TW201739769A

TW201739769A - 人源化之單株抗體及其用途

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Publication number: TW201739769A
Application number: TW105143525A
Authority: TW
Inventors: 范佳玉; 周民元
Original assignee: 財團法人工業技術研究院
Priority date: 2016-05-09
Filing date: 2016-12-28
Publication date: 2017-11-16
Also published as: TWI615408B

Abstract

本發明提供一種人源化之單株抗體，包括：一輕鏈變異區；以及一重鏈變異區，其中編碼該輕鏈變異區之胺基酸序列的核苷酸序列包括一核苷酸序列，其編碼序列辨識號：9之胺基酸序列或者是與序列辨識號：9之序列具有至少80%之序列相似度的一胺基酸序列，而編碼該重鏈變異區的之胺基酸序列的核苷酸序列包括另一核苷酸序列，其編碼序列辨識號：10之胺基酸序列或者是與序列辨識號：10之序列具有至少80%之序列相似度的一胺基酸序列，又其中該人源化單株抗體與CD34結合。

Description

人源化之單株抗體及其用途

本發明係關於一種人源化單株抗體與其用途。

CD34蛋白質為單向穿膜唾液酸黏蛋白(single-pass transmembrane sialomucin proteins)之家族的一員，具有約115kD的表觀分子量(apparent Mr)。CD34⁺細胞通常被發現於骨髓與臍帶血中，如造血幹細胞(hematopoietic stem cell)、內皮前驅細胞(endothelial progenitor cell)與血管中之經活化的內皮細胞。在活體外(in vitro)，表現於人類臍靜脈內皮細胞(human vascular endothelial cell,HUVEC)上的CD34顯示血管新生尖端細胞(angiogenic tip cell)表現型。

QBEND/10為針對CD34的一種小鼠單株抗體monoclonal antibodies(mAbs)，且被確認其與第II型(class II)抗原決定位(epitope)的反應性。而發源於小鼠之單株抗體，當將其應用於人類治療時，可能引起(human anti-mouse antibody,HAMA)或(human anti-chimeric antibody,HACA)。為了防止此類之不利免疫反應，鼠源抗體需要被人源化以用於臨床應用。

血管新生(angiogenesis)係關於來自現存血管分佈(vasculature)之新血管的萌芽(sprouting)與生長的生理過程。血管新生也是在惡性腫瘤中之新血管生長的最常見途徑，所以此過程稱又為腫瘤血管新生。

因此，目前亟需一種新穎之抗CD34之人源化單株抗體與新穎之抑制血管新生之藥物。

本發明提供一種人源化之單株抗體，包括：一輕鏈變異區，該輕鏈變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：1之序列或者是與序列辨識號：1之序列具有至少80%之序列相似度的一序列；以及一重鏈變異區，該重鏈變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：2之序列或者是與序列辨識號：2之序列具有至少80%之序列相似度的一序列，其中該輕鏈變異區的胺基酸序列與該重鏈變異區的胺基酸序列具有擇自由下列所組成之群組的至少一個置換：該輕鏈變異區的胺基酸序列之第8位的胺基酸被置換為Pro；該輕鏈變異區的胺基酸序列之第41位的胺基酸被置換為Glu；該輕鏈變異區的胺基酸序列之第58位的胺基酸被置換為Lys；該輕鏈變異區的胺基酸序列之第81位的胺基酸被置換為Ser；該輕鏈變異區的胺基酸序列之第108位的胺基酸被置換為Thr；該重鏈變異區的胺基酸序列之第5位的胺基酸被置換為Val；該重鏈變異區的胺基酸序列之第9位的胺基酸被置換為Ala；該重鏈變異區的胺基酸序列之第74位的胺基酸被置換為Thr；以及該重鏈變異區的胺基酸序列之第75位的胺基酸被置換為Ser，又其中該人源化單株抗體與CD34結合。

本發明也提供一種人源化之單株抗體，包括：一輕鏈變異區；以及一重鏈變異區，其中編碼該輕鏈變異區之胺基酸序列的核苷酸序列包括一核苷酸序列，而該核苷酸序列編碼序列辨識號：9之胺基酸序列或者是與序列辨識號：9之序列具有至少80%之序列相似度的一胺基酸序列，而編碼該重鏈變異區之胺基酸序列的核苷酸序列包括另一核苷酸序列，該另一核苷酸序列編碼序列辨識號：10之胺基酸序列或者是與序列辨識號：10之序列具有至少80%之序列相似度的一胺基酸序列，又其中該人源化單株抗體與CD34結合。

本發明還提供一種人源化之單株抗體，包括：一輕鏈變異區；以及一重鏈變異區，其中編碼該輕鏈變異區的核苷酸序列包括序列辨識號：13之序列或者是與序列辨識號：13之序列具有至少80%之序列相似度的一序列，而編碼該重鏈之變異區的核苷酸序列包括序列辨識號：14之序列或者是與序列辨識號：14之序列具有至少80%之序列相似度的一序列，又其中該人源化單株抗體與CD34結合。

又，本發明更提供一種上述之人源化之單株抗體用於製備抗血管新生藥劑的用途。

此外，本發明也提供一種上述之人源化之單株抗體用於製備治療與血管新生相關之疾病的藥物的用途。

為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳細說明如下：

第1圖顯示小鼠QBEND/10減少人類臍靜脈內皮細胞(human umbilical vascular endothelial cell)的管形成(tube formation)。

第2A圖與第2B圖分別顯示來自胰蛋白酶分解之QBEND/10輕鏈與重鏈的基峰強度(base peak intensity,BPI)色譜圖(chromatogram)。“Ln”與“Hn”分別代表從輕鏈與重鏈之N端所計數之第n個胰蛋白酶胜肽。星號指出脫醯氨基(deamidated)胜肽；“pyro”指出位於麩醯胺(Q)之焦谷氨酸(pyro-glutamate)，而“oxi”則代表在甲硫胺酸(M)的氧化。

第3A圖與3B圖分別顯示對於QBEND/10輕鏈變異區與重鏈變異區之多種酵素分解與膠體內分解之鑑定結果的序列校直(alignment)。

第4圖顯示QBEND/10變異區之分子模型。經由以網頁為基礎之抗體結構預測程式PIGS來產生鼠源之QBEND/10 Fv區域的三維結構。9個胺基酸(以粗體字顯示)，包括在輕鏈變異區骨架中的5個殘基與在重鏈變異區骨架中之4個殘基，被以人類種系(germline)殘基所置換。CDR圈環以粗線顯示。

第5A圖與第5B圖顯示鼠源QBEND/10與對應之人類種系序列的序列校直(alignment)。第5A圖顯示將鼠源QBEND/10之輕鏈變異區與最同源(homologous)之人類種系序列IGLV4-69*01/J1*01序列校直；第5B圖顯示將鼠源QBEND/10之重鏈變異區與最同源之人類種系序列IGHV1-3*01/J4*01序列校直。以空心方框來標示保守表面殘基(conserved surface residues)，而非保守表面殘基(non-conserved surface residues)則以填有陰影之方框來強調。並未改變CDRs(於括號內)。殘基則根據Kabat et al.(Kabat EA,Wu, T.T.,Bilofsky,H.,Reid-Miller,M.,Perry,H.Sequence of Proteins of Immunological Interest.National Institutes of Health,Bethesda,1983)來編碼。a、b、c、d係依據Kabat編碼規則(可參見Abnum：Antibody numbering(http：//www.bioinf.org.uk/abs/abnum/))所給予之位置代碼。例如於第5A圖中，於第1排之胺基酸序列中應編碼為27的位置為S，而其後方之Q標註a，則代表Q應編碼為27a，依此類推。

第6A圖與第6B圖顯示經重修表面(resurfacing)之QBEND/10 CDRs比對小鼠QBEND/10 CDR之結構相似(homology)模型。以深灰色顯示之經表面重修之QBEND/10 CDRs，相較於以淺灰色顯示之小鼠QBEND/10 CDRs，僅在圈環結構(loop structures)中顯示些微的差異。

第7圖顯示嵌合(chimeric)與人源化之QBEND/10抗體的純化。所指出之嵌合QBEND/10(泳道1與2)與人源化QBEND/10(泳道3與4)抗體被穩定地表現於小鼠骨髓瘤NS0細胞中，且藉由管柱層析(column chromatography)被純化。將樣本以3-嗎啉丙磺酸(3-morpholinopropanesulfonic acid,MOPS)緩衝溶液於非還原狀態(泳道1與3)與還原狀態(泳道2與4)，於一4-12% NuPAGE Bis-Tris聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳。將膠體以考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue)染色。

第8A圖與第8B圖分別顯示介於人類CD34蛋白質與嵌合QBEND/10之間及介於人類CD34蛋白質與人源化QBEND/10之間的相互作用的表面電漿共振(surface plasmon resonance,SPR)分析。將各抗體注入並使其以30μl/分鐘之流速流過具有固定之人類CD34蛋白質的一表面晶片。使用由製造商提供之分析程式(BIAevaluation 3.2)來分析所產生之表面電漿共振傳感圖(sensorgram)，以確定結合/解離率常數。將所測量出之動力學常數總結於表3中。

