TW201822776A - 用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，該醫藥組合物包括幹細胞及一富含血小板纖維蛋白(Platelet-rich fibrin, PRF)釋放液；其中，該幹細胞係胚胎幹細胞、成體幹細胞、或誘導型多能幹細胞，該富含血小板纖維蛋白釋放液係含有從TGF-β1 (Transforming growth factor-beta1)、VEGF (Vascular endothelial growth factor)、PDGF (Platelet-derived growth factor) 、BMP (Bone morphogenetic protein)、PF4 (Platelet factor 4)、IL(Interleukin)、EGF (Epidermal growth factor)、FGF (Fibroblast growth factor) 、NGF(Nerve growth factor)、及IGF(Insulin-like growth factor)中所選出之至少一種生長因子。
Description
本發明係關於一種醫藥組合物，特別是關於一種用於治療罹患急性腎臟損傷之醫藥組合物。
急性腎臟損傷(Acute kidney injury, AKI)為一種常見的腎臟受損病徵，以急性腎功能減退為特徵。在臨床情況中，急性腎損傷會增加病患的死亡率，即使是血肌酐(creatinine)輕微的升高或輕度蛋白尿，對病患的預後仍會產生不利影響。不只如此，急性腎損傷患者在未來發生末期腎臟病（End-stage renal disease, ESRD）的風險和長期的死亡率，皆比沒有急性腎損傷的患者來的高，目前台灣的末期腎臟病發病率和患病率皆是世界上最高的，因此如何治療AKI變成一項重要議題。
為了尋找有效且方便的治療方法，目前研究以幹細胞(stem cell)為基礎的治療方式為其主流。幹細胞和身體中其他的一般細胞不同，具有有兩種特性：第一，自我更新能力；第二則為具有分化的能力。在人體的組織中可以發現的，包含胎兒、嬰兒和成人，稱之為組織幹細胞，亦可稱為成體幹細胞。脂肪幹細胞(Mesenchymal stem cells from adipose或Adipose-derived stem cells, ADSC)為近年來熱門的研究課題之一，主要原因在於脂肪幹細胞體外增生以及多重分化能力相當強，可以利用體外培養的技術獲得大量的成體幹細胞，使得許多臨床上尚未有較快速且有效的疾病都能得到進一步的治療及改善。對於研究成體幹細胞的好處，首先是取得來源容易且能無限培養供應，患者可以使用自己的細胞來培養及治療，不會產生道德上的爭議，可以很容易地用於臨床治療中。
血小板在生理中具有凝血功能，並可以促進傷口癒合及細胞組織再生的能力， 1997年學者Kjaergard等人發展了一種不需要添加凝血酶的血小板濃縮物-富含血小板纖維蛋白（Platelet-rich fibrin, PRF），PRF製作方法類似於PRP（Plateletrich plasma），兩者的差異是在製作PRF時不需添加抗凝劑，也沒有另外添加鈣離子與凝血蛋白酶，即可直接離心使纖維蛋白原轉化成纖維蛋白，因此PRF也被稱之為第二代富含血小板濃縮物。2006年Dohan等學者對利用此製作方式製造出的PRF進行進一步的研究並探討當中含有的成分，發現此方式得到的PRF中有許多有能促進傷口癒合和細胞組織再生的生長因子，如PDGF、BMP、PF4、TGF、IL、EGF、FGF、VEGF等(Dohan et al., 2006)。目前研究已經顯示會非常緩慢地釋放出生長因子至少持續7天甚至最高會長達28天，這表示PRF對於傷口癒合過程中周圍環境可以造成長時間的刺激影響。所以如果使用從患者自身抽取的血液所製備之血小板濃縮物，作為各種生長因子的來源可以具有高安全性和高成本效益，因此最近越來越受到關注。
目前急性腎臟損傷的治療方法為進行血液透析(Hemodialysis)、腎臟替換療法(Renal replacement therapy)或是支持性療法為主，但都會大量耗費醫療資源，也無法對腎臟損傷進行有效的治療，因此這方面的研究，都導向以脂肪幹細胞或其他種類的幹細胞為基礎的新治療方式；但已經有研究指出若單獨使用幹細胞作為治療材料，可能會因為腎臟在受損後會產生強烈的免疫反應(Immune response)、氧化壓力(Oxidative stress)和細胞凋亡(Apoptosis)的情形，導致幹細胞進入後無法有效的進行治療，如何改善此窘境成為近幾年來研究的焦點。
所以，亟待開發出一種能夠解決現行急性腎臟損傷治療技術之缺陷、且又能夠充分發揮優異的醫療效果之組合物，特別是一種具有不同作用機制組合的急性腎臟損傷治療劑。
有鑑於此，本發明人乃對於上述習用技術之問題點潛心研究的結果，令人驚奇地發現：將幹細胞、及富含血小板纖維蛋白(PRF)釋放液加以組合使用於治療急性腎臟損傷時，能夠提供遠遠地超越使用一般的急性腎臟損傷治療技術之令人意想不到的優異效果，包括能夠達到良好的組織修復能力、減緩手術所誘導之急性腎臟損傷、進行急性腎臟損傷之早期治療…等。
再者，亦發現此一以有效成分之組合而成的醫藥組合物，同時具有良好的生化、物理、化學特性及體內傳輸性與藥效，可為使用者易於施用、於短時間吸收，並且可做為治療或預防急性腎臟損傷之藥物或其佐劑，藉由實施於急性腎臟損傷之預防與治療時具有能夠修復腎臟組織之功效，至此而完成本發明。
亦即，根據本發明之一觀點可以提供一種用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，其包括幹細胞及富含血小板纖維蛋白釋放液；其中，該幹細胞係為胚胎幹細胞、成體幹細胞、或誘導型多能幹細胞；該富含血小板纖維蛋白釋放液係含有從TGF-β1、VEGF、PDGF、BMP、PF4、IL、EGF、FGF、NGF、及IGF中所選出之至少一種生長因子。
根據本發明中之一觀點可以提供一種用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，上述之幹細胞可為任何合宜的幹細胞，包括例如：胚胎幹細胞、成體幹細胞、或誘導型多能幹細胞；但上述之幹細胞並非人類全能幹細胞。
根據本發明中之一觀點可以提供一種用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，其中該血小板纖維蛋白釋放液中之TGF-β1的濃度為在90至500 pg/mL之範圍；較佳為120至500pg/mL之範圍；更佳為150至500pg/mL之範圍；特佳為200至500pg/mL之範圍；最佳為300至500pg/mL之範圍。
根據本發明中之一觀點可以提供一種用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，其中該血小板纖維蛋白釋放液中之VEGF的濃度為在35至110pg/mL之範圍；較佳為40至105pg/mL之範圍；更佳為50至105pg/mL之範圍；最佳為80至100pg/mL之範圍。
根據本發明中之一觀點可以提供一種用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，其中該血小板纖維蛋白釋放液中之PDGF的濃度為在15至2350 pg/mL之範圍；較佳為20至2300pg/mL之範圍；更佳為20至2200pg/mL之範圍；特佳為200至2200pg/mL之範圍；最佳為1700至2200pg/mL之範圍。
根據本發明中之一觀點可以提供一種用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，其中該血小板纖維蛋白釋放液中之EGF的濃度為在10.0至25.0pg/mL之範圍；較佳為12至25pg/mL之範圍；更佳為15至25pg/mL之範圍；最佳為17至25pg/mL之範圍。
根據本發明中之一觀點可以提供一種用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，其中該血小板纖維蛋白釋放液中之FGF的濃度為在4至30 pg/mL之範圍；較佳為4至28pg/mL之範圍；更佳為6至24pg/mL之範圍；最佳為8至24pg/mL之範圍。
