TW201811203A - 用於減少食品中金屬含量之螯合劑及與其相關之方法 - Google Patents
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Abstract
一些實施例係關於用於自蔬菜及植物來源製備具有減少金屬含量之食品(包含營養補充劑)的金屬螯合劑。在一些實施例中，所述植物來源包含稻米。在一些實施例中，當與待移除之金屬錯合時，所述金屬螯合劑為水溶性的且可在處理期間自所述食品材料分離(例如沖洗等)。在一些實施例中，所述金屬螯合劑為可認證有機的。
Description
本文揭示用於自食品移除金屬之螯合劑及其使用方法。
在濃縮及分離蔬菜及植物產品時，通常分離及濃縮大體積量之材料以獲得最終產物。在此分離方法期間，僅以大體積量源之少量存在的重金屬可變得更加濃縮且可達到不可接受高濃度。
一些實施例涉及用於製備具有減少重金屬之有機食品之方法。在一些實施例中，所述方法包括添加經認證有機或可認證有機螯合劑至含有重金屬之有機食品。在一些實施例中，所述方法包括使螯合劑與重金屬結合，藉此形成錯合物。在一些實施例中，所述方法包括自食品分離錯合物以製備具有減少重金屬含量的有機食品。 上文所述，或本文其他處所描述之方法中之任一者可包含以下特徵中之一或多者。 在一些實施例中，經認證有機或可認證有機螯合劑為肽螯合劑、檸檬酸或其鹽。在一些實施例中，食品為巨量營養素分離物。在一些實施例中，巨量營養素分離物為碳水化合物分離物、脂肪分離物或蛋白質分離物。在一些實施例中，巨量營養素源自植物。在一些實施例中，食品源自白米、糙米、米糠、亞麻籽、椰子、南瓜、大麻、豌豆、芡歐鼠尾草(chia)、扁豆、蠶豆、馬鈴薯、向日葵、奎奴亞藜(quinoa)、莧菜、燕麥、小麥或其組合。在一些實施例中，食品為植物蛋白質。 在一些實施例中，重金屬為砷、鎘、鉛、汞或其組合。 在一些實施例中，分離步驟藉由經由過濾器之過濾進行。在一些實施例中，錯合物大體上可溶且移動穿過過濾器。在一些實施例中，分離步驟藉由傾析及/或離心進行。 在一些實施例中，螯合劑為肽螯合劑，其中肽螯合劑藉由水解有機蛋白質製備。在一些實施例中，肽螯合劑藉由酶促或化學水解有機蛋白質製備。在一些實施例中，有機蛋白質與食品源自相同植物或動物。 一些實施例涉及包括稻米蛋白質分離物之組合物。在一些實施例中，稻米蛋白質分離物包括與經認證有機或可認證有機螯合劑結合之重金屬。在一些實施例中，經認證有機或可認證有機螯合劑為肽螯合劑或檸檬酸。在一些實施例中，肽螯合劑為稻米蛋白質水解產物。在一些實施例中，蛋白質分離物為生成營養補充劑時之中間產物。在一些實施例中，中間產物包括稻米蛋白質分離物，所述稻米蛋白質分離物包括與經認證有機或可認證有機螯合劑結合之重金屬。 一些實施例涉及用於製備肽螯合劑之方法。在一些實施例中，所述方法包括酶促或化學水解有機蛋白質以形成有機肽螯合劑。在一些實施例中，所述方法包括收集肽螯合劑。在一些實施例中，使用酶使有機蛋白質酶促水解。 在一些實施例中，酶包括以下一或多者：酸內肽酶、鹼內肽酶、胃蛋白酶、木瓜酶、羧肽酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或嗜熱菌蛋白酶。 在一些實施例中，所述方法包括自水解產物分餾肽螯合劑。 一些實施例涉及肽螯合劑。在一些實施例中，肽螯合劑包括在約21 kD至約19 kD、約16 kD至約14 kD、約13.5 kD至約12.5 kD、約11.5 kD至約10.5 kD及/或約4 kD至約2 kD分子量範圍處之根據PAGE凝膠的顯性(例如高於平均強度及/或比平均值暗)帶(及/或根據彼等帶之光學強度掃描的峰)。在一些實施例中，肽螯合劑之顯性PAGE帶(及/或獲自凝膠掃描之峰)在約20.5 kD、約15 kD及/或約12.7 kD中之一或多者處。在一些實施例中，肽螯合劑之顯性帶及/或峰在約20.5 kD、約15 kD、約12.7 kD及/或約11 kD中之一或多者處。 一些實施例涉及製備肽螯合劑之方法。在一些實施例中，所述方法包含步驟：將來自植物源之蛋白質暴露於水解條件一段時間，以製備蛋白質螯合劑。在一些實施例中，所述方法包含步驟：自水解條件移出蛋白質螯合劑。在一些實施例中，所述方法包含步驟：收集蛋白質螯合劑。 在一些實施例中，時間段小於或等於約1小時、約2小時、約4小時、約6小時，或包含及/或跨越前述值之範圍。 在一些實施例中，在暴露於水解條件期間，蛋白質暴露於酶。 在一些實施例中，在收集肽螯合劑期間，過濾肽螯合劑以基於尺寸及/或分子量分離肽螯合劑。 在一些實施例中，藉由本文所揭示之方法製備之肽螯合劑在約21 kD至約19 kD、約16 kD至約14 kD、約13.5 kD至約12.5 kD、約11.5 kD至約10.5 kD及/或約4 kD至約2 kD分子量範圍處具有根據PAGE凝膠之顯性帶(例如峰)。在一些實施例中，藉由本文所揭示之方法製備之肽螯合劑在約20.5 kD、約15 kD及/或約12.7 kD中之一或多者處具有其顯性PAGE帶及/或峰。在一些實施例中，藉由本文所揭示之方法製備之肽螯合劑在約20.5 kD、約15 kD、約12.7 kD及/或約11 kD中之一或多者處具有其顯性PAGE帶(例如峰)。 一些實施例涉及肽螯合劑，包括蛋白質水解產物，所述蛋白質水解產物包括一或多種分子量範圍為約2 kD至約25 kD的肽。在一些實施例中，所述一或多種肽具有選自約21 kD至約19 kD、約16 kD至約14 kD、約13.5 kD至約12.5 kD、約11.5 kD至約10.5 kD及/或約4 kD至約2 kD之分子量範圍。在一些實施例中，所述一或多種肽包括選自約20.5 kD、約15 kD及約12.7 kD之分子量。在一些實施例中，所述一或多種肽包括選自約20.5 kD、約15 kD、約12.7 kD及約11 kD之分子量。 一些實施例涉及藉由包括以下之方法製備之肽螯合劑：將來自植物源之蛋白質暴露於水解條件一段時間以製備蛋白質螯合劑。在一些實施例中，所述方法包括自水解條件移出蛋白質螯合劑。在一些實施例中，所述方法包括收集蛋白質螯合劑。在一些實施例中，水解條件下之時間段小於或等於約1小時、約2小時、約4小時、約6小時，或包含及/或跨越前述值之範圍。在一些實施例中，暴露於水解條件，蛋白質暴露於酶。在一些實施例中，在收集肽螯合劑期間，過濾肽螯合劑以基於尺寸及/或分子量收集肽螯合劑。在一些實施例中，所述方法產生肽螯合劑，其包括一或多種具有選自約21 kD至約19 kD、約16 kD至約14 kD、約13.5 kD至約12.5 kD、約11.5 kD至約10.5 kD及/或約4 kD至約2 kD之分子量範圍的肽。在一些實施例中，所述方法產生肽螯合劑，其包括更多肽中之一者，所述肽包括選自約20.5 kD、約15 kD及/或約12.7 kD之分子量。在一些實施例中，所述方法產生肽螯合劑，其包括更多肽中之一者，所述肽包括選自約20.5 kD、約15 kD、約12.7 kD及/或約11 kD之分子量。
[ 相關申請案之交叉參考 ]
此專利申請案主張2016年8月18日申請之美國臨時專利申請案第62/376,716號之優先權。前述申請案出於所有目的以全文引用的方式併入本文中。 本文揭示之一些實施例涉及螯合劑，製備及/或使用螯合劑之方法，及/或用於自食品減少及/或移除金屬的方法。在一些實施例中，金屬為重金屬。在一些實施例中，食品為穀物或植物分離物。在一些實施例中，食品包含自各種源分離之以下一或多者：碳水化合物類分離物(包含澱粉、纖維素、糠、纖維、碳水化合物、醣類、多醣、寡醣、麥芽糊精等)、蛋白質類分離物，(包含胺基酸、肽、寡肽、蛋白質等)、脂肪類分離物(例如油、脂肪等)、礦物質及/或其組合。在一些實施例中，食品包含源自以下之物質：稻米、米糠、亞麻籽、椰子、南瓜、大麻、豌豆、芡歐鼠尾草、扁豆、蠶豆、馬鈴薯、向日葵、奎奴亞藜、莧菜、燕麥、小麥及其類似物。在一些實施例中，食品為穀物或植物蛋白質分離物。在一些實施例中，食品包含自植物(例如含有碳水化合物類、蛋白質類、脂肪類及/或礦物質中之一或多者的植物物質)及/或動物物質(例如含有蛋白質類、脂肪類及/或礦物質之動物物質)分離之物質。在一些實施例中，食品為有機的(例如在美國、歐洲或日本有機認證標準下經認證或可認證有機)。在一些實施例中，在自蛋白質源分離蛋白質、碳水化合物或脂肪期間採用螯合劑。在一些實施例中，在已分離分離物(例如蛋白質、碳水化合物、脂肪或其組合)之後採用螯合劑。舉例而言，產品可提供至金屬減少條件用於金屬修復(remediation)。在一些實施例中，舉例而言，用螯合劑再處理例如蛋白質、脂肪或碳水化合物以移除金屬。在一些實施例中，螯合劑亦為有機的、經認證有機的及/或可認證有機的。 在一些實施例中，本文揭示之減少金屬方法可使用本文揭示之螯合劑中之任何一或多者(單獨或呈組合形式)進行，或藉由實現製備大體上移除或減少重金屬含量之有機或可認證有機食品的目標的其他螯合劑進行。在一些實施例中，本文所揭示方法之步驟中之任一者可組合及/或省略。 由於與食用化學處理食品相關之潛在健康風險及/或潛在危險，存在對有機食品增長的需求。在美國，對於有機標識當前存在四個不同層級或類別：1)『100%』有機(所有成分經有機生成)；2)『有機』(至少95%或多於95%成分為有機)；3)『用有機成分製成』(含有至少70%有機成分)；及4)『少於70%有機成分』(其中三種有機成分必須列於標籤之成分部分下)。經有機製備之食品必須無人造食品添加劑，且通常用較少人工方法、材料及條件處理，諸如化學熟化、食品輻照及遺傳修飾成分。允許非合成殺蟲劑(例如天然存在)或處理，但一般不允許合成殺蟲劑。 儘管認為食用有機處理食品比食用非有機處理食品更健康，但一些處理食品即使為有機，亦可含有有害製劑。舉例而言，儘管有機處理食品具有潛在健康益處，但其中可存在重金屬(正如在非有機處理食品中)。此等金屬可天然存在於食品中或可藉由人類活動(諸如工業及農業製程)進入食品。 儘管一些金屬(例如鈣、鎂、鈉、鉀、鐵等)對生物功能，包含細胞功能而言為基本的，但某些金屬在體內不具有功能效果且對其有害。特別關注與對健康具有有害效果相關之金屬為汞(Hg)、鉛(Pb)、鎘(Cd)、鉻(Cr)、錫(Sn)及砷(Ar)。