第9A圖與第9B圖顯示QBEND/10減少了人類臍靜脈內皮細胞的管形成。第9A圖上半部顯示，活體外(in vitro)在PBS(控制組)、20μg/ml或40μg/ml之人源化之QBEND/10存在下，由人類臍靜脈內皮細胞所形成之在Matrigel上的tubular network的螢光影像；第9A圖下半部顯示，ImageJ plugin分析之人類臍靜脈內皮細胞network的二元樹(binary tree)；第9B圖顯示，來自第9A圖之每視野管長度(tube length)的量化。於每個實驗中，每個劑量於5個孔洞進行測試，每孔檢驗一個視野。其中*代表P值<0.05。

在本發明一態樣中，提供一人源化單株抗體，其中此人源化單株抗體與CD34結合，而上述CD34可為人類CD34。上述人源化單株抗體可包括一輕鏈變異區與一重鏈變異區。在一實施例中，上述本發明人源化單株抗體為一免疫球蛋白G(IgG)抗體，其可包括一輕鏈變異區、一重鏈變異區與人類免疫球蛋白G保守區域。

在一實施例中，本發明人源化單株抗體之輕鏈變異區的胺基酸序列與重鏈變異區的胺基酸序列可藉由對與CD34結合的非人類單株抗體執行變異區表面重組(variable domain resurfacing)來獲得。於本發明中所進行之變異區表面重組的步驟可如下所述，但不限於此。

首先，取得一與CD34結合的非人類單株抗體之輕鏈變異區的胺基酸序列與重鏈變異區的胺基酸序列。在一實施例中，與CD34結合的非人類單株抗體可包括一鼠源單株抗體，而此鼠源單株抗體之輕鏈變異區的胺基酸序列可包括序列辨識號：1之序列或者是與序列辨識號：1之序列具有至少80%之序列相似度的一序列，而重鏈變異區的胺基酸序列可包括序列辨識號：2之序列或者是與序列辨識號：2之序列具有至少80%之序列相似度的一序列。又，於上述實施例中，此鼠源單株抗體可為市售抗體QBEND/10。

於本發明中，用語「至少80%之序列相似度」意指一序列與其比對序列具有大於或等於80%之序列相似度，例如，80%、85%、90%、92%、95%、99%、99.9%、100%之序列相似度，但不限於此。

接著，根據前述與CD34結合的非人類單株抗體之輕鏈變異區的胺基酸序列與重鏈變異區的胺基酸序列來建立前述與CD34結合的非人類單株抗體之輕鏈變異區與重鏈變異區的分子模擬結構，並且確認其表面可及殘基(surface accessible residues)。在一實施例中，分子模擬結構可藉由目前已知之模擬程式或軟體來進行，例如分子模擬結構可藉由免疫球蛋白結構預測(Prediction of ImmunoGlobulin Structure,PIGS)來進行，但不限於此。

之後，搜尋與CD34結合的非人類單株抗體之變異區胺基酸序列相似度最高之人類序列，並將兩者進行比對而決定出此與CD34結合的非人類單株抗體之變異區胺基酸序列的可置換殘基。最後，將此與CD34結合的非人類單株抗體之變異區胺基酸序列的可置換殘基置換為對應於此殘基位置之前述人類序列的胺基酸殘基，以獲得與CD34結合的人源化單株抗體之輕鏈變異區的胺基酸序列與重鏈變異區的胺基酸序列。

在一實施例中，前述與CD34結合的非人類單株抗體之輕鏈變異區胺基酸序列可包括序列辨識號：1之序列或者是與序列辨識號：1之序列具有至少80%之序列相似度的一序列，且重鏈變異區胺基酸序列可包括序列辨識號：2之序列或者是與序列辨識號：2之序列具有至少80%之序列相似度的一序列，而與前述非人類單株抗體之輕鏈變異區胺基酸序列相似度最高之的人類序列為來自IGLV4-69*01群組之人類種系(germline)V區(序列辨識號：3)與來自IGLJ1*01之人類共有序列J區(序列辨識號：4)所構成的輕鏈變異區序列(序列辨識號：5)，又與前述非人類單株抗體之重鏈變異區胺基酸序列相似度最高之的人類序列為來自IGHV1-3*01群組之人類種系(germline)V區(序列辨識號：6)與來自IGHJ4*01之人類共有序列J區(序列辨識號：7)所構成的重鏈變異區序列(序列辨識號：8)。在此實施例中，可對前述非人類單株抗體之輕鏈變異區與重鏈變異區的胺基酸序列進行的置換則至少包括下列之一：上述非人類單株抗體之輕鏈變異區胺基酸序列之第8位的胺基酸被置換為Pro、上述非人類單株抗體之輕鏈變異區胺基酸序列之第41位的胺基酸被置換為Glu、上述非人類單株抗體之輕鏈變異區胺基酸序列之第58位的胺基酸被置換為Lys、上述非人類單株抗體之輕鏈變異區胺基酸序列之第81位的胺基酸被置換為Ser、上述非人類單株抗體之輕鏈變異區胺基酸序列之第108位的胺基酸被置換為Thr、上述非人類單株抗體之重鏈變異區胺基酸序列之第5位的胺基酸被置換為Val、上述非人類單株抗體之重鏈變異區胺基酸序列之第9位的胺基酸被置換為Ala、上述非人類單株抗體之重鏈變異區胺基酸序列之第74位的胺基酸被置換為Thr，與上述非人類單株抗體之重鏈變異區胺基酸序列之第75位的胺基酸被置換為Ser。

所以，於上述實施例中所獲得之與CD34結合的人源化單株抗體可包括一輕鏈變異區與一重鏈變異區，此輕鏈變異區的胺基酸序列可包括序列辨識號：1之序列或者是與序列辨識號：1之序列具有至少80%之序列相似度的一序列，而此重鏈變異區的胺基酸序列可包括序列辨識號：2之序列或者是與序列辨識號：2之序列具有至少80%之序列相似度的一序列，其中上述輕鏈變異區的胺基酸序列與上述重鏈變異區的胺基酸序列具有至少下列置換之一：上述輕鏈變異區胺基酸序列之第8位的胺基酸被置換為Pro、上述輕鏈變異區胺基酸序列之第41位的胺基酸被置換為Glu、上述輕鏈變異區胺基酸序列之第58位的胺基酸被置換為Lys、上述輕鏈變異區胺基酸序列之第81位的胺基酸被置換為Ser、上述輕鏈變異區胺基酸序列之第108位的胺基酸被置換為Thr、上述重鏈變異區胺基酸序列之第5位的胺基酸被置換為Val、上述重鏈變異區胺基酸序列之第9位的胺基酸被置換為Ala、上述重鏈變異區胺基酸序列之第74位的胺基酸被置換為Thr、上述重鏈變異區胺基酸序列之與第75位的胺基酸被換為Ser。

而在另一實施例中，前述與CD34結合的非人類單株抗體之輕鏈變異區胺基酸序列可包括序列辨識號：1之序列且重鏈變異區胺基酸序列可包括序列辨識號：2之序列，而與前述非人類單株抗體之輕鏈變異區胺基酸序列相似度最高之的人類序列為來自IGLV4-69*01群組之人類種系V區(序列辨識號：3)與來自IGLJ1*01之人類共有序列J區(序列辨識號：4)所構成的輕鏈變異區序列(序列辨識號：5)，又與前述非人類單株抗體之重鏈變異區胺基酸序列相似度最高之的人類序列為來自IGHV1-3*01群組之人類種系(germline)V區(序列辨識號：6)與來自IGHJ4*01之人類共有序列J區(序列辨識號：7)所構成的重鏈變異區序列(序列辨識號：8)。在此實施例中，可對前述與CD34結合的非人類單株抗體之輕鏈變異區與重鏈變異區的胺基酸序列進行的置換則至少包括下列之一：序列辨識號：1之第8位的胺基酸由Ser置換為Pro(Ser8Pro)、序列辨識號：1之第41位的胺基酸由Leu置換為Glu(Leu41Glu)、序列辨識號：1之第58位的胺基酸由Thr置換為Lys(Thr58Lys)、序列辨識號：1之第81位的胺基酸由Asn置換為Ser(Asn81Ser)、序列辨識號：1之第108位的胺基酸由Gly置換為Thr(Gly108Thr)、序列辨識號：2之第5位的胺基酸由Gln置換為Val(Gln5Val)、序列辨識號：2之第9位的胺基酸由Pro置換為Ala(Pro9Ala)、序列辨識號：2之第74位的胺基酸由Lys置換為Thr(Lys74Thr)與序列辨識號：2之與第75位的胺基酸由Gln置換為Ser(Gln75Ser)。

