TW201920286A - Bcma單株抗體-藥物結合物 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種抗體-藥物結合物(ADC)，其包含針對與細胞毒素結合之B細胞成熟抗原(BCMA)之單株抗體或其抗原結合片段。本發明亦提供包含該抗體-藥物結合物之組合物，及藉由使多發性骨髓瘤細胞與該ADC接觸來殺滅表現BCMA之多發性骨髓瘤細胞(包括多發性骨髓瘤幹細胞)的方法。

Description

BCMA單株抗體-藥物結合物
多發性骨髓瘤(MM)為一種表徵為純系漿細胞積聚之惡性腫瘤(參見例如，Palumbo等人,New England J. Med .,364 (11): 1046-1060 (2011),及Lonial等人,Clinical Cancer Res .,77 (6): 1264-1277 (2011))。當前用於MM之療法包括化學療法、放射、手術、雙膦酸鹽及自體性幹細胞移植(ASCT)。雖然此等療法通常引起緩解，但幾乎所有患者最終復發並死亡(參見例如，Lonial等人，同前文獻，及Rajkumar,Nature Rev. Clinical Oncol ,5 (8): 479-491 (2011))。
B細胞成熟抗原(BCMA)為在B細胞譜系之細胞上表現的腫瘤壞死因子家族受體(TNFR)成員(Laabi等人,Nucleic Acids Research , 22(7): 1147-1154 (1994))。在最終分化之B細胞上，BCMA表現最高。BCMA參與調節漿細胞之存活以維持長期體液免疫性。BCMA之表現與許多癌症、自體免疫病症及感染性疾病相關。若干研究者已普遍地在多發性骨髓瘤細胞中偵測到BCMA RNA，且已在來自多發性骨髓瘤患者之漿細胞表面上偵測到BCMA蛋白(參見例如，Novak等人,Blood ,103 (2): 689-694 (2004)；Neri等人,Clinical Cancer Research ,73 (19): 5903-5909 (2007)；Bellucci等人,Blood ,105 (10): 3945-3950 (2005)；及Moreaux等人,Blood ,703 (8): 3148-3157 (2004))。因此，已將BCMA作為多發性骨髓瘤之可能治療性靶標來研究。
對可在治療多發性骨髓瘤之方法中使用的組合物之需求仍然存在。本發明提供此類組合物及方法。
本發明提供一種抗體-藥物結合物(ADC)，其包含針對與細胞毒素結合之B細胞成熟抗原(BCMA)之單株抗體或其抗原結合片段。該單株抗體包含：(a)重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 1之互補決定區1 (HCDR1)胺基酸序列、SEQ ID NO: 2之HCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 3之HCDR3胺基酸序列；及(b)輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 4之互補決定區1 (LCDR1)胺基酸序列、SEQ ID NO: 5之LCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 6之LCDR3胺基酸序列。
另外，本發明提供包含前述抗體-藥物結合物之組合物，及藉由使多發性骨髓瘤細胞與ADC接觸來殺滅表現BCMA之多發性骨髓瘤細胞(包括多發性骨髓瘤幹細胞)的方法。
本發明亦提供一種針對BCMA之單株抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 1之互補決定區1 (HCDR1)胺基酸序列、SEQ ID NO: 2之HCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 3之HCDR3胺基酸序列；及(b)輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 4之互補決定區1 (LCDR1)胺基酸序列、SEQ ID NO: 5之LCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 6之LCDR3胺基酸序列。
以電子方式提交之材料之合併引用
與本申請案同時提交且如下標識之電腦可讀核苷酸/胺基酸序列表以全文引用的方式併入本文中：一個16,420位元組ASCII (文本)檔案，其命名為「BCMA-100-US-PSP-SeqListing.TXT」，創建於2017年7月31日。
本發明提供一種抗體-藥物結合物(ADC)，其包含針對與細胞毒素結合之B細胞成熟抗原(BCMA)之單株抗體或其抗原結合片段。如本文所用之術語「抗體-藥物結合物」係指包含經由化學連接子連接至至細胞毒性劑(通常為具有較高全身性毒性之小分子藥物)之單株抗體(mAb)的化合物。在一些實施例中，ADC可包含已經化學修飾以含有連接子之小分子細胞毒素。連接子隨後用於將細胞毒素結合至抗體或其抗原結合片段。在與細胞表面上之靶標抗原結合後，ADC經內化且遷移至溶酶體，在該溶酶體中，藉由可裂解連接子之蛋白水解(例如，藉由溶酶體中發現之組織蛋白酶B)或藉由抗體之蛋白降解(在經由非可裂解連接子連接至細胞毒素之情況下)來釋放細胞毒素。細胞毒素隨後易位出溶酶體且進入細胞溶質或細胞核，在該細胞溶質或細胞核中，細胞毒素可隨後取決於其作用機制而與其標靶結合。
如本文所用之術語「單株抗體」係指由B細胞之單一純系產生且與同一抗原決定基結合之抗體。相反，術語「多株抗體」係指由不同B細胞產生且與同一抗原之不同抗原決定基結合之抗體群。本文中所描述之抗體-藥物結合物可包含完整抗體或抗體片段。完整的抗體通常由四個多肽組成：重(H)鏈多肽之兩個一致複本及輕(L)鏈多肽之兩個一致複本。重鏈中之各者含有一個N端可變(VH)區及三個C端恆定(CH1、CH2及CH3)區，且各輕鏈含有一個N端可變(VL)區及一個C端恆定(CL)區。每對輕鏈及重鏈之可變區形成抗體之抗原結合位點。VH區及VL區具有相同通式結構，其中各區包含序列相對保守之四個構架區。構架區由三個互補決定區(CDR)連接。已知為CDR1、CDR2及CDR3的三個CDR形成抗體之「高變區」，該高變區負責抗原結合。
ADC可包含抗體之抗原結合片段。術語「抗體片段」、「抗原結合片段」、「抗體之功能性片段」及「抗原結合部分」在本文中可互換使用，且係指抗體之保留特異性結合至抗原之能力的一或多個片段或部分(一般而言，參見Holliger等人,Nat. Biotech .,23 (9): 1 126-1129 (2005))。舉例而言，抗體片段可包含一或多個CDR、可變區(或其部分)、恆定區(或其部分)或其組合。抗體片段之實例包括但不限於：(i) Fab片段，其為由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；(ii) F(ab')2片段，其為包含由在鉸鏈區處之雙硫橋鍵連接的兩個Fab片段之二價片段；(iii) Fv片段，其由抗體之單臂之VL及VH域組成；(iv)單鏈Fv (scFv)，其為由Fv片段之兩個域(亦即，VL及VH)組成之單價分子，該兩個域藉由使得兩個域能夠合成為單個多肽鏈之合成連接子接合(參見例如，Bird等人,Science ,242 : 423-426 (1988)；Huston等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,85 : 5879-5883 (1988)；及Osbourn等人,Nat. Biotechnol .,16 : 778 (1998))；及(v)雙功能抗體，其為多肽鏈之二聚體，其中各多肽鏈包含由肽連接子連接至VL之VH，該肽連接子過短而無法在同一多肽鏈上的VH與VL之間配對，從而驅使在不同VH-VL多肽鏈上的互補域之間配對以產生具有兩個功能性抗原結合位點之二聚分子。抗體片段為此項技術中已知的且更詳細地描述於例如美國專利申請公開案2009/0093024 Al中。
在一個實施例中，本文中所描述之抗體-藥物結合物包含針對B細胞成熟抗原(BCMA，亦稱為CD269)之單株抗體或其抗原結合片段。BCMA為腫瘤壞死因子受體超家族之成員(參見例如，Thompson等人,J. Exp. Medicine ,192 (1): 129-135 (2000)及Mackay等人,Annu. Rev. Immunol .,21 : 231-264 (2003))。BCMA結合B細胞活化因子(BAFF)及增殖誘導配體(APRIL) (參見例如，Mackay等人，同前文獻，及Kalled等人,Immunological Reviews ,204 : 43-54 (2005))。在非惡性細胞中，已報導BCMA主要在漿細胞及成熟B細胞之亞群中表現(參見例如，Laabi等人,EMBO J .,77 (11): 3897-3904 (1992)；Laabi等人,Nucleic Acids Res .,22 (7): 1147-1154 (1994)；Kalled等人，同前文獻；O'Connor等人,J. Exp. Medicine ,199 (1): 91-97 (2004)；及Ng等人,J. Immunol .,173 (2): 807-817 (2004))。缺乏BCMA之小鼠係健康的且具有正常數目之B細胞，但長期存活的漿細胞之存活率受損(參見例如，O'Connor等人，同前文獻；Xu等人,Mol. Cell. Biol .,21 (12): 4067-4074 (2001)；及Schiemann等人,Science ,293 (5537): 2111-2114 (2001))。若干研究者已普遍地在多發性骨髓瘤細胞中偵測到BCMA RNA，且已在來自多發性骨髓瘤患者之漿細胞表面上偵測到BCMA蛋白(參見例如，Novak等人,Blood ,103 (2): 689-694 (2004)；Neri等人,Clinical Cancer Research ,73 (19): 5903-5909 (2007)；Bellucci等人,Blood ,105 (10): 3945-3950 (2005)；及Moreaux等人,Blood ,703 (8): 3148-3157 (2004))。