此等金屬之毒性在某種程度上係由於其在生物組織中積累比其被排出快得多，稱為生物蓄積之過程。生物蓄積在所有由於暴露於食品及環境中之金屬之活生物體中發生，包含食用動物(諸如魚及牛)以及人類中。此外，在巨量營養素產物(例如碳水化合物、蛋白質及/或脂肪)自其來源，大數量材料中分離時，此等金屬在食物中可變得更加濃縮。 如上所指出，關於某些金屬之毒性之關注點視金屬而變化。一些金屬對幼兒大腦及心智發展產生潛在效果(例如汞、鉛等)。長期暴露於某些金屬(例如鉛)可對腎、生殖及免疫系統造成損害，以及在神經系統上的效果。一些金屬(例如鎘)對腎臟具有毒性，且其他金屬(例如錫)可導致胃腸刺激及失常。一些金屬(例如砷)備受關注，因為其導致癌症。考慮到在健康方面廣泛範圍的影響及此等毒性金屬在體內積累的事實，至關重要的為控制食品中的金屬含量以便保護人類健康。 本文揭示之一些實施例涉及自食品減少及/或移除金屬之螯合劑(chelator)(例如螯合劑(chelant))。在一些實施例中，一或多種螯合劑添加至食品之溶液或混合物。在一些實施例中，螯合劑與溶液或混合物中之一或多種金屬離子結合(形成錯合物)。在一些實施例中，待自食品移除之錯合物隨後自食品沖洗(例如在錯合物可溶、大體上可溶或具有比食品更大的溶解度的情況下)。在一些實施例中，食品自金屬錯合物沖洗(例如在食品可溶、大體上可溶或具有比金屬錯合物更大的溶解度的情況下)。在一些實施例中，錯合物包括可自液體及食品之可溶或不可溶溶液或混合物撇除或傾析的絮狀或漂浮塊狀物。 在一些實施例中，金屬錯合物可藉由過濾、傾析及/或離心自食品分離。舉例而言，在一些實施例中，在錯合物大體上或完全可溶且食品大體上不可溶或比錯合物較不可溶的情況下(例如固體懸浮溶液作為混合物)，混合物經傾析且上清液含有金屬錯合物，而固體含有減少金屬含量的食品。在一些實施例中，在傾析之前，混合物經離心以分離固相及液相。在一些實施例中，藉由傾倒、抽吸(例如藉由真空)或以其他方式自固體移除上清液來進行傾析。在一些實施例中，混合物經過濾，且含有金屬錯合物之濾液自含有經純化食品的濾餅移除。在一些實施例中，超過濾、滲析或微過濾方法可用以自固體移除濾液。 不受特定理論限制，咸信螯合劑俘獲及結合重金屬及其他金屬，且運載來自例如穀物及/或植物蛋白質基質之金屬穿過過濾裝置，所述過濾裝置截留蛋白質基質。過濾裝置使得錯合物離開食品懸浮液，所述懸浮液隨後可經分離。螯合劑使金屬溶解且可使用水自基質衝出。在一些實施例中，使用肽允許在已製備食品之後及/或在製備初步處理有機食品期間的金屬移除製程中的重金屬修復。 在一些實施例中，本文揭示之螯合劑為有機的、經認證有機的及/或可認證有機的。在一些實施例中，有機、經認證有機及/或可認證有機螯合劑為天然存在之金屬螯合劑或使用經認證有機技術生成的金屬螯合劑。在一些實施例中，藉由使用有機螯合劑，有機食品可自大體積量有機食品源分離。在一些實施例中，有機、經認證有機或可認證有機螯合劑為可自天然源分離之金屬螯合劑或使用經認證有機技術生成的金屬螯合劑。在一些實施例中，螯合劑用以製備有機及/或可認證有機且具有減少的重金屬含量的食品。在一些實施例中，螯合劑用以製備有機蛋白質分離物、澱粉分離物或脂肪分離物。在一些實施例中，有機螯合劑用以製備有機蛋白質分離物或其他可認證有機、具有減少的金屬的食品。 在一些實施例中，所述方法可使用以下螯合劑、實現可認證有機移除重金屬的目標的其他螯合劑及其組合中的任一者進行。在一些實施例中，下文所揭示步驟或參數中之任一者可組合。在一些實施例中，可省略或以任何方式組合步驟以實現食品中之金屬螯合，減少彼等食品之金屬含量。 在一些實施例中，螯合劑包括檸檬酸或其鹽。在一些實施例中，螯合劑包括以水解方式製備之肽或寡肽(「肽螯合劑」)、其混合物及/或其鹽。在一些實施例中，螯合劑可為乙二胺四乙酸(EDTA)或其鹽。在一些實施例中，檸檬酸、肽螯合劑及/或EDTA中之一或多者呈組合形式使用。 在一些實施例中，肽螯合劑源自藉由酶促及/或化學水解蛋白質製備之植物(例如穀物、植物等)肽。在一些實施例中，酶促及化學水解方法允許生成用於減少穀物及植物蛋白質中之重金屬的有機螯合劑。在一些實施例中，一或多種酶用以製備肽螯合劑。在一些實施例中，酶為內肽酶。在一些實施例中，此等酶選擇性地在特異性胺基酸序列之間將蛋白質分解成肽片段。在一些實施例中，使用一或多種酸內肽酶及/或鹼內肽酶。在一些實施例中，酸內肽酶在酸性環境中使用。在一些實施例中，酸內肽酶在pH等於或小於約2、6.5，或包含及/或跨越前述值之範圍的溶液中使用。在一些實施例中，酸蛋白酶選自胃蛋白酶、木瓜酶、羧肽酶及其類似物中之一或多者。在一些實施例中，鹼內肽酶在鹼性pH溶液中使用。在一些實施例中，鹼內肽酶在小於或等於約7.0、12，或包含及/或跨越前述值之範圍的pH中使用。在一些實施例中，鹼內肽酶包含胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶及其類似物中之一或多者。在一些實施例中，用於製備肽螯合劑之溶液之pH小於或等於約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11，或包含及/或跨越前述值的範圍。在一些實施例中，酶包含Alcalase®或DSM Maxipro BAPTM
中之一或多者。在一些實施例中，此等內肽酶水解反應在等於或低於約4℃及80℃，或包含及/或跨越前述值的範圍的溫度下進行。在一些實施例中，內肽酶水解反應在大於或等於約50℃的溫度下進行。在一些實施例中，酶促水解反應在小於或等於約4℃、10℃、20℃、40℃、50℃、60℃、80℃、99℃，或包含及/或跨越前述值的範圍的溫度下進行。在一些實施例中，酶水解進行之時間段小於或等於約1小時、約2小時、約4小時、約6小時、約10小時，或包含及/或跨越前述值的範圍。在一些實施例中，隨後藉由使酶去活化淬滅所述方法，例如藉由加熱混合物至高於約60℃、80℃、85℃、90℃、99℃，或包含及/或跨越前述值的範圍。 在一些實施例中，將內肽酶中之一或多者添加至穀物蛋白質溶液。在一些實施例中，用鹼調節pH，鹼為諸如氫氧化鈉或氫氧化鉀，或磷酸三鈉。在一些實施例中，用酸調節pH，酸為諸如鹽酸、檸檬酸或磷酸。在一些實施例中，視類型或所用特定酶而定來調節pH。在一些實施例中，攪拌蛋白質及酶(及/或另一種水解劑)之溶液一段時間以自主要穀物蛋白鏈分解肽。在一些實施例中，在使用酶的情況下，在獲得所期望肽螯合劑特徵之後，使酶變性或以其他方式去活化。在一些實施例中，舉例而言，將酶環境加熱至高於85℃持續一段時間，以使酶去活化。 在一些實施例中，肽螯合劑由與所處理之食品相同的食品源(例如相同類型的動物、穀物及/或植物源)生成。在一些實施例中，肽螯合劑由與所處理之食品不同的食品源生成。 在一些實施例中，肽螯合劑包括粗蛋白水解產物，含有例如肽、寡肽及/或胺基酸之混合物。在一些實施例中，粗蛋白水解產物之某些部分在用作肽螯合劑之前經由熟知分離技術(諸如基於分子量、電荷及/或結合親和力之彼等者)分餾及/或分離及/或濃縮。在一些實施例中，水解產物之金屬結合肽組分藉由親和力分離技術(分批或層析)富集，其中金屬固定於珠粒或分離介質上且粗製水解產物暴露於親和力介質。非結合部分可洗出，且隨後金屬結合部分可藉由較高親和力結合劑(反離子等)自金屬移出，在用作肽螯合劑之前收集及/或濃縮。在一些實施例中，粗蛋白水解產物之某些部分使用過濾、密度離心等中之一或多者分餾及/或分離及/或濃縮。在一些實施例中，肽螯合劑包括在水解來自植物源之蛋白質之後作為分離形式使用的肽、寡肽及/或胺基酸的混合物。在一些實施例中，肽螯合劑包括一或多種在酸之間具有或不具有胺基酸間隔基，或其他間隔基的多官能酸肽(例如二羧酸、三羧酸、四羧酸或更多)。在一些實施例中，此等多官能酸結合金屬以形成金屬錯合物。在一些實施例中，肽螯合劑包括一或多種在胺之間具有或不具有胺基酸間隔基的多官能胺肽(例如二羧酸、三羧酸、四羧酸或更多)。在一些實施例中，此等多官能胺結合金屬以形成金屬錯合物。酸及胺官能基可來自包括酸及胺末端兩者之天然胺基酸的任何胺基酸(例如丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及/或纈胺酸)。結合酸或胺亦可由胺基酸之側鏈生成，例如：麩胺酸及/或天冬胺酸(酸)；色胺酸、麩醯胺酸、離胺酸、組胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸及/或精胺酸(胺及/或鈲)。在一些實施例中，肽螯合劑包括一或多個與金屬結合之硫基或羥基取代基(例如絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、酪胺酸)。 在一些實施例中，肽螯合劑基於以水解方式處理之蛋白質的分子量分數來分離。在一些實施例中，肽螯合劑包括具有一或多種不同分子量之肽的蛋白質水解產物。在一些實施例中，蛋白質水解產物為藉由酶促分解植物蛋白質源產生之植物蛋白質水解產物。在一些實施例中，蛋白質水解產物具有一或多種分子量範圍為約500 kD至約25,000 kD的肽。在一些實施例中，更多肽中之一者經進一步純化(例如藉由尺寸排阻及/或離子交換層析法)且用作肽螯合劑。在一些實施例中，肽螯合劑之數目平均分子量(g/mol)及/或重量平均分子量(g/mol)等於或小於約500、1000、2000、5000、10,000、15,000、20,000、25,000或包含及/或跨越前述值的範圍。在一些實施例中，肽螯合劑之分子量(g/mol)等於或小於約500、1000、2000、5000、10,000、15,000、20,000、25,000或包含及/或跨越前述值的範圍。 在一些實施例中，此等胺基酸及其不同官能基之混合物與金屬結合以形成錯合物。在一些實施例中，產生5員環或6員環之胺基酸組態可提供更有利的結合定向(例如絲胺酸中之例如硫醇、胺及金屬之間)，但不為所需的。此類組態包含包含GHK錯合物(例如藉由甘胺酸胺及醯胺及組胺酸之咪唑與金屬結合)之彼等者。單胺基酸及胺基酸鏈(例如長度為2、3、4、5、6或大於6)可用作螯合劑。 在一些實施例中，除上文所述之彼等者以外可使用添加其他螯合劑材料或替代上文所述之彼等者。在一些實施例中，螯合劑源自植物材料，例如海藻、茶皂素、腐殖酸、馬鈴薯皮、鋸屑、黑豆皮、蛋殼、咖啡殼、甜菜果膠凝膠、橘皮、木瓜木、玉米葉、葉粉、白茅、葉粉、橡膠葉粉、花生殼顆粒、西米廢棄物、濱藜(saltbush)葉、樹蕨、楝樹皮、葡萄莖、稻殼、廢穀物(例如來自酒廠)、甘蔗灰、麥麩、玉米穗軸、野草(白茅(Imperata cylindrical
