TW201922770A - 新穎胜肽、含有該胜肽之組合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明係揭露一種新穎胜肽，其胺基酸序列係為SEQ ID No.1。該新穎胜肽係具有促進細胞吸收鈣離子、降低細胞內氧化壓力、抑制發炎相關細胞激素、抑制破骨細胞作用及增加成骨細胞增生、分化之能力，而能夠用以作為組合物之有效成份，達到預防或/及治療疾病之功效。

Description

新穎胜肽、含有該胜肽之組合物及其用途

本發明係有關於一種胜肽，特別是指一種新穎胜肽、含有該胜肽之組合物及其用途。

按，人之骨質密度係於30歲開始逐年下降，尤其停經後之婦女或是65歲以上之男性更面臨罹患骨質疏鬆症之高風險。根據台灣2013～2015年間所作之健康調查，罹患骨質疏鬆症之民眾佔12.3％，其中，隨著年齡增加而罹患比例亦隨之增加，並且，女性罹患骨質疏鬆症之比例係明顯高於男性。

所謂骨質疏鬆症係指骨骼內形成許多空隙，導致骨骼結構中空而變得薄、脆，會造成脊椎壓迫性骨折、駝背、身高變矮，或是當受到外力碰撞或跌倒時，造成骨折、骨骼碎裂之情形發生。而大多數老年人若已罹患骨質疏鬆症，一旦發生髖骨骨折之情形，常因難以治癒而須長期臥床或是仰賴他人照顧，使得家庭及社會需要付出龐大成本及醫療資源，並且，根據統計約有20％左右之髖骨骨折病人會於一年內死亡。

過去認為攝取高量鈣質能夠有助於補充體內之鈣，因而各類鈣質營養品隨之推出，惟，事實上，腸道對於鈣離子之吸收取決於眾多外源性因素，例如每日攝取之鈣含量或其他營養成份，如磷酸、植酸等，以及內源性因素，例如胃酸分泌，因此，人體自外界攝取之鈣質係非能夠完全直接被腸道吸收而被利用。

雖然有研究指出同時攝取鈣質及維生素D能有效補充鈣質，惟，日曬會受膚色、生活習慣、氣候、地理位置等原因影響，進而阻礙維生素D之合成，例如：皮膚之黑色素抵擋紫外線作用而阻礙維生素D合成；長袖長褲或深色服裝會阻隔紫外線而減少皮膚合成維生素D之能力，並且，過度日曬亦會造成皮膚之損傷。換言之，即便於補充大量鈣質之基礎下，若無使人體合成足夠之維生素D，係無法使鈣質係無法被人體吸收利用。

目前臨床上係有提供用於治療骨質疏鬆症之藥物，包含抑鈣素（calcitonin）、荷爾蒙療法（hormone therapy）和雙磷酸鹽藥物（bisphosphonate）、副甲狀腺素等，然而上述藥物係限用於被確診罹患骨質疏鬆症之患者，亦即若骨質流失程度未達到骨質疏鬆症之標準時係無法使用該些藥物，並且，長期使用雙磷酸鹽藥物會使患者產生顎骨壞死之副作用。

由上可知，目前臨床上係欠缺一種能夠有效治療或/及預防骨質疏鬆相關病症並且無副作用之組合物。

本發明之主要目的係在於提供一種新穎胜肽，其胺基酸序列係包含有如SEQ ID No. 1所示序列或與其具有90％以上相似度之同源性胺基酸序列。

本發明之另一目的在於提供一種新穎胜肽，其係具有促進細胞吸收鈣離子、降低細胞內氧化壓力、抑制發炎相關細胞激素、抑制破骨細胞作用及增加成骨細胞增生、分化之能力，而能夠用以作為組合物之有效成份，達到預防或/及治療疾病之功效。

為能達成上述目的，本發明係揭露一種新穎胜肽，其係包含有SEQ ID NO.1所示胺基酸序列或是與其具有90％以上相似度之同源性胺基酸序列。

其中，於本發明之一實施例中，該新穎胜肽之胺基酸序列係為SEQ ID NO.1。

其中，本發明所揭新穎胜肽係為一種鈣離子吸收促進劑。

其中，本發明所揭新穎胜肽係為一種骨質流失抑制劑。

其中，本發明所揭新穎胜肽係為一種骨質生成促進劑。

因此，藉由投予一有效量之本發明所揭新穎胜肽至一個體時，係能夠提昇該個體吸收飲食中鈣離子之效率，並且，能夠治療或/及預防與鈣離子缺乏相關疾病、骨質疏鬆相關疾病、發炎性疾病。

於本發明之一實施例中，本發明所揭該新穎胜肽係能用於製備一組合物，而該組合物係得為一醫藥組合物、一食品、一營養補充品。

舉例來說，當該組合物為一醫藥組合物時，該組合物係包含一有效量之本發明所揭新穎胜肽，及至少一藥學上可接受之載體，並且，該組合物係能用於預防或/及治療骨質疏鬆症、骨折等與鈣離子缺乏或骨質疏鬆相關之病症，亦能用於治療或/及發炎性疾病。

而當該組合物為一食品時，該組合物係得被製作為任何形式、型態、口味，並且，能用以預防與鈣離子不足相關之疾病，亦能用於增進體內鈣離子之吸收率。

本發明所揭新穎胜肽，其胺基酸序列編碼係包含SEQ ID No.1所示序列（TEVPAINTIASAEPTVH）。更進一步來說，該新穎胜肽之胺基酸序列係為SEQ ID No. 1所示序列或是與其具有90％以上相似之同源性胺基酸序列。而該新穎胜肽係能以萃取法、發酵法、水解法、人工合成方式、重組生物體產製平台或上述任二以上方法之組合所獲得。

