TW201930593A

TW201930593A - 用於複雜且無偏見之溶液剖析的組成物和方法

Info

Publication number: TW201930593A
Application number: TW107131949A
Authority: TW
Inventors: 安德魯弗雷瑟; 德克史丹普
Original assignee: 英商卡美納生物科學公司
Priority date: 2017-09-11
Filing date: 2018-09-11
Publication date: 2019-08-01
Also published as: WO2019051470A1

Abstract

本發明揭示包含多個非活性核酸生物傳感器(NAB)之組成物，其中該多個NAB的各NAB包含：(a)至少一個可變區，其中該可變區包含至少一個生物分子結合結構域和(b)恆定區，其中該多個非活性NAB(c)識別二或更多個不同之生物分子；(d)識別在至少一個生物分子上之二或更多個不同部位；(e)正向選擇至少一個生物分子且負向選擇至少一個生物分子；或(f)識別至少一個在閾值濃度之第一側具有高親和力但在該閾值濃度之第二側不具有高親和力之生物分子。

Description

用於複雜且無偏見之溶液剖析的組成物和方法

本發明提供用於選擇特定生物分子傳感器及檢測複雜生物流體中之許多小的特定生物分子之組成物和方法。

就組成分子而言，對於生物流體之組成的了解對許多現代應用是必不可少的。例如，存在於生物流體中之代謝物濃度之變化性可表明人類健康的深刻狀態。現存之小分子檢測技術對目前之分子診斷市場通常服務欠佳，該小分子檢測技術利用對個人使用來說太昂貴且檢測能力太慢，並對護理點適用性而言有限的儀器。本發明提供用於選擇特定之生物分子傳感器及檢測許多小的特定生物分子之組成物和方法，其提供解決方案來滿足本技藝中對以廉價方法來鑑定和量化在任何指定之生物液體中之全部代謝物和其他特定生物分子的需求。

本發明提供用於選擇特定之生物分子傳感器及檢測在複雜生物溶液中之許多小的特定生物分子之組成物和方法。該組成物和方法允許鑑定核酸生物傳感器(NAB)之宿主、鑑定先前已知或未知之該NAB的同源特定生物分子及排列或多重分析數種或數千種NAB以同時檢測和量化在分析物組成物中之多種特定生物分子。本發明中，多種分析物在溶液中為游離的，在接觸前不固定在固體支持物上。

本發明提供包含多個非活性核酸生物傳感器(NAB)之組成物，其中該多個NAB之各個NAB包含：(a)至少一個可變區，其中該可變區包含至少一個生物分子結合結構域和(b)至少一個恆定區，其中該多個非活性NAB(c)識別二或更多個不同之生物分子；(d)識別在至少一個生物分子上之二或更多個不同部位；(f)正向選擇至少一個生物分子且負向選擇至少一個生物分子，或(g)識別至少一個在低濃度下具有高親和力之生物分子且在相對較高之濃度下具有相對較低之親和力的該相同之生物分子。

本發明提供包含多個非活性核酸生物傳感器(NAB)之組成物，其中該多個NAB之各個NAB包含：(a)至少一個可變區，其包含至少一個生物分子結合結構域 (b)至少一個恆定區，或(c)至少一個具有可變區和恆定區之替換對，其中該可變區包含至少一個生物分子結合結構域，其中該多個非活性NAB(d)識別二或更多個不同之生物分子；(e)識別在至少一個生物分子上之二或更多個不同部位；(f)正向選擇至少一個生物分子且負向選擇至少一個生物分子，或(g)識別至少一個在低濃度下具有高親和力之生物分子且在相對較高之濃度下具有相對較低之親和力的該相同之生物分子。於某些實施態樣中，該至少一個恆定區包含至少一個報告子構建體。

本發明提供包含多個非活性核酸生物傳感器(NAB)之組成物，其中該多個NAB之各個NAB包含：(a)至少一個可變區，其包含至少一個生物分子結合結構域(b)至少一個恆定區，其中該恆定區包含至少一個報告子構建體，或(c)至少一個具有可變區和恆定區之替換對，其中該可變區包含至少一個生物分子結合結構域且其中該恆定區包含至少一個報告子構建體，其中該多個非活性NAB(d)識別二或更多個不同之生物分子；(e)識別在至少一個生物分子上之二或更多個不同部位；(f)正向選擇至少一個生物分子且負向選擇至少一個生物分子；或(g)識別至少一個在低濃度下具有高親和力之生物分子且在相對較高之濃度下具有相對較低之親和力的該相同之生物分子。

於本發明之組成物的某些實施態樣中(包括那些其中該多個NAB之各個NAB包含至少一個具有可變區和恆定區之替換對者)，該至少一個包含(a)之可變區和恆定區之替換對包含二級結構。於某些實施態樣中，該至少一個包含(a)之可變區和恆定區之替換對包含三級結構。於某些實施態樣中，該至少一個包含(a)之可變區和恆定區之替換對包含四級結構。於某些實施態樣中，該至少一個包含(a)之可變區和恆定區之替換對包含莖-環結構。於某些實施態樣中，該莖-環結構包含二個莖。於某些實施態樣中(包括其中該莖-環結構包含二個莖者)，該莖-環結構包含核苷酸序列，該核苷酸序列包含
ACTGNNNNATACNNNNNNNGTATNNNNCAGT。於某些實施態樣中，該莖-環結構包含三個莖。於某些實施態樣中，該至少一個包含(a)之可變區和恆定區之替換對形成四聯體結構。於某些實施態樣中，該四聯體結構為G-四聯體。於某些實施態樣中，該G-四聯體包含核苷酸序列，該核苷酸序列包含NNNGGNNNGGNNNGGNNNGGNNN。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，該恆定區包含報告子構建體。於某些實施態樣中，該恆定區或該報告子構建體包含下列一或多者：親和劑、配體結合區、酶結構域和連接另一分子之連接部位。於某些實施態樣中，該可變結構域及/或恆定結構域進一步包含親和劑。於某些實施態樣中，該親和劑包含受體、抗體、肽、脫氧核糖核酸、核糖核酸、小分子或彼等之組合。於本發明之組成物的某些實施態樣中，該酶結構域裂解該NAB之RNA序列或DNA序列。於本發明之組成物的某些實施態樣中，該酶結構域裂解該NAB之至少一個可變區或至少一個恆定區中之RNA序列或DNA序列。於本發明之組成物的某些實施態樣中，該酶結構域裂解至少一個包含該NAB之可變區和恆定區之替換對中的RNA序列或DNA序列。於某些實施態樣中，該酶結構域裂解RNA，其中該酶結構域包含核酶。於某些實施態樣中，該核酶為自我裂解性。於某些實施態樣中，該自我裂解性核酶包含錘頭核酶(HHR)或核糖開關。於某些實施態樣中，該酶結構域裂解DNA序列，其中該酶結構域包含脫氧核酶。於某些實施態樣中，該脫氧核酶為自我裂解性。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，該酶結構域之活化導致NAB之RNA序列或DNA序列裂解。於某些實施態樣中，該可變區或恆定區包含雙股DNA(dsDNA)序列且該dsDNA包含限制性內切核酸酶之靶的部位。於某些實施態樣中，該酶結構域裂解DNA序列且其中該酶結構域包含內切核酸酶。於某些實施態樣中，該內切核酸酶為限制性內切核酸酶。於某些實施態樣中，該dsDNA靶部位之限制分解導致該可變區從恆定區裂解，或反之亦然。於某些實施態樣中，在該核酸靶的部位之限制分解導致該恆定區內裂解。於某些實施態樣中，在該核酸靶的部位之限制分解導致該可變區內裂解。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，該多個非活性NAB之各個NAB進一步包含一或多個用於可操作地連接表面之連接部位。於某些實施態樣中，該表面包含液體表面、固體表面、生物表面或彼等之組合。於某些實施態樣中，該固體表面包含固體支持物、固相基質、小珠、聚合物、複合物、碳複合物、塑料、玻璃、基本上平坦之表面、側流條、多重陣列或彼等之組合。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，該液體表面包含液滴。於某些實施態樣中，該液滴係經配製以流過微流體通道。於某些實施態樣中，該液滴包含一或多種試劑以促進與第二液滴之內容物接觸而產生產物液滴。於某些實施態樣中，該第二液滴之內容物包含分析物組成物

於本發明之組成物的某些實施態樣中，該表面包含液體表面和固體表面。於某些實施態樣中，該表面包含液滴，該液滴包含固體基質。於某些實施態樣中，該液滴係經配製以流過微流體通道。於某些實施態樣中，該液滴包含一或多種試劑以促進與第二液滴之內容物或彼等之內容物接觸而產生產物液滴。於某些實施態樣中，該第二液滴包含分析物組成物。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，該液滴包含液體體積和固體表面。於某些實施態樣中，該表面包含液滴，該液滴包含固體基質。於某些實施態樣中，該液滴係經配製以流過微流體通道。於某些實施態樣中，該液滴包含一或多種試劑以促進與第二液滴之內容物或彼等之內容物接觸而產生產物液滴。於某些實施態樣中，該第二液滴包含分析物組成物。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，該液滴僅為液相。於某些實施態樣中，該液滴包含固相基質。於某些實施態樣中，該液滴係經配製以流過微流體通道。於某些實施態樣中，該液滴包含一或多種試劑以促進與第二液滴之內容物或彼等之內容物接觸而產生產物液滴。於某些實施態樣中，該第二液滴包含分析物組成物。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，該生物表面包含細胞表面或細胞膜表面。於某些實施態樣中，該生物表面係從細胞分離或源自細胞。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，該生物表面為合成性。於某些實施態樣中，該生物表面主要包含下列之一或多種組分：轉錄組、分泌蛋白組、蛋白質組、微環境、幹細胞、分化之細胞、組織或系統。於某些實施態樣中，該生物表面係包含在微晶片上。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，該表面進一步包含選擇配體。於某些實施態樣中，該選擇配體與該恆定區內之親和劑、配體結合區或彼等之組合結合。於某些實施態樣中，該選擇配體與該可變區內之親和劑和/或配體結合區結合。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，該多個非活性NAB中至少一個NAB進一步包含與至少一個生物分子結合結構域結合之生物分子，從而產生至少一個活化之NAB。於某些實施態樣中，該多個非活性NAB之一部分進一步包含與至少一個生物分子結合結構域結合之生物分子，從而產生多個活化之NAB。於某些實施態樣中，該進一步包含生物分子之多個非活性NAB的一部分占該多個非活性NAB之至少1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或其間之任何百分比。於某些實施態樣中，該進一步包含生物分子之多個非活性NAB的一部分與所有生物分子結合結構域之至少1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或其間之任何百分比結合。於某些實施態樣中，該多個非活性NAB之各NAB進一步包含與至少一個生物分子結合結構域結合之生物分子，從而產生多個活化之NAB。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，生物分子與該至少一個生物分子結合結構域結合可誘導該多個活化之NAB的各個活化之NAB之構象變化。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，該構象變化增加該配體結合區對選擇配體之親和力。該實施態樣稱為“經誘導之親和力”模式。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，該構象變化誘導該酶結構域之活性，從表面釋出該活化之NAB。該實施態樣稱為“經誘導之活性”模式。於某些實施態樣中，該酶結構域之活性為自我裂解性。於某些實施態樣中，該酶結構域之活性裂解可變區或恆定區之dsDNA。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，該可變區或恆定區進一步包含報告子構建體。於某些實施態樣中，該報告子構建體包含螢光團或發色團。於某些實施態樣中，該報告子構建體修飾該螢光團或發色團。於某些實施態樣中，該活性報告子構建體增強該發色團或螢光團之螢光活性。於某些實施態樣中，該發色團或螢光團包含孔雀石綠、(5Z)-5-[(3,5-二氟-4-羥苯基)伸甲基]-3,5-二氫-2,3-二甲基-4H-咪唑-4-酮、(Z)-4-(3,5-二氟-4-羥基亞苄基)-1,2-二甲基-1H-咪唑-5(4H)-酮(DFHBI)或與DFHBI結合之Spinach適體。於某些實施態樣中，該發色團包含共軛結合之π鍵系統或金屬複合物。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，該可變區或恆定區進一步包含淬滅劑構建體。於某些實施態樣中，去活化之NAB包含報告子構建體和淬滅劑構建體，該報告子構建體和淬滅劑構建體之定位使該淬滅劑構建體抑制該報告子構建體之信號。於某些實施態樣中，該經活化之NAB包含報告子構建體和淬滅劑構建體，該報告子構建體和淬滅劑構建體之定位使該淬滅劑構建體無法抑制該報告子構建體之信號，從而從該活化之NAB的報告子構建體產生可檢測之信號。於某些實施態樣中，該報告子構建體和淬滅劑構建體為分開之分子。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，多個NAB之各個非活性或活性NAB進一步包含第二可變區，其中該第二可變區包含生物分子結合結構域且其中該恆定區係位於第一可變區與第二可變區之間。該實施態樣被稱為“雜交體破壞”。於某些實施態樣中，該第二可變區進一步包含用於可操作地連接表面之連接部位。於某些實施態樣中，該第一可變區、恆定區和第二可變區中一或多者包含報告子構建體。於某些實施態樣中，該恆定區包含報告子構建體。於某些實施態樣中，該報告子構建體包含二或更多個單獨之結構域。於某些實施態樣中，該報告子構建體包含螢光團、發色團、淬滅劑、發色團-結合結構域或彼等之組合

於本發明之組成物的某些實施態樣中，各個非活性NAB之恆定區包含第一雜交序列，該第一雜交序列與第二核酸之恆定區中之序列具有足夠的互補性以形成相對穩定之雜交體。於某些實施態樣中，該第二核酸包含恆定區。於某些實施態樣中，該恆定區包含第二雜交序列，該第二雜交序列與該多個非活性NAB之各個NAB的恆定區中之序列具有至少足夠之互補性以形成相對穩定的雜交體。於某些實施態樣中，用於形成相對穩定之雜交體的足夠互補性為至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或其間之任何百分比的互補性。於某些實施態樣中，用於形成相對穩定之雜交體的足夠互補性為100%互補性。於某些實施態樣中，該相對穩定之雜交體在介於周圍室溫和體溫之間的溫度下穩定，或在介於約23℃和約37℃之間的溫度(包括端點溫度)下穩定。於某些實施態樣中，該多個NAB之各個非活性NAB透過形成雙股區與該第二核酸雜交，該雙股區包含該第一雜交序列和第二雜交序列。於某些實施態樣中，該第二核酸之恆定區進一步包含用於可操作地連接表面之連接部位。於某些實施態樣中，該第二核酸之恆定區進一步包含淬滅劑構建體。於某些實施態樣中，該淬滅劑構建體抑制來自該非活性NAB之報告子構建體的信號。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，該第二可變區進一步包含連接子。於某些實施態樣中，該連接子包含彈性連接子、剛性連接子或可裂解性連接子。於某些實施態樣中，該連接子包含生物聚合物或合成聚合物。於某些實施態樣中，該連接子包含DNA、RNA、聚乙二醇(PEG)、肽鏈、胺基酸或彼等之任何組合。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，該去活化之NAB進一步包含與該第一生物分子結合結構域和/或第二生物分子結合結構域結合之生物分子，從而產生活化之NAB。於某些實施態樣中，該生物分子與該第一生物分子結合結構域和/或第二生物分子結合結構域之結合可誘導該多個活化之NAB的各個活化之NAB之構象變化。於某些實施態樣中，該構象變化破壞該包含該第一雜交序列和第二雜交序列之雙股區的雜交。於某些實施態樣中，其中該構象變化將髮夾結構引入各個活性NAB之恆定區。於某些實施態樣中，該生物分子與該第一生物分子結合結構域和/或第二生物分子結合結構域之結合使該活性NAB之報告子構建體與第二核酸之淬滅劑構建體分開，從而從該報告子構建體釋出可檢測之信號。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，該生物分子與生物分子結合結構域之結合可誘導該可變結構域之構象變化且其中該構象變化產生用於配體之結合部位。於某些實施態樣中，該配體包含用於表面之連接部位。於某些實施態樣中，該配體係可操作地連接該表面。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，該多個NAB之各個非活性NAB或各個活性NAB包含DNA序列、RNA序列、XNA序列、肽序列或雜交分子。於某些實施態樣中，該DNA序列包含L-DNA。於某些實施態樣中，該RNA序列包含2'-NH2-RNA、L-RNA或2'F-RNA。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，該生物分子包含小分子。於某些實施態樣中，該小分子包含初級代謝物、中心代謝物、次級代謝物、離子、核酸或胺基酸。於某些實施態樣中，該小分子等於或小於500千道耳吞(kDa)。

於某些實施態樣中，本發明之組成物進一步包含分析物組成物。於某些實施態樣中，該分析物組成物包含多種代謝物。於某些實施態樣中，該多種代謝物不與表面結合。於某些實施態樣中，該分析物組成物包含液體。於某些實施態樣中，該分析物組成物係源自生物流體或生物固體。於某些實施態樣中，該生物流體為未經加工或原始的生物流體。於某些實施態樣中，該生物流體為經加工之生物流體。於某些實施態樣中，該經加工之生物流體係源自生物固體。於某些實施態樣中，該生物流體係經過濾。於某些實施態樣中，該過濾包含尺寸排阻色層分析或凝膠過濾。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，該分析物組成物進一步包含多個反應性小分子。於某些實施態樣中，該多個反應性小分子之至少一個反應性小分子修飾下列群組之一或多者：胺、硫醇、醇、醛、酮、胺基酸、還原糖、類固醇、羧酸、羧醯胺、脂質分子和有機分子。於某些實施態樣中，該多個反應性小分子之一部分修飾下列群組之一或多者：胺、硫醇、醇、醛、酮、胺基酸、還原糖、類固醇、羧酸、羧醯胺和有機分子。於某些實施態樣中，該多個反應性小分子之一部分包含該多個反應性小分子之至少1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或其間之任何百分比。於某些實施態樣中，該多個反應性小分子之各個反應性小分子修飾下列群組之一或多者：胺、硫醇、醇、醛、酮、胺基酸、還原糖、類固醇、羧酸、羧醯胺和有機分子。

