TW201812016A - 用於同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Ｔａｑｍａｎ探針ｑＰＣＲ反應之套組 - Google Patents

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本發明提供一種用於同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應之套組。其中該套組包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、與SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、與SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、與SEQ ID NO：9、以及SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11與SEQ ID NO：12所組成之引子探針群組；目標檢測之四種的血源性病毒係為B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、人類免疫缺乏病毒第一型(HIV1)、以及人類嗜T淋巴球病毒第一型(HTLV1)，此引子探針組合與分析方法具有極高的靈敏度及專一性，可作為血液捐贈者之血液篩選、血液產品的檢測、臍帶血幹細胞的檢測、抗-病毒藥物療效之評估、抗-病毒藥物的開發以及其它用途。

Description

用於同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應之套組
本發明提供一種用於同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應之套組；特別係一種用於同時檢測及定量分析B型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)、C型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)、人類免疫缺乏病毒第一型(human immunodeficiency virus type1，HIV1)、以及人類嗜T淋巴球病毒第一型(human T-cell lymphoma/leukemia virus type 1，HTLV1)之血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應之套組。
血源性病毒(blood-borne viruses，BBV)主要係經由接觸感染血液或血液製品、接觸某些身體組織及體液、性接觸及染病的母親垂直傳染給胎兒而傳播。常見的血源性病毒包含B型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)、C型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)、人類免疫缺乏病毒第一型(human immunodeficiency virus type1，HIV1)、人類嗜T淋巴球病毒第一型(human T-cell lymphoma/leukemia virus type 1，HTLV1)、以及其他病毒。
HBV及HCV的感染是肝臟疾病中最常見及最嚴重的類型，全球有超過500萬人感染這兩種病毒。在臺灣地區，有90%的成人人口曾經感染過HBV；約有15%至20%的總人口(約300萬)是B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的帶原者。從1985年開始臺灣實施全國性新生兒接種B型肝炎疫苗計畫，以使B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的帶原者明 顯地減少。感染HBV的長期病症包含肝硬化及肝癌；由於肝炎及肝硬化而造成的死亡為所有死亡案例的第六名，而且在臺灣肝癌的癌症死亡率是僅次於肺癌，為第二個常見的癌症死亡原因。此外，在臺灣約有30萬人口為HCV帶原者，大約是總人口的5%或HBV帶原者的1/10。
人類慢性病毒亞科(lentivirinae)群組是由HIV-1以及HIV-2組合而成，其與嚴重免疫缺陷及後天免疫缺乏症候群(Acquired lmmunodeficiency Syndrome，AIDS)有關。感染這些病毒的個體發病的可能性極高，感染HIV1的平均疾病症狀發病時間約為10.7年，延後治療或未接收到HIV檢測結果或延後進入HIV陽性反應照顧的患者是常見醫療衛生的問題。
人類致癌病毒(oncovirinae)包含HTLV-1及HTLV-2，近期稱之為人類T-淋巴細胞病毒(human T-lymphotropic viruses)，其與良性及腫瘤淋巴增生性疾病、多種自身免疫疾病及免疫缺陷有關。然而，大多數個體感染這兩種病毒仍可保持無症狀的生活。由於因輸血而感染此病毒的可能性，美國食品及藥物管理局(United States Food and Drug Administration)建議對所有血液捐贈者的血液除了HBV、HCV及HIV之篩選外，再針對HTLV1進行篩選。在美國血液捐贈者HTLV1感染的血清陽性率是在0.025%的範圍內，在血清或血漿中以qRT-PCR定量HTLV1 RNA是最直接檢測病毒感染、複製及治療效果的方法。
臨床上對於上述四種血源性病毒分析的要求很嚴謹。在2003年，臺灣血庫利用酵素免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)對30,000個血液樣本進行篩選，其結果顯示HBV的陽性機率為1.09%、HCV的陽性機率為0.28%、HIV1/2的陽性機率為0.06%、HTLV的陽性機率為0.05%，並進一步檢測出梅毒螺旋體(Treponema pallidum，TP)的陽性機率為0.07%。若使用核酸擴增技術(nucleic acid amplification technology，NAT)，由於各種病毒的空窗期，核酸擴增技術的陽性機率會比上述ELISA檢測方法高。在美國地區，血液的需求量極大，在一天當中，約有38,000個人需要紅血球細胞，其包含事故受害者、接受手術的患者以及接受白血病、癌症或其他例如是鐮狀細胞病(sickle cell disease)、地中海 貧血(thalassemia)之疾病治療的患者，因此每年有超過2千6百多萬次的輸血治療。
臺灣血庫已利用酵素免疫分析法(ELISA)進行HBV、HCV、HIV1/2、以及HTLV1/2的篩選。HBV係檢測B型肝炎病毒表面抗原而其他(HCV、HIV、以及HTLV)是進行相對應的抗原及抗體進行檢測。由於血液病毒具有各種空窗期，造成ELISA的檢測有敏感度低、交叉反應性及假陰性的可能性之缺點。例如，HCV抗體的空窗期是70天、HIV抗體的空窗期是22天以及B型肝炎病毒表面抗原的空窗期是56天。由於目前血清篩選測試無法檢測出受感染的捐贈者的感染空窗期或檢測出該些病毒的各種抗原種類，因此還是存在病原性病毒傳輸之風險。
