TW201902910A

TW201902910A - 核酸寡核苷酸與細胞凋亡誘導性分子治療劑之協同增效性組合

Info

Publication number: TW201902910A
Application number: TW107111858A
Authority: TW
Inventors: 貝勒帕拉哈卡; 希妮霍普斯; 艾帝堤麥瑟; 岳菲; 席哈賽尼
Original assignee: 美商吉瓦納生技公司; 伊利諾大學董事會
Priority date: 2017-04-24
Filing date: 2018-04-03
Publication date: 2019-01-16
Also published as: WO2018200146A1; AR111586A1

Abstract

本發明提供用於治療癌症之組成物及方法，該方法包含投予抗癌藥物之組合，其中該組合包含細胞凋亡誘導性分子治療劑及一或多種能夠下調IG20基因之至少一個剪接變體的表現之核酸分子，且其中並非所有IG20基因之剪接變體皆經下調。在一實施態樣中，IG20基因之剪接變體係MADD剪接變體且該等核酸分子係包含與該MADD剪接變體之外顯子13L的核酸序列或與該MADD剪接變體之外顯子13L的mRNA轉錄物互補之核酸序列的siRNA、shRNA及反義寡核苷酸。本發明涵蓋治療癌症之方法，該方法包括使用能夠下調IG20基因之至少一個剪接變體的表現之核酸分子與細胞凋亡誘導性分子治療劑之組合療法。

Description

核酸寡核苷酸與細胞凋亡誘導性分子治療劑之協同增效性組合

本發明關於用於治療癌症之醫藥組成物及方法，該等方法包含投予抗癌藥物之組合，其中該組合包含細胞凋亡誘導性分子治療劑及一或多種能夠下調胰島瘤-升糖素瘤(IG20)基因之至少一個剪接變體的表現之核酸分子，且其中並非所有IG20基因之剪接變體皆經下調。在一實施態樣中，IG20基因之剪接變體係MADD剪接變體且能夠下調IG20基因之至少一個剪接變體的表現之核酸分子係選自siRNA、shRNA及反義寡核苷酸，其中siRNA、shRNA及反義寡核苷酸MADD包含與MADD剪接變體之外顯子13L的核酸序列及/或與MADD剪接變體之外顯子13L的mRNA轉錄物互補之核酸序列。本發明涵蓋治療癌症之方法，該等方法包括能夠下調IG20基因之至少一個剪接變體的表現之核酸分子與細胞凋亡誘導性分子治療劑之組合療法。

IG20基因在癌細胞的增生、細胞凋亡及存活上扮演重要角色(Chow VT, Lee SS. (1996). DNA Seq 6: 263-273, Chow VT, Lim KM, Lim D. (1998). Genome 41: 543-552; Schievella AR, Chen JH, Graham JR, Lin LL. (1997). J Biol Chem 272: 12069-12075; Brinkman BM, Telliez JB, Schievella AR, Lin LL, Goldfeld AE. (1999). J Biol Chem 274: 30882-30886; Murakami-Mori K, Mori S, Bonavida B, Nakamura S. (1999). J Immunol 162: 3672-3679; Telliez JB, Bean KM, Lin LL. (2000). Biochem Biophys Acta 1478: 280-288; Al-Zoubi AM, Efimova EV, Kaithamana S, Martinez O, El-Idrissi ME, Dogan RE et al. (2001). J Biol Chem 276: 47202-47211; Lim KM, Chow VT. (2002). Mol Carcinog 35: 110-126; Efimova EV, Al-Zoubi AM, Martinez O, Kaithamana S, Lu SF, Arima T et al. (2004). Oncogene 23: 1076-1087; Efimova EV, Martinez O, Lokshin A, Arima T, Prabhakar BS. (2003). Cancer Res 63: 8768-8776; Lim KM, Yeo WS, Chow VT. (2004). Int J Cancer 109: 24-37; Ramaswamy M, Efimova EV, Martinez O, Mulherkar NU, Singh SP, Prabhakar BS. (2004). Oncogene 23: 6083-6094)。此外，其在神經傳遞上扮演重要角色(Zhang Y, Zhou L, Miller CA. (1998). Proc Natl Acad Sci USA 95: 2586-2591; Tanaka M, Miyoshi J, Ishizaki H, Togawa A, Ohnishi K, Endo K et al. (2001). Mol Biol Cell 12: 1421-1430; Yamaguchi K, Tanaka M, Mizoguchi A, Hirata Y, Ishizaki H, Kaneko K et al. (2002). Proc Natl Acad Sci USA 99: 14536-14541), neurodegeneration (Del Villar K, Miller CA. (2004). Proc Natl Acad Sci USA 101: 4210-4215) and guanine nucleotide exchange (Wada M, Nakanishi H, Satoh A, Hirano H, Obaishi H, Matsuura Y et al. (1997). J Biol Chem 272: 3875-3878; Brown TL, Howe PH. (1998). Curr Biol 8: R191; Iwasaki K, Toyonaga R. (2000). EMBO J 19: 4806-4816; Levivier E, Goud B, Souchet M, Calmels TP, Mornon JP, Callebaut I. (2001). Biochem Biophys Res Commun 287:688-695)。這些多變的功能最有可能是經由IG20基因的選擇性剪接媒介，以提供剪接變體及蛋白質多變性(Chow VT, Lim KM, Lim D. (1998). Genome 41: 543-552; Al-Zoubi AM, Efimova EV, Kaithamana S, Martinez O, El-Idrissi ME, Dogan RE et al. (2001). J Biol Chem 276: 47202-47211; Efimova EV, Al-Zoubi AM, Martinez O, Kaithamana S, Lu, SF, Arima T et al. (2004). Oncogene 23: 1076-1087)。使用反義寡核苷酸針對所有內源性IG20剪接變體進行下調，已顯示導致癌細胞體外及體內的自發性細胞凋亡，但不影響正常細胞(Lim KM, Chow VT. (2002). Mol Carcinog 35: 110-126; Lim KM, Yeo WS, Chow VT. (2004). Int J Cancer 109: 24-37)。

美國專利第8,722,637號描述「IG20及IG20-[SV2]以及先前報告的KIAA0358、MADD及DENN-SV係IG20基因的剪接變體，該基因位於染色體11p11且由36個外顯子組成。上述變體之間的差異係由於外顯子13L、16、21、26及34之選擇性剪接所致。」IG20、MADD、SV2及DENN-SV異構體可被視為在下列文獻中描述：Contrasting Effects of IG20 and Its Splice Isoforms, MADD and DENN-SV, on Tumor Necrosis Factor α-induced Apoptosis and Activation of Caspase-8 and -3, Adeeb M. Al-Zoubi, Elena V. Efimova, Shashi Kaithamana, Osvaldo Martinez, Mohammed El-Azami El-Idrissi, Rukiye E. Dogan, and Bellur S. Prabhakar, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 276, No. 50, Issue of December 14, pp. 47202-47211, 2001。

在Al-Zoubi, et al之揭露後，較長的異構體被識別，包括KIAA0358。因此由Al-Zoubi, et al.識別為IG20之IG20剪接變體變成被稱為IG20pa，因為如同'637專利所解釋的，該IG20表現蛋白質係促細胞凋亡傳訊分子，與IG20-FL或全長變體不同。(第5欄，第43至45行)

Efimova解釋「目前為止所識別之所有七個IG20的變體皆由外顯子13L、16、21、26及34之選擇性剪接所引起。IG20 (IG20-FL)(編號AF440100)之全長cDNA係5995個鹼基對(bps)長，由所有36個外顯子組成且代表最長變體。Elena V. Efimova, et al., IG20, in contrast to DENN-SV, (MADD splice variants) suppresses tumor cell survival, and enhances their susceptibility to apoptosis and cancer drugs, Oncogene (2004) 23, 1076-1087。這些剪接變體可以圖代表於圖1。單獨剪接外顯子34產製由5942 bps組成的KIAA0358(編號AB002356)。剪接外顯子21及26以及剪接外顯子16、21及26分別產製5878 bps長的IG20(編號AF440101)以及6002 bps長的MADD(編號U77352)。MADD亦稱為DENN(編號U44953)，其為5844 bps長。剪接外顯子13L、21及26以及13L、16、21及26產製5749 bps長的IG20-SV2(編號AF440102)以及5689 bps長的IG20-SV3(編號AF440103)(較早稱為DENN-SV)。最後，剪接所有五個外顯子(13L、16、21、26及34)產製IG20-SV4(編號AF440434)，其為最短變體且由5619 bps組成。」

圖1以圖顯示藉由選擇性mRNA剪接所產製之人類IG20剪接變體。顯示七個IG20剪接變體之間的cDNA序列同源性。實心長條代表所有變體之間完全同源性的區域。空心部位指示外顯子13L、16、21、26及34，當以不同組合剪接時，彼等產生左側顯示的七個剪接變體。在KIAA0358及IG20-SV4中剪接外顯子34誘導外顯子35中的提早終止密碼子。也顯示不同剪接變體的不同5'非轉譯區域(UTR)。

在'637專利所描述的發明當時，判定IG20pa、MADD、IG20-SV2及DENN-SV係表現於人類組織中且以較高程度表現於腫瘤。'637第5欄，第1至2行。DENN-SV的過度表現與增強的細胞複製及對化學治療所誘導的細胞凋亡產生抗性有關。'637第5欄，第4至6行。顯示IG20pa的過度表現凌駕於內源性DENN-SV功能，導致細胞凋亡。'637第5欄，第16至17行。

經由在'637專利中執行的實驗，判定「因為DENN-SV缺乏兩個外顯子13L及16、MADD缺乏外顯子16且IG20-SV2缺乏外顯子13L，所以這些結果證實兩個外顯子13L及16的表現(如在IG20[pa]中所見)係抗增生及促細胞凋亡性質所需，而刪除兩個外顯子(如在DENN-SV中所見)係促增生及抗細胞凋亡性質所需。」'637第17欄，第38至44行。最後，'637專利作出結論「有清楚證據指出IG20[pa]及DENN-SV在細胞凋亡及細胞增生上具有對比效應。」'637第18欄，第37至39行。其進一步作出結論「IG20[pa]是一種促細胞凋亡蛋白質，可與DR4及DR5交互作用，且藉由增加招募FADD及凋亡蛋白酶-8以促進DISC形成，顯著增強TRAIL誘導細胞凋亡。」'637第23欄，第1至4行。最後，結論是「IG20[pa]可使細胞對細胞凋亡更具感受性且抑制細胞生長。此導致很可能使用IG20[pa]以使原本具抗性的細胞變得對於各種癌症療法模式更具感受性。」'637第27欄，第20至24行。

由於經由IG20剪接變體的過度表現所達成的了解，結論是「經IG20[pa]及DENN-SV轉染的細胞分別對TNFα誘導細胞凋亡最具感受性及最具抗性，而經MADD或IG20-SV2轉染的細胞相對於經對照質體轉染的細胞未顯示顯著差異。因為DENN-SV缺乏外顯子13L及16、MADD缺乏外顯子16且IG20-SV2缺乏外顯子13L，所以這些結果證實兩個外顯子13L及16的表現(如在IG20[pa]中所見)係抗增生及促細胞凋亡性質所需，而刪除兩個外顯子(如在DENN-SV中所見)係促增生及抗細胞凋亡性質所需。」'637第17欄，第34至44行。

因此，在'637專利之前，並不清楚IG20剪接變體表現、不同異構體在不同組織的選擇性表現及各剪接變體獨特功能屬性的完整複雜性。基於'637專利所揭示之IG20剪接變體過度表現的實驗，無差別敲低(knock-down)剪接變體的影響(不考慮內含子16 (MADD)、13L及16 (DENN-SV)、21及26 (MADD, DENN-SV, IG20pa)及34 (KIAA0358, IG20-SV4)的變體剪接)可證實對正常神經元功能及動物存活(即KIAA0358)、癌細胞存活(即MADD)及增生(即DENN-SV)至關重要。因此，該專利提供IG20異構體的功能特徵並解釋設計可能選擇性調節各種異構體表現同時避免意外致死性後果之策略的複雜性。

IG20pa剪接變體係促細胞凋亡、抗增生的，且使細胞對於誘導的細胞死亡(即腫瘤抑制因子)更具感受性。IG20pa或其片段可被過度表現以控制細胞增生、細胞週期，並使細胞對於化學治療、輻射療法或死亡受體媒介的細胞死亡更具感受性。

DENN-SV表現可下調以減少細胞增生、影響細胞週期並增加對化學治療、輻射療法及死亡受體媒介的細胞死亡治療更具感受性。

IG20pa及DENN-SV剪接變體的差別表現使細胞對於誘導的細胞死亡分別更具感受性或抗性，且可利用IG20pa變體的促細胞凋亡性質以使原本對化學治療劑具抗性的腫瘤細胞變成對於TNF相關之細胞凋亡誘導性配體(TRAIL)及/或化學治療劑的殺滅具感受性。

當IG20pa過度表現於細胞中時，細胞顯示顯著減少增生且對於自發性TNFα及TRAIL誘導細胞凋亡具有更高感受性。因此，可利用IG20pa剪接變體的促細胞凋亡性質以使原本具抗性的腫瘤細胞變成對於TRAIL及/或化學治療劑的殺滅具感受性。

用siRNA下調IG20剪接變體的表現，係使用靶向於具有序列(5'-GTACCAGCTTCAGTCTTTC-3')的IG20 mRNA Mid區域(特別是外顯子15)之siRNA及靶向於IG20 mRNA的死亡結構域(DD)區域之siRNA評估。Mid區域及DD區域皆存在於所有IG20剪接變體中。

用針對IG20 mRNA之Mid區域但不針對IG20 mRNA之死亡結構域(DD)的siRNA處理細胞，抑制DENN-SV之水準(完全廢除)。經針對IG20 mRNA之Mid區域(即外顯子15)的siRNA處理之細胞歷經自發性細胞凋亡。另外，無法歷經自發性細胞凋亡的細胞在針對IG20 mRNA之Mid區域(即外顯子15)的siRNA處理後，對於TNF-α誘導細胞凋亡更具感受性。

可作出的結論是，為了降低細胞複製，選擇下調DENN-SV表現、但不影響特別是正常細胞功能尤其是神經元功能及存活所需之IG20剪接變體(KIAA0358及IG20-SV4剪接變體)表現之siRNA係為所欲。

另外，對比現有技術中在許多情況中證實致死的寡去氧核苷酸序列，考慮'637專利的研究可對寡去氧核苷酸進行最佳化，以與在不同異構體中差異表現之特定外顯子結合。使用該等經工程改造之寡去氧核苷酸之敲低，可能僅敲低該些表現特定靶向性外顯子之異構體，從而允許選擇性敲低所欲異構體，並減少與敲低關鍵異構體有關之非所欲負面效應。