於本發明之組成物的某些實施態樣(包括其中該分析物組成物包含多個反應性小分子者)中，該多個反應性小分子中至少一個反應性小分子係可操作地連接表面。於某些實施態樣中，該多個反應性小分子之一部分係可操作地連接表面。於某些實施態樣中，該多個反應性小分子之一部分包含該多個反應性小分子之至少1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或其間之任何百分比。於某些實施態樣中，該多個反應性小分子中之各個反應性小分子係可操作地連接表面。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，該多個NAB之至少一個非活性或活性NAB包含該NAB之第一部分和該NAB之第二部分。於某些實施態樣中，該NAB之第一部分和該NAB之第二部分是分開的。於某些實施態樣中，該NAB之第一部分和該NAB之第二部分經連接或重新連接。於某些實施態樣中，該NAB之第一部分和該NAB之第二部分係藉由點擊化學反應連接或重新連接。於某些實施態樣中，該NAB之第一部分和該NAB之第二部分係藉由接合連接或重新連接。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，各個非活性或活性NAB包含該NAB之第一部分和該NAB之第二部分。於某些實施態樣中，該NAB之第一部分和該NAB之第二部分是分開的。於某些實施態樣中，該NAB之第一部分和該NAB之第二部分經連接或重新連接。於某些實施態樣中，該NAB之第一部分和該NAB之第二部分係藉由點擊化學反應連接或重新連接。於某些實施態樣中，該NAB之第一部分和該NAB之第二部分係藉由接合連接或重新連接。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，該生物流體包含體液。於某些實施態樣中，該體液包含尿液、血液、全血、血清、血漿、外周血、唾液、淚液、母乳、皮脂、精液、耳垢(cerumen)、糞便、滑液、淋巴液、間質液、汗液、腦脊液(CSF)、羊水、胸水或心包積液。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，該生物流體包含合成流體。於某些實施態樣中，合成流體包含消費者生物製品。於某些實施態樣中，該消費者生物製品包含飲料、食品、化妝品、香水或膳食補充劑。於某些實施態樣中，該膳食補充劑包含維生素、多種維生素、礦物質、金屬、代謝物、油或彼等之組合。在膳食補充劑方面，該實施態樣包含那些銷售或營銷不受任何政府機構管制者。於某些實施態樣中，該生物流體包含藥物、前藥、藥物中間體、藥物產品或彼等之組合。於某些實施態樣中，該藥物產品包含由藥物誘導之途徑的中間代謝物。於某些實施態樣中，該藥物產品包含核酸轉錄子、轉錄子變體、轉錄組之組分、蛋白質、蛋白質複合物、分泌之蛋白質、分泌蛋白組之組分、傳信分子或彼等之組合。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，各個非活性或活性NAB之第一部分包含該分裂蛋白之第一部分，其中各個非活性或活性NAB之第二部分包含該分裂蛋白之第二部分，其中包含該NAB之第一部和該NAB之第二部分的非活性NAB或活性NAB包含完整蛋白，且其中包含該NAB之第一部分但不包含該NAB之第二部分或包含該NAB之第二部分但不包含該NAB之第一部分的非活性NAB或活性NAB不包含完整蛋白。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，各個非活性或活性NAB之第一部分包含該分裂蛋白之第一部分，其中各個非活性或活性NAB之第二部分包含該分裂蛋白之第二部分，其中包含該NAB之第一部和該NAB之第二部分的非活性NAB或活性NAB包含完整蛋白，且其中包含該NAB之第一部分但不包含該NAB之第二部分或包含該NAB之第二部分但不包含該NAB之第一部分的非活性NAB或活性NAB不包含完整蛋白。於某些實施態樣中，該完整蛋白包含酶，其中該酶於呈完整蛋白時具有活性且其中該酶於呈分裂蛋白時不具有活性。於某些實施態樣中，該完整蛋白包含β-內醯胺酶、二氫葉酸還原酶(DHFR)、局部黏著斑激酶(FAK)、酵母轉錄因子、螢光蛋白、辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、煙草蝕刻病毒蛋白酶(TEV)或泛素。於某些實施態樣中，該酵母轉錄因子包含Gal4。於某些實施態樣中，該螢光蛋白包含綠色螢光蛋白(GFP)、紅外線螢光蛋白(IFP1.4)、螢光素酶或重組酶增強之雙分子螢光素酶(ReBiL)。於某些實施態樣中，該分裂蛋白可為單一結構域，諸如分裂泛素結構域、分裂ShK毒素結構域或分裂CCP結構域。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，該恆定結構域包含報告子構建體。於某些實施態樣中，該報告子構建體包含第一部分和第二部分。於某些實施態樣中，該報告子構建體之第一部分包含與分裂蛋白之第一部分連接的第一連接部位且該報告子構建體之第二部分包含與分裂蛋白之第二部分連接的第二連接部位。於某些實施態樣中，該完整蛋白包含該分裂蛋白之第一部分和該分裂蛋白之第二部分。於某些實施態樣中，該完整蛋白包含酶，其中該酶於呈完整蛋白時具有活性且其中該酶於呈分裂蛋白時不具有活性。於某些實施態樣中，該完整蛋白包含β-內醯胺酶、二氫葉酸還原酶(DHFR)、局部黏著斑激酶(FAK)、酵母轉錄因子、螢光蛋白、辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、煙草蝕刻病毒蛋白酶(TEV)或泛素。於某些實施態樣中，該酵母轉錄因子包含Gal4。於某些實施態樣中，該螢光蛋白包含綠色螢光蛋白(GFP)、紅外線螢光蛋白(IFP1.4)、螢光素酶或重組酶增強之雙分子螢光素酶(ReBiL)。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，各個非活性或活性NAB之第一部分包含分裂核酸結合部位之第一部分，其中各個非活性或活性NAB之第二部分包含分裂核酸結合部位之第二部分，其中包含該NAB之第一部分和該NAB之第二部分的非活性NAB或活性NAB包含完整之核酸結合部位，且其中包含該NAB之第一部分但不包含該NAB之第二部分及包含該NAB之第二部分但不包含該NAB之第一部分的非活性NAB或活性NAB不包含完整之核酸結合部位。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，各個非活性或活性NAB之第一部分包含分裂核酸結合部位之第一部分，其中各個非活性或活性NAB之第二部分包含分裂核酸結合部位之第二部分，其中包含該NAB之第一部分和該NAB之第二部分的非活性NAB或活性NAB包含完整之核酸結合部位，且其中包含該NAB之第一部分但不包含該NAB之第二部分及包含該NAB之第二部分但不包含該NAB之第一部分的非活性NAB或活性NAB不包含完整之核酸結合部位。於某些實施態樣中，包含該緊密並置之分裂核酸結合部位之第一部分和分裂核酸結合部位之第二部分的完整核酸結合部位包含連續(continuous)或接連(contiguous)序列，該連續或接連序列包含分裂核酸結合部位之第一部分和分裂核酸結合部位之第二部分。於某些實施態樣中，包含該緊密並置之分裂核酸結合部位之第一部分和分裂核酸結合部位之第二部分的完整核酸結合部位包含不連續序列，該不連續序列包含分裂核酸結合部位之第一部分和分裂核酸結合部位之第二部分。於某些實施態樣中，包含該緊密並置之分裂核酸結合部位之第一部分和分裂核酸結合部位之第二部分的完整核酸結合部位包含與已知或功能性核酸結合部位具有足夠同一性以保留結合功能，但與該已知或功能性核酸結合部位並不具有100%同一性之序列。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，該NAB之第一部分包含分裂核酸結合部位之第一部分，該NAB之第二部分包含分裂核酸結合部位之第二部分，其中活性NAB包含完整核酸結合部位，該完整核酸結合部位包含緊密並置之分裂核酸結合部位之第一部分和分裂核酸結合部位之第二部分且其中非活性NAB不包含完整核酸結合部位，該分裂核酸結合部位之第一部分和該分裂核酸結合部位之第二部分是分開的。於某些實施態樣中，包含緊密並置之分裂核酸結合部位之第一部分和分裂核酸結合部位之第二部分的完整核酸結合部位包含連續或接連序列，該連續或接連序列包含分裂核酸結合部位之第一部分和分裂核酸結合部位之第二部分。於某些實施態樣中，包含該緊密並置之分裂核酸結合部位之第一部分和分裂核酸結合部位之第二部分的完整核酸結合部位包含不連續序列，該不連續序列包含分裂核酸結合部位之第一部分和分裂核酸結合部位之第二部分。於某些實施態樣中，包含該緊密並置之分裂核酸結合部位之第一部分和分裂核酸結合部位之第二部分的完整核酸結合部位包含與已知或功能性核酸結合部位具有足夠同一性以保留結合功能，但與該已知或功能性核酸結合部位並不具有100%同一性之序列。

於本發明之組成物的某些實施態樣中，該NAB之第一部分包含分裂蛋白結合部位之第一部分，該NAB之第二部分包含分裂蛋白結合部位之第二部分，其中活性NAB包含完整蛋白結合部位，該完整蛋白結合部位包含緊密並置之分裂蛋白結合部位之第一部分和分裂蛋白結合部位之第二部分且其中非活性之NAB不包含完整蛋白結合部位，該分裂蛋白結合部位之第一部分和分裂蛋白結合部位之第二部分是分開的。於某些實施態樣中，包含緊密並置的分裂蛋白結合部位之第一部分和分裂蛋白結合部位之第二部分的完整蛋白結合部位包含連續或接連序列，該連續或接連序列包含分裂蛋白結合部位之第一部分和分裂蛋白結合部位之第二部分。於某些實施態樣中，包含緊密並置之分裂蛋白結合部位之第一部分和分裂蛋白結合部位之第二部分的完整蛋白結合部位包含不連續序列，該不連續序列包含分裂蛋白結合部位之第一部分和分裂蛋白結合部位之第二部分。於某些實施態樣中，包含該緊密並置之分裂蛋白結合部位之第一部分和分裂蛋白結合部位之第二部分的完整蛋白結合部位包含與已知或功能性蛋白結合部位具有足夠同一性以保留結合功能，但與該已知或功能性蛋白結合部位並不具有100%同一性之序列。

於某些實施態樣中，該完整核酸和/或蛋白結合部位允許與酶結合，其中該酶與完整之核酸和/或蛋白結合部位結合且其中該酶不與分裂核酸和/或蛋白結合部位結合。於某些實施態樣中，該核酸結合部位為DNA結合部位或RNA結合部位。於某些實施態樣中，該核酸和/或蛋白結合部位為DNA結合部位且其中該DNA為雙股DNA(dsDNA)。於某些實施態樣中，該完整dsDNA和/或蛋白結合部位允許與轉錄活化因子結合。於某些實施態樣中，該完整dsDNA和/或蛋白結合部位包含UAS序列且其中該完整dsDNA和/或蛋白結合部位允許與Gal4結合。於某些實施態樣中，該完整dsDNA和/或蛋白結合部位允許與轉錄遏制因子結合。於某些實施態樣中，該轉錄遏制因子包含λ遏制因子。

本發明提供一種檢測生物流體中至少一個生物分子之方法。於該方法之某些實施態樣中，步驟包括(1)處理該生物流體以保留至少一個生物分子並除去除該至少一個生物分子之外的一或多種組分以產生分析物組成物；(2)令分析物組成物與本發明之任一組成物的NAB組成物在適合允許該分析物組成物之至少一個生物分子與該NAB組成物之至少一個未經活化之NAB結合的條件下接觸以產生反應組成物，從而在該反應組成物中產生至少一個活化之NAB；及(3)檢測在該反應組成物中至少一個活化的NAB，從而檢測與該至少一個活化之NAB結合的至少一個生物分子。

於檢測生物流體中至少一個生物分子之方法的某些實施態樣中，步驟包括：(1)處理該生物流體以保留至少一個生物分子並除去除該至少一個生物分子之外的一或多種組分以產生分析物組成物；(2)令分析物組成物與本發明之任一組成物的NAB組成物在適合允許該分析物組成物之至少一個生物分子與該NAB組成物之至少一個未經活化之NAB結合的條件下接觸以產生反應組成物，從而在該反應組成物中產生至少一個活化之NAB；和(3) 檢測在該反應組成物中至少一個活化的NAB，從而檢測與該至少一個活化之NAB結合的至少一個生物分子。

於檢測生物流體中至少一個生物分子之方法的某些實施態樣中，步驟包括：(1) 處理該生物流體以保留至少一個生物分子並除去除了該至少一個生物分子之外的一或多種組分以產生分析物組成物；(2) 令分析物組成物與本發明組成物之某些實施態樣的NAB組成物適合允許該分析物組成物之至少一個生物分子與該NAB組成物之至少一個未經活化之NAB結合的條件下接觸以產生反應組成物，從而在該反應組成物中產生至少一個活化之NAB；及(3) 檢測在該反應組成物中至少一個活化之NAB，從而檢測與該至少一個活化之NAB結合的至少一個生物分子。

於檢測生物流體中至少一個生物分子之方法的某些實施態樣中，該分析物組成物包含至少2個、至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少60個、至少65個、至少70個、至少75個、至少80個、至少85個、至少90個、至少95個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少300個、至少350個、至少400個、至少450個、至少500個、至少550個、至少600個、至少650個、至少700個、至少750個、至少800個、至少850個、至少900個、至少950個、至少1000個、至少2000個、至少3000個、至少4000個、至少5000個、至少6000個、至少7000個、至少8000個、至少9000個、至少10,000個或至少任何數量之生物分子。

於檢測生物流體中至少一個生物分子之方法的某些實施態樣中，該方法檢測該反應組成物中至少2個、至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少60個、至少65個、至少70個、至少75個、至少80個、至少85個、至少90個、至少95個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少300個、至少350個、至少400個、至少450個、至少500個、至少550個、至少600個、至少650個、至少700個、至少750個、至少800個、至少850個、至少900個、至少950個、至少1000個、至少2000個、至少3000個、至少4000個、至少5000個、至少6000個、至少7000個、至少8000個、至少9000個、至少10,000個或至少其間任何數量之生物分子。

於檢測生物流體中至少一個生物分子之方法的某些實施態樣中，該方法檢測該反應組成物中至少1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或其間之任何百分比的生物分子。於某些實施態樣中，該分析物組成物包含至少二種不同之生物分子。於某些實施態樣中，該分析物組成物之各個生物分子為不同之生物分子。

於檢測生物流體中至少一個生物分子之方法的某些實施態樣中，在接觸分析物組成物之前，該NAB組成物包含至少2個、至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少60個、至少65個、至少70個、至少75個、至少80個、至少85個、至少90個、至少95個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少300個、至少350個、至少400個、至少450個、至少500個、至少550個、至少600個、至少650個、至少700個、至少750個、至少800個、至少850個、至少900個、至少950個、至少1000個、至少2000個、至少3000個、至少4000個、至少5000個、至少6000個、至少7000個、至少8000個、至少9000個、至少10,000個或至少其間之任何數量之不同非活性NAB在該NAB組成物中。

於檢測生物流體中至少一個生物分子之方法的某些實施態樣中，在接觸該分析物組成物之後，該NAB組成物包含至少2個、至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少60個、至少65個、至少70個、至少75個、至少80個、至少85個、至少90個、至少95個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少300個、至少350個、至少400個、至少450個、至少500個、至少550個、至少600個、至少650個、至少700個、至少750個、至少800個、至少850個、至少900個、至少950個、至少1000個、至少2000個、至少3000個、至少4000個、至少5000個、至少6000個、至少7000個、至少8000個、至少9000個、至少10,000個或至少其間之任何數量之活化的NAB在該反應組成物中。

於檢測生物流體中至少一個生物分子之方法的某些實施態樣中，在接觸該分析物組成物之後，該NAB組成物包含至少1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或其間之任何百分比之活化的NAB在該NAB組成物中。於某些實施態樣中，在接觸該分析物組成物之後，該方法檢測該反應組成物中至少1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或其間之任何百分比之活化的NAB。
於檢測生物流體中至少一個生物分子之方法的某些實施態樣中，該方法包含令該反應組成物與表面接觸。於某些實施態樣中，該表面包含液體表面、固體表面、生物表面或彼等之組合。於某些實施態樣中，其中該固體表面包含固體支持物、固相基質、小珠、聚合物、複合物、碳複合物、塑料、玻璃、基本上平坦之表面、側流條、多重陣列或彼等之組合。於某些實施態樣中，該液體表面包含液滴。於某些實施態樣中，該液滴包含液體體積和固體表面。於某些實施態樣中，該表面包含液滴，該液滴包含固體基質。於某些實施態樣中，該液滴包含一或多種試劑以降低剪切力和/或促進該液滴通過該微流體通道之移動。於某些實施態樣中，該液滴包含一或多種試劑以促進與第二液滴之接觸而產生產物液滴。於某些實施態樣中，該第二液滴包含分析物組成物。於某些實施態樣中，該生物表面包含細胞表面或細胞膜表面。於某些實施態樣中，該生物表面係從細胞分離或源自細胞。於某些實施態樣中，該生物表面為合成性。於某些實施態樣中，該生物表面主要包含下列之一或多種組分：轉錄組、分泌蛋白組、蛋白質組、微環境、幹細胞、分化之細胞、組織或系統。於某些實施態樣中，該生物表面係包含在微晶片上。

於檢測生物流體中至少一個生物分子之方法的某些實施態樣中，該選擇配體與該恆定區內之親和劑和/或配體結合區結合。於某些實施態樣中，該選擇配體與該可變區內之親和劑和/或配體結合區結合。於某些實施態樣中，該表面為側流條。於某些實施態樣中，該表面進一步包含陽性檢測對照組和陰性檢測對照組。

於檢測生物流體中至少一個生物分子之方法的某些實施態樣中，該至少一個活化之NAB與可操作地連接該表面之第一選擇性配體結合且其中非活性NAB與可操作地連接該表面之第二選擇性配體結合。於某些實施態樣中，該第一選擇性配體包含第一可檢測標記且該第二選擇性配體包含第二可檢測標記。於某些實施態樣中，該第一可檢測標記和該第二可檢測標記不同。於某些實施態樣中，該第一可檢測標記或第二可檢測標記分別在與活化之NAB或非活性NAB結合時釋出信號。

於檢測生物流體中至少一個生物分子之方法的某些實施態樣中，在該接觸步驟之前，第一液滴包含該分析物組成物且第二液滴包含該NAB組成物。於某些實施態樣中，令該第一液滴與該第二液滴接觸可產生包含該反應組成物之反應液滴。於某些實施態樣中，在接觸步驟之前，該第一液滴流過第一微流體通道。於某些實施態樣中，在該接觸步驟之前，該第二液滴流過第二微流體通道。於某些實施態樣中，該第一微流體通道中之流速和該第二微流體通道中之流速係經協調，使得在進入第三微流體通道時，該第一液滴與該第二液滴碰撞以產生反應液滴。於某些實施態樣中，該反應液滴中之至少一個活化的NAB釋出可檢測之信號。於某些實施態樣中，該信號係在該反應液滴在該第三微流體通道時被檢測。

於檢測生物流體中至少一個生物分子之方法的某些實施態樣中，該NAB組成物包含表面。於某些實施態樣中，該表面為陣列。於某些實施態樣中，該陣列包含多個奈米孔。於某些實施態樣中，該多個奈米孔之各個奈米孔被多個金色顆粒包圍。於某些實施態樣中，該多個金色顆粒包含一層金色顆粒，該層金色顆粒與該陣列之頂部表面和該多個奈米孔之各個奈米孔的邊界接觸。於某些實施態樣中，生物分子與非活性NAB之至少一個生物分子結合結構域之結合產生活化之NAB，且其中該活化之NAB與多個金色顆粒中至少一個金色顆粒接觸，導致在該多個奈米孔之至少一個奈米孔中產生事件。

於檢測生物流體中至少一個生物分子之方法的某些實施態樣中，生物分子與非活性NAB之至少一個生物分子結合結構域之結合產生活化之NAB，且其中該活化之NAB與該多個金色顆粒中至少一個金色顆粒接觸，導致在該多個奈米孔之僅一個奈米孔中產生事件。於某些實施態樣中，該事件包含形成等離子體。於某些實施態樣中，輻射光束係聚焦在該多個奈米孔之至少一個奈米孔。於某些實施態樣中，輻射光束係聚焦在該多個奈米孔之各個奈米孔。於某些實施態樣中，該在奈米孔處之事件產生可檢測捕獲活化之NAB。於某些實施態樣中，在奈米孔處產生事件可檢測活化之NAB的釋出。於某些實施態樣中，事件之產生包含形成等離子體。

於檢測生物流體中至少一個生物分子之方法的某些實施態樣中，該多個奈米孔之各個奈米孔的直徑為約20奈米。於某些實施態樣中，該陣列包含至少2個、至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少60個、至少65個、至少70個、至少75個、至少80個、至少85個、至少90個、至少95個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少300個、至少350個、至少400個、至少450個、至少500個、至少550個、至少600個、至少650個、至少700個、至少750個、至少800個、至少850個、至少900個、至少950個、至少1000個、至少2000個、至少3000個、至少4000個、至少5000個、至少6000個、至少7000個、至少8000個、至少9000個、至少10,000個或至少其間之任何數量的奈米孔。於某些實施態樣中，該陣列包含多個奈米孔，該等奈米孔之數量等於或大於該NAB組成物中非活性NAB的數量。於某些實施態樣中，該陣列包含多個奈米孔，該等奈米孔之數量等於或大於該反應組成物中活化之NAB的數量。

於檢測生物流體中至少一個生物分子之方法的某些實施態樣中，該生物流體中至少一個生物分子之特性未知。於某些實施態樣中，該生物流體之多個生物分子的各個生物分子之特性未知。於某些實施態樣中，該生物流體之各個生物分子之特性未知。於某些實施態樣中，該生物流體之特性未知。於某些實施態樣中，該NAB組成物之各個非活性NAB的各可變區之至少一個生物分子結合結構域之序列為已知。於某些實施態樣中，該NAB組成物之各個非活性NAB的各可變區之序列為已知。

本發明提供一種製造NAB庫之方法。於製造NAB庫之方法的某些實施態樣中，該步驟包括：(1)令分析物組成物與本發明中任一組成物之NAB組成物在適合允許該分析物組成物中至少一個生物分子與該NAB組成物之至少一種去活化的NAB結合之條件下接觸以產生反應組成物，從而在該反應組成物中產生至少一個活化之NAB，其中該至少一個生物分子之特性為已知且該NAB組成物之各NAB的可變區之至少一個生物分子結合結構域的序列為未知；(2)檢測該反應組成物中至少一個活化之NAB或與該活化之NAB結合之生物分子；及(3)測定該活化之NAB的可變區之至少一個生物分子結合結構域的序列，從而鑑定至少一個與該至少一個生物分子特異性結合之活化的NAB。

於製造NAB庫之方法的某些實施態樣中，該分析物組成物包含至少2個、至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少60個、至少65個、至少70個、至少75個、至少80個、至少85個、至少90個、至少95個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少300個、至少350個、至少400個、至少450個、至少500個、至少550個、至少600個、至少650個、至少700個、至少750個、至少800個、至少850個、至少900個、至少950個、至少1000個、至少2000個、至少3000個、至少4000個、至少5000個、至少6000個、至少7000個、至少8000個、至少9000個、至少10,000個或至少其間之任何數量的生物分子。