核酸擴增技術(NAT)具有比前述篩選方法更早檢測出病毒之存在，NAT已經使用作為血液捐贈者篩選的方法，其已證實其可用於檢測出早期感染的有效性。先前研究已經表示病毒核酸檢測更能降低在空窗期間病原性病毒傳輸之風險。典型的NAT之步驟包含樣本的製備、目標物的擴增、以及檢測。在過去幾年中，許多膠體電泳、定性的單一目標PCR已經用於人類皰疹EB病毒(Epstein-Barr virus)、人類皰疹病毒(human herpes virus)、呼吸病毒病原體、中樞神經系統病毒感染、蝦病毒、以及6種食源性致病菌的檢測。
目前，用於單一、二種、及三種血源性病毒的Taqman探針及beacon探針qPCR分析之類似方法已有報導；然而，上述方法皆有其方法上之缺點及不完整性，例如：三種血源性病毒皆以相同螢光標記，無法得知陽性反應之樣本是感染何種病毒；無法在三種血源性病毒上皆具有較高的專一性及敏感度以及無法獲得定量的結果。
目前，分別檢測四種血源性病毒(HCV、HBV、HIV、及HTLV)皆為大部份國家之血液篩檢所要求。然而，現今在血液篩檢方面缺少可應用在臨床血液樣本，於單一試管內便可同時檢測及定量四種血源性病毒含各種基因型之含有引子及探針組合的套組。
本發明提供一種用於同時檢測及定量分析四種血源性病毒 的多重Taqman探針qPCR反應之套組，其係包含：SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：9、以及SEQ ID NO：10至SEQ ID NO：12所組成之群組；其中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3係用於檢測B型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)存在與否；SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：6係用於檢測C型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)存在與否；SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：9係用於檢測人類免疫缺乏病毒第一型(human immunodeficiency virus type1，HIV1)存在與否；以及SEQ ID NO：10至SEQ ID NO：12係用於檢測人類嗜T淋巴球病毒第一型(human T-cell lymphoma/leukemia virus type 1，HTLV1)，且該即時聚合酶鏈鎖反應係於一單一反應混合物中進行。
本發明另提供一種用於檢測及定量分析B型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的Taqman探針qPCR反應之套組，其係包含：SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所組成之群組。
本發明另提供一種用於檢測及定量分析C型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)的Taqman探針qPCR反應之套組，其係包含：SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：6所組成之群組。
本發明另提供一種用於檢測及定量分析人類免疫缺乏病毒第一型(human immunodeficiency virus type1，HIV1)的Taqman探針qPCR反應之套組，其係包含：SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：9所組成之群組。
本發明另提供一種用於檢測及定量分析人類嗜T淋巴球病毒第一型(human T-cell lymphoma/leukemia virus type 1，HTLV1)的Taqman探針qPCR反應之套組，其係包含：SEQ ID NO：10至SEQ ID NO：12所組成之群組。
本發明亦提供一種用於同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應之方法，其係包含：(a)提供一生物樣本；(b)提供一引子組合，包含SEQ ID NO：1與SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4與SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7與SEQ ID NO：8、以及SEQ ID NO：10與SEQ ID NO：11所組成之群組；(c)提供一探針組合，包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、以及SEQ ID NO：12；(d)使用該引子組合、該探針 組合以及該生物樣本進行一即時聚合酶鏈鎖反應(real-time polymerase chain reaction)；以及(e)觀察生成之反應產物，以判斷該血源性病毒是否存在於該生物樣本以及定量該血源性病毒，其中，步驟(e)SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3係用於檢測B型肝炎病毒(HBV)存在與否；SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：6係用於檢測C型肝炎病毒(HCV)存在與否；SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：9係用於檢測人類免疫缺乏病毒第一型(HIV1)存在與否；以及SEQ ID NO：10至SEQ ID NO：12係用於檢測人類嗜T淋巴球病毒第一型(HTLV1)，且該即時聚合酶鏈鎖反應係於一單一反應混合物中進行。
本發明之一實施例中，其中SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、或SEQ ID NO：12係為5’端具有螢光染劑以及3’端具有螢光抑制分子之探針。
本發明之一實施例中，其中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、或SEQ ID NO：11係為引子。
有鑑於此，本發明提供一種在臨床單一血液樣本試管內同時檢測及定量四種血源性病毒的各種基因型檢測之套組，其中該血源性病毒包含B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、人類免疫缺乏病毒第一型(HIV1)、以及人類嗜T淋巴球病毒第一型(HTLV1)。本發明之包含引子及探針的套組可用於在1.5個小時內檢測96-孔盤之高通量(High throughput)的檢測方式，密封式試管型式可減少交叉汙染的可能性，並具有極高的靈敏度及專一性。因此，本發明之套組可作為血液捐贈者之血液篩選、血液產品的檢測、臍帶血幹細胞的檢測、抗-病毒藥物療效之評估、抗-病毒藥物的開發以及其它用途。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第一圖A至E係為本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之套組的定量增殖放大結果與標準曲線。定量標準品(QS)拷貝數是係為103至107；A至D上圖、以及E圖為HBV、HCV、HIV1、及HTLV1四種病毒及內部控制組(internal control，IC)的擴增圖形；A至D下圖為HBV、HCV、HIV1、以及HTLV1四種病毒的標準曲線。