根據本發明中之一觀點可以提供一種用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，其中該血小板纖維蛋白釋放液中之NGF的濃度為在2至6pg/mL之範圍；較佳為4至6pg/mL之範圍。
根據本發明中之一觀點可以提供一種用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，其中該血小板纖維蛋白釋放液中之IGF的濃度為在650至920pg/mL之範圍；較佳為680至900pg/mL之範圍；更佳為700至900pg/mL之範圍；最佳為750至850pg/mL之範圍。
根據本發明中之一觀點可以提供一種用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，上述之成體幹細胞包括但不限於臍帶血幹細胞、周邊血幹細胞、神經幹細胞、表皮幹細胞、肌肉幹細胞、脂肪幹細胞、骨髓幹細胞、眼角膜幹細胞、肝臟幹細胞、或腸上皮幹細胞；較佳為臍帶血幹細胞、周邊血幹細胞、神經幹細胞、表皮幹細胞、肌肉幹細胞、脂肪幹細胞、或骨髓幹細胞；更佳為臍帶血幹細胞、周邊血幹細胞、神經幹細胞、肌肉幹細胞、脂肪幹細胞、或骨髓幹細胞；特佳為臍帶血幹細胞、周邊血幹細胞、脂肪幹細胞、或骨髓幹細胞；最佳為脂肪幹細胞。
根據本發明中之一觀點可以提供一種用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，上述之脂肪幹細胞為自人類、或哺乳類動物之脂肪組織中分離而得。
另外，根據本發明之又一觀點還可以提供一種用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，其中該幹細胞及該富含血小板纖維蛋白釋放液係同時使用、或依序使用。
又且，根據本發明之其他觀點亦可以提供一種用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，其係進一步包含該醫藥組合物在藥學上可接受之鹽類或載劑。
更且，根據本發明之其他觀點還可以提供一種用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，其中該載劑包含賦形劑、稀釋劑、增稠劑、填充劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、油脂或非油脂的基劑、介面活性劑、懸浮劑、膠凝劑、輔助劑、防腐劑、抗氧化劑、穩定劑、著色劑或香料等。
然後，根據本發明之其他觀點亦可以提供一種用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，其係用於治療人類、及哺乳類動物中任一種。
此外，根據本發明之其他觀點亦可以提供一種用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，其係以注射方式投予。
以下，針對本發明的實施態樣列舉不同的具體實施例而更加詳盡地敘述與說明，以便使本發明的精神與內容更為完備而易於瞭解；然而，本項技藝中具有通常知識者應當明瞭本發明當然不受限於此等實例而已，亦可利用其他相同或均等的功能與步驟順序來達成本發明。
首先，對於本說明書中所使用的特定用語或名詞進行描述性的說明。
除非本說明書另有定義以外，在本文中所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。
在本文中，「預防(prophylaxis)」之用語係指對一種未來事件，包括在事前防止發生急性腎損傷、以及防止發生因手術或診斷程序致使急性腎損傷的事件而實施之的防制手段。
在本文中，「治療(treatment或treating)」之用語係指對於具有某種醫療狀況、症狀、疾病、病症或其先期狀況的個體或患者，實施可達成藥學和/或生理效果的預防性、治癒性或緩和性之處置，藉以部分或完全減輕嚴重性、延遲發生進程、及/或抑制該醫療狀況之一或多個病徵、異常及/或疾病出現機率之行為。前述病徵、疾病、異常和/或醫療狀況可以是急性腎損傷。
在本文中，「有效量(an effective amount)」之用語係指對於受損腎臟組織直接或間施用(administered、administering、或administration)之醫學藥物，在經過適當的給藥期間後，能夠達到修複腎臟組織之效果、或者治療急性腎臟損傷之目的所施用之特定用量。
在本文中，前述之「醫學藥物」係指能透過局部和/或全身性作用而誘發所期待的藥學和/或生理反應之具有藥學上活性之物質，通常包括醫藥化合物(compound)、調配物(formulation)、組合物(composition)、藥劑(agent)、醫藥品(medicine or medicament)、或者藥學活性化合物的前驅藥(prodrug)、衍生物(derivative)、或類似物(analog) 等。
在本文中，「個體(subject)」或「患者(patient)」可彼此交替使用。該「個體」或「患者」分別指可接受所述化合物和/或方法治療的動物，包括但不限於例如包含狗、貓、馬、羊、豬、牛等之任何的哺乳類動物，以及人類、非人類的靈長類。除非另有具體說明以外，該「個體」或「患者」可包括雄性與雌性兩種性別。又，適合接受本發明之醫藥組合物和/或方法治療之個體或患者，較佳者為人類。
在本文中，對於用以界定本發明範圍的數值與參數，本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差，因而大多是以約略的數量值來表示，然而於具體實施例中則盡可能精確呈現的相關數值。在本文中，「約」通常視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定，一般係指代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，例如，該實際數值為在一特定數值或範圍的±10%、±5%、±1%、或±0.5%以內。
在本文中，各比較例與各實施例所獲得數據皆利用統計分析來判定不同組別之間是否有顯著性差異。其中細胞實驗如細胞生長率、細胞存活率等，選用的統計學方式為One-way ANOVA (Analysis of variance)檢定法，對各組之間進行比較，當p值小於0.01則顯示有統計學上極顯著差異。而動物實驗之損傷恢復評估、血清及尿液檢測等，則採用Student’s t-test對各組之間進行比較，當p值小於0.05認為具有統計學上的顯著差異(p＜0.05)，而當p值小於0.01則顯示有統計學上的極顯著差異(p＜0.01)。
亦即，本發明之揭示內容可以提供一種用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，其包括一幹細胞及一血小板纖維蛋白釋放液；其中，該脂肪幹細胞係為胚胎幹細胞、成體幹細胞、或誘導型多能幹細胞為自人類或哺乳類動物之脂肪組織中分離而得；該血小板纖維蛋白釋放液係含有從TGF-β1、VEGF、PDGF、BMP、PF4、IL、EGF、FGF 、NGF、及IGF中所選出之至少一種的生長因子。
又，根據本發明之其他較佳實施方式亦可以提供一種用於治療急性腎臟損傷的個體之醫藥組合物，其係進一步包含該組合物在藥學上可接受之鹽類或載劑。
更且，根據本發明之另一實施方式還可以提供一種用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，上述之載劑包含賦形劑、稀釋劑、增稠劑、填充劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、油脂或非油脂的基劑、介面活性劑、懸浮劑、膠凝劑、輔助劑、防腐劑、抗氧化劑、穩定劑、著色劑或香料等
又且，根據本發明之另一實施方式還可以提供一種用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，其係為液體、凍乾粉末、晶球、或緩效釋放劑之劑型；較佳者為液體、晶球、或緩效釋放劑之劑型；更佳者為晶球、或緩效釋放劑之劑型；最佳為以緩效釋放劑之劑型。