於製造NAB庫之方法的某些實施態樣中，該方法檢測在該反應組成物中至少2個、至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少60個、至少65個、至少70個、至少75個、至少80個、至少85個、至少90個、至少95個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少300個、至少350個、至少400個、至少450個、至少500個、至少550個、至少600個、至少650個、至少700個、至少750個、至少800個、至少850個、至少900個、至少950個、至少1000個、至少2000個、至少3000個、至少4000個、至少5000個、至少6000個、至少7000個、至少8000個、至少9000個、至少10,000個或至少其間之任何數量之活化的NAB。於某些實施態樣中，該方法檢測在該反應組成物中至少1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或其間之任何百分比之活化的NAB。

於製造NAB庫之方法的某些實施態樣中，該反應組成物包含至少二種不同之活化的NAB。於某些實施態樣中，該反應組成物包含多種不同之活化的NAB。於某些實施態樣中，該反應組成物之各個活化之NAB為不同之活化的NAB。於某些實施態樣中，該反應組成物之各個活化之NAB為不同之活化的NAB。於某些實施態樣中，根據本發明揭示之用於製造NAB庫之方法的任一方法鑑定非活性或經活化之NAB。

詳細說明

本發明之組成物和方法(亦稱為“複雜且無偏見之溶液剖析”(CUSP))檢測並發現為許多特異性生物分子之複雜混合物的生物流體和/或分析物組成物(其，例如可包含緩衝溶液)內之生物分子。示例性組成物可包含多個非活性核酸生物傳感器(NAB)，該核酸生物傳感器包含用於鑑別、選擇和檢測流體中多個未知之生物分子的隨機序列區。不像現有之技術(諸如指數增益之配體系統進化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)(SELEX)，於本發明之組成物和方法的某些實施態樣中，在與本發明之NAB組成物接觸之前，該分析物組成物或至少一種該分析物組成物之生物分子最初並非固定於固體支撐物。例如，於一些實施態樣中(包括那些其中該分析物組成物或至少一種該分析物組成物之生物分子在與本發明之NAB組成物接觸之前最初並非固定於固體支撐物者)，該至少一個生物分子在溶液中為游離的。本發明之組成物和方法可用於，例如檢測本發明之一或多種分析物組成物中之任何數量的生物分子(在單一程序中係在一至數萬個生物分子之範圍內)。於一些實施態樣中，本發明之組成物和方法可用於，例如定量本發明之一或多種分析物組成物中之任何數量的生物分子(在單一程序中係在一至數萬個生物分子之範圍內)。於一些實施態樣中，本發明之組成物和方法可用於，例如測定本發明之一或多種分析物組成物或生物流體中之任何數量的生物分子(在單一程序中係在一至數萬個生物分子之範圍內)之濃度。

本發明之組成物和方法的三種示例性應用包括，但不限於 (1)用於發現一或多個NAB集合庫之組成物和方法；(2)用於發現/鑑定在分析物組成物中或來自生物流體之NAB同源特異性生物分子的組成物和方法；和(3)用於排列或多重分析，例如成千上萬之NAB以同時檢測和定量在分析物組成物中或來自生物流體之成千上萬之生物分子的組成物和方法。

本發明之組成物包含多個非活性NAB，其中該多個NAB之各個NAB包含至少一個可變區，其中該可變區包含至少一個生物分子結合結構域，及恆定區，其中該多個非活性NAB識別二或更多個不同之生物分子、識別在至少一個生物分子上之二或更多個不同部位、正向選擇至少一個生物分子且負向選擇至少一個生物分子，及識別至少一個在閾值濃度之第一側具有高親和力但在該閾值濃度之第二側不具有高親和力之生物分子。

就組成分子而言，對於生物流體之組成的了解對許多現代應用是必不可少的。例如醫學實踐之核心為測量體液(諸如尿液和血液)中之小分子。本發明提供用於檢測、鑑別和/或定量來自生物流體(包括各種複雜之體液)之生物分子(包括代謝物)的組成物和方法。於某些實施態樣中，本發明之組成物和方法可應用於一或多種體液，包括，但不限於尿液、血液、血清、唾液、淚液、母乳、皮脂、精液、耳垢、糞便、滑液、淋巴液、間質液、汗液、腦脊液、羊水、胸水和心包積液。

現有之代謝物檢測技術對目前之診斷市場所提供的服務不佳。現今，最全面之分析技術為質譜法，質譜法每部儀器成本高達$1,000,000。對於個人使用而言，此現有設備太昂貴，且該技術對護理點適用性而言太慢。因此，此種分析係在高成本之集中式實驗室中進行，而較負擔得起之現有技術只能檢測一些被充分表徵的生物分子。於某些實施態樣中，本發明提供用於作為分子鑑定生物分子(包括代謝物)之親和劑的NAB和NAB組成物。於某些實施態樣中，將分析物組成物中之未知生物分子與含有，例如親和標籤之未經結合的特異性NAB混合。在分析前經由親和標籤純化法分離和富集已與特定之NAB結合之未知生物分子，該分析係藉由，例如作為廉價之分析方式的側流條，或藉由陣列或藉由用於高通量分析之微流體檢測進行(純化步驟之後可使用其他生化分析方法)。

尿液分析為目前代謝物(包括小分子)檢測技術如何為抑制性之反映真實情況的實例。人類尿液中含有4000種已知之代謝產物，但目前常規尿檢僅對樣品進行26種表淺的測量且僅在單一時間點測量。長期以來，該領域感到需要簡單且負擔得起地查詢，例如尿液樣品中所有代謝物且可輕易地在多個時間點進行的檢測技術。本發明可提供患者健康狀況之動態視圖，而非當前技術之單一、成本過高、低解析率的分析。本發明提供之分析將對理解疾病提供獨特之角度，因為人類體液含有代謝產物及那些來自飲食、藥物和環境暴露之產物。

代謝物為細胞活性之產物和中間分子，一般包含小的有機分子。在本發明之背景下，代謝物可，例如等同於術語“生物分子”或“特定生物分子”。於某些實施態樣中，生物分子或特定之生物分子包括，但不限於初級代謝物、中心代謝物、次級代謝物、離子、核酸或胺基酸。

代謝產物濃度之變化可指明人體健康之深刻狀態。例如，飯後血糖和其他相關代謝物之濃度在健康個人以外可能變化極大。目前，大多數對糖尿病發作之測量都是在可能很難獲得之小血液樣本或血清樣本進行。長期以來，本領域感覺需要能夠從較容易且無痛獲得之樣品(例如唾液而非血液)測量第I型或第II型糖尿病之發作。葡萄糖相關分子1,5脫水葡萄糖醇(1,5-AG)(其長期為良好之與葡萄糖濃度負相關之代謝物)可在唾液中測量。然而，用於1,5-AD之現有測試不能充分區分1,5-AG和半乳糖。本發明呈現生物分子之更具選擇性和定量性測量方法，可更準確地定量生物分子，諸如唾液中之1,5-AG和相關化合物。本發明之組成物和方法滿足本領域對於更佳之監測個體，例如糖尿病發作和一般糖蛋白狀態之方法的長期需要。

藉由提供定量測量任何指定溶液(包括，例如生物流體或體液)中之全系列代謝物來檢測和定量特定之生物分子的廉價方法將可滿足本領域之長期需要。本發明之組成物和方法提供用於高度多重分析流體之生物分子的快速、準確和廉價方法，從而增加，例如診斷、食品和飲料分析，及常規檢測環境毒素之準確性。

鑑別未知代謝物

本發明之組成物和方法可用於鑑別溶液中之未知代謝物。

在先前方法(諸如SELEX)中係將已知代謝物固定在固體支持物並鑑別選擇性地結合這些已知之靶的代謝物的適體。然後使這些序列進行數輪擴增並重新選擇，之後通常將鑑定少量用於靶的代謝物之高親和力交互作用子。主要困難在於使用該等先前技術一次只能使用一個已知靶的。
與先前之方法(包括SELEX)相反，本發明之組成物和方法可用於鑑定任何流體中之任何生物分子，而無需任何關於該生物分子之特性或該流體之特性的先前知識。根據這些實施態樣，各個NAB之可變區序列(雖然是隨機，且因此能夠與幾乎無限數量之可能的生物分子結合)亦被認為具有被證實之特異結合某些生物分子之能力。因此，在沒有任何關於該生物流體或包含在其中之生物分子之任何先前知識的情況下，本發明之NAB組成物在與生物流體或由其衍生之分析物組成物接觸後可與存在於生物流體或對應之分析物中的任何及所有生物分子結合。在選擇具有已知序列和已知之結合特異性的經活化之NAB時，可隨後鑑別該與各經活化之NAB結合的生物分子。

未知代謝物可能包括數種已知類別之有機分子。因此，藉由與反應性其他分子之瞬時交互作用(此導致分析物與，無論是在溶液中或固定在固體支持物上之反應性分子共價鍵結)可產生新衍生之未知之分析物物種形式。示例性反應性分子包括，尤其是，那些能共價修飾胺、硫醇、醇、酮、醛、羧酸和羧醯胺者。這些衍生之分析物形式為NAB發現和檢測之靶的。

本發明之示例性生物流體包括，但不限於液體、半液體及源自固體之液體或半液體。本發明之半液體包括，但不限於糊劑、軟膏、非中性液體(例如血液)、血漿、血清、膿、凝膠、乳液、洗劑和乳膏。本發明之示例性生物流體包括，但不限於一或多種生物流體之混合物。

本發明之示例性生物流體包括，但不限於未知之生物流體、已知之生物流體或彼等之混合物。這些生物流體可從一或多個來自相同個體之樣品、一或多個來自不同個體之樣品或彼等之混合物獲得。示例性體液包括，但不限於尿液、血液、全血、血清、血漿、外周血、唾液、淚液、母乳、皮脂、精液、耳垢、糞便、滑液、淋巴液、間質液、汗液、腦脊液(CSF)、羊水、胸水或心包積液。本發明之示例性生物流體包括，但不限於合成流體。本發明之合成液體包括，但不限於消費者生物製品。本發明之示例性消費者生物製品包括，但不限於飲料、食品、化妝品、香料或膳食補充劑。消費者生物製品亦可包括藥物、前藥、藥物中間體、藥物產品或彼等之組合。

本發明之示例性生物流體包括，但不限於粗的或未經加工之生物流體、經加工之生物流體或彼等之組合。本發明之生物流體可經加工以產生，例如本發明之分析物組成物。於一些實施態樣中，檢測生物流體中至少一個生物分子的方法包含處理該生物流體以保留至少一個生物分子並除去一或多種除了該至少一個生物分子之外的組分以產生分析物組成物。本發明之分析物組成物可包含該生物流體所衍生之各個代謝物和每種代謝物。該分析物組成物可，例如包含多種代謝物，該等代謝物可使用本發明之組成物和方法鑑別和定量。

高度多重反應

本發明之組成物和方法滿足本領域長期以來對於高度多重檢測複雜之生物流體中之未知生物分子的需要。本發明之組成物和方法之多重性質藉由，例如鑑定和量化存在於個體外周循環血之血液樣品中的各個和每種代謝物來提供所測量之個體健康的快照。藉由傳統方法，稱為“SMAC 80”之類似測試使用約四小瓶血液、多個測試中心及一周內之時間來提供個體血液中之80種測量的水準讀數。形成鮮明對比的是，本發明之組成物和方法可在不到一天之時間內在少於一小瓶之個體血液中鑑定成千上萬之代謝物，包括由現有技術提供之每一種測量，加上成千上萬之另外的生物分子以及各個生物分子之濃度測量。

即使當該流體為未知的或該流體為流體之混合物時，本發明之組成物和方法仍提供類似有力之分析能力。

本發明之組成物和方法提供用於診斷或監控治療效力之特殊優點，因為在將流體與本發明之NAB組成物接觸之前不需要先知道生物分子之特性。可發現有效之診斷方案，其中該使用本發明之組成物和方法鑑定之方案可包括成千上萬之生物標記，提供比任何現有之技術更複雜且完整的診斷和統計工具。

本發明之多重反應可用於發現新型NAB和用於產生各種各樣之NAB庫。此外，因為使用本發明之組成物和方法，發現NAB的過程更快且較不貴，可產生特定之NAB庫以，例如用於評估特定之生物流體、用於評估特定之疾病狀態、用於檢測消費者生物製品中是否存有污染及用於篩選臨床試驗之參與者或測定個體對特定療法之反應性或抗性。

多重分析係從，例如使生物流體或分析物組成物與本發明之NAB組成物接觸來產生反應組成物開始。該反應組成物可藉由任何高通量篩選方法分析，包括陣列檢測。當將生物流體或分析物組成物、NAB組成物和反應組成物配製成液滴時，該接觸和檢測步驟可，例如在包括微流體晶片之微流體裝置上進行。

測量生物分子濃度

本發明之組成物和方法包含在該多個NAB內發現濃度敏感性NAB。一組NAB(各個NAB均識別相同之特異性生物分子)可具有不同之交互作用親和力。這允許定量在分析物組成物中之特定生物分子。例如，高親和力NAB在較低之特異性生物分子濃度下從固體支持物分離，而較低親和力之NAB在較高之特定生物分子濃度下從固體支持物分離。

核酸生物傳感器 (NAB)

本發明之組成物和方法包含模塊化NAB。本發明之示例性NAB可包含可變區和恆定區。本發明之各個NAB的可變區可包含至少一個生物分子結合結構域。或者，成對之短可變區和恆定區組可包含至少一個生物分子結合結構域。本發明之各個NAB的恆定區可包含下列群組之一或多者：親和劑、配體結合區、酶結構域、分裂蛋白之連接點或酶之結合部位。於一些實施態樣中，本發明之各個NAB的恆定區包含親和劑。於一些實施態樣中，本發明之各個NAB的可變區包含親和劑。NAB可包含二個分開之分子，該二個分開之分子可藉由接合或藉由化學共價交聯連接。

關於模塊化，各個NAB之可變區可與至少一個生物分子結合，而各個NAB之恆定區可在接觸生物分子和轉化成經活化之NAB之前或是在接觸生物分子和轉化成經活化之NAB之後與選擇配體結合或與可操作地連接表面之序列雜交。

本發明之NAB可包含報告子構建體和可選擇地，淬滅劑構建體。報告子構建體可包含可檢測之標記或可釋出之信號。當淬滅劑構建體非常接近該報告子構建體時，淬滅劑構建體可能阻止標記物之檢測或抑制信號釋出。例如，當該淬滅劑構建體可操作地連接該報告子構建體或可操作地連接報告子構建體附近之部位，從而使該淬滅劑構建體抑制該報告子構建體之活性或在空間上阻礙該報告子構建體時，該淬滅劑構建體可能阻止標記物之檢測或抑制信號釋出。

報告子構建體可包含螢光團、發色團或彼等之組合。本發明之NAB可增強發色團之螢光。例如，當與該與生物分子結合之特定核酸序列結合時，染料孔雀石綠顯示出增強之螢光。同樣地，綠色螢光蛋白(GFP)之核心發色團可藉由與稱為Spinach之生物分子(其將發色團螢光增強超過2000倍)結合之核酸協調。

本發明之組成物和方法包含該進一步包含下列群組之NAB：DNA序列、RNA序列、XNA序列、肽序列或雜交體分子。本發明之組成物和方法中可使用各種具有非天然鹼基、主鏈或彼等之組合的非天然存在之核苷酸。

包含非天然鹼基之示例性非天然存在之核苷酸包括，但不限於dBTP、dKTP、dPTP、dXTP和dZTP。包含非天然鹼基之示例性非天然存在之核苷酸包括，但不限於dInDTP、d5FITP、dAITP、dNITP、dCHITP、dCEITP、d5PhITP、d5NapITP和d5AnITP。包含非天然主鏈之示例性非天然存在之核苷酸包括，但不限於CeNA(環己烯基核酸)、ANA(阿拉伯核酸)、FANA(2'-氟-阿拉伯核酸)、TNA(α-L-蘇型呋喃基核酸)和LNA(2'-O,4'-C-伸甲基-β-D-核糖核酸；鎖核酸)。

本發明之NAB亦可包含，例如二種親和劑和可變區。該可變區可進一步包含生物分子結合結構域、恆定區、第二可變區，其中該可變區含有生物分子結合結構域和至少一個用於可操作地連接固體支持物之連接部位。該恆定區進一步包含，例如自我裂解性核酶(例如鎚頭狀核酶)或脫氧核酶。多個NAB可經由第一連接部位或親和劑連接於固體支持物。該親和劑可進一步包含抗體、肽、核酸、特異性結合靶分子之小分子或彼等之組合。

該多個NAB之各個NAB亦可包含第一可變區(其包含第一生物分子結合結構域)、恆定區、第二可變區(其包含第二生物分子結合結構域)及可選擇地，用於可操作地連接固體支持物之連接部位。例如該NAB之恆定區包含具有足夠互補性以與第二核酸之恆定區雜交之序列，該第二核酸之恆定區包含用於可操作地連接固體支持物的連接部位。可選擇地，該NAB之恆定區可包含螢光團構建體，在未與生物分子結合之情況下，來自該螢光團構建體之信號破壞NAB之恆定區與第二核酸雜交而從該固體基質釋出該經活化之NAB，並可選擇地將螢光團和淬滅劑分開以產生可檢測之信號。

本發明之NAB可包含能與選擇配體結合之配體結合結構域。與生物分子結合可導致所產生之經活化的NAB與選擇配體結合。

於本發明之NAB的一些實施態樣中，NAB包含可與至少一個生物分子結合之可變區。當該生物分子與該可變區結合時，該NAB從去活化之NAB轉換為經活化之NAB。然後可檢測該經活化之NAB，從而允許檢測在所欲之生物流體內的生物分子。

於本發明之NAB的一些實施態樣中，NAB可包含酶結構域，其中在與生物分子結合時，去活化之NAB轉換為經活化之NAB可誘導酶結構域之活性。在誘導酶結構域之活性之後，可使用本技藝已知之方法檢測該經活化之NAB。該實施態樣稱為“經誘導之活性”模式。於非限制性實例中，當生物分子與包含酶結構域之去活化的NAB結合時，該酶結構域之活性被誘導，從而使該NAB自我裂解。該自我裂解可導致NAB從表面釋出。然後可使用本技藝已知之方法檢測該釋出之經活化的NAB。於一些實施態樣中，該酶結構域可為核酶。於一些實施態樣中，該核酶可為自我裂解性。經誘導之活性模式的實例顯示在第3和4圖中。

於本發明之NAB的一些實施態樣中，NAB可包含第一可變區(其包含第一生物分子結合結構域)、恆定區、可選擇之第二可變區(其包含第二生物分子結合結構域)及可選擇之用於可操作地連接第一固體支持物之連接部位。於此實施態樣中，該NAB之恆定區包含具有足夠互補性以與第二核酸之恆定區雜交的序列，該第二核酸之恆定區包含用於可操作地連接第二固體支持物的連接部位。當生物分子與第一可變區和/或第二可選擇之可變區結合時，NAB之恆定區與第二核酸之雜交被破壞，從而使該經活化之NAB從該第二固體基質釋出。此實施態樣被稱為“經誘導之雜交體破壞”模式。

於本發明之組成物和方法的一些實施態樣中(包括那些其中該方法包含經誘導之雜交體破壞模式者)，NAB可包含第一可變區(其包含第一生物分子結合結構域)、恆定區、可選擇之第二可變區(其包含第二生物分子結合結構域)、可選擇之用於可操作地連接第一固體支持物及可檢測之標記的連接部位。於一些實施態樣中，該NAB之恆定區包含具有足夠互補性以與第二核酸之恆定區雜交的序列，該第二核酸之恆定區包含淬滅劑分子。該包含淬滅劑分子之第二核酸係可操作地連接該NAB。在去活化之狀態下，該NAB之恆定區與包含該淬滅劑分子之第二核酸雜交，從而使該來自可檢測之標記的信號被淬滅。當生物分子與第一可變區和/或第二可選擇之可變區結合時，NAB之恆定區與第二核酸之雜交被破壞，釋出該淬滅劑分子，導致產生來自該可檢測之標記的信號。經誘導之雜交體破壞模式之實例顯示於第5至7圖中。

於本發明之NAB的一些實施態樣中，NAB可包含可變區(其包含第一生物分子結合部位)、轉導子結構域及恆定區(其包含選擇配體結合部位)。於經去活化之形式中，該恆定區顯示出與選擇配體結合之親和力低。當第一生物分子與可變區結合時，該NAB被活化，導致能顯著增加該恆定區對該選擇配體之親和力的構象變化，允許該經活化之NAB經由該選擇配體被捕獲。該實施態樣稱為“經誘導之親和力”模式。經誘導之親和力模式之實例顯示於第9至11圖中。

生物分子

本發明之組成物和方法鑑別、選擇和量化在複雜之生物流體或分析物組成物中之至少一個生物分子。或者，此外，本發明之組成物和方法鑑別、選擇和量化在複雜之生物流體或分析物組成物中之成千上萬個生物分子。