含Map激酶活化死亡結構域(MADD)之蛋白質(IG20基因之MADD剪接變體的產物)係癌細胞存活所必要。MADD以遠遠較高的水準表現於癌細胞及組織中，相對於彼等之正常對應體而言。已顯示MADD與死亡受體-4 (DR4)及死亡受體-5 (DR5)結合，且在甲狀腺、卵巢及子宮頸癌細胞系中授予對TRAIL誘導細胞凋亡之抗性(Mulherkar N, Prasad KV, Prabhakar BS, MADD/DENN splice variant of the IG20 gene is a negative regulator of caspase-8 activation. Knockdown enhances TRAIL-induced apoptosis of cancer cells, J Biol Chem 282: 11715-11721 (2007); Subramanian M, Pilli T, Bhattacharya P, Pacini F, Nikiforov YE, et al., Knockdown of IG20 gene expression renders thyroid cancer cells susceptible to apoptosis, J Clin Endocrinol Metab 94: 1467-1471 (2009); Prabhakar BS, Mulherkar N, Prasad KV, Role of IG20 splice variants in TRAIL resistance,. Clin Cancer Res 14: 347-351 (2008); Li LC, Jayaram S, Ganesh L, Qian L, Rotmensch J, et al., Knockdown of MADD and c-FLIP overcomes resistance to TRAIL-induced apoptosis in ovarian cancer cells, Am J Obstet Gynecol 205: 362 e312-325 (2011))。

廢除MADD但非其他IG20剪接變體可使癌細胞對自發性以及TRAIL(腫瘤壞死因子相關之細胞凋亡誘導性配體)誘導細胞凋亡更具感受性。MADD匱乏細胞中的自發性以及TRAIL誘導細胞凋亡可被CrmA或顯性陰性FADD之表現所抑制，藉此建議內源性MADD可能干擾凋亡蛋白酶-8活化。另外，已發現MADD可直接與死亡受體交互作用，但不與凋亡蛋白酶-8或FADD交互作用，但仍抑制凋亡蛋白酶-8之活化。已顯示MADD可干擾招募FADD至死亡受體的細胞質結構域(Mulherkar N, Prasad K and Prabhakar B, MADD/DENN Splice Variant of the IG20 Gene is a Negative Regulator of Caspase-8 Activation, Journal of Biological Chemistry, Vol. 282, no. 16, 11715-11721 (2007)。這顯示MADD在控制癌細胞存活/死亡及授予對TRAIL誘導細胞凋亡抗性之重要性。

ERK(細胞外信號相關激酶)途徑係癌症化學治療的藥物標靶，因為在大約三分之一的所有人類癌症中，皆發生導致ERK活化之哺乳動物致裂物質活化蛋白質激酶(MAPK)途徑失調。MAPK係絲胺酸/蘇胺酸特異性蛋白質激酶，其對細胞外刺激(致裂物質)有反應且調節數種重要且關鍵的細胞恆定所需的細胞功能，如代謝、細胞週期進展、細胞介素表現、運動性及附著性。因此MAPK影響細胞存活、增生、分化、發展及細胞凋亡。細胞外刺激諸如細胞介素、生長因子及環境壓力導致由MAPK構成之傳訊級聯的順序活化。

當活化時，ERK1/2使得與多種細胞過程有關的數種細胞核及細胞質受質(包括轉錄因子、傳訊蛋白質、激酶及磷酸酶、細胞骨架蛋白質、細胞凋亡蛋白質及蛋白酶)發生磷酸化。即使ERK途徑可由許多細胞外信號活化，細胞介素及生長因子所藉以活化ERK傳訊之途徑與癌症有特定相關性。例如，TNF-α(一種富含於腫瘤基質中的細胞凋亡誘導性分子)與存在於癌細胞上的TNF受體1 (TNFR1)結合，且有效地活化ERK MAPK。在無MADD存在下，此促存活傳訊途徑可能被轉化成細胞凋亡傳訊途徑，導致癌細胞死亡(Kurada BRVVSN, Li LC, Mulherkar N, Subramanian M, Prasad KV, Prabhakar BS, MADD, a Splice Variant of IG20, is Indispensable for MAPK Activation and Protection against Apoptosis upon Tumor Necrosis Factor-α Treatment, (2009), Journal of Biological Chemistry 284:13533-13541)。

外在細胞死亡誘導傳訊途徑可能在死亡配體(例如TRAIL)與其同源死亡受體結合時啟動。死亡受體進行三聚化並招募FADD，導致後續凋亡蛋白酶-8活化，隨後行刑者凋亡蛋白酶-3活化導致細胞凋亡。TRAIL通常與癌細胞上的死亡受體-4 (DR4)及-5 (DR5)結合，導致死亡受體(DR)寡聚化及後續招募FADD及凋亡蛋白酶原-8至DR (Bodmer JL, Holler N, Reynard S, Vinciguerra P, Schneider P, et al., TRAIL receptor-2 signals apoptosis through FADD and caspase-8, Nat Cell Biol 2: 241-243 (2000); Sprick MR, Weigand MA, Rieser E, Rauch CT, Juo P, et al., FADD/MORT1 and caspase-8 are recruited to TRAIL receptors 1 and 2 and are essential for apoptosis mediated by TRAIL receptor 2, Immunity 12: 599-609 (2000); Kischkel FC, Lawrence DA, Chuntharapai A, Schow P, Kim KJ, et al.,Apo2L/TRAIL-dependent recruitment of endogenous FADD and caspase-8 to death receptors 4 and 5, Immunity 12: 611-620 (2000))。凋亡蛋白酶原-8接著進行近距離誘導開裂及活化，形成凋亡蛋白酶-8，其接著活化行刑者凋亡蛋白酶-3，造成細胞凋亡性細胞死亡。然而，在MADD過度表現的癌細胞中，MADD與DR4及DR5結合，防止招募FADD至DR。當MADD下調時，FADD比較容易被招募至DR，導致增強的細胞凋亡(Mulherkar N, Prasad KV, Prabhakar BS, MADD/DENN splice variant of the IG20 gene is a negative regulator of caspase-8 activation. Knockdown enhances TRAIL-induced apoptosis of cancer cells, J Biol Chem 282: 11715-11721 (2007); Mulherkar N, Ramaswamy M, Mordi DC, Prabhakar BS, MADD/DENN splice variant of the IG20 gene is necessary and sufficient for cancer cell survival, Oncogene 25: 6252-6261 (2006))。

TRAIL的獨特之處在於其通常不會不良地影響正常細胞或組織(Keane MM, Ettenberg SA, Nau MM, Russell EK, Lipkowitz S, Chemotherapy augments TRAIL-induced apoptosis in breast cell lines, Cancer Res 59: 734-741 (1999))。然而，由不同抗細胞凋亡蛋白質干擾所發展出來的化學治療及TRAIL抗性，仍然是主要挑戰。MADD是一種這類抗細胞凋亡蛋白質，顯示下調MADD在使癌細胞對細胞死亡具感受性上的效用(Mulherkar N, Ramaswamy M, Mordi DC, Prabhakar BS, MADD/DENN splice variant of the IG20 gene is necessary and sufficient for cancer cell survival, Oncogene 25: 6252-6261 (2006))。

MADD在調節細胞凋亡上可能具有雙重功能，取決於Akt對其之磷酸化。腫瘤抑制因子PTEN(染色體10上刪除之磷酸酶及張力蛋白同源物)係負向調節磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K)-Akt傳訊途徑之脂質磷酸酶。當MADD之磷酸化受到PTEN減弱時，其可作為促細胞凋亡因子以起始細胞凋亡(Jayarama S, Li L, Ganesh L, Mardi D, Kanteti P, Hay N, Li P, and Prabhakar BS, J Cell Biochem. 2014, 115(2):261-270)。TRAIL誘導PTEN上調，同時減少MADD磷酸化。PTEN之下調干擾TRAIL所誘導的pMADD水準減少。非磷酸化MADD自細胞膜轉位至細胞質，在細胞質中與14-3-3蛋白質結合並取代14-3-3締合Bax，該Bax轉位至粒線體導致細胞色素-c釋放。綜上所述，結論是PTEN可藉由防止MADD被Akt磷酸化而傳送死亡信號。

外在細胞凋亡途徑可能被磷酸化MADD廢除。內源性MADD的三個高度保守部位被Akt磷酸化，且只有磷酸化MADD可直接與TRAIL受體DR4交互作用，藉此防止FADD招募。然而，在對TRAIL治療具感受性的細胞中，TRAIL誘導MADD磷酸化程度減少，導致MADD與DR4解離及FADD與DR4締合，此允許死亡誘導傳訊錯合物(DISC)形成導致細胞凋亡(Li P, Jayarama S, Ganesh L, Mordi D, Carr R, Kanteti P, Hay N, and Prabhakar BS, J Biol Chem. 2010 July 16; 285(29): 22713-22722)。因此，MADD之促生存功能取決於Akt對其磷酸化。由於Akt在大多數癌細胞中皆具活性且磷酸化MADD授予對TRAIL誘導細胞凋亡之抗性，因此共靶向Akt-MADD軸心有可能增加涉及DR4/5結合之治療劑的療效，包括基於TRAIL之療法。

內在細胞凋亡途徑係於死亡信號誘導粒線體促細胞凋亡蛋白質例如細胞色素c (Li P, Nijhawan D, Budihardjo I, Srinivasula SM, Ahmad M, Alnemri ES, Wang X. Cell, 1997; 91(4):479-489)、粒線體細胞凋亡誘導因子(Susin SA, Lorenzo HK, Zamzami N, Marzo I, Snow BE, Brothers GM, Mangion J, Jacotot E, Costantini P, Loeffler M, Larochette N, Goodlett DR, Aebersold R, Siderovski DP, Penninger JM, Kroemer G. Nature. 1999; 397(6718):441-446)及Smac/Diablo (Du C, Fang M, Li Y, Li L, Wang X. Cell. 2000; 102(1):33-42; Verhagen AM, Ekert PG, Pakusch M, Silke J, Connolly LM, Reid GE, Moritz RL, Simpson RJ, Vaux DL. Cell. 2000; 102(1):43-53)釋放時啟動。細胞色素-c與Apaf-1及凋亡蛋白酶原-9形成錯合物，導致凋亡蛋白酶-9之活化。Smac/Diablo可與細胞凋亡蛋白質(IAP)之抑制劑締合並抵銷彼等之凋亡蛋白酶抑制效應。內在途徑係由Bcl-2家族成員調節。例如，因應促細胞凋亡刺激，胞質液Bax及Bad轉位至粒線體以通透化外粒線體膜導致細胞色素c釋放至胞質液。相對地, Bcl-2及Bcl-xL可與Bax及Bad締合，藉此防止彼等誘導死亡(Antignani A, Youle RJ. Curr Opin 細胞 Biol. 2006; 18(6):685-689)。有趣的是，非磷酸化MADD自細胞膜轉位至細胞質，在細胞質中與14-3-3結合並取代14-3-3締合Bax，Bax轉位至粒線體導致細胞色素-c釋放(Jayarama S, Li L, Ganesh L, Mardi D, Kanteti P, Hay N, Li P, and Prabhakar BS, J Cell Biochem. 2014, 115(2):261-270)。

MADD cDNA序列可在GenBank資料庫上以編號：NM_130470取得，且在本文中以SEQ ID NO:11之核苷酸序列及SEQ ID NO:12之多肽序列為代表。下調MADD之干擾RNA(包括siRNA、shRNA及反義寡核苷酸)係經設計以靶向IG20基因剪接變體之外顯子13L的核酸序列，且包括MADD之任何等位變體及天然發生突變，及可在特定人口族群中發現之發生在MADD剪接變體中之多型性。換句話說，具有高度類似性(例如在胺基酸層級約95%及在核酸層級約75%)且代表MADD剪接變體中天然發生變化之序列屬於本揭露之範疇，其中在本文中揭示之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸能夠下調該等序列的表現。MADD剪接變體之外顯子13L可包含由SEQ ID NO:11之核苷酸2699至2827所代表的核苷酸序列。在核酸層級與在本文中揭示之MADD序列具有約80%或90%或95%類似性之核酸序列亦可經下調。產製包含與IG20基因之MADD剪接變體之外顯子13L的核酸序列及/或MADD剪接變體之外顯子13L的mRNA轉錄物互補之核酸序列以及可能發生在外顯子13L靶區內之核酸變化的siRNA及shRNA之核酸序列皆屬於本揭露之範疇內。另外，包含與IG20基因之MADD剪接變體之外顯子13L的核酸序列及/或MADD剪接變體之外顯子13L的mRNA轉錄物互補之核酸序列以及可能發生在外顯子13L靶區內之核酸變化的反義寡核苷酸皆屬於本揭露之範疇內。

已顯示用於特異性下調IG20基因之剪接變體的表現之方法包括：(a)獲得能夠下調MADD表現之核酸分子，其中該核酸分子或其轉錄產物能夠選擇性地與mRNA分子結合，該mRNA分子包括IG20基因之MADD剪接變體的核酸序列；及(b)使表現IG20基因之MADD剪接變體的細胞與該核酸分子接觸，其中該核酸分子下調MADD剪接變體的表現。在細胞質中，選自siRNA、經表現shRNA及反義寡核苷酸之核酸與靶外顯子13L mRNA結合並導致靶13L mRNA降解，其下調MADD剪接變體的表現。

具體而言，已顯示下調MADD表現是實質下調，例如減少內源性MADD表現大於90%或95%。事實上，下調例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%及至少80%的內源性MADD表現係為所欲。

選擇性下調IG20基因之剪接變體的表現之單離siRNA、shRNA及反義寡核苷酸係揭示於美國專利第7,910,723號，其中該剪接變體係MADD。該專利描述選擇性下調IG20基因之一或多個剪接變體之「剪接變體特異性」核酸分子的發展及彼等在癌細胞存活上的相對重要性。不是所有癌細胞皆表現所有IG20剪接變體且一些僅表現MADD及DENN剪接變體。使用表現四個已知剪接變體或僅MADD及DENN剪接變體的細胞，以及不同的選自特異性靶向外顯子13L(以下調IG20pa及MADD)、外顯子16(以下調IG20pa及IG20-SV2)及外顯子15(外顯子15表現於IG20基因之所有剪接變體中，因此其可下調所有剪接變體的表現)之shRNA、siRNA及反義寡核苷酸的核酸分子，顯示MADD是癌細胞存活的關鍵必要條件。雖然靶向外顯子16之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸可敲低IG20pa，但只有靶向外顯子13L之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸可造成癌細胞死亡。這是第一次具體指示MADD可能是癌細胞存活的關鍵。另一個顯示MADD是癌細胞存活所必需且足以使癌細胞存活的證據，在經Mid-shRNA抗性IG20剪接變體轉染的細胞中獲得證明，其中cDNA建構體之Mid-shRNA靶向區域的三重密碼子之第3個鹼基被取代，該DNA取代不會改變胺基酸序列但使它們對Mid-shRNA具有抗性。當使用Mid-shRNA下調所有內源性IG20剪接變體的表現時，只有表現MADD剪接變體的細胞可防止細胞死亡，而其他剪接變體無法防止細胞死亡。使用僅表現MADD及DENN-SV剪接變體的癌細胞，顯示可使用靶向外顯子13L之siRNA、shRNA或反義寡核苷酸選擇性地下調MADD，且顯示僅MADD即足以使癌細胞存活且為癌細胞存活所必要。(Mulherkar, N.,et al., Oncogene 2006; 25:6252-61.)

