以下,詳細地說明本發明。 本發明之環狀肽化合物合成相關基因意指參與彎孢屬絲狀菌所生產之環狀肽化合物之合成之基因群(基因簇)中所包含的各基因。該環狀肽化合物係如日本專利特表平8-504165號公報(或WO93/12659)所揭示般,以下式表示。 [化1]
(此處,式中,各胺基酸殘基及乳酸酯殘基可獨立地採用L體或D體) 再者,環狀肽化合物(以下,亦有時稱為KK-1)之化合物名稱為酪胺酸、N-[N-[N-[N-[N-[N-[N-[N-[[1-(2-羥基-1-氧代丙基)-2-哌啶基]羰基]-N-甲基纈胺醯基]纈胺醯基]-N-甲基-a-天冬胺醯基]-N-甲基纈胺醯基]-N甲基異白胺醯基]甘胺醯基]-N-甲基纈胺醯基]-O-甲基-,d2-內酯(9CI)。 生產該環狀肽化合物之彎孢屬絲狀菌代表性地可列舉棒狀彎孢菌,除此以外,亦可列舉:近緣彎孢菌(C. affinis)、短孢子彎孢(C. brachyspora)、番木瓜彎孢菌(C. caricae-papayae)、畫眉草彎孢菌(C. eragrostidis)(畫眉草旋孢腔菌(Cochliobolus eragrostidis))、假彎孢菌(C. fallax)、膝曲彎孢菌(C. geniculata)(膝曲旋孢腔菌(Cochliobolus geniculatus))、哈氏彎孢菌(C. harveyi)、半月彎孢菌(C. lunata)(半月旋孢腔菌(Cochliobolus lunatus))、卵形彎孢菌(C. ovoidea)、蒼變淡彎孢菌(C. pallescens)、狗尾彎孢菌(C. penniseti)、普瑞斯彎孢菌(C. prasadii)、管突彎孢菌(C. protuberata)、塞內加爾彎孢菌(C. senegalensis)、三葉彎孢菌(C. trifolii)、小瘤彎孢菌(C. tuberculata)(小瘤旋孢腔菌(Cochliobolus tuberculatus))等。又,作為棒狀彎孢菌,可列舉由秋田今野商店股份有限公司分售之棒狀彎孢菌BAUA-2787株。關於棒狀彎孢菌BAUA-2787,於2016年12月28日,以寄存編號NITE BP-02399寄存於獨立行政法人製品評價技術基盤機構專利微生物寄存中心(NPMD)(〒292-0818 日本千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8 122號室)。 又,參與本環狀肽化合物之合成之基因群可如下述實施例所示,定義為包含10種基因、較佳為9種基因之基因群。 該等10種基因係O-甲基轉移酶基因、非核糖體型肽合成酶基因(NRPS基因)、醯胺酶基因、功能未知之基因(2種)、轉錄因子基因、編碼輕肌蛋白B耐性蛋白質之pmd1基因、吡咯啉-5-羧酸還原酶樣基因及α/β水解酶基因。於該等10種基因中,尤其作為強烈參與環狀肽化合物之合成之基因,亦可將O-甲基轉移酶基因、非核糖體型肽合成酶基因(NRPS基因)、醯胺酶基因、功能未知之基因(1種)、轉錄因子基因、編碼輕肌蛋白B耐性蛋白質之pmd1基因、吡咯啉-5-羧酸還原酶樣基因及α/β水解酶基因定義為參與本環狀肽化合物之合成之基因群。 [NRPS基因] 該等基因群中之NRPS基因編碼具有形成本環狀肽化合物之基本骨架之功能之NRPS。即,本NRPS形成包含[丙胺酸(Ala)-2-哌啶甲酸(Pip)-纈胺酸(Val)-纈胺酸-天冬胺酸(Asp)-纈胺酸-異白胺酸(Ile)-甘胺酸(Gly)-纈胺酸-酪胺酸(Tyr)]之10個胺基酸之肽骨架。即,本NRPS具有如下活性:於丙胺酸之羧基與2-哌啶甲酸之胺基之間形成肽鍵,於該2-哌啶甲酸之羧基與纈胺酸之胺基之間形成肽鍵,於該纈胺酸之羧基與纈胺酸之胺基之間形成肽鍵,於該纈胺酸之羧基與天冬胺酸之胺基之間形成肽鍵,於該天冬胺酸之羧基與纈胺酸之胺基之間形成肽鍵,於該纈胺酸之羧基與異白胺酸之胺基之間形成肽鍵,於該異白胺酸之羧基與甘胺酸之胺基之間形成肽鍵,於該甘胺酸之羧基與纈胺酸之胺基之間形成肽鍵,於該纈胺酸之羧基與酪胺酸之胺基之間形成肽鍵,於該酪胺酸之羧基與上述丙胺酸之胺基之間形成肽鍵。又,本NRPS具有如下活性:將2-哌啶甲酸與纈胺酸之間之肽鍵甲基化,將纈胺酸與天冬胺酸之間之肽鍵甲基化,將天冬胺酸與纈胺酸之間之肽鍵甲基化,將纈胺酸與異白胺酸之間之肽鍵甲基化,將甘胺酸與纈胺酸之間之肽鍵甲基化。 本NRPS具有與上述構成基本之肽骨架[丙胺酸-2-哌啶甲酸-纈胺酸-纈胺酸-天冬胺酸-纈胺酸-異白胺酸-甘胺酸-纈胺酸-酪胺酸]之10個胺基酸對應之10個模組。各模組具有引入目標胺基酸,並且使AMP(adenosine monophosphate,腺苷單磷酸)與胺基酸結合而合成胺基醯基AMP之A域(腺苷醯化域:adenylation domain)。又,各模組具有PCP域(肽醯載體蛋白域:peptidyl carrier protein domain),該PCP域具有磷酸泛醯巰基乙胺,且藉由形成於磷酸泛醯巰基乙胺之絲胺酸部位與胺基醯基AMP之間之硫酯而結合該胺基醯基AMP。進而,各模組具有於與鄰接之PCP域結合之胺基醯基AMP之間形成肽鍵的C域(縮合域:condensation domain)。進而,於模組中亦有具有將所形成之肽鍵甲基化之nMT域(N-甲基轉移酶域:N-methyltransferase domain)者。 具有上述活性之NRPS如圖1所示,包含第1~10模組。此處,NRPS之各模組之位置係與構成所合成之肽骨架之胺基酸之位置一致。又,具有nMT域之模組之位置與經N-甲基化之肽鍵之位置一致。 第1模組自N末端側起依序具有:第1 A域,其包含序列編號1所示之胺基酸序列;及第1 PCP域,其包含序列編號2所示之胺基酸序列。但是,第1模組中之第1 A域及第1 PCP域並不分別限定於序列編號1及2所示之胺基酸序列,只要分別發揮作為A域及PCP域之作用,則亦可為相對於序列編號1及2所示之胺基酸序列具有70%以上之同一性、較佳為80%以上之同一性、更佳為90%以上之同一性、進而較佳為95%以上之同一性、最佳為97%以上之同一性之胺基酸序列。 第2模組自N末端側起依序具有:第1 C域,其包含序列編號3所示之胺基酸序列;第2 A域,其包含序列編號4所示之胺基酸序列;及第2 PCP域,其包含序列編號5所示之胺基酸序列。但是,第2模組中之第1 C域、第2 A域及第2 PCP域並不分別限定於序列編號3、4及5所示之胺基酸序列,只要分別發揮作為C域、A域及PCP域之作用,則亦可為相對於序列編號3、4及5所示之胺基酸序列具有70%以上之同一性、較佳為80%以上之同一性、更佳為90%以上之同一性、進而較佳為95%以上之同一性、最佳為97%以上之同一性之胺基酸序列。 第3模組自N末端側起依序具有:第2 C域,其包含序列編號6所示之胺基酸序列;第3 A域,其包含序列編號7所示之胺基酸序列;第1 nMT域,其包含序列編號8所示之胺基酸序列;及第3 PCP域,其包含序列編號9所示之胺基酸序列。但是,第3模組中之第2 C域、第3 A域、第1 nMT域及第3 PCP域並不分別限定於序列編號6、7、8及9所示之胺基酸序列,只要分別發揮作為C域、A域、nMT域及PCP域之作用,則亦可為相對於序列編號6、7、8及9所示之胺基酸序列具有70%以上之同一性、較佳為80%以上之同一性、更佳為90%以上之同一性、進而較佳為95%以上之同一性、最佳為97%以上之同一性之胺基酸序列。 第4模組自N末端側起依序具有:第3 C域,其包含序列編號10所示之胺基酸序列;第4 A域,其包含序列編號11;及第4 PCP域,其包含序列編號12所示之胺基酸序列。但是,第4模組中之第3 C域、第4 A域及第4 PCP域並不分別限定於序列編號10、11及12所示之胺基酸序列,只要分別發揮作為C域、A域及PCP域之作用,則亦可為相對於序列編號10、11及12所示之胺基酸序列具有70%以上之同一性、較佳為80%以上之同一性、更佳為90%以上之同一性、進而較佳為95%以上之同一性、最佳為97%以上之同一性之胺基酸序列。 第5模組係自N末端側起依序具有:第4 C域,其包含序列編號13所示之胺基酸序列;第5 A域,其包含序列編號14所示之胺基酸序列;第2 nMT域,其包含序列編號15所示之胺基酸序列;及第5 PCP域,其包含序列編號16所示之胺基酸序列。但是,第5模組中之第4 C域、第5 A域、第2 nMT域及第5 PCP域並不分別限定於序列編號13、14、15及16所示之胺基酸序列,若分別作為C域、A域、nMT域及PCP域發揮作用,則亦可為相對於序列編號13、14、15及16所示之胺基酸序列具有70%以上之同一性、較佳為80%以上之同一性、更佳為90%以上之同一性、進而較佳為95%以上之同一性、最佳為97%以上之同一性之胺基酸序列。 第6模組係自N末端側起依序具有:第5 C域,其包含序列編號17所示之胺基酸序列;第6 A域,其包含序列編號18所示之胺基酸序列;第3 nMT域,其包含序列編號19所示之胺基酸序列;及第6 PCP域,其包含序列編號20所示之胺基酸序列。但是,第6模組中之第5 C域、第6 A域、第3 nMT域及第6 PCP域並不分別限定於序列編號17、18、19及20所示之胺基酸序列,若分別作為C域、A域、nMT域及PCP域發揮作用,則亦可為相對於序列編號17、18、19及20所示之胺基酸序列具有70%以上之同一性、較佳為80%以上之同一性、更佳為90%以上之同一性、進而較佳為95%以上之同一性、最佳為97%以上之同一性之胺基酸序列。 第7模組係自N末端側起依序具有:第6 C域,其包含序列編號21所示之胺基酸序列;第7 A域,其包含序列編號22所示之胺基酸序列;第4 nMT域,其包含序列編號23所示之胺基酸序列;及第7 PCP域,其包含序列編號24所示之胺基酸序列。但是,第7模組中之第6 C域、第7 A域、第4 nMT域及第7 PCP域並不分別限定於序列編號21、22、23及24所示之胺基酸序列,若分別作為C域、A域、nMT域及PCP域發揮作用,則亦可為相對於序列編號21、22、23及24所示之胺基酸序列具有70%以上之同一性、較佳為80%以上之同一性、更佳為90%以上之同一性、進而較佳為95%以上之同一性、最佳為97%以上之同一性之胺基酸序列。 第8模組係自N末端側起依序具有:第7 C域,其包含序列編號25所示之胺基酸序列;第8 A域,其包含序列編號26;及第8 PCP域,其包含序列編號27所示之胺基酸序列。但是,第8模組中之第7 C域、第8 A域及第8 PCP域並不分別限定於序列編號25、26及27所示之胺基酸序列,若分別作為C域、A域及PCP域發揮作用,則亦可為相對於序列編號25、26及27所示之胺基酸序列具有70%以上之同一性、較佳為80%以上之同一性、更佳為90%以上之同一性、進而較佳為95%以上之同一性、最佳為97%以上之同一性之胺基酸序列。 第9模組係自N末端側起依序具有:第8 C域,其包含序列編號28所示之胺基酸序列;第9 A域,其包含序列編號29所示之胺基酸序列;第5 nMT域,其包含序列編號30所示之胺基酸序列;及第9 PCP域,其包含序列編號31所示之胺基酸序列。但是,第9模組中之第8 C域、第9 A域、第5 nMT域及第9 PCP域並不分別限定於序列編號28、29、30及31所示之胺基酸序列,若分別作為C域、A域、nMT域及PCP域發揮作用,則亦可為相對於序列編號28、29、30及31所示之胺基酸序列具有70%以上之同一性、較佳為80%以上之同一性、更佳為90%以上之同一性、進而較佳為95%以上之同一性、最佳為97%以上之同一性之胺基酸序列。 第10模組係自N末端側起依序具有:第9 C域,其包含序列編號32所示之胺基酸序列;第10 A域,其包含序列編號33;第10 PCP域,其包含序列編號34所示之胺基酸序列;及第10 C域,其包含序列編號35所示之胺基酸序列。但是,第10模組中之第9 C域、第10 A域、第10 PCP域及第10 C域並不分別限定於序列編號32、33、34及35所示之胺基酸序列,若分別作為C域、A域、PCP域及C域發揮作用,則亦可為相對於序列編號32、33、34及35所示之胺基酸序列具有70%以上之同一性、較佳為80%以上之同一性、更佳為90%以上之同一性、進而較佳為95%以上之同一性、最佳為97%以上之同一性之胺基酸序列。 另外,於第1 A域與序列編號1之胺基酸序列不同之情形時,是否可作為與丙胺酸對應之A域發揮作用可如下評價。首先,以編碼以與序列編號1之胺基酸序列不同之方式設計之第1變異型A域的方式設計變異型NRPS基因。使該變異型NRPS基因於適當之宿主內表現,確認是否於宿主內及培養上清液中之代謝物中合成有具有上述環狀肽化合物之基本肽骨架之化合物。於在代謝物中合成有具有上述環狀肽化合物之基本肽骨架之化合物之情形時,可評價為設計之第1變異型A域作為與丙胺酸對應之A域發揮作用。再者,於第2~10 A域與序列編號4、7、11、14、18、22、26、29及33之胺基酸序列不同之情形時,亦可以相同之方式評價是否可作為A域發揮作用。 又,於第1 PCP域與序列編號2之胺基酸序列不同之情形時,是否可作為PCP域發揮作用可如下評價。首先,以編碼以與序列編號2之胺基酸序列不同之方式設計之第1變異型PCP域的方式設計變異型NRPS基因。使該變異型NRPS基因於適當之宿主內表現,確認是否於宿主內及培養上清液中之代謝物中合成有具有上述環狀肽化合物之基本肽骨架之化合物。於在代謝物中合成有具有上述環狀肽化合物之基本肽骨架之化合物之情形時,可評價為設計之第1變異型PCP域作為PCP域發揮作用。再者,於第2~10 PCP域與序列編號5、9、12、16、20、24、27、31及34之胺基酸序列不同之情形時,亦可以相同之方式評價是否可作為PCP域發揮作用。 進而,於第1 C域與序列編號3之胺基酸序列不同之情形時,是否可作為C域發揮作用可如下評價。首先,以編碼以與序列編號3之胺基酸序列不同之方式設計之第1變異型C域的方式設計變異型NRPS基因。使該變異型NRPS基因於適當之宿主內表現,確認是否於宿主內及培養上清液中之代謝物中合成有具有上述環狀肽化合物之基本肽骨架之化合物。於在代謝物中合成有具有上述環狀肽化合物之基本肽骨架之化合物之情形時,可評價為設計之第1變異型C域作為C域發揮作用。再者,於第2~10 C域與序列編號6、10、13、17、21、25、28、32及35之胺基酸序列不同之情形時,亦可以相同之方式評價是否可作為C域發揮作用。 進而,又,於第1 nMT域與序列編號8之胺基酸序列不同之情形時,是否可作為nMT域發揮作用可如下評價。