TW201812301A - 使用量子點靶向及操作粒線體功能的探針 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於適用於靶向及操作粒線體功能之量子點奈米粒子，及使用此類量子點奈米粒子靶向及操作粒線體功能之方法。

Description

使用量子點靶向及操作粒線體功能的探針
本文揭示之實施例係關於適用於靶向及操作粒線體功能之量子點奈米粒子，及使用此類量子點奈米粒子靶向及操作粒線體功能之方法。
粒線體係具有許多作用之細胞器，該等作用包括能量產生、熱量產生、激素合成、調節代謝及鈣、釋放典型酶細胞色素c氧化酶(COX)、細胞凋亡、產生活性氧物種(ROS)體內平衡及衰老。近年來，已考慮將靶向粒線體用於各種疾病管理方案，包括敗血症、生命末期之急性器官衰竭、癌症、阿茲海默症(Alzheimer)及糖尿病。參見例如Karu等人, Life , 62(8), 607-610, 2010；Singer等人, Virulence , 5(1), 66-72, 2014；Wu等人, Antioxidants & Redox Signaling , 20(5), 733-745, 2014；Pathania等人, Adv. Drug Delivery Rev. , 61, 1250-1275, 2009；及D'Souza等人, Biochimica et Biophysica Acta , 1807, 689-696, 2011。 近期研究表明奈米粒子有特定積聚於亞細胞器主要溶酶體中之趨勢。參見例如Frohlich, International Journal of Nanomedicine, 2012年10月31日 , 5577-5591。亦已發現粒線體使奈米粒子積聚。參見例如D'Souza等人, Biochimica et Biophysica Acta 1807 (2011) 689-696。 研究亦已展示，將酶細胞色素c氧化酶(COX)視為可見及近紅外(NIR)區域中之光受體及光信號轉換器。光照射使COX活性增加，由此產生可改變細胞體內平衡且增加三磷酸腺苷(ATP)、活性氧物種(ROS)、氧化氮(NO)及細胞內鈣(iCa2 + )產生之級聯反應。參見例如Karu等人, Multiple roles of cytochrome c oxidase in mammalian cells under action of red and IR-A radiation,Life , 62(8), 607-610, 2010及Tafur等人, Photomedicine and Laser Surgery, 第26卷, 第4期, 2008 323-28。 已大體關注製備及表徵尺寸在例如2-50 nm範圍內之粒子，通常稱為量子點(QD)或奈米晶體。此等研究主要因此等材料之大小可調之電子特性而出現，該等材料可用於例如光學及電子裝置、太陽電池、催化作用、發光二極體及普通空間照明。已針對QD之源於「量子限制作用」之特有光學、電子及化學特性而對QD進行廣泛研究；當半導體奈米粒子之尺寸減少至低於波爾半徑的兩倍時，能級進行量化，從而產生離散能級。帶隙隨著粒度減小而增加，產生大小可調之光學、電子及化學特性，例如大小依賴性光致發光。 呈明亮且極具吸收性之螢光團形式之此類量子點之出現提供靶向及操作粒線體功能之機會。 需要靶向及操作粒線體功能之新穎方法。
所揭示之實施例包括可用於靶向粒線體功能之量子點奈米粒子。藉由操作此類量子點奈米粒子之光學及/或光伏打特性，可調節某些粒線體功能(諸如COX活性或薄膜電位)以達到偵測及標記目的及/或治療性目的。 在一個態樣中，本發明係關於一種適用於靶向粒線體功能之量子點奈米粒子。 在一個實施例中，使本文所述之量子點奈米粒子與使得粒線體中之代謝活性可調節(例如減緩或終止)之官能配位體共軛。 在一個實施例中，使量子點奈米粒子與諸如2-去氧葡萄糖(2DG)之己糖激酶(HK)抑制劑共軛。酶HK導致糖酵解且與粒線體膜相關。糖酵解係癌細胞中能量之主要來源。量子點奈米粒子因此可具有獨立或呈組合形式之三種功能：i)遞送糖酵解抑制劑，諸如己糖激酶(HK)抑制劑，諸如2-去氧葡萄糖(2DG)；ii)活化COX，及iii)標記。 在一個實施例中，奈米粒子經由直接位於量子點奈米粒子之無機表面上或位於有機電暈層上之醯胺、酯、硫酯或硫醇錨定基團連接(例如共價鍵結或物理鍵結(電荷或凡得瓦爾作用(Van de Waals))至官能配位體，使用該有機電暈層使奈米粒子呈現水溶性及生物相容性。在某些實施例中，水溶性QD奈米粒子包括一些實施例中之一種半導體材料之核心及至少一個不同半導體材料之外殼，而在其他實施例中，水溶性QD奈米粒子包括藉由組成漸變合金化而使帶隙值向外增大之合金化半導體材料。 在某些實施例中，光響應量子點(quantum dot，QD)包括具有配位體相互作用劑及表面改質配位體之水溶性QD奈米粒子。水溶性QD奈米粒子可由將配位體相互作用劑及表面改質配位體化學添加至於包含六甲氧基甲基三聚氰胺之溶液中之QD中而形成。在特定實施例中，配位體相互作用劑係C8 - 20 脂肪酸及其酯，而表面改質配位體係單甲氧基聚環氧乙烷。 在某些實施例中，水溶性奈米粒子包括能夠結合於甲基化特異性結合配位體之封端配位體。在某些實施例中，封端配位體係選自由以下組成之群：硫醇、羧基、胺、膦、氧化膦、膦酸、一元膦酸、咪唑、OH、硫醚及杯芳烴基團。 在另一實施例中，奈米粒子藉由離子成對或凡得瓦爾相互作用結合於官能配位體。在一個實施例中，奈米粒子經由醯胺鍵共價連接至官能配位體。 在一個實施例中，量子點奈米粒子共軛物包含：包含核心半導體材料及外層之量子點，其中該外層包含使粒子呈現水溶性及生物相容性之有機塗層電暈(官能化有機塗層)及使得粒線體中之代謝活性可調節之官能配位體。 在一個實施例中，本文所述之量子點奈米粒子中之任一者經表面改質(例如經物理化學化學塗佈及/或經電荷改質)以增強量子點於粒線體附近或粒線體內之積聚。適合塗層包括例如趨粒線體性配位體，諸如由tebu-bio出售之抗粒線體抗體(目錄號909-301-D79)、由tebu-bio出售之Anti HSP60 (T547) (目錄號BS1179-50ul (50ul)及BS1179-100ul (100ul))、由tebu-bio出售之Anti SOD1 (目錄號MAB10394)、由tebu-bio 出售之Anti Grp75純系S19-2 (目錄號MAB6629)、由tebu-bio出售之抗細胞色素c (H19) (目錄號BS1089-50ul (50ul)及BS1089-100ul (100ul))、三苯基鏻(TPP)及其衍生物。