第二圖係為本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之套組之膠體電泳圖，黑色指標表示四種病毒的PCR特定產物；白色指標表示內部控制組(IC)的PCR產物。
第三圖A至D係為本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之套組的定量臨床病毒樣本的拷貝數結果。虛線表示平均病毒拷貝數；上實線表示定量標準品(QS)最大值；下實線表示定量標準品(QS)最小值，(A)為HCV陽性反應的樣本；(B)為HBV陽性反應的樣本；(C)為HIV1陽性反應的樣本；(D)HTLV1陽性反應的樣本。
第四圖A至D係為本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之套組的再現性，(A)HCV、(B)HBV、(C)HIV1、以及(D)HTLV1。
第五圖A至D係為本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之套組的敏感度，(A)HCV、(B)HBV、(C)HIV1、以及(D)HTLV1。
第六圖A至D係為本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之套組的動態範圍(dynamic range)分析，(A)HCV、(B)HBV、(C)HIV1、以及(D)HTLV1。
第七圖A至D係為本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之套組分析樣本的拷貝數與標準品連續稀釋的拷貝數之關係圖，(A)HCV、(B)HBV、(C)HIV1、以及(D) HTLV1。
第八圖A至D係為本發明之分別利用單一血源性病毒之引子組及Taqman探針定量已知標準品拷貝數結果的標準曲線，(A)為HCV陽性反應的樣本；(B)為HBV陽性反應的樣本；(C)為HIV1陽性反應的樣本；(D)HTLV1陽性反應的樣本。
第九圖A至D係為本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之套組與單一血源性病毒之引子組及Taqman探針qPCR反應的比較圖，(A)HCV、(B)HBV、(C)HIV1、以及(D)HTLV1。
第十圖係表示本發明之HBV引子核苷酸改變對qPCR特異性的影響，3’-G(G：C)代表本發明之Taqman探針qPCR反應之套組；3’-C(CxC)代表改變檢測HBV病毒之正向引子序列(SEQ ID NO：1)的3’末端之單一核苷酸。
第十一圖係表示本發明之HBV探針核苷酸改變對qPCR特異性的影響，C(C：G)代表本發明之Taqman探針qPCR反應之套組；A(AxG)表改變檢測HBV病毒探針序列(SEQ ID NO：3)的中間位置第12個鹼基C的單一核苷酸為A、G(GxG)代表改變檢測HBV病毒探針序列(SEQ ID NO：3)中間位置第12個鹼基C的單一核苷酸為G；T(TxG)代表改變檢測HBV病毒探針序列(SEQ ID NO：3)的中間位置第12個鹼基C的單一核苷酸為T。
第十二圖係表示本發明之HCV引子核苷酸改變對qPCR特異性的影響，3’-C(C：G)代表本發明之Taqman探針qPCR反應之套組；3’-A(AxC)代表改變檢測HCV病毒之正向引子序列(SEQ ID NO：4)的3’末端之單一核苷酸。
第十三圖係表示本發明之HIV1引子核苷酸改變對qPCR特異性的影響，3’-T(T：A)代表本發明之Taqman探針qPCR反應之套組；3’-G(GxA)代表改變檢測HIV1病毒之正向引子序列(SEQ ID NO：7)的3’末端之單一核苷酸。
第十四圖係表示本發明之HTLV1引子核苷酸改變對qPCR特異性的影 響，3’-G(G：C)代表本發明之Taqman探針qPCR反應之套組；3’-A(AxC)代表改變檢測HTLV1病毒之正向引子序列(SEQ ID NO：10)的3’末端之單一核苷酸。
本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之套組合可用於同時或分別檢測及定量活體外(in vitro)四種血源性病毒(blood borne viruses)，其中包含B型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)、C型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)、人類免疫缺乏病毒第一型(human immunodeficiency virus type1)、以及人類嗜T淋巴球病毒第一型(human T-cell lymphoma/leukemia virus type 1)。本發明之套組可用於作為血液捐贈者之血液篩選、血液產品的檢測、臍帶血幹細胞的檢測、抗-病毒藥物療效之評估、抗-病毒藥物的開發以及其它用途。本發明之套組具有極高的聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)之靈敏度、定量分析準確度、Taqman探針雜交的專一性、在Taq DNA聚合酶5’核酸酶活性的水解性且具有廣泛的檢測範圍。本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之套組適用於兩步驟之定量反轉錄PCR檢測方法：第一步驟、以隨機六聚體(random hexamer)將RNA病毒(包含HCV、HIV、以及HTLV)反轉錄為cDNA；以及第二步驟、將經純化的HBV DNA病毒樣本一起進行多重Taqman探針qPCR反應。
為測定本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之套組的專一性，本發明採用477個陽性臨床樣本，其中包含57個HCV PCR陽性反應、91個HBV PCR陽性反應、20個HIV1 PCR陽性反應以及19個HTLV1 PCR陽性反應的樣本；該些樣本經由定量PCR、即時(real-time)SYBR green PCR、北方點墨法以及DNA定序進行病毒檢測及鑑定。本發明使用MagBead病毒DNA/RNA試劑組(Ambergene公司，臺灣)或矽酸鹽化包膜柱病毒DNA/RNA純化試劑組(silicated membrane column for viral purification DNA/RNA Kit)(Ambergene公司，臺灣)純化出病毒DNA/RNA。經由本發明之同時檢測及 定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之套組能準確鑑定出四種血源性病毒且沒有偽陰性發生，本發明之套組能快速且準確地在受感染的血液樣本中檢測及定量HBV、HCV、HIV、以及HTLV1四種病毒。