因此，較早的研究無一顯露IG20基因表現的完整複雜性、剪接變體在不同組織中的差異表現、各剪接變體的獨特功能屬性(即癌細胞存活(MADD)及增生(DENN))。因此，發現各種剪接變體、彼等之功能特徵及識別可選擇性下調剪接變體的表現之特定核酸分子之能力，允許發明人得以發展不具有非所欲潛在負面後果的癌症治療劑。

美國專利第7,910,723號描述靶向IG20基因之外顯子13L之核酸分子及經編碼siRNA、shRNA及反義寡核苷酸在下調MADD蛋白質表現上的用途。該專利描述如何最佳化核酸選擇以達成有效下調MADD表現，包括選擇基本上由核苷酸序列CGGCGAATCTATGACAATC (SEQ ID NO:1)組成之核酸分子，及其編碼基本上由核苷酸序列CGGCGAAUCUAUGACAAUC (SEQ ID NO:2)組成之核酸分子的轉錄產物。代表該策略之核酸分子物種包括siRNA、shRNA及反義寡核苷酸，其包含小於50% GC核苷酸含量、3'端具高AU核苷酸含量且在siRNA區域內無反向重複，該寡核苷酸構成可橫跨外顯子13L核苷酸序列之核酸分子陣列。這些經編碼核酸分子及經編碼siRNA、shRNA及反義寡核苷酸證實足以下調MADD剪接變體的表現。該等核酸分子可靶向於可能出現在一或多個癌症類型子群中之MADD天然變化包括特定SNP、等位變體或突變。

所描述的下調MADD的表現之方法包括：(a)獲得選擇性下調MADD表現之核酸分子，其中該核酸分子能夠選擇性地與IG20基因之MADD剪接變體之mRNA分子結合；及(b)使表現IG20基因之MADD剪接變體的癌細胞與該核酸分子接觸，其中該核酸分子下調癌細胞中之MADD剪接變體的表現。

另外，顯示下調IG20之MADD剪接變體、其等位變化、其多型性及其基因突變之代表性核酸分子包括可包含核苷酸序列CGGCGAAUCUAUGACAAUC (SEQ ID NO:2)之siRNA、shRNA及反義核酸分子。siRNA可與同源反義核酸呈雙股形式，該同源反義核酸係與靶MADD外顯子13L核苷酸序列及/或MADD外顯子13L之mRNA轉錄物互補。

下調IG20基因之特定剪接變體很困難，因為靶序列非常短，且在不同剪接變體中有不同表現。美國專利第7,910,723號解釋，在該發明之一實施態樣中，下調可經由使用特別設計的短髮夾RNA分子(shRNA)達成。短髮夾RNA (shRNA)包含由圈結構連接之靶基因之互補正義及反義序列。可將dsDNA選殖至用於轉染之表現載體接著經轉錄形成shRNA，該shRNA被切割成可經由RNA干擾(RNAi)抑制基因表現之siRNA。在一實施態樣中，編碼該shRNA之核酸包括下列結構： X_正義 - 髮夾圈 - X_反義，　　其中X(編碼siRNA)包括具有序列 CGGCGAATCTATGACAATC (SEQ ID NO:1)之核酸或實質上由該核酸組成。核酸係經轉錄以形成shRNA且可被切割以形成最終可抑制MADD表現之siRNA。因此，亦包括在體外或體內例如在癌細胞或腫瘤中轉錄以形成shRNA及siRNA之RNA分子。

編碼抑制MADD表現之shRNA的例示性dsDNA核酸序列可為 CGGCGAATCTATGACAATCTTCAAGAGAGATTGTCATAGATTCGCCG (SEQ ID NO:3)，其中介於X_正義及X_反義之間的髮夾圈區域係序列的位置20至28。髮夾圈區域可能含有任何合適序列。為了建構shRNA載體，見McIntyre and Fanning, Design and cloning strategies for constructing shRNA expression vectors, BMC Biotechnol. 2006; 6: 1 (2006)，其整體以引用方式併入本文中。

在一實施態樣中，雙股RNA或dsRNA係指匹配預先決定之基因序列的雙股RNA，該預先決定之基因序列能夠活化降解該基因之對應信使RNA轉錄物的細胞酶。這些dsRNA包含可為短干擾RNA (siRNA)且可用於抑制基因表現的核酸分子。在本文中使用之用語「雙股RNA」或「dsRNA」係指能夠RNA干擾「RNAi」之雙股RNA分子，包括短干擾RNA「siRNA」。

此處說明的siRNA、shRNA及反義寡核苷酸分子也可能包括所屬技術領域中已知的核酸修飾以增強穩定性且增強對靶mRNA的切割破壞。關於所體現的核酸分子，代表性實例可包含19個鹼基的核心，其中包括2或3個核苷酸的3'懸端，諸如3'端胸苷(TT)。懸端可扮演呈現對稱雙股給RISC的結構性角色。通常選擇dTdT，因為它們可授予核酸酶抗性給核酸分子。然而，有些研究員偏好UU懸端或與真實mRNA靶互補的懸端。最重要的是，獨特mRNA靶如何認定核酸分子的19個鹼基核心。

siRNA、shRNA及反義寡核苷酸分子也可能經化學重新合成。合成的核酸分子的形式可為單股核酸分子或可為具有同源反義核酸分子的雙股。siRNA、shRNA及反義寡核苷酸包含與靶MADD外顯子13L核苷酸序列及/或MADD外顯子13L之mRNA轉錄物互補的核酸序列。

RNA干擾是在大多數真核生物中可見的保留性途徑，其中雙股RNA (dsRNA)下調具有互補序列之基因的表現。長的dsRNA經內核酸酶Dicer降解成小效應分子，稱為siRNA(小干擾RNA)。siRNA通常約為21個鹼基對(bp)長，中央為19 bp雙股，並具有2個鹼基的3'懸端(這可能是TT)(Elbashir, SM, Lendeckel W and Tuschl T, RNA interference is mediated by 21- and 23-nucleotide RNAs, Genes & Development, 2001, 15:188-200)。在哺乳動物，Dicer處理發生在與RNA結合蛋白質TRBP形成的多蛋白複合物中。新生siRNA與Dicer、TRBP及Argonaute 2 (Ago2)締合以形成RNA誘導靜默複合物(RISC)。一旦形成RISC，siRNA的一股(乘客股/與靶mRNA具有相同序列之股)被降解或丟棄，然而另一股(導引股/與靶mRNA互補之股)仍保留以引導靜默複合物之序列特異性。RISC的Ago2組分係核糖核酸酶，其將在導引股的引導下切割靶RNA。一旦RISC複合物被活化時，其可開始靶向額外的mRNA靶。此效應放大基因靜默作用，並允許治療效應在快速分裂細胞中持續3至7天。目前許多研究人員採用合成RNA雙股作為他們的RNAi試劑，以模仿由Dicer處理長的受質RNA所產生的天然siRNA。這些合成siRNA雙股經轉染至細胞系，以模仿體內Dicer產物。

利用siRNA、shRNA或反義寡核苷酸進行MADD表現調節及/或MADD表現下調可能增加傳統癌症療法的效用。

從化學治療的角度來看，癌症化療在近年來有顯著進展。許多癌症化療物質已經確定可有效治療癌症。儘管如此，許多化療在投予特定化療藥物時經常伴隨有毒副作用的發生。

例如，眾所周知投予許多已建立的化療藥物導致非所要的副作用包括噁心、嘔吐、食慾不振、味覺變化、頭髮變少或易碎、關節痛、指甲變化及手或腳趾刺痛感。更嚴重的副作用例如排便問題、吞嚥困難、暈眩、呼吸急促、極度疲憊及胸痛也可能發生。因此，仍有未滿足的需要，希望能提供照顧者具有各種已知化療藥物的潛在化療優點，但卻沒有會限制順從性和有效性的非所要副作用的治療方案。

化療藥物及細胞凋亡誘導性分子曾被投予用於治療不同形式諸如白血病及淋巴瘤的循環癌症、黑色素瘤、膀胱癌、腎癌及其他類型的實質腫瘤癌症，並且有良好程度的成功。細胞介素可被視為發揮調節及指揮免疫系統的作用之蛋白質分子。就癌症治療而言，合成及注射比身體正常生產還大劑量的細胞介素。有2種常見的用於癌症免疫療法的細胞介素，即介白素2 (IL2)及干擾素α (IFN-α)。在癌症治療中，IL2是用來靶向適應性免疫細胞、T細胞及B細胞以回應腫瘤，且IFN-α幫助身體產生用來靶向不健康的細胞之內生性免疫細胞，如樹突細胞與巨噬細胞。

腫瘤壞死因子α相關之細胞凋亡誘導性配體(TRAIL)是一種廣為周知的細胞毒性蛋白質，其誘導腫瘤細胞但非正常細胞的細胞凋亡。

腫瘤發展對生物製劑如TRAIL治療的抗性，就像它們對其他治療方式例如化學治療劑的反應。因此，儘管TRAIL是一種在腫瘤細胞中誘導選擇性細胞凋亡的高度所欲生物製劑，但腫瘤往往發展出對TRAIL的抗性，因此其治療效用有限。因此，仍有未滿足的提供包括投予新類型藥物之治療的需要，新類型藥物有助於克服對TRAIL的抗性，且在不造成非所欲不良反應下達成緩解。

此外，儘管使用細胞凋亡誘導性分子療法的預期壽命得到延長，其仍有藥物的非所欲不良反應。因此，仍有未滿足的提供包括投予新類型藥物之治療的需要，新類型藥物在不造成非所欲不良反應下導致更完全的緩解作用。

發明人現在已經確定了新的投予細胞凋亡誘導性分子的方法，也就是當該投予與MADD剪接變體之下調組合時，造成顯著的協同作用包括增加療效及減少副作用。

發明人已構思且首次證實，一或多種能夠下調IG20基因之至少一個剪切變體的表現的核酸分子(其中並非所有IG20基因之剪接變體皆經下調)與傳統的化療藥物諸如細胞凋亡誘導性分子之臨床組合，是一種意外有價值的治療各種形式的癌症之藥物治療方式。發明人證明，當向罹患癌症諸如卵巢癌、乳癌、肺癌、胰臟癌、膀胱癌、子宮頸癌、前列腺癌、黑色素瘤、食道癌及其他實質腫瘤包括卡波西氏肉瘤之個體組合投予時，siRNA、shRNA及反義寡核苷酸(其中siRNA、shRNA及反義寡核苷酸包含與MADD剪接變體之外顯子13L的核酸序列或MADD剪接變體之外顯子13L的mRNA轉錄物互補之核酸序列)與化療藥物諸如細胞凋亡誘導性分子的效應有意外的獲益且在至少一段時間之後導致未預期的超級加成症狀緩解結果，證據為症狀、腫瘤生長及腫瘤存活的顯著減少或不存在，且因此在治療多種癌症上特別有益。另外，至少一種siRNA、shRNA及反義寡核苷酸(其中siRNA、shRNA及反義寡核苷酸包含與MADD剪接變體之外顯子13L的核酸序列或MADD剪接變體之外顯子13L的mRNA轉錄物互補之核酸序列)與化療藥物諸如細胞凋亡誘導性分子的組合可能首次顯示提供多種癌症完全緩解以及增強安全及耐受邊際的承諾。發明目的

本發明的目的是要提供包含投予代表性化療藥物與能夠下調MADD剪接變體表現之核酸分子的組合的新穎組合式抗腫瘤治療，該等組合式抗腫瘤治療可有效治療各種癌症，以及包含該組合式抗腫瘤劑的醫藥組成物。本發明的進一步目的是提供新穎的治療各種癌症的方法，包括投予包含能夠下調MADD剪接變體表現之核酸分子及化療藥物諸如細胞凋亡誘導性分子的組合式抗腫瘤治療。

本發明的額外目的是提供一種用於生產靶向配方之過程及組合式抗腫瘤治療的治療遞送程序。然而額外目的會在下文變得明顯，且進一步目的對於所屬技術領域中具有通常知識者將更為明顯。　　因此，我們認為我們的發明可歸納成特別是如下所述：

一種可用於治療癌症之抗癌藥物之組合，其包含有效量之一或多種核酸分子及一或多種細胞凋亡誘導性分子治療劑，該一或多種核酸分子能夠下調IG20基因之至少一個剪接變體的表現，其中並非所有IG20基因之剪接變體皆經下調。

如該組合，其中IG20基因之該至少一個剪接變體係選自MADD剪接變體、SNP、其等位變化、其多型性及其基因突變。

如該組合，其中IG20基因之該至少一個剪接變體係展現外顯子13L之MADD剪接變體。

如該組合，其中該一或多種能夠下調IG20基因之該至少一個剪接變體的表現之核酸分子係選自siRNA、shRNA及反義寡核苷酸。

如該組合，其中該等siRNA、shRNA及反義寡核苷酸包含與MADD剪接變體之外顯子13L的核酸序列、SNP、其等位變化、其多型性及其基因突變及/或其mRNA轉錄物互補之核酸。

如該組合，其中能夠下調IG20基因之至少一個剪接變體的表現之該核酸分子係包含在siRNA或shRNA中。

如該組合，其中該siRNA及shRNA係由包括下列結構之核酸分子編碼： X_正義 - 髮夾圈 - X_反義，　　其中X包括核酸序列CGGCGAATCTATGACAATC (SEQ ID NO:1)或實質上由該核酸序列組成。

如該組合，其中該siRNA或shRNA包含具有序列CGGCGAAUCUAUGACAAUC (SEQ ID NO:2)之核酸。

如該組合，其中該siRNA或shRNA包含具有序列CGGCGAAUCUAUGACAAUC (SEQ ID NO:2)之核酸且係呈帶有同源核酸之雙股形式，該同源核酸具有序列GAUUGUCAUAGAUUCGCCG (SEQ ID NO:10)。

如該組合，其中該shRNA及siRNA係由具有序列CGAATCTATGACAATCTTCAAGAGAGATTGTCATAGATTCGCCG (SEQ ID NO:3)之核酸編碼，其中髮夾圈區域係序列位置20至28。

如該組合，其中包含與IG20基因之MADD剪接變體之外顯子13L的核酸序列及/或其mRNA轉錄物互補之核酸的該等siRNA、shRNA及反義寡核苷酸包含具有選自GAUUGUCAUAGAUUCGCCGTT (SEQ ID NO:4)及 GAUUGUCAUAGAUUCGCCG (SEQ ID NO:10)之序列的核酸。