所謂「同源性胺基酸序列」，係指一多胜肽之胺基酸序列中，進行單一或多個胺基酸之取代、刪除、添加而所衍生出之胺基酸序列。

所謂「萃取法」，其係指透過一物質於不同溶劑中之溶解度不同，將該物質自一混合物中分離出之方法，其中，用以獲得本發明所揭新穎胜肽之混合物係不侷限於來自植物或動物。更進一步來說，分離或/及純化之技術包含有，但不限於，利用蛋白質電泳分離法分離出特定大小之多胜肽、液相層析法、利用不同大小之濾膜進行分離等，而該等技術乃為本發明所屬技術領域且具通常知識者一般周知之技術，故於此不加以一一詳細說明。

所謂「發酵法」，係指將植物、動物或其衍生物與微生物進行發酵反應，用以獲得不同之代謝物質，如胜肽、胺基酸等，並且，得進一步透過分離純化之技術，獲得特定之一代謝物質，舉例來說，如黃豆經發酵反應後，其內含有多種生物活性胜肽。

所謂「水解法」，係指將植物、動物或其衍生物以酵素或酸進行水解，以產生特定胜肽，舉例來說，酪蛋白磷酸胜肽係將酪蛋白經由胰酶或胰蛋白酶水解而製成者。

所謂「人工合成方式」，其係透過人工方式將胺基酸依序連接而成為一多胜肽，通常具有以下優點：可方便地於合成過程中改變多胜肽之一級結構、加入特殊的胺基酸、以及對多胜肽之末端進行修飾等。

更進一步來說，人工合成方式係包含化學合成法以及胜肽合成儀。化學合成法可分為固相胜肽合成法及液相胜肽合成法，其中，液相合成法必須於完成每ㄧ胺基酸之連接後，進行萃取操作。惟，由於萃取所得之多胜肽中間物通常為混合物，因此，尚須進行層析純化步驟，因此，以液相合成法進行多胜肽之合成，必須涉及繁瑣之萃取及層析純化步驟，才能得到高純度之產物。

固相合成法係在固體聚合物顆粒（或聚合支撐物）上進行胜肽之鍵結反應。於此方法中，先將所欲多胜肽之N端胺基酸共價鍵結至聚合物顆粒上，其後再透過專一性鍵結之方式將後續胺基酸依序連接上，最後合成一多胜肽。由於該聚合物顆粒並不溶於溶劑中，故僅需於反應終了透過清洗及過濾操作，即可將該聚合物顆粒（以及連接在該聚合物顆粒上之所欲之多胜肽）與反應試劑及副產物分開。因此，固相胜肽合成法因為不需要純化中間產物，不僅具有較佳產率，且可大幅縮短反應時間，於長鏈多胜肽之合成上亦較具優勢，為目前較為廣為人所使用之胜肽合成方法。

所謂「重組生物體產製平台」，係指透過生物技術將用以表現特定蛋白質之核酸構築於一表現載體上，再將該重組表現載體轉形至一宿主細胞中，如大腸桿菌、酵母菌、乳酸菌等，使該重組表現載體能於該宿主細胞內表現該核酸，而得獲得該特定蛋白質。

所謂「有效量」，係指欲產生所求特定效果所需化合物或活性成份之量，得以其在組合物中所佔重量百分比表示。如同本發明所屬技術領域中具有通常知識者所瞭解者，該有效量會因為欲引起特定效果之投予方式而有所不同。一般來說，活性成分或化合物於組合物中之量可佔該組合物重量之約1%至約100%，較佳者係為約30%至約100%。

所謂「醫藥組合物」，係包含一有效量之欲產生特定效果之所需化合物或活性成份，以及至少一藥學上能接受之載體。如同本發明所屬技術領域中具有通常知識者所瞭解者，醫藥組合物之型態得隨著欲引起特定效果之投予方式有所不同，如錠劑、粉劑、針劑等，並且，該載體亦隨著醫藥組合物之型態而得為固態、半固態或液態。舉例來說，載體包含，但不限於，明膠、乳化劑、烴類混合物、水、甘油、生理食鹽水、緩衝生理鹽水、羊毛脂、石蠟、蜂蠟、二甲基硅油、乙醇。

所謂「與鈣離子缺乏相關之疾病」係指體內鈣離子濃度低下而引起之病症，例如抽筋、高血壓、中風、骨質疏鬆症、骨折、指甲脆弱、牙齒脆弱、肩頸背疼痛、失眠、暈眩等。

所謂「發炎性疾病」，係指與體內促發炎因子表現增加而引發之疾病，例如阿茲海默症、類風濕性關節炎、骨質疏鬆症、紅斑性狼瘡、花粉症、過敏、慢性關節炎等疾病，其中，促發炎因子係如IL-1、IL-6、TNF-α等。

所謂「一」或「該」乙詞，於本發明說明書及申請專利範圍中，除非另有說明者，應指包含一及一以上之數值。

以下，為能更進一步說明本發明之多功效，將茲分別舉實例作詳細說明，惟，該等實例係為用以解說之例示，其中所使用之任何詞彙並不限制本發明說明書及申請專利範圍之範圍及意義。

須先已說明者，以下實例中之動物係依據國家實驗研究院國家動物中心之要求（Guide for the care and Use of Laboratory Animals）進行飼養與照顧，並且相關實驗係通過國立中興大學實驗動物管理小組之審查（IACUC No:104-091）。