另外，根據本發明之其他觀點還可以提供一種用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，其中上述之賦型劑係指可和藥學製劑中其他成分相容且與生物體相容者，例如，囊封材料或諸如吸收促進劑、抗氧化劑、黏合劑、緩衝液、包覆劑、著色劑、稀釋劑、崩解劑、乳化劑、補充劑、填充劑、調味劑、保濕劑、潤滑劑、防腐劑、推進劑、釋放劑、殺菌劑、增溶劑、濕潤劑及其混合物等之各種添加劑。
又，在本發明之其他較佳實施方式中，係將含有本發明醫藥組合物的液態配方製作成無菌注射溶液或懸浮液；例如，製作成適合於以靜脈內注射、肌肉內注射、皮下注射或腹膜內注射等方式施用的溶液；適合使用於上述無菌注射溶液或懸浮液中之稀釋劑，舉例來說，例如，其可以包括但不限於1,3-丁二醇、甘露醇、水、林格氏溶液、等張氯化鈉溶液；亦可以使用例如油酸等之脂肪酸、甘油酯衍生物、或者是例如橄欖油或菜籽油等之藥學可接受的天然油脂。
再者，在本發明之另一較佳實施方式中，亦可將本發明上述之醫藥組合物與藥學可接受的高分子輔劑一起製成緩效釋放之劑型。上述之高分子輔劑包含親水性聚合物，舉例來說，例如，其可以使用包括但不限於甲基纖維素(Methyl Cellulose)、羥丙基纖維素(Hydroxypropyl Cellulose)、羥丙基甲基纖維素(Hydroxypropyl Methyl Cellulose )、羧乙烯聚合物(Carboxypolymethylene, Carbopol, Cabomer)、聚環氧乙烷(polyethylene oxide)、羧甲基纖維素鈉(CarboxymethylCellulose Sodium)、海藻素、玻尿酸、明膠等。
以下，藉由實施例來說明本發明之特定實施態樣，但本發明之內容範疇並不受限於此等實施例而已。
《製備例1》(富含血小板纖維蛋白釋放液之製備)
首先，將10週齡大之紐西蘭大白兔（New Zealand White Rabbit，威信行購入）以濃度為50mg/mL之Zoletil(Zoletil®50，Virbac，France)及濃度為20mg/mL 之Xylazine (Balanzine®，公源藥品，臺灣)以1：1之比例混合後之混合液，以0.25 mL/kg之劑量注射肌肉進行全身性麻醉，使該大白兔鎮靜並達淺層麻醉狀態。接著，將該大白兔頸部附近的毛髮剃除乾淨，並利用已沾取10％碘酒及75%酒精混合液之棉花，由內向外擦拭該大白兔之頸部皮膚，進行消毒。
消毒完成後，使用10mL注射筒搭配18G針頭，在不加抗凝劑的條件之下，從該兔子頸部外頸靜脈血管抽取採集新鮮血液。
將抽取出之新鮮兔血立即移至含有clot activator之8.5 mL BD Vacutainer採血管當中，因為沒有添加抗凝血劑，過程中需以手輕輕搖晃並轉動採血管，避免血液凝固。最後，將裝有兔血的採血管以轉速3000rpm進行離心10分鐘，位於採血管底部為紅血球、白血球等凝集血球，位於採血管頂部為缺乏血小板血漿，而中間的半透明狀凝膠則為富含血小板纖維蛋白(Platelet-Rich Fibrin, PRF)。
將該製作富含血小板纖維蛋白完成之採血管以酒精消毒，接著在無菌操作台內分離該採血管之中富含血小板纖維蛋白及底部的凝膠。接著，將該富含血小板纖維蛋白移至乾淨且無菌的玻璃管中，放置於室溫環境下歷經5小時，過程中釋放出來的液體即為富含血小板纖維蛋白釋放液P，並將該富含血小板纖維蛋白釋放液P放置於-20℃冷凍庫中保存。
將兔血小板纖維蛋白經靜置一小時後進行血小板纖維蛋白釋放液P之生長因子濃度分析，並將各生長因子之濃度紀錄於表1。
表1
《製備例2》(脂肪幹細胞之製備)
首先，將8週齡大之健康、無任何明顯外傷之SD品系大鼠以濃度為50mg/mL之Zoletil(Zoletil®50，Virbac，France)及濃度為20mg/mL 之Xylazine (Balanzine®，公源藥品，臺灣)以1：1之比例混合後之混合液，以0.25 mL/kg的劑量肌肉注射，將該大鼠全身麻醉。接著，剃除該大鼠後肢處的毛髮，並利用已沾取10％的碘酒、及75%酒精混合液之棉花，由內向外擦拭該大鼠後肢處皮膚以完整消毒。
消毒完成的大鼠在無菌的環境下進行脂肪抽取。從大鼠腹腔內抽取出的脂肪組織，以PBS清洗三次，隨後加入第一型膠原蛋白酶，在室溫下震盪一小時。以3000rpm離心10分鐘。 離心後再將沉澱物打散後以100μm尼龍篩網過濾，並混合PBS再次以3000rpm離心10分鐘。最後去除上清液，取底部細胞進行細胞培養。取出的細胞即為初代脂肪幹細胞，利用含有10%胎牛血清及 1X三合一抗生素之α-MEM培養液進行細胞培養。而細胞培養至細胞數量超過1x106
顆後即可準備染細胞表面CD marker抗體，進行流式細胞儀篩選。
將1x106
顆細胞以1倍之0.25 ％Trypsin - 0.02 ％EDTA全數打下後，收集在15mL離心管中，以1000rpm離心5分鐘。離心完後把離心管中上清液移除，再利用1 mL預冷過之PBS將細胞團塊打散，以完整清洗細胞。清洗後再利用1000rpm離心5分鐘，以完整移除管內上清液。
確認細胞完整清洗後，需使用酒精固定細胞，固定前先使用1 mL PBS將細胞團塊確實打散，避免酒精固定時細胞聚集成團塊。接著緩慢加入3mL 70%預冷過的EtOH，於-20℃環境下置放1小時或是在4℃環境中放置一天後，以1000rpm 離心5分鐘。清除上清液後再加入5 mL PBS，且重複動作一次將細胞清洗乾淨。
接著配製1:100 iso ab mouse anti human CD34(BD553731，BD Biosciences，USA)、CD45(AB10558，abcam，USA)、
CD44(AB119335，abcam，USA)、
CD73(BD550738，BD Biosciences，USA) 和CD90(BD554895，BD Biosciences，USA) 以及用來測試抗體效力之相對應抗體1:100 iso ab mouse IgG CD34(BD553927，BD Biosciences，USA) 、CD45(AB172730，abcam，USA)、
CD44(BD553927，BD Biosciences，USA)、
CD73(BD553927，BD Biosciences，USA) 和CD90(BD555746，BD Biosciences，USA)，再分別加30ul抗體至1mL之細胞液當中後，接著使用1 mL PBS將離心管中細胞團塊打散，並放置在4℃環境下作用1.5小時。等待過程中，先於避光環境下配製1:100 PE goat anti mouse ab(BD550589，BD Biosciences，USA)，完成後加入30ul至1mL 細胞液中，並作用30 分鐘。待作用完成後，以3000rpm 離心10分鐘且移除上清液，最後利用0.5 mL PBS將細胞團塊打散後，即可使用流式細胞儀進行篩選。
細胞利用流式細胞儀篩選後，以預先準備內裝10mLα-MEM培養液之15mL離心管，將流式細胞儀篩選出含有CD90抗體之細胞取回，利用內含10%胎牛血清及1X 三合一抗生素的α-MEM培養液進行細胞培養。
將脂肪液緩慢加入到含有LymphoprepTM
離心管(Axis-Shield)內以3000 rpm離心30分鐘，取用單核細胞層的細胞培養。培養後的間葉幹細胞會附著到培養皿上，培養五天之後，將細胞放置在顯微鏡下觀察，可以看出細胞形態類似於纖維母細胞的狀態。
從初代培養的細胞形態中，可以發現剛貼壁的細胞仍呈現圓形，兩天後貼壁的細胞體積會明顯增大，形態變為橢圓形或不規則。隨著培養時間增加，細胞不斷分裂增殖，細胞會逐漸變成長梭形，並向四周伸展延長。
接種後三天首次更換培養液，可見間葉幹細胞體積增大，呈梭形或多角形，細胞核位於中間位置，呈現均勻有序的排列。細胞中間較高，立體凸起，周圍較低，分化後的細胞形態則會呈現比較扁平。