實施例1 材料與方法 1.1 PCR引子、探針設計及病毒株
本發明利用Primer Express軟體(Applied Biosystems，美國)設計寡核苷酸引子(表一)，在組成後計算所有的熔解溫度(melting temperature，Tm)值及以聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)測試預期的產物大小。組成的寡核苷酸引子及Taqman探針是經由百力生物科技有限公司(Purigo Biotechnology Co.,Ltd，臺灣)、基龍米克斯生物科技股份有限公司(Genomics BioSci & Tech，臺灣)以及Integrated DNA Technologies(美國)合成而獲得。Taqman探針係分別以FAM/BHQ1(HCVtp-313R-FAM)、HEX/BHQ1(HBVtp-395R-HEX)、CAL螢光紅610/BHQ2(HIV1papPEtp-610)、Quasar 670/BHQ2(HTLV1-73-tp-670)以及Quasar 705/BHQ2(Qbeta tp-705)標記，每一配對為螢光染劑及螢光抑制分子。BioRad iQ5即時(real-time)熱循環儀(thermal cycler)具有5組激發濾鏡與放射濾鏡組，以705nm濾鏡組取代原來的TAMRA濾鏡組(TAMRA filter set)(第4通道)，該新的組合具有最小重疊的激發發射波長，5個螢光染色可同時使用。
設計所有的病毒特定的qPCR引子及探針，並經過多次的測試、修飾及改善。經過美國全國生物技術信息中心(National Center for Biotechnology information，NCBI)比對後，該引子及探針序列符合以下病毒株：HBV A(編號X70185)、HBV B(編號D00331)、HBV C(編號X01587)、HBV D(編號X72702)、HBV E(編號X75664)、HBV F(編號X75663)、HBV G(編號AF405706)、HBV H(編號EF157291)、HCV 1a(編號M67463)、HCV 1b(編號AB016785)、HCV 2a(編號AB047639)、HCV 2b(編號AB030907)、HCV 3a(編號AF046866)、HCV 3b(編號D49374)、HCV 4a(編號D45193、Y11604)、HCV 5a(編號D50466、Y13184)、HCV 6a(編號D88469,AY859526)、HIV1(編號NC_001802)、以及HTLV1(編號NC_001436)。
本發明設計之所有的引子及Taqman探針可檢測特定病毒且包含特定病毒大部分的基因型，4對引子及探針可檢測HBV病毒的A至H基因型、HCV的1至6基因型、HIV1、及HTLV1。HCV目標基因為5’UTR、HBV目標基因為S基因、HIV1目標基因為5’LTR、以及HTLV1目標基因為Tax基因；其相對應的產物大小分別為120bp、150bp、<100bp、以及73bp。該些引子、探針、目標基因及相對應的產物大小陳列於表一及表二。
備註：FAM、HEX、610、670、705為螢光染劑。BHQ1及BHQ2為螢光抑制分子。
1.2 HBV/HCV/HIV1/HTLV1拷貝數標準品及基因型系統組
依據PeliCheck HBV/HCV/HIV系統組，HBV DNA拷貝數標準品(A基因型，拷貝數從0.1至30,000)、HCV RNA拷貝數標準品(1、2、3基因型，拷貝數從0.14至38,000)、HIV1 RNA拷貝數標準品(B、C、E基因型，拷貝數從0.075至25,000)。HTLV1 RNA拷貝數標準品經由PCR、北方點墨法及定序確定，該拷貝數經由實驗室HTLV1 SYBR green qRT-PCR分析確認。
使用Advanced Biotechnologies(ABI)公司的HTLV1病毒 DNA控制組(感染細胞DNA，MT2病毒株)、HTLV2病毒DNA控制組(感染細胞DNA，C3-44(Mo))、HIV1(感染細胞，IIIB病毒株)、HIV2(感染細胞，NIH-Z病毒株)作為整合HIV1及HTLV拷貝數標準。HBV DNA的A、B、C、D、E、及F基因型係由Cliniqa公司的血清製備(HBV基因型系統組)。HBV的G及H基因型的PCR模板係依據資料庫的基因型序列合成的單股DNA。
1.3 臨床樣本
本發明之陽性臨床樣本數為477個，其來源包含：(i)150個血液樣本，先前使用於HBV基因型研究，包含91個HBV PCR陽性反應的樣本，該91個HBV PCR陽性反應樣本含有HBV各基因型系統組(genotypes panel)；(ii)190個血液樣本，先前使用於HCV基因型研究，包含57個HCV PCR陽性反應的樣本，該57個HCV PCR陽性反應樣本含有HCV各基因型系統組；(iii)87個血液樣本，來自臨床臍帶血幹細胞病毒汙染篩選，包含20個HIV1 PCR陽性反應的樣本；以及(iv)50個血液樣本，先前使用作於臍帶血幹細胞病毒汙染篩選，包含19個HTLV1 PCR陽性反應的樣本。該些樣本經由定量PCR、即時(real-time)SYBR green PCR、北方點墨法、以及DNA定序進行過病毒檢測及鑑定。
1.4 內部控制組
使用表二的內部控制組(internal control，IC)，其可以監控萃取步驟及確認PCR失敗的可能性。內部控制組的模板係特別選擇為4個目標病毒非同源性的序列，並將內部控制組加入至每個樣本中一起進行核酸萃取及檢測PCR擴增之步驟。其可作為萃取及PCR的步驟效能之評估指標。在萃取步驟開始時，在與濃縮的血清樣本(200μL)混合之前先加入內部控制組至裂解緩衝液(lysis buffer)中(200μL/每個)；最後，將經純化的病毒DNA/RNA沈澱物溶解於25μL的RNase-free以及DNase-free溶液中。
1.5 定量標準品(QS)的製備
定量標準品(QS)係為作為標準曲線的非感染性DNA(如表二所示)。IC Taqman探針含有705nm螢光染劑，IC不需加入進行 RNA/DNA萃取步驟。其製備為將病毒基因體全長或特定基因的PCR產物進行純化，然後選殖至pEZT載體(TA選殖載體，Ambergene公司，臺灣)。含有特定插入序列的重組質體DNA經由矽酸鹽化薄膜柱(silicated membrane column)或DEAE-親合管柱層析(DEAE-affinity column chromatography)方法純化，然後以OD260/280吸光值定量，以計算出重組質體DNA的理想拷貝數。每個病毒定量標準品模板皆經由qPCR確認其拷貝數。
本發明之五組定量標準品(QS)係為分別含有HBV基因體全長(pHBV-二聚體)、HCV基因體全長(pHCV-fl)、部分HIV1基因體(5’LTR，pHIV1-PapPEQF/QR)的插入序列之質體、部分HTLV1基因體(tat基因，pHTLV1-158)、以及IC序列的插入序列之質體。