本發明之示例性生物分子包含代謝物。本發明之代謝物包括，但不限於細胞活性產品和細胞信號傳導級聯反應之中間體。本發明之代謝物包括，但不限於細胞內和細胞外分子。本發明之代謝物包括，但不限於用於合成作為細胞內或細胞外途徑之生物分子的分解代謝及合成代謝反應之組分。本發明之代謝物包括，但不限於藥物、前藥、補充劑和膳食補充劑之分解產物。本發明之代謝物包括，但不限於食物之分解產物。本發明之代謝物包括，但不限於內分泌和神經內分泌系統之組分。本發明之代謝物包括，但不限於細胞間和細胞內信號傳導分子。本發明之代謝物包括，但不限於鹽、糖、蛋白質、電解質或彼等之任何組合。本發明之代謝物包括，但不限於可能刺激個體免疫系統之一或多種自身或外來抗原。

代謝物濃度之變化可指明各種健康狀況、食品和飲料之品質和環境毒性。本發明之示例性生物分子包括，但不限於小有機分子、初級代謝產物、中心代謝物、次級代謝物、離子、核酸和胺基酸。於本發明之生物分子的某些實施態樣中，與本發明之一或多個NAB選擇性結合之生物分子或代謝物等於或小於500千道耳吞(kDa)。

生物流體

本發明之組成物和方法可鑑別、選擇及定量複雜之生物流體中的生物分子。生物流體可參考由生物體產生之任何生物有機流體。在本發明之背景下，生物流體包含已轉化成液體、液體或彼等之組合的固體或半固體。

本發明中之生物流體可為經加工、未經加工或粗物質。例如，該生物流體可經加工以產生含有代謝物之分析物組成物。該等加工可包括藉由標準方法過濾，例如藉由尺寸排阻色層分析或凝膠過濾。該分析物組成物可含有一或多種不同之代謝物。該分析物組成物亦可含有一或多種相同之代謝物。

本發明中之生物流體可為任何體液。這些生物流體可從患者或任何數量之個體獲得。該等體液包括尿液、血液、全血、血清、血漿、外周血、唾液、淚液、母乳、皮脂、精液、耳垢、糞便、滑液、淋巴液、間質液、汗液、腦脊液(CSF)、羊水、胸水或心包積液。

生物流體亦可為合成之流體，諸如消費者生物製品。例如，消費者生物製品可包括飲料、食品、化妝品、香水或膳食補充劑。消費者生物製品亦可包括藥物、前藥、藥物中間體、藥物產品或彼等之組合。本發明之組成物和方法可檢測具有已知或未知特性或來源之複雜生物流體或彼等之混合物中的未知代謝物。

分析物組成物

本發明之生物流體可為經加工或未經加工/粗物質。例如，該生物流體可經加工以產生含有代謝物之分析物組成物。該等加工可包括藉由標準方法過濾，例如藉由尺寸排阻色層分析或凝膠過濾。該分析物組成物可含有一或多種不同之代謝物。該分析物組成物亦可含有一或多種相同之代謝物。

表面

本發明之組成物和方法能夠選擇和檢測至少一個NAB或生物分子，此係藉由，例如與選擇配體結合或與含有連接部位之核酸序列雜交以將該NAB或該生物分子可操作地連接表面。該表面可為液體表面、固體表面、生物表面或彼等之組合。

例如，固體表面可包括固體支持物、固相基質、小珠、聚合物、複合物、碳複合物、塑料、玻璃、基本上平坦之表面、側流條、多重陣列或彼等之組合。

該液體表面可包括液滴，例如那些產生以用於微流體檢測方案者。該液滴係經配製以流過微流體通道。該液滴亦可包含一或多種試劑以降低剪切力和/或促進該液滴通過該微流體通道之移動。該液滴進一步包含一或多種試劑以促進與第二液滴之接觸，產生產物或反應液滴。該第二液滴可包含分析物組成物。

支持表面亦可包括生物表面，諸如細胞表面或細胞膜表面。該生物表面可從細胞分離或源自細胞。該生物表面可為合成性。例如，該生物表面可主要包含下列之一或多種組分：轉錄組、分泌蛋白組、蛋白質組、微環境、幹細胞、分化之細胞、組織或系統。該類生物表面係包含在微晶片上。

該支持表面可進一步包含選擇配體，其中該選擇配體與該恆定區內之親和劑和/或配體結合區結合。該選擇配體亦可與該可變區內之親和劑和/或配體結合區結合。

該支持表面亦可包含側流條。經活化之NAB與配體結合可在該側流條上產生，例如正信號。在該支持物上，未與分析物結合之非活性NAB進一步在該側流條之後被捕獲在第二配體結合結構域，例如在陰性對照區產生信號。該側流條包含陽性檢測對照組和陰性檢測對照組。

於本發明之組成物和方法的一些實施態樣中，個別之側流條上可進行至少二種不同類型之NAB的多重分析以允許至少二個生物分子之不同指紋測量。可設計個別之側流條，從而使該在條帶上進行多重分析之NAB對應於通常在特定類型之生物流體中發現的生物分子。於一非限制性實例中，可設計側流條以測試水之純度。經設計以用於測試水純度之側流條可包含與軍團菌(Legionella)、來自危險之變形蟲的細胞產品及/或已知之水源性毒素結合並識別彼等之NAB。於另一非限制性實例中，側流條可經過設計以用於測試非法娛樂性藥物。經設計以測試用於非法娛樂性藥物之側流條可包含與該非法藥物分子和/或與該非法藥物之代謝相關的各種代謝物結合並識別彼等之NAB。於另一非限制性實例中，側流條可經過設計以監測糖尿病。經過設計以監測糖尿病之側流條可包含與存在於各種與糖尿病相關之生物流體(例如唾液、血液、血清、尿液)中之代謝物結合並識別彼等的NAB。

陣列

本發明之示例性陣列包含多個小孔。於本發明之陣列的一些實施態樣中，該小孔為奈米孔。

於本發明之陣列的一些實施態樣中，該陣列包含至少5個、至少10個、至少50個、至少100個、至少200個、至少500個、至少1000個、至少2500個、至少5000個、至少7500個、至少10,000個、至少20,000個、至少50,000個或其間之任何數量的奈米孔。

於本發明之陣列的一些實施態樣中，該多個奈米孔之各個奈米孔的直徑為約5、約10、約15、約20、約25、約30、約35、約40、約45或約50奈米。於本發明之陣列的一些實施態樣中，該多個奈米孔之各個奈米孔的直徑為約20奈米。於本發明之陣列的一些實施態樣中，該多個奈米孔之各個奈米孔的直徑為20奈米。

於本發明之陣列的一些實施態樣中，該陣列係由玻璃組成。於一些實施態樣中，該玻璃係源自經受加熱直至形成玻璃之矽膠組成物。於一些實施態樣中，該多個奈米孔係源自奈米柱或最初以奈米柱之形式形成，然後將該奈米柱截短或斷裂以形成奈米孔。於一些實施態樣中，該多個奈米孔係源自奈米柱或最初以奈米柱形成，該奈米柱各自被一層金色顆粒包圍，再被截斷以形成奈米孔。

於本發明之陣列的一些實施態樣中，該陣列係位在VCSEL(垂直腔表面發射雷射)或顯微雷射陣列與檢測器之間。或者，於本發明之陣列的一些實施態樣中，該陣列係位於發光二極管(LED) 之陣列與檢測器之間。於一些實施態樣中，各個顯微雷射或LED係與本發明之陣列的小孔或奈米孔對準。於一些實施態樣中，金色顆粒在至少一個小孔或奈米孔內與經活化之NAB交互作用而產生等離子體。於一些實施態樣中，該等離子體能使光的傳輸形成通過小孔或奈米孔之顯微雷射或LED，而在該小孔或奈米孔處被位於本發明之陣列上方的檢測器檢測到。使用此方法可同時檢測1至成千上萬之活化的NAB。

NAB 庫

本發明提供包含NAB之結構化集合庫的組成物，該NAB包含核酸序列
ctctcgggacgacCGCGGTAGTCTTAACCTAAAGCGGTGTCAGgtcgtccc (SEQ ID NO：3)。於一些實施態樣中，該NAB與CP*RH(III)-衍生之L-色胺酸結合並可呈現三種不同之莖-環結構。於一些實施態樣中，該集合庫包含多個核酸分子，該核酸分子包含核酸序列
ctctcgggacgacCNNNNNNNNNNNNACCTAAAGCGGNNNNNNgtcgtccc
(SEQ ID NO：5)，其中N為任何核苷酸。於一些實施態樣中，該集合庫包含多個核酸分子，該核酸分子包含核酸序列ctctcgggacgacCNNNNNNNNCTTAACCTAAAGNNNNNNNNGgtcgtccc
(SEQ ID NO：6)，其中N為任何核苷酸。於一些實施態樣中，該集合庫包含多個核酸分子，該核酸分子包含核酸序列ctctcgggacgacCGCGGTAGTCTTAACCTAAAGCGNNNNNNNgtcgtccc
(SEQ ID NO：7)，其中N為任何核苷酸。

本發明提供包含NAB之結構化集合庫的組成物，該NAB包含核酸序列
CTCTCGGGACGACGGGGTCACAGGGGTCCGGGTGTGGGTGGTTGTCGTCCC(SEQ ID NO：4)。於一些實施態樣中，該NAB與CP*RH(III)-衍生之L-色胺酸結合並可呈現二種不同之G-四聯體結構。於一些實施態樣中，該集合庫包含多個核酸分子，該核酸分子包含核酸序列
ctctcgggacgacGGGNNNNNNGGGNNNNGGGNNNNNNNNNNNccgtccc
(SEQ ID NO：10)，其中N為任何核苷酸。於一些實施態樣中，該集合庫包含多個核酸分子，該核酸分子包含核酸序列ctctcggg acgacGGGGNNNNNGGGNNNNGGGNNNGGGNNNNNgtcgtccc
(SEQ ID NO：11)，其中N為任何核苷酸。

本發明提供設計NAB之結構化集合庫的方法。於一些實施態樣中，該方法包含選擇NAB作為起始支架。於一些實施態樣中，該NAB可包含與生物分子結合之可變區。可選擇地，於一些實施態樣中，該設計結構化集合庫之方法包含使用二級結構預測程序來鑑定起始支架中可能之配體結合結構域。於一些較佳之實施態樣中，該起始支架可呈現莖-環結構或G-四聯體結構。於一些實施態樣中，該方法進一步包含在該起始支架內選擇至少一個以隨機核苷酸替換之核苷酸位置。於一些實施態樣中，該起始支架內至少一個、至少二個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個、至少27個、至少28個、至少29個或至少30個核苷酸位置可以隨機核苷酸替換。於一些實施態樣中，NAB之結構化集合庫可用於鑑定具有改善之特性(諸如，但不限於增加之結合親和力、增加之結合特異性或增加之穩定性)的新NAB。

本發明提供包含NAB之三聚體掃描庫的組成物，該NAB包含核酸序列
GGAGACTCCTGGGACGACCGCGGTAGTCTTAACCTAAAGCGGTGTCAGGTCGTCCCGATGCTGCATACGTAA(SEQ ID NO：12)。於一些實施態樣中，該NAB與CP*RH(III)-衍生之L-色胺酸結合並可呈現莖-環結構。於一些實施態樣中，該集合庫包含多個核酸分子，該多個核酸分子包含表1中呈現之任何核酸序列。表1中，N對應於任何核苷酸。

本發明提供包含NAB之三聚體掃描庫的組成物，該NAB包含核酸序列
GGAGACTCCTGGGACGACGGGGTCACAGGGGTCCGGGTGTGGGTGGTTGTCGTCCCGATGCTGCATACGTAA(SEQ ID NO：22)。於一些實施態樣中，該NAB與CP*RH(III)-衍生之L-色胺酸結合並可呈現G-四聯體結構。於一些實施態樣中，該集合庫包含多個核酸分子，該多個核酸分子包含表2中呈現之任何核酸序列。表2中，N對應於任何核苷酸。

本發明提供設計NAB之三聚體掃描庫的方法。於一些實施態樣中，該方法包括選擇NAB作為起始支架。於一些實施態樣中，該NAB可包含與生物分子結合之可變區。可選擇地，於一些實施態樣中，設計三聚體掃描庫之方法包含使用二級結構預測程序來鑑定起始支架中可能之配體結合結構域。於一些較佳之實施態樣中，該起始支架可呈現莖-環結構或G-四聯體結構。於一些實施態樣中，該方法進一步包含選擇該起始支架內以隨機核苷酸替換之三個核苷酸位置。由於每個集合庫具有3個可變位置且每個位置可為4個核苷酸其中一者，每集合庫含有總共64個不同之NAB(4×4×4=64)。換言之，每個集合庫據說簡併性為64。於一些實施態樣中，NAB之三聚體掃描庫可用於鑑定具有改善之特性(諸如，但不限於增加之結合親和力、增加之結合特異性或增加之穩定性)的新NAB。

本發明提供使用基於微陣列之集合庫來篩選新穎NAB之方法。於一些實施態樣中，該方法包含選擇NAB作為起始支架。於一些實施態樣中，該NAB可包含與生物分子結合之可變區。於一些較佳之實施態樣中，該起始支架可呈現莖-環結構或G-四聯體結構。於一些實施態樣中，該方法進一步包含在該起始支架內選擇將以隨機核苷酸替換之至少一個、至少二個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個、至少26個、至少27個、至少28個、至少29個或至少30個核苷酸位置。於其中選擇10個以隨機核苷酸替換之位置的非限制性實例中，考慮到有4種不同之核苷酸，在該集合庫內之可能的NAB之數量為1,048,576(4¹⁰ )。於一些實施態樣中，該集合庫內之NAB序列可與固體支持物(諸如有序之微陣列)偶合以允許使用本技藝已知之技術(諸如螢光微陣列分析儀)徹底篩選分析型結合。於一非限制性實例中，經生物素標記之NAB庫可與塗覆鏈黴抗生物素蛋白之固體支持物偶合。於使用印製之微陣列的一些實施態樣中，由於商用微陣列上的每個斑點具有數量大致相同之印製的核酸分子，因此可藉由直接比較從各斑點獲得之螢光信號來定量NAB親和力。

經 NAB 塗層之小珠

本發明提供包含多個小珠之組成物，該小珠係經塗覆多種非活性NAB。於一些實施態樣中，該非活性NAB可經由該NAB之恆定區與該小珠連接。於非限制性之實例中，該NAB之恆定區可包含與存在於該多個小珠上之捕獲劑結合的親和劑。於非限制性實例中，該親和劑可為與互補序列雜交之多核苷酸，該互補序列係可操作地連接多個小珠。於另一非限制性實例中，該NAB之恆定區可包含生物素且該多個小珠可包含鏈黴抗生物素蛋白。

本發明提供鑑別生物流體中存在生物分子之方法，該方法包含將多個塗覆多個非活性NAB之小珠在生物流體中培育。於一些實施態樣中，該非活性NAB可包含將非活性NAB與多個小珠連接之恆定區。該非活性NAB亦可包含與生物分子結合之可變區。於一些實施態樣中，當該生物分子與該可變區結合時，該非活性NAB被轉化為活性NAB，可檢測該活性NAB以測定該生物流體中是否存有該生物分子。

於本發明之組成物和方法的一些實施態樣中，可將塗覆多個第一NAB之第一組多個小珠與塗覆多個至少第二NAB之至少第二組多個小珠混合，從而創建混合之小珠群。於一些實施態樣中，該第一NAB和該至少第二NAB可與不同的生物分子特異性結合。可將任何數量(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、100、200、500、1000、10,000、100,000或1,000,000)之多個塗覆NAB之小珠混合在一起以創建混合之小珠群。於一些實施態樣中，各組多個小珠可塗覆可與不同生物分子結合之NAB。

本發明提供鑑別生物流體中存有至少二個生物分子之方法，該方法包含將混合之小珠群在生物流體中培育，其中該混合之小珠群包含至少二組多個小珠，其中各組多個小珠被塗覆多種非活性NAB。於一些實施態樣中，非活性NAB可包含將非活性NAB與多個小珠連接之恆定區。於一些實施態樣中，非活性NAB亦可包含與生物分子結合之可變區。於一些實施態樣中，當生物分子與可變區結合時，該非活性NAB轉化為可檢測之活性NAB，可檢測活性NAB以測定該生物流體中存在生物分子。於一些實施態樣中，在該混合之小珠群中，可清楚地檢測出那些包含與不同生物分子結合之可變區的不同活性NAB以鑑定該生物流體中存有至少二種生物分子。

本發明提供包含多個小珠之組成物，該小珠係經塗覆第一組多個非活性NAB和至少第二組多個非活性NAB，其中該第一組多個非活性NAB和該至少第二組多個活性NAB與不同的生物分子結合。

本發明提供包含核酸序列
CTCTCGGGACGACCGCCCTAGTCTTAACCTAAAGCGGTGTCAGGTCGTCCC
(SEQ ID NO：1)之NAB，該核酸序列之5'端具有ATTO488螢光團。於一些實施態樣中，該NAB與五甲基環戊二烯基-銠(III)(CP*RH(III))衍生之L-色胺酸結合。於一些實施態樣中，該NAB亦可與攜帶淬滅劑之寡核苷酸(QBO)結合。於一些實施態樣中，當該QBO與第一NAB結合時，該QBO將連接該NAB之ATTO 488螢光團淬滅。然而，當該第一NAB與衍生之L-色胺酸結合時，QBO被置換，導致由於ATTO 488螢光增強而產生螢光信號。本發明亦提供多個塗覆前述之NAB的小珠。

本發明提供包含核酸序列
CTCTCGGGACGACGGCCCGATCTCAGAGTAGTCGTCCC(SEQ ID NO：2)之NAB，該核酸序列之5'端具有ATTO565螢光團。於一些實施態樣中，該NAB與五甲基環戊二烯基-銠(III)(CP*RH(III))衍生之L-酪胺酸結合。於一些實施態樣中，該NAB亦可與攜帶淬滅劑之寡核苷酸(QBO)結合。於一些實施態樣中，當該QBO與該NAB結合時，該QBO將連接該NAB之ATTO 565螢光團淬滅。然而，當該NAB與衍生之L-酪胺酸結合時，QBO被置換，導致由於該ATTO 565螢光增強而產生螢光信號。本發明亦提供多個塗覆前述之NAB的小珠。

CUSP 檢測器系統

本發明提供CUSP檢測器系統，其包含多個檢測和/或定量生物流體中之多個生物分子的NAB。

於本發明之檢測器系統的一些實施態樣中，CUSP檢測器系統包含特異於欲分析之生物流體類型的特定NAB組。於一些實施態樣中，這些NAB組可使用選擇過程產生，該選擇過程中首先將特定之生物流體經化學分離以產生具有減少數量之分析物的子樣品。於一些實施態樣中，然後可將子樣品通過結構化NAB陣列之收集器並可收集在這些子樣品內與分析物結合之NAB。於一些實施態樣中，然後可將收集之NAB與它們所結合之生物分子匹配，該匹配係透過使用NAB之親和力純化或藉由MS確認進一步化學分離。於一些實施態樣中，在各生物流體方面，個人可回收多種不同之NAB，各NAB具有不同之結合特徵。於一些實施態樣中，藉由多個用於指定之生物分子的NAB，該檢測系統可更準確地量化該生物分子之濃度。於一些實施態樣中，不同NAB組對特定生物流體樣品之反應可經定量分析以與特定性質關聯。於一非限制性實例中，與源自，尤其是多產性抗體產生組織培養細胞之生物流體反應的NAB組將不同於該與源自較低生產力之細胞株的生物流體反應的NAB組。

於本發明之檢測器系統的一些實施態樣中，CUSP檢測器系統係基於實驗室。於一些實施態樣中，CUSP檢測器系統可具有用於常規(間隔數分鐘至數小時)測量相當大量之不同生物分子(例如10、100、1000、10,000、100,000個不同生物分子)的內置容量。於一些實施態樣中，可有同時測量許多(例如24、48、96、384或1536個孔)樣品之內置容量。於一些實施態樣中，基於實驗室之CUSP檢測器系統可包含至少一個小孔陣列，其中小孔陣列包含至少一簇NAB之有序陣列，其中該有序陣列內之各NAB簇可獨立地成像，從而使NAB簇之活化允許定量測量生物分子。該成像和影像處理可藉由安裝之電腦處理。

於本發明之檢測器系統的一些實施態樣中，基於實驗室之CUSP檢測器系統可讀取並處理在小孔陣列上之多種有序的NAB。於一非限制性實例中，在經設計以用於生產臨床生物製品(諸如單株抗體)之應用方面，該小孔陣列將承載能識別已知在抗體生產之背景下對細胞的健康很重要之胺基酸、維生素和多種組織培養細胞產物的NAB。