此等粒線體特異性配位體，一旦使用下文論述之共軛化學反應連接至量子點奈米粒子，即確保量子點奈米粒子更特定積聚於粒線體附近或粒線體內。 在本文所述量子點奈米粒子中之任一者的一個實施例中，該奈米粒子包含II-VI材料、III-V材料、I-III-VI材料或其任何合金。 在另一實施例中，本文所述之量子點奈米粒子中之任一者進一步包含細胞吸收增強劑、細胞滲透肽(CPP，如TAT、RGD或聚精胺酸)、組織滲透增強劑(例如皂苷、陽離子型脂質、鏈球菌溶血素O (SLO))或其組合。細胞吸收增強劑之實例包括例如反式活化轉錄活化劑(trans-activating transcriptional activators，TAT)、Arg-Gly-Asp (RGD)三肽或聚精胺酸肽。配位體-奈米粒子共軛物可進一步包含可增強細胞吸收之其他已知藥劑，諸如皂苷、陽離子型脂質體或鏈球菌溶血素O。 在另一態樣中係指示一種製備根據本文所述實施例中之任一者之量子點奈米粒子之方法。在一個實施例中，該方法包含：i)使奈米粒子與官能化配位體偶合以得到官能化奈米粒子共軛物，其中該奈米粒子包含有包含核心半導體材料及外層之量子點，其中該外層包含羧基。 在一個實施例中，偶合步驟i)包含(a)使外層中之羧基與碳化二亞胺連接基團反應以活化該羧基，及b)使該活化之羧基與官能化配位體(例如與該配位體上之胺末端)反應。 在另一實施例中，該方法進一步包含：ii)純化該量子點奈米粒子。在另一實施例中，該方法進一步包含：iii)分離特異性結合奈米粒子共軛物。在一個實施例中，該方法包含步驟i)、ii)及iii)。 在另一態樣中，本發明提供一種操作粒線體功能之方法。在一個實施例中，該方法包含i)使根據本文所述實施例中之任一者之量子點奈米粒子與粒線體締合，及視情況ii)用光源刺激量子點奈米粒子，由此產生光子及/或伏打電流(伏打能量)。在一個實施例中，光子及/或伏打電流調節粒線體功能(諸如COX活性或薄膜電位)之反應性。 在一個實施例中，產生之伏打電流(諸如微電壓)刺激細胞色素C氧化酶(COX)釋放，由此誘導細胞凋亡。在另一實施例中，產生之光子用例如580-860 nm之光對COX之活性進行光調節。 在另一態樣中，本發明提供一種調節COX或其次單元或衍生物之活性(諸如刺激COX釋放)之方法。在一個實施例中，該方法包含i)使根據本文所述實施例中之任一者之量子點奈米粒子與粒線體接觸，及視情況ii)用光源刺激量子點奈米粒子。在一個實施例中，COX經由吸收光伏打能量而活化。在另一實施例中，COX經由吸收光能而活化。 在另一態樣中，本發明提供一種將粒線體膜去極化之方法(例如由此誘導信號級聯，例如細胞凋亡，從而導致細胞死亡)。在一個實施例中，該方法包含i)使根據本文所述實施例中之任一者之量子點奈米粒子與粒線體接觸，及ii)用光源刺激量子點奈米粒子。在一個實施例中，粒線體膜經由光伏打效應去極化。 在另一態樣中，本發明提供一種抑制糖酵解之方法。在一個實施例中，該方法包含i)使連接至己糖激酶(HK)抑制劑之根據本文所述實施例中之任一者之量子點奈米粒子與粒線體接觸，及ii)用光源刺激量子點奈米粒子。在一個實施例中，HK抑制劑係2-去氧葡萄糖(2DG)。
本文揭示能夠與粒線體締合且能夠發射光以活化某些粒線體路徑之量子點(QD)。本文揭示與粒線體特異性結合配位體共軛之QD，該等QD能夠足夠接近粒線體以偵測及操作粒線體功能。 縮寫：本申請案通篇使用以下縮寫： 為有助於理解本發明且為在解釋本文中之申請專利範圍時避免疑問，如下定義多種術語。本文所定義之術語具有如熟悉與本發明相關領域之技術者通常所理解之含義。用以描述本發明之特定實施例的術語並不限定本發明，但如申請專利範圍中所概述除外。 諸如「一(a/an)」及「該(the)」之術語除非明確如此定義，否則不欲指單個實體，而係包括可用於說明之特定實例之一般類別。術語「一(a/an)」在申請專利範圍及/或說明書中結合「包含」使用時使用可意謂「一個/一種(one)」，但亦可與「一或多個」、「至少一個」及/或「一個或多於一個」一致。 在申請專利範圍中使用術語「或」除非明確指示係指互斥替代物，否則用以意謂「及/或」。因此，除非另外說明，否則替代物群組中之術語「或」意謂該群組之成員「中之任一者或組合」。此外，除非明確指示係指互斥替代物，否則短語「A、B及/或C」意謂單獨具有要素A、單獨具有要素B、單獨具有要素C或具有A、B及C之任何組合的實施例。 類似地，為避免疑問且除非另外明確指示係指互斥替代物，否則短語「中之至少一者」在與一系列物品組合時意謂來自該系列之單一物品或該系列中之物品之任何組合。舉例而言，且除非另外定義，否則短語「A、B及C中之至少一者」意謂「來自群組A、B、C中之至少一者或A、B及C之任何組合」。因此，除非另外定義，否則該短語需要所列舉物品中之一或多者，且有可能係全部。 術語「包含(comprising)」(及其任何形式，諸如「包含(comprise)」及「包含(comprises)」)、「具有(having)」(及其任何形式，諸如「具有(have)」及「具有(has)」)、「包括(including)」(及其任何形式，諸如「包括(includes)」及「包括(include)」)或「含有(containing)」(及其任何形式，諸如「含有(contains)」及「含有(contain)」)係包含性的或開放的且不排除額外、未列出之要素或方法步驟。 如在本說明書及申請專利範圍中所使用，術語「有效」意謂足以提供或實現所需的、期待的或預期的結果。 術語「約」或「大致」定義為與一般熟習此項技術者所理解的接近，且在一個非限制性實施例中，該等術語定義為在10%內、在5%內、在1%內，且在某些態樣中在0.5%內。 在某些實施例中，粒線體特異性結合配位體係識別粒線體特異性結合位點之抗體。如本文所用，術語「抗體」包括完整免疫球蛋白分子以及其部分、片段及衍生物，諸如Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv、Fsc、CDR區，或抗體之能夠結合抗原或抗原決定基之任何部分，包括具有雙特異性或組合由抗體起始之抗原結合域與另一類型多肽之嵌合抗體。