)葉粉)、水果/蔬菜廢棄物、木薯廢棄物、植物纖維、樹皮縐、滿江紅(Azolla)、苜蓿生物質、棉籽殼、大豆殼、豌豆殼、道格拉斯(Douglas)冷杉樹皮、胡桃殼、土耳其咖啡(Turkish coffee)、堅果殼、木質素、泥炭蘚苔泥炭、竹漿、橙皮(白色內表皮)、橙皮(外表皮)、番瀉葉及其組合。 在一些實施例中，所移除金屬包含具有大於或等於約63.5、100、200.6，或包含及/或跨越前述值之範圍之原子量的金屬。在一些實施例中，所移除及/或減少的金屬包含砷、鋅、銅、鎳、汞、鎘、鉛、硒及鉻中之一或多者。在一些實施例中，螯合劑結合於、移除及/或減少比重大於約3.0、5.0、10.0，或包含及/或跨越前述值的範圍的金屬。 在一些實施例中，用於處理食品之螯合劑的量基於乾式量測值。舉例而言，在一些實施例中，螯合劑相對於食品之2乾重%量測值指示每98公克食品為2公克螯合劑(2 g螯合劑/100 g總乾重)。在一些實施例中，用於處理食品之螯合劑之乾重量測值小於或等於約0.5%、1%、2%、5%、10%，或包含及/或跨越前述值的範圍。 在一些實施例中，用於處理食品之螯合劑(或螯合劑之組合)的量基於重量百分比量測值。舉例而言，在一些實施例中，所處理調配物包括液體(例如水)中之食品(例如諸如蛋白質、蛋白質分離物、碳水化合物等之植物物質的混合物及/或懸浮液)。在一些實施例中，螯合劑相對於調配物之2 wt%量測值指示每100公克調配物(例如食品、螯合劑及液體溶劑)為2公克螯合劑(例如溶質)。在一些實施例中，用於處理調配物之螯合劑wt%小於或等於約0.0125、0.25%、1%、2%、5%、7.5%、10%，或包含及/或跨越前述值之範圍。在一些實施例中，調配物中之無水食品物質之重量百分比等於或大於約10%、20%、30%、40%、60%、80%、90%、99%，或包含及/或跨越前述值之範圍。 在一些實施例中，不使用螯合劑，且替代地，改為使用不添加或大體上不添加螯合劑之液體以自食品移除金屬。舉例而言，在一些實施例中，使用液體(諸如水、乙醇等)之一或多種組合移除金屬。 在一些實施例中，移除及/或減少金屬可在不同pH值下進行。在一些實施例中，改變進行螯合及/或過濾之溶液之pH提高例如金屬錯合物(當存在時)或金屬的溶解度，使得其自例如懸浮食品移除(例如在金屬錯合物可溶且食品不可溶的情況下)。在其他實施例中，舉例而言，在錯合物(當存在時)或金屬比食品更不可溶的情況下，可藉由改變含有食品之溶液之pH來提高食品的溶解度。在一些實施例中，用於進行錯合及金屬減少之溶液之pH小於或等於約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11，或包含及/或跨越前述值的範圍。 在一些實施例中，金屬移除及/或減少可使用不同溶液溫度下之方法進行。在一些實施例中，改變進行螯合(當執行時)、金屬溶解及或過濾之溶液之溫度提高例如金屬錯合物(當存在時)或金屬的溶解度，使得其自例如懸浮食品移除(例如在金屬錯合物可溶且食品不可溶的情況下)。在其他實施例中，舉例而言，在錯合物(當存在時)或金屬比食品更不可溶的情況下，可藉由改變溫度來提高食品的溶解度。在一些實施例中，用於執行錯合及/或金屬減少之溶液之溫度小於或等於約4℃、10℃、20℃、40℃、60℃、80℃、99℃，或包含及/或跨越前述值之範圍。 在一些實施例中，微過濾、超過濾及/或奈米過濾膜技術用以截留目標食品(例如穀物及/或植物蛋白質)，同時允許螯合劑及/或其他雜質通過膜，導致減少食品重金屬。在一些實施例中，過濾藉由具有等於或小於約10,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000，或包含及/或跨越前述值之範圍之分子量截斷(以道爾頓為單位)的微過濾膜進行。在一些實施例中，過濾藉由具有等於或小於0.1 µ、0.5 µ、0.8 µ、1.0 µ、1.2 µ、1.4 µ、2.0 µ，或包含/或跨越前述值之範圍之孔隙尺寸的微過濾膜進行。在一些實施例中，使用分子量截斷為約100,000道爾頓至4微米之微過濾膜。在一些實施例中，藉由具有等於或小於約700、10,000、50,000、100,000、500,000、800,000，或包含及/或跨越前述值之範圍之分子量截斷(以道爾頓為單位)的超過濾膜進行過濾。在一些實施例中，藉由具有等於或小於約100、300、500、1,000，或包含及/或跨越前述值之範圍之分子量截斷(以道爾頓為單位)的奈米過濾膜進行過濾。在一些實施例中，微過濾、超過濾及/或奈米過濾膜由無機及/或有機基質形成。在一些實施例中，微過濾、超過濾及奈米過濾膜模組可由螺旋空心纖維板及框架、管狀及/或擠壓膜組態形成。 一些實施例涉及使用織物及/或篩網過濾器技術截留目標穀物及/或植物產物(例如蛋白質)，同時允許螯合劑及/或其他雜質通過膜，導致減少重金屬。在一些實施例中，織物可為任何天然或人工編織或擠壓材料。在一些實施例中，篩網可為任何金屬或塑膠材料。在一些實施例中，篩網可具有等於或小於約10目、100目、400目，或包含及/或跨越前述值之範圍的網孔。在一些實施例中，過濾器系統使用織物及/或篩網網格、及/或燒結不鏽鋼或玻璃過濾器。 在一些實施例中，過濾系統呈筒式過濾器、板及框架過濾器雙連續傳送帶過濾器、真空鼓過濾器、平板過濾器、傾斜過濾器或遞增傳送帶過濾器組態。 在一些實施例中，過濾方法使用溫度小於或等於約4℃、10℃、20℃、40℃、60℃、80℃、99℃，或包含及/或跨越前述值之範圍的溶液進行。在一些實施例中，膜系統操作壓力在等於或至少約1巴、10巴、20巴、40巴，或包含及/或跨越前述值之範圍之壓力下進行。在一些實施例中，膜系統操作壓力視系統及膜類型及組成的需要。在一些實施例中，織物及/或篩網過濾器系統操作壓力可在真空下操作(例如在過濾器之濾液側)。 在一些實施例中，過濾步驟及膜系統使用不含或大體上不含重金屬的水。 在一些實施例中，此透濾方法可沖洗不同體積水穿過膜，移除重金屬螯合劑錯合物，直至蛋白質基質中保留所期望重金屬含量。在一些實施例中，透濾水可在上文所陳述範圍內之任何所期望pH下採用，且亦可在透濾起始直至透濾完成間變化。在一些實施例中，透濾水可在上文所陳述範圍內之任何所期望溫度下採用，且亦可在透濾起始直至透濾完成間變化。在一些實施例中，操作壓力可視需要在透濾方法期間之任何時間在上文所陳述範圍內變化。 在一些實施例中，可使用具有與初始螯合劑溶液不同pH之沖洗液自穀物及植物蛋白質沖洗金屬錯合物(例如使用微過濾、超過濾、奈米過濾膜技術，或織物)，以允許截留上述穀物或植物蛋白質，同時允許變更pH的水通過，所述水攜載自所述蛋白質移除之重金屬。在一些實施例中，各種pH位準下之液體沖洗液可混合或相配，以移除可具有隨pH變化之溶解度之各種金屬(或錯合物)。 在一些實施例中，不使用過濾且藉由傾析(例如使用離心傾析器)移除混合物之可溶部分。在一些實施例中，離心可用以自溶液分離不溶部分。在一些實施例中，可使用堆疊盤式離心機及/或離心鬥離心機自溶液(上清液)分離不溶部分。在一些實施例中，將上清液傾倒、泵送或藉由真空自固體部分抽離。 在一些實施例中，本文揭示之螯合劑(或方法)允許使金屬(例如Hg、Pb、Cd、Cr、Sn、Ar)中之一或多者的量(例如重量或莫耳含量)減少至少約50%、75%、90%、99%、99.9%，或包含及/或跨越前述值之範圍。在一些實施例中，本文揭示之螯合劑(或方法)將食品中之金屬中之一或多者的量減少至等於或小於約10 ppm、1 ppm、100 ppb、1 ppb，或包含及/或跨越前述值之範圍。在一些實施例中，將金屬減少至FDA及/或歐洲食品安全局(European Food Safety Authority)發現可接受用於食用的含量。在一些實施例中，舉例而言，Ar減少至等於或小於約125 ppb，Cd減少至等於或小於約250 ppb，Pb減少至等於或小於約125 ppb，Hg減少至等於或小於約29 ppb。 本文所揭示之方法可用於製備具有減少重金屬含量或其中已大體上完全移除重金屬之麥芽糊精及來自稻米(例如白米、糙米等)及碎米(例如破損及不完整之米粒，且其通常在機械研磨米粒之米糠移除步驟期間受損)之稻米蛋白質。在一些實施例中，在生成植物源食品期間可引入金屬螯合劑以移除金屬。在一些實施例中，使用在稻米產品製備期間之特定階段藉由使用洗滌用於移除金屬的方法。在一些實施例中，基於用於移除此等金屬之技術，本文揭示之產品為低過敏性的且可保留其「有機食品」狀態。實例
實例1 稻米測試 為測定各種稻米源中As、Cd、Pb及Hg的量，進行測試。測試結果展示於圖1中。簡言之，數種稻米源(例如來自不同國家、稻米種類、供應商等)中之重金屬的量藉由原子吸收光譜分析(ICP-MS)(方法參考號AOAC: 993.14)量測。另外，如圖1中所示，測試樣品中表徵之其他組分為某些稻米樣品(例如樣品B、樣品C及樣品K至樣品N)之水分及總固體(參見例如樣品B、樣品C及樣品K至樣品N)(強制空氣烘箱130℃)(藉由參考方法AOAC: 926.07、925.10、934.06、969.38、977.21、AACC: 44.15 44.3)，以及總蛋白(杜馬斯(Dumas))(藉由參考方法AOAC: 992.15、AACC: 46-30)、脂肪(重量)(藉由參考方法AOAC:948.15、922.06、925.32、950.54、922.09)、灰分(隔夜)(藉由參考方法AOAC: 923.03)，及纖維含量。所有此等量測使用所指出之參考方法藉由獨立分析型實驗室進行。 針對所進行之金屬減少試驗，使用具有較高重金屬之稻米蛋白質分離物樣品獲得資料且驗證此等技術減少最終處理及乾燥蛋白質粉末中重金屬含量的能力。所有樣品均相對於相同總固體含量校正。由於重金屬含量量測為樣品總重量之十億分率(ppb)且由於乾燥樣品可含有變化量水分，因此為確保所有值可比較，樣品相對於全乾質(bone dry basis)進行校正。如何進行此之實例解釋於下文下一段落中。 假設粉末或稻米樣品#1含有10%水分(90%粉末)且量測值為1000 ppb之重金屬M++
