TW201902488A - 核酸寡核苷酸與紫杉烷化學治療劑之協同增效性組合 - Google Patents

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Abstract

本發明提供包含投予抗癌劑組合之用於治療癌症的組成物及方法，其中該組合包含紫杉烷衍生物化學治療劑及一或多種能夠下調至少一種IG20 基因之剪切變體表現的核酸分子，且其中並非所有IG20 基因之剪切變體被下調。於一具體實施例中，IG20 基因之剪切變體為MADD剪切變體而核酸分子為包含與MADD剪切變體的外顯子13L之核酸序列、或MADD剪切變體的外顯子13L的mRNA轉錄本互補之核酸序列之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸。本發明涵蓋治療癌症之方法，其包括具有能夠下調至少一種IG20 基因之剪切變體表現的核酸分子與紫杉烷衍生物化學治療劑的組合療法。

Description

核酸寡核苷酸與紫杉烷化學治療劑之協同增效性組合
本發明涉及包括投予抗癌劑組合之用於治療癌症之醫藥組成物及方法，其中該組成物包含紫杉烷衍生物化學治療劑與一或多種能夠下調至少一種胰島素瘤-升糖素瘤(Insulinoma-Glucagonoma；IG20 )基因之剪切變體表現的核酸分子，且其中並非所有IG20 基因之剪切變體被下調。於一具體實施例中，IG20 基因之剪切變體為MADD剪切變體而一或多種能夠下調至少一種IG20 基因之剪切變體表現的核酸分子係選自siRNA、shRNA及反義寡核苷酸，其中該siRNA、shRNA及反義寡核苷酸包含與MADD剪切變體的外顯子13L之核酸序列、及/或MADD剪切變體的外顯子13L的mRNA轉錄本互補之核酸序列。本發明涵蓋治療癌症之方法，其包括具有能夠下調至少一種IG20 基因之剪切變體表現的核酸分子與紫杉烷衍生物化學治療劑的組合療法。
IG20 基因在癌細胞增生、凋亡及生存中扮演重要的角色(Chow VT, Lee SS. (1996). DNA Seq 6：263-273, Chow VT, Lim KM, Lim D. (1998). Genome 41：543-552；Schievella AR, Chen JH, Graham JR, Lin LL. (1997). J Biol Chem 272：12069-12075；Brinkman BM, Telliez JB, Schievella AR, Lin LL, Goldfeld AE. (1999). J Biol Chem 274：30882-30886；Murakami-Mori K, Mori S, Bonavida B, Nakamura S. (1999). J Immunol 162：3672-3679；Telliez JB, Bean KM, Lin LL. (2000). Biochem Biophys Acta 1478：280-288；Al-Zoubi AM, Efimova EV, Kaithamana S, Martinez O, El-Idrissi ME, Dogan RE et al. (2001). J Biol Chem 276：47202-47211；Lim KM, Chow VT. (2002). Mol Carcinog 35：110-126；Efimova EV, Al-Zoubi AM, Martinez O, Kaithamana S, Lu SF, Arima T et al. (2004). Oncogene 23：1076-1087；Efimova EV, Martinez O, Lokshin A, Arima T, Prabhakar BS. (2003). Cancer Res 63：8768-8776；Lim KM, Yeo WS, Chow VT. (2004). Int J Cancer 109：24-37；Ramaswamy M, Efimova EV, Martinez O, Mulherkar NU, Singh SP, Prabhakar BS. (2004). Oncogene 23：6083-6094)。額外地，其在神經傳遞(neurotransmission)(Zhang Y, Zhou L, Miller CA. (1998). Proc Natl Acad Sci USA 95：2586-2591；Tanaka M, Miyoshi J, Ishizaki H, Togawa A, Ohnishi K, Endo K et al. (2001). Mol Biol Cell 12：1421-1430；Yamaguchi K, Tanaka M, Mizoguchi A, Hirata Y, Ishizaki H, Kaneko K et al. (2002). Proc Natl Acad Sci USA 99：14536-14541)、神經退化(neurodegeneration)(Del Villar K, Miller CA. (2004). Proc Natl Acad Sci USA 101：4210-4215)及鳥嘌呤核苷酸交換(Wada M, Nakanishi H, Satoh A, Hirano H, Obaishi H, Matsuura Y et al. (1997). J Biol Chem 272：3875-3878；Brown TL, Howe PH. (1998). Curr Biol 8：R191；Iwasaki K, Toyonaga R. (2000). EMBO J 19：4806-4816；Levivier E, Goud B, Souchet M, Calmels TP, Mornon JP, Callebaut I. (2001). Biochem Biophys Res Commun 287：688-695)中扮演重要的角色。該等分歧的功能最有可能通過IG20 基因之選擇性剪接(alternative splicing)介導而提供剪接變體及蛋白多樣性(Chow VT, Lim KM, Lim D. (1998). Genome 41：543-552；Al-Zoubi AM, Efimova EV, Kaithamana S, Martinez O, El-Idrissi ME, Dogan RE et al. (2001). J Biol Chem 276：47202-47211；Efimova EV, Al-Zoubi AM, Martinez O, Kaithamana S, Lu, SF, Arima T et al. (2004). Oncogene 23：1076-1087)。使用反義寡核苷酸之所有內源性IG20 剪接變體的下調已顯示於活體外及活體內導致癌細胞的自發性凋亡，但在正常細胞中則不然(Lim KM, Chow VT. (2002). Mol Carcinog 35：110-126；Lim KM, Yeo WS, Chow VT. (2004). Int J Cancer 109：24-37)。
美國專利案編號8,722,637描述了"IG20和IG20-[SV2]，及先前報導之KIAA0358、MADD和DENN-SV為IG20 基因之剪接變體，IG20 基因位於染色體11p11且由36個外顯子所組成。上述變體間的差異是由於外顯子13L、16、21、26及34之選擇性剪接所致"。可認為已於下列文章中描述IG20、MADD、SV2及DENN-SV的同型異構體：Contrasting Effects of IG20 and Its Splice Isoforms, MADD and DENN-SV, on Tumor Necrosis Factor α-induced Apoptosis and 　　Activation of Caspase-8 and -3, Adeeb M. Al-Zoubi, Elena V. Efimova, Shashi Kaithamana, Osvaldo Martinez, Mohammed El-Azami El-Idrissi, Rukiye E. Dogan, and Bellur S. Prabhakar, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, Vol. 276, No. 50, Issue of December 14, pp. 47202-47211, 2001。
在Al-Zoubi等人的揭示之後，鑑定出更長的同型異構體，包括KIAA0358。因此，由Al-Zoubi等人鑑定為IG20之IG20 剪接變體變成稱作IG20pa，因為根據'637專利解釋，該IG20表現蛋白為促凋亡傳訊分子，其不同於IG20-FL或全長變體(第5欄，第43-45行)。
Efimova描述了"迄今鑑定之IG20的全部七種變體都源於外顯子13L、16、21、26及34之選擇性剪接。IG20之全長cDNA(IG20-FL)(存取編號AF440100)為5995個鹼基對(bp)長度，由全部36個外顯子所組成且代表最長的變體。Elena V. Efimova,et al ., IG20, in contrast to DENN-SV, (MADD splice variants) suppresses tumor cell survival, and enhances their susceptibility to apoptosis and cancer drugs, Oncogene (2004) 23, 1076-1087。這些剪接變體可如圖1中般以圖形代表。外顯子34之剪接單獨產生由5942個bp所組成之KIAA0358(存取編號AB002356)。外顯子21和26之剪接及外顯子16、21和26之剪接分別產生5878個bp長度的IG20(存取編號AF440101)及6002個bp長度的MADD(存取編號U77352)。MADD亦稱作DENN(存取編號U44953)，其為5844個bp長度。外顯子13L、21和26，及13L、16、21和26之剪接產生5749個bp長度的IG20-SV2(存取編號AF440102)及5689個bp長度的IG20-SV3(存取編號AF440103)(更早稱作DENN-SV)。最後，全部五種外顯子(13L、16、21、26和34)之剪接產生IG20-SV4(存取編號AF440434)，其為最短的變體且由5619個bp所組成"。
圖1係以圖展示藉由選擇性mRNA剪接所產生之人類IG20剪接變體。顯示在七種IG20剪接變體間的cDNA序列同源性。實心長條代表在所有變體之間的完全同源性區域。空白區域表明外顯子13L、16、21、26和34，當彼等以不同的組合剪接時，得到在左邊所示的七種剪接變體。在KIAA0358及IG20-SV4中外顯子34的剪接會誘導在外顯子35中提早出現的終止密碼子。亦顯示不同的剪接變體之不同的5'非轉譯區(UTR)。
在'637專利中描述該發明時，其確定IG20pa、MADD、IG20-SV2及DENN-SV係表現在人類組織中及更大程度表現在腫瘤中('637的第5欄第1至2行)。DENN-SV的過度表現係與由化學療法誘導之提高的細胞複製及凋亡抗性相關聯('637的第5欄第4至6行)。IG20pa的過度表現顯示出壓倒內源性DENN-SV功能，導致凋亡('637的第5欄第16至17行)。
通過在'637專利中所執行的實驗，已確定"因為DENN-SV缺少外顯子13L和16二者，MADD缺少外顯子16，及IG20-SV2缺少外顯子13L，這些結果證實外顯子13L和16二者的表現(如IG20[pa]中所見)為抗增生及促凋亡性質所必需的，而外顯子13L和16二者都缺失(如DENN-SV中所見)為促增生及抗凋亡性質所必需的"('637的第17欄第38至44行)。最終，'637專利作出了結論"有明確的證據示意IG20[pa]及DENN-SV對凋亡及細胞增生具有對比效應"('637的第18欄第37至39行)。其進一步作出了結論" IG20[pa]為促凋亡蛋白，其可與DR4及DR5交互作用且藉由以增加之FADD及半胱天冬酶-8的募集來促進DISC形成而顯著地提高TRAIL所誘導之凋亡"('637的第23欄第1至4行)。最後，其作出了結論"IG20[pa]可使得細胞更易受到凋亡的影響且抑制細胞生長。這提升使用IG20[pa]而使得不然會具有抗性的細胞變得更易受各種方式的癌症療法影響的可能性"('637的第27欄第20至24行)。
作為通過IG20 剪接變體的過度表現所達成之理解的結果，而作出了結論"以IG20[pa]及DENN-SV轉染之細胞分別對TNFα所誘導之凋亡為最易受影響及最能抵抗，而以MADD或IG20-SV2轉染之細胞則相對於以對照質體所轉染之細胞而言並未顯示顯著的差別。因為DENN-SV缺少外顯子13L和16二者，MADD缺少外顯子16，及IG20-SV2缺少外顯子13L，這些結果證實外顯子13L和16二者的表現(如在IG20[pa]中所見)為抗增生及促凋亡性質所必需的，而13L和16二者的缺失(如DENN-SV中所見)為促增生及抗凋亡性質所必需的"('637的第17欄第34至44行)。
因此，在'637專利之前，IG20 剪接變體表現的完整複雜性、不同的同型異構體在不同組織中的選擇性表現及剪接變體之各者獨特的功能屬性未經認可。以'637專利中所揭示對IG20 剪接變體的過度表現之實驗為基礎，在不考慮在內含子16剪接之變體(MADD)、在13L和16剪接之變體(DENN-SV)、在21和26剪接之變體(MADD、DENN-SV、IG20pa)及在34剪接之變體(KIAA0358、IG20-SV4)下，剪接變體的無差別減弱(knockdown)之衝擊能證明對動物的正常神經元功能和生存(亦即KIAA0358)、癌細胞生存(亦即MADD)及增生(亦即DENN-SV)極其重要。因此，該專利提供IG20 同型異構體之功能表徵化(functional characterization)及解釋可選擇性調節各種同型異構體表現同時避免非意欲的致命結果之設計策略的複雜性。
IG20pa剪接變體為促凋亡的、抗增生的，且使得細胞更易受到經誘導之細胞死亡(亦即為腫瘤抑制劑)的影響。IG20pa、或其片段可過度表現以控制細胞增生、細胞週期，且使得細胞更易受到化學療法、輻射療法或死亡受體介導之細胞死亡的影響。
可下調DENN-SV表現以降低細胞增生、影響細胞週期且增加對以化學療法、輻射療法及死亡受體介導之細胞死亡的治療之易受影響性。
IG20pa及DENN-SV剪接變體之差別表現分別使得細胞對經誘導之細胞死亡更易受影響或更能抵抗，且可利用IG20pa變體之促凋亡性質使得不然會具有化學治療劑抗性的腫瘤細胞變得易受以TRAIL及/或化學治療劑殺死的影響。
當IG20pa在細胞中過度表現時，則細胞顯示顯著降低的增生且還更易受自發性TNFα及TRAIL所誘導之凋亡影響。因此，可利用IG20pa剪接變體之促凋亡性質使得不然會具有抗性的腫瘤細胞變得易受以TRAIL及/或化學治療劑殺死的影響。
以siRNA下調IG20剪接變體的表現係使用靶向具有序列(5'-GTACCAGCTTCAGTCTTTC-3')的IG20 mRNA之中間(Mid)區(尤其為外顯子15)的siRNA及靶向IG20 mRNA之死亡結構域(DD)區的siRNA評估。中間區及DD區二者係存在於所有的IG20剪接變體中。
以對抗IG20 mRNA之中間區但不對抗IG20 mRNA之死亡結構域(DD)的siRNA治療細胞會抑制DENN-SV含量(完全廢除)。以對抗IG20 mRNA之中間區(亦即外顯子15)的siRNA治療之細胞會經歷自發性凋亡。而且，在對抗IG20 mRNA之中間區(亦即外顯子15)的siRNA治療之後無法經歷自發性凋亡之細胞更易受TNF-α所誘導之凋亡的影響。
可作出的結論是，為了降低細胞複製，希望選擇siRNA以下調DENN-SV表現，尤其在不影響IG20剪接變體(其為正常的細胞功能所必要的IG20剪接變體，特別為神經元功能及生存(KIAA0358及IG20-SV4剪接變體)所必要的IG20剪接變體)的表現下。