1.6 樣本的收集
本發明使用病毒DNA/RNA純化試劑組(Ambergene公司，臺灣)純化血清或血漿樣本。血清可以血清分離管(serum separator tube)收集；白血球以無菌的EDTA或檸檬酸血液收集管(citrate blood collection tube)，含有抗凝血藥物之樣本不適合進行樣本純化。收集血液六小時內，必須將血液收集凝血管在室溫下以3,000rpm離心10分鐘以收集血清或血漿；再將血清或血漿吸取至聚丙烯試管內，以作為病毒DNA/RNA純化使用。或者，血清或血漿可存放至-20℃冰箱中以供之後使用。
1.7 樣本的運送
白血球必須在收集六小時內以2至20℃運送；血清或血漿可在2至8℃運送或冷凍運送。
1.8 病毒DNA/RNA純化
本發明使用MagBead病毒DNA/RNA試劑組(Ambergene公司，臺灣)或矽酸鹽化包膜柱病毒DNA/RNA純化試劑組(silicated membrane column for viral purification DNA/RNA Kit(Ambergene公司，臺灣)並依據該商品製造商的操作手冊從0.2mL血清或血漿樣本純化出病毒 DNA/RNA，最後將病毒DNA/RNA溶解於50μL RNase-free以及DNase-free溶液中。病毒DNA/RNA更進一步利用異丙醇沉澱以及以0.3M NaOAc pH 5.2溶液濃縮至25μL。使用隨機六聚體(random hexamer)將5μL病毒DNA/RNA進行cDNA合成，每一個PCR分析使用1μL cDNA。
1.9 cDNA的合成
cDNA的合成的反應總體積為10μL，包含1μL經純化的病毒DNA/RNA、1μg隨機六聚體引子、0.5μL 10mM dNTPs、2μL 5x第一股緩衝液(5x cDNA 1st strand synthesis buffer)(250mM Tris-HCl pH 8.3、375mM KCl、15mM MgCl2)、0.5μL 0.1M DTT、0.1至0.25μL RNase抑制劑(40units/μL)以及0.1至0.25μL MMLV RT(200U/μL，Ambergene公司，臺灣)。該反應液先在25℃反應5分鐘使六聚體引子接合至RNA模板上，第一股cDNA在30℃反應10分鐘、40℃反應40分鐘、以及在95℃反應5分鐘而合成。在理想的狀態下，在樣本中同時有超過一種RNA目標序列會進行反轉錄。將完成的cDNA產物放置於冰上以進行多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)或單一Taqman探針qPCR反應；或將cDNA產物儲存於-20°C冰箱中以供之後使用。
實施例2 本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)
本發明利用具有5個濾膜組(FAM-495(激發)/520(發射)、HEX-535(激發)/556(發射)、CAL螢光紅610-590(激發)/610(發射)、Quasar 670-647(激發)/667(發射)、Quasar 705-690(激發)/705(發射)BioRad iQ5即時熱循環儀。本發明之多重Taqman探針qPCR之方法的反應總體積為20μL，包含20mM Tris-HCl pH 8.8、10mM KCl、3mM MgCl2、0.1% Triton X-100、0.1mg/mL BSA、每個dNTP 0.25mM、每個引子0.4mM、每個Taqman探針0.25mM以及2units熱啟動(hot start)Taq DNA聚合酶(加熱至42℃以上1分鐘進行活化)(Ambergene公司，臺灣)。並使用八連排反應管(8-well strips)或96孔PCR微量盤(Bio-Rad公司，美國)進行實驗。反應條件為：95℃反應1分鐘，再以95℃，1秒、55℃，30秒以及72℃反應30秒為 一循環，並重複此循環40次結束反應。利用iCycler iQ5軟體進行數據分析而獲得擴增圖形(RFU對循環數)、標準曲線(Ct對模板拷貝數的log值)。
2.1 本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之套組的特異性
本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之方法在緩衝液中具有定量標準品(QS)質體及cDNA(目標病毒)模板、多重引子及探針混合的條件下進行檢測之結果，本發明以斜率、R2、RFU、PCR效率(E)、Y截距評估qPCR之有效性，其中PCR效率(E)以E=10(-1/slope)定義，線性的相關係數(corrlation coefficient)，R2為測量該數據是否適合模組或數據是否適配於直線，其可能因吸取器吸取時的精確度及分析的範圍所影響。如果R2≦0.985表示該分析非為可信賴之結果。如果一個或多個點在輸入模板的最小值從圖形的線性區域偏移，可能代表該數值超過分析敏感度(assay sensitivity)。如果PCR是具有100%效率，PCR產物的產量會隨每個循環而倍數增加且標準曲線的斜率是-3.33(100=100%=10(-1/-3.33)-1)；標準曲線的斜率介於-3.9及-3.0之間(80至110%效率)通常是可以接受的。Y截距可被使用作為監控分析敏感度的參數之一，Y值超過40則表示為較慢的反應及低的分析敏感度，Y值低於40則表示為較快的反應且通常由不正確的模板複製計算或非特異性PCR產物的背景值。較高的鎂離子濃度(Mg+2)會增加引子雜交的結合力，但亦會增加非專一性產物的產生及引子-引子二聚體的形成。
結果如第一圖A至E及表四、表五所示，本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之套組對HBV、HCV、HIV1、以及HTLV1四種病毒之特異性極佳，HBV、HCV、HIV1、以及HTLV1的PCR效率分別為96.9、95、96.9、及113.2，該分析的線性關係是從1.000至0.997，該反應斜率分別為-3.399、-3.448、-3.399、及-3.014、以及該敏感度是高達101至102個拷貝數。該結果證實本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之套組可用於檢測cDNA含不同的起始濃度，含有4種血源 性病毒序列的DNA模板皆適用於本發明之分析方法；多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)或單一Taqman探針qPCR反應之套組分別以定量標準品103至107或102至107拷貝數進行。
本發明特別設計不會干擾樣本中病毒的內部控制組(IC)，並將其加入至臨床樣本中，與臨床樣本同時純化。內部控制組經由標記705nm螢光染劑的IC Taqman探針檢測，其可監控純化步驟及PCR步驟的效果。此外，經由本發明之多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之方法分析確認每個含有DNA插入序列的控制組標準品(QS)的拷貝數，之後經由膠體電泳分析確認產物大小與預期的一致(表二及第二圖)。