下列實例所使用之「Caco-2細胞株」，係為人類上皮結腸直腸癌細胞之簡稱，其具有小腸之運送能力，被認為是用以評估腸道運送機制之良好模式，因而為目前醫學實驗中最廣泛地被使用於評估人類腸道鈣離子吸收之細胞。

下列實例中所使用之「骨質疏鬆動物模式」，係為Akr1A1 基因喪失功能小鼠，其係無法自行大量合成維生素C，而會導致嚴重之骨質疏鬆症及氧化壓力失衡，而若給予該小鼠維生素C，可使小鼠之骨結構回復接近正常之狀態。

下列實例所使用之「維他命C」，係為一種抗氧化劑，可以降低活性氧自由基對於成骨細胞之傷害，亦能降低體內發炎因子，抑制破骨細胞分化及活化。而維生素C係被文獻揭露其能夠透過抑制ERK活化達到調節軟骨細胞分化，並且得誘導成骨細胞分化及活化。此外，有研究指出投予維生素C予去除卵巢之母鼠，係能增加其骨密度、提高體內抗氧化酵素超氧歧化酶及過氧化氫酶之活性。

下列實例之結果所使用之統計分析方法為單因子變異數分析（One-Way ANOVA）及鄧肯事後比較試驗（Duncan's post-hoc test）。當p值小於0.05時，該結果被認為具有統計上之顯著性。

實例一：製備胜肽

透過人工合成之方式，製備胺基酸序列係如SEQ ID No.1所示之胜肽，並且，確認該胜肽序列係為TEVPAINTIASAEPTVH。

實例二：培養Caco-2細胞株

將Caco-2 細胞株單層膜培養於含有DEME培養基之10平方公分培養盤，以TrypLE（Invitrogen, Carlsbad, CA）將分離細胞，再以無磷酸鹽KRH（Krebs Ringer Heps）溶液清洗數次，於37℃下加入1mM Fluo-3-AM染劑5μL以及20％（w/v）之熱可逆水膠（Pluronic F-127，RF127）溶液，約30分鐘，用以獲得一Caco-2 細胞懸浮液，其中，KRH 溶液係由140mM氯化鈉、5mM氯化鉀、6mM葡萄糖、10mM HEPES、0.55mM氯化鎂所製備成者，其酸鹼值約7.4，而該熱可逆水膠溶液係由熱可逆水膠與5毫升之KRH 溶液所配製而成者。

將帶有Fluo-3-AM染劑之該Caco-2 細胞懸浮液以無磷酸鹽KRH溶液充分沖洗後分成等分，每一等分係含有5X107細胞。各等分沈澱後，再次懸浮於240μL之無磷酸鹽KRH溶液後，移至96孔盤，備用。

實例三：細胞試驗（一）

將帶有Fluo-3-AM之Caco-2 細胞懸浮液分為三組，於第154秒時分別加入6mM 之鈣離子，再於第320秒時，分別以下列條件處理各組細胞：第一組係加入400μM 之本發明所揭胺基酸序列為SEQ ID No.1之胜肽，第二組係加入400μM 之市售酪蛋白磷酸肽（CPP），第三組係未加入胜肽。該帶有Fluo-3-AM之Caco-2 細胞株懸浮液係於波長488nm被激發，而螢光強度係於波長538nm下被紀錄，各組細胞之螢光強度係如第一圖所示。更進一步者，藉由各組Caco-2細胞內之fluo-3螢光強度之變化，推算出第一組及第二組之Caco-2細胞分別相較於第三組Caco-2細胞之波峰鈣離子（peak [Ca2+]）增加之百分比，結果如第二圖所示。

由第一圖及第二圖之結果可知，第一組之Caco-2 細胞產生之螢光強度顯著高於第二組及第三組，並且，比較各組波峰鈣離子之變化值發現，第一組之Caco-2 細胞內之鈣離子濃度應較第二組及第三組有顯著增加。由此可知，本發明所揭胺基酸序列為SEQ ID No.1之胜肽確實具有能夠將鈣離子運送至細胞內之能力。

實例四：細胞試驗（二）

將帶有Fluo-3-AM之Caco-2 細胞懸浮液分為六組，於第154秒時，依序於各組加入以下濃度之鈣離子：0mM、0.3mM、0.5 mM、1.5 mM、3 mM、6 mM，並且，於第320秒時，分別加入400μM 之本發明所揭胺基酸序列為SEQ ID No.1之胜肽。以如實例三中所述方法，觀察分析各該組Caco-2細胞內fluo-3螢光強度之變化及各組波峰鈣離子（peak [Ca2+]）濃度之變化，結果如第三圖及第四圖所示。

由第三圖及第四圖之結果可知，於第442秒時，第一組至第六組Caco-2 細胞之螢光強度分別為7059148、9780517、9720348、10604175、10986171、10912015，並且，相較於第一組，第二組至第六組之鈣離子增加百分比依序為38.6％、37.7％、50.2％、55.6％、54.6％。

由上述結果顯示，本發明所揭胺基酸序列為SEQ ID No.1之胜肽係能夠將鈣離子運送進入細胞中，並且，隨著細胞外鈣離子濃度增加而使進入細胞內之鈣離子濃度增加。據此可知，本發明所揭胺基酸序列為SEQ ID No.1之胜肽係能將不同劑量之鈣離子運送至細胞內。

實例五：細胞試驗（三）

將帶有Fluo-3-AM之Caco-2 細胞懸浮液分為五組，於第154秒時，分別依序加入以下濃度之尼非待平（nifedipine）：0μM、10μM、20μM、50μM、100μM，再於第320秒時，分別於各組加入6mM之鈣離子，於第502秒時，分別於各組加入400μM之本發明所揭胺基酸序列為SEQ ID No.1之胜肽。以如實例三中所述條件，觀察分析各該組Caco-2細胞內fluo-3螢光強度之變化，結果如第五圖所示。