而且，與在許多例子中證明致命的先前技術之寡去氧核苷酸序列對比，將'637專利的研究列入考量的寡去氧核苷酸可被最優化以結合在不同的同型異構體中差別地表現的特別外顯子。使用此等工程化之寡去氧核苷酸的減弱可以僅減弱那些其中表現特別靶向外顯子之同型異構體，容許意欲之同型異構體的選擇性減弱及降低與關鍵性同型異構體的減弱相關聯的非意欲之負面效果。
含Map激酶活化死亡结構域(MADD)之蛋白(IG20 基因之MADD剪接變體的產物)為癌細胞生存不可或缺的。MADD係以遠遠較高的水平表現在癌細胞及組織中(相對於正常的對應物)。已顯示MADD與死亡受體-4(DR4)及死亡受體-5(DR5)結合且於甲狀腺癌、卵巢癌和子宮頸癌細胞系中賦予對TRAIL所誘導之凋亡的抗性(Mulherkar N, Prasad KV, Prabhakar BS, MADD/DENN splice variant of theIG20 gene is a negative regulator of caspase-8 activation. Knockdown enhances TRAIL-induced apoptosis of cancer cells, J Biol Chem 282：11715-11721 (2007)；Subramanian M, Pilli T, Bhattacharya P, Pacini F, Nikiforov YE, et al., Knockdown ofIG20 gene expression renders thyroid cancer cells susceptible to apoptosis, J Clin Endocrinol Metab 94：1467-1471 (2009)；Prabhakar BS, Mulherkar N, Prasad KV, Role of IG20 splice variants in TRAIL resistance,. Clin Cancer Res 14：347-351 (2008)；Li LC, Jayaram S, Ganesh L, Qian L, Rotmensch J, et al., Knockdown of MADD and c-FLIP overcomes resistance to TRAIL-induced apoptosis in ovarian cancer cells, Am J Obstet Gynecol 205：362 e312-325 (2011))。
MADD而非其他的IG20 剪接變體之廢除可使得癌細胞更易受自發性以及TRAIL(腫瘤壞死因子相關性誘導配體)所誘導之凋亡影響。在沒有MADD之細胞中的自發性凋亡以及TRAIL所誘導之凋亡係可藉由CrmA或顯性負FADD(dominant-negative FADD)的表現而抑制，從而示意內源性MADD可干擾半胱天冬酶-8(caspase-8)活化。再者，頃發現MADD可直接與死亡受體，但不與半胱天冬酶-8或FADD交互作用，但仍然抑制半胱天冬酶-8活化。已顯示MADD干擾FADD募集至死亡受體之細胞質結構域(Mulherkar N, Prasad K and Prabhakar B, MADD/DENN Splice Variant of the IG20 Gene is a Negative Regulator of Caspase-8 Activation, Journal of Biological Chemistry, Vol. 282, no. 16, 11715-11721 (2007)。這證實MADD在控制癌細胞生存/死亡及對TRAIL所誘導之凋亡賦予抗性的重要性。
ERK(細胞外訊號相關性激酶)途徑為癌症化學療法之藥物標靶，因為在所有人類癌症中約三分之一有哺乳動物有絲分裂原活化之蛋白激酶(MAPK)途徑的失調，引起ERK活化。MAPK為絲胺酸/蘇胺酸專一性蛋白激酶，其回應細胞外刺激(有絲分裂原)且調控細胞恆定所需的許多重要及關鍵的細胞功能，像是代謝、細胞週期進程、細胞激素的表現、運動(motility)及黏附。因此，MAPK影響細胞生存、增生、分化、發展及凋亡。細胞外刺激(諸如細胞激素、生長因子及環境應力)引起由MAPK所構成之傳訊級聯的相繼活化。
當活化時，ERK1/2使涉及眾多細胞過程的數種核及細胞質受質磷酸化，包括轉錄因子、傳訊蛋白、激酶和磷酸酶、細胞支架蛋白、凋亡蛋白及蛋白酶。儘管ERK途徑可由許多細胞外訊號活化，但是藉此使細胞激素及生長因子活化ERK傳訊的途徑與癌症特別相關。例如，TNF-α(富集在腫瘤基質中的細胞激素)係與存在於癌細胞上的TNF受體1(TNFR1)結合且有效地活化ERK MAPK。在MADD不存在下，此促生存傳訊途徑可能轉換成凋亡傳訊途徑，引起癌細胞死亡(Kurada BRVVSN, Li LC, Mulherkar N, Subramanian M, Prasad KV, Prabhakar BS, MADD, a Splice Variant ofIG20 , is Indispensable for MAPK Activation and Protection against Apoptosis upon Tumor Necrosis Factor-α Treatment, (2009), Journal of Biological Chemistry 284：13533-13541)。
外因性誘導細胞死亡傳訊途徑可在死亡配體(例如TRAIL)與其同源死亡受體結合時開始。死亡受體經歷三聚合反應且募集FADD，導致後續的半胱天冬酶-8活化，接著劊子手(executioner)半胱天冬酶-3活化，引起凋亡。TRAIL正常係與癌細胞上的死亡受體-4(DR4)及死亡受體-5(DR5)結合，導致死亡受體(DR)寡聚合及後續FADD與半胱天冬酶原-8募集至DR(Bodmer JL, Holler N, Reynard S, Vinciguerra P, Schneider P, et al., TRAIL receptor-2 signals apoptosis through FADD and caspase-8, Nat Cell Biol 2：241-243 (2000)；Sprick MR, Weigand MA, Rieser E, Rauch CT, Juo P, et al., FADD/MORT1 and caspase-8 are recruited to TRAIL receptors 1 and 2 and are essential for apoptosis mediated by TRAIL receptor 2, Immunity 12：599-609 (2000)；Kischkel FC, Lawrence DA, Chuntharapai A, Schow P, Kim KJ, et al., Apo2L/TRAIL-dependent recruitment of endogenous FADD and caspase-8 to death receptors 4 and 5, Immunity 12：611-620 (2000))。半胱天冬酶原-8(procaspase-8)接著經歷鄰近誘導之切割(proximity induced cleavage)及活化以形成半胱天冬酶-8，其接著活化劊子手半胱天冬酶-3，其造成凋亡性細胞死亡。然而，在其中MADD過度表現之癌細胞中，MADD係與DR4及DR5結合且阻止FADD募集至DR。在MADD下調時，FADD更輕易地募集至DR，導致提高的凋亡(Mulherkar N, Prasad KV, Prabhakar BS, MADD/DENN splice variant of theIG20 gene is a negative regulator of caspase-8 activation. Knockdown enhances TRAIL-induced apoptosis of cancer cells, J Biol Chem 282：11715-11721 (2007)；Mulherkar N, Ramaswamy M, Mordi DC, Prabhakar BS, MADD/DENN splice variant of theIG20 gene is necessary and sufficient for cancer cell survival, Oncogene 25：6252-6261 (2006))。
TRAIL的獨特性在於其通常對正常的細胞或組織沒有負面效果((Keane MM, Ettenberg SA, Nau MM, Russell EK, Lipkowitz S, Chemotherapy augments TRAIL-induced apoptosis in breast cell lines, Cancer Res 59：734-741 (1999))。然而，由於不同的抗凋亡蛋白的干擾，導致化學療法的發展及TRAIL抗性仍是重大的挑戰。MADD為一種這樣的抗凋亡蛋白，其證實在使得癌細胞易受細胞死亡影響方面，MADD下調的有用性(Mulherkar N, Ramaswamy M, Mordi DC, Prabhakar BS, MADD/DENN splice variant of the IG20 gene is necessary and sufficient for cancer cell survival, Oncogene 25：6252-6261 (2006))。
取決於MADD之磷酸化(藉由Akt)，其可具有調控凋亡的雙重功能。腫瘤抑制劑PTEN(在染色體10上缺失了磷酸酶與張力蛋白同源物(tensin homolog))為負向調控磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K)-Akt傳訊途徑之脂質磷酸酶。當MADD之磷酸化以PTEM弱化時，則MADD可充當促凋亡因子以開始凋亡(Jayarama S, Li L, Ganesh L, Mardi D, Kanteti P, Hay N, Li P, and Prabhakar BS, J Cell Biochem. 2014, 115(2)：261-270)。TRAIL誘導PTEN之上調與伴隨降低的MADD磷酸化。PTEN之下調干擾TRAIL所誘導之pMADD含量降低。非磷酸化之MADD係自質膜易位至細胞質，其在此與14-3-3蛋白結合且置換與14-3-3締合之Bax，該Bax易位至粒腺體，導致細胞色素-c釋放。這些合在一起，吾人可作出的結論是藉由阻止以Akt將MADD磷酸化，PTEN可傳達死亡訊號。
外因性凋亡途徑可藉由磷酸化之MADD廢除。內源性MADD係在三個高度保守位點上以Akt磷酸化，且僅磷酸化之MADD可與TRAIL受體DR4直接交互作用，從而防止FADD募集。然而，在易受TRAIL處理影響的細胞中，TRAIL誘導MADD磷酸化水平降低，導致MADD自DR4解離及FADD與DR4締合，其容許死亡誘導傳訊複合體(DISC)形成，引起凋亡(Li P, Jayarama S, Ganesh L, Mordi D, Carr R, Kanteti P, Hay N, and Prabhakar BS, J Biol Chem. 2010 July 16；285(29)：22713-22722)。因此，MADD之促生存功能係取決於其之磷酸化(藉由Akt)。因為Akt在大多數癌細胞中為活性且磷酸化之MADD對TRAIL所誘導之凋亡賦予抗性，所以共同靶向Akt-MADD軸有可能增加涉及DR4/5結合之治療劑的效能，包括基於TRAIL之療法。
當死亡訊號誘導粒腺體促凋亡蛋白諸如細胞色素-c(Li P, Nijhawan D, Budihardjo I, Srinivasula SM, Ahmad M, Alnemri ES, Wang X. Cell, 1997；91(4)：479-489)、粒腺體凋亡誘導因子(Susin SA, Lorenzo HK, Zamzami N, Marzo I, Snow BE, Brothers GM, Mangion J, Jacotot E, Costantini P, Loeffler M, Larochette N, Goodlett DR, Aebersold R, Siderovski DP, Penninger JM, Kroemer G. Nature. 1999；397(6718)：441-446) and Smac/Diablo (Du C, Fang M, Li Y, Li L, Wang X. Cell. 2000；102(1)：33-42；Verhagen AM, Ekert PG, Pakusch M, Silke J, Connolly LM, Reid GE, Moritz RL, Simpson RJ, Vaux DL. Cell. 2000；102(1)：43-53)釋放時，則開始內因性凋亡途徑。細胞色素-c與Apaf-1及半胱天冬酶原-9形成複合體，導致半胱天冬酶-9活化。Smac/Diablo可與凋亡蛋白(IAP)抑制劑締合及抵制彼等之半胱天冬酶抑制效果。內因性途徑係以Bcl-2家族成員調控。例如，回應促凋亡刺激，細胞溶質Bax及Bad易位至粒腺體以使粒腺體外膜可通透，引起細胞色素c釋放至細胞溶質中。相反地，Bcl-2及Bcl-xL可與Bax及Bad締合，從而阻止它們誘導死亡(Antignani A, Youle RJ. Curr Opin Cell Biol. 2006；18(6)：685-689)。有趣地，非磷酸化之MADD係自質膜易位至細胞質，其在此與14-3-3結合且置換與14-3-3締合之Bax，該Bax易位至粒腺體，導致細胞色素-c釋放(Jayarama S, Li L, Ganesh L, Mardi D, Kanteti P, Hay N, Li P, and Prabhakar BS, J Cell Biochem. 2014, 115(2)：261-270)。
MADD cDNA序列可在GenBank數據庫以存取號：NM_130470取得且在本文以SEQ ID NO：11之核苷酸序列及SEQ ID NO：12之多肽序列代表。設計下調MADD之干擾RNA(包括siRNA、shRNA及反義寡核苷酸)以靶向IG20 基因之剪接變體的外顯子13L之核酸序列，且包括MADD的任何對偶基因變體和天然生成突變體，及出現在可於特定的群體部分中發現之MADD剪接變體中的多型性。換言之，高度相似(例如以胺基酸水平約95%及以核酸水平約75%)及代表在MADD剪接變體中的天然生成變異之序列係在本發明之範圍內，其中本文所揭示之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸能夠下調此等序列的表現。MADD剪接變體的外顯子13L可包含以SEQ ID NO：11之核苷酸2699至2827代表的核苷酸序列。亦可下調與本文所揭示之MADD序列具有以核酸水平約80%或90%或95%相似性的核酸序列。產生包含與IG20 基因之MADD剪接變體的外顯子13L之核酸序列及/或MADD剪接變體的外顯子13L之mRNA轉錄本互補的核酸序列，以及可出現在外顯子13L標靶區內的核酸變異之siRNA及shRNA的核酸序列係在本發明之範圍內。而且，包含與IG20 基因之MADD剪接變體的外顯子13L之核酸序列及/或MADD剪接變體的外顯子13L之mRNA轉錄本互補的核酸序列，以及可出現在外顯子13L標靶區內的核酸變異之反義寡核苷酸係在本發明之範圍內。
已顯示用於專一性下調IG20 基因之剪接變體的表現之方法包括：(a)獲得能夠下調MADD表現之核酸分子，其中核酸分子或其轉錄產物能夠選擇性結合mRNA分子，mRNA分子其包括IG20 基因之MADD剪接變體的核酸序列；及(b)將表現IG20 基因之MADD剪接變體的細胞與核酸分子接觸，其中核酸分子下調MADD剪接變體的表現。在細胞質中，選自siRNA、表現之shRNA及反義寡核苷酸之核酸結合標靶外顯子13L mRNA及引起標靶13L mRNA降解，其下調MADD剪接變體的表現。