如該組合，其中能夠下調IG20基因之該至少一個剪接變體的表現之該一或多種核酸分子係包含在藥物遞送系統中。

如該組合，其中該藥物遞送系統係靶向性脂質體製劑或慢病毒載體。

如該組合，其中該一或多種細胞凋亡誘導性分子治療劑係選自介白素2 (IL2)、干擾素α (IFN-α)及腫瘤壞死因子α相關之細胞凋亡誘導性配體(TRAIL)。

如該組合，其中該一或多種細胞凋亡誘導性分子治療劑係呈醫藥上可接受之鹽的形式。

如該組合，其中該癌症係選自循環癌症諸如白血病及淋巴瘤、黑色素瘤、膀胱癌及腎癌及其他類型的實質腫瘤癌症。

另外，一種治療有治療需要之個體的癌症之方法，該等癌症選自循環癌症諸如白血病及淋巴瘤、黑色素瘤、膀胱癌及腎癌及其他類型的實質腫瘤癌症，該方法包含投予有效量的抗癌藥劑與一或多種細胞凋亡誘導性分子治療劑之組合，該等抗癌藥劑包含有效量的一或多種能夠下調IG20基因之至少一個剪接變體的表現之核酸分子，其中並非所有IG20基因之剪接變體皆經下調。

如該方法，其中該等癌症展現IG20基因之至少一個剪接變體的表現。

如該方法，其中該等癌症展現IG20基因之該MADD剪接變體、SNP、其等位變化、其多型性及其基因突變的表現。

如該方法，其中MADD剪接變體展現IG20基因之外顯子13L。

如該方法，其中該一或多種能夠下調IG20基因之至少一個剪接變體的表現之核酸分子係選自siRNA、shRNA及反義寡核苷酸。

如該方法，其中該等siRNA、shRNA及反義寡核苷酸包含與IG20基因之MADD剪接變體之外顯子13L的核酸序列、SNP、其等位變化、其多型性及其基因突變及/或其mRNA轉錄物互補之核酸。

如該方法，其中能夠下調IG20基因之至少一個剪接變體的表現之該核酸分子係包含在siRNA或shRNA中。

如該方法，其中該siRNA及shRNA係由包括下列結構之核酸分子編碼： X_正義 - 髮夾圈 - X_反義，　　其中X包括核酸序列CGGCGAATCTATGACAATC (SEQ ID NO:1)或實質上由該核酸序列組成。

如該方法，其中該siRNA及shRNA包含具有序列CGGCGAAUCUAUGACAAUC (SEQ ID NO:2)之核酸。

如該方法，其中該siRNA及shRNA包含具有序列CGGCGAAUCUAUGACAAUC (SEQ ID NO:2)之核酸且係呈帶有同源核酸之雙股形式，該同源核酸具有序列GAUUGUCAUAGAUUCGCCG (SEQ ID NO:10)。

如該方法，其中該shRNA係由具有序列CGAATCTATGACAATCTTCAAGAGAGATTGTCATAGATTCGCCG (SEQ ID NO:3)之核酸編碼，其中髮夾圈區域係從序列位置20至28。

如該方法，其中包含與IG20基因之MADD剪接變體之外顯子13L的核酸序列及/或其mRNA轉錄物互補之核酸的該等siRNA、shRNA及反義寡核苷酸包含具有選自GAUUGUCAUAGAUUCGCCGTT (SEQ ID NO:4)及GAUUGUCAUAGAUUCGCCG (SEQ ID NO:10)之序列的核酸。

如該方法，其中該一或多種siRNA、shRNA及反義寡核苷酸係以脂質體製劑之形式或藉由慢病毒轉染投予。

如該方法，其中該一或多種siRNA、shRNA及反義寡核苷酸係以作為佐劑投予。

如該方法，其中該一或多種細胞凋亡誘導性分子治療劑係選自介白素2 (IL2)、干擾素α (IFN-α)及腫瘤壞死因子α相關之細胞凋亡誘導性配體(TRAIL)。

如該方法，其中該一或多種細胞凋亡誘導性分子治療劑係以醫藥組成物之形式投予，該醫藥組成物進一步包含一或多種醫藥上可接受之稀釋劑、賦形劑或載體。

如該方法，其中該一或多種siRNA、shRNA及反義寡核苷酸係在該一或多種細胞凋亡誘導性分子治療劑之前投予，或與該一或多種細胞凋亡誘導性分子治療劑同時投予。

如該方法，其中該一或多種siRNA、shRNA及反義寡核苷酸係以醫藥組成物之形式投予，該醫藥組成物進一步包含一或多種醫藥上可接受之稀釋劑、賦形劑或載體。

如該方法，其中該一或多種siRNA、shRNA及反義寡核苷酸及該一或多種細胞凋亡誘導性分子治療劑係調製成劑量包裝且係根據選定治療方案投予。

本發明之組合

如上所述，在一態樣中，本發明提供一種新穎的藥物組合，可用於治療、預防、停止癌症的至少一種症狀、延緩癌症的至少一種症狀之開始及/或減少癌症的至少一種症狀之發展風險、或逆轉癌症的至少一種症狀，該癌症選自哺乳動物之卵巢癌、乳癌、肺癌、胰癌、膀胱癌、子宮頸癌、前列腺癌、黑色素瘤、食道癌及其他實質腫瘤包括卡波西氏肉瘤，包含向該哺乳動物投予能夠下調IG20基因之MADD剪接變體表現之量的siRNA、shRNA及/或反義寡核苷酸(其中該剪接變體係MADD、SNP、其等位變化、其多型性及其基因突變，且其中並非所有IG20之剪接變體皆經下調)及當組合投予時提供有益效應之治療有效劑量的細胞介素。定義

應用在活性成分的用語「組合」，在本文中係用於定義包含本發明的兩種藥物(即，一或多種能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸，其中並非所有IG20之剪接變體皆經下調，及一或多種細胞介素)之單一醫藥組成物(配方)，或將被聯合投予或在預先治療/治療規程中投予之二種分開的醫藥組成物(配方)，各包含本發明的單一藥物(即，一或多種能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸，其中並非所有IG20之剪接變體皆經下調，及一或多種細胞介素)。

在本發明的意義中，用語「聯合投予」係用於指稱同時以一個組成物投予、或同時以不同組成物投予或依序以不同組成物投予一或多種能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸(其中並非所有IG20之剪接變體皆經下調)及一或多種細胞介素。然而，要被視為「聯合」依序投予，該投予一或多種能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸(其中並非所有IG20之剪接變體皆經下調)及一或多種細胞介素必須分開一段時間間隔投予，但仍允許聯合治療所導致的治療、預防、停止哺乳動物的癌症、延緩哺乳動物的癌症開始及/或減少哺乳動物的癌症發展風險的有益效應。例如，該一或多種能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸(其中並非所有IG20之剪接變體皆經下調)及一或多種細胞介素可依序投予。例如，siRNA可在投予細胞介素之前8至72小時(hrs)投予，以在化學治療劑治療之前下調MADD的表現。

根據本發明的另一實施態樣，該一或多種能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸係用來作為佐劑。本說明書的內容中之「佐劑」係指特定細胞介素反應的增強子。「使用一或多種能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸」意指將一或多種能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸包括於化療藥劑之前的預先治療、或與化學治療劑組合以用於同時遞送。佐劑諸如一或多種能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸與化學治療劑之組合提供協同性細胞死亡。

因此，在本發明的進一步實施態樣中，該一或多種能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸係向展現癌症之哺乳動物包括人類投予，以活化癌細胞的死亡。一或多種能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸及一或多種化學治療劑亦可在對於腫瘤發展之感受性增加的情況中用來支持細胞凋亡途徑，諸如在緩解患者的情況中。

用語「治療」在本文中意指緩解或減輕個體的疾病之至少一種症狀。例如，在癌症方面，用語「治療」可指緩解或減輕腫瘤生長或與癌症相關的症狀及/或造成腫瘤消退。在本發明的意義中，用語「治療」亦可表示停止、延遲開始(即疾病有臨床表徵之前的期間)及/或減少疾病發展或惡化的風險。在本文中使用之用語「保護」意指在個體中預防延遲或治療疾病的所有(適用的)發展或延續或加劇。在本發明的意義中，癌症與臨床表徵相關，包括但不限於藥物誘導的非所欲不良反應。例如，如本文所揭示之預防性投予一或多種能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸及細胞介素可保護接受個體免於癌症發展之風險(例如，具有上升CA125水準之個體、展現組織病理學癌症標誌之個體；亦見腫瘤學文獻中所描述的用於標準篩選各種癌症之基因篩選及臨床分析)。類似地，根據本發明，治療性投予一或多種能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸及細胞介素可導致臨床症狀發展之延緩或甚至症狀消退。

用語短干擾RNA (siRNA)係指能夠干擾特定基因轉錄之RNA分子，藉此靜默靶蛋白質的基因表現。此過程的代表機制可包含投予包含與MADD剪接變體mRNA轉錄物之外顯子13L的核酸序列互補之siRNA、dsRNA、短髮夾RNA (shRNA)及/或反義寡核苷酸之核酸分子。dsRNA及短髮夾RNA經內核糖核酸酶Dicer切割，該酶將dsRNA或shRNA切成組分siRNA。siRNA是經由RNA誘導靜默複合物或RISC的形成來發揮作用。RISC複合物將siRNA解纏以形成單股siRNA。包含單股siRNA之RISC與靶mRNA結合、將mRNA切割、使其無法識別，而藉此靜默預定蛋白質的產生。

在本發明的意義中，用語「能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸」係用來指稱靶向信使RNA之藥物。本發明之能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之實施態樣siRNA、shRNA及反義寡核苷酸可為siRNA衍生物，諸如包含與MADD剪接變體mRNA轉錄物之外顯子13L的核酸序列互補之核酸的經修飾siRNA、shRNA及/或反義寡核苷酸。具體實施態樣包括該些美國專利第7,910,723號中描述的物質。

能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸的設計可經由已建立的技術完成。用於靶向MADD mRNA轉錄物之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸係得自Dharmacon (Lafayette, Colo.)。最合適的序列係基於小於50% GC核苷酸含量、3'端具高AU核苷酸含量且在siRNA區域內無反向重複的原則選出(Reynolds et al. (2004), Nat Biotechnol, 22(3), 326-30)。

反義寡核苷酸係指藉由RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-PNA(肽核酸)交互作用與靶mRNA結合且改變靶mRNA的活性之核酸分子。一般而言，反義分子沿著反義分子的單一毗連序列與靶序列互補。

在另一實施態樣中，反義DNA可用來藉由DNA-RNA交互作用靶向RNA，藉此活化可消化雙股中之靶RNA的RNase H。反義寡核苷酸可包含一或多個RNAse H活化區域，其能夠活化RNAse H切割靶RNA。反義DNA可經化學合成或經由使用單股DNA表現載體或其等效物表現。

在另一態樣中，與靶RNA分子交互作用且下調MADD活性之核酸分子或反義分子係自插入DNA或RNA載體的轉錄單位表現。重組載體可為DNA質體或病毒載體。酶核酸分子或反義表現病毒載體可基於腺病毒相關病毒、反轉錄病毒、腺病毒或α病毒建構。在一實施態樣中，能夠表現核酸分子的重組載體係如本文中所述遞送，且持續存在靶細胞中。替代地，可使用提供暫時表現shRNA/siRNA/反義核酸分子的病毒載體。該等載體可視需要重複投予。在表現之後，干擾核酸分子與靶RNA結合且下調其功能或表現。核酸分子或反義表現載體的遞送可為全身性，諸如藉由靜脈內或肌肉內投予、藉由投予至自患者或個體移出之靶細胞隨後重新導入患者或個體體內、或藉由任何其他允許導入所欲靶細胞的方式。反義DNA亦可經由使用單股DNA細胞內表現載體表現。

siRNA及shRNA核酸分子及反義寡核苷酸係基於MADD剪接變體之外顯子13L的核苷酸序列適當設計。MADD剪接變體之外顯子13L展現如同由SEQ ID NO:11之核苷酸2699至2827所定義的核苷酸序列。siRNA、shRNA及反義寡核苷酸包含具有19個鹼基核心核苷酸序列之寡核苷酸，其特異性靶向MADD剪接變體之外顯子13L。熟悉此項技術者可建構包含小於50% GC核苷酸含量、3'端具高AU核苷酸含量且無反向重複之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸，該等寡核苷酸構成可橫跨外顯子13L核苷酸序列之寡核苷酸陣列。siRNA、shRNA及反義寡核苷酸可進一步包含2或3個核苷酸的懸吊3'端，諸如末端TT以增強對靶mRNA的切割破壞。通常選擇dTdT，因為其可授予核酸酶抗性給寡核苷酸。另外，可將UU懸端或與真實mRNA靶互補的懸端添加至寡核苷酸的19個鹼基核心。

在一實施態樣中，siRNA、shRNA及反義寡核苷酸包含具有序列GAUUGUCAUAGAUUCGCCGTT (SEQ ID NO:4)之核酸。siRNA及shRNA可呈雙股形式。

在一實施態樣中，能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸(其中並非所有IG20基因之剪接變體皆經下調)包含具有序列GAUUGUCAUAGAUUCGCCG (SEQ ID NO:10)之核酸。siRNA或shRNA可呈雙股之形式。

在一實施態樣中，能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸(其中並非所有IG20基因之剪接變體皆經下調)實質上由具有序列GAUUGUCAUAGAUUCGCCG (SEQ ID NO:10)之核酸組成。siRNA或shRNA可呈雙股之形式。

能夠下調IG20基因之至少一個剪接變體的表現之反義寡核苷酸(其中並非所有剪接變體皆經下調)可為單股核酸分子，其展現與MADD剪接變體之外顯子13L及/或其mRNA轉錄物的核酸序列或其部分互補的核酸序列。單股核酸分子可呈RNA或DNA之形式。在一實施態樣中，反義寡核苷酸包含序列GAUUGUCAUAGAUUCGCCG (SEQ ID NO:10)。

在本文中使用之用語「細胞凋亡誘導性分子治療劑」係指誘導細胞凋亡且展現抗癌化學治療劑效應之藥物。該用語包含發揮調節及指揮免疫系統的作用之蛋白質分子。就癌症治療而言，合成及注射比身體正常生產還大劑量的細胞介素。有2種常見的用於癌症免疫療法的細胞介素，即介白素2 (IL2)及干擾素α (IFN-α)。在癌症治療中，IL2是用來靶向適應性免疫細胞、T細胞及B細胞以回應腫瘤，且IFN-α幫助身體產生用來靶向不健康的細胞之內生性免疫細胞，如樹突細胞與巨噬細胞。腫瘤壞死因子α相關之細胞凋亡誘導性配體(TRAIL)是一種廣為周知的細胞毒性蛋白質，其誘導腫瘤細胞但非正常細胞的細胞凋亡。

在本文中之用語「類似物」或「衍生物」係依習知醫藥意義使用，以指稱結構上類似參考分子的分子(諸如細胞介素)，但已經靶向及控制方式修飾以利用替代取代基置換該參考分子之一或多個特定取代基，藉此產製結構類似該參考分子之分子。合成及篩選類似物(例如使用結構性及/或生化分析)以識別可能具有改善或偏差特性(諸如較高效力及/或對特定靶向受體類型具有選擇性、較高的穿透哺乳動物血腦障蔽之能力、較少不良反應等)的稍微修飾版本已知化合物，是一種醫藥化學界所廣為周知的藥物設計方法。