於本發明之檢測器系統的一些實施態樣(包括那些其中該檢測器系統為基於實驗室之CUSP檢測器者)中，對許多不同之生物流體可有不同之有序的NAB小孔陣列，包括，但不限於尿液、血液、唾液、淚液、汗液、飲用水和在商業、診斷或環境設置中之多種相關的生物流體。於一些實施態樣中，不同之有序的NAB小孔陣列將包含與測量該特定生物流體最相關之NAB集合庫。

於本發明之檢測器系統的一些實施態樣中，CUSP檢測器系統為可攜式平台。於一些實施態樣中，可攜式CUSP檢測器系統具有可方便地從一個地方運至另一個地方的尺寸，較佳為由單一操作者運輸。於一些實施態樣中，可攜式CUSP檢測器系統可以手持方式使用。於一些實施態樣中，可攜式CUSP檢測器可為設備齊全的。於一些實施態樣中，可攜式CUSP檢測器系統可攜帶其自有之電源。

於本發明之檢測器系統的一些實施態樣中，可攜式CUSP檢測器系統可包含基於實驗室之CUSP檢測器系統的所有特性。於一些實施態樣中，可攜式CUSP檢測器可包含至少一個小孔陣列，其中該小孔陣列包含具有至少一簇NAB之NAB的有序陣列，其中在該有序陣列內之各個NAB簇可獨立成像，從而使NAB簇之活化允許定量測量生物分子。該成像和圖像處理可藉由安裝之電腦處理。

於本發明之檢測器系統的一些較佳實施態樣中，為了減小尺寸，可攜式CUSP檢測器可具有單一樣品輸入。於一些實施態樣中，在分析一個樣品之後，可沖洗該檢測器系統以再生該有序之NAB陣列並使陣列回復非活性狀態以允許隨後分析其他樣品。於一些較佳之實施態樣中，可攜式CUSP檢測器系統包含具有誘導之親和力活性模式的NAB。

於本發明之檢測器系統的一些較佳實施態樣中，CUSP檢測器系統為可穿戴的。較佳地，可穿戴式CUSP檢測器系統之可攜程度足以使個體穿戴較長之時間。較佳地，可穿戴式CUSP檢測器系統可為獨立的。於一些實施態樣中，可穿戴式CUSP檢測器系統可攜帶其自有電源。於一些實施態樣中，可穿戴式CUSP檢測器系統可包含成像裝置和電腦。

於本發明之檢測器系統的一些較佳實施態樣中，可穿戴式CUSP檢測器系統可包含可穿戴帶。可穿戴帶可為，但不限於腕帶、腰帶、腳踝帶、手鐲、頸帶、項鍊、頭帶、指帶、環或臂帶。於一些實施態樣中，可穿戴式CUSP檢測器系統可被併入衣服內，包括，但不限於腰帶或皮帶扣、罩衫或襯衫、衣扣、衣服鈕扣、外套或夾克、洋裝或裙子、手套、帽子或便帽、頭帶、連帽衫或斗篷、領帶、褲子、牛仔褲或短褲、襯衫或罩衫、鞋子或靴子、襪子、運動服和貼身衣、內褲、汗衫、胸罩或內衣。於一些較佳之實施態樣中，可穿戴式CUSP檢測器系統係由個體佩戴從而使該CUSP檢測器系統與該個體之皮膚接觸。於一些實施態樣中，可穿戴式裝置可包含貼在個體皮膚上之貼片。可穿戴式裝置之實例描述於
US20140180019A1、美國專利案編號8,920,332、
US20160058375A1、US20150277559A1、US20170091412A1、
US20170079583A1、WO/2018/106249、WO/2017/132618、
US20180064377A和美國專利案編號9,874,554中。

於本發明之檢測器系統的一些較佳實施態樣中，可穿戴式CUSP檢測器系統可包含至少一個小孔陣列，其中該小孔陣列包含具有至少一簇NAB之NAB的有序陣列，其中在該有序陣列內之各個NAB簇可獨立地成像，從而使NAB簇之活化允許定量測量生物分子。該成像和圖像處理可藉由安裝之成像裝置和電腦處理。

於本發明之檢測器系統的一些較佳實施態樣中，可穿戴式CUSP檢測器系統可監測和分析來自個體之汗液。於一些實施態樣中，該可穿戴式CUSP檢測器系統可與個體之皮膚接觸，允許該汗液在有序之NAB陣列上藉由移位驅動流動。於一些實施態樣中，當汗液流過該有序之NAB陣列，將該陣列成像以分析該汗液樣品中是否存在某些生物分子或生物分子之濃度。

於本發明之檢測器系統的一些較佳實施態樣中，可穿戴式CUSP檢測器系統可包含至少一個針。於一些實施態樣中，針可為微針或奈米針。於一些實施態樣中，該可穿戴式CUSP檢測器系統之針可用於從欲使用NAB之有序陣列分析的個體提取血液和/或血清樣品。

可穿戴式CUSP檢測器系統可具有與輔助裝置通信之功能。輔助裝置可為，但不限於電腦、智慧型手機或廣域網路上之伺服器(諸如互聯網)。於非限制性實例中，可穿戴式CUSP檢測器系統可儲存數據，直到該可穿戴式CUSP檢測器系統能夠將該分析數據傳送到輔助裝置以進行進一步分析和/或儲存。該輔助裝置亦可作為中繼器以將數據從外部公共設施或數據庫或伺服器傳輸到可穿戴式CUSP檢測器系統和/或從可穿戴式CUSP檢測器系統傳輸到外部公共設施或數據庫或伺服器。

藉由可穿戴式CUSP檢測器系統收集之數據可透過通信介面與外部裝置通信。通信介面可包括無線通信功能，使得當該可穿戴式CUSP檢測器系統進入無線基地台或接入點的範圍內時，所儲存之數據自動上傳到互聯網可視源(諸如網站)。無線通信功能可使用本技藝中已知之一或多種通信技術提供，例如藍牙、RFID、近距離無線通信(NFC)、Zigbee、Ant、光學數據傳輸、Wi-Fi介面、TCP/IP介面，等。可穿戴式CUSP檢測器系統亦可包含有線通信能力，包括，但不限於USB。

於一些實施態樣中，該可穿戴式CUSP檢測器系統可向輔助電子裝置發送數據和/或命令和/或從輔助電子裝置接收數據和/或命令。該輔助電子裝置可與該可穿戴式CUSP檢測器系統直接或間接通信。本文中直接通信係指在沒有任何中間裝置之情況下在第一裝置和輔助裝置之間傳輸數據。例如，二個裝置可藉由無線連接(例如藍牙)或有線連接(例如USB)彼此通信。間接通信係指借助於一或多個傳達該數據之中間第三裝置在第一裝置和輔助裝置之間傳輸數據。第三裝置可包括，但不限於無線中繼器(例如WiFi中繼器)、電腦裝置，諸如智慧型手機、手提電腦、桌上型電腦或平板電腦、手機塔、電腦伺服器和其他網絡電子設備。例如，可穿戴式CUSP檢測器系統可將數據發送到智慧型手機，該智慧型手機再透過蜂巢式網絡數據連接將數據轉發至透過互聯網連接到蜂巢式網絡的伺服器。

於其中可穿戴式CUSP檢測器系統將數據傳輸至輔助裝置(例如伺服器或數據庫)的一些實施態樣中，該輔助裝置可接收和/或儲存和/或分析從多個來自多個用戶之可穿戴式CUSP檢測器系統獲得之數據。來自多個可穿戴式CUSP檢測器系統之數據可使用輔助裝置儲存和/或進一步分析。於非限制性實例中，來自多個可穿戴式CUSP檢測器系統之數據可用於分析用戶群以鑑別該群體內之趨勢和模式。

於其中可穿戴式CUSP檢測器系統將數據傳輸至輔助裝置之一些實施態樣中，該CUSP檢測器系統亦可傳輸與所收集之數據相關之背景信息。背景信息包括，但不限於執行數據收集時之時間、位置和/或用戶活動。背景信息亦可包含用戶之健康和/或人口統計信息。

可穿戴式CUSP檢測器系統可包含安裝之成像裝置。安裝之成像裝置可包含一或多個可發射具有一或多種波長之光的光源。該光源可包括，但不限於合適之相干性光源(例如雷射或UV光源)或合適之非相干性光源(例如弧光燈或發光二極管(LED))。安裝之成像裝置可包含一或多個光偵測器，包括，但不限於電荷耦合裝置(CCD)成像傳感器、互補金屬氧化物半導體(CMOS)成像傳感器或N型金屬氧化物-半導體(NMOS)成像傳感器。安裝之成像裝置可包含發射濾波器、激發濾波器。

實施例1：使用CUSP結構性NAB集合庫選擇NAB

產生NAB集合庫，使該NAB集合庫包括配體結合結構域，例如作為報告子區之孔雀石綠結合結構域(第10圖描寫為恆定特異性配體結合模塊)，及一組短恆定區(其賦予二級或三級結構，包括，但不限於莖環、G-四聯體、i-基序或Holliday連接點)和短可變區(其作為生物分子結合結構域)。將含有特定生物分子之複雜分析物溶液(第10圖係以藍色星號和紫色星號描繪)與非活性NAB集合庫混合。活性NAB之選擇係藉由誘導該配體結合結構域與其固定於固體支持物之配體的親和力來發生。

實施例2：使用陣列形式之CUSP結構性NAB集合庫選擇NAB

來自實施例1之固體支持物有數種例證。CUSP集合庫可依個別選殖株之形式有序排列在固體支持物上，或使用，諸如藉由單分子擴增成小(大約1000個分子)簇選殖株形成“聚合酶選殖株”之方法隨機放置在固體支持物上(有關形成“聚合酶選殖株”之更多描述，參見R.D. Mitra, G.M. Church, In situ localized amplification and contact replication of many individual DNA molecules, Nucleic Acids Res 27(24) (1999) e34)。從已經純化之選殖株開始，在分析物結合分析後，可從原始之分析盤/孔位置印製並為每一選殖株測序。在無序陣列之情況下(諸如在測序平台上)，該選殖株在晶片上之位置將隨同其序列一起記錄。選殖株可直接印製並共價固定在固體支持物上或使用經共價固定之引物原地進行擴增，但在任一情況下，用於該NAB集合庫之合適的單股DNA可藉由具有5'或3'特異性之核酸外切酶(例如λ核酸外切酶或核酸外切酶)之作用產生(核酸外切酶或λ核酸外切酶之更多描述分別參見I.R. Lehman, A.L. Nussbaum, The Deoxyribonucleases of Escherichia Coli. V. On the Specificity of Exonuclease I (Phosphodiesterase), J Biol Chem 239 (1964) 2628-36；J.W. Little, Lambda exonuclease, Gene Amplif Anal 2 (1981) 135-45)。在適當之緩衝條件下，該單股DNA NAB將再折疊。然後可將分析物溶液施放於陣列。使用經誘導親和力之NAB集合庫(例如具有孔雀石綠增強螢光)，可施加各種濃度之分析物溶液並可記錄各種濃度之分析物溶液的陽性NAB簇之螢光。

用於基於陣列之篩選方法的NAB集合庫可全部為結構性NAB集合庫。這具有明顯之優點，因為該集合庫之可變區的複雜度數量級(~10⁸ )將與陣列技術之典型情況相同。結構性NAB集合庫可為雜交體破壞，誘導親和力形式。分裂之結構性NAB集合庫亦適用。實際上，形成之“聚合酶選殖株”可在成功結合生物分子和該NAB之二個半部隨後接合時進行選擇。

實施例3-塗覆NAB之小珠可鑑別複雜之生物流體中存有或不存有生物分子。

下列實施例證明顯示一或多個NAB之基質可用來區分含有不同組之代謝物的溶液。

第一小珠群係塗覆多個第一NAB。該第一NAB包含核酸序列
CTCTCGGGACGACCGCCCTAGTCTTAACCTAAAGCGGTGTCAGGTCGTCCC
(SEQ ID NO：1)，其5'端連接ATTO 488螢光團。該第一NAB先前已被證明與五甲基環戊二烯基-銠(III)(CP*RH(III))衍生之L-色胺酸結合。該第一NAB亦可與攜帶淬滅劑之寡核苷酸(QBO)結合。當該QBO與第一NAB結合時，該QBO將連接該NAB之ATTO 488螢光團淬滅。然而，當該第一NAB與衍生之L-色胺酸結合時，該QBO被置換，導致由於ATTO 488螢光增強而產生螢光信號。因此，該第一NAB為本發明之雜交體破壞檢測方法之實例。

第二小珠群係塗覆多個第二NAB。該第二NAB包含核酸序列
CTCTCGGGACGACGGCCCGATCTCAGAGTAGTCGTCCC
(SEQ ID NO：2)，其5'端連接ATTO 565螢光團。該第二NAB先前已被證明與CP*RH(III)衍生之L-色胺酸結合。該第二NAB亦可與QBO結合。當該QBO與第二NAB結合時，該QBO將連接該NAB之ATTO 565螢光團淬滅。然而，當該第二NAB與衍生之L-酪胺酸結合時，該QBO被置換，導致由於ATTO 565螢光增增強而產生螢光信號。因此，該第二NAB為本發明之雜交體破壞檢測方法之實例。

將第一小珠群和第二小珠群一起培育以創建混合之小珠群。由於衍生之L-色胺酸和衍生之L-酪胺酸都不存在，該混合之小珠群在488nm波長(ATTO 488)和561nm波長(ATTO 565)通道中僅顯示基礎水準之螢光信號，如第27圖所示。如第28圖之左圖所示，當將混合之小珠群與0.1mM衍生之L-色胺酸一起培育時，僅在488nm 波長(ATTO 488)通道中有螢光信號記錄，表明衍生之L-色胺酸與該第一NAB結合。如第28圖之中間圖所示，當將混合之小珠群與0.1mM衍生之L-酪胺酸一起培育時，僅在561nm波長(ATTO 565)通道中有螢光信號記錄，表明衍生之L-酪胺酸與該第二NAB結合。如第28圖之右圖所示，當將混合之小珠群與0.1mM衍生之L-色胺酸和0.1mM衍生之L-酪胺酸一起培育時，在488nm波長(ATTO 488)通道和561nm波長(ATTO 565)通道中有螢光信號記錄，表明衍生之L-色胺酸與第一NAB及衍生之L-酪胺酸與第二NAB同時結合。這些結果證明，塗覆本發明之一或多個NAB之基質可用於鑑別在複雜生物流體中存有或不存有特定之生物分子。

實施例4-創建具有莖環結構之NAB結構化集合庫

下列實施例證明可如何構建具有莖-環結構之NAB結構化集合庫。該結構化集合庫可用於篩選具有優異活性(包括，但不限於對特定之生物分子具有增加的結合親和力)之NAB。

選擇包含核酸序列
ctctcgggacgacCGCGGTAGTCTTAACCTAAAGCGGTGTCAGgtcgtccc
(SEQ ID NO：3)之NAB作為起始支架。該NAB(本文中稱為NAB_Trp-Cp*Rh(III)_01)已被證明包含用於Cp*Rh(III)衍生之L-色胺酸的結合部位。作為設計結構化集合庫之第一步，使用二級結構預測程式來鑑別可能之配體結合結構域。該預測程式透露NAB_Trp-Cp*Rh(III)_01可折疊成三種不同之莖環結構。該三種結構顯示於第29圖中且從左至右其折疊dG為-8.89、-8.79和-9.43。

基於二級結構預測，設計三種不同之結構化集合庫。在該三個集合庫的各個集合庫中，莖結構域之序列是固定的。然後以隨機核苷酸替換在預測之配體結合環內之位置。

在第一集合庫(稱為N₁₂ N₆ 庫)中，選擇欲以隨機核苷酸替換之18個位置。該18個位置為位置15至26和位置38至43，如第29圖下方所示。

在第二集合庫(稱為N₈ N₈ 庫)中，選擇欲以隨機核苷酸替換之16個位置。該16個位置為位置15至22和位置35至42，如第29圖下方所示。

在第三集合庫(稱為N₇ 庫)中，選擇欲以隨機核苷酸替換之7個位置。該7個位置為位置37至43，如第29圖下方所示。

相較於先前研究中使用之集合庫，該等結構化集合庫之複雜度大幅降低，因為該可變區係位於該預測之結構的環內。

實施例5-創建具有G-四聯體結構之NAB的結構化集合庫

下列實施例證明可如何構建具有G-四聯體結構之NAB的結構化集合庫。結構化集合庫可用於篩選具有優異活性(包括，但不限於對特定生物分子具有增加之結合親和力)之NAB。

選擇包含核酸序列
CTCTCGGGACGACGGGGTCACAGGGGTCCGGGTGTGGGTGGTTGTCGTCCC(SEQ ID NO：4)之NAB作為起始支架。該NAB(本文中稱為NAB_Trp-Cp*Rh(III)_07)已被證明包含用於Cp*Rh(III)衍生之L-色胺酸的結合部位。作為設計結構化集合庫之第一步，使用二級結構預測程式來鑑別可能之配體結合結構域。該預測程式透露NAB_Trp-Cp*Rh(III)_07可折疊成二種不同之G-四聯體結構，如第30圖之上方所示。下方劃線表示各個G-四聯體結構之G-軌跡。

基於二級結構預測，設計二種不同之結構化集合庫。在二個集合庫的各個庫中，該G-四聯體結構域之序列是固定的。然後以隨機核苷酸替換在預測之配體結合環內之位置。

在第一集合庫中(稱為N₂₁ 庫)，選擇欲以隨機核苷酸替換之21個位置。該21個位置為位置17至22、位置26至29和位置33至43，如第30圖之下方所示。

在第二集合庫中(稱為N₁₇ 庫)，選擇欲以隨機核苷酸替換之17個位置。該17個位置為位置18至22、位置26至29、位置33至35和位置39至43，如第30圖之下方所示。

相較於先前研究中所使用之集合庫，該等結構化集合庫之複雜度大幅降低，因為該可變區位於該預測之結構的環內。

實施例6-使用具有莖-環結構之NAB的三聚體掃描庫

下列為可用於鑑定新NAB之三聚體掃描庫方法的實例，該新NAB對特定之生物分子的結合親和力較最初鑑定之NAB來得高。於該非限制性實例中，該最初鑑別之NAB可折疊成莖-環結構。

選擇包含核酸序列
GGAGACTCCTGGGACGACCGCGGTAGTCTTAACCTAAAGCGGTGTCAGGTCGTCCCGATGCTGCATACGTAA(SEQ ID NO：12)之NAB作為起始支架。該NAB(本文中稱為NAB_Trp-Cp*Rh(III)_01)已被證明包含用於Cp*Rh(III)衍生之L-色胺酸的結合部位。二級結構預測透露NAB_Trp-Cp*Rh(III)_01可折疊成莖-環結構，如第31圖之左下圖所示。

在集合庫之設計方面，該莖結構域之序列是固定的。選擇該預測之環結構內欲以隨機核苷酸替換之24個核苷酸。為了涵蓋所有24個核苷酸，設計一組9個之集合庫，其中在各個集合庫內，以隨機核苷酸替換該NAB內之3個位置，如第31圖之上圖所示。由於每個集合庫具有3個可變位置且每個位置可為4個核苷酸其中一者，因此每個集合庫共含有64個不同之NAB(4×4×4=64)。換言之，每個集合庫之簡併度據說為64。

測試每個集合庫與CP*RH(III)-衍生之L-色胺酸結合之能力並將此結合能力與該與NAB_Trp-Cp*Rh(III)_01結合之能力相比較。為了監測結合，以螢光團標記各個NAB並與攜帶淬滅劑之寡核苷酸雜交。當該攜帶淬滅劑之寡核苷酸與NAB雜交時，其將連接NAB之螢光團的螢光淬滅。當CP*RH(III)衍生之L-色胺酸與NAB結合時，該攜帶淬滅劑之寡核苷酸被置換，導致該連接NAB之螢光團增強，從而產生螢光信號。

在各種CP*RH(III)-衍生之L-色胺酸濃度下，該集合庫大部分顯示與NAB_Trp-Cp*Rh(III)_01之結合力相當。然而，一些集合庫顯示較NAB_Trp-Cp*Rh(III)_01低很多之信號，表明在該集合庫中之三個可變的核苷酸組很可能是重要的CP*RH(III)-衍生L-色胺酸結合區中的一部分，或為對NAB活化(該攜帶淬滅劑之寡核苷酸被置換)重要之區域的一部分。如第31圖之右下圖所示，FT_165庫顯示與NAB_Trp-Cp*Rh(III)_01相比較，結合活性顯著降低。在每組條形圖中，左側條形圖為NAB_Trp-Cp*Rh(III)_01結合力，右側條形圖為FT_165結合力。