在一些實施例中，本發明提供針對上文所描述之不依賴抗體-藥物結合物之BCMA的單株抗體或其抗原結合片段。該單株抗體或其抗原結合片段可包含：(a)重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 1之互補決定區1 (HCDR1)胺基酸序列、SEQ ID NO: 2之HCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 3之HCDR3胺基酸序列；及(b)輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 4之互補決定區1 (LCDR1)胺基酸序列、SEQ ID NO: 5之LCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 6之LCDR3胺基酸序列。在另一實施例中，單株抗體包含：含有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的重鏈可變區及/或含有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的輕鏈可變區。
針對BCMA之單株抗體或其抗原結合片段可包含與BCMA或其抗原決定基之任何適合之結合親和力。術語「親和力」係指兩種藥劑之可逆結合的平衡常數，且表示為解離常數(KD )。抗體或其抗原結合片段對所關注之抗原或抗原決定基之親和力，可使用此項技術中已知之任何方法量測。此類方法包括例如螢光激活細胞分選術(FACS)、表面電漿子共振(例如，Biacore、ProteOn)、生物層干涉測量術(BLI，例如Octet)、動力學排除分析(例如KinExA)、可分離珠粒(例如，磁性珠粒)、抗原淘選及/或ELISA (參見例如，Janeway等人(編),Immunobiology , 第5版, Garland Publishing, New York, N.Y., 2001)。此項技術中已知，特定抗體之結合親和力將視用於分析結合親和力之方法而變化。
已在多發性骨髓瘤患者之血清中偵測到可溶形式之BCMA (sBCMA)，其中所報導值之範圍為3.8至1062 ng/mL (Lee等人Br J Haematol 2016, Sanchez等人Br J Haematol 2012)，且該sBCMA由分子的整個胞外域構成(Laurent等人Nat Commun 2015)。因此，sBCMA可削弱基於抗體之療法之效果。sBCMA與重組單體人類BCMA之功能特徵類似(Laurent等人Nat Commun 2015)。因此，為了減輕sBCMA對BCMA抗體-藥物結合物之療效的潛在影響，期望選擇與重組單體人類BCMA之結合弱而與膜結合BCMA之結合強的抗體組分。
結合劑對配體之親和力(諸如，抗體對抗原決定基之親和力)可為例如約1皮莫耳(pM)至約1微莫耳(μM) (例如，約1皮莫耳(pM)至約1奈莫耳(nM)，或約1 nM至約1微莫耳(μM))。在一個實施例中，單株抗體或其抗原結合片段可以小於或等於100奈莫耳(例如，100 nM、約90 nM、約80 nM、約70 nM、約60 nM、約50 nM、約40 nM、約30 nM、約20 nM或約10 nM，或由前述值中之任兩者限定之範圍)之KD 與BCMA結合。在另一實施例中，單株抗體可以小於或等於10奈莫耳(例如，約9 nM、約8.5 nM、約8 nM、約7.5 nM、約7 nM、約6.5 nM、約6 nM、約5.5 nM、約5 nM、約4.5 nM、約4 nM、約3.5 nM、約3 nM、約2.5 nM、約2 nM、約1.5 nM、約1 nM、約0.9 nM、約0.8 nM、約0.7 nM、約0.6 nM、約0.5 nM、約0.4 nM、約0.3 nM、約0.2 nM、約0.1 nM、約0.05 nM、約0.025 nM、約0.01 nM、約0.001 nM，或由前述值中之任兩者限定之範圍)之KD 與BCMA結合。在另一實施例中，單株抗體可以小於或等於200 pM (例如，約190 pM、約175 pM、約150 pM、約125 pM、約110 pM、約100 pM、約90 pM、約80 pM、約75 pM、約60 pM、約50 pM、約40 pM、約30 pM、約25 pM、約20 pM、約15 pM、約10 pM、約5 pM、約1 pM，或由前述值中之任兩者限定之範圍)之KD 與BCMA結合。
在一個實施例中，BCMA抗體或其抗原結合片段對單體BCMA之親和力(如利用表面電漿子共振(SPR)所量測)為約90 nM、約80 nM、約70 nM、約60 nM、約50 nM、約40 nM、約30 nM，或由前述值中之任兩者限定之範圍，例如約50 nM至約70 nM、約55 nM至約65 nM或約58 nM至約62 nM。
在一個實施例中，BCMA抗體或其抗原結合片段對膜結合BCMA之親和力(如利用FACS所量測)小於或等於10奈莫耳(例如，約9 nM、約8.5 nM、約8 nM、約7.5 nM、約7 nM、約6.5 nM、約6 nM、約5.5 nM、約5 nM、約4.5 nM、約4 nM、約3.5 nM、約3 nM、約2.5 nM、約2 nM、約1.5 nM、約1 nM、約0.9 nM、約0.8 nM、約0.7 nM、約0.6 nM、約0.5 nM、約0.4 nM、約0.3 nM、約0.2 nM、約0.1 nM、約0.05 nM、約0.025 nM、約0.01 nM、約0.001 nM，或由前述值中之任兩者限定之範圍)。
單株抗體之抗原結合部分或片段可具有任何大小，只要該部分與BCMA結合即可。就此而言，針對BCMA之單株抗體(在本文中亦稱為「抗BCMA單株抗體」)之抗原結合部分或片段宜包含約5至18個之間的胺基酸(例如，約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18個，或由前述值中之任兩者限定之範圍)。
在一個實施例中，抗體-藥物結合物包含抗BCMA單株抗體之可變區。就此而言，ADC可包含抗BCMA單株抗體之輕鏈可變區、重鏈可變區或輕鏈可變區及重鏈可變區兩者。較佳地，ADC包含抗BCMA單株抗體之輕鏈可變區及重鏈可變區。與BCMA結合之單株抗體揭示於例如國際專利申請公開案WO 2010/104949中。在一個實施例中，本文中所描述之ADC之單株抗體包含：(a)重鏈可變區，其包含互補決定區1 (HCDR1)胺基酸序列SYSMN (SEQ ID NO: 1)、HCDR2胺基酸序列SISGSSNYIYYADSVKG (SEQ ID NO: 2)及HCDR3胺基酸序列GGNYYVEYFQY (SEQ ID NO: 3)；及(b)輕鏈可變區，其包含互補決定區1 (LCDR1)胺基酸序列RASQYISSNYLA (SEQ ID NO: 4)、LCDR2胺基酸序列GASNRAT (SEQ ID NO: 5)及LCDR3胺基酸序列QQYGSSPIT (SEQ ID NO: 6)。在另一實施例中，本文中所描述之ADC之單株抗體可包含：含有SEQ ID NO: 7之胺基酸序列的重鏈可變區及/或含有SEQ ID NO: 8之胺基酸序列的輕鏈可變區。
術語「細胞毒素」及「細胞毒性劑」係指抑制或妨礙細胞功能及/或造成對細胞之破壞(細胞死亡)及/或發揮抗增殖作用的任何分子。應瞭解，ADC之細胞毒素或細胞毒性劑在此項技術中亦稱作ADC之「有效負載」。在ADC分子中具有潛在效用且可用於本文中所描述之ADC中的多個種類之細胞毒性劑為此項技術中已知的。該等種類之細胞毒性劑包括例如抗微管劑(例如，奧瑞他汀(auristatin)及類美登素(maytansinoid))、吡咯并苯并二氮呯(PBD)、RNA聚合酶II抑制劑(例如，毒傘毒素)及DNA烷基化劑(例如，吲哚啉并苯并二氮呯偽二聚體(indolinobenzodiazepine pseudodimer))。可用於本文中所描述之ADC中之特定細胞毒性劑之實例包括但不限於瓢菌素、奧瑞他汀、卡奇黴素(calicheamicin)、道諾黴素(daunomycin)、阿黴素(doxorubicin)、倍癌黴素(duocarmycin)、尾海兔素(dolastatin)、烯二炔、來紅黴素(lexitropsin)、紫杉烷、嘌呤黴素(puromycin)、類美登素、長春花生物鹼、妥布賴森(tubulysin)及吡咯并苯并二氮呯(PBD)。更特定而言，細胞毒性劑可為例如AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB、奧瑞他汀E (auristatin E)、太平洋紫杉醇、多烯紫杉醇、CC-1065、SN-38、拓朴替康(topotecan)、嗎啉基-阿黴素、根瘤菌素、氰基嗎啉基-阿黴素、海兔毒素-10、棘黴素、康布他汀(combretatstatin)、卡里奇黴素(chalicheamicin)、美登素(maytansine)、DM1、DM4、長春鹼、甲胺喋呤、紡錘菌素，或其衍生物或類似物。適合用於ADC之細胞毒素亦描述於例如國際專利申請公開案第WO 2015/155345號及第WO 2015/157592號中。
在一個實施例中，細胞毒性劑可為抗微管劑，諸如妥布賴森、類美登素、奧瑞他汀，或其衍生物。術語「抗微管劑」及「微管靶向劑」同義且係指藉由干擾微管來抑制細胞分裂之藥劑。妥布賴森為自黏液性細菌物種分離的一類天然產物之成員(Sasse等人,J. Antibiot .,53 : 879-885 (2000))，其充當抑制微管蛋白聚合且導致細胞週期停滯及細胞凋亡之有絲分裂毒物(Steinmetz等人,Chem. Int. Ed .,43 : 4888-4892 (2004)；Khalil等人,Chem. Biochem .,7 : 678-683 (2006)；Kaur等人,Biochem. J .,396 : 235-242 (2006))。妥布賴森之實例揭示於例如國際專利申請公開案第WO 2015/157594號、第WO 2004/005326號、第WO 2012/019123號、第WO 2009/134279號、第WO 2009/055562號、第WO 2004/005327號；美國專利7,776,841、7,754,885及7,816,377；及美國專利申請公開案2010/0240701、2011/0021568及2011/0263650中。