術語抗體包括藉由包括(但不限於)酶促裂解及重組技術之任何已知技術提供之單株抗體(mAb)、嵌合抗體、人類化抗體以及其片段、部分、區或衍生物。如本文所用，術語「抗體」亦包括具有重鏈抗體之單一單體可變抗體域(VH )之單域抗體(sdAb)及其片段。缺乏可變輕鏈(VL )及恆定輕鏈(CL )域之sdAb天然發現於駱駝(VH H)及軟骨魚(VNAR )中且最初在駱馬中研發特異性抗原結合sdAb之醫藥公司Ablynx有時由稱其為「奈米抗體」。修飾語「單株」指示抗體之特徵係自實質上同種之抗體群體獲得，且不應視為需要藉由任何特定方法產生該抗體。 在其他實施例中，粒線體特異性結合配位體係識別甲基化DNA鹼基之適體。適體係結構獨特的RNA或DNA寡核苷酸(ODN)，其可模擬蛋白質結合分子且根據其特有二級三維結構構形而非藉由逐對核酸結合來展現高(nM)結合親和力。可經由活體外高通量方法選擇適體以結合標靶分子。適體通常係抗體分子量之大致1/10且又提供具有足以與抗體競爭之識別表面區域之複雜三級摺疊結構。 QD係具有特有光學特性之螢光半導體奈米粒子。QD表示尤其小尺寸形式之半導體材料，其中粒子之尺寸及形狀在光激發時產生量子機械效應。一般而言，諸如半徑5至6 nm之較大QD將發射發橙色或紅色之較長波長，且半徑2至3 nm之較小QD發射藍色及綠色之較短波長，但特定色彩及尺寸視QD之組成而定。與習知螢光染料中之任一者(如吲哚菁綠(indocyanine green，ICG))相比，量子點發出的光亮大約20倍且光穩定性高達許多倍。重要的是，QD滯留時間因其化學性質及奈米尺寸而更長。QD可吸收且發射更強的光強度。在某些實施例中，QD可具有多於一個結合標籤，從而形成二特異性或三特異性奈米裝置。QD之特有特性能夠實現若干醫學應用，該等應用可滿足未滿足的需要。 在本文中呈現之實施例中，將QD官能化以存在親水性外層或電暈，其允許將QD用於水性環境中，諸如活細胞中之活體內及活體外應用。將此類QD稱為水溶性QD。 在一個實施例中，QD可為具有可共軛官能基(COOH、OH、NH2 、SH、疊氮基、炔烴)之表面。在一個例示實施例中，水溶性無毒QD經或變得經羧基官能化。舉例而言，COOH-QD可使用碳化二亞胺連接技術利用水溶性1-乙基-3-(-3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)連接至靶向抗體之胺末端。將羧基官能化之QD與EDC混合以形成活性O-醯基異脲中間物，其接著藉由親核攻擊而自反應混合物中單株抗體上之第一胺基置換。必要時，在與帶有一級胺之抗體反應期間添加N-羥基丁二醯亞胺之磺基衍生物(sulfo-NHS)。在sulfo-NHS添加下，EDC使NHS與羧基偶合，形成比O-醯基異脲中間物更穩定之NHS酯，同時允許在生理學pH值下與一級胺有效共軛。無論如何，結果係QD與抗體之間共價鍵結。或者可使用如鈴木-宮浦交叉偶合(Suzuki-Miyaura cross-coupling) (4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸丁二醯亞胺酯) (SMCC)或基於醛之反應的其他化學反應。 合成核心及核心-外殼奈米粒子之方法揭示於例如共同擁有之美國專利第7,867,556號、第7,867,557號、第7,803,423號、第7,588,828號及第6,379,635號中。前述專利各者之內容以全文引用的方式併入本文中。美國專利第9,115,097號、第8,062,703號、第7,985,446號、第7,803,423號及第7,588,828號及美國公開案第2010/0283005號、第2014/0264196號、第2014/0277297號及第2014/0370690號，其各者之整個內容以引用的方式併入本文中，描述產生大量高品質單分散量子點之方法。 在一個實施例中，利用至少一種半導體組合物之中心區或「核心」埋入一或多個明顯不同半導體組合物之外層或「外殼」中或經其塗佈之核心/外殼粒子。舉例而言，核心可包含In、P、Zn及S之合金，諸如藉由實例1之描述形成：該描述涉及使基於In之奈米粒子之分子接種於ZnS分子團簇之上，之後形成ZnS外殼。 在其他實施例中，所用水溶性QD奈米粒子包含藉由漸變合金化替代產生核心/外殼QD而使帶隙值或能量(E g )向外增大之合金化半導體材料。帶隙能量(E g )係將電子自基態價能帶激發至空導能帶所要之最小能量。 漸變合金QD組合物視為由粒子中心或接近粒子中心至QD之最外層表面係元素組成「漸變的」，而非形成為上覆個別外殼層之個別核心。實例將係In1 - x P1 - y Znx Sy 漸變合金QD，其中由QD之中心至表面x及y由0逐漸增加至1。在此類實例中，QD之帶隙將由接近中心之純InP向表面之純ZnS之較大帶隙值逐漸變化。儘管帶隙視粒度而定，但ZnS之帶隙寬於InP，以使得漸變合金之帶隙將由QD之內部態樣至表面逐漸增加。 可採用一鍋合成方法作為本文實例1中所述之分子接種方法之修改。此情況可如下來實現：逐漸降低添加至反應溶液中以維持粒子生長之豆蔻酸銦及(TMS)3 P之量，同時在諸如產生實例1之「核心」粒子所述之方法期間添加遞增量之鋅及硫前驅體。因此，在一個實例中，將二丁基酯及飽和脂肪酸置放於反應燒瓶中且在加熱下脫氣。引入氮氣且增加溫度。在攪拌下添加分子團簇，諸如ZnS分子團簇[Et3 NH]4 [Zn10 S4 (SPh)l6 ]。在根據涉及添加逐漸遞減濃度之第一半導體材料及逐漸遞增濃度之第二半導體材料的漸升式方案添加漸變合金前驅體溶液時，溫度增加。舉例而言，漸升式方案可以添加溶解於二甲酸酯(諸如癸二酸二正丁酯)中之豆蔻酸銦(In(MA)3 )及三甲基矽烷基膦(TMS)3 P開始，其中所添加之In(MA)3 及(TMS)3 P之量隨時間推移逐漸減小，置換為逐漸遞增濃度之硫及鋅化合物，諸如(TMS)2 S及乙酸鋅。因為In(MA)3 及(TMS)3 P之添加量減小，所以將逐漸遞增量之溶解於飽和脂肪酸(諸如肉豆蔻酸或油酸)及二甲酸酯(諸如癸二酸二正丁酯)中之(TMS)2 S與乙酸鋅一起添加。以下反應將使得遞增產生ZnS化合物。隨著添加繼續，形成所需尺寸之最大發射波長逐漸遞增之QD粒子，其中InP及ZnS之濃度漸變，接近QD粒子中心係InP之最高濃度，且QD粒子外部上係ZnS之最高濃度。當獲得所需最大發射時，向反應物中之其他添加終止，且使所得漸變合金粒子退火，之後藉由沈澱及洗滌分離粒子。 