可使用本文中列示之藥物的各種鹽及異構物(包括立體異構物及鏡像異構物)。用語「鹽」可包括醫藥上可接受之游離酸或游離鹼的添加鹽。可採用以形成醫藥上可接受之酸加成鹽的酸實例包括無機酸諸如鹽酸、硫酸或磷酸及有機酸諸如乙酸、順丁烯二酸、丁二酸或檸檬酸等。所有這些鹽(或其他類似鹽)可藉由習知方法製備。鹽或異構物的本質並不重要，只要其不具毒性且不實質上干擾所欲的藥理活性。

應用至劑量或量的用語「治療上有效(therapeutically effective)」係指化合物或醫藥組成物向有此需要之哺乳動物投予時足以導致所欲活性的數量。在本文中關於包含能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸及細胞介素之醫藥組成物，用語「治療有效量/劑量」可與用語「化學治療有效量/劑量」交換使用，且係指向哺乳動物投予時足以產生有效化學治療反應的化合物或醫藥組成物的量/劑量。應注意當活性成分之組合係經投予時，該組合之有效量可能包括或不包括各成分個別投予時有效之量。

指稱活性成分的量之用語「閾下 (subthreshold)」意指無法產生反應的量，即低於最小有效量的量。相同上下文中的用語「次最適(suboptimal)」意指產生不完全反應之活性成分的量，該完全反應將可以較高的量達成。此方法在其中所述之組合療法提供投予「閾下」數量的例如細胞介素的本情境中特別有趣，其中投予原本屬於「閾下」，但經由與能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸之組合，另外提供完全有效的治療且減輕與細胞介素相關的非所要不良反應。

與本發明之組合療法一起使用之用語「協同效應」、「協同的」、「協同性」、「協同作用」係指二或更多個刺激組合時所產生的合作作用之效應大於各個別刺激所貢獻之效應的總和，即超過加成效應。刺激例如可為下調MADD的表現之藥劑及至少一種治療劑。

與本發明之組成物一起使用之用語「醫藥上可接受」係指該等組成物之分子實體及其他成分為生理上可耐受且當投予至哺乳動物(例如人類)通常不會產生非所欲之反應。在一實施態樣中，本文中所使用之用語「醫藥上可接受」係指由美國聯邦主管機關或州政府核准，或列於美國藥典或其他公認藥典可供用於哺乳動物及特別是人。

應用至本發明之醫藥組成物的用語「載劑」係指與活性化合物(例如能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸及細胞介素)一起投予之稀釋劑、賦形劑或媒劑。該等醫藥載劑可為無菌液體，諸如水、鹽水溶液、葡萄糖水溶液、甘油水溶液及油類，包括該些石油、動物、植物或合成來源者，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及該類似物。另外，合適載劑可包含脂質體製劑。合適的醫藥載劑亦可描述於E.W. Martin著作的「Remington's Pharmaceutical Sciences」，第18版。

在本文中使用的用語「個體」係指哺乳動物(例如囓齒動物諸如小鼠或大鼠)。具體而言，用語係指人類。

用語「約」或「大約」通常意指在一給定值或範圍的20%內、10%內及可選地5%內。替代地，特別是在生物系統中，用語「約」意指在約一給定值的一個對數(即一個量級)內、可選地在二倍內。

用語「由…組成」排除請求項中未指明的任何元件、步驟或成分。In re Gray, 53 F.2d 520, 11 USPQ 255 (CCPA 1931)。用語「實質上由…組成」將請求項的範疇限制在所指明的材料或步驟「及該些不實質影響(所主張之發明的)基本及新穎特徵者」。In re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 USPQ 461, 463 (CCPA 1976) (emphasis in original)。醫藥組成物

配合本發明之方法，亦提供包含治療有效量之能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸及/或治療有效量之細胞介素以及可選地額外載劑或賦形劑(所有皆醫藥上可接受者)之醫藥組成物。該能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸及細胞介素可經調製為單一組成物或二個分開的組成物，該二個分開的組成物可經聯合投予。在一實施態樣中，彼等係經調製為單一組成物或二個分開的組成物，該二個分開的組成物可選地依序或同時投予。組成物可調製為一天投予一次或一天投予兩次，以及各別療法中的典型劑量方案。

在一進一步實施態樣中，本組合可經調製以使彼等可在滴定方案中投予，以使患者可習慣細胞介素的效應及/或臨床醫師可能往上調高能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸，以使細胞介素可被往下調低至顯著降低劑量，以最小化細胞介素的毒性不良反應及/或調節與細胞介素相關之投藥困難。

在揭示組成物中，能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸與細胞介素二者可選地以治療有效量存在。最佳治療有效量應經實驗判定，考慮確切投予模式、藥物的投予形式、投予針對的適應症、所涉及的個體(例如體重、健康、年齡、性別等)及主治醫師或獸醫師的偏好及經驗。如本文所揭示，用於人類投予時，能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸與細胞介素二者皆以合適形式以該領域了解的劑量範圍投予。在一實施態樣中，能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸係以治療劑量投予；細胞介素係以次最適或較低劑量投予。在某些情況中亦希望以次最適或閾下量投予一種或另一種活性成分，且該投予亦將在本發明之範圍內。

本發明亦提供用於製備醫藥組成物之方法，該方法包含混合治療有效量的能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸與細胞介素，及可選地一或多種生理上可接受的載劑及/或賦形劑及/或輔助物質。投予

本發明之活性藥劑可以含有習知非毒性醫藥上可接受之載劑且含有或不含有將選擇性遞送活性藥劑至特定細胞類型或組織之靶向分子的劑量單位配方經皮內、非經腸、鼻內或腫瘤內投予。皮內投予可能涉及使用經皮貼布、微磨蝕或奈米乳液。非經腸投予藥物可以注射、時間控制釋放媒劑包括擴散控制系統、滲透裝置、溶解控制基質及可蝕/可降解基質之形式投予。

為了以錠劑或膠囊之形式口服投予，活性藥物組分可與不具毒性之醫藥上可接受之賦形劑組合，諸如結合劑(例如預糊化玉米澱粉、聚乙烯吡咯啶酮或羥丙基甲基纖維素)；填料(例如乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇及其他還原及非還原糖類、微晶型纖維素、硫酸鈣或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石、或矽石、硬脂酸、硬脂醯反丁烯二酸鈉、甘油山萮酸酯、硬脂酸鈣及類似物)；崩解劑(例如馬鈴薯澱粉或乙醇酸澱粉鈉)；或潤濕劑(例如月桂硫酸鈉)、著色劑及調味劑、明膠、甜味劑、天然膠及合成膠(諸如阿拉伯膠、黃蓍膠或藻酸鹽)、緩衝鹽、羧甲基纖維素、聚乙二醇、蠟及類似物。為了以液體形式口服投予，藥物組分可與不具毒性之醫藥上可接受之惰性載劑(例如乙醇、甘油、水)、懸浮劑(例如山梨醇漿料、纖維素衍生物或可食氫化脂肪)、乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯膠)、非水性媒劑(例如杏仁油、油性酯類、乙醇或分餾蔬菜油)、保存劑(例如甲基或丙基對羥苯甲酸酯或山梨酸)及類似物組合。穩定劑諸如抗氧化劑(BHA、BHT、五倍子酸丙酯、抗壞血酸鈉、檸檬酸)亦可被添加以穩定該劑型。

錠劑可藉由該領域廣為周知之方法包覆。本發明之組成物亦可被導入例如由聚乙醇酸/乳酸(PGLA)所製成之微球或微膠囊(見例如美國專利第5,814,344號；第5,100,669號及第4,849,222號；PCT公開號WO95/11010及WO93/07861)。供口服投予之液體製劑可採例如溶液、漿料、乳劑或懸浮液之形式，或可被製備成乾燥產物以於使用前用水或其他合適媒劑重構。口服投予之製劑可經適當地調製以給予活性化合物之控制或延後釋放。

所屬技術領域中已知之藥物遞送系統係用於靶向遞送及/或控制釋放治療藥劑之專門技術。

藥物遞送系統經由可控制療法投予之介質，將藥物完整部署至身體的特別靶向部位。該等藥物遞送系統可包括微技術及奈米技術。

能夠下調IG20基因之至少一個剪接變體的表現之核酸分子選自與IG20基因mRNA轉錄物之MADD剪接變體的核苷酸序列互補之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸，其可併入所屬技術領域中已知之藥物遞送系統中，且該系統可包括聚合微球、聚合物微胞及水凝膠類型材料，所屬技術領域理解該藥物遞送系統有效增強藥物靶向特異性、降低全身性毒性、改善治療吸收率且提供醫藥品保護以防生化降解。此外，設想數種其他藥物遞送系統，包括可生物降解之聚合物、樹狀聚合物(亦稱為星狀聚合物)、電活性聚合物及經修飾的C-60富勒烯(亦稱為「巴克球」)。

另外，藥物遞送系統可包括慢病毒媒介之核酸轉導，該核酸編碼能夠下調IG20基因之至少一個剪接變體的表現之核酸分子，該核酸分子係選自與IG20基因mRNA轉錄物之MADD剪接變體的核苷酸序列互補之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸。

活性藥物亦可以脂質體遞送系統之形式投予，諸如小單層囊泡、大單層囊泡及多層囊泡。眾所周知，脂質體可自多種磷脂質形成，諸如膽固醇、硬脂胺或磷脂醯膽鹼。

能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸可以靶向脂質體製劑之形式結合。代表性總成可包括封裝於自我組裝之工程化蛋白質內，該等蛋白質提供有效包裝、結合、組裝及遞送該等寡核苷酸。該等工程化蛋白質之組分可選自經由附接至選定細胞表面受體而主動靶向腫瘤細胞之肽、促進受體媒介之胞飲作用之肽及提供主動釋放經運送之寡核苷酸之肽。該等自我組裝之蛋白質運送分子(包含本發明之寡核苷酸)可組裝為包含二種組分之奈米粒子(＜50nm)之形式：工程化多肽(靶向肽、膜穿透肽、寡核苷酸捕捉肽)及寡核苷酸治療酬載。

本發明之藥物亦可藉由使用單株抗體作為與化合物分子偶合之個別載劑來遞送。活性藥物亦可與作為可靶向藥物載劑之可溶聚合物偶合。該等聚合物可包括聚乙烯-吡咯啶酮、哌喃共聚物、聚羥基-丙基甲基丙烯醯胺-苯酚、聚羥基-乙基-天冬醯胺-苯酚或經棕櫚醯基殘基取代的聚環氧乙烷-聚離胺酸。另外，活性藥物可與用於達成藥物控制釋放之一類可生物降解聚合物偶合，例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸與聚乙醇酸之共聚物、聚ε-己內酯、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚縮醛、聚氫化哌喃、聚氰基丙烯酸酯及水凝膠之交聯或兩親性嵌段共聚物。

為了藉由吸入投予，本發明之治療劑可利用適當推進劑(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他適當氣體)，方便的以氣霧噴劑形式自加壓包裝或噴霧器遞送。在加壓氣霧劑之例中，該劑量單位可藉由提供遞送經計量之量之閥決定。用於吸入器或吹入器中之膠囊及卡匣例如明膠可經調製為包含該化合物及適當粉末基諸如乳糖或蔗糖之粉末混合。

本發明之配方可非經腸遞送，即藉由靜脈內(i.v.)、腦室內(i.c.v.)、皮下(s.c.)、腹膜內(i.p.)、肌肉內(i.m.)、真皮下(s.d.)、腫瘤內(i.t.)或皮內(i.d.)投予，藉由直接注射，例如經由推注注射或連續輸注。注射配方可以單位劑量形式呈現，例如以安瓿或含有添加保存劑之多劑量容器。組成物可採取諸如賦形劑、懸浮液、溶液或乳劑於油性或水性媒劑中之形式，且可含有調配劑諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。替代地，活性成分可呈粉末形式以供使用前以適當媒劑例如無致熱原之無菌水重構。

本發明之組成物亦可調製用於直腸投予，例如栓劑或留置灌腸(例如含有習知栓劑基劑諸如可可脂或其他甘油酯)。

如本文所揭示，能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸及細胞介素可與醫藥上可接受且與活性成分可相容之賦形劑混合。此外，若有需要，製劑亦可包括少量的輔助物質，諸如潤濕或乳化劑、pH緩衝劑及/或增強醫藥組成物的有效性之藥劑。這些輔助分子可如蛋白質經系統性或局部遞送或藉由編碼分子表現之載體表現。上述用於遞送能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸及細胞介素之技術亦可採用以遞送輔助分子。

雖然本發明之活性劑可以分開劑量投予，例如每天二或三次，同時投予能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸及細胞介素各者之單一每日劑量係一實施態樣，其中兩種藥劑之單一每日劑量在一個組成物中或在二個分開之組成物中。

本發明亦包含用於製備醫藥組成物之過程，該過程包含組合能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸與細胞介素與醫藥上可接受的載劑及/或賦形劑。

可以本發明之單位劑量之量使用的能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸的具體量可輕易地由所屬技術領域中具有通常知識者查明。可以本發明之減少的單位劑量之量使用的細胞介素的具體量包括例如，以建議劑量的3/4、1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/20使用的細胞介素。

本發明亦提供一種醫藥包裝或套組，其包含一或多個含有本發明之配方的一或多種成分之容器。在相關實施態樣中，本發明提供用於製備本發明之醫藥組成物之套組，該套組包含一或多種能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸於第一容器或多個容器中、及一或多種細胞介素於第二容器或多個容器中之配方，及可選地混合這二種藥物之說明及/或以有治療意義的方案投予藥物之說明。套組之各容器亦可包括可選地一或多種生理上可接受的載劑及/或賦形劑及/或輔助物質。與該(等)容器相關的可為主管機關規範藥品或生物藥品製造、使用或販售之指定形式標示，該標示反映主管機關核准製造、使用或販售以供人類使用。

所欲時，組成物可呈現於可含有一或多個(含有活性成分之)單位劑型之包裝或分配裝置中。包裝可例如包含金屬或塑膠箔，例如泡殼包裝。包裝或分配裝置可伴隨有投予說明。調製於相容醫藥載劑中的本發明之組成物亦可經製備、置於適當容器中並標示用來治療所指示之病況。有效劑量及安全性評估

根據本發明之方法，在本文中描述之醫藥組成物在一實施態樣中，係以除該組合之治療目的必需之外具有最小毒性之治療有效劑量投予至病患。標題為「定義」之節提供用語「化學治療有效劑量」及「治療有效劑量」之定義。在一實施態樣中，能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸及細胞介素各自以當組合時提供增強效應之劑量使用，例如提供單獨投予各自藥劑時未觀察到之效應。本發明之實施態樣在於能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸與細胞介素兩者皆以「次最適」或「閾下」劑量投予，該等劑量組合時提供意外減少非所要不良反應之超加成效應。

本發明之能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸的療效可使用體外藥理測試判定，諸如使用定量反轉錄酶-聚合酶連鎖反應(Q-RT-PCR)或RT-PCR等測量mRNA之水準。本發明之細胞介素的療效可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知之方法體外判定，例如細胞之細胞毒性測定、MTT測定、細胞凋亡測定、細胞遷移測定等。