使用FACScan流式細胞儀(Becton Dickinson, USA)的分析技術，篩選方式為使用間葉幹細胞的特定標誌物，篩選出含細胞表面陽性標誌物CD90和CD44螢光抗體大小密度接近的細胞群，同時使用CD31和CD45做為陰性對照組，篩選出細胞顆粒大小的範圍，經所含螢光強度分析後得知所挑選的區域CD90為99.9％和CD44為75.6％，陰性對照組CD31和CD45為0.8%及0.6%，均小於1％，之後將篩選出的細胞進行繼代培養，增殖放大細胞數量，而得到脂肪幹細胞R。
為了在犧牲大鼠腎臟切片觀察是否可以在施打後發現幹細胞的存留，因此利用螢光進行標記以方便之後的觀察。本實驗使用細胞螢光除外追蹤探針CellTracker™ Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate , Thermo Fisher Scientific Inc. , USA)作為標記活細胞之用。步驟首先為準備Working dye solution：將染料(Dye)回溫至室溫，將100%的DMSO (BLS-410301, BloodStor, USA)加入染料(Dye)配成10 mM的stock，並將配好的溶液和培養基配成10 μM的濃度成為working dye solution，最後將Working dye solution加熱至37℃等待使用。之後將培養基去除緩慢加入Working dye solution，在37℃下培養30分鐘。之後利用suction幫浦將Working dye solution吸除乾淨，最後加入一般培養基α-MEM等待使用。
《治療急性腎臟損傷效果之體外實驗分析》
《比較例1》(正常之腎臟組織勻漿+脂肪幹細胞R)
首先，製備正常腎臟組織勻漿(Normal-kidney homogenate supernatant, N-KHS)作為實驗材料。將健康大鼠犧牲後取下其腎臟，將其腎臟之皮質取下切碎，與PBS在勻漿器中製成濃度為20 g/L的正常腎臟組織勻漿(N-KHS)，再將該正常腎臟組織勻漿(N-KHS)於恆溫4℃的環境下以轉速20000 rpm進行離心15分鐘。之後，取出上清液並利用孔徑為30 μm 之篩網將上清液進行過濾而得到N-KHS濾液。最後，將該濾液放入乾淨離心管中並存放於-80℃冰箱。
利用Transwell chamber具有上下層的特點，將由《製備例2》所得之脂肪幹細胞R以4 × 105
cells/well的細胞數配合DMEM培養液一起置於下層的6-well培養盤中，並將1.5ml之上述的N-KHS過濾液置入在上層，使脂肪幹細胞R維持在正常腎臟組織之培養環境。經培養3天後，將20μl之 MTT溶液加入上述之6-well培養盤進行培養4小時，再將150μl 之DMSO 加入上述之6-well培養盤進行培養10分鐘；然後，利用細胞計數器可算出脂肪幹細胞R之數量為4.1x105
。
《比較例2》(急性腎臟損傷之腎臟組織+脂肪幹細胞R)
首先，製備急性腎臟損傷之腎臟組織勻漿(Acute kidney iinjury-kidney homogenate supernatant, AKI-KHS)作為實驗材料。將進行腎臟缺血後灌流(Ischemia Reperfusion, IR)手術後之大鼠犧牲並取下其腎臟，將其腎臟之皮質取下切碎，與PBS在勻漿器中製成濃度為20 g/L的急性腎臟損傷組織勻漿(AKI-KHS)，再將該急性腎臟損傷組織勻漿(AKI-KHS)於恆溫4℃的環境下以轉速20000 rpm進行離心15分鐘。之後，取出上清液並利用孔徑為30 μm 之篩網將上清液進行過濾而得到AKI-HHS濾液。最後，將該濾液放入乾淨離心管中並存放於-80℃冰箱
利用Transwell chamber具有上下層的特點，將由《製備例2》所得之脂肪幹細胞R以4 × 105
cells/well的細胞數配合DMEM培養液一起置於下層的6-well培養盤中，並將1.5ml之上述的AKI-KHS過濾液置入在上層，使脂肪幹細胞R維持在正常腎臟組織之培養環境。經培養3天後，將20μl之 MTT溶液加入上述之6-well培養盤進行培養4小時，再將150μl 之DMSO 加入上述之6-well培養盤進行培養10分鐘；然後，利用細胞計數器可算出脂肪幹細胞R之數量為1.63 x105
。
《比較例3》(正常之腎臟組織勻漿+PRFr+脂肪幹細胞R)
首先，製備正常腎臟組織勻漿(N-KHS)作為實驗材料。將健康大鼠犧牲後取下其腎臟，將其腎臟之皮質取下切碎，與PBS在勻漿器中製成濃度為20 g/L的正常腎臟組織勻漿(N-KHS)，再將該正常腎臟組織勻漿(N-KHS)於恆溫4℃的環境下以轉速20000 rpm進行離心15分鐘。之後，取出上清液並利用孔徑為30 μm 之篩網將上清液進行過濾而得到N-KHS濾液。最後，將該濾液放入乾淨離心管中並存放於-80℃冰箱。
利用Transwell chamber分上下層的特點，將由《製備例2》所得之脂肪幹細胞R以4 × 105
cells/well的細胞數配合DMEM培養液一起置於下層6-well培養盤中，並將1.5ml之上述的N-KHS過濾液置入在上層，使脂肪幹細胞R維持在正常腎臟組織之培養環境；接著，將由《製備例1》所得之富含血小板纖維蛋白釋放液P加入上述之6-well培養盤中。經培養3天後，將20μl之 MTT溶液加入上述之6-well培養盤進行培養4小時，再將150μl 之DMSO 加入上述之6-well培養盤進行培養10分鐘；然後，利用細胞計數器可算出脂肪幹細胞R之數量為3.97x105
。
《實施例1》(急性腎臟損傷之腎臟組織+PRFr+脂肪幹細胞R)
首先，製備急性腎臟損傷之腎臟組織勻漿(AKI-KHS)作為實驗材料。將進行腎臟缺血後灌流(Ischemia Reperfusion, IR)手術後之大鼠犧牲並取下其腎臟，將其腎臟之皮質取下切碎，與PBS在勻漿器中製成濃度為20 g/L的急性腎臟損傷組織勻漿(AKI-KHS)，再將該急性腎臟損傷組織勻漿(AKI-KHS)於恆溫4℃的環境下以轉速20000 rpm進行離心15分鐘。之後，取出上清液並利用孔徑為30 μm 之篩網將上清液進行過濾而得到AKI-HHS濾液。最後，將該濾液放入乾淨離心管中並存放於-80℃冰箱
利用Transwell chamber分上下層的特點，將由《製備例2》所得之脂肪幹細胞R以4 × 105
cells/well的細胞數配合DMEM培養液一起置於下層的6-well培養盤中，並將1.5ml之上述的AKI-KHS過濾液置入在上層，使脂肪幹細胞R維持在正常腎臟組織之培養環境；接著，將由《製備例1》所得之血小板纖維蛋白釋放液加入上述之6-well培養盤中。經培養3天後，將20μl之 MTT溶液加入上述之6-well培養盤進行培養4小時，再將150μl 之DMSO 加入上述之6-well培養盤進行培養10分鐘；然後，利用細胞計數器可算出脂肪幹細胞R之數量為3.87x105
。
培養完成後所測得的各組之脂肪幹細胞R之數量為如圖1所示。比較比較例1及比較例2的數據，結果可知：脂肪幹細胞R數量在腎臟組織受損的情況下將會減少60%，所以脂肪幹細胞不易在受損的腎臟組織中生長；另外，比較比較例2及實施例1的數據，結果可知：當將富含血小板纖維蛋白釋放液P加入已受損之腎臟組織，脂肪幹細胞R數量可以提升至237%；所以加入富含血小板纖維蛋白釋放液P有助於提高脂肪幹細胞在受損腎臟組織中之生長能力。
從而，可以確認：若僅以脂肪幹細胞為唯一的治療急性腎臟損傷之材料時，該脂肪幹細胞之生長不易，只能發揮40%的效率，因而無法得到令人滿意的治療效果；但另一方面，當將脂肪幹細胞與一起加入富含血小板纖維蛋白釋放液於受損腎臟組織中，將可以有效促進脂肪幹細胞之生長，例如，脂肪幹細胞的生長效率可提高到237%；亦即，與只加入脂肪幹細胞的情況相比，脂肪幹細胞與一起加入富含血小板纖維蛋白釋放液P的情況可以得到237%之治療受損腎臟組織的功效。
《治療急性腎臟損傷效果之動物實驗分析》
《比較例4》(假手術組，未投與藥物)
取6隻8週齡大的健康大鼠進行假手術。先將禁食約8~12小時後的大鼠從鼠籠中抓出，觀察有無異狀或明顯外傷，接著放置磅秤上測量體重以決定麻醉藥劑量。其後以50mg/mL之Zoletil® (Zoletil®50，Virbac，France)及之Xylazine (Balanzine®，公源藥品，臺灣) 以1：1之比例混合後以肌肉注射進行麻醉。