奈米粒子與介質之相容性以及奈米粒子對結塊、光氧化及/或淬滅之敏感性主要藉由奈米粒子之表面組成介導。對於任何核心、核心-外殼或核心-多外殼奈米粒子中最終無機表面原子之配位可為不完全的，表面上具有高度反應性「懸鍵」，其可導致粒子結塊。此問題藉由用保護有機基團鈍化(封端)「裸」表面原子來克服，在本文中該等基團稱為封端配位體或封端劑。粒子之封端或鈍化會阻止粒子結塊出現，且亦保護粒子不受其化學環境影響，且在核心材料之情況下為粒子提供電子穩定性(鈍化)。封端配位體可為(但不限於)結合於粒子之最外部無機層之表面金屬原子的路易斯鹼。封端配位體之性質主要確定奈米粒子與特定介質之相容性。封端配位體可視所需特徵而定進行選擇。可採用之封端配位體之類型包括硫醇基、羧基、胺、膦、氧化膦、膦酸、一元膦酸、咪唑、OH、硫代乙醚及杯芳烴基團。除杯芳烴之外，所有此等封端配位體均具有頭基，該等頭基可在粒子之表面上形成封端配位體之錨定中心。封端配位體主體可為直鏈、環狀或芳族的。封端配位體本身可為大的、小的、寡聚的或多牙的。配位體主體之性質及不結合於粒子上之凸起側面一起判定配位體是否係親水性、疏水性、兩親媒性、陰性、陽性或兩性離子的。 在許多量子點材料中，封端配位體係疏水性的(例如烷基硫醇、脂肪酸、烷基膦、烷基膦氧化物及其類似物)。因此，在奈米粒子合成及分離之後，奈米粒子通常分散於諸如甲苯之疏水性溶劑中。此類封端奈米粒子通常不分散於更具極性之介質中。若需要對QD表面改質，則使用最廣泛之程序稱為配位體交換。在核心合成及/或去殼程序期間與奈米粒子表面配位之親脂性配位體分子隨後可與極性/帶電配位體化合物交換。替代性表面改質策略使極性/帶電分子或聚合物分子嵌入已與奈米粒子表面配位之配位體分子。然而，某些配位體交換及嵌入程序使奈米粒子與水性介質更具相容性，其可產生與相應未改質奈米粒子相比量子產率(QY)更低及/或尺寸大體上更大之材料。 出於活體內及活體外目的，若不作要求，則需要具有低毒性特徵之QD。因此，出於一些目的，量子點奈米粒子較佳大體上不含諸如鎘、鉛及砷之毒性重金屬(例如含有小於5 wt%，諸如小於4 wt%、小於3 wt%、小於2 wt%、小於1 wt%、小於0.5 wt%、小於0.1 wt%、小於0.05 wt%或小於0.01 wt%之諸如鎘、鉛及砷之重金屬)或不含諸如鎘、鉛及砷之重金屬。在一個實施例中，提供缺乏諸如鎘、鉛及砷之重金屬的降低毒性之QD。 QD之特有特性能夠實現若干可能的醫學應用，包括活細胞中未滿足之活體外及活體內診斷。關於QD之醫學應用之主要關注點中之一者在於，大多數研究集中於含有諸如鎘、鉛或砷之毒性重金屬之QD。本文所述之生物相容且水溶性無重金屬QD可在活體外與活體內安全地用於醫學應用。在某些實施例中，提供流體動力學大小10-20 nm (在全IgG2抗體之尺寸大小之範圍內)之活體內相容之水分散性無鎘QD。在一個實施例中，活體內相容之水分散性無鎘QD根據本文中實例1及2中所陳述之程序產生。在某些實施例中，活體內相容之水分散性無鎘QD經羧基官能化且用配位體結合部分進一步衍生化。 無鎘、鉛及砷奈米粒子之實例包括包含例如ZnS、ZnSe、ZnTe、InP、InSb、AlP、AlS、AlSb、GaN、GaP、GaSb、PbS、PbSe、AgInS2 、CuInS2 、Si、Ge及其合金及經摻雜衍生物之半導體材料之奈米粒子，尤其包含此等材料中之一者之核心及一或多個此等材料中之另一者之外殼的奈米粒子。 在某些實施例中，無毒QD奈米粒子經表面改質以使其能夠具有水溶性且具有表面部分，該等表面部分藉由使其暴露於配位體相互作用劑而使其衍生化，以實現配位體相互作用劑與QD表面之締合。配位體相互作用劑可包含如下所述鏈部分及對連接/交聯劑具有特定親和力或與其具有反應性之官能基。鏈部分可為例如烷烴鏈。官能基之實例包括親核體，諸如硫基、羥基、甲醯胺基、酯基及羧基。配位體相互作用劑亦可包含或亦可不包含對QD之表面具有親和力之部分。此類部分之實例包括硫醇、胺、羧酸基及膦。若配位體相互作用基團不包含此類部分，則配位體相互作用基團可藉由嵌入封端配位體而與奈米粒子之表面締合。配位體相互作用劑之實例包括C8 - 20 脂肪酸及其酯，諸如十四烷酸異丙酯。 應注意，配位體相互作用劑可藉由用於合成奈米粒子之過程而與QD奈米粒子簡單締合，從而避免需要使奈米粒子暴露於額外量之配位體相互作用劑。在此情況下，可能不需要使其他配位體相互作用劑與奈米粒子締合。或者或另外，可在QD奈米粒子合成且分離之後使該奈米粒子暴露於配位體相互作用劑。舉例而言，奈米粒子可於含有配位體相互作用劑之溶液中培育一段時間。此類培育或培育期之一部分可處於高溫下，以有助於使配位體相互作用劑與奈米粒子之表面締合。在配位體相互作用劑與奈米粒子之表面締合之後，使QD奈米粒子暴露於連接/交聯劑及表面改質配位體。連接/交聯劑包括對配位體相互作用劑之基團及表面改質配位體具有特定親和力之官能基。可使配位體相互作用劑-奈米粒子締合複合物相繼暴露於連接/交聯劑及表面改質配位體。舉例而言，可使奈米粒子暴露於連接/交聯劑一段時間以實現交聯，且隨後暴露於表面改質配位體以將其併入至奈米粒子之配位體外殼中。或者，可使奈米粒子暴露於連接/交聯劑及表面改質配位體之混合物，因此在單一步驟中實行交聯及併入表面改質配位體。 在一個實施例中，在分子團簇化合物存在下，在維持該分子團簇之完整性且充當充分定義之預製晶種或模板之條件下，提供量子點前驅體，得到與化學物質前驅體反應以按足夠大之工業應用規模產生高品質奈米粒子之成核中心。 然而，所揭示之方法不限於分子團簇方法。製備量子點之額外方法包括例如雙注射方法、水基方法、熱注射方法及接種方法。 適用於本發明之適合類型之量子點奈米粒子包括(但不限於)包含以下類型(包括其任何組合或合金)之核心材料： 併入有來自週期表之2族之第一元素及來自週期表之16族之第二元素的IIA-VIB (2-16)材料，以及包括三級及四級材料及摻雜材料。適合奈米粒子材料包括(但不限於)：MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe及BaTe。 併入有來自週期表之12族之第一元素及來自週期表之15族之第二元素的II-V材料，且亦包括三級及四級材料及經摻雜材料。適合奈米粒子材料包括(但不限於)：Zn3 P2 、Zn3 As2 、Cd3 P2 、Cd3 As2 、Cd3 N2 及Zn3 N2 。 併入有來自週期表之12族之第一元素及來自週期表之16族之第二元素的II-VI材料，且亦包括三元及四元材料及經摻雜材料。