。假設粉末或稻米樣品#2含有13%水分(87%粉末)且量測值亦為1000 ppb之重金屬M++
。若樣品#1相對於全乾質校正，則重金屬含量將藉由1000 ppb乘以100%/90% = 1.111來校正，且校正之重金屬含量將為1000 ppb × 1.111 = 1111 ppb。若樣品#2相對於全乾質校正，則重金屬含量將藉由1000 ppb乘以100%/87% = 1.149來校正，且校正之重金屬含量將為1000 ppb × 1.149 = 1149 ppb。可看出在校正之前，當實際上存在38 ppb差異時，結論將為兩種樣品均含有相同量重金屬。 此資訊用以量測目標稻米蛋白質分離物中重金屬的量作為移除方案的基礎，隨後量測及比較以用不同螯合及洗滌方案處理起始稻米蛋白質分離物來進行量測的各螯合及洗滌方案對減少重金屬的效果。 下表展示由來源之國家/區域分隔開之隨機稻米樣品中存在的各As、Cd、Pb及Hg的平均量(以ppm為單位)。 表1
如所示，在所測試稻米樣品中，平均美國源呈現較高As及Hg含量，而亞洲源呈現較高Cd及Pb含量。基於本文所述之研發用於減少金屬之技術，使特定稻米源經歷針對特定金屬調適之螯合劑技術及/或螯合技術之組合可移除及/或減少金屬含量至適合含量，同時生成保留「有機食品」標識的食品。 實例2 比較用於移除金屬之各種螯合劑及/或方法 本文揭示之實驗使用螯合劑化合物(包含稻米類肽螯合劑、檸檬酸、EDTA等)進行。測試稻米及稻米提取產物(例如蛋白質)中之重金屬含量。確定稻米中天然存在之重金屬可藉由有機金屬配位結合至螯合劑(例如稻米蛋白質肽)，以自例如源自植物之食品之蛋白質提取部分移除及/或減少重金屬。在一些實施例中，在製備稻米產物期間進行之洗滌(例如水洗滌)可用以自源自植物之食品移除重金屬。在一些實施例中，在製備期間進行之洗滌可在各種pH位準下進行，以自源自植物之食品移除特定重金屬。在一些實施例中，使用此等螯合劑(及/或洗滌方法)可以「普遍認為安全」(generally recognized as safe；GRAS)及遵循「有機」之方式進行，以自食品減少及/或大體上移除金屬。在一些實施例中，本文揭示之螯合劑及洗滌方法可用以製備有機產物。在一些實施例中，在製備移除重金屬之產物期間單獨進行水洗滌。 測試概述 稻米類肽螯合劑、檸檬酸及EDTA自稻米產物移除金屬之能力量測為製備蛋白質產物期間沖洗溶液的能力。量測在處理之前及在暴露於螯合劑(及或洗滌溶液)之後蛋白質產物的金屬含量。為測試螯合劑(稻米類肽螯合劑、檸檬酸及EDTA)移除重金屬之能力，將具有較高含量重金屬且在各種pH值下之稻米蛋白質產物分別暴露於各螯合劑。溶液隨後經由離心沖洗以移除螯合劑及重金屬。在使用無螯合劑洗滌之情況下，pH在不添加螯合劑的情況下變化。 實驗程序 稻米類蛋白質螯合劑(例如肽螯合劑)藉由水解Silk 80 AXIOM產品製備。Axiom之Silk 80產品為產生自完整及/或破損白米粒之稻米蛋白質分離物。米粒通常為約7%蛋白質及89%澱粉，且Silk 80產品為已自米粒移出且純化至高位準蛋白質含量之蛋白質。蛋白質分離物以乾物質重量計一般為75%至96%蛋白質純度。其藉由以下製造：經由酶促操作將澱粉部分轉化成較低分子量碳水化合物部分，且隨後經由過濾、傾析或離心移除較低分子量碳水化合物部分，以減少最終分離物中相對於蛋白質之碳水化合物、灰分及脂肪含量。簡言之，稻米類肽螯合劑藉由以下程序製備。將100 g Silk-80(AXIOM蛋白質產品：水分：2.7%；蛋白質81%；脂肪1.2%；灰分＜ 4.5%；纖維：＜ 10%，碳水化合物＜ 13.3%)置放於攪拌器中，且與233 g熱50℃ RO/DI水攪拌，生成300 g溶液(約30%總固體)。向此溶液中添加3.6 g(300 ppm)CaCl2
。向此溶液中添加10% NaOH以將pH變為8.5(+/- 0.1)。向此混合物中添加蛋白質乾重2重量%之Alcalase®(鹼蛋白酶)。溶液在50℃下攪拌4小時。4小時後，將混合物加熱至80-85℃且保持10分鐘以使酶去活化。在10分鐘保持時間後，將混合物冷卻至50℃，隨後將混合物離心，促使固體經由G力自肽溶液分離。傾析含有肽螯合劑之上清液且量測總固體重量。收集上清液用作螯合劑。由稻米蛋白質之此酶水解獲得稀釋肽溶液。過濾此產物且儲存，以供螯合實驗期間使用。 以購自Hawkins化學品供應公司使用食品級檸檬酸螯合劑。以購自Santa Cruze生物技術公司(Santa Cruze Biotechnology, Inc.)使用食品級EDTA螯合劑。 在製備及/或購買螯合劑之後，將具有較高含量重金屬之稻米蛋白質分離產物分別暴露於呈混合物之各螯合劑，且隨後螯合劑經由洗滌自蛋白質產物沖洗，且藉由施加離心回收蛋白質。 針對下文測試中之每一者，由稻米蛋白質分離物粉末(水分：4%；蛋白質(純度)：80.7%；脂肪：3.4%；灰分：＜ 4.5%；纖維：＜ 10%；碳水化合物：＜ 11.4%；重金屬(一式三份分析)：砷(範圍88-114 ppb)：使用101 ppb；鎘：(範圍1199-1418 ppb)：使用1199 ppb；鉛(範圍240-310 ppb)：使用310 ppb；汞(範圍23.4-29.5 ppb)使用29.5 ppb)製備蛋白質之本體溶液。 一般而言針對測試，添加螯合劑(或無螯合劑)，調節pH，且經處理蛋白質與螯合劑溶液攪拌且隨後分離，且測試重金屬含量。簡言之，針對特定螯合劑，將480 g去離子水加熱至50-70℃且攪拌。將120 mL起始稻米蛋白質溶液(具有混雜有高於正常及各種量之不同重金屬的蛋白質的蛋白質混合物)添加至水。由此600 mL溶液採集三個200 g等分試樣。使用10重量% HCl溶液(例如濃縮38% HCl用水稀釋至10重量%)將第一溶液之pH調節至pH 3。使用10重量% HCl溶液將第二溶液之pH調節至pH 6。使用濃縮50% NaOH之10重量%溶液將第三溶液之pH調節至pH 9。針對各螯合劑在三個不同pH值(例如pH 3.0、pH 6.0及pH 9.0)下執行此等程序。用溫度校正pH測定計量測pH。各溶液在70℃溫度下攪拌15分鐘。 為實現螯合劑重金屬減少，向上文所述之pH經調節蛋白質溶液添加足夠螯合劑(肽螯合劑、檸檬酸、EDTA)，得到溶液，其為相對於乾重蛋白質含量之2重量%螯合劑(例如相對於100 g無水植物蛋白質為2 g螯合劑)。混合物在70℃溫度下攪拌15分鐘，此時藉由離心分離固體部分。為實現固體蛋白質部分之分離，樣品使用Perkin Elmer離心機以9,000 RPM離心。在離心3分鐘後，用真空移液管傾析出上清液。藉由添加120 mL水在70℃溫度下重複沖洗方法3次(以重量計4倍沖洗)，離心，且傾析出上清液。可重複離心及傾析步驟直至達成所期望沖洗量。視最終植物蛋白質產物中所期望之最終重金屬量而定，可進行更多或更少離心/沖洗步驟。將最終傾析蛋白質固體置放於容器中，冷凍，經由運載工具隔夜運送至所選擇獨立分析型實驗室，且分析重金屬及固體。隨後使用原子吸收光譜分析測定所得蛋白質固體部分之重金屬含量。亦收集上清液溶液且冷凍用於分析。 為測試水在高溫下(例如70℃溫度下)自植物蛋白質移除重金屬之能力，如上文所述在3、6及9之pH值下製備具有較高含量重金屬之稻米蛋白質產物。執行如用螯合劑之相同程序，但無螯合劑添加至蛋白質部分。攪拌pH經調節水及植物蛋白質混合物，且將所得混合物置入如與上文針對含有螯合劑之混合物所述使用之相同離心及洗滌循環。在一些實施例中，自食品減少某些重金屬可使用水洗滌實現，其中水溫為至少約5℃、10℃、30℃、50℃、70℃、90℃、95℃，或包含及/或跨越前述值之範圍。在一些實施例中，自食品減少某些重金屬可使用水洗滌實現，其中水pH已調節至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，或包含及/或跨越前述值之範圍。 結果 藉由各別HM資料校正所有總固體，以確保來自測試工作之精確分析及結論，因為乾燥固體相對地不具有稀釋重金屬含量之水，而當蛋白質置放於水混合物中時，重金屬經水稀釋，且基於包含水之總質量量測。此將產生比以乾物質重量計存在之重金屬含量低得多的重金屬含量，因此結果相對於所述方法起始時之共用固體濃度進行校正，且重金屬的量與以原始起始溶液固體濃度進行量測的濃度進行比較。此提供處理前及處理後蛋白質混合物之重金屬含量之更精確比較。並非所有樣品為完全相同固體濃度。出於彼原因，由於期望30%總固體之目標初始溶液，所有值均相對於30%固體值進行校正，使得所量測之重金屬結果直接與彼此比較。以下段落提供證明性理論計算。 以全乾質計之起始重金屬粉末具有1000 ppb重金屬M++
。為製備具有30%總固體之任意100 g起始溶液，30公克全乾粉將與70 g水混合。在分析時此樣品現將具有300 ppb重金屬M++
含量。儘管除用水將樣品稀釋至30%溶液以外未對樣品進行任何處理，但此液體樣品之重金屬含量將不再測出為1000 ppm。在處理之後，使過濾系統以30%提供最終液體蛋白質樣品為極難的，且在分析之前乾燥樣品為不可行的。所得最終液體樣品固體將需要調節至原始目標30%，以獲得與起始材料之適當比較。為實現此校正，比如來自分離系統之液體樣品為28%且在28%下量測之重金屬濃度為150 ppb。此150 ppb量測值低於所提供之實際分離，此係因為28%之略微稀釋。因而此150 ppb之液體樣品結果藉由使分析結果乘以30%/28% = 1.0714來相對於30%進行校正。修改之結果現為160.7 ppb，其比所展示之液體分析結果高約7%。若使用150 ppm結果，則其將展示所述方法在移除重金屬方面比實際情況高效7%。此校正值更準確，因此為進行校正的原因。在來自分離方法之液體總固體高於30%之情況下相反為正確的。亦將需要藉由使用相同校正方法校正彼值，以避免若結果未進行校正，則少計算用於移除重金屬之方法的成效。貫穿所有測試使用此相同技術以確保針對所有樣品報導之重金屬為可比較的。 目標重金屬含量等於或低於125 ppb Ar、250 ppb CD、125 ppb Pb及29 ppb Hg。自上文所述之各實驗收集之資料展示於表2中。 表2.