在某些態樣中，妥布賴森為描述於WO 2015/157594 (以引用之方式併入本文中)中之化合物，諸如具有以下結構之化合物：或具有以下結構之化合物：。
類美登素抑制微管蛋白之聚合，從而防止形成微管(參見例如，美國專利第6,441,163號及Remillard等人,Science ,189 :1002-1005 (1975))。據顯示類美登素在活體外使用細胞培養模型且在活體內使用實驗室動物系統抑制腫瘤細胞生長。另外，類美登素之細胞毒性比諸如甲胺喋呤、道諾黴素及長春新鹼之習知化學治療劑高1,000倍(參見例如，美國專利5,208,020)。類美登素包括美登素、美登醇、美登醇之C-3酯，及其他美登醇類似物及衍生物(參見例如，美國專利5,208,020及6,441,163)。美登醇之C-3酯可為天然存在或合成得到的。另外，天然存在之C-3美登醇酯及合成C-3美登醇酯兩者皆可分類為具有單一羧酸之C-3酯或具有N-甲基-L-丙胺酸之衍生物之C-3酯，後者比前者更具細胞毒性。合成類美登素類似物亦為此項技術中已知的，且描述於例如Kupchan等人,J. Med. Chem .,21 : 31-37 (1978)中。用於產生美登醇及其類似物及衍生物之方法描述於例如美國專利4,151,042中。可結合本文中所描述之ADC使用之類美登素之實例包括但不限於N2'-去乙醯基-N2'-(3-巰基-1-側氧基丙基)-美登素(DM1)及N2'-去乙醯基-N2'-(4-巰基-4-甲基-1-側氧基戊基)-美登素(DM4)。
奧瑞他汀代表已在良好耐受劑量下展示實質性臨床前活性的一類高效抗有絲分裂劑(Law等人,Cancer Res .,66 : 2328-2337 (2006)；Ma等人,Clin. Cancer Res .,12 : 2591-2596 (2006)；Tse等人,Cancer Res .,12 : 1373-1382 (2006)；及Oflazoglu等人, Br. J. Haematol., 142: 69-73 (2008)及Oflazoglu等人,Clin. Cancer Res .,14 : 6171-6180 (2008))。奧瑞他汀ADC目前正在臨床前及臨床試驗中評估。可結合本文中所描述之ADC使用之奧瑞他汀之實例包括但不限於單甲基奧瑞他汀E (MMAE)及相關分子單甲基奧瑞他汀F (MMAF) (參見例如，Doronina等人,Nat. Biotechnol .,21 : 778-784 (2003)；及Doronina等人,Bioconjug. Chem .,17 : 114-124 (2006))。
在一個實施例中，細胞毒性劑可為吡咯并苯并二氮呯(PBD)或PBD衍生物。PBD易位至細胞核，在細胞核中其交聯DNA，從而防止在有絲分裂期間複製，藉由誘導單股斷裂破壞DNA，且隨後導致細胞凋亡。一些PBD亦具有識別DNA之特定序列並與其結合之能力。PBD具有通式結構：。
PBD在取代基之數目、類型與位置方面，在其芳族A環與吡咯并C環方面及在C環之飽和度方面不同。在B環中，在N10-C11位置處存在亞胺(N=C)、甲醇胺(NH-CH(OH))或甲醇胺甲醚(NH-CH(OMe))，該位置為負責烷化DNA之親電子中心。所有已知天然產物在對掌性C11a位置處均具有(S)組態，當由C環朝向A環查看時該(S)組態為其提供右旋扭轉。此特徵亦給予PBD適當的三維形狀以與B型DNA之小凹槽具有等螺旋性，從而在結合位點處產生適貼配合(Kohn, In:Antibiotics III . Springer-Verlag, New York，第3-11頁(1975)；Hurley及Needham-VanDevanter,Acc. Chem. Res .,19 , 230-237(1986))。PBD可在小凹槽中形成加成物，從而導致干擾DNA加工。
第一種PBD抗腫瘤抗生素安麯黴素(anthramycin)發現於1965年(Leimgruber等人,J. Am. Chem. Soc .,87 : 5793-5795 (1965)；Leimgruber等人,J. Am. Chem. Soc .,87 :5791-5793 (1965))。此後，已報導多種天然存在之PBD，且已研發針對各種類似物的超過十種合成途徑(Thurston等人,Chem. Rev . 433-465 (1994)；及Antonow, D.及Thurston, D.E.,Chem. Rev .111 :2815-2864 (2011))。家族成員包括赤黴素(Hochlowski等人,J. Antibiotics ,40 :145-148 (1987))、芝加黴素(chicamycin) (Konishi等人,J. Antibiotics ,37 :200-206 (1984))、DC-81 (日本專利58180487；Thurston等人,Chem. Brit .,26 :767-772 (1990)；及Bose等人,Tetrahedron ,48 :751-758 (1992))、混胺茴黴素(Kuminoto等人,J. Antibiotics ,33 :665-667 (1980))、新茴黴素A及B (Takeuchi等人,J. Antibiotics ,29 :93-96 (1976))、坡咯黴素(porothramycin) (Tsunakawa等人,J. Antibiotics ,41 :1366-1373 (1988))、普咯黴素(prothracarcin) (Shimizu等人,J. Antibiotics ,29 :2492-2503 (1982)；及Langley及Thurston,J. Org. Chem .,52 :91-97 (1987))、西巴黴素(sibanomicin；DC-102) (Hara等人,J. Antibiotics ,41 :702-704 (1988)；及Itoh等人,J. Antibiotics , 41:1281-1284 (1988))、西伯利亞黴素(sibiromycin) (Leber等人,J. Am. Chem. Soc .,110 :2992-2993 (1988))及托馬黴素(tomamycin) (Arima等人,J. Antibiotics ,25 :437-444 (1972))。PBD以及包含PBD之ADC亦描述於國際專利申請公開案第WO 2015/155345號及第WO 2015/157592號中。
在一個實施例中，PBD為PBD 3249，在本文中亦稱為「SG3249」，且詳細地描述於WO 2014/057074中，其具有以下結構：。
在另一實施例中，PBD為PBD 3315，在本文中亦稱為「SG3315」，且詳細地描述於WO 2015/052322中，其具有以下結構：。
在另一實施例中，PBD為SG3400，亦稱為化合物23，其詳細地描述於2017年2月10日申請之PCT/EP2017/052988中，且具有以下結構：。
BCMA單株抗體或其抗原結合片段可使用此項技術中已知之任何適合方法(包括位點特異性或非位點特異性結合方法)與細胞毒素結合。抗體之習知結合策略通常依賴於使有效負載經由離胺酸或半胱胺酸與抗體、其抗原結合片段隨機(亦即，非特異性)結合。因此，在一些態樣中，抗體或其抗原結合片段例如藉由以下來與細胞毒性劑隨機結合：部分還原抗體或抗體片段，接著與具有或不具有經連接連接子部分之所期望之藥劑反應。舉例而言，可使用二硫蘇糖醇(DTT)或類似還原劑還原抗體或其抗原結合片段。接著可在二甲亞碸(DMSO)存在下以超過經還原抗體或抗體片段之莫耳濃度添加具有或不具有連接至其之連接子部分的細胞毒性劑。在結合之後，可添加過量游離半胱胺酸以淬滅未反應的藥劑。反應混合物接著可經純化且緩衝液交換為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。
在其他實施例中，細胞毒性劑可使用位點特異性結合方法在特定反應性胺基酸殘基處與BCMA單株抗體結合，從而產生具有均一化學計量之均質ADC製劑。可經由半胱胺酸殘基或非天然胺基酸進行位點特異性結合。在一個實施例中，細胞毒性劑可經由至少一個半胱胺酸殘基與抗體或其抗原結合片段結合。特定言之，舉例而言，細胞毒性劑可在BCMA單株抗體之Fc區中之特定Kabat位置處與胺基酸側鏈化學結合。就此而言，細胞毒性劑可經由抗體之Fc區中之任何適合之位置處的半胱胺酸殘基與BCMA單株抗體結合，包括但不限於位置239、248、254、273、279、282、284、286、287、289、297、298、312、324、326、330、335、337、339、350、355、356、359、360、361、375、383、384、389、398、400、413、415、418、422、440、441、442、443及446中之至少一處之半胱胺酸，其中編號對應於Kabat中之EU索引。在一個實施例中，細胞毒性劑，可經由BCMA單株抗體之特定Kabat位置239及/或442處之半胱胺酸殘基及/或經由插入於BCMA抗體之Kabat位置239與240之間的胺基酸殘基，與BCMA單株抗體結合(Dimasi等人,Mol Pharm , 14(5):1501-1516 (2017)。或者，細胞毒性劑可經由硫醇-順丁烯二醯亞胺鍵，諸如，經由鉸鏈及重-輕鏈處之硫氫基反應性基團，與BCMA單株抗體或其抗原結合片段結合。
本文中所描述之BCMA單株抗體包含至少一個與結合其之細胞毒素分子；然而，BCMA單株抗體可包含任何合適數量之與其結合之細胞毒素分子(例如，1、2、3、4或更多個細胞毒素分子)，以達成所期望的治療效果。理想地，本文中所描述之ADC包含兩個與BCMA單株抗體結合之細胞毒素分子。