具體地，已顯示下調MADD表現為實質性下調，例如超過90%或95%之內源性MADD表現降低。事實上，希望下調例如至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，及至少80%之內源性MADD表現。
選擇性下調IG20 基因之剪接變體(其中剪接變體為MADD)的表現的經分離之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸揭示於美國專利案號7,910,723中。該專利描述選擇性下調IG20 基因之剪接變體中之一或多者的〝剪接變體專一性〞核酸分子之發展及彼等在癌細胞生存中的相對重要性。並非所有的癌細胞皆表現所有的IG20 剪接變體且一些僅表現MADD及DENN剪接變體。使用表現四種已知的剪接變體或僅表現MADD及DENN剪接變體之細胞及選自專一性靶向外顯子13L(來下調IG20pa和MADD)、外顯子16(來下調IG20pa和IG20-SV2)和外顯子15(外顯子15係表現在IG20 基因的所有剪接變體且因此可下調所有剪接變體的表現)之shRNA、siRNA及反義寡核苷酸之不同的核酸分子已證實對癌細胞生存之MADD的關鍵要求。儘管靶向外顯子16之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸可減弱IG20pa，但是僅靶向外顯子13L之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸可造成癌細胞死亡。這是首次表明特別是MADD可能為癌細胞生存的關鍵。顯示MADD為必要且足以使癌細胞生存的額外證據跡象係在以Mid-shRNA抗性IG20 剪接變體轉染之細胞中證實，其中在cDNA構築體(construct)的經Mid-shRNA靶向之區域中的三重密碼子之第三個鹼基被置換，該DNA取代將不會改變胺基酸序列，但使得彼等抵抗Mid-shRNA。當所有的內源性IG20 剪接變體的表現使用Mid-shRNA下調時，僅有表現MADD剪接變體之細胞可阻止細胞死亡，而其他的剪接變體不可能阻止細胞死亡。使用僅表現MADD及DENN-SV剪接變體之細胞，已顯示MADD可使用靶向外顯子13L之siRNA、shRNA或反義寡核苷酸選擇性地下調，且已顯示單獨的MADD足以使癌細胞生存且為癌細胞生存所必需的(Mulherkar, N.,et al ., Oncogene 2006；25：6252-61.)。
故，該等早期研究沒有任何一者透露IG20 基因表現的完整複雜性、剪接變體在不同組織中的差別表現、剪接變體之各者獨特的功能屬性(亦即癌細胞生存(MADD)及增生(DENN))。因此，各種剪接變體、彼等的功能表徵化及鑑定可選擇性下調剪接變體的表現之專一性核酸分子的能力之發現容許發明者發展癌症療劑而沒有非意欲的潛在負面結果。
美國專利案號7,910,723描述靶向IG20 基因的外顯子13L之核酸分子及經編碼之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸在下調MADD蛋白的表現之用途。該專利描述如何使核酸選擇可最優化以達成有效的MADD表現下調，包括選擇基本上由核苷酸序列CGGCGAATCTATGACAATC (SEQ ID NO：1)所組成之核酸分子及其轉錄產物(編碼基本上由核苷酸序列CGGCGAAUCUAUGACAAUC (SEQ ID NO：2)所組成之核酸分子)。此策略之核酸分子種類的代表包括siRNA、shRNA及反義寡核苷酸，其包含少於50%之GC核苷酸含量、朝向3’端的高AU核苷酸含量及在siRNA區域內沒有反轉的重複物，該寡核苷酸構築可跨越外顯子13L核苷酸序列之核酸分子陣列。這些經編碼之核酸分子及經編碼之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸經證實足以下調MADD剪接變體的表現。可能出現在癌症類型的亞群之一個或多者中的包括專一性SNP、對偶基因變體或突變的MADD之天然變異可以此等核酸分子靶向。
描述用於下調MADD的表現之方法，其包括：(a)獲得選擇性下調MADD表現之核酸分子，其中核酸分子能夠選擇性結合IG20基因之MADD剪接變體的mRNA分子；及(b)將表現IG20 基因之MADD剪接變體的癌細胞與核酸分子接觸，其中核酸分子下調癌細胞中之MADD剪接變體的表現。
而且，顯示出下調IG20 之MADD剪接變體、其對偶基因變異、其多型性和其基因突變的代表性核酸分子包括：siRNA、shRNA及反義核酸分子，其可包含核苷酸序列CGGCGAAUCUAUGACAAUC (SEQ ID NO：2)。siRNA可與同源反義核酸呈雙鏈體(duplex)形式，該同源反義核酸係與標靶MADD外顯子13L核苷酸序列及/或MADD外顯子13L之mRNA轉錄本互補。
IG20 基因之專一性剪接變體的下調是困難的，因為非常短的標靶序列在不同的剪接變體中有差別的表現。美國專利案號7,910,723在發明的實施態樣中解釋下調可通過使用特別設計之短髮夾RNA分子(shRNA)達成。短髮夾RNA (shRNA)包含以環圈結構連結之標靶基因的互補正義及反義序列。dsDNA可選殖至用於轉染之表現載體中，接著可轉錄以形成shRNA，shRNA被切割成siRNA，siRNA可通過RNA干擾(RNAi)而抑制基因表現。在一實施態樣中，編碼此shRNA之核酸包括下列結構： X正義 -髮夾環圈-X反義 ， 　　其中X(編碼siRNA)包括具有下列序列之核酸或基本上由具有下列序列之核酸所組成：CGGCGAATCTATGACAATC (SEQ ID NO：1)。核酸經轉錄以形成shRNA且可切割以形成siRNA，其最終可抑制MADD表現。因此，亦包括於活體外或活體內(例如於癌細胞或腫瘤內)轉錄以形成shRNA及siRNA之RNA分子。
編碼抑制MADD表現之shRNA的例示性dsDNA核酸序列可為CGGCGAATCTATGACAATCTTCAAG AGAGATTGTCATAGATTCGCCG (SEQ ID NO：3)，其中在X正義 與X反義 之間的髮夾環圈區係在序列的位置20至28。髮夾環圈區可含有任何適合的序列。關於構築shRNA載體，參見McIntyre and Fanning, Design and cloning strategies for constructing shRNA expression vectors, BMC Biotechnol. 2006；6：1(2006)，將其全文併入本文以供參考。
在一實施態樣中，雙股型RNA或dsRNA係指匹配預定的基因序列之雙股型RNA，其能夠活化降解基因之對應信使RNA轉錄本的細胞酵素。這些dsRNA包含可為短干擾RNA (siRNA)且可用於抑制基因表現的核酸分子。如本文所使用的術語"雙股型RNA"或"dsRNA"係指能夠RNA干擾("RNAi")的雙股型RNA分子，包括短干擾RNA ("siRNA")。
如本文所述之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸分子亦可包括本技術中已知的核酸修飾以提高標靶mRNA的穩定性及提高切割破壞。關於具體實施態樣的核酸分子，代表性實例可包含19個鹼基核心(base core)，其包括2或3個核苷酸突出的3'末端，諸如3'端胸腺嘧啶(TT)。突出端可扮演使RISC呈現對稱雙鏈體的結構角色。時常選擇dTdT，因為其可對核酸分子賦予核酸酶抗性。雖然如此，一些研究員仍偏好UU突出端或與真實的mRNA標靶互補的突出端。最重要的是朝向獨特的mRNA標靶之19個鹼基核心的核酸分子的身份。
siRNA、shRNA及反義寡核苷酸分子亦可從頭化學地合成。經合成之核酸分子可呈單股核酸分子的形式或可與同源反義核酸分子之呈雙鏈體的形式。siRNA、shRNA及反義寡核苷酸包含與標靶MADD外顯子13L核苷酸序列及/或MADD外顯子13L之mRNA轉錄本互補的核酸序列。
RNA干擾為在大部分真核生物中發現的保守途徑，其中雙股RNA (dsRNA)下調具有互補序列之基因的表現。長的dsRNA係被核糖核酸內切酶(endoribonuclease)切丁酶(Dicer)降解成小的效應子分子，稱作siRNA (小干擾RNA)。siRNA通常為約21個鹼基對(bp)長度，具有中心19個bp雙鏈體及2個鹼基3’-突出端(這可為TT) (Elbashir, SM, Lendeckel W and Tuschl T, RNA interference is mediated by 21-and 23-nucleotide RNAs, Genes & Development, 2001, 15：188-200。在哺乳動物中，切丁酶加工係發生在與RNA-結合蛋白TRBP的多蛋白複合體中。新生siRNA係與切丁酶、TRBP及阿爾古(Argonaute) 2 (Ago2)締合以形成RNA所誘導之靜默複合體(RISC)。一旦進入RISC，則siRNA的一股(隨從股/具有與標靶mRNA相同序列的股)被降解或丟棄，而另一股(引導股/與靶向mRNA互補的股)續留以指引靜默複合體之序列專一性。RISC之Ago2組份為核糖核酸酶，其在引導股的指引下切割標靶RNA。一旦RISC複合體活化，其可繼續靶向額外的mRNA標靶。此效果放大基因靜默且能使治療效果在快速分裂的細胞中持續3至7天。許多現今研究員使用合成的RNA雙鏈體作為彼等的RNAi試劑，其模擬自長受質RNA之切丁酶加工所生成的天然siRNA。這些合成的siRNA雙鏈體轉染至細胞系中，它們在該處模擬活體內切丁酶產物。
利用siRNA、shRNA或反義寡核苷酸調節MADD表現及/或下調MADD表現可增強傳統的癌症療法。
從化學治療劑的觀點來看，癌症化學療法於近年來已顯著地進步。已鑑定許多有效治療癌症的癌症化學治療物質。雖然如此，許多癌症化學療法仍以投予特定的化學治療劑時常遭遇的毒性副作用為特徵。
例如，已熟知許多經確立之化學治療劑的投予導致非所欲副作用，包括噁心和嘔吐、食慾不振、味覺變化、頭髮稀少或變脆弱、關節疼痛、指甲變型及手或腳趾刺痛。亦可能發生更嚴重的副作用，諸如排便困難、吞嚥困難、頭暈、呼吸急促、嚴重疲勞和胸痛。因此，有未被滿足的下列需求：對護理員提供具有各種已知的化學治療劑之化學治療潛力的優點，但沒有限制順從性和效能的非所欲副作用之治療方案。
已有投予化學治療劑(諸如紫杉烷衍生物)於治療各種形式卵巢癌、乳癌、肺癌、膀胱癌、子宮頸癌、前列腺癌、黑色素瘤、食道癌、及其他種類實體腫瘤癌症以及卡波西肉瘤而有良好程度的成功。紫杉烷衍生物可以細胞骨架藥物為其特徵，其靶向微管蛋白並於有絲分裂紡錘體組裝、染色體分離和細胞分裂上造成缺陷。與其他微管蛋白靶向藥物不同，紫杉烷衍生物穩定微管聚合物並保護其免於去組裝(disassembly)。紫杉烷衍生物通常被歸類為有絲分裂抑制劑。
紫杉烷衍生物在治療癌症中的效果可能歸因於穩定微管聚合物並因此防止去組裝的能力，這導致有絲分裂檢查點的長時間激活，此最終導致凋亡細胞死亡或逆轉細胞週期G-期而沒有細胞分裂。
代表性紫杉烷衍生物可包括紫杉醇、多西他賽、卡巴他賽、紫杉醇類似物SID 350、多西他賽乳劑ANX-514、多西他賽調配劑CKD-810、多西他賽脂質微球體、裝載多西他賽之奈米藥劑CRLX301、多西他賽-PNP、脂質體多西他賽以及本領域已知的修飾和其他相關衍生物。
而且，雖然在紫杉烷衍生物療法下預期壽命被延長，但並非沒有藥物的不希望的副作用。因此，有未被滿足的下列需求：提供將會包括投予具有不同作用機制的新類藥物，並且將導致更完全的緩解(remission)曲線而沒有不希望的副作用的治療。
本發明
本案發明人現已鑑定出投予紫杉烷衍生物之新穎方法，當紫杉烷衍生物與MADD剪接變體的下調組合投予時，會導致顯著的協同增效性效果，包括增加的效能以及降低的副作用。
由本案發明人首次構想且證實了一或多種能夠下調至少一種IG20 基因之剪接變體的表現之核酸分子(其中並非所有IG20 基因之剪切變體被下調)與傳統的化學治療劑(諸如紫杉烷衍生物)之臨床組合為治療各種形式的癌症之出乎意料的高價值性藥物治療方法。當組合投予患有癌症的個體(諸如那些患有卵巢癌、乳癌、肺癌、胰腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、前列腺癌、黑色素瘤、食管癌及其他的實質固態瘤(包括卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma))的個體)時，本案發明人證實siRNA、shRNA及反義寡核苷酸(其中siRNA、shRNA及反義寡核苷酸包含與MADD剪接變體的外顯子13L之核酸序列或與MADD剪接變體的外顯子13L之mRNA轉錄本互補的核酸序列)與化學治療劑(諸如紫杉烷衍生物)的效果具有出乎意料的益處，且至少在一段時期內得到出乎意料的優加性(superadditive)症狀減輕，以顯著降低或不存在症狀、腫瘤生長及腫瘤生存證實，且以此方式特別有益於治療多種癌症。而且，首次，至少一種siRNA、shRNA及反義寡核苷酸(其中siRNA、shRNA及反義寡核苷酸包含與MADD剪接變體的外顯子13L之核酸序列或與MADD剪接變體的外顯子13L之mRNA轉錄本互補的核酸序列)與化學治療劑(諸如紫杉烷衍生物)的組合可顯示有望提供完全緩解多種癌症以及提高的安全性及耐受性限度。 本發明之目的
本發明之目的係提供新穎組合的抗腫瘤治療，其包含投予代表性化學治療劑與能夠下調MADD剪接變體的表現之核酸分子的組合，該組合的抗腫瘤治療有效治療各種癌症；及提供包含此等組合的抗癌劑之醫藥組成物。本發明進一步的目的係提供治療各種癌症之新穎方法，其包括投予包含能夠下調MADD剪接變體的表現之核酸分子與化學治療劑(諸如紫杉烷衍生物)之組合的抗腫瘤治療。
本發明之額外目的係提供生產用於組合的抗腫瘤治療之靶向調配物及治療劑遞送程序之方法。又額外目的係於下文變得顯而易見，且又另外的目的為技術領域中具有通常知識者所顯而易見。
因此，我們相信由我們發明所包含的事物可總結於尤其是下文中：
一種有用於治療癌症的抗癌劑之組合，其包含有效量的一或多種能夠下調IG20 基因之至少一種剪接變體的表現之核酸分子，其中並非所有IG20 基因之剪切變體被下調，以及一或多種紫杉烷衍生物化學治療劑。
此組合，其中至少一種IG20 基因之剪接變體係選自MADD剪接變體、SNP、其對偶基因變異、其多型性和其基因突變。
此組合，其中至少一種IG20 基因之剪接變體為展現外顯子13L之MADD剪接變體。
此組合，其中一或多種能夠下調至少一種IG20 基因之剪切變體表現的核酸分子係選自siRNA、shRNA及反義寡核苷酸。
此組合，其中siRNA、shRNA及反義寡核苷酸包含與MADD剪切變體的外顯子13L之核酸序列、SNP、其對偶變異、其多型性、及其遺傳突變、及/或其mRNA轉錄本互補之核酸。
此組合，其中能夠下調至少一種IG20 基因之剪切變體表現的核酸分子係包含在siRNA或shRNA中。
此組合，其中siRNA及shRNA由包括下列結構的核酸分子編碼： X正義 -髮夾環圈- X反義 ， 　　其中X包括下列核酸序列或基本上由下列核酸序列所組成：CGGCGAATCTATGACAATC (SEQ ID NO：1)。
此組合，其中siRNA或shRNA包含具有CGGCGAAUCUAUGACAAUC (SEQ ID NO：2)序列之核酸。
此組合，其中siRNA或shRNA包含具有CGGCGAAUCUAUGACAAUC (SEQ ID NO：2)序列之核酸且與具有GAUUGUCAUAGAUUCGCCG (SEQ ID NO：10)序列之同源核酸呈雙鏈體(duplex)形式。
此組合，其中shRNA及siRNA由具有CGAATCTATGACAATCTTCAAGAGAGATTGTCATAGATTCGCCG (SEQ ID NO：3)序列的核酸編碼，其中髮夾環圈區為該序列的位置20-28。
此組合，其中包含與IG20 基因的MADD剪切變體的外顯子13L之核酸序列、及/或其mRNA轉錄本互補之核酸的siRNA、shRNA及反義寡核苷酸係包含具有選自GAUUGUCAUAGAUUCGCCGTT (SEQ ID NO：4)及GAUUGUCAUAGAUUCGCCG (SEQ ID NO：10)序列之核酸。
此組合，其中一或多種能夠下調至少一種IG20 基因之剪切變體表現的核酸分子係包含在藥物遞送系統中。
