木瓜培養基（3:1-椰粉：砂）的單獨的聚乙烯袋中。幼苗每星期一次用硝酸鈣浸泡、並施用殺真菌劑（普拔克(promocarb hydrochloride)/滅達樂(Metalaxyl)以防止立枯病問題。木瓜突變株生長至8葉期，且從PRSV感染的症狀葉製備接種物。為了能夠確定將作為PRSV的良好繁殖宿主的適合品種，接種易感木瓜對照組並評估以及比較其疾病嚴重性。藉由比較兩種接種物稀釋液（1:5以及1:10）確定適合的接種物濃度。第一以及第二完全展開的葉的病毒力價是使用它們的ELISA值而進行比較，在接種後的不同天（DAI）（7天、14天以及21天）收集葉樣本。收集來自PRSV感染幼苗的年輕有症狀的葉（較佳是接種後14至21天），並使用攪拌器或研缽及研杵以1：5稀釋液（在10ml接種緩衝液中2g的受感染木瓜葉）在驟冷的接種緩衝液中均質化。病毒均質液然後經由一層紗布過濾，並從1：5稀釋液製備1:10稀釋液。30天齡的幼苗是使用海綿在上部葉表面上接種含有矽藻土的冰冷接種物（5g/升），並在5分鐘後用自來水洗滌，以除去葉子表面上的矽藻土以及植株殘渣（第1圖）。第一次接種後那一天重複接種。在接種後的不同時間（7、14以及21天）評估症狀發展、疾病嚴重性以及發病率。使用如下的0至4等級，基於21天的疾病嚴重性對接種的幼苗進行分級（表3）：
表3：
計算病毒負荷量的值，並基於嚴重性分級將病毒負荷量的值與突變的百分比（％）增加進行相關。因此，與野生型木瓜植株相較，0等級可以與抗病性增加99至100％相關。M2(0.3)-1709是根據本發明的eIF4e 突變體木瓜。M2(0.4)-740是eIF(iso)4e 內含子突變。M2(0.4)-882是在位置70帶有Y至C的胺基酸改變（Y70C）的eIF4e(iso) 誤義突變體。下表顯示了觀察結果（表4）。
表4：突變體與野生型木瓜植株對PRSV抗性的表現型觀察。
表4：
*健康對照組的平均 X 2.5
上表清楚地表示出，與作為正控制植株的野生型以及其他突變體(M2(0.4)-740, 882)相較下，eIF4e 突變體具有增加的抗性。清楚地觀察到所有抗性植株具有0.069的低病毒負荷量OD值，解釋為比顯現出0.787的高病毒負荷量OD值的野生型易感植株增加100％的抗性。當與正控制組相較下，一些突變植株顯現出抗性增加了90％。藉由TILLING以及藉由基因型分型證實的所有同型接合突變體在接種後均未顯現症狀，而正控制組（易感對照組）在木瓜植株中顯現出PRSV感染典型的嚴重斑紋以及發育遲緩效應（第2圖）。在進行標準ELISA時，必須包括負控制組，這些負控制組是指健康對照組。從未受PRSV攻擊的幼苗中取三個健康對照組。為了計算我們可以表示樣本受PRSV感染的臨界值，我們採用3個健康對照組的平均讀數並將其乘以2.5。並且此計算值（=正值）是臨界值。任何高於或等於「正值」者都意味著其受PRSV感染。如果該值低於臨界值，則表示其未受PRSV感染。正對照組是正控制組 - 來自PRSV感染植株的葉子。
無
第1圖顯示出木瓜輪點病毒感染的疾病嚴重性程度分級。
第2圖顯示出木瓜M2(0.3)-1709突變體幼苗表現出對木瓜輪點病毒的抗性以及感染等級；S對照是易感對照，即正控制。

Claims (20)

  1. 一種木瓜植株，由於一eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因中的一突變導致非功能性eIF4e及/或eIF(iso)4e蛋白質，該木瓜植株與一野生型植株相較下具有對一木瓜輪點病毒的一增加的抗性。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的木瓜植株，其中該植株包括完整植株、植物細胞、種子及/或果實。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的木瓜植株，其中該突變是一非基因轉殖的、誘發的突變。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的木瓜植株，其中該突變以及偵測是使用一定向誘導基因組局部突變（TILLING）方法、一鋅指核酸酶（ZFN）方法、一寡核苷酸定點誘變（ODM）方法、一TALENS方法、一CRISPR-CAS9方法而進行。
  5. 如申請專利範圍第1項所述的木瓜植株，其中該突變在該eIF4e 基因的核苷酸序列中引入抑制該功能性eIF4e蛋白質的轉譯的一終止密碼子。