因此，於上述實施例中所獲得之與CD34結合的人源化單株抗體可包括一輕鏈變異區與一重鏈變異區，此輕鏈之變異區的胺基酸序列可包括序列辨識號：1之序列，而此重鏈之變異區的胺基酸序列可包括序列辨識號：2之序列，且序列辨識號：1之序列與序列辨識號：2之序列具有至少下列置換之一：序列辨識號：1之第8位的胺基酸由Ser置換為Pro(Ser8Pro)、序列辨識號：1之第41位的胺基酸由Leu置換為Glu(Leu41Glu)、序列辨識號：1之第58位的胺基酸由Thr置換為Lys(Thr58Lys)、序列辨識號：1之第81位的胺基酸由Asn置換為Ser(Asn81Ser)、序列辨識號：1之第108位的胺基酸由Gly置換為Thr(Gly108Thr)、序列辨識號：2之第5位的胺基酸由Gln置換為Val(Gln5Val)、序列辨識號：2之第9位的胺基酸由Pro置換為Ala(Pro9Ala)、序列辨識號：2之第74位的胺基酸由Lys置換為Thr(Lys74Thr)、序列辨識號：2之與第75位的胺基酸由Gln置換為Ser(Gln75Ser)。

又，在一特定實施例中，前述與CD34結合的非人類單株抗體之輕鏈變異區胺基酸序列可包括序列辨識號：1之序列而重鏈變異區胺基酸序列可包括序列辨識號：2之序列，而與前述非人類單株抗體之輕鏈變異區胺基酸序列相似度最高之的人類序列為來自IGLV4-69*01群組之人類種系(germline)V區(序列辨識號：3)與來自IGLJ1*01之人類共有序列J區(序列辨識號：4)所構成的輕鏈變異區序列(序列辨識號：5)，又與前述非人類單株抗體之重鏈變異區胺基酸序列相似度最高之的人類序列為來自IGHV1-3*01群組之人類種系(germline)V區(序列辨識號：6)與來自IGHJ4*01之人類共有序列J區(序列辨識號：7)所構成的重鏈變異區序列(序列辨識號：8)。而在進行前述序列比對後，所獲得之與CD34結合的人源化單株抗體包括一輕鏈變異區與一重鏈變異區，其中輕鏈變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：9，而重鏈變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：10。

此外，本發明還可提供一人源化單株抗體，其中此人源化單株抗體與CD34結合，而所述CD34可為人類CD34。上述人源化單株抗體可包括一輕鏈與一重鏈，其中，此輕鏈之變異區的胺基酸序列，為任一種前述本發明人源化單株抗體之輕鏈變異區的胺基酸序列，而此重鏈之變異區的胺基酸序列，為任一種前述本發明人源化單株抗體之重鏈變異區的胺基酸序列。在一實施例中，上述本發明人源化單株抗體為一免疫球蛋白G(IgG)抗體，其單側可包括一輕鏈變異區、一重鏈變異區與人類免疫球蛋白G保守區域。

再者，本發明還可提供一人源化單株抗體，其中此人源化單株抗體可包括一輕鏈變異區與一重鏈變異區，編碼此輕鏈變異區之胺基酸序列的核苷酸序列可包括一核苷酸序列，此核苷酸序列編碼序列辨識號：9之胺基酸序列或者是與序列辨識號：9之序列具有至少80%之序列相似度的一胺基酸序列，而編碼此重鏈變異區之胺基酸序列的核苷酸序列可包括另一核苷酸序列，此另一核苷酸序列編碼序列辨識號：10之胺基酸序列或者是與序列辨識號：10之序列具有至少80%之序列相似度的一胺基酸序列，又其中該人源化單株抗體與CD34結合。在一實施例中，上述編碼此輕鏈變異區之胺基酸序列的核苷酸序列可包括編碼序列辨識號：9之序列，而上述編碼此重鏈變異區之胺基酸序列的核苷酸序列可包括編碼序列辨識號：10之序列。

而上述本發明人源化單株抗體可藉由下述步驟來獲得，但不限於此。

首先，獲得一與CD34結合的非人類單株抗體之輕鏈變異區的胺基酸序列與重鏈變異區的胺基酸序列。根據前述與CD34結合的非人類單株抗體之輕鏈變異區胺基酸序列與重鏈變異區胺基酸序列來建立前述與CD34結合的非人類單株抗體之輕鏈變異區與重鏈變異區的分子模擬結構，並且標定出其非保守表面殘基(non-conserved surface residues)。在一實施例中，分子模擬結構可以電腦輔助同源性模擬方式來進行。

再來，搜尋與前述本發明與CD34結合的單株抗體之變異區胺基酸序列相似度最高之人類序列，並將兩者進行比對而決定出此與CD34結合的非人類單株抗體之變異區胺基酸序列的可置換殘基。最後，將編碼出前述與CD34結合的非人類單株抗體之變異區胺基酸序列的核苷酸序列於上述可置換殘基的對應位置以定點突變方式置換為編碼出對應於此殘基位置之前述人類序列的胺基酸殘基的核苷酸，以獲得本發明與CD34結合的人源化單株抗體之輕鏈變異區核苷酸片段與重鏈變異區的核苷酸片段。在一實施例中，與CD34結合的非人類單株抗體可包括一鼠源單株抗體。此鼠源單株抗體之輕鏈變異區的核苷酸序列可包括序列辨識號：11之序列，而重鏈變異區的核苷酸序列可包括序列辨識號：12之序列，其中序列辨識號：11之核苷酸序列可編碼序列辨識號：1之胺基酸序列，而序列辨識號：12之核苷酸序列可編碼序列辨識號：2之胺基酸序列。又於此實施例中，所獲得本發明與CD34結合的人源化單株抗體之輕鏈變異區之核苷酸片段可包括序列辨識號：13之序列，而重鏈變異區之核苷酸序列可包括序列辨識號：14之序列，其中序列辨識號：13之核苷酸序列可編碼序列辨識號：9之胺基酸序列，而序列辨識號：14之核苷酸序列可編碼序列辨識號：10之胺基酸序列。

之後，藉由本技術領域熟知的方法，將前述本發明與CD34結合的人源化單株抗體之輕鏈變異區核苷酸片段與重鏈變異區的核苷酸片段與一已知人類保守區域核苷酸片段分別選殖進入合適的表現載體，並將此表現載體轉染進合適的宿主細胞，以使宿主細胞表現本發明與CD34結合的人源化單株抗體。

又，依據前述可知，本發明還可提供一人源化單株抗體，其中此人源化單株抗體可包括一輕鏈變異區與一重鏈變異區，其中編碼此輕鏈變異區的核苷酸序列包括序列辨識號：13之序列或者是與序列辨識號：13之序列具有至少80%之序列相似度的一序列，而編碼此重鏈之變異區的核苷酸序列包括序列辨識號：14之序列或者是與序列辨識號：14之序列具有至少80%之序列相似度的一序列，又其中該人源化單株抗體與CD34結合。在一實施例中，上述編碼此輕鏈變異區的核苷酸序列包括序列辨識號：13之序列，而編碼此重鏈之變異區的核苷酸序列包括序列辨識號：14之序列。

此外，上述任一本發明之人源化單株抗體對CD34的結合親和力可為約10-20nM，較佳為約5-10nM。

在一實施例中，上述任一本發明人源化之單株抗體，可與一載體(solid support)、官能基或生物分子等連結，以便於可能所需之後續操作處理，例如，分離步驟。上述的載體可例如微珠(beads)、晶片(chip)或盤(plate)，但不限於此。此述的官能基包括抗體蛋白上可與載體或生物分子形成鍵結的官能基，例如胺基(-NH₂)、巰基(-SH)、羧基(-COOH)或羥基(-OH)。此生物分子可選用習知具有結合專一性的生物分子，例如生物素(biotin)、卵白素(avidin)或鏈黴素(streptavidin)等。此述的微珠可為商業上可獲得者，例如氧化鐵奈米磁珠(iron oxide particle,IOP)或超順磁化鐵奈米磁珠(superparamagnetic iron oxide particle,SPIO)，沒有特別限制。當上述人源化單株抗體上結合的生物分子為生物素(biotin)時，較佳使用表面攜帶抗生物素(anti-biotin)的微珠。

又，上述任一本發明人源化之單株抗體也可攜帶顯色物質之部分。此述的顯色物質可例如螢光染劑(fluorochromes)，如fluoresceinisothiocyanate(FITC)、Alexa Fluor系列螢光染劑、對稱型花青染料(Cyanine Dye,Cy2,Cy3 and Cy5)等；螢光蛋白(fluorescent protein)，如以光敏素為主的近紅外螢光蛋白(phytochrome-based near-infrared fluorescent protein,iRFP)；生物性冷光(bioluminescence)，如螢火蟲螢光素酶(firefly luciferase,Fluc)、Gaussia螢光素酶(Gaussia luciferase,Gluc)；奈米粒子，如量子點(quantum dots)、氧化鐵奈米磁珠(iron oxide magnetic beads)或超順磁氧化鐵奈米磁珠(superparamagnetic iron oxide beads)等。