2.2 本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之套組在臨床血液樣本之應用
本發明共採用477個臨床血液樣本，利用MagBead病毒DNA/RNA試劑組(Ambergene公司，臺灣)或矽酸鹽化包膜柱病毒DNA/RNA純化試劑組(silicated membrane column for viral purification DNA/RNA Kit(Ambergene公司，臺灣)純化出病毒DNA/RNA。並事先將樣本經由定量PCR、即時SYBR green PCR、北方點墨法、以及DNA定序進行病毒檢測及鑑定。
利用本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之套組檢測HBV、HCV、HIV1、以及HTLV1四種病毒的辨識度100%與上述先前檢測技術一致。如表六所示，該些樣本混合包含各種基因型系統組標準品(HBV A至H基因型、HCV 1至6基因型、HIV1、以及HTLV1)。本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之套組具有辨識度100%與先前檢測技術一致表示其可用於檢測四種病毒的上述所有基因型。
本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR之套組定量的結果進一步提供每個陽性反應病毒樣本的拷貝數。如第三圖A至D所示，其中57個HCV PCR陽性反應的樣本，拷貝數分布在102至107拷貝數/mL的範圍內，每毫升血液樣本的平均拷貝數 為104至105拷貝數/mL；91個HBV PCR陽性反應的樣本，拷貝數分布在102至108拷貝數/mL的範圍內，每毫升血液樣本的平均拷貝數為105拷貝數/mL；20個HIV1 PCR陽性反應的樣本，拷貝數分布在<102至104拷貝數/mL的範圍內，每毫升血液樣本的平均拷貝數為103拷貝數/mL；19個HTLV1 PCR陽性反應的樣本，拷貝數分布在<102至104拷貝數/mL的範圍內，每毫升血液樣本的平均拷貝數為103拷貝數/mL。
2.3 本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之套組的再現性及敏感度
本發明利用含有DNA插入序列的控制組質體定量標準品(QS)的六個重複樣本進行擴增以確認再現性。輸入每一個拷貝數(從100至106)以獲得Ct值、Ct值平均值且因而計算標準差(SD)。結果如第四圖A至D、以及表五所示，本發明經由HBV、HCV、HIV1、以及HTLV1模板輸入100至106拷貝數(從100至106)而分別獲得Ct值之標準差(SD)為0.21至2.50、0.19至2.1、0.27至2.62、以及0.26至2.52。
本發明利用含有DNA控制組質體定量標準品(QS)的十個重複樣本連續稀釋進行擴增以確認敏感度(從100至106)，並計算陽性檢測率。如第五圖A至D、以及表六所示，所有HBV、HCV、HIV1、以及HTLV1四種病毒的檢測敏感度高達10至102拷貝數。
2.4 本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之套組之動態範圍(dynamic range)分析
本發明經由標的物從101至109分別連續稀釋四個病毒控制組質體DNA以確認四個病毒的動態範圍以及定量分析。如第六圖A至D以及表五所示，所有四種病毒從101至109有一個廣泛的動態範圍。所有四種病毒分析顯示極佳的效性(斜率從-3.095至-3.4133)、極佳的線性關係(R2從0.999至0.9996)以及極佳的擴增率(Y截距從38.031至39.433)。
2.5 利用本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之套組分析所得的拷貝數與標準品連續稀釋的拷貝數之比較
本發明以三重複之樣本進行分析利用本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之套組分析獲得的拷貝數與標準品連續稀釋的拷貝數。如第七圖A至D所示，經本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之套組分析所得的拷貝數與標準品連續稀釋的拷貝數具有高度線性關係(R2)，其中HCV線性關係(R2)為0.9732(從101至105)、HBV線性關係(R2)為0.9793(從101至106)、HIV1線性關係(R2)為0.9447(從101至104)、HTLV1線性關係(R2)為0.9788(從101至104)；並且較高的拷貝數比較低的拷貝數顯示有較具有關聯性及較高的再現性。
實施例3 本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)與單一血源性病毒的Taqman探針qPCR反應之比較
本發明分別利用單一血源性病毒之引子組及Taqman探針與本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)的套組之檢測結果進行比較。
單一血源性病毒的Taqman探針qPCR反應總體積為20μL，包含20mM Tris-HCl，pH 8.8、10mM KCl、3mM MgCl2、0.1% Triton X-100、0.1mg/mL BSA、每個dNTP 0.25mM、每個引子0.4mM、每個Taqman探針0.25mM、以及2unit熱啟動(hot start)Taq DNA聚合酶(加熱至42℃以上1分鐘進行活化)(Ambergene公司，臺灣)。並使用八連排反應管(8-well strips)或96孔PCR微量盤(Bio-Rad公司，美國)進行實驗。反應條件為：95℃反應1分鐘，再以95℃，1秒、55℃，30秒以及72℃反應30秒為一循環，並重複此循環40次結束反應。其餘方法皆參照實施例2之檢測方式。
本發明分別利用單一血源性病毒之引子組及Taqman探針定量已知標準品拷貝數結果的標準曲線，如第八圖A至D所示，其中57個HCV PCR陽性反應的樣本，拷貝數分布在10至106拷貝數/mL的範圍內， 每毫升血液樣本的平均拷貝數為1.36×105拷貝數/mL；91個HBV PCR陽性反應的樣本，拷貝數分布在102至107拷貝數/mL的範圍內，每毫升血液樣本的平均拷貝數為4.02×106拷貝數/mL；20個HIV1 PCR陽性反應的樣本，拷貝數分布在<101至104拷貝數/mL的範圍內，每毫升血液樣本的平均拷貝數為1.89×104拷貝數/mL；19個HTLV1 PCR陽性反應的樣本，拷貝數分布在<101至104拷貝數/mL的範圍內，每毫升血液樣本的平均拷貝數為3.46×104拷貝數/mL。
第九圖A至D顯示單一血源性病毒的Taqman探針qPCR反應與之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)的檢測結果近乎一致，皆具有良好特異性。證實本發明之套組除可同時檢測及定量分析HCV、HBV、HIV1、以及HTLV1四種血源性毒外，亦可使用個別之引子組及探針檢測個別病毒。