適合奈米粒子材料包括(但不限於)：CdSe、CdTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、ZnO、HgS、HgSe、HgTe、CdSeS、CdSeTe、CdSTe、ZnSeS、ZnSeTe、ZnSTe、HgSeS、HgSeTe、HgSTe、CdZnS、CdZnSe、CdZnTe、CdHgS、CdHgSe、CdHgTe、HgZnS、HgZnSe、HgZnTe、CdZnSeS、CdZnSeTe、CdHgSeS、CdHgSeTe、CdHgSTe、HgZnSeS及HgZnSeTe。 併入有來自週期表之13族之第一元素及來自週期表之15族之第二元素的III-V材料，且亦包括三元及四元材料及經摻雜材料。適合奈米粒子材料包括(但不限於)：BP、AlP、AlAs、AlSb; GaN、GaP、GaAs、GaSb; InN、InP、InAs、InSb、AIN及BN。 併入有來自週期表之13族之第一元素及來自週期表之14族之第二元素的III-V材料，且亦包括三元及四元材料及經摻雜材料。適合奈米粒子材料包括(但不限於)：B4 C、Al4 C3 、Ga4 C、Si及SiC。 併入有來自週期表之13族之第一元素及來自週期表之16族之第二元素的III-VI材料，且亦包括三元及四元材料。適合奈米粒子材料包括(但不限於)：Al2 S3 、Al2 Se3 、Al2 Te3 、Ga2 S3 、Ga2 Se3 、GeTe；In2 S3 、In2 Se3 、Ga2 Te3 、In2 Te3 及InTe。 併入有來自週期表之14族之第一元素及來自週期表之16族之第二元素的IV-VI材料，且亦包括三元及四元材料及經摻雜材料。適合奈米粒子材料包括(但不限於)：PbS、PbSe、PbTe、Sb2 Te3 、SnS、SnSe及SnTe。 併入併入有來自週期表之過渡金屬中之任何族之第一元素及來自週期表之第16族之第二元素之奈米粒子材料，且亦包括三元及四元材料及經摻雜材料。適合奈米粒子材料包括(但不限於)：NiS、CrS、AgS及I-III-VI材料，例如CuInS2 、CuInSe2 、CuGaS2 及AgInS2 。 在一較佳實施例中，奈米粒子材料包含II-IV材料、III-V材料、I-III-VI材料及其任何合金或經摻雜衍生物。 就說明書及申請專利範圍而言，術語經摻雜奈米粒子係指以上奈米粒子及包含一或多種主族或稀土元素之摻雜劑，此元素最常係過渡金屬或稀土元素，諸如(但不限於)具有錳之硫化鋅，諸如摻雜有Mn+ 之ZnS奈米粒子。 在一個實施例中，量子點奈米粒子大體上不含諸如鎘之重金屬(例如含有小於5 wt%，諸如小於4 wt%、小於3 wt%、小於2 wt%、小於1 wt%、小於0.5 wt%、小於0.1 wt%、小於0.05 wt%或小於0.01 wt%之諸如鎘、鉛及砷之重金屬)或不含諸如鎘之重金屬。 對於活體內應用，無重金屬半導體奈米粒子，諸如基於In之量子點，例如InP量子點及其合金及經摻雜衍生物較佳。 在一實施例中，本文所述之量子點奈米粒子中之任一者包括提供於奈米粒子核心上之包括第一半導體材料之第一層。可於第一層上提供包括第二半導體材料之第二層。合成 可使用以下合成步驟進行共軛。可使用連接基團以在奈米粒子上之羧基官能基與甲基化特異性結合配位體上之胺末端基團之間形成醯胺基。可使用已知連接基團，諸如直接位於量子點奈米粒子之無機表面上之硫醇錨定基團。可採用標準偶合條件且將為一般熟習此項技術者所已知。舉例而言，適合的偶合劑包括(但不限於)碳二醯亞胺，諸如二環己基碳化二亞胺(DCC)、二異丙基碳化二亞胺(DIC)及1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)。在一個實施例中，偶合劑係EDC。 在一實例中，帶有羧基端基及官能化配位體之量子點奈米粒子可於溶劑中混合。可將諸如EDC之偶合劑添加至混合物中。可將反應混合物培育。粗官能化配位體奈米粒子共軛物可經受純化及/或分離。 可使用標準固體狀態純化方法。可能需要若干個過濾及用適合溶劑洗滌之週期以移除過量未反應之官能化配位體及/或EDC。 為了揭示內容之完整性且為說明製造本發明之組合物及複合物之方法，以及為呈現組合物之某些特徵，包括以下實例。此等實例意欲不以任何方式限制本發明之範疇或教示。 實例1 合成無毒量子點 使用分子接種方法產生無毒量子點(QD)。簡言之，如下進行500至700 nm範圍內發射之非官能化基於銦之量子點之製備：將二丁酯(大致100 ml)及肉豆蔻酸(MA)(10.06 g)置放於三頸燒瓶中且在約70℃下在真空下脫氣1小時。此時段之後，引入氮氣且使溫度升高至約90℃。添加大致4.7 g ZnS分子團簇[Et3 NH]4 [Zn10 S4 (SPh)l6 ]，且攪拌混合物大致45分鐘。接著使溫度升高約100℃，之後逐滴添加In(MA)3 (1M，15 ml)，之後添加三甲基矽烷基膦(TMS)3 P (1M，15 ml)。在溫度升高至約140℃的同時，攪拌反應混合物。在140℃下，再逐滴添加溶解於癸二酸二正丁酯中之豆蔻酸銦(In(MA)3 ) (1M，35 ml) (攪拌5 min)及溶解於癸二酸二正丁酯中之(TMS)3 P (1M，35 ml)。接著溫度緩慢升高至180℃，且再依序逐滴添加In(MA)3 (1M，55 ml)、(TMS)3 P (1M，40 ml)。藉由以此方式添加前驅體，形成最大發射由500 nm逐漸遞增至720 nm之基於銦之粒子。當獲得所需最大發射時終止反應，且在該反應溫度下攪拌半小時。此時段之後，使混合物退火長達大致4天(在低於反應溫度約20-40℃之溫度下)。在此階段亦使用UV燈以幫助退火。 經由套管技術藉由添加無水經脫氣甲醇(大致200 ml)來分離粒子。使沈澱物沈降且接著經由套管藉助於過濾棒移除甲醇。添加無水經脫氣三氯甲烷(大致10 ml)以洗滌該固體。使固體在真空下乾燥1天。此程序使得於ZnS分子團簇上形成基於銦之奈米粒子。在其他處理中，所得基於銦之奈米粒子之量子產率藉由用稀氫氟酸(HF)洗滌而進一步提高。基於銦之核心材料之量子效率在大致25%至50%之範圍內。此組合物視為包含In、P、Zn及S之合金結構。 ZnS外殼之生長：使一部分20 ml之經HF蝕刻之基於銦之核心粒子在三頸燒瓶中乾燥。添加1.3 g肉豆蔻酸及20 ml癸二酸二正丁酯且脫氣30分鐘。