首先,以編碼以與序列編號8之胺基酸序列不同之方式設計之第1變異型nMT域的方式設計變異型NRPS基因。使該變異型NRPS基因於適當之宿主內表現,確認是否於宿主內及培養上清液中之代謝物中合成有具有上述環狀肽化合物之基本肽骨架之化合物。於在代謝物中合成有具有上述環狀肽化合物之基本肽骨架之化合物之情形時,可評價為設計之第1變異型nMT域作為nMT域發揮作用。再者,於第2~5 nMT域與序列編號15、19、23及30之胺基酸序列不同之情形時,亦可以相同之方式評價是否可作為nMT域發揮作用。 如上所述,合成上述環狀肽化合物之基本肽骨架之NRPS可藉由第1模組~第10模組規定。作為一例,將源自棒狀彎孢菌,且具有上述環狀肽化合物中之基本肽骨架之合成活性之NRPS的胺基酸序列示於序列編號37,將與序列編號37所示之胺基酸序列對應之編碼區域之鹼基序列示於序列編號36。 因此,本發明之NRPS基因可為具備上述序列編號1~35所示之胺基酸序列所規定之第1模組~第10模組,並且編碼如下蛋白質之基因:為相對於序列編號37所示之胺基酸序列具有70%以上之同一性、較佳為80%以上之同一性、更佳為90%以上之同一性、進而較佳為95%以上之同一性、最佳為97%以上之同一性之胺基酸序列,且具有上述環狀肽化合物中之基本肽骨架之合成活性。胺基酸序列間之同一性之值可藉由安裝有BLAST演算法之BLASTN或BLASTX程式算出(缺省之設定)。再者,同一性之值係算出對一對胺基酸序列進行成對比對分析時完全一致之胺基酸殘基,以進行比較之所有胺基酸殘基中之比率之形式算出。 又,本發明之NRPS基因亦可具備上述序列編號1~35所示之胺基酸序列所規定之第1模組~第10模組,並且編碼如下蛋白質:具有對序列編號37之胺基酸序列而1個或數個胺基酸經置換、缺失、插入或附加之胺基酸序列,且具有上述環狀肽化合物中之基本肽骨架之合成活性。此處,數個例如為2~1300個,較佳為2~1000個,更佳為2~700個,進而較佳為2~500個,進而較佳為2~250個,進而較佳為2~100個,進而較佳為2~50個。 進而,本發明之NRPS基因亦可具備上述序列編號1~35所示之胺基酸序列所規定之第1模組~第10模組,並且於嚴格之條件下與包含序列編號36之鹼基序列之DNA之互補鏈之全部或一部分進行雜交,且編碼具有上述環狀肽化合物中之基本肽骨架之合成活性之蛋白質。此處所謂之「嚴格之條件」意指所謂形成特異性之雜種,且不形成非特異性之雜種之條件,例如可參照分子選殖(Molecular Cloning):實驗室手冊(A Laboratory Manual)(第三版(Third Edition))適當確定。具體而言,可根據Southern雜交時之溫度或溶液中所包含之鹽濃度、及Southern雜交之清洗步驟時之溫度或溶液中所包含之鹽濃度設定嚴格度。更詳細而言,作為嚴格之條件,例如鈉濃度為25~500 mM,較佳為25~300 mM,溫度為42~68℃,較佳為42~65℃。更具體而言,為5×SSC(83 mM之NaCl、83 mM檸檬酸鈉)、溫度42℃。 另外,本發明之NRPS基因並不限定於上述具備序列編號1~35所示之胺基酸序列所規定之第1模組~第10模組之編碼蛋白質者。如上所述,將源自棒狀彎孢菌,且具有上述環狀肽化合物中之基本肽骨架之合成活性之NRPS的胺基酸序列示於序列編號37,將與該胺基酸序列對應之編碼區域之鹼基序列示於序列編號36,但亦可藉由該等序列編號36及37規定本發明之NRPS基因。 即,本發明之NRPS基因可採用編碼包含序列編號37所示之胺基酸序列之蛋白質的基因。 又,本發明之NRPS基因亦可為編碼如下蛋白質之基因:為相對於序列編號37所示之胺基酸序列具有70%以上之同一性、較佳為80%以上之同一性、更佳為90%以上之同一性、進而較佳為95%以上之同一性、最佳為97%以上之同一性之胺基酸序列,且具有上述環狀肽化合物中之基本肽骨架之合成活性。胺基酸序列間之同一性之值可以與上述相同之方式,藉由安裝有BLAST演算法之BLASTN或BLASTX程式算出(缺省之設定)。再者,同一性之值係以與上述相同之方式算出對一對胺基酸序列進行成對比對分析時完全一致之胺基酸殘基,以進行比較之所有胺基酸殘基中之比率之形式算出。 又,本發明之NRPS基因可利用儲存有鹼基序列資訊之公知之資料庫,鑑定出滿足對序列編號36所示之鹼基序列覆蓋率較高,E-value較低,同一性(identity)之值較高之條件之基因。此處,作為鑑定之基因之條件,覆蓋率可設為90%以上,較佳為設為95%以上,更佳為設為99%以上。又,作為鑑定之基因之條件,E-value可設為1.0e-5以下,較佳為設為1.0e-15以下,更佳為設為0.0。進而,又,作為鑑定之基因之條件,同一性之值可設為70%以上,較佳為設為75%以上,更佳為設為80%以上。鑑定為滿足該等條件者之基因可鑑定為作為包含序列編號36之鹼基序列之NRPS基因之同源基因之可能性非常高,且與包含序列編號36之鹼基序列之NRPS基因同樣地編碼具有上述環狀肽化合物中之基本肽骨架之合成活性之蛋白質的基因。 鑑定之基因編碼具有上述環狀肽化合物中之基本肽骨架之合成活性之蛋白質只要獲取具有該基因之微生物,驗證該微生物中之上述環狀肽化合物合成能力即可。獲取之微生物中之上述環狀肽化合物能力可藉由培養該微生物,確認於培養菌體內或培養上清液中是否包含上述環狀肽化合物而驗證。 另外,本發明之NRPS基因若確定其鹼基序列,則可藉由化學合成,或者藉由以基因體DNA作為模板之PCR(polymerase chain reaction,聚合酶鏈反應),或者藉由以具有該鹼基序列之DNA片段作為探針進行雜交而製作。進而,包含與序列編號36不同之鹼基序列之基因、或編碼與序列編號37不同之胺基酸序列之基因亦可對包含序列編號36所示之鹼基序列之聚核苷酸藉由定點誘變等進行合成。再者,於對包含序列編號36所示之鹼基序列之聚核苷酸導入變異時,可採用Kunkel法、Gapped duplex法等公知之方法或依據其之方法。例如使用利用定點突變誘發法之變異導入用套組(例如Mutant-K(TAKARA BIO公司製造)或Mutant-G(TAKARA BIO公司製造))等,或者使用TAKARA BIO公司之LA PCR in vitro Mutagenesis系列套組而進行變異之導入。 尤其是本發明之NRPS基因可自已知生產上述環狀肽化合物之微生物單離。作為一例,可自棒狀彎孢菌單離NRPS基因(編碼序列編號37所示之胺基酸序列之NRPS基因)。 又,本發明之NRPS基因係利用序列編號36所示之鹼基序列,亦可自棒狀彎孢菌以外之彎孢屬絲狀菌單離之可能性較高。即,藉由利用以包含選自序列編號36所示之鹼基序列中之連續之一部分鹼基序列之聚核苷酸作為探針的雜交反應,可自棒狀彎孢菌以外之彎孢屬絲狀菌之基因體或源自轉錄產物之cDNA單離本發明之NRPS基因。再者,棒狀彎孢菌以外之彎孢屬絲狀菌可為不生產上述環狀肽化合物者,亦可為生產上述環狀肽化合物者。其原因在於即便為不生產上述環狀肽化合物之彎孢屬絲狀菌,亦可具有本發明之NRPS基因。 作為棒狀彎孢菌以外之彎孢屬絲狀菌,例如可列舉:近緣彎孢菌(C. affinis)、短孢子彎孢(C. brachyspora)、番木瓜彎孢菌(C. caricae-papayae)、畫眉草彎孢菌(C. eragrostidis)(畫眉草旋孢腔菌(Cochliobolus eragrostidis)(有性型(Teleomorph))、假彎孢菌(C. fallax)、膝曲彎孢菌(C. geniculata)(膝曲旋孢腔菌(Cochliobolus geniculatus)(有性型(Teleomorph))、哈氏彎孢菌(C. harveyi)、半月彎孢菌(C. lunata)(半月旋孢腔菌(Cochliobolus lunatus)(有性型(Teleomorph))、卵形彎孢菌(C. ovoidea)、蒼變淡彎孢菌(C. pallescens)、狗尾彎孢菌(C. penniseti)、普瑞斯彎孢菌(C. prasadii)、管突彎孢菌(C. protuberata)、塞內加爾彎孢菌(C. senegalensis)、三葉彎孢菌(C. trifolii)及小瘤彎孢菌(C. tuberculata)(小瘤旋孢腔菌(Cochliobolus tuberculatus)(有性型(Teleomorph))等。 [彎孢屬絲狀菌] 本發明之彎孢屬絲狀菌具備具有上述NRPS基因之特徵。如上所述,本發明之NRPS基因亦可自棒狀彎孢菌以外之彎孢屬絲狀菌單離之可能性較高。即,本發明之彎孢屬絲狀菌並不限定於棒狀彎孢菌,可列舉:生產環狀肽化合物之近緣彎孢菌(C. affinis)、短孢子彎孢(C. brachyspora)、番木瓜彎孢菌(C. caricae-papayae)、畫眉草彎孢菌(C. eragrostidis)(畫眉草旋孢腔菌(Cochliobolus eragrostidis))、假彎孢菌(C. fallax)、膝曲彎孢菌(C. geniculata)(膝曲旋孢腔菌(Cochliobolus geniculatus))、哈氏彎孢菌(C. harveyi)、半月彎孢菌(C. lunata)(半月旋孢腔菌(Cochliobolus lunatus))、卵形彎孢菌(C. ovoidea)、蒼變淡彎孢菌(C. pallescens)、狗尾彎孢菌(C. penniseti)、普瑞斯彎孢菌(C. prasadii)、管突彎孢菌(C. protuberata)、塞內加爾彎孢菌(C. senegalensis)、三葉彎孢菌(C. trifolii)、小瘤彎孢菌(C. tuberculata)(小瘤旋孢腔菌(Cochliobolus tuberculatus))等。 作為本發明之彎孢屬絲狀菌,尤佳為棒狀彎孢菌。進而,作為本發明之彎孢屬絲狀菌,可列舉由秋田今野商店股份有限公司分售之棒狀彎孢菌BAUA-2787株。關於棒狀彎孢菌BAUA-2787,於2016年12月28日,以寄存編號NITE BP-02399寄存於獨立行政法人製品評價技術基盤機構專利微生物寄存中心(NPMD)(〒292-0818 日本千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8 122號室)。 [轉錄因子基因] 上述參與環狀肽化合物之合成之基因群中所包含之轉錄因子基因係編碼具有以轉錄水準確實地控制該基因群中所包含之各基因之表現之功能的蛋白質。關於本發明之轉錄因子基因,作為一例,將源自棒狀彎孢菌,且具有對參與環狀肽化合物之合成之基因群中所包含之基因之轉錄促進活性之蛋白質的胺基酸序列示於序列編號39,將與該胺基酸序列對應之編碼區域之鹼基序列示於序列編號38。本發明之轉錄因子基因可藉由該等序列編號38及39規定。 即,本發明之轉錄因子基因可採用編碼包含序列編號39所示之胺基酸序列之蛋白質的基因。 又,本發明之轉錄因子基因亦可為編碼如下蛋白質之基因:為相對於序列編號39所示之胺基酸序列具有70%以上之同一性、較佳為80%以上之同一性、更佳為90%以上之同一性、進而較佳為95%以上之同一性、最佳為97%以上之同一性之胺基酸序列,且具有上述轉錄促進活性。胺基酸序列間之同一性之值可以與上述相同之方式,藉由安裝有BLAST演算法之BLASTN或BLASTX程式算出(缺省之設定)。再者,同一性之值係以與上述相同之方式算出對一對胺基酸序列進行成對比對分析時完全一致之胺基酸殘基,以進行比較之所有胺基酸殘基中之比率之形式算出。 進而,本發明之轉錄因子基因亦可為編碼具有對序列編號39之胺基酸序列而1個或數個胺基酸經置換、缺失、插入或附加之胺基酸序列,且具有上述轉錄促進活性之蛋白質者。此處,數個係與上述同樣地,例如為2~40個,較佳為2~30個,更佳為2~20個,進而較佳為2~10個,進而較佳為2~5個。 進而,又,本發明之轉錄因子基因亦可為於嚴格之條件下與包含序列編號38之鹼基序列之DNA之互補鏈之全部或一部分進行雜交,且編碼具有上述轉錄促進活性之蛋白質者。此處所謂之「嚴格之條件」係與上述同樣地意指所謂形成特異性之雜種,且不形成非特異性之雜種之條件,例如可參照分子選殖:實驗室手冊(第三版)適當確定。具體而言,可以與上述相同之方式,根據Southern雜交時之溫度或溶液中所包含之鹽濃度、及Southern雜交之清洗步驟時之溫度或溶液中所包含之鹽濃度而設定嚴格度。更詳細而言,作為嚴格之條件,例如鈉濃度為25~500 mM,較佳為25~300 mM,溫度為42~68℃,較佳為42~65℃。更具體而言,為5×SSC(83 mM之NaCl、83 mM檸檬酸鈉)、溫度42℃。 如上所述,包含與序列編號38不同之鹼基序列之基因、或編碼與序列編號39不同之胺基酸序列之基因是否編碼具有轉錄促進活性之蛋白質可藉由將該基因以能夠表現之方式導入至生產上述環狀肽化合物之宿主(一例為棒狀彎孢菌),以轉錄水準驗證參與該宿主中之環狀肽化合物之合成之基因群之表現而確認。 另外,本發明之轉錄因子基因若確定其鹼基序列,則可藉由化學合成,或者藉由以基因體DNA作為模板之PCR,或者藉由以具有該鹼基序列之DNA片段作為探針進行雜交而製作。進而,包含與序列編號38不同之鹼基序列之基因、或編碼與序列編號39不同之胺基酸序列之基因亦可藉由對包含序列編號38所示之鹼基序列之聚核苷酸進行定點突變誘發等而合成。再者,於對包含序列編號38所示之鹼基序列之聚核苷酸導入變異時,可採用Kunkel法、Gapped duplex法等公知之方法或依據其之方法。例如使用利用定點突變誘發法之變異導入用套組(例如Mutant-K(TAKARA BIO公司製造)或Mutant-G(TAKARA BIO公司製造))等,或者使用TAKARA BIO公司之LA PCR 體外突變系列套組而進行變異之導入。 尤其是本發明之轉錄因子基因可自已知生產上述環狀肽化合物之微生物單離。作為一例,可自棒狀彎孢菌單離轉錄因子基因(編碼序列編號39所示之胺基酸序列之轉錄因子基因)。 又,本發明之轉錄因子基因利用序列編號38所示之鹼基序列,亦可自棒狀彎孢菌以外之彎孢屬絲狀菌單離之蓋然性較高。即,藉由利用以包含選自序列編號38所示之鹼基序列中之連續之一部分鹼基序列之聚核苷酸作為探針的雜交反應,可自棒狀彎孢菌以外之彎孢屬絲狀菌之基因體或源自轉錄產物之cDNA單離本發明之轉錄因子基因。再者,棒狀彎孢菌以外之彎孢屬絲狀菌可為不生產上述環狀肽化合物者,亦可為生產上述環狀肽化合物者。