又，上述任一本發明之人源化單株抗體具有抑制血管新生之功效。在一實施例中，本發明之人源化單株抗體藉由與表現於細胞上CD34結合，而達成抑制血管新生之功效。

因此，在本發明另一態樣中，可提供一種人源化單株抗體用於製備抗血管新生藥劑的用途，其中該人源化之單株抗體，可為任一上述本發明人源化之單株抗體。

此外，本發明還可提供一種人源化單株抗體用於製備治療與血管新生相關之疾病的藥物的用途，其中該人源化之單株抗體，可為任一上述本發明人源化之單株抗體。

而上述與血管新生相關之疾病可包括，癌症、新生血管性青光眼、老年性黃斑部病變等，但不限於此。

再者，於前述各種用途中，本發明人源化之單株抗體可視需要而定與一載體、官能基或生物分子等連結。而載體、官能基或生物分子的說明如前方所記載。

實施例

A. 材料與方法

1. 材料

小鼠抗體QBEND/10係購自AbD Serotec。碳酸氫銨(ammonium bicarbonate)、二硫蘇糖醇(dithiolthreitol,DTT)、碘乙醯胺(iodoacetamide,IAM)、甲酸(formic acid,FA)、嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)與枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)為購自Sigma-Aldrich。尿素(urea)與乙腈(acetonitrile,ACN)為購自J.T Baker。胰蛋白酶(trypsin)與胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)為購自Promega。內肽酶Glu-C(endoproteinase Glu-C)(Glu-C)與N糖苷肽酶F(Peptide N-glycosidase F,PNGase F)係分別購自New England BioLabs與Roche。4-12%與4-20% NuPAGE Bis-Tris聚丙烯醯胺凝膠(polyacrylamide gel)為購自Invitrogen。Amicon標示分子量篩選 (cut-off)>100kDa的超離心過濾膜(Ultra Centrifugal Filters)為購自Millipore。

2. 方法

(1)QBEND/10之酵素分解與去醣基化(deglycosylation)

首先將小鼠QBEND/10以分子量篩選(cut-off)>100kDa之Amicon超離心過濾膜處理，以移除清潔劑(detergent)，並將緩衝溶液置換為50mM碳酸氫銨緩衝溶液。然後，將QBEND/10以6M尿素變性、利用10mM二硫蘇糖醇於37℃反應1小時來還原，並利用50mM碘乙醯胺在黑暗中於室溫反應30分鐘來烷基化(alkylated)。將所產生之蛋白質分別以胰蛋白酶、內肽酶Glu-C、嗜熱菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶與枯草桿菌蛋白酶於37℃分解18小時(蛋白質：酵素=20：1)。一等份之胰蛋白酶分解物被添加內肽酶Glu-C以於37℃分解20小時。在分解之後添加PNGase F以隔夜進行去醣基化反應。之後，將樣本稀釋並以0.1%甲酸酸化以進行LC-MS分析。

(2)膠體內(in-gel)胰蛋白酶分解(tryptic digestion)

在一平行實驗中，使用一迷你膠體(mini gel)(8cm x 8cm；4-20% NuPAGE Bis-Tris聚丙烯醯胺凝膠)來進行SDS-PAGE分離，接著藉由考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue)R-250來染色。將包含具有表觀分子量(apparent molecular mass)約25kDa與50kDa之蛋白質的兩條條帶自膠體割出、清洗、膠體內還原、烷基化並以胰蛋白酶隔夜分解。

(3)液相層析串聯式質譜儀(Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry,LC-MS/MS)分析

以Q Exactive質譜儀(Thermo Scientific)結合Ultimate 3000 RSLC系統(Dionex)來分析樣本。使用C18管柱(Acclaim PepMap RSLC；75μm x 150mm；2μm；100Å)，以從1%至25%之移動相(mobile phase)B(移動相A：5% ACN/0.1% FA；移動相B：95% ACN/0.1% FA)執行40分鐘、25%至60%之移動相B執行3分鐘，與60%至80%之移動相B執行2分鐘的線性梯度，總共70分鐘之分離時間，來進行液相層析(LC)分離。以m/z 350-2000的範圍來執行全質譜掃描(full MS scan)，並使來自質譜掃描之前十強離子訊號樣品碎成片段(fragmentation)以取得MS/MS質譜。藉由Proteome Discoverer 1.3將原始數據處理成波峰列表(peak lists)以進行Mascot資料庫搜尋(database search)。

(4)資料庫搜尋與起始定序(de novo sequencing)

藉由收集來自(National Center for Biotechnology Information,NCBI)資料庫之免疫球蛋白(immunoglobulin)的序列來製作一定製的資料庫。以Mascot version 2.4.0來執行資料庫搜尋。將脲甲基(carbamidomethyl,C)選為固定修飾(fixed modification)，並將而脫醯胺(Deamidated,NQ)、氧化(Oxidation,M)、焦麩氨酸(Pyroglutamate,N-term Q)當作可變修飾(variable modification)。對於各個酵素分解(enzyme digestion)，允許上至五個漏切位點(missed cleavage)，並將±5ppm與±0.02Da分別做為對於親體離子(parent ion)與碎體離子(fragment ion)的質量容許窗(mass tolerance window)。進一步執行錯誤容忍搜尋(error tolerant search)，於其中所有修飾(modification)與序列變化 (sequence variation)被考慮。將具有高強度之MS/MS圖譜進行手動定序，若其未被Mascot所確認的話。建構一定製之計算演算法(computational algorithm)以將所觀察到之胜肽分成重鏈或輕鏈，且之後將胜肽校直(align)成一完整的序列。將結果送回至Mascot當作蛋白質鑑定與錯誤容忍搜尋之一新的資料庫。反覆重複此程序直至獲得具有最高分數的蛋白質序列。手動確認於此研究中之所有MS/MS圖譜以確保其品質。

(5)分子模擬(molecular modeling)

使用免疫球蛋白結構預測(Prediction of ImmunoGlobulin Structure,PIGS)(http：//www.biocomputing.it/pigs)(Marcatili P,Rosi A,Tramontano A.PIGS：automatic prediction of antibody structures.Bioinformatics.2008；24(17)：1953-4；Marcatili P,Olimpieri PP,Chailyan A,Tramontano A.Antibody structural modeling with prediction of immunoglobulin structure(PIGS).Nature protocols.2014；9(12)：2771-83.)網頁伺服器(web server)，經由單一序列提交(single sequence submission)，來執行鼠源之QBEND/10之可變片段(variable fragment,Fv)的分子模擬。使用PIGS以內定值(default setting)，從對應之胺基酸序列產生小鼠QBEND/10可變片段(Fv)區域的結構模型。自所顯示之20條模板(template)選出最佳之重鏈與輕鏈模板。將與分別小鼠QBEND/10之重鏈變異區(V_H)與輕鏈變異區(V_L)具有序列相似度為86.67%與94.92%的蛋白質資料銀行(Protein Data Bank,PDB)代號(code)2GKI_H(Kim YR,Kim JS,Lee SH,Lee WR,Sohn JN,Chung YC,et al.Heavy and light chain variable single domains of an anti-DNA binding antibody hydrolyze both double- and single-stranded DNAs without sequence specificity.The Journal of biological chemistry.2006；281(22)：15287-95)與2QHR_L(Lee JE,Kuehne A,Abelson DM,Fusco ML,Hart MK,Saphire EO.Complex of a protective antibody with its Ebola virus GP peptide epitope：unusual features of a V lambda x light chain.Journal of molecular biology.2008；375(1)：202-16)用來模擬小鼠QBEND/10的三維(three-dimensional,3D)結構。為了小鼠QBEND/10之可變片段(Fv)區域的三維結構自動化建構，對所有互補決定區(complementarity-determining regions,CDRs)L1至L3及H1至H3使用一標準圈環移植方式(canonical loop grafting approach)。維持保守胺基酸側鏈的位置，而非保守胺基酸側鏈則以SCWRL 4.0來模擬(Krivov GG,Shapovalov MV,Dunbrack RL,Jr.Improved prediction of protein side-chain conformations with SCWRL4.Proteins.2009；77(4)：778-95.)。藉由使用Swiss-PdbViewer應用來執行能量最小化(energy minimization)(Guex N,Peitsch MC.SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer：an environment for comparative protein modeling.Electrophoresis.1997；18(15)：2714-23.)。

(6)QBEND/10之人源化(humanization)