將麻醉完成的大鼠放置在手術桌旁，使用剃毛刀將腹部皮膚上毛髮剃除後，以碘酒由內向外畫圈，完整將皮膚清潔消毒，再用酒精以相同方式清潔消毒一次，之後大鼠以尾巴朝向手術者的方向放置在手術台上，並蓋上無菌洞巾。以手術刀在大鼠正中間的腹部皮膚開一道長約3公分的傷口，將腎臟曝露出來，接著直接將傷口縫合。
然後，分別進行《尿液中尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析》、《血清中之尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析》、及《腎臟組織切片分析》
《尿液中尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析》
將手術完成之大鼠置入代謝籠中，歷24小時後收集其尿液；接著，第一個月以一週一次的頻率收集，而後以一個月一次的頻率收集總共四個月份的尿液檢體。然後，將尿液檢體利用全自動生化分析儀(J&J Vitros 350 Chemistry Analyzer, USA)進行尿液中尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析。
《血清中之尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析》
經16週後犧牲大鼠並採集其血液，接著將所抽取到的血液利用離心機以轉速3000rpm進行離心10分鐘，藉以從血液中採集分離出的血清。然後，利用全自動生化分析儀(Spotchem EZ SP-4430 Fully automated dry clinical chemistry analyzer, Japan)進行血清中之尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析。
《腎臟組織切片分析》
解剖犧牲後之大鼠並取其腎臟組織。將腎臟組織從中間對半切開固定於10%中性福馬林，再以組織修片刀進行修整，隨即將固定之組織脫水，再以石臘包埋。將包埋之腎臟組織切成大約4 µm之厚度並製作成切片，進行H&E染色，然後在光學顯微鏡下觀察了解腎臟內部形態的改變及恢復情形。
《比較例5》(手術組(control)，未投與藥物)
取6隻8週齡大的健康大鼠，進行腎臟缺血後灌流手術。先將禁食約8~12小時後的大鼠從鼠籠中抓出，觀察有無異狀或明顯外傷，接著放置磅秤上測量體重以決定麻醉藥劑量。其後以50mg/mL之Zoletil® (Zoletil®50，Virbac，France)及之Xylazine (Balanzine®，公源藥品，臺灣) 以1：1之比例混合後以肌肉注射進行麻醉。
將麻醉完成的大鼠放置在手術桌旁，使用剃毛刀將腹部皮膚上毛髮剃除後，以碘酒由內向外畫圈，完整將皮膚清潔消毒，再用酒精以相同方式清潔消毒一次，之後大鼠以尾巴朝向手術者的方向放置在手術台上，並蓋上無菌洞巾。以手術刀在大鼠正中間的腹部皮膚開一道長約3公分的傷口，將腎臟曝露出來。找到腎動脈後，利用前端套有塑膠細導管的止血鉗將其夾住45分鐘後鬆開，並以3個零之縫線將傷口縫合。最後將腹部皮膚缺口以間斷縫法將腹部皮膚缺口閉合，並擦上碘酒及包紮傷口，即完成手術。
然後，分別進行《尿液中尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析》、《血清中之尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析》、及《腎臟組織切片分析》
《尿液中尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析》
將手術完成之大鼠置入代謝籠中，歷24小時後收集其尿液；接著，第一個月以一週一次的頻率收集，而後以一個月一次的頻率收集總共四個月份的尿液檢體。然後，將尿液檢體利用全自動生化分析儀(J&J Vitros 350 Chemistry Analyzer, USA)進行尿液中尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析。
《血清中之尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析》
經16週後犧牲大鼠並採集其血液，接著將所抽取到的血液利用離心機以轉速3000rpm進行離心10分鐘，藉以從血液中採集分離出的血清。然後，利用全自動生化分析儀(Spotchem EZ SP-4430 Fully automated dry clinical chemistry analyzer, Japan)進行血清中之尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析。
《腎臟組織切片分析》
解剖犧牲後之大鼠並取其腎臟組織。將腎臟組織從中間對半切開固定於10%中性福馬林，再以組織修片刀進行修整，隨即將固定之組織脫水，再以石臘包埋。將包埋之腎臟組織切成大約4 µm之厚度並製作成切片，進行H&E染色，然後在光學顯微鏡下觀察了解腎臟內部形態的改變及恢復情形。
《比較例6》(手術組(PRFr)，投與富含血小板纖維蛋白釋放液P)
取6隻8週齡大的健康大鼠，進行腎臟缺血後灌流手術。先將禁食約8~12小時後的大鼠從鼠籠中抓出，觀察有無異狀或明顯外傷，接著放置磅秤上測量體重以決定麻醉藥劑量。其後以50mg/mL之Zoletil® (Zoletil®50，Virbac，France)及之Xylazine (Balanzine®，公源藥品，臺灣) 以1：1之比例混合後以肌肉注射進行麻醉。
將麻醉完成的大鼠放置在手術桌旁，使用剃毛刀將腹部皮膚上毛髮剃除後，以碘酒由內向外畫圈，完整將皮膚清潔消毒，再用酒精以相同方式清潔消毒一次，之後大鼠以尾巴朝向手術者的方向放置在手術台上，並蓋上無菌洞巾。以手術刀在大鼠正中間的腹部皮膚開一道長約3公分的傷口，將腎臟曝露出來。找到腎動脈後，利用前端套有塑膠細導管的止血鉗將其夾住45分鐘後鬆開，並以3個零之縫線將傷口縫合。最後將腹部皮膚缺口以間斷縫法將腹部皮膚缺口閉合，並擦上碘酒及包紮傷口，即完成手術。
接著觀察手術完成後之大鼠沒有明顯不適症狀後即可注術由《製備例1》而得之富含血小板纖維蛋白釋放液P至大鼠體內。注射時先利用酒精棉花將大鼠的尾部完整消毒，避免細菌感染，接著使用1mL注射筒搭配26G針頭，抽取離心管中之富含血小板纖維蛋白釋放液P，對準大鼠尾根部薦尾靜脈緩慢將富含血小板纖維蛋白釋放液P推入，避免瞬間推入使大鼠產生瞬間性凝血現象造成死亡。注射後的大鼠以酒精棉加壓止血以避免靜脈回血，確認無任何出血後即可鬆開酒精棉，放入代謝籠中。每一週注射一次，連續注射四次，每次注射之劑量如表2所示。
然後，分別進行《尿液中尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析》、《血清中之尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析》、及《腎臟組織切片分析》
《尿液中尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析》
將手術完成之大鼠置入代謝籠中，歷24小時後收集其尿液；接著，第一個月以一週一次的頻率收集，而後以一個月一次的頻率收集總共四個月份的尿液檢體。然後，將尿液檢體利用全自動生化分析儀(J&J Vitros 350 Chemistry Analyzer, USA)進行尿液中尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析。
《血清中之尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析》
經16週後犧牲大鼠並採集其血液，接著將所抽取到的血液利用離心機以轉速3000rpm進行離心10分鐘，藉以從血液中採集分離出的血清。然後，利用全自動生化分析儀(Spotchem EZ SP-4430 Fully automated dry clinical chemistry analyzer, Japan)進行血清中之尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析。