實施例7-使用具有G-四聯體結構之NAB的三聚體掃描庫

以下為可用於鑑別新NAB之三聚體掃描庫方法之實例，該新NAB對特定之生物分子的結合親和力較最初鑑別之NAB來得高。於該非限制性實例中，該最初鑑別之NAB可折疊成G-四聯體結構。

選擇包含核酸序列
GGAGACTCCTGGGACGACGGGTCACAGGGGTCCGGGTGTGGGTGGTTGTCGTCCCGATGCTGCATACGTAA(SEQ ID NO：22)之NAB作為起始支架。該NAB(本文中稱為NAB_Trp-Cp*Rh(III)_07)已被證明包含用於Cp*Rh(III)衍生之L-色胺酸的結合部位。二級結構預測透露NAB_Trp-Cp*Rh(III)_07可折疊成G-四聯體結構，如第31圖之左下圖所示。

在設計集合庫方面，G-四聯體結構域之序列是固定的。選擇該預測之環結構內欲以隨機核苷酸替換之16個核苷酸。為了涵蓋所有16個核苷酸，設計一組6個之集合庫，其中在各個集合庫中，以隨機核苷酸替換該NAB內之3個位置，如第32圖之上圖所示。由於每個集合庫具有3個可變位置且每個位置可為4個核苷酸其中一者，因此每個集合庫共含有64個不同之NAB(4×4×4=64)。換言之，每個集合庫之簡併度據說為64。

測試每個集合庫與CP*RH(III)-衍生之L-色胺酸結合之能力並將此結合能力與該與NAB_Trp-Cp*Rh(III)_07之結合能力相比較。為了監測結合，以螢光團標記各個NAB並與攜帶淬滅劑之寡核苷酸雜交。當該攜帶淬滅劑之寡核苷酸與NAB雜交時，其將連接NAB之螢光團的螢光淬滅。當CP*RH(III)衍生之L-色胺酸與NAB結合時，該攜帶淬滅劑之寡核苷酸被置換，導致該連接NAB之螢光團增強，從而產生螢光信號。

在各種CP*RH(III)-衍生之L-色胺酸濃度下，該集合庫大部分顯示與NAB_Trp-Cp*Rh(III)_07之結合力相當。然而，一些集合庫顯示較NAB_Trp-Cp*Rh(III)_07低很多之信號，表明在該集合庫中之三個可變的核苷酸組很可能是重要的CP*RH(III)-衍生L-色胺酸結合區中的一部分，或為對NAB活化(該攜帶淬滅劑之寡核苷酸被置換)重要之區域的一部分。如第32圖之右下圖所示，FT_159庫顯示與NAB_Trp-Cp*Rh(III)_07相比較，結合活性顯著降低。在每組條形圖中，左側條形圖為NAB_Trp-Cp*Rh(III)_07結合力，右側條形圖為FT_159結合力。

實施例8-使用微陣列篩選NAB

以下為可如何設計NAB集合庫及與印製之微陣列一起使用以篩選新穎NAB的非限制性實例。

首先，可在結構化NAB之可能的配體結合結構域之內選擇以隨機核苷酸替換的隨機一組10個位置。具有10個可變位置和4個可能之核苷酸，可能之NAB數量為1,048,576(410)。該1,048,576個NAB序列可與固體支持物(諸如有序微陣列)偶合以允許使用螢光微陣列分析儀徹底篩選分析物結合。於一非限制性實施例中，經生物素標記之NAB集合庫可與塗覆鏈黴抗生物素蛋白之固體支持物偶合，如第33和34圖所示。

如第33和34圖所示，該10個位置可藉由一次性改變該3個變化的位置來篩選，從而創建具有64個不同NAB之集合庫。

於一些使用印製之微陣列的實施態樣中，由於商用微陣列上的每個斑點具有數量大致相同之印製的核酸分子，因此可藉由直接比較從各斑點獲得之螢光信號來定量NAB親和力。

於一些其中使用攜帶淬滅劑之寡核苷酸之實施態樣中，該淬滅劑寡核苷酸可在每次使用微陣列後重新雜交，從而允許在多種不同濃度下快速且具成本效益地篩選多種不同配體。

以引用方式納入參考

除非明確排除或以其他方式限制，否則本文中引用之每篇文件(包括任何交叉引用或相關之專利案或申請案)的全部內容均以引用方式整體併入本文。任何文件之引用並非承認其為與本文揭示之任何發明或主張之權利有關的先前技藝，或單獨之該文件或其與任何其他參考文件組合時教導、建議或揭示任何該等發明。此外，若本文件中之術語的任何含義或定義與以引用方式併入本文之文件中的相同術語之任何含義或定義相衝突，則以本文件中賦予該術語之含義或定義為準。

其他實施態樣

雖然已說明和描述本發明之特定實施態樣，但在不脫離本發明之精神和範圍的情況下可進行各種其他改變和修飾。所附之申請專利範圍包括在本發明之範圍內的所有該等變化和修飾。

本專利案或申請文件包含至少一幅彩色附圖。具有彩色附圖之本專利案或專利申請刊物之副本將在請求和支付必要費用後由主管當局提供。

第1圖之示意圖描繪與複雜且無偏見之溶液剖析(CUSP)(本文中稱為“經誘導之親和力方法”(亦顯示於第8和9圖中))之實施態樣相比較的SELEX。根據SELEX方法，SELEX分析物(特定之已知生物分子或生物分子之混合物)在接觸SELEX核酸適體庫之前被固定在固體支持物(例如，包括柱或細胞)。在選擇步驟期間，該SELEX分析物保持固定在固體支持物，透過此，該SELEX適體庫的每個適體與SELEX分析物結合。根據該SELEX方法，需要額外之檢測步驟將標記物連接在該SELEX分析物/SELEX適體複合物上以能夠檢測該複合物，從而分離該SELEX分析物。儘管本圖形描繪CUSP之一種實施態樣(經誘導之親和力實施態樣)，在CUSP之所有實施態樣中，該與包含多個本發明之NAB的組成物接觸之多個已知或未知分析物在接觸該包含多個NAB的組成物之前並未固定在固體支持物上。例如，如本圖形所示，包含在溶液中之該多個分析物為游離的。於本CUSP之實施態樣中，包含本發明之多個核酸生物傳感器(NAB)之組成物最先並非固定在固體支持物上。於本CUSP之實施態樣中，包含多個NAB之組成物在溶液中為游離的。於本CUSP之實施態樣中，選擇和檢測經活化之NAB(與該分析物溶液之生物分子結合的那些NAB)是同時進行的，因為NAB與生物分子結合會誘導構象變化，該構象變化允許經活化之NAB與報告子配體(顯示在右下方之八角形)結合。於本CUSP之實施態樣中，當經活化之NAB與報告子配體結合時，該配體自我裂解而釋出該NAB並活化該報告子以產生可檢測之信號。

第2圖之示意圖描繪CUSP對任何生物流體和各種工業(例如消費者生物製品、生物工業、個人診斷劑和製藥)之適用性。

第3圖為用於產生多個NAB之實施態樣(此處稱為“經誘導之活性模式”(亦顯示於第4圖中))的示意圖。於該實施態樣中，該多個NAB在該信號傳導結構域內包含能夠連接固體支持物之自我裂解性核酶結構域。於該實施態樣中，該多個NAB之每一個NAB包含二個親和劑(五角形和圓形，該圖形中之中央圖)和一個可變區(該二個親和劑之間的漂移線)。於該實施態樣中，NAB與特定生物分子(Y，該圖形中之右圖)交互作用導致構象變化，該構象變化使NAB或NAB片段透過自我裂解性核酶之活化而從該固體支持物釋出。

第4圖之示意圖描繪使用經誘導之活性模式實施態樣(亦顯示於第3圖中)來選擇生成之多個NAB之任一者的實施態樣。該多個NBA最初係連接，例如固體支持物並與包含已知或未知之生物分子(星形和太陽形，左上方)之混合物的分析物溶液組合。經活化之NAB被裂解(被NAB可變區包圍之星形和太陽形，中央圖之左側)而經去活化之NAB保持連接(中央圖之右側)。然後，該經活化之NAB被捕捉在第二固體支持物上，例如藉由與第二親和劑(小圓圈)結合。

第5圖為產生多個NAB之實施態樣(此處稱為“經誘導之雜交體破壞模式”(亦顯示於第6和7圖中))的示意圖。於該實施態樣中，該多個NAB之各個NAB包含第一可變區和第二可變區，該第一可變區包含第一生物分子結合結構域、恆定區，該第二可變區包含第二生物分子結合結構域及可選擇地，用於可操作地連接固體支持物之連接部位(圓圈)。於該實施態樣中，該NAB之恆定區包含具有足夠互補性之序列以與第二核酸之恆定區雜交，該第二核酸之恆定區包含用於可操作地連接固體支持物之連接部位(正方形)。可選擇地，該NAB之恆定區可包含螢光團構建體(小圓圈，右圖)，在未與生物分子結合之情況下，來自該螢光團構建體之信號破壞NAB之恆定區與第二核酸雜交而從該固體基質釋出經活化之NAB，並可選擇地將螢光團和淬滅劑分開以產生可檢測之信號。

第6圖之詳細示意圖描繪用於選擇從經誘導之雜交體破壞模式(亦顯示於第5圖中)產生之多個NAB的任一者的實施態樣。例如與特定生物分子(六邊形，其代表混合物中之單一已知或未知的生物分子)交互作用而產生構象變化，該構象變化破壞該雜交體並從固體支持物釋出該NAB。

第7圖之詳細示意圖描繪用於檢測從該經誘導之雜交體破壞模式產生之經活化的NAB之實施態樣。在檢測步驟期間，例如該信號傳導結構域含有螢光團和淬滅劑對(小圓圈和大圓圈)。當NAB被特定之生物分子結合(六邊形)活化時，該淬滅劑和螢光團分開且該NAB變成螢光。儘管為了清楚起見以二個步驟顯示，根據本實施態樣生物分子與NAB結合時會同時使NAB從固體支持物釋出並誘導產生可檢測之信號。

第8圖之示意圖描繪用於生成多個NAB(本文稱為“經誘導之親和力模式”)之實施態樣。於該實施態樣中，高親和力選擇配體(六邊形內之X)係，例如連接固體支持物。於該實施態樣中，該多個NAB之任一者包含能與該選擇配體結合之信號傳導結構域(中央圖中之A-“恆定區”)。與特定生物分子(星星內之Y)之結合導致該NAB與選擇配體結合。

第9圖之詳細示意圖描繪用於選擇從經誘導之親和力模式產生之NAB的實施態樣。於該實施態樣中，該包含已知或未知之生物分子(星星形和太陽形)之混合物的分析物溶液與該多個NAB(左圖下方)組合。經活化之NAB與，例如與固體支持物(右圖之左側)結合之選擇配體(六邊形內之X)結合。非活性NAB保持未連接(右圖之右側)。如第1圖所示，於一些實施態樣中，經活化之NAB與選擇配體結合可誘導信號轉導結構域中之構象變化(第8圖之中央圖的B)並誘導該選擇配體/經活化之NAB複合物從該固體基質自我裂解。

第10圖之示意圖描繪CUSP結構性NAB庫之實施態樣，該CUSP結構性NAB庫係用於發現用於生物分子之分子鑑定的傳感器，該生物分子與本發明之分析物組成物的已知分析物(且，尤其是，包含未知或未經鑑定之分析物的分析物組成物)特異性結合。將未知之分析物特異性生物分子(以藍色星號和紫色星號)與非活性NAB庫混合，該非活性NAB庫係由配體結合結構域(綠色)和特定之生物分子結合結構域所組成，其包含至少一對短恆定區(賦予二級或三級結構，包括，但不限於莖-環、G-四聯體、i-基序或Holliday連接點)和短可變區。活性NAB係藉由經誘導之該配體結合結構域對固定於固體支持物之其配體的親和力選擇。

第11圖之示意圖描繪二元CUSP結構性NAB庫之實施態樣，該二元CUSP結構性NAB庫係用於發現用於生物分子之分子鑑定的傳感器，該生物分子與本發明之分析物組成物的已知分析物(且，尤其是，包含未知或未經鑑定之分析物的分析物組成物)特異性結合。將未知之分析物特異性生物分子(以藍色星號和紫色星號)與非活性NAB庫混合，該非活性NAB庫係由配體結合結構域(綠色)和特定之生物分子結合結構域所組成，其包含至少一對短恆定區(賦予二級或三級結構，包括，但不限於莖-環、G-四聯體、i-基序或Holliday連接點)和短可變區。該NAB庫包含二個彼此部分互補或完全互補之分開的結構性CUSP庫。活性NAB與其同源特異性生物分子之交互作用係藉由共價連接穩定。活性NAB係藉由經誘導之該配體結合結構域對固定於固體支持物之其配體的親和力選擇。

第12圖之示意圖描繪示例性分析物組成物中之可藉由共價交聯試劑特異修飾的各種化學基團。不同交聯試劑(其各自分別連接固體支持物)靶向在複雜組成物內之分析物的不同化學部分類別。這些化學部分包括，但不限於胺、硫醇、酮、醛、還原糖、類固醇、羧酸和羧醯胺。該附接之衍生的分析物係作為CUSP庫之選擇靶的。

第13圖之示意圖描繪經胺反應性修飾之螢光素與複雜分析物組成物交聯的示例性實施態樣。該經胺反應性修飾之螢光素首先藉由可逆式鍵聯連接固體支持物，再令其與複雜之分析物組成物接觸。反應後，將剩餘之未反應的分析物漂洗掉。漂洗後，收集純化之經改質的分析物。此為一種用於將複雜組成物內之分析物的不同化學部分類別交聯的一般方法之實例。該不同化學部分包括，但不限於胺、硫醇、酮、醛、還原糖、類固醇、羧酸和羧醯胺。

第14圖之示意圖描繪經胺反應性修飾之螢光素與複雜分析物組成物交聯的示例性實施態樣。該經胺反應性修飾之螢光素首先藉由可逆式鍵聯連接固體支持物，再令其與複雜之分析物組成物接觸。反應後，將剩餘之未反應的分析物漂洗掉並令非活性NAB庫與固體支持物上之經修飾分析物接觸。

第15圖之示意圖描繪使用該利用第14圖中所描述之方法選擇的NAB檢測經改質之分析物的示例性實施態樣(如第13圖中所描述者)。經改質之分析物特異性NAB係排列在允許查詢每一個不同之特異性NAB的固體支持物上。

第16圖之示意圖描繪使用NAB作為用於分子鑑定之親和劑的示例性實施態樣。將分析物組成物中之未知生物分子與含有，例如親和標籤之未經結合的特異性NAB混合。將已與特異性NAB結合之未知生物分子分離出(星形)並經由親和力純化法富集，再藉由，例如質譜法或其他生化分析方法分析。

第17圖之示意圖描繪在多個NAB中發現濃度敏感性NAB的示例性實施態樣。例如，高親和力NAB在低特異性生物分子濃度下從固體支持物分離(左圖)。較低親和力之NAB在較高之特異性生物分子濃度下從固體支持物分離(右圖)。本發明之NAB的此種功能能夠定量在分析物溶液中之特異性生物分子。

第18圖之示意圖描繪側流條檢測活化之NAB的示例性實施態樣。於該實施態樣中，令該分析物組成物與非活性NAB接觸。例如，當代謝物與非活性NAB結合時，發生允許該經活化之NAB與連接側流條之配體可操作地結合之構象變化。將該NAB組成物和該分析物組成物施於該側流條，例如其中該組合之組成物行進該側流條之長度。例如當經活化之NAB與該配體在陽性檢測區(上方之紫色條帶，+條帶，左側)結合時，產生正信號。未與該配體結合之經去活化的NAB行進該側流條剩餘之長度且隨後被從側流條沖洗掉。包含固定在該基質上之陰性對照第二捕獲劑以，例如用來指示該NAB之組成物/代謝物已行進該側流條之長度並捕獲非活性NAB(出現在左方和右方條帶中之下方紫色條帶)。

第19圖之詳細示意圖描繪檢測特定之經活化的NAB的側流條之示例性實施態樣。令該分析物組成物與特定NAB接觸，該特定之NAB包含，例如生物分子結合結構域(介於該圓形和該三角形之間的波浪線)、配體結合結構域(經活化之NAB係由波浪線之形狀變化，二個弧形表示，第二個圖)、第二配體結合結構域(菱形)和比色酶(圓形)。於該實施態樣中，分析物(五邊形)與特定NAB生物分子結合結構域結合會產生，例如構象轉變(波浪線，第二個圖)。該構象轉變，例如允許與該連接固體支持物之配體(新月形)結合。該經活化之NAB與配體結合會產生，例如在側流條上之正信號(亦參見第18和19圖)。於本實施態樣中，未與分析物結合(未經結合)之非活性NAB係在側流條之後被第二配體結合結構域(與斜L形結合之菱形)捕獲，例如在陰性對照區產生信號(亦參見第18和19圖)。

第20圖之圖形描繪用於檢測經活化之NAB的2D奈米柱微陣列之示例性實施態樣。於該實施態樣中，將玻璃奈米柱切成直徑~20nm且例如在200℃下烘烤，並例如以格子陣列排列。於該實施態樣中，將液態金傾倒在奈米柱之間，例如在該陣列上形成金色塗層(右側，中決圖)。然後將奈米柱降至該液態金之高度，例如創建奈米孔陣列(右側，下方圖；側視圖和俯視圖)。

第21圖之圖形描繪在奈米孔陣列上檢測經活化之NAB的示例性實施態樣。於該實施態樣中，該奈米孔陣列係暴露於，例如垂直腔表面發射雷射(VCSEL；底部)。經活化之NAB與液態金交互作用，例如在該奈米柱之表面創建等離子體。例如，如圖中所示，該交互作用或“事件”允許VCSEL通過該金層(中間)並到達檢測器(頂部)產生正信號。

第22圖之圖形描繪微陣列檢測平台之示例性實施態樣。於該實施態樣中，NAB與生物分子之交互作用(經活化之NAB)促進與該液體金之反應，創建，例如有助於傳輸該光信號之等離子體(亦參見第20和21圖)。例如正信號可從經活化之NAB與配體結合(“平台1”，左側)或已自我裂解或與淬滅劑或螢光團分開之經活化的NAB(“平台2”，右側)檢測。

第23圖之示意圖描繪使用結構性NAB在陣列上擴增選殖株和測序。在最左邊之圖中，藉由在無序之陣列載玻片上與共價連接之引物分子雜交捕獲單一CUSP NAB。第二圖描繪使用原始CUSP NAB作為模板之第一輪合成。第三圖描繪在固體支持物上之“聚合酶選殖株(polony)”形成過程。第四圖描繪所產生之“聚合酶選殖株”，其可依第五圖中之描述定序。

第24圖之示意圖描繪結構性NAB與核酸外切酶(“exo”) 在陣列上接觸，重新折疊該結構性NAB及篩選該結構性NAB。最左邊之圖代表CUSP NAB“聚合酶選殖株”。中央圖描繪5'特異性外切核酸酶活性，其產生單股DNA之“聚合酶選殖株”。最右邊之圖描繪來自複雜分析物溶液之特定生物分子的結合，其誘導具有可檢測螢光之孔雀石綠(MG)的結合。

第25圖之示意圖描繪結構性CUSP NAB在陣列上之有序，點樣的定序前選殖株。將CUSP NAB選殖株庫點在載玻片(固體支持物)上，此可允許以溶液試劑檢測活性NAB及檢測螢光。

第26圖之示意圖描繪陣列上之結構性CUSP NAB的無序、經擴增、定序的選殖株。將CUSP NAB選殖株之集合庫隨機連接允許產生“聚合酶選殖株”之載玻片。該系統允許將NAB與複雜分析物溶液混合、螢光檢測及為每個“聚合酶選殖株”測序。

第27圖之一系列圖顯示在無任何胺基酸存在下培育小珠時，該混合之小珠群的基礎螢光信號，該小珠群係經塗覆與五甲基環戊二烯-銠(III)(CP*RH(III))衍生之L-色胺酸結合之第一NAB及與CP*RH(III)衍生之L-酪胺酸結合之第二NAB。

第28圖之一系列圖顯示當將小珠培育在0.1mM衍生之L-色胺酸(左圖)、0.1mM衍生之L-酪胺酸(中間圖)及0.1mM衍生之L-色胺酸和0.1mM衍生之L-酪胺酸(右圖)中時來自混合之小珠群的螢光信號，該混合之小珠群體係塗覆與五甲基環戊二烯-銠(III)(CP*RH(III))衍生之L-色胺酸結合之第一NAB及與CP*RH(III)衍生之L-酪胺酸結合之第二NAB。