使用重修表面方式(resurfacing approach)來執行小鼠QBEND/10的人源化(Padlan EA.A possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand-binding properties.Molecular immunology.1991；28(4-5)：489-98.)。將重鏈變異區(V_H)、輕鏈變異區(V_L)與互補決定區(CDRs)，依據Kabat定義來進行編碼與確認(Kabat EA,National Institutes of H,Columbia U.Sequences of proteins of immunological interest.Bethesda,MD：U.S.Dept.of Health and Human Services,Public Health Service,National Institutes of Health；1991.)。首先，藉由使用Swiss-PdbViewer(Guex N,Peitsch MC.SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer：an environment for comparative protein modeling.Electrophoresis.1997；18(15)：2714-23.)設定30%為臨界值(Pedersen JT,Henry AH,Searle SJ,Guild BC,Roguska M,Rees AR.Comparison of surface accessible residues in human and murine immunoglobulin Fv domains.Implication for humanization of murine antibodies.Journal of molecular biology.1994；235(3)：959-73.)，且使用產生之小鼠QBEND/10的可變片段(Fv)區域模型以確認表面可及殘基(surface accessible residues)。再來，使用對於人類IgG種系(germline)資料庫的NCBI IgBLAST(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)來搜尋小鼠QBEND/10變異之重鏈與輕鏈的序列。使用與鼠源之重鏈變異區(V_H)與輕鏈變異區(V_L)具有最高相似度的人類種系V序列。從最相似之人類共通序列(consensus sequence)中選出相對於重鏈與輕鏈的J區域。然後，將這些重要的支架區(framework region)之表面殘基(surface residues)手動置換成在所選擇之人類IgG種系序列上發現的那些。將這些側鏈手動旋轉(rotate)以評估穩定之側鏈構造 (conformation)，之後使用Swiss-PdbViewer執行能量最小化。最後，將相對於經重整之QBEND/10之可變片段(Fv)區域的序列組成進行裝配(assemble)。以Swiss-PdbViewer(Guex N,Peitsch MC.SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer：an environment for comparative protein modeling.Electrophoresis.1997；18(15)：2714-23.)來分析、形象化(visualize)與疊映(superimpose)兩個所產生之模型，鼠源與經人源化之QBEND/10。根據疊映之結果確認於互補決定區(CDRs)中的結構改變。

(7)重組質體之建構(construction)

QBEND/10重鏈變異區(V_H)與輕鏈變異區(V_L)的DNA序列經由GenScript(GenScript USA Inc.,Piscataway,NJ,USA)被分別合成。重鏈之編碼區係由一N端QBEND/10重鏈變異區(V_H)與一C端人類IgG1固定區(constant region)(CH1、樞紐(hinge)、CH2與CH3)核苷酸序列所構成。藉由重疊(overlapping)聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)來製備此合成基因。將兩側帶有EcoRV與BamHI位點的聚合酶鏈鎖反應產物以相同位點選殖進(cloned)表現載體pSecTag2/Hygro(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)。為了分泌之目的，將QBEND/10之完整重鏈DNA和pSecTag2/Hygro表現載體之N-端鼠源之Ig kappa-鏈V-J2-C訊息胜肽(signal peptide)一起框內(in-frame)選殖。輕鏈之編碼區係由一N-端QBEND/10輕鏈變異區(V_L)與一C端lambda輕鏈固定區(constant region)核苷酸序列。藉由重疊聚合酶鏈鎖反應來製備此合成基因。將聚合酶鏈鎖反應產物選殖進表現載體pcDNA3.3-TOPO TA(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA, USA)。為了分泌之目的，也將QBEND/10之完整DNA與N-端鼠源之Ig kappa-chain V-J2-C訊息胜肽一起進行框內選殖(in-frame cloning)。

(8)抗體之表現與純化

藉由在小鼠骨髓瘤(myeloma)NS0細胞(European Collection of Animal Cell Cultures,Wiltshire,UK)中之表現構築體(construct)的穩定的共轉染(co-transfection)，根據製造商之操作指南，使用Effectene(QIAGEN Inc.,Valencia,CA,USA)，來獲得重組QBEND/10抗體。在以400μg/ml Hygromycin B(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)與800μg/ml G418(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)篩選4週之後，將一穩定選植株(clone)，以5 x 10⁵個細胞/ml之起始接種密度，以含2%胎牛血清(fetal bovine serum)之化學性界定培養基(chemically defined medium)HyClone CDM4NS0(Hyclone,GE Healthcare,South Logan,UT,USA)，培養於搖瓶(shaker flask)中。在37℃將培養物維持於130rpm培養5天。取上清液經由人類-IgG親和性管柱(IgSelect；GE Healthcare,South Logan,UT,USA)來純化重組抗體。

(9)SDS-PAGE

使用一4-12% NuPAGE Bis-Tris聚丙烯醯胺凝膠以3-嗎啉丙磺酸(3-morpholinopropanesulfonic acid,MOPS)為電泳緩衝溶液(running buffer)(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)來執行SDS-PAGE。以考馬斯亮藍R-250來對蛋白質進行染色。

(10)ELISA

使用布拉德福(Bradford)的程序來評估蛋白質濃度(Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Analytical biochemistry.1976；72：248-54.)。簡而言之，將一Nunc^TM MaxiSorp 96-孔盤(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)以濃度5μg/ml之體積50μl的人類CD34蛋白質(Fc tag)(Sino Biological Incorporation,Beijing,China)塗覆並於4℃培養18小時。在以StartingBlock^TM阻隔緩衝溶液(blocking buffer)(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)阻隔並以含有0.01% Tween-20之PBS(PBST)清洗三次之後，將樣本添加至培養盤中並於37℃培養1小時。在清洗之後，將培養盤於室溫以山葵過氧化酶(horseradish peroxidase(HRP))連結之抗人類lambda輕鏈抗體(Bethyl Laboratories,Inc.,Montgomery,TX)培養1小時，然後以PBST清洗。然後添加3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine,TMB)以產生顏色反應。在以1N HCl終止反應之後，經由一微量盤讀取儀(microplate reader)來讀取在450nm的吸收。以雙重複來執行測量。

(11)表面電漿共振(surface plasmon resonance,SPR)

使用Biacore system(Biacore X,GE Healthcare,South Logan,UT,USA)於電泳緩衝溶液HBS-EP(10mM HEPES,pH 7.4；150mM NaCl；3mM EDTA；0.005% surfactant P20)中來測量QBEND/10抗體對人類CD34蛋白質(Fc tag)(Sino Biological Incorporation,Beijing,China)的結合動力學。簡而言之，經由胺類偶合(amine coupling)將人類CD34蛋白質固定於一CM5感應晶片上至1200反應單位(response unit,RU)的程度，並以30μl/分鐘之流速注入具有不同濃度之經純化的抗體。藉由注人15μl之10mM甘胺酸-HCl(pH 2.5)來使表面恢復(regenerate)。使用程式BIA Evaluation 3.2(GE Healthcare,South Logan,UT,USA)來評估於各濃度獲得之傳感圖(sensorgram)。將結合資料以一2：1(雙價(bivalent))結合模型來擬合(fitting)以計算親和常數(affinity constant)K_D，其被定義為解離速率(dissociation rate)(k_off)/結合速率(association rate)(k_on)的比。

(12)細胞培養

自美國典型培養物保藏中心(American Type Cell Culture,ATCC)(Manassas,VA)獲得人類臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)。在37℃，5% CO₂下，使細胞生長於添加有5%胎牛血清、1%內皮細胞生長添加物(endothelial cell growth supplement,ECGS)與1%青黴素/鏈黴素(penicillin/streptomycin,P/S)的內皮細胞培養基(endothelial cell medium,ECM)以擴增(內皮細胞培養基、內皮細胞生長添加物與抗生素為購自ScienCell Research Laboratory)。

(13)管形成(tube formation)分析

利用將Matrigel(生長因子降低，BD Biosciences)添加至15-孔μ-載玻片(μ-Slides)(ibidi,Germany)並於37℃使膠體凝固1小時來執行分析。接著，以10μg/ml DiIC₁₂(3)螢光染劑(BD Biosciences)來將次匯合(sub-confluent)之人類臍靜脈內皮細胞於 37℃預染1小時，且之後以胰蛋白酶/EDTA來使細胞懸浮。為了評估小鼠或經人源化之QBEND/10的功效，將人類臍靜脈內皮細胞在不同濃度之QBEND/10抗體存在或不存在下，重新懸浮於內皮細胞基礎培養基(ECM-basal medium)，且之後以每孔8 x 10³個細胞之細胞數目接種於Matrigel之層上。在培養18小時之後，以一倒立式螢光顯微鏡(inverted fluorescence microscope)來使管網結構(tubular network structure)顯現並照相。使用ImageJ software來將細胞覆蓋區域或管長度量化。