圖2A提供在三個不同pH值中之每一者下使用各螯合劑的重金屬總減少%概觀。如圖2A中所示，所有測試之螯合劑將所測試之所有重金屬減少大於75%。如所示，一些螯合劑將含量減少大於或等於95%(例如pH 3下之檸檬酸、pH 6下之EDTA及pH 3下之肽)。值得注意的是，使用熱水用於減少重金屬之程序亦將重金屬含量減少大於或等於95%。在所有情況下可達成低於最大可允許含量之含量。因此，實現移除重金屬之有機方案。 圖2B展示pH 3下重金屬之減少。如圖2B中所示，在一些實施例中，肽螯合劑在pH 3下可將As含量自約134 ppb減少至約15 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 3下可將As含量自約134 ppb減少至約13 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 3下可將As含量減少等於或至少約85%或約95%。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 3下可將Cd含量自約1199 ppb減少至約20 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 3下可將Cd含量自約1592 ppb減少至約19 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑可將Cd含量減少等於或至少約85%或約99%。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 3下可將Pb含量自約310 ppb減少至約79 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 3下可將Pb含量自約412 ppb減少至約56 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 3下可將Pb含量減少等於或至少約75%或約85%。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 3下可將Hg含量自約29.5 ppb減少至約8.7 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 3下可將Hg含量自約39.2 ppb減少至約8.2 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 3下可將Hg含量減少等於或至少約70%或約80%。 如圖2B中所示，在一些實施例中，檸檬酸在pH 3下可將As含量自約101 ppb減少至約12 ppb。在一些實施例中，檸檬酸在pH 3下可將As含量自約134 ppb減少至約11 ppb。在一些實施例中，檸檬酸在pH 3下可將As含量減少等於或至少約85%或約90%。在一些實施例中，檸檬酸在pH 3下可將Cd含量自約1199 ppb減少至約12 ppb。在一些實施例中，檸檬酸在pH 3下可將Cd含量自約1592 ppb減少至約11 ppb。在一些實施例中，檸檬酸在pH 3下可將Cd含量減少等於或至少約98%或約99%。在一些實施例中，檸檬酸在pH 3下可將Pb含量自約310 ppb減少至約80 ppb。在一些實施例中，檸檬酸在pH 3下可將Pb含量自約412 ppb減少至約73 ppb。在一些實施例中，檸檬酸在pH 3下可將Pb含量減少等於或至少約75%或約83%。在一些實施例中，檸檬酸在pH 3下可將Hg含量自約29.5 ppb減少至約9.2 ppb。在一些實施例中，檸檬酸在pH 3下可將Hg含量自約39.2 ppb減少至約8.4 ppb。在一些實施例中，檸檬酸在pH 3下可將Hg含量減少等於或至少約70%或約80%。 如圖2B中所示，在一些實施例中，EDTA在pH 3下可將As含量自約101 ppb減少至約12 ppb。在一些實施例中，EDTA在pH 3下可將As含量自約134 ppb減少至約16 ppb。在一些實施例中，EDTA在pH 3下可將As含量減少等於或至少約85%或約90%。在一些實施例中，EDTA在pH 3下可將Cd含量自約1199 ppb減少至約232 ppb。在一些實施例中，EDTA在pH 3下可將Cd含量自約1592 ppb減少至約232 ppb。在一些實施例中，EDTA在pH 3下可將Cd含量減少等於或至少約80%或約85%。在一些實施例中，EDTA在pH 3下可將Pb含量自約310 ppb減少至約63 ppb。在一些實施例中，EDTA在pH 3下可將Pb含量自約412 ppb減少至約66 ppb。在一些實施例中，EDTA在pH 3下可將Pb含量減少等於或至少約80%或約85%。在一些實施例中，EDTA在pH 3下可將Hg含量自約29.5 ppb減少至約8.4 ppb。在一些實施例中，EDTA在pH 3下可將Hg含量自約39.2 ppb減少至約8.2 ppb。在一些實施例中，EDTA在pH 3下可將Hg含量減少等於或至少約70%或約80%。 如圖2B中所示，在一些實施例中，在至少約70℃溫度下之水洗滌在pH 3下可將As含量自約101 ppb減少至約10 ppb。在一些實施例中，水在pH 3下可將As含量自約134 ppb減少至約10 ppb。在一些實施例中，水在pH 3下可將As含量減少等於或至少約90%或約95%。在一些實施例中，水在pH 3下可將Cd含量自約1199 ppb減少至約10 ppb。在一些實施例中，水在pH 3下可將Cd含量自約1592 ppb減少至約10 ppb。在一些實施例中，水在pH 3下可將Cd含量減少等於或至少約98%或約99%。在一些實施例中，水在pH 3下可將Pb含量自約310 ppb減少至約83 ppb。在一些實施例中，水在pH 3下可將Pb含量自約412 ppb減少至約85 ppb。在一些實施例中，水在pH 3下可將Pb含量減少等於或至少約70%或約75%。在一些實施例中，水在pH 3下可將Hg含量自約29.5 ppb減少至約7.5 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 3下可將Hg含量自約39.2 ppb減少至約7.7 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 3下可將Hg含量減少等於或至少約70%或約80%。 pH 3.0條件結論：對於所有測試之HM，所有螯合劑提供幾乎相同移除含量；自蛋白質樣品移除85%至95%之間的HM含量；鉛保持於最高濃度，對於所有螯合劑鉛濃度亦約相同；對於EDTA螯合劑，鎘移除中存在顯著降低；對於總HM移除，pH 3.0下之熱水為用於移除重金屬之良好技術。 圖2C展示pH 6下重金屬之減少。如圖2C中所示，在一些實施例中，肽螯合劑在pH 6下可將As含量自約101 ppb減少至約23 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 6下可將As含量自約134 ppb減少至約23 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 6下可將As含量減少等於或至少約85%或約90%。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 6下可將Cd含量自約1199 ppb減少至約216 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 6下可將Cd含量自約1592 ppb減少至約196 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 6下可將Cd含量減少等於或至少約80%或約85%。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 6下可將Pb含量自約310 ppb減少至約78 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 6下可將Pb含量自約412 ppb減少至約71 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 6下可將Pb含量減少等於或至少約80%或約85%。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 6下可將Hg含量自約29.5 ppb減少至約8.9 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 6下可將Hg含量自約39.2 ppb減少至約8.1 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 6下可將Hg含量減少等於或至少約70%或約80%。 如圖2C中所示，在一些實施例中，檸檬酸在pH 6下可將As含量自約101 ppb減少至約18 ppb。在一些實施例中，檸檬酸在pH 6下可將As含量自約134 ppb減少至約16 ppb。在一些實施例中，檸檬酸在pH 6下可將As含量減少等於或至少約80%或約90%。在一些實施例中，檸檬酸在pH 6下可將Cd含量自約1199 ppb減少至約194 ppb。在一些實施例中，檸檬酸在pH 6下可將Cd含量自約1592 ppb減少至約171 ppb。在一些實施例中，檸檬酸在pH 6下可將Cd含量減少等於或至少約80%或約85%。在一些實施例中，檸檬酸在pH 6下可將Pb含量自約310 ppb減少至約75 ppb。在一些實施例中，檸檬酸在pH 6下可將Pb含量自約412 ppb減少至約66 ppb。在一些實施例中，檸檬酸在pH 6下可將Pb含量減少等於或至少約75%或約83%。在一些實施例中，檸檬酸在pH 6下可將Hg含量自約29.5 ppb減少至約9.3 ppb。在一些實施例中，檸檬酸在pH 6下可將Hg含量自約39.2 ppb減少至約8.2 ppb。在一些實施例中，檸檬酸在pH 6下可將Hg含量減少等於或至少約70%或約80%。 如圖2C中所示，在一些實施例中，EDTA在pH 6下可將As含量自約101 ppb減少至約18 ppb。在一些實施例中，EDTA在pH 6下可將As含量自約134 ppb減少至約17 ppb。在一些實施例中，EDTA在pH 6下可將As含量減少等於或至少約85%或約90%。在一些實施例中，EDTA在pH 6下可將Cd含量自約1199 ppb減少至約57 ppb。在一些實施例中，EDTA在pH 6下可將Cd含量自約1592 ppb減少至約53 ppb。在一些實施例中，EDTA在pH 6下可將Cd含量減少等於或至少約95%或約97%。在一些實施例中，EDTA在pH 6下可將Pb含量自約310 ppb減少至約31 ppb。在一些實施例中，EDTA在pH 6下可將Pb含量自約412 ppb減少至約27 ppb。在一些實施例中，EDTA在pH 6下可將Pb含量減少等於或至少約85%或約95%。在一些實施例中，EDTA在pH 6下可將Hg含量自約29.5 ppb減少至約9.2 ppb。在一些實施例中，EDTA在pH 6下可將Hg含量自約39.2 ppb減少至約8.5 ppb。在一些實施例中，EDTA在pH 6下可將Hg含量減少等於或至少約70%或約80%。 如圖2C中所示，在一些實施例中，在至少約70℃溫度下之水洗滌在pH 6下可將As含量自約101 ppb減少至約11 ppb。在一些實施例中，水在pH 6下可將As含量自約134 ppb減少至約12 ppb。在一些實施例中，水在pH 6下可將As含量減少等於或至少約90%或約95%。