《腎臟組織切片分析》
解剖犧牲後之大鼠並取其腎臟組織。將腎臟組織從中間對半切開固定於10%中性福馬林，再以組織修片刀進行修整，隨即將固定之組織脫水，再以石臘包埋。將包埋之腎臟組織切成大約4 µm之厚度並製作成切片，進行H&E染色，然後在光學顯微鏡下觀察了解腎臟內部形態的改變及恢復情形。
《比較例7》(手術組(ADSC)，投與脂肪幹細胞R)
首先，將由《製備例2》所得之脂肪幹細胞R從37 ℃，5 ％CO2
的培養箱中取出，在顯微鏡下確認脂肪幹細胞R之生長型態正常後，使用1倍0.25 ％Trypsin - 0.02 ％EDTA將脂肪幹細胞R從培養皿上分離下，接著利用PBS清洗脂肪幹細胞R，移除多餘的胰蛋白酵素，並以3000rpm 離心10分鐘清除廢液。離心後取100 μl細胞液與相等體積之0.5 ％Trypan blue混合染色後，滴於血球計數盤上，並在顯微鏡下計數以確認注射的脂肪幹細胞R之數量。
接著，將欲打入大鼠體內的脂肪幹細胞R以PBS混合均勻，且將細胞團塊打散，當確認混合液中沒有其他會造成血管阻塞的物質產生後即得到脂肪幹細胞R-PBS混合液。
然後，取6隻8週齡大的健康大鼠，進行腎臟缺血後灌流手術。先將禁食約8~12小時後的大鼠從鼠籠中抓出，觀察有無異狀或明顯外傷，接著放置磅秤上測量體重以決定麻醉藥劑量。再以50mg/mL之Zoletil® (Zoletil®50，Virbac，France)及之Xylazine (Balanzine®，公源藥品，臺灣) 以1：1之比例混合後以肌肉注射進行麻醉。
將麻醉完成的大鼠放置在手術桌旁，使用剃毛刀將腹部皮膚上毛髮剃除後，以碘酒由內向外畫圈，完整將皮膚清潔消毒，再用酒精以相同方式清潔消毒一次，之後大鼠以尾巴朝向手術者的方向放置在手術台上，並蓋上無菌洞巾。以手術刀在大鼠正中間的腹部皮膚開一道長約3公分的傷口，將腎臟曝露出來。找到腎動脈後，利用前端套有塑膠細導管的止血鉗將其夾住45分鐘後鬆開，並以3個零之縫線將傷口縫合。最後將腹部皮膚缺口以間斷縫法將腹部皮膚缺口閉合，並擦上碘酒及包紮傷口，即完成手術。
接著觀察手術完成後之大鼠沒有明顯不適症狀後即可注術上述之脂肪幹細胞R-PBS混合液至大鼠體內。注射時先利用酒精棉花將大鼠的尾部完整消毒，避免細菌感染，接著使用1mL注射筒搭配26G針頭，抽取離心管中之脂肪幹細胞R-PBS混合液，對準大鼠尾根部薦尾靜脈緩慢將脂肪幹細胞R-PBS混合液推入，避免瞬間推入使大鼠產生瞬間性凝血現象造成死亡。注射後的大鼠以酒精棉加壓止血以避免靜脈回血，確認無任何出血後即可鬆開酒精棉，放入代謝籠中。每一週注射一次，連續注射四次，每次注射之劑量如表2所示。
然後，分別進行《尿液中尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析》、《血清中之尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析》、及《腎臟組織切片分析》
《尿液中尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析》
將手術完成之大鼠置入代謝籠中，歷24小時後收集其尿液；接著，第一個月以一週一次的頻率收集，而後以一個月一次的頻率收集總共四個月份的尿液檢體。然後，將尿液檢體利用全自動生化分析儀(J&J Vitros 350 Chemistry Analyzer, USA)進行尿液中尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析。
《血清中之尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析》
經16週後犧牲大鼠並採集其血液，接著將所抽取到的血液利用離心機以轉速3000rpm進行離心10分鐘，藉以從血液中採集分離出的血清。然後，利用全自動生化分析儀(Spotchem EZ SP-4430 Fully automated dry clinical chemistry analyzer, Japan)進行血清中之尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析。
《腎臟組織切片分析》
解剖犧牲後之大鼠並取其腎臟組織。將腎臟組織從中間對半切開固定於10%中性福馬林，再以組織修片刀進行修整，隨即將固定之組織脫水，再以石臘包埋。將包埋之腎臟組織切成大約4 µm之厚度並製作成切片，進行H&E染色，然後在光學顯微鏡下觀察了解腎臟內部形態的改變及恢復情形。
《實施例2》(手術組(ADSC+PRFr)，投與富含血小板纖維蛋白釋放液P+脂肪幹細胞R)
首先，將由《製備例2》所得之脂肪幹細胞R從37 ℃，5 ％CO2
的培養箱中取出，在顯微鏡下確認脂肪幹細胞R之生長型態正常後，使用1倍0.25 ％Trypsin - 0.02 ％EDTA將脂肪幹細胞R從培養皿上分離下，接著利用PBS清洗脂肪幹細胞R，移除多餘的胰蛋白酵素，並以3000rpm 離心10分鐘清除廢液。離心後取100 μl細胞液與相等體積之0.5 ％Trypan blue混合染色後，滴於血球計數盤上，並在顯微鏡下計數以確認注射的脂肪幹細胞R之數量。
接著，將欲打入大鼠體內的脂肪幹細胞R以由《製備例1》所得之富含血小板纖維蛋白釋放液P混合均勻，且將細胞團塊打散，當確認混合液中沒有其他會造成血管阻塞的物質產生後即得到脂肪幹細胞R-PRFr混合液。
然後，取6隻8週齡大的健康大鼠，進行腎臟缺血後灌流手術。先將禁食約8~12小時後的大鼠從鼠籠中抓出，觀察有無異狀或明顯外傷，接著放置磅秤上測量體重以決定麻醉藥劑量。再以50mg/mL之Zoletil® (Zoletil®50，Virbac，France)及之Xylazine (Balanzine®，公源藥品，臺灣) 以1：1之比例混合後以肌肉注射進行麻醉。
將麻醉完成的大鼠放置在手術桌旁，使用剃毛刀將腹部皮膚上毛髮剃除後，以碘酒由內向外畫圈，完整將皮膚清潔消毒，再用酒精以相同方式清潔消毒一次，之後大鼠以尾巴朝向手術者的方向放置在手術台上，並蓋上無菌洞巾。以手術刀在大鼠正中間的腹部皮膚開一道長約3公分的傷口，將腎臟曝露出來。找到腎動脈後，利用前端套有塑膠細導管的止血鉗將其夾住45分鐘後鬆開，並以3個零之縫線將傷口縫合。最後將腹部皮膚缺口以間斷縫法將腹部皮膚缺口閉合，並擦上碘酒及包紮傷口，即完成手術。
接著觀察手術完成後之大鼠沒有明顯不適症狀後即可注入上述之脂肪幹細胞R-PRFr混合液至大鼠體內。注射時先利用酒精棉花將大鼠的尾部完整消毒，避免細菌感染，接著使用1mL注射筒搭配26G針頭，抽取離心管中之脂肪幹細胞R-PRFr混合液，對準大鼠尾根部薦尾靜脈緩慢將脂肪幹細胞R-PRFr混合液推入，避免瞬間推入使大鼠產生瞬間性凝血現象造成死亡。注射後的大鼠以酒精棉加壓止血以避免靜脈回血，確認無任何出血後即可鬆開酒精棉，放入代謝籠中。每一週注射一次，連續注射四次，每次注射之劑量如表2所示。
表2
然後，分別進行《尿液中尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析》、《血清中之尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析》、及《腎臟組織切片分析》
《尿液中尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析》
將手術完成之大鼠置入代謝籠中，歷24小時後收集其尿液；接著，第一個月以一週一次的頻率收集，而後以一個月一次的頻率收集總共四個月份的尿液檢體。然後，將尿液檢體利用全自動生化分析儀(J&J Vitros 350 Chemistry Analyzer, USA)進行尿液中尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析。
《血清中之尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析》