本文中所描述之BCMA抗體適用於其中期望靶向BCMA之任何療法，諸如過繼細胞轉移(ACT)、雙特異性T細胞接合子(BiTE)及奈米粒子。在一個實施例中，本發明提供一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含本文中所描述之BCMA單株抗體連接至T細胞活化部分之抗原結合域。「嵌合抗原受體(CAR)」為人工構築之雜交蛋白質或多肽，其含有連接至T細胞信號傳導部分或T細胞活化部分之抗體之抗原結合域(例如，單鏈可變片段(scFv))。在過去二十年，CAR結構已演變成最常合併來源於單株抗體(mAb)之單鏈可變片段(scFv)及來自TCRζ鏈之信號傳導基元(稱為「第一代」CAR (參見例如，Okur, F.V., Brenner, M.K.,Methods Mol. Biol .,651 : 319-45 (2010)；及Lee等人,Clin. Cancer. Res .,18 (10): 2780-2790 (2012))。近年來，已研發出第二及第三代CAR，其合併一個(「第二代」)或兩個(「第三代」)來自例如CD28、4-1BB (CD137)及/或CD134 (OX-40)之共刺激活化基元，其促進活體內增殖、細胞毒性及持久性(參見例如，Finney等人,J. Immunol .,172 : 104-13 (2004)；Imai等人,Leukemia ,18 : 676-84 (2004)；Maher等人,Nat Biotechnol .,20 :70-5 (2002)；Milone等人,Mol Ther .,17 : 1453-64 (2009)；及Lee等人，同前文獻)。
CAR之抗原結合域可包含完整的單株抗體或單株抗體片段，如本文中所描述。在一個實施例中，CAR之抗原結合域可包含抗BCMA單株抗體之單鏈Fv (scFv)片段。嵌合抗原受體及用於產生CAR之方法進一步描述於例如Riviere, I.及M. Sadelain,Mol. Ther .,25 (5): 1117-1124 (2017)；Davila, M.L.及M. Sadelain,Int. J. Hematol .,104 (1): 6-17 (2016)；及美國專利申請公開案2015/0051266 A1中。
本發明亦提供一種組合物，其包含上述抗體或抗體-藥物結合物及醫藥學上可接受之(例如，生理學上可接受之)載劑。可在本發明之上下文內使用此項技術中已知之任何適合之載劑。載劑之選擇將部分藉由可投與組合物之特定部位及用於投與組合物之特定方法來判定。組合物視情況可為無菌的。組合物可根據例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy , 第21版, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2001)中所描述之習知技術產生。
組合物宜包含對治療或預防多發性骨髓瘤有效之量的抗體或抗體-藥物結合物。因此，本發明提供一種殺滅多發性骨髓瘤細胞之方法，其包含使表現BCMA之多發性骨髓瘤細胞與本文中所描述之抗體或抗體-藥物結合物或包含本文中所描述之抗體或ADC的組合物接觸，由此抗體或抗體-藥物結合物與多發性骨髓瘤細胞上之BCMA結合並殺滅多發性骨髓瘤細胞。本發明亦提供一種本文中所描述之抗體或ADC或包含抗體或ADC之組合物之用途，其用於製造用以治療多發性骨髓瘤之藥物。如本文中所論述，多發性骨髓瘤(亦稱為漿細胞骨髓瘤或卡勒氏病(Kahler's disease))為漿細胞之癌症，漿細胞為通常負責產生抗體的一種白血球(Raab等人,Lancet ,374 : 324-329 (2009))。多發性骨髓瘤影響1至4人/100,000人/年。該疾病更常見於男性中，且出於仍未知之原因，在非洲裔美國人中通常為白種美國人中的兩倍。多發性骨髓瘤為最不常見的血液惡性病(14%)且佔所有癌症之1% (Raab等人，同前文獻)。多發性骨髓瘤之治療通常涉及高劑量化學療法，接著造血幹細胞移植(同種異體或自體性)；然而，在已進行此類治療之多發性骨髓瘤患者中常常見到高速復發。如上文所論述，BCMA由多發性骨髓瘤細胞高度表現(參見例如，Novak等人，同前文獻；Neri等人，同前文獻；Bellucci等人，同前文獻；及Moreaux等人，同前文獻)。
如本文中所表明，BCMA亦在多發性骨髓瘤幹細胞上表現。因此，本發明提供一種殺滅多發性骨髓瘤細胞之方法，其包含使表現BCMA之多發性骨髓瘤幹細胞與本文中所描述之抗體-藥物結合物或包含本文中所描述之ADC的組合物接觸，由此抗體-藥物結合物與多發性骨髓瘤細胞上之BCMA結合並殺滅多發性骨髓瘤幹細胞。多發性骨髓瘤幹細胞可藉由其表面表現CD19且表面不表現CD138而在多發性骨髓瘤患者之骨髓中經鑑別(參見例如，Matsui等人,Blood ,103 : 2332-6 (2004))。此等細胞為獨特細胞群落細胞且植入免疫缺乏小鼠中，而骨髓瘤漿細胞(定義為CD138+CD19-)並非如此。多發性骨髓瘤幹細胞亦對當前療法具有抗性(Matsui等人,Cancer Res. ,68 : 190-7 (2008))。
本文中所描述之抗體-藥物結合物或包含抗體-藥物結合物之組合物，可與離體、活體內或活體外表現BCMA之多發性骨髓瘤細胞群接觸。「離體」係指在生物體外部之天然條件變化最小之人工環境中之細胞或組織內或上進行的方法。與此對比，術語「活體內」係指在活生物體內在其正常、完整狀態下進行之方法，而「活體外」方法係使用已自其普通的生物學環境分離之生物體組分來進行。在一個實施例中，多發性骨髓瘤細胞為與本文中所描述之ADC或包含ADC之組合物活體內接觸之人類多發性骨髓瘤細胞。
如本文所用，術語「治療(treatment/treating)」及其類似者係指獲得所期望的藥理學及/或生理學效果。較佳地，該效果為治療性的，亦即，該效果部分或完全治癒疾病及/或可歸因於該疾病之不良症狀。為此目的，本發明方法包含投與「治療有效量」之抗體或ADC或包含抗體或ADC及醫藥學上可接受之載劑的組合物。「治療有效量」係指在必需劑量及時間段有效以達成所期望之治療結果的量。治療有效量可根據諸如以下之因素而變化：個體之疾病病況、年齡、性別及體重，及抗體或ADC引起個體之所期望的反應之能力。舉例而言，本發明之ADC之治療有效量為與多發性骨髓瘤細胞上之BCMA結合且破壞該等細胞的量。
替代地，藥理學及/或生理學效果可為預防性的，亦即，該效果完全或部分預防疾病或其症狀。就此而言，本發明方法包含向易患多發性骨髓瘤之哺乳動物投與「預防有效量」之ADC或包含ADC之組合物。「預防有效量」係指在必需劑量及時間段有效以達成所期望之預防結果(例如，預防疾病發作)的量。
可藉由定期評估所治療患者來監測治療或預防功效。在一個實施例中，本文中所描述之ADC抑制或遏制表現BCMA之骨髓瘤細胞之增殖至少約10% (例如，至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%)。細胞增殖可使用此項技術中已知之任何適合之方法(諸如，對併入基因組DNA中之經標記核苷(例如，3H-胸苷或溴去氧尿苷Brd(U))進行量測)來量測(參見例如，Madhavan, H.N.,J. Stem Cells Regen. Med .,3 (1): 12-14 (2007))。
可使用標準投與技術，包括例如靜脈內、腹膜內、皮下投與技術，向哺乳動物(例如人類)投與本文中所描述之抗體或ADC或包含抗體或ADC之組合物。更佳地，藉由靜脈內注射，向哺乳動物投與抗體或ADC或含有其之組合物。
本文中所描述之抗體或ADC或包含抗體或ADC之組合物，可與一或多種可共投與至哺乳動物之額外治療劑一起投與。如本文所用之術語「共投與」係指時間足夠接近地投與一或多種額外治療劑及本文中所描述之抗體或ADC或含有抗體或ADC之組合物，以使得抗體或ADC可增強一或多種額外治療劑之效果，或反之亦然。就此而言，首先可投與抗體或ADC或含有其之組合物，且其次可投與一或多種額外治療劑，或反之亦然。舉例而言，抗體或ADC或含有其之組合物可與其他藥劑(例如，作為佐劑)組合投與，以用於治療或預防多發性骨髓瘤。就此而言，抗體或ADC或含有抗體或ADC之組合物可與至少一種其他抗癌劑組合使用，包括例如此項技術中已知之任何適合之化學治療劑、離子化放射物、小分子抗癌劑、癌症疫苗、生物治療劑(例如，其他單株抗體、癌症殺滅病毒、基因療法及過繼T細胞轉移)及/或手術。
以下實施例進一步說明本發明，但當然不應解釋為以任何方式限制其範疇。 實例1
此實例描述針對B細胞成熟抗原(BCMA)之單株抗體之產生。
根據Kilpatrick等人,Hybridoma ,16 (4): 381-389 (1997)中所描述之RIMMS免疫接種方案，六週齡雌性Ablexis基因轉殖小鼠(Ablexis, LLC, San Francisco, CA)在多個部位處接受六輪的僅經純化重組人類(rHu) BCMA-Fc之皮下注射(操作1)或用rHu BCMA-Fc及食蟹獼猴BCMA-Fc (Cyno BCMA-Fc)兩者或表現Hu BCMA或Cyno BCMA之黏附性293細胞(Ad293)交替進行之免疫接種(操作2)。小鼠在13天之療程內以2至3天之時間間隔進行免疫接種。對於每一輪的免疫接種，小鼠首先用異氟醚麻醉。免疫原在完全或不完全弗氏佐劑(Freund's adjuvant)及TITERMAX® Gold佐劑(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)中乳化且在多個部位進行兩側注射。測試血在第13天收集且在表現人類及食蟹獼猴BCMA之黏附性293細胞上以抗原ELISA及FACS結合分析。在腹膜內給予具有良好血清效價之小鼠預融合強化注射，並在第17天將其殺死。採集淋巴結細胞，並根據聚乙二醇融合方法(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)融合至骨髓瘤細胞株P3-X63-Ag8.653以產生穩定融合瘤。