由於藥物尼非待平係為L型電位敏感性鈣離子通道之抑制劑，因此，投予尼非待平應可阻礙鈣離子經由L型電位敏感性鈣離子通道進入細胞中，而使Caco-2 細胞之螢光強度下降。惟，由第五圖之結果顯示，投予本發明所揭胺基酸序列為SEQ ID No.1之胜肽後，各該組之螢光強度係提昇且未有顯著差異存在。換言之，L型電位敏感性鈣離子通道抑制劑無法阻礙鈣離子進入Caco-2 細胞，本發明所揭胺基酸序列為SEQ ID No.1之胜肽仍能將細胞外之鈣離子運送至細胞內。

由此可知，本發明所揭胺基酸序列為SEQ ID No.1之胜肽係非經由L型電位敏感性鈣離子通道將鈣離子運送至細胞內。

實例六：細胞試驗（四）

如同實例五中所述步驟，惟，不同在於，於第154秒時投予鈣離子通道V6抑制劑：釕紅（ruthenium red，RUR）。各該組Caco-2 細胞內之螢光強度變化之結果如第六圖所示。

由第六圖之結果可知，隨著釕紅投予劑量增加，各該組Caco-2 細胞內之螢光強度係隨之減少。而由第六圖之結果進一步計算出，相較於第一組，第二組至第五組波峰鈣離子（peak [Ca2+]）減少百分比，分別為41.9％、57.3％、72.0％、86.7％。換言之，雖然該胺基酸序列為SEQ ID No.1之胜肽能夠將外界之鈣離子運送至細胞內，但是，當投予釕紅至細胞時，會阻礙鈣離子進入細胞內，並且，鈣離子進入細胞內之濃度會隨著釕紅投予劑量增加而降低。

實例七：製備骨質疏鬆症動物模式

取8週齡之ICR品系公鼠製備骨質疏鬆動物模式為Akr1A1基因缺失小鼠，其中，以基因定位植入技術，將綠螢光基因 (eGFP) 導入 ICR 品系公鼠之第四號染色體 Akr1A1 基因座上，並剔除 Akr1A1 基因 exon 1-5 區域 30 kb 基因片段，使 Akr1A1 基因喪失功能所製備而成骨質疏鬆模式小鼠。

實例八：動物試驗

取複數隻Akr1A1基因缺失公鼠，分為三組，並分別依據以下條件處理12週，其中，第一組係投予400mg/L維他命C；第二組係為未治療組，僅餵食水；第三組係投予本發明所揭新穎胜肽，劑量為1.5mg/kg/天。

於實驗結束後，分別取各該組小鼠之血液及左右股骨，而血液離心後獲得無紅血球之血清，以供後續實例分析；左右股骨係被分別清除附著於其上之肌肉後，將其中一根股骨經福馬林固定後以µ-CT掃描，另一股骨以70％酒精消毒後作骨髓沖出，進行細胞培養，以供後續實例分析。

實例九：含氧自由基/含氮自由基（ROS/RNS）分析

取實例九中各該組小鼠於20週齡所得之血清與骨髓沖出液，分別作為本實例之待析樣品。

將待析樣品以含氧自由基/含氮自由基檢測套組進行分析（OxiSelect™ In Vitro ROS/RNS Assay Kit, Green Fluorescence），流程如下：先將標準品溶液（DCF）、催化劑和DCFH 溶液（2 .7 - Dichlorofluorescndacetate）製備完成，於黑色96孔盤中加入50 μL待析樣品，接著加入50 μL催化劑反應5分鐘，再加入100 μL DCFH 溶液，於室溫避光反應30分鐘待反應完成後，並以多功能盤孔檢測儀，以480 nm excitation / 530 nm emission條件偵測待析樣品中之螢光DCF。血清之檢測結果如第七圖A所示，骨髓沖出液之檢測結果如第七圖B所示。

由第七圖A及第七圖B之結果可知，相較於第一組小鼠，未投予維他命C之第二組小鼠，其體內及骨頭內之氧化壓力係明顯增加，而投予本發明所揭胜肽之第三組小鼠，其體內及骨內之活性氧自由基濃度係較第二組明顯下降，並且與第一組小鼠相近，顯示本發明所揭胺基酸序列為SEQ ID No.1之胜肽係能夠抑制體內及骨頭內之自由基濃度，並且隨著投予時間越長效果越佳。

先前研究指出係指出含氧自由基/含氮自由基濃度過高，會抑制成骨細胞生成、促進骨細胞凋亡及破骨細胞分化、增值，因此，含氧自由基/含氮自由基已被認為引起骨質疏鬆症之因子，而藉由投予本發明所揭胺基酸序列為SEQ ID No.1之胜肽係能夠有效地降低體內之自由基濃度，因而能夠促進骨細胞生成並且抑制破骨細胞分化，以達到治療或/預防骨質疏鬆相關病症之功效。此外，體內氧化壓力增加會使細胞受損，並且提昇促發炎因子表現，而會導致與發炎相關疾病之發生，因此，藉由投予本發明所揭胺基酸序列為SEQ ID No.1之胜肽係能降低體內之氧化壓力，而達到預防或/及治療與發炎相關疾病之功效。