此組合，其中藥物遞送系統為靶向脂質體調配劑或慢病毒載體(lentivirus vector)。
此組合，其中一或多種紫杉烷衍生物化學治療劑係選自紫杉醇、多西他賽、卡巴他賽、紫杉醇類似物SID 350、多西他賽乳劑ANX-514、多西他賽調配劑CKD-810、多西他賽脂質微球體、裝載多西他賽之奈米藥劑CRLX301、多西他賽-PNP及脂質體多西他賽。
此組合，其中一或多種紫杉烷衍生物化學治療劑係呈醫藥上可接受的鹽之形式。
此組合，其中該癌症選自卵巢癌、乳癌、肺癌、子宮頸癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、黑色素瘤、食道癌、及包括卡波西肉瘤的其他實體腫瘤。
而且，一種治療有需要之個體選自卵巢癌、乳癌、肺癌、子宮頸癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、黑色素瘤、食道癌、及包括卡波西肉瘤的其他實體腫瘤的癌症之方法，該方法包含投予有效量的抗癌劑組合，該組合包含有效量的一或多種能夠下調至少一種IG20 基因之剪接變體的表現之核酸分子，其中並非所有IG20 基因之剪切變體被下調；以及一或多種紫杉烷衍生物化學治療劑。
此方法，其中癌症展現至少一種IG20 基因之剪接變體的表現。
此方法，其中癌症展現IG20 基因之MADD剪切變體、SNP、其對偶變異、其多型性、及其遺傳突變的表現。
此方法，其中MADD剪切變體展現IG20 基因之外顯子13L。
此方法，其中一或多種能夠下調至少一種IG20 基因之剪切變體表現的核酸分子係選自siRNA、shRNA及反義寡核苷酸。
此方法，其中siRNA、shRNA及反義寡核苷酸包含與IG20 基因之MADD剪切變體的外顯子13L之核酸序列、SNP、其對偶變異、其多型性、及其遺傳突變、及/或其mRNA轉錄本互補之核酸。
此方法，其中該能夠下調至少一種IG20 基因之剪切變體表現的核酸分子係包含在siRNA或shRNA中。
此方法，其中siRNA及shRNA由包括下列結構的核酸分子編碼： X正義 -髮夾環圈- X反義 ， 　　其中X包括下列核酸序列或基本上由下列核酸序列所組成：CGGCGAATCTATGACAATC (SEQ ID NO：1)。
此方法，其中siRNA及shRNA包含具有CGGCGAAUCUAUGACAAUC (SEQ ID NO：2)序列之核酸。
此方法，其中siRNA及shRNA包含具有(SEQ ID NO：2)序列之核酸且與具有GAUUGUCAUAGAUUCGCCG (SEQ ID NO：10)序列之同源核酸呈雙鏈體形式。
此方法，其中shRNA由具有CGAATCTATGA CAATCTTCAAGAGAGATTGTCATAGATTCGCCG (SEQ ID NO：3)序列的核酸編碼，其中髮夾環圈區為該序列的位置20-28。
此方法，其中包含與IG20 基因的MADD剪切變體的外顯子13L之核酸序列、及/或其mRNA轉錄本互補之核酸的siRNA、shRNA及反義寡核苷酸係包含具有選自GAUUGUCAUAGAUUCGCCGTT(SEQ ID NO：4)及 GAUUGUCAUAGAUUCGCCG (SEQ ID NO：10)序列之核酸。
此方法，其中一或多種siRNA、shRNA及反義寡核苷酸以脂質體調配劑之形式或藉由慢病毒載體轉染投予。
此方法，其中一或多種siRNA、shRNA及反義寡核苷酸以佐劑投予。
此方法，其中一或多種紫杉烷衍生物化學治療劑係選自紫杉醇、多西他賽、卡巴他賽、紫杉醇類似物SID 350、多西他賽乳劑ANX-514、多西他賽調配劑CKD-810、多西他賽脂質微球體、裝載多西他賽之奈米藥劑CRLX301、多西他賽-PNP及脂質體多西他賽。
此方法，其中一或多種紫杉烷衍生物化學治療劑係以進一步包含一或多種醫藥上可接受的稀釋劑、賦形劑或載劑之醫藥組成物之形式投予。
此方法，其中一或多種siRNA、shRNA及反義寡核苷酸係在一或多種紫杉烷衍生物化學治療劑之前投予、或係與一或多種紫杉烷衍生物化學治療劑同時投予。
此方法，其中一或多種siRNA、shRNA及反義寡核苷酸係以進一步包含一或多種醫藥上可接受的稀釋劑、賦形劑或載劑之醫藥組成物之形式投予。
此方法，其中一或多種siRNA、shRNA及反義寡核苷酸與一或多種紫杉烷衍生物化學治療劑係調配在劑量包裝(dosage pack)中並根據所選治療方案投予。
發明的組合
如上文具體描述，在一個態樣中，本發明提供有用於治療、預防、遏阻、延遲哺乳動物之選自下列癌症的至少一種症狀之發作及/或降低該症狀發展的風險或逆轉該症狀之新穎藥物組合：卵巢癌、乳癌、肺癌、胰腺癌、膀胱癌、子宮頸癌、前列腺癌、黑色素瘤、食管癌及其他的實質固態瘤(包括卡波西氏肉瘤)，其包含對該哺乳動物投予能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及/或反義寡核苷酸的量(其中剪接變體為MADD、SNP、其對偶基因變異、其多型性和其基因突變，且其中並非所有IG20 基因之剪切變體被下調)，以及當組合投予時提供有益效果之治療有效劑量的紫杉烷化學治療劑。定義
應用於活性成分之術語“組合”在本文用於定義包含本發明之藥物二者(亦即一或多種能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸，其中並非所有IG20 基因之的剪接變體被下調，以及一或多種紫杉烷化學治療劑)的單一醫藥組成物(調配物)或聯合地(conjointly)投予或以預治療/治療方案投予之兩種分開的醫藥組成物(調配物)，各包含本發明之單一藥物(亦即一或多種能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸，其中並非所有IG20 基因之的剪接變體被下調，以及一或多種紫杉烷化學治療劑)。
在本發明之意義範圍內，術語“聯合投予”係用於意指於一種組成物中同時地或於不同組成物中同時地，或於不同組成物中相繼地投予一或多種能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸，其中並非所有IG20基因之的剪接變體被下調，以及一或多種紫杉烷化學治療劑。然而，關於被認為“聯合”的相繼投予，一或多種能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸(其中並非所有IG20基因之的剪接變體被下調)以及一或多種紫杉烷化學治療劑的投予必須以時間間隔分開投予，該時間間隔仍允許得到用於治療、預防、遏阻、延遲哺乳動物的癌症發作及/或降低癌症發展的風險之聯合治療的有益效果。例如，一或多種能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸(其中並非所有IG20基因之的剪接變體被下調)以及一或多種紫杉烷化學治療劑可相繼投予。例如，siRNA可在投予紫杉烷化學治療劑之前8至72小時(hr)投予，以便在以化學治療劑治療之前具有下調的MADD表現。
根據本發明的又另一實施態樣，一或多種能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸係用作為佐劑。在本發明的背景下，"佐劑"係指特定的紫杉烷化學治療劑回應之增強劑。"使用一或多種能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸"意指在化學治療劑之前將一或多種能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸包括在預治療中，或包括與化學治療劑組合的一或多種能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸而用於同時遞送。佐劑(諸如與化學治療劑組合的一或多種能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸)提供協同增效性細胞死亡。
因此，在本發明進一步的實施態樣中，將一或多種能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸投予到展現癌症的哺乳動物(包括人類)中，活化癌細胞的死亡。一或多種能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸以及一或多種化學治療劑亦可用於在增加對腫瘤發展之易受影響性的情況下，諸如在患者緩解的例子中，支持凋亡途徑。
術語“治療”在本文係用於意指減輕或緩和個體的疾病之至少一種症狀。例如，與癌症有關的術語“治療”可意指減輕或緩和與癌症相關聯的腫瘤生長或症狀及/或造成腫瘤消退。在本發明之意義範圍內，術語“治療”亦可表示遏阻、延遲發作(亦即在疾病的臨床表現之前的時期)及/或降低疾病發展或惡化的風險。術語"防護(protect)"在本文係用於意指預防、延遲或治療或全然(當適當時)防護個體疾病的發展或持續或加重。在本發明之意義範圍內，癌症係與臨床表現相關聯，包括但不限於藥物所誘導的非所欲副作用。例如，如本文所揭示，一或多種能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸以及紫杉烷化學治療劑的預防性投予(prophylactic administration)可防護收受個體發展癌症的風險(例如具有升高之CA125水平的個體、展現組織病理學癌症標誌物的個體；亦參考在用於各種癌症之標準篩選的腫瘤學文獻中所述之基因篩選及臨床分析)。同樣地，根據本發明，一或多種能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸以及紫杉烷化學治療劑的治療性投予可引起臨床症狀的發展緩降或甚至症狀消退。
術語短干擾RNA (siRNA)係指能夠干擾特定基因的轉錄，從而靜默標靶蛋白的基因表現之RNA分子。此程序的代表性機制可包含投予包含與MADD剪接變體mRNA轉錄本的外顯子13L之核酸序列互補的siRNA、dsRNA、短髮夾RNA (shRNA)及/或反義寡核苷酸之核酸分子。dsRNA及短髮夾RNA係以核糖核酸內切酶切丁酶(其將dsRNA或shRNA切斷成構成分siRN)切割。siRNA係通過RNA所誘導之靜默複合體或RISC的形成而起作用。RISC複合體鬆解(unwind) siRNA以形成單股siRNA。包含單股siRNA之RISC結合標靶mRNA，切割mRNA，使其無法被識別且從而靜默意欲蛋白之生產。
在本發明之意義範圍內，術語“能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸”係用於意指靶向信使RNA之藥物。本發明之能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸的實施態樣可為siRNA衍生物，諸如經修飾之siRNA、shRNA及/或反義寡核苷酸，其包含與MADD剪接變體之mRNA轉錄本的外顯子13L的核酸序列互補的核酸。特別的實施態樣包括那些在美國專利案號7,910,723中所述之物質。
能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸的設計可通過已確立之技術完成。用於靶向MADD mRNA轉錄本之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸係自Dharmacon (Lafayette, Colo.)獲得。最適合的序列係基於少於50%之GC核苷酸含量、朝向3’端的高AU核苷酸含量及在siRNA區域內沒有反轉的重複物分類出(sorted out) (Reynolds et al. (2004), Nat Biotechnol, 22(3), 326-30)。
反義寡核苷酸係指藉助於RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-PNA(肽核酸)交互作用的手段與標靶mRNA結合及改變標靶mRNA的活性之核酸分子。反義分子通常與沿著反義分子的單一毗連序列與標靶序列互補。
在另一實施態樣中，反義DNA可藉助於DNA-RNA交互作用的手段而用於靶向RNA，從而活化RNase H，RNase H分解在雙鏈體中的標靶RNA。反義寡核苷酸可包含一或多個RNAse H活化區域，活化區域能夠活化標靶RNA之RNAse H切割。反義DNA可化學地合成或經由使用單股DNA表現載體或其同等物表現。
在另一態樣中，與標靶RNA分子交互作用且下調MADD活性之核酸分子或反義分子係自插入到DNA或RNA載體中之轉錄單元表現。重組載體可為DNA質體或病毒載體。酶促核酸分子或反義表現病毒載體可基於腺相關病毒、反轉錄病毒、腺病毒或α 病毒(alphavirus)構築。在一實施態樣中，能夠表現核酸分子的重組載體係如本文所述方式遞送，且持續在標靶細胞中。替代地，病毒載體可用於提供shRNA/siRNA/反義核酸分子的瞬間表現。此等載體可在必要時重複投予。在表現之後，干擾核酸分子與標靶RNA結合且下調其功能或表現。核酸分子或反義表現載體的遞送可為全身性，諸如藉由靜脈內或肌肉內投予、藉由投予到自患者或個體移植之標靶細胞，繼而再引入患者或個體中、或藉由能容許引入到所欲標靶細胞中的任何其他手段。反義DNA亦可經由使用單股DNA細胞內表現載體表現。
基於MADD剪接變體的外顯子13L之核苷酸序列，據而設計siRNA及shRNA核酸分子及反義寡核苷酸。MADD剪接變體的外顯子13L展現諸如定義如SEQ ID NO：11之核苷酸2699至2827的核苷酸序列。siRNA、shRNA及反義寡核苷酸包含具有專一性靶向MADD剪接變體的外顯子13L之19個鹼基核心的寡核苷酸。技術領域中具有通常知識者可構築siRNA、shRNA及反義寡核苷酸，其包含少於50%之GC核苷酸含量、朝向3’端的高AU核苷酸含量及沒有反轉的重複物，該等寡核苷酸構築可跨越外顯子13L 核苷酸序列之寡核苷酸陣列。siRNA、shRNA及反義寡核苷酸可進一步包含2或3個核苷酸突出的3'末端(諸如端TT)以提高標靶mRNA之切割破壞。時常選擇dTdT，因為其可對寡核苷酸的核酸酶賦予抗性。而且，UU突出端(overhang)或與真實的mRNA標靶互補的突出端可添加至寡核苷酸的19個鹼基核心。
在一實施態樣中，siRNA、shRNA及反義寡核苷酸包含具有GAUUGUCAUAGAUUCGCCGTT (SEQ ID NO：4)序列之核酸。siRNA及shRNA可呈雙鏈體形式。
在一實施態樣中，能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸(其中並非所有IG20基因之的剪接變體被下調)包含具有GAUUGUCAUAGAUUCGCCG (SEQ ID NO：10)序列之核酸。siRNA或shRNA可呈雙鏈體形式。
在一實施態樣中，能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸(其中並非所有IG20基因之的剪接變體被下調)基本上由具有GAUUGUCAUAGAUUCGCCG (SEQ ID NO：10)序列之核酸所組成。siRNA或shRNA可呈雙鏈體形式。
能夠下調IG20 基因之至少一種剪接變體的表現之反義寡核苷酸(其中並非所有的剪接變體被下調)可為單股核酸分子，其展現與MADD剪接變體的外顯子13L之核酸序列或其部分及/或其mRNA轉錄本互補的核酸序列。單股核酸分子可呈RNA或DNA形式。在一實施態樣中，反義寡核苷酸包含GAUUGUCAUAGAUUCGCCG (SEQ ID NO：10)序列。
在本文所使用的術語紫杉烷化學治療劑係指展現抗癌化學治療效果之藥物。該術語涵蓋紫杉烷家族化學治療劑以及其它能夠靶向微管蛋白的細胞骨架化學治療劑。在一實施態樣中，有用於本發明之方法與組成物之紫杉烷化學治療劑係細胞骨架靶向化學治療劑且係有絲分裂抑制劑。有用於本發明之方法與組成物之紫杉烷家族化學治療劑的具體實例包括但不限於紫杉醇。白蛋白結合(Albumin-bound)紫杉醇 (商品名稱Abraxane® ，也稱作nab-paclitaxel)。Abraxane® ，其中紫杉醇結合到白蛋白作為常用毒性溶劑遞送方法的替代遞送劑。合成之紫杉醇，多西他賽。多西他賽與紫杉醇有類似的臨床用途，並以Taxotere® 名稱銷售。額外形式包括卡巴他賽、紫杉醇類似物SID 350、多西他賽乳劑ANX-514、多西他賽調配劑CKD-810、多西他賽脂質微球體、裝載多西他賽之奈米藥劑CRLX301、多西他賽-PNP、脂質體多西他賽，以及本領域已知的其他修飾和相關衍生物。