比較例1 改變本發明之引子或探針的核苷酸對PCR特異性的影響
為證實本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之引子及探針具有極佳的特異性，本發明經由改變本發明之引子或探針的核苷酸以確認本發明之引子或探針對qPCR反應的特異性。
C1.1 改變檢測HBV病毒之正向引子序列SEQ ID NO：1的3’末端的核苷酸
本發明經由改變檢測HBV病毒之正向引子序列(SEQ ID NO：1)的3’末端之單一核苷酸G為C(SEQ ID NO：16)，以確認本發明之引子對qPCR反應的特異性。結果如第十圖所示，該改變核苷酸的引子會改變動態範圍而影響PCR的特異性，該改變核苷酸的引子的循環數(Ct)升高表示起始的拷貝數越少，證實本發明之用於檢測及定量分析HBV的Taqman探針qPCR反應之套組具有極高的靈敏度及專一性。
C1.2 改變檢測HBV病毒探針序列(SEQ ID NO：3)的中間位置的單一核苷酸
本發明經由改變檢測HBV病毒探針序列(SEQ ID NO：3)的中間位置第12個鹼基C的單一核苷酸為A、G、或T，以確認本發明之 探針對qPCR反應的特異性。結果如第十一圖所示，經由本發明之HBV病毒探針序列(SEQ ID NO：3)的曲線證實本發明之HBV病毒探針序列完全配對(match)於目標序列；其他三個單一核苷酸改變(第12個鹼基由C改變為A、第12個鹼基由C改變為G、以及第12個鹼基由C改變為T)的探針則呈現負反應(negative response)結果，證實本發明之用於檢測及定量分析HBV的Taqman探針qPCR反應之套組具有極高的靈敏度及專一性。廣泛來說，本發明之引子及探針只要變動一個鹼基，靈敏度與特性變影響非常大，只以HBV病毒舉例而已。
C1.3 改變檢測HCV病毒之正向引子序列SEQ ID NO：4的3’末端的核苷酸
本發明經由改變檢測HBV病毒之正向引子序列(SEQ ID NO：4)的3’末端之單一核苷酸C為A(SEQ ID NO：17)，以確認本發明之引子對qPCR反應的特異性。結果如第十二圖所示，該改變核苷酸的引子會改變動態範圍而影響PCR的特異性，該改變核苷酸的引子的循環數(Ct)升高表示起始的拷貝數越少，證實本發明之用於檢測及定量分析HCV的Taqman探針qPCR反應之套組具有極高的靈敏度及專一性。
C1.4 改變檢測HIV1病毒之正向引子序列SEQ ID NO：7的3’末端的核苷酸
本發明經由改變檢測HIV1病毒之正向引子序列(SEQ ID NO：7)的3’末端之單一核苷酸T為G(SEQ ID NO：18)，以確認本發明之引子對qPCR反應的特異性。結果如第十三圖所示，該改變核苷酸的引子會改變動態範圍而影響PCR的特異性，該改變核苷酸的引子的循環數(Ct)升高表示起始的拷貝數越少，證實本發明之用於檢測及定量分析HCV的Taqman探針qPCR反應之套組具有極高的靈敏度及專一性。
C1.5 改變檢測HTLV1病毒之正向引子序列SEQ ID NO：10的3’末端的核苷酸
本發明經由改變檢測HTLV1病毒之正向引子序列(SEQ ID NO：10)的3’末端之單一核苷酸G為A(SEQ ID NO：19)，以確認本發明之引子對qPCR反應的特異性。結果如第十四圖所示，該改變核苷酸的引子會改變動態範圍而影響PCR的特異性，該改變核苷酸的引子的循環數(Ct)升 高表示起始的拷貝數越少，證實本發明之用於檢測及定量分析HCV的Taqman探針qPCR反應之套組具有極高的靈敏度及專一性。
綜上所述，本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之套組檢測HCV、HBV、HIV1、及HTLV1四種病毒相較於傳統利用酵素免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)更能有效的減少檢測時間，同時對於ELISA無法檢測出帶有突變病毒測及處於無症狀空窗期的患者，本發明之方法亦能有效的被檢測出來。本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之套組用於檢測所有HBV基因型(A至H)、所有HCV基因型(1至6)、HIV1、及HTLV1。本發明未包含HIV2、及HTLV2之原因為該兩基因發生的機率較低對人類少有致病性。
本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之方法特別設計不會干擾樣本中的病毒標定的內部控制組(IC)，其加入至臨床樣本中，與臨床樣本共純化。內部控制組同時經由標記705nm螢光染劑的IC Taqman探針檢測，其可監控純化步驟及PCR步驟的效果。此外，本發明之方法設計五組定量標準品(QS)，其分別含有HBV基因體全長(pHBV-二聚體)、HCV基因體全長(pHCV-fl)、部分HIV1基因體(5’LTR,pHIV1-PapPEQF/QR)的插入序列之質體、部分HTLV1基因體(tax基因，pHTLV1-158)、以及IC序列的插入序列之質體，將樣本及定量標準品之訊號比較後可計算出樣本的病毒之數量。
本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之套組與其他檢測方法之結果100%一致；且由本發明之套組所測得的病毒拷貝數與標準品具有極高相關性，其中HCV、HBV、HIV1、及HTLV1線性關係(R2)分別為0.9732、0.9793、0.9447、以及0.9788。本發明之套組可在單一血液樣本試管內同時檢測HCV、HBV、HIV1、及HTLV1四種血源性病毒，或使用於檢測單一血源性病毒，其皆具有極高的專一性(包含廣泛的基因型檢測範圍)以及高度敏感度(10至100拷貝數/mL血液樣本)。相較於一般檢測方法僅提供定性的 結果，本發明之同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應(M-tp-qPCR)之套組可獲得病毒定量的結果。此外，本發明之套組可在1.5個小時內使用於檢測96-孔盤之高通量(high throughput)檢測方式，密封式試管型式可減少交叉汙染的可能性，並具有極高的靈敏度及專一性。因此，本發明之套組及方法作可為血液捐贈者之血液篩選、血液產品的檢測、臍帶血幹細胞的檢測、抗-病毒藥物療效之評估、抗-病毒藥物的開發以及其它用途。
<110> 旭基科技股份有限公司
<120> 用於同時檢測及定量血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應之套組
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence encoding a primer
<400> 7
<210> 8
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence encoding a primer
<400> 8
<210> 9