在一些實施例中，水在pH 6下可將Cd含量自約1199 ppb減少至約299 ppb。在一些實施例中，水在pH 6下可將Cd含量自約1592 ppb減少至約313 ppb。在一些實施例中，水在pH 6下可將Cd含量減少等於或至少約75%或約80%。在一些實施例中，水在pH 6下可將Pb含量自約310 ppb減少至約83 ppb。在一些實施例中，水在pH 6下可將Pb含量自約412 ppb減少至約87 ppb。在一些實施例中，水在pH 6下可將Pb含量減少等於或至少約70%或約75%。在一些實施例中，水在pH 6下可將Hg含量自約29.5 ppb減少至約7.9 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 6下可將Hg含量自約39.2 ppb減少至約8.3 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 6下可將Hg含量減少等於或至少約70%或約80%。 pH 6.0下之結果展示砷經由EDTA減少最多。砷及汞在所有螯合劑情況下均移除至約相同含量。鎘，及在較小程度上鉛，在此pH條件下經由EDTA最有效移除。 圖2D展示pH 9下重金屬之減少。如圖2D中所示，在一些實施例中，肽螯合劑在pH 9下可將As含量自約101 ppb減少至約23 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 9下可將As含量自約134 ppb減少至約24 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 9下可將As含量減少等於或至少約85%或約90%。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 9下可將Cd含量自約1199 ppb減少至約379 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 9下可將Cd含量自約1592 ppb減少至約349 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 9下可將Cd含量減少等於或至少約70%或約75%。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 9下可將Pb含量自約310 ppb減少至約87 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 9下可將Pb含量自約412 ppb減少至約80 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 9下可將Pb含量減少等於或至少約70%或約80%。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 9下可將Hg含量自約29.5 ppb減少至約9.1 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 9下可將Hg含量自約39.2 ppb減少至約8.4 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 9下可將Hg含量減少等於或至少約70%或約80%。 如圖2D中所示，在一些實施例中，檸檬酸在pH 9下可將As含量自約101 ppb減少至約14 ppb。在一些實施例中，檸檬酸在pH 9下可將As含量自約134 ppb減少至約13 ppb。在一些實施例中，檸檬酸在pH 9下可將As含量減少等於或至少約85%或約90%。在一些實施例中，檸檬酸在pH 9下可將Cd含量自約1199 ppb減少至約269 ppb。在一些實施例中，檸檬酸在pH 9下可將Cd含量自約1592 ppb減少至約252 ppb。在一些實施例中，檸檬酸在pH 9下可將Cd含量減少等於或至少約75%或約85%。在一些實施例中，檸檬酸在pH 9下可將Pb含量自約310 ppb減少至約60 ppb。在一些實施例中，檸檬酸在pH 9下可將Pb含量自約412 ppb減少至約56 ppb。在一些實施例中，檸檬酸在pH 9下可將Pb含量減少等於或至少約80%或約85%。在一些實施例中，檸檬酸在pH 9下可將Hg含量自約29.5 ppb減少至約8.7 ppb。在一些實施例中，檸檬酸在pH 9下可將Hg含量自約39.2 ppb減少至約8.2 ppb。在一些實施例中，檸檬酸在pH 9下可將Hg含量減少等於或至少約70%或約80%。 如圖2D中所示，在一些實施例中，EDTA在pH 9下可將As含量自約101 ppb減少至約20 ppb。在一些實施例中，EDTA在pH 9下可將As含量自約134 ppb減少至約20 ppb。在一些實施例中，EDTA在pH 9下可將As含量減少等於或至少約80%或約90%。在一些實施例中，EDTA在pH 9下可將Cd含量自約1199 ppb減少至約76 ppb。在一些實施例中，EDTA在pH 9下可將Cd含量自約1592 ppb減少至約76 ppb。在一些實施例中，EDTA在pH 9下可將Cd含量減少等於或至少約90%或約95%。在一些實施例中，EDTA在pH 9下可將Pb含量自約310 ppb減少至約40 ppb。在一些實施例中，EDTA在pH 9下可將Pb含量自約412 ppb減少至約40 ppb。在一些實施例中，EDTA在pH 9下可將Pb含量減少等於或至少約85%或約90%。在一些實施例中，EDTA在pH 9下可將Hg含量自約29.5 ppb減少至約8.9 ppb。在一些實施例中，EDTA在pH 9下可將Hg含量自約39.2 ppb減少至約8.8 ppb。在一些實施例中，EDTA在pH 9下可將Hg含量減少等於或至少約70%或約80%。 如圖2D中所示，在一些實施例中，在至少約70℃溫度下之水洗滌在pH 9下可將As含量自約101 ppb減少至約15 ppb。在一些實施例中，水在pH 9下可將As含量自約134 ppb減少至約15 ppb。在一些實施例中，水在pH 9下可將As含量減少等於或至少約85%或約90%。在一些實施例中，水在pH 9下可將Cd含量自約1199 ppb減少至約366 ppb。在一些實施例中，水在pH 9下可將Cd含量自約1592 ppb減少至約374 ppb。在一些實施例中，水在pH 9下可將Cd含量減少等於或至少約70%或約80%。在一些實施例中，水在pH 9下可將Pb含量自約310 ppb減少至約74 ppb。在一些實施例中，水在pH 9下可將Pb含量自約412 ppb減少至約76 ppb。在一些實施例中，水在pH 9下可將Pb含量減少等於或至少約75%或約80%。在一些實施例中，水在pH 9下可將Hg含量自約29.5 ppb減少至約7.9 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 9下可將Hg含量自約39.2 ppb減少至約8.1 ppb。在一些實施例中，肽螯合劑在pH 9下可將Hg含量減少等於或至少約70%或約80%。 圖2E-圖2H以虛線展示可接受金屬含量。如圖2E-圖2H中所示，對於幾乎所有金屬且對於幾乎所有螯合劑及洗滌程序，重金屬含量減少至可接受含量。如圖2A-圖2H中所示，改變提取pH對移除效率產生影響，且最有效pH對於所有測試之HM成分或所有螯合劑而言並不相同。 如圖2E中所示，砷在較低pH 3.0下經由所有螯合劑移除。所有螯合劑及條件實現顯著低於所需最小值之位準。如圖2F中所示，在pH 3.0下，水、檸檬酸及肽有效。鎘在pH 6.0下經由EDTA有效移除。各測試生成低於目標最小含量之產物。水、檸檬酸及肽在pH 3.0下有效。EDTA在pH 6及pH 9位準下起作用，但在較低pH範圍內不如水、檸檬酸及肽一樣好。如圖2G中所示，EDTA移除鉛至少與其他螯合劑一樣好，且在pH 6.0下最有效。所有螯合劑及條件實現低於最小金屬含量之含量。如圖2H中所示，汞經由低pH水，隨後檸檬酸移除。EDTA尤其在更加鹼性條件下最不有效。您可看出吾等需要在產物中達成低於目標最小含量之汞含量。所有螯合劑及條件實現低於最小金屬含量之含量。 圖2I-圖2L展示來自表2之經調節重金屬之資料。 實驗室測試展示蛋白質及重金屬實體可藉由使用傾析離心機分離。微過濾(「MF」)及/或超過濾(「UF」)膜可替代離心機使用。大規模測試工作展示離心機及傾析器可用以自混合物分離稻米蛋白質分離物，且分離出之所得稻米蛋白質分離物濾餅可再懸浮於熱水中且用傾析器或離心機再次分離。洗滌螯合劑以及來自稻米蛋白質分離物之螯合之重金屬、脂肪、灰分、肽及胺基酸所需之洗滌水的量在經重金屬污染的植物蛋白質混合物起始質量的4倍至10倍範圍之間變化。 測試工作展示除離心機及傾析器以外，亦可成功應用其他分離技術自低分子量碳水化合物部分、灰分、脂肪、肽片段及胺基酸分離蛋白質分離物。除傾析器及離心機以外亦可用以進行自螯合劑及螯合之重金屬分離稻米蛋白質分離物之技術描述如下。可採用微過濾(MF)及超過濾(UF)交叉流動膜技術以及極具選擇性之孔隙尺寸膜獲得自蛋白質分離物之極精確分離。具有1,000道爾頓至800,000道爾頓分子截留範圍之UF膜將藉由高溫水穿過膜來允許螯合劑自稻米蛋白質混合物透濾(洗滌)出，同時截留稻米蛋白質混合物，允許含有螯合之重金屬之螯合劑自重金屬減少蛋白質分離物的所期望分離。測試展現有效洗出螯合劑及重金屬所需之透濾水的量在經重金屬污染的蛋白質混合物起始質量的4倍至10倍範圍之間變化。歸因於膜之極高度受控孔隙尺寸，由此技術之應用可實現高蛋白質分離物產率。 具有各種設計之壓濾機可用以自混合物過濾稻米蛋白質分離物，且隨後可用各種量之高溫水當場洗滌所得濾餅以再次自稻米蛋白質分離物混合物洗滌螯合劑及螯合之重金屬。洗滌體積同樣可在經重金屬污染的蛋白質混合物起始質量的2倍與10倍之間的範圍內。在此技術情況下蛋白質產率可略微較低，因為一部分蛋白質可穿過所用之過濾器介質。 旋轉式真空過濾鼓可用以自混合物過濾稻米蛋白質分離物，且隨後所得濾餅可當場洗滌，或稻米蛋白質濾餅可再懸浮且用各種量之熱水再過濾，以再次自稻米蛋白質分離物混合物洗滌螯合劑及螯合之重金屬。洗滌體積同樣可在經重金屬污染的蛋白質混合物起始質量的2倍與10倍之間的範圍內。正如壓濾機技術之情況，已使用旋轉式真空過濾鼓且已展示提供略微低於膜技術情況下的蛋白質產率。 應注意此等方案可用於在製造期間減少產物中之HM，及/或修復預先生成之蛋白質產物中的HM含量。 實例3 介紹及目標 具有重金屬污染物之稻米蛋白質樣品用以進行以下重金屬修復測試。此測試用以證實在一些實施例中，使用本文揭示之程序，使用無螯合劑之洗滌方法可移除一些重金屬。簡言之，將固定數量之粉末蛋白質添加至固定量之pH經調節DI水。蛋白質分離物水混合物調節至如圖3A-圖3H中所示之pH值3、4、5或6。使用稀釋10重量%濃縮38% HCl溶液且藉由使用溫度校正pH測定計量測pH來調節pH。在調節pH後，在約70℃下攪拌混合物5分鐘。隨後使溶液在70℃之溫度受控熱水浴中靜置15至20分鐘。蛋白質分離物混合物隨後以9000 RPM離心3分鐘。隨後提取上清液。視洗滌方法而定，如圖3A-圖3H中所示，稀釋及濃縮程序可重複。提供起始樣品、2倍洗滌樣品、4倍洗滌樣品及6倍洗滌樣品用於分析目標重金屬砷(Ar)、鎘(Cd)、汞(Hg)及鉛(Pb)。 資料： 隨附為圖3A-圖3H為展示資料及所進行之洗滌的圖。如可在一部分分析結果中所見，在一些情況下金屬含量增加。不受特定理論限制，此可歸因於在傾析期間一部分肽/蛋白質產物與可溶部分一起溶解及移除，而未溶解移除相同數量的重金屬。 表3及表4含有獲自所揭示之測試程序之分析結果的原始資料。 表3.