B. 結果

1. 以小鼠QBEND/10處理內皮細胞減少管形成

由於CD34-/-小鼠顯現不規則之血管型態(vessel morphology)(Maltby S,Freeman S,Gold MJ,Baker JH,Minchinton Al,Gold MR,et al.Opposing roles for CD34 in B16 melanoma tumor growth alter early stage vasculature and late stage immune cell infiltration.PloS one.2011；6(4)：e18160.)，因此分析小鼠QBEND/10在人類臍靜脈內皮細胞管形成中的作用。人類臍靜脈內皮細胞管形成分析係為一活體外(in vitro)血管新生分析(angiogenesis)，其可再現一些血管新生步驟，且已被使用多年(Kubota Y,Kleinman HK,Martin GR,Lawley TJ.Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures.The Journal of cell biology.1988；107(4)：1589-98；Arnaoutova I,George J,Kleinman HK,Benton G.The endothelial cell tube formation assay on basement membrane tnrns 20：state of tbe science and the art. Angiogenesis.2009；12(3)：267-74.)。相較於PBS控制組，以40μg/ml小鼠QBEND/10處理的人類臍靜脈內皮細胞，其細胞覆蓋區域呈現顯著降低的狀況(P值<0.05；第1圖)。

2. 小鼠QBEND/10之可變片段的起始蛋白質定序

LC-MS/MS為基礎之技術已顯露為蛋白質鑑定的一重要工具(Olsen JV,Macek B,Lange O,Makarov A,Horning S,Mann M.Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis.Nature methods.2007；4(9)：709-12；Syka JE,Coon JJ,Schroeder MJ,Shabanowitz J,Hunt DF.Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.2004；101(26)：9528-33；Guthals A,Bandeira N.Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes.Molecular & cellular proteomics：MCP.2012；11(9)：550-7.)。關於胜肽序列之詳細資訊可藉由MS/MS圖譜所提供之離子碎片的指派(assignment)來獲得。Mascot為至今最熱門的搜尋引擎，且其以或然率(probability)為基礎的評分演算法(scoring algorithm)已被廣泛接受。於本研究中採用Mascot分數為蛋白質鑑定與起始定序的信心參考(reference of confidence)。為了達成一較佳之序列覆蓋(sequence coverage)，針對分離之重鏈與輕鏈，執行使用數種酵素之溶液內(in-solution)分解與使用胰蛋白酶之膠體內分解。使用LC-MS/MS來分析所有產生之胜肽，並產生用於對照客製化資料庫(customized databases)之反覆資料庫搜尋(iterative database search)與錯誤容忍搜尋的波峰列表。僅列出具有高品質MS/MS圖譜(離子分數30)的胜肽。表1與表2分別列出QBEND/10輕鏈與重鏈之經胰蛋白酶切割(trypsin digestion)後的理論性胜肽片段(theoretical peptides)及其序列。

由胰蛋白酶所分解之QBEND/10輕鏈與重鏈的基峰強度(base peak intensity,BPI)色譜圖(chromatogram)分別顯示於第2A與2B圖。Ln與Hn分別指出從輕鏈與重鏈之N端所指派的第n個胰蛋白酶胜肽。根據第2A與2B圖來確認與指派各個波峰。

將來自多種酵素分解之輕鏈與重鏈的可變區的鑑定結果校直(align)並分別顯示於第3A與3B圖中。

3. QBEND/10之分子模擬

如前方材料與方法段落所述，使用免疫球蛋白結構預測(Prediction of ImmunoGlobulin Structure,PIGS)網頁伺服器(http：//www.biocomputing.it/pigs)(Marcatili P,Rosi A,Tramontano A.PIGS：automatic prediction of antibody structures.Bioinformatics.2008；24(17)：1953-4；Marcatili P,Olimpieri PP,Chailyan A,Tramontano A.Antibody structural modeling with prediction of immunoglobulin structure(PIGS).Nature protocols.2014；9(12)：2771-83)來執行鼠源之QBEND/10的分子模擬。使用Swiss-PdbViewer(aka DeepView)程式(Guex N,Peitsch MC.SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer：an environment for comparative protein modeling.Electrophoresis.1997；18(15)：2714-23)來查看可變片段(Fv)區域之三維結構(第4圖)。使用與來自不同結構之已知模板具有最高序列相似度的最佳配對(match)來模擬鼠源之QBEND/10之輕鏈與重鏈的可變片段(Fv)區域。對於鼠源之QBEND/10可變片段(Fv)區域的模板的蛋白質資料銀行(Protein Data Bank,PDB)代號如下所示(序列相似度於括號內指出)：2GKI(Kim YR,Kim JS,Lee SH,Lee WR,Sohn JN,Chung YC,et al.Heavy and light chain variable single domains of an anti-DNA binding antibody hydrolyze both double- and single-stranded DNAs without sequence specificity.The Journal of biological chemistry.2006；281(22)：15287-95)用於重鏈(86.67%)，而2QHR(Lee JE,Kuehne A,Abelson DM,Fusco ML,Hart MK,Saphire EO.Complex of a protective antibody with its Ebola virus GP peptide epitope：unusual features of a V lambda x light chain.Journal of molecular biology.2008；375(1)：202-16)用於輕鏈(94.92%)；2QHR用於CDR-L1(序列辨識號：72)(75%)，2QHR用於CDR-L2(序列辨識號：73)(85.71%)，與2QHR用於CDR-L3(序列辨識號：74)(92.31%)；2GKI用於CDR-H1(序列辨識號：75)(90%)，2GKI用於CDR-H2(序列辨識號：76)(82.35%)，與2GKI用於CDR-H3(序列辨識號：77)(45.45%)。根據為了特定標準結構種類(canonical structure class)所定義之標準構造(canonical conformation)來模擬所有CDRs。

4. QBEND/10之人源化

使用NCBI IgBLAST，來自IGLV4-69*01之人類種系(germline)V區域(序列辨識號：4)則對於鼠源之QBEND/10輕鏈變異區(V_L)顯示最高的相似度(70.1%)，而來自IGHV1-3*01群組之人類種系V區域(序列辨識號：7)對於鼠源之QBEND/10重鏈變異區(V_H)顯示最高的相似度(67.3%)。小鼠與人類模板之序列校直(alignment)顯示於第5A與5B圖。針對輕鏈與重鏈的J區域係選自最相似之人類共通序列，所選擇之針對輕鏈的J區域(IGLJ1*01；序列：FG T GTKVTVL(序列辨識號：4)與針對重鏈的J區域(IGHJ4*01；序列：WGQGT L VTVSS(序列辨識號：7)分別對於QBEND/10之輕鏈變異區(V_L)與重鏈變異區(V_H)各顯示一個錯誤配對之殘基。使用QBEND/10之模型(第6圖)來確認表面可及殘基(surface accessible residues)。

於QBEND/10輕鏈變異區(V_L)中之35個胺基酸(第5A圖)被確認為表面可及殘基。排除CDR區域，它們其中僅有5個不同於人類種系序列，且被改造為人類版本(human version)。依照Kabat’s慣例將QBEND/10之輕鏈變異區(V_L)(序列辨識號：1)進行編碼，則上述5個胺基酸改變為QBEND/10之輕鏈變異區(V_L)之Kabat編號第8位的胺基酸由Ser置換為Pro(Ser8Pro)、Kabat編號第41位的胺基酸由Leu置換為Glu(Leu41Glu)、Kabat編號第54位的胺基酸由Thr置換為Lys(Thr54dLys)、Kabat編號第77位的胺基酸由Asn置換為Ser(Asn77Ser)與Kabat編號第100位的胺基酸由Gly置換為Thr(Gly100Thr)(直接依照序列表中所示輕鏈變異區(V_L)序列(序列辨識號：1)之各胺基酸位置，上述5個胺基酸改變為QBEND/10之輕鏈變異區(V_L)之第8位的胺基酸由Ser置換為Pro(Ser8Pro)、第41位的胺基酸由Leu置換為Glu(Leu41Glu)、第58位的胺基酸由Thr置換為Lys(Thr58Lys)、第81位的胺基酸由Asn置換為Ser(Asn81Ser)與第108位的胺基酸由Gly置換為Thr(Gly108Thr)，而經過上述置換所獲得之序列為序列辨識號：9之序列)。

在QBEND/10之重鏈變異區(V_H)(第5B圖)之情況，28個表面可及胺基酸中有4個胺基酸不同於人類種系，而被置換為其所對應者。依照Kabat’s慣例將QBEND/10之重鏈變異區(V_H)進行編碼，則上述4個胺基酸改變為QBEND/10之重鏈變異區(V_H)之 Kabat編號第5位的胺基酸由Gln置換為Val(Gln5Val)、Kabat編號第9位的胺基酸由Pro置換為Ala(Pro9Ala)、Kabat編號第73位的胺基酸由Lys置換為Thr(Lys73Thr)與Kabat編號第74位的胺基酸由Gln置換為Ser(Gln74Ser)(依照序列表中所示重鏈變異區(V_H)序列之各胺基酸位置，上述4個胺基酸改變為QBEND/10之重鏈變異區(V_H)之第5位的胺基酸由Gln置換為Val(Gln5Val)、第9位的胺基酸由Pro置換為Ala(Pro9Ala)、第74位的胺基酸由Lys置換為Thr(Lys74Thr)與第75位的胺基酸由Gln置換為Ser(Gln75Ser))。