其原因在於即便為不生產上述環狀肽化合物之彎孢屬絲狀菌,亦可具有本發明之NRPS基因。 作為棒狀彎孢菌以外之彎孢屬絲狀菌,例如可列舉:近緣彎孢菌(C. affinis)、短孢子彎孢(C. brachyspora)、番木瓜彎孢菌(C. caricae-papayae)、畫眉草彎孢菌(C. eragrostidis)(畫眉草旋孢腔菌(Cochliobolus eragrostidis)(有性型(Teleomorph))、假彎孢菌(C. fallax)、膝曲彎孢菌(C. geniculata)(膝曲旋孢腔菌(Cochliobolus geniculatus)(有性型(Teleomorph))、哈氏彎孢菌(C. harveyi)、半月彎孢菌(C. lunata)(半月旋孢腔菌(Cochliobolus lunatus)(有性型(Teleomorph))、卵形彎孢菌(C. ovoidea)、蒼變淡彎孢菌(C. pallescens)、狗尾彎孢菌(C. penniseti)、普瑞斯彎孢菌(C. prasadii)、管突彎孢菌(C. protuberata)、塞內加爾彎孢菌(C. senegalensis)、三葉彎孢菌(C. trifolii)及小瘤彎孢菌(C. tuberculata)(小瘤旋孢腔菌(Cochliobolus tuberculatus)(有性型(Teleomorph))等。 [轉形體] 藉由將上述本發明之環狀肽化合物合成相關基因中之NRPS基因以能夠表現之方式導入至宿主,可製作具備具有上述環狀肽化合物中之基本肽骨架之化合物合成能力的轉形體,又,藉由將NRPS基因以外之環狀肽化合物合成基因與NRPS基因一起以能夠表現之方式導入至宿主,可製作具有上述環狀肽化合物合成能力之轉形體。 此處,於製作具有上述環狀肽化合物合成能力之轉形體時,作為NRPS基因以外之環狀肽化合物合成相關基因,可導入上述轉錄因子基因,亦可不導入。例如藉由將NRPS基因及其他基因於配置於可於宿主發揮作用之恆常表現啟動子之下游之狀態下導入至宿主,可恆常地表現誘導該等NRPS基因及其他基因。於此情形時,即便不導入上述轉錄因子基因,亦可表現環狀肽化合物合成相關基因而生產上述環狀肽化合物。 此處,作為宿主,並無特別限定,任何生物、尤其是任何微生物均可作為宿主。可用作宿主之微生物並無特別限定,例如可列舉:大腸桿菌(Escherichia coli)等屬於大腸桿菌屬之細菌、麩胺酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)等屬於棒狀桿菌之細菌、枯草桿菌(Bacillus subtilis)等屬於芽孢桿菌屬之細菌、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)等屬於假單胞菌屬之細菌、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)等屬於根瘤菌屬之細菌,且可列舉包含釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、畢赤酵母(Pichia pastoris)等酵母、絲狀菌等之真菌。 於以大腸桿菌等細菌作為宿主之情形時,較佳為表現載體可於該細菌中進行自主複製,同時包含啟動子、核糖體結合序列、上述基因、轉錄終止序列。又,於表現載體中亦可包含控制啟動子活性之基因。 作為啟動子,只要為可於大腸桿菌等宿主中表現者,則可使用任一啟動子。例如使用trp啟動子、lac啟動子、PL啟動子、PR啟動子等源自大腸桿菌者、或T7啟動子等源自噬菌體者。進而,亦可使用如tac啟動子等般人為地進行設計修飾之啟動子。 作為表現載體之導入方法,只要為於細菌導入DNA之方法,則並無特別限定。例如可列舉:使用鈣離子之方法[Cohen, S. N., et al. : Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69: 2110-2114(1972)]、電穿孔法等。 又,作為可用作宿主之酵母,並無特別限定,可列舉:休哈塔假絲酵母(Candida Shehatae)等念珠菌(Candida)屬酵母、畢赤酵母(Pichia stipitis)等畢赤酵母菌(Pichia)屬酵母、嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)等管囊酵母(Pachysolen)屬酵母、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等酵母菌(Saccharomyces)屬酵母及粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等裂殖酵母(Schizosaccharomyces)屬酵母,尤佳為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。 又,於強化上述NRPS基因或其他基因之表現時,使用轉錄活性較高之適當之啟動子。作為此種啟動子,並無特別限定,例如可利用甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(TDH3)之啟動子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)之啟動子、高滲透壓應答7基因(HOR7)之啟動子等。其中,由於丙酮酸脫羧酶基因(PDC1)之啟動子高表現下游之目標基因之能力較高,故而較佳。除此以外,亦使用gal1啟動子、gal10啟動子、熱休克蛋白質啟動子、MFα1啟動子、PHO5啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子、AOX1啟動子等,藉此可強烈表現下游之基因。 又,作為可用於宿主之絲狀菌,並無特別限定,可列舉:小巢狀麴菌(Aspergillus nidulans)、黑麴菌(Aspergillus niger)、米麴菌、醬油麴菌(Aspergillus sojae)、灰綠麯黴(Aspergillus glaucus)等麴菌屬絲狀菌;瑞氏木黴(Trichoderma reesei)、綠色木黴(Trichoderma viride)等木黴(Trichoderma)屬絲狀菌;微小根毛黴(Rhizomucor pusillus)、米赫根毛黴(Rhizomucor miehei)等根毛黴(Rhizomucor)屬絲狀菌;青黴(Penicillium notatum)、產黃青黴(Penicillium chrysogenum)等青黴(Penicillium)屬絲狀菌;米根黴(Rhizopus oryzae)等根黴(Rhizopus)屬絲狀菌;解纖維枝頂孢黴(Acremonium cellulolyticus)、灰腐質黴(Humicola grisea)、嗜熱子囊菌(Thermoaseus aurantiacus)。尤其作為宿主,較佳為麴菌屬絲狀菌,其中較佳為米麴菌。 於在絲狀菌中表現上述NRPS基因或其他基因時,可使用α-澱粉酶基因(amyB)之啟動子、α-葡萄糖苷酶基因(agdA)之啟動子、葡糖澱粉酶基因之啟動子(glaA)、色胺酸生物合成基因(trpC)之啟動子、醇脫氫酶基因(alcA)之啟動子、轉譯伸長因子基因(tef1)之啟動子、磷酸丙糖異構酶基因(tpiA)之啟動子、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gpdA)基因之啟動子、烯醇酶(enoA)之啟動子、丙酮酸羧化酶(pdcA)之啟動子、纖維二糖水解酶基因(cbh1)之啟動子等。 又,作為導入上述基因之方法,可應用已知為酵母及絲狀菌之轉形方法之先前公知之任一方法。具體而言,例如可使用轉型法、或轉染法、接合法、原生質體法、球形質體法、電穿孔法、脂轉染法、乙酸鋰法等。 [環狀肽化合物之製造] 藉由利用上述轉形體,可製造目標環狀肽化合物。 即,藉由利用可表現地導入有上述本發明之環狀肽化合物合成相關基因中之NRPS基因之轉形體,可製造具有上述環狀肽化合物中之基本肽骨架之化合物。例如,可藉由化學合成反應,自所獲得之化合物製造上述環狀肽化合物。又,藉由利用可表現地導入有NRPS基因及其他基因之轉形體,可製造上述環狀肽化合物。 藉由轉形體合成之上述環狀肽化合物、或具有其基本肽骨架之化合物可自培養上清液,藉由離心分離機、Miracloth等分離菌體後,加入乙酸乙酯等有機溶劑進行萃取。又,可自菌體內,藉由物理破壞法(均質機、玻璃珠破碎、凍結融解等)或化學破壞法(溶劑處理、酸、鹼處理、滲透壓處理、酵素處理等)釋出至菌體外後,加入乙酸乙酯等有機溶劑進行萃取。關於萃取之上述環狀肽化合物或具有其基本肽骨架之化合物之純化,可藉由既有之純化方法(管柱層析法、鹽沈澱等)實施。該等方法可視需要適當組合而實施。 如上所述般製造之上述環狀肽化合物例如可用作具有對植物病原菌、尤其是菌類之殺菌作用之殺菌劑。更具體而言,於使用上述環狀肽化合物作為殺菌劑之情形時,可直接使用,通常可與適當之固體載體、液體載體等、界面活性劑及其他製劑用助劑進行混合,製成乳劑、EW劑、液劑、懸浮劑、水合劑、顆粒水合劑、粉劑、DL粉劑、微粒劑、微粒劑F、粒劑、錠劑、油劑、氣溶膠、水懸劑、乾水懸劑、微膠囊劑等任意之劑型而使用。 作為固體載體,例如可列舉:澱粉、活性碳、大豆粉、小麥粉、木粉、魚粉、乳粉等動植物性粉末;滑石、高嶺土、膨潤土、碳酸鈣、沸石、矽藻土、白碳、黏土、氧化鋁、硫酸銨、脲等無機物粉末。 作為液體載體,例如可列舉:水;異丙醇、乙二醇等醇類;環己酮、甲基乙基酮等酮類;二㗁烷、四氫呋喃等醚類;煤油、輕油等脂肪族烴類;二甲苯、三甲基苯、四甲基苯、甲基萘、溶劑石腦油等芳香族烴類;氯苯等鹵化烴類;二甲基乙醯胺等醯胺類;脂肪酸之甘油酯等酯類;乙腈等腈類;二甲基亞碸等含硫化合物類等。 作為界面活性劑,例如可列舉:烷基苯磺酸金屬鹽、二萘基甲二磺酸金屬鹽、醇硫酸酯鹽、烷基芳基磺酸鹽、木質素磺酸鹽、聚氧乙二醇醚、聚氧乙烯烷基芳基醚、聚氧乙烯山梨醇單烷化物等。 作為其他助劑,例如可使用羧甲基纖維素、阿拉伯膠、海藻酸鈉、瓜爾膠、黃耆膠、聚乙烯醇等固著劑或增黏劑、金屬皂等消泡劑、脂肪酸、烷基磷酸鹽、聚矽氧、石蠟等物性提昇劑、著色劑等。 殺菌劑之各種製劑或其稀釋物之施用通常可藉由一般進行之施用方法、即散佈(例如噴霧、成霧、霧化、撒粉、散粒、水面施用、箱施用等)、土壤施用(例如混入、灌注等)、表面施用(例如塗佈、粉末塗佈、被覆等)、浸漬、毒餌、熏煙施用等進行。又,亦可藉由所謂超高濃度少量散佈法施用。於該方法中,可含有活性成分100%。 進而,以上述環狀肽化合物作為有效成分之殺菌劑當然上述環狀肽化合物單獨亦作為有效成分充分有效,可視需要與其他肥料、農藥、例如殺蟲劑、殺蟎劑、殺線蟲劑、其他殺菌劑、抗病毒劑、引誘劑、除草劑、植物生長調整劑等混用、併用,亦有於此情形時表現出更優異之效果之情況。作為KK-1本身表現出防除效果之植物病原菌,例如可列舉:灰色黴菌(灰色葡萄孢菌)、白粉病菌(禾本科布氏白粉菌(Blumeria graminis))、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、紋枯病菌(瓜亡革菌(Thanatephorus cucumeris(Frank)Donk))等,但並不限定於該等。 [實施例] 以下,藉由實施例更詳細地說明本發明,但本發明之技術範圍並不限定於以下之實施例。 [實施例1] [棒狀彎孢菌之基因體分析] 將由秋田今野商店股份有限公司分售之棒狀彎孢菌BAUA-2787株之分生孢子植菌於200 ml之CM液體培養基(500 ml錐形瓶)中,於26℃、130 rpm之條件下培養48小時。藉由Miracloth收集培養菌體後,藉由刮勺按壓菌體進行脫水,於預先冷卻至-20℃之研缽中放入菌體,注入液態氮使之冷凍。藉由杵迅速破碎至成為粉狀後,使用DNeasy Plant Maxi Kit萃取基因體DNA。 基因體分析係使用2種下一代定序儀(5500xl SOLiD(life technologies)及MiSeq(illumina))而實施。自所製備之棒狀彎孢菌之基因體DNA使用5500 SOLiD Mate-Paired Library Kit(5500xl SOLiD用)、Nextera DNA Sample Prep Kit(MiSeq用)製作基因庫,進行藉由下一代定序儀之基因體分析。 [棒狀彎孢菌所具有之NRPS基因之探索] 棒狀彎孢菌BAUA-2787株所產生之環狀肽(以下,稱為KK-1)係如圖2所示,包含10個胺基酸之環狀肽,作為特徵,可列舉:具有9個之肽鍵中之5個經N-甲基化之方面;及分子內之酪胺酸(Tyr)殘基經O-甲基化之方面。於本實施例中,探索合成本KK-1之基本骨架之非核糖體型肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase(NRPS))基因。 首先,於推定KK-1之生物合成基因簇時,基於棒狀彎孢菌BAUA-2787株之基因體序列資訊推定生物合成肽之基本骨架之NRPS基因。 NRPS係不經由核糖體連結胺基酸而合成肽之酵素,具有依序與構成作為生產物之肽之胺基酸殘基之數量一致的模組結構。因此,可推定具有與化合物之結構特徵一致之模組及區結構之NRPS係生物合成該化合物之肽骨架之NRPS。 藉由棒狀彎孢菌BAUA-2787株之基因體分析,推定本菌所具有之基因、及經編碼之蛋白質之序列,故而自棒狀彎孢菌之基因體中檢索所有推定為編碼NRPS之基因,基於該等推定蛋白質之結構特徵,進行生物合成KK-1之肽基本骨架之基因之推定。 首先,藉由與作為近緣之絲狀菌之異旋孢腔菌(Cochliobolus heterostrophus)之NRPS之同源性檢索,探索棒狀彎孢菌之所有NRPS基因。於異旋孢腔菌(C. heterostrophus)中,發現12個NRPS基因NPS1~12。若調查該等12個NRPS之區結構,則NPS7係與PKS(polyketide synthase,聚酮合酶)之雜種(hybrid)型NRPS,NPS10及NPS12係不具有C域之類NRPS蛋白(NRPS-like protein)。因此,以除該等3個以外之NPS1~6、NPS8、NPS9及NPS11之胺基酸序列作為同源性檢索之查詢,對棒狀彎孢菌之推定蛋白質之胺基酸序列之資料庫進行blastp檢索。