在本文以傳統醫藥意義使用的術語“類似物”或“衍生物”係指在結構上相似於參考分子(諸如紫杉烷化學治療劑)，但是已以靶向及控制方式以替代的取代基置換參考分子的一或多個特定的取代基而予以修飾之分子，從而產生在結構上類似於參考分子之分子。用於鑑定可能具有改進或偏倚特性(諸如在特定的靶向型受體類型上較高的效力及/或選擇性、更大的穿透哺乳動物血腦障壁能力、較少的副作用等)的已知化合物之輕度修飾版本的類似物之合成及篩選(例如使用結構及/或生物化學分析)為醫藥化學中熟知的藥物設計方法。
可使用本文所列示之藥物的各種鹽類及異構物(包括立體異構物及鏡像異構物)。術語"鹽類"可包括醫藥上可接受之自由酸或自由鹼之加成鹽類。可用以形成醫藥上可接受之酸加成鹽類的酸類之實例包括無機酸，諸如鹽酸、硫酸或磷酸，及有機酸，諸如乙酸、順丁烯二酸、琥珀酸、檸檬酸等。所有的這些鹽類(或其他類似的鹽類)可以傳統的手段製備。鹽或異構物的本性並不重要，其先決條件是其為無毒性且不顯著地干擾所欲藥理活性。
應用於劑量或量之術語“治療有效的”係指在投予有需要的哺乳動物時足以得到所欲活性之化合物或醫藥組成物的量。如本文關於包含能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸以及紫杉烷化學治療劑之醫藥組成物所使用的術語“治療有效量/劑量”係與術語“化學治療有效量/劑量”可交換使用且係指在投予哺乳動物時足以產生有效的化學治療回應之化合物或醫藥組成物的量/劑量。應注意當投予活性成分的組合時，則組合的有效量可能包括或可能不包括個別治療有效的各成分的量。
述及活性成分量的術語“次閾值”意指不足以產生回應的量，亦即低於最小有效量的量。在相同的背景下，術語“次最優”意指產生回應但不及其最大程度的活性成分量，該最大程度能以較高的量達成。此方法在其中所述之組合療法提供投予“次閾值”量之例如紫杉烷化學治療劑的本發明背景下特別令人關注，其中該投予不然會是“次閾值”，但是通過與能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸組合提供具有緩和與紫杉烷化學治療劑相關聯的非所欲副作用之不然會是完全有效的治療。
當與本發明之組合療法一起使用時，短語"協同增效效果(synergistic effect) "、"協同增效性(synergistic) "、"協同增效性(synergy) "、"協同增效作用(synergism)"係指二或更多種刺激當組合時的合作行為產生比每個單獨的刺激貢獻之效果的總和更大的效果，亦即超過相加效果。刺激例如可為下調MADD的表現之劑及至少一種治療劑。
當與本發明之組合療法一起使用時，短語"醫藥上可接受"係指當投予哺乳動物(例如人類)時身體可耐受且通常不產生不利的反應之分子實體及此等組成物的其他成分。在一實施態樣中，如本文所使用的術語〝"醫藥上可接受"意指經聯邦或州政府管理局核准或在美國藥典或其他公認的藥典中所列示供哺乳動物及更特別地供人類使用。
應用於本發明之醫藥組成物的術語"載劑"係指與活性化合物(例如能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸以及紫杉烷化學治療劑)一起投予的稀釋劑、賦形劑或媒劑。此等醫藥載劑可為無菌液體，諸如水、食鹽水溶液、水性葡萄糖溶液、水性甘油溶液及油，包括石油、動物、植物或合成來源的那些油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及類似者。此外，適合的載劑可包含脂質體調配物。適合的醫藥載劑亦可於E.W. Martin的第18版之"Remington's Pharmaceutical Sciences"中描述。
如本文所使用的術語"個體"係指哺乳動物(例如囓齒類，諸如小鼠或大鼠)。該術語特別係指人類。
術語"約"或"大約"通常意指在距給定值或範圍的20%之內，10%之內，及隨意地5%之內。替代地，尤其在生物系統中，術語"約"意指在距給定值的約對數之內(亦即數量級)，隨意地在距給定值的兩倍之內。
術語"由…所組成"係排除未在申請專利範圍內明確描述之任何元素、步驟或成分(在re Gray, 53 F.2d 520, 11 USPQ 255 (CCPA 1931)中)。術語"基本上由…所組成"係將申請專利範圍的範疇限成所主張之發明的明確描述之材料或步驟"及不實質地影響基本及新穎特性的那些" (在re Herz, 537 F.2d 549, 551-52, 190 USPQ 461, 463 (CCPA 1976)(於原著中強調)中)。醫藥組成物
與本發明之方法一起，亦提供醫藥組成物，其包含治療有效量的能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸及/或治療有效量的紫杉烷化學治療劑，以及隨意地，額外的載劑或賦形劑(全部皆為醫藥上可接受)。能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之該等siRNA、shRNA及反義寡核苷酸以及紫杉烷化學治療劑可調配成單一組成物或可聯合投予之兩種分開的組成物。在一實施態樣中，它們係調配成單一組成物或隨意地相繼或同時投予之單獨的兩種組成物。可調配用於一天投予一次或一天投予兩次，以及在各自之療法中典型的劑量方案之組成物。
在進一步的實施態樣中，可調配本組合，使得它們可以以滴定方案投予，而使得患者可適應紫杉烷化學治療劑的效果及/或臨床醫師可向上滴定能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸，以致於紫杉烷化學治療劑可向下滴定至顯著較低的劑量，以致紫杉烷化學治療劑的毒性副作用減至最低及/或調和與紫杉烷化學治療劑相關聯的給藥難度。
在所揭示之組成物中，能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸以及紫杉烷化學治療劑二者隨意地以治療有效量存在。最優的治療有效量應考慮實際的投予模式、投予之藥物形式、投予針對的適應症、所涉及的個體(例如體重、健康、年齡、性別等)及負責的醫師或獸醫師的偏好和經驗而憑實驗判定。如本文所揭示，用於人類投予的能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸以及紫杉烷化學治療劑二者係以適合的形式以本技術領域理解的那些劑量範圍投予。在一實施態樣中，能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸係以治療劑量投予；紫杉烷家族化學治療劑係以次最優或降低的劑量投予。在某些例子中，亦可能希望以次最優或次閾值量投予活性成分的一者或另一者，且此等投予亦可在本發明之範圍內。
本發明亦提供製備醫藥組成物之方法，其包含摻合治療有效量的能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸以及紫杉烷化學治療劑，以及隨意之一或多種生理上可接受的載劑及/或賦形劑及/或輔助物質。投予
本發明之活性劑可呈含有傳統無毒性醫藥上可接受之載劑與或不與能選擇性遞送活性劑至特定的細胞類型或組織之靶向分子的單位劑量調配物經皮內、非經腸、鼻內或腫瘤內投予。皮內投予可包含使用透皮貼片、微研磨劑或奈米乳液。非經腸投予之藥可呈注射、時間控制釋放媒劑(包括擴散控制系統)、滲透裝置、溶解控制基質及可溶蝕/可降解的基質形式投予。
對於以錠劑或膠囊形式經口投予來說，活性藥物組份可與無毒的醫藥上可接受之賦形劑組合，諸如結合劑(例如預糊化玉米澱粉、聚乙烯基吡咯啶酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇及其他還原和非還原糖、微晶纖維素、硫酸鈣或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石或矽石、硬脂酸、硬脂基反丁烯二酸鈉、甘油二十二酸酯(glyceryl behenate)、硬脂酸鈣及類似者)；崩解劑(例如馬鈴薯澱粉或乙醇酸澱粉鈉)；或潤濕劑(例如月桂基硫酸鈉)、著色和調味劑、明膠、甜味劑、天然和合成膠(諸如阿拉伯膠、黃蓍膠或藻酸鹽)、緩衝鹽、羧甲基纖維素、聚乙二醇、蠟及類似者。對於以液體形式經口投予來說，藥物組份可與無毒的醫藥上可接受之惰性載劑(例如乙醇、甘油、水)、懸浮劑(例如山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化可食性脂肪)、乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯膠)、非水性媒劑(例如杏仁油、油性酯(oily ester)、乙醇或分餾植物油)、保存劑(例如對-羥基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)及類似者。亦可添加穩定劑以穩定劑型，諸如抗氧化劑(BHA、BHT、五倍子酸丙酯、抗壞血酸鈉、檸檬酸)。
錠劑可以本技術領域已知的方法包膜。本發明之組成物亦可引入到例如從聚乙醇酸/乳酸(PGLA)所製造之微球或微膠囊中(參見例如美國專利案號5,814,344、5,100,669和4,849,222；PCT公開案號WO95/11010和WO93/07861)。用於經口投予之液體製劑可呈例如溶液、糖漿、乳液或懸浮液的形式，或它們可以在使用前採乾產物(用於以水或其他適合的媒劑重構)呈現。用於經口投予之製劑可適當地調配以給出經控制或延後釋放之活性化合物。
在本技術領域中已知的藥物遞送系統為靶向遞送及/或控制釋放治療劑之專業技術。
藥物遞送系統係通過可控制療法的投予之介質而使藥完好地部署至專一性靶向之身體部分。此等藥物遞送系統可包括微技術及奈米技術。
選自與IG20 基因mRNA轉錄本之MADD剪接變體的核苷酸序列互補的siRNA、shRNA及反義寡核苷酸之能夠下調至少一種IG20 基因之剪接變體的表現之核酸分子可併入到本技術領域中已知且可包括聚合物微球、聚合物微胞及水凝膠型材料的藥物遞送系統，在本技術領域中瞭解該藥物遞送系統有效提高藥物靶向專一性、降低全身毒性、改善治療吸收速率及提供醫藥品免於生物降解的防護。另外，設想了許多其他的藥物遞送系統，包括生物可降解聚合物、樹狀聚合物(亦稱作星狀聚合物)、電活性聚合物及經修飾之C-60富勒烯(亦稱作“巴克球(buckyball) ”)。
而且，藥物遞送系統可包括編碼能夠下調至少一種IG20 基因之剪接變體的表現之核酸分子的核酸之慢病毒介導之轉導，該核酸分子係選自與IG20 基因mRNA轉錄本之MADD剪接變體的核苷酸序列互補的siRNA、shRNA及反義寡核苷酸。
活性藥物亦可以脂質體遞送系統的形式投予，諸如單層小微脂粒、單層大微脂粒及多層微脂粒。脂質體可自各種熟知的磷脂形成，諸如膽固醇、硬脂胺或磷脂醯膽鹼，這是眾所周知的。
能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸可採靶向脂質體調配物的形式結合。代表性組裝體可包括囊封在自組裝之工程化蛋白內，其提供此等寡核苷酸有效的包裝、結合、組裝及遞送。此等工程化蛋白之構成分可選自通過附著於選定之細胞表面受體主動靶向腫瘤細胞的肽、促進受體介導之胞飲作用的肽及提供運送之寡核苷酸主動釋放的肽。此等自組裝之蛋白運送分子(包括本發明之寡核苷酸)可用包含下列兩種組份的奈米粒子(＜50奈米)形式組裝：工程化多肽(靶向肽、膜穿透鈦、寡核苷酸捕獲肽)及寡核苷酸治療酬載。
本發明之藥物亦可藉由使用單株抗體作為化合物分子偶合至其上之個別載劑遞送。活性藥物亦可與作為可靶向的藥物載劑之可溶性聚合物偶合。此等聚合物可包括聚乙烯基吡咯啶酮、吡喃共聚物、聚羥基-丙基甲基丙醯胺-酚(polyhydroxy-propyl methacrylamide-phenol)、聚羥基-乙基天門冬醯胺-酚(polyhydroxy-ethyl-aspartamide-phenol)或經棕櫚醯基殘基取代之聚環氧乙烷-聚離胺酸。此外，活性藥物可與有用於達成控制藥物釋放之生物可降解的聚合物類別偶合，例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸與聚乙醇酸之共聚物、聚ε己內酯、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚縮醛、聚氫化吡喃、聚氰基丙烯酸酯及水凝膠之交聯或兩親性嵌段共聚物。
對於以吸入投予來說，根據本發明之治療劑可以採來自使用適當的推進劑(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他適合的氣體)之加壓包裝或噴霧器的氣霧噴劑的形式方便地遞送。在加壓氣霧的例子中，單位劑量可藉由提供遞送經計量之量的閥判定。可調配在吸入器或吹入器中使用的例如明膠之膠囊及藥匣以含有化合物與適合的粉末基底(諸如乳糖或澱粉)之粉末混合物。
本發明之調配物可非經腸遞送，亦即經靜脈內(i.v.)、側腦室內(i.c.v.)、皮下(s.c.)、腹膜內(i.p.)、肌肉內(i.m.)、真皮下(s.d.)、腫瘤內(i.t.)或皮內(i.d.)投予，以經由例如快速濃注或連續輸注之直接注射。用於注射之調配物可採具有添加的保存劑之單位劑型呈現，例如在安瓿或多劑量容器中。組成物可呈諸如在油性或水性媒劑中的賦形劑、懸浮液、溶液或乳液的形式，且可含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。替代地，活性成分可在使用前呈粉末(用於以適合的媒劑(例如無菌的無熱原水)重構)形式。
亦可調配本發明之組成物用於直腸投予，例如成為栓劑或保留灌腸(例如含有傳統栓劑基底，諸如可可脂或其他的甘油酯)。
如本文所揭示，能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸以及紫杉烷化學治療劑可與醫藥上可接受且與活性成分可相容之賦形劑摻合。另外，若必要時，製劑亦可包括少量的輔助物質，諸如潤濕劑或乳化劑、pH緩衝劑及/或提高醫藥組成物的有效性之劑。該等輔助分子可作為蛋白或藉由編碼該分子之表現載體表現而全身或局部遞送。用於遞送能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸以及紫杉烷化學治療劑的上述技術亦可用於輔助分子的遞送。
儘管本發明之活性劑可以分次劑量投予，例如以能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸以及紫杉烷化學治療劑之各者的單一日劑量每天分二或三次，但是以同時投予兩種劑在一個組成物中或在兩個分開的組成物中的單一日劑量為一實施態樣。
本發明亦涵蓋製備醫藥組成物之程序，其包含將能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸以及紫杉烷化學治療劑與醫藥上可接受之載劑及/或賦形劑組合。
可用於本發明之單位劑量之量中的能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸的具體量可由那些技術領域中具有通常知識者輕易地確定。可用於本發明之減少的單位劑量之量中之紫杉烷化學治療劑的具體量包括例如以建議劑量的3/4、1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/20使用紫杉醇。
本發明亦提供醫藥包裝或套組，其包含一或多個含有本發明之調配物的成分中之一或多者的容器。在相關的實施態樣中，本發明提供用於製備本發明之醫藥組成物的套組，該套組包含在第一容器或多個容器中的一或多種能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸之調配物，以及在第二容器或多個容器中的一或多種紫杉烷化學治療劑，及隨意之用於摻合兩種藥物及/或用於以治療有意義的方案投予藥物的說明書。套組的各容器亦可隨意地包括一或多種身體上可接受之載劑及/或賦形劑及/或輔助物質。與此(等)容器相關的是可為由管理醫藥品或生物產品之製造、使用或銷售的政府機構規定之形式的公告，該公告反映由機構核准用於人類投予之製造、使用或銷售。