如第6A與6B圖所顯示，將小鼠與經重修表面(resurfacing)之QBEND/10的模型進行疊印(superimpose)以確定在CDR區域中之構造變化(conformational changes)。藉由使用均方根離差(root-mean-square deviation,RMSD)(Maiorov VN,Crippen GM.Significance of root-mean-square deviation in comparing three-dimensional structures of globular proteins.Journal of molecular biology.1994；235(2)：625-34)，來測量此這兩個三維結構的相似度。均方根離差為0時，代表相同，而數值高之均方根離差則代表在構造上不同。均方根離差之值<1.5Å已被公開當作定義一比較之模型的正確性(Baker D,Sali A.Protein structure prediction and structural genomics.Science.2001；294(5540)：93-6)。如第6圖所示，均方根離差之值在0.01Å與0.23Å之間指出，小鼠QBEND/10模型相似於經重修表面之QBEND/10模型。在CDR-H1(His35)與CDR-H3(Tyr95)之圈環中觀察到介於小鼠與經重修表面之QBEND/10模型之間的唯一差異。而由於低的均方根離差1.5Å之值，His35與Tyr95被認為可能不影響正確之CDR-H1與CDR-H3構造。

5. QBEND/10之建構與表現

為了表現一完整之QBEND/10 IgG分子，使用兩個不同之哺乳動物表現載體，pSecTag2/Hygro與pcDNA3.3。為了讓所表現之QBEND/10被分泌之培養基中，將一引導序列分別添加至重鏈與輕鏈的上游。分別將QBEND/10重鏈變異區(VH)與輕鏈變異區(V_L)之胺基酸序列框內融合至人類免疫球蛋白gamma 1重鏈與lambda輕鏈固定區域。於小鼠骨髓瘤NS0細胞中，嵌合(chimeric)與經人源化之QBEND/10抗體被表現為可溶分泌型蛋白質。使用一人類IgG親和性管柱(IgSelect；GE Healthcare)來純化培養基並藉由SDS-PAGE來分析。如第7圖所示，可觀察到在非還原狀態下之約150kDa的一條顯著的條帶(band)，與在還原狀態下之約50kDa(重鏈)與約25kDa(輕鏈)之清楚的兩條條帶。

6. 抗體結合分析

使用一以表面電漿共振為基礎的分析來研究兩個抗體，嵌合與經人源化之QBEND/10對於重組人類CD34蛋白質的結合親和力，並測定結合動力學。結果如表3及第8A與8B圖所示。

依據第8A與8B圖與表3可知，嵌合QBEND/10與人類 CD34蛋白質之結合的K_D值為14.7nM，而經人源化之QBEND/10與人類CD34蛋白質之結合的K_D值為7.34nM。

在此兩例子中，解離常數為約2.62 x 10^-4s^-1，而在經人源化之QBEND/10的情況下，結合常數增加2倍(從1.78 x 10⁴M^-1 s^-1至3.66 x 10⁴M^-1 s^-1)(表3)。在嵌合與經人源化之QBEND/10中，相似之K_D值指出人源化步驟並未改變對人類CD34蛋白質之結合親和力。

7. 經人源化之QBEND/10對於內皮細胞管形成的影響

第9A與第9B圖顯示，相較於控制組，當對培養物施用40μg/ml經人源化之QBEND/10時，顯著地抑制了管形成網(tube-forming network)(P值<0.05；第9B圖)。且如第9B圖所示，經人源化之QBEND/10的劑量對於人類臍靜脈內皮細胞之管形成呈現一劑量依附型式(dose-dependent manner)的抑制狀況。隨著經人源化之QBEND/10的劑量提高，對於人類臍靜脈內皮細胞之管形成的抑制效果也就愈明顯。

雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

<110> 財團法人工業技術研究院

<120> 人源化之單株抗體及其用途

<130>

<160> 77

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠QBEND/10之輕鏈變異區

<400> 1

<210> 2

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠QBEND/10之重鏈變異區

<400> 2

<210> 3

<211> 101

<212> PRT

<213> 人類

<400> 3

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人類

<400> 4

<210> 5

<211> 111

<212> PRT

<213> 人類

<400> 5

<210> 6

<211> 102

<212> PRT

<213> 人類

<400> 6

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人類

<400> 7

<210> 8

<211> 113

<212> PRT

<213> 人類

<400> 8

<210> 9

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化之QBEND/10的輕鏈變異區

<400> 9

<210> 10

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化之QBEND/10的重鏈變異區

<400> 10

<210> 11

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠QBEND/10之輕鏈變異區

<400> 11

<210> 12

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠QBEND/10之重鏈變異區

<400> 12

<210> 13

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化之QBEND/10的輕鏈變異區

<400> 13

<210> 14

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化之QBEND/10的重鏈變異區

<400> 14

<210> 15

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠QBEND/10輕鏈之經胰蛋白酶切割後的理論性胜肽片段之一

<400> 15

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> 16

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<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> 18

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<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> 21

<210> 22

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> 22

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> 23

<210> 24

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> 24

<210> 25

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> 25

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> 26

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<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> 27

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<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> 29

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<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> 30

<210> 31

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠QBEND/10重鏈之經胰蛋白酶切割後的理論性胜肽片段之一

<400> 31

<210> 32

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> 32

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<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> 33

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<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> 34

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<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> 35

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> 36

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> 38

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<211> 62

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> 41

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<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> 44

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<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

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<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<211> 4

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<220>

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

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<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> 54

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<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<400> 57

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<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 來自胰蛋白酶與內肽酶分解之輕鏈的可變區的鑑定結果

<220>

<221> misc_feature

<222> (46)..(52)

<223> Xaa為未知胺基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (66)..(75)

<223> Xaa為未知胺基酸

<400> 58

<210> 59

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 來自胰蛋白酶分解之輕鏈的可變區的鑑定結果

<220>

<221> misc_feature

<222> (112)..(119)

<223> Xaa為未知胺基酸

<400> 59

<210> 60

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 來自膠體內胰蛋白酶分解之輕鏈的可變區的鑑定結果

<400> 60

<210> 61

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 來自內肽酶分解之輕鏈的可變區的鑑定結果

<220>

<221> misc_feature

<222> (35)..(85)

<223> Xaa為未知胺基酸

<400> 61

<210> 62

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 來自胰凝乳蛋白酶分解之輕鏈的可變區的鑑定結果

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(36)

<223> Xaa為未知胺基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (105)..(120)

<223> Xaa為未知胺基酸

<400> 62

<210> 63

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 來自嗜熱菌蛋白酶分解之輕鏈的可變區的鑑定結果

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(23)

<223> Xaa為未知胺基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (47)..(49)

<223> Xaa為未知胺基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (77)..(104)

<223> Xaa為未知胺基酸

<400> 63

<210> 64

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 來自枯草桿菌蛋白酶分解之輕鏈的可變區的鑑定結果

<220>

<221> misc_feature

<222> (35)..(36)

<223> Xaa為未知胺基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (48)..(50)

<223> Xaa為未知胺基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (70)..(75)

<223> Xaa為未知胺基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (100)..(119)

<223> Xaa為未知胺基酸

<400> 64

<210> 65

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 來自胰蛋白酶與內肽酶分解之重鏈的可變區的鑑定結果

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(23)

<223> Xaa為未知胺基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (60)..(74)

<223> Xaa為未知胺基酸

<400> 65

<210> 66

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 來自胰蛋白酶分解之重鏈的可變區的鑑定結果

<220>

<221> misc_feature

<222> (20)..(24)

<223> Xaa為未知胺基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (64)..(74)

<223> Xaa為未知胺基酸

<400> 66

<210> 67

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 來自膠體內胰蛋白酶分解之重鏈的可變區的鑑定結果

<220>

<221> misc_faature

<222> (64)..(65)

<223> Xaa為未知胺基酸

<400> 67

<210> 68

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 來自內肽酶分解之重鏈的可變區的鑑定結果

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(46)

<223> Xaa為未知胺基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (63)..(120)

<223> Xaa為未知胺基酸

<400> 68

<210> 69

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 來自胰凝乳蛋白酶分解之重鏈的可變區的鑑定結果

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(50)

<223> Xaa為未知胺基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (65)..(120)

<223> Xaa為未知胺基酸

<400> 69

<210> 70

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 來自嗜熱菌蛋白酶分解之重鏈的可變區的鑑定結果

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(47)

<223> Xaa為未知胺基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (64)..(85)

<223> Xaa為未知胺基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (104)..(120)

<223> Xaa為未知胺基酸

<400> 70

<210> 71

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 來自枯草桿菌蛋白酶分解之重鏈的可變區的鑑定結果

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(5)

<223> Xaa為未知胺基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(23)

<223> Xaa為未知胺基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (39)..(74)