於絲狀菌中,考慮具有10個左右之NRPS之報告(異旋孢腔菌為12個之NRPS,煙麯黴(Asperillus fumigatus)為14個之NRPS),分別對作為查詢之基因萃取命中之上位20基因,結果縮小範圍至以下之24種基因。 TRAF01000140000154、TRAF01000135000001、TRAF01000070000001、TRAF01000068000001、TRAF01000108000067、TRAF01000130000847、TRAF01000117000049、TRAF01000117000050、TRAF01000099000028、TRAF01000088000002、TRAF01000082000001、TRAF01000081000001、TRAF01000117000368、TRAF01000142000376、TRAF01000109000032、TRAF01000142000383、TRAF01000136000233、TRAF01000100000101、TRAF01000061000021、TRAF01000108000142、TRAF01000139000099、TRAF01000140000122、TRAF01000117000201、TRAF01000136000219 棒狀彎孢菌之基因序列(CDS)係基於藉由下一代定序儀分析之基因體DNA序列,藉由專用程式進行預測。然而,該CDS預測錯誤之情況亦不少,多數情況下尤其是因內含子之存在等,CDS之5'-側及3'-側之序列被刪去,預測為短於實際之CDS。為了獲得更準確之CDS,必須利用基因所位於之基因體區域周邊之序列資訊等,逐個詳細地進行研究。因此,首先,以自縮小範圍之24種基因各者之推定起始密碼子之上游3000 bp至推定終止密碼子之下游3000 bp的基因體DNA序列作為查詢,對GenBank之資料庫進行blastx檢索。藉由該檢索,可知與已知之蛋白質序列表現出同源性之區域,故而推定基因之起始及終止密碼子。又,同樣地因與已知之蛋白質序列之同源性而表現出存在內含子之部位,故而按照GU-AG rule預測內含子部位,推定更準確之CDS。 其結果為,可知TRAF01000117000049及TRAF01000117000050係推定為不同之基因,但實際上為一種基因(設為TRAF01000117000049-50)。又,亦有因未充分地獲得檢索中所使用之基因之周邊基因體DNA序列之原因,5'-側缺失(無法發現起始密碼子)或3'-側缺失(無法發現終止密碼子)之基因。以下,示出該等基因。 TRAF01000135000001(5'缺失) TRAF01000070000001(5'、3'均缺失) TRAF01000068000001(3'缺失) TRAF01000088000002(3'缺失) TRAF01000082000001(5'缺失) TRAF01000081000001(3'缺失) TRAF01000117000368(5'缺失) 更詳細地分析該等序列,結果於TRAF01000068000001之3'-末端、TRAF01000070000001之5'-及3'-末端、TRAF01000135000001之5'-末端發現2285 bp之完全相同之序列。即,推定該等3種基因實際上為TRAF01000068000001、TRAF01000070000001及TRAF01000135000001依序連接而成之1種基因(設為TRAF01000135000001_J3G)。 又,同樣地,於TRAF01000088000002及TRAF01000081000001之3'-末端以及TRAF01000082000001及TRAF01000117000368之5'-末端發現2959 bp之完全相同之序列。即,推定該等4種基因實際上為2種基因。但是,該等基因可能會以 1)TRAF01000088000002-TRAF01000082000001 2)TRAF01000088000002-TRAF01000117000368 3)TRAF01000081000001-TRAF01000082000001 4)TRAF01000081000001-TRAF01000117000368 之4種組合連接,無法自序列資訊確定正確之組合。 繼而,調查進行CDS之預測之基因所編碼之蛋白質之區結構。於該分析中,使用InterProScan及antiSMASH程式,將藉由antiSMASH獲得之分析結果示於圖3-1及3-2。具有NRPS之功能必需之A域、PCP域、C域之基因係TRAF01000140000154、TRAF01000135000001_J3G、TRAF01000108000067、TRAF01000130000847、TRAF01000117000049、TRAF01000117000050、TRAF01000099000028、TRAF01000088000002、TRAF01000082000001、TRAF01000081000001、TRAF01000117000368、TRAF01000142000376、TRAF01000109000032、TRAF01000142000383之14種基因,但如上所述,該等中之4個(TRAF01000088000002、TRAF01000082000001、TRAF01000081000001、TRAF01000117000368)係2種基因斷裂成者,故而棒狀彎孢菌BAUA-2787株具有12個NRPS基因。再者,關於TRAF01000142000383,藉由antiSMASH之分析中發現者僅為A域及C域,但自藉由InterProScan之分析,於N末端側發現類PCP域之序列,故而推定為NRPS。又,TRAF01000109000032由於在N末端側具有典型之PKS(polyketide synthase,聚酮合酶)之區,故而認為為PKS-NRPS雜種。 [參與KK-1之生物合成之NRPS之推定] 認為棒狀彎孢菌BAUA-2787株具有12個NRPS基因,故而自其中進行生物合成KK-1之基本肽骨架之基因之探索。KK-1係如圖2所示,以包含10個胺基酸之環狀之肽作為基本骨架。Tyr與Ala之間成為酯鍵結而並非肽鍵結,認為受到某些修飾而成為此種形式。藉由NRPS而生物合成之肽具有構成之胺基酸之數量與生物合成NRPS之模組之數量一致的特徵。因此,認為生物合成包含10個胺基酸之KK-1之基本肽骨架之NRPS具有10個模組、即10個A域。因此,調查棒狀彎孢菌之12個推定NRPS基因之A域之數量,結果僅TRAF01000135000001_J3G具有10個A域,故而認為本基因係與KK-1之生物合成有關之NRPS(圖3-1)。 於TRAF01000135000001_J3G之區結構,如圖1所示,存在5個將肽鍵進行N-甲基化之N-甲基轉移酶域(N-methy transferase domain)(nMT域),位於第3模組、第5模組、第6模組、第7模組及第9模組。NRPS之各模組之位置係與構成生物合成之肽之胺基酸的位置一致,同樣地,具有nMT域之模組與經N-甲基化之肽鍵之位置亦一致。若假設TRAF01000135000001_J3G之第1模組與KK-1之Ala殘基對應,則具有nMT域之模組與經N-甲基化之肽鍵之位置完全一致。根據該情況,強烈提示TRAF01000135000001_J3G為生物合成KK-1之基本肽骨架之NRPS。 進而,推定藉由TRAF01000135000001_J3G合成Ala-Pip-(N-甲基)Val-Val-(N-甲基)Asp-(N-甲基)Val-(N-甲基)Ile-Gly-(N-甲基)Val-Tyr之肽後,進行環化及修飾。再者,已知於見解較多之源自細菌之NRPS中,TE域擔負環化反應。相對於此,於絲狀菌中,於較多之NRPS中缺少TE域,但包含C域。可知近年來,於絲狀菌中,該C域擔負肽之環化。 於TRAF01000135000001_J3G中亦於第10模組之C末端具有C域,考慮該C域進行環化之可能性。又,推定藉由TRAF01000135000001_J3G生物合成基本肽骨架後,藉由各種酵素進行修飾,生物合成KK-1。認為該等修飾酵素基因係與TRAF01000135000001_J3G一起於棒狀彎孢菌BAUA-2787株之基因體中形成基因簇。 將與構成推定之NRPS之第1模組~第10模組中所包含之各區、其胺基酸序列相關之序列編號等彙總於下述表。 [表1]
再者,於表1中,「胺基酸序列」之欄中所記載之數值範圍表示推定之NRPS之所有胺基酸序列(序列編號37)中之胺基酸殘基的位置。 [KK-1之生物合成基因簇之推定] 如上所述,推定TRAF01000135000001_J3G作為形成KK-1之基本肽骨架之NRPS基因,故而認為於包含該NRPS(TRAF01000135000001_J3G)之區域存在構成KK-1生物合成基因簇之基因群。因此,關於位於該NRPS周邊之基因,基於編碼之蛋白質之胺基酸序列、及基於胺基酸序列推定之功能,嘗試構成生物合成基因簇之基因群之推定。再者,TRAF01000135000001_J3G係將基因體序列及基因預測時斷裂之3個序列結合而成者,故而於以下之基因簇之預測中使用結合後之序列。 首先,萃取NRPS基因(TRAF01000135000001_J3G)之上游、下游各者之14種基因,繼而,藉由對GenBank資料庫之blastp檢索,對該等基因附加註解。將其結果示於圖4。根據該註解,將包含可能會參與二次代謝之基因之區域(TRAF01000135000002至TRAF01000068000009)推定為KK-1生物合成基因簇。將該推定生物合成基因簇之結構模式性地示於圖5。本簇之尺寸為約75 kb,成為NRPS基因占其大部分之結構。若觀察構成簇之基因之功能,則TRAF01000135000002註解為O-甲基轉移酶,故而認為其係進行KK-1分子內之酪胺酸(Tyr)殘基之O-甲基化。註解為編碼輕肌蛋白B耐性蛋白質之pmd1之TRAF01000068000006係蛋白質之功能為ABC轉運體(transporter),考慮參與KK-1排出至菌體外之可能性。又,於簇內存在轉錄因子基因(TRAF01000068000005)。一般,構成生物合成基因簇之基因之表現多數情況下因簇內存在之轉錄因子而受到共通之控制,推定於本基因簇中,TRAF01000068000005亦控制簇構成基因整體之轉錄。因此,認為藉由控制該轉錄因子之表現,可控制基因簇之表現,認為為就嘗試KK-1之高生產之方面而言較為重要之基因。 [基於基因表現資訊之KK-1之生物合成基因簇之推定] 於進行KK-1生物合成基因簇之推定時,亦進行藉由使用MIDDAS-M(Umemura M. et. al., Plos one, 8(5), e63673. (2013))演算法之生物資訊學之方法之簇檢測。 MIDDAS-M係基於基因之表現資訊而檢測基因簇。於檢測二次代謝物之生物合成基因簇時,將該物質之產生及非產生各者之條件下之產生宿主之基因之綜合表現資訊進行比較,將於生產條件下連動運動之基因群以簇檢測。於橫軸對基因依序排列基因體之位置,於縱軸對得分(表現量)進行繪圖,藉此將有表現量變動之基因聚集之區域檢測為波峰。 棒狀彎孢菌BAUA-2786株之CM液體培養中之KK-1產生,若將培養溫度設為高溫之37℃時未確認,故而將作為通常之培養溫度之26℃設為產生條件,將37℃設為非產生條件。藉由使用下一代DNA定序儀之RNA-seq而綜合分析該等條件下之棒狀彎孢菌之基因表現,進行利用MIDDAS-M之簇檢測,結果如圖6所示,檢測到與基於序列資訊推測之基因簇相同之基因群(圖6中a及b)。檢測到2個波峰之原因在於該基因簇如上所述,於起初之基因體序列資料中,為斷裂之狀態。再者,亦同時進行將手動連接之推定簇序列與基因體序列之末尾(橫軸之右端)結合而成之序列中之使用MIDDAS-M的分析,結果亦有意義地檢測到該部分之基因(圖6中c)。 根據以上之結果,強烈暗示基於基因序列資訊推定之包含10種基因之基因簇參與KK-1之生物合成。關於推定之基因簇中所包含之10種基因,將編碼區域之鹼基序列及胺基酸序列彙總於下述表。 [表2]
[實施例2] 於本實施例中,對實施例1中推定之KK-1生物合成基因簇中所包含之基因群中之轉錄因子基因分析功能。再者,於本實施例中,於實施例1中,將編碼記載為TRAF01000068000005之轉錄因子之基因記載為TF068-005。 [使用轉錄因子高表現株之分析] 1)TF068-005高表現構建物之構建(圖7) 將高表現TF068-005基因之構建物模式性地示於圖7。於該構建物中,將距棒狀彎孢菌BAUA-2787株之Ccnmt1(TRAF01000124000183)基因之起始密碼子上游1000 bp設為啟動子,將Ccnmt1基因之下游355 bp設為終止子,將選擇標記設為金擔子素A(AurA)耐性基因。再者,Ccnmt1基因之啟動子及終止子係藉由以棒狀彎孢菌基因體DNA作為模板之PCR進行擴增,金擔子素A(AurA)耐性基因係藉由以pAUR316質體(TaKaRa)作為模板之PCR進行擴增,TF068-005基因係藉由以棒狀彎孢菌之cDNA作為模板之PCR進行擴增。 繼而,與In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)之直鏈pUC19一起進行In-Fusion反應,製作目標質體(pUC-Pnmt1-TF-Tnmt1-aurA)。將所使用之引子及反應條件示於以下。 nmt1-pro_In-Fus_FW1:5'-cggtacccggggatcTAGTCTGTTGATTACTCG-3'(序列編號56) nmt1-pro_In-Fus_RV1:5'-ctcgacaaaggtcatTTTGACTTTGAATACCGGTG-3'(序列編號57) nmt1-ter_FW1:5'-GCAGTTGCCGTTGGACCAGAGG-3'(序列編號58) nmt1-ter_In-Fus_RV2:5'-atagtcataacaagcCGCGACACTGTAATATTAAAGC-3'(序列編號59) TF-CDS_FW1:5'-ATGACCTTTGTCGAGACTGTAGCC-3'(序列編號60) TF-CDS_In-Fus_RV1:5'-TCCAACGGCAACTGCCTATGATATACTCATGTTCTCGTC-3'(序列編號61) 於PCR中使用Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase(Thermo Fisher Scientific)。作為溫度條件,初期改性:於98℃下設為30 sec,將改性:於98℃下10 sec、退火:於60℃下30 sec、伸長:於72℃下30 sec設為1個循環而進行30個循環,最終伸長:於72℃下設為7 min。 AnaurA-mark_In-Fus_FW1:5'-cgactctagaggatcCTGATGGTCAGATGGATCTG-3'(序列編號62) AnaurA-mark_RV1:5'-GCTTGTTATGACTATGTATACATATGCG-3'(序列編號63) 於PCR中使用Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase(Thermo Fisher Scientific)。作為溫度條件,初期改性:於98℃下設為30 sec,將改性:於98℃下10 sec、退火:於60℃下30 sec及伸長:於72℃下2 min設為1個循環而進行30個循環,最終伸長:於72℃下設為7 min。 2)棒狀彎孢菌BAUA-2787株之轉形 將棒狀彎孢菌BAUA-2787株之孢子懸浮液植菌於100 ml之CM培養基(300 ml錐形瓶)中,於30℃下振盪培養40小時後,藉由使用玻璃過濾器(11G1)之過濾而收集菌絲,藉由殺菌水進行清洗後,藉由刮勺等進行按壓而充分地去除水分。將菌體加入至10 ml之原生質體(protoplast)化溶液(YL組成)中並使之懸浮,於30℃下緩慢振盪3小時而進行原生質體化。藉由Miracloth進行過濾,將濾液以1,500xg離心5分鐘,收集原生質體,藉由0.8 M之NaCl清洗2次。將原生質體以成為2×10