實例十：硫巴比妥酸反應物（Thiobarbituric acid reactive substances, TBARS）分析

將實例八中各該組小鼠20週齡所得之血清以硫巴比妥酸反應物分析套組（Cayman, Ann Arbor, MI, USA）進行分析，流程如下：將標準品溶液和顏色試劑製備完成，每一個濃度標準品及血清使用一管15毫升試管加入100 μL之TBA SDS 溶液，接著加入100 μL之各濃度標準品及血清，最終每管加入4 mL之顯色試劑，於水浴槽中100℃加熱1小時，加熱完成後立即冷卻10分鐘，使反應終止，冷卻完後用4℃、1600 x g離心10分鐘，而後置於室溫25℃下，取上清液150 μL，使用酵素免疫微盤分析儀（Multiskan EX），以波長為535 nm測定待析樣品濃度，對照標準曲線後，計算得知血清中丙二醛（MDA）含量。各該組小鼠血清之分析結果係如第八圖所示。

根據先前研究指出，體內丙二醛含量增加，係代表體內氧化壓力增加，不僅會提昇促發炎因子，並且會活化破骨細胞，導致骨質疏鬆症發生或是面臨罹患骨質疏鬆相關病症之高風險。由第八圖之結果可知，第二組小鼠血清內之丙二醛含量係明顯高於第一組小鼠，顯示第二組小鼠之脂質過氧化代謝異常，以至於其骨質代謝失衡。而藉由投予本發明所揭胜肽，第三組小鼠血清內之丙二醛含量係明顯低於第二組小鼠，並且與第一組小鼠相近，顯示藉由投予本發明所揭胺基酸序列為SEQ ID No.1之胜肽係能夠有效地降低血清中丙二醛之含量，而能夠達到預防或是治療骨質疏鬆相關疾病及發炎性相關疾病之功效。

實例十一：超氧化物歧化酶分析

將實例八中各該組小鼠20週齡所得之血清以超氧化物歧化酶分析套組（Cayman, Ann Arbor, MI, USA）進行分析。首先，先將標準品溶液、自由基檢測劑（Radical Detector）和黃嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase）製備完成，接著在96孔盤依序加入200 μL之自由基檢測劑、10 μL之各濃度標準品及血清，最後加入20 μL之黃嘌呤氧化酶，於室溫中搖晃反應30分鐘，使用酵素免疫微盤分析儀（Multiskan EX），以波長為454 nm測定血清濃度，對照標準曲線後，經計算後可得知血清中超氧化物歧化酶含量。各該組小鼠血清檢測結果如第九圖所示。

實例十二：過氧化氫酶分析

將實例八中各該組小鼠20週齡所得之血清以過氧化氫酶分析套組（Cayman, Ann Arbor, MI, USA）進行分析，流程如下：先將標準品溶液、過氧化氫酶分析緩衝液、過氧化氫酶樣品緩衝液和Catalase Hydrogen Peroxide製備完成，於96孔盤依序加入100 μL 過氧化氫酶分析緩衝液、30 μL 甲醇和20 μL之各濃度標準品及血清混勻；接著加入20 μL 過氧化氫酶，於室溫中搖晃反應20分鐘；反應完後再加入30 μL 氫氧化鉀和30 μL Catalase Purpald （Chromogen），於室溫中搖晃反應10分鐘；最後加入10 μL Catalase Potassium Periodate，於室溫中搖晃反應5分鐘後，使用酵素免疫微盤分析儀，以波長為540 nm測定血清濃度，對照標準曲線後，計算血清濃度，即可得知血清中過氧化氫酶含量。檢測結果如第十圖所示。

過去研究指出，超氧化物歧化酶及過氧化氫酶係為體內重要之抗氧化劑，若其含量過低會無法清除體內自由基，使細胞承受高氧化壓力而增加身體臟器發炎反應之發生，並且抑制成骨細胞增生及抑制軟骨細胞分化之現象，進而影響骨生成作用，造成骨質疏鬆相關病症之惡化或是罹患骨質疏鬆症之高度風險。

請參第九圖及第十圖，由實例十一及實例十二之結果可知，第二組小鼠血清內之抗氧化酵素含量係明顯低於第一組小鼠，顯示第二組小鼠面臨高氧化壓力而無法清除體內自由基；而投予本發明所揭胜肽之第三組小鼠，其血清內抗氧化酵素之含量係較第二組小鼠高，並且與第一組小鼠相近，顯示本發明所揭胜肽係能提高體內抗氧化酵素之活性，達到清除自由基及降低體內氧化壓力之功效。

因此，由第九圖及第十圖之結果顯示，透過投予本發明所揭胺基酸序列為SEQ ID No.1之胜肽係能夠降低血清中超氧化物歧化酶及過氧化氫酶之濃度，以避免氧化壓力抑制骨生成作用，能夠有效地達到治療或預防骨質疏鬆相關病症及發炎性疾病之功效。

實例十三：促發炎因子分析

將實例八中各該組小鼠20週齡所得之血清分別以IL-1 Mouse SimpleStep ELISA套組（abcam, Cambridge, MA, USA）、IL-6 Mouse ELISA 套組(abcam, Cambridge, MA, USA)及TNF-α Mouse SimpleStep ELISA套組（abcam, Cambridge, MA, USA）進行分析，其中：

檢測血清中IL-1或TNF-α濃度之流程如下：將製備好之標準品溶液及血清取50 μL/well和50 μL/well antibody cocktail加入96孔盤，於室溫培養一小時後，清洗後再加入100 μL/well之TMB 受質溶液（substrate solution），進行室溫避光反應約10分鐘，最後加入100 μL/well之終止溶液，用酵素免疫微盤分析儀，設定波長為450 nm測定血清濃度，經計算後即可得知血清中IL-1β或TNF-α濃度。