經16週後犧牲大鼠並採集其血液，接著將所抽取到的血液利用離心機以轉速3000rpm進行離心10分鐘，藉以從血液中採集分離出的血清。然後，利用全自動生化分析儀(Spotchem EZ SP-4430 Fully automated dry clinical chemistry analyzer, Japan)進行血清中之尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析。
《腎臟組織切片分析》
解剖犧牲後之大鼠並取其腎臟組織。將腎臟組織從中間對半切開固定於10%中性福馬林，再以組織修片刀進行修整，隨即將固定之組織脫水，再以石臘包埋。將包埋之腎臟組織切成大約4 µm之厚度並製作成切片，進行H&E染色，然後在光學顯微鏡下觀察了解腎臟內部形態的改變及恢復情形。
《尿液中尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析結果》
各組含量分析結果為如圖2至圖6所示。
圖2為顯示比較例5的結果。如圖2所示，於手術後連續四週的尿液中尿素氮(BUN)的含量及肌酸酐(Creatinine) 的含量均呈現與比較例4有極顯著性差異(p ＜ 0.01)，可以確定比較例5已完成大鼠腎臟缺血後灌流之模式。
圖3為顯示比較例6的結果。如圖3所示，手術後連續四週的尿液中尿素氮(BUN) 的含量和肌酸酐(Creatinine) 的含量在第一週均與比較例5有極顯著差異(p ＜ 0.01)，之後三週與比較例5相比也有顯著性差異(p ＜ 0.05)。
圖4為顯示比較例7的結果。如圖4所示，尿液中尿素氮(BUN) 的含量在第二週開始與比較例5相比達到顯著性差異(p ＜ 0.05)，尿液中肌酸酐(Creatinine) 的含量則是第一週與比較例5相比有極顯著差異(p ＜ 0.01)，之後三週達到顯著性差異(p ＜ 0.05)。
圖5為顯示實施例2的結果。如圖5所示，手術後連續四週的尿液中尿素氮(BUN) 的含量和肌酸酐(Creatinine)的含量在第一週均與比較例5之數值有顯著性差異(p ＜ 0.05)。
圖6為顯示以4-16週長時間收集的結果。如圖6所示，不管是尿液中尿素氮(BUN) 的含量或肌酸酐(Creatinine) 的含量，單獨治療的組別(比較例6及比較例7)其數值都有上升的情況，甚至與比較例5相比無顯著性差異，而實施例2在停止治療後的三個月內尿液中尿素氮(BUN)和肌酸酐(Creatinine)的含量與比較例5數值相比均達到極顯著差異(p ＜ 0.01)。
接著，將各組實驗數據結果整理記載於表3。
表3
比較比較例6與比較例5的數據結果，可知：當連續注射4週後，比較例6之尿液中尿素氮(BUN)含量較比較例5之尿液中尿素氮(BUN)含量降低37%，而比較例6之尿液中肌酸酐(Creatinine)含量較比較例5之尿液中肌酸酐(Creatinine)降低28%。
另外，比較比較例7組與比較例5的數據，結果可知：當連續注射4週後，比較例7之尿液中尿素氮(BUN)含量較比較例5之尿液中尿素氮(BUN)含量降低32%，而比較例7之尿液中肌酸酐(Creatinine)含量較比較例5之尿液中肌酸酐(Creatinine)降低43%。
再者，比較實施例2與比較例5的數據，結果可知：當連續注射4週後，實施例2之尿液中尿素氮(BUN)含量較比較例5之尿液中尿素氮(BUN)含量降低64%，而實施例2之尿液中肌酸酐(Creatinine)含量較比較例5之尿液中肌酸酐(Creatinine)降低50%。
從而，以脂肪幹細胞R來治療急性腎臟損傷時，對於抑制尿液中尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)之生成的抑制率分別僅為32%、43%；當以富含血小板纖維蛋白釋放液P來治療急性腎臟損傷時，對於抑制尿液中尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)之生成的抑制率分別僅為37%、28%。因而，不論是單獨以脂肪幹細胞R、或者單獨以富含血小板纖維蛋白釋放液P為治療急性腎臟損傷之材料時，顯然皆無法得到令人滿意的治療效果。
另一方面，當同時使用脂肪幹細胞及富含血小板纖維蛋白釋放液P來治療急性腎臟損傷時，對於抑制尿液中尿素氮(BUN)及肌酸酐之生成的抑制率分別高達64%、50%；顯示出令人滿意的治療效果。
接著，比較當4週治療結束後至16週內比較例6的數據變化，結果可知：當治療結束後，比較例6之尿素氮(BUN) 之含量及肌酸酐(Creatinine) 的含量呈緩慢減少；然後，比較當4週治療結束後至16週內比較例7的數據變化，結果可知：當治療結束後，比較例7之尿液中尿素氮(BUN) 之含量及尿液中肌酸酐(Creatinine) 之含量呈現持平的狀態；又，比較當4週治療結束後至16週內實施例2的數據變化，結果可知：當治療結束後，實施例2之尿液中尿素氮(BUN) 之含量及尿液中肌酸酐(Creatinine) 之含量有持續遞減的趨勢。
從而，可以確認：若僅單獨使用富含血小板纖維蛋白釋放液或脂肪幹細胞進行急性腎臟損傷治療，在治療結束後，無法持續抑制尿液中尿素氮(BUN)及尿液中肌酸酐(Creatinine)之生成或抑制速度緩慢；但另一方面，若以脂肪幹細胞及富含血小板纖維蛋白釋放液共同進行急性腎臟損傷治療，在治療結束後，還能夠持續抑制尿液中尿素氮(BUN)及尿液中肌酸酐(Creatinine)之生成，對腎臟損傷具有較為積極的治療效果。
《血清中之尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析結果》
圖7為顯示血清中之尿素氮(BUN)及肌酸酐(Creatinine)的含量分析之結果。如圖7所示，比較例7及比較例6的血中尿素氮(BUN)之含量均與比較例5有極顯著差異(p ＜0.01)，而實施例2的血清中尿素氮(BUN)的含量與比較例5相比亦達到極顯著性差異(p ＜ 0.01)；此外不管是比較例7、比較例6或實施例2，其血清中肌酸酐(Creatinine)的含量均與比較例5相比達到極顯著性差異(p ＜ 0.01)；顯示，脂肪幹細胞及富含血小板纖維蛋白不論是單獨或合併使用，在治療腎臟損傷均具有極顯著差異。
接著，將各組實驗數據結果整理記載於表4
表4
比較比較例6組與比較例5的數據，結果可知：比較例6之血中尿素氮(BUN)含量較比較例5之血中尿素氮(BUN)含量降低35%，而比較例6之血中肌酸酐(Creatinine)含量較比較例5之血中肌酸酐(Creatinine)降低61%。
比較比較例7與比較例5的數據，結果可知：比較例7之血中尿素氮(BUN)含量較比較例5之血中尿素氮(BUN)含量降低45%，比較例7之血中肌酸酐(Creatinine)含量較比較例5之血中肌酸酐(Creatinine)降低78%。
比較實施例2與比較例5的數據，結果可知：實施例2之血中尿素氮(BUN)含量較比較例5之血中尿素氮(BUN)含量降低60%，而實施例2之血中肌酸酐(Creatinine)含量較比較例5之血中肌酸酐(Creatinine)降低86%；所以，相較於單獨使用富含血小板纖維蛋白釋放液P或脂肪幹細胞R進行急性腎臟損傷治療的組別，使用脂肪幹細胞R及富含血小板纖維蛋白釋放液P共同進行急性腎臟損傷治療的組別能夠更有效抑制血中尿素氮(BUN)及血中肌酸酐(Creatinine)之生成。
從而，以脂肪幹細胞來治療急性腎臟損傷時，對於抑制血液中之尿素氮(BUN)及肌酸酐之生成的抑制率分別僅為35%、61%；當以富含血小板纖維蛋白釋放液來治療急性腎臟損傷時，對於抑制血液中之尿素氮(BUN)及肌酸酐之生成的抑制率分別僅為45%、78%。因而，不論是單獨以脂肪幹細胞、或者單獨以血小板纖維蛋白釋放液為治療急性腎臟損傷之材料時，治療效果有限。
另一方面，當同時使用脂肪幹細胞及血小板纖維蛋白釋放液來治療急性腎臟損傷時，對於抑制血液中之尿素氮(BUN)及肌酸酐之生成的抑制率分別提昇至60%、86%；顯示出令人滿意的治療效果。
《腎臟組織切片分析結果》
於顯微鏡下放大100倍的組織學照片如圖8到圖12所示；圖8為比較例5之組織學照片；圖9為比較例6之組織學照片；圖10為比較例7之組織學照片；圖11為實施例2之組織學照片；圖12為比較例4之組織學照片。