表4.
結果： 砷(Ar)： 使用水使砷重金屬減少之結果展示於圖3A-圖3B中。試驗指示pH 3及pH 4為用於處理及進一步砷之目標pH位準。在2倍洗滌後，pH 5樣品之砷高於進料。各種pH位準下之酸洗滌能夠減少砷含量。 鎘(Cd)： 鎘重金屬修復工作之結果展示於圖3C-圖3D中。起始樣品蛋白質具有高於最大允許目標含量之大量鎘。鎘含量在所有洗滌之情況下均減少，且更加酸性pH 3洗滌提供最大減少。在pH 3下3倍洗滌後，樣品處於鎘之目標規範下。在pH 4溶液之情況下亦減少鎘，但相比於pH 3溶液，需要額外沖洗體積。 汞(Hg)： 汞重金屬修復工作之結果展示於圖3E-圖3F中。在幾乎每一樣品中，相比於起始，在測試沖洗結束時存在更多HgpH 5樣品展示顯著減少。 鉛(Pb)： 鉛重金屬修復工作之結果展示於圖3G-圖3H中。鉛分析再次展示與起始材料相比，6倍洗滌中存在更多鉛。pH 5洗滌直接展示與起始材料相比具有更多鉛，但在2倍洗滌時其他pH位準展示離心蛋白質質量的鉛含量減少約10%-20%。樣品中無一者展示將鉛減少至低於目標最大含量。 測試觀測： 注意到更多酸性沖洗自蛋白質移除更多重金屬砷及鎘。鎘及砷含量兩者藉由低pH處理減少至低於最大允許食品標準含量。在汞上觀測到極小影響，但起始汞含量低於所允許之最大目標，因此所有樣品通過汞含量標準。可獲得資料之pH位準及洗滌含量中無一者將鉛減少至低於最大標準。此關於鉛之結果可歸因於鉛具有兩性化作用，意謂其在高及低pH範圍下均具有反應性且可溶。 實例4 肽螯合劑之合成及特徵化 稻米類肽螯合劑藉由以下程序製備。將100 g Silk-80(AXIOM蛋白質產品：水分：2.7%；蛋白質81%；脂肪1.2%；灰分＜ 4.5%；纖維：＜ 10%，碳水化合物＜ 13.3%)置放於攪拌器中，且與233 g熱50℃ RO/DI水攪拌，生成300 g溶液(約30%總固體)。向此溶液中添加3.6 g(300 ppm)CaCl2
。向此溶液中添加10% NaOH以將pH變為8.5(+/- 0.1)。向此混合物中添加蛋白質乾重2重量%之Alcalase®(鹼蛋白酶)。溶液在50℃下攪拌2小時，此時移出等分試樣且淬滅(使用下文描述之程序)以產生第一肽螯合劑樣品(K-1)。溶液在50℃下攪拌另外2小時(總共4小時)，此時移出第二等分試樣且淬滅(使用下文描述之程序)以產生第二肽螯合劑樣品(K-2)。溶液在50℃下攪拌另外2小時(總共6小時)，此時使溶液淬滅(使用下文描述之程序)以產生第三肽螯合劑樣品(K-3)。 為進行淬滅，將混合物加熱至80-85℃且保持10分鐘以使酶去活化。在10分鐘保持時間後，將混合物冷卻至50℃，隨後將混合物離心，促使固體經由G力自肽溶液分離。傾析含有肽螯合劑之上清液且量測總固體重量。收集上清液用作螯合劑。由稻米蛋白質之此酶水解獲得稀釋肽溶液。過濾此產物且儲存，以供螯合實驗期間使用。 圖4A展示聚丙烯醯胺凝膠電泳(「PAGE」)肽分離之結果。PAGE分析使用以下特性：當在整個凝膠中施加電場時，視電荷之獨特量及蛋白質及肽實體之分子量而定，蛋白質及肽以不同速率遷移穿過聚丙烯醯胺凝膠。電荷差異由特定蛋白質可具有之不同荷電的官能基導致。PAGE分析藉由Kendrick實驗室公司(Kendrick Laboratories, Inc.)進行，其為位於1202 Ann St., Madison, WI 53713(800-462-3417)之獨立分析型實驗室。用於製備此PAGE之方法如下： 稱量樣品，溶解於無還原劑之SDS樣品緩衝液中，且在沸水浴中加熱5分鐘。冷卻樣品，短暫離心，且隨後使用BCA分析測定上清液之蛋白質濃度(Smith等人Anal. Biochem. 150:
76-85, 1985，及Pierce化學公司(Pierce Chemical Co.)，伊利諾伊州羅克福德(Rockford, IL))。在BCA後，在具有含2.3%十二烷基硫酸鈉(SDS)、10%甘油、50 mM二硫蘇糖醇及63 mM三羥甲基胺基甲烷之還原劑的pH 6.8的樣品緩衝液中製備樣品。在添加緩衝液後，樣品在沸水浴中加熱5分鐘。樣品經短暫離心且上清液裝載於凝膠上。 使用16.5%丙烯醯胺肽平板凝膠(Shagger, H.及Jagow, G. Anal. Biochem. 166:368, 1987)(0.75 mm厚)進行SDS平板凝膠電泳。如對於肽分離，SDS平板凝膠電泳在前四小時始於15 毫安/凝膠，且隨後以12毫安/凝膠進行隔夜。在溴酚藍前端已遷移至平板凝膠末端時停止平板凝膠。在完成平板凝膠後，用庫馬斯藍(Coomassie blue)染料使凝膠染色，在10%乙酸中脫色直至獲得透明背景，且在塞璐芬薄片之間乾燥。 添加以下蛋白質(西格瑪化學公司(Sigma Chemical Co.)，密蘇里州聖路易斯(St. Louis, MO)及EMD密理博(EMD Millipore)，馬薩諸塞州比勒利卡(Billerica, MA))作為分子量標準品：磷酸化酶A(94,000)、過氧化氫酶(60,000)、肌動蛋白(43,000)、碳酸酐酶(29,000)、溶菌酶(14,000)、肌紅蛋白(I + III，56-153)(10,600)、肌紅蛋白(I，56-131)(8,160)、肌紅蛋白(II 1-55)(6,210)、升糖素(3,480)及肌紅蛋白(III，132-153)(2,510)。 經染色凝膠使用經校準GE Healthcare影像掃描儀III在適當光密度範圍內數位化。藉由Windows 7兼容電腦使用Phoretix 1D軟體(11.2版)及一階拉格朗日(lagrange)分子量曲線由分子量標準品計算分子量。 藉由具有充分特性化分子量之蛋白質及肽標準品進行PAGE工作，以比較用於分析之所供應肽樣品的分子量。具有一式兩份軌跡之實際凝膠板影像之相片複本展示於圖4A上。表5展示軌跡(色帶)數及各別軌跡上之樣品。表6以樣品重量之百分比展示總蛋白結果。此表提供關於經歷PAGE程序之樣品之相對蛋白質濃度的細節。用於PAGE方案中之相對蛋白質濃度在所測試之各種蛋白質/肽部分之間在459至1109 µg/L間變化。如可所見，原料批次具有最高蛋白質%。此可解釋為何軌跡4及軌跡5比其他軌跡更暗。較稀溶液將具有彼等兩個軌跡之減小的光密度。然而，樣品處於良好比較峰為可能的範圍內。使用如上所陳述之BCA分析型方案相對於蛋白質標準品量測蛋白質濃度。BCA採用蛋白質結合染料及UV吸收技術針對各軌跡測定蛋白質濃度。50 µg之各蛋白質樣品置放於各軌跡上用於PAGE發展。 表5. 加載凝膠SC p.26 #2之關鍵。
表6. 呈樣品重量之百分比形式之總蛋白結果。
已知標準品在圖4A之極左側，其中選擇高分子量標準品在軌跡1中，且選擇低分子量標準品在軌跡2中。緩衝液標準品在軌跡3中運行，且帶或峰上所展示表明緩衝液載體未干擾其他PAGE軌跡中之蛋白質/肽染色。起始蛋白質材料展示於一式兩份之深藍色軌跡中，緊鄰軌跡4及軌跡5中之標準品，以提供蛋白酶活性之前及之後的比較。隨後之軌跡展示一式兩份之肽部分，其在蛋白酶活性下保持2小時(軌跡6及軌跡7)、4小時(軌跡8及軌跡9)及6小時(軌跡10及軌跡11)暴露時間，直至在85℃下加熱10分鐘使蛋白酶去活化。進行2小時蛋白酶暴露時間之第二回合，且此樣品經由濾紙過濾。經過濾肽之PAGE結果展示於軌跡12及軌跡13中。過濾肽溶液以查看其是否影響PAGE帶發展。藉由過濾樣品限定之PAGE某種程度上的確呈現較好。軌跡15為高及低分子量標準品兩者之組合，再次用於參考。 同一凝膠軌跡板展示於PAGE BAND INDENTIFICATION IMAGE上，其中軌跡經標記以便較容易鑑定。此等軌跡可用作本文所述之光學掃描上所展示之峰的參考。 藉由使用光學掃描裝置以不同方式再次展示凝膠軌跡，以提供對凝膠帶之更詳細查看(圖4B-圖4F)。選擇及提供各別軌跡中之每一者的一個掃描以較好展示肽帶(注意凝膠板撕裂兩個板上之一部分軌跡，因此此處包含各重複板之最佳掃描以消除所述問題及撕裂輕微變形。注意掃描圖頂部之數字對應於凝膠板上之較富集帶。肽及蛋白質峰之分子量以對數規模展示於掃描圖底部用於參考。簡言之，圖4B-圖4F為展示來自圖4A PAGE凝膠板之軌跡之分子量分佈的掃描。圖4B為色帶4樣品：K-5原料批次號HZN16003E。圖4C為色帶6樣品：K-1酶保持2小時。圖4D為色帶8樣品：K-2酶保持4小時。圖4E為色帶11樣品：K-3酶保持6小時。圖4F為色帶13樣品：I-F經過濾批次號WRP34316。 圖4B為來自軌跡4之未處理進料材料之掃描。注意到高分子量區域中之重帶(例如經展示為峰)在經蛋白酶暴露樣品軌跡中下降。注意到峰1與其他峰相比之相對高度，且存在組分減少，低於來自峰1之分子量至在3,000分子量標記處幾乎為無。圖4C為肽溶液暴露於蛋白酶2小時之軌跡6之掃描。注意到大部分高於20,000分子量帶之蛋白質以減少量存在，而較低分子量肽峰的量相對於大分子量峰較高(表明生成較短鏈肽)。亦注意到低於峰4存在新材料，其現於峰5處具有帶，其不存在於未處理之原料材料中(圖4B中所示)。此等峰偏移指示生成肽。圖4D為軌跡8掃描，且展示暴露於蛋白酶處理4小時之後的起始蛋白質溶液。注意到在較低分子量區域存在更多肽吸光度，其中與圖4B及圖4C相比形成一些額外低分子量峰。圖4B中缺失之峰5之高度幾乎與圖4C中的峰4高度相同。圖4E展示在暴露於蛋白酶處理6小時之後的軌跡11掃描。注意到較低分子量峰之相對高度相對於較高分子量峰富集。峰1、峰2及峰3與峰4具有類似高度，表明隨時間連續生成較低分子量肽。圖4F展示經過濾之2小時蛋白酶暴露蛋白酶處理溶液的軌跡13。