8
/ml之方式懸浮於溶液(Solution)1[0.8 M之NaCl、10 mM之CaCl
2
、10 mM之Tris-HCl(pH值8.0)]中,加入0.2體積之溶液2[40%(w/v)PEG4000、50 mM之CaCl
2
、50 mM之Tris-HCl(pH值8.0)]並緩慢懸浮,於0.2 ml之原生質體懸浮液中加入pUC-Pnmt1-TF-Tnmt1-aurA(7.8 μg/20 μl),於冰中靜置10分鐘。加入1 ml之溶液2,緩慢懸浮,於室溫下靜置15分鐘。加入10 ml之溶液1並緩慢懸浮,藉由離心而收集原生質體,儘可能去除上清液,使原生質體懸浮於1 ml之溶液1中。於5片CM+1.2 M蔗糖(sucrose)+10 μg/ml之AbA選擇板每0.2 ml放置原生質體懸浮液,加入6~7 ml(相當於90 mm
皮氏培養皿)之CM+1.2 M蔗糖+10 μg/ml之AbA軟瓊脂(1%)選擇培養基,以原生質體變得均勻之方式迅速重層,於26℃下培養6天。 再者,使用pUC-Pnmt1-TF-Tnmt1-aurA質體之棒狀彎孢菌之轉形係藉由保持環狀之形式使用質體者、及藉由限制酶BamH I切割1處而以直鏈狀使用者2種方法進行。 3)TF068-005高表現株之培養條件 TF068-005高表現株係進行以下之3種培養,調查RNA之製備以及KK-1之生產。 「培養1」 將野生株及TF068-005高表現株之分生孢子植菌於100 ml之CM培養基(500 mL錐形瓶)中,於26℃、160 rpm之條件下振盪培養72 h。 「培養2」 將野生株及TF068-005高表現株之分生孢子植菌於30 ml之K1培養基(100 mL附擋板之錐形瓶)中,於26℃、200 rpm之條件下預培養72 h,將培養液500 μl轉移至將葡萄糖(glucose)濃度設為5%之CM培養基(500 mL附擋板之錐形瓶)中,於26℃、130 rpm之條件下進行正式培養。 「培養3」 於50 ml之Falcon管中放入糙米2.5 g及水2 ml,進行高壓釜處理。將野生株及TF068-005高表現株之分生孢子植菌於其中,於26℃下靜置培養8天。 4)TF068-005高表現株之RNA-seq分析 藉由液態氮冷凍經液體培養之菌體,藉由研缽及杵磨碎,使用ISOGEN(Nippon Gene)製備所有(total)RNA。自該總RNA,使用Truseq RNA Sample Prep Kit v2,製備RNA-Seq用基因庫,供於下一代定序儀(MiSeq)(雙端(Paired-End),讀取長度(Read Length)75)。所獲得之序列資料係使用TopHat程式映射於棒狀彎孢菌之基因體序列。 5)KK-1之萃取及定量 於液體培養中,於30 ml之培養系統中直接添加15 ml乙酸乙酯,以130 rpm振盪1小時後,以4,700xg離心15分鐘。回收、離心濃縮上清液,將其作為菌體外組分。繼而,於乙酸乙酯回收後之水層添加15 ml丙酮,藉由漩渦攪拌器進行攪拌後,以4,700xg離心15分鐘。藉由傾析而回收上清液,藉由離心濃縮而去除丙酮。於其中添加乙酸乙酯15 ml,以4,700xg離心15分鐘。將乙酸乙酯層回收於50 ml管中,將經離心濃縮者作為菌體內組分。 於固體培養中,將80%丙酮25 ml添加至培養系統中,進行漩渦攪拌。藉由離心濃縮而去除丙酮,添加10 ml乙酸乙酯,藉由漩渦攪拌器進行攪拌。藉由離心分離而回收乙酸乙酯層,將經旋轉柱純化者作為樣本。 KK-1之定量係藉由UPLC(ultra performance liquid chromatography,超高效液相層析法)進行。將條件示於以下。 ・裝置:ACQUITY UPLC I-Class系統(Waters) ・管柱:Acquity UPLC BEH C18 2.1×100 mm ・溶劑(Solvent):梯度(Gradient)50%-98%乙腈(Acetonitrile)+0.1%甲酸(Fomic Acid)(3 min) ・流速:0.6 ml/min ・檢測波長:273 nm <結果及探討> 於本實施例中,使用發現為於棒狀彎孢菌中高表現之基因之nmt-1基因同系物(TRAF01000124000183;Ccnmt1)之啟動子及終止子,製作高表現轉錄因子之構建物(pUC-Pnmt1-TF-Tnmt1-aurA)(圖7)。使用該質體之棒狀彎孢菌之轉形係藉由保持環狀之形式使用質體者、及切割1處而以直鏈狀使用者2種方法進行。對其結果獲得之直鏈導入有質體之1株(ox_TF_1)及環狀導入有質體之1株(ox_TF_2)進行RNA-seq分析以及KK-1之生產性之確認。 首先,將野生株及TF068-005高表現株(ox_TF_1及ox_TF_2)之分生孢子於CM液體培養基中於26℃、160 rpm之條件下振盪培養72 h,進行RNA-seq分析(方法「培養1」)。將調查KK-1生物合成基因簇構成基因之轉錄量之結果示於圖8。如圖8所示,於TF068-005高表現株中,任一基因均與野生株相比確認到8倍左右之增加。再者,ox_TF_1株與ox_TF_2株之轉錄不存在差異。 因此,調查該等TF068-005高表現株中之KK-1之生產性,同時亦進行RNA-seq分析。此時,為了使液體培養時之菌體之形狀穩定化,於包含大豆粉(Soybean flour)之K1培養基中進行預培養後,於CM培養基中進行正式培養(方法「培養2」)。將於正式培養後,藉由RNA-seq而分析2天及4天之基因之轉錄之結果示於圖9。如圖9所示,TF068-005高表現株之KK-1生物合成基因簇構成基因之轉錄係與野生株相比顯著較高。又,與2天後相比,4天後與野生株中之表現量之差較大。 繼而,將KK-1之生產量於正式培養後3天及7天之時間分為菌體外及菌體內進行調查。將其結果示於圖10。如圖10所示,培養系統內之KK-1之總量(菌體外+菌體內)係於培養3天及7天中之任一天,均於TF068-005高表現株增加,於第7天,成為野生株之2倍左右。又,根據圖10所示之結果,認為KK-1總量之20~30%左右累積於菌體內。 進而,進行使用糙米之固體培養條件下之KK-1生產性之確認(方法「培養3」)。將其結果示於圖11。又,於圖11中,示出對固體培養TF068-005高表現株之狀態進行拍攝之照片。如圖11所示,藉由固體培養,TF068-005高表現株中之KK-1之生產性亦成為野生株之約6倍。 根據以上之結果,顯示藉由高表現TF068-005基因,推定之基因簇中所包含之各基因之表現量上升。因此,鑑定TF068-005基因係以轉錄水準確實地控制特定之基因表現之轉錄因子。而且,顯示藉由高表現編碼轉錄因子之TF068-005基因,KK-1之生產性提昇,故而因本轉錄因子之控制而表現上升之一連串之基因群為參與KK-1之生產的基因簇。 [使用轉錄因子破壞株之分析] 1)CcpyrG基因破壞用質體之構建(圖12) 將用以破壞棒狀彎孢菌BAUA-2787株中之pyrG基因(CcpyrG基因)之質體構建之方案示於圖12。再者,pyrG基因破壞株無法將5-氟乳清酸(5-FOA)轉換為5-氟尿苷磷酸(胸腺嘧啶生物合成酶之抑制劑),故而於包含5-FOA之培養基中亦可生長。 首先,如圖12所示,以棒狀彎孢菌BAUA-2787株之基因體DNA作為模板,藉由以下之引子集進行PCR,自CcpyrG基因之起始密碼子之上游2005 bp擴增至終止密碼子之下游1261 bp。 CcPyrG-del_FW3:5'-GACAGACTCTTCGTCGACGTC-3'(序列編號64) CcPyrG-del_RV3:5'-GTTGTGGTTGGTGTTCCTGAGG-3'(序列編號65) PCR係使用Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase(Thermo Fisher Scientific)。關於溫度條件,初期改性:於98℃下設為3 min,將改性:於98℃下10 sec、退火:於60℃下30 sec、伸長:於72℃下2.5 min設為1個循環而進行30個循環,最終伸長:於72℃下設為7 min。 其次,藉由T4多核苷酸激酶(Polynucleotide Kinase)(TOYOBO)將包含擴增之CcpyrG基因之DNA片段(4463 bp)之末端進行磷酸化。將pUC18進行Sma I消化後,藉由大腸桿菌鹼性磷酸酶(E. coli Alkaline Phosphatase)(TOYOBO)進行脫磷酸化,與包含經磷酸化之CcpyrG基因之DNA片段接合。繼而,藉由以下之引子集,將包含CcpyrG基因之上游及下游區域之pUC18側進行PCR擴增,使包含CcpyrG基因之區域缺失。 CcPyrG-del_FW2:5'-CACTCGATCTACCAAATCGACG-3'(序列編號66) CcPyrG-del_RV2:5'-CCTATCCGGATATGCAGTCAC-3'(序列編號67) PCR係使用Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase。關於溫度條件,初期改性:於98℃下設為3 min,將改性:於98℃下10 sec、退火:於60℃下30 sec、伸長:於72℃下3 min設為1個循環而進行30個循環,最終伸長:於72℃下設為7 min。 其次,藉由T4多核苷酸激酶將所獲得之PCR片段進行磷酸化後,進行自接合,構建目標CcpyrG基因破壞構建物(pUC-CcPyrG-del_C1)。 2)棒狀彎孢菌BAUA-2787株之CcpyrG基因破壞轉形 將以pUC-CcPyrG-del_C1為模板藉由CcPyrG-del_FW3/CcPyrG-del_RV3之引子集進行PCR擴增之片段用於CcpyrG基因破壞。PCR係使用Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase。關於溫度條件,初期改性:於98℃下設為30 sec,將改性:於98℃下10 sec、退火:63℃下30 sec、伸長:於72℃下30 sec設為1個循環而進行35個循環,最終伸長:於72℃下設為5 min。 棒狀彎孢菌BAUA-2787株之轉形基本上按照[使用轉錄因子高表現株之分析]中所說明之操作說明進行。但是,選擇培養基採用CM+1 mg/ml之5-FOA+0.2%尿苷(Uridine)+0.02%尿嘧啶(Uracil)。 3)TF068-005基因破壞構建物之構建(圖13) 將構建用以破壞如上所述判明了編碼轉錄因子之TF068-005基因之構建物之方案示於圖13。 如圖13所示,首先,以棒狀彎孢菌BAUA-2787株之基因體為模板,於TF068-005基因之上游區域使用互補之引子TF068-005_L-arm_FW1及TF068-005_L-arm_RV1擴增左臂(left arm)(1147 bp)。同樣地於TF068-005基因之下游區域使用互補之引子TF068-005_R-arm_FW1及TF068-005_R-arm_RV1擴增右臂(right arm)(1205 bp)。進而,使用引子CcPyrG-mark_FW1及CcPyrG-mark_RV1擴增篩選標記基因pyrG(2231 bp)。將擴增之各片段之電泳照片示於圖14。 其次,按照In-Fusion HD cloning Kit(Clontech)之操作說明,向套組所附屬之直鏈狀pUC19質體載體依序插入上述藉由PCR擴增之左臂、pyrG標記物及右臂。將所獲得之載體導入至大腸桿菌JM109株,由3株轉形體製備質體並進行測序。 將各DNA片段之擴增中所使用之引子之序列示於以下。 TF068-005_L-arm_FW1:5'-cggtacccggggatcCTCTGAAGCGGTCAAGGATAACG-3'(序列編號68) TF068-005_L-arm_RV1:5'-atgaagcagagcggcGAGCCTAAGATATGCCAGGAGG-3'(序列編號69) TF068-005_R-arm_FW1:5'-ctagcaaccgtcatgCCATAGACGTGGCACTCGAACG-3'(序列編號70) TF068-005_R-arm_RV1:5'-cgactctagaggatcCGTCTTAAGGATGGTTCAGCTGC-3'(序列編號71) CcPyrG-mark_FW1:5'-CATGACGGTTGCTAGGGTCG-3'(序列編號72) CcPyrG-mark_RV1:5'-GCCGCTCTGCTTCATTGCTG-3'(序列編號73) (小寫字母係用於In-Fusion反應之15 bp之重疊序列) 4)藉由TF068-005基因破壞構建物之轉形(圖15) 於圖15中模式性地表示藉由TF068-005基因破壞構建物將上述2)中所製作之棒狀彎孢菌BAUA-2787株之CcpyrG基因破壞株進行轉形之方法。首先,將TF068-005基因破壞構建物藉由限制酶EcoR I(TaKaRa)消化而進行直鏈化,使用Ethachinimate(Nippon Gene)進行純化。繼而,將經直鏈化之構建物導入至棒狀彎孢菌BAUA-2787 pyrG基因破壞株進行轉形。轉形基本上按照[使用轉錄因子高表現株之分析]中所說明之操作說明進行。其中,棒狀彎孢菌BAUA-2787 pyrG基因破壞株之培養係使用CM+5 mM尿苷+5 mM尿嘧啶培養基,轉形體之篩選係使用MM瓊脂培養基[1%葡萄糖、0.6% NaNO