藉由對於表現BCMA之Ad293細胞以直接結合ELISA繼之以FACS來篩選融合瘤上清液，來鑑別抗BCMA特異性融合瘤。使用二級沙泊寧(saporin)結合物Fab-ZAP (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA, IT-48)及藉由對於在細胞株上表現之內源性BCMA之FACS結合，來進一步測試陽性融合瘤的其活體外結合、內化及殺滅NCI-H929多發性骨髓瘤細胞之能力。基於內化及細胞殺滅效能，隨後融合瘤進行有限稀釋選殖及擴增，以用於抗體純化及可變區基因拯救。
第一操作產生44個僅人類結合子及4個人類及食蟹獼猴交叉反應結合子之組。隨後藉由對於表現BCMA之黏附性293細胞及表現內源性huBCMA之NCI-H929細胞株的FACS，來進一步測試此等48種抗體。藉由排序抗體(最佳藉由與內源性人類BCMA結合)鑑別25個融合瘤細胞株之主導組。將總共11個融合瘤推進至次選殖、擴大規模、定序及純化。亦評估純系之基於Fab Zap的殺滅。一個抗體(純系4679)以重組方式選殖為人類IgG1以進一步評估。
第二操作產生用rHu/Cyno BCMA-Fc進行免疫接種之98個結合子、用rHu/Cyno BCMA-Fc及表現Cyno BCMA之Ad293細胞進行免疫接種之九個結合子及用表現Hu及Cyno BCMA兩者的Ad293細胞進行免疫接種之零個結合子之組。藉由FACS進一步測試此等融合瘤與TACI及BAFF-R之結合，且將展示與TACI及BAFF-R之任何可偵測結合的抗體消除。此等二級篩選以及Fab Zap分析造成向前移動以進行有限稀釋法選殖(LDC)之八個融合瘤的鑑別。基於其活性，隨後將兩個純系(純系756及純系15B2)轉化成人類IgG1以進一步評估。
藉由FACS分析抗體4679、756及15B2GL (如下文所描述)，以使用在Ad293細胞上穩定地表現之受體的重組形式，評估抗體與人類BCMA、食蟹獼猴BCMA、TACI及BAFF-R之結合。藉由在4℃下將抗體4679、756及15B2GL與200,000個細胞一起培育45分鐘，接著用PBS + 2% FBS洗滌兩次，來進行結合分析。隨後在4℃下將細胞與經Alexa-Fluor 647標記之二級抗體一起培育，接著在PBS + 2% FBS中洗滌兩次。根據製造商之推薦稀釋度，將經抗BAFF-R、抗TACI及抗人類BCMA-APC標記之抗體添加至對照孔中。將細胞再懸浮於200 μL PBS + 2% FBS + DAPI中，且使用Becton Dickinson Biosciences LSRII細胞計數器分析與活細胞結合之抗體。抗體15B2GL為經測試不與BAFF-R及/或TACI結合之唯一食蟹獼猴交叉反應性抗體，如圖1中所展示。
15B2單株抗體使用經設計以使15B2中之四個非生殖系化殘基突變之引子，突變成生殖系形式(15B2GL)。使用15B2野生型DNA作為模板DNA，以進行QuikChange Lightning突變誘導(Agilent Genomics, Santa Clara, CA)。使用STBIII細胞((Invitrogen/Thermofisher Scientific, Waltham, MA)進行轉化。在序列驗證之後，進行BCMA結合及動力學分析以將15B2GL與15B2WT之結合進行比較，且產生15B2GL之一系列主導最佳化(lead optimized，LO)純系。簡言之，將15B2選殖至經設計以進行細菌表現之FAb表現載體中。重鏈中之二十七個殘基及輕鏈中之十九個殘基，各自用經設計以允許十九種不同胺基酸(不包括半胱胺酸)之引子進行簡約突變。使用QuikChange Lightning突變誘導套組(Agilent Genomics, Santa Clara, CA)進行突變誘導。
對於總共6000個純系，藉由結合ELISA篩選出約一百個群落/位置。ELISA結合藉由捕獲低密度之人類BCMA及在細菌表現48小時之後使用細菌上清液來量測。命中定義為高於15B2GL對照組超過兩倍。在不與非特異性蛋白質結合之情況下，藉由對食蟹獼猴BCMA之ELISA來確認單個胺基酸命中。來自簡約篩選之經鑑別命中隨後進行組合，以進行引子設計來產生組合庫。使用15B2GL作為親本模板及ELISA對照，重複以上利用ELISA結合進行之FAb篩選途徑作為組合庫。隨後，將在組合篩選之後所鑑別的命中，選殖至經設計以用於ADC結合之IgG哺乳動物表現載體(「Maia」)中。蛋白質在293HEK細胞中表現且藉由蛋白質A親和力層析法純化以用於進一步測試。
使用Fab-ZAP及藉由與在如上文所描述之細胞株上表現的內源性BCMA之FACS結合，來評估15B2GL抗體及15B2GL之LO純系活體外結合、內化及殺滅H929多發性骨髓瘤細胞之能力。簡言之，將抗體與200,000個細胞在4℃下一起培育30分鐘，接著用PBS + 2% FBS洗滌兩次。將細胞再懸浮於100 μL冷PBS + 2% FBS中且保持在4℃下。在特定時間點，洗滌細胞且將其再懸浮於溫RPMI + 10% FBS中且置放於37℃、5% CO2 培育箱中。在實驗結束時，洗滌細胞且隨後將其與境Alexa-Fluor 647標記之二級抗體在4℃下一起培育，接著在PBS + 2% FBS中洗滌兩次。將細胞再懸浮於200 μL PBS + 2% FBS + DAPI中，且使用Becton Dickinson Biosciences LSRII細胞計數器分析與活細胞結合之抗體。與抗BCMA抗體J6M0 (描述在美國專利9,273,141中)及LO抗體相比，15B2GL抗體藉由此方法呈現獨特且快速的內化。
基於BCMA結合、動力學篩選(上文所論述)及內化，選擇單株抗體15B2GL，且選擇五個LO純系(亦即I09、L15、P10、N22及M02)進行純化及與15B2GL結合。
單株抗體15B2 (野生型及生殖系化)及LO純系I09、L15、P10、N22及M02之重鏈及輕鏈可變區之胺基酸序列展示於表1中。 表1
此實例之結果表明針對BCMA之單株抗體之產生。 實例2
此實例表明一種產生包含與根據本發明之細胞毒素結合之BCMA單株抗體的抗體-藥物結合物(ADC)之方法。
使用位點特異性結合，將實例1中所描述之15B2GL單株抗體及經最佳化純系與PBD有效負載SG3249結合(Thompson等人,J. Control Release ,236 : 100-116 (2016)；Dimasi等人Mol Pharm . 2017年五月1日;14(5):1501-1516)。特定言之，在37℃下將純化抗體與40莫耳過量的還原劑TCEP (Tris(2-羧基乙基)膦)一起在PBS pH 7.2，1 mM EDTA (乙二胺四乙酸)中培育3小時。培育後，使用10,000個MWCO透析卡匣，藉由4℃下含2X透析之PBS pH 7.2，1 mM EDTA，來移除還原劑，接著在25℃下與20莫耳當量之去氫抗壞血酸一起培育四個小時。隨後，連續添加來自於10% (v/v) DMSO中之儲備溶液的八當量之PBD有效負載SG3249，接著在室溫下在平緩旋轉下培育一小時。藉由添加四莫耳當量(超過SG3249)之N-乙醯基半胱胺酸淬滅結合反應。
結合方法使得形成8至10%聚集物。大分子聚集物(即結合試劑，包括半胱胺酸淬滅之SG3249)使用陶瓷羥磷灰石II型層析(CHT)來移除，如先前所描述(Thompson等人,J. Control Release ,236 : 100-116 (2016))。位點特異性ADC係在25 mM 組胺酸-HCL、7%蔗糖、0.02%聚山梨醇酯-80，pH 6中調配。
為了判定單體成分、聚集物及片段，使用加載至TSKgel G3000WXL管柱(Tosoh Bioscience, Tokyo, Japan)中之100 μg (100 μL體積)抗體或ADC，進行分析性粒徑排阻層析(SEC-HPLC)。移動相由0.1 M硫酸鈉、0.1 M磷酸鈉及10%異丙醇，pH 6.8構成。流動速率為1 mL/min，且在室溫下每個分析進行20分鐘。使用疏水性相互作用層析(HIC-HPLC)來評估結合及藥物加載分佈，且使用丁基非多孔樹脂(NPR)管柱(4.6 μm ID×3.5 cm, 2.5 μm, Tosoh Bioscience)進行該HIC-HPLC。移動相A由25 mM Tris-HCl、1.5 M (NH4 )2 SO4 ，pH 8.0構成；且移動相B由25 mM Tris-HCl及5%異丙醇，pH 8.0構成。以1 mg/mL之濃度加載100 μL抗體或ADC，且以1 mL/min之流動速率，以及5% B至100% B之梯度溶離13min。採用還原性逆相層析法(rRP-HPLC)確認定鏈結合性。抗體及ADC在37℃下使用42 mM二硫蘇糖醇(DTT)在PBS (pH 7.2)中還原20分鐘。將10 μg經還原抗體或ADC加載至聚合物反相介質(PLRP-S) 1000 A管柱(2.1×50 mm) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)上，且在80℃下以1 mL/min之流動速率，及5% B至100% B之梯度溶離25分鐘(移動相A：0.1%三氟乙酸之水溶液；移動相B：0.1%三氟乙酸之乙腈溶液)。
在重鏈及輕鏈處之結合及藥物：抗體比率(DAR)，係藉由在偶合至Agilent 6230 TOF之Agilent 1290系列uHPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)上進行之還原性液相層析質譜分析(rLCMS)來判定。將2 μg經還原抗體或ADC加載至ZORBAX快速解析度高清晰度(RRHD) 300-二苯基管柱(2.1×50 mm，1.8 μm) (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)上，且使用80% B之階段梯度，以0.5 mL/min之流動速率溶離2.1分鐘(移動相A：0.1%甲酸之水溶液；及移動相B：0.1%甲酸之乙腈溶液)。讀取陽性飛行時間MS掃描，且使用MassHunter軟體(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)收集及處理數據。如前述文獻Thompson等人所描述，使用rLCMS數據計算DAR。
使用以下等式判定結合效率，其中所用2之理論DAR：。
所測試抗體之結合效率及DAR闡述於表2中。 表2.