將溶液加熱至200℃，且逐滴添加2 ml 1 M (TMS)2 S(以7.93 ml/h之速率)。在此添加完成之後，使溶液靜置2分鐘，且接著添加1.2 g無水乙酸鋅。使溶液保持於200℃下1小時，且接著冷卻至室溫。藉由添加40 ml無水經脫氣甲醇且離心來分離所得粒子。丟棄上清液，且將30 ml無水脫氣己烷添加至剩餘固體中。使溶液沈降5小時且接著再次離心。收集上清液且丟棄剩餘固體。最終非官能化基於銦之奈米粒子材料在有機溶劑中之量子效率在大致60%-90%之範圍內。 實例2 水溶性表面改質QD 本發明提供產生及使用作為藥物遞送媒劑之經三聚氰胺，六甲氧基甲基三聚氰胺(HMMM)修飾之螢光奈米粒子之方法的一個實施例。特有的基於三聚氰胺之塗層存在極佳生物相容性、低毒性及極低非特異性結合。此等特有特徵允許活體外與活體內之各種生物醫學應用。 如下提供製備適合水溶性奈米粒子之一個實例：使200 mg具有如實例1中所述之作為核心材料之包含銦及磷之合金及含Zn外殼之具有608 nm之紅色發射之無鎘量子點奈米粒子分散於甲苯(1 ml)及十四烷酸異丙酯(100微升)中。包括十四烷酸異丙酯作為配位體相互作用劑。在50℃下加熱混合物約1-2分鐘，接著在室溫下緩慢振盪15小時。將六甲氧基甲基三聚氰胺(HMMM) (CYMEL 303，獲自Cytec Industries, Inc.，West Paterson, NJ) (400 mg)、單甲氧基聚環氧乙烷(CH3 O-PEG2000 -OH) (400 mg)及柳酸(50 mg)之甲苯溶液(4 ml)添加至奈米粒子分散液中。官能化反應中所包括之柳酸起三種作用，如催化劑、交聯劑及COOH之來源。部分地由於HMMM對於OH基團較佳，故在交聯之後許多由柳酸提供之COOH基團仍可用於QD。 HMMM係具有以下結構之基於三聚氰胺之連接/交聯劑：HMMM可以酸催化之反應進行反應以交聯各種官能基，諸如醯胺、羧基、羥基及硫醇基。 在用磁性攪拌棒在300 rpm下攪拌的同時，將混合物脫氣且在130℃下回流第一個小時，之後在140℃下回流3小時。在第一個小時期間，使氮氣流流經燒瓶，以確保移除由HMMM與親核試劑之反應產生的揮發性副產物。使混合物冷卻至室溫且儲存於惰性氣體下。與未改質奈米粒子相比，表面改質之奈米粒子展示螢光量子產率有少量損失或無損失，且發射峰值或最大半高全寬(FWHM)值無變化。真空乾燥表面改質之奈米粒子之等分試樣且將去離子水添加至殘餘物中。表面改質奈米粒子充分分散於水性介質中且永久保持分散。相反，未改質奈米粒子可不懸浮於水性介質中。根據以上程序之表面改質奈米粒子之螢光量子產率係40-50%。在典型批次中，獲得47% ± 5%之量子產率。 在另一實施例中，使具有608 nm之紅色發射之無鎘量子點奈米粒子(200 mg)分散於甲苯(1 ml)及膽固醇(71.5 mg)中。在50℃下加熱混合物約1-2分鐘，接著在室溫下緩慢振盪15小時。將HMMM (CYMEL 303) (400 mg)、單甲氧基聚環氧乙烷(CH3 O-PEG2000 -OH) (400 mg)、愈創甘油醚(100 mg)、二氯甲烷(DCM)(2 mL)及柳酸(50 mg)之甲苯溶液(4 ml)添加至奈米粒子分散液中。 如本文所用，化合物「愈創甘油醚」具有以下化學結構：如本文所用，化合物「柳酸」具有以下化學結構：在用磁性攪拌棒在300 rpm下攪拌的同時，將混合物脫氣且在140℃下回流4小時。如同先前程序一樣，在第一個小時期間，氮氣流流經燒瓶，以確保移除由HMMM與親核試劑之反應產生的揮發性副產物。使混合物冷卻至室溫且儲存於惰性氣體下。真空乾燥表面改質之奈米粒子之等分試樣且將去離子水添加至殘餘物中。使用100 mM KOH溶液將溶液之pH值調節至6.5，且過量非反應材料藉由三個使用Amicon過濾器(30kD)之超濾週期來移除。使最終水溶液保持冷凍直至使用。 值得注意的是，改質奈米粒子以增加其水溶性之傳統方法(例如與巰基官能化水溶性配位體之配位體交換)在溫和條件下對於使奈米粒子呈現水溶性無效。在諸如加熱及超聲處理之較嚴苛之條件下，具有水溶性之部分具有極低量子產率(QY ＜ 20%)。相比之下，本發明之方法提供具有高量子產率之水溶性奈米粒子。如本文所定義，高量子產率等於或大於40%。在某些實施例中，獲得等於或大於45%之高量子產率。如此實例中所製備之表面改質之奈米粒子亦充分分散且永久保持分散於包括乙醇、丙醇、丙酮、甲基乙基酮、丁醇、甲基丙烯酸三丙基甲酯或甲基丙烯酸甲酯之其他極性溶劑中。 實例3 包括靶向配位體之水溶性QD 在某些實施例中，水溶性QD經改質以包括添加至QD中之靶向配位體。因此，在一個實施例中，合成無毒且具有水溶性(生物相容性)且表面具有可共軛官能基(COOH、OH、NH2 、SH、疊氮基、炔烴)之量子點奈米粒子。藉助於可添加至QD中之官能基，諸如本文中實例2中提供COOH官能基，QD可經改質以包括使QD選擇性識別樣品、細胞及組織中之粒線體的靶向配位體。經靶向配位體改質之QD經照射且發光以用於偵測。 在一個例示實施例中，水溶性無毒QD經或變得經羧基官能化。使用化學方法，諸如採用水溶性1-乙基-3-(-3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)之碳化二亞胺連接技術，使COOH-QD連接至諸如特異性抗體之粒線體靶向部分之胺末端。將羧基官能化之QD與EDC混合以形成活性O-醯基異脲中間物，其接著藉由親核攻擊而自反應混合物中單株抗體上之第一胺基置換。必要時，在與帶有一級胺之抗體反應期間添加N-羥基丁二醯亞胺之磺基衍生物(sulfo-NHS)。在sulfo-NHS添加下，EDC使NHS與羧基偶合，形成比O-醯基異脲中間物更穩定之NHS酯，同時允許在生理學pH值下與一級胺有效共軛。無論如何，結果係QD與抗體之間共價鍵結。或者可使用如鈴木-宮浦交叉偶合(4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸丁二醯亞胺酯) (SMCC)或基於醛之反應的其他化學反應。 在一個實施例中，無毒水溶性量子點以化學方式連接至針對粒線體結合之抗體。