檢測血清中IL-6濃度之流程如下：將製備好之標準品溶液及血清（2倍）取100 μL/well加入96孔盤，於室溫下培養2.5小時，清洗孔盤後，加入100 μL/well之1X 生物素化（Biotinylated） IL-6 偵測抗體，室溫培養1小時；清洗孔盤後再加入100 μL/well之HRP鏈黴親和素溶液，於室溫反應45分鐘；清洗孔盤後再加入100 μL/well之TMB 單步驟受質試劑（One-Step Substrate Reagent），於室溫下進行避光反應30分鐘；最後加入50 μL/well之終止溶液，再以酵素免疫微盤分析儀，設定波長為450 nm測定血清濃度，計算後即可得知血清中IL-6濃度。

於各該組小鼠之血清中檢測分析IL-1β、IL-6及TNF-α含量之結果係分別如第十一圖至第十三圖所示。

先前文獻係指出，當體內與發炎相關之細胞激素，如IL-1β、IL-6、TNF-α增加時，不僅會導致慢性發炎相關之疾病，亦會刺激破骨細胞增生，導致加速骨質流失，會使骨質疏鬆相關病症惡化或是提高罹患骨質疏鬆症之風險。

由第十一圖至第十三圖之結果可知，第二組小鼠體內之促發炎因子係明顯高於第一組小鼠，而投予本發明所揭胜肽之第三組小鼠，其體內促發炎因子之含量係明顯低於第二組小鼠，並且與第一組血清內含量相近。由此結果顯示，投予本發明所揭胺基酸序列為SEQ ID No.1之胜肽係能夠降低體內發炎相關之細胞激素濃度，因而能夠降低發炎性疾病發生之機會，並且，能夠抑制破骨細胞增生，以避免骨質快速流失，而能夠達到預防及/或治療骨質疏鬆相關病症之功效。

實例十四：骨質代謝指標測定

將實例八中各該組小鼠20週齡所得之血清或股骨骨髓沖出液作為本實例之待析樣品，而分別以P1NP（ProcollagenⅠN-Terminal Propeptide）分析套組（Uscn Life Science Inc., Wuhan, China）、CTX-1（Cross Linked C-Telopeptide Of Type I Collagen）ELISA套組（Uscn Life Science Inc., Wuhan, China）、骨鈣蛋白（Osteocalcin） ELISA套組（Uscn Life Science Inc., Wuhan, China）、老鼠護骨蛋白（Osteoprotegerin，簡稱OPG）/TNFRSF11B 免疫分析套組（R&D System Inc., MN, USA）、老鼠TRANCE/RANKL/TNFSF11 免疫分析套組（R&D System Inc., MN, USA）進行分析，其中：

檢測待析樣品中P1NP濃度之流程如下：將標準品溶液和樣品（100倍）稀釋製備完成，然後取100 μL/well加入96孔盤37℃培養一小時，移除孔盤內之液體後，加入100 μL/well 偵測試劑A培養一小時，清洗孔盤後再加入100 μL/well 偵測試劑 B培養30分鐘；清洗孔盤後再加入90 μL/well之受質溶液反應15分鐘，最後加入50 μL/well之終止溶液，以酵素免疫微盤分析儀，設定波長為450 nm測定待析樣品濃度，計算後即可得知待析樣品中P1NP濃度。檢測各該組小鼠血清內P1NP含量之結果係如第十四圖A所示，檢測各該組小鼠股骨內P1NP含量之結果係如第十四圖B所示。

檢測待析樣品中CTX-1或骨鈣蛋白濃度之流程如下：將標準品溶液和待析樣品（10倍）稀釋製備完成，取50μL/well和50μL/well 偵測試劑A加入96孔盤37℃培養一小時，清洗孔盤後再加入100μL/well B培養30分鐘； r清洗孔盤後再加入90μL/well之受質溶液反應15分鐘，最後加入50 μL/well之終止溶液，用酵素免疫微盤分析儀，設定波長為450 nm測定待析樣品濃度，計算後即可得知待析樣品中CTX-1或骨鈣蛋白之濃度。檢測各該組小鼠血清內CTX-1含量之結果係如第十五圖A所示，檢測各該組小鼠股骨內CTX-1含量之結果係如第十五圖B所示；檢測各該組小鼠血清內骨鈣蛋白含量之結果係如第十六圖A所示，檢測各該組小鼠股骨內骨鈣蛋白含量之結果係如第十六圖B所示。

檢測血清中核因子κ-B配體受體致活劑（RANKL）濃度之流程如下：先將50 μL/well 分析稀釋液 RD1W加入塗覆老鼠TRANCE 之專一性單株抗體的孔盤中，再加入50 μL/well之標準品溶液和血清於室溫中培養2小時，清洗孔盤後再加入100 μL/well老鼠TRANCE/RANKL結合劑，於室溫培養2小時；清洗孔盤後再加入100 μL/well 受質溶液室溫避光培養30分鐘，最後加入100 μL/well之終止溶液，用酵素免疫微盤分析儀，設定波長為450 nm測定血清濃度，計算後即可得知血清中RANKL濃度。各該組小鼠血清內之RANKL濃度之檢測結果係如第十七圖所示。

檢測血清中護骨蛋白濃度之流程如下：將50 μL/well分析稀釋液 RD1-21加入塗覆老鼠護骨蛋白之專一性單株抗體的孔盤中，再加入50 μL/well之標準品溶液和血清於室溫中培養2小時，清洗孔盤後再加入100 μL/well 老鼠護骨蛋白結合劑（conjugate），於室溫培養2小時；清洗孔盤後再加入100 μL/well受質溶液，室溫避光培養30分鐘，最後加入100 μL/well之終止溶液後，以酵素免疫微盤分析儀，設定波長為450 nm測定血清濃度，計算後即可得知血清中護骨蛋白濃度。各該組小鼠血清內之護骨蛋白濃度之檢測結果係如第十八圖所示。