此實例之結果表明根據本發明之包含與吡咯并苯并二氮呯結合之BCMA單株抗體的ADC之產生。 實例3
此實例表明本文中所描述之單株BCMA抗體與單體(可溶性)及膜結合BCMA之結合親和力。
使用單體人類sBCMA (GenScript, Piscataway, NJ)，使用ProteOn XPR36儀器(Bio-Rad, Hercules, CA)，來評估15B2GL單株抗體及經最佳化純系I09、L15、P10、N22及M02 (實例1中所描述)之結合。亦評估J6M0之結合以進行比較。標準胺偶合用於將在10 mM醋酸鈉緩衝液(pH 4.5)中製備之25 µg/ml抗Fc多株抗體(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)以~200-600共振單位(RU)之密度固定至用20 mM EDAC (1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺氫氯化物)及5 mM Sulfo-NHS (N-羥基磺基丁二醯亞胺)預活化之ProteOn GLC生物感測器晶片(Bio-Rad, Hercules, CA)之表面。隨後以1 µg/ml之濃度注射15B2GL、I09、L15、P10、N22、M02及J6M0，以用於藉由經固定之抗Fc多株抗體捕獲。藉由使在具有0.005% (v/v) Tween-20之PBS (pH 7.4)中製備之sBCMA之兩倍連續稀釋液(範圍在100-6.25 nM內)，在所捕獲表面上方，以75微升/分鐘流動150秒來記錄感測器圖譜，其中解離時間為600秒。ProteOn資料分析軟體用於分析資料。
此實驗之結果展示於圖13及圖14以及表3中。 表3.使用BioRad ProteOn之動力學量測
使用流式細胞測量術，在內源性表現BCMA之多發性骨髓瘤細胞株及漿細胞性白血病細胞株(分別為NCI-H929及MM.1S)中，評估15B2GL、I09、L15及J6M0與膜結合人類BCMA之結合。亦在表現人類BCMA之Ad293細胞中，評估15B2GL、I09、L15與膜結合人類BCMA之結合。藉由在4℃下將抗BCMA抗體與200,000個細胞一起培育30分鐘，接著用PBS + 2% FBS (FACS緩衝液)洗滌兩次，來進行結合分析。使用12點3倍稀釋系列來評估一系列抗體濃度。隨後在4℃下將細胞與5 μg/mL山羊抗人類IgG-AF647二級抗體(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)一起培育，接著在PBS + 2% FBS中洗滌兩次。將細胞再懸浮於200 μL PBS + 2% FBS + DAPI中。
使用BD Biosciences LSRII細胞計數器及BD FACSDiva軟體(BD Biosciences, San Jose, CA)來量測活體單細胞之螢光。使用FlowJo軟體(FlowJo, LLC, Ashland, OR)分析資料。平均螢光強度值用於判定結合百分比，且使用Prism軟體(GraphPad Software Inc, La Jolla, CA)判定EC50。此實驗之結果展示於圖15中。SPR及流式細胞測量術「表觀親和力」資料之概述展示於表4中。 表4. ND=未測定
此實例之結果表明，單株抗BCMA抗體15B2GL與膜結合BCMA強有力地結合且與單體(可溶性) BCMA微弱地結合，此不同於在此等分析中分析之其他單株抗體。 實例4
此實例表明使用本文中所描述之抗體-藥物結合物活體外殺滅多發性骨髓瘤細胞及漿細胞性白血病細胞之方法。
使用CELLTITER-GLO®套組(Promega, Madison, WI)中推薦之方法，活體外評估藉由包含與SG3249結合之15B2GL或其親和力最佳化純系的抗體-藥物結合物進行之多發性骨髓瘤細胞株及漿細胞性白血病細胞株之殺滅。亦使用CELLTITER-GLO®套組(Promega, Madison, WI)中推薦之方法，評估藉由無彈頭SG3199進行之多發性骨髓瘤細胞株及漿細胞性白血病細胞株之殺滅。簡言之，將含5×103 個細胞之80 μL RPMI + 10% FBS添加至白壁96孔培養盤(Corning® Costar®, Fisher Scientific, Waltham, MA)之內孔中。測試以下表現BCMA之細胞株：NCI-H929、EJM、MM.1R、JJN3、OPM-2、MM.1S、U266.B1及L363。亦測試BMCA陰性細胞株Raji及Jurkat。將抗體-藥物結合物稀釋至含5x儲備液(2.5 μg/mL)之RPMI + 10% FBS中。隨後在RPMI + 10% FBS中以1:3連續稀釋治療劑。將20 μL此系列稀釋液添加至細胞中，重複兩次，從而產生自在最高濃度下之0.5 μg/mL至在最低濃度下之3×10-6 μg/mL範圍內的抗體-藥物結合物之12點劑量曲線。同型抗體-藥物結合物(IgG1-SG3249及IgG1-mc-MMAF)及僅培養基對照組亦包括在內。將培養盤在37℃、5% CO2 下培育96小時。在培育期結束時，將100 μL受質溶液(Promega, Madison WI)添加至各孔中。使用EnVision Multilabel盤式讀取器(Perkin Elmer, Waltham, MA)來量測螢光。使用GraphPad Prism軟體(GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA)分析資料並圖示出，且判定半最大抑制濃度(IC50)。
各細胞株之染色體易位資訊獲自Moreaux等人，2011及Boersma-Vreugdenhil等人，2004。使用經AF647標記之15B2 (Alexa Fluor 647 Protein Labeling套組，Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)及Alexa Fluor 647之Quantum™ MESF套組(Bangs Laboratories, Fishers, IN)來測定BCMA受體數目。
此實驗之結果展示於表5及圖2A至圖2J中。 表5.多發性骨髓瘤細胞株及漿細胞性白血病細胞株之活體外細胞毒性 BCMA=B細胞成熟抗原；NA=不適用；NT=未測試
使用上文所描述之方法，除所測試細胞株亦用自表現人類BCMA之Ad293細胞收集之含有BCMA的改良培養基處理以外，在MM.1S細胞中評估與I09-SG3249 ADC相比15B2GL-SG3249 ADC在可溶性BCMA (sBCMA)存在下活體外殺滅多發性骨髓瘤細胞之能力(圖3A及圖3B)。亦將在sBCMA存在下之15B2GL-SG3249 ADC細胞殺滅與包含抗BCMA抗體J6M0 (其描述於美國專利9,273,141中)之ADC進行比較。此實驗之結果展示於圖3中，其表明在比ADC I09-SG3249 (圖3A)、J6M0-mc-MMAF及J6M0-SG3249 (圖3B及表6)更高的程度上在臨床相關含量之sBCMA存在下維持15B2GL-SG3249 ADC活性。 表6.
此實例之結果表明，15B2GL-SG3249 ADC活體外殺滅多發性骨髓瘤細胞及漿細胞性白血病細胞，且即使在可溶性BCMA存在下仍保持細胞殺滅活性。特定言之，15B2GL-SG3249 ADC對MM.1S及NCI-H929兩者皆具有活體外細胞毒性，在至多720 ng/mL之水準下之sBCMA存在下，殺滅平均95%的腫瘤細胞，且對IC50影響極小。由在單體BCMA與膜結合BCMA之間具有類似親和力之抗體產生之ADC，呈現效能之sBCMA劑量依賴性下降，在720 ng/mL sBCMA存在下，IC50具有20倍位移。 實例5
此實例表明使用本文中所描述之抗體-藥物結合物活體內殺滅多發性骨髓瘤細胞及漿細胞性白血病細胞之方法。
藉由使用MATRIGEL™ (BD Biosciences, San Jose, CA)將表現BCMA之多發性骨髓瘤細胞株或漿細胞性白血病細胞株(亦即，NCI-H929、JJN-3、MM.1S及MM.1R)植入雌性CB-17 SCID (C.B-17/IcrHsd-Prkdc-scid)或無胸腺裸(Foxn1nu )鼠中，產生多發性骨髓瘤及漿細胞性白血病之皮下異種移植小鼠模型。一旦腫瘤達到約180 mm3 (NCI-H929細胞)、190 mm3 (JJN3細胞)、160 mm3 (MM.1S細胞)或175 mm3 (MM.1R細胞)，就基於腫瘤尺寸而將小鼠隨機分組，且置放於給藥群組中，且如下文所描述用靶向BCMA之ADC處理。NCI-H929 異種移植模型
以0.3 mg/kg用ADC 15B2GL-SG3249、I09-SG3249、L15-SG3249之單次靜脈內劑量處理小鼠，或以0.3 mg/kg之劑量每週一次靜脈內給藥J6M0-mc-MMAF持續2週。對照組小鼠保持未經處理。在腫瘤植入後在無腫瘤再生之跡象的情況下，觀測經15B2GL-SG3249、I09-SG3249及L15-SG3249處理之小鼠99天，如圖4中所展示。在給藥群組中之任一者中均未觀測到體重減輕。JJN3 異種移植模型
以1 mg/kg用15B2GL-SG3249、I09-SG3249及L15-SG3249 ADC之單次靜脈內劑量處理小鼠，或以1 mg/kg之劑量每週一次靜脈內給藥J6M0-mc-MMAF ADC持續3週。對照組小鼠保持未經處理。在腫瘤植入後在無腫瘤再生之跡象的情況下，觀測經15B2GL-SG3249、I09-SG3249及L15-SG3249處理之小鼠104天，如圖5中所展示。在給藥群組中之任一者中均未觀測到體重減輕。MM.1S 異種移植模型
以1 mg/kg用15B2GL-SG3249、I09-SG3249、L15-SG3249 ADC之單次靜脈內劑量處理小鼠，或以1 mg/kg之劑量每週兩次靜脈內給藥J6M0-mc-MMAF持續4週。對照組小鼠保持未經處理。在腫瘤植入後在無腫瘤再生之跡象的情況下，觀測經15B2GL-SG3249、I09-SG3249及L15-SG3249處理之小鼠99天，如圖6中所展示。在給藥群組中之任一者中均未觀測到體重減輕。MM.1R 異種移植模型