若希望時，組成物可呈現在可含有一或多種含有活性成分之單位劑型的包裝或分配器裝置中。包裝例如可包含金屬或塑膠箔片，諸如泡殼包裝。包裝或分配器裝置可附有投藥的說明書。在可相容的醫藥載劑中調配的本發明之組成物亦可被製備、置於適當的容器中且貼上用於適應症治療之標籤。有效的劑量及安全性評估
根據本發明之方法，本文所述之醫藥組成物係以治療有效劑量投予患者，在一實施態樣中具有最低之除了組合之治療目的所需以外的毒性之劑量。以“定義”為標題的章節提供術語“化學治療有效劑量”及“治療有效劑量”之定義。在一實施態樣中，能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸以及紫杉烷化學治療劑各以在組合時提供提高的效果(例如在各劑單獨投予時未觀察到的效果)之劑量使用。本發明之一實施態樣為能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸以及紫杉烷化學治療劑二者係以"次最優"或"次閾值"劑量投予，該等劑量在組合時提供具有意外降低的非所欲副作用之優加性效果。
本發明能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸的效能可使用諸如活體外藥理試驗判定，諸如使用定量反轉錄酶-聚合酶鏈反應(Q-RT-PCR)或RT-PCR等mRNA水平之量測。本發明之紫杉烷化學治療劑的效能可使用那些技術領域中具有通常知識者已知的活體外方法判定，例如細胞毒性檢定法、MTT檢定法、細胞凋亡檢定法、細胞遷移檢定法等。
依照本技術領域中完整確立之方法，在活體外試驗執行良好的本發明之化合物及組成物的有效劑量及毒性接著可在使用小動物模式(例如小鼠或大鼠)的臨床前研究中判定，其中發現能夠下調 IG20基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸以及紫杉烷化學治療劑二者為治療有效的。
對於在本發明之方法中所使用的任何醫藥組成物來說，治療有效劑量可在最初自動物模式估計以達成循環血漿濃度範圍，其包括IC50 (亦即達成最大值一半的試驗化合物濃度)。自動物系統導出之劑量回應曲線接著可用來判定在人類中最初臨床研究的測試劑量。在各組成物之安全性判定中，投予劑量及頻率應符合或超過那些在臨床試驗中預期使用的劑量及頻率。
如本文所揭示，判定在本發明之組成物中的組份劑量以確保連續或間歇投予之劑量不超過在考慮於試驗動物中的結果及患者的個別狀況之後所判定之量。具體劑量本就取決於劑量程序、患者或個體動物的狀況，諸如年齡、體重、性別、敏感性、進食、劑量周期、組合使用的藥物、疾病的嚴重性而改變。在某些條件下的適當劑量及劑量次數可基於上述指數之試驗判定，但可根據醫師的判斷及各患者的情況(年齡、一般狀況、症狀的嚴重性、性別等)按照標準的臨床技術使其完善及最終判定。如本文所揭示，能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸的適當劑量通常為那些技術領域中具有通常知識者可確定的劑量，且紫杉烷化學治療劑的適當劑量通常為那些技術領域中具有通常知識者可確定的劑量。在一實施態樣中，欲投予之siRNA的劑量可在1至10毫克/每公斤體重的範圍內。劑量可取決於所使用的劑型及所利用的投予路徑而在此範圍內改變。在一實施態樣中，可以每天投予各藥物之單一劑量。
本發明之組成物的毒性及治療效能可在實驗動物中以標準的醫藥程序判定，例如藉由判定LD50 (對50%之群體致命的劑量)及ED50 (對50%之群體治療有效的劑量)。在治療及毒性效果之間的劑量比為治療指數且其可以ED50 /LD50 之比表示。以展現大的治療指數之調配物/組合較佳。
自動物研究所獲得的數據可用於調配於人類中使用的劑量範圍。能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸以及紫杉烷化學治療劑於人類中的治療有效劑量係落在循環濃度範圍內，其包括具有少許或不具有除了治療必需以外的毒性之ED50 。例如，能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸的此等治療有效的循環濃度常為那些技術領域中具有通常知識者可確定的濃度。能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸的待投予之劑量可在1至10毫克/每公斤體重的範圍內。劑量可取決於所使用的劑型及所利用的投予路徑而在此範圍內改變。理想地，應於每天使用各藥物之單一劑量。
本發明之藥物組合不僅在相對低的劑量下高度有效，且亦具有除了治療必需以外的低毒性及產生少的副作用。事實上，本發明之紫杉烷化學治療劑僅有的常見副作用為本發明組合療法經設計用以緩解的那些副作用，而源於使用本發明能夠下調IG20 基因之MADD剪接變體的表現之siRNA、shRNA及反義寡核苷酸的最常見副作用係與RNA之注射相關聯，諸如瞬間加重的發炎回應，包括增加的干擾素產生。 藥理學-總結
本發明之活性主藥及其醫藥組成物，以及以其治療之方法的特徵在於獨特之有利且不可預料的性質，其使得如本文所主張之"主題整體"非顯而易見。組合及其醫藥組成物在標準可接受之可靠試驗程序中展現下列有價值的性質及特性。
結果證實MADD之siRNA減弱與紫杉烷治療之組合對卵巢癌細胞的細胞死亡之協同增效效果，其中出於MADD之siRNA減弱與紫杉烷治療之組合的細胞死亡數量超過以MADD siRNA減弱之單一療法或紫杉烷單一療法的相加效果。
結果證實MADD之siRNA減弱與Abraxane® 治療之組合對卵巢癌細胞的細胞死亡之協同增效效果，其中出於MADD之siRNA減弱與Abraxane® 治療之組合的細胞死亡數量超過以MADD siRNA減弱之單一療法或Abraxane® 單一療法的相加效果。
結果證實MADD之siRNA減弱與Abraxane® 治療之組合對慢性骨髓性白血病細胞的細胞死亡之協同增效效果，其中出於MADD之siRNA減弱與Abraxane® 治療之組合的細胞死亡數量超過以MADD siRNA減弱之單一療法或Abraxane® 單一療法的相加效果。實施例 1 ：紫杉烷化學治療劑細胞毒性劑量曲線之判定
可能易受紫杉烷化學治療劑治療影響之代表各種癌症的癌細胞系包括8505C (甲狀腺癌)、HTH7 (甲狀腺癌)、C643 (人類甲狀腺癌)、AsPC-1 (胰腺癌)、SU.86.86 (胰腺癌)、CFPAC-1 (胰腺癌)、MCF7 (乳腺癌)、SK-BR-3 (乳癌)、OVCAR3 (卵巢癌)、SKOV3 (卵巢癌)、NCI-H522 (非小細胞肺癌)、NCI-H2122 (非小細胞肺癌)、NCI-H2227 (小細胞肺癌)、HepG2 (肝臟肝細胞癌)、PLC/PRF/5 (肝臟肝腫瘤)、AGS(胃腺癌)、JIMT1 (乳癌)、K562 (慢性骨髓性白血病)及N87 (胃癌)。細胞系可自馬里蘭州貝塞斯達之國家癌症研究所(National Cancer Institute, Bethesda, MD)或美國菌種中心(American Type Culture Collection)或其他國家的類似組織獲得。可選擇這些細胞系，因為他們全部皆表現較高水平的MADD剪接變體、衍生自不同類型的癌症、全部皆需要新的治療方式、展現獨特的生長性質及由於根本不同的突變而對以化學治療劑之不同的治療方式具有不同的易受影響性。儘管它們的異質性，它們在MADD減弱時可使得它們易受治療性治療影響，且因此顯示MADD 減弱在一範圍內的不同癌症潛在的有益效果。因為它們獨特的生長性質，所以這些細胞系在經調配以支持它們在培養時最優化生長的培養基中培養。
8505C細胞係在RPMI-1640培養基中培養並補充有10%胎牛血清及1%青黴素/鏈黴素。
HTH7細胞係在RPMI-1640培養基中培養並補充有10%胎牛血清及1%青黴素/鏈黴素。
C643細胞係在RPMI-1640培養基中培養並補充有10%胎牛血清及1%青黴素/鏈黴素。
AsPC-1細胞係在經改質以含有2 mM L-麩醯胺酸、10 mM HEPES、1 mM丙酮酸鈉、4500毫克/公升之葡萄糖及1500毫克/公升之碳酸氫鈉的RPMI-1640培養基(以用於使用5% CO2 之空氣的培育箱中)中培養。可能需要額外的碳酸氫鈉，以用於含有較高的CO2 百分比之培育箱中。基礎培養基補充有10%胎牛血清及抗生素和抗黴菌劑。
SU.86.86細胞係在經改質以含有2 mM L-麩醯胺酸、10 mM HEPES、1 mM丙酮酸鈉、4500毫克/公升之葡萄糖及1500毫克/公升之碳酸氫鈉的RPMI-1640培養基(以用於使用5% CO2 之空氣的培育箱中)中培養。可能需要額外的碳酸氫鈉，以用於含有較高的CO2 百分比之培育箱中。基礎培養基補充有10%胎牛血清及抗生素和抗黴菌劑。
CFPAC-1細胞係在含有4 mM L-麩醯胺酸、4500毫克/公升之葡萄糖及1500毫克/公升之碳酸氫鈉的經伊斯寇氏(Iscove's)改質之杜貝克氏(Dulbecco's)培養基(IMDM)中培養。此基礎培養基補充有10%胎牛血清及抗生素和抗黴菌劑。
MCF7細胞係在經改質以含有厄爾式(Earle's)平衡鹽溶液、非必需胺基酸、2 mM L-麩醯胺酸、1 mM丙酮酸鈉及1500毫克/公升之碳酸氫鈉的伊格氏(Eagle’s)最低必需培養基中培養。此基礎培養基補充有0.01毫克/毫升之人類重組胰島素；達10%之最終濃度的胎牛血清。
SK-BR-3細胞係在經改質以含有1.5 mM L-麩醯胺酸及2200毫克/公升之碳酸氫鈉的麥克寇伊氏(McCoy's) 5A培養基中培養。此基礎培養基補充有10%胎牛血清及抗生素和抗黴菌劑。
OVCAR3細胞係在經改質以含有2 mM L-麩醯胺酸、10 mM HEPES、1 mM丙酮酸鈉、4500毫克/公升之葡萄糖及1500毫克/公升之碳酸氫鈉的RPMI-1640培養基(以用於使用5% CO2 之空氣的培育箱中)中培養。此基礎培養基補充有0.01毫克/毫升之牛胰島素、抗生素和抗黴菌劑及達20%之最終濃度的胎牛血清。
SKOV3細胞係在經改質以含有1.5 mM L-麩醯胺酸及2200毫克/公升之碳酸氫鈉的麥克寇伊氏5A培養基中培養。此基礎培養基補充有10%胎牛血清及抗生素和抗黴菌劑。
NCI-H522細胞係在經改質以含有2 mM L-麩醯胺酸、10 mM HEPES、1 mM丙酮酸鈉、4500毫克/公升之葡萄糖及1500毫克/公升之碳酸氫鈉的RPMI-1640培養基(以用於使用5% CO2 之空氣的培育箱中)中培養。此基礎培養基補充有10%胎牛血清及抗生素和抗黴菌劑。
NCI-H2122細胞係在經改質以含有2 mM L-麩醯胺酸、10 mM HEPES、1 mM丙酮酸鈉、4500毫克/公升之葡萄糖及1500毫克/公升之碳酸氫鈉的RPMI-1640培養基(以用於使用5% CO2 之空氣的培育箱中)中培養。此基礎培養基補充有10%胎牛血清及抗生素和抗黴菌劑。
NCI-H2227細胞係在含有0.005毫克/毫升之胰島素、0.01毫克/毫升之運鐵蛋白、30nM亞硒酸鈉、10 nM氫皮質酮、10 nM β-雌二醇、額外的2mM L-麩醯胺酸(4.5 mM之最終濃度)、5%胎牛血清的DMEM：F12培養基中培養。
HepG2細胞係在伊格氏最低必需培養基(EMEM)中培養並補充有10%胎牛血清及1%青黴素/鏈黴素。
PLC/PRF/5細胞係在伊格氏最低必需培養基(EMEM)中培養並補充有10%胎牛血清及1%青黴素/鏈黴素。
K562細胞係在經伊斯寇氏改質之杜貝克氏培養基(IMDM)中培養 並補充有10%胎牛血清及1%青黴素/鏈黴素。
N87細胞係在補充有10%胎牛血清及1%青黴素/鏈黴素的RPMI-1640培養基中培養。
所有的細胞系皆維持在37℃具有5% CO2 之潮濕氣氛中。
紫杉烷化學治療劑廣泛處方用於治療癌症(Rowinsky, MD, Eric K. (February 1997). "THE DEVELOPMENT AND CLINICAL UTILITY OF THE TAXANE CLASS OF ANTIMICROTUBULE CHEMOTHERAPY AGENTS".Annual Review of Medicine 48 (1)：353-374)。紫杉衍生物化學治療劑作用於多種癌症的能力是因為它們能破壞細胞分裂的能力，而不受控制的細胞分裂是所有癌症的特點，紫杉烷衍生物化學治療劑適用於治療廣泛種類的癌症。主要是，紫杉烷衍生物化學治療劑被理解為破壞微管功能，而微管功能對於細胞分裂是必需的。細胞分裂需要微管的解聚，且因為紫杉烷衍生物化學治療劑防止微管解聚，它們防止細胞分裂。故，本質上，紫杉烷衍生物化學治療劑以作為有絲分裂抑制劑為其特徵(Abal M, Andreu JM, Barasoain I. Taxanes：microtubule and centrosome targets, and cell cycle dependent mechanisms of action. Curr Cancer Drug Targets. 2003 Jun;3(3)：193-203)。
紫杉烷衍生物化學治療劑可於市場上以FDA核准之藥物在醫師處方下自藥房獲得。
8505C、HTH7、C643、AsPC-1、SU.86.86、CFPAC-1、MCF7、SKBR3、OVCAR3、SKOV3、NCIH2142、NCI-H522、NCI-H2122、NCI-H2227、HepG2、PLC/PRF/5、K562及N87細胞係在它們各自如上所述具有適當補充物之培養基中培養。 　表1. 　製程綜述 - 附著細胞系 製程綜述- 懸浮細胞系
在第0天，將附著細胞接種在96槽孔盤中(Corning；目錄編號：353072)且經隔夜培育。
在第0天，將懸浮細胞接種在96槽孔盤中(Corning；目錄編號：353072)且同時添加如表1中表明之紫杉烷衍生物化學治療劑。
在經隔夜培育之後(第1天)，以一式三份添加6個不同濃度的各化學治療藥物。各藥物的儲備和工作濃度如下：紫杉醇的儲備溶液是製備在DMSO中。Abraxane®係溶解在0.9%食鹽水中。這些藥物的供作濃度是製備在培養基中。
細胞系模式各自的細胞毒性可用經比較之細胞毒性(如利用MTT檢定法所測量者)為基礎評估。
用於代謝活性之MTT染色：MTT (溴化3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑鎓；噻唑藍(Thiazolyl blue))可購自Sigma Aldrich (目錄編號：M5655)且以5毫克/毫升之濃度溶解在無菌DPBS中。
在附著細胞中，在藥物暴露24及48小時之後(分別於第2天及第3天)，將10微升經製備之MTT溶液添加至96槽孔盤的每一槽孔中。將盤在37℃之潮濕CO2 培育箱中培育2小時。在2小時之後，在生物安全抽氣櫃內使用真空抽吸培養基。在活細胞中形成的紫色甲臢(formazan)晶體以添加100微升二甲亞碸(Thermo Fisher Scientific；目錄編號：D128-500)溶解。將盤保持在振盪器上10分鐘以競爭晶體溶解且使用Bio-Rad iMark微量盤讀取機記錄在595奈米之吸光度。
在懸浮細胞中，在藥物暴露24及48小時之後(分別於第1天及第2天)，將10微升經製備之MTT溶液添加至96槽孔盤的每一槽孔中。將盤在37℃之潮濕CO2 培育箱中培育2小時。在2小時之後，添加等體積的溶解劑(在50%二甲基甲醯胺中的20% SDS)且將盤在37℃之潮濕CO2 培育箱中經隔夜培育。在隔夜培育之後，將盤保持在振盪器上10分鐘以競爭晶體溶解且使用Bio-Rad iMark微量盤讀取機記錄在595奈米之吸光度。
細胞生存百分比係使用MS excel計算。使用GraphPad Prism軟體計算EC50 。MTT檢定法表明整體細胞死亡。
研究證實以紫杉烷衍生物化學治療劑治療癌細胞展現基於癌細胞死亡可測量的劑量回應輪廓。實施例 2 ： 含 Map 激酶活化死亡结構域之蛋白 (MADD) 轉染 .