適合甲基化特異性結合配位體包括(但不限於)由tebu-bio出售之抗粒線體抗體(目錄號909-301-D79)、由tebu-bio出售之Anti HSP60 (T547) (目錄號BS1179-50ul (50ul)及BS1179-100ul (100ul))、由tebu-bio出售之Anti SOD1 (目錄號MAB10394)、由tebu-bio出售之Anti Grp75純系S19-2 (目錄號MAB6629)、由tebu-bio出售之抗細胞色素c (H19) (目錄號BS1089-50ul (50ul)及BS1089-100ul (100ul))、三苯基鏻(TPP)及其任何組合。 活體內相容之水分散性無鎘QD與粒線體特異性結合配位體之共價共軛：在Eppendorf管中，使1 mg羧基官能化水溶性量子點與100 µl MES活化緩衝劑(亦即使25 μl 40mg/ml儲備液達至100 μl MES)混合將MES緩衝劑製備為(2-(N-嗎啉基))乙烷磺酸半鈉鹽(MES))，Sigma Aldrich)於去離子(DI)水之25 mM溶液，pH 4.5中。向此混合物中，添加33 µl新鮮EDC溶液(於去離子水中之30 mg/ml儲備液，1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)，Fisher Scientific)且將溶液混合。添加4 μl新鮮sulfo-NHS (於去離子水中之100 mg/ml儲備液，ThermoFisher Scientific)且混合。NanoSep 300K過濾器(PALL NanoSep 300K Omega超濾器)用100 μl MES預先潤濕。將MES/EDC/Sulfo-NHS/QD溶液添加至NanoSep 300K過濾器中且注滿足夠MES。過濾器在5000 rpm/15 min下離心。使該等點再分散於50 µl活化緩衝劑中且轉移至含有10 μl粒線體特異性配位體之Eppendorf管中。將溶液充分混合且在室溫下培育隔夜(大約16-18小時)。用16 μl 6-胺基己酸(6AC) (19.7 mg/100 mM)淬滅溶液。應注意，淬滅或者可由具有一級胺之其他化合物進行，但選擇6AC用於此實施例，因為其具有COOH且可維持產物之膠體穩定性。將溶液轉移至預先濕潤之Nanosep 300K過濾器(100 μl，1×PBS)中且用1×PBS加滿至500 μl線。藉由三個使用Nanosep 300K過濾器及1×PBS緩衝劑之超濾週期來移除過量SAV。在5000 rpm下執行各離心週期20分鐘，在各週期之後用約400 μl 1×PBS再分散。使最終濃縮物再分散於100 µl PBS中。 實例4 活體外應用 因為COX酶之光吸收峰在620、680、760及820 nm，所以可調整量子點發射以匹配COX吸收峰中之一者。在此實例中，使用620 nm發射量子點奈米粒子。將培養之癌細胞與一系列濃度(1-20 μg/mL)之水溶性620 nm發射量子點奈米粒子一起培育。預定時間之後，獲得螢光顯微術影像以偵測量子點之內化。如圖1中可見，將量子點奈米粒子內化至細胞質結構中。接著照射QD，且使用來自內化QD之後續發射刺激COX且調節COX活性或自培養之癌細胞培養物中之粒線體釋放。 研究已展示，將酶細胞色素c氧化酶(COX)視為可見及近紅外(NIR)區域中之光受體及光信號轉換器。藉由內化QD產生之光照射使COX活性增加，由此產生可改變細胞體內平衡且增加三磷酸腺苷(ATP)、活性氧物種(ROS)、氧化氮(NO)及細胞內鈣(iCa2 + )產生之級聯反應。發光內化QD之活體外應用使得較佳理解COX在細胞功能及疾病中之作用。 實例5 活體內應用-體內平衡 視治療目的及投與方法而定，可使用量子點奈米粒子作為直接注射至哺乳動物中之關注區域(例如靶向區域或器官)中的簡單裸量子點。咸信足以增加COX活性之藉由內化QD產生之光照射藉由調節體內平衡(例如增加三磷酸腺苷(ATP)、活性氧物種(ROS)、氧化氮(NO)及/或細胞內鈣(iCa2 + ))導致低強度光療法。參見Tafur等人,Low-Intensity Light Therapy: Exploring the Role of Redox Mechanisms ,Photomed Laser Surg. 2008年8月; 26(4): 323-328。使用藉由內化QD產生之光照射靶向哺乳動物中之關注區域，而不使其他區域經歷光照射。使用藉由QD產生之內部光照射調節發炎修復、創傷癒合及軟組織修復之方法。 QD亦可藉由皮下、肌肉內、皮內或靜脈內途徑投與。使QD具有組織特異性標籤(根據如上文所述之實例3)以確保在哺乳動物中特異性遞送，該等QD靶向關注區域(例如哺乳動物中之特定器官)。 實例6 活體內應用-細胞凋亡 視治療目的及投與方法而定，可使用量子點奈米粒子作為直接注射至哺乳動物中之關注區域(例如靶向區域或器官)中的簡單裸量子點。藉由內化QD產生之光照射使COX活性增加；咸信COX之過度表現藉由達至存在有粒線體之細胞之細胞質而觸發細胞凋亡路徑。參見Boehning D等人, Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate receptors, amplifying calcium-dependent apoptosis.Nature Cell Biology . 5 (12): 1051-61 (2003年12月)。使用藉由內化QD產生之光照射靶向哺乳動物中之關注區域，而不使其他區域經歷光照射。使用藉由QD產生之內部光照射起始不合需要之細胞，諸如腫瘤細胞中之細胞死亡(細胞凋亡)。光照射使粒線體膜去極化，從而致使COX釋放至存在有粒線體之細胞之細胞質中。 QD亦可藉由皮下、肌肉內、皮內或靜脈內途徑投與。使QD具有組織特異性標籤(根據如上文所述之實例3)以確保在哺乳動物中特異性遞送，該等QD靶向關注區域(例如哺乳動物中之特定器官)。 本文所引用之所有公開案、專利及專利申請案均以引用的方式併入本文中，其引用的程度就如同在本文中全文所述一般。本發明之此等及其他優勢將由前述說明書而對熟習此項技術者顯而易見。因此，熟習此項技術者認識到，可在不背離本發明之廣泛發明概念的情況下對上述實施例進行變化或修改。應瞭解，本發明並不限於本文所述之特定實施例，而是意欲包括在本發明之範疇及精神範圍內的所有變化及修改。
圖1描述5小時、24小時及48小時之後小鼠胚胎幹細胞中量子點奈米粒子之細胞質吸收。細胞核區域使用一種強有力地結合至DNA中之富含A-T之區的螢光染料4'-6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)複染藍色/綠色。 圖2描述所提出之粒線體中量子點奈米粒子之相互作用機制。