以1 mg/kg用15B2GL-SG3249之單次靜脈內劑量處理小鼠，或以3 mg/kg之劑量每週一次靜脈內給藥J6M0-mc-MMAF持續4週。對照組小鼠保持未經處理。在腫瘤植入後在無腫瘤再生之跡象的情況下，觀測經15B2GL-SG3249處理之小鼠109天，如圖7中所展示。在給藥群組中之任一者中均未觀測到體重減輕。
此實例之結果表明，與靶向表現BCMA之細胞之其他ADC相比，ADC 15B2GL-SG3249呈現增加之活體內抗腫瘤功效。 實例6
此實例表明表現BCMA之多發性骨髓瘤幹細胞。
多發性骨髓瘤(MM)患者之骨髓含有一小群癌症幹細胞(CSC)，該等癌症幹細胞可藉由其表面表現CD19且表面不表現CD138而在患者之骨髓中經鑑別(Matsui等人,Blood ,103 : 2332-6 (2004))。
藉由流式細胞測量術，在四個多發性骨髓瘤患者樣本之幹細胞群上評估BCMA表現。樣本獲自Proteogenex, Inc. (Culver City, CA) (參見表7)，且個別多發性骨髓瘤(MM)樣本在37℃水浴中解凍。 表7.MM患者資訊
將解凍細胞添加至10 mL PBS中，且使用ViCELL™計數器(Beckmann-Coulter Life Sciences, Indianapolis, IN)計數。製備細胞懸浮液之等分試樣以用於群落形成分析，而細胞懸浮液之剩餘部分在低速下離心以集結(pellet)細胞。根據製造商之指示，將細胞經Fc阻斷，隨後以每孔200,000個細胞接種於96孔培養盤中。將培養盤離心以集結細胞，將Fc阻斷溶液傾析，且將細胞樣本再懸浮於BV染色緩衝液中，接著用由商業來源的直接結合抗體構成之恰當抗體組進行染色，該等直接結合抗體展示於表8及表9中。 表8.抗體染色組 表9.用於流式細胞測量術分析之抗體
另外，補償珠粒單獨用測試抗體染色。將培養盤在4℃下在暗處培育30分鐘。將培養盤離心，且在DPBS + 2% FBS中洗滌細胞，接著再懸浮於200 μL DPBS + 2% FBS + DAPI中。在BD LSRII流式細胞儀(BD Biosciences, San Jose, CA)上評估來自各孔之細胞，且產生FCS檔案。使用以下閘控策略進行細胞鑑別：利用補償珠粒及單染色資料藉由FlowJo®10 (FlowJo LLC, Ashland, OR)中之自動comp矩陣進行補償。隨後選擇經由FSC-A與SSC-A曲線圖閘控的漿細胞之經由DAPI與SSC-W曲線圖之活的單細胞。隨後使用排除閘控來經由BV-510與SSC-A曲線圖移除CD3、CD14、CD34及CD193染色呈陽性之細胞。隨後在CD138-PE與CD19-APC曲線圖中分析此群體。產生在定義為CD19+/CD138-之MM CSC群體及定義為CD19-/CD138+之MM漿細胞群體上之BCMA表現的直方圖。基於恰當螢光減一(FMO)對照組設定分析閘控。所有樣本顯示小百分比的BCMA表現呈陽性之CD138+CD19-細胞，如圖7中所展示。除了MM277以外，幹細胞群體上之BCMA表現之水準通常等於漿細胞上觀測到之水準，其中該水準較低但BCMA表現仍呈陽性。
此實例之結果表明，BCMA在多發性骨髓瘤癌症幹細胞上表現。 實例7
此實例表明，15B2GL-SG3249抗體-藥物結合物殺滅多發性骨髓瘤幹細胞。
由於MM幹細胞能夠活體外形成群落(Matsui等人,Blood ,103 : 2332至6 (2004))，因此測試ADC 15B2GL-SG3249殺滅實例2中表徵之MM骨髓生檢中之細胞群落細胞的能力。特定言之，細胞使用ViCELL™計數器(Beckmann-Coulter Life Sciences, Indianapolis, IN)計數，且以比用於接種所需的高10倍之密度再懸浮於IMDM + 2% FBS中。根據製造商之指示，將METHOCULT™ H4434 Classic (StemCell Technologies, Inc., Vancouver, BC, Canada)與2000個細胞MM263、MM284及MM276及4000個細胞/毫升MM277混合。隨後將25-400 ng/mL之測試ADC 15B2GL-SG3249及J6M0-mc-MMAF添加至恰當試管中。以400 ng/mL之唯一較高劑量添加對照IgG1-SG3249抗體。所有試管充分渦旋以混合，且隨後使其靜置不受干擾，從而使氣泡上升至頂部。在氣泡已上升後，藉由16號鈍頭針移出400 μL，且小心地將其接種至24孔超低連接培養盤(VWR, Radnor, PA)的一個孔中。每種處理劑以兩次重複接種於培養盤之內孔中。將PBS添加至外孔中且在37℃下將培養盤培育7-10天。藉由眼睛對群落進行計數，其中藉由在Celigo®影像細胞計數器(Nexcelom Biosciences, Lawrence, MA)上掃描培養盤記錄集落形成。如圖8中所展示，在所有4種情況下，15B2GL-SG3249能夠殺滅細胞群落細胞，而J6M0-mc-MMAF不能。在最高所測試劑量(400 ng/mL)下，15B2GL-SG3249能夠殺滅100%之MM263及MM284的群落及分別87.5%及91%之MM276及MM277的群落。相比之下，400 ng/mL之J6M0-mc-MMAF並未減少MM263所形成群落之數目，且對於MM276、MM277及MM284僅分別引起12.5%、40%及50%之群落形成的減少。
此實例之結果表明，抗體-藥物結合物15B2GL-SG3249靶向且殺滅表現BCMA之多發性骨髓瘤癌症幹細胞。 實例8
此實例表明使用本文中所描述之抗體-藥物結合物活體外殺滅多發性骨髓瘤細胞及漿細胞性白血病細胞之方法。
使用CELLTITER-GLO®套組(Promega, Madison, WI)，活體外評估藉由包含與SG3400結合之15B2GL的抗體-藥物結合物進行之多發性骨髓瘤細胞株及漿細胞性白血病細胞株之殺滅，如實例4中所描述。測試以下表現BCMA之細胞株：NCI-H929、EJM、MM.1R、JJN3、OPM-2、MM.1S、U266.B1及L363。亦測試BMCA陰性細胞株Raji及Jurkat。將抗體-藥物結合物稀釋至含5x儲備液(25 μg/mL)之RPMI + 10% FBS中。隨後在RPMI + 10% FBS中以1:3連續稀釋治療劑。將20 μL此系列稀釋液添加至細胞中，重複兩次，從而產生自在最高濃度下之5 μg/mL至在最低濃度下之2.8×10-5 μg/mL範圍內的抗體-藥物結合物之12點劑量曲線。同型抗體-藥物結合物(IgG1-SG3400)及僅培養基對照組亦包括在內。將培養盤在37℃、5% CO2 下培育96小時。在培育期結束時，將100 μL受質溶液(Promega, Madison WI)添加至各孔中。使用EnVision Multilabel盤式讀取器(Perkin Elmer, Waltham, MA)來量測螢光。使用GraphPad Prism軟體(GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA)分析資料並圖示出。此實驗之結果展示於圖10A至圖10J中。
此實例之結果表明，15B2GL-SG3400 ADC活體外殺滅多發性骨髓瘤細胞及漿細胞性白血病細胞。 實例9
此實例表明使用本文中所描述之抗體-藥物結合物活體內殺滅多發性骨髓瘤細胞及漿細胞性白血病細胞之方法。
藉由使用MATRIGEL™ (BD Biosciences, San Jose, CA)將表現BCMA之多發性骨髓瘤細胞株或漿細胞性白血病細胞株(亦即，NCI-H929及MM.1S)植入雌性CB-17 SCID (C.B-17/IcrHsd-Prkdc-scid)小鼠中，來產生多發性骨髓瘤及漿細胞性白血病之皮下異種移植小鼠模型。一旦腫瘤達到約200 mm3 (NCI-H929細胞)或180 mm3 (MM.1S細胞)，基於腫瘤尺寸而將小鼠隨機分組，且置放於給藥群組中，且用如下文所描述之靶向BCMA之ADC處理。NCI-H929 異種移植模型
以1 mg/kg用ADC IgG1-SG3400或以0.3 mg/kg或1 mg/kg用15B2GL-SG3400之單次靜脈內劑量處理小鼠，或以0.3 mg/kg或1 mg/kg之單次劑量靜脈內給藥J6M0-SG3400。對照組小鼠保持未經處理。在腫瘤植入後在無腫瘤再生之跡象的情況下，觀測經15B2GL-SG3400處理之小鼠74天，如圖11中所展示。在給藥群組中之任一者中均未觀測到體重減輕。MM.1S 異種移植模型
以1 mg/kg或3 mg/kg用ADC IgG1-SG3400或15B2GL-SG3400之單次靜脈內劑量處理小鼠，或以1 mg/kg或3 mg/kg之劑量靜脈內給藥J6M0-SG3400。對照組小鼠保持未經處理。在腫瘤植入後在無腫瘤再生之跡象的情況下，觀測經3 mg/kg之J6M0-SG3400處理之小鼠85天，如圖12中所展示。在給藥群組中之任一者中均未觀測到體重減輕。
此實例之結果表明，ADC 15B2GL-SG3400呈現活體內抗腫瘤功效。
描述於實例中之資料表明，包含單株抗體15B2GL之ADC在MM之臨床前模型中呈現有效抗腫瘤活性。重要的是，活體外實驗表明，在sBCMA存在下保持此活性。此等資料進一步表明，攜帶強效PBD有效負載之ADC 15B2GL-SG3249有效地靶向大量骨髓瘤漿細胞以及更為靜態的CD19+/CD138-細胞群落細胞兩者，此可在此基因異質疾病中提供用於更持久之臨床反應的機會。
本文中所引用之所有參考文獻(包括公開案、專利申請案及專利)均以用的方式併入本文中，該引用程度如同各參考文獻個別地且特定地指示以引用的方式併入且全文闡述於本文中。
除非本文中另外指示或明顯與上下文矛盾，否則在描述本發明之上下文中(尤其在隨附申請專利範圍之上下文中)，術語「一(a/an)」及「該」及「至少一個」及類似指示物之使用應理解為涵蓋單數與複數兩者。除非本文中另外指示或與上下文明顯矛盾，否則後接一或多個項目之清單之術語「至少一個」(例如「A及B中之至少一者」)的使用應理解為意謂選自所列項目之一個項目(A或B)或所列項目中之兩者或多於兩者之任何組合(A及B)。除非另外指出，否則術語「包含」、「具有」、「包括」及「含有」應理解為開放式術語(亦即，意謂「包括但不限於」)。除非本文另外指示，否則本文中數值範圍之列舉僅意欲充當個別提及屬於該範圍內之各獨立值之簡寫方法，且各獨立值併入本說明書中，如同在本文中個別敍述一般。除非本文另外指示或與上下文明顯矛盾，否則本文中描述之所有方法可以任何適合順序進行。除非另外主張，否則使用本文所提供之任何及所有實例或例示性語言(例如，「諸如」)僅意欲更好地闡明本發明而不對本發明之範圍造成限制。本說明書中之語言不應理解為暗指任何未主張之要素對於實踐本發明而言必不可少。