可設計包含靶向MADD剪接變體的外顯子13L之核酸分子的siRNA、shRNA及/或反義寡核苷酸。合成包含中心19個bp雙鏈體與2個鹼基3’-突出端的siRNA。而且，合成具有19個bp雙鏈體與2個鹼基3’-突出端的非專一性亂序型(scramble) siRNA以提供陰性對照siRNA。所使用的siRNA (雙股型雙鏈體)之序列為：
Lipofectamine RNAimax (轉染介導試劑)為在水中具有正表面電荷之陽離子單層脂質體結構。脂質陽離子電荷與siRNA中的核酸之負磷酸酯基團交互作用並與細胞膜形成脂質體/siRNA轉染複合體。此複合體可容易與細胞膜融合且經由胞飲作用在細胞內部遞送siRNA。
必須為各細胞系判定siRNA及轉染試劑的給量。通常使用製造商建議之每立方毫米組織培養盤區域的轉染試劑體積，而siRNA濃度可有變化。對大多數的細胞而言，以10 nM siRNA足以在轉染48小時內引起MADD減弱。轉染 ：
細胞係在37℃，5% CO2 培育箱中，在含有5% CO2 之濕朝氣氛中於ATCC建議之具有10%胎牛血清(Gibco；目錄編號：26140-079)及1x抗生素/抗黴菌劑(Gibco；目錄編號：15240096)的培養基中培養及維持。對於轉染，將細胞接種在96槽孔盤中(在轉染前24小時達到60至80%之匯聚(confluence))。
在下文給出所測試之各細胞系的轉染反應之細節。
轉染反應混合物係按照製造商說明書的建議以一式三份製備。簡言之，在管A中，將100 µM siRNA儲備溶液之等分試樣以5微升OPTI-MEM稀釋，以給出每一槽孔10 nM siRNA的最終濃度。在管B中，將0.3微升RNAiMax (Thermo Fisher Scientific)試劑以4.7微升OPTI-MEM混合。將來自管A及B的內容物混合且在室溫下培育15分鐘。將反應混合物添加至盤中且在37℃下培育24小時、48小時及72小時。培養基係在48小時之後更換。RNA 分離 ：
總RNA係使用Trizol試劑(Ambion；目錄編號：15596018)抽取。對96槽孔盤的各槽孔添加150微升Trizol以懸浮及均質化細胞懸浮液。將一式三份樣品倒在一起以供進一步處理。將細胞在室溫下培育10分鐘。將250微升氯仿(Fisher；目錄編號：C606-1)添加至細胞懸浮液中。將樣品在室溫下培育3分鐘。將管在4℃下以10,000 rpm離心15分鐘。將頂層轉移至新鮮管中且添加600微升異丙醇(Fisher；目錄編號：A451-1)。將管在室溫下培育10分鐘。接著將管在4℃下以10,000 rpm離心10分鐘。丟棄上清液清且將沈澱物以1毫升75%乙醇(Decon；目錄編號：DSP-AZ-1)清洗。將管在4℃下以7500 rpm再次離心5分鐘。將沈澱物風乾且溶解在20微升DEPC水(Fisher；目錄編號：BP561-1)中。RNA係使用Thermo Fisher Scientific NanoDrop One定量。使用A260/280及A260/230驗證樣品的純度。反轉錄酶 PCR ：
對於RT-PCR，使用MADD及β-肌動蛋白(內部裝載對照組)引子。所使用的引子之序列為：
對於擴增，使用Qiagen One step RT_PCR套組(目錄編號：210212)及BioRaD T100熱循環儀。在下文給出RT-PCR之描述。 表3. RT-PCR之擴增製程為： 1. 50℃經30分鐘 2. 95℃經15分鐘 3. 94℃經50秒 4. 55℃經50秒 5. 72℃經60秒 6. 重複步驟3至5，39次 7. 72℃經7分鐘 8. 保持在4℃5% 聚丙烯醯胺凝膠電泳 ：
聚丙烯醯胺凝膠係以手動澆注且使用下列配方製備凝膠。依序添加所有的組份。 　表4.
於裝載於凝膠上前，將整個樣品體積(25微升)與5微升6x 核酸緩衝液(Thermo Fisher Scientific；目錄編號：RO611)混合。凝膠電泳係使用BioRad Protean II Xi Cell在200伏特下進行2小時。將凝膠使用100毫升工作染色溶液(在0.5x TBE中的1微克/毫升之溴化乙錠(Ethidium Bromide))染色30分鐘。溴化乙錠係購自BioRad (目錄編號：161-0433)。使用BioRad ChemiDoc MP成像系統擷取影像。
該等研究證實本實驗的核酸之有效轉染，以及區別轉染試劑對MADD表現(MADD減弱)及細胞生存之效果。實施例 3 ：紫杉烷衍生物化學治療劑對於在有及沒有 MADD 減弱之癌細胞中的細胞死亡之效果
可判定紫杉烷衍生物化學治療劑在MADD下調的存在或不存在下對癌細胞之細胞毒性效果。
SKOV3細胞係在它們各自如上述具有適當的補充劑的培養基中培養。 　表5.製程綜述
細胞係如上述在37℃之含有5% CO2 之朝濕氣氛中培養及維持。在第0天，將細胞接種在100立方毫米組織培養盤中(Corning；目錄編號：353003)以達到60至70%之匯聚。同時，亦將細胞接種在一個96槽孔盤中(Corning；目錄編號：353072)，以供用於再接種前的生存率分析。
在12至18小時之後(第1天)，將細胞以10 nM濃度之亂序型或MADD siRNA轉染。所使用的siRNA (雙股型)之序列為：
將儲備siRNA在1x siRNA溶解緩衝液(GE Healthcare；目錄編號：B-002000-UB-700)中重構成100 µM濃度且貯存在-20℃下。對於轉染，藉由添加30微升lipofectamine RNAimax (Invitrogen；目錄編號：13778-150)、1毫升Opti-MEM (Gibco；目錄編號：31985062)及儲備siRNA之等分試樣，以獲得每一盤或含有70%之匯聚細胞的槽孔盤10 nM siRNA的最終濃度，而製備每一盤的反應混合物。將反應混合物在室溫下培育10分鐘。將轉染混合物逐滴添加至含有在具有10% FBS，但沒有抗生素之RPMI培養基中的70%之匯聚細胞的盤上。轉染混合物平行添加至種在96槽孔盤中的細胞中。
細胞係在37℃之潮濕CO2 培育箱中培育24小時，且在隔天(第2天)，將培養基以完全RPMI (10% FBS及1x 抗生素/抗黴菌劑)置換。更換所有細胞的培養基。
在轉染48小時之後(第3天)，藉由0.05%胰蛋白酶(Gibco；目錄編號：25-300-054)處理，收穫細胞。簡言之，細胞以DPBS (Gibco；目錄編號：14190250)清洗且以胰蛋白酶處理5分鐘。接著細胞脫附著且收集在10毫升完全培養基中。將細胞懸浮液在1500 rpm下離心10分鐘。丟棄上清液清且將細胞沈澱物懸浮在5毫升完全RPMI中。將所有的細胞[對照組(未經處理)、經轉染亂序型及MADD siRNA]在再接種前使用血球計計數。將細胞計數，將細胞懸浮液與0.4%錐蟲藍(Lonza；目錄編號：17-942E)以等體積混合。將10微升細胞懸浮液(具有錐蟲藍)放在血球計上且計數細胞。執行兩次計數且使用平均值判定細胞數量。
將等數量的細胞[對照組(未經處理)、經轉染亂序型及MADD siRNA]接種在96槽孔盤中。在同一天(在轉染48小時之後)進行MTT檢定法以判定在再接種前的相對細胞生存率。
在第4天，當細胞在96槽孔盤中適當地附著且保持彼等的形狀時，添加藥物。所有的藥物係在添加至細胞前的同一天稀釋於完全培養基中。在未經處理之細胞中，將培養基以完全培養基置換。以200微升培養基體積(具有或不具有藥物)用於藥物治療檢定法。將盤在37℃之潮濕CO2 培育箱中培育24小時、48小時及72小時。
進行MTT檢定法以判定在如上述之藥物治療後的相對生存率。
用於代謝活性之MTT染色：MTT (溴化3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四唑鎓；噻唑藍(Thiazolyl blue))可購自Sigma Aldrich (目錄編號：M5655)。將MTT以5毫克/毫升之濃度溶解在無菌DPBS中且通過0.45微米針筒過濾器(Corning；目錄編號：431220)過濾。對96槽孔盤的每一槽孔添加10微升MTT溶液。將盤在37℃之潮濕CO2 培育箱中培育2小時。在2小時之後，在生物安全抽氣櫃內使用真空抽吸培養基。在活細胞中形成的紫色晶體以添加100微升二甲亞碸(Thermo Fisher Scientific；目錄編號：D128-500)溶解。將盤保持在振盪器上10分鐘以競爭晶體溶解且使用Bio-Rad iMark微量盤讀取機記錄在595奈米之吸光度。
數據係以MS excel軟體分析。相對生存率係相對於對照組(未經處理之細胞)的吸光度計算以判定轉染以及組合治療之效果。
以亂序型siRNA轉染導致很少或沒有自發性細胞死亡。自發性細胞死亡可歸因於個別細胞系對轉染試劑的敏感性。有必要在各實驗中包括亂序型siRNA轉染作為轉染對照組且建立反映可由於轉染反應發生的細胞死亡數量之基線。
各數據集考慮到以亂序型siRNA轉染時所觀察的任何自發性細胞死亡；自各siRNA轉染反應中所觀察的細胞死亡數量減去亂序型siRNA轉染的自發性細胞死亡數量(基線)，得到在考慮經亂序型siRNA誘導之細胞死亡之後的細胞死亡淨百分比(淨%)。
在一實施態樣中，將0.09375 nM紫杉醇作為單一療法添加至OVCAR3卵巢癌細胞中。而且，將細胞以作為單一療法的MADD siRNA轉染。在組合中，將0.09375 nM紫杉醇添加至以MADD siRNA轉染之OVCAR3細胞中。以未治療之對照組細胞、以亂序型siRNA轉染之對照組細胞、以MADD siRNA轉染之細胞、以0.09375 nM紫杉醇治療之細胞及以MADD siRNA轉染且以0.09375 nM紫杉醇治療之細胞所代表的治療範例之細胞培養物中的細胞死亡數量係在紫杉醇治療後24小時評估。 表6.
如表6中所記述之結果證實MADD之siRNA減弱導致7%之細胞死亡，以0.09375 nM濃度之紫杉醇單一療法導致沒有細胞死亡，而以0.09375 nM紫杉醇添加至以MADD siRNA轉染之細胞導致47%之細胞死亡。所有的結果將利用亂序型siRNA細胞死亡數據之轉染效果納入考慮。總之，結果證實MADD之siRNA減弱與紫杉醇治療的組合之協同增效性導致47%之細胞死亡，其遠超過以MADD siRNA減弱之單一療法或紫杉醇單一療法之相加效果，各單一療法的相加效果為7%之細胞死亡。
在一實施態樣中，將1.5 nM 紫杉醇作為單一療法添加至OVCAR3卵巢癌細胞中。而且，將OVCAR3細胞以作為單一療法的MADD siRNA轉染。在組合中，將1.5 nM 紫杉醇添加至以MADD siRNA轉染之OVCAR3細胞中。以未治療之對照組OVCAR3細胞、以亂序型siRNA轉染之對照組OVCAR3細胞、以MADD siRNA轉染之細胞、以1.5 nM 紫杉醇治療之細胞及以MADD siRNA轉染且以1.5 nM 紫杉醇治療之細胞所代表的治療範例之細胞培養物中的細胞死亡數量係在紫杉醇治療後48小時評估。 表7.
如表7中所記述之結果證實MADD之siRNA減弱導致2%之細胞死亡，以1.5 nM濃度之紫杉醇單一療法導致36%之細胞死亡，而以1.5 nM紫杉醇添加至以MADD siRNA轉染之細胞導致69%之細胞死亡。所有的結果將利用亂序型siRNA細胞死亡數據之轉染效果納入考慮。總之，結果證實MADD之siRNA減弱與紫杉醇治療的組合之協同增效性導致69%之細胞死亡，其遠超過以MADD siRNA減弱之單一療法或紫杉醇單一療法之相加效果，各單一療法的相加效果為38%之細胞死亡。
在一實施態樣中，將0.375 nM紫杉醇作為單一療法添加至OVCAR3細胞中。而且，將OVCAR3卵巢癌細胞以作為單一療法的MADD siRNA轉染。在組合中，將0.375 nM紫杉醇添加至以MADD siRNA轉染之OVCAR3細胞中。以未治療之對照組OVCAR3細胞、以亂序型siRNA轉染之對照組OVCAR3細胞、以MADD siRNA轉染之細胞、以0.375 nM 紫杉醇治療之細胞及以MADD siRNA轉染且以0.375 nM紫杉醇治療之細胞所代表的治療範例之細胞培養物中的細胞死亡數量係在紫杉醇治療後72小時評估。 表8.