Claims (23)

  1. 一種奈米粒子共軛物，其包含： 包含以下之量子點： 核心半導體材料及 外層， 其中該外層包含連接至使得粒線體中之代謝活性可調節之官能化配位體的官能化有機塗層。
  2. 如請求項1之奈米粒子共軛物，其中該奈米粒子共軛物經表面改質以增強該奈米粒子共軛物於粒線體中之積聚。
  3. 如請求項1之奈米粒子共軛物，其中該奈米粒子共軛物塗佈有趨粒線體性配位體。
  4. 如請求項1之奈米粒子共軛物，其中趨粒線體性配位體係三苯基鏻或其衍生物。
  5. 如請求項4之奈米粒子共軛物，其中該奈米粒子包含II-VI材料、III-V材料、I-III-VI材料或其任何合金。
  6. 如請求項5之奈米粒子共軛物，其中該官能化配位體係己糖激酶(HK)抑制劑。
  7. 如請求項6之奈米粒子共軛物，其中該己糖激酶(HK)抑制劑係2-去氧葡萄糖(2DG)。
  8. 如請求項7之奈米粒子共軛物，其進一步包含細胞吸收增強劑、組織滲透增強劑或其組合。
  9. 一種製備配位體奈米粒子共軛物之方法，其包含使奈米粒子與使得粒線體中之代謝活性可調節之官能化配位體偶合，其中該奈米粒子包含量子點、核心半導體材料及外層，其中該外層包含羧基。
  10. 如請求項9之方法，其進一步包含純化該配位體奈米粒子共軛物。
  11. 如請求項10之方法，其進一步包含分離該配位體奈米粒子共軛物。
  12. 如請求項11之方法，其中該偶合步驟在偶合劑存在下進行。
  13. 如請求項12之方法，其中該偶合劑係1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽。
  14. 一種操作粒線體功能之方法，其包含 i)使如請求項1之配位體奈米粒子共軛物與粒線體接觸；及 ii)用光源刺激量子點奈米粒子。
  15. 如請求項14之方法，由此伏打電流刺激細胞色素c氧化酶之釋放。
  16. 如請求項15之方法，由此產生之光子調節細胞色素c氧化酶之活性。
  17. 一種調節細胞色素c氧化酶之活性的方法，其包含 i)使如請求項1之配位體奈米粒子共軛物與粒線體接觸； ii)用光源刺激量子點奈米粒子；及 iii)自該量子點奈米粒子產生光照射。
  18. 如請求項17之方法，由此伏打電流刺激細胞色素C氧化酶之釋放。
  19. 如請求項18之方法，由此該細胞色素c氧化酶之釋放引發細胞死亡。
  20. 一種將粒線體膜去極化之方法，其包含 i)使如請求項1之配位體奈米粒子共軛物與粒線體接觸；及 ii)用光源刺激量子點奈米粒子；及 iii)自該量子點奈米粒子產生光照射。
  21. 如請求項20之方法，其中該方法誘導細胞凋亡。
  22. 如請求項20之方法，其中粒線體膜經由光伏打效應去極化。
  23. 一種抑制糖酵解之方法，其包含 i)使如請求項1之配位體奈米粒子共軛物與粒線體接觸；及 ii)用光源刺激量子點奈米粒子；及 iii)自該量子點奈米粒子產生光照射。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR102658797B1 (ko) * 2020-11-20 2024-04-19 인제대학교 산학협력단 메틸화된 dna에 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하는 폴리디아세틸렌 리포좀 및 이를 이용한 dna 메틸화의 형광 검출 방법
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Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI20002623A (fi) * 2000-11-30 2002-05-31 Inno Trac Diagnostics Oy Bioanalyyttinen määritysmenetelmä
CN1784600A (zh) * 2003-05-02 2006-06-07 安克塞斯生物公司 层析分析系统
GB0409877D0 (en) 2004-04-30 2004-06-09 Univ Manchester Preparation of nanoparticle materials
US7588828B2 (en) 2004-04-30 2009-09-15 Nanoco Technologies Limited Preparation of nanoparticle materials
US20060246524A1 (en) * 2005-04-28 2006-11-02 Christina Bauer Nanoparticle conjugates
KR101575114B1 (ko) 2007-09-28 2015-12-08 나노코 테크놀로지스 리미티드 코어 쉘 나노입자들 및 이들의 준비 방법
EP2794464B1 (en) * 2011-12-22 2023-11-22 Samsung Electronics Co., Ltd. Surface modified nanoparticles
JP2016518468A (ja) 2013-03-14 2016-06-23 ナノコ テクノロジーズ リミテッド 多層コーティングされた量子ドットビーズ
US9343301B2 (en) 2013-03-14 2016-05-17 Nanoco Technologies Ltd. Quantum dots made using phosphine
CN105228696B (zh) 2013-03-15 2018-04-10 纳米技术有限公司 用于波长特定的光疗法的医用装置
KR101591475B1 (ko) * 2014-07-16 2016-02-03 고려대학교 산학협력단 레일리 산란을 이용한 순환 종양 DNA(ctDNA)의 종양 특이적 돌연변이와 후성유전학적 변이의 동시 검출방법
CN104513862A (zh) * 2015-01-14 2015-04-15 中国科学院广州生物医药与健康研究院 一种dna特异位点甲基化的检测方法及试纸条生物传感器

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