本發明之較佳實施例描述於本文中，包括本發明人已知用於實施本發明之最佳模式。在閱讀前文之描述後，彼等較佳實施例之變化形式對於一般熟習此項技術者可變得顯而易見。本發明人期望熟習此項技術者適當時採用該等變化形式，且本發明人意欲以不同於本文中特定描述之其他方式來實施本發明。因此，若適用法律允許，則本發明包括在隨附於本文之申請專利範圍中所敍述的主題之所有修改及等效物。此外，除非本文中另外指示或另外上下文明顯矛盾，否則本發明涵蓋上述要素以其所有可能變化形式之任何組合。
圖1為說明經純化抗體與表現huBCMA、cynoBCMA、BAFF-R及TACI之黏附性293 (Ad293)細胞之FACS結合的一系列曲線圖(圖1A至圖1C)，如實例1中所描述。15B2GL單株抗體為經測試不與BAFF-R及/或TACI結合之唯一食蟹獼猴交叉反應性抗體。
圖2為說明BCMA抗體藥物-結合物在活體外殺滅多發性骨髓瘤(MM)細胞及漿細胞性白血病(PCL)細胞之能力的曲線圖，如實例4中所描述。圖2A至圖2H展示經指定ADC處理之表現BCMA之特定多發性骨髓瘤細胞株及漿細胞性白血病細胞株的存活率，而圖2I及圖2J展示不表現BCMA之細胞株的存活率。
圖3含有說明與在經改良之培養基中自表現人類BCMA之Ad293細胞收集之ADC I09-SG3249相比(圖3A)，或與在經改良之培養基中自表現人類BCMA之Ad293細胞收集之ADC J6M0-mc-MMAF及J6M0-SG3249相比(圖3B)，藉由抗體藥物結合物15B2GL-SG3249在可溶性BCMA存在下殺滅多發性骨髓瘤細胞株的曲線圖，如實例4中所描述。
圖4為說明與未經處理之小鼠相比，在多發性骨髓瘤之H929異種移植小鼠模型中，回應於用靶向BCMA之ADC 15B2GL-SG3249、I09-SG3249、L15-SG3249及J6M0-mc-MMAF處理之腫瘤體積變化的曲線圖。
圖5為說明與未經處理之小鼠相比，在多發性骨髓瘤之JJN3異種移植小鼠模型中，回應於用ADC 15B2GL-SG3249、I09-SG3249、L15-SG3249、J6M0-mc-MMAF及同型對照IgG1-SG3249處理之腫瘤體積變化的曲線圖。
圖6為說明與未經處理之小鼠相比，在漿細胞性白血病之MM.1S異種移植小鼠模型中，回應於用ADC 15B2GL-SG3249、I09-SG3249、L15-SG3249及J6M0-mc-MMAF處理之腫瘤體積變化的曲線圖。
圖7為說明與未經處理之小鼠相比，在漿細胞性白血病之MM.1R異種移植小鼠模型中，回應於用ADC 15B2GL-SG3249及J6M0-mc-MMAF處理之腫瘤體積變化的曲線圖。
圖8含有說明BCMA在MM幹細胞上之表現的一系列圖式及流式細胞測量術圖。在MM漿細胞(CD19-CD138+，灰色跡線)及在MM幹細胞(CD19+CD138-，黑色跡線)兩者上皆偵測到BCMA表現。
圖9含有說明與ADC J6M0-mc-MMAF相比，在細胞群落分析中，來自患者樣本MM263 (圖9A)、MM276 (圖9B)、MM277 (圖9C)及MM284 (圖9D)之MM幹細胞對ADC 15B2GL-SG3249之敏感性的一系列曲線圖。對照包括未經處理之細胞及在400 ng/mL之最高劑量下的非特異性IgG1-SG3249結合物。所形成群落之數目標準化為在未經處理之培養物中形成之數目，設定為100%。
圖10為說明BCMA抗體-藥物結合物在活體外殺滅多發性骨髓瘤(MM)細胞及漿細胞性白血病(PCL)細胞之能力的曲線圖，如實例7中所描述。圖10A至圖10H展示經指定ADC處理之表現BCMA之特定多發性骨髓瘤細胞株及漿細胞性白血病細胞株的存活率，而圖10I及圖10J展示不表現BCMA之細胞株的存活率。
圖11為說明與未經處理之小鼠相比，在多發性骨髓瘤之H929異種移植小鼠模型中，回應於用靶向BCMA之ADC 15B2GL-SG3400、J6M0-SG3400及同型對照IgG1-SG3400處理之腫瘤體積變化的曲線圖。
圖12為說明與未經處理之小鼠相比，在漿細胞性白血病之MM.1S異種移植小鼠模型中，回應於用靶向BCMA之ADC 15B2GL-SG3400、J6M0-SG3400及同型對照IgG1-SG3400處理之腫瘤體積變化的曲線圖。
圖13為說明使用基於SPR之ProteOn系統，與人類BCMA結合之15B2GL、I09、P10及L15抗體之親和力及動力學量測的曲線圖。
圖14為說明使用基於SPR之ProteOn系統，與人類BCMA結合之N22、M02及J6M0抗體之親和力及動力學量測的曲線圖。
圖15為說明藉由流式細胞測量術量測之15B2GL、L15、I09或J6M0抗體與NCI-H929、MM.1S及Ad293+huBCMA細胞株之結合的曲線圖。

Claims (22)

  1. 一種抗體-藥物結合物(ADC)，其包含針對與細胞毒素結合之B細胞成熟抗原(BCMA)之單株抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體包含：(a)重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 1之互補決定區1 (HCDR1)胺基酸序列、SEQ ID NO: 2之HCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 3之HCDR3胺基酸序列；及(b)輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 4之互補決定區1 (LCDR1)胺基酸序列、SEQ ID NO: 5之LCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 6之LCDR3胺基酸序列。
  2. 如請求項1之抗體-藥物結合物，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。
  3. 如請求項1或請求項2之抗體-藥物結合物，其中該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗體-藥物結合物，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗體-藥物結合物，其中該細胞毒素為抗微管劑、吡咯并苯并二氮呯(PBD)、RNA聚合酶II抑制劑或DNA烷基化劑。
  6. 如請求項5之抗體-藥物結合物，其中該細胞毒素為選自由以下組成之群的抗微管劑：類美登素(maytansinoid)、奧瑞他汀(auristatin)及妥布賴森(tubulysin)。
  7. 如請求項5之抗體-藥物結合物，其中該細胞毒素為吡咯并苯并二氮呯(PBD)。
  8. 如請求項7之抗體-藥物結合物，其中該吡咯并苯并二氮呯為具有下式之SG3249：。
  9. 一種組合物，其包含如請求項1至8中任一項之抗體-藥物結合物及醫藥學上可接受之載劑。
  10. 一種殺滅多發性骨髓瘤細胞之方法，其包含使表現BCMA之多發性骨髓瘤細胞與如請求項1至8中任一項之抗體-藥物結合物接觸，由此該抗體-藥物結合物與該等多發性骨髓瘤細胞上之BCMA結合且殺滅該等多發性骨髓瘤細胞。
  11. 一種殺滅多發性骨髓瘤細胞之方法，其包含使表現BCMA之多發性骨髓瘤細胞與如請求項9之組合物接觸，由此該抗體-藥物結合物與該等多發性骨髓瘤細胞上之BCMA結合且殺滅該等多發性骨髓瘤細胞。
  12. 如請求項10或請求項11之方法，其中該等多發性骨髓瘤細胞係在人體內。
  13. 如請求項10或請求項11之方法，其中該等多發性骨髓瘤細胞係在活體外。
  14. 一種殺滅多發性骨髓瘤細胞之方法，其包含使表現BCMA之多發性骨髓瘤細胞與如請求項1至8中任一項之抗體-藥物結合物接觸，由此該抗體-藥物結合物與該等多發性骨髓瘤幹細胞上之BCMA結合且殺滅該等多發性骨髓瘤幹細胞。
  15. 一種如請求項9之組合物的用途，其用於製造用以治療多發性骨髓瘤之藥物。
  16. 一種單株抗體或其抗原結合片段，其針對B細胞成熟抗原(BCMA)，其包含：(a)重鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 1之互補決定區1 (HCDR1)胺基酸序列、SEQ ID NO: 2之HCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 3之HCDR3胺基酸序列；及(b)輕鏈可變區，其包含SEQ ID NO: 4之互補決定區1 (LCDR1)胺基酸序列、SEQ ID NO: 5之LCDR2胺基酸序列及SEQ ID NO: 6之LCDR3胺基酸序列。
  17. 如請求項16之單株抗體，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列。
  18. 如請求項16或請求項17之單株抗體，其中該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。
  19. 如請求項16至18中任一項之單株抗體，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO: 7之胺基酸序列且該輕鏈可變區包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。
  20. 一種組合物，其包含如請求項16至19中任一項之單株抗體及醫藥學上可接受之載劑。
  21. 一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含如請求項16至19中任一項之單株抗體連接至T細胞活化部分之抗原結合域。
  22. 如請求項21之嵌合抗原受體，其中該抗原結合域包含該單株抗體之單鏈Fv (scFv)片段。
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