第29圖之示意圖為具有莖-環結構之NAB的三種結構化集合庫之設計圖。選擇包含P*RH(III)-衍生之L-色胺酸之結合部位的單一NAB作為該集合庫之起始支架。第29圖上方顯示起始支架可呈現之三種莖環結構。第29圖下方顯示三種不同之集合庫(N₁₂ N₆ 、N₈ N₈ 和N₇ )和各集合庫內之可變核苷酸位置。N對應於任何核苷酸。

第30圖之示意圖為具有G-四聯體結構之NAB的二種結構化集合庫之設計圖。選擇包含P*RH(III)-衍生之L-色胺酸之結合部位的單一NAB作為該集合庫之起始支架。第30圖上方顯示起始支架可呈現之二種G-四聯體結構。第30圖下方顯示二種不同之集合庫(N₂₁ 和N₁₇ )和各NAB庫內之可變核苷酸位置。N對應於任何核苷酸(A，T，C或G)。

第31圖之示意圖為使用具有莖-環結構之NAB的三聚體掃描集合庫之設計圖。選擇包含P*RH(III)-衍生之L-色胺酸之結合部位的單一NAB作為該集合庫之起始支架。第31圖上方顯示具有9個不同集合庫之設計。在各個集合庫中，選擇三個可變之連續核苷酸位置。N對應於任何核苷酸。第31圖之左下方顯示起始支架可呈現之莖環結構及FT_165集合庫中變化之三個核苷酸的位置。第31圖之右下圖比較FT_165集合庫和該起始支架之結合活性。在每組條形圖中，左側條形圖為該起始支架結合活性，而右側條形圖為FT_165結合活性。

第32圖之示意圖為使用具有G-四聯體結構之NAB的三聚體掃描集合庫之設計圖。選擇包含P*RH(III)-衍生之L-色胺酸之結合部位的單一NAB作為該集合庫之起始支架。第32圖上方顯示具有6個不同集合庫之設計。在各個集合庫中，選擇三個可變之連續核苷酸位置。N對應於任何核苷酸。第32圖之左下方顯示起始支架可呈現之G-四聯體結構及FT_159集合庫中變化之三個核苷酸的位置。第32圖之右下圖比較FT_159集合庫和該起始支架之結合活性。在每組條形圖中，左側條形圖為該起始支架結合活性，而右側條形圖為FT_159結合活性。

第33圖之示意圖為可與微陣列一起使用，以篩選呈現莖-環結構之新型NAB的集合庫設計。左下圖顯示該起始支架可呈現之莖環結構。第33圖之上圖顯示可在微陣列上篩選之64種不同的NAB序列。例如SEQ ID NO：31包含

“GGAGACTCCTGGGACGACCGC AAA AGTCTTAACCTAAAGCGGTGTCAG GTCGTCCCGATGCTGCATACGTAA”之序列，其中該下方劃線且呈粗體之“AAA”代表本圖形中提供之64種可能組合的其中一者。

第34圖之示意圖為可與微陣列一起使用，以篩選呈現G-四聯體結構之新型NAB的集合庫設計。左下圖顯示該起始支架可呈現之G-四聯體結構。第34圖之上圖顯示可在微陣列上篩選之64種不同的NAB序列。