更進一步地，計算出各該組小鼠血清中RANKL相對護骨蛋白之比率，結果如第十九圖所示。

於骨形成作用時，成骨細胞係會分泌P1NP與骨鈣蛋白，當P1NP與骨鈣蛋白之含量高時，表現成骨細胞之活性較佳；而破骨細胞進行骨再吸收作用時，會產生許多短小胜肽，如CTX-1，被釋放於血液當中，當血液或股骨骨髓沖出液中CTX-1含量高時，表示破骨細胞活性高。由第十四圖至第十六圖之結果可知，第二組小鼠血清及骨髓沖提液中之P1NP與骨鈣蛋白含量係較第一組小鼠低，並且，其CTX-1含量係較第一組小鼠高，顯示第二組小鼠之成骨細胞活性較低，且破骨細胞活性較高，表示第二組小鼠係為骨質疏鬆症小鼠；而相較於第二組小鼠來說，第三組小鼠體內P1NP與骨鈣蛋白之含量係明顯提昇，並且，CTX-1含量係明顯下降，表示投予本發明所揭胜肽係能夠增加成骨細胞之活性，並且抑制破骨細胞活化。

再者，RANKL係為破骨細胞分化及活化需要之一細胞激素，而當破骨細胞過度作用時，成骨細胞會分泌護骨蛋白而用於結合RANKL，藉此抑制骨再吸收作用，意即當RANKL含量高或/及護骨蛋白含量低時，表示個體面臨骨質疏鬆症發生或惡化之高風險。由第十七圖至第十九圖之結果可知，相較於第一組小鼠，第二組小鼠體內RANKL含量係明顯提昇，並且，護骨蛋白之含量係明顯降低，顯示第二組小鼠之骨質代謝失衡而快速流失中；相較於第二組小鼠，投予本發明所揭胜肽之第三組小鼠體內之RANKL含量係明顯下降，並且，分泌大量之護骨蛋白，顯示第三組小鼠之骨質代謝係偏向骨質再生作用。

據此，由第十四圖至第十九圖之結果可知，藉由投予本發明所揭胺基酸序列為SEQ ID No.1之胜肽係能夠提高個體骨質合成指標，並且降低骨骼吸收指標，顯示本發明所揭胺基酸序列為SEQ ID No.1之胜肽係能夠促進成骨細胞增生，並抑制破骨細胞之作用，不僅能夠避免骨質疏鬆相關病症之惡化，更能夠透過增加骨生成之效率而達到治療或/及預防骨質疏鬆相關病症之效果。

實例十五：電腦斷層掃描分析

以電腦斷層掃描儀器（Micro-CT, Skyscan, Belgium）掃描實例九中之各該組小鼠骨頭，以CTAn軟體建立3D圖檔並進行調整，以獲得各該組小鼠骨小樑與皮質骨之結構變化，並且，藉由軟體之分析功能，換算出骨小樑骨體積比例、骨小樑平均厚度、骨小樑數量、骨小樑分離率、骨小樑骨礦物密度、皮質骨骨體積、皮質骨骨表面積體積比、皮質骨體積比例、股骨寬度、皮質骨骨礦物密度等，結果如第二十圖至第三十圖所示。

由第二十圖至第三十圖之結果係能清楚得知，由於第二組小鼠之骨質流失速率大於骨生成速率，因此，相較於第一組小鼠來說，第二組小鼠之骨質結構較為鬆散、骨小樑厚度較薄、骨小樑數目下降、骨小樑間之寬度較大、皮質骨骨表面積體積比較低、骨礦物質密度較低、皮質骨直徑增加，造成骨密度下降、皮質骨骨架支撐力較差之情形；而由於本發明所揭胜肽係能使第三組小鼠之骨質代謝往骨生成之方向作用，因此，由電腦斷層掃描及其分析之結果來看，第三組小鼠之骨質結構及骨密度係明顯優於第二組小鼠，並且與第一組小鼠間無顯著差異存在。

由此可知，本發明所揭胺基酸序列為SEQ ID No.1之胜肽不僅能夠改善或抑制骨質流失，更能夠有效提昇骨質密度，顯示本發明所揭胺基酸序列為SEQ ID No.1之胜肽係具有促進成骨細胞增生及分化之能力，而使刺激骨生成，達到預防或/及治療骨質疏鬆相關病症之功效。

藉由上述說明可知，本發明所揭新穎胜肽係能有效地將鈣離子經由經由鈣離子通道V6運送至細胞中，其中，輸送鈣離子進入細胞之效率係隨著該新穎胜肽投予劑量之增加而提昇，達到預防或/治療與鈣離子缺乏相關病症之功效；並且，本發明所揭新穎胜肽係能夠降低細胞內氧化壓力及發炎相關細胞激素之濃度，進而抑制破骨細胞增生及骨細胞凋亡，且同時會促進成骨細胞增生及分化，增加成骨細胞之數量，亦即本發明所揭新穎胜肽係能提昇骨生成效率，以達到治療或/及預防骨質疏鬆相關病症之功效。此外，本發明所揭新穎胜肽係具有治療或/及預防發炎性相關疾病之功效。據此，本發明所揭該新穎胜肽係能地作為一醫藥組合物之有效成份，或是一食品之組成份，以提供不同需求者。