依照在所屬技術領域中發展成熟的方法，在體外測試中表現良好之本發明之化合物及組成物，可接著在使用小動物模型(例如小鼠或大鼠)之臨床前試驗中判定有效劑量及毒性，其中能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸及細胞介素兩者皆被發現為治療有效的。

對於本發明之方法中所使用的任何醫藥組成物，治療有效劑量可自達成包括IC₅₀ (即達到半數最大值之測試化合物的濃度)之循環血漿濃度範圍之動物模型初步估計。衍生自動物系統之劑量-反應曲線可接著用於判定人類初始臨床試驗的測試劑量。在判定各組成物的安全性時，投予之劑量及頻率應符合或超越預期在臨床試驗中使用的劑量及頻率。

如本文所揭示，本發明之組成物中的組分之劑量係經判定以確保連續或間歇投予之劑量將不超越在考慮測試動物及病患之個別病況的結果後所判定之量。具體劑量自然而然地依劑量程序、病患或個體動物的狀況諸如年齡、體重、性別、敏感性、飼料、投藥期間、組合使用之藥物、疾病嚴重性而異。在某些狀況下的適當劑量及投藥時間可藉由基於上述指標根據標準臨床技術之測試判定，但可調整且最終根據醫師判斷及各病患的情況(年齡、整體狀況、症狀嚴重性、性別等)決定。如本文所揭示，能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸之適當劑量通常可由所屬技術領域中具有通常知識者查明，且細胞介素之適當劑量通常可由所屬技術領域中具有通常知識者查明。在一實施態樣中，欲投予之siRNA的劑量可自每公斤體重1至10 mg不等。劑量可在此範圍內依據所採用之劑量形式及所利用之投予途徑加以變化。在一實施態樣中，各藥物之單次劑量可每日投予。

本發明之組成物的毒性及治療療效可由在實驗動物進行之標準醫藥程序判定，例如判定LD₅₀ (對50%之族群致死之劑量)及ED₅₀ (對50%之族群有效之劑量)。治療與毒性效應之間的劑量比係治療指數，可由ED₅₀ /LD₅₀ 之比表示。展現高治療指數之配方/組合係為較佳。

自動物試驗獲得的資料可用於設計用於人類之劑量範圍。能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸及細胞介素在人類的治療有效劑量分布在循環濃度範圍以內，該等濃度包括除治療必需之外的極少毒性或不具毒性的ED₅₀ 。例如，能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸的該治療上有效的循環濃度通常可由所屬技術領域中具有通常知識者查明。欲投予之能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸的劑量可自每公斤體重1至10 mg不等。劑量可在此範圍內依據所採用之劑量形式及所利用之投予途徑加以變化。理想上，各藥物之單次劑量應每日使用。

本發明之藥物組合不僅在相對低劑量下高度有效，而且除治療必需之外亦具有低毒性且產生少數不良反應。事實上，本發明之細胞介素的唯一常見不良反應係該些本組合療法經設計以減輕之不良反應，然而因使用本發明之能夠下調IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸的最常見不良反應係該些與注射RNA相關者，諸如暫時升高之發炎反應包括增加干擾素產生。藥理學-摘要

本發明的活性成分及其醫藥組成物及用以治療之方法的特徵在於獨特優異且非預期的性質，使本文中所請求申請專利範圍之「整體標的」不具顯而易見性。其組合及醫藥組成物在標準公認可靠的測試程序中展現下列有價值的性質及特徵。

結果顯示siRNA敲低MADD與TRAIL治療之組合對於卵巢癌細胞的細胞死亡具有協同效應，其中siRNA敲低MADD與TRAIL治療之組合所造成的細胞死亡的量超越MADD siRNA敲低或TRAIL單一療法之單一療法的加成效應。

結果顯示siRNA敲低MADD與TRAIL治療之組合對於肺癌細胞的細胞死亡具有協同效應，其中siRNA敲低MADD與TRAIL治療之組合所造成的細胞死亡的量超越MADD siRNA敲低或TRAIL單一療法之單一療法的加成效應。

結果顯示siRNA敲低MADD與TRAIL治療之組合對於甲狀腺癌細胞的細胞死亡具有協同效應，其中siRNA敲低MADD與TRAIL治療之組合所造成的細胞死亡的量超越MADD siRNA敲低或TRAIL單一療法之單一療法的加成效應。

結果顯示siRNA敲低MADD與TRAIL治療之組合對於肝癌細胞的細胞死亡具有協同效應，其中siRNA敲低MADD與TRAIL治療之組合所造成的細胞死亡的量超越MADD siRNA敲低或TRAIL單一療法之單一療法的加成效應。

結果顯示siRNA敲低MADD與TRAIL治療之組合對於結腸癌細胞的細胞死亡具有協同效應，其中siRNA敲低MADD與TRAIL治療之組合所造成的細胞死亡的量超越MADD siRNA敲低或TRAIL單一療法之單一療法的加成效應。

結果顯示siRNA敲低MADD與TRAIL治療之組合對於慢性骨髓性白血病細胞的細胞死亡具有協同效應，其中siRNA敲低MADD與TRAIL治療之組合所造成的細胞死亡的量超越MADD siRNA敲低或TRAIL單一療法之單一療法的加成效應。

結果顯示siRNA敲低MADD與TRAIL治療之組合對於胃腺癌癌細胞的細胞死亡具有協同效應，其中siRNA敲低MADD與TRAIL治療之組合所造成的細胞死亡的量超越MADD siRNA敲低或TRAIL單一療法之單一療法的加成效應。

結果顯示siRNA敲低MADD與TRAIL治療之組合對於胰癌細胞的細胞死亡具有協同效應，其中siRNA敲低MADD與TRAIL治療之組合所造成的細胞死亡的量超越MADD siRNA敲低或TRAIL單一療法之單一療法的加成效應。實例1：測定細胞凋亡誘導性分子治療劑細胞毒性劑量曲線

可能對細胞介素治療有感受性的各種癌症的代表性癌細胞系包括8505C(甲狀腺癌)、HTH7(甲狀腺癌)、C643(人類甲狀腺癌)、AsPC-1(胰癌)、SU.86.86(胰癌)、CFPAC-1(胰癌)、MCF7(腺癌乳癌)、SK-BR-3(乳癌)、OVCAR3(卵巢癌)、SKOV3(卵巢癌)、NCI-H522(非小細胞肺癌)、NCI-H2122(非小細胞肺癌)、NCI-H2227(小細胞肺癌)、HepG2(肝臟肝細胞癌)、PLC/PRF/5(肝臟肝腫瘤)、AGS(胃腺癌)、HCT-116(結腸癌)及K562(慢性骨髓性白血病)。細胞系可獲自美國國家癌症研究所(National Cancer Institute, Bethesda, MD)或美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)，或其他國家的類似機構。可以選擇這些細胞系，因為它們全都表現較高水準的MADD剪接變體、源自皆須新治療方式的不同類型的癌症、展現獨特的生長性質且因潛在不同的突變而對不同的化學治療劑治療方式具有不同的感受性。儘管它們的異質性，這些細胞系可能因為MADD敲低而變得對治療性治療具感受性，且因此顯示MADD敲低在各種不同的癌症的潛在的有利影響。由於彼等之獨特的生長性質，這些細胞系培養於經調製來支持彼等在培養中最佳生長的培養介質。

8505C細胞培養於RPMI-1640培養基中且補充有10%胎牛血清及1%青黴素/鏈黴素。

HTH7細胞培養於RPMI-1640培養基中且補充有10%胎牛血清及1%青黴素/鏈黴素。

C643細胞培養於RPMI-1640培養基中且補充有10%胎牛血清及1%青黴素/鏈黴素。

AsPC-1細胞培養於RPMI-1640培養基中，該培養基經改良以含有2 mM L-麩醯胺酸、10 mM HEPES、1 mM丙酮酸鈉、4500 mg/L葡萄糖及1500 mg/L碳酸氫鈉(用於使用5% CO₂ 於空氣中之恆溫箱中)。含有較高百分比CO₂ 之恆溫箱需要使用額外的碳酸氫鈉。鹼性培養基補充有10%胎牛血清及抗生素及抗黴菌劑。

SU.86.86細胞培養於RPMI-1640培養基中，該培養基經改良以含有2 mM L-麩醯胺酸、10 mM HEPES、1 mM丙酮酸鈉、4500 mg/L葡萄糖及1500 mg/L碳酸氫鈉(用於使用5% CO₂ 於空氣中之恆溫箱中)。含有較高百分比CO₂ 之恆溫箱需要使用額外的碳酸氫鈉。鹼性培養基補充有10%胎牛血清及抗生素及抗黴菌劑。

CFPAC1細胞培養於Iscove's經改良 Dulbecco's培養基(IMDM)，其含有4 mM L-麩醯胺酸、4500 mg/L葡萄糖及1500 mg/L碳酸氫鈉。此鹼性培養基補充有10%胎牛血清及抗生素及抗黴菌劑。

MCF7細胞培養於Eagle's最低必需培養基，該培養基經改良以含有Earle's平衡鹽溶液、非必需胺基酸、2 mM L-麩醯胺酸、1 mM丙酮酸鈉及1500 mg/L碳酸氫鈉。此鹼性培養基補充有0.01 mg/ml人類重組胰島素；補充胎牛血清至最終濃度10%。

SK-BR-3細胞培養於McCoy's 5A培養基，該培養基經改良以含有1.5 mM L-麩醯胺酸及2200 mg/L碳酸氫鈉。此鹼性培養基補充有10%胎牛血清及抗生素及抗黴菌劑。

OVCAR3細胞培養於RPMI-1640培養基中，該培養基經改良以含有2 mM L-麩醯胺酸、10 mM HEPES、1 mM丙酮酸鈉、4500 mg/L葡萄糖及1500 mg/L碳酸氫鈉(用於使用5% CO₂ 於空氣中之恆溫箱中)。此鹼性培養基補充有0.01 mg/ml牛胰島素、抗生素及抗黴菌劑，且補充胎牛血清至最終濃度20%。

SKOV3細胞培養於McCoy's 5A培養基，該培養基經改良以含有1.5 mM L-麩醯胺酸及2200 mg/L碳酸氫鈉。此鹼性培養基補充有10%胎牛血清及抗生素及抗黴菌劑。

NCI-H522細胞培養於RPMI-1640培養基中，該培養基經改良以含有2 mM L-麩醯胺酸、10 mM HEPES、1 mM丙酮酸鈉、4500 mg/L葡萄糖及1500 mg/L碳酸氫鈉(用於使用5% CO₂ 於空氣中之恆溫箱中)。此鹼性培養基補充有10%胎牛血清及抗生素及抗黴菌劑。

NCI-H2122細胞培養於RPMI-1640培養基中，該培養基經改良以含有2 mM L-麩醯胺酸、10 mM HEPES、1 mM丙酮酸鈉、4500 mg/L葡萄糖及1500 mg/L碳酸氫鈉(用於使用5% CO₂ 於空氣中之恆溫箱中)。此鹼性培養基補充有10%胎牛血清及抗生素及抗黴菌劑。

NCI-H2227細胞培養於DMEM:F12培養基中，該培養基含有0.005 mg/ml胰島素、0.01 mg/ml轉鐵蛋白、30nM亞硒酸鈉、10 nM氫可的松、10 nM β-雌二醇、多餘2mM L-麩醯胺酸(最終濃度4.5 mM)、5%胎牛血清。

HepG2細胞培養於Eagle's最低必需培養基(EMEM)中且補充有10%胎牛血清及1%青黴素/鏈黴素。

PLC/PRF/5細胞培養於Eagle's最低必需培養基(EMEM)中且補充有10%胎牛血清及1%青黴素/鏈黴素。

K562細胞培養於Iscove's經改良Dulbecco's培養基(IMDM)中且補充有10%胎牛血清及1%青黴素/鏈黴素。

HCT116細胞培養於RPMI-1640培養基中，該培養基補充有10%胎牛血清及1%青黴素/鏈黴素。

AGS細胞培養於RPMI-1640培養基中，該培養基補充有10%胎牛血清及1%青黴素/鏈黴素。

所有細胞系維持在37℃下、含有5% CO₂ 的加濕大氣中。

細胞凋亡誘導性分子治療劑可為自藥局憑醫師處方籤購得之FDA核准藥物。

8505C、HTH7、C643、AsPC-1、SU.86.86、CFPAC-1、MCF7、SKBR3、OVCAR3、SKOV3、NCIH2142、NCI-H522、NCI-H2122、NCI-H2227、HepG2、AGS、PLC/PRF/5、HCT116及K562細胞皆培養於彼等各別的培養基中，並含有如上述之適當補充物。　　表1. 　　實驗程序簡介-貼壁細胞系實驗程序簡介-懸浮細胞系

在第0天，將貼壁細胞接種於96孔板(Corning；目錄編號：353072)且孵養整夜。

在第0天，將懸浮細胞連同細胞凋亡誘導性分子治療劑接種於96-孔板(Corning；目錄編號：353072)，如表1所示。

在整夜孵養(第1天)之後，將六個不同濃度的各種化學治療劑做三重複添加。各種藥物的原液及工作濃度如下：TRAIL的儲備溶液係以細胞培養級水製備。這些藥物的工作濃度係以培養基製備。

各別細胞系模型的細胞毒性可基於利用MTT測定所測得的比較細胞毒性評估。

代謝活性的MTT染色：MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物；噻唑藍)可購自Sigma Aldrich(目錄編號：M5655)且以5mg/ml之濃度溶解於無菌DPBS中。

在貼壁細胞經藥物暴露24及48 hr後(分別為第2及3天)，於96孔板的每孔中添加10µl之MTT製備溶液。將板在37℃、加濕CO₂ 恆溫箱中孵養2小時。經過2小時後，在生物安全櫃內使用真空抽吸培養基。將存活細胞中形成的紫色甲臢結晶藉由添加100µl的二甲亞碸(Thermo Fisher Scientific；目錄編號D128-500)溶解。將板放在振盪器上10分鐘，使結晶完全溶解，並使用Bio-Rad iMark微量板讀取儀記錄在595 nm下的吸光度。

在懸浮細胞經藥物暴露24及48 hr後(分別為第1及2天)，於96孔板的每孔中添加10µl之MTT製備溶液。將板在37℃、加濕CO₂ 恆溫箱中孵養2小時。經過2 hr孵養後，添加相等體積的溶解劑(20% SDS於50%二甲基甲醯胺中)且將板在37℃下加濕CO₂ 恆溫箱中孵養整夜。經過整夜孵養後，將板放在振盪器上10分鐘，使結晶完全溶解，並使用Bio-Rad iMark微量板讀取儀記錄在595 nm下的吸光度。

細胞存活百分比是使用MS excel計算。GraphPad Prism軟體用於計算EC₅₀ 。MTT測定指示整體細胞死亡率。

試驗表明，使用細胞凋亡誘導性分子治療劑治療癌細胞展現可基於癌細胞死亡測量的劑量反應特性。實例2：含Map激酶活化死亡結構域(MADD)之蛋白質siRNA轉染。

可設計包含靶向MADD剪接變體之外顯子13L的核酸分子之siRNA、shRNA及/或反義寡核苷酸。合成包含中央19 bp雙股及2個鹼基之3'懸端之siRNA。另外，合成具有19 bp雙股及2個鹼基之3'懸端之非特異性凌亂siRNA以提供陰性對照siRNA。所使用之siRNA(雙股)的序列為：