  6. 如申請專利範圍第1項所述的木瓜植株，其中該突變包括該eIF4e 基因中的一核苷酸位置2112處的一G至A置換(G2112A)的一修飾。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的木瓜植株，其中與一野生型木瓜植株相較下具有增加的抗性的該植株編碼對SEQ ID NO：2具有至少80至95%一致性的核苷酸序列。
  8. 如申請專利範圍第1項所述的木瓜植株，其中該突變包括該eIF(iso)4e 基因中的一位置2046處的一G至A核苷酸序列(G2046A)的一修飾，該修飾抑制該功能性eIF(iso)4e蛋白質的eIF(iso)4e 基因的轉譯。
  9. 如申請專利範圍第1項所述的木瓜植株，其中所誘發的該突變導致該蛋白質中的一G105E 突變。
  10. 如申請專利範圍第1項所述的木瓜植株，其中與一野生型木瓜植株相較下具有增加的抗性的該植株編碼對SEQ ID NO：2具有至少80至95%一致性的核苷酸序列。
  11. 如申請專利範圍第1項所述的木瓜植株，其中與一野生型木瓜植株相較下具有增加的抗性的該植株編碼對SEQ ID NO：3具有至少80至95%一致性的核苷酸序列。
  12. 如申請專利範圍第1項所述的木瓜植株，其中與一野生型木瓜植株相較下具有增加的抗性的該植株編碼對SEQ ID NO：21具有至少80至95%一致性的核苷酸序列。
  13. 如申請專利範圍第1項所述的木瓜植株，其中該植株與一野生型木瓜植株相較下具有增加的抗性，其中該eIF4e及/或eIF(iso)4e基因中的該突變是藉由一誘變劑誘發且使用一TILLING方法而被偵測。
  14. 如申請專利範圍第1項所述的木瓜植株，其中該突變是一點突變、一缺失、或一插入。
  15. 一種產生對一木瓜輪點病毒具有一增加的抗性的一木瓜植株的方法，該方法包括： (a) 以一誘變劑處理木瓜種子以及種植這些植株； (b) 萃取一DNA及/或一RNA、以及分析後代木瓜植株以偵測導致非功能性eIF4e及/或eIF(iso)4e蛋白質的一eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因/RNA轉錄本的至少一複製中的至少一突變； (c) 選擇攜帶該突變、以及表現出對木瓜輪點病毒具有增加的抗性的後代木瓜植株； (d) 重複種植以及培養該後代木瓜植株的循環，以產生對木瓜輪點病毒具有一完全抗性的其他植株；以及 (e) 將兩個親本中存在的eIF4e 基因中的同型接合突變體進行組合以產生一雜種；或者，將該兩個親本中存在的eIF(iso)4e 基因中的同型接合突變體進行組合以產生一雜種；或者，將兩種不同親本植株中存在的eIF4e及/或eIF(iso)4e中的同型接合突變體進行組合以藉由基因堆疊而產生一雜種。
  16. 如申請專利範圍第15項所述的方法，其中該誘變劑是從甲基磺酸乙酯（EMS）、甲基磺酸甲酯（MMS）、N-乙基-N-亞硝基尿素（ENU）、三乙基三聚氰胺（TEM）、N-甲基-N-亞硝基尿素（MNU）、甲基苄肼、氯芥苯丁酸、環磷醯胺、硫酸二乙酯、丙烯醯胺單體、黴法蘭、氮芥、長春新鹼、二甲基亞硝胺、N-甲基-N'-硝基-亞硝基胍(MNNG)、亞硝基胍、2-胺基嘌呤、7,12二甲基苯并(a)蒽(DMBA)、環氧乙烷、六甲基磷酸三胺、白消安、二環氧烷烴（二環氧辛烷（DEO）、二環氧丁烷（BEB）等）、2-甲氧基-6-氯-9[3（乙基-2-氯-乙基）胺基丙胺基]吖啶二鹽酸鹽(ICR- l 70)、以及甲醛中選出的一化學誘變劑。
  17. 如申請專利範圍第15項所述的方法，其中該突變是一點突變、一缺失、或一插入。
  18. 如申請專利範圍第16項所述的方法，其中偵測至少一突變包括SEQ ID NO：8至19以及26至49中所示的引子序列。
  19. 如申請專利範圍第21項所述的方法，其中PCR擴增產物與一核酸內切酶一起培養，該核酸內切酶優先切割野生型與突變序列之間異源雙股中的錯配。
  20. 一種包括一木瓜果實的食品，該木瓜果實由於一eIF4e 及/或eIF(iso)4e 基因中的一突變導致非功能性eIF4e及/或eIF(iso)4e蛋白質而具有對一木瓜輪點病毒的一增加的抗性。
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