3
、0.052% KCl、0.052% MgSO
4
・7H
2
O、0.152% KH
2
PO
4
及Hutner微量元素(Hutner's trace elements)(pH值6.5)]。 5)TF068-005基因破壞株之抗菌活性試驗 將如上所述製作之TF068-005基因破壞株之分生孢子懸浮液植菌於100 ml之CM培養基中,於26℃、130 rpm之條件下培養72小時。藉由Miracloth過濾培養液而去除菌體,通過0.22 μm之過濾器而殺菌後,滲入至圓盤試紙。將該圓盤試紙、及連同瓊脂培養基剪出之灰色黴菌(灰色葡萄孢菌(Botrytis cinerea))之菌絲隔開2.5 cm左右置於PDA培養基上,於26℃下對峙培養3天。陽性對照係採用作為野生株之棒狀彎孢菌BAUA-2787株之培養液,陰性對照係採用未培養菌體之CM培養基。 6)轉錄因子基因(TF068-005)破壞株之總RNA之調整 將TF068-005基因破壞株及野生株之分生孢子懸浮液植菌於30 ml之CM培養基中,於26℃、130 rpm之條件下振盪培養72小時。繼而,使用Miracloth過濾培養液,回收菌體。稱量菌體0.8 g並藉由液態氮進行冷凍後,藉由研缽及杵磨碎。使該菌體懸浮於10 ml之ISOGEN(Nippon Gene)並靜置10分鐘,添加氯仿2 ml,藉由漩渦攪拌器進行攪拌後,以4,700xg離心10分鐘。回收水層,添加5 ml之異丙醇並藉由漩渦攪拌器進行攪拌後,以4,700xg離心10分鐘。捨棄上清液,添加5 ml之75%乙醇進行清洗,以4,700xg離心10分鐘後,再次捨棄上清液,將RNA之顆粒溶解於200 μl之無核酸酶水(Nucrease-free water)中。所獲得之RNA溶液係使用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)再次進行純化。 7)轉錄因子基因(TF068-005)破壞株之RNA-seq分析 自如上所述製備之總RNA,使用Truseq RNA Sample Prep Kit v2(illumina)製備RNA-Seq用基因庫,供於下一代定序儀(MiSeq)(雙端,讀取長度75)。所獲得之序列資料係使用TopHat程式映射於棒狀彎孢菌之基因體序列。 8)轉錄因子基因破壞株及野生株中之KK-1之萃取及定量 將TF068-005基因破壞株及野生株之分生孢子懸浮液植菌於30 ml之CM培養基中,於26℃、130 rpm之條件下振盪培養10天。於培養液中添加15 ml之乙酸乙酯並振盪1小時後,以4,700xg離心15分鐘。回收乙酸乙酯層,使之乾燥而作為菌體外組分。繼而,於乙酸乙酯層回收後之水層添加丙酮10 ml,藉由漩渦攪拌器進行攪拌後,藉由離心濃縮而去除丙酮。於其中添加乙酸乙酯15 ml,藉由漩渦攪拌器進行攪拌後,以4,700xg離心10分鐘。回收乙酸乙酯層並進行離心濃縮,將其作為菌體內組分。所獲得之萃取物係再次溶解於乙酸乙酯中後,供於LC/MS(liquid chromatograph/mass spectrometer,液相層析質譜)分析。 <LC> 裝置:ACQUITY UPLC I-Class系統(Waters) 管柱:Acquity UPLC BEH C18 2.1×100 mm 流動相:DW+0.1%甲酸/乙腈+0.1%甲酸= 50/50(0.5 min)→2/98(3.4 min) 梯度50%-98%乙腈+0.1%甲酸(0.5-3.4 min) 流速:0.6 ml/min 檢測波長:273 nm <MS> 裝置:Xevo G2 QTof(Waters) 離子化條件:負(Negative) <結果及探討> 於本實施例中,獲得5株確認到TF068-005基因之破壞及核之純化之株,故而調查該等株於培養上清液中之抗菌活性。將上述抗菌活性試驗之結果示於圖16。於圖16中記載對取得之5株TF068-005基因破壞株中之3株之抗菌活性試驗的結果。如圖16所示,於陽性對照(野生株之培養液)中,可見灰色黴菌於圓盤試紙側延伸之菌絲伸長之抑制,相對於此,於TF068-005基因破壞株之培養液中未檢測到抑制活性,獲得與陰性對照(僅培養液)相同之結果。根據該情況,認為於TF068-005基因破壞株中KK-1生產能力明顯降低,強烈提示TF068-005基因密切參與KK-1之生物合成。 因此,對TF068-005基因破壞株進行綜合基因表現分析(RNA-seq)及KK-1生產量之分析。於綜合基因表現分析(RNA-seq)中,以野生株作為比較對照,對TF068-005基因破壞株(2株)進行分析。將其結果示於圖17。於圖17中,「del_TF」表示TF068-005基因破壞株之結果。又,於圖17所示之圖表中,縱軸之「RPKM」係reads per kilobase of exon per million mapped sequence reads,為藉由整體之讀取總數及轉錄物之序列長度將映射之序列(讀取)數標準化之值。 如圖17所示,可知於TF068-005基因破壞株中,推定之生物合成簇中所包含之基因之表現量與野生株相比顯著降低,相對於此,不包含於本簇中之周邊基因群之表現量係除TRAF01000068000011基因以外與野生株同等。再者,TRAF01000068000011基因之功能係根據註解資訊,推定為參與於細胞溶質或核合成之糖核苷酸向內質網或高爾基體之輸送之核苷酸糖轉運體(Nucleotide-sugar transporter)。認為由於KK-1之結構中不存在糖核苷酸,故而本基因對生物合成之參與較低。 又,將藉由LC/MS測定TF068-005基因破壞株(5株)中之KK-1生產量之結果示於圖18。如圖18所示,於TF068-005基因破壞株(5株)之任一者中,均未於培養上清液及菌體內檢測到KK-1。 根據以上之與TF068-005基因破壞株相關之結果、及於TF068-005基因高表現株中簇內基因表現量及KK-1生產量顯著上升之情況,可知除推定之基因簇擔負KK-1之生物合成,除此以外,TF068-005基因亦控制構成KK-1生物合成基因簇之各基因之轉錄。 [實施例3] 於本實施例中,對實施例1中推定之KK-1生物合成基因簇中所包含之各基因製作基因破壞株,分析各基因之功能。 1)各簇基因破壞構建物之構建(圖19) 除實施例2中驗證之TRAF01000068000005(轉錄因子基因)以外,對KK-1生物合成基因簇中所包含之各基因,將上游側約1,000 bp之區域設為L-arm,將下游側約1,000 bp之區域設為R-arm,藉由以棒狀彎孢菌BAUA-2787株之基因體DNA作為模板之PCR獲得兩種基因片段。又,將成為轉形體之選擇標記之pyrG基因進行PCR擴增。繼而,使用In-Fusion Cloning Kit(Clontech),將依序連結上述經PCR擴增之L-arm、pyrG基因、R-arm而成之基因片段插入至pUC19,製作各基因破壞構建物(圖19)。 將對構成各構建物之各DNA片段進行PCR擴增時使用之引子之序列及PCR條件示於以下。再者,以小寫字母表示用以進行In-Fusion反應之重疊之序列(15 bp)。 ・pyrG選擇標記擴增用(實施例2中所使用之引子) CcPyrG-mark_FW1:5'-CATGACGGTTGCTAGGGTCG-3'(序列編號72) CcPyrG-mark_RV1:5'-GCCGCTCTGCTTCATTGCTG-3'(序列編號73) ・TRAF01000135000002破壞構建物L-arm(982 bp)擴增用 TRAF135-002_del_L-arm_FW:5'-cggtacccggggatcGACCCATTGCAGCTTGTG-3'(序列編號74) TRAF135-002_del_L-arm_RV:5'-atgaagcagagcggcGTGCAGTATGGTGTCTAAAACG-3'(序列編號75) ・TRAF01000135000002破壞構建物R-arm(950 bp)擴增用 TRAF135-002_del_R-arm_FW:5'-ctagcaaccgtcatgGATGAATGAGCACCCTGTTAG-3'(序列編號76) TRAF135-002_del_R-arm_RV:5'-cgactctagaggatcGTACATTACAAAAACCTGTTGCAG-3'(序列編號77) ・TRAF01000135000001破壞構建物L-arm(1,000 bp)擴增用 TRAF135-001_del_L-arm_FW:5'-cggtacccggggatcGTCCCACGTGCAGCTTCAAC-3'(序列編號78) TRAF135-001_del_L-arm_RV:5'-atgaagcagagcggcCGTGGAGTATCCCAGGATGG-3'(序列編號79) ・TRAF01000135000001破壞構建物R-arm(982 bp)擴增用 TRAF135-001_del_R-arm_FW:5'-ctagcaaccgtcatgCCAGCCAAAGGGTATCATGG-3'(序列編號80) TRAF135-001_del_R-arm_RV:5'-cgactctagaggatcTGAGGGCAGCGTAGCCTG-3'(序列編號81) ・TRAF01000068000002破壞構建物L-arm(992 bp)擴增用 TRAF068-002_del_L-arm_FW:5'-cggtacccggggatcGTGGATAAATTCGTACCCTTTG-3'(序列編號82) TRAF068-002_del_L-arm_RV:5'-atgaagcagagcggcCTGATCTTTGTTGTGGTCGTG-3'(序列編號83) ・TRAF01000068000002破壞構建物R-arm(1,014 bp)擴增用 TRAF068-002_del_R-arm_FW:5'-ctagcaaccgtcatgCAGTTTGGCACTTGAGCATC-3'(序列編號84) TRAF068-002_del_R-arm_RV:5'-cgactctagaggatcCACGGAAAGGAACTCCTACAG-3'(序列編號85) ・TRAF01000068000003破壞構建物L-arm(912 bp)擴增用 TRAF068-003_del_L-arm_FW:5'-cggtacccggggatcCTCTGGGAAAAGCGGTTAG-3'(序列編號86) TRAF068-003_del_L-arm_RV:5'-atgaagcagagcggcGAAGAACCGAGAGCGAGAG-3'(序列編號87) ・TRAF01000068000003破壞構建物R-arm(995 bp)擴增用 TRAF068-003_del_R-arm_FW:5'-ctagcaaccgtcatgCTTGCATCTACCTAGATATTTCACG-3'(序列編號88) TRAF068-003_del_R-arm_RV:5'-cgactctagaggatcCAGAGAATCAGCAGAGACACC-3'(序列編號89) ・TRAF01000068000004破壞構建物L-arm(991 bp)擴增用 TRAF068-004_del_L-arm_FW:5'-cggtacccggggatcCCCTGGTAGTTCAGTGGAAGTAAG-3'(序列編號90) TRAF068-004_del_L-arm_RV:5'-atgaagcagagcggcTGATAGAGGTACGGGGGTG-3'(序列編號91) ・TRAF01000068000004破壞構建物R-arm(1,003 bp)擴增用 TRAF068-004_del_R-arm_FW:5'-ctagcaaccgtcatgTGCTTGGCTGCTTCAAATC-3'(序列編號92) TRAF068-004_del_R-arm_RV:5'-CGACTCTAGAGGATCCTAATACTTGTCGTCCCACTGATG-3' (序列編號93) ・TRAF01000068000006破壞構建物L-arm(993 bp)擴增用 TRAF068-006_del_L-arm_FW:5'-cggtacccggggatcGCAGTACATCGTCAGGGTC-3'(序列編號94) TRAF068-006_del_L-arm_RV:5'-atgaagcagagcggcGATGAATAAGGCGAAGGAAAG-3'(序列編號95) ・TRAF01000068000006破壞構建物R-arm(579 bp)擴增用 TRAF068-006_del_R-arm_FW:5'-ctagcaaccgtcatgCCCTCTTTTTTCTTGCTGTCTC-3'(序列編號96) TRAF068-006_del_R-arm_RV:5'-cgactctagaggatcGAAGGAAGGACGGATACTGG-3'(序列編號97) ・TRAF01000068000007破壞構建物L-arm(769 bp)擴增用 TRAF068-007_del_L-arm_FW:5'-cggtacccggggatcGATGAGCGTAGAATTCGTAAAAAG-3'(序列編號98) TRAF068-007_del_L-arm_RV:5'-atgaagcagagcggcGCGAACGGGCGTTTTTC-3'(序列編號99) ・TRAF01000068000007破壞構建物R-arm(579 bp)擴增用 TRAF068-007_del_R-arm_FW:5'-ctagcaaccgtcatgGAAGGAAGGACGGATACTGG-3'(序列編號100) TRAF068-007_del_R-arm_RV:5'-cgactctagaggatcCCCTCTTTTTTCTTGCTGTCTC-3'(序列編號101) ・TRAF01000068000008破壞構建物L-arm(716 bp)擴增用 TRAF068-008_del_L-arm_FW:5'-cggtacccggggatcCTCCTTATTTTGCAACTTCTGATAC-3'(序列編號102) TRAF068-008_del_L-arm_RV:5'-atgaagcagagcggcCGTGTTGATTTTGGTAATTTTG-3'(序列編號103) ・TRAF01000068000008破壞構建物R-arm(769 bp)擴增用 TRAF068-008_del_R-arm_FW:5'-ctagcaaccgtcatgGATGAGCGTAGAATTCGTAAAAAG-3'(序列編號104) TRAF068-008_del_R-arm_RV:5'-cgactctagaggatcGCGAACGGGCGTTTTTC-3'(序列編號105) ・TRAF01000068000009破壞構建物L-arm(716 bp)擴增用 TRAF068-009_del_L-arm_FW:5'-cggtacccggggatcCGTGTTGATTTTGGTAATTTTG-3'(序列編號106) TRAF068-009_del_L-arm_RV:5'-atgaagcagagcggcCTCCTTATTTTGCAACTTCTGATAC-3'(序列編號107) ・TRAF01000068000009破壞構建物R-arm(989 bp)擴增用 TRAF068-009_del_R-arm_FW:5'-ctagcaaccgtcatgCTAGCAGCCATAAGAGACGTAACC-3'(序列編號108) TRAF068-009_del_R-arm_RV:5'- cgactctagaggatcGTTTTCATTGCATGCTCCG-3'(序列編號109) ・PCR反應條件 於PCR中使用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(Thermo Fisher Scientific)。