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Nucleotide sequence encoding a probe
<400> 9
<210> 10
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
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<223> Nucleotide sequence encoding a primer
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<223> Nucleotide sequence encoding a primer
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence encoding a primer

Claims (11)

  1. 一種用於同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應之套組，其係包含：SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：9、以及SEQ ID NO：10至SEQ ID NO：12所組成之群組；其中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3係用於檢測B型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)存在與否；SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：6係用於檢測C型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)存在與否；SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：9係用於檢測人類免疫缺乏病毒第一型(human immunodeficiency virus type1，HIV1)存在與否；以及SEQ ID NO：10至SEQ ID NO：12係用於檢測人類嗜T淋巴球病毒第一型(human T-cell lymphoma/leukemia virus type 1，HTLV1)，且該即時聚合酶鏈鎖反應係於一單一反應混合物中進行。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之套組，其中SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、以及SEQ ID NO：12係為5’端具有螢光染劑以及3’端具有螢光抑制分子之探針。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之套組，其中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、以及SEQ ID NO：11係為引子。
  4. 一種用於檢測及定量分析B型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的Taqman探針qPCR反應之套組，其係包含：SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3所組成之群組。
  5. 一種用於檢測及定量分析C型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)的Taqman探針qPCR反應之套組，其係包含：SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：6所組成之群組。
  6. 一種用於檢測及定量分析人類免疫缺乏病毒第一型(human immunodeficiency virus type1，HIV1)的Taqman探針qPCR反應之套組，其係包含：SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：9所組成之群組。
  7. 一種用於檢測及定量分析人類嗜T淋巴球病毒第一型(human T-cell lymphoma/leukemia virus type 1，HTLV1)的Taqman探針qPCR反應之套組，其係包含：SEQ ID NO：10至SEQ ID NO：12所組成之群組。
  8. 如申請專利範圍第4項至第7項任一項所述之套組，其中SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、或SEQ ID NO：12係為5’端具有螢光染劑以及3’端具有螢光抑制分子之探針。
  9. 如申請專利範圍第4項至第7項任一項所述之套組，其中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、或SEQ ID NO：11係為引子。
  10. 一種用於同時檢測及定量分析四種血源性病毒的多重Taqman探針qPCR反應之方法，其係包含：(a)提供一生物樣本；(b)提供一引子組合，包含SEQ ID NO：1與SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4與SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7與SEQ ID NO：8、以及SEQ ID NO：10與SEQ ID NO：11所組成之群組；(c)提供一探針組合，包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9、以及SEQ ID NO：12；(d)使用該引子組合、該探針組合以及該生物樣本進行一即時聚合酶鏈鎖反應(real-time polymerase chain reaction)；以及(e)觀察生成之反應產物，以判斷該血源性病毒是否存在於該生物樣本以及定量該血源性病毒，其中，步驟(e)SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3係用於檢測B型肝炎病毒(HBV)存在與否；SEQ ID NO：4至SEQ ID NO：6係用於檢測C型肝炎病毒(HCV)存在與否；SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：9係用於檢測人類免疫缺乏病毒第一型(HIV1)存在與否；以及SEQ ID NO：10至SEQ ID NO：12係用於檢測人類嗜T淋巴球病毒第一型(HTLV1)， 且該即時聚合酶鏈鎖反應係於一單一反應混合物中進行。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該探針組合係為5’端具有螢光染劑以及3’端具有螢光抑制分子之探針。
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