過濾可已移除一些顆粒，得到略微更加限定之PAGE掃描。超過濾可用於分離肽螯合劑，較佳地選擇帶，且濃縮肽用於進一步用於本文所述之螯合方法中。由此資料預期蛋白質分解成較低分子量肽片段將產生更多抓住及固持於重金屬離子上的分子，用於自稻米蛋白質分離物混合物移除重金屬離子。 圖4C中之結果表明K-1稻米蛋白質水解產物(例如肽螯合劑)含有至少肽範圍在約21 kD下至約1,000 kD的混合物，且在溶液中具有範圍為約21 kD至約19 kD、約16 kD至約14 kD、約13 kD至約12.5 kD、約11.5 kD至約10.5 kD及約4 kD至約2 kD的明顯帶。最大量的肽(標註為圖4C中的帶1、2及3)具有約20.5 kD、約15 kD及約12.7 kD的分子量，如所示。圖4D中之結果表明K-2稻米蛋白質水解產物(例如肽螯合劑)在溶液中含有至少範圍在約21 kD至約19 kD、約16 kD至約14 kD、約13.5 kD至約12.5 kD、約11.5 kD至約10.5 kD及約4 kD至約2 kD的帶。最大量的肽(標註為圖4D中的帶1、2及3)具有約20.5 kD、約15 kD及約12.7 kD的分子量，如所示。圖4E中之結果表明K-3稻米蛋白質水解產物(例如肽螯合劑)在溶液中含有至少範圍在約21 kD至約19 kD、約16 kD至約14 kD、約13.5 kD至約12.5 kD、約11.5 kD至約10.5 kD及約4 kD至約2 kD的帶。最大量的肽(標註為圖4E中的帶1、2、3及4)具有約20.5 kD、約15 kD、約12.7 kD及約11 kD的分子量，如所示。 上述描述提供情境及實例，但不應解釋為限制由本說明書隨後之申請專利範圍，或在任何其他主張此說明書優先權的專利中的申請專利範圍覆蓋的本發明的範疇。無單個組分或組分的集合為必需的或必不可少的。舉例而言，一些實施例可能不包含流體改質劑。在本說明書中之任何實施例中描述及/或說明之任何特徵、結構、組分、材料、步驟或方法可與本說明書中的任何其他實施例中描述及/或說明的任何特徵、結構、組分、材料、步驟或方法一起使用或替代其使用。 已揭示若干說明性實施例。儘管已關於某些說明性實施例及用途描述本發明，但其他實施例及其他用途，包含未提供全部本文所闡述的特徵及優勢的實施例及用途，亦在本發明的範疇內。組分、要素、特徵、動作或步驟可與所描述不同地配置或進行，且在各種實施例中可組合、合併、添加或省略組分、要素、特徵、動作或步驟。本文所述之要素及組分之所有可能組合及子組合意欲包含於本發明中。無單個特徵或特徵的組為必需的或必不可少的。 總之，已揭示螯合劑之各種實施例及實例，及減少金屬之方法。本發明除特定揭示之實施例及實例以外延伸至其他替代實施例及/或實施例之其他用途，以及其某些修改及等效者。此外，本發明明確涵蓋所揭示實施例之各種特徵及態樣可與彼此組合或相互替代。因此，本發明之範疇不應由上文所述之特定所揭示實施例限制，但應僅由合理閱讀申請專利範圍來確定。
圖1描繪量化各種稻米類型及來自各種源之稻米中金屬含量的資料。 圖2A提供在不同pH值下使用各種螯合劑或水自蛋白質混合物減少的重金屬總%的概觀。 圖2B描繪在pH 3下使用各種螯合劑或水自蛋白質混合物減少重金屬的結果。 圖2C描繪在pH 6下使用各種螯合劑或水自蛋白質混合物減少重金屬的結果。 圖2D描繪在pH 9下使用各種螯合劑或水自蛋白質混合物減少重金屬的結果。 圖2E描繪在不同pH值下使用各種螯合劑或水自蛋白質混合物減少砷的結果。 圖2F描繪在不同pH值下使用各種螯合劑或水自蛋白質混合物減少鎘的結果。 圖2G描繪在不同pH值下使用各種螯合劑或水自蛋白質混合物減少鉛的結果。 圖2H描繪在不同pH值下使用各種螯合劑或水自蛋白質混合物減少汞的結果。 圖2I描繪在不同pH值下使用各種螯合劑或水自蛋白質混合物減少砷的結果。 圖2J描繪在不同pH值下使用各種螯合劑或水自蛋白質混合物減少鎘的結果。 圖2K描繪在不同pH值下使用各種螯合劑或水自蛋白質混合物減少鉛的結果。 圖2L描繪在不同pH值下使用各種螯合劑或水自蛋白質混合物減少汞的結果。 圖3A-圖3B描繪在不同pH值下水沖洗以自蛋白質混合物移除砷的結果。 圖3C-圖3D描繪在不同pH值下水沖洗以自蛋白質混合物移除鎘的結果。 圖3E-圖3F描繪在不同pH值下水沖洗以自蛋白質混合物移除汞的結果。 圖3G-圖3H描繪在不同pH值下水沖洗以自蛋白質混合物移除鉛的結果。 圖4A為聚丙烯醯胺凝膠電泳(「PAGE」)肽分離凝膠(庫馬斯藍(coomassie blue)染色)之影像。 圖4B-圖4F為展示來自圖4A PAGE凝膠之軌跡之分子量分佈的掃描。
Claims (35)
- 一種用於製備具有減少重金屬含量之有機食品之方法，所述方法包括： 添加經認證有機或可認證有機螯合劑至含有重金屬之有機食品； 使所述螯合劑與所述重金屬結合，藉此形成錯合物；及 自所述食品分離所述錯合物以製備具有減少重金屬含量的所述有機食品。
- 如請求項1之方法，其中所述經認證有機或可認證有機螯合劑為肽螯合劑、檸檬酸或其鹽。
- 如請求項1或2之方法，其中所述食品為巨量營養素分離物。
- 如請求項3之方法，其中所述巨量營養素分離物為碳水化合物分離物、脂肪分離物或蛋白質分離物。
- 如請求項3至4中任一項之方法，其中所述巨量營養素源自植物。
- 如請求項1至5中任一項之方法，其中所述食品源自白米、糙米、米糠、亞麻籽、椰子、南瓜、大麻、豌豆、芡歐鼠尾草、扁豆、蠶豆、馬鈴薯、向日葵、奎奴亞藜、莧菜、燕麥、小麥或其組合。
- 如請求項1至6中任一項之方法，其中所述食品為植物蛋白質。
- 如請求項1至7中任一項之方法，其中所述重金屬為砷、鎘、鉛、汞或其組合。
- 如請求項1至8中任一項之方法，其中所述分離步驟藉由經過濾器過濾進行。
- 如請求項9之方法，其中所述錯合物為大體上可溶的且穿過所述過濾器。
- 如請求項1至8中任一項之方法，其中所述分離步驟藉由傾析及/或離心進行。
- 如請求項1至11中任一項之方法，其中所述螯合劑為肽螯合劑，其中所述肽螯合劑藉由水解有機蛋白質製備。
- 如請求項12之方法，其中所述肽螯合劑藉由酶促或化學水解所述有機蛋白質製備。
- 如請求項12或13之方法，其中所述有機蛋白質與所述食品源自相同植物或動物。
- 一種包括稻米蛋白質分離物之組合物，所述稻米蛋白質分離物包括與經認證有機或可認證有機螯合劑結合之重金屬。
- 如請求項18之組合物，其中所述經認證有機或可認證有機螯合劑為肽螯合劑或檸檬酸。
- 如請求項19之組合物，其中所述肽螯合劑為稻米蛋白質水解產物。
- 一種製造營養補充劑時之中間產物，所述中間產物包括稻米蛋白質分離物，所述稻米蛋白質分離物包括與經認證有機或可認證有機螯合劑結合之重金屬。
- 一種用於製備肽螯合劑之方法，所述方法包括： 酶促或化學水解有機蛋白質以形成有機肽螯合劑；及 收集所述肽螯合劑。
- 如請求項19之方法，其中使用酶使所述有機蛋白質酶促水解。
- 如請求項20之方法，其中所述酶包括以下一或多者：酸內肽酶、鹼內肽酶、中性內肽酶、胃蛋白酶、木瓜酶、羧肽酶、彈性蛋白酶、Asp-N、Glu-C、Lys-C、Arg-C、蛋白酶K、枯草桿菌蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、麩胺醯基內肽酶或嗜熱菌蛋白酶。
- 如請求項19之方法，進一步包括自所述水解產物分餾所述肽螯合劑。
- 一種肽螯合劑，包括蛋白質水解產物，所述蛋白質水解產物包括一或多種分子量在約2 kD至約25 kD範圍內的肽。
- 如請求項23之肽螯合劑，其中所述一或多種肽具有選自約21 kD至約19 kD、約16 kD至約14 kD、約13.5 kD至約12.5 kD、約11.5 kD至約10.5 kD或約4 kD至約2 kD之分子量範圍。
- 如請求項23之肽螯合劑，其中所述更多肽中之一者包括選自約20.5 kD、約15 kD及約12.7 kD之分子量。
- 如請求項23之肽螯合劑，其中所述更多肽中之一者包括選自約20.5 kD、約15 kD、約12.7 kD及約11 kD之分子量。
- 一種肽螯合劑，由包括以下之方法製得： 將來自植物源之蛋白質暴露於水解條件一段時間以製備蛋白質螯合劑； 自所述水解條件移出所述蛋白質螯合劑；及 收集所述蛋白質螯合劑。
- 如請求項27之肽螯合劑，其中所述時間段小於或等於約1小時、約2小時、約4小時、約6小時、約10小時，或包含及/或跨越前述值之範圍。
- 如請求項27之肽螯合劑，其中在暴露於所述水解條件期間，所述蛋白質暴露於酶。
- 如請求項27之肽螯合劑，其中在收集所述肽螯合劑期間，過濾所述肽螯合劑以基於尺寸及/或分子量收集所述肽螯合劑。
- 如請求項27之肽螯合劑，其中所述肽螯合劑包括一或多種具有選自約21 kD至約19 kD、約16 kD至約14 kD、約13.5 kD至約12.5 kD、約11.5 kD至約10.5 kD及/或約4 kD至約2 kD之分子量範圍的肽。
- 如請求項31之肽螯合劑，其中所述更多肽中之一者包括選自約20.5 kD、約15 kD及/或約12.7 kD之分子量。
- 如請求項31之肽螯合劑，其中所述更多肽中之一者包括選自約20.5 kD、約15 kD、約12.7 kD及/或約11 kD之分子量。
- 如請求項27之肽螯合劑，其中在暴露於所述水解條件期間，溫度保持在5℃與85℃範圍內之溫度。
- 如請求項27之肽螯合劑，其中在暴露於所述水解條件期間，pH保持在2.0至12.0範圍內之pH。
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