關於溫度條件,初期改性:於98℃下設為30 sec,將改性:於98℃下10 sec、退火:於60℃下30 sec及伸長:於72℃下45 sec設為1個循環而進行30個循環,最終伸長:於72℃下進行5 min。 2)棒狀彎孢菌pyrG破壞株之轉形 於圖20之A中,模式性地表示藉由各基因破壞構建物將實施例2之2)中所製作之棒狀彎孢菌BAUA-2787株之CcpyrG基因破壞株進行轉形的方法。將所構建之各基因破壞構建物藉由特定之限制酶(示於圖20之B)進行直鏈化。繼而,按照實施例2之[使用轉錄因子高表現株之分析]中所說明之操作說明,將經直鏈化之構建物導入至棒狀彎孢菌BAUA-2787 pyrG基因破壞株。於培養宿主之棒狀彎孢菌BAUA-2787 pyrG基因破壞株時,使用添加有5 mM之尿苷及尿嘧啶之液體CM培養基,轉形體之選擇係於MM瓊脂培養基中進行。 3)簇基因破壞株之培養 將上述2)中所獲得之各基因破壞株之分生孢子懸浮液植菌於KM培養基30 ml(附擋板之100 ml錐形瓶)中,於26℃、130 rpm之條件下振盪培養3天,將所獲得者作為預培養液。繼而,將預培養液300 μl植菌於CM培養基30 ml(附擋板之100 ml錐形瓶)中,於26℃、130 rpm之條件下振盪培養7天。 4)培養系統內之代謝物之萃取及分析 於上述3)中所獲得之培養液中添加15 ml之乙酸乙酯並以130 rpm振盪1小時後,以4,200xg離心15分鐘。回收乙酸乙酯層,將經離心濃縮者作為菌體外組分。繼而,於乙酸乙酯層回收後之水層添加丙酮10 ml,藉由漩渦攪拌器進行攪拌後,藉由離心濃縮而去除丙酮。於其中添加乙酸乙酯15 ml,藉由漩渦攪拌器進行攪拌後,以4,200xg離心10分鐘。回收乙酸乙酯層並進行離心濃縮,將其作為菌體內組分。所獲得之萃取物係集中菌體內外之組分而溶解於500 μl之乙酸乙酯中後,將1 μl供於LC/MS分析。 ・LC/MS分析條件 <LC> 裝置:ACQUITY UPLC I-Class系統(Waters) 管柱:Acquity UPLC BEH C18 2.1×100 mm 流動相:DW/MeCN=50/50(0.5 min)→2/98(3.4 min)(各溶劑包含0.1%甲酸) 流速:0.6 ml/min 檢測波長:273 nm <MS> 裝置:Xevo G2 QTof(Waters) 離子化條件:負 <結果及探討> 對本實施例中所製作之各基因破壞株及實施例2中所製作之轉錄因子基因破壞株調查KK-1之生產性。將其結果示於圖21。於圖21中,以平均±標準偏差(n=2)表示各株之KK-1生產量(相對於野生株之相對量)。如圖21所示,提示於破壞生物合成基本骨架之環狀肽之NRPS(TRAF01000135000001)基因之株中,KK-1之生產完全消失,本基因對KK-1之生物合成而言必需。 又,如圖21所示,基因簇中所包含之基因群中之5種基因(TRAF01000135000002、TRAF01000068000002、TRAF01000068000003、TRAF01000068000007及TRAF01000068000008)破壞株之KK-1生產量與野生株相比大幅降低。根據該情況,認為該等基因於對藉由NRPS而生物合成之環狀肽骨架之修飾等階段密切參與KK-1之生產。 又,如圖21所示,關於3種基因(TRAF01000068000004、TRAF01000068000006及TRAF01000068000009)破壞株,亦與野生株相比,與上述5種基因相比變動幅度較小,但KK-1之生產量降低。根據該情況,提示關於該等3種基因,亦參與KK-1之生產。實際上TRAF01000068000006所編碼之蛋白質推定為ABC轉運體,認為參與菌體內產生之KK-1向細胞外之排出。又,關於註解為α/β水解酶之TRAF01000068000009,於放線菌婁徹氏鏈黴菌(Streptomyces rochei)7434AN4株所產生之聚酮化合物系抗生物質之蘭卡黴素生物合成簇內包含編碼將錯誤引入之基質水解之硫酯酶的基因,故而考慮本基因亦發揮相同之作用之可能性。再者,TRAF01000068000004之尺寸較小為8.1 kDa,且亦不存在類似之蛋白質,故而亦考慮不具有特定之功能之可能性。 [實施例4] 於本實施例中,將實施例1~3中進行功能分析之KK-1生物合成基因簇導入至米麴菌,研究米麴菌中之KK-1之異種生產。 1)米麴菌之菌株、培養基(A. oryzae strain and growth media) 作為於米麴菌(A. oryzae)中導入KK-1生物合成基因簇之母株,使用NS4 ΔadeA株(sC-、niaD-、ΔligD::sC、ΔadeA::ptrA)。於通常之生長及分生孢子之形成中,使用滿足菌株之營養需求性之Czapek-dox(CD)最小培養基[0.6% NaNO
3
、0.052% KCl、0.152% KH
2
PO
4
、0.0001% FeSO
4
・7H
2
O、0.00088% ZnSO
4
・7H
2
O、0.00004% CuSO
4
・5H
2
O、0.000015% MnSO
4
・4H
2
O、0.00001% Na
2
B
4
O
7
・10H
2
O、0.000005%(NH
4
)
6
Mo
7
O
24
・4H
2
O、0.059% MgSO
4
・7H
2
O及2%葡萄糖]。即,使用添加有70 mM之麩胺酸鈉作為氮源以代替NaNO
3
之培養基(CDE)、或於CDE中添加有0.01%腺嘌呤之培養基(CDEA)。於誘導經米麴菌amyB啟動子導入之基因之表現時,使用YPM之培養基(1%酵母萃取物(yeast extract)、2%多聚蛋白腖(polypeptone)、2%麥芽糖(maltose)),於評價KK-1之生產性時,亦同樣地使用YPM之培養基。 2)NRPS基因分割導入載體之構建(圖22) 於圖22中模式性地表示導入KK-1生物合成基因簇時使用之載體之構建方案。如圖22所示,關於KK-1生物合成基因簇中所包含之基因中之NRPS基因,分割為2個部分而導入至米麴菌。即,將全長39 kb之基因之前半部分(約20 kb)及後半部分(約20 kb)分別次選殖至載體質體,導入至米麴菌。其後,選擇於米麴菌內連結兩個片段而成之轉形體。作為載體質體,使用藉由內源性Cre重組酶表現而可實現標記再循環之pAAG-Cre。 首先,為了擴增前半部分之基因,使用引子NRPS-fh-F及NRPS-fh-R進行PCR。作為PCR之模板,使用棒狀彎孢菌BAUA-2787株之基因體DNA。PCR中所使用之酵素係PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(Takara),按照製品說明書實施PCR。所獲得之PCR產物暫時與pZErO-2(Invitrogen)之Eco RV切割部位連結。自所獲得之質體,藉由Not I切割而切割出NRPS基因前半部分,與pAAG-Cre之同部位連結。選擇以正確之方向連結米麴菌用啟動子PamyB與NRPS基因之質體,作為NRPS基因前半導入載體pAAG-Cre/KK1-F。 NRPS基因後半部分之基因擴增由於難以藉由一次之PCR擴增進行選殖,故而進而分割為3個部分進行擴增,藉由In-Fusion選殖法進行連結。首先,藉由PCR而擴增後半片段A、B、C。於後半片段A之擴增中使用引子NRPS-rh-IF-Fa及NRPS-rh-IF-Ra,於後半片段B之擴增中使用NRPS-rh-IF-Fb及NRPS-rh-IF-Rb,於後半片段C之擴增中使用NRPS-rh-IF-Fc及NRPS-rh-IF-Rc。將各片段與經Not I消化之pAAG-Cre藉由In-Fusion選殖法連結,將正確連結之質體作為NRPS基因後半導入載體pAAG-Cre/NRPSrh。 In-Fusion選殖係使用In-Fusion HD Cloning kit(Clontech),藉由如附屬之製品說明書中記載之方法實施。NRPS基因前半導入載體、後半導入載體均確認基因序列,確認到NRPS未產生變異。 將所使用之引子之序列示於以下。 NRPS-fh-F:TCGACAAGCTTGCGGCCGCCACGTGACTAGTATGGCCAGCGACATCAATACTCATCCAG(序列編號110) NRPS-fh-R:ACTAGTCACGTGGCGGCCGCGGCGCGCCAAGATCGTCTTGCTGTACG(序列編號111) NRPS-rh-IF-Fa: GATGCGCTAGCGGCCGCGAAGTGGTCCTTGTCGCTGGTGAC(序列編號112) NRPS-rh-IF-Ra: TGCCGTTCGCATTCATAGGCATCTCGTC(序列編號113) NRPS-rh-IF-Fb: TGAATGCGAACGGCAAGGTTGACAG(序列編號114) NRPS-rh-IF-Rb: CTTGGTTGCTGGCTTCGTCGTTGTC(序列編號115) NRPS-rh-IF-Fc: AAGCCAGCAACCAAGTCGAAGATTG(序列編號116) NRPS-rh-IF-Rc:GTCACTAGTGCGGCCGCCTATTTTTGCAAGATCTTGTTCAAAC(序列編號117) 3)簇基因導入載體之構建(圖22) 如實施例2所記載,提示KK-1生物合成基因簇中所包含之基因中之TRAF01000068000004係對KK-1之生物合成而言不必需。又,TRAF01000068000005係控制簇基因之表現之轉錄因子,故而預測於藉由米麴菌用啟動子控制所有基因之情形時,並不必需。為了將除上述NRPS基因及該等2種基因以外之7種基因導入至米麴菌,如圖22所示,實施搭載有該等基因之基因導入載體之構建。 作為搭載基因之質體,選擇可同時搭載最多3種基因,且可藉由amyB啟動子控制所有基因之pA3AXPC(可由東北大學、基因資訊系統學領域、五味勝也教授提供)。本質體亦搭載利用Cre重組酶及loxP序列之Cre-loxP標記再循環系統,為適於多階段基因導入之載體。 首先,以棒狀彎孢菌BAUA-2787株之cDNA作為模板進行PCR,擴增各基因。於TRAF01000068000002基因之擴增中使用引子TR02-SpeI-F與TR02-SpeI-R之集合,於TRAF01000068000003基因之擴增中使用引子TR03-NotI-F與TR03-NotI-R之集合。所獲得之擴增片段暫時與pZErO-2之Eco RV切割部位連結(分別命名為pZTR02及pZTR03)。其後,自pZTR02藉由Spe I消化而切割TRAF01000068000002基因,自pZTR03藉由Not I消化而切割TRAF01000068000003基因。切割之基因係以TRAF01000068000002(Spe I)及TRAF01000068000003(Not I)之順序,導入至pA3AXPC之Spe I、Not I部位。選擇兩種基因之插入方向正確之質體,設為pATR0203。 其次,於TRAF01000068000006基因之擴增中使用引子TR06-NheI-F與TR06-NheI-R之集合,於TRAF01000068000007基因之擴增中使用引子TR07-NotI-F與TR07-NotI-R之集合,於TRAF01000068000009基因之擴增中使用引子TR08-SpeI-F與TR08-SpeI-R之集合。將所獲得之PCR產物暫時與pZErO-2之Eco RV切割部位連結(分別命名為pZTR06、pZTR07及pZTR08)。其後,自pZTR06藉由Nhe I消化而切割TRAF01000068000006基因,自pZTR07藉由Not I消化而切割TRAF01000068000007基因,自pZTR08藉由Spe I消化而切割TRAF01000068000008基因。切割之基因係以TRAF01000068000006(Nhe I)、TRAF01000068000008(Spe I)及TRAF01000068000007(Not I)之順序,分別導入至pA3AXPC之Nhe I、Spe I及Not I部位。選擇所有基因之插入方向正確之質體,設為pATR678。 最後,於TRAF01000068000009基因之擴增中使用引子TR09-NheI-F與TR09-NheI-R之集合,關於TRAF01000135000002基因,使用引子OMT-NotI-F與OMT-NotI-R之集合。