脂質體轉染劑RNAimax(轉染媒介試劑)是一種在水中帶有正表面電荷之陽離子單層脂質體結構。脂質陽離子電荷與siRNA中之核酸的負電荷磷酸基團交互作用，且與細胞膜形成脂質體/siRNA轉染複合物。此複合物可輕易地與細胞膜融合，且經由胞飲作用將siRNA遞送至細胞內。

siRNA及轉染試劑之投予需要就各種細胞系判定。大致上使用廠商建議的每mm³ 組織培養板面積之轉染試劑體積，而siRNA濃度可有所變化。對於大多數細胞而言，10 nM的siRNA足以在轉染48小時內造成MADD敲低。轉染：

將細胞培養及維持在含有5% CO₂ 的加濕大氣中，使用ATCC建議之含有10%胎牛血清(Gibco；目錄編號26140-079)及1x抗生物劑/抗黴菌劑(Gibco；目錄編號：15240096)的培養基及37℃、5% CO₂ 恆溫箱。為進行轉染，將細胞接種至96孔板(在轉染前24h達到60至80%長滿)。

各種測試細胞系的詳細轉染反應如下。

轉染反應混合物如廠商說明所建議的方式以三重複製備。簡言之，將100 μM siRNA儲備溶液之等分樣品稀釋於試管A中之5 µl OPTI-MEM中，以給出每孔10 nM siRNA之最終濃度。將0.3 µl的RNAiMax (Thermo Fisher Scientific)試劑混合於試管B中之4.7 µl OPTI-MEM中。將試管A與B之內容物混合並在室溫下孵養15分鐘。將反應混合物添加至板並在37℃下孵養24h、48h及72h。48小時後更換培養基。 RNA單離：

使用Trizol試劑(Ambion；目錄編號：15596018)萃取總RNA。在96孔板的各孔中添加150 µl的Trizol以懸浮及均質化細胞懸浮液。將三重複樣本匯集在一起以進行進一步處理。將細胞在室溫下孵養10分鐘。將250µl的氯仿(Fisher；目錄編號：C606-1)添加至細胞懸浮液。將樣本在室溫下孵養3分鐘。將試管在4℃下以10,000 rpm離心15分鐘。將上層轉移至新的試管，並添加600 µl的異丙醇(Fisher；目錄編號：A451-1)。將試管在室溫下孵養10分鐘。後續將試管在4℃下以10,000 rpm離心10分鐘。將上清液捨棄並將團塊用1 ml的75%乙醇(Decon；目錄編號：DSP-AZ-1)洗滌。將試管在4℃下以7500 rpm再次離心5分鐘。將團塊風乾，並溶解於20 µl的DEPC水(Fisher；目錄編號：BP561-1)。使用Thermo Fisher Scientific NanoDrop One定量RNA。使用A260/280及A260/230驗證樣本的純度。反轉錄酶PCR：

為進行RT-PCR，使用MADD及β-肌動蛋白(內部裝載對照)引子。使用的引子序列為：

為進行擴增，使用Qiagen單步驟RT_PCR套組(目錄編號：210212)及BioRaD T100熱循環儀。RT-PCR的說明如下。　　表3. 用於RT-PCR之擴增協定：　　1. 50℃進行30分鐘　　2. 95℃進行15分鐘　　3. 94℃進行50秒　　4. 55℃進行50秒　　5. 72℃進行60秒　　6. 重複步驟3至5，39次　　7. 72℃進行7分鐘　　8. 保持在4℃ 5%聚丙醯胺凝膠電泳：

聚丙醯胺凝膠係以手澆注形成，使用下列配方製備凝膠。所有組分依序添加。　表4.

整個樣本體積(25µl)在裝載至凝膠之前，先與5µl的6倍核酸緩衝劑(Thermo Fisher Scientific；目錄編號：RO611)混合。凝膠電泳以200伏特進行二小時，使用BioRad Protean II Xi電泳槽。將凝膠使用100ml的工作染色溶液(1µg/ml溴化乙啶於0.5x TBE中)染色30分鐘。溴化乙啶是購自BioRad(目錄編號161-0433)。使用BioRad ChemiDoc MP成像系統擷取影像。

這些試驗證明有效轉染本實驗核酸以及區分轉染試劑對MADD表現(MADD敲低)及細胞存活的影響。實例3：細胞凋亡誘導性分子治療劑對於MADD敲低存在及不存在之癌細胞的細胞死亡之影響

可判定細胞凋亡誘導性分子治療劑對於MADD下調存在或不存在之癌細胞的細胞毒性效應。

所有細胞皆培養於彼等各別的培養基中，並含有如上述之適當補充物。　　表5. 　　實驗程序簡介

將細胞培養及維持在37℃下如上述之含有5% CO₂ 加濕大氣中。在第0天，將細胞接種於100 mm³ 組織培養皿(Corning；目錄編號：353003)以達到60至70 %長滿。同時，亦將細胞接種於一個在重新接種之前用於存活性分析之96孔板(Corning；目錄編號：353072)。

經過12至18小時後(第1天)，將細胞用10nM濃度之凌亂或MADD siRNA轉染。所使用之siRNA(雙股)的序列為：

將siRNA原液用1x siRNA溶解緩衝劑(GE Healthcare；目錄編號：B-002000-UB-700)重構至100µM濃度並儲存在-20℃下。為進行轉染，每板的反應混合物係藉由添加30 µl脂質體轉染劑RNAimax(Invitrogen；目錄編號13778-150)、1ml Opti-MEM(Gibco；目錄編號：31985062)及siRNA原液之等分製備，以獲得含有70%長滿細胞之每板或板的孔最終濃度10 nM siRNA。將反應混合物在室溫下孵養10分鐘。將轉染混合物逐滴添加至含有70%長滿細胞於含有10% FBS但不含抗生素之RPMI培養基中的板上。將轉染混合物平行添加至接種在96孔板中的細胞。

將細胞在37℃、加濕CO₂ 恆溫箱中孵養24小時，且隔天(第2天)用完全RPMI(10% FBS及1x抗生素/抗黴菌劑)置換培養基。所有細胞的培養基皆經更換。

經過48小時轉染後(第3天)，細胞藉由0.05%胰蛋白酶(Gibco；目錄編號：25-300-054)處理收獲。簡言之，用DPBS(Gibco；目錄編號：14190250)洗滌細胞且用胰蛋白酶處理5分鐘。後續，將細胞脫壁並收集於10 ml完全培養基中。將細胞懸浮液以1500 rpm離心10分鐘。將上清液捨棄且將細胞團塊懸浮於5 ml完全RPMI中。重新接種前使用血球計計數所有細胞[對照(未治療)、凌亂及MADD siRNA轉染]。為進行細胞計數，混合相等體積的細胞懸浮液與台盼藍0.4%(Lonza；目錄編號：17-942E)。將10 µl的細胞懸浮液(含台盼藍)放置在血球計上並計數細胞。執行兩次計數且使用平均值來判定細胞數目。

將相同數量的細胞[對照(未治療)、凌亂及MADD siRNA轉染]接種在96孔板。在同一天(轉染後48小時)，進行MTT測定以判定重新接種前的相對細胞存活率。

在第4天，當細胞得以在96孔板中適當貼壁且保留它們的形狀，添加藥物。所有藥物皆在添加至細胞前的同一天用完全培養基稀釋。在未治療細胞中，用完全培養基置換培養基。使用200 µl體積的培養基(含或不含藥物)進行藥物治療測定。將板在37℃、加濕CO₂ 恆溫箱中孵養24h、48h及72小時。

執行MTT測定以判定如上述之藥物治療後的相對存活率。

代謝活性的MTT染色：MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑溴化物；噻唑藍)係購自Sigma Aldrich(目錄編號：M5655)。將MTT以濃度5mg/ml溶解於無菌DPBS中，且過濾通過0.45 µM注射過濾器(Corning；目錄編號：431220)。在96孔板的每孔中添加10µl的MTT溶液。將板在37℃、加濕CO₂ 恆溫箱中孵養2小時。經過2小時後，在生物安全櫃內使用真空抽吸培養基。將存活細胞中形成的紫色結晶藉由添加100µl的二甲亞碸(Thermo Fisher Scientific；目錄編號D128-500)溶解。將板放在振盪器上10分鐘，使結晶完全溶解，並使用Bio-Rad iMark微量板讀取儀記錄在595 nm下的吸光度。

將資料用MS excel軟體分析。相對存活率係相對於對照(未治療細胞)的吸光度來計算，以判定轉染以及組合治療的效果。

以凌亂siRNA轉染導致很少或沒有自發性細胞死亡。自發性細胞死亡可能歸因於個別細胞系對轉染試劑的敏感度。凌亂siRNA轉染是每個實驗中必須包括的轉染對照，並建立反映了可能由於轉染反應所致的細胞死亡量的基線。

各資料集皆會考慮到在凌亂siRNA轉染觀察到的任何自發性細胞死亡；將凌亂siRNA轉染之自發性細胞死亡的量(基線)自各siRNA轉染反應所觀察到的細胞死亡的量減去，以產生在計算凌亂siRNA誘導的細胞死亡後的細胞死亡淨百分比(淨%)。

在一實施態樣中，添加100 ng/ml TRAIL至H522肺癌細胞作為單一療法。另外，細胞經MADD siRNA轉染作為單一療法。在組合中，100 ng/ml TRAIL添加至經MADD siRNA轉染的細胞。由未治療對照細胞、經凌亂siRNA轉染的對照細胞、經MADD siRNA轉染的細胞、經100 ng/ml TRAIL治療的細胞及經MADD siRNA轉染且經100 ng/ml TRAIL治療的細胞表示之治療典範之細胞培養中的細胞死亡量係於TRAIL治療48小時後評估。

結果如表6中報告，證明siRNA敲低MADD導致7%細胞死亡、100 ng/ml濃度之TRAIL單一療法導致0%細胞死亡，且添加100 ng/ml TRAIL至MADD siRNA轉染細胞導致15%細胞死亡。所有結果利用凌亂siRNA細胞死亡資料進行轉染效應之調整。綜上所述，結果顯示MADD之siRNA敲低與TRAIL治療之組合的協同性，導致15%細胞死亡，遠遠超過MADD siRNA敲低單一療法或TRAIL單一療法的加成效應(各單一療法之加成效應為7%細胞死亡)。

在另一實施態樣中，添加50 ng/ml TRAIL至SKOV3卵巢癌細胞作為單一療法。另外，細胞經MADD siRNA轉染作為單一療法。在組合中，50 ng/ml TRAIL添加至經MADD siRNA轉染的細胞。由未治療對照細胞、經凌亂siRNA轉染的對照細胞、經MADD siRNA轉染的細胞、經50 ng/ml TRAIL治療的細胞及經MADD siRNA轉染且經50 ng/ml TRAIL治療的細胞表示之治療典範之細胞培養中的細胞死亡量係於TRAIL治療48小時後評估。

結果如表7中報告，證明siRNA敲低MADD導致29%細胞死亡、50 ng/ml濃度之TRAIL單一療法導致13%細胞死亡，且添加50 ng/ml TRAIL至MADD siRNA轉染細胞導致79%細胞死亡。所有結果利用凌亂siRNA細胞死亡資料進行轉染效應之調整。綜上所述，結果顯示MADD之siRNA敲低與TRAIL治療之組合的協同性，導致79%細胞死亡，遠遠超過MADD siRNA敲低單一療法或TRAIL單一療法的加成效應(各單一療法之加成效應為42%細胞死亡)。

在另一實施態樣中，添加6.25 ng/ml TRAIL至8508C甲狀腺癌細胞作為單一療法。另外，細胞經MADD siRNA轉染作為單一療法。在組合中，6.25 ng/ml TRAIL添加至經MADD siRNA轉染的細胞。由未治療對照細胞、經凌亂siRNA轉染的對照細胞、經MADD siRNA轉染的細胞、經6.25 ng/ml TRAIL治療的細胞及經MADD siRNA轉染且經6.25 ng/ml TRAIL治療的細胞表示之治療典範之細胞培養中的細胞死亡量係於TRAIL治療48小時後評估。

結果如表8中報告，證明siRNA敲低MADD導致39%細胞死亡、6.25 ng/ml濃度之TRAIL單一療法導致6.56%細胞死亡，且添加6.25 ng/ml TRAIL至MADD siRNA轉染細胞導致49%細胞死亡。所有結果利用凌亂siRNA細胞死亡資料進行轉染效應之調整。綜上所述，結果顯示MADD之siRNA敲低與TRAIL治療之組合的協同性，導致49%細胞死亡，超過MADD siRNA敲低單一療法或TRAIL單一療法的加成效應(各單一療法之加成效應為46%細胞死亡)。

在另一實施態樣中，添加50 ng/ml TRAIL至PLC/PRF/5肝癌細胞作為單一療法。另外，細胞經MADD siRNA轉染作為單一療法。在組合中，50 ng/ml TRAIL添加至經MADD siRNA轉染的細胞。由未治療對照細胞、經凌亂siRNA轉染的對照細胞、經MADD siRNA轉染的細胞、經50 ng/ml TRAIL治療的細胞及經MADD siRNA轉染且經50 ng/ml TRAIL治療的細胞表示之治療典範之細胞培養中的細胞死亡量係於TRAIL治療24小時後評估。

結果如表9中報告，證明siRNA敲低MADD導致20%細胞死亡、50 ng/ml濃度之TRAIL單一療法導致0%細胞死亡，且添加50 ng/ml TRAIL至MADD siRNA轉染細胞導致52%細胞死亡。所有結果利用凌亂siRNA細胞死亡資料進行轉染效應之調整。綜上所述，結果顯示MADD之siRNA敲低與TRAIL治療之組合的協同性，導致52%細胞死亡，遠遠超過MADD siRNA敲低單一療法或TRAIL單一療法的加成效應(各單一療法之加成效應為20%細胞死亡)。

在另一實施態樣中，添加50 ng/ml TRAIL至HCT116結腸癌細胞作為單一療法。另外，細胞經MADD siRNA轉染作為單一療法。在組合中，50 ng/ml TRAIL添加至經MADD siRNA轉染的細胞。由未治療對照細胞、經凌亂siRNA轉染的對照細胞、經MADD siRNA轉染的細胞、經50 ng/ml TRAIL治療的細胞及經MADD siRNA轉染且經50 ng/ml TRAIL治療的細胞表示之治療典範之細胞培養中的細胞死亡量係於TRAIL治療48小時後評估。

結果如表10中報告，證明siRNA敲低MADD導致16%細胞死亡、50 ng/ml濃度之TRAIL單一療法導致27%細胞死亡，且添加50 ng/ml TRAIL至MADD siRNA轉染細胞導致52%細胞死亡。所有結果利用凌亂siRNA細胞死亡資料進行轉染效應之調整。綜上所述，結果顯示MADD之siRNA敲低與TRAIL治療之組合的協同性，導致46%細胞死亡，超過MADD siRNA敲低單一療法或TRAIL單一療法的加成效應(各單一療法之加成效應為43%細胞死亡)。