Claims

一種組成物，其包含多個非活性核酸生物傳感器(NAB)，其中該多個NAB之各NAB包含： (a)至少一個可變區，其中該可變區包含至少一個生物分子結合結構域；和 (b)至少一個恆定區，其中該多個非活性NAB (c)識別二或更多個不同之生物分子； (d)識別在至少一個生物分子上之二或更多個不同部位； (e)正向選擇至少一個生物分子且負向選擇至少一個生物分子；或 (f)識別至少一個在低濃度下具有高親和力之生物分子且在相對較高之濃度下具有相對較低之親和力的該相同之生物分子。
一種組成物，其包含多個非活性核酸生物傳感器(NAB)，其中該多個NAB之各NAB包含： (a)至少一個可變區，其中該可變區包含至少一個生物分子結合結構域和至少一個恆定區，或 (b)至少一個替換對，該替換對包含(a)之可變區和恆定區，其中該多個非活性NAB， (c)識別二或更多個不同之生物分子； (d)識別在至少一個生物分子上之二或更多個不同部位； (e)正向選擇至少一個生物分子且負向選擇至少一個生物分子；或 (f)識別至少一個在低濃度下具有高親和力之生物分子且在相對較高之濃度下具有相對較低之親和力的該相同之生物分子。
一種組成物，其包含多個非活性核酸生物傳感器(NAB)，其中該多個NAB之各NAB包含： (a)至少一個可變區，其中該可變區包含至少一個生物分子結合結構域，和至少一個恆定區，其中該恆定區包含至少一個報告子構建體，或 (b)至少一個替換對，該替換對包含(a)之可變區和恆定區，其中該多個非活性NAB (c)識別二或更多個不同之生物分子； (d)識別在至少一個生物分子上之二或更多個不同部位； (e)正向選擇至少一個生物分子且負向選擇至少一個生物分子；或 (f)識別至少一個在低濃度下具有高親和力之生物分子且在相對較高之濃度下具有相對較低之親和力的該相同之生物分子。
如申請專利範圍第2或3項之組成物，其中該至少一個包含(a)之可變區和恆定區之替換對包含二級結構。
如申請專利範圍第2或3項之組成物，其中該至少一個包含(a)之可變區和恆定區之替換對包含三級結構。
如申請專利範圍第2或3項之組成物，其中該至少一個包含(a)之可變區和恆定區之替換對包含四級結構。
如申請專利範圍第2至7項中任一項之組成物，其中該至少一個包含(a)之可變區和恆定區之替換對包含莖-環結構。
如申請專利範圍第7項之組成物，其中該莖-環結構包含二個莖。
如申請專利範圍第8項之組成物，其中該莖-環結構包含核苷酸序列，該核苷酸序列包含 ACTGNNNNATACNNNNNNNGTATNNNNCAGT。
如申請專利範圍第7項之組成物，其中該莖-環結構包含三個莖。
如申請專利範圍第6或7項之組成物，其中該至少一個包含(a)之可變區和恆定區之替換對形成四聯體結構。
如申請專利範圍第11項之組成物，其中該四聯體結構為G-四聯體。
如申請專利範圍第12項之組成物，其中該G-四聯體包含核苷酸序列，該核苷酸序列包含 NNNGGNNNGGNNNGGNNNGGNNN。
如申請專利範圍第1至13項中任一項之組成物，其中該恆定區包含下列之一或多者：親和劑、配體結合區、酶結構域和連接另一分子之連接部位。
如申請專利範圍第1至14項中任一項之組成物，其中該可變結構域進一步包含親和劑。
如申請專利範圍第13或14項之組成物，其中該親和劑包含受體、抗體、肽、脫氧核糖核酸、核糖核酸、小分子或彼等之組合。
如申請專利範圍第13至16項中任一項之組成物，其中該酶結構域裂解該NAB之RNA序列或DNA序列。
如申請專利範圍第13至16項中任一項之組成物，其中該酶結構域裂解該NAB之至少一個可變區或至少一個恆定區中之RNA序列或DNA序列。
如申請專利範圍第13至16項中任一項之組成物，其中該酶結構域裂解至少一個包含該NAB之可變區和恆定區之替換對中的RNA序列或DNA序列。
如申請專利範圍第17至19項中任一項之組成物，其中該酶結構域裂解RNA且其中該酶結構域包含核酶。
如申請專利範圍第20項之組成物，其中該核酶為自我裂解性。
如申請專利範圍第21項之組成物，其中該自我裂解之核酶包含錘頭核酶(HHR)或核糖開關。
如申請專利範圍第17至19項中任一項之組成物，其中該酶結構域裂解DNA序列且其中該酶結構域包含脫氧核酶。
如申請專利範圍第23項之組成物，其中該脫氧核酶為自我裂解性。
如申請專利範圍第17至24項中任一項之組成物，其中該酶結構域之活化導致該NAB之RNA序列或DNA序列裂解。
如申請專利範圍第1至25項中任一項之組成物，其中該可變區或恆定區包含雙股DNA(dsDNA)序列且其中該dsDNA包含限制性內切核酸酶之靶的部位。
如申請專利範圍第17或26項之組成物，其中該酶結構域裂解DNA序列且其中該酶結構域包含內切核酸酶。
如申請專利範圍第26項之組成物，其中該內切核酸酶為限制性內切核酸酶。
如申請專利範圍第1至28項中任一項之組成物，其中該多個非活性NAB之各NAB進一步包含一或多個用於可操作地連接表面的連接部位。
如申請專利範圍第29項之組成物，其中該表面包含液體表面、固體表面、生物表面或彼等之組合。
如申請專利範圍第30項之組成物，其中該固體表面包含固體支持物、固相基質、小珠、聚合物、複合物、碳複合物、塑料、玻璃、基本上平坦之表面、側流條、多重陣列或彼等之組合。
如申請專利範圍第30項之組成物，其中該液體表面包含液滴。
如申請專利範圍第30項之組成物，其中該表面包含液體表面和固體表面。
如申請專利範圍第33項之組成物，其中該表面包含液滴，該液滴包含固體基質。
如申請專利範圍第32至34項中任一項之組成物，其中該液滴係經配製以流過微流體通道。
如申請專利範圍第35項之組成物，其中該液滴包含一或多種試劑以降低剪切力和/或促進該液滴通過該微流體通道之移動。
如申請專利範圍第35或36項之組成物，其中該液滴包含一或多種試劑以促進與第二液滴接觸而產生產物液滴。
如申請專利範圍第37項之組成物，其中該第二液滴包含分析物組成物。
如申請專利範圍第30項之組成物，其中該生物表面包含細胞表面或細胞膜表面。
如申請專利範圍第39項之組成物，其中該生物表面係從細胞分離或源自細胞。
如申請專利範圍第39項之組成物，其中該生物表面為合成性。
如申請專利範圍第41項之組成物，其中該生物表面主要包含下列之一或多種組分：轉錄組、分泌蛋白組、蛋白質組、微環境、幹細胞、分化之細胞、組織或系統。
如申請專利範圍第42項之組成物，其中該生物表面係包含在微晶片上。
如申請專利範圍第29至43項中任一項之組成物，其中該表面進一步包含選擇配體。
如申請專利範圍第44項之組成物，其中該選擇配體與該恆定區內之親和劑和/或配體結合區結合。
如申請專利範圍第44項之組成物，其中該選擇配體與該可變區內之親和劑和/或配體結合區結合。
如申請專利範圍第1至46項中任一項之組成物，其中該多個非活性NAB中至少一個NAB進一步包含與至少一個生物分子結合結構域結合之生物分子，從而產生至少一個活化之NAB。
如申請專利範圍第1至46項中任一項之組成物，其中該多個非活性NAB之一部分進一步包含與至少一個生物分子結合結構域結合之生物分子，從而產生多個活化之NAB。
如申請專利範圍第48項之組成物，其中該進一步包含生物分子之多個非活性NAB的一部分占至少1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或其間之任何百分比。
如申請專利範圍第1至46項中任一項之組成物，其中該多個非活性NAB之各NAB進一步包含與至少一個生物分子結合結構域結合之生物分子，從而產生多個活化之NAB。
如申請專利範圍第47至50項中任一項之組成物，其中生物分子與該至少一個生物分子結合結構域結合可誘導該多個活化之NAB的各個活化之NAB之構象變化。
如申請專利範圍第51項之組成物，其中該構象變化增加該配體結合區對選擇配體之親和力。
如申請專利範圍第51項之組成物，其中該構象變化誘導該酶結構域之活性，從表面釋出該活化之NAB。
如申請專利範圍第53項之組成物，其中該酶結構域之活性為自我裂解性。
如申請專利範圍第54項之組成物，其中該酶結構域之活性為限制該可變區或恆定區之dsDNA。
如申請專利範圍第1至55項中任一項之組成物，其中該可變區或恆定區進一步包含報告子構建體。
如申請專利範圍第56項之組成物，其中該報告子構建體包含螢光團或發色團。
如申請專利範圍第56或57項之組成物，其中該報告子構建體修飾該螢光團或發色團。
如申請專利範圍第58項之組成物，其中該報告子構建體增強該發色團之螢光活性。
如申請專利範圍第57至59項中任一項之組成物，其中該螢光團包含孔雀石綠、(5Z)-5-[(3,5-二氟-4-羥苯基)伸甲基]-3,5-二氫-2,3-二甲基-4H-咪唑-4-酮、(Z)-4-(3,5-二氟-4-羥基亞苄基)-1,2-二甲基-1H-咪唑-5(4H)-酮(DFHBI)、綠色螢光蛋白(GFP)或與DFHBI結合之Spinach適體。
如申請專利範圍第57至59項中任一項之組成物，其中該發色團包含共軛結合之π鍵系統或金屬複合物。
如申請專利範圍第56至61項中任一項之組成物，其中該可變區或恆定區進一步包含淬滅劑構建體。
如申請專利範圍第56至62項中任一項之組成物，其中去活化之NAB包含報告子構建體和淬滅劑構建體，該報告子構建體和淬滅劑構建體之定位使該淬滅劑構建體抑制該報告子構建體之信號。
如申請專利範圍第56至63項中任一項之組成物，其中活化之NAB包含報告子構建體和淬滅劑構建體，該報告子構建體和淬滅劑構建體之定位使該淬滅劑構建體無法抑制該報告子構建體之信號，從而從該活化之NAB的報告子構建體產生可檢測之信號。
如申請專利範圍第1或14至64項中任一項之組成物，其中多個NAB之各個非活性或活性NAB進一步包含第二可變區，其中該第二可變區包含生物分子結合結構域，且其中該至少一個恆定區係位於第一可變區與第二可變區之間。
如申請專利範圍第65項之組成物，其中該第二可變區進一步包含用於可操作地連接表面之連接部位。
如申請專利範圍第65或66項之組成物，其中該第一可變區、恆定區和第二可變區中一或多者包含報告子構建體。
如申請專利範圍第65或66項之組成物，其中該恆定區包含報告子構建體。
如申請專利範圍第67或68項之組成物，其中該報告子構建體包含螢光團或發色團。
如申請專利範圍第65至69項中任一項之組成物，其中各個非活性NAB之恆定區包含第一雜交序列，該第一雜交序列與第二核酸之恆定區中之序列具有足夠的互補性以形成相對穩定之雜交體。
如申請專利範圍第70項之組成物，其中該第二核酸包含恆定區。
如申請專利範圍第71項之組成物，其中該恆定區包含第二雜交序列，該第二雜交序列與該多個非活性NAB的各個NAB之恆定區中之序列具有足夠之互補性以形成相對穩定的雜交體。
如申請專利範圍第70至72項中任一項之組成物，其中多個NAB的各個非活性NAB透過形成包含該第一雜交序列和第二雜交序列之雙股區與該第二核酸雜交。
如申請專利範圍第70至73項中任一項之組成物，其中該第二核酸之恆定區進一步包含用於可操作地連接表面之連接部位。
如申請專利範圍第70至74項中任一項之組成物，其中該第二核酸之恆定區進一步包含淬滅劑構建體。
如申請專利範圍第75項之組成物，其中該淬滅劑構建體抑制來自非活性NAB之報告子構建體的信號。
如申請專利範圍第70至76項中任一項之組成物，其中該第二可變區進一步包含連接子。
如申請專利範圍第77項之組成物，其中該連接子包含彈性連接子、剛性連接子或可裂解性連接子。
如申請專利範圍第77或78項之組成物，其中該連接子包含生物聚合物或合成聚合物。
如申請專利範圍第77至79項中任一項之組成物，其中該連接子包含DNA、RNA、胺基酸或彼等之任何組合。
如申請專利範圍第70至80項中任一項之組成物，其中該去活化之NAB進一步包含與該第一生物分子結合結構域和/或第二生物分子結合結構域結合之生物分子，從而產生活化之NAB。
如申請專利範圍第81項之組成物，其中該生物分子與該第一生物分子結合結構域和/或第二生物分子結合結構域之結合可誘導該多個活化之NAB的各個活化之NAB之構象變化。
如申請專利範圍第82項之組成物，其中該構象變化破壞該包含該第一雜交序列和第二雜交序列之雙股區的雜交。
如申請專利範圍第83項之組成物，其中該構象變化將髮夾結構引入各個活性NAB之恆定區。
如申請專利範圍第82至84項中任一項之組成物，其中該生物分子與該第一生物分子結合結構域和/或第二生物分子結合結構域之結合使該活性NAB之報告子構建體與該第二核酸之淬滅劑構建體分開，從而從該報告子構建體釋出可檢測之信號。
如申請專利範圍第1至85項中任一項之組成物，其中生物分子與生物分子結合結構域之結合可誘導該可變結構域之構象變化且其中該構象變化產生用於配體之結合部位。
如申請專利範圍第86項之組成物，其中該配體包含用於表面之連接部位。
如申請專利範圍第87項之組成物，其中該配體係可操作地連接該表面。
如申請專利範圍第1至88項中任一項之組成物，其中該多個NAB之各個非活性NAB或各個活性NAB包含DNA序列、RNA序列、XNA序列、肽序列或雜交分子。
如申請專利範圍第89項之組成物，其中該DNA序列包含L-DNA。
如申請專利範圍第89項之組成物，其中該RNA序列包含2'-NH2-RNA、L-RNA或2'F-RNA。
如申請專利範圍第1至91項中任一項之組成物，其中該生物分子包含小分子。
如申請專利範圍第92項之組成物，其中該小分子包含初級代謝物、中心代謝物、次級代謝物、離子、核酸或胺基酸。
如申請專利範圍第93項之組成物，其中該小分子等於或小於500千道耳吞(kDa)。
如申請專利範圍第1至94項中任一項之組成物，其進一步包含分析物組成物。
如申請專利範圍第95項之組成物，其中該分析物組成物包含多個代謝物。
如申請專利範圍第95項之組成物，其中該多個代謝物不與表面結合。
如申請專利範圍第97項之組成物，其中該分析物組成物包含液體。
如申請專利範圍第96至98項中任一項之組成物，其中該分析物組成物係源自生物流體或生物固體。
如申請專利範圍第99項之組成物，其中該生物流體或生物固體為從個體獲得之樣品。
如申請專利範圍第99或100項之組成物，其中該生物流體為未經加工或原始的生物流體。
如申請專利範圍第99或100項之組成物，其中該生物流體為經加工之生物流體。
如申請專利範圍第102項之組成物，其中該經加工之生物流體係源自生物固體。
如申請專利範圍第102或103項之組成物，其中該生物流體係經過濾。
如申請專利範圍第104項之組成物，其中過濾包含尺寸排阻色層分析或凝膠過濾。
如申請專利範圍第99至105項中任一項之組成物，其中該生物流體包含體液。
如申請專利範圍第106項之組成物，其中該體液包含尿液、血液、全血、血清、血漿、外周血、唾液、淚液、母乳、皮脂、精液、耳垢、糞便、滑液、淋巴液、間質液、汗液、腦脊液(CSF)、羊水、胸水或心包積液。
如申請專利範圍第99至105項中任一項之組成物，其中該生物流體包含合成流體。
如申請專利範圍第108項之組成物，其中該合成流體包含消費者生物製品。
如申請專利範圍第109項之組成物，其中該消費者生物製品包含飲料、食品、化妝品、香水或膳食補充劑。
如申請專利範圍第110項之組成物，其中該膳食補充劑包含維生素、多種維生素、礦物質、金屬、代謝物、油或彼等之組合。
如申請專利範圍第110或111項之組成物，其中該膳食補充劑之銷售或營銷不受任何政府機構管制。
如申請專利範圍第99至105項中任一項之組成物，其中該生物流體包含藥物、前藥、藥物中間體、藥物產品或彼等之組合。
如申請專利範圍第113項之組成物，其中該藥物產品包含由藥物誘導之途徑的中間代謝物。
如申請專利範圍第113項之組成物，其中該藥物產品包含核酸轉錄子、轉錄子變體、轉錄組之組分、蛋白質、蛋白質複合物、分泌之蛋白質、分泌蛋白組之組分、傳信分子或彼等之組合。
如申請專利範圍第95至115項中任一項之組成物，其中該分析物組成物進一步包含多個反應小分子。
如申請專利範圍第116項之組成物，其中該多個反應小分子中至少一個反應小分子修飾下列之一或多者：胺、硫醇、醇、醛、酮、胺基酸、還原糖、類固醇、羧酸、羧醯胺及有機分子或脂質。
如申請專利範圍第116項之組成物，其中該多個反應小分子之一部分修飾下列之一或多者：胺、硫醇、醇、醛、酮、胺基酸、還原糖、類固醇、羧酸、羧醯胺及有機分子或脂質。
如申請專利範圍第118項之組成物，其中該多個反應小分子之一部分包含該多個反應小分子之至少1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或其間之任何百分比。
如申請專利範圍第116項之組成物，其中該多個反應小分子之各個反應小分子修飾下列之一或多者：胺、硫醇、醇、醛、酮、胺基酸、還原糖、類固醇、羧酸、羧醯胺及有機分子或脂質。
如申請專利範圍第116至120項中任一項之組成物，其中該多個反應小分子中至少一個反應小分子係可操作地連接表面。
如申請專利範圍第116至120項中任一項之組成物，其中該多個反應小分子之一部分係可操作地連接表面。
如申請專利範圍第122項之組成物，其中該多個反應小分子之一部分包含該多個反應小分子之至少1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或其間之任何百分比。
如申請專利範圍第116至120項中任一項之組成物，其中該多個反應小分子之各個反應小分子係可操作地連接表面。
如申請專利範圍第1至124項中任一項之組成物，其中各個非活性或活性NAB包含該NAB之第一部分和該NAB之第二部分。
如申請專利範圍第125項之組成物，其中該NAB之第一部分和該NAB之第二部分是分開的。
如申請專利範圍第126項之組成物，其中該NAB之第一部分和該NAB之第二部分經連接或重新連接。
如申請專利範圍第127項之組成物，其中該NAB之第一部分和該NAB之第二部分係藉由點擊化學反應連接或重新連接。
如申請專利範圍第127項之組成物，其中該NAB之第一部分和該NAB之第二部分係藉由接合連接或重新連接。
如申請專利範圍第1至129項中任一項之組成物，其中各個非活性或活性NAB之第一部分包含該分裂蛋白之第一部分，其中各個非活性或活性NAB之第二部分包含該分裂蛋白之第二部分，其中包含該NAB之第一部分和該NAB之第二部分的非活性NAB或活性NAB包含完整蛋白，且其中包含該NAB之第一部分但不包含該NAB之第二部分或包含該NAB之第二部分但不包含該NAB之第一部分的非活性NAB或活性NAB不包含完整蛋白。
如申請專利範圍第130項之組成物，其中該完整蛋白包含該分裂蛋白之第一部分和該分裂蛋白之第二部分。
如申請專利範圍第130或131項之組成物，其中該完整蛋白包含酶，其中該酶於呈完整蛋白時具有活性且其中該酶於呈分裂蛋白時不具有活性。
如申請專利範圍第130至133項中任一項之組成物，其中該完整蛋白包含β-內醯胺酶、二氫葉酸還原酶(DHFR)、黏著斑激酶(FAK)、酵母轉錄因子、螢光蛋白、辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶(LacZ)、煙草蝕刻病毒蛋白酶(TEV)、泛素結構域、ShK毒素結構域或CCP結構域。
如申請專利範圍第133項之組成物，其中該酵母轉錄因子包含Gal4。
如申請專利範圍第133項之組成物，其中該螢光蛋白包含綠色螢光蛋白(GFP)、紅外線螢光蛋白(IFP1.4)、螢光素酶或重組酶增強之雙分子螢光素酶(ReBiL)。
如申請專利範圍第1至135項中任一項之組成物，其中各個非活性或活性NAB之第一部分包含分裂核酸結合部位之第一部分，其中各個非活性或活性NAB之第二部分包含分裂核酸結合部位之第二部分，其中該包含NAB之第一部分和NAB之第二部分的非活性NAB或活性NAB包含完整之核酸結合部位，且其中包含該NAB之第一部分但不包含該NAB之第二部分及包含該NAB之第二部分但不包含該NAB之第一部分的非活性NAB或活性NAB不包含完整之核酸結合部位。
如申請專利範圍第136項之組成物，其中該完整核酸結合部位包含該分裂核酸結合部位之第一部分和該分裂核酸結合部位之第二部分。
如申請專利範圍第136或137項之組成物，其中該完整之核酸結合部位允許與酶結合，其中該酶與完整之核酸結合部位結合且其中該酶不與分裂核酸結合部位結合。
如申請專利範圍第136至138項中任一項之組成物，其中該核酸結合部位為DNA結合部位或RNA結合部位。
如申請專利範圍第136至139項中任一項之組成物，其中該核酸結合部位為DNA結合部位且其中該DNA為雙股DNA(dsDNA)。
如申請專利範圍第140項之組成物，其中該完整dsDNA結合部位允許與轉錄活化因子結合。
如申請專利範圍第141項之組成物，其中該完整dsDNA結合部位包含UAS序列且其中該完整dsDNA結合部位允許與Gal4結合。
如申請專利範圍第141項之組成物，其中該完整dsDNA結合部位允許與轉錄遏制因子結合。
如申請專利範圍第141項之組成物，其中該轉錄遏制因子包含λ遏制因子。
一種檢測生物流體中至少一個生物分子之方法，其包含： (1)處理該生物流體以保留至少一個生物分子並除去除了該至少一個生物分子之外的一或多種組分以產生分析物組成物， (2)令分析物組成物與如申請專利範圍第1至144項中任一項之NAB組成物在適合允許該分析物組成物中至少一個生物分子與該NAB組成物之至少一個未經活化之NAB結合的條件下接觸以產生反應組成物，從而在該反應組成物中產生至少一個活化之NAB，及 (3)檢測在該反應組成物中至少一個活化的NAB，從而檢測與該至少一個活化之NAB結合的至少一個生物分子。
一種檢測生物流體中至少一個生物分子之方法，其包含： (1)處理該生物流體以保留至少一個生物分子並除去除了該至少一個生物分子之外的一或多種組分以產生分析物組成物， (2)令分析物組成物與如申請專利範圍第1至52項、56至64項或89至144項中任一項之NAB組成物在適合允許該分析物組成物之至少一個生物分子與該NAB組成物之至少一個未經活化之NAB結合的條件下接觸以產生反應組成物，從而在該反應組成物中產生至少一個活化之NAB，及 (3)檢測在該反應組成物中至少一個活化的NAB，從而檢測與該至少一個活化之NAB結合的至少一個生物分子。
一種檢測生物流體中至少一個生物分子之方法，其包含： (1)處理該生物流體以保留至少一個生物分子並除去除了該至少一個生物分子之外的一或多種組分以產生分析物組成物， (2)令分析物組成物與如申請專利範圍第1至51項、53至64項或89至144項中任一項之NAB組成物在適合允許該分析物組成物之至少一個生物分子與該NAB組成物之至少一個未經活化之NAB結合的條件下接觸以產生反應組成物，從而在該反應組成物中產生至少一個活化之NAB，及 (3)檢測在該反應組成物中至少一個活化之NAB，從而檢測與該至少一個活化之NAB結合的至少一個生物分子。
一種檢測生物流體中至少一個生物分子之方法，其包含： (1)處理該生物流體以保留至少一個生物分子並除去除了該至少一個生物分子之外的一或多種組分以產生分析物組成物， (2)令分析物組成物與如申請專利範圍第1至51項或56至144項中任一項之NAB組成物在適合允許該分析物組成物之至少一個生物分子與該NAB組成物之至少一個未經活化之NAB結合的條件下接觸以產生反應組成物，從而在該反應組成物中產生至少一個活化之NAB，及 (3)檢測在該反應組成物中至少一個活化之NAB，從而檢測與該至少一個活化之NAB結合的至少一個生物分子。
如申請專利範圍第145至148項中任一項之方法，其中該生物流體包含至少2個、至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少60個、至少65個、至少70個、至少75個、至少80個、至少85個、至少90個、至少95個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少300個、至少350個、至少400個、至少450個、至少500個、至少550個、至少600個、至少650個、至少700個、至少750個、至少800個、至少850個、至少900個、至少950個、至少1000個、至少2000個、至少3000個、至少4000個、至少5000個、至少6000個、至少7000個、至少8000個、至少9000個、至少10,000個或其間之任何數目的生物分子。
如申請專利範圍第145至149項中任一項之方法，其中該分析物組成物包含至少2個、至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少60個、至少65個、至少70個、至少75個、至少80個、至少85個、至少90個、至少95個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少300個、至少350個、至少400個、至少450個、至少500個、至少550個、至少600個、至少650個、至少700個、至少750個、至少800個、至少850個、至少900個、至少950個、至少1000個、至少2000個、至少3000個、至少4000個、至少5000個、至少6000個、至少7000個、至少8000個、至少9000個、至少10,000個或其間之任何數目的生物分子。
如申請專利範圍第145至150項中任一項之方法，其中該方法檢測在該反應組成物中至少2個、至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少60個、至少65個、至少70個、至少75個、至少80個、至少85個、至少90個、至少95個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少300個、至少350個、至少400個、至少450個、至少500個、至少550個、至少600個、至少650個、至少700個、至少750個、至少800個、至少850個、至少900個、至少950個、至少1000個、至少2000個、至少3000個、至少4000個、至少5000個、至少6000個、至少7000個、至少8000個、至少9000個、至少10,000個或至少其間之任何數目的生物分子。
如申請專利範圍第145至150項中任一項之方法，其中該方法檢測在該反應組成物中至少1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或其間之任何百分比的生物分子。
如申請專利範圍第145至152項中任一項之方法，其中該分析物組成物包含至少二種不同之生物分子。
如申請專利範圍第145至152項中任一項之方法，其中該分析物組成物包含多種不同之生物分子。
如申請專利範圍第145至152項中任一項之方法，其中該分析物組成物之各個生物分子為不同之生物分子。
如申請專利範圍第145至155項中任一項之方法，其中在接觸該分析物組成物之前，該NAB組成物包含多個不同之非活性NAB，該等不同之非活性NAB的數量等於或大於存在於該分析物組成物中之不同生物分子的數量。
如申請專利範圍第145至156項中任一項之方法，其中在接觸該分析物組成物之前，該NAB組成物包含至少2個、至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少60個、至少65個、至少70個、至少75個、至少80個、至少85個、至少90個、至少95個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少300個、至少350個、至少400個、至少450個、至少500個、至少550個、至少600個、至少650個、至少700個、至少750個、至少800個、至少850個、至少900個、至少950個、至少1000個、至少2000個、至少3000個、至少4000個、至少5000個、至少6000個、至少7000個、至少8000個、至少9000個、至少10,000個或至少其間之任何數量之不同非活性NAB在該反應組成物中。
如申請專利範圍第145至157項中任一項之方法，其中在接觸該分析物組成物之後，該NAB組成物包含至少2個、至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少60個、至少65個、至少70個、至少75個、至少80個、至少85個、至少90個、至少95個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少300個、至少350個、至少400個、至少450個、至少500個、至少550個、至少600個、至少650個、至少700個、至少750個、至少800個、至少850個、至少900個、至少950個、至少1000個、至少2000個、至少3000個、至少4000個、至少5000個、至少6000個、至少7000個、至少8000個、至少9000個、至少10,000個或至少其間之任何數量之活化的NAB在該反應組成物中。
如申請專利範圍第145至157項中任一項之方法，其中在接觸該分析物組成物之後，該NAB組成物包含至少1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或其間之任何百分比之活化的NAB在該反應組成物中。
如申請專利範圍第116至159項中任一項之方法，其中在接觸該分析物組成物之後，該方法檢測在該反應組成物中至少1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或其間之任何百分比的活化之NAB。
如申請專利範圍第145、146或148至160項中任一項之方法，其中該方法包含令該反應組成物與表面接觸。
如申請專利範圍第161項之方法，其中該表面包含液體表面、固體表面、生物表面或彼等之組合。
如申請專利範圍第162項之方法，其中該固體表面包含固體支持物、固相基質、小珠、聚合物、複合物、碳複合物、塑料、玻璃、基本上平坦之表面、側流條、多重陣列或彼等之組合。
如申請專利範圍第162項之方法，其中該液體表面包含液滴。
如申請專利範圍第162項之方法，其中該表面包含液體和固體表面。
如申請專利範圍第165項之方法，其中該表面包含液滴，該液滴包含固體基質。
如申請專利範圍第165或166項之方法，其中該液滴係經配製以流過微流體通道。
如申請專利範圍第167項之方法，其中該液滴包含一或多種試劑以降低剪切力和/或促進該液滴通過該微流體通道之移動。
如申請專利範圍第167或168項之方法，其中該液滴包含一或多種試劑以促進與第二液滴之接觸而產生產物液滴。
如申請專利範圍第169項之方法，其中該第二液滴包含分析物組成物。
如申請專利範圍第162項之方法，其中該生物表面包含細胞表面或細胞膜表面。
如申請專利範圍第171項之方法，其中該生物表面係從細胞分離或源自細胞。
如申請專利範圍第171項之方法，其中該生物表面為合成性。
如申請專利範圍第173項之方法，其中該生物表面主要包含下列之一或多種組分：轉錄組、分泌蛋白組、蛋白質組、微環境、幹細胞、分化之細胞、組織或系統。
如申請專利範圍第174項之方法，其中該生物表面係包含在微晶片上。
如申請專利範圍第161至175項中任一項之方法，其中該表面進一步包含選擇配體。
如申請專利範圍第176項之方法，其中該選擇配體與該恆定區內之親和劑和/或配體結合區結合。
如申請專利範圍第176項之方法，其中該選擇配體與該可變區內之親和劑和/或配體結合區結合。
如申請專利範圍第163項之方法，其中該表面為側流條。
如申請專利範圍第179項之方法，其中該表面進一步包含陽性檢測對照組和陰性檢測對照組。
如申請專利範圍第179或180項之方法，其中該至少一個活化之NAB與可操作地連接該表面之第一選擇配體結合且其中非活性NAB與可操作地連接該表面之第二選擇配體結合。
如申請專利範圍第181項之方法，其中該第一選擇配體包含第一可檢測標記且該第二選擇配體包含第二可檢測標記。
如申請專利範圍第182項之方法，其中該第一可檢測標記和該第二可檢測標記不同。
如申請專利範圍第182或183項之方法，其中該第一可檢測標記或第二可檢測標記分別在與活化之NAB或非活性NAB結合時釋出信號。
如申請專利範圍第145至178項中任一項之方法，其中在該接觸步驟之前，第一液滴包含該分析物組成物且第二液滴包含該NAB組成物。
如申請專利範圍第185項之方法，其中令該第一液滴與該第二液滴接觸可產生包含該反應組成物之反應液滴。
如申請專利範圍第185或186項之方法，其中在該接觸步驟之前，該第一液滴流過第一微流體通道。
如申請專利範圍第185至187項中任一項之方法，其中在該接觸步驟之前，該第二液滴流過第二微流體通道。
如申請專利範圍第185至188項中任一項之方法，其中該第一微流體通道中之流速和該第二微流體通道中之流速係經協調，使得在進入第三微流體通道時，該第一液滴與該第二液滴碰撞以產生反應液滴。
如申請專利範圍第185至189項中任一項之方法，其中該反應液滴中至少一個活化的NAB釋出可檢測之信號。
如申請專利範圍第189或190項之方法，其中該信號係在該反應液滴在該第三微流體通道時被檢測。
如申請專利範圍第145至178項中任一項之方法，其中該NAB組成物包含表面。
如申請專利範圍第192項之方法，其中該表面為陣列。
如申請專利範圍第193項之方法，其中該陣列包含多個奈米孔。
如申請專利範圍第194項之方法，其中該多個奈米孔之各個奈米孔係被多個金色顆粒包圍。
如申請專利範圍第195項之方法，其中該多個金色顆粒包含一層金色顆粒，該層金色顆粒與該陣列之頂部表面和該多個奈米孔之各個奈米孔的邊界接觸。
如申請專利範圍第195或196項之方法，其中生物分子與非活性NAB之至少一個生物分子結合結構域之結合產生活化之NAB，且其中該活化之NAB與多個金色顆粒中至少一個金色顆粒接觸，導致在該多個奈米孔之至少一個奈米孔中產生事件。
如申請專利範圍第195或196項之方法，其中生物分子與非活性NAB之至少一個生物分子結合結構域之結合產生活化之NAB，且其中該活化之NAB與該多個金色顆粒中至少一個金色顆粒接觸，導致在該多個奈米孔之僅一個奈米孔中產生事件。
如申請專利範圍第197或198項之方法，其中該事件包含形成等離子體。
如申請專利範圍第199項之方法，其中輻射光束係聚焦在該多個奈米孔之至少一個奈米孔。
如申請專利範圍第200項之方法，其中輻射光束係聚焦在該多個奈米孔之各個奈米孔。
如申請專利範圍第200或201項之方法，其中在奈米孔處產生事件可檢測捕獲之活化的NAB。
如申請專利範圍第200或201項之方法，其中在奈米孔處產生事件可檢測活化之NAB的釋出。
如申請專利範圍第202或203項之方法，其中事件之產生包含形成等離子體。
如申請專利範圍第194至204項中任一項之方法，其中該多個奈米孔之各個奈米孔的直徑為約20奈米。
如申請專利範圍第194至205項中任一項之方法，其中該陣列包含至少2個、至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少60個、至少65個、至少70個、至少75個、至少80個、至少85個、至少90個、至少95個、至少100個、在至少150個、至少200個、至少250個、至少300個、至少350個、至少400個、至少450個、至少500個、至少550個、至少600個、至少650個、至少700個、至少750個、至少800個、至少850個、至少900個、至少950個、至少1000個、至少2000個、至少3000個、至少4000個、至少5000個、至少6000個、至少7000個、至少8000個、至少9000個、至少10,000個或至少其間之任何數量的奈米孔。
如申請專利範圍第194至205項中任一項之方法，其中該陣列包含多個奈米孔，該等奈米孔之數量等於或大於該NAB組成物中非活性NAB的數量。
如申請專利範圍第194至205項中任一項之方法，其中該陣列包含多個奈米孔，該等奈米孔之數量等於或大於該反應組成物中活化之NAB的數量。
如申請專利範圍第145至208項中任一項之方法，其中該生物流體中至少一個生物分子之特性未知。
如申請專利範圍第145至208項中任一項之方法，其中該生物流體之多個生物分子的各個生物分子之特性未知。
如申請專利範圍第145至210項中任一項之方法，其中該生物流體之各個生物分子之特性未知。
如申請專利範圍第145至210項中任一項之方法，其中該生物流體之特性未知。
如申請專利範圍第145至212項中任一項之方法，其中該NAB組成物之各個非活性NAB的各可變區之至少一個生物分子結合結構域之序列為已知。
如申請專利範圍第145至212項中任一項之方法，其中該NAB組成物之各個非活性NAB的各可變區之序列為已知。
一種製造NAB庫之方法，其包含 (1) 令分析物組成物與如申請專利範圍第1至144項中任一項之NAB組成物在適合允許該分析物組成物中至少一個生物分子與該NAB組成物之至少一種去活化的NAB結合之條件下接觸以產生反應組成物，從而在該反應組成物中產生至少一個活化之NAB，其中該至少一個生物分子之特性為已知且該NAB組成物之各NAB的可變區之至少一個生物分子結合結構域的序列為未知， (2)檢測該反應組成物中至少一個活化之NAB或與該活化之NAB結合之生物分子，及 (3) 測定該活化之NAB的可變區之至少一個生物分子結合結構域之序列，從而鑑定至少一個與該至少一個生物分子特異性結合之活化的NAB。
如申請專利範圍第215項之方法，其中該分析物組成物包含至少2個、至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少60個、至少65個、至少70個、至少75個、至少80個、至少85個、至少90個、至少95個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少300個、至少350個、至少400個、至少450個、至少500個、至少550個、至少600個、至少650個、至少700個、至少750個、至少800個、至少850個、至少900個、至少950個、至少1000個、至少2000個、至少3000個、至少4000個、至少5000個、至少6000個、至少7000個、至少8000個、至少9000個、至少10,000個或至少其間之任何數量的生物分子。
如申請專利範圍第215或216項之方法，其中該方法檢測在該反應組成物中至少2個、至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、至少50個、至少55個、至少60個、至少65個、至少70個、至少75個、至少80個、至少85個、至少90個、至少95個、至少100個、至少150個、至少200個、至少250個、至少300個、至少350個、至少400個、至少450個、至少500個、至少550個、至少600個、至少650個、至少700個、至少750個、至少800個、至少850個、至少900個、至少950個、至少1000個、至少2000個、至少3000個、至少4000個、至少5000個、至少6000個、至少7000個、至少8000個、至少9000個、至少10,000個或至少其間之任何數量的活化之NAB。
如申請專利範圍第215至217項中任一項之方法，其中該方法檢測在該反應組成物中至少1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或其間之任何百分比之活化的NAB。
如申請專利範圍第215至218項中任一項之方法，其中該反應組成物包含至少二種不同之活化的NAB。
如申請專利範圍第215至218項中任一項之方法，其中該反應組成物包含多種不同之活化的NAB。
如申請專利範圍第215至218項中任一項之方法，其中該反應組成物之各個活化之NAB為不同之活化的NAB。
一種組成物，其包含如申請專利範圍第215至221項中任一項之方法鑑定的非活性或活化之NAB。