將所獲得之PCR產物暫時與pZErO-2之Eco RV切割部位連結(分別命名為pZTR09及pZOMT)。其後,自pZTR09藉由Nhe I消化而切割TRAF01000068000009基因,自pZOMT藉由Not I消化而切割TRAF01000135000001基因。切割之基因係以TRAF01000068000009(Nhe I)及TRAF01000135000001OMT(Not I)之順序,導入至pA3AXPC之Nhe I、Not I部位。選擇兩種基因之插入方向正確之質體,設為pATR09OMT。 將所使用之引子之序列示於以下。 TR02-SpeI-F:GGACTAGTATGACTGAACCCACATGGAAG(序列編號118) TR02-SpeI-R:GGACTAGTTTAATAATCTACTTCAAGCAC(序列編號119) TR03-NotI-F: ATAAGAATGCGGCCGCATGGCGTTGCAAGAGCG(序列編號120) TR03-NotI-R: ATAAGAATGCGGCCGCTCAAGATGGGAAAGCCGCTG(序列編號121) TR06-NheI-F:CTAGCTAGCATGAGTGCTATCGAGCTGC(序列編號122) TR06-NheI-R:CTAGCTAGCTCAGCGATTGAGGGCCTGG(序列編號123) TR07-NotI-F: ATAAGAATGCGGCCGCATGAAGCTCACCGTTTTCAG(序列編號124) TR07-NotI-R: ATAAGAATGCGGCCGCTCAGAGCCGCGCCAAC(序列編號125) TR08-SpeI-F:GGACTAGTATGACGAAAAGGGAAAGCAAC(序列編號126) TR08-SpeI-R:GGACTAGTCTACGCGTTTTCTTTCGAC(序列編號127) TR09-NheI-F:CTAGCTAGCATGGAGAGCGAAGACAATCC(序列編號128) TR09-NheI-R:CTAGCTAGCTCAGCAGTATCCCATCGG(序列編號129) OMT-NotI-F: ATTTGCGGCCGCATGGACCCGAGACAGTCACGGATC(序列編號130) OMT-NotI-R: ATTTGCGGCCGCTTATGGTGTGGTGGGTTGCCATTC(序列編號131) 4)對米麴菌之基因導入方法 於使用上述3)中所製作之各種質體之米麴菌之轉形中,使用原生質體PEG(polyethylene glycol,聚乙二醇)法進行。將1×10
7
個母株(NS4 ΔadeA株)之分生孢子接種於200 ml體積之錐形瓶中之100 ml之YPD液體培養基(1%酵母萃取物、2%多聚蛋白腖及2%葡萄糖)中,將於30℃下以160轉振盪培養20小時之菌絲藉由Miracloth(CALIBIOCHEM公司)進行過濾、集菌。藉由殺菌水進行清洗,藉由經乾熱殺菌之刮勺按壓菌體進行脫水。將收集之菌絲放入至50 ml體積之管中,加入藉由0.20 μm之過濾器進行過濾之原生質體化溶液[10 mg/ml之Lysing Enzymes(Sigma公司)、5 mg/ml之Cellulase Onozuka(Yakult Pharmaceutical Ind. Co., Ltd.)、2.5 mg/ml之Yatalase(TAKARA)in 0.8 M之NaCl及10 mM之磷酸鹽緩衝液(Phosphate buffer)(pH值6.0)]25 ml並使之懸浮。於30℃、83 rpm之條件下振盪3小時,將細胞壁消化,藉此製作原生質體。反應後,藉由經殺菌之Miracloth過濾未消化之菌體,將濾液於4℃下以2,500×g離心分離5分鐘而回收原生質體。將回收之原生質體藉由10 ml之0.8 M之NaCl進行清洗,於4℃下以2,500×g再次離心分離5分鐘,藉此使原生質體沈澱而回收。以原生質體成為2×10
8
個/ml之方式加入Sol.I[0.8 M之NaCl、10 mM之CaCl
2
、10 mM之Tris-HCl(pH值8.0)],使之懸浮後,加入1/5量之Sol.II[40%(w/v)PEG4000、50 mM之CaCl
2
、50 mM之Tris-HCl(pH值8.0)],充分進行混合。將240 μl之原生質體液分注於15 ml體積之管中,加入DNA溶液5~20 μg並充分進行混合,於冰中放置30分鐘。其次,加入1 ml之Sol.II,充分進行混合後,於室溫下放置20分鐘。加入10 ml之Sol.I,充分進行混合後,於室溫下以2,500×g離心5分鐘,移除上清液,加入300 μl之Sol.I。使原生質體均勻地懸浮,分散於包含0.8 M之NaCl之CDE選擇瓊脂培養基中後,自周圍注入加熱至55℃之同組成之軟瓊脂培養基[0.6%(w/v)瓊脂(Agar)]5 ml,以使原生質體迅速均勻地懸浮之方式重層。其後,於30℃下進行培養直至形成菌落。 5)米麴菌中之標記再循環 米麴菌中之標記再循環係按照以下之方法進行。即,為如下方法:於變異型loxP序列(lox66與lox71)之間配置adeA選擇標記及Cre重組酶,表現Cre重組酶,藉此誘導loxP序列間之環出,抽出adeA選擇標記。此處,Cre重組酶可藉由木糖(Xylose)誘導型啟動子誘導表現。即,可藉由將引入有上述系統之菌株植菌於使碳源為木糖之培養基中,表現Cre重組酶,取得adeA選擇標記脫落之菌株。於adeA選擇標記脫落之菌株中,由於腺嘌呤需求性恢復,故而可再次使用adeA選擇標記而選擇基因重組體。 6)米麴菌內之KK-1 NRPS基因再構建(圖23) 將利用Cre-loxP系統以2個階段導入NRPS基因之前半部分及後半部分之方案模式性地示於圖23。如圖23所示,於對米麴菌導入載體時,首先導入搭載有NRPS基因前半部分之pAAG-Cre/NRPSfh。對所獲得之轉形體藉由PCR確認載體之導入。為了對本株導入後半部分,實施藉由Cre-loxP系統之標記再循環。為了表現載體內之Cre重組酶(藉由xynG2啟動子進行控制),於含有木糖且添加腺嘌呤之CDE培養基、即CDEAX培養基中使菌體生長。針對生長之菌體,選擇作為標記之adeA基因缺失之特徵即泛紅之菌落。對該等株進行核純化,確認到於未添加腺嘌呤之培養基中無法生長。 其次,為了對所獲得之標記再循環株導入NRPS後半部分,進行導入pAAG-Cre/NRPSrh之轉形操作。對所獲得之營養需求恢復株,選擇藉由PCR連結前半-後半部分之株。最終,自成為候補之菌株萃取DNA,藉由PCR確認全長是否連結。其結果為確認到NRPS基因全長之導入。 其次,藉由連結部分之序列確認是否連結部分藉由同源重組而正確重組。其結果為連結部分未確認到變異或偏移等。根據該等結果,可知於米麴菌內正確再構建NRPS基因。 然後,為了對本株導入其他簇內基因,實施藉由Cre-loxP系統之標記再循環。確認到腺嘌呤需求性之恢復後,將經核純化之株作為之後實施之所有基因導入之母株。 7)米麴菌內之簇內必需基因之高表現 將上述3)中所製作之搭載有簇基因之質體pATR0203、pATR678及pATR09OMT依序反覆進行標記再循環而導入至米麴菌。然而,於導入有所有質體之株中,可見TRAF01000068000009基因之脫落。又,可知關於本系統之株,NRPS基因亦產生部分之脫落。進而,對另一系統之株調查基因脫落之有無,結果多次觀察到基因之脫落。根據該等結果,考慮於標記再循環或轉形操作時接近之啟動子序列間產生環出之可能性。因此,重訂導入方案,如圖24所示,為了儘可能減少標記再循環或轉形操作,同時導入搭載有7種基因之3種載體。其結果為獲得可確認到所有基因之導入之株。 8)轉錄分析(圖25) 其次,對如上所述製作之導入有KK-1生物合成簇基因之轉形米麴菌,實施導入基因之表現分析。將菌株於YPM培養基(作為啟動子誘導基質,包含2%麥芽糖)中振盪培養24小時後,將培養液藉由Miracloth進行過濾而回收菌體。菌體係藉由液態氮進行瞬間冷凍,迅速於液態氮下藉由研缽、杵進行破碎。將破碎菌體轉移至1.5 ml體積之微量離心管中,按照RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)之操作說明萃取RNA。為了避免DNA之混入,按照附屬之操作說明於柱上亦進行DNase處理。最終,藉由50 μl之RNase free water溶出2次,藉此取得總RNA。 其次,自所取得之總RNA合成cDNA。於cDNA之合成中,使用High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystem),藉由按照附屬操作說明之方法實施。將所取得之總RNA 4 μg當量用於40 μl之反應系統,自mRNA合成cDNA。反轉錄之反應條件係於25℃下預培養10分鐘後,於37℃下反應120分鐘之條件,藉由85℃、5秒之加熱而終止反應。所獲得之cDNA係於使用之前於-20℃下保存。 於定量即時PCR(qRT-PCR)中,使用THUNDERBIRD SYBR qRCR Mix(TOYOBO),按照附屬之說明書於20 μl之系統中進行反應。於該混合溶液中包含400 ng當量之藉由反轉錄反應所合成之cDNA。每一樣本進行3次測定。PCR係使用Mini Opticon即時PCR分析系統(BioRad),分析軟體係使用BioRad CFX Manager 2.1。相對表現強度係以於同條件下測得之各基因相對於內部標準基因(組織蛋白H2B)之表現量之表現比的形式算出。 將所使用之引子集示於以下。 ・TRAF01000135000001基因用 NRPS-RT1-F:GACGCCACGAACGCATAGAC(序列編號132) NRPS-RT1-R:TTCCCAGAGAGGTAGATCGAC(序列編號133) ・TRAF01000135000001基因用 NRPS-RT2-F:GACCGTTACAGCGAGTTCAG(序列編號134) NRPS-RT2-R:CTGAATTCCTCGCACAGAAC(序列編號135) ・TRAF01000135000001基因用 NRPS-RT3-F:GAAGTTGAGAACGCCATGCT(序列編號136) NRPS-RT3-R:GATGCGAGATGGGAGCATGT(序列編號137) ・TRAF01000068000002基因用 TR02-RT-F:GCCCTACTAGATCTGACCAC(序列編號138) TR02-RT-R:GCTGTTACCTTTTCCTCCTC(序列編號139) ・TRAF01000068000003基因用 TR03-RT-F:AGATCTTAGACGAGCTGCTC(序列編號140) TR03-RT-R:AAACAGTCGCGAAGCGACTG(序列編號141) ・TRAF01000068000006基因用 TR06-RT-F:ACGTCCAGGAAGCTATCGAG(序列編號142) TR06-RT-R:ATTGAGGGCCTGGGCTTGAC(序列編號143) ・TRAF01000068000007基因用 TR07-RT-F:GTGATGAAGGCGCTGAAGAG(序列編號144) TR07-RT-R:CTCCGCAATTTCCGTGAGTG(序列編號145) ・TRAF01000068000008基因用 TR08-RT-F:TGACTCTATGGTGGATGGTG(序列編號146) TR08-RT-R:CCTTGTTCAAGTGCCAGTAG(序列編號147) ・TRAF01000068000009基因用 TR09-RT-F:GATTCCGTCACGAGACACTG(序列編號148) TR09-RT-R:AGTATCCCATCGGGCAACAG(序列編號149) ・TRAF01000135000002基因用 OMT-RT-F:ACGTTCAAGACCTTCCAG(序列編號150) OMT-RT-R:GTTCCGGATGATTTGCAG(序列編號151) 將定量即時PCR之結果示於圖25。再者,於圖25中,O-MT意指TRAF01000135000002基因,NRPS-1~NRPS-3意指TRAF01000135000001基因(實施例1之NRPS基因),TR02意指TRAF01000068000002基因,TR03意指TRAF01000068000003基因,TR06意指TRAF01000068000006基因,TR07意指TRAF01000068000007基因,TR08意指TRAF01000068000008基因,TR09意指TRAF01000068000009基因。如圖25所示,可知導入之所有基因表現出與組織蛋白相同程度之表現水準,於導入有簇基因之米麴菌中,高表現KK-1生物合成所需之所有基因。 9)KK-1生產性評價 又,對如上所述製作之導入有KK-1生物合成簇基因之轉形米麴菌,評價KK-1之生產性。 於本實施例中所製作之轉形米麴菌中,以導入之所有基因可藉由PamyB啟動子進行控制之方式設計,故而於使碳源為麥芽糖時,可誘導所有基因之表現。首先,將本實施例中所製作之轉形米麴菌之分生孢子懸浮液植菌於100 ml之YPM(麥芽糖2%)或CM(麥芽糖2%)中,於26℃、140 rpm之條件下振盪培養5天。繼而,藉由丙酮-乙酸乙酯對培養之菌體及培養液進行萃取,進行濃縮乾燥。將其溶解於乙腈中,供試於LC/MS分析。LC/MS分析之條件係按照彎孢屬(Curvularia sp.)中評價KK-1生產之條件。又,藉由對作為抗菌性評價之對象之灰色黴菌之生長阻止效果而評價上述萃取物之抗菌性。首先,使萃取物滲入至圓盤試紙(較薄,
6 mm),將該圓盤試紙、及每一瓊脂培養基剪出之灰色黴菌(灰色葡萄孢菌)之菌絲置於CM瓊脂培養基上,進行對峙培養。繼而,藉由灰色黴菌至圓盤試紙周邊之菌落伸長程度而評價抗菌活性。 將結果示於圖26。圖26之A表示LC/MS分析結果,B表示抗菌活性試驗結果。如圖26之A所示,於源自本實施例中所製作之轉形米麴菌之萃取物中,檢測到與KK-1標準品之保持時間及分子量完全一致之波峰。進而,如圖26之B所示,本萃取物可見灰色黴菌之菌絲伸長抑制活性。根據該等結果,證實本實施例中所製作之轉形米麴菌係以使棒狀彎孢菌中鑑定之KK-1生物合成基因簇發揮作用之形式導入者,可進行KK-1之異種生產。 本說明書中所引用之所有刊物、專利及專利申請案係直接藉由引用而併入至本說明書中。