在另一實施態樣中，添加12.5 ng/ml TRAIL至K562慢性骨髓性白血病癌細胞作為單一療法。另外，細胞經MADD siRNA轉染作為單一療法。在組合中，12.5 ng/ml TRAIL添加至經MADD siRNA轉染的細胞。由未治療對照細胞、經凌亂siRNA轉染的對照細胞、經MADD siRNA轉染的細胞、經12.5 ng/ml TRAIL治療的細胞及經MADD siRNA轉染且經12.5 ng/ml TRAIL治療的細胞表示之治療典範之細胞培養中的細胞死亡量係於TRAIL治療48小時後評估。

結果如表11中報告，證明siRNA敲低MADD導致4%細胞死亡、12.5 ng/ml濃度之TRAIL單一療法導致0%細胞死亡，且添加12.5 ng/ml TRAIL至MADD siRNA轉染細胞導致16%細胞死亡。所有結果利用凌亂siRNA細胞死亡資料進行轉染效應之調整。綜上所述，結果顯示MADD之siRNA敲低與TRAIL治療之組合的協同性，導致16%細胞死亡，超過MADD siRNA敲低單一療法或TRAIL單一療法的加成效應(各單一療法之加成效應為4%細胞死亡)。

在另一實施態樣中，添加6.25 ng/ml TRAIL至K562慢性骨髓性白血病癌細胞作為單一療法。另外，細胞經MADD siRNA轉染作為單一療法。在組合中，6.25 ng/ml TRAIL添加至經MADD siRNA轉染的細胞。由未治療對照細胞、經凌亂siRNA轉染的對照細胞、經MADD siRNA轉染的細胞、經6.25 ng/ml TRAIL治療的細胞及經MADD siRNA轉染且經6.25 ng/ml TRAIL治療的細胞表示之治療典範之細胞培養中的細胞死亡量係於TRAIL治療72小時後評估。

結果如表12中報告，證明siRNA敲低MADD導致47%細胞死亡、6.25 ng/ml濃度之TRAIL單一療法導致0%細胞死亡，且添加6.25 ng/ml TRAIL至MADD siRNA轉染細胞導致69%細胞死亡。所有結果利用凌亂siRNA細胞死亡資料進行轉染效應之調整。綜上所述，結果顯示MADD之siRNA敲低與TRAIL治療之組合的協同性，導致69%細胞死亡，超過MADD siRNA敲低單一療法或TRAIL單一療法的加成效應(各單一療法之加成效應為59%細胞死亡)。

在另一實施態樣中，添加6.25 ng/ml TRAIL至AGS胃腺癌癌細胞作為單一療法。另外，細胞經MADD siRNA轉染作為單一療法。在組合中，6.25 ng/ml TRAIL添加至經MADD siRNA轉染的細胞。由未治療對照細胞、經凌亂siRNA轉染的對照細胞、經MADD siRNA轉染的細胞、經6.25 ng/ml TRAIL治療的細胞及經MADD siRNA轉染且經6.25 ng/ml TRAIL治療的細胞表示之治療典範之細胞培養中的細胞死亡量係於TRAIL治療72小時後評估。

結果如表13中報告，證明siRNA敲低MADD導致3%細胞死亡、6.25 ng/ml濃度之TRAIL單一療法導致0%細胞死亡，且添加6.25 ng/ml TRAIL至MADD siRNA轉染細胞導致24%細胞死亡。所有結果利用凌亂siRNA細胞死亡資料進行轉染效應之調整。綜上所述，結果顯示MADD之siRNA敲低與TRAIL治療之組合的協同性，導致24%細胞死亡，遠遠超過MADD siRNA敲低單一療法或TRAIL單一療法的加成效應(各單一療法之加成效應為10%細胞死亡)。

在另一實施態樣中，添加12.5 ng/ml TRAIL至CFPAC-1胰癌細胞作為單一療法。另外，細胞經MADD siRNA轉染作為單一療法。在組合中，12.5 ng/ml TRAIL添加至經MADD siRNA轉染的細胞。由未治療對照細胞、經凌亂siRNA轉染的對照細胞、經MADD siRNA轉染的細胞、經12.5 ng/ml TRAIL治療的細胞及經MADD siRNA轉染且經12.5 ng/ml TRAIL治療的細胞表示之治療典範之細胞培養中的細胞死亡量係於TRAIL治療72小時後評估。

結果如表14中報告，證明siRNA敲低MADD導致53%細胞死亡、12.5 ng/ml濃度之TRAIL單一療法導致0%細胞死亡，且添加12.5 ng/ml TRAIL至MADD siRNA轉染細胞導致8%細胞死亡。所有結果利用凌亂siRNA細胞死亡資料進行轉染效應之調整。綜上所述，結果顯示MADD之siRNA敲低與TRAIL治療之組合的協同性，導致94%細胞死亡，遠遠超過MADD siRNA敲低單一療法或TRAIL單一療法的加成效應(各單一療法之加成效應為61%細胞死亡)。

在另一實施態樣中，添加6.25 ng/ml TRAIL至CFPAC-1胰癌細胞作為單一療法。另外，細胞經MADD siRNA轉染作為單一療法。在組合中，6.25 ng/ml TRAIL添加至經MADD siRNA轉染的細胞。由未治療對照細胞、經凌亂siRNA轉染的對照細胞、經MADD siRNA轉染的細胞、經6.25 ng/ml TRAIL治療的細胞及經MADD siRNA轉染且經6.25 ng/ml TRAIL治療的細胞表示之治療典範之細胞培養中的細胞死亡量係於TRAIL治療72小時後評估。

結果如表15中報告，證明siRNA敲低MADD導致53%細胞死亡、6.25 ng/ml濃度之TRAIL單一療法導致30%細胞死亡，且添加6.25 ng/ml TRAIL至MADD siRNA轉染細胞導致91%細胞死亡。所有結果利用凌亂siRNA細胞死亡資料進行轉染效應之調整。綜上所述，結果顯示MADD之siRNA敲低與TRAIL治療之組合的協同性，導致91%細胞死亡，遠遠超過MADD siRNA敲低單一療法或TRAIL單一療法的加成效應(各單一療法之加成效應為83%細胞死亡)。

考慮上述實驗的結果，本測定顯示細胞凋亡誘導性分子治療劑治療與MADD敲低之組合在誘導癌細胞死亡上導致出乎意料的協同效應。結果顯示細胞介素化療與MADD敲低組合在細胞死亡上導致超過加成效應。因此，細胞凋亡誘導性分子治療劑的劑量可降低至以前被視為非治療性的水準，藉此提供展現出意外的安全邊際且減少非所要的不良反應之癌症療法。 * * * * *

本發明並不侷限在本文所述之特定實施態樣的範疇。事實上，除了在此處說明之修飾之外，本發明之許多修飾將為該領域之技藝人士自前述說明所顯而易見。該等修飾意圖屬於隨附之權利要求之範圍內。

所有在本文中引述的專利、申請案、出版物、測試方法、文獻及其他材料特此以引用方式併入本文中。 * * * * *

圖1：藉由選擇性mRNA剪接所產製之人類IG20剪接變體。顯示七個IG20剪接變體之間的cDNA序列同源性。實心長條代表所有變體之間完全同源性的區域。空心部位指示外顯子13L、16、21、26及34，當以不同組合剪接時，彼等產生左側顯示的七個剪接變體。在KIAA0358及IG20-SV4中剪接外顯子34誘導外顯子35中的提早終止密碼子。也顯示不同剪接變體的不同5'非轉譯區域(UTR)。

Claims

一種可用於治療癌症之抗癌藥物之組合，其包含有效量之一或多種核酸分子及一或多種細胞凋亡誘導性分子治療劑，該一或多種核酸分子能夠下調IG20基因之至少一個剪接變體的表現，其中並非所有IG20基因之剪接變體皆經下調。
如請求項1之組合，其中IG20基因之該至少一個剪接變體係選自MADD剪接變體、SNP、其等位變化、其多型性及其基因突變。
如請求項2之組合，其中IG20基因之該至少一個剪接變體係展現外顯子13L之MADD剪接變體。
如請求項2之組合，其中該一或多種能夠下調IG20基因之該至少一個剪接變體的表現之核酸分子係選自siRNA、shRNA及反義寡核苷酸。
如請求項4之組合，其中該等siRNA、shRNA及反義寡核苷酸包含與MADD剪接變體之外顯子13L的核酸序列、SNP、其等位變化、其多型性及其基因突變及/或其mRNA轉錄物互補之核酸。
如請求項4之組合，其中能夠下調IG20基因之至少一個剪接變體的表現之該核酸分子係包含在siRNA或shRNA中。
如請求項6之組合，其中該siRNA及shRNA係由包括下列結構之核酸分子編碼： X_正義 - 髮夾圈 - X_反義，　　其中X包括核酸序列CGGCGAATCTATGACAATC (SEQ ID NO:1)或實質上由該核酸序列組成。
如請求項6之組合，其中該siRNA或shRNA包含具有序列CGGCGAAUCUAUGACAAUC (SEQ ID NO:2)之核酸。
如請求項6之組合，其中該siRNA或shRNA包含具有序列CGGCGAAUCUAUGACAAUC (SEQ ID NO:2)之核酸且係呈帶有同源核酸之雙股形式，該同源核酸具有序列GAUUGUCAUAGAUUCGCCG (SEQ ID NO:10)。
如請求項7之組合，其中該shRNA及siRNA係由具有序列CGAATCTATGACAATCTTCAAGAGAGATTGTCATAGATTCGCCG (SEQ ID NO:3)之核酸編碼，其中髮夾圈區域係序列位置20至28。
如請求項4之組合，其中包含與IG20基因之MADD剪接變體之外顯子13L的核酸序列及/或其mRNA轉錄物互補之核酸的該siRNA、shRNA及反義寡核苷酸包含具有選自GAUUGUCAUAGAUUCGCCGTT(SEQ ID NO:4)及 GAUUGUCAUAGAUUCGCCG(SEQ ID NO:10)之序列的核酸。
如請求項4之組合，其中能夠下調IG20基因之該至少一個剪接變體的表現之該一或多種核酸分子係包含在藥物遞送系統中。
如請求項12之組合，其中該藥物遞送系統係靶向性脂質體製劑或慢病毒載體。
如請求項1之組合，其中該一或多種細胞凋亡誘導性分子治療劑係選自介白素2 (IL2)、干擾素α (IFN-α)及腫瘤壞死因子α相關之細胞凋亡誘導性配體(TRAIL)。
如請求項1之組合，其中該一或多種細胞凋亡誘導性分子治療劑係呈醫藥上可接受之鹽之形式。
如請求項1之組合，其中該癌症係選自循環癌症，諸如白血病及淋巴瘤、黑色素瘤、膀胱癌及腎癌及其他類型的實質腫瘤癌症。
一種抗癌藥物與一或多種細胞凋亡誘導性分子治療劑之組合於製備用於治療個體的癌症之藥劑之用途，該等癌症選自循環性癌症，諸如白血病及淋巴瘤、黑色素瘤、膀胱癌及腎癌及其他類型的實質腫瘤癌症，該等抗癌藥物包含一或多種能夠下調IG20基因之至少一個剪接變體的表現之核酸分子，其中並非所有IG20基因之剪接變體皆經下調。
如請求項17之用途，其中該等癌症展現IG20基因之至少一個剪接變體的表現。
如請求項17之用途，其中該等癌症展現IG20基因之該MADD剪接變體、SNP、其等位變化、其多型性及其基因突變的表現。
如請求項19之用途，其中MADD剪接變體展現IG20基因之外顯子13L。
如請求項17之用途，其中該一或多種能夠下調IG20基因之至少一個剪接變體的表現之核酸分子係選自siRNA、shRNA及反義寡核苷酸。
如請求項21之用途，其中該等siRNA、shRNA及反義寡核苷酸包含與IG20基因之MADD剪接變體之外顯子13L的核酸序列、SNP、其等位變化、其多型性及其基因突變及/或其mRNA轉錄物互補之核酸。
如請求項22之用途，其中能夠下調IG20基因之至少一個剪接變體的表現之該核酸分子係包含在siRNA或shRNA中。
如請求項23之用途，其中該siRNA及shRNA係由包括下列結構之核酸分子編碼： X_正義 - 髮夾圈 - X_反義，　　其中X包括核酸序列CGGCGAATCTATGACAATC (SEQ ID NO:1)或實質上由該核酸序列組成。
如請求項23之用途，其中該siRNA及shRNA包含具有序列CGGCGAAUCUAUGACAAUC (SEQ ID NO:2)之核酸。
如請求項25之用途，其中該siRNA及shRNA包含具有序列CGGCGAAUCUAUGACAAUC (SEQ ID NO:2)之核酸且係呈帶有同源核酸之雙股形式，該同源核酸具有序列GAUUGUCAUAGAUUCGCCG (SEQ ID NO:10)。
如請求項22之用途，其中該shRNA係由具有序列CGAATCTATGACAATCTTCAAGAGAGATTGTCATAGATTCGCCG (SEQ ID NO:3)之核酸編碼，其中髮夾圈區域係序列位置20至28。
如請求項22之用途，其中包含與IG20基因之MADD剪接變體之外顯子13L的核酸序列及/或其mRNA轉錄物互補之核酸的該等siRNA、shRNA及反義寡核苷酸包含具有選自GAUUGUCAUAGAUUCGCCGTT (SEQ ID NO:4)及GAUUGUCAUAGAUUCGCCG (SEQ ID NO:10)之序列的核酸。
如請求項22之用途，其中該一或多種siRNA、shRNA及反義寡核苷酸係以脂質體製劑之形式或藉由慢病毒轉染投予。
如請求項22之用途，其中該一或多種siRNA、shRNA及反義寡核苷酸係以作為佐劑投予。
如請求項17之用途，其中該一或多種細胞凋亡誘導性分子治療劑係選自介白素2 (IL2)、干擾素α (IFN-α)及腫瘤壞死因子α相關之細胞凋亡誘導性配體(TRAIL)。
如請求項17之用途，其中該一或多種細胞凋亡誘導性分子治療劑係以醫藥組成物之形式投予，該醫藥組成物進一步包含一或多種醫藥上可接受之稀釋劑、賦形劑或載體。
如請求項22之用途，其中該一或多種siRNA、shRNA及反義寡核苷酸係在該一或多種細胞凋亡誘導性分子治療劑之前投予，或與該一或多種細胞凋亡誘導性分子治療劑同時投予。
如請求項22之用途，其中該一或多種siRNA、shRNA及反義寡核苷酸係以醫藥組成物之形式投予，該醫藥組成物進一步包含一或多種醫藥上可接受之稀釋劑、賦形劑或載體。
如請求項22之用途，其中該一或多種siRNA、shRNA及反義寡核苷酸及該一或多種細胞凋亡誘導性分子治療劑係調製成劑量包裝且係根據選定治療方案投予。