首先，由6位評分者針對比較例5、比較例7、比較例6、實施例2、及比較例4之組織學照片中腎小管、腎小球、刷狀緣邊界、及尿柱(cast)等之腎臟組織之擴張、皺縮、形成等情況進行評價。評價為對於：腎小管擴張比例、腎小球皺縮比例、刷狀緣邊界消失比例、及尿柱形成量等以0分至3分加以評分，評分標準如表5所示，以其平均分數來評價腎臟組織之受損程度。當平均分數為0至0.01分的情況，代表腎臟組織無受損，而在平均分數為0.01至1分的情況，則代表腎臟組織輕微受損；當平均分數為1.01至2分時，則代表腎臟組織中度受損，而在平均分數為2.01至3分的情況，則代表腎臟組織嚴重受損。
表5
在比較例4至比較例7、實施例2中分別對於腎小管擴張比例、腎小球皺縮比例、刷狀緣邊界消失比例、及尿柱形成量進行評價所得之結果為如表6所示。
表6
如圖13所示，實施例2在評分中的平均分數與比較例5平均分數有極顯著差異(p ＜ 0.01)，而比較例7及比較例6則與比較例5平均分數有顯著性差異(p ＜ 0.05)。
比較比較例6與比較例5的平均得分，結果可知：經富含血小板纖維蛋白釋放液P進行治療後，腎臟組織的受損程度由嚴重受損(2.79)降至中度受損(1.62)。
比較比較例7組與比較例5的平均得分，結果可知：經脂肪幹細胞R進行治療後，腎臟組織的受損程度由嚴重受損(2.79)降至中度受損(1.46)。
比較實施例2與比較例5組的平均得分，結果可知：經富含血小板纖維蛋白釋放液P及脂肪幹細胞R共同進行治療後，腎臟組織的受損程度由嚴重受損(2.79)降至輕微受損(0.88)。
從而，可以確認：若個別使用富含血小板纖維蛋白釋放液P或脂肪幹細胞R進行急性腎臟損傷治療，僅能使腎臟組織的受損程度由嚴重受損(2.79)降至中度受損，因而無法得到令人滿意的治療效果；但另一方面當使用脂肪幹細胞R及富含血小板纖維蛋白釋放液P共同進行治療急性腎臟損傷時，能使腎臟組織的受損程度由嚴重受損(2.79)降至輕微受損(0.88)，因而能夠更有效治療急性腎臟損傷。
從上述以大鼠為模型的結果顯示，若個別使用富含血小板纖維蛋白釋放液或脂肪幹細胞進行急性腎臟損傷治療，雖然在前4週的治療期間內，能夠抑制尿素氮和肌酸酐生成，但當治療停止後，尿素氮和肌酸酐檢驗數值呈現持平或緩慢下降的趨勢，腎臟損傷評估方面也未有較好的成績，因而無法得到令人滿意的治療效果；反觀利用本發明之醫藥組合物治療急性腎臟損傷時，顯示本發明對於尿液中尿素氮及肌酸酐的抑制率分別為60%~80%及50%~70%，以及對於血液中尿素氮及肌酸酐的抑制率分別為50%~70%及80%~99%，因而可以確認：本發明之醫藥組合物能夠有效抑制尿素氮和肌酸酐之生成並修復腎臟組織。是以，本發明之醫藥組合物是一種有效治療急性腎臟損傷的藥物。
當可理解上述實施方式與實施例僅為例示，且熟習此技藝者可對其進行各種修飾。上文提出之說明書、實施例與資料的目的在於使本說明書的結構完備，並作為實作本發明之例示。雖然本揭示內容已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本揭示內容，任何熟習此技藝者，在不脫離本揭示內容之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本揭示內容之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
在本文中引用的包括專利申請、公開、公告之各種專利文獻及非專利文獻，皆以全文引用完整方式納入本文列入參考，且不應該以任何方式解釋為用來限制本發明之創作精神與權利範圍。
無
圖1 係顯示本發明有關之比較例1、比較例2、比較例3及實施例1中之脂肪幹細胞數量統計圖。 圖2 係顯示本發明有關之比較例4及比較例5中之連續四週的尿液生化檢測結果比較圖。 圖3係顯示本發明有關之比較例4、比較例5、及比較例6中之連續四週的尿液生化檢測結果比較圖。 圖4係顯示本發明有關之比較例4、比較例5、及比較例7中之連續四週的尿液生化檢測結果比較圖。 圖5係顯示本發明有關之比較例4、比較例5、及實施例2中之連續四週的尿液生化檢測結果比較圖。 圖6係顯示本發明有關之比較例4、比較例5、比較例6、比較例7及實施例2中之連續四個月的尿液生化檢測結果比較圖。 圖7係顯示本發明有關之比較例4、比較例5、比較例6、比較例7及實施例2中之血液生化檢測結果比較圖。 圖8係顯示本發明有關之比較例5之切片圖(放大倍率皆為100x) 。 圖9係顯示本發明有關之比較例6之切片圖(放大倍率皆為100x) 。 圖10係顯示本發明有關之比較例7之切片圖(放大倍率皆為100x) 。 圖11係顯示本發明有關之實施例2之切片圖(放大倍率皆為100x) 。 圖12係顯示本發明有關之比較例4之切片圖(放大倍率皆為100x) 。 圖13 係顯示本發明有關之比較例4、比較例5、比較例6、比較例7及實施例2中之腎臟損傷評分結果比較圖。
Claims (9)
- 一種用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，其包括幹細胞及一富含血小板纖維蛋白(Platelet Rich Fibrin, PRF)釋放液； 該幹細胞並非人類全能幹細胞； 該富含血小板纖維蛋白釋放液係含有從TGF-β1 (Transforming growth factor-bata1)、VEGF (Vascular endothelial growth factor)、PDGF (Platelet-derived growth factor) 、BMP (Bone morphogenetic protein)、PF4 (Platelet factor 4)、IL(Interleukin)、EGF (Epidermal growth factor)、FGF (Fibroblast growth factor) 、NGF(Nerve growth factor)、及IGF(Insulin-like growth factor)中所選出之至少一種生長因子。
- 如請求項1所記載之用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，其中該幹細胞為胚胎幹細胞、成體幹細胞、或誘導型多能幹細胞。
- 如請求項2所記載之用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，其中該成體幹細胞為臍帶血幹細胞、周邊血幹細胞、神經幹細胞、表皮幹細胞、肌肉幹細胞、脂肪幹細胞、骨髓幹細胞、眼角膜幹細胞、肝臟幹細胞、及腸上皮幹細胞所選出中至少一種。
- 如請求項1所記載之用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，其中所述急性腎臟損傷為因任何病因導致腎血流量之減少(腎缺血(Ischemia)、暴露於對腎有害之物質(Nephrotoxicity)、腎發炎之過程，或阻塞尿流量之尿路阻礙。
- 如請求項1所記載之用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，其係個別、依序或同時使用。
- 如請求項1所記載之用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，其中進一步包含該醫藥組合物在藥學上可接受之鹽類或載劑。
- 如請求項6所記載之用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，其中該載劑包含賦形劑、稀釋劑、增稠劑、填充劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、油脂或非油脂的基劑、介面活性劑、懸浮劑、膠凝劑、輔助劑、防腐劑、抗氧化劑、穩定劑、著色劑等。
- 如請求項1所記載之用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，其中該醫藥組合物係以注射方式投予。
- 如請求項1所記載之用於治療急性腎臟損傷之醫藥組合物，其係用於治療人類、或哺乳類動物。
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