如表8中所記述之結果證實MADD之siRNA減弱導致沒有細胞死亡，以0.375 nM濃度之紫杉醇單一療法導致33%之細胞死亡，而以0.375 nM紫杉醇添加至以MADD siRNA轉染之細胞導致54%之細胞死亡。所有的結果將利用亂序型siRNA細胞死亡數據之轉染效果納入考慮。總之，結果證實MADD之siRNA減弱與紫杉醇治療的組合之協同增效性導致54%之細胞死亡，其超過以MADD siRNA減弱之單一療法或紫杉醇單一療法之相加效果，各單一療法的相加效果為33%之細胞死亡。
在一實施態樣中，將0.625 nM Abraxane® 作為單一療法添加至SKOV 3卵巢癌細胞中。而且，將SKOV 3細胞以作為單一療法的MADD siRNA轉染。在組合中，將0.625 nM Abraxane® 添加至以MADD siRNA轉染之SKOV 3細胞中。以未治療之對照組SKOV 3細胞、以亂序型siRNA轉染之對照組SKOV 3細胞、以MADD siRNA轉染之細胞、以0.625 nM Abraxane® 治療之細胞及以MADD siRNA轉染且以0.625 nM Abraxane® 治療之細胞所代表的治療範例之細胞培養物中的細胞死亡數量係在Abraxane® 治療後24小時評估。 表9.
如表9中所記述之結果證實MADD之siRNA減弱導致31%之細胞死亡，以0.625 nM濃度之Abraxane® 單一療法導致6%之細胞死亡，而以0.625 nM Abraxane® 添加至以MADD siRNA轉染之細胞導致50%之細胞死亡。所有的結果將利用亂序型siRNA細胞死亡數據之轉染效果納入考慮。總之，結果證實MADD之siRNA減弱與Abraxane® 治療的組合之協同增效性導致50%之細胞死亡，其遠超過以MADD siRNA減弱之單一療法或Abraxane® 單一療法之相加效果，各單一療法的相加效果為37%之細胞死亡。
在另一實施態樣中，將5 nM Abraxane® 作為單一療法添加至SKOV 3細胞中。而且，將SKOV 3細胞以作為單一療法的MADD siRNA轉染。在組合中，將5 nM Abraxane® 添加至以MADD siRNA轉染之SKOV 3細胞中。以未治療之對照組SKOV 3細胞、以亂序型siRNA轉染之對照組SKOV 3細胞、以MADD siRNA轉染之細胞、以5 nM Abraxane® 治療之細胞及以MADD siRNA轉染且以5 nM Abraxane® 治療之細胞所代表的治療範例之細胞培養物中的細胞死亡數量係在Abraxane® 治療後48小時評估。 表10.
如表10中所記述之結果證實MADD之siRNA減弱導致29%之細胞死亡，以5 nM濃度之Abraxane® 單一療法導致34%之細胞死亡，而以5 nM Abraxane® 添加至以MADD siRNA轉染之細胞導致74%之細胞死亡。所有的結果將利用亂序型siRNA細胞死亡數據之轉染效果納入考慮。總之，結果證實MADD之siRNA減弱與Abraxane® 治療的組合之協同增效性導致74%之細胞死亡，其遠超過以MADD siRNA減弱之單一療法或Abraxane® 單一療法之相加效果，各單一療法的相加效果為63%之細胞死亡。
在另一實施態樣中，將1 nM Abraxane® 作為單一療法添加至K562細胞中。而且，將K562慢性骨髓性白血病細胞以作為單一療法的MADD siRNA轉染。在組合中，將1 nM Abraxane® 添加至以MADD siRNA轉染之K562細胞中。以未治療之對照組K562細胞、以亂序型siRNA轉染之對照組K562細胞、以MADD siRNA轉染之細胞、以1 nM Abraxane® 治療之細胞及以MADD siRNA轉染且以1 nM Abraxane® 治療之細胞所代表的治療範例之細胞培養物中的細胞死亡數量係在Abraxane® 治療後48小時評估。 表11.
如表11中所記述之結果證實MADD之siRNA減弱導致4%之細胞死亡，以1 nM濃度之Abraxane® 單一療法導致11%之細胞死亡，而以1 nM Abraxane® 添加至以MADD siRNA轉染之細胞導致24%之細胞死亡。所有的結果將利用亂序型siRNA細胞死亡數據之轉染效果納入考慮。總之，結果證實MADD之siRNA減弱與Abraxane® 治療的組合之協同增效性導致24%之細胞死亡，其超過以MADD siRNA減弱之單一療法或Abraxane® 單一療法之相加效果，各單一療法的相加效果為15%之細胞死亡。
在另一實施態樣中，將0.0625 nM Abraxane® 作為單一療法添加至K562慢性骨髓性白血病細胞中。而且，將細胞以作為單一療法的MADD siRNA轉染。在組合中，將0.0625 nM Abraxane® 添加至以MADD siRNA轉染之K562細胞中。以未治療之對照組K562細胞、以亂序型siRNA轉染之對照組K562細胞、以MADD siRNA轉染之細胞、以0.0625 nM Abraxane® 治療之細胞及以MADD siRNA轉染且以0.0625 nM Abraxane® 治療之細胞所代表的治療範例之細胞培養物中的細胞死亡數量係在Abraxane® 治療後48小時評估。 表12.
如表12中所記述之結果證實MADD之siRNA減弱導致47%之細胞死亡，以0.0625 nM濃度之Abraxane® 單一療法導致沒有細胞死亡，而以0.0625 nM Abraxane® 添加至以MADD siRNA轉染之細胞導致70%之細胞死亡。所有的結果將利用亂序型siRNA細胞死亡數據之轉染效果納入考慮。總之，結果證實MADD之siRNA減弱與Abraxane® 治療的組合之協同增效性導致70%之細胞死亡，其遠超過以MADD siRNA減弱之單一療法或Abraxane® 單一療法之相加效果，各單一療法的相加效果為47%之細胞死亡。
考慮前述的實驗結果，本檢定法證實紫杉烷衍生物化學治療劑治療與MADD減弱的組合對誘導癌細胞死亡導致意外的協同增效效果。結果證實紫杉烷衍生物化學療法與MADD減弱的組合對細胞死亡導致超過相加效果。結果，紫杉烷衍生物化學治療劑之劑量可降低至先前認為不具治療性的水平，從而提供展現出乎意料的安全性限度及降低的非所欲副作用之癌症療法。 * * * * *
本發明之範圍不受限於本文所述之具體實施態樣。事實上，除了那些本文所述者以外，從前文的描述使本發明之各種修改變得對那些技術領域中具有通常知識者為顯而易見。意欲使此等修改落在所附之申請專利範圍之範疇內。
將本文引用的所有專利、申請案、出版物、試驗方法、文獻及其他材料藉由引用而特此併入本文中。 * * * * *
圖1. 藉由選擇性mRNA剪接所產生的人類IG20剪接變體。顯示在七種IG20剪接變體之間的cDNA序列同源性。實心長條代表在所有變體之間的完全同源性區域。空的範圍表明外顯子13L、16、21、26和34，當以不同的組合剪接時，彼等得到在左邊所示的七種剪接變體。在KIAA0358及IG20-SV4中的外顯子34之剪接誘導在外顯子35中提早出現的終止密碼子。亦顯示不同的剪接變體之不同的5'非轉譯區(UTR)。

Claims (35)

  1. 一種有用於治療癌症之抗癌劑(antineoplastic agents)組合，其包含有效量的一或多種能夠下調至少一種IG20 基因之剪切變體表現的核酸分子，其中並非所有IG20 基因之剪切變體被下調；以及一或多種紫杉烷衍生物化學治療劑。
  2. 如請求項1之組合，其中該至少一種IG20 基因之剪切變體係選自MADD剪切變體、SNP、其對偶變異、其多型性(polymorphism)、及其遺傳突變。
  3. 如請求項2之組合，其中該至少一種IG20基因之剪切變體為展現外顯子13L的MADD剪切變體。
  4. 如請求項2之組合，其中該一或多種能夠下調至少一種IG20 基因之剪切變體表現的核酸分子係選自siRNA、shRNA及反義寡核苷酸。
  5. 如請求項4之組合，其中該siRNA、shRNA及反義寡核苷酸包含與MADD剪切變體的外顯子13L之核酸序列、SNP、其對偶變異、其多型性、及其遺傳突變、及/或其mRNA轉錄本互補之核酸。
  6. 如請求項4之組合，其中該能夠下調至少一種IG20 基因之剪切變體表現的核酸分子係包含在siRNA或shRNA中。
  7. 如請求項6之組合，其中該siRNA及shRNA由包括下列結構的核酸分子編碼： X正義 -髮夾環圈- X反義 ， 　　其中X包括下列核酸序列或基本上由下列核酸序列所組成：CGGCGAATCTATGACAATC (SEQ ID NO：1)。
  8. 如請求項6之組合，其中該siRNA或shRNA包含具有CGGCGAAUCUAUGACAAUC (SEQ ID NO：2)序列之核酸。
  9. 如請求項6之組合，其中該siRNA或shRNA包含具有 CGGCGAAUCUAUGACAAUC (SEQ ID NO：2)序列之核酸且與具有GAUUGUCAUAGAUUCGCCG (SEQ ID NO：10)序列之同源核酸呈雙鏈體(duplex)形式。
  10. 如請求項7之組合，其中該shRNA及siRNA由具有CGAATCTATGACAATCTTCAAGAGAGATTGTCATAGATTCGCCG (SEQ ID NO：3)序列的核酸編碼，其中髮夾環圈區為該序列的位置20-28。
  11. 如請求項4之組合，其中該包含與IG20 基因的MADD剪切變體的外顯子13L之核酸序列、及/或其mRNA轉錄本互補之核酸的siRNA、shRNA及反義寡核苷酸係包含具有選自GAUUGUCAUAGAUUCGCCGTT (SEQ ID NO：4)及GAUUGUCAUAGAUUCGCCG (SEQ ID NO：10)序列之核酸。
  12. 如請求項4之組合，其中該一或多種能夠下調至少一種IG20 基因之剪切變體表現的核酸分子係包含在藥物遞送系統中。
  13. 如請求項12之組合，其中該藥物遞送系統為靶向脂質體調配劑或慢病毒載體(lentivirus vector)。
  14. 如請求項1之組合，其中該一或多種紫杉烷衍生物化學治療劑係選自紫杉醇、多西他賽、卡巴他賽、紫杉醇類似物SID 350、多西他賽乳劑ANX-514、多西他賽調配劑CKD-810、多西他賽脂質微球體、裝載多西他賽之奈米藥劑CRLX301、多西他賽-PNP及脂質體多西他賽。
  15. 如請求項1之組合，其中該一或多種紫杉烷衍生物化學治療劑係呈醫藥上可接受的鹽之形式。
  16. 如請求項1之組合，其中該癌症選自卵巢癌、乳癌、肺癌、子宮頸癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、黑色素瘤、食道癌、及包括卡波西肉瘤的其他實體腫瘤。
  17. 一種使用抗癌劑與一或多種紫杉烷衍生物化學治療劑之組合於製備用於治療個體中選自卵巢癌、乳癌、肺癌、子宮頸癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌、黑色素瘤、食道癌、及包括卡波西肉瘤的其他實體腫瘤之癌症之藥物的用途，該抗癌劑包含一或多種能夠下調至少一種IG20 基因之剪切變體表現的核酸分子，其中並非所有IG20 基因之剪切變體被下調。
  18. 如請求項17之用途，其中該癌症展現至少一種IG20 基因之剪切變體的表現。
  19. 如請求項17之用途，其中該癌症展現該IG20 基因之MADD剪切變體、SNP、其對偶變異、其多型性、及其遺傳突變的表現。
  20. 如請求項19之用途，其中該MADD剪切變體展現該IG20 基因之外顯子13L。
  21. 如請求項17之用途，其中該一或多種能夠下調至少一種IG20 基因之剪切變體表現的核酸分子係選自siRNA、shRNA及反義寡核苷酸。
  22. 如請求項21之用途，其中該siRNA、shRNA及反義寡核苷酸包含與該IG20 基因之MADD剪切變體的外顯子13L之核酸序列、SNP、其對偶變異、其多型性、及其遺傳突變、及/或其mRNA轉錄本互補之核酸。
  23. 如請求項22之用途，其中該能夠下調至少一種IG20 基因之剪切變體表現的核酸分子係包含在siRNA或shRNA中。
  24. 如請求項23之用途，其中該siRNA及shRNA由包括下列結構的核酸分子編碼： X正義 -髮夾環圈- X反義 ， 　　其中X包括下列核酸序列或基本上由下列核酸序列所組成：CGGCGAATCTATGACAATC (SEQ ID NO：1)。
  25. 如請求項23之用途，其中該siRNA及shRNA包含具有CGGCGAAUCUAUGACAAUC (SEQ ID NO：2)序列之核酸。
  26. 如請求項25之用途，其中該siRNA及shRNA包含具有 CGGCGAAUCUAUGACAAUC (SEQ ID NO：2)序列之核酸且與具有GAUUGUCAUAGAUUCGCCG (SEQ ID NO：10)序列之同源核酸呈雙鏈體(duplex)形式。
  27. 如請求項22之用途，其中該shRNA由具有CGAATCTATGACAATCTTCAAGAGAGATTGTCATAGATTCGCCG (SEQ ID NO：3)序列的核酸編碼，其中髮夾環圈區為該序列的位置20-28。
  28. 如請求項22之用途，其中該包含與IG20 基因的MADD剪切變體的外顯子13L之核酸序列、及/或其mRNA轉錄本互補之核酸的siRNA、shRNA及反義寡核苷酸係包含具有選自GAUUGUCAUAGAUUCGCCGTT (SEQ ID NO：4)及GAUUGUCAUAGAUUCGCCG (SEQ ID NO：10)序列之核酸。
  29. 如請求項22之用途，其中該一或多種siRNA、shRNA及反義寡核苷酸以脂質體調配劑之形式或藉由慢病毒載體轉染投予。
  30. 如請求項22之用途，其中該一或多種siRNA、shRNA及反義寡核苷酸以佐劑投予。
  31. 如請求項17之用途，其中該一或多種紫杉烷衍生物化學治療劑係選自紫杉醇、多西他賽、卡巴他賽、紫杉醇類似物SID 350、多西他賽乳劑ANX-514、多西他賽調配劑CKD-810、多西他賽脂質微球體、裝載多西他賽之奈米藥劑CRLX301、多西他賽-PNP及脂質體多西他賽。
  32. 如請求項17之用途，其中該一或多種紫杉烷衍生物化學治療劑係以進一步包含一或多種醫藥上可接受的稀釋劑、賦形劑或載劑之醫藥組成物之形式投予。
  33. 如請求項22之用途，其中該一或多種siRNA、shRNA及反義寡核苷酸係在該一或多種紫杉烷衍生物化學治療劑之前投予、或係與該一或多種紫杉烷衍生物化學治療劑同時投予。
  34. 如請求項22之用途，其中該一或多種siRNA、shRNA及反義寡核苷酸係以進一步包含一或多種醫藥上可接受的稀釋劑、賦形劑或載劑之醫藥組成物之形式投予。
  35. 如請求項22之用途，其中該一或多種siRNA、shRNA及反義寡核苷酸與該一或多種紫杉烷衍生物化學治療劑係調配在劑量包裝(dosage pack)中並根據所選治療方案投予。
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