<223> Xaa為未知胺基酸

<400> 71

<210> 72

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠QBEND/10之輕鏈CDR1

<400> 72

<210> 73

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠QBEND/10之輕鏈CDR2

<400> 73

<210> 74

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠QBEND/10之輕鏈CDR3

<400> 74

<210> 75

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠QBEND/10之重鏈CDR1

<400> 75

<210> 76

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠QBEND/10之重鏈CDR2

<400> 76

<210> 77

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠QBEND/10之重鏈CDR3

<400> 77

Claims

一種人源化之單株抗體，包括：一輕鏈變異區，該輕鏈變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：1之序列或者是與序列辨識號：1之序列具有至少80%之序列相似度的一序列；以及一重鏈變異區，該重鏈變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：2之序列或者是與序列辨識號：2之序列具有至少80%之序列相似度的一序列，其中該輕鏈變異區的胺基酸序列與該重鏈變異區的胺基酸序列具有擇自由下列所組成之群組的至少一個置換：該輕鏈變異區的胺基酸序列之第8位的胺基酸被置換為Pro；該輕鏈變異區的胺基酸序列之第41位的胺基酸被置換為Glu；該輕鏈變異區的胺基酸序列之第58位的胺基酸被置換為Lys；該輕鏈變異區的胺基酸序列之第81位的胺基酸被置換為Ser；該輕鏈變異區的胺基酸序列之第108位的胺基酸被置換為Thr；該重鏈變異區的胺基酸序列之第5位的胺基酸被置換為Val；該重鏈變異區的胺基酸序列之第9位的胺基酸被置換為Ala；該重鏈變異區的胺基酸序列之第74位的胺基酸被置換為Thr；以及該重鏈變異區的胺基酸序列之第75位的胺基酸被置換為Ser，又其中該人源化單株抗體與CD34結合。
如申請專利範圍第1項所述之人源化之單株抗體，其中該輕鏈變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：1之序列而該重鏈變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：2之序列，且該序列辨識號：1之序列與該序列辨識號：2之序列具有擇自由下列所組成之群組的至少一個置換：序列辨識號：1之第8位的胺基酸由Ser置換為Pro(Ser8Pro)；序列辨識號：1之第41位的胺基酸由Leu置換為Glu(Leu41Glu)；序列辨識號：1之第58位的胺基酸由Thr置換為Lys(Thr58Lys)；序列辨識號：1之第81位的胺基酸由Asn置換為Ser(Asn81Ser)；序列辨識號：1之第108位的胺基酸由Gly置換為Thr(Gly108Thr)；序列辨識號：2之第5位的胺基酸由Gln置換為Val(Gln5Val)；序列辨識號：2之第9位的胺基酸由Pro置換為Ala(Pro9Ala)；序列辨識號：2之第74位的胺基酸由Lys置換為Thr(Lys74Thr)；以及序列辨識號：2之與第75位的胺基酸由Gln置換為Ser(Gln75Ser)。
如申請專利範圍第1項所述之人源化之單株抗體，其中該輕鏈變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：9之序列而該重鏈變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：10之序列。
如申請專利範圍第1項所述之人源化之單株抗體，其中該人源化之單株抗體係與一載體(solid support)、一官能基或一生物分子連結。
如申請專利範圍第4項所述之人源化之單株抗體，其中該載體包括微珠(beads)、晶片(chip)或盤(plate)。
如申請專利範圍第4項所述之人源化之單株抗體，其中該官能基包括胺基(-NH₂)、巰基(-SH)、羧基(-COOH)或羥基(-OH)。
如申請專利範圍第4項所述之人源化之單株抗體，其中該生物分子包括生物素(biotin)、卵白素(avidin)或鏈黴素(Streptavidin)。
如申請專利範圍第1項所述之人源化之單株抗體，其中該人源化之單株抗體攜帶一顯色物質。
如申請專利範圍第8項所述之人源化之單株抗體，其中該顯色物質包括螢光染劑(fluorochromes)、螢光蛋白(fluorescent protein)、生物性冷光(bioluminescence)或奈米粒子。
如申請專利範圍第1項所述之人源化之單株抗體，其中該CD34為人類CD34。
一種人源化之單株抗體，包括：一輕鏈變異區；以及一重鏈變異區，其中編碼該輕鏈變異區之胺基酸序列的核苷酸序列包括一核苷酸序列，而該核苷酸序列編碼序列辨識號：9之胺基酸序列或者是與序列辨識號：9之序列具有至少80%之序列相似度的一胺基酸序列，而編碼該重鏈變異區之胺基酸序列的核苷酸序列包括另一核苷酸序列，該另一核苷酸序列編碼序列辨識號：10之胺基酸序列或者是與序列辨識號：10之序列具有至少80%之序列相似度的一胺基酸序列，又其中該人源化單株抗體與CD34結合。
如申請專利範圍第11項所述之人源化之單株抗體，其中該人源化之單株抗體係與一載體、一官能基或一生物分子連結。
一種人源化之單株抗體，包括：一輕鏈變異區；以及一重鏈變異區，其中編碼該輕鏈變異區的核苷酸序列包括序列辨識號：13之序列或者是與序列辨識號：13之序列具有至少80%之序列相似度的一序列，而編碼該重鏈之變異區的核苷酸序列包括序列辨識號：14之序列或者是與序列辨識號：14之序列具有至少80%之序列相似度的一序列，又其中該人源化單株抗體與CD34結合。
如申請專利範圍第13項所述之人源化之單株抗體，其中該人源化之單株抗體係與一載體、一官能基或一生物分子連結。
一種如申請專利範圍第1項所述之人源化之單株抗體用於製備抗血管新生藥劑的用途。
如申請專利範圍第15項所述之人源化之單株抗體用於製備抗血管新生藥劑的用途，其中該輕鏈變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：1之序列而該重鏈變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：2之序列，且該序列辨識號：1之序列與該序列辨識號：2之序列具有擇自由下列所組成之群組的至少一個置換：序列辨識號：1之第8位的胺基酸由Ser置換為Pro(Ser8Pro)；序列辨識號：1之第41位的胺基酸由Leu置換為Glu (Leu41Glu)；序列辨識號：1之第58位的胺基酸由Thr置換為Lys(Thr58Lys)；序列辨識號：1之第81位的胺基酸由Asn置換為Ser(Asn81Ser)；序列辨識號：1之第108位的胺基酸由Gly置換為Thr(Gly108Thr)；序列辨識號：2之第5位的胺基酸由Gln置換為Val(Gln5Val)；序列辨識號：2之第9位的胺基酸由Pro置換為Ala(Pro9Ala)；序列辨識號：2之第74位的胺基酸由Lys置換為Thr(Lys74Thr)；以及序列辨識號：2之與第75位的胺基酸由Gln置換為Ser(Gln75Ser)。
如申請專利範圍第15項所述之人源化之單株抗體用於製備抗血管新生藥劑的用途，其中該輕鏈變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：9之序列而該重鏈變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：10之序列。
如申請專利範圍第15項所述之人源化之單株抗體用於製備抗血管新生藥劑的用途，其中該人源化之單株抗體係與一載體、一官能基或一生物分子連結。
一種如申請專利範圍第1項所述之人源化之單株抗體用於製備治療與血管新生相關之疾病的藥物的用途。
如申請專利範圍第19項所述之人源化之單株抗體用於製備治療與血管新生相關之疾病的藥物的用途，其中該輕鏈變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：1之序列而該重鏈變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：2之序列，且該序列辨識號：1之序列與該序列辨識號：2之序列具有擇自由下列所組成之群組的至少一個置換：序列辨識號：1之第8位的胺基酸由Ser置換為Pro(Ser8Pro)；序列辨識號：1之第41位的胺基酸由Leu置換為Glu(Leu41Glu)；序列辨識號：1之第58位的胺基酸由Thr置換為Lys(Thr58Lys)；序列辨識號：1之第81位的胺基酸由Asn置換為Ser(Asn81Ser)；序列辨識號：1之第108位的胺基酸由Gly置換為Thr(Gly108Thr)；序列辨識號：2之第5位的胺基酸由Gln置換為Val(Gln5Val)；序列辨識號：2之第9位的胺基酸由Pro置換為Ala(Pro9Ala)；序列辨識號：2之第74位的胺基酸由Lys置換為Thr(Lys74Thr)；以及序列辨識號：2之與第75位的胺基酸由Gln置換為Ser(Gln75Ser)。
如申請專利範圍第19項所述之人源化之單株抗體用於製備治療與血管新生相關之疾病的藥物的用途，其中該輕鏈變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：9之序列而該重鏈變異區的胺基酸序列包括序列辨識號：10之序列。
如申請專利範圍第19項所述之人源化之單株抗體用於製備治療與血管新生相關之疾病的藥物的用途，其中該與血管新生相關之疾病包括癌症、新生血管性青光眼、老年性黃斑部病變。
如申請專利範圍第19項所述之人源化之單株抗體用於製備治療與血管新生相關之疾病的藥物的用途，其中該人源化之單株抗體係與一載體、一官能基或一生物分子連結。