以上僅是藉由各該實例詳細說明本發明，熟知該技術領域者於不脫離本發明精神下，而對於說明書中之實施例所做的任何簡單修改或是變化，均應為本案申請專利範圍所得涵攝者。

無

第一圖係為紀錄以不同條件處理後之各組Caco-2 細胞的螢光強度變化。 第二圖係以第一圖中之第三組作為基準，計算出第一組及第二組相較於第一組之螢光強度變化之結果。 第三圖係以不同濃度之鈣離子處理之各該組Caco-2 細胞，其螢光強度變化之結果。 第四圖係以第三圖中之第一組為基準，計算出第二組至第五組分別相較於第一組螢光強度增加之百分比的結果。 第五圖係為以不同濃度之L型電位敏感性鈣離子通道抑制劑處理之各該組Caco-2 細胞，其螢光強度變化之結果。 第六圖係為以不同濃度之鈣離子通道V6抑制劑處理之各該組Caco-2 細胞，其螢光強度變化之結果。 第七圖A係於各該組小鼠於20週齡時，分析其血清內含氧自由基/含氮自由基之結果。 第七圖B係於各該組小鼠於20週齡時，分析其股骨內含氧自由基/含氮自由基之結果。 第八圖係於各該組小鼠於20週齡時，分析其血清內丙二醛含量之結果。 第九圖係於各該組小鼠於20週齡時，分析其血清內超氧化物歧化酶含量之結果。 第十圖係於各該組小鼠於20週齡時，分析其血清內過氧化氫酶含量之結果。 第十一圖係於各該組小鼠於20週齡時，分析其血清內IL-1β含量之結果。 第十二圖係於各該組小鼠於20週齡時，分析其血清內IL-6含量之結果。 第十三圖係於各該組小鼠於20週齡時，分析其血清內TNF-α含量之結果。 第十四圖A係於各該組小鼠於20週齡時，分析其血清內P1NP含量之結果。 第十四圖B係於各該組小鼠於20週齡時，分析其股骨內P1NP含量之結果。 第十五圖A係於各該組小鼠於20週齡時，分析其血清內CTX-1含量之結果。 第十五圖B係於各該組小鼠於20週齡時，分析其股骨內CTX-1含量之結果。 第十六圖A係於各該組小鼠於20週齡時，分析其血清內骨鈣蛋白含量之結果。 第十六圖B係於各該組小鼠於20週齡時，分析其股骨內骨鈣蛋白含量之結果。 第十七圖係於各該組小鼠於20週齡時，分析其血清內RANKL含量之結果。 第十八圖係於各該組小鼠於20週齡時，分析其血清內護骨蛋白含量之結果。 第十九圖係為計算各組小鼠血清中RANKL相對於護骨蛋白之比率的結果。 第二十圖係顯示各組小鼠之骨小樑結構變化。 第二十一圖係顯示各組小鼠之骨小樑骨體積比例。 第二十二圖係顯示各組小鼠之骨小樑數量。 第二十三圖係顯示各組小鼠之骨小樑分離率。 第二十四圖係顯示各組小鼠之骨小樑平均厚度。 第二十五圖係顯示各組小鼠之骨小樑骨礦物密度。 第二十六圖係顯示各組小鼠之皮質骨骨表面積體積比。 第二十七圖係顯示各組小鼠之皮質骨體積。 第二十八圖係顯示各組小鼠之皮質骨體積比例。 第二十九圖係顯示各組小鼠之股骨寬度。 第三十圖係顯示各組小鼠之皮質骨骨礦物密度。

＜110＞ 國立中興大學 ＜120＞ 新穎胜肽、含有該胜肽之組合物及其用途 ＜130＞ 無 ＜160＞ 1 ＜170＞ PatentIn version 3.5 ＜210＞ 1 ＜211＞ 17 ＜212＞ PRT ＜213＞ Artificial Sequence ＜220＞ ＜223＞ 人工合成 ＜400＞ 1 Thr Glu Val Pro Ala Ile Asn Thr Ile Ala Ser Ala Glu Pro Thr Val 1 5 10 15 His

Claims (13)

1. 一種新穎胜肽，其係包含有SEQ ID NO.1所示胺基酸序列或是與其具有90％以上相似度之同源性胺基酸序列。
2. 依據申請專利範圍第1項所述新穎胜肽，其胺基酸序列係為SEQ ID NO.1。
3. 一種醫藥組合物，其係至少包含有一有效量之如申請專利範圍第1或2項所述新穎胜肽，及至少一藥學上可接受之載體。
4. 一種如申請專利範圍第3項所述醫藥組合物之用途，其係用以治療或/及預防與鈣離子缺乏相關之疾病。
5. 依據申請專利範圍第4項所述醫藥組合物之用途，其中，該與鈣離子缺乏相關之疾病係為骨質疏鬆症。
6. 一種如申請專利範圍第3項所述醫藥組合物之用途，其係用以治療或/及預防發炎性疾病。
7. 一種如申請專利範圍第3項所述醫藥組合物之用途，其係用以治療或/及預防與骨質疏鬆相關疾病。
8. 依據申請專利範圍第7項所述醫藥組合物之用途，其中，該與骨質疏鬆相關疾病係為骨折。
9. 一種組合物，其係至少包含有如申請專利範圍第1或2項所述新穎胜肽。
10. 依據申請專利範圍第9項所述組合物，其係為一營養補充品。
11. 一種鈣離子吸收促進劑，其係包含如申請專利範圍第1或2項所述新穎胜肽。
12. 一種骨質流失抑制劑，其係包含如申請專利範圍第1或2項所述新穎胜肽。
13. 一種骨質生成促進劑，其係包